Khóa luận Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa Việt Nam

82 trang thiennha21 13/04/2022 6790

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_kha_nang_tai_sinh_in_vitro_cua_mot_so_g.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NÔNG THỊ MINH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH – CNTP Khóa học : 2015 – 2019 Thái Nguyên, 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NÔNG THỊ MINH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 47 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Tiến Dũng Thái Nguyên, 2019
i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập em đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa Việt Nam”. Trong quá trình thực tập để hoàn thành khóa luận ngoài sự nỗ lực của bản thân em còn nhận được nhiều sự giúp đỡ của nhà trường cùng với sự chỉ dạy tận tình của các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Tiến Dũng đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình học tập; cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ em trong thời gian vừa qua. Mặc dù bản thân đã cố gắng hết sức nhưng do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên bản khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu xót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Nông Thị Minh
ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1. Ảnh hưởng của NaOCl 3% tới hiệu quả khử trùng mẫu 23 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa (sau 28 ngày) 24 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa (sau 28 ngày) 27 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự tái sinh chồi một số giống lúa Việt Nam (sau 28 ngày) 30
iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Quá trình phân hóa tế bào 8 Hình 2.1. Tình hình sản xuất và diện tích lúa toàn cầu năm 2017 (Nguồn: FAO, 2017) 10 Hình 3.1. Tình hình sản xuất và năng xuất lúa ở Việt Nam từ 1993 đến 2017 (Nguồn: GAIN, FAS Hoa Kỳ 2017) 13 Hình 4.1. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa (sau 28 ngày) 26 Hình 4.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa (sau 28 ngày). 29 Hình 4.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự tái sinh chồi của một số giống lúa (sau 28 ngày) 31
iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BAP: 6-Benzylaminopurine CS: Cộng sự CT: Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/c : Đối chứng Kinetin :Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS: Murashige&Skoog MT: Môi trường
v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT iv PHẦN 1 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 2 1.3. Yêu cầu của đề tài 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 3 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4 2.1. Giới thiệu về cây lúa 4 2.1.1. Vị trí phân loại 4 2.1.2. Nguồn gốc và phân bố 5 2.2. Đặc điểm sinh thái học của một số giống lúa nghiên cứu 6 2.3. Cơ sở khoa học của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào 7 2.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật 7 2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa 7 2.4. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật 9 2.4.1. Auxin 9 2.4.2. Cytokinin 9 2.5. Tình hình nghiên cứu thuộc lính vực của đề tài trên thế giới và trong nước. 10
vi 2.5.1. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới: 10 2.5.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới 12 2.5.3. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam. 13 2.5.4. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam 14 2.5.4.1. Chọn tạo giống bằng lai hữu tính 14 2.5.4.2. Chọn tạo giống bằng công nghệ tế bào 14 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 17 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 17 3.1.2. Hóa chất sử dụng và phạm vi nghiên cứu 17 3.1.3. Thiết bị sử dụng 17 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 17 3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1. Nội dung 1 : Nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy 18 3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi 19 3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi. 20 3.4. Điều kiện bố trí thí nghiệm 20 3.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá 21 3.5.2. Các chỉ tiêu đánh giá 21 PHẦN 4 23 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy 23 4.2. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa 24 4.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa 27
vii 4.4. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa Việt Nam. 30 PHẦN 5 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 5.1. Kết luận 32 5.2. Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 I. Tài liệu tiếng việt 34 II. Tài liệu Tiếng Anh 35 PHỤ LỤC
1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Lúa là một trong những cây lương thực phổ biến trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng, có lịch sử phát triển lâu đời và được trồng trên khắp các vùng sinh thái của thế giới. Ở nước ta lúa được trồng chủ yếu ở đồng bằng, nhất là hai đồng bằng châu thổ sông Hồng và sông Cửu Long. Ngoài ra, lúa được trồng thêm ở một số đồng bằng ven biển việc trồng lúa đã mang lại thu nhập cao cho nông dân đóng góp một phần không nhỏ vào việc phát triển kinh tế chung của cả nước, nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân. Lúa là loại lương thực có giá trị dinh dưỡng cao như: tinh bột, protein, lipit, vitamin, Chính vì vậy, là cây lương thực có vai trò quan trọng cho con người và gia súc. Do đó, nghiên cứu về cây lúa đã và đang được quan tâm sâu sắc của nhiều nhà nghiên cứu. Để đảm bảo an ninh lương thực trong điều kiện dân số thế giới tăng nhanh, diện tích đất trồng bị thu hẹp, hiện tượng hạn hán, lũ lụt ngày càng tăng do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu, đòi hỏi phải chọn tạo các giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng kháng với sâu, bệnh, và các điều kiện ngoại cảnh. Phương pháp chọn tạo giống truyền thống đã thu được nhiều giống có năng suất cao, sử dụng trong cuộc cách mạng xanh. Tuy nhiên, để tạo ra các giống mới bằng các phương pháp truyền thống thường mất 3-4 năm. Do đó, để tạo ra các giống lúa mới mang tính trạng mong muốn trong thời gian ngắn hơn, các phương pháp truyền thống cần kết hợp với những kết quả thu được do phương pháp Công nghệ sinh học tạo ra. Việc tạo ra các giống biến đổi di truyền có khả năng kháng sâu, bệnh và côn trùng nhờ kỹ thuật chuyển gen thực vật đang được quan tâm nghiên cứu
2 và ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất và tính chống chịu của cây trồng để đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp. Hiệu quả biến nạp gen lúa phụ thuộc vào nhiều yếu tố: phương pháp biến nạp, giống, mô sử dụng để biến nạp, thành phần môi trường nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng, và điều kiện tái sinh cây [15]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ở các giống lúa indica hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây in vitro thấp hơn ở các giống japonica [13]. Do đó, để tăng hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây cần thiết tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho các giống. Trên cơ sở ý nghĩa lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa Việt Nam” 1.2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu được các chất kích thích sinh trưởng để xác định thành phần phù hợp để tái sinh in vitro một số giống lúa Việt Nam. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định phương pháp khử trùng cho hiệu quả vô trùng cao nhất. - Xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh, tạo đa chồi. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học - Xác định được phương pháp khử trùng cho hiệu quả khử trùng của một số giống lúa Việt Nam. - Đánh giá được ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đối với một số giống lúa nghiên cứu.
3 - Góp phần xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro phù hợp với một số giống lúa Việt Nam. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu là những đánh giá về khả năng tái sinh in vitro của các giống lúa có giá trị của Việt Nam. Qua đó chọn ra được những giống có khả năng tái sinh cao, phục vụ công tác chọn tạo giống, đặc biệt là chuyển gen.
4 PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1. Giới thiệu về cây lúa Lúa là cây lương thực chính cho nhiều người và đồng thời lúa gạo cũng tham gia vào các hoạt động kinh tế quan trọng nhất thế giới. Châu Á là nơi sản xuất 90% tổng sản lượng và cũng là nơi tiêu thụ lúa gạo nhiều nhất. Khoảng 85% sản lượng gạo, 72% lúa mì và 19% ngô được con người tiêu thụ trực tiếp [20]. Lúa gạo cung cấp 21% năng lượng và 15% protein cho loài người [14]. Từ 1989 trở lại đây, Việt Nam trở thành một trong những nước xuất khẩu gạo hàng đầu trên thế giới. Năm 2001 các nước xuất khẩu gạo chính (tính theo triệu tấn), bao gồm: Thái Lan (6,4), Việt Nam (4,0), Trung Quốc (3,0), Mỹ (2,8) (USDA, 2001). 18 năm qua, cây lúa đặc biệt là ở ĐBSCL đã đóng góp cho đất nước gần 8 tỷ USD trị giá xuất khẩu và góp phần to lớn cho công cuộc đổi mới ở Việt Nam có kết quả. Tuy sản xuất với số lượng nhiều, nhưng chất lượng và giá gạo xuất khẩu của Việt Nam thường thấp hơn so với một số nước như Thái Lan, Mỹ, Úc, đặc biệt có sự chệnh lệch lớn ở loại gạo đặc sản và gạo cao cấp [3]. 2.1.1. Vị trí phân loại Lớp: Monocotyledonae Họ: Poaceae Giống: Oryza Loài: Oryza sativa L. Lúa O. sativa có 2n =24 nhiễm sắc thể, thường được phân biệt làm 3 nhóm:
5 - Lúa Indica: thường trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, có thân cao, dễ đổ ngã, nhiều chồi, lá ít xanh và cong, kháng được nhiều sâu bệnh nhiệt đới. Hạt gạo dài hoặc trung bình, có nhiều tinh bột. năng suất kém hơn lúa Japonica. - Lúa Japonica: thường được trồng ở những vùng ôn đới hoặc những nơi có độ cao trên 1000m (trên mặt biển), có thân ngắn, chống đổ ngã, lá xanh đậm, thẳng đứng, ít chồi, hạt gạo thường trồn, ngắn hoặc trung bình, dẻo khi nấu vì ít chất tinh bột. Lúa Japonica có năng suất cao. - Lúa Javanica (bulu) hay lúa Japonica nhiệt đới được trồng ở Indonexia, có đặc tính ở giữa hai loại lúa Japonica và Indica. Hình thức gần giống như lúa Japonica, có lá rộng với nhiều lông và ít chồi. Thân cứng, chắc và ít cảm quang. Hạt lúa thường có đuôi [2]. 2.1.2. Nguồn gốc và phân bố Cây lúa được canh tác từ vĩ tuyến 40° phía nam bán cầu đến vĩ tuyến 53° của bắc bán cầu, và được trồng từ mặt đất thấp hơn mặt nước biển cho đến độ cao 2000m trên mặt biển. Trên thế giới có 20 loài lúa hoang và 2 loài canh tác. Cây lúa hiện được canh tác đại trà để cung cấp lương thực cho con người trên thế giới là Oryza sativa L. ở châu Á, có năng suất cao và được ưa chuộng. Loài lúa Oryza glaberrima Steud được canh tác ít hơn ở Tây châu Phi, có năng suất và chỉ số thu hoạch thấp hơn O.sativa . Các cuộc nghiên cứu trên đất gạch bằng trấu trong các thành phố danh tiếng đổ nát ở Ấn Độ và trong vùng sông Cửu Long như Myanma, Thái lan, Lào, Campuchia và Việt Nam phát hiện rằng cây lúa trồng ở Đông Dương do phát triển theo 2 ngả: từ Lào theo sông Cửu Long đi xuống phương nam có đặc tính cây lúa Japonica nhiệt đới, một ngả khác ở Ấn Độ qua vịnh Bengal đến bờ biển Đông Dương, với đặc tính của cây lúa Indica. Vì vậy, Việt Nam
6 với khí hậu nhiệt đới nằm trong vùng đa dạng sinh thái của thảo mộc gồm cả cây lúa Indica và Japonica nhiệt đới [2]. 2.2. Đặc điểm sinh thái học của một số giống lúa nghiên cứu Giống lúa Bao thai: Nguồn gốc: Vào những năm 70, giống lúa Bao thai chính thức nhập nội vào Việt Nam, đây là giống lúa thuần có nguồn gốc từ Trung Quốc. Đặc điểm: Đặc tính là giống có tính cảm quang, chỉ gieo cấy vụ mùa, thời gian sinh trưởng từ 160 ngày đến 170 ngày. Cây cứng đẻ khỏe, cao từ 90 đến 100 cm, bông dài 19 đến 20 cm, khối lượng 1000 hạt 23 đến 25 gram, vỏ trấu màu sẫm. Phẩm chất gạo ngon, đậm cơm nhưng hơi khô, cứng. Khả năng chịu lạnh khá nên thích hợp cấy ở các tỉnh miền núi Trung du phía Bắc. Giống lúa Đoàn kết: Nguồn giống: Do nông dân tự trữ giống. Đặc điểm: Thời gian sinh trưởng 150 đến 160 ngày, năng suất 37 đến 40 tạ/ha, chiều cao cây 120 đến 130 cm, bông dài 25 đến 30 cm. Chất lượng gạo ngon và được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía bắc. Giống lúa Khang dân: Nguồn gốc: Là giống lúa thuần Trung Quốc. Đặc điểm: Ngắn ngày, vụ Đông Xuân từ 105 đến 110 ngày, vụ Hè Thu khoảng 85 đến 90 ngày. Dạng cây gọn, cứng cây, dạng hạt thon có màu vàng, năng suất bình quân đạt 60 tạ/ha. Khả năng chống chịu các điều kiện ngoại cảnh tương đối tốt, chịu rét tốt, thích ứng rộng. Giống lúa Nếp 87: Nguồn gốc: Do Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo.
7 Đặc điểm: Gieo trồng được cả hai vụ, vụ mùa và vụ xuân. Thời gian sinh trưởng vụ xuân từ 135 đến 140 ngày, vụ mùa từ 110 đến 115 ngày. Chiều cao cây từ 100 đến 110 cm, cứng cây, chống đổ, kháng bệnh đạo ôn, khô vằn, bạc lá, đẻ nhánh khỏe, bông dài. Năng suất trung bình đạt 55 đến 60 tạ/ha. 2.3. Cơ sở khoa học của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào 2.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể. Trong điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [11]. 2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa Cơ thể thực vật hình thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [11]. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:
8 Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. Hình 1.1. Quá trình phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của một cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [11].
9 2.4. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.4.1. Auxin Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid (IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là naphthalene axetic acid (NAA) và 2,4 – Diclophenoxy acid (2,4D). Các dẫn xuất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ. NAA có tác dụng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ [12]. 2.4.2. Cytokinin Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6 – Benzyl aminopurin (BA). Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hạt tính mạnh hơn nhiều kinetin. Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tê bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histone với AND, tạo điều kiện cho sự tổng hợp AND [12].
10 2.5. Tình hình nghiên cứu thuộc lính vực của đề tài trên thế giới và trong nước. 2.5.1. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới: Theo cơ quan FAO tại Rome, sản xuất lúa thế giới trong 2017 tương đối thuận lợi đạt đến 756,7 triệu tấn, 0,2 % hơn vụ 2016, mặc dù điều kiện khí hậu bất thường xảy ra tại nhiều nơi, với diện tích trồng toàn cầu khoảng 163 triệu ha. Hình 2.1. Tình hình sản xuất và diện tích lúa toàn cầu năm 2017 (Nguồn: FAO, 2017) Tại Châu Á, sản xuất lúa chiếm gần 75% tổng sản ngạch thế giới hay đạt đến 684,2 triệu tấn trong 2017, tăng 1,4 triệu tấn so với mùa kỷ lục 2016. Ở Châu Phi, sản xuất 31,1 triệu tấn, hay 1% hơn 2016 dù gặp hạn hán và ngập lụt tại vài nơi ở Burkina Faso, Gambia, Niger, Tanzania và Madagascar. Ở Nam Mỹ và Caribbean, sản xuất lúa đạt đến 28,4 triệu tấn, Brazil là nước sản xuất lúa lơn nhất của vùng, năm 2017 trúng mùa với sản lượng 12,3 triệu tấn, tăng 16% so với 2016.
11 Ở Châu Âu, sản xuất trong 2017 khoảng 3 triệu tấn lúa. Hai nước trồng lúa lớn của Châu Âu là Ý và Tây Ban Nha. Châu Úc, năm 2017 sản xuất lúa tại châu lục này tăng 195% so với 2016, Sản ngạch lúa thu hoạch đạt đến 809.000 tấn và xuất khẩu 0,3 triệu tấn gạo.
12 2.5.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới * Nghiên cứu tái sinh invitro và chuyển gen Tái sinh cây từ mô sẹo được thông báo lần đầu tiên ở loài cây ngũ cốc bởi Tamaoki và Ullstrup năm 1958. Cho đến nay mô sẹo đã được tạo ra từ các mô lúa khác nhau như lát cắt thân, hoa non, bao phấn, tiểu bào tử, đỉnh rễ, bao lá mầm, trụ dưới lá mầm, hạt trưởng thành [6], [2]. Hiện nay, hạt trưởng thành và hạt non (phôi non) được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu nhiều nhất vì các vật liệu này cho mô sẹo có tỷ lệ tái sinh cây cao hơn. Năm 1985, tái sinh cây từ phôi trưởng thành ở các giống lúa Japonica được thông báo bởi Fujimura và cộng sự. Tạo mô sẹo và tái sinh cây ở các giống lúa indica từ phôi non được thông báo bởi Koetije và cộng sự năm 1989 nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các giống lúa Indica có sự khác nhau đáng kể về phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh cây [17]. Do đó, để cải thiện hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây, cần thiết tối ưu hóa môi trường cho các giống lúa indica. Lin và Zhang (2005), Ge và Cộng sự (2006) đã tối ưu hóa môi trường và các điều kiện nuôi cấy phục vụ biến nạp gen cho hiệu quả cao ở các giống lúa indica [18]. Rachmawati và Anzai (2016) đã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường tạo mô sẹo và tái sinh cây lúa và sử dụng hệ thống tái sinh đã được tối ưu hóa này để biến nạp gen vào các giống lúa javanica. Họ cũng nhận thấy hiệu quả biến nạp phụ thuộc vào nhiều giống [19]. Lin và Zhang đã chỉ ra rằng nguyên nhân chính thu được tỷ lệ biến nạp thành công thấp ở các giống lúa indica (so với các giống lúa japonica) có thể do hiệu quả tái sinh của các giống lúa indica thấp hơn. Họ đã tìm ra được hai
13 môi trường mới để cấy chuyển, phân hóa mô sẹo và sử dụng quy trình tái sinh cây để biến nạp cho các giống lúa indica [18]. Hiei và cộng sự (2006) đã tối ưu hóa quy trình biến nạp cho các giống lúa indica bằng Agrobacterium tumerfaciens sử dụng phôi non của hạt non sau thu phấn 8-12 ngày. Quy trình đã được áp dụng để biến nạp thành công với hiệu quả cao (trên 7 dòng/phôi) cho các giống lúa indica IR8, IR24, IR26, IR36, IR54, IR64, IR72, Xin Qing Ai 1, Nan Jin 11 và Suewon 258 [16]. 2.5.3. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam. Theo báo cáo của Bộ NN&PTNT sản lượng gạo của Việt Nam niên vụ 2017/18 được dự báo sẽ đạt 44,96 triệu tấn với năng suất các vụ lúa tăng cao, dao động từ 5,78 tấn/ha trong niên vụ 2016/17 đến 5,83 tấn/ha. Diện tích gieo trồng/thu hoạch gạo dự đoán chỉ tăng nhẹ, khoảng 10 nghìn ha. Sản lượng gạo của Việt nam niên vụ 2015/16 cũng được điều chỉnh lên mức 44,13 triệu tấn lúa. Hình 3.1. Tình hình sản xuất và năng xuất lúa ở Việt Nam từ 1993 đến 2017 (Nguồn: GAIN, FAS Hoa Kỳ 2017)
14 2.5.4. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam. 2.5.4.1. Chọn tạo giống bằng lai hữu tính Lâm Quang Dụ (2000) đã nghiên cứu lai hữu tính giữa dòng VN-01 với các dòng bố khác nhau để phục vụ phát triển lúa lai hai dòng ở miền Bắc Việt Nam [5]. Nguyễn Xuân Dũng và Cộng sự (2015) nghiên cứu giống lúa nếp N31 có năng suất, chất lượng tốt và thời gian sinh trưởng ngắn ngày được chọn tạo bằng phương pháp lai hữu tính giữa tổ hợp lai hai giống nếp DT22 và giống nếp N87-2 (N98) [10]. 2.5.4.2. Chọn tạo giống bằng công nghệ tế bào * Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro Nghiêm Thị Như Vân đã nghiên cứu sự hình thành mô sẹo từ hạt phấn lúa trong điều kiện in vitro. Trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung 2mg/l 2,4D, nuôi cấy trong tối, các kết quả tác giả cho thấy quá trình hình thành mô sẹo, hình thái mô sẹo và mức độ đa bội xảy ra trong quá trình nuôi cấy [5]. Hồ Hữu Nghị, Hoàng Thị Yên (1996) nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của các dòng lúa bất dục phục vụ cho công nghệ sản xuất lúa lai. Tác giả sử dụng môi trường nền Murashige-Skoog (MS, 1962) có bổ sung acid amin (arginine, casein hydrolysate) và các phytohocmon (BAP, NAA) cho nuôi cấy tái sinh mô phân sinh và hoa non. Kết quả nghiên cứu này khẳng định vai trò cụ thể của từng yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh in vitro của mô phân sinh và hoa non lúa. [4] Bùi Bá Bổng đã sử dụng môi trường có bổ sung thêm kinetine (1mg/l) trong nuôi cấy túi phấn lúa lai thuộc tổ hợp Japonica indica. Tác giả đã cho thấy môi trường nền N6 có hiệu quả trong tạo mô sẹo, tái sinh trên
15 môi trường nền MS. Tác giả đồng thời khẳng định: “callus không thành lập nếu chỉ bổ sung 2,4D (2mg/l)”. [1] Nguyễn Mạnh Đôn nuôi cấy bao phấn lúa indica trên môi trường tạo mô sẹo (G1, Fj và L8) trong tối nhiệt độ 25 ± 10°C. Tái sinh cây trên môi trường MS trong điều kiện chiếu sang có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Tác giả bố trí thí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, số liệu được thu thập và xử lý thống kê theo chương trình SAS. Tỷ lệ tạo mô sẹo dao động từ 1,2% (giống VN23) đến 28,4% (giống VN15) [7]. * Nghiên cứu chuyển gen Nguyễn Thị Hồng Châu và Cộng sự (2003) đã thực hiện chuyển gen vào giống lúa C71 thông qua A.tumerfaciens. Nhóm tác giả đã sử dụng môi trường MS làm nền, cho tất cả các giai đoạn nuôi cấy, chuyển gen và tái sinh. Gen được chuyển gồm 3 gen là CryIA(b), CryIA(c) (gen mã hóa cho protein độc tố trừ sâu của vi khuẩn Bt và gen Xa21 – gen kháng bệnh bạc lá). Vật liệu là giống lúa C71. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo callus của giống lúa C71 khoảng 92%. Tỷ lệ biến nạp gen CryIA(c) đạt 6,6%. Tác giả cũng cho rằng khả năng tái sinh của lúa indica là thấp hơn so với japonica. Thời gian cho cây chuyển gen mất từ 4,5 đến 5 tháng [8]. Nguyễn Thị Thanh Huyền và Cộng sự (2003) đã nghiên cứu và đánh giá ảnh hưởng của mối tương tác giữa nguồn gen lúa và môi trường nuôi cấy. Tác giả sử dụng giống lúa C70 làm đối chứng để đánh giá cho tập đoàn các giống lúa địa phương, nghiên cứu này cho rằng đối với các nguồn gen trong thí nghiệm, môi trường N6 tỏ ra thích hợp cho tạo mô sẹo hơn so với L8 và MS [9]. Nhóm tác giả đã sử dụng vật liệu là bao phấn lúa, thí nghiệm bố trí theo phương pháp split-plot với giống là yếu tố chính, môi trường nuôi cấy là yếu tố phụ, số liệu được thu nhập và xử lý theo chương trình IRRISTAT 3.1 [9]
16 Ngoài kết quả tổng hợp ở trên, còn nhiều công trình khác nghiên cứu về công nghệ nuôi cấy mô tế bào lúa và chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn.
17 PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: các giống lúa Bao thai, Đoàn kết, Khang dân, Nếp 87 được thu thập tại địa phương các tỉnh miền núi phía bắc. 3.1.2. Hóa chất sử dụng và phạm vi nghiên cứu 3.1.2.1. Hóa chất sử dụng: + NaClO, cồn, tween. + Các muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường cơ bản MS. + Chất kích thích sinh trưởng: BAP, 2,4D, Kinetin + Một số chất khác 3.1.2.2. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tái sinh in vitro của một số giống lúa ở quy mô phòng thí nghiệm. 3.1.3. Thiết bị sử dụng - Tủ cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, cân phân tích, một số trang thiết bị khác của phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật. 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành - Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
18 - Thời gian tiến hành : Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 1/2019 đến tháng 5/2019. 3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Nội dung 1 : Nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy. Thí nghiệm được bố trí 4 công thức khác nhau: CT1: Hạt + NaOCl 3% ngâm trong 10 phút CT2: Hạt + NaOCl 3% ngâm trong 15 phút CT3: Hạt + NaOCl 3% ngâm trong 20 phút CT4: Hạt + NaOCl 3% ngâm trong 25 phút Cách tiến hành: Hạt lúa được tách vỏ, sau đó hạt lúa được rửa bằng cồn 70˚C trong 1 phút để sơ loại các mầm bệnh và tăng hiệu quả khử trùng. Sau đó đổ cồn và ngâm hạt vào dung dịch sodium hypochlorite 3% với thời gian khử trùng khác nhau. Cuối cùng, rửa sạch mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Sau khi khử trùng mẫu được gắp mẫu đặt lên giấy thấm đã được vô trùng, đợi khô. Cấy mẫu vào môi trường mô sẹo tạo mô sẹo có chứa 2,4D. Sau đó đưa vào phòng nuôi, tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng mắt thường). Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần và mỗi công thức 100 mẫu. Các chỉ tiêu theo dõi như sau: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết.
19 3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo. CT1(đ/c): MS + 30g/l đường + 7g/l agar CT2: MS + 1mg/l 2,4D + 30g/l đường + 7g/l agar CT3: MS + 2mg/l 2,4D + 30g/l đường + 7g/l agar CT4: MS + 3mg/l 2,4D + 30g/l đường + 7g/l agar Cách tiến hành: Khử trùng mẫu, cấy lên môi trường chứa 2,4D tương ứng với các công thức khác nhau. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100 mẫu, 3 lần nhắc lại, nồng độ 2,4D sử dụng cho một lít môi trường lần lượt là CT1: 0 mg/l; CT2: 1mg/l; CT3: 2mg/l; CT4: 3mg/l. Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu chết, hình thái mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy. 3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi CT1(đ/c): MS + 30g/l đường + 7g/l agar CT2: MS + 0,5mg/l BAP + 30g/l đường + 7g/l agar CT3: MS + 1mg/l BAP + 30g/l đường + 7g/l agar CT4: MS + 1,5mg/l BAP + 30g/l đường + 7g/l agar CT5: MS + 2mg/l BAP + 30g/l đường + 7g/l agar Cách tiến hành: Mẫu đã được vô trùng ở thí nghiệm 1, được cấy trên môi trường MS tái sinh chồi có bổ sung chất kích thích sinh trưởng BAP theo các công thức khác nhau.
20 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100 mẫu, 3 lần nhắc lại, nồng độ BAP sử dụng cho một lít môi trường lần lượt là CT1: 0mg/l; CT2: 0,5 mg/l; CT3: 1 mg/l; CT4: 1,5 mg/l; CT5: 2 mg/l. Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu bật chồi, chất lượng chồi sau 14 ngày nuôi cấy. 3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi. CT1(đ/c): MS + 30g/l đường + 7g/l agar CT2: MS + 0,5mg/l kinetin + 30g/l đường + 7g/l agar CT3: MS + 1mg/l kinetin + 30g/l đường + 7g/l agar CT4: MS + 1,5mg/l kinetin + 30g/l đường + 7g/l agar CT5: MS + 2mg/l kinetin + 30g/l đường + 7g/l agar Cách tiến hành: Mẫu đã được vô trùng ở thí nghiệm 1, được cấy trên môi trường MS tái sinh chồi có bổ sung chất kích thích sinh trưởng Kinetin theo các công thức khác nhau. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100 mẫu, 3 lần nhắc lại, nồng độ Kinetin sử dụng cho một lít môi trường lần lượt là CT1: 0mg/l; CT2: 0,5 mg/l; CT3: 1 mg/l; CT4: 1,5 mg/l; CT5: 2 mg/l. Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu bật chồi, chất lượng chồi sau 14 ngày nuôi cấy. 3.4. Điều kiện bố trí thí nghiệm Các bình nuôi cấy in vitro được đặt trong phòng nuôi cấy với các điều kiện như: - Số giờ chiếu sáng: 10h - 12h/ ngày - Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25°C ± 2°C
21 - Độ ẩm: 60- 70% - Cường độ chiếu sáng: 2000 – 2500 lux 3.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá. 3.5.1. Các chỉ tiêu theo dõi - Thời gian theo dõi: + Đối với thí nghiệm vào mẫu: tiến hành theo dõi số mẫu nhiễm, số mẫu chết, số mẫu sống. + Đối với thí nghiệm tạo mô sẹo: theo dõi số mẫu nhiễm, số mẫu chết, số mẫu tạo mô sẹo. + Đối với thí nghiệm tái sinh chồi theo dõi sau 2 tuần và 4 tuần. - Thu thập số liệu + Số mẫu vào, số mẫu bị nhiễm, số mẫu chết, số mẫu sống. + Số mẫu tạo mô sẹo + Số mẫu bật chồi. 3.5.2. Các chỉ tiêu đánh giá - Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu: ∑ Số mẫu chết Tỷ lệ mẫu chết (%) = 100% ∑ Số mẫu ∑ Số mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = 100% ∑ Số mẫu ∑ Số mẫu sống Tỷ lệ mẫu sống (%) = 100 % ∑ Số mẫu - Chỉ tiêu theo dõi mô sẹo:
22 ∑ Số mẫu tạo mô sẹo Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo = 100% ∑ Số mẫu nuôi cấy ∑ Số mẫu chết Tỷ lệ mẫu chết = 100% ∑ Số mẫu nuôi cấy - Chỉ tiêu theo dõi chồi: ∑ Số mẫu có chồi Tỷ lệ mẫu bật chồi = 100% ∑ Số mẫu nuôi cấy ∑ Số mẫu chết Tỷ lệ mẫu chết = 100% ∑ Số mẫu nuôi cấy ∑ Số chồi tạo ra Hệ số nhân chồi = ∑ Số chồi nuôi cấy 3.6. Phương pháp xử lý số liệu - Các số liệu tính toán bằng phần mềm Excel 2010. - Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính theo chương trình IRRISTART 4.0. Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (Least Significant Different) ở độ tin cậy 95%. - Kiểm tra độ biến động của các thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV.
23 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy Để đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy cần đảm bảo các chỉ tiêu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tốc độ sinh trưởng tốt. Vì vậy, mô thực vật trước khi đưa vào nuôi cấy cần phải trải qua giai đoạn khử trùng để đảm bảo yêu cầu vô trùng trong nuôi cấy mô. Chọn phương pháp khử trùng thích hợp đóng vai trò quan trọng khi bắt đầu bất kỳ một hệ thống nuôi cấy mô nào, có ý nghĩa quyết định tới hiệu quả nuôi cấy mô. Thí nghiệm này thực hiện trên 4 giống cho kết quả như sau: Bảng 4.1. Ảnh hưởng của NaOCl 3% tới hiệu quả khử trùng mẫu (sau 14 ngày) Thời gian Tổng số mẫu Tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ này Giống CT (phút) cấy (hạt) (%) mầm (%) 1 10 100 49 50 2 15 100 40 59 3 20 100 25 75 Đoàn kết 4 25 100 13 86 CV% 3,3 LSD05 4,4 1 10 100 53 47 2 15 100 43 56 3 20 100 27 73 Bao thai 4 25 100 16 83 CV% 3,9 LSD05 5,0 1 10 100 55 44 2 15 100 38 62 3 20 100 29 70 Khang dân 4 25 100 12 87 CV% 4,1 LSD05 5,3 1 10 100 58 41 2 15 100 50 49 3 20 100 37 63 Nếp 87 4 25 100 13 86 CV% 9,6 LSD05 11
24 Qua các số liệu thu được ở bảng 4.1 ta thấy: Dung dịch NaOCl có tác dụng tốt trong việc tiêu diệt nấm và vi khuẩn. Sau 1 tuần nuôi cấy tỷ lệ mẫu nhiễm dao động từ 12% đến 58%. Các công thức thí nghiệm sử dụng thời gian ngâm mẫu khác nhau cho tỷ lệ mẫu sống khác nhau. Ở nồng độ NaOCl 3% từ CT1 đến CT4 tương ứng với thời gian khử trùng từ 10 đến 25 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất ở CT4, tỷ lệ mẫu nảy mầm của giống Đoàn kết 86%; Nếp 87 86%; Khang dân 87%; Bao thai 83%. Kết luận: Cùng sử dụng một chất khử trùng NaOCl 3% nhưng thu được tỷ lệ mẫu nảy mầm, tỷ lệ nhiễm khác nhau rõ rệt ở các thời gian khử trùng khác nhau. Các công thức khử trùng cho hiệu quả mẫu nảy mầm cao nhất trong khoảng 25 phút. 4.2. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa (sau 28 ngày) Nồng độ Tổng số Tỷ lệ tạo Công Tỷ lệ mẫu Chất lượng Giống 2,4D mẫu cấy mô sẹo thức chết (%) mô sẹo (mg/l) (mẫu) (%) 1 0 100 0,0 0,0 0 2 1 100 81 18 Vàng, cứng 3 2 100 88 12 Vàng, xốp Đoàn kết 4 3 100 83 17 Vàng, xốp CV% 2,0 LSD05 1,7 1 0 100 0,0 1,6 0 2 1 100 78 21 Vàng, xốp 3 2 100 82 17 Vàng, cứng Bao thai 4 3 100 81 18 Vàng, cứng CV% 2,4 LSD05 2,9 1 0 100 0,0 2,3 0 2 1 100 86 13 Trắng cứng Khang 3 2 100 91 9,0 Vàng, cứng dân 4 3 100 85 14 Vàng, cứng CV% 2,1 LSD05 2,7 1 0 100 0,0 1,0 0 2 1 100 80 19 Vàng, xốp 3 2 100 85 14 Vàng, xốp Nếp 87 4 3 100 82 18 Vàng, cứng CV% 1,8 LSD05 2,2
25 Từ kết quả trình bày ở bảng 4.2 ta thấy khả năng tạo mô sẹo ở các giống và các công thức có sự khác biệt. Với LSD05 đạt 1,7 ở giống Đoàn kết thì các công thức có sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Mẫu cấy trên cả 3 công thức (CT2, CT3, CT4) đều cho tỷ lệ tạo mô sẹo trên 80%, công thức 1 không tạo mô sẹo. Công thức 3 (2mg/l 2,4D) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất 88%. Với LSD05 đạt 2,9 ở giống Bao thai thì các công thức có sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Mẫu cấy trên cả 3 công thức (CT2, CT3, CT4) đều cho tỷ lệ tạo mô sẹo trên 70%, công thức 1 không tạo mô sẹo. Công thức 3 (2mg/l 2,4D) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất 82%. Với LSD05 đạt 2,7 ở giống Khang dân thì các công thức có sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Mẫu cấy trên cả 3 công thức (CT2, CT3, CT4) đều cho tỷ lệ tạo mô sẹo trên 80%, công thức 1 không tạo mô sẹo. Công thức 3 (2mg/l 2,4D) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất 91%. Với LSD05 đạt 2,2 ở giống Nếp 87 thì các công thức có sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Mẫu cấy trên cả 3 công thức (CT2, CT3, CT4) đều cho tỷ lệ tạo mô sẹo trên 80%, công thức 1 không tạo mô sẹo. Công thức 3 (2mg/l 2,4D) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất 85%. Kết quả ở bẳng 4.2 sẽ là nguồn vật liệu phục vụ cho tái sinh các giống lúa ở thí nghiệm tiếp theo.
26 Hình 4.1. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa (sau 28 ngày) A- Nếp 87 (2mg/l 2,4D); B- Bao thai (1mg/l 2,4D) C- Khang dân (2mg/l 2,4D); D- Đoàn kết (2mg/l 2,4D)
27 4.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa (sau 28 ngày) Hệ số Nồng độ Tổng số Hình Công Tỷ lệ tái nhân Giống BAP mẫu cấy thái thức sinh (%) chồi (mg/l) (mô sẹo) chồi (lần) 1 0,0 100 56 1,3 2 0,5 100 71 1,4 Xanh, 3 1,0 100 75 1,3 mập Đoàn kết 4 1,5 100 62 1,3 5 2,0 100 62 1,3 CV% 3,5 LSD05 4,3 1 0,0 100 72 1,1 2 0,5 100 83 1,3 Xanh, 3 1,0 100 76 1,3 mập Bao Thai 4 1,5 100 73 1,2 5 2,0 100 69 1,1 CV% 4,1 LSD05 5,8 1 0,0 100 63 1,2 2 0,5 100 77 1,3 Xanh, 3 1,0 100 71 1,3 Khang nhỏ Dân 4 1,5 100 68 1,2 5 2,0 100 61 1,2 CV% 3,7 LSD05 4,8 1 0,0 100 68 1,2 2 0,5 100 76 1,4 3 1,0 100 73 1,3 Xanh, nhỏ Nếp 87 4 1,5 100 70 1,2 5 2,0 100 67 1,2 CV% 2,8 LSD05 3,7
28 Từ bảng 4.3 cho thấy: Tỉ lệ tái sinh ở giống Đoàn kết cao nhất là 75% (CT3), tỉ lệ này thấp nhất là ở CT1 chỉ với 56%. Trên giống Bao thai cao nhất là 83% (CT2), thấp nhất là 56% (CT2). Trên giống Khang dân cao nhất là 77% (CT2), thấp nhất là 61% (CT5). Còn trên giống Nếp 87 thì tỉ lệ này lại cao nhất là 76% (CT2), thấp nhất là 67% (CT5). Ở giống Đoàn kết, với LSD05 đạt 4,3 thì các CT1, CT2, CT3 có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các công thức còn lại có sự sai khác không có ý nghĩa. Công thức cho hệ số nhân chồi cao nhất là CT2 với hệ số là 1,4 chồi/ mẫu. Công thức còn lại đều cho hệ số tạo chồi như nhau với 1,3 chồi /mẫu. Với giá trị LSD05 đạt 5,8 ở giống Bao thai, thì các CT1, CT2, CT3 có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, công thức CT4, CT5 có sự sai khác không có ý nghĩa. Công thức 2 và 3 với hệ số nhân chồi 1,3 chồi/mẫu là công thức cho hệ số chồi cao nhất. Công thức cho hệ số nhân chồi thấp nhất là CT5 và CT1 hệ số là 1,1 chồi/mẫu. Ở giống Khang dân các công thức có sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% khi đạt LSD05 đạt 4,8. Công thức cho hệ số nhân cao nhất là CT2 và CT3 hệ số nhân đạt 1,3 chồi/mẫu. Các công thức còn lại cho hệ số nhân chồi là 1,2 chồi/mẫu. Giống nếp 87, với LSD05 đạt 3,7 thì các công thức có sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Công thức cho hệ số nhân chồi cao nhất là CT2 đạt 1,4 chồi/mẫu. Giữa các giống khác nhau cho tỉ lệ tái sinh và nhân chồi khác nhau. Giống lúa Bao thai cho tỉ lệ tái sinh cao hơn 3 giống còn lại. Tỉ lệ tái sinh thấp
29 nhất ở giống này là 69% (CT5), ở giống Nếp 87 thấp hơn là 67%, ở giống Đoàn kết và Khang dân chỉ có 56% (CT5) và 61% (CT5). BAP và Kinetin là những cytokine có tác dụng phân bào, kích thích khả năng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh, hạn chế sự hóa già của tế bào. Tuy nhiên nếu sử dụng BAP và Kinetin với hàm lượng cao quá dẫn đến ức chế quá trình sinh trưởng của mẫu – gây độc cho mẫu [2]. Vậy kết luận với nồng độ BAP 0,5mg/l thích hợp cho tái sinh và nhân chồi từ mô sẹo của một số giống lúa nghiên cứu. Hình 4.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa (sau 28 ngày). A-Đoàn kết (0,5 mg/l BAP); B- Nếp 87 (0,5 mg/l BAP) C-Khang dân (0,5 mg/l BAP); D- Bao thai (0,5 mg/l BAP)
30 4.4. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa Việt Nam. Bảng 4.4. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi một số giống lúa Việt Nam (sau 28 ngày) Nồng độ Tổng số Hệ số Công Tỷ lệ tái Hình Kinetin mẫu nhân Giống thức sinh thái chồi ( mg/l) (mô sẹo) chồi 1 0,0 100 61 1,2 2 0,5 100 75 1,3 Xanh, 3 1,0 100 74 1,2 mập 4 1,5 100 68 1,2 Đoàn kết 5 2,0 100 66 1,2 CV% 2,9 LSD05 3,7 1 0,0 100 63 1,2 2 0,5 100 76 1,3 Xanh, 3 1,0 100 74 1,3 nhỏ 4 1,5 100 69 1,3 Bao thai 5 2,0 100 60 1,3 CV% 4,7 LSD05 6,0 1 0,0 100 60 1,2 2 0,5 100 74 1,3 Xanh, 3 1,0 100 76 1,3 nhỏ Khang 4 1,5 100 69 1,2 dân 5 2,0 100 64 1,2 CV% 3,0 LSD05 3,9 1 0,0 100 56 1,3 2 0,5 100 76 1,4 Xanh, 3 1,0 100 74 1,3 nhỏ 4 1,5 100 69 1,3 Nếp 87 5 2,0 100 66 1,3 CV% 4,3 LSD05 5,5
31 Kết quả trình bày từ bảng 4.4 cho thấy, việc bổ sung Kinetin ở các nồng độ khác nhau cho khả năng tái sinh chồi khác nhau với nồng độ từ 0 – 2 mg/l Kinetin thu được tỷ lệ tái sinh từ 56% đến 76%. Ở giống Bao thai, Nếp 87 đều cho tỉ lệ tái sinh cao nhất ở CT2 với 76%. Giống Bao thai công thức cho tỉ lệ tái sinh thấp nhất là CT5 với 60%; hệ số nhân chồi thấp ở CT1 chỉ 1,2 chồi/mẫu và công thức 3 có tỉ lệ tái sinh là 74%, các công thức còn lại đều có hệ số nhân chồi là 1,3 chồi/mẫu. Còn giống Nếp 87 tỉ lệ tái sinh thấp nhất là CT1 chỉ chiếm 56%, hệ số nhân chồi cao nhất là CT2 đạt 1,4 chồi/mẫu, các công thức còn lại đều là 1,3 chồi/mẫu. Ở giống Đoàn kết cho tỉ lệ tái sinh cao nhất là 75% (CT5), 74% (CT3); hệ số nhân chồi là 1,3 chồi/mẫu (CT2), các công thức còn lại đạt 1,2 chồi/mẫu. Tỉ lệ tái sinh thấp nhất là CT1 chỉ chiếm 61%. Còn ở giống Khang dân thì tỉ lệ tái sinh cao nhất là 76% (CT3), 74% (CT2); hệ số nhân chồi ở cả 2 CT đạt 1,3 chồi/mẫu. Tỉ lệ tái sinh thấp nhất là CT1 chỉ chiếm 60%. Hình 4.3. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa (sau 28 ngày) A-Nếp 87 (0,5 mg/l Kinetin); B- Đoàn kết (0,5 mg/l Kinetin) C-Khang dân (0,5 mg/l Kinetin); D- Bao thai (0,5 mg/l Kinetin)
32 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Kết quả nghiên cứu phương pháp khử trùng, khả năng tạo mô sẹo, tái sinh ở một số giống lúa (Đoàn kết, Bao thai, Nếp 87, Khang dân) trên môi trường MS và các chất kích thích sinh trưởng như BAP, Kinetin, 2,4D chúng tôi đưa ra kết luận như sau: - Khử trùng hạt các giống lúa nghiên cứu bằng NaOCl 3% trong 25 phút cho kết quả phù hợp với tỉ lệ mẫu sạch còn sống đạt 86% (Đoàn kết), 83% (Bao thai), 87% ( Khang dân), 86% (Nếp 87) sau 14 ngày. - Chất kích thích tạo mô sẹo 2,4D ở nồng độ 2mg/l cho tỉ lệ tạo mô sẹo tốt nhất ở cả 4 giống lúa nghiên cứu đạt 88% (Đoàn kết), 82% (Bao Thai), 91% (Khang dân), 87% (Nếp 87). - Chất kích thích sinh trưởng BAP ở nồng độ 0,5 mg/l cho tỉ lệ tái sinh và hệ số nhân chồi là tốt nhất ở 3 giống lúa đạt 83%, 0,83 chồi/mẫu (Bao thai);77%, 0,77 chồi/mẫu ( Khang dân);76% , 0,76 chồi/mẫu (Nếp 87). Ở nồng độ 1 mg/l cho tỉ lệ tái sinh và hệ số nhân chồi tốt nhất ở giống Đoàn kết là 75% và 0,75 chồi/mẫu. - Chất kích thích sinh trưởng Kinetin ở nồng độ 0,5 mg/l cho tỉ lệ tái sinh và hệ số nhân chồi là tốt nhất ở 3 giống lúa đạt 75%, 0,75 chồi/mẫu (Đoàn kết); 76%, 0,76 chồi/mẫu (Bao thai, Nếp 87). Đối với giống Khang dân thì cho ti lệ tái sinh và hệ số nhân chồi tốt nhất ở nồng độ 1mg/l Kinetin đạt 76%, 0,76 chồi/mẫu.
33 5.2. Kiến nghị - Cần thử nghiệm nhiều loại hóa chất khử trùng khác để xác định loại hóa chất và nồng độ thích hợp nhất cho các giống lúa nghiên cứu. - Tiếp tục nghiên cứu thêm ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ hạt lúa. - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi của cây lúa.
34 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tiếng việt 1. Bùi Bá Bổng (1997), “ Kết quả nuôi cấy túi phấn của cây lúa ”, Tạp chí Sinh học, 19 (3): 31-34. 2. Đỗ Khắc Thịnh (2003), “ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố canh tác và yếu tố môi trường đối với năng suất và phẩm chất lúa thơm ở đồng bằng sông Cửu Long”, Luận án Tiến sĩ Nông Nghiệp, Đại học Nông Lâm TP HCM. 3. Hiệp hội Lương thực Việt Nam (2003), “Báo cáo Hội nghị tổng kết hoạt động năm 2002 và phương hướng năm 2003”. TP HCM Việt Nam. 4. Hồ Hữu Nghị, Hoàng Thị Yên (1996), “ Khả năng tái sinh in vitro và duy trì mức độ bất dục cao của một số dòng lúa bất dục”, Tạp chí Sinh Học, 18(2): 29 – 32. 5. Lâm Quang Dụ (2000) “Chọn tạo các dòng lúa bất dục đực di truyền nhân nhạy cảm nhiệt độ bằng lai hữa tính để phục vụ phát triển lúa lai hai dòng ở miền Bắc việt Nam”, Luận án Tiến sĩ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên. 6. Nghiêm Thị Như Vân (1989), “ Sự hình thành mô sẹo từ hạt phấn bên trong báo phấn lúa được nuôi cấy in vitro ”, Tạp chí Sinh học, 11(2): 27- 30. 7. Nguyễn Mạnh Đôn (2001), “ Nuôi cấy bao phấn lúa indica ”, Tạp chí khoa học và công nghệ, trang 78-80. 8. Nguyễn Thị Hồng Châu (2003), “Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumerfaciens vào giống lúa C71”, Tạp chí Công nghệ sinh học 1(2): 219 – 226.
35 9. Nguyễn Thị Thanh Huyền (2003), “ Ảnh hưởng của mối tương tác giữa nguồn ge lúa và môi trường nuôi cấy đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn lúa”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 3/2003, trang 266 – 268. 10. Nguyễn Xuân Dũng (2005), “Kết quả nghiên cứu chọn tạo giống lúa nếp thơm và ngắn ngày N31”, viện cây lương thực và Cây thực phẩm. 11. Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học, tập 4, Nxb Giáo dục. 12. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tân (2009), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục. II. Tài liệu Tiếng Anh 13. Amin M. A., Uddin M. A. and Hossain M. A. (2004). “Regeneration study some indica rice cultivars followed by Agrobacterium mediated transformation of highly regenerable cultivars”, BR-8. Journal of Biological Sciences, 4(2): 207-211 14. Eggum B. O.(1989). The nutrient value of rice in comparison with other cereals. In: Chemical aspects of grain quatity. Manila, Philippine, IRRI, p. 83-90 15. Ge X., Chu Z., Lin Y. (2006). “A tissue culture system for different germplasms of indica rice” . Plant Cell Reports, 25: 392-402. 16. Hiei Y. and Komari T. (2006) “Improved protocol for transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 85, pp. 271-28. 17. Khanna H.K., Raina S.K. (1999), “Agrobacterium mediated transformation of indica rice cultivars using binary and superbinary vectors”, Aust Journal Plant Physiology, 26: 311-324
36 18. Lin Y.J., Zhang Q. (2005), “Optimising the tisue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice”, Plant Cell reports, 23:540-547 19. Rachmawati D., Anzai H. (2006)”Studies on callus inducition, plant regeneration and transformation of javanica rice cultivars”, Plant Biotechnology, (23);521-524. 20. Sativa.O, (2005) Department of health and ageing office of the gene technology regulator. The biology and ecology of rice in Australia
PHỤ LỤC 1 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MÔ TẢ QUÁ TRÌNH TÁI SINH CÂY LÚA IN VITRO
PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU 4.1. Kết quả thí nghiệm 1 so sánh hiệu quả khử trùng bằng hóa chất NaOCl 3% với thời gian xử lý khác nhau Giống lúa Nếp 87 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLNM FILE N87 28/ 5/ 12:24 PAGE 1 TN khu trung giong lua N87 VARIATE V003 TLNM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 3 3488.25 1162.75 34.62 0.001 3 2 NL 2 48.5000 24.2500 0.72 0.527 3 * RESIDUAL 6 201.500 33.5834 * TOTAL (CORRECTED) 11 3738.25 339.841 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE N87 28/ 5/ 12:24 PAGE 2 TN khu trung giong lua N87 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLNM 1 3 41.6667 2 3 49.6667
3 3 63.0000 4 3 86.6667 SE(N= 3) 3.34581 5%LSD 6DF 11.5737 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLNM 1 4 58.2500 2 4 59.5000 3 4 63.0000 SE(N= 4) 2.89756 5%LSD 6DF 10.0231 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE N87 28/ 5/ 12:24 PAGE 3 TN khu trung giong lua N87 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLNM 12 60.250 18.435 5.7951 9.6 0.0006 0.5265
Giống lúa Khang dân BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLNM FILE KT KD 28/ 5/ 14:16 PAGE 1 TN khu trung giong lua Khang dan VARIATE V003 TLNM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 3 2843.67 947.889 129.75 0.000 3 2 NL 2 4.16667 2.08333 0.29 0.763 3 * RESIDUAL 6 43.8335 7.30558 * TOTAL (CORRECTED) 11 2891.67 262.879 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KT KD 28/ 5/ 14:16 PAGE 2 TN khu trung giong lua Khang dan MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLNM 1 3 44.6667 2 3 62.0000 3 3 70.6667 4 3 87.3333
SE(N= 3) 1.56051 5%LSD 6DF 5.39806 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLNM 1 4 65.7500 2 4 67.0000 3 4 65.7500 SE(N= 4) 1.35144 5%LSD 6DF 4.67485 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KT KD 28/ 5/ 14:16 PAGE 3 TN khu trung giong lua Khang dan F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLNM 12 66.167 16.214 2.7029 4.1 0.0000 0.7634
Giống lúa Đoàn kết BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLNM FILE ĐK 28/ 5/ 14:34 PAGE 1 TN khu trung giong lua Doan ket VARIATE V003 TLNM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 3 2316.25 772.083 157.03 0.000 3 2 NL 2 40.5000 20.2500 4.12 0.075 3 * RESIDUAL 6 29.5001 4.91668 * TOTAL (CORRECTED) 11 2386.25 216.932 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ĐK 28/ 5/ 14:34 PAGE 2 TN khu trung giong lua Doan ket MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLNM 1 3 50.3333 2 3 59.3333 3 3 75.0000 4 3 86.3333 SE(N= 3) 1.28019 5%LSD 6DF 4.42839
MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLNM 1 4 67.7500 2 4 70.0000 3 4 65.5000 SE(N= 4) 1.10868 5%LSD 6DF 3.83510 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ĐK 28/ 5/ 14:34 PAGE 3 TN khu trung giong lua Doan ket F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLNM 12 67.750 14.729 2.2174 3.3 0.0000 0.0747
Giống lúa Bao thai BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLNM FILE BT 28/ 5/ 14:48 PAGE 1 TN khu trung giong lua Bao thai VARIATE V003 TLNM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 3 2380.67 793.555 125.85 0.000 3 2 NL 2 63.5000 31.7500 5.04 0.052 3 * RESIDUAL 6 37.8336 6.30559 * TOTAL (CORRECTED) 11 2482.00 225.636 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BT 28/ 5/ 14:48 PAGE 2 TN khu trung giong lua Bao thai MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLNM 1 3 47.0000 2 3 56.6667 3 3 73.0000 4 3 83.3333 SE(N= 3) 1.44978 5%LSD 6DF 5.01502
MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLNM 1 4 61.7500 2 4 66.7500 3 4 66.5000 SE(N= 4) 1.25555 5%LSD 6DF 4.34314 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BT 28/ 5/ 14:48 PAGE 3 TN khu trung giong lua Bao thai F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLNM 12 65.000 15.021 2.5111 3.9 0.0000 0.0522
4.2. Kết quả thí nghiệm so sánh ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo. Giống lúa Đoàn kết BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTMS FILE 2,4D ĐK 28/ 5/ 15:59 PAGE 1 TN 2,4D tao mo seo voi giong lua Doan ket VARIATE V003 TLTMS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 3 15990.2 5330.08 0.000 3 2 NL 2 2.16667 1.08333 1.00 0.424 3 * RESIDUAL 6 6.50135 1.08356 * TOTAL (CORRECTED) 11 15998.9 1454.45 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 2,4D ĐK 28/ 5/ 15:59 PAGE 2 TN 2,4D tao mo seo voi giong lua Doan ket MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTMS 1 3 0.000000 2 3 81.3333 3 3 88.0000 4 3 83.0000 SE(N= 3) 0.600988
5%LSD 6DF 2.07891 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTMS 1 4 63.5000 2 4 63.2500 3 4 62.5000 SE(N= 4) 0.520471 5%LSD 6DF 1.80039 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 2,4D ĐK 28/ 5/ 15:59 PAGE 3 TN 2,4D tao mo seo voi giong lua Doan ket F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTMS 12 63.083 38.137 1.0409 1.7 0.0000 0.4238
Giống lúa Nếp 87 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTMS FILE 2,4D N87 28/ 5/ 16:33 PAGE 1 TN 2,4 tao mo seo giong lua Nep 87 VARIATE V003 TLTMS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 3 15420.7 5140.22 0.000 3 2 NL 2 3.50000 1.75000 1.34 0.331 3 * RESIDUAL 6 7.83310 1.30552 * TOTAL (CORRECTED) 11 15432.0 1402.91 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 2,4D N87 28/ 5/ 16:33 PAGE 2 TN 2,4 tao mo seo giong lua Nep 87 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTMS 1 3 0.000000 2 3 80.3333 3 3 85.6667 4 3 82.0000 SE(N= 3) 0.659676 5%LSD 6DF 2.28192
MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTMS 1 4 61.2500 2 4 62.5000 3 4 62.2500 SE(N= 4) 0.571296 5%LSD 6DF 1.97620 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 2,4D N87 28/ 5/ 16:33 PAGE 3 TN 2,4 tao mo seo giong lua Nep 87 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTMS 12 62.000 37.455 1.1426 1.8 0.0000 0.3309
Giống lúa Bao thai BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTMS FILE 2,4D BT 28/ 5/ 16:44 PAGE 1 TN 2,4D tao mo seo giong lua Bao thai VARIATE V003 TLTMS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 3 14746.7 4915.55 0.000 3 2 NL 2 1.16666 .583332 0.27 0.772 3 * RESIDUAL 6 12.8354 2.13923 * TOTAL (CORRECTED) 11 14760.7 1341.88 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 2,4D BT 28/ 5/ 16:44 PAGE 2 TN 2,4D tao mo seo giong lua Bao thai MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTMS 1 3 0.000000 2 3 78.6667 3 3 82.6667 4 3 81.3333 SE(N= 3) 0.844439
5%LSD 6DF 2.92105 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTMS 1 4 61.0000 2 4 60.7500 3 4 60.2500 SE(N= 4) 0.731305 5%LSD 6DF 2.52970 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 2,4D BT 28/ 5/ 16:44 PAGE 3 TN 2,4D tao mo seo giong lua Bao thai F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTMS 12 60.667 36.632 1.4626 2.4 0.0000 0.7719
Giống lúa Khang dân BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTMS FILE 2,4D KD 28/ 5/ 16:56 PAGE 1 TN 2,4D tao mo seo giong lua Khang dan VARIATE V003 TLTMS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 3 17384.3 5794.78 0.000 3 2 NL 2 .166666 .833329E-01 0.04 0.957 3 * RESIDUAL 6 11.1693 1.86154 * TOTAL (CORRECTED) 11 17395.7 1581.42 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 2,4D KD 28/ 5/ 16:56 PAGE 2 TN 2,4D tao mo seo giong lua Khang dan MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTMS 1 3 0.000000 2 3 86.6667 3 3 91.0000 4 3 85.6667 SE(N= 3) 0.787728 5%LSD 6DF 2.72488
MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTMS 1 4 66.0000 2 4 65.7500 3 4 65.7500 SE(N= 4) 0.682192 5%LSD 6DF 2.35981 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 2,4D KD 28/ 5/ 16:56 PAGE 3 TN 2,4D tao mo seo giong lua Khang dan F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 12) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTMS 12 65.833 39.767 1.3644 2.1 0.0000 0.9568
4.3. Kết quả thí nghiệm so sánh ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi. Giống lúa Đoàn kết BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE B ĐK 28/ 5/ 21:56 PAGE 1 TN BAP tai sinh choi giong lua Doan ket VARIATE V003 TLTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 4 679.067 169.767 31.93 0.000 3 2 NL 2 20.1333 10.0667 1.89 0.212 3 * RESIDUAL 8 42.5334 5.31667 * TOTAL (CORRECTED) 14 741.733 52.9810 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B ĐK 28/ 5/ 21:56 PAGE 2 TN BAP tai sinh choi giong lua Doan ket MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTS 1 3 56.3333 2 3 71.3333 3 3 75.0000 4 3 62.6667 5 3 62.3333
SE(N= 3) 1.33125 5%LSD 8DF 4.34107 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTS 1 5 65.8000 2 5 64.0000 3 5 66.8000 SE(N= 5) 1.03118 5%LSD 8DF 3.36258 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B ĐK 28/ 5/ 21:56 PAGE 3 TN BAP tai sinh choi giong lua Doan ket F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 15) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTS 15 65.533 7.2788 2.3058 3.5 0.0001 0.2116
Giống lúa Khang dân BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE B KD 28/ 5/ 22:15 PAGE 1 TN BAP tai sinh choi giong lua Khang dan VARIATE V003 TLTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 4 505.067 126.267 19.38 0.000 3 2 NL 2 10.5333 5.26667 0.81 0.482 3 * RESIDUAL 8 52.1334 6.51667 * TOTAL (CORRECTED) 14 567.733 40.5524 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B KD 28/ 5/ 22:15 PAGE 2 TN BAP tai sinh choi giong lua Khang dan MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTS 1 3 63.0000 2 3 77.0000 3 3 71.6667 4 3 68.0000 5 3 61.0000
SE(N= 3) 1.47385 5%LSD 8DF 4.80606 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTS 1 5 67.0000 2 5 68.4000 3 5 69.0000 SE(N= 5) 1.14164 5%LSD 8DF 3.72276 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B KD 28/ 5/ 22:15 PAGE 3 TN BAP tai sinh choi giong lua Khang dan F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 15) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTS 15 68.133 6.3681 2.5528 3.7 0.0005 0.4819
Giống lúa Nếp 87 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE B N87 29/ 5/ 12:46 PAGE 1 TN BAP tai sinh choi giong lua Nep 87 VARIATE V003 TLTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 4 187.733 46.9333 11.64 0.002 3 2 NL 2 1.73333 .866667 0.21 0.812 3 * RESIDUAL 8 32.2667 4.03333 * TOTAL (CORRECTED) 14 221.733 15.8381 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B N87 29/ 5/ 12:46 PAGE 2 TN BAP tai sinh choi giong lua Nep 87 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTS 1 3 68.0000 2 3 76.6667 3 3 73.6667 4 3 70.0000 5 3 67.3333 SE(N= 3) 1.15950 5%LSD 8DF 3.78102 MEANS FOR EFFECT NL
NL NOS TLTS 1 5 71.0000 2 5 71.6000 3 5 70.8000 SE(N= 5) 0.898146 5%LSD 8DF 2.92876 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B N87 29/ 5/ 12:46 PAGE 3 TN BAP tai sinh choi giong lua Nep 87 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 15) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTS 15 71.133 3.9797 2.0083 2.8 0.0023 0.8123
Giống lúa Bao thai BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE B BT 29/ 5/ 12:56 PAGE 1 TN BAP tai sinh choi giong lua Bao thai VARIATE V003 TLTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 4 329.067 82.2667 8.64 0.006 3 2 NL 2 1.20000 .600000 0.06 0.939 3 * RESIDUAL 8 76.1333 9.51667 * TOTAL (CORRECTED) 14 406.400 29.0286 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B BT 29/ 5/ 12:56 PAGE 2 TN BAP tai sinh choi giong lua Bao thai MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTS 1 3 72.3333 2 3 83.0000 3 3 76.0000 4 3 73.6667 5 3 69.0000 SE(N= 3) 1.78107
5%LSD 8DF 5.80790 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTS 1 5 74.6000 2 5 75.2000 3 5 74.6000 SE(N= 5) 1.37961 5%LSD 8DF 4.49878 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B BT 29/ 5/ 12:56 PAGE 3 TN BAP tai sinh choi giong lua Bao thai F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 15) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTS 15 74.800 5.3878 3.0849 4.1 0.0057 0.9391
4.4. Kết quả thí nghiệm so sánh ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi. Giống lúa Đoàn kết BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE K ĐK 29/ 5/ 13:51 PAGE 1 TN Kinetin tai sinh choi giong lua Doan ket VARIATE V003 TLTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 4 396.400 99.1000 25.09 0.000 3 2 NL 2 32.4000 16.2000 4.10 0.059 3 * RESIDUAL 8 31.6000 3.95000 * TOTAL (CORRECTED) 14 460.400 32.8857 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE K ĐK 29/ 5/ 13:51 PAGE 2 TN Kinetin tai sinh choi giong lua Doan ket MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTS 1 3 61.6667 2 3 75.6667 3 3 74.0000 4 3 68.6667 5 3 66.0000
SE(N= 3) 1.14746 5%LSD 8DF 3.74175 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTS 1 5 69.2000 2 5 71.0000 3 5 67.4000 SE(N= 5) 0.888819 5%LSD 8DF 2.89835 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE K ĐK 29/ 5/ 13:51 PAGE 3 TN Kinetin tai sinh choi giong lua Doan ket F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 15) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTS 15 69.200 5.7346 1.9875 2.9 0.0002 0.0590
Giống lúa Bao thai BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE K BT 29/ 5/ 14:10 PAGE 1 TN KInetin tai sinh choi giong lua Bao thai VARIATE V003 TLTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 4 553.733 138.433 13.40 0.002 3 2 NL 2 10.0000 5.00000 0.48 0.637 3 * RESIDUAL 8 82.6667 10.3333 * TOTAL (CORRECTED) 14 646.400 46.1714 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE K BT 29/ 5/ 14:10 PAGE 2 TN KInetin tai sinh choi giong lua Bao thai MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTS 1 3 63.6667 2 3 76.0000 3 3 74.6667 4 3 69.3333 5 3 60.3333 SE(N= 3) 1.85592 5%LSD 8DF 6.05197
MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTS 1 5 67.8000 2 5 68.8000 3 5 69.8000 SE(N= 5) 1.43759 5%LSD 8DF 4.68784 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE K BT 29/ 5/ 14:10 PAGE 3 TN KInetin tai sinh choi giong lua Bao thai F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 15) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTS 15 68.800 6.7950 3.2146 4.7 0.0015 0.6372
Giống lúa Khang dân BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE K KD 29/ 5/ 14:18 PAGE 1 TN Kinetin tai sinh choi giong lua khang dan VARIATE V003 TLTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 4 531.600 132.900 30.91 0.000 3 2 NL 2 56.9333 28.4667 6.62 0.020 3 * RESIDUAL 8 34.4000 4.30000 * TOTAL (CORRECTED) 14 622.933 44.4952 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE K KD 29/ 5/ 14:18 PAGE 2 TN Kinetin tai sinh choi giong lua khang dan MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTS 1 3 60.3333 2 3 74.3333 3 3 76.0000 4 3 69.0000 5 3 64.0000 SE(N= 3) 1.19722 5%LSD 8DF 3.90401
MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTS 1 5 68.0000 2 5 71.4000 3 5 66.8000 SE(N= 5) 0.927362 5%LSD 8DF 3.02403 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE K KD 29/ 5/ 14:18 PAGE 3 TN Kinetin tai sinh choi giong lua khang dan F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 15) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTS 15 68.733 6.6705 2.0736 3.0 0.0001 0.0203
Giống lúa Nếp 87 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE K N87 29/ 5/ 14:31 PAGE 1 TN Kinetin tai sinh choi giong lua Nep 87 VARIATE V003 TLTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === 1 CT 4 724.000 181.000 20.57 0.000 3 2 NL 2 168.933 84.4667 9.60 0.008 3 * RESIDUAL 8 70.4000 8.80000 * TOTAL (CORRECTED) 14 963.333 68.8095 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE K N87 29/ 5/ 14:31 PAGE 2 TN Kinetin tai sinh choi giong lua Nep 87 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TLTS 1 3 56.6667 2 3 76.3333 3 3 74.3333 4 3 69.6667 5 3 66.3333 SE(N= 3) 1.71270
5%LSD 8DF 5.58493 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTS 1 5 69.0000 2 5 64.4000 3 5 72.6000 SE(N= 5) 1.32665 5%LSD 8DF 4.32607 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE K N87 29/ 5/ 14:31 PAGE 3 TN Kinetin tai sinh choi giong lua Nep 87 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |NL | (N= 15) SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLTS 15 68.667 8.2951 2.9665 4.3 0.0004 0.0077
PHỤ LỤC 3 MÔI TRƯỜNG THÀNH PHẦN DUNG DỊCH MẸ Môi trường MS Macro MS (stock 20X) g/L NH4NO3 33 g KNO3 38 g MgSO4.7H2O 7,4 g KH2PO4 3,4 g Micro MS (stock 1000X) g/L MnSO4.H2O 16,7 g ZnSO4.7H2O 8,6 g H3BO3 6,2 g CuSO4.5H2O 0,025 g Na2MoO4.2H2O 0,25 g CoCl2.6H2O 0,025 g KI 0,83 g MS FeEDTA (stock 100X) g/L Na2EDTA.2H2O 3,73 g FeSO4.7H2O 2,78 g Vitamins MS (stock 100X) g/L Acide Nicotique 50 mg Pyridixine-HCl 100 mg Thiamine-HCl 100 mg Glycine 200 mg
MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM Môi trường tạo mô sẹo 1L Macro MS (stock 10X) 50 ml Micro MS (stock 1000X) 1 ml MS FeEDTA (stock 100X) 10 ml Vitamins MS (stock 100X) 10 ml Sucrose 30 g Agar 7g 2,4D 1- 3 mg pH 5,6 - 5,8 Môi trường tái sinh chồi BAP: Macro MS (stock 10X) 50ml Micro MS (stock 1000X) 1 ml MS FeEDTA (stock 100X) 10 ml Vitamins MS (stock 100X) 10 ml Sucrose 30 g Agar 7 g BAP 0,5 – 2 mg/l pH 5,6 – 5,8 Kinetin: Macro MS (stock 10X) 50 ml Micro MS (stock 1000X) 1 ml MS FeEDTA (stock 100X) 10 ml Vitamins MS (stock 100X) 10 ml
Sucrose 30 g Agar 7 g Kinetin 0,5 – 2 mg/l pH 5,6 – 5,8
Thái Nguyên, ngày . tháng .năm2019 Người nhận xét phản biện Người hướng dẫn (chữ ký và ghi rõ họ tên) (chữ ký và ghi rõ họ tên) Nguyễn Tiến Dũng