Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương pháp in vitro

64 trang thiennha21 13/04/2022 5910

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương pháp in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_kha_nang_nhan_nhanh_loai_hai_huong_lan.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN QUỐC ÂN Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH – CNTP Khoá học : 2016 - 2020 Thái Nguyên, năm 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN QUỐC ÂN Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LOÀI HÀI HƯƠNG LAN (Paphiopedilum emersonii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K48 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2016 – 2020 Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020
i LỜI CÁM ƠN Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóaluận tốt nghiệp. Đặc iệt,b em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉbảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đềtài. Em xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa CNSH & CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để em hoàn thành khóa luận này. Trong quá trình làm khóa luận không tránh khỏi những sai sót, em mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để em có thể làm tốt hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Quốc Ân
ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. 1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảotồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) 7 Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 21 Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùngcủa H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) 31 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy). 33 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan Paphiopedilum( emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy) 35 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khảnăng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 37 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZđến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 39 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễHài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 43 Biểu đồ 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng rarễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 43 Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Hài Hương Lan (sau 4 tuần nuôi cấy) 45
iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Hình ảnh về cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tại nhà lưới khoa CNSH&CNTP 10 Hình 4.2. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy) 34 Hình 4.3. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 20 ngày nuôi cấy). 37 Hình 4.4. Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 39 Hình 4.5. Hình ảnh ảnh hưởng của BA và Kinetin kết hợp với TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 42 Hình 4.6. Hình Hài Hương Lanả nh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ hoàn chỉnh (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 44 Hình 4.7. Hình ảnh ảnh hưởng của NAA kết hợp với THT đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 47
iv DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) 31 Biểu đồ 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy). 33 Biểu đồ 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năngnhân nhanh Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy) 35 Biểu đồ 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khảnăng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 38 Biểu đồ 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZđến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii (sau 4 tuần nuôi cấy) 40 Biểu đồ 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng rarễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 43 Biểu đồ 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tínhđến khả năng ra rễ cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) 45
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BA : 6-Benzyladenine CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng H2O2 : oxi già IUCN : International Union for Conservation of Nature and Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog’s, 1962 MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế ND : Nước dừa TDZ : Thidiazol THT : Than hoạt tính TN : Thí nghiệm WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980
vi MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vi Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích nghiên cứu 2 1.3 Yêu cầu của đề tài 2 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Tổng quan về lan Hài 4 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 4 2.1.2. Đặc điểm hình thái 5 2.1.3. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam và phương thức bảo tồn 6 2.2. Giới thiệu về giống Hài Hương lan 9 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố 9 2.2.2 Hình dạng 10 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 11 2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 11 2.2.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 2.2.6. Môi trường dinh dưỡng 13 2.3. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước 17
vii 2.3.1. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới 17 2.3.2. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trong nước 18 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 21 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 21 3.1.2. Hoá chất sử dụng 21 3.1.3. Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu 21 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu 22 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu 22 3.2.2. Thời gian nghiên cứu 22 3.3. Nội dung nghiên cứu 22 3.3.1.Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng của cây Hài Hương Lan. 22 3.3.2.Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi rường đến khả năng tái sinh của chồi Hài Hương Lan từ đoạn thân mang chồi ngủ. 22 3.3.3.Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinnetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan. 22 3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây Hài Hương Lan. 23 3.4. Phương pháp nghiên cứu 23 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 23 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 23 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 24 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 27 3.5.1. Thu thập số liệu 27 3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi 28 3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu 29 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30
viii 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng 30 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 32 4.3. Kết qủa nghiên cứu của một số Cytokinnetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) từ đoạn thân mang mầm ngủ. 34 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). 34 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan( Paphiopedilum emersonii) 37 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA,Kinetin kết hợp với TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 39 Kết quả thu được ở bảng 4.5 cho thấy: Giá trị CV (%): 6,7 và LSD0.5 đạt 0,63; các thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ không tin cậy 95%. Cho thấy rằng tất cả các công thức có bổ sung nồng độ BA 2,0 mg/l; Kinetin 1,0 mg/l; TDZ 0- 3,0mg/l vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tới việc nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). 40 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng rarễ của cây . 42 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của Hài Hương Lan. 42 4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính (THT) đến khả năng ra rễ Hài Hương Lan . 45 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1. Kết luận 48 5.2. Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Họ Lan, hay họ Phong lan, (danh pháp khoa học: Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc bộ Măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm Họ Orchideceae là một trong những họ lớn nhất của thực vật và có các thành viên mọc trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực; có cây hoa lan sống dưới mặt đất và chỉ nở hoa trên mặt đất cũng như có cây hoa lan sống tại vùng cao nguyên của dãy núi Himalaya; hoa lan có thể tìm thấy tại các vùng có khí hậu nhiệt đới như trong rừng già của Brasil đến các vùng có tuyết phủ trong mùa đông như tại bình nguyên của Manitoba, Canada. Các loài lan chủ yếu mọc trên cây cao, sống biểu sinh lâu năm. Chúng được gọi chung là phong lan. Bên cạnh đó cũng có các loàiọ m c trong đất, tức là địa lan và có một số loài mọc trên đá tức thạch lan. Họ Orchidaceae phân bổ rộng khắp thế giới, gần như có thể có mặt trong mọi môi trường sống, ngoại trừ các sa mạc và sông băng. Phần lớn các loài được tìm thấy trong khu vực nhiệt đới, chủ yếu là châu Á, Nam Mỹ và Trung Mỹ. Chúng cũng được tìm thấy tại các vĩ độ cao hơn vòng Bắc cực, ở miền nam Patagonia và thậm chí trên đảo Macquarie, gần với châu Nam Cực. Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) có khu phân bố hẹp tại một số nơi như Thái Nguyên và Vĩnh Phúc với số lượng cá thể rất ít, trên các vách núi dựng đứng và loài cây làm cảnh rất quý vì hoa có màu sắc đẹp dịu dàng với cấu tạo môi có hạt độc đáo,cánh hoa hình bầu dục rộng - gần tròn, ở gốc có lông dài và chấm tía, mép bên đôi khi uốn vào trong; môi màu vàng hay da cam nhạt, gân hình cầu với các chấm to và trắng đục như hạt ngọc lại rất hiếm có giá trị thẩm mỹ cao nên rất được thế giới ưa chuộng dẫn đến tình trạng thu thập và xuất khẩu hài hương lan khiến chúng đang đứng trên bờ vực của sự tuyệt chủng ngoài thiên nhiên do việc thu mẫu ồ ạt nhằm mục đích thương mại. Hiện nay, trong quá trình phát triển kinh tế xã hội, nhiều loài lan quý hiếm đang bị đe doạ tuyệt chủng. Trong đó phải kể đến hài Hương Lan là một trong các
2 loài lan Hài quý của Việt Nam đang bị đe doạ nghiêm trọng. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy in vitro tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều cao và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn. Bởi vậy,phương pháp nhân giống hài vô tínhin vitro Hài Hương Lan.đã và đang mở ra triển vọng tốt cho việc bảo tồn các loài thực vật quý hiếm và phát triển cácgiống lan quy hiếm này. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương pháp in vitro” 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống Hài Hương Lan từ đoạn thân non mang chồi ngủ bằng phương pháp in vitro. 1.3 Yêu cầu của đề tài - Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. - Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồiH ài Hương Lan. - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokiinine đến khả năng nhân nhanh Hài Hương Lan. - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Hài Hương Lan. 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sungvào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn. - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này.
3 - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới về nhân giống cây Hài Hương lan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹthuật nuôi cấy mô. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương phán nuôi cấyin vitro, tạo ra số lượng giống hài Hương Lan góp phần bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về lan Hài 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1. Phân loại Lan Hài (Paphiopedium) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá chồi (Monocotyledoneae), nghành hạt kín (Angiospermatophyta). Lan Hài là một nhóm rất đặc trưng trong họ lan. Chúng dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa đặc biệt khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống như một chiếc Hài, nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ ngoài đặc sắc có thể dễ dàng phân biệt với các loại lan khác. Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chilà: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ. - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon. Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộcchi Paphipedilum, thuộc tông, Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành( Liliidae), lớp một lá mầm( Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1],[13]. 2.1.1.2. Nguồn gốc Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếuở Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạn chế. Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ cáctổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong
5 gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ởvòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoácủahọ Lan. Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhómlancó ba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộctông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1],[13]. 2.1.2. Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt,đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn [1] - Lá: thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ. Mặtdướilá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1]. - Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũng có loài cócụm hoa mang hai hoa, xong rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn. - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và bacánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổibật với các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị tríthấp
6 hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài [1]. Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặtngoài. Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cộtnhị- nhuỵ. Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và haibên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này.Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1]. - Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Quả mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả thường chín trong điềukiên tự nhiên sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1]. - Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1]. 2.1.3. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam và phương thức bảo tồn Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao, được sưu tầm và tìm kiếm rất nhiều. Với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú. Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩcao, được thế giới ưa chuộng [3]. Vì vậy tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tựnhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay,lan Hài càng biến mất nhanh chóng.
7 Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1. Bảng 2. 1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] Tên loài Tình trạng Tên loài (tiếng Latinh) (tiếng Việt) Đã bị tuyệt chủng P. vietnamense Hài Việt ngoài thiên nhiên Đang bị tuyệt P. delenatii Hài Đỏ chủng trầm trọng P.  aspersum Chưa rõ tên gọi P. barbigerum var. lokianum Hài Lộc P. callosum Hài Vân P. dianthum Hài Xoắn P. emersonii Hài Hương Lan P. gratrixianum Hài Đuôi công P. hangiannum Hài Hằng P. helenae Hài hê len P. henryanum Hài Henry Đang bị P.  herrmannii Hài Herman tuyệt chủng P. malipoense var. jackii Hài Jack P. malipoense Hài Giáp P. micranthum Hài Mốc Hồng P. purpuratum Hài Tía P. tralienianum Hài Trần liên Sắp bị tuyệt chủng P. appletonianum Hài Cánh Sen P. concolor Hài Gia Định P. hirsutissimum var. chiwuawnum Hài Tiên biến dị P. hirsutissimum var. esquirolai Hài Tiên P. villosun var. annamense Hài Lông Thiếu dẫn liệu P.  affine Hài Hoà P.  datalanse Chưa rõ tên gọi P. villosum var. boxalli Chưa rõ tên gọi (Nguồn: Averyanov et al, 2008) Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lanHài Việt Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần đây do sựsuy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều tra
8 thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽtrên diện rộng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [8],[9],[10]. Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số lượng các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các loài lan Hàirất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều hơn vàsẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái. Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Namtrong những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên ra nước ngoài. Do không có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thuthập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên toàn bộ lãnh thổ [1]. Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khurừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc hữu. Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên củachúng. Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Namcủa nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1]. Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam. Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang ảb o tồn các loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắk Lắk), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum.
9 - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn loài P. callosum - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P.dalatensis. - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang(Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum. - Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii, P.hangianum, P. malipoense varijackii. - Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum. - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae. - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha đang bảo tồn loài P. malipoense Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vậtin vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng năm 2005. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau. 2.2. Giới thiệu về giống Hài Hương lan 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố 2.2.1.1. Nguồn gốc - Sau rất nhiều những nghi ngờ về sự tuyệt chủng của chúng thì loài này cuối cùng cũng đã được tìm thấy năm 2000 ở vùng núi đá vôi cao ngất thuộc tỉnh Tuyên Quang. Từ lâu, cây lan này được ghi nhận là một loài đặc hữu của Trung Quốc. Nhưng mãi đầu năm 2001 nhà thực vật học người Nga Averyanov và các cộng sự đã phát hiện ra nơi mọc ở những phần nhỏ của khu vực núi đá vôi thuộc tỉnh Bắc Cạn và phía bắc tỉnh Thái Nguyên.
10 2.2.1.2 Phân bố - Loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) này được phân bố ở nước ta điển hình tại huyện Võ Nhai - Thái Nguyên, Vĩnh phúc [16]. 2.2.2 Hình dạng - Loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) có lâu năm, có 4 - 7 lá xếp thành 2 dãy. Lá rất giống P. hangianum, chất da, có hình thoi - bầu dục, cỡ 15 - 25 x 3 - 5 cm,mặt trên màu lục bóng, mặt dưới màu lục nhạt. Cụm hoa có cuống dài 10 - 15 cm, mang 1 hoa. Lá bắc hình bầu dục rộng, cỡ 2,8 - 3 x 1,2 - 2 cm, màu trắng. Hoa thơm dịu, rộng 8 - 9,5 cm; lá đài và cánh hoa dày, màu trắng, có lông ngắn ở cả 2 mặt; lá đài ở gần trục hoa hình bầu dục - trứng, cỡ 3 - 4,5 x 2 - 3 cm; lá đài kia hình bầu dục rộng - gần tròn, cỡ 2,5 - 3,5 x 2,4 - 3,5 cm; cánh hoa hình bầu dục rộng - gần tròn, cỡ 4 - 4,5 x 2,5 - 3,5 cm, ở gốc có lông dài và chấm tía, mép bên đôi khi uốn vào trong; môi màu vàng hay da cam nhạt, gân hình cầu với các chấm to và trắng đục như hạt ngọc, cỡ 3,5 - 4,5 x 2 - 3 cm, mép cuốn vào trong với mạng gân lõm; nhị lép màu vàng với 2 vệt màu đỏ cam, cỡ 1,6 - 2 x 0,8 - 1,1 cm; bầu dài khoảng 3 cm, có lông nhung trắng [16]. Hình 2.1. Hình ảnh về cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tại nhà lưới khoa CNSH&CNTP
11 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) 2.2.3.1. Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng - Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật chung, những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đô lạnh đến trung bình, ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn thích hợp với điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16-18°C, ban ngày là 21-25°C. - Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lanHàiưa ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lan từ11.000-22.000 lux. [8]. Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu lámàu xanh đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng. - Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt là rất cần thiết, nhất là trong mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không bị khô quá nhanh. Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên các khay sỏi nhẹ với 50% độ ẩm là lý tưởng [8]. 2.2.3.2. Nhu cầu bón phân Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón phân, nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tưới phân. Sangchậu khi giá thể trồng có dấu hiệu mục nát [4]. 2.2.3.3. Giá thể trồng Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than củi, xỉ than tổ ong, sỏi, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2 lần/ tuần trong suốt mùa sinh trưởng của cây lan. 2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) - Phương pháp tách chiết thông thường: Hài Hương Lan là loài đơn thân nên chỉ có thể tách chồi non ra khỏi cây mẹ, trồng vào chính giữa chậu mới. Cầncột
12 chặt cây vào chậu bằng một cây tựa sau đó phun một dung dịch NAA 0,1 ppm và vitamin B1 và treo cây vào nơi ẩm mát, thoáng. Sau khi cây bén rễ thì bổ sung thêm chất trồng vào chậu sau đó đặt cây vào nơi có điều kiện ánh sáng thích hợpcho sự phát triển lâu dài của cây [4]. - Phương pháp cấy mô: Đây là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống lan Hài trên quy mô công nghiệp, cây con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ. So với phương pháp tách chiết thông thường có tốc độ phát triển 1cây/năm thì phương pháp nuôi cấy mô sẽ sản xuất được khoảng 4 triệu cây/năm. Các loài lan Hài thường được nuôi cấy trên môi trường Murashige & Skoog 1962, Heller, Vacin & Went có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng như NAA, 2,4D, BA, TDZ, Kinetin trong điều kiện vô trùng hoàn toàn. Nhờ tiến bộ khoa học, ngày nay người ta có thể cấy nhiều bộ phận khác nhau của cây lan để hình thành các thể giống protocorm như đỉnh sinh trưởng hay chồi bên, gcọn hoa, lá,đốt thân hoặc rễ [4]. 2.2.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thựcvật 2.2.5.1. Vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô – tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá ), các cấu trúc của phôi (lámầm, trụ lá mầm ), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ ) . Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau, trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổicủamẫu, chất lượng cây lấy mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu quảvô trùng tuỳ thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật
13 của hoá chất. Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫulà: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, H2O2- oxi già, HgCl2- thuỷ ngân clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin ) [18]. 2.2.5.2. Điều kiện nuôi cấy - Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùnguồng gồmb cấy vô trùng, các dụng cụ cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ không bị nhiễm vi sinh vật. Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoại chiếu trong 30 phútsau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường đượcng khửtrù ở 121°C trong 25-30 phút [18]. - Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổnđịnh về ánh sáng và nhiệt độ [18]. 2.2.6. Môi trường dinh dưỡng Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấynhư duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầmhoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [5]. Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồmcác thành phần chính sau: 2.2.6.1. Nguồn Cacbon Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không cón khả năng tự dưỡng do không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôicấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn Cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose vớihàm lượng từ 20- 30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose, những loại đường này chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt [7]. 2.2.6.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phầncơ
14 bản để tổng hợp chất hữu cơ [5]. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấuvà điện thế màng. Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S[7]. - + + Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3 hoặc NH4 , hầu hết các loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩmhữucơ. + Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường. + Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O + Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O + Magie: Sử dụng chủ yếu là MgSO4 + Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni các nguyên tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy. 2.2.6.3. Vitamin Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủvề lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B [17]. - Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid [18]. - Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất [18]. - Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [18]. - Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon [18] .
15 2.2.6.4. Các chất hữu cơ tự nhiên - Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin [18]. - Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid [18]. - Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B [18]. - Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, khoai tây, nước ép chuối xanh[18] . 2.2.6.5. Các thành phần khác - Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy [18]. - Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxy hoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic [18]. 2.2.6.6. pH của môi trường Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ [18]. 2.2.6.7. Các chất điều hoà sinh trưởng Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệu quả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hoà sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy[18]. Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2 nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng [18].
16 - Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây ếny mạch. Sau đó nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này. Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các láchồi, non, hạt nảy mầm, trong thấn hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễphụdo auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì– nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì, Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá[6],[19]. - Các auxin thường được sử dụng là: NAA; IBA; 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (các auxin tự nhiên). Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA; IBA; NAA; 2,4D; IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi. NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độcao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus[6],[19]. - Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim. Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn. Trong thục vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ứcchếưu thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin. Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá[6].
17 - Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea [6]. - Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [6],[19]. 2.3. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước 2.3.1. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới Thông thườngPaphiopedilum có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt hay tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ. Tuy nhiên, các phương pháp này cho hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu câù của thị trường. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng để bảo vệ lan Hài thoát khỏi nguycơ tuyệt chủng. Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài được thực hiện bởi Bubeck năm 1973. Kể từ đó nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng nhân giống lan Hài bằng nhiều phương pháp nuôi cấy sử dụng các bộ phận khác nhau của cây. Một số nghiên cứu đã thành công: Năm 1975, Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô sẹo, đôi khi có sự hình thành một vài cây con trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các mô sẹo rất khó tái sinh, sau một thời gian nuôi cấy những mô sẹo này sẽ chết. Vì lý do này, hầu hết các nghiên cứu về nuôi cấy môPaphiopedilum đều sử dụng nguồn vật liệu ban đầu từ hạt Năm 1980, Nieman đã tiến hành nuôi cấy chồi bên và cây con [24] và phương pháp này cũng được Sampolinski sử dụng cho nghiên cứunăm 1983
18 Năm 1988, Huang đã tiến hành nuôi cấy kéo dài cây in vitro, sau đó cảm ứng tạo chồi từ chồi nách của cây invtro được nuôi cấy kéo dài [24] Năm 2000, Lin và cs đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo từ nguồn protocorm của hạt một loài lan Hài lai và đã thu được một vài cây con trong ống nghiệm Năm 2001, Huang đã tiến hành nhân nhanh hạt giống lan Hài laigiữa P. philippinese và P. susan trong môi trường MS bổ sung với BAP 13 mM Năm 2002 và 2004, Chen và các cộng sự cũng báo cáo rằng có thể cảm ứng tạo chồi từ thân và lá của lan HàiP. philippinese khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4D 4,52 mM và TDZ 4,54 mM Năm 2008, Hong và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từmô sẹo của cây con giống P. alma gavaert khi nuôi cấy trên môi trường MS có Kinetin 4,65 mM . Năm 2011, Liao và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây con hoàn chỉnh từ nụ hoa của P. deperle vàP. armeni. Tuy nhiên, cần rất nhiều thời gian để cho cây lan Hài ra hoa vì vậy phương pháp này kém hiệu quả hơn các phương pháp khác. Người ta cũng tiến hành phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào từ những dòng mô sẹo có nguồn gốc từ protocorm và nuôi cấy mô sẹo từ những loại mô khác củaPaphiopedilum . 2.3.2. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trong nước Tại Việt Nam cũng đã có nhiều nhà khoa học tiến hành nuôi cấy mô lan Hài nhằm nhân giống một số loài lan Hài quý hiếm góp phần bảo tồn loài lan Hài khỏi nguy cơ tuyệt chủng như: Năm 2005, Dương Tấn Nhựt đã nghiên cứu thành công phương pháp nhân nhanh giống lan hài P. delenatii bằng phương pháp sử dụng hạt nảy mầm in vitro. Từ cây con in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồn gốc từ hạt, được nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D và TDZ với nồng độ cao, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua bước hình thành PLB.Một phần mô sẹo có thể tái sinh được 3-7 chồi trong 3 tháng và chúng có thể tồn tại trên môi trường nuôi cấy trong 3 năm mà không mất đi khả năng tái sinh [20],[24].
19 Ngoài ra, Dương Tấn Nhựt còn nghiên cứu thành công một phương pháp mới cho phép nhân nhanh giống lan P. delenatii là phương pháp gây vết thương trên phần gốc thân của cây con in vitro. Phần gốc sau khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm TDZ; NAA; 2,4D sẽ hình thành mô sẹo và một số ít xuất hiện protocorm. Năm 2007, Dương Tấn Nhựt và cs đã nghiên cứu nhân giống thành công lan Hài Hồng qua các chồi tái sinh từ các đoạn thân của cây non được nuôi cấy kéodài in vitro khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung TDZ 1,5 mg/l, BA 2 mg/l, NAA 0,5 mg/l, than hoạt tính 1 g/l, đường 30 g/l, agar 9 g/l . Khi nuôi cấy trong bóng tối sẽ thu được chồi dài, màu vàng, yếu, còn khi nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ có cườngđộ thấp sẽ thu được chồi có sự giãn cách giữa các lá dọc trên thân cây [23],[25]. Dương Tấn Nhựt (2006) đã nhân giống thành công giống lan hài Hồng bằng phương pháp nuôi cấy cây con in vitro trong ống nghiệm, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồn gốc từ hạt, được nuôi cấytrên môi trường có chứa 2,4D; TDZ với nồng độ cao, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua các bước hình thành PLB. Một phần mô sẹo có thể tái sinh được 3-7 chồi trong 3 tháng và chúng có thể tồn tại trên môi trường nuôi cấy trong 3 năm mà không mất đi khả ăng tái sinh , đồng thời cũng nghiên cứu ra phương pháp tạo vết thương ởgốc chồi và nuôi cấy trong môi trường lỏng để nhân nhanh giống lan hài Hồng [20] . Năm 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu nhanh giống thành công lan hài Hồng thông qua các chồi tái sinh từ các đoạn thân cây non được nuôi kéo dài. Độ giãn dài của P. delenatii gốc được thực hiện trong điều kiện ánh sáng thấp. Thân cây thon dài sau đó được cắt thành các đoạn có chồi ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS đã đượcsửa đổi, bổ sung thêm các chất điều hoà sinh trưởng thực vật ở các nồng độ khác nhauđể nghiên cứu khả năng tái sinh chồi [20]. Năm 2010, tác giả Hoàng Thị Giang và cs đã nghiên cứu thành công quy trình nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài hằng thu thập ở Việt Nam, kết
20 quả nghiên cứu cho thấy hạt lan hài Hằng nảy mầm thích hợp trên môi trương RE, cho nhân nhanh tốt nhất khi bổ sung thêm nước dừa 150 ml/l và khoai tây 100 mg/l và cho khả năng ra rễ tốt nhất khi môi trường có thêm -NAA 0,4-0,6 mg/l. Các kết quả thí nghiệm ngoài vườn ươm cho thấy: Cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao 3-4 cm, có từ 3-4 lá, 4-5 rễ, trồng trến giá thể dớn, chế độ dinh dưỡng NPK (30:10:10) với lượng bón là 1 g/l và chế độ phun 2 lần/tuần [2]. Trong nghiên cứu của Vũ Quốc Luận và cộng sự (2014) về lan Hài Hồng cho thấy các chồi non lan Hài Hồng có 4 lá được cấy vào môi trường SH có bổ sung 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính và được nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài các đốt thân, sau đó được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp diệp lục tố và các năng lượng cần thiết cho cây. Kết quả cho thấy, các chồi non được kéo dài trung bình 10.5 cm, với số lá mới hình thành trung bình 5 lá/chồi, tương ứng với 5 đốt/chồi thu được sau 120 ngày nuôi trong điều kiện tối. Sau đó, các chồi được đưa sang điều kiện chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình thành lá mới, tuy nhiên không nhận thấy có sự phân đốt. Sau 180 ngày nuôi cấy, các chồi được cắt thành 5 đốt riêng biệt với 1 lá và 1 rễ, riêng phần đỉnh chồi được giữ nguyên với 3 lá và 2 rễ. Cuối cùng, các đốt thân được trồng trên giá thể dớn Đài Loan thu được kết quả cao nhất ở vị trí đốt thân số 1 với tỷ lệ sống sót (100%) sau 12 tháng [7],[9]. Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2017) đã thành công trong nhân nhanh cây lan Hài gấm (Paphiopedilum concolor) từ phôi trên môi trường MS cải tiến có bổ sung BA 2mg/l và TDZ 1,0mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 2,9 lần. Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) đã nhân giống thành công loài lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và NAA 0,3mg/l cho hệ số nhân chồi 3,28 lần. Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài Xuân Cảnh (Paphiopedilum canhii) trong môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l + Kinetine 1mg/l + TDZ 1mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 2,93 lần.
21 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Giống Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii) được thu thập từ tỉnh Thái Nguyên - Vật liệu: Đoạn thân mang chồi ngủ Hài Hương Lan. 3.1.2. Hoá chất sử dụng - Hoá chất khử trùng: cồn 70°, oxi già (H2O2). - Môi trường MS, WPM, B5 đường sacharose, agar, than hoạt tính - Một số chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin (NAA, ), nhóm cytokinin (BA, Kinentin,TDZ), 3.1.3. Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Thiết bị Dụng cụ Cân phân tích Pank cấy Máy khuấy từ Dao kéo Máy đo PH Đèn cồn Lò vi sóng Cốc đong, ống đong Nồi hấp vô trùng Bình tam giác Tủ sấy Đĩa (hạt đậu, peptri) Hệ thống giàn đèn Chun nịt Máy cất nước Túi nilon Box cấy vô trùng Giấy thấm Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm.
22 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cây Hài Hương Lan. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ cây Hài Hương anL . 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu - Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa CNSH– CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên. 3.2.2. Thời gian nghiên cứu - Thời gian: Từ 12/2019– 6/2020. 3.3. Nội dung nghiên cứu 3.3.1.Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng của câyHài Hương Lan. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng đoạn thân mang mầm ngủ, Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). 3.3.2.Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi rường đến khả năng tái sinh của chồiHài Hương Lan từ đoạn thân mang chồi ngủ. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh mầm ngủ, Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii). 3.3.3.Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinnetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan. - Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan - Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan. - Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi Hương Lan.
23 3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây Hài Hương Lan. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây lan Hài Hương Lan - Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt đếntính khả năng ra rễ của cây Hài Hương Lan. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro Sử dụng môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung agar 5,5 g/l, đường 30g/l, nước dừa 150ml/l, inositol 100mg/l, các chất BA, Kinetin, TDZ, NAA (mg/l), than hoạt tính (g/l) có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm, pH=5,6-5,8. MT nền gồm: MS + 30g đường saccharose/l + 100mg inositol/l + 5,5g agar/l + 150ml nước dừa/l+ 0,5g/l than hoạt tính. Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,0 atm từ 15-20 phút. 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu Đoạn thân mang chồi ngủ o Khử trùng (cồn 70 , H2O2) Tái sinh chồi Nhân nhanh chồi Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
24 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 1 mẫu. 3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ,gian thời của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cây Hài Hương Lan. Các bước tiến hành vô trùng mẫu như sau: - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Mẫu lấy là các đoạn thân của câyHài Hương Lan có mang chồi ngủ, đem rửa sạch dưới vòi nước, loại bỏ hết phần đất bẩn, cắt bỏphần thừa, dùng xà phòng loãng để rửa, sau đó tráng lại bằng nước cất. - Khử trùng mẫu: Tiến hành trong box cấy vô trùng, khử trùng sơ bộ bằng cồn 70° trong 30 giây, tráng lại 3-5 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng tiếp bằng dung dịch H2O2 để tiêu diệt nấm, vi khuẩn. Sau đó tráng lại bằng nước. Đặt mẫu lên giấy thấm và để khô tự nhiên trong box. Sau đó dùng pank, dao, kéo cắt bỏ phần mẫu ngấm hoá chất trên mẫu và cấy vào môi trường nuôi cấy. - Sau khi cấy song đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 220C – 25oC, cường độ chiếu sáng 2000– 2500 lux, độ ẩm: 60– 65% quang chu kì 14h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng cuả nồng độ, thời gian của chất khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cây Hài Hương Lan Các công thức được bố trí như sau: Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng cuả nồng độ, thời gian của chất khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cây Hài Hương Lan Hóa chất Công thức Thời gian (phút) CT1 (Đ/C) 15 CT2 10 H2O2 1% CT3 15 CT4 20 CT5 10 H2O2 2% CT6 15 CT7 20 CT8 10 H2O2 3% CT9 15 CT10 20
25 3.4.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan từ đoạn thân mang chồi ngủ. 3.4.3.3.Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang chồi ngủ Hài Hương Lan Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh đoạn thân mang chồi ngủ Hài Hương Lan Mẫu sau khi khử trùng, sau một tuần theo dõi không bị nhiễm được cấy chuyển sang các môi trường nuôi cấy khác nhau với chất bổ sung Đường 30g/L + Agar 5,5g/L + Nước dừa 150 ml/L + Inositol 100mg/l + Than hoạt tính 0,5g/l, để nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) Công thức thí nghiệm được bố trí như sau: CT Môi trường Chất bổ sung 1 Muashige & Skoog (MS) Đường 30g/L + Agar 5,5g/L + Nước 2 Woody Plant Medium (WPM) dừa 150 ml/L + Inositol 100mg/l + 3 Gamborg’s (B5) THT 0,5g/l, pH 5,6 – 5,8. - Mẫu có kích thước tương đồng sau khi khử trùng được đưa vào môi trường tái sinh, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi, quan sát chồi tái sinh và chất lượng chồi tái sinh. - Chồi tái sinh được tách và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền, có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin, TDZ) để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. - Theo dõi, quan sát số chồi, chất lượng chồi. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi của cây Hài Hương Lan . Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + BA 1 mg/l
26 CT 3: MT nền + BA 2 mg/l CT 4: MT nền + BA 3 mg/l CT 5: MT nền + BA 5 mg/l Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Hài Hương Lan Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A (nồng độ BA thích hợp nhất cho quá trình tái sinh chồiở thí nghiệm 3) + Kinetin ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1(Đ/c): MT nền + A + Kinetin 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + Kinetin 0,3 mg/l CT 3: MT nền + A + Kinetin 0,5 mg/l CT 4: MT nền + A + Kinetin 1,0 mg/l CT 5: MT nền + A + Kinetin 2,0 mg/l Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Hài Hương Lan . Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A + B (nồng độ Kinetin thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi đã xác định ở thí nghiệm 4) + TDZ ở các nồng độkhác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + A + B + TDZ 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + B + TDZ 1,0 mg/l CT 3: MT nền + A + B + TDZ 1,5 mg/l CT 4: MT nền + A + B + TDZ 2,0 mg/l CT 5: MT nền + A + B + TDZ 3,0 mg/l
27 3.4.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây Hài Hương Lan Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của Hài Hương Lan - Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT nền có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng tạo rễ của mẫu. - Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + NAA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + NAA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + NAA 1,0 mg/l CT 4: MT nền + NAA 1,5 mg/l CT 5: MT nền + NAA 2,0 mg/l Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây Hài Hương Lan. - Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT nền + C (nồng độ NAA thích hợp nhất cho ra rễ đãợc đư xác định ở thí nghiệm 6) + THT ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng ra rễ của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + C + THT 0,0 mg/l CT 2: MT nền + C + THT 1,0 mg/l CT 3: MT nền + C + THT 2,0 mg/l CT4:MT nền + C + THT 3,0 mg/l CT 5: MT nền + C + THT 4,0 mg/l. 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 3.5.1. Thu thập số liệu - Đếm số mẫu sống, mẫu nhiễm, mẫu chết. - Đếm số chồi: Đếm tổng số chồi và nhánh trên một mẫu nuôi cấy ban đầu. - Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ.
28 3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi - Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu + Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm: Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100 Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) + Tỷ lệ mẫu sống nhiễm: Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) + Tỷ lệ mẫu chết: Tổng số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Chỉ tiêu theo dõi chồi: Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng chồi thu được Hệ số nhân chồi (lần) = ×100% Tổng chồi nuôi cấy Hình thái chồi: + Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh + Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt + Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng - Chỉ tiêu theo dõi ra rễ: Tổng số chồi ra rễ (chồi) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = × 100% Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu) Hình thái rễ: + Rễ tốt: Rễ khỏe, dài.
29 + Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn. + Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ. 3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm Microsoft office Excel 2010 và phần mềm IRRISTAT 5.0.
30 Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thờigian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng Tái sinh mẫu cấy là bước đầu tiên rất quan trọng trong nuôi cấy in vitro. Đây là giai đoạn tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho các quá trình nhân giống tiếp theo. Nếu như bước tái sinh mẫu không thành công thì quy trình nhân giống in vitro cũng không thể tiến hành. Để tiến hành tái sinh mẫu trước hết cần phải tiến hành khử trùng mẫu cho phù hợp với từng loại đối tượng cũng như từng loại mẫu khác nhau. Nguồn mẫu cây Hài Hương Lan đưa vào nuôi cấy trong các thí nghiệm được lấy từ chồi và đỉnh sinh trưởng thu thập ngoài tự nhiên nên chứa rất nhiều loại vi sinh vật. Vì vậy,cần lựa chọn nồng độ, thời gian chất khử trùng thích hợp để loại bỏ hoàn toàn mầm bệnh khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Trong quá trình vô trùng mẫu để tiêu diệt nấm và vi khuẩn trên mẫu nuôi cấy, các nhà nghiên cứu thường sử dụng cácchất hoá học có hoạt tính tiêu diệt nấm và vi khuẩn. Một số chất thường được sử dụng để khử trùng mẫu nuôi cấy như: Oxi già hydroxid (H2O2), Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2), H2O2 là một trong các hoá chất có khả năng tiêu diệt nấm và vì khuẩn, không gây ảnh hưởng lớn đến môi trường như thủy ngân, vì vậy nên những năm gần đây các thí nghiệm về nuôi cấy mô đã ầd n thay thế các chất như thủy ngân clorua bằng oxi già ểđ giảm ô nhiễm môi trường .Vì vậy, chúng tôi đã ựl a chọn H2O2 là chất khử trùng để tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng trong nghiên cứu của mình. Để lựa chọn nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp cho cây Hài HươngLan (Paphiopedilum emersonii) chúng tôi đã thử nghiệm khả năng khử trùng với dung dịch H2O2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau. Sau 7 ngày nuôi cấy kết quả thu được trình bày ở bảng sau
31 Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) Số Chỉ tiêu đánh giá Thời mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ Nồng độ Tỷ lệ mẫu Công thức gian đưa sống không mẫu (%) sống (phút) vào nhiễm chết nhiễm (%) (mẫu) (%) (%) Nước cất CT1(Đ/c) 15 30 0 100 0 vô trùng CT2 10 30 13,56 64,44 22 CT3 15 30 24,66 62,33 13,01 H O 1% CT4 2 2 20 30 36,66 40,56 22,78 CT5 10 30 25 50 25 CT6 15 30 40 30 20 H O 2% CT7 2 2 20 30 49,33 14,65 36,02 CT8 10 30 30 12 58 CT9 15 30 64,66 20,45 14,89 H O 3% CT10 2 2 20 30 53,33 6,67 40 LSD05 5,1 CV (%) 7,6 Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đồ 4.1 Tỷ lệ mẫu sông không nhiễm (%) 70 64.66 60 53.33 49.33 50 40 40 36.66 30 Tỷ lệ mẫu sông không nhiễm (%) 30 24.66 25 20 13.56 10 0 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 Biểu đồ 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy)
32 Các công thức thí nghiệm đều cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao hơn công thức đối chứng (0,00%), từ đó cho thấy nồng độ H2O2 và thời gian khử trùng có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tiêu diệt nấm, vi khuẩn. H2O2 có cơ chất tiêu diệt khuẩn nấm là phá vỡ màng tế bào, không gây độc nhưng nếu mẫu nghiên cứu tiếp xúcở nồng độ cao và thời gian dài sẽ gây chết mẫu. - Dung dịch H2O2 ở nồng độ 1% trong 20 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm ở mức độ cao nhất đạt 36,66 % và mức chết khá thấp cao nhất ở ứcm 22,78%. - Dung dịch H2O2 ở nồng độ 2% trong 20 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm ở mức độ cao nhất đạt 49,33%, tỷ lệ mẫu sống nhiễm thấp ở mức 14,65% và mức chết khá cao ở mức 36,02%. - Dung dịch H2O2 ở nồng độ 3% trong thời gian 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm ở mức độ cao nhất đạt 64,66%, mẫu sống nhiễm và mẫu chết khá thấp lần lượt ở mức 20,45% và 14,89%. Kết quả thí nghiệm cho thấy dung dịch H2O2 ở nồng độ thấp nhất 1% ít ảnh hưởng đến mẫu, tỷ lệ mẫu chết cao nhất ởmức 22,78% nhưng hiệu quả khử trùng thấp. Khi nồng độ H2O2 tăng lên 3% thì hiệu quả của khử trùng củaH2O2 khá cao đạt mức cao nhất 64,66% khử trùng trong 15 phút nhưng khi tăng lên theo thời gian khử trùng lên 20 phút thì tỷ lệ mẫu sống không nhiễm giảm mạnh xuống 53,33% và tỷ lệ mẫu chết khá cao 40%. Điều này cho thấy nếuH 2O2 nồng độ và thời gian không phù hợp thì sẽ không đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất. Nồng độ H2O2 và thời gian khử trùng phù hợp và tốt nhất trong thí nghiệm là CT9 có H2O2 nồng độ 3% thời gian khử trùng 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 64,66% và tỷ lệ mẫu chết ở mức tương đối thấp 14,89%. 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lanHài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) Mẫu sau khi xử lí vô trùng, cấy chuyển sang các môi trường dinh dưỡng có chứa các thành phần khoáng khác nhau để đánh giá khả năng tái sinh chồi lan chồi Hài Hương Lan .
33 Chúng tôi thu được kết qủa ở bảng sau: Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy). Tổng mẫu Tổng số Công Môi Tỷ lệ nuôi cấy mẫu bật Chất lượng chồi thức trường tái sinh (%) (mẫu) chồi (mẫu) 1 MS 30 19 63,33 Xanh đậm, mập 2 B5 30 18 60 Xanh nhạt, mập 3 WPM 30 8 26,67 Xanh nhạt, gầy LDS05 7,5 CV(%) 6,7 Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tái sinh (%) 70 63.33 60 60 50 40 30 26.67 Tỷ lệ tái sinh (%) 20 10 0 0 MS B5 WPM 0 Biểu đồ 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy). Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy giá trị CV(%) 6.7 và LDS05 đạt 7.5 thì các công thức đều có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy là 95%. Xét chỉ tiêu tỷ lệ tái sinh chồi, CT1 (MS) cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất 63.33% tiếp theo CT2 (B5) tỷ lệ tái sinh chồi là 60%. CT3 cho tỷ lệ thấp nhất 26,67%. Xét chỉ tiêu chất lượng chồi, CT3 (WPM) chồi thu được có màu xanh nhạt và gầy. Trên môi trường MS cho tỷ lệ tái sinh cao nhất trong thí nghiệm trên quan sát
34 và thu được chồi có màu xanh đậm và mập. CT2 là môi trường B5 chất lượng chồi thu được có màu xanh nhạt và mập. Kết quả thí nghiệm cho thấy chồi cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) có thể tái sinh tốt trên nền môi trường chứa hàm lượng dinh dưỡng từ trung bình đến giàu dinh dưỡng. Còn đối với môi trường nghèo dinh dưỡng hạn chế cho sự tái sinh trưởng và phát triển chồi cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). Từ kết quả trên chúng tôi chọn môi trường MS làm môi trường cơ bản cho quá trình nghiên cứu sau của cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). Trong nghiên cứu của tác giả Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) đã sử dụng môi trường RE cho tỉ lệ tái sinh chồi đạt 58% thấp hơn thí nghiệm 2 của chúng tôi. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn môi trường MS làm môi trường cơ bản cho quá trình nghiên cứu sau của cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). CT1 (Xanh đậm, mập) CT2 (Xanh nhạt, mập) CT3 (Xanh nhạt, gầy) Hình 4.2. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy) CT1: Môi trường MS, tỷ lệ tái sinh chồi đạt 63.33%; CT2: Môi trườngg B5, tỷ lệ tái sinh chồi đạt 60%; CT3: Môi trường WPM, tỷ lệ tái sinh chồi đạt 26,67%. 4.3. Kết qủa nghiên cứu của một sốCytokinnetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) từ đoạn thân mang mầm ngủ. 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). Nhân nhanh chồi là giai đoạn gia tăng số lượng chồi trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân nhanh phụ thuộc vào thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy
35 (nhiệt độ, ánh sáng). Thảo luận ở phần này, lấy từ kết quả nghiên cứu của các tác giả trong phần tổng quan, nhất là bổ sung các chất kích thích sinh trưởng. Với mục đích nhân nhanh Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tái sinh, chúng tôi tiến hành thí nghiệm: mẫu nuôi cấy được thử nghiệm khả năng nhân nhanh chồi sử dụng môi trường có bổ sung BA với nồng độ khác nhau. Thí nghiệm được theo dõi trong 6 tuần. Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy) Tổng số mẫu Tỷ lệ tái Công Nồng độ BA Số mẫu đưa Chất lượng bật chồi sinh chồi thức (mg/l) vào (mẫu) chồi (chồi) (%) 1 (Đ/c) 0,0 30 9 0,3 Xanh nhạt, gầy 2 1,0 30 23 0,77 Xanh đậm, gầy 3 2,0 30 39 1,3 Xanh đậm, mập 4 3,0 30 25 0,93 Xanh đậm,mập 5 5,0 30 13 0,27 Xanh đậm, gầy LSD05 0,44 CV% 4,1 Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đồ 4.3 Tỷ lệ tái sinh chồi (%) 1.4 1.3 1.2 1 0.93 0.77 0.8 Tỷ lệ tái sinh chồi (%) 0.6 0.4 0.3 0.27 0.2 0 0,0 1,0 2,0 3,0 5,0 Biểu đồ 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy)
36 Kết quả bảng 4.3 cho thấy giá trị CV (%): 4.1 và LSD05 đạt 0,44 thì công thức CT3 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95 % , các CT khác có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều này cho thấy BA có sự ảnh hưởng tích cực tới khả năng tái sinh chồiHài Hương Lan( Paphiopedilum emersonii). Xét chỉ tiêu nhân nhanh chồi, từ CT2 đến CT5 tương ứng với bổ sung BA ở các nồng ộđ từ 1,0-5,0 mg/l, sau 6 tuần nuôi cấy thì tổng số chồi thu được nhiều hơn so với công thức đối chứng (9 chồi). Trong thí nghiệm này, khi sử dụng BA ở nồng độ 2,0 mg/l (CT3) cho tổng chồi thu được cao nhất (39 chồi) với hệ số nhân chồi là 1,3 lần. Xét chỉ tiêu chất lượng chồi, khi không bổ sung BA(CT đối chứng) chiều cao chồi tái sinh thấp và chồi nhạt màu. CT2 (nồng độ BA 1,0 mg/l) cho chất lượng chồi tốt nhất (chồi xanh đậm và gầy). CT3 (nồng độ BA 2,0mg/1) cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất chồi xanh đậm và mập. Chất lượng chồi giảm khi tăng dần nồng độ BA. Kết quả trên được giải thích như sau: BA là Cytokinnetin có vai trò trong việc hoạt hóa quá trình phân bào, nhờ đó sẽ có tác dụng cảm ứng cho việc hình thành chồi và phân hóa chồi. Khi tăng dần nồng độ BA trong môi trường (0 – 2,0 mg/l) thì tỷ lệ chồi tái sinh tăng đáng kể. Nồng độ BA 2,0 mg/l đối với cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) cho tổng chồi thu được cao nhất đạt39 chồi, chất lượng chồi tốt. Khi tăng nồng độ BA lên, tỷ lệ tái sinh có xu hướng giảm dần, điều này có thể giải thích là nồng độ BA thích hợp kích thích cây sinh trưởng, tuy nhiên khi nồng độ BA tăng cao vượt quá ngưỡng cần thiết có thể gây ức chế khả năngtạo chồi. Trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) trên môi trường MS có bổ sung BA 2,0 mg/l cho hệ số nhân chồi 2,14 lần. So với thí nghiệm 3 của đề tài kết quả của tác giả Nguyễn Thị Tình không có sự chênh lệch đáng kể (< 1%). Do vậy chúng tôi lựa chọn BA với nồng độ 2,0 mg/l, cho kết quả tốt nhất sẽ được sử dụng nghiên cứu kết hợp với chất kích thích sinh trưởng khác ở các thí nghiệm tiếp theo.
37 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Xanh nhạt, gầy) (Xanh đậm,gầy) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm, gầy) Hình 4.3. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan Paphiopedilum( emersonii) (sau 20 ngày nuôi cấy). CT1: 0 mg/l BA; CT2: 1,0 mg/l BA; CT3: 2,0 mg/l BA; CT4: 3,0 mg/l BA; CT5: 5,0mg/l BA. 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan( Paphiopedilum emersonii) Cũng như BA, Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm Cytokinnetin, được sử dụng khá phổ biến trong nuôi cấy mô- tế bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ [3]. Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh với nồng độ BA thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi + Kinetin ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Sau 4 tuần nuôi cấy kết quả được trình bày ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) Nồng độ Nồng độ Số mẫu Tổng số Hệ số Công BA Kinetin nuôi cấy chồi thu nhân chồi Chất lượng chồi thức (mg/l) (mg/l) (mẫu) được (chồi) (lần) CT 1 0,0 30 27 0,8 Xanh nhạt, gầy CT 2 0,3 30 18 0,6 Xanh đậm, gầy CT 3 0,5 30 29 0,97 Xanh nhạt,gầy 2,0 CT 4 1,0 30 Xanh đậm, mập 45 1,23 CT 5 2,0 30 30 1,08 Xanh nhạt, mập LSD05 0,13 CV (%) 9,5
38 Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đồ 4.4 Hệ số nhân chồi (lần) 1.5 1.23 1.08 0.97 1 0.8 0.6 Hệ số nhân chồi (lần) 0.5 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Biểu đồ 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan( Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) Kết quả thu được ở bảng 4.4 cho thấy: Giá trị CV (%): 9.5 và LSD0.5 đạt 0,13; cặp công thức CT2 và CT3 không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% và các CT còn lại thì các thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Cho thấy rằng tất cả các công thức có bổ sung nồng độ BA 2,0 mg/l; Kinetin 0 – 2 mg/l vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực tới việc nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) Trong thí nghiệm này nồng độ Kinetin 1,0 mg/l cho tổng số chồi thu được là 45 chồi và hệ số nhân cao nhất là 1,23 lần, chồi thu được xanh đậm, mập. Tuy nhiên, nồng độ Kinetin từ 0,3; 0,5; 2,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm với CT2,CT3, CT5 lần lượt là 18 chồi , 29 chồi, 30 chồi tương ứng vợi hệ số nhân là 0,6; 0,97 ; 1,08 lần, chất lượng chồi cũng kém dần xanh nhạt, gầy. Kết quả thí nghiệm thu được được giải thích như sau: Ở CT đối chứng (CT1) do môi trường nuôi cấy không bổ sung Kinetin nên khả năng tạo chồi thấp hơn so với các công thức có bổ sung Kinetin. Ở CT2, CT3, Kinetin có nồng độ là 0,3– 0,5 mg/l làm tăng hệ số nhân chồi nhưng không đáng kể, do nồng độ thấp nên các chồi mẫu hầu như không tiếp xúc với Kinetin trong môi trường nuôi cấy, vì vậy nên mẫu phân chia yếu nên chỉ tạo ít chồi mới. Khi nồng độ Kinetin đạt 1,0 mg/l (CT4) nòng độnày Kinetin kích thích chồi sinh trưởng. Ở CT5 tương ứng với nồng độ 2,0 mg/l
39 hệ số nhân chồi thấp hơn so với CT4. Tuy nhiên khi nồng độ Kinetin tăng cao, vượt quá ngưỡng cần thiết có thể ức chế khả năng tạo chồi. Vậy trong khuôn khổ thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồi cần bổ sung BA 2,0 mg/l, Kinetin 1,0 mg/l, sẽ thu được tổng số chồi là 45 với hệ số nhân chồi là 1,23 lần. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Xanh nhạt, mập) (Xanh nhạt, mập) (Xanh nhạt, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm,mập) Hình 4.4. Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) CT1: 0 mg/l Kinetin; CT2: 0,3 mg/l Kinetin; CT3: 0,5mg/l Kinetin; CT4: 1,0 mg/l Kinetin; CT5: 2,0 mg/l Kinetin. 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA,Kinetin kết hợp với TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) Kết quả được thể hiện ở bảng 4.5 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) Nồng Tổng số Hệ số Nồng độ Số mẫu Công độ chồi thu nhân Nồng độ TDZ nuôi cấy Chât lượng chồi thức Kinetin được chồi BA(mg/l) (mg/l) (mẫu) (mg/l) (chồi) (lần) CT 1 0,0 30 9 0,3 Xanh nhạt,gầy CT 2 1,0 30 39 1,3 Xanh đậm, mập CT 3 2,0 1,0 1,5 30 27 0,9 Xanh đậm,mập CT 4 2,0 30 14 0,4 Xanh nhạt,gầy CT 5 3,0 30 8 0,27 Xanh nhạt,gầy LSD05 0.63 CV (%) 6.7
40 Hệ số nhân chồi (%) 1.4 1.3 1.2 1 0.9 0.8 Hệ số nhân chồi (%) 0.6 0.4 0.4 0.3 0.27 0.2 0 0,0 1,0 1,5 2,0 3,0 Biểu đồ 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) Kết quả thu được ở bảng 4.5 cho thấy: Giá trị CV (%): 6,7 và LSD0.5 đạt 0,63; các thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độkhông tin cậy 95%. Cho thấy rằng tất cả các công thức có bổ sung nồng độBA 2,0 mg/l; Kinetin 1,0 mg/l; TDZ 0- 3,0mg/l vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tới việc nhân nhanh chồiHài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). Khi bổ sung BA 2,0 mg/l (CT3), Kinetin 1,0 mg/l (CT4) và TDZ từ 0,0 đến 3,0 mg/l vào môi trường nuôi cấy co ảnh hưởng dến khả năng nhân nhanh chồi cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). Các công thức có bổ sung TDZ đều cho hệ số nhân chồi cao hơn công thức đối chứng không bổ sung TDZ và khi tăng nồng độ TDZ từ 0,0 đến 3,0 mg/l thì cho tổng số chồi thu được đã ừt CT2 (BA 2,0 mg/l + Kinetin 1,0 mg/l + TDZ 1,0 mg/l) thu được 39 chồi và hệ số nhân cao nhất là 1.3 lần . Tuy nhiên nồng độ từ CT3 (1,5 mg/l) ; CT4 (2,0 mg/l) và CT5 (3,0mg/l) có dấu hiệu giảm dần với tổng số chồi thu được là CT3 , CT4, CT5 lần lượt là 27 chồi, 14 chồi, 8 chồi và hệ số nhân chồi là 0,9 ; 0,4 ; 0,27 lần.
41 Xét chỉ tiêu chất lượng chồi với công thức đối chứng ban đầu là CT1 không có TDZ cho chất lượng chồi thu được là xanh nhạt, gầy thì CT2 (BA 2,0 mg/l + Kinetin 1,0 mg/l + TDZ 1,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu được xanh đậm, mập. Kết quả thí nghiệm được giải thích như sau: TDZ là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích tế bào phân chia hình thành chồi mới. Ở công thức đối chứng không có TDZ trong môi trường nuôi cấy nên khả năng tạo chồi thấp hơn các công thức bổ sung TDZ. Ở CT2 với nồng độ TDZ 1,0 mg/l có tác dụng kích thích phát triển chồi mới nhưng do nồng độ TDZ thấp nên mẫu ít chịu tác động kích thích phân chia tế bào của chất này. Khi nồng độ TDZ tăng dần từ 1,5 – 3,0 mg/l ứng với CT3, CT4 và CT5 có sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài hoặc bị biến dạng, nồng độ TDZ càng cao thì hệ số nhân chồi càng giảm dần. Kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhựtvà cs (2005) [32] cho thấy khi nuôi cấy lan hài P. delenatii trong môi trường MS lỏng bổ sung TDZ 1,0 mg/l, NAA 0,5 mg/l. than hoạt tính 1,0 mg/l, sucrose 20 g/l, agar 8 g/l (sau 3 tháng) thu được nhiều chồi nhất, có hệ số nhân chồi là 52lần So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt thấy kết quả nghiên cứu của tôi hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả trên. Kết quả nghiên cứu của tôi cho hệ sốnhân chồi cao nhất là 1,3 lần thấp hơn 17,5 lần so với kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt vì thời gian thí nghiệm ngắn hơn (30 ngày) và do mẫu nghiên cứu của tôi là chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tái sinh từ đoạn thân mang chồi ngủ nuôi cấy trên môi trường MS bán rắn, còn nghiên cứu trên sử dụng mẫu tái sinh từ gốc chồi lanhài Hồng được gây vết thương nuôi cấy trên môi trường lỏng. Vậy trong khuôn khổ thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồi cần bổ sung BA 2,0 mg/l, Kinetin 1,0 mg/l, TDZ 1,0 mg/l sẽ thu được tổng số chồi là 39 với hệ số nhân chồi là 1,3 lần.
42 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Xanh nhạt, gầy) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh nhạt, gầy) (Xanh nhạt, gầy) Hình 4.5. Hình ảnh ảnh hưởng của BA và Kinetin kết hợp với TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) CT1: 0mg/l TDZ ; CT2: 1,0mg/l TDZ ; CT3: 1,5mg/l TDZ ;CT4: 2,0mg/l TDZ ; CT5: 3,0mg/l TDZ. 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây . Bộ rễ là cơ quan quan trọng đối với tất cả các loài thực vật. Trong nuôi cấy mô, sau khi nhân chồi với số lượng lớn, giai đoạn tiếp theo là tạo cây hoàn chỉnh để đưa ra ngoài vườn ươm. Một cây khi được chuyển ra môi trường tự nhiên cần phải có bộ rễ khỏe mạnh, hoàn chỉnh giúp cây có khả năng hút nước và dinh dưỡng khoáng tốt, làm tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này. Vì vậy, giai đoạn kích thích tạo rễ của các chồi là giai đoạn quan trọng và không thể thiếu. Sau khi kết thúc giai đoạn nhân nhanh tạo ra số lượng chồi Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii) đồng nhất và khỏe mạnh, các chồi tạo thành đạt tiêu chuẩn sẽ được tách ra đưa vào mỗi trường kích thích ra rễ.Chất kích thích sinh trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn này thuộc nhóm auxin. 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của Hài Hương Lan. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng NAA (có dụng kích thích chồi tạo rễ) với các nồng độ khác nhau (0,5- 2,0mg/l) trong từng công thức thí nghiệm để
43 nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) Nồng độ Số mẫu Số mẫu Công Tỷ lệ mẫu NAA nuôi cấy ra rễ Chất lượng rễ thức ra rễ (%) (mg/l) (mẫu) (mẫu) CT1(Đ/c) 0,0 30 5 16,67 Ngắn, nhỏ CT 2 0,5 30 14 46,67 Ngắn, nhỏ CT 3 1,0 30 26 86,67 Ngắn, mập CT 4 1,5 30 22 78,11 Ngắn, mập CT 5 2,0 30 18 60 Ngắn, nhỏ LSD05 7,3 CV(%) 8,7 Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đồ 4.6 Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) 100 90 86.67 81.11 80 70 60 60 50 46.67 Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) 40 30 20 16.67 10 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Biểu đồ 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy)
44 Từ bảng kết quả 4.6 cho thấy: giá trị CV (%): 8,7 và LSD05 đạt 7,3; các CT khác nhau có sự sai khác có ý nghĩaở mức độ tin cậy 95%. Nồng độ NAA có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành rễ đối với câyHài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). Xét chỉ tiêu nhân nhanh rễ, từ CT2 dến CT5 tương ứngvới bổ sung NAA ở các nồng độ 0,5-2,0 mg/l, sau 4 tuần nuôi cấy thì tổng số rễ thu được nhiều hơn với công thức đối chứng (5 rễ). Trong thí nghiệm này, khi sử dụng NAA ở nồng độ 1,0 mg/l (CT3) cho tổng số rễ thu được cao nhất (26 chồi) với hệ số nhân rễ là 86,67 lần Xét chỉ tiêu chất lượng ,rễ CT3 thu được chất lượng rễ tốt nhất, ngắn và mập. Kết quả trên được giả thích như sau: NAA có dụng kích thích chồi tạo rễ. CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung NAA nên số mẫu tạo rễ không lớn và ít rễ. Nồng độ NAA 1.0 mg/l (CT3) cho nhiều cây ra rễ và có số rễ lớn nhất là do NAA ở nồng độ này có tác dụng kích thích chồi lan ra rễ mạnh nhất đồng thời tạo điều kiệncho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất. CT2, CT4, CT5, nồng độ NAA lần lượt là 0,5 mg/l, 1,5 mg/l, 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ ra rễ và số rễ giảm dần, bởi vì NAA ở nồngđộ cao gây ức chế chồi phát triển, chồi yếu nên số lượng rễ hình thành cũng giảm,rễ sinh ra dài và nhỏ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thây khi bổ sung NAA ở nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ cây ra rễ cao nhất đạt 86.6%. Vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp này để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Ngắn, nhỏ) (Ngắn, nhỏ) (Ngắn ,mập) (Ngắn, mập) (Ngắn, nhỏ) Hình 4.6. Hình Hài Hương Lan ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ hoàn chỉnh (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) CT1: 0 mg/l NAA; CT2: 0,5 mg/l NAA; CT3: 1.0 mg/l NAA; CT4: 1,5 mg/l NAA; CT5: 2.0 mg/l NAA
45 4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính (THT) đến khả năng ra rễ Hài Hương Lan . Kết quả được thể hiện ở bảng 4.7 Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Hài Hương Lan (sau 4 tuần nuôi cấy) Nồng độ Nồng độ Số mẫu Tổng số Tỷ lệ Công Số lượng Chất lượng NAA THT nuôi cấy chồi ra rễ mẫu ra thức rễ (rễ) rễ (mg/l) (g/l) (mẫu) (chồi) rễ (lần) CT 1 0,0 30 7 27 23,33 Ngắn, mập CT 2 0,5 30 27 71 90 Dài, mập 1.0 CT 3 1,0 30 21 60 70 Ngắn, mập CT 4 1,5 30 15 49 50 Dài, nhỏ CT 5 2,0 30 12 36 40 Dài, nhỏ LSD05 7,4 CV (%) 9,3 Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đồ 4.7 Tỷ lệ ra rễ (lần) 100 90 90 80 70 70 60 50 50 40 Tỷ lệ ra rễ (lần) 40 30 23.33 20 10 0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Biểu đồ 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy)
46 Từ bảng kết quả 4.7 cho thấy: giá trị CV (%): 9,3 và LSD05 đạt 7,4; các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Nồng độ NAA kết hợp THT có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành rễ đốivớicây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). Xét chỉ tiêu nồng độ THT tăng thì tỷ lệ ra rễ cũng tăng, CT2( 0,5g/l) THT cho kết quả cao nhất đạt 90%. Khi nồng độ THT tăng lên từ CT3 (1,0g/l) , CT4 (1,5g/l) và CT5 (2,0g/l) thì tỷ lệ ra rễ sẽ giảm xuống lần lượt là 70%; 50%; 40%. Xét theo tổng số chồi ra rễ thì CT2 (0,5g/l) THT cho ra số lượng chồi cao nhất là 27 chồi và khi được tăng lượng THT lên từ CT3 (1,0 g/l ) ; CT4 ( 1,5 g/l ) ; CT5 (2,0 g/l) thì tổng số chồi ra rễ giảm dần lần lượt là 21 chồi, 15 chồi 12chồi. Đối với tỷ lệ ra rễ cao nhất là CT2 (0,5g/l) cho số lượng ra rễ là 71 rễ và khi tăng lượng THT từ CT3 (1,0 g/l) đến CT5 (2,0 g/l) thì lượng rễ cung giảm xuống từ 60 đến 36 rễ . Kết quả trên cũng cho thấy chất lượng rễ của các công thức có bổ sung NAA và THT cho chất lượng rễ tốt, nhiều rễ, khỏe, dài, mập. Tác giả Nguyễn Thị Sơn và cs (2012) nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook (lan Hoàng thảo long nhãn) đã kết luận: Hàm lượng THT phù hợp nhất cho lan Hoàng thảo long nhãn ra rễ là 1,0 g/l, tỷ lệ ra rễ đạt100% sau 30 ngày nuôi cấy , số rễ đạt/cây cao nhất là 5,6 rễ/cây, chiều dai rễ lớn nhất là 2,87cm, khi hàm lượng THT cao hơn 1,0 g/l chiều cao cây thấp dần. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: Hàm THTlượng phù hợp nhất cho cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) ra rễ là 0,5 g/l, cho tỷ lệ ra rễ đạt 90% sau 4 tuần nuôi cấy, tổng số rễ nhiều nhất là 71 rễ. So với kết quả nghiên cứu của tác giả trên thấy: Tỷ lệ mẫu ra rễ của tôi thấp hơn kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Sơn. Nguyên nhân là do mẫu nuôi cấy, môi trường và điều kiên nuôi cấy ở hai thí nghiệm là khác nhau. Kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng THT thích hợp nhất cho cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) ra rễ là 0,5 g/l, khi đó tổng số rễ là 71 rễ và cho rễ dài, mập.
47 Từ kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng THT thích hợp nhất cho cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) ra rễ là 0,5 g/l, khi đó tổng số rễ là 71 rễ và cho rễ dài, mập. Than hoạt tính là một hợp chất vô cơ thường đượcsử dụng trong giai đoạn ra rễ trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. THT có vai trò là tạo điều kiệntối cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật. Ngoài ra, THT còn có khả năng làmgiảm hiện tượng thuỷ tinh thể ở một số loài thực vật. Để số mẫu nuôi cấy có thể ra nhiều rễ với chất lượng rễ tốt, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng nồng độ NAA 1,0 mg/l thích hợp nhất cho quá trình ra rễ kết hợp với THT ở các hàm lượng khác nhau để thử nghiệm khả năng ra rễ của câyHài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Ngắn, mập) (Dài , mập) (Ngắn, mập) (Dài, nhỏ) (Dài,nhỏ) Hình 4.7. Hình ảnh ảnh hưởng của NAA kết hợp với THT đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần nuôi cấy) CT1: 1,0mg/l NAA + 0,0g/l THT; CT2: 1,0mg/l NAA + 0,5g/lTHT ; CT3: 1,0g/l NAA + 1,0g/l THT;CT4: 1,0mg/l NAA + 1,5g/l THT;CT5: 1,0mg/l NAA + 2,0g/l THT.
48 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Trong khuôn khổ các thí nghiệm nghiên cứu chúng tôi đưa ra ộm t số kết luận nghiên cứu như sau: - Xác định được hóa chất khử trùng tốt nhất đối với đoạn thân mang chồi ngủ của cây Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii) là dung dịch H2O2 3% trong thời gian ngâm mẫu 20 phút. Với hóa chất khử trùng này tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 64,66 %. - Xác ịđ nh được môi trường thích hợp cho tái sinh chồi cây Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii) là môi trường MS+ Đường 30g/l + Agar 5,5g/l + Nước dừa 150 ml/l + Inositol 100mg/l+0,5g/l THT, pH 5,6 – 5,8; cho tỷ lệ tái sinh đạt 63,33%. - Xác định được hàm lượng 2,0 mg/l BA; 1,0 mg/l Kinetin; 1,0 mg/l TDZ tốt nhất cho nhân nhanh chồi Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii) trên nền môi trường MS + Đường 30g/l + Nước dừa 150ml/l + Agar 5,5 g/l +Inositol 100 mg/l +0,5g/l THT, pH 5,6-5,8, hệ số nhân chồi đạt 1,3 lần. - Xác định được nồng độ NAA 1,0 mg/l ; THT 0,5 g/l thích hợp cho giai đoạn ra rễ tỷ lệ đạt 90% rễ có chất lượng tốt, trên môi trường MS + Đường 30g/l + Nước dừa 150ml/l + Agar 5,5 g/l +Inositol 100 mg/l+0,5g/l THT , pH 5,6-5,8. 5.2. Kiến nghị - Nghiên cứu điều kiện ngoại cảnh (ẩm độ, nhiệt độ, dinh dưỡng) đến sinh trưởng và phát triển Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) giai đoạn vườn ươm để hoành thiện công nghệ nhân giống in vitro đối với loài lan hài quý và có giá trị này. - Nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng khác đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). - Nghiên cứu thêm nồng độ của BA > 2mg/l đến khả năng nhân nhanh Hài Hương lan (Paphiopedilum emersonii). - Cần nghiên cứu bảo tồn và phát triển các loài lan hài của Việt Nam.
49 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài liệu tiếng việt 1. Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2008), Lan Hài Việt Nam, Nxb Giao thông Vận tải TP Hồ Chí Minh. 2. Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài quý P. hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2010 - tập 8, số 2, tr. 194-201, Trường Đại Học Nông NghiệpHà Nội. 3. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (2002), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Khoa học và Kỹ thuật. 4. Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ 5. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp. 6. Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011),Giáo trình các chất điều hoà sinh trưởng thục vật, Nxb Giáo dục Việt Nam. 7. Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 8. Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2014), “Ảnh hưởng của các chất bổ sung hữu cơ lên quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi lan Vân Hài (Paphiopedilum callosum) nuôi cấy intro”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 52 (số 1), trang 49 – 62. 9. Mai Xuân Lương (2005), Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Đại học Đà ạL t. 10. Nguyễn Thị Tuyết Mai (2011), “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) bằng phương pháp chiếu xạ”, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM. 11.Nguyễn Công Nghiệp (2006),Trồng hoa lan, Nxb Trẻ. 11. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp. 12. Hoàng Thị Sản (2002), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục.
50 13. Trương Thị Đẹp (2017), Thực vật dược, NXB Y học, Hà Nội. 14. Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2010), Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan Hài quýP. hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Phát triển, số 2, tr. 194-201. 15. Võ Văn Chi (2017), Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam, NXB Giáo Dục 16. Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2014), “Ảnh hưởng của các chất bổ sung hữu cơ lên quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi lan Vân Hài (Paphiopedilum callosum) nuôi cấy intro”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 52 (số 1), trang 49 – 62. 17. Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 8. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009),Công nghệ sinh học tập –2 Công nghệ sinh học tế bào, Nxb Giáo dục. 18. Nguyễn Thị Tuyết Mai (2011), “ Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) bằng phương pháp chiếu xạ”, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM. II.Tiếng anh 19. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Don N. T., Luan V. Q., Hai N. T., Tran Thanh Van K., Chinnappa C. C. (2007), “In vitro stem elongation of Paphiopedilum delenatiii Guillaumin and shoot regeneration via stem node culture”, Propagation of Ornamental Plants 7, p. 29-36. 20. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Luan V. Q., Don N. T., Khiem D. V., Tran Thanh Van K. (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & Bio- System Engineering, p. 184-190. 21. Nhut D. T., Trang P. T. T., Vu N. H., Thuy D. T. T., Khiem D. V., Binh N. V., Tran Thanh Van K. (2005), “A wounding method and liquid culture in
51 Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants 5(3), p.156-161. 22. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Don N. T., Luan V. Q., Hai N. T., Tran Thanh Van K., Chinnappa C. C. (2007), “In vitro stem elongation of Paphiopedilum delenatiii Guillaumin and shoot regeneration via stem node culture”, Propagation of Ornamental Plants 7, p. 29-36. 23. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Luan V. Q., Don N. T., Khiem D. V., Tran Thanh Van K. (2005), “Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & Bio- System Engineering, p. 184-190. 24. Nhut D. T., Trang P. T. T., Vu N. H., Thuy D. T. T., Khiem D. V., Binh N. V., Tran Thanh Van K. (2005), “A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants 5(3), p.156-161.
PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bảng 1: Thành phần cơ bản của môi trường MS (Muashige & Skoog) Amount to Stock Final take Bottle Component Solution concentratic preparation (g/l) (mg/l) (ml) NH4NO3 82,5 1.650,0 I 20 KNO3 95 1.900,0 MgSO4.7H2O 37 370,0 MnSO4.4H2O 2,23 22,3 II 10 ZnSO4.7H2O 1,058 10,6 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 III KI 0,083 10 0,83 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 KH2PO4 17 170,0 IV H3BO4 0,62 10 6,2 Na2MoO4.2H2O 0,025 0,25 FeSO4.7H2O 2,784 27,85 V 10 Na2EDTA.2H2O 3,724 37,25 mg/100ml Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Vitamin Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 Sucrose 30.0000,0 Agar 5.500,0 pH 5,6 - 5,8
Bảng 2: Thành phần cơ bản của môi trường WPM (Woody Plant Medium Lioyd và Mc Cown, 1980) Muối khoáng Nồng độ (mg/l) CuSO4.5H2O 0.25 Na2EDTA.2H2O 37.2 Vi lượng H3BO3 6.20 MnSO4.H2O 22.30 FeSO4.7H2O 27.8 ZnSO4.7H2O 8.6 CaCl2.2H2O 96 Ca(NO3)2.4H2O 556 KH2PO4 170 Đa lượng K2SO4 990 MgSO4.7H2O 370 NH4NO3 400 NaMoO4.2H2O 0.25 Myo – inositol 100 Pyridoxine HCl 0.5 Glycine 2.0 Các chất hữa cơ Nicotinic acid 0.5 Thiamine HCl 1.0 Agar 6 Đường 30
Bảng 3: Thành phần cơ bản của môi trường B5 (Gamborg cs, 1976) Muối khoáng Nồng dộ (mg/l) (NH4)2SO4 134 CaCl2.2H2O 150 MgSO4.7H2O 246 KNO3 2.258 Đa lượng MnSO4.2H2O 10 KI 0.75 Na2MoO4.2H2O 0.25 Na2H2PO4.2H2O 150 ZnSO4.7H2O 2.0 Na2EDTA.2H2O 37.2 H3BO3 3 CoCl2.6H2O 0.025 Vi lượng CuSO4.5H2O 0.025 FeSO4.7H2O 27.8 Myo- inositol 100 Nicotinic acid 1 Pyrodoxine HCl 1 Thiamine 10 Các chất hữu cơ Đường 30