Khóa luận Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro và tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam (JO2, Bắc thơm 07, LP5, Khang dân, Bao thai)

75 trang thiennha21 13/04/2022 4390

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro và tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam (JO2, Bắc thơm 07, LP5, Khang dân, Bao thai)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_kha_nang_tai_sinh_in_vitro_va_tiep_nhan.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro và tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam (JO2, Bắc thơm 07, LP5, Khang dân, Bao thai)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN SĨ HOÀNG ANH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO VÀ TIẾP NHẬN GEN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA VIỆT NAM (JO2, BẮC THƠM 07, LP5, KHANG DÂN, BAO THAI)” KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành/ chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2016 - 2020 Thái Nguyên, tháng 7 năm 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN SĨ HOÀNG ANH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO VÀ TIẾP NHẬN GEN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA VIỆT NAM (JO2, BẮC THƠM 07, LP5, KHANG DÂN, BAO THAI)” KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành/ chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp : K48 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2016 - 2020 Ngƣời hƣớng dẫn : 1. TS. Bùi Tri Thức 2. TS. Nguyễn Tiến Dũng Thái Nguyên, tháng 7 năm 2020
i LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp là sản phẩm nghiên cứu khoa học đầu đời của mỗi sinh viên, thành quả của quá trình học tập và rèn luyện trong trường đại học. Chính vì thế, việc hoàn thành khóa luận đòi hỏi rất nhiều công sức, sự chuyên tâm, nhiệt huyết cũng như thời gian của người viết. Tuy nhiên, một trong những yếu tố không nhỏ tạo nên “sản phẩm trí tuệ” này là sự hướng dẫn, giúp đỡ của giảng viên hướng dẫn, các thầy cô đã giảng dạy cũng như sự ủng hộ của gia đình và bạn bè. Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy TS. Bùi Tri Thức và thầy TS. Nguyễn Tiến Dũng, hai thầy trực tiếp hướng dẫn em trong quá trình làm thí nghiệm. Không chỉ gợi ý và hướng dẫn em trong quá trình tìm hiểu, đọc tài liệu và lựa chọn đề tài, thầy còn tận tình chỉ bảo em những kĩ năng phân tích, khai thác tài liệu để có được những lập luận phù hợp với nội dung của khóa luận. Hơn nữa, thầy còn rất nhiệt tình trong việc đốc thúc quá trình viết khóa luận, đọc và đưa ra những nhận xét, góp ý để em có thể hoàn thành luận văn một cách tốt nhất. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi đến các thầy cô giáo đã và đang công tác, giảng dạy tại khoa CNSH & CNTP, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên lòng biết ơn sâu sắc về những kiến thức và kĩ năng mà các thầy cô đã truyền đạt cho em trong suốt quá trình học tập và rèn luyện. Em xin cảm ơn thầy TS. Nguyễn Văn Duy, trưởng khoa CNSH & CNTP về những lời khuyên răn, chỉ bảo của thầy trong suốt 4 năm học. Em xin cảm ơn cô ThS. Nguyễn Thị Tình, người đã truyền cho em cảm hứng nghiên cứu khoa học, dìu dắt em trong những bước đi đầu đời, cùng với tất cả những thầy cô giáo khác trong khoa CNSH & CNTP đã giúp đỡ em rất nhiều về mặt tài liệu cũng như đóng góp những ý kiến cho việc hoàn thành khóa luận của em. Cuối cùng, em xin được gửi đến bố mẹ, gia đình và bạn bè lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc vì những sự động viên, ủng hộ và cổ vũ tinh thần trong suốt quá trình gian nan và vất vả này. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực hiện
ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ viết tắt (cả tiếng Anh và tiếng Việt) 2,4D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid A Adenine A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ANOVA ANalysis Of VAriance BAP 6 – Benzyl Amino Purin C Cytosine CNSH Công nghệ sinh học Cs Cộng sự CT Công thức CV Coeficient of Variation – Hệ số biến động DNA Deoxyribonucleic acid EtOH Ethyl alcohol FAO Tổ chức nông lương Liên hợp quốc G Guanine GMC Genetically Modified Crop GMF Genetically Madified Foods GMO Genetically Modified Organism GUS Beta-glucuronidase HSD Honestly Significant Difference IRRI Viện nghiên cứu lúa quốc tế KHKT Khoa học kĩ thuật
iii LMO Living Modified Organisms LSD Least Singnificant Difference Test – Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa MT Môi trường NAA α– Naphthalen Acetic Acid NN-PTNT Nông nghiệp – Phát triển nông thôn O. fatua Oryza fatua O. granulata Oryza granulata O. nivara Oryza nivara O. ridleyi Oryza ridleyi O. rufipogon Oryza rufipogon O. sativa Oryza sativa PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylene glycol PTNT Phát triển nông thôn QĐ-TTg Quyết định của thủ tướng QPL Quantitative trait loci RNA Acid Ribo Nucleic S. tuberosum Solanum tuberosum T Thymine TN Thí nghiệm TT-BNNPTNT Thông tư của Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn TT-BTNMT Thông tư của Bộ tài nguyên môi trường USD United States Dollar
iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thị trường gạo năm 2019 4 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam. 29 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam 32 Bảng 4.3. Kết quả nghiên khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam. 35 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu khả năng ra rễ của một số g iống lúa Việt Nam. 38 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh của một số giống lúa Việt Nam. 40 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam (sau 14 ngày) 43
v DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1. Chủng loại gạo xuất khẩu năm 2019 3 Hình 2. Quá trình tiến hoá của lúa trồng 8 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen lúa thông qua qúa trình tiếp nhận gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens [30] 27 Hình 4.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo callus của giống lúa JO2 (A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự tạo callus tốt giảm dần) 31 Hình 4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa JO2 (A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự tạo chồi tốt giảm dần)34 Hình 4.3. Kết quả nghiên khả năng nhân nhanh của giống lúa JO2. (A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự nhân nhanh chồi tốt giảm dần) 37 Hình 4.4. Kết quả nghiên cứu cứu khả năng ra rễ của giống lúaJO2. 39 Hình 4.5. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnhcủa giống lúa JO2 (A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự tạo cây hoàn chỉnh tốt giảm dần) 42
vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH, SƠ ĐỒ iv MỤC LỤC v Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 3 2.1 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới 3 2.1.1 Tình hình sản xuất lúa gạo trong nước 3 2.1.2 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới 5 2.2 Nguồn gốc cây lúa 7 2.3 Phân loại cây lúa 8 2.3.1 Phân loại theo loại hình canh tác 9 2.3.2 Phân loại theo điều kiện sinh thái 9 2.4 Giá trị và chất lượng dinh dưỡng 10 2.4.1 Giá trị dinh dưỡng 10 2.4.2 Chất lượng dinh dưỡng 11 2.5 Tái sinh in vitro cây lúa 13 2.6 Cây trồng tiếp nhận gen 18
vii Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh của một số giống lúa Việt Nam 23 3.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh của một số giống lúa Việt Nam 23 3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam 26 3.4 Các phương pháp xử lý số liệu 28 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết quả nghiên cứu khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam. 29 4.2 Kết quả nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam 32 4.3 Kết quả nghiên khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam. 35 4.4 Kết quả nghiên cứu cứu khả năng ra rễ của một số giống lúa Việt Nam. 38 4.5 Kết quả nghiên cứu Nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh của một số giống lúa Việt Nam. 40 4.6 Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam 43 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lương thực chính quan trọng hàng đầu của con người, cung cấp từ 60 đến 70% calories [29]. Trên thế giới, cây lúa được xếp vào vị trí thứ 2 sau cây lúa mì về diện tích và sản lượng. Ở Việt Nam, cây lúa có vai trò đặc biệt quan trọng đóng góp sản lượng lương thực cho con người. Điều kiện tự nhiên phù hợp với phát triển nền nông nghiệp lúa nước, diện tích đồng bằng ven sông lớn như đồng bằng sông Cửu Long 4.081,63 ha và đồng bằng Sông Hồng 2.126 ha, lượng mưa trung bình vào khoảng 700 – 5.000 mm, là những thế mạnh giúp chúng ta phát triển lĩnh vực nông nghiệp. Thế nhưng, khi đi sâu vào thực tế, gạo Việt Nam vẫn còn tồn đọng một số hạn chế nhất định bên cạnh những ưu điểm vang danh bấy lâu [9]. Diện tích canh tác 5 năm gần đây giảm 358 ha do sự phát triển của công nghiệp hoá, đất nông nghiệp bình quân/hộ chỉ vào khoảng 0,46 ha và trung bình được chia thành 2,83 (Tổng Cục Thống Kế, 2019). Cùng với áp lực dân số và biến đổi khí hậu đòi hỏi cần phải tạo ra bộ giống có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu được hạn hán, bất lợi của môi trường là yêu cầu cấp thiết và góp phần giữ ổn định an ninh lương thực quốc gia. Sự phát triển của công nghệ sinh học cho phép chọn tạo ra những giống cây trồng, vật nuôi mới phù hợp với mục đích sử dụng. Ở Việt Nam, công tác chọn tạo giống lúa đang được đặc biệt quan tâm trong đó việc áp dụng kỹ thuật mới như chuyển gen đột biến, chỉnh sửa gen được xem là công cụ hỗ trợ hiệu quả trong chọn tạo giống. Cho đến nay, phương pháp dùng để chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm trong đó có cây lúa mặc dù đã có những thành công nhất định trong nghiên cứu chuyển gen, chỉnh sửa gen ở cây lúa. Tuy nhiên, sự thành công của phương pháp phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kiểu gen, môi trường, kỹ thuật. Việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro ở cây lúa có vai trò quan trọng cho hiệu quả chuyển gen.
2 Việc nghiên cứu khả năng tái sinh và tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam phục vụ cho chương trình cải tạo giống lúa chuyển gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất là cần thiết. Tái sinh in vitro giống lúa Việt Nam là khâu rất quan trọng để thực hiện thành công các kỹ thuật chuyển gen trong công tác chuyển gen chỉnh sửa gen, chọn dòng biến dị soma. Trong đó, tái sinh tạo callus từ hạt là một trong những phương pháp cho được hiệu quả tạo chồi cao trong nuôi cấy in vitro, không chỉ đơn thuần là chọn tạo giống thông thường mà ngay cả trong chọn tạo giống công nghệ sinh học và tạo cây chuyển gen. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi đã hình thành lên đề tài: “Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro và tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam (JO2, Bắc thơm 07, LP5, Khang dân, Bao thai)”. 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định được khả năng tái sinh và tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định được khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam - Xác định được khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam - Xác định được khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam - Xác định được khả năng ra rễ của một số giống lúa Việt Nam - Xác định được khả năng tạo cây hoàn chỉnh một số giống lúa Việt Nam - Xác định được khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Xây dựng và hoàn thiện được quy trình tái sinh cây phục vụ chuyển gen nghiên cứu chuyển gen của một số giống lúa Việt Nam
3 - Giúp sinh viên tiếp cận với nghiên cứu khoa học, ứng dụng lý thuyết vào thực tiễn, nâng cao năng lực nghiên cứu và kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm. Phần 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan tình hình trong nƣớc và trên thế giới 2.1.1 Tình hình sản xuất lúa gạo trong nước Sản xuất gạo trong nước có nhiều biến động, nguồn cung gạo toàn cầu liên tục dự báo tăng và ở mức cao, trong khi đó, nhập khẩu gạo từ các nước dự báo giảm gây áp lực đối với xuất khẩu gạo của Việt Nam. Tuy vậy, xuất khẩu gạo của Việt Nam năm 2019 vẫn đạt được kết quả tích cực, góp phần tiêu thụ thóc, gạo cho người nông dân trồng lúa. (Đơn vị tính: Nghìn tấn) 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 5 % 5451 JAPONICA JASMINE TẤM ĐÀI THƠM 8 NẾP KHÁC (Nguồn: Tính toán từ số liệu sơ bộ của Tổng cục Hải quan) Hình 1. Chủng loại gạo xuất khẩu năm 2019 Năm 2019 xuất khẩu gạo đạt 6,37 triệu tấn, trị giá đạt 2,80 tỷ USD, tăng 4,2% về lượng nhưng giảm 8,3% về trị giá so với năm 2018. Trong bối cảnh thị trường khó
4 khăn, xuất khẩu gạo Việt Nam vẫn duy trì được mức tăng về lượng. Tuy nhiên, giá xuất khẩu bình quân ở mức 441 USD/tấn, giảm 12,1% tương đương mức giảm 60 USD/tấn [9]. Bảng 2.1. Thị trƣờng gạo năm 2019 (Đơn vị tính: Nghìn tấn) Tăng/giảm so với Năm 2019 năm 2018 Thị Trƣờng Lƣợng (tấn) Kim ngạch Tỷ trọng Lƣợng Kim ngạch (USD) (%) (tấn) Tổng 6.366.469 2.805.353.946 100 4,2 -8,3 Philippines 2.131.668 884.947.516 33,5 110,6 93,6 Malaysia 551.583 884.947.516 8,7 16,1 0,9 Trung Quốc 447.127 240.391.971 7,0 -66,5 -64,8 Bờ Biển Ngà 583.579 252.633.047 9,2 113,3 61,4 Ghana 427.187 212.648.202 6,7 150,1 -0,7 Hồng Kông 120.760 63.310.183 1,9 35,0 25,1 (Trung Quốc) Singapore 100.474 53.390.628 1,6 21,0 14,6 Indonesia 40.1508 18.396.076 0,6 -94,8 -94,9 Đài loan 25.443 11.931.575 0,4 32,9 26,3 Algeria 16.394 6.281.035 0,3 41,9 20,8 Angola 16.253 6.071.324 0,3 255,4 135,2 Nam Phi 8.735 4.308.502 0,1 117,7 91,2 Bangladesh 5.262 1.948.587 0,1 -76,0 -79,4
5 (Nguồn: Tính toán từ số liệu sơ bộ của Tổng cục Hải quan năm 2019) Năm 2019, xuất khẩu gạo của Việt Nam gặp nhiều diễn biến bất lợi về thị trường. Các thị trường nhập khẩu gạo lớn, truyền thống như Trung Quốc, Indonesia, Bangladesh đồng loạt giảm nhập khẩu. Xuất khẩu gạo Việt Nam năm 2019 được bù đắp từ nhu cầu thị trường Philippines, Hồng Kông (Trung Quốc), Singapore và một số thị trường châu Phi như Bờ Biển Ngà, Ghana. Trong năm 2019, châu Á vẫn là khu vực thị trường xuất khẩu lớn nhất của gạo Việt Nam, đạt 3,68 triệu tấn, chiếm 58% tổng lượng gạo xuất khẩu. Trong đó, Philippines trở thành thị trường xuất khẩu lớn nhất của Việt Nam, đạt 2,13 triệu tấn, chiếm 33,5% trong tổng xuất khẩu cả nước. Nhu cầu từ Philippines đã bù đắp sự sụt giảm xuất khẩu mạnh của một số thị trường truyền thống của Việt Nam. Châu Phi là thị trường khu vực lớn thứ hai, đạt 1,39 triệu tấn, chiếm 21,9%. Trong đó, Bờ Biển Ngà (583.579 tấn, chiếm 9,2%) và Ghana (427.187 tấn, chiếm 6,7%) là 2 thị trường tiêu biểu [9]. Theo quyết định số 11/2006/QĐ-TTg ngày 12/01/2006 của Thủ tướng Chính phủ về Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng CNSH trong lĩnh vực nông nghiệp và PTNT đến năm 2020 đã nêu rõ. Mục tiêu giai đoạn 2011-2015: Đưa một số giống cây trồng biến đổi gen vào sản xuất (cây bông, cây ngô, đậu nành). Tầm nhìn đến 2020: Diện tích trồng trọt các giống cây trồng mới tạo ra bằng các kỹ thuật của CNSH chiếm trên 70%, trong đó diện tích trồng trọt các giống cây trồng biến đổi gen chiếm 30 - 50%. Thông tư 08/2013/TT-BTNMT của Bộ Tài nguyên Môi trường ngày 16/5/2013 Quy định trình tự, thủ tục cấp và thu hồi giấy chứng nhận an toàn sinh học đối với cây trồng biến đổi gen. Thông tư 02/2014/TT-BNNPTNT của Bộ NN-PTNT ngày 14/01/2014 về quy định trình tự, thủ tục cấp và thu hồi giấy xác nhận thực vật biến đổi gen đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi. 2.1.2 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới Hiện nay, vẫn chưa có nhiều loại lúa gạo biến đổi gen nào được chấp nhận sử dụng trên toàn thế giới, tuy nhiên đã phát hiện một số loại lúa gạo biến đổi gen (đặc
6 biệt có nguồn gốc từ Trung Quốc) xuất hiện trên thị trường 1, 2, 3, 4]. Cho đến nay, trên thế giới có trên 700 công ty giống cây trồng áp dụng công nghệ nuôi cấy mô, cơ quan và tế bào thực vật để sản xuất hàng trăm triệu giống cây trồng sạch bệnh mỗi năm (cây dược liệu, cây ăn quả, cây lương thực, cây hoa, cây cảnh, cây rừng) và đã mang lại hiệu quả kinh tế cao so với việc sử dụng các phương pháp truyền thống khác, góp phần bảo vệ an ninh lương thực và chống biến đổi khí hậu toàn cầu [8]. Dự báo về sản lượng gạo toàn cầu 2020, uớc tính con số tiêu thụ gạo toàn cầu năm 2019-2020 vào khoảng 516,8 triệu tấn (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc). Cải dầu (Brassica napus ), khoai tây (S. tuberosum), lúa mì (Triticum spp.) là ba loại cây trồng biến đổi gen về sinh học được kiểm soát an toàn nhằm tìm ra tiềm năng chuyển gen trong cácloài cây trồng. Lúa (O. sativa) chuyển gen vẫn đang là loại cây trồng thứ tư được kiểm soát nghiêm ngạ t nhất trên thế giới. Cây trồng biến đổi gen được bắt đầu trồng thương mại đại trà từ năm 1996. Tuy nhiên, đến nay các sản phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen (thực phẩm biến đổi gen) vẫn đang còn là một cuộc tranh luận toàn cầu về những nguy cơ tiềm tàng của chúng để đi tới những giải pháp bảo đảm an toàn cho cây trồng biến đổi gen. Nhờ công nghệ sinh học hiện đại - công nghệ gen, GMO đã xuất hiện hơn 2 thập kỷ nay. Việc thử nghiệm trồng cây đầu tiên ngoài đồng ruộng là cây thuốc lá biến đổi gen kháng thuốc diệt cỏ, được tiến hành ở Mỹ và Pháp vào năm 1986 [31].Việc cung cấp lương thực cho toàn thế giới đã trở thành vấn đề toàn cầu, nó cũng là chương trình đang được chú trọng hàng đầu của tổ chức Nông lương Liên Hợp Quốc - FAO. Sản lượng thực phẩm toàn cầu cần phải tăng đến 70% vào năm 2050 để cung cấp đủ cho 9,2 tỉ dân. Với sự thành công của cuộc cách mạng xanh và sự tiến bộ của công nghệ sinh học, sản lượng nông nghiệp đã tăng lên đáng kể trong vòng 40 năm qua. Sản lượng lương thực chính (lúa mạch, lúa, bắp) tăng từ 100 - 200% từ cuối những năm 1960 [30].
7 Theo bản báo cáo mới nhất về an ninh lương thực thế giới [30], báo cáo này đã trình bày một cách tính mới về số người thiếu ăn trên toàn thế giới dựa trên một phương pháp sửa đổi và cải tiến. Thống kê mới nhất của FAO trên thế giới vẫn còn 870 triệu người tương đương với một phần tám dân số thế giới vẫn còn trong tình trạng đói kém và xóa đói vẫn là một thách thức lớn cho toàn cầu. Giá lương thực qua các năm có sự gia tăng mạnh đối với nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là lúa mì, ngô, gạo, đậu nành và bông. Ở các nước phát triển mạnh thì giá của thực phẩm vẫn thấp, vì vậy việc tăng giá thực phẩm ít tác động đến nền kinh tế. Trong khi vấn đề này đối với các nước đang phát triển thì rất khác biệt. Khi một nửa tiền lương của người dân được dùng cho việc mua thực phẩm và giá thực phẩm lại tăng 30 - 40%, chính vì vậy người dân phải gặp rất nhiều khó khăn trong việc lựa chọn. Do đó, bất chấp các nỗ lực của chính phủ và nhiều tổ chức phi chính phủ mà số người đói (số người suy dinh dưỡng) thực tế vẫn còn rất nhiều. Có nhiều vấn đề xảy ra khi hầu hết các nguồn thực phẩm dư thừa được sản xuất ở các vùng rất xa khu vực cần được hỗ trợ thực phẩm. Một lượng lớn thực phẩm sản xuất mỗi năm bị lãng phí do hư hỏng, côn trùng và do các vấn đề khác. Các vấn đề khí hậu hàng năm như hạn hán (gần đây đã được chứng kiến ở Ukraina) và lũ lụt (Pakistan và Australia) có thể giảm sản lượng lương thực một lượng đáng kể [31]. 2.2 Nguồn gốc cây lúa Cho đến nay, đã có rất nhiều giả thiết khác nhau về nguồn gốc của chi lúa trên trái đất, nhưng hầu hết đều thừa nhận rằng các loài lúa hoang dại đã xuất hiện từ thời tiền sử của trái đất (thời Gondwana). Theo công bố của Chang và cs (1984) [22], O. sativa xuất hiện đầu tiên ở dãy Himalaya, Miến Điện, Lào, Việt Nam và Trung Quốc. Từ các trung tâm trên lúa Indica phát tán đến lưu vực sông Hoàng Hà và sông Dương Tử rồi sang Nhật Bản, Triều Tiên và từ đó biến thành chủng Japonica. Lúa được hình thành ở Indonesia và là sản phẩm của quá trình chọn lọc từ Indica.
8 Ở Việt Nam, theo các kết quả khảo sát nguồn gen cây lúa trong những năm gần đây nhiều công trình khoa học đã chỉ ra rằng các loài lúa dại mọc hoang dã nhiều ở vùng Tây Bắc, Nam Trung bộ, đồng bằng sông Cửu Long, Tây Nguyên là các loài O. granulata, O. nivara, O. ridleyi, O. rufipogon. Với những điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng có thể là cái nôi hình thành cây lúa nước. Từ lâu, cây lúa đã trở thành cây lương thực chủ yếu có ý nghĩa quan trọng trong nền kinh tế và xã hội của nước ta. Lúa trồng hiện nay có nguồn gốc từ lúa dại. Việc xác định trực tiếp tổ tiên của cây lúa trồng ở Châu Á (O. sativa) vẫn còn khá nhiều ý kiến tranh cãi khác nhau. Một số tác giả như Đinh Dĩnh, Bùi Huy Đáp, Đinh Văn Lữ cho rằng: O. fatua là loài lúa dại gần nhất và được coi là tổ tiên của lúa trồng hiện nay. 2.3 Phân loại cây lúa Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) trước đây đã nghiên cứu và xếp lúa trồng ở châu Á (O. sativa) thuộc họ hòa thảo (Graminae) và có bộ nhiễm sắc thể là 2n = 24. Theo Trần Văn Đạt (2005) [1], Kato là người đầu tiên xây dựng các luận cứ khoa học về phân loại dưới loài của lúa trồng châu Á dựa trên các đặc điểm hình thái. Tùy theo các đặc điểm và tiêu chí khác nhau mà các nhà khoa học phân loại cây lúa theo các quan điểm khác nhau, phân loại cây lúa nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng nguồn gen để phục vụ cho mục tiêu chọn tạo giống cây trồng. Nhiều tư liệu đưa ra cơ sở tiến hóa của các loài lúa trồng hiện nay, tuy nhiên theo Khush (1997) [23], sự tiến hóa của hai loại lúa trồng phổ biến hiện nay trên thế giới được thể hiện trong sơ đồ, như sau:
9 Hình 2. Quá trình tiến hoá của lúa trồng 2.3.1 Phân loại theo loại hình canh tác Quá trình thuần hóa và thích nghi với điều kiện sống và điều kiện canh tác khác nhau, cây lúa trồng được phân thành các nhóm. Lúa có tưới, loại lúa được trồng trên những cánh đồng có công trình thủy lợi, chủ động về nước tưới trong suốt thời gian sinh trưởng và phát triển. Lúa nước sâu, được trồng trên những cánh đồng thấp, không có khả năng rút nước sau mưa hoặc lũ. Tuy nhiên, nước không ngập quá 10 ngày và nước không cao quá 50 cm. Lúa nổi: lúa được gieo trồng trước mùa mưa, khi mưa lớn, cây lúa đã đẻ nhánh, khi nước lên cao cây lúa vươn khỏi mặt nước khoảng 10 cm/ ngày để ngoi theo. Lúa cạn: lúa được trồng trên đất cao, không có khả năng giữ nước, cây lúa sống hoàn toàn nhờ nước trời trong suốt quá trình sinh trưởng, phát triển. Ở Việt Nam, tồn tại cả 4 nhóm lúa như nêu trên. Theo Nguyễn Văn Hoan (2006),
10 cho đến nay phân loại lúa theo hệ thống phân loại học thực vật của loài lúa trồng Oryza sativa L. đã đạt được sự thống nhất [2]. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu: loài Oryza sativa L. gồm 3 loại phụ, 8 nhóm biến chủng và 284 biến chủng. Theo cấu tạo của tinh bột còn phân biệt lúa nếp (Glutinosa) và lúa tẻ (Utilissma). Tuy nhiên, theo định luật về dãy biến dị tương đồng của Vavilov. N. I thì cây lúa vẫn tiếp tục tiến hóa và nhiều biến chủng mới vẫn tiếp tục xuất hiện. Vì vậy, các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu, tập hợp và bổ sung thêm cho hệ thống phân loại này. 2.3.2 Phân loại theo điều kiện sinh thái Lúa trồng thành hai nhóm lớn là Japonica (lúa cánh) và Indica (lúa tiên). Lúa tiên thường phân bố ở vĩ độ thấp như: Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Indonesia, là loại hình cây to, lá nhỏ xanh nhạt, bông xòe, hạt dài, vỏ trấu mỏng, cơm khô nở nhiều, chịu phân kém, dễ lốp đổ nên có năng suất thấp. Lúa cánh thường phân bố ở vĩ độ cao như: Nhật Bản, Triều Tiên, Bắc Trung Quốc, châu Âu là loại hình cây có lá to, xanh đậm, bông chụm, hạt ngắn, vỏ trấu dày, cơm thường dẻo, ít nở, thích nghi với điều kiện thâm canh, chịu phân tốt, thường thu hoạch cho năng suất cao. Phân loại theo địa lý Theo Nguyễn Văn Hoan (2006), phân chia lúa trồng thành các nhóm sinh thái địa lý, như sau [2]: Nhóm Đông Á: Bao gồm Triền Tiên, Nhật Bản, phía Bắc Trung Quốc. Đặc trưng của nhóm là chịu lạnh rất tốt và hạt khó rụng. Nhóm Trung Á: Bao gồm các nước Trung Á. Đặc điểm nổi bật của lúa vùng này là hạt to, khối lượng 1000 hạt đạt trên 32 gam, chịu lạnh và chịu nóng khá. Nhóm Iran: Gồm toàn bộ các nước Trung Đông xung quanh Iran. Đây là nhóm sinh thái địa lý với các loại hình chịu lạnh tốt, hạt gạo to, đục, cơm dẻo. Nhóm Nam Á: Bắt đầu từ Pakistan sang vùng bờ biển phía Nam Trung Quốc đến Bắc Việt Nam. Đặc điểm nổi bật của nhóm sinh thái địa lý này là chịu lạnh kém, phần lớn có hạt dài và nhỏ. Nhóm Philippin: Nhóm lúa điển hình nhiệt đới không chịu lạnh. Toàn bộ vùng Đông Nam Á, miền Nam Việt Nam nằm trong nhóm này. Nhóm châu Âu: Bao gồm các nước trồng lúa ở châu Âu như: Nga, Italia, Bungaria Đây là nhóm sinh thái với
11 các loại hình japonica chịu lạnh, hạt to, cơm dẻo, chịu nóng kém. Nhóm châu Phi: Nhóm lúa trồng thuộc loại Oryza glaberrima. Nhóm châu Mỹ La Tinh: Gồm các nước Trung Mỹ và Nam Mỹ. Nhóm lúa cao cây, thân to, hạt gạo lớn, gạo trong và dài, chịu ngập và chống đổ tốt. 2.4 Giá trị và chất lƣợng dinh dƣỡng 2.4.1 Giá trị dinh dưỡng Lúa gạo là lương thực chính của nhiều nước trên thế giới, 80% nhu cầu kalo của người dân châu Á lấy từ lúa gạo. Ở châu Âu và Nam Mỹ, lúa gạo cũng đang dần trở thành loại lương thực quan trọng. Theo FAO (2012) [27], thành phần hoá sinh trung bình của lúa gạo (% chất khô) được tính như sau: tinh bột 63%, protein 7%, dầu 2,3%, xellulose 12%, đường tan 3,6%, tro 6% và gluxit khác 2%. Ngoài thành phần hoá sinh kể trên, trong lúa gạo còn chứa 1,6-3,2% lipit và một số Vitamin như: Vitamin nhóm B (chủ yếu là B1), Vitamin PP, Vitamin E Ngoài ra, còn có nhiều chất khoáng. Protein trong lúa gạo có giá trị dinh dưỡng cao và có sự cân bằng giữa các axit amin không thay thế. Lúa gạo cung cấp lượng kalo nhiều nhất trong các loại cây ngũ cốc. Những chỉ tiêu chính được dùng để đánh giá giá trị dinh dưỡng của lúa gạo là: hàm lượng protein, amylose, chất khoáng và độ bền thể gen. Trong đó chỉ tiêu là: hàm lượng protein và amylose được quan tâm hàng đầu. Amylose của tinh bột có liên quan mật thiết đến đặc tính của cơm như: độ nở, độ cứng, độ bóng, độ mềm và độ dẻo dính. Các giống lúa nếp có hàm lượng protein cao hơn các giống lúa tẻ (trung bình đối với các giống lúa nếp khoảng 7,94%, biến động từ 7,25 - 8,56%). Điều này được giải thích bởi khả năng sinh tổng hợp và tích lũy protein trong hạt gạo nếp tốt hơn, dẫn đến hàm lượng protein trong gạo nếp cao hơn gạo tẻ. Nội nhũ của các giống lúa nếp chứa tinh bột chủ yếu ở dạng amylopectin có cấu tạo phân nhánh, còn tinh bột bình thường của gạo tẻ thì chủ yếu ở dạng amylose có cấu tạo không phân nhánh. Chính sự khác biệt trong cấu trúc của tinh bột gạo nếp và gạo tẻ đã gây ra sự khác
12 nhau về sinh tổng hợp và tích lũy protein trong hai loại gạo này (FAO, 2013) [28]. Gạo không chỉ là ngũ cốc quan trọng như một loại lương thực lớn trên toàn thế giới mà còn là nguồn các chất dinh dưỡng có giá trị của cho sức khỏe con người. Protein là một trong những yếu tố chính quyết định việc ăn uống, chế biến và chất lượng dinh dưỡng của gạo. Hàm lượng protein trong gạo nếp cao hơn so với gạo tẻ, hàm lượng protein trong gạo nếp dao động 8,6 - 9,7 % trong gạo xay và 8,1 - 8,5 % trong gạo xát. 2.4.2 Chất lượng dinh dưỡng Theo Yoshida (1981), tinh bột là thành phần chủ yếu chiếm trên 80% trong hạt gạo, nó được hình thành từ hai đại phân tử là amylose và amylopectin. Hàm lượng amylose có thể được coi là tính trạng quan trọng nhất trong phẩm chất cơm vì nó có tính chất quyết định tới việc cơm dẻo, mềm hay cứng. Hàm lượng amylose càng thấp thì cơm càng mềm. Hàm lượng tinh bột trong hạt gạo thường có mối tương quan nghịch với hàm lượng đạm. Nếu hàm lượng đạm trong hạt tăng thì hàm lượng tinh bột trong hạt gạo thường giảm. Liều lượng phân bón thích hợp không những làm giảm hàm lượng đạm mà còn làm tăng hàm lượng tinh bột ) [24]. Theo IRRI (2013), hàm lượng amylose khác nhau ở các giống lúa, hàm lượng này càng thấp thì cơm càng mềm dẻo. Các giống lúa nếp thường có hàm lượng amylose nhỏ hơn 2%, các giống lúa tẻ thường có hàm lượng amylose cao hơn. Các giống lúa thuộc nhóm Japonica có hàm lượng amylose thấp hơn các giống thuộc nhóm Indica. Hàm lượng amylose cũng tham gia quyết định tới độ bạc của hạt gạo. Những giống có hàm lượng amylopectin cao thường có cấu trúc phân tử khá lỏng lẻo vì thế đã tạo ra rất nhiều lỗ nhỏ trên bề mặt tinh bột và kết quả là toàn bộ nội nhũ có màu trắng đục, do đó hàm lượng amylose tỷ lệ nghịch với độ bạc của hạt gạo. Vì vậy, hướng nghiên cứu trong thời gian tới là phải dung hòa được cả hai yếu tố tỷ lệ trắng trong và độ dẻo [25].
13 Theo Jenning P.R (1979), trong suốt quá trình sinh trưởng phát triển của cây lúa, thời gian vào chắc ảnh hưởng lớn nhất tới hàm lượng amylose. Với các giống thuộc nhóm Japonica, nhiệt độ tăng vào thời gian này làm giảm hàm lượng amylose trong hạt gạo. Hàm lượng amylose cũng biến động trong cùng một giống lúa.Tuy nhiên, mức biến động thường chỉ dưới 2%. Các chân đất khác nhau cũng tạo ra sự biến động hàm lượng amylose trên cùng một giống lúa, lúa trồng ở vùng đất phèn thường có hàm lượng amylose cao hơn các vùng đất khác. Ngoài ra, lúa trồng ở vụ Mùa cũng cho hàm lượng amylose cao hơn vụ Xuân. Nhìn chung, sự biến động hàm lượng amylose của một số giống lúa dưới tác động của môi trường chỉ dao động trong khoảng 6%. Amylose có cấu tạo mạch thẳng không phân nhánh tạo thành từ 300 - 1.000 gốc glucose nhờ vào liên kết α-(1-4) glucose. Amylose phân bố bên trong hạt tinh bột nên tan trong nước nóng, nhưng độ nhớt không cao, dễ lắng cặn, gây phản ứng tủa với butanol và pentanol, bị nhiệt hóa hồ. Ở lúa, amylose có trọng lượng phân tử là 100 - 200 kDa, chuỗi amylose tạo thành có dạng xoắn lò xo với 6 gốc glucose trên một vòng, mỗi vòng xoắn hấp thụ một phân tử iodine vào bên trong tạo thành dung dịch màu xanh, khi đun nóng thì iodine tách ra làm mất màu xanh. Người ta đã dựa vào đặc tính này để xác định hàm lượng amylose có trong tinh bột. Mặc dù hàm lượng protein trong gạo chỉ dao động khoảng 7%, nhưng protein trong lúa gạo vẫn được coi là protein có phẩm chất cao, do nó có hàm lượng lysine cao. Với các nước coi lúa gạo là thức ăn chính thì hàm lượng protein cao trong lúa gạo là nguồn bổ sung protein cực kỳ quan trọng [26]. Theo Vũ Tiên Hoàng và cs (1988), hàm lượng protein không giống nhau ở các giống lúa. Thông thường, các giống lúa nếp có hàm lượng protein cao hơn các giống lúa tẻ. Trong thời gian qua, các nhà chọn tạo giống trên Thế giới và Việt Nam đã có nhiều thành công trong việc chọn tạo ra giống lúa có hàm lượng protein cao. Gần đây nhất, các nhà chọn tạo giống của Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã tạo ra các giống lúa P4, P6, có hàm lượng protein trên 10%. Hàm lượng protein là tính
14 trạng có cơ chế di truyền rất phức tạp và chịu tác động mạnh mẽ của môi trường. Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ không khí và nhiệt độ nước trong ruộng đến hàm lượng protein [6]. Nguyễn Trọng Khanh (2016) đã kết luận: nhiệt độ không khí hoặc nhiệt độ nước trong ruộng cao sau khi lúa trỗ sẽ làm tăng hàm lượng protein và tỷ lệ hạt chắc. Qua đó làm tăng năng suất hạt và năng suất protein trên một đơn vị diện tích. Bên cạnh đó, hàm lượng protein cũng có quan hệ chặt chẽ với lượng phân bón đặc biệt là phân đạm. Phân đạm có tác dụng tăng cường quá trình tổng hợp protein mà không thay đổi đặc tính, phẩm chất của giống [7]. 2.5 Tái sinh in vitro cây lúa Ở Việt Nam, hiện tại có trên 100 phòng thí nghiệm sử dụng kĩ thuật tái sinh và đã sản xuất gần 30 triệu cây giống vô tính riêng Đà Lạt là thành phố đi đầu trong cả nước đã sản xuất hơn 26 triệu giống và là nơi có phòng thí nghiệm tư nhân có quy mô thuộc loại hàng đầu thế giới. Bên cạnh đó, kĩ thuật không thể thiếu được trong công tác tạo giống mới như kĩ thuật chuyển gen, dung hợp, nuôi cấy tế bào đơn, tạo cây đơn bội, với nhiều mục đích như tạo cây chống stress, tích lũy các chất có hoạt tính sinh học, thích nghi với những điều kiện trồng trọt khác nhau, Nhu cầu gạo Việt Nam hiện đang giảm dần do các quốc gia khác đã và đang cơ cấu lại nền nông nghiệp để nâng cao khả năng tự cung cấp và đáp ứng phần nào nhu cầu lương thực nội địa. Đồng thời, Việt Nam đang gặp khó khăn trong việc tìm kiếm các đối tác nhập khẩu mới. Khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên Việt Nam thường xuyên khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác lúa nước [8]. Nghiên cứu tái sinh cây invitro để xác định nguồn vật liệu phục vụ nghiên cứu chuyển gen cũng đã được báo cáo. Phạm Thị Thu Hiền (2012) đã khảo sát khả năng tái sinh của 31 giống lúa địa phương khu vực miền Bắc Việt Nam cho thấy 25 giống có khả năng tạo mô sẹo cao trên 50%. Trong đó giống Kháu trặm họm và Kháu công ton có tỷ lệ mô sẹo đạt lần lượt 76,3% và 85% [5].
15 Tương tự, đối với Phạm Thị Hương và cộng sự (2014) xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lúa từ nghiên cứu khả năng tái sinh của 7 giống lúa bao gồm: BM9603, NV1, NV2, NV3, J02, Hương Cốm và BC150. Kết quả cho thấy tỷ lệ tái sinh mô sẹo trung bình từ 72 đến 98%. Trong đó, giống Hương cốm, NV1 và J02 có tỷ lệ tạo mô sẹo trên 90% (tương ứng 97%, 92% và 98%). Môi trường tạo mô sẹo thích hợp đối với giống Hương cốm và các giống japonica là môi trường muối N6 + vitamin B5 + 3 mg/l 2,4-D + 100 mg/l myoinositol + 500 mg/l L-proline + 500 mg/l L-glutamin + 300 mg/l casein hydrolysate + 30 g/l sucrose. Nghiên cứu đã xác định được khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của 3 giống Hương cốm, BC150 và J02. Hai giống J02 và Hương cốm có khả năng tái sinh cao trên môi trường muối N6 + vitamin B5 + 3 mg/l BAP + 1 mg/l α-NAA + 100 mg/l myo-inositol + 500 mg/l L-proline + 500 mg/l L-glutamin + 300 mg/l casein hydrolysate + 30 g/l sucrose [8]. Như vậy, ở Việt Nam mới chỉ có một số nghiên cứu sử dụng các phương pháp lai truyền thống nhằm chọn tạo các giống lúa phục vụ cho các tỉnh khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. Các nghiên nghiên cứu tạo giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt phục vụ cho sự phát triển kinh tế xã hội khu vực Trung du Miền núi phía Bắc Việt Nam còn khá hạn chế. Đặc biệt việc sử dụng các phương pháp hiện đại ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen để tạo giống lúa năng suất cao phù hợp với Khu vực Trung du, miền núi phía Bắc còn chưa được quan tâm nghiên cứu. Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen nhằm tạo ra các dòng giống lúa có năng suất cao có ý nghĩa rất quan trọng, góp phần xóa đói, giảm nghèo cho các đồng bào khu vực miền núi phía Bắc. Khu vực phía Bắc Việt Nam hiện nay có 3 cơ sở nghiên cứu và chọn tạo cây lúa chính đó là: Viện Cây Lương thực, Viên Di truyền Nông nghiệp, Viện KHKT Nông Lâm nghiệp miền núi phía Bắc. Hai cơ sở nghiên cứu có nguồn lực tương đối mạnh (Viện cây lương thực và Viện Di Truyền Nông nghiệp) nằm ở khu vực đồng
16 bằng sông Hồng, đối tượng nghiên cứu ứng dụng trên toàn quốc, các nghiên cứu dành riêng cho khu vực miền núi phía Bắc còn ít. Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp miền núi phía Bắc mới được thành lập, nguồn lực hạn chế, Viện cũng nghiên cứu về lĩnh vực cây lúa cho vùng miền núi nhưng cần có nhiều thời gian để có kết quả cụ thể. Khu vực phía Bắc Việt Nam hiện nay có 3 cơ sở nghiên cứu và chọn tạo cây lúa chính đó là: Viện Cây Lương thực, Viên Di truyền Nông nghiệp, Viện KHKT Nông Lâm nghiệp miền núi phía Bắc. Hai cơ sở nghiên cứu có nguồn lực tương đối mạnh (Viện cây lương thực và Viện Di Truyền Nông nghiệp) nằm ở khu vực đồng bằng sông Hồng, đối tượng nghiên cứu ứng dụng trên toàn quốc, các nghiên cứu dành riêng cho khu vực miền núi phía Bắc còn ít. Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp miền núi phía Bắc mới được thành lập, nguồn lực hạn chế, Viện cũng nghiên cứu về lĩnh vực cây lúa cho vùng miền núi nhưng cần có nhiều thời gian để có kết quả cụ thể. Một số kết quả nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam những năm gần đây: - Thu thập đánh giá nguồn vật liệu giống lúa địa phương phục vụ chọn tạo giống lúa cho vùng canh tác nhờ nước trời vùng núi Tây Bắc Việt Nam của Trường Đại học nông nghiệp 1 Hà Nội để làm vật liệu di truyền lai tạo giống lúa cho vùng núi phía Bắc Việt Nam như G4, G6, G10, G13, G14, G19, G22, G24, [10]. - Chọn giống lúa lai hai dòng Việt Lai 20 của Trường Đại học nông nghiệp 1 Hà Nội có thời gian sinh trưởng 110-115 ngày, tiềm năng năng suất 8-10 tấn/ha, chất lượng dinh dưỡng cao, thích hợp cho hệ thống canh tác 3-4 vụ/năm ở các tỉnh phía Bắc [11]. - Nghiên cứu các giống lúa phẩm chất cao phục vụ đồng bằng sông Cửu Long của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long với phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học hợp với khảo nghiệm đồng ruộng để chọn tạo giống lúa ngắn ngày, năng suất cao, chất lượng gạo tốt như OM1490, OM2517, OM3536, OM2717, OM2718, OM3405, OM4495, OM4498, OM2514 trồng rộng rãi ở vùng sản xuất ngập lũ Đồng bằng sông Cửu Long [12].
17 - Tạo giống lúa biến đổi gen giàu chất vi dinh dưỡng của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long dùng phương pháp Agrobacterium và hệ thống chọn lọc manose chuyển gen với vector pCaCar, pEun3 mang gen psy, crtI vào giống lúa IR6, MTL250, Tapei309 tạo ra các dòng lúa giàu Vitamine A giúp giảm suy dinh dưỡng của cộng đồng dân cư nghèo với gạo là thực phẩm chính [13]. - Ứng dụng kết quả điện di protein SDS - Page trong công tác chọn tạo giống lúa chất lượng cao của Trường Đại học Cần Thơ dùng phương pháp điện di protein SDS-Page tuyển chọn các giống lúa thuần như lúa Nếp Bè Tiền Giang, VĐ20, Klong Kluang, đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn giống phục vụ công tác lai tạo như tập đoàn lúa mùa ven biển đồng bằng sông Cửu Long và khảo sát quy luật di truyền ở mức độ phân tử, ví dụ như hàm lượng proglutelin, acidic glutilin, basic glutelin [14]. - Xác định gen fgr điều khiển tính trạng mùi thơm của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long [15]. - Nghiên cứu chọn giống lúa chống chịu khô hạn của Viện cây lương thực thực phẩm với phương pháp thu thập nguồn vật liệu giống lúa cạn chịu hạn địa phương và các dòng lúa cải tiến nhập nội từ IRRI với phương pháp lai hữu tính kết hợp với gây đột biến để tạo ra các tổ hợp lai có khả năng chịu hạn khá và năng suất cao như CH2, CH3,CH 133, CH5 trồng rộng rãi ở vùng Trung du miền núi phía Bắc, Trung bộ, Đông Nam Bộ và Tây nguyên [16]. - Phân tích QTL (quantitative trait loci) tính trạng chống chịu mặn của cây lúa của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long dùng phương pháp marker RFLP, microsatellite phân tích bản đồ di truyền của tổ hợp lai IR 28/Đốc Phụng xác định marker RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách di truyền 6,3cM trên nhiểm sắc thể số 8 ở giai đoạn mạ [17]. - Chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở Miền Bắc của Trường
18 Đại học Nông nghiệp Hà Nội dùng phương pháp thu thập mẫu bệnh, ứng dụng công nghệ sinh học phân lập, nuôi cấy và phân biệt gen kháng bệnh bằng PCR đã xác định 16 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzea gây bệnh khác nhau. Các dòng chỉ thị ỊRBB5 (có gen Xa5), IRBB7 (Xa7), IRBB21 (Xa2) có tính kháng đa số các chủng vi khuẩn gây bệnh [18]. - Áp dụng chỉ thị phân tử để chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long dùng phương pháp chỉ thị marker kết hợp với chọn giống truyền thống thanh lọc và đánh giá kiểu hình, kiểu gen các giống lúa mùa địa phương xác định gen kháng bạc lá Xa5, Xa13 trên nhiểm sắc thể số 5, 8 và việc liên kết các gen mục tiêu làm tăng tính kháng rộng của giống lúa [19]. - Nghiên cứu chất kích kháng và khả năng ứng dụng trong quản lý tổng hợp bệnh cháy lá trên lúa ở đồng bằng sông Cửu Long của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long đã nghiên cứu sử dụng chất kích thích tính kháng đối với bệnh cháy lá lúa như dipotassium hydrogen phosphat (K2HPO4), oxalic acid (C2H2O4), natritetraborac (Na2B4O7) dùng xử lý hạt giống trước khi sạ hàng giúp giảm bệnh cháy lá, tăng cường lực mạ, tăng số hạt chắc và năng suất [20]. - Nghiên cứu di truyền phân tử tính trạng kháng rầy nâu của cây lúa của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long dùng phương pháp PCR chọn giống kháng rầy nâu có gen Bph-10 ở nhiễm sắc thể số 12 liên kết với marker RG457 (tổ hợp lai PTB33/TN1) và RM227 (IR 64/Hoa lài) [21]. Hơn nữa, tốc độ gia tăng năng suất phân bố không đồng đều qua từng mùa vụ và khu vực. Ở các quốc gia đang phát triển, 80% gia tăng sản xuất được hoạch định dựa vào gia tăng năng suất trồng trọt và thu hoạch, chỉ có 20% gia tăng sản xuất dựa vào mở rộng địa bàn trồng trọt. Ở các quốc gia khan hiếm đất đai, tăng gia sản xuất chủ yếu dựa vào cải thiện năng suất vụ mùa. Không may thay, sản lượng các cây lương thực chính đang giảm dần qua các vụ mùa. Hơn nữa, diện tích đất trồng trọt trên thế giới đã đạt đến mức bão hòa vào những năm 1970 và hiện tại đang giảm dần
19 do tình trạng đô thị hóa. Gia tăng sản lượng mùa vụ để đảm bảo cho nguồn cung cấp. Công nghệ sinh học thực vật trong thế kỉ XXI: Triển vọng và thách thức lương thực từ đó càng trở thành một nhiệm vụ khó thực thi. Sự thay đổi khí hậu lại là một thử thách nữa cho an ninh lương thực thực phẩm. Bên cạnh đó, những phương pháp sản xuất truyền thống không còn đảm bảo việc đáp ứng nhu cầu lương thực của con người. Chính vì vậy, sự ứng dụng các biện pháp công nghệ sinh học thực vật là rất cần thiết trong việc gia tăng các sản phẩm lương thực cho xã hội. Về lâu dài, việc áp dụng rộng rãi các biện pháp (kĩ thuật) công nghệ sinh học thực vật và công nghệ sinh học nông nghiệp là điều cần thiết. Thêm vào đó những biện pháp này cũng lần lượt thay thế công nghệ y sinh nhằm giảm thiểu nguy cơ suy dinh dưỡng của con người do tình trạng thiếu lương thực như hiện nay. Trong các nghiên cứu về “Sự điều khiển những thảm họa”, một trong những chủ đề trọng tâm của những nghiên cứu xã hội và trong chương trình giảng dạy là thực phẩm và sự thiếu hụt thực phẩm là hiểm họa đỉnh điểm. Tuy nhiên, không như những căn bệnh tự nhiên, chúng ta hoàn toàn có thể chuẩn bị và phòng chống căn bệnh về thiếu hụt thực phẩm từ trước. Sự thuần hóa thực vật và động vật được tìm thấy trong tự nhiên kết hợp với những thay đổi về số lượng và chất lượng giống dần dần qua thời gian dài là những đóng góp đầu tiên của nông nghiệp. Sự thuần hóa, sau đó là sự dự trữ lương thực xảy ra đồng thời với sự phát triển của vi sinh vật. Từ đó những thực phẩm lên men truyền thống ra đời, đây có thể được xem như là những ứng dụng sớm nhất của công nghệ sinh học vào việc tạo ra những sản phẩm thực phẩm. Hình thức nông nghiệp truyền thống này hiện đang đối mặt với những hạn chế nghiêm trọng [32]. 2.6 Cây trồng tiếp nhận gen Ở nước ta mặc dù có nhiều nhóm nghiên cứu về chọn tạo giống lúa mới đi theo các hướng như tăng năng suất, tăng khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, nhưng phần lớn vẫn chủ yếu dựa vào các phương pháp chọn tạo truyền thống như: đánh giá các dòng nhập nội, lai tạo, xử lý đột biến. Cho tới nay, thông qua các
20 chương trình hợp tác với đối tác nước ngoài, một số kỹ thuật mới, hiện đại đã được ứng dụng trong công tác chọn tạo giống lúa ở Việt Nam như ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống. Phương pháp này đã hỗ trợ hiệu quả cho công tác tạo giống lúa mới tại Viện nghiên cứu lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Viện Di truyền Nông Nghiệp, Một loài cây điển hình có từ 20.000 đến 40.000 gen. Các gen này chứa thông tin chuyên biệt và cần thiết để cây hình thành lá, rễ, hoa và hạt, nẩy mầm và sinh trưởng, tiến hành quá trình quang hợp và hô hấp, sản sinh ra các loại hợp chất dự trữ và hợp chất giúp cây chống chọi lại bệnh hại và sâu bọ, giúp cây thích nghi với các điều kiện môi trường như nóng, lạnh hoặc khô hạn. Toàn bộ thông tin chứa trong DNA của cây lúa, nếu được thể hiện đầy đủ các nucleotide (ATGC) sẽ có độ dài của khoảng 40.000 trang giấy. Việc gen cây trồng được “chuyển đổi”, “biến đổi” đã xảy ra trong tự nhiên thông qua các hình thức như chọn lọc tự nhiên, thuần hóa cây trồng, lai tạo giống, ghép cây Sinh học hiện đại gần đây đã bổ sung phương thức “biến đổi gen” một cách chủ động bằng các kỹ thuật sinh học có kiểm soát. Cây trồng chuyển gen (Genetically Modified Crop - GMC) là một trong các loại sinh vật biến đổi gen. Cũng như sinh vật biến đổi gen, cây chuyển gen là một thực vật mang một hoặc nhiều gen “lạ” được đưa vào bằng công nghệ hiện đại. Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn với vật chủ. Ngoài ra, cây trồng được tiếp nhận gen nhằm mục đích có thể tạo ra các đặc tính mới như mong muốn cho cây trồng [4]: • Các đặc tính nông học: Kháng sâu bệnh, cỏ dại, bệnh hại, chống chịu các điều kiện khắc nghiệt: khô hạn, ngập úng, mặn • Các đặc tính cho chế biến: Hàm lượng dầu, tinh bột, protein cao
21 • Các đặc tính cho tiêu dùng: Chất lượng dinh dưỡng: giàu Vitamin A, E, protein, giảm các chất không mong muốn: cafein, nicotine, chất gây dị ứng, sản phẩm y học: vacxin, dược liệu Một số loại cây trồng đã được tiếp nhận gen thành công trên thế giới như: • Đậu nành: kháng thuôc diệt cỏ (RR, Bt) • Cây Alfafa: kháng thuốc diệt cỏ (RR) • Bông: kháng sâu (Bt), kháng thuốc diệt cỏ (RR) • Bắp: kháng sâu (Bt), kháng thuốc diệt cỏ (RR) • Lúa: kháng sâu (Bt) • Cải dầu: kháng thuốc diệt cỏ (RR) • Đu đủ: kháng virus • Bầu bí: kháng virus Tất cả sự vật có sự sống đều mang gen và tiếp nhận gen. Gen (Gene) là một trình tự nucleic acid đặc trưng (còn gọi là mã hóa) cho một “sản phẩm” hay một đặc tính cần thiết đối với hoạt động sống của tế bào, của sinh vật. Thành phần hóa học của gen được thể hiện dưới dạng các phân tử Acid Deoxyribo Nucleic (DNA) hay Acid Ribo Nucleic (RNA). “Ngôn ngữ” thông tin của gen có tính đồng nhất ở tất cả các loài sinh vật, nghĩa là mọi trình tự của gen (DNA) đều tạo nên từ một phân tử đường ribose, một gốc phosphate và thành phần khác nhau của 4 loại bazơ nitơ (nucleobase) là adenine (A), thymine (T), Cytosine (C) và guanine (G). Các thông tin của gen được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Có thể gọi gen của 1 sinh vật là một bản di truyền chi tiết (blueprint) hay bản đồ gen quy định việc hình thành nên đặc điểm riêng của mỗi sinh vật sống [25]. Chuyển gen là kỹ thuật đưa một gen lạ, là một đoạn DNA hay RNA không thuộc bản thân tế bào chủ vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các thể mang (plasmid) trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Khi gen lạ trong tế bào chủ hoạt động cho kết quả là tổng hợp các protein đặc trưng, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm
22 mới của sinh vật được chuyển gen. Ngày nay việc ứng dụng các giống cây trồng và vật nuôi chuyển gen càng trở nên phổ biến. Người ta ước tính hiện nay trên thế giới có khoảng hơn một nửa đậu tương và khoảng một phần ba ngũ cốc được trồng từ những hạt giống có chuyển gen [4]. Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Chuyển gen cụ thể trên từng đối tượng sinh vật có phương pháp kỹ thuật đặc trưng, gọi chung là kỹ thuật di truyền. Sinh vật biến đổi gen nói chung (Genetically Modified Organisms - GMO) là sản phẩm của công nghệ sinh học cấp độ phân tử (DNA), còn gọi là kỹ thuật di truyền. Khi sinh vật được đưa các gen lạ, xem như vật liệu di truyền mới từ sinh vật khác vào bộ gen chúng làm biến đổi một vài đặc tính hay xuất hiện đặc tính mới được gọi là sinh vật biến đổi gen hay chuyển gen. Các gen/vật liệu di truyền được chuyển có thể có nguồn gốc từ các loài không có quan hệ di truyền gần gũi với sinh vật nhận. Như gen của vi khuẩn được tách ra và chuyển vào cây trồng để tạo cây trồng biến đổi gen. Quá trình biến đổi hay chỉnh sửa diễn ra có thể ở một hay nhiều gen. Thuật ngữ sinh vật biến đổi gen còn được gọi là sinh vật biến đổi di truyền hay sinh vật công nghệ sinh học. GMOs có thể tồn tại ở dạng sống hay không sống. Để tách các sinh vật biến đổi gen tồn tại ở dạng sống ra khỏi GMOs nói chung, thuật ngữ Sinh vật biến đổi gen sống (gọi tắt là LMOs - Living Modified Organisms) đã được sử dụng. GMOs, LMOs đều là những sinh vật có mang vật liệu di truyền tái tổ hợp. Không phải GMO nào cũng là LMOs, trong khi tất cả LMOs đều là GMOs Một số thuật ngữ hay đối tượng liên quan đến biến đổi gen khác phổ biến là vi sinh vật biến đổi gen và động vật biến đổi gen [25]. Thực phẩm được tạo ra từ GMOs hay có chứa thành tố của chúng được gọi là thực phẩm biến đổi gen (Genetically Modified Foods - GMFs) hay thực phẩm công nghệ sinh học. Bao gồm các kỹ thuật sau: • Kỹ thuật siêu âm
23 • Kỹ thuật điện xung • Kỹ thuật PEG • Kỹ thuật vi tiêm • Kỹ thuật bắn gen • Kỹ thuật chuyển gen bằng sốc nhiệt • Phương pháp chuyển gen gián tiếp • Chuyển gen nhờ vi khuẩn - Agrobacterium tumefaciens • Chuyển gen nhờ virus và phage Kỹ thuât làm biến đổi gen cho cây trồng (chuyển gen) là một số trong các kỹ thuật di truyền trong sinh học, dùng để gắn một gen mới, quy định cho một đặc tính (tính trạng) có lợi (ví dụ như tính kháng bệnh hoặc sâu bọ). Kỹ thuật chính trong chuyển gen gồm có: DNA tái tổ hợp/biến nạp. Gắn DNA thành các cấu trúc tái tổ hợp mới và đưa DNA vào một sinh vật mới. Các bƣớc thông thƣờng tạo cây trồng chuyển gen [4]: • Bước 1: Thu nhận và biến đổi mã di truyền của gen mong muốn để có thể biểu hiện gen này ở thực vật. • Bước 2. Chuyển gen đã biến đổi vào tế bào thực vật mong muốn: Hai phương pháp thường được áp dụng là biến nạp thông qua chủng vi khuẩn Agrobacterium (gián tiếp) và súng bắn gen (trực tiếp). • Bước 3: Tái sinh các tế bào chứa gen mới thành cây hoàn chỉnh. • Bước 4: Kiểm tra cây chuyển gen (về sự hiện diện của gen mới và tính trạng mong muốn) ở quy mô phòng thí nghiệm, nhà kính và đồng ruộng. • Bước 5: Chuyển gen mới này vào các giống cây trồng có năng suất cao bằng phương pháp lai giống truyền thống.
24 Phần 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: 5 giống lúa trồng phổ biến khu vực miền Bắc Việt Nam (JO2, Bắc Thơm 07, LP5, Khang Dân, Bao thai). - Phạm vi nghiên cứu: Đề tài triển khai và thực hiện tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 3.2 Nội dung nghiên cứu 3.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh của một số giống lúa Việt Nam - Nghiên cứu khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam. - Nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam. - Nghiên cứu khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam. - Nghiên cứu khả năng ra rễ của một số giống lúa Việt Nam. - Nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh của một số giống lúa Việt Nam. 3.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa
25 Việt Nam 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh của một số giống lúa Việt Nam Tái sinh mẫu hạt giống là giai đoạn quan trọng để quyết định việc tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho quá trình chuyển gen tiếp theo. Nếu như bước tái sinh mẫu hạt giống không thành công thì các quy trình chuyển gen về sau thông qua vi khuẩn A. tumefaciens cũng không thể tiến hành. Để tiến hành tái sinh mẫu trước hết cần phải khử trùng mẫu hạt cho phù hợp với từng loại đối tượng cũng như từng loại mẫu khác nhau. Nguồn mẫu hạt giống lúa đưa vào nuôi cấy trong các thí nghiệm được thu thập từ ngoài tự nhiên nên chứa rất nhiều loại vi sinh vật. Vì vậy, cần lựa chọn nồng độ, thời gian chất khử trùng thích hợp để đưa vào môi trường nuôi cấy. 3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam. Hạt lúa chín sau khi đã thu thập ở ngoài tự nhiên, hạt giống được bóc vỏ cẩn thận bằng tay để tránh tổn thương phôi. Khử trùng mẫu trong box cấy bằng viên khử trùng EFFERVESCENT nồng độ 5g/200ml mước cất trong 20 phút, sau đó xử lý bằng EtOH 70% trong 1-2 phút, rửa lại qua 2-3 lần nước cất, thấm khô hạt bằng giấy thấm trong vòng 20-30 phút. Mẫu hạt sau khi thấm khô được cấy vào các đĩa petri có chứa sẵn 25 ml môi trường trên mỗi đĩa, đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng nuôi cấy 25 ± 2OC. Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường N6 bổ sung: đường glucose 30g/l + 1 mg/l 2,4D + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8. Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: số mẫu cấy, số mẫu tạo callus, tỷ lệ mẫu tạo callus được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần. Các công thức bao gồm:
26 Công thức 1: Giống lúa JO2 Công thức 2: Giống lúa Bắc thơm 07 Công thức 3: Giống lúa LP5 Công thức 4: Giống lúa Khang dân Công thức 5: Giống lúa Bao thai 3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam. Sau khi mẫu đã tạo callus, ta sử dụng nhóm các chất cytokinins để kích thích sự tái sinh tạo chồi. Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường N6 bổ sung: bổ sung 1 mg/l BAP + đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8. Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: số mẫu cấy, số mẫu tạo chồi, tỷ lệ mẫu tạo chồi được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần. Các công thức bao gồm: Công thức 1: Giống lúa JO2 Công thức 2: Giống lúa Bắc thơm 07 Công thức 3: Giống lúa LP5 Công thức 4: Giống lúa Khang dân Công thức 5: Giống lúa Bao thai 3.3.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam. Sau khi mẫu đã tạo chồi, ta sử dụng nhóm các chất để kích thích sự tái sinh tạo chồi. Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường N6 bổ sung: 1 mg/l BAP + 1 mg/l NAA đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8.
27 Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: số mẫu cấy, số mẫu không đạt, tỷ lệ mẫu tạo chồi được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần. Các công thức bao gồm: Công thức 1: Giống lúa JO2 Công thức 2: Giống lúa Bắc thơm 07 Công thức 3: Giống lúa LP5 Công thức 4: Giống lúa Khang dân Công thức 5: Giống lúa Bao thai 3.3.1.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu khả năng ra rễ của một số giống lúa Việt Nam. Sau khi mẫu đã nhân nhanh, ta sử dụng nhóm các chất để kích thích sự tái sinh tạo rễ. Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường N6 bổ sung: 1ml/l Kinetin + đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8. Bổ sung nồng độ các chất Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi số mẫu cấy, số mẫu không đạt, tỷ lệ ra rễ được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần. Các công thức bao gồm: Công thức 1: Giống lúa JO2 Công thức 2: Giống lúa Bắc thơm 07 Công thức 3: Giống lúa LP5 Công thức 4: Giống lúa Khang dân Công thức 5: Giống lúa Bao thai 3.3.1.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh một số giống lúa Việt Nam. Sau khi mẫu đã tạo rễ, ta sử dụng nhóm các chất để kích thích để tạo cây hoàn chỉnh. Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin
28 là thành phần của môi trường N6 bổ sung: đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8. Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi số mẫu cấy, số mẫu không đạt, tỷ lệ tạo cây hoàn chỉnh được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần. Các công thức bao gồm: Công thức 1: Giống lúa JO2 Công thức 2: Giống lúa Bắc thơm 07 Công thức 3: Giống lúa LP5 Công thức 4: Giống lúa Khang dân Công thức 5: Giống lúa Bao thai 3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam Các mẫu giống lúa Việt Nam được tiếp nhận gen thông qua quá trình chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens. Xác định được khả năng tiếp nhận gen được tiến hành như sau: callus tốt nhất của thí nghiệm 1 trên môi trường N6 được ngâm trong dung dịch AAM có chứa vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 trong 3 phút. Sau đó, mẫu lúa được chuyển lên môi trường N6-AS nuôi cấy 4 ngày. Sau đó, các mẫu này được chuyển sang môi trường chọn lọc N6-GA có chứa Glyfonate - ammonium 5mg/l và theo dõi trong 14 ngày. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức, 3 lần nhắc lại, 150 mẫu cho mỗi lần nhắc lại. Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi tỷ lệ % GUS+, tỷ lệ % GUS- được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần. Các công thức được bố trí như sau: Công thức 1: JO2 Công thức 2: Bắc thơm 07 Công thức 3: LP5
29 Công thức 4: Khang dân Công thức 5: Bao thai. Quy trình chung được tóm tắt như sau tực hiện như sau: Hạt giống nuôi cấy trong môi trường 2N6 - Tối 4 tuần Chuyển sang môi trường 2N6 - Tối 4 - 10 ngày Nuôi cấy hai loại tế bào vào 2N6-AS - Tối 3 - 7 ngày Nuôi chọn lọc trong môi trường 2N6 - Tối 4 tuần, 2N6- TCH (2 tuần) Chuy ể n m ô t ố t l ê n m ôi t r ư ờ ng 2N 6- T CH - T ố i 2 t u ầ n Chuy ể n và o m ôi t r ư ờ ng RG H 6 - T ố i 7 ngà y Chuy ể n s a ng nuôi s á ng 4 - 6 ngà y Chuy ể n c â y c on s a ng m ôi t r ư ờ ng ½ M S H – S á ng Chuy ể n c â y c on và o nhà kí nh đ ể t he o dõi kh ả n ă ng t i ế p nh ậ n ge n Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen lúa thông qua qúa trình tiếp nhận gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens [30] 3.4 Các phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu của các thí nghiệm được thu thập hàng tuần. Số liệu tinh được phân tích sự sai khác theo phương pháp so sánh cặp đôi 1 One-way ANOVA with posthoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) trên phần mềm Microsoft Excel. Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được tính toán theo các công thức sau:
30 Tổng số mẫu sống (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (%) = 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng mẫu thu được (mẫu) 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng chồi thu được  100% Hệ số nhân chồi = Tổng chồi nuôi cấy Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả nghiên cứu khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo callus, như tác giả Phan Thị Thu Hiền, sử dụng môi trường MS + 1 mg/l 2,4D thu được tỷ lệ tạo callus cao nhất là 78,7% [5]. Tác giả
31 Phan Thị Hương, với tỷ lệ tạo callus của JO2 là 81% trên môi trường N6 + 2 mg/l 2,4-D + 100 mg/l L-proline + 300 mg/l casein hydrolysate, Ozawa (2008) [8]. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh được hiệu quả của N6 + 1 mg/l 2,4D + 30 g/l đường glucose + 6 g/l agar, pH = 5,6 - 5,8 cho hiệu quả cao nhất lên đến 94,2%, thí nghiệm chứng tỏ khả năng hình thành callus phụ thuộc vào sự tương tác giữa chất lượng giống với nhau, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu về sau. Kết quả nghiên cứu được trình bày, thể hiện rõ ràng và chi tiết trong bảng 4.1, hình 4.1. Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam. Giống Số mẫu Thời gian Mẫu chết Mẫu tạo Tỷ lệ tạo callus trung bình tạo callus trung bình callus trung bình (hạt) trung bình (hạt) trung bình (%) (ngày) (hạt) JO2 150 5,33 8,7 141,3a 94,2 Bắc thơm 07 150 7,33 61,7 88,3b 58,87 LP5 150 28,67 130,3 19,7e 13,13 Khang dân 150 13,67 111,7 38,3d 25,53 Bao thai 150 10,67 98,3 51,7c 34,47 CV% 9,56 4,17 4,92 LSD.05 2,14 0,64 0,64 (a, b, c, d và e là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,05) Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.1 cho thấy: Với giá trị LSD0.5 = 0,64 và CV% = 4,92 thì các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý ngĩa và ở mức độ tin cậy 95%. Kết quả phân tích ANOVA (Bảng 4.1) cho thấy khả năng hình thành callus bị ảnh
32 hưởng bởi giống (bản chất di truyền). Kết quả phân tích biến sai của yếu tố giống cho thấy rằng khi F = 593,51 lớn hơn rất nhiều lần Fcrit = 3,48 chứng tỏ sự sai khác về tỷ lệ tạo callus bị ảnh hưởng mạnh bởi yếu tố bộ giống, chứng tỏ bản chất di truyền có bị ảnh hưởng đến việc tạo callus của từng giống lúa, các giống lúa có khả năng tạo callus cao từ 50% đến 95% (JO2 94,2%, Bắc thơm 07 58,87%, Bao thai 34,47%, Khang dân 25,53%, LP5 13,13%) là bản chất và có ý nghĩa thống kê.
33 B D E A
34 C Hình 4.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo callus của giống lúa JO2 (A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự tạo callus tốt giảm dần) 4.2 Kết quả nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam Từ kết qủa nghiên cứu khả năng tạo callus có kết luận ban đầutiến hành đánh giá khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam, các công thức thí nghiệm cho kết quả tạo callus thành công được chuyển sang môi trường tạo chồi N6 + 1 mg/l BAP + 30 g/l đường glucose + 6g/l agar, pH = 5,6–5,8. Bộ giống có khả năng tạo chồi trên môi trường nghiên cứu so sánh khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo J02 có khả năng tái sinh số cây tái sinh/cụm mô sẹo 16,33%, trên môi trườngtái sinh N6 bổ sung 3 mg/l BAP + 1 mg/l -NAA, Phan Thị Hương và cộng sự (2014) [8]. Việc chuyển các mẫu tốt sang môi trường có BAP cho kết quả được trình bày, thể hiện rõ ràng và chi tiết trong bảng 4.2 và hình 4.2. Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam Giống Số mẫu Thời gian Mẫu chết Mẫu tạo Tỷ lệ tạo chồi trung bình tạo chồi trung bình chồi trung bình
35 (hạt) trung bình (hạt) trung bình (%) (ngày) (hạt) JO2 150 5,17 6 144a 96 Bắc thơm 07 150 5,27 28 122b 81,33 LP5 150 11,8 61,7 88,3e 58,87 Khang dân 150 7,87 47,7 102,3d 68,2 Bao thai 150 7,07 36,7 113,3c 75,33 LSD.05 7,09 8,52 2,69 CV% 0,96 0,70 0,55 (a, b, c, d và e là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,05) Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.2 cho thấy: Với giá trị LSD0.5 = 0,55 và CV% = 2,69 thì các công thức thí nghiệm có ý ngĩa và ở mức độ tin cậy cao là 95%. Kết quả phân tích ANOVA (Bảng 4.2) cho thấy khả năng hình thành tạo chồi bị ảnh hưởng bởi giống (bản chất di truyền). Kết quả phân tích biến sai của yếu tố giống cho thấy F = 125,13 lớn hơn rất nhiều lần Fcrit = 3,48 chứng tỏ một lần nữa sự sai khác về tỷ lệ tạo chồi bị ảnh hưởng bởi yếu tố bộ giống, chứng tỏ bản chất di truyền có bị ảnh hưởng ít nhiều đến việc tạo chồi của từng giống lúa, các giống lúa có khả năng tạo chồi cao từ 50% đến 96% (JO2 96%, Bắc thơm 07 81,33%, Bao thai 75,33%, Khang dân 68,2%, LP5 58,87%) là bản chất và có ý nghĩa thống kê. Để đánh giá chất lượng chồi, dữ liệu thực nghiệm về thời gian phát triển chồi và hình thành callus trong nuôi cấy in vitro một số giống lúa Việt Nam đã chỉ ra rằng cả thời gian tạo callus và hình thành chồi đạt giá trị vào ngày chuyển mẫu sang môi trường tạo chồi. Nó có nghĩa là sự hình thành chồi tiến triển gần như song song với sự phát triển của callus.
36 B D E A
37 C Hình 4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa JO2 (A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự tạo chồi tốt giảm dần) 4.3 Kết quả nghiên khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam. Ngoài ra, một số giống lúa Việt Nam đều có khả năng tái sinh để nhân nhanh, phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu đáp ứng các tiêu chí của mục đính là hoàn thiện các quy trình nghiên cứu in vitro trên các giống lúa có khả năng tái sinh cao phục vụ cho công tác chuyển gen. Nguồn mẫu tạo chồi tiếp tục được chuyển sang môi trường N6 bổ sung: 1 mg/l BAP + 1 mg/l NAA đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8 để nhân với số lượng cao, đánh giá chất lượng bộ giống cao hơn, giảm thời gian quy trình vào mẫu nhiều lần, rút ngắn thời gian, giảm rủi ro mà vẫn có số lượng mẫu lớn phục vụ cho công tác nghiên cứu lâu dài. Kết quả của thí nghiệm dược ghi nhận, trình bày rõ ràng và chi tiết trong bảng kết qủa thí nghiệm 4.3 và hình 4.3. Bảng 4.3. Kết quả nghiên khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam. Giống Số mẫu Thời gian Mẫu chết Mẫu nhân Hệ số nhân chồi trung bình nhân chồi trung bình nhanh chồi trung bình (hạt) trung bình (hạt) trung bình (lần) (ngày) (hạt)
38 JO2 150 5,57 4 296a 1,97 Bắc thơm 07 150 7,83 24,3 275,7b 1,7 LP5 150 15,57 120,3 179,7e 1,2 Khang dân 150 10,63 95 205d 1,37 Bao thai 150 9,17 67,7 232,3c 1,55 LSD.05 7,37 7,32 1,92 CV% 1,27 0,91 0,77 (a, b, c, d và e là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,05) Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.3 cho thấy: Với giá trị LSD0.5 = 0,77 và CV% = 1,92 thì các công thức thí nghiệm có ý ngĩa và ở mức độ tin cậy cao là 95%. Kết quả phân tích ANOVA (Bảng 4.3) cho thấy khả năng hình thành số lượng lớn chồi bị ảnh hưởng bởi giống (bản chất di truyền). Kết quả phân tích biến sai của yếu tố giống cho thấy rằng F = 335,56 lớn hơn rất nhiều lần Fcrit = 3,48 chứng tỏ một lần nữa sự sai khác về tỷ lệ tạo chồi nhân nhanh bị ảnh hưởng bởi yếu tố bộ giống, chứng tỏ bản chất di truyền có bị ảnh hưởng ít nhiều đến việc tạo chồi của từng giống lúa, có giống lúa có hệ số tạo chồi nhân nhanh cao từ 0,12 đến (JO2 1,97, Bắc thơm 07 1,7, Bao thai 1,55, Khang dân 1,37, LP5 1,2) là bản chất và có ý nghĩa thống kê.
39 B D E A
40 C Hình 4.3. Kết quả nghiên khả năng nhân nhanh của giống lúa JO2. (A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự nhân nhanh chồi tốt giảm dần) 4.4 Kết quả nghiên cứu cứu khả năng ra rễ của một số giống lúa Việt Nam. Bộ rễ của một số giống lúa Việt Nam được theo dõi trên nền môi trường N6 bổ sung: 1 ml/l Kinetin + đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6 – 5,8. Bổ sung nồng độ các chất, thí nghiệm đã phần nào lý giải rõ ràng hơn về khả năng hình thành bộ rễ của giống khá tích cực khi mà chất lượng bộ rễ được ghi nhận rất tốt và khả quan. Trong khuôn khổ của đề tài này, chúng tôi nhận thấy hiệu qủa của giống trong giai đoạn hình thành rễ khi đã tạo cây nhân nhanh và chuyển sang môi trường lý tưởng để kích thích khả năng tạo cây mạnh mẽ và khỏe hơn trong quá trình nuôi cấy các mẫu rễ biệt hóa và phân hóa số lượng rễ có mối quan hệ chằng chịt nhau. Kết quả thí nghiệm được trình bày thể hiện rõ ràng, chi tiết trong bảng kết quả thí nghiệm 4.4 và hình 4.4. Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu khả năng ra rễ của một số giống lúa Việt Nam. Giống Số mẫu Thời gian Mẫu chết Mẫu tạo Tỷ lệ tạo rễ trung bình tạo rễ trung bình rễ trung bình (hạt) trung bình (hạt) trung bình (%) (ngày) (hạt)
41 JO2 150 5,4 4 146a 97,33 Bắc thơm 07 150 6,57 9,7 140,3b 93,53 LP5 150 10,83 34,3 115,7e 77,13 Khang dân 150 8,1 29 121d 80,67 Bao thai 150 7,7 23,3 126,7c 84,47 LSD.05 2,49 8,34 1,29 CV% 0,36 0,59 0,3 (a, b, c, d và e là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,05) Kết quả nghiên cứu trong bảng 4.4 cho thấy: Với giá trị LSD0.5 = 0,3 và CV% = 1,29 thì các công thức thí nghiệm có ý ngĩa và ở mức độ tin cậy cao là 95%. Kết quả phân tích ANOVA (Bảng 4.4) cho thấy khả năng hình thành tạo rễ bị ảnh hưởng ít nhiều bởi giống (bản chất di truyền). Kết quả phân tích biến sai của yếu tố giống cho thấy giá trị F = 176,87 lớn hơn rất nhiều lần Fcrit = 3,48 chứng tỏ một lần nữa sự sai khác về tỷ lệ tạo rễ bị ảnh hưởng bởi yếu tố bộ giống, chứng tỏ bản chất di truyền có bị ảnh hưởng ít nhiều đến việc tạo rễ của từng giống lúa, có giống lúa có khả năng tạo rễcao từ 77% đến 98% (JO2 97,33%, Bắc thơm 07 93,53%, Bao thai 84,47%, Khang dân 80,67%, LP5 77,13%) là bản chất và có ý nghĩa thống kê.
42 B D E A
43 C Hình 4.4. Kết quả nghiên cứu cứu khả năng ra rễ của giống lúaJO2. (A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự tạo rễ tốt giảm dần) 4.5 Kết quả nghiên cứu Nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh của một số giống lúa Việt Nam. Các giống lúa Việt Nam cho kết quả từ các nghiên cứu ban đầu được theo dõi trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh này để ghi nhận khả năng sống sót sinh trưởng và phát triển của bộ giống, chúng tôi nhận thấy phạm vi của mức độ tạo thành cây hoàn chỉnh là tương đối tốt, đáp ứng các chỉ tiêu và phù hợp với tiến độ của thí nghiệm. Một lần nữa kết quả về giống (bản chất di truyền) đã phần nào được hé lộ. Các mẫu giống lúa Việt Nam đã phát triển tạo thành bộ rễ được đặt vào môi trường N6 + 30 g/l đường glucose, 6g/l agar, pH= 5,6 - 5,8 để đánh giá khả năng thích nghi trong điều kiện chỉ bổ sung thành phần khoáng đa lượng và vi lượng, đảm bảo các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá. Kết quả được trình bày, thể hiện rõ ràng và chi tiết trong bảng thí nghiệm 4.5, hình 4.5. Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh của một số giống lúa Việt Nam. Giống Số mẫu Thời gian Mẫu chết Mẫu tạo Tỷ lệ tạo cây trung bình tạo cây trung bình cây trung bình
44 (hạt) trung bình (hạt) trung bình (%) (ngày) (hạt) JO2 150 8,47 16 134a 89,33 Bắc thơm 07 150 8,4 26 122b 82,67 LP5 150 12,4 62,3 87,7e 58,44 Khang dân 150 11,03 53,3 96,9d 64,44 Bao thai 150 11,37 39,3 110,7c 73,78 LSD.05 2,94 7,61 2,71 CV% 0,55 0,68 0,54 (a, b, c, d và e là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,05) Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.5 cho thấy: Với giá trị LSD0.5 = 0,54 và CV% = 2,71 thì các công thức thí nghiệm có ý ngĩa và ở mức độ tin cậy cao là 95%. Kết quả phân tích ANOVA (Bảng 4.5) cho thấy khả năng hình thành tạo cây hoàn chỉnh bị ảnh hưởng ít nhiều bởi giống (bản chất di truyền). Kết quả phân tích biến sai của yếu tố giống cho thấy giá trị F = 120,6 lớn hơn rất nhiều lần Fcrit = 3,48 chứng tỏ một lần nữa sự sai khác về tỷ lệ tạo cây hoàn chỉnh bị ảnh hưởng bởi yếu tố bộ giống, chứng tỏ bản chất di truyền có bị ảnh hưởng ít nhiều đến việc tạo cây hoàn chỉnh của từng giống lúa, có giống lúa có khả năng tạo cây hoàn chỉnh cao (trên 85%) nhưng cũng có giống lúa có khả năng tạo cây hoàn chỉnhcao trên 50% (JO2 89,33%, Bắc thơm 07 82,67%, Bao thai 73,78%, Khang dân 64,44%, LP5 58,44%) là bản chất và có ý nghĩa trong thống kê.
45 A B C D Hình 4.5. Kết quả nghiên cứu E khả năng tạo cây hoàn chỉnhcủa giống lúa JO2 (A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự tạo cây hoàn chỉnh tốt giảm dần)
46 4.6 Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam Đánh giá các đặc tính di truyền của cây lúa là một khâu không thể thiếu được trong các chương trình cải tiến giống lúa. Việc đánh giá đầy đủ, chính xác sẽ giúp lai tạo chọn được những thực liệu lai thích hợp. Để nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam (J02, Bắc Thơm số 7, LP5, Khang Dân, Bao Thai), các mẫu được chuyển sang môi trường N6 để theo dõi khả năng tạo cây hoàn chỉnh của bộ giống và tiến hành cho giai đoạn tạo tiếp nhận gen mong muốn, mẫu lưu giữ trong phòng thí nghiệm và trồng ngoài thực tế để đánh giá các chỉ tiêu về sau. Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam (sau 14 ngày) Giống Tổng mẫu Gus+ (%) Gus- (%) Mức độ biểu hiện JO2 150 78,3 21,7 +++ Bắc thơm 07 150 52,3 47,7 ++ LP5 150 26,7 73,3 + Khang dân 150 34,4 65,6 ++ Bao thai 150 48 52 ++ Số liệu ở bảng 4.6 chỉ ra rằng, các giống khác nhau có khả năng tiếp nhận gen khác nhau. Hiệu quả chuyển gen thông qua tỷ lệ GUS+dao động từ 26,67% đến 78,3%. So sánh hiệu quả chuyển gen có thể phân chúng thành 03 nhóm. Nhóm có mức độ biểu hiện gen mạnh nhất, hiệu quả chuyển gen cao nhất là JO2 với tỷ lệ GUS+ lên đến 78,3%. Tiếp đó là nhóm có mức biểu hiện khá là Bắc thơm 07, Bao thai và Khang dân cho hiệu quả chuyển gen đạt 52,3%, 48% và 34,4. Đứng sau là nhóm có mức biểu
47 hiện yếu là LP5 có hiệu quả chuyển gen thấp là 26,7%. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu thu được của 5 giống lúa. Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Xác định được giống lúa JO2 có khả năng tạo callus cao nhất trên nền môi trường N6 + 1 ml/l 2,4Dvới tiềm năng tạo callus tốt nhất là 94,2%, Bắc thơm 07 (58,87%), Bao thai (34,47%), Khang dân (25,53%), LP5 (13,13%). Khả năng tạo chồi của một số giống lúa là khác nhau, JO2 là 96% trên nền môi trường N6 + 1 ml/l BAP, Bắc thơm 07 (81,33%), Bao thai (75,33%), Khang dân (68,2%), LP5 (58,87%). Khả năng nhân nhanh của của một số giống lúa là khác nhau trong đó JO2 có hệ số nhân cao nhất và chất lượng tốt nhất là 1,97; Bắc thơm 07 là 1,7; Bao Thai 1,55; Khang Dân là 1,37; LP5 là 1,2 trên nền môi trường N6 + 1 ml/l BAP + 1 ml/l NAA. Khả năng tạo rễ của một số giống lúa là tương đối khác nhau, với giống lúa JO2 khả năng tạo rễ tốt nhất là 97,33%, Bắc thơm 07 (93,53%), Bao thai (84,47%), Khang Dân (80,67%), LP5 (77,13%) trên nền môi trường N6 + 1 ml/l Kinetin. Khả năng tạo cây hoàn chỉnh của một số giống lúa là khác nhau, với giống lúa JO2 khả năng tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất là 89,33%, Bắc thơm 07 (82,67%), Bao thai (73,78%), Khang Dân (58,44%), LP5 (64,44%) trên nền môi trường N6. Khả năng tiếp nhận gen Gus+ của giống lúa JO2 là 78,3%, cho mức độ biểu hiện mạnh nhất. 5.2 Kiến nghị Sẽ tiếp tục nghiên cứu thêm ảnh hưởng của các tập đoàn giống lúa Việt Nam khác đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh, góp phần đánh giá chất lượng lúa gạo Việt Nam, cung cấp các dữ liệu khoa học cơ bản cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn.
48 Sẽ tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện đề tài ở mức độ chuyên sâu hơn, đảm bảo yếu tố khoa học trong nghiên cứu, minh bạch hóa trong quá trình thực hiện. TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng Việt 1. Trần Văn Đạt (2005), “Sản uất lúa gạo trên Th gi i - Hiện trạng và khuynh hư ng phát triển trong th k 21”, nhà xuất bản Nông nghiệp. 2. Nguyễn Văn Hoan (2006), “C m nang cây lúa”, NXB Lao động, Tr. 169-180. 3. Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Trần Thị Dung, Nguyễn Văn Uyển (2001),“Tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens và khảo sát sự di truyền các tính trạng nói trên ở th hệ T1”, Công nghệ sinh học và nông nghiệp sinh thái bền vững, NXB Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. 4. Dương Hoa Xô (2011), Các nghiên cứu về cây trồng biến đổi gen, Báo cáo hội thảo chuyên đề “Cây trồng chuyển gen – u hư ng phát triển Việt Nam và th gi i”, Trung tâm Thông tin KHCN - TP.HCM. 5. Phan Thị Thu Hiền (2012),“Khả năng tạo callus và tái sinh cây của tập đoàn 31 giống lúa nương miền Bắc Việt Nam phục vụ công tác chuyển gen”, Tạp chí khoa học và Phát triển, 10(4), Tr. 567-575. 6. Vũ Tuyên Hoàng, Trương Văn Kính, Nguyễn Thị Then (1988),“K t quả ây dựng qu gen và chọn tạo giống lúa m i”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, số 11. 7. Nguyễn Trọng Khanh (2016),“Nghiên cứu chọn tạo giống lúa chất lượng tốt cho vùng đồng bằng sông Hồng”, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp.
49 8. Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thùy Linh, Nguyễn Tràng Hiếu, Ninh Thị Thảo (2014),“Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lúa”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 12 (8), Tr. 1249-1257 9. Tổng cục hải quan (2019),“số liệu sơ bộ tình hình uất nhập kh u gạo Việt Nam”, Hải quam Việt Nam. 10. Phạm Thị Kim Vàng, Nguyễn Trọng Phước, Phạm Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Lang (2018),“Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn dòng lúa kháng rầy nâu trong quần thể lai hồi giao của tổ hợp OM6162*3/OM6683”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, Số 3(88). 11. Nguyễn Đắc Khoa, Dương Minh và Phạm Văn Kim (2010),“Sản uất các sản ph m sinh học để quản lý bệnh hại lúa, cây ăn quả và rau màu theo hư ng bền vững và không gây ô nhiễm môi trường”, Trường Đại học Cần Thơ, Tạp chí Khoa học, 16b, Tr. 117-126. 12. Trương Ánh Phương (2019),“Ứng dụng chỉ thị phân tử để nghiên cứu cải thiện t lệ bạc bụng trên các giống lúa cao sản (Oryza sativa L.)”, Luận án tiến sĩ nông nghiệp. 13. Nguyễn Thị Lệ, Vũ Hồng Quảng, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thị Huế, Nguyễn Văn Hoan, Nguyễn Chí Dũng (2013),“K t quả chọn tạo giống lúa bắc thơm số 7 kháng bệnh bạc lá”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2014, tập 12, số 2, Tr. 131-138. 14. Nguyễn Thị Lang, Nguyễn Trọng Phước, Trần Bảo Toàn, Trần Minh Tài, Bùi Chí Bửu (2017),“Bản đồ di truyền QTL chống chịu mặn của cây lúa giái đoạn mạ thông qua phân tích quần thể phân ly hồi giao bằng k thuật SSR MARKER”, Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam. 15. Nguyễn Thị Hảo, Đàm Văn Hưng, Phạm Mỹ Linh, Vũ Quốc Đại, Lê Thị Hậu, Đồng Huy Giới, Vũ Văn Liết (2013),“Nhận bi t khả năng chịu hạn của một số dòng, giống lúa địa phương làm vật liệu di truyền cho chọn tạo giống lúa thích
50 ứng v i điều kiện khó khăn về nư c tư i”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, Tập 11, số 2, Tr. 145-153. 16. Dương Xuân Tú, Nguyễn Văn Khởi, Lê Thị Thanh, Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Thế Dương, Trần Thị Diệu, Phan Hữu Tôn (2014),“Sử dụng chỉ thị phân tử ADN ác định gen mùi thơm trong chọn tạo giống lúa thơm”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 12, số 4, Tr. 539-548. 17. Phạm Văn Phượng, Hứa Minh Sang, Võ Công Thành (2011),“Nghiên cứu chọn tạo các giống lúa chất lượng cao cho vùng đồng bằng sông cửu long”, Trường Đại học Cần Thơ, Tạp chí Khoa học, 19b, Tr. 136-144. 18. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (2004),“Hội nghị quốc gia về chọn tạo giống lúa”, NXB Nông Nghiệp, Tr. 164. 19. Trần Duy Dương (2016),“Hiện trạng công nghệ chọn tạo giống lúa ở Việt Nam”, Viện di truyền nông nghiệp. 20. Trần Duy Quý, Trần Duy Vương, Trần Duy Dương, Bùi Huy Thủy (2015),“Ứng dụng năng lượng hạt nhân để chọn tạo và phát triển giống lúa thuần siêu năng suất, chất lượng khá thay th giống lúa lai nhập nội”, Viện di truyền nông nghiệp. 21. Đỗ Việt Anh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Văn Tứ, Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Văn Chinh (2015),“K t quả nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu hạn cho vùng đất cạn nhờ nư c trời và vùng đất khó khăn về nư c”, Viện cây lương thực và cây thực phẩm. II. Tiếng Anh 22. Amirjani, Mohammad R (2010), “Effect of NaCl on some physiological parameter of rice”, Eur J Biol Sci, 31, pp. 6-16. 23. Khush, G.S. (1997), “Origin, dispersal, cultivation and variation of rice. Plant” Mo. Biol. 35:25-34.
51 24. Yoshida (1981), “Fundamentals of rice crop science, The International rice research institute, Los Banos, Philippines”. 25. IRRI (2013), “Rice science for a better world, IRRI Annual Report (available at ” 26. Jenning P.R, W.R Coffmen and H.E Kauffman (1979), “Rice improvement, IRRI, Los Bnaros, Philippines”, pp. 101-102 27. FAO - Food and Agriculture Ogranization (2012), “Newsletter January 2012”. Rome, p 3-4. 28. FAO – “Food and Agriculture Ogranization (2013)”, Newsletter July 2013. Rome, p 7-8. 29. Juliano Zanela Ana P. Bilck Maira Casagrande Maria V. E. Grossmann Fabio Yamashita (2018), “Oat Fiber as Reinforcement for Starch/Polyvinyl Alcohol Materials Produced by Injection Molding”. 30. Chilton, M.D., T.C. Currier, S.K. Farrand, A.J. Bendich, M.P. Gordon and E.W.Nester, (1974), “Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumours. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (71)”, 3672-3676.
PHỤ LỤC 1 MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY Bảng 1. Thành phần môi trường N6 Bottle Stock Amount to Final Solution (g/l) take concentratic Thành phần preparation (mg/l) (ml) I KNO3 (NH4)2SO4 56,6 50 28 KH2PO4 9,26 3,5 MgSO4.7H2O 8 2,9 CaCl2.2H2O 3,7 0,75 3,32 1,13 II MnSO4.4H2O 10 19,7 H3BO4 4,4 25,9 ZnSO4.7H2O 1,6 5,2 KI 1,5 4,8 0,08 III FeSO4.7H2O 2,78 10 0,1 Na2EDTA 3,72 0,1 Vitamin Myo-inositol 10 555 Glycine 200 26,6 Thiamine acid 100 3 Nicotinic acid 50 4 Pyridocine HCl 50 2,4
Sucrose 30.000 pH 5,6-5,8 Bảng 2. Thành phần môi trƣờng AAM medium Bottle Stock Amount to Final Solution (g/l) take concentratic Thành phần preparation (mg/l) (ml) I KCI 29,5 100 39,5 MgSO4 .7H2O 2,5 1 CaCl2 1,5 1 1,5 1,1 NaH2PO4.2H2 II MnSO4.4H2O 1000 1 1000 H3BO4 300 300 ZnSO4.7H2O 200 200 2,5 2,5 CuSO4.5H2O KI 75 75 25 25 Na2MoO4.2H2O 2,5 2,5 CoCl2. 6H2O III L- Glutamin 8,76 10 6 L- aspartic acid 2,66 2 L- arginine 1,74 1 Glycine 0,075 0,1 IV Myo-inositol 10 10 0,5 Nicotinic acid 50 2 Pyridocine HCl 50 0,1 Thiamine acid 1mL 0,5 Glycine 20 µl 0,02 Sucrose 68,5g
pH 5,6 - 5,8 PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU PL 2.1 Kết quả phân tích khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam. K t quả 1. K t quả phân tích thời gian tạo calluscủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single Factor 25/06/2020 11:40 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 9 3 0 Row 2 3 22 7.333333 2.333333 Row 3 3 86 28.66667 0.333333 Row 4 3 41 13.66667 2.333333 10.66667 12.66667 Row 5 3 32 2.333333 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 1148.667 4 287.1667 195.7955 1.89E-09 5.994339 Within Groups 14.66667 10 1.466667 Total 1163.333 14 CV% 9.561001 t0.05 2.16 LSD0.05 2.135865 t0.01 3.01 SD 0.988826 LSD0.01 2.976368 t0.001 4.22 LSD0.001 4.172848
K t quả 2. K t quả phân tíchmẫu ch t trong quá trình tạo calluscủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single Factor 25/06/2020 12:01 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 2.6 0.866667 0.063333 Row 2 3 18.5 6.166667 0.303333 Row 3 3 39.1 13.03333 0.083333 Row 4 3 33.5 11.16667 0.013333 Row 5 3 29.1 9.7 0.12 8.186667 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 276.9707 4 69.24267 593.5086 7.76E-12 3.47805 Within Groups 1.166667 10 0.116667 Total 278.1373 14 CV% 4.172211 t0.05 2.31 SD 0.278887 LSD0.05 0.644228 t0.01 3.36 LSD0.01 0.937059 t0.001 5.04 LSD0.001 1.405589 K t quả 3. K t quả phân tích mẫutạo calluscủa một số giống lúa Việt Nam
Anova: Single Factor 25/06/2020 12:29 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 42.4 14.13333 0.063333 Row 2 3 26.5 8.833333 0.303333 Row 3 3 5.9 1.966667 0.083333 Row 4 3 11.5 3.833333 0.013333 Row 5 3 150.5 5.166667 0.093333 6.786667 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 278.224 4 69.556 624.7545 6.01E-12 3.47805 Within Groups 1.113333 10 0.111333 Total 279.3373 14 CV% 4.9165 t0.05 2.36 SD 0.272438 LSD0.05 0.642953 t0.01 3.5 LSD0.01 0.953531 t0.001 5.41 LSD0.001 1.473887 PL 2.2 Kết quả nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam K t quả 1. K t quả phân tích thời gian tạo chồicủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single Factor 25/06/2020 12:45 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 9.5 3.166667 0.123333
Row 2 3 150.8 5.266667 0.443333 Row 3 3 35.4 11.8 0.57 Row 4 3 23.6 7.866667 0.083333 Row 5 3 21.2 7.066667 0.023333 7.033333 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 124.4667 4 31.11667 125.134 1.7E-08 3.47805 Within Groups 2.486667 10 0.248667 Total 126.9533 14 CV% 7.090022 t0.05 2.36 SD 0.4071508 LSD0.05 0.960893 t0.01 3.5 LSD0.01 1.425054 t0.001 5.41 LSD0.001 2.202726 K t quả 2. K t quả phân tíchmẫu ch t trong quá trình tạo chồicủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single Factor 25/06/2020 13:04 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 1.8 0.6 0.01 Row 2 3 8.4 2.8 0.07 Row 3 3 18.5 6.166667 0.163333 Row 4 3 14.3 4.766667 0.023333 Row 5 3 11 3.666667 0.203333 3.6 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 52.78 4 13.195 140.3723 9.7E-09 3.47805 Within Groups 0.94 10 0.094 Total 53.72 14 CV% 8.516505 t0.05 2.78 SD 0.250333 LSD0.05 0.695926 t0.01 4.6 LSD0.01 1.15015032 t0.001 8.61 LSD0.001 2.1505368 K t quả 3. K t quả phân tích mẫu tạo chồicủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single Factor 25/06/2020 13:31 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 43.2 14.4 0.01 Row 2 3 36.6 12.2 0.07 Row 3 3 26.5 8.833333 0.163333 Row 4 3 30.7 10.23333 0.023333 Row 5 3 34 11.33333 0.203333 11.4 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 52.78 4 13.195 140.3723 9.7E-09 3.47805 Within Groups 0.94 10 0.094 Total 53.72 14 CV% 2.689423 t0.05 2.2 SD 0.250333 LSD0.05 0.550733 t0.01 3.11 LSD0.01 0.778536
t0.001 4.4 LSD0.001 1.101466 PL 2.3 Kết quả phân tích khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam K t quả 1. K t quảphân tích thời gian nhân nhanhcủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single Factor 25/06/2020 13:58 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 10.7 3.566667 0.013333 Row 2 3 23.5 7.833333 0.163333 Row 3 3 46.7 150.56667 0.023333 Row 4 3 31.9 10.63333 2.173333 Row 5 3 27.5 9.166667 0.003333 9.353333 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 228.224 4 57.056 120.0337 2.09E-08 3.47805 Within Groups 4.753333 10 0.475333 Total 232.9773 14 CV% 7.371107 t0.05 2.26 SD 0.562929 LSD0.05 1.272219 t0.01 3.25 LSD0.01 1.829519 t0.001 4.78 LSD0.001 2.6908 K t quả 2. K t quả phân tích mẫu ch ttrong quá trình nhân nhanhcủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single Factor 25/06/2020 14:22
SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 1.2 0.4 0.01 Row 2 3 7.3 2.433333 0.043333 Row 3 3 36.1 12.03333 0.693333 Row 4 3 28.5 9.5 0.27 Row 5 3 20.3 6.766667 0.023333 6.226667 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 279.1893 4 69.79733 335.5641 1.32E-10 3.47805 Within Groups 2.08 10 0.208 Total 281.2693 14 CV% 7.324467 t0.05 2.45 SD 0.37238 LSD0.05 0.91233 t0.01 3.71 LSD0.01 1.3815029 t0.001 5.96 LSD0.001 2.219383 K t quả 3. K t quả phân tích mẫu nhân nhanhcủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single Factor 25/06/2020 14:47 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 43.8 14.6 0.01 Row 2 3 37.7 12.56667 0.043333 Row 3 3 8.9 2.966667 0.693333 Row 4 3 16.5 5.5 0.27 Row 5 3 24.7 8.233333 0.023333 8.773333 ANOVA
Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 279.1893 4 69.79733 335.5641 1.32E-10 3.47805 Within Groups 2.08 10 0.208 Total 281.2693 14 CV% 5.198368 t0.05 2.26 SD 0.37238 LSD0.05 0.8415078 t0.01 3.25 LSD0.01 1.210234 t0.001 4.78 LSD0.001 1.779975 PL2.4 Kết quả nghiên cứu cứu khả năng ra rễ của một số giống lúa Việt Nam. K t quả 1. Phân tích thời gianra rễcủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single Factor 25/06/2020 15:04 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 13.2 4.4 0.01 Row 2 3 19.7 6.566667 0.023333 Row 3 3 32.5 10.83333 0.103333 Row 4 3 24.3 8.1 0.01 Row 5 3 21.2 7.066667 0.023333 7.393333 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 66.24933 4 16.56233 487.1275 2.07E-11 3.47805 Within Groups 0.34 10 0.034 Total 66.58933 14 CV% 2.494016
t0.05 2.36 SD 0.1500555 LSD0.05 0.355309 t0.01 3.5 LSD0.01 0.526941 t0.001 5.41 LSD0.001 0.8145 K t quả 2. K t qảu phân tích mẫu ch t trong quá trình ra rễcủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single Factor 25/06/2020 15:28 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 1.2 0.4 0.01 Row 2 3 2.9 0.966667 0.023333 Row 3 3 10.3 3.433333 0.093333 Row 4 3 8.7 2.9 0.01 Row 5 3 7 2.333333 0.003333 2.006667 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 19.80933 4 4.952333 176.869 3.12E-09 3.47805 Within Groups 0.28 10 0.028 Total 20.08933 14 CV% 8.338804 t0.05 4.3 SD 0.136626 LSD0.05 0.587492 t0.01 9.92 LSD0.01 1.35533 t0.001 31.6 LSD0.001 4.317382 K t quả 3. K t qủa phân tích mẫu ra rễcủa một số giống lúa Việt Nam Anova: Single
Factor 25/06/2020 15:59 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 43.8 14.6 0.01 Row 2 3 42.1 14.03333 0.023333 Row 3 3 34.7 11.56667 0.093333 Row 4 3 36.3 12.1 0.01 Row 5 3 38 12.66667 0.003333 12.99333 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 19.80933 4 4.952333 176.869 3.12E-09 3.47805 Within Groups 0.28 10 0.028 Total 20.08933 14 CV% 1.28783 t0.05 2.16 SD 0.136626 LSD0.05 0.295112 t0.01 3.01 LSD0.01 0.411244 t0.001 4.22 LSD0.001 0.576562 PL 2.5 Kết quả phân tích khả năng tạo cây hoàn chỉnh của một số giống lúa Việt Nam. K t quả 1. K t quả phân tích thời gian tạo cây hoàn chỉnhcủa một số giống lúa Việt Nam. Anova: Single Factor 25/06/2020 16:19 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 25.4 8.466667 0.003333 Row 2 3 25.2 8.4 0.04
Row 3 3 37.2 12.4 0.09 Row 4 3 33.1 11.03333 0.303333 Row 5 3 34.1 11.36667 0.023333 10.33333 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 39.150333 4 9.788333 106.3949 3.75E-08 3.47805 Within Groups 0.92 10 0.092 Total 40.07333 14 CV% 2.935307 t0.05 2.23 SD 0.247656 LSD0.05 0.552272 t0.01 3.17 LSD0.01 0.785068 t0.001 4.59 LSD0.001 1.13674 K t quả 2. K t qủa phân tích mẫu ch t trong quá trình tạo cây hoàn chỉnhcủa một số giống lúa Việt Nam. Anova: Single Factor 25/06/2020 16:44 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 4.8 1.6 0.37 Row 2 3 7.8 2.6 0.01 Row 3 3 18.7 6.233333 0.023333 Row 4 3 16 5.333333 0.023333 Row 5 3 11.8 3.933333 0.023333 3.94 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 43.416 4 10.854 120.6 2.04E-08 3.47805 Within Groups 0.9 10 0.09 Total 44.316 14 CV% 7.614213 t0.05 2.78 SD 0.244949 LSD0.05 0.680958 t0.01 4.6 LSD0.01 1.126765 t0.001 8.61 LSD0.001 2.109011 K t quả 3. K t quả phân tích mẫu thành công tạo cây hoàn chỉnhcủa một số giống lúa Việt Nam. Anova: Single Factor 25/06/2020 17:22 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 1 3 40.2 13.4 0.37 Row 2 3 37.2 12.4 0.01 Row 3 3 26.3 8.766667 0.023333 Row 4 3 29 9.666667 0.023333 Row 5 3 33.2 11.06667 0.023333 11.06 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 43.416 4 10.854 120.6 2.04E-08 3.47805 Within Groups 0.9 10 0.09 Total 44.316 14 CV% 2.712477 t0.05 2.2 SD 0.244949 LSD0.05 0.538888 t0.01 3.11 LSD0.01 0.761791
t0.001 4.44 LSD0.001 1.087573 XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Ngƣời nhận xét phản biện Ngƣời hƣớng dẫn (chữ ký và ghi rõ họ tên) (chữ ký và ghi rõ họ tên) PGS.TS Dƣơng Văn Cƣờng TS. Bùi Tri Thức