›

Khóa luận Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và chiết phân đoạn rễ cây Đinh lăng

pdf 102 trang thiennha21 18/04/2022 5701
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và chiết phân đoạn rễ cây Đinh lăng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_so_bo_thanh_phan_hoa_hoc_va_chiet_phan_do.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và chiết phân đoạn rễ cây Đinh lăng

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ CHIẾT PHÂN ĐOẠN RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. TRẦN CÔNG LUẬN TRẦN THỊ KIM TUYỀN ThS. ĐỖ VĂN MÃI MSSV: 12D720401259 LỚP: ĐH DƯỢC 7C Cần Thơ, năm 2017
  2. i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu để hoàn thành khoá luận tại bộ môn dược liệu trường Đại học Tây Đô, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè và gia đình. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Trần Công Luận, ThS. Đỗ Văn Mãi người thầy tận tuỵ, nhiệt tình đã dìu dắt, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô của bộ môn dược liệu trường Đại học Tây Đô đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong toàn bộ thời gian thực hiện khoá luận này. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Tây Đô đã tận tình dạy bảo em trong suốt những năm học vừa qua. Cuối cùng, em xin tỏ lòng cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất tới Cha mẹ, gia đình, bạn bè, những người thân đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập và hoàn thành khoá luận. Cần Thơ, ngày tháng năm 2017 Sinh viên TRẦN THỊ KIM TUYỀN
  3. ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong một công trình nào khác. Sinh viên TRẦN THỊ KIM TUYỀN
  4. iii TÓM TẮT Khóa luận tốt nghiệp đại học - Khóa học: 2012 – 2017 Chuyên ngành Dược học - Mã số: 52720401 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học và chiết phân đoạn của rễ cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trồng tại An Giang Sinh viên: Trần Thị Kim Tuyền Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. Trần Công Luận ThS. Đỗ Văn Mãi Mở đầu Trong y học cổ truyền, cây Đinh lăng từ lâu đã được sử dụng như một vị thuốc thông huyết mạch. Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra Đinh lăng có các tác dụng dược lý tương tự như Nhân sâm nhưng giá thành lại rẻ hơn và dễ trồng hơn Nhân sâm nên chúng đã đang được quan tâm nghiên cứu. Ở Việt Nam, nguồn dược liệu Đinh lăng dồi dào, hứa hẹn là một nguồn khai thác các thành phần hóa học của chúng đầy tiềm năng. Đề tài này hướng tới việc khảo sát các thành phần hóa học trong cây Đinh lăng để cung cấp nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu là cây Đinh lăng, được thu hái tại Tri Tôn – An Giang. Sau khi qua quá trình sơ chế ban đầu thì đối tượng được khảo sát các đặc điểm về vi học, thử độ tinh khiết, nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ cây Đinh lăng với phương pháp chiết lỏng – lỏng. Sau khi phơi khô 9,3 kg rễ Đinh lăng, ngấm kiệt với cồn 96 %. Tiến hành cô thu hồi cồn, thu được 1,75 kg cao rễ tiến hành lắc phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần. Cô thu hồi dung môi, thu được các cao tương ứng. Kết quả và bàn luận Từ 9,3 kg rễ Đinh lăng, bằng kỹ thuật ngấm kiệt với cồn 96 %, sau đó lắc phân bố tuần tự với diethyl ether, ethyl acetat, n-butanol, đã thu được 300 g cao Et2O, 30 g cao EtOAc, 405 g cao n-BuOH và 800 g cao nước cuối cùng. Song song đó, cũng thu được kết quả của các đặc điểm về vi học, thử độ tinh khiết và khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của Đinh lăng. Kết luận: Bằng các kỹ thuật đơn giản đã khảo sát được các đặc điểm về vi học, độ tinh khiết của cây. Với phương pháp ngấm kiệt và lắc phân bố đã thu được các cao phân đoạn. Để làm tài liệu cho các nghiên cứu sau.
  5. iv MỤC LỤC Trang DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC BẢNG IX DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT X CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2.1.TỔNG QUAN VỀ ĐINH LĂNG 2 2.1.1.Vị trí, phân loại Đinh lăng 2 2.1.2.Tên Việt Nam, tên khoa học, tên gọi khác 3 2.1.2.1.Tên Việt Nam 3 2.1.2.2.Tên khoa học 3 2.1.2.3.Tên gọi khác 3 2.1.3.Một số loài Đinh lăng khác 4 2.1.3.1.Đinh lăng lá tròn 4 2.1.3.2.Đinh lăng lá ráng 4 2.1.3.3.Polyscias sambucifolia (Sieber) Harms. 4 2.1.3.4.Đinh lăng trổ 4 2.1.3.5.Đinh lăng lá răng 5 2.1.3.6.Polyscias grandifolia Volkens. 5 2.1.3.7.Đinh lăng đĩa 5 2.1.4.Đặc điểm thực vật Đinh lăng 5 2.1.4.1.Mô tả 5 2.1.4.2.Sinh thái 6 2.1.5.Thu hái chế biến 6 2.1.6.Phân bố thu hái 6 2.1.7.Trồng trọt 7 2.1.8.Thành phần hóa học 8 2.1.9.Tác dụng dược lý 20
  6. v 2.1.10.Công dụng và liều dùng 23 2.1.10.1.Công dụng 23 2.1.10.2.Liều dùng 23 2.1.11.Sản phẩm Đinh lăng có mặt trên thị trường 25 2.2.TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT 27 2.3.MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH 30 2.3.1.Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng 31 2.3.2. Kỹ thuật chiết rắn - lỏng 33 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 3.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 38 3.1.1.Nguyên liệu 38 3.1.2.Hóa chất và dung môi 38 3.1.3.Trang thiết bị 38 3.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 3.2.1.Thu hái xử lý và bảo quản Đinh lăng 39 3.2.1.1.Thu hái 39 3.2.1.2.Xử lý và bảo quản 39 3.2.2.Nghiên cứu về đặc điểm vi học 39 3.2.2.1.Khảo sát hình thái 39 3.2.2.2.Khảo sát vi phẫu 39 3.2.2.3.Khảo sát bột dược liệu 40 3.2.3.Thử tinh khiết 40 3.2.3.1.Xác định độ ẩm 40 3.2.3.2.Xác định tro toàn phần 41 3.2.3.3.Xác định chất chiết được trong dược liệu 41 3.2.4.Nghiên cứu về hóa học 41 3.2.4.1.Định tính 41 3.2.4.2.Định tính sơ bộ các nhóm chính trong thân và rễ Đinh lăng 43 3.2.4.3.Chiết xuất và tách phân đoạn 49 3.2.4.4.Thăm dò hệ sắc ký các cao phân đoạn 52 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 4.1.THỰC VẬT HỌC 53
  7. vi 4.1.1.Đặc điểm hình thái 53 4.1.2.Đặc điểm vi phẫu 59 4.1.3.Đặc điểm bột dược liệu 65 4.2.THỬ TINH KHIẾT 70 4.2.1.Độ ẩm 70 4.2.2.Xác định độ tro 71 4.2.3. Chất chiết được trong dược liệu 70 4.3.NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ TÁCH PHÂN ĐOẠN 71 4.3.1.Định tính 71 4.3.2.Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong thân và rễ Đinh lăng 76 4.3.3.Chiết xuất 78 4.3.4.Tách phân đoạn bằng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng 79 4.4.THĂM DÒ HỆ DUNG MÔI 80 4.4.1.Sắc ký lớp mỏng cao diethyl ether 80 4.4.2.Sắc ký lớp mỏng cao ethyl acetat 82 4.4.3.Sắc ký lớp mỏng cao n-butanol 84 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 87 5.1. KẾT LUẬN 87 5.1.1. Nghiên cứu về đặc điểm vi học 87 5.1.2. Thử tinh khiết 87 5.1.3. Nghiên cứu về hóa học 87 5.2. ĐỀ XUẤT 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89
  8. vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1. Sơ đồ vị trí và phân loại của loài Polyscias fruticosa (L.) Harms 2 Hình 2.2. Toàn cây và lá Đinh lăng 4 Hình 2.3. Toàn cây và hoa Đinh lăng . 6 Hình 2.4. Một số acid amin có trong Đinh lăng 8 Hình 2.5. Một số vitamin có trong Đinh lăng . 9 Hình 2.6. Một số hợp chất chính có trong tinh dầu 16 Hình 2.7. Một số flavonoid từ lá Đinh lăng 16 Hình 2.8. Công thức falcarindiol của cây Đinh lăng 18 Hình 2.9. Công thức chung saponin triterpenoid của cây Đinh lăng 18 Hình 2.10. Sản phẩm Đinh lăng 27 Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết . 43 Hình 3.2. Sơ đồ tách các chất trong dịch chiết ether 44 Hình 3.3. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn 45 Hình 3.4. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn thủy phân 46 Hình 3.5. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết nước 47 Hình 3.6. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết nước thủy phân 48 Hình 3.7. Sơ đồ tách chiết phân đoạn . 50 Hình 4.1. Toàn cây và lá Đinh lăng 52 Hình 4.2. Hình thái bên ngoài của lá Đinh lăng 53 Hình 4.3. Cụm hoa Đinh lăng 54 Hình 4.4. Hình thái bên ngoài hoa Đinh lăng 55 Hình 4.5. Hình toàn cây và thân Đinh lăng . 56 Hình 4.6. Hình đường kính thân Đinh lăng . 56 Hình 4.7. Hình hình thái bên ngoài rễ Đinh lăng 57 Hình 4.8. Hình thái bên ngoài rễ chính và rễ con Đinh lăng 58 Hình 4.9. Vi phẫu lá Đinh lăng vật kính 10X 59
  9. viii Hình 4.10. Vi phẫu lá Đinh lăng vật kính 40X 59 Hình 4.11. Vi phẫu cuống lá Đinh lăng vật kính 10X 60 Hình 4.12. Vi phẫu cuống lá Đinh lăng vật kính 40X 61 Hình 4.13. Vi phẫu thân Đinh lăng vật kính 10X 62 Hình 4.14. Hình vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 10X 63 Hình 4.15. Vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 40X . 64 Hình 4.16. Bột lá Đinh lăng soi vi phẫu . 65 Hình 4.17. Soi bột lá Đinh lăng vật kính 40X . 66 Hình 4.18. Bột thân Đinh lăng soi bột 66 Hình 4.19. Soi bột thân Đinh lăng vật kính 40X 67 Hình 4.20. Bột rễ Đinh lăng 67 Hình 4.21. Soi bột rễ Đinh lăng vật kính 40X . 68 Hình 4.22. Định tính cao rễ bằng hệ n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5) 72 Hình 4.23. Định tính cao rễ bằng hệ Toluen - ethyl acetat (7 : 3) 73 Hình 4.24. Định tính saponin bằng sắc kí lớp mỏng 74 Hình 4.25. Định tính saponin thân Đinh lăng bằng SKLM . 75 Hình 4.26.Sơ đồ chiết xuất rễ Đinh lăng 77 Hình 4.27. Sơ đồ tách phân đoạn . 79 Hình 4.28. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S1 80 Hình 4.29. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S2 80 Hình 4.30. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S3 81 Hình 4.31. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S1 82 Hình 4.32. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S2 83 Hình 4.33. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S3 83 Hình 4.34. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S1 84 Hình 4.35. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S2 84 Hình 4.36. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S3 85
  10. ix DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Tóm tắt các saponin triterpen trong cây Đinh lăng 19 Bảng 4.1. Độ ẩm bột dược liệu Đinh lăng 69 Bảng 4.2. Độ ẩm cao toàn phần Đinh lăng 69 Bảng 4.3. Tiêu chuẩn độ tro của dược liệu 70 Bảng 4.4. Chất chiết được trong dược liệu 70 Bảng 4.5. Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong thân và rễ Đinh lăng 76 Bảng 4.6. Khối lượng và độ ẩm các cao phân đoạn trong cao rễ 78
  11. x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CHCl3 Chloroform DĐVN Dược điển Việt Nam Et2O Diethyl ether EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol H2O Nước MeOH Methanol MS Mass Spectotrocopy - Phổ khối n-BuOH n-butanol SKLM Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo TP Toàn phần TT Thuốc thử UV Ultraviolet -Tử ngoại
  12. CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU Từ xa xưa các dân tộc ở Châu Á đã biết sử dụng các loại cây cỏ, hoa, lá trong tự nhiên để chữa bệnh tật. Tuy nhiên sự kết hợp hài hòa giữa các vị thuốc cây cỏ chủ yếu dựa trên các kinh nghiệm dân gian về công dụng của các loài thảo dược. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu hiểu biết của con người về các loài thảo dược ngày càng sâu rộng hơn. Việc nghiên cứu sâu các thành phần hóa học để hiểu rõ nguồn gốc hoạt tính của cây thuốc chữa bệnh trở thành một lĩnh vực thu hút được sự chú ý của giới khoa học. Ở nước ta, việc sử dụng cây cỏ để chữa bệnh là rất phổ biến trong dân gian. Trong thời gian gần đây có rất nhiều thông tin cho rằng tác dụng chữa bệnh của Đinh lăng giống như Nhân sâm nên người ta thường gọi Đinh lăng là Nhân sâm ở Việt Nam. Đây là một cây thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) với tên khoa học là Polyscias fruticosa (L.) Harms. Trong dân gian, Đinh lăng được sử dụng rất rộng rãi trong việc tăng cường sức khỏe, tăng cường lưu thông khí huyết, giảm đau thấp khớp, (Phạm Hoàng Hộ, 2003). Trong y học phương Đông, Đinh lăng được sử dụng như một vị thuốc bổ, kích thích tiêu hóa, giải độc kháng khuẩn, tiêu viêm, Nó có nhiều ưu điểm như dễ trồng, dễ sử dụng và mang nhiều tác dụng tiêu biểu của họ Nhân sâm. Trong thập nhiên 70, rễ Đinh lăng được các nhà khoa học Liên Xô, Viện y học quân sự, Viện dược liệu và trường đại học Dược Hà Nội nghiên cứu về thành phần hóa học, một số tác dụng dược liệu và lâm sàng (Đỗ Huy Bích, 2006). Tuy nhiên, phần lớn các thông tin về tác dụng chữa bệnh của Đinh lăng từ kinh nghiệm dân gian. Những kinh nghiệm đó chưa được chứng minh rõ ràng bằng các nghiên cứu. Chính vì vậy mà đề tài “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và chiết phân đoạn rễ cây Đinh lăng” được thực hiện nhằm đóng góp một phần khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học của rễ và trong các phân đoạn chiết tách rễ của cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), so sánh thành phần hóa học giữa thân và rễ Đinh lăng, cung cấp thêm những vấn đề có liên quan đến dược liệu như tổng quan về thực vật học, tác dụng dược lý, công dụng và một số bài thuốc có chứa Đinh lăng. 1
  13. CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN VỀ ĐINH LĂNG 2.1.1. Vị trí, phân loại Đinh lăng Theo như mô tả của TS Trương Thị Đẹp (2014) Đinh lăng thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), chi Polyscias, loài Polyscias fruticosa (L.) Harms (Trương Thị Đẹp (2014). Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Thù Du (Cornidae) Bộ Ngũ Gia Bì (Araliales) Họ Nhân sâm (Araliaceae) Chi Polyscias Loài Polyscias fruticosa (L.) Harms Hình 2.1. Sơ đồ vị trí và phân loại của loài Polyscias fruticosa (L.) Harms Đặc điểm họ Nhân sâm (Araliaceae) Các chi thuộc họ Ngũ gia bì thường tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có rất ít chi trong vùng ôn đới; các chi thường tập trung chủ yếu ở phía Nam, Đông Nam Á và đảo Thái Bình Dương (Armen Takhtajan, 2009; Trương Thị Đẹp, 2014). Thân: Cỏ (Panax) hay cây gỗ nhỏ mọc đứng hay cây gỗ to ít phân nhánh, đôi khi leo. 2
  14. Lá: Thường mọc cách ở góc thân, mọc đối ở ngọn, đôi khi mọc vòng. Lá có thể đơn hay kép hình lông chim hoặc kép hình chân vịt. Phiến lá nguyên, có khía răng hoặc có thùy. Lá kèm rụng sớm hay dính vào cuống lá. Bẹ lá tương đối phát triển. Cụm hoa: Tán đơn hay kép, tụ thành chùm, đầu ở nách lá hay ngọn cành. Hoa: Nhỏ, hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5, 4 vòng. Bao hoa: Lá đài thu hẹp chỉ còn 5 răng, 5 cánh hoa rời và dễ rụng sớm. Bộ nhị: 5 nhị xen kẽ cánh hoa. Bộ nhụy: 5 lá noãn dính nhau thành bầu dưới có 5 ô, mỗi ô 1 noãn; đôi khi có 10 lá noãn, ít khi giảm còn 3 hay 1 lá noãn; vòi rời. Quả: Mọng hay quả hạch. Hạt có nội nhũ. Ở Việt Nam có trên 20 chi: Acanthompanax, Aralia, Aralidium, Arthrophyllum, Brassaiopsis, Dendropanax, Dizygotheca, Evodiopanax, Grushvitzkia, Hedera, Heteropanax, Macropanax, Panax, Plerandropsis, Polycias (Nothopanax), Pseudopanax, Schefflera, Scheffleropsis, Tetrapanax, Trevesia, Tupidanthus; gần 120 loài (Armen Takhtajan, 2009; Trương Thị Đẹp, 2014). 2.1.2. Tên Việt Nam, tên khoa học, tên gọi khác 2.1.2.1. Tên Việt Nam Tên Việt Nam: Đinh lăng. 2.1.2.2. Tên khoa học Cây Đinh lăng có tên khoa học là Polyscias fruticosa (L.) Harms, họ Nhân sâm (Araliaceae) (Dược điển Việt Nam IV, 2009). Tên đồng nghĩa: Nothopanax fruticosus (L.) Harms (Đỗ Tất Lợi, 2004), Tieghemopanax fruticosa (L.) Vig. (Phạm Hoàng Hộ, 2003), Panax fruticosum I (J.Seidemann, 2005), Panax fruticosa L. ( Phạm Hoàng Hộ, 2003; Đỗ Huy Bích và cs, 2006). 2.1.2.3. Tên gọi khác Đinh lăng còn có các tên gọi khác như: Đinh lăng lá nhỏ, cây Gỏi cá, Nam dương lâm. Tên nước ngoài: Ming aralie; Tea tree; Ginseng tree (Anh); Polyscias (Pháp); Strau - chige Fiederaralie (Greman); Taiwan momiji (Japanese); Bani, Makan, Papua (Philipion); Ovang (Sumatra) (DĐVN IV, 2009; Đỗ Huy Bích và cs, 2006). 3
  15. Hình 2.2. Toàn cây và lá Đinh lăng 2.1.3. Một số loài Đinh lăng khác 2.1.3.1. Đinh lăng lá tròn Tiểu mộc cao 1 - 2 m, thơm. Lá kép thường mang 3 lá chét trên một cuống dài, lá chét hình tròn, đầu tù, xanh đậm, không lông, bìa có răng nhọn, cuống phụ 1 cm; cuống có đáy thành bẹ. Chùm tụ tán mang tán to 1 - 1,5 cm; hoa có 6 cánh hoa, 6 tiểu nhụy. Thường được trồng làm kiểng, gốc Tân - Caledonia III (Phạm Hoàng Hộ, 2003; Đỗ Huy Bích và cs, 2006). 2.1.3.2. Đinh lăng lá ráng Được gọi là Polyscias ilicifolia Bailf. Có tên khác là Polyscias cumingiana (C.Presl) Fern. - Vill, Anthrophyllum pinnatum (Lam.) Clarke (J.Seidemann, 2004). Tiểu mộc cao đến 2,5 m; thân có bì khổng. Lá kép có 11 - 13 lá chét; lá chét hình mác có răng cưa và sâu. Lá đặc biệt đa dạng: ở thân non, kép 1 - 2 lần thành đoạn hẹp nhọn, bìa có răng nhọn, dạng lá ráng; ở nhánh già lá đơn, xoan đến thon, thường lục tươi, gân giữa tía. Trồng ở đảo Thái Bình Dương (Đỗ Huy Bích và cs, 2006; Phạm Hoàng Hộ, 2003). 2.1.3.3. Polyscias sambucifolia (Sieber) Harms. Trồng ở Hà Nội làm thuốc, gốc Châu Úc (Phạm Hoàng Hộ, 2003). 2.1.3.4. Đinh lăng trổ Tên khoa học là Polyscias guilfoylei (Cogn. & Marche) Bail. Lá kép có 7 lá chét: lá chét thường có viền trắng (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). 4
  16. 2.1.3.5. Đinh lăng lá răng Tên khoa học là Polyscias serrata Balf. Cây kiểng. Bụi cao 50 - 150 cm; thân xám trắng, không lông, cành non xanh. Lá thơm, 2 lần kép (Pham Hoàng Hộ, 2003). 2.1.3.6. Polyscias grandifolia Volkens, 1965 Micronesica. Trồng ở Hà Nội (Phạm Hoàng Hộ, 2003). 2.1.3.7. Đinh lăng đĩa Tên khoa học là Polysicas scutellarius (Burm. f.) Merr. Cây nhỏ, cao 1 - 2 m; thân nâu đen, có bì khẩu trắng. Lá đơn hay do 2 - 3 lá phụ, phiến tròn bũm như cái dĩa hay bán cầu, xanh hay trổ, không lông. Chùm tụ tán thông dài; tán 5 - 8 hoa, hoa giữa không cọng; cánh hoa xanh, cao 3,5 mm. Có nguồn gốc từ Mexico (Phạm Hoàng Hộ, 2003). 2.1.4. Đặc điểm thực vật Đinh lăng 2.1.4.1. Mô tả Cây nhỏ dạng bụi, xanh tốt quanh năm, có thể cao từ 1,5 - 2 m. Thân nhám, không gai, ít phân nhánh, mang nhiều vết sẹo to, màu xám, các nhánh non có nhiều lỗ bì lồi. Lá kép, mọc so le, kép lông chim 2 - 3 tán, dài 20 - 40 cm; lá chét có răng cưa nhọn không đều, đôi khi chia thùy, gốc và thuôn nhọn, có mùi thơm khi vò nát; cuống lá dài, phát triển thành bẹ to ở phần cuối; các đoạn đều có cuống. Cụm hoa mọc ở ngọn thành hình chùy ngắn mang nhiều tán; lá bắc rộng, sớm rụng; loa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám; mép uốn lượn; tràng 5 cánh trái xoan; nhị 5, chỉ nhị ngắn; bán hạ, 2 ô. Quả dẹt, hình trứng rộng, màu trắng bạc. Mùa hoa quả: Tháng 4 - 7 (Armen Takhtajan, 2009; Phạm Hoàng Hộ, 2003; Trương Thị Đẹp, 2014; Võ Văn Chi, 2012). 5
  17. Hình 2.3. Toàn cây và hoa Đinh lăng 2.1.4.2. Sinh thái Cây có khả năng tái sinh dinh dưỡng cao. Người ta thường trồng chủ yếu bằng cách giâm cành; chọn những cành già, chặt thành đoạn ngắn 15 - 20 cm, cắm nghiêng xuống đất. Thời gian gieo trồng vào tháng 2 - 4 hoặc tháng 8 - 10. Đinh lăng ưa đất cao ráo, hơi ẩm (Võ Văn Chi, 2012). 2.1.5. Thu hái chế biến Thu hoạch rễ của cây đã trồng từ 3 năm trở lên (cây trồng càng lâu năm càng tốt). Rễ củ thu hái thường vào mùa thu, lúc này rễ mềm, nhiều hoạt chất, rửa sạch. Rễ nhỏ để nguyên, rễ to chỉ dùng vỏ rễ. Thái rễ mỏng, đem rửa sạch, phơi khô ở chỗ mát, thoáng gió để đảm bảo mùi thơm và hoạt chất. Khi dùng để nguyên hoặc tẩm rượu gừng 5 %, sao qua, rồi tẩm 5 % mật ong hoặc mật mía. Lá thu hái quanh năm thường dùng tươi (DĐVN IV, 2009; Võ Văn Chi, 2012). 2.1.6. Phân bố thu hái Chi Polyscias Forst & Forst f. có gần 100 loài trên thế giới, phân bố rải rác ở các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt Nam có khoảng 7 loài đều là cây trồng. Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynesic ở Thái Bình Dương. Cây được trồng ở Malaysyia, Indonesia, Campuchia, Lào Ở Việt Nam, Đinh lăng cũng có từ lâu trong 6
  18. nhân dân và được trồng khá phổ biến ở vườn gia đình, đình chùa, trạm xá, bệnh viện, để làm cảnh, làm thuốc và rau gia vị. Đinh lăng là loại cây ưa ẩm và có thể chịu bóng, trồng được trên nhiều loại đất, thậm chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể sống được theo kiểu cây cảnh bonsai. Trồng bằng cành sau 2 - 3 năm cây có hoa quả. Chưa quan sát được cây con mọc từ hạt. Đinh lăng có khả năng tái sinh vô tính khỏe. Từ một đoạn thân hoặc cành cắm xuống đất đều trở thành cây mới (Đỗ Huy Bích, 2006; Võ Văn Chi, 2012; Đỗ Tất Lợi, 2004; Phạm Hoàng Hộ, 2003; Nguyễn Thượng Dong và cs, 2007). 2.1.7. Trồng trọt Đinh lăng được trồng phân tán ở khắp nơi, để làm cảnh, lá làm gia vị, rễ làm thuốc. Hiện nay, một số nơi đã bắt đầu trồng Đinh lăng ở quy mô sản xuất thử (1000 - 2000 m2). Đinh lăng được nhân giống bằng cành trong chậu, góc sân, góc vườn, người ta chỉ cần lấy một đoạn thân cành cấm xuống đất là được. Nếu trồng diện tích lớn, chọn cành bánh tẻ có đường kính 1 - 1,5 cm, cắt thành từng đoạn dài 5 - 7 cm, giâm trong cát ẩm (70 %). Sau 7 - 10 ngày, hom giống nảy mầm và sau 1,5 - 2 tháng có thể ra ngòi. Cành giâm lúc đầu chỉ ra rễ ở đầu dưới của cành. Thực tiễn thấy rằng, rễ này nhỏ và chất lượng kém hơn rễ phát sinh từ gốc chồi tái sinh. Tuy nhiên, chồi tái sinh của Đinh lăng ra rễ rất chậm. Đó là lý do tại sao Đinh lăng lâu được thu hoạch. Vấn đề này đang được nghiên cứu để tìm giải pháp khắc phục. Đất trồng Đinh lăng cần nhiều màu, tầng canh tác sâu. Tơi xốp, cao ráo, thoát nước và tiện tưới. Sau khi làm đất, khơi rãnh thoát nước hoặc lên thành luống, bứng cây con ra trồng với khoảng cách 0,8 x 0,6 m. Mỗi gốc cây, cần bón lót 3 - 5 kg phân chuồng hoặc phân rơm mục. Đinh lăng trồng được quanh năm, tốt nhất là giâm cành vào tháng 5 - 6 và trồng vào tháng 7 - 8. Khi trồng nên cắt bớt lá để hạn chế thoát hơi nước, giúp cây nhanh hồi phục. Cây ưa bóng và ưa ẩm nên có thể trồng xen dưới tán cây trong vườn. Thường xuyên làm cỏ, nhất là lúc mới trồng cây. Từ giữa mùa xuân đến mùa thu, thời kỳ sinh trưởng mạnh, cần bón thúc cho cây. Dùng nước phân chuồng, nước giải pha loãng, phân vi sinh, liều lượng tùy thuộc độ sinh trưởng của cây. Đinh lăng không có sâu bệnh nghiêm trọng. Cây trồng sau 7 - 10 năm mới được thu hoạch. Cây càng già, năng suất và chất lượng rễ càng cao (Đỗ Huy Bích, 2006). 7
  19. 2.1.8. Thành phần hóa học Năm 1989, Nguyễn Khắc Viện đã nghiên cứu và cho thấy trong rễ có 4 % saccarose, một chất kết tinh A chưa xác định cấu trúc hóa học, có điểm sôi trong khoảng 158 - 161 oC, tan nhiều trong chloroform và aceton (Nguyễn Khắc Viện, 1989). Năm 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã công bố trong thành phần của rễ, thân và lá có các glycosid, alkaloid, tanin, vitamin B1 và khoảng 20 loại acid amin như arginin, alanin, asparagin, acid glutamic, leucin, lysin, phenylalanin, prolin, threonin, tyrosin, cystein, tryptophan, metionin (Nguyễn Thới Nhâm và cs, 1990). O O O H3C H3C NH N OH OH OH H NH2 NH2 O NH2 Arginin Alanin Asparagin O O O O H3C HS OH HO OH OH NH2 NH2 CH3 NH2 Cystein Acid Glutamic Leucin O O O S OH OH HN OH NH NH 2 2 Phenylalanin Prolin Metionin O CH3 O O OH HO OH OH NH NH2 NH 2 N 2 HO H Threonin Tyrosin Tryptophan O H2N OH NH2 Lysin Hình 2.4. Một số acid amin có trong Đinh lăng 8
  20. Năm 1990, Brophy Joseph J. và cộng sự đã dùng phương pháp GC - MS để phân tích thành phần tinh dầu của lá cây mọc ở Fiji và Thái Lan. Kết quả cho thấy trong tinh dầu có khoảng 24 cấu tử, trong đó có 4 chất chính là: β-elemen; β-germacren-D; E-γ-bisabolen và α-bergamoten (Brophy J.J et al., 1990). Năm 1991, Võ Xuân Minh cùng cộng sự đã khảo sát hàm lượng saponin toàn phần trong các bộ phận của cây Đinh lăng với kết quả: Rễ (0,49 %), vỏ rễ (1,00 %), lõi rễ (0,11 %) và lá (0,38 %) (Võ Xuân Minh và cs, 1991). Năm 1992, trong nghiên cứu tiếp theo, Võ Xuân Minh cho biết trong cây Đinh lăng có các alcaloid, glucosid, saponin, các vitamin tan trong nước như B1, B2, B6, C. Nghiên cứu cũng cho thấy rễ cây Đinh lăng có chứa tới 20 acid amin (Võ Xuân Minh, 1992). OH H3C N NH2 HO S OH N N OH OH H3C N N O CH3 NH H3C N O Vitamin B1 (Thiamin) Vitamin B2 (Riboflavin) OH HO OH H HO O OH O N CH3 HO OH Vitamin B6 (Pyridoxin) Vitamin C (Acid ascorbic) Hình 2.5. Một số vitamin có trong Đinh lăng Năm 1992, Lutomski và cộng sự đã cô lập từ rễ 5 hợp chất thuộc loại hợp chất polyacetylen: (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol; (8E)-heptadeca-1,8-dien- 4,6-diyn-3-ol-10-on; (8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on; falcarinol và panaxydol (Lutomski et al., 1992). OH O HO HO 4 6 8 4 6 8 3 10 3 17 10 1 17 1 9
  21. (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10- (8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol- diol 10-on HO 4 6 8 9 10 3 HO 4 6 1 17 10 3 O 17 1 (8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol- Palcarinol 10-on 17 HO 4 6 8 3 O 10 1 Panaxydol Cũng vào năm 1992, Nguyễn Thị Nguyệt và cộng sự đã cô lập được acid oleanolic (1) (Nguyễn Thị Nguyệt và cs, 1992; Nguyễn Thị Nguyệt, Võ Xuân Minh, Nguyễn văn Bàn, 1992). COOH OH Năm 1995, Chaboud A. và cộng sự đã cô lập từ lá một saponin triterpen, đó là acid 3- O-β-D-galactopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyloleanolic (2) (Chaboud A et al., 1995). 10
  22. CH3 CH3 CH3 CH3 COOH OH H CH3 HO O O OH HO H OH H3C CH3 O O HO Năm 1996, Chaboud A. và cộng sự đã cô lập từ lá khô, một saponin triterpen là: Acid 3-O-[α-rhamnopiranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D glucopyranosyl] leanolic (3) (Chaboud A et al., 1996). H3C CH3 CH3 CH3 COO OH H CH3 O HO O O OH HO O H H3C CH3 O HO OH OH CH3 OH HO OH Năm 1998, Võ Duy Huấn cùng cộng sự đã cô lập được 11 saponin triterpen: Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (4) (Võ Duy Huấn và cs, 1998). H3C CH3 CH3 CH3 COOH OH H CH3 OH O O O HO O H H3C CH3 OH OH HO HO Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (5) 11
  23. CH3 CH3 CH3 CH3 COOH H CH3 HOOC HO O O OH HO H H3C CH3 O O HO HO OH Acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic (6) CH3 CH3 CH3 CH3 COOH OH H CH3 HOOC OH O O O H HO OH HO H3C CH3 O O HO HO OH Acid 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic (7) CH3 CH3 CH3 CH3 COOH OH H CH3 HOOC OH O O O H HO HO OH H3C CH3 O O HO OH Acid 3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic(8) 12
  24. CH3 CH3 CH3 CH3 COOH OH H CH HO 3 O COOH OH O O O H HO H3C CH3 HO HO O O HO OH 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→ 4)-β-D-glucuronopyranosyl oleanolic 28-O-β-D- glucopyranosyl ester (9) CH3 CH3 O CH3 CH3 C OH H CH O HOOC 3 O O O O HO O HO HO H H3C CH3 OH HO OH OH HO HO 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (10) CH3 CH3 CH3 CH3 COO O OH H CH HO HOOC 3 O HO O O O H OH H3C CH3 HO HO HO O HO OH HO O OH HO HO 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2),β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β–D- glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (11) 13
  25. CH3 CH3 CH3 CH3 COO OH O H CH HO HOOC 3 O O O O H OH HO HO H C CH O 3 3 HO OH HO HO O OH HO HO 3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β–D- glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (12) CH3 CH3 CH3 CH3 COO O OH H CH HO HOOC 3 O HO O O O H OH H3C CH3 HO O HO HO HO OH HO O OH HO HO 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl ester (13) CH3 CH3 CH3 CH3 COO OH O H CH HO HOOC 3 O O O O HO HO H OH HO H3C CH3 OH OH HO O H C 3 O HO HO OH 14
  26. 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic 28-O-[ α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β–D-glucopyranosyl ester. (14) CH3 CH3 CH3 CH3 COO OH O H CH HO HOOC 3 O O O HO O H OH HO H C CH HO O 3 3 OH HO HO O O HO O HO HO OH HO HO OH Năm 2010, Nguyễn Thị Lan bằng phương pháp GC và GC/MS để phân tích thành phần tinh dầu của lá cây Đinh lăng ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa. Kết quả cho thấy trong tinh dầu Đinh lăng có 15 hợp chất như là β-elemen, -elemen, E-γ-bisabolen, α- bergamoten, β-germacren-D, Gecmacren-B, -farnesen (Nguyễn Thị Lan, 2010). β-elemen -elemen E-γ-bisabolen (3) α-bergamoten 15
  27. β-germacren-D Gecmacren-B -farnesen Hình 2.6. Một số hợp chất chính có trong tinh dầu Năm 2012, Viện hóa sinh biển - Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam đã phân lập được 3 hợp chất flavonoid từ lá Đinh lăng là quercitrin, afzelin và kaempferol-3-O- rutinosid (Nguyễn Thị Luyến và cs, 2012). OH OH OH OH O OH O OH O O OH OH O OH O O O O OH O OH OH O O OH OH O OH OH O HO OH OH OH OH OH quercitrin afzelin kaempferol-3-O-rutinosid Hình 2.7. Một số flavonoid từ lá Đinh lăng Năm 2014, Hồ Lương Nhật Vinh từ lá cây Đinh lăng đã 3 saponin triterpen: 3-O-[β-D-galactopyranosyl(1→4)-β-D glucoronopyranosyl] oleanolic acid 28-O-β- D-glucopyranosyl ester (15) ( Hồ Lương Nhật Vinh, 2014). 16
  28. CH3 CH3 O CH3 CH3 C OH OH OH O H CH O OH HOOC 3 O OH O O O HO HO H H3C CH3 HO OH OH 3-O-{β-D glucopyranosyl(1→2)-[β-D-galactopyranosyl(1→4)]-β-D- glucoronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D- glucopyranosyl] ester (16). CH3 CH3 O CH CH OH 3 3 OH OH O H CH3 O OH O COOH OH OH O O O H O HO HO H C CH OH 3 3 O OH O HO OH HO HO O HO OH 3-O-{β-D-glucopyranosyl(1→2)-[β-D-galactopyranosyl(1→4)]-β-D- glucoronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (17) (Hồ Lương Nhật Vinh, 2014). CH3 CH3 O CH CH OH 3 3 OH OH O H CH3 O OH O COOH OH O O O H HO HO OH HO H3C CH3 O HO HO O HO OH 17
  29. Năm 2016 Trần Thị Hồng Hạnh cùng cộng sự đã phân lập được 3 saponin triterpen từ lá Đinh lăng. Trong đó 3-O-{훽-D-glucopyranosyl-(1→2)-[훽-D-glucopyranosyl- (1→4)]-훽-D-glucuronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-훽-D-glucopyranosyl-(1→2)-훽- D-galactopyranosyl ester là saponin được phân lập lần đầu tiên, và được đặt tên là polyscioside I (18) (Trần Thị Hồng Hạnh, 2016). CH3 CH3 O CH3 CH3 OH O H CH HOOC 3 O O O O OH OH HO HO H H3C CH3 HO OH O O HO HO O O HO O HO HO HO OH OH Năm 2016, Nguyễn Thị Bích Thu và công sự Viện dược liệu đã phân lập được 5 hợp chất saponin triterpen từ rễ Đinh lăng. Và trong đó có một hợp chất lần đầu tiên được phân lập là falcarindiol (Nguyễn Thị Bích Thu và cs, 2016). OH 3 8 17 OH falcarindiol Hình 2.8. Công thức falcarindiol của cây Đinh lăng COOR2 R1O Hình 2.9. Công thức chung saponin triterpenoid của cây Đinh lăng 18
  30. Bảng 2.1. Tóm tắt các saponin triterpen trong cây Đinh lăng R1 R2 (1) H H (2) Gal-(1→2)-Glc- H (3) Rha-(1→4)-Glc- Glc- (4) Glc-(1→4)-Glc- H (5) Glc-(1→2)-Glc- H Glc-(1→2) Glc- (6) H Glc-(1→4) Ara-(1→2) Glc- (7) H Glc-(1→4) Gal-(1→2) Glc- (8) H Glc-(1→3) (9) Glc-(1→4)-Glc- Glc- Glc-(1→2) Glc- (10) Glc- Glc-(1→4) Ara-(1→2) Glc- (11) Glc- Glc-(1→4) Gal-(1→2) Glc- (12) Glc- Glc-(1→3) (13) Glc-(1→4) - Glc- Rha-(1→3)-Glc- Glc-(1→2) Glc- (14) Rha-(1→3)-Glc- Glc-(1→4) (15) Gal-(1→4)-Glc- Glc- 19
  31. Glc-(1→2) Glc- (16) Glc-(1→2)-Glc- Gal-(1→4) Glc-(1→2) Glc- (17) Glc- Gal-(1→4) Glc-(1→2) Glc- (18) Glc-(1→2)-Gal- Glc-(1→4) 2.1.9. Tác dụng dược lý Đinh lăng là loài cây quen thuộc với nhiều gia đình Việt Nam. Ở nước ta, Đinh lăng có từ lâu và được trồng phổ biến ở vườn trong gia đình, trong khuôn viên đình chùa, trạm xá, bệnh viện để làm cảnh, làm thuốc và còn được làm gia vị. Trong cuộc sống thường ngày, lá cây được sử dụng như rau sống hoặc có thể ăn kèm trong món gỏi cá. Theo y học cổ truyền, rễ cây có vị ngọt, hơi đắng, tính mát, có tác dụng thông huyết mạch, bồi bổ khí huyết; lá Đinh lăng có vị đắng, tính mát có tác dụng giải độc thức ăn, chống dị ứng, chữa ho ra máu, kiết lỵ. Toàn cây Đinh lăng bao gồm rễ, thân, lá đều có thể sử dụng làm thuốc với nhiều công dụng và bài thuốc khác nhau. Từ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, Đinh lăng đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu bài bản về tính ưu việt trên nhiều góc độ khác nhau trong nhiều năm. Theo nghiên cứu của GS Ngô Ứng Long và cộng sự của ông thuộc học viện Quân y. Trong rễ Đinh lăng có chứa nhiều saponin giống như sâm, các vitamin B1, B2, B6, C và 20 acid amin cần thiết cho cơ thể và những acid amin không thể thay thế được như lyzin, cystein, methionin. Song song đó, TS Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự tại Trung tâm Sâm và dược liệu TP HCM cũng đã dành nhiều thời gian và tâm huyết nghiên cứu tác dụng của cây Đinh lăng trong suốt 7 năm (2000 - 2007). Những nghiên cứu của TS Hương đã chỉ ra Đinh lăng có các tác dụng dược lý tương tự như cây sâm nhưng giá thành lại rẻ hơn và dễ trồng hơn sâm. Cụ thể, theo nghiên cứu của tác giả, cây có tác dụng tăng thể lực, kích thích các hoạt động của não bộ, giải tỏa lo âu, mệt mỏi, chống oxy hóa, bảo vệ gan và kích thích miễn dịch. Qua các kết quả nghiên cứu trên, với những tác dụng quý của mình, Đinh lăng được gợi ý cho các đối tượng như dùng cho lực lượng vũ trang với tác dụng tăng lực, tăng 20
  32. khả năng làm việc, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể; dùng cho vận động viên thể thao để tăng độ dẻo dai, tăng sức bền, tăng thành tích thi đấu. Bên cạnh đó, Đinh lăng còn dùng cho phi hành gia trong thời gian rèn luyện để tăng sinh thích nghi, tăng sức chịu đựng của cơ thể, tăng sức đề kháng, giảm sự mệt mỏi trong điều kiện môi trường bất lợi. Đinh lăng là sâm quý của người Việt bởi các tác dụng dược lý trên cơ thể cũng như tính an toàn cho bệnh nhân sử dụng (Đỗ Huy Bích, 2006; Trần Yên, 1994; Ngô Ứng Long và cs, 1993; www.wikiwand.com). Đinh lăng có một số tác dụng cụ thể như sau: Tăng lực trên động vật thí nghiệm và trên người. Thân và lá cũng có tác dụng tăng lực nhưng yếu hơn so với rễ. Làm tăng hiệu lực điều trị của cloroquin trong bệnh sốt rét thực nghiệm trên động vật. Tăng co bóp tử cung và tăng tiết niệu. Tác dụng an thần và ít độc. Đinh lăng đã được nghiên cứu và chứng minh có tác dụng nội tiết kiểu oestrogen. Nước sắc Đinh lăng có tác dụng kháng đối với trùng roi Euglena vindis, trùng tiêm mao Paramecium caudatum và một số động vật nguyên sinh khác trong nước ngâm rơm và nước ao. Nước sắc Đinh lăng còn có tác dụng chống choáng phản vệ ở mức độ vừa, bảo vệ được 60 % chuột lang qua cơn choáng. Dựa theo kinh nghiệm nhân gian, Đinh lăng được áp dụng điều trị bệnh nhân lỵ amip cấp. Sau 10 ngày, hết triệu chứng lâm sàng, và sau 16 ngày xét nghiệm lại, trong phân hết thể amip thực huyết, hết kén. Đinh lăng có tác dụng kháng Entamoeba histolyica, làm đơn bào co thành kén và có tác dụng kích thích miễn dịch gây chuyển dạng lympho bào trong thí nghiệm nuôi cấy in vitro. Đinh lăng đã được nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu trong thí nghiệm gây mẫn cảm chuột nhắt bằng hồng cầu cừu. Sau đó 4 ngày, mổ tách tế bào lách và ủ với kháng nguyên trong môi trường. Đếm số tế bào mảng dung huyết và thấy Đinh lăng thể hiện tác dụng kích thích miễn dịch mạnh. Đã thử tác dụng chống trầm uất theo nghiệm pháp “trạng thái thất vọng”, chống trầm uất. Trong thí nghiệm trên động vật được uống Đinh lăng cũng như trong thí nghiệm in vitro, ủ tổ chức não hoặc gan với chiết Đinh lăng và sau đó định lượng hoạt độ men MAO, thấy Đinh lăng có tác dụng ức chế mạch hoạt độ men MAO ở não và gan. Đinh lăng còn có tác dụng giảm chứng tăng cholesterol trong máu gây theo cơ chế nội sinh bằng Tween 80 (Nguyễn Thị Thu Hương, 2009; Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, 2001). 21
  33. Dịch chiết Đinh lăng còn được thử tác dụng với ATPase màng tế bào, thấy K+ Na+ ATPase điều được kích thích bởi dịch chiết thân, rễ và lá của cây. Đối với ATPase dạng hòa tan, kết quả tương tự như ATPase của màng tế bào. Sự kích thích hoạt tính men của dịch chiết Đinh lăng có khả năng đề kháng sự kìm hãm K+ Na+ ATPase của aminazin. Đinh lăng có tác dụng kích thích sinh dục ở động vật già và kích thích tăng sinh lực ở động vật gây mệt mỏi, tác dụng kéo dài và bền vững. Đinh lăng ít độc hơn cả Nhân sâm và khác với Nhân sâm, nó không làm tăng huyết áp. Nước sắc rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể. Đinh lăng làm cho nhịp tim sớm trở lại bình thường sau khi chạy dai sức làm cơ thể chịu được nóng. Người bệnh bị suy mòn uống Đinh lăng chóng phục hồi cơ thể, ăn ngon, ngủ tốt, tăng cân. Falcarinol và heptadeca thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram dương mạnh và vi khuẩn gây bệnh nấm da, cho thấy hoạt tính kháng nấm. Hoạt tính kháng khuẩn của falcarinol được tìm thấy mạnh hơn 15 - 35 lần so với erythromycin, chloramphenicol và oxytetracycline (Đỗ Huy Bích, 2006; Võ Văn Chi, 2012; Đỗ Tất Lợi, 2004; Nguyễn Thị Thu Hương và cs, 2003). Năm 1961, các khoa dược lý, dược liệu và giải phẫu bệnh lý Viện y học quân sự Việt Nam nghiên cứu tác dụng của Đinh lăng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể và một số tác dụng khác đã đi đến kết luận sau: - Nước sắc rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể trên thí nghiệm cấp tính tương tự như Sâm. - Với liều 0,1 ml cao lỏng Đinh lăng cho 20 g thể trọng sống làm giảm hoạt động của chuột trắng. - Đinh lăng có tác dụng trực tiếp trên cơ tim ếch với liều nhất định làm giảm trương lực cơ tim, làm tim co bóp yếu và thưa, tiến tới tim ngừng đập. - Dùng dịch nước 0,2 đến 1 % rễ Đinh lăng gây co mạch tai thỏ. - Với liều 0,5 ml dung dịch cao Đinh lăng 100 – 200 % trên 1 kg thể trọng tiêm tĩnh mạch vành tai làm tăng cường hô hấp về biên độ và tần số: Huyết áp nhất thời hạ xuống. - Trên tử cung tại chỗ, với liều 1 ml dung dịch cao Đinh lăng 100 % cho 1 kg thể trọng tiêm tĩnh mạch vành tai làm tăng co bóp tử cung nhẹ. - Đinh lăng có tác dụng tăng tiết niệu trên 5 lần so với bình thường với liều uống 2 ml dung dịch Đinh lăng 100 % cho 100 g thể trọng (thí nghiệm trên chuột bạch Trung Quốc). - Liều độc: Đinh lăng ít độc hơn so với Nhân sâm và Ngũ gia bì. Cho chuột uống với liều 50 g/kg thể trọng chuột vẫn sống bình thường. 22
  34. - Làm tăng sức đề kháng của chuột đối với tác hại của bức xạ siêu tần. - GS Ngô Ứng Long và Xavaev (Liên Xô cũ) đã cùng nhận thấy Đinh lăng có tác dụng tốt đối với các nhà du hành vũ trụ khi luyện tập ở tư thế tĩnh, đầu dốc ngược. - Thực nghiệm trên người, viên bột rễ Đinh lăng làm tăng khả năng chịu đựng của bộ đội, vận động viên thể dục, thể thao trong các nghiệm pháp gắng sức cũng như luyện tập (Đỗ Tất Lợi, 2004; Ngô Ứng Long và cs, 1993; Nguyễn Thị Thu Hương và cs, 2003). 2.1.10. Công dụng và liều dùng 2.1.10.1. Công dụng Theo y học hiện đại, cây Đinh lăng có một số tác dụng chính như: Tác dụng bổ chung, ăn ngon, dễ ngủ và tăng cân, tăng lực, tăng khả năng lao động nặng và phục hồi sức khỏe tốt, hoạt hóa các tế bào thần kinh, tăng cường trí nhớ (Quách Tuấn Vinh, 2005; Nguyễn Thượng Dong và cs 2007). Theo Đông y: Đinh lăng có tác dụng giải độc, ban chẩn, thương hàn nhập lý, thông tiểu tiện, mát phổi, ho ra máu, kiết lỵ, phong thấp, nhức mỏi chân tay (Quách Tuấn Vinh, 2005). Rễ Đinh lăng được dùng làm thuốc bổ tăng lực, chữa cơ thể suy nhược, gầy yếu, mệt mỏi, tiêu hóa kém, phụ nữ sau khi sinh ít sữa. Có nơi còn dùng chữa ho, đau tử cung, thuốc lợi tiểu, chống độc và co rút tử cung (Phạm Hoàng Hộ, 2003; DĐVN IV, 2009). Lá chữa cảm sốt, mụn nhọt sưng tấy, sưng vú, dị ứng mẩn ngứa, vết thương (giã đắp). Thân và cành chữa thấp khớp, đau lưng. Ở Ấn Độ, Đinh lăng được dùng làm thuốc làm săn da và trị sốt rét. Rễ và lá sắc uống có tác dụng lợi tiểu chữa sỏi thận, sỏi bàng quang, chứng khó tiểu tiện. Bột lá được giã với muối và đắp trị vết thương (DĐVN IV, 2009; Đỗ Tất Lợi, 2004). 2.1.10.2. Liều dùng Ngày dùng từ 1 g đến 6 g, dạng thuốc sắc hoặc 2 g trở lên với thuốc tán bột (Dược Điển Việt Nam IV, 2009). Trên cơ sở kết quả nghiên cứu dược lý, Viện y học quân sự Việt Nam năm 1964 cho thí nghiệm dùng trên người với liều 0,23 g đến 0,50 g bột Đinh lăng trong một ngày dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu nhẹ độ (khoảng 30o) thì có kết quả tăng sức dẻo dai của cơ thể như khi nghiên cứu trong qui mô phòng thí nghiệm (Đỗ Tất Lợi, 2004). 23
  35. Một số bài thuốc Chữa mỏi mệt mỏi, biếng hoạt động Rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 5 g. Thêm 100 ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2 – 3 lần uống trong ngày. Chữa sốt lâu ngày, nhức đầu, ho, đau, tức ngực, nước tiểu vàng Đinh lăng rễ tươi (rễ, cành) 30 g, lá hoặc vỏ Chanh 10 g, vỏ Quýt 10 g, Sài hồ (rể, lá, cành) 20 g, lá Tre tươi 20 g, Cam thảo dây hoặc Cam thảo đất 30 g, Rau má tươi 30 g, Me đất 20 g. Các vị cắt nhỏ, đổ ngập nước, sắc đặc lấy 250 ml, chia uống 3 lần trong ngày. Chữa sưng vú Cành lá Đinh lăng 30 – 40 g. Thêm 300 ml, sắc còn 200 ml, uống nóng. Ngày uống 1 – 2 lần. Thuốc lợi sữa Lá Đinh lăng tươi 50 – 100 g, Bong bóng lợn 1 cái. Băm nhỏ, trộn với gạo nếp, nấu cháo ăn. Chữa đau tử cung Cành lá Đinh lăng rửa sạch sao vàng, sắc uống thay nước. Đây là kinh nghiệm của Hải Thượng Lãn Ông. Chữa mẩn ngứa do dị ứng Lá Đinh lăng 80 g, sao vàng, sắc uống. Dùng trong 2 - 3 tháng. Chữa thiếu máu Rễ Đinh lăng, Hà thủ ô, Thục địa, Hoàng tinh, mỗi vị 100 g, Tam thất 20 g. Tán bột, sắc uống ngày 100 g. Chữa viêm gan mạn tính Rễ Đinh lăng 12 g, Nhân trần 20 g, Ý dĩ 16 g; Chi tử, Hoài sơn, Biển đậu, rễ Cỏ tranh, Xạ tiền tử, Ngũ gia bì, mỗi vị 12 g; Uất kim, Nghệ, Ngưu tất, mỗi vị 8 g. Sắc uống, ngày một thang. Chữa liệt dương Rễ Đinh lăng, Hoài sơn, Ý dĩ, Hoàng tinh, Hà thủ ô, Kỳ tử, Long nhãn, Cám nếp, mỗi vị 12 g; Trâu cổ, Cao ban long, mỗi vị 8 g; Sa nhân 6 g. Sắc uống, ngày một thang. Chữa sốt rét 24
  36. Rễ Đinh lăng, Sài hồ, mỗi vị 20 g; Rau má 16 g; lá Tre, Cam thảo nam, mỗi vị 12 g; Bán hạ sao vàng 8 g, Gừng 6 g. Sắc uống. Chữa phong tê thấp, đau xương khớp, đau lưng Đinh lăng 100 g, thái khúc, sao vàng, sắc uống hằng ngày thay nước. Phòng tác dụng của thuốc điều trị lao Lá Đinh lăng sao vàng 20 g - 25 g, hãm uống nước dùng hằng ngày. Phòng co giật ở trẻ em Lấy lá Đinh lăng phơi khô rồi lót vào gối hay trải xuống giường cho trẻ em nằm. (Đỗ Huy Bích, 2006; Quách Tuấn Vinh, 2005; chuthapdo.org.vn; ydvn.net). 2.1.11. Sản phẩm Đinh lăng có mặt trên thị trường Rượu Đinh lăng ❖ Thành phần - Rễ Đinh lăng khô khoảng 100 g - 150 g. - 1 lít rượu ngon có độ cồn khoảng 35 - 40o. ❖ Công dụng - Khí huyết lưu thông, ăn ngon, ngủ yên, tăng cường sinh lực. - Trị đau xương khớp. Đinh lăng trà TRC ❖ Thành phần - Đinh lăng 1,5 g - Lá Vằng 0,2 g - Lá Sen 0,2 g - Cỏ ngọt 0,1 g ❖ Công dụng - Tăng tuần hoàn não, giảm hội chứng tiền đình, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, ù tai. - Tăng khả năng tập trung, giảm tình trạng căng thẳng thần kinh, mất trí nhớ, run chân tay. ❖ Cách dùng - Nhúng túi trà vào trong nước sôi, chờ 3 - 5 phút. - Ngày dùng từ 4 - 6 túi (lasen.com.vn). Trà Đinh lăng 25
  37. ❖ Thành phần - Đinh lăng - Cỏ ngọt ❖ Công dụng - Tăng tuần hoàn não, giảm hội chứng tiền đình: Đau đầu, chóng mặt, ù tai, mất ngủ, mất thăng bằng. - Tăng khả năng tập trung, giảm tình trạng căng thẳng thần kinh, mất trí nhớ, run chân tay. ❖ Cách dùng - Dùng cho mọi lứa tuổi. - Những túi trà vào ấm nước sôi 150 ml - 200 ml, chờ 2 - 3 phút. Có thể thêm đá theo ý thích (quagac.com). Hoạt huyết dưỡng não HBN ❖ Thành phần - Cao mềm Đinh lăng 150 mg - Cao lá Bạch quả 10 mg - Tá dược vừa đủ 1 viên ❖ Công dụng - Phòng và điều trị chứng suy giảm trí nhớ, thiếu tuần hoàn não. - Thích hợp cho người làm việc trí óc căng thẳng bị đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, mệt mỏi. ❖ Cách dùng - Người lớn: 1 - 2 viên/lần, ngày uống 2 - 3 lần. - Trẻ em trên 6 tuổi: 1 viên/lần, ngày uống 2 lần. Gối lá Đinh lăng ❖ Thành phần - Lá Đinh lăng. - Vỏ gối. ❖ Công dụng Gối lá Đinh lăng được làm đúng quy cách tiêu chuẩn sẽ cho bé giấc ngủ ngon, chống mồ hôi trộm, hết tật giật mình, tránh được muỗi và côn trùng. ❖ Cách dùng Đối với trẻ từ 0 - 24 tháng tuổi nên sử dụng gối size 26 cm x 40 cm. Trẻ trên 24 tháng tuổi nên sử dụng gối size 30 cm x 46 cm (goianhviet.com). 26
  38. Gỏi cá Rượu Đinh lăng Đinh lăng trà - TRC Trà Đinh lăng Hoạt huyết dưỡng não HBN Gối Đinh lăng - Anh Việt Hình 2.10. Sản phẩm Đinh lăng 2.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT Để khảo sát thành phần hóa thực vật của một loài cây thì các nhà nghiên cứu đã đưa ra quyết định và làm việc trên một loài cây mà tùy vào mục đích lựa chọn trước. Việc lựa chọn này phụ thuộc rất nhiều tài liệu tham khảo và các phương tiện sẵn có hoặc liên kết được của phòng thí nghiệm đó. Các tài liệu tham khảo đó có thể là dữ liệu tin học NAPRALERT cho biết các thông tin về hóa - thực vật, đặc điểm thực vật, hoạt tính sinh học của hợp chất cụ thể, hoặc tất cả các thông tin về vùng địa phương, từng quốc gia (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 27
  39. Trong nghiên cứu và sản xuất dược liệu và các chế phẩm từ Dược liệu, để chiết xuất và tinh chế các cao chiết Dược liệu; kiểm soát và đảm bảo chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu hay phân lập các chất tinh khiết người ta cần phải biết thành phần (ở mức độ cao hơn là cấu trúc hóa học) của các chất trong dược liệu đó. Trong sử dụng Dược liệu, có nhiều trường hợp dược liệu được sử dụng nhiều và có hiệu quả trong điều trị nhưng thành phần hóa học của chúng lại không được biết đầy đủ hay đôi khi hoàn toàn chưa được nghiên cứu sâu. Ngày nay việc hiểu biết về thành phần hóa thực vật của các dược liệu càng trở nên quan trọng hơn khi mà tiêu chuẩn hóa Dược liệu, kiểm soát chất lượng dược liệu và các dạng chế phẩm từ dược liệu có xu hướng là những yêu cầu bắt buộc để đảm bảo tính an toàn, hiệu quả và chất lượng của sản phẩm cho người sử dụng. Thành phần hóa học của một dược liệu rất phức tạp và thường không thể được biết tường tận. Vì thế, thông thường ở mức độ đơn giản nhất, việc nghiên cứu thành phần hóa học của dược liệu thường được bắt đầu bằng việc xác định các nhóm hợp chất thường gặp trong thực vật bằng các phản ứng hóa học. Việc xác định này được gọi là “Phân tích thành phần hóa thực vật”. Trong phân tích thành phần hóa thực vật, người ta thường sử dụng các phản ứng hóa học đặc trưng cho một nhóm hợp chất để xác định sự có mặt của nhóm hợp chất này trong nguyên liệu thực vật. Việc phân tích này được tiến hành theo 2 bước: Phân tích sơ bộ: Các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành một vài phân đoạn đơn giản bằng cách sử dụng các quy trình chiết đơn giản, trong những điều kiện nhất định (dung môi, pH môi trường v.v ). Định tính nhanh các hợp chất trong các phân đoạn bằng một số thuốc thử chung. Định tính xác định: Dùng các quy trình chiết đặc hiệu hơn, nhiều phản ứng đặc hiệu hơn để xác nhận sự có mặt của nhóm hợp chất. Không phải tất cả các nhóm hợp chất trong dược liệu đều có thể được định tính. Phân tích thành phần hóa thực vật chỉ có thể xác định một số nhóm hợp chất phổ biến trong thực vật. Ở mức độ cao hơn, việc định tính các nhóm hợp chất bằng các phương pháp khác nhau như: Các phương pháp sắc ký kết hợp với định tính hóa học, kết hợp với phân tích quang phổ cũng có thể được sử dụng (ĐH Y Dược TPHCM, 2014). Quy trình dùng để xác định nhanh một số nhóm hợp chất thường gặp trong nguyên liệu thực vật bằng các phản ứng hóa học (thường được gọi là phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật) dựa trên nguyên tắc: 28
  40. Phân tách hỗn hợp các chất trong nguyên liệu thành những phân đoạn đơn giản. Dùng các phản ứng hóa học đặc trưng (thường là các phản ứng kết tủa, phản ứng màu) để phát hiện các nhóm hợp chất có trong dịch chiết. Kết quả của các phản ứng đặc trưng, đặc biệt là các phản ứng màu, phụ thuộc nhiều vào mức độ “tinh khiết” của nhóm chất đó trong môi trường phản ứng. Phản ứng của một hợp chất hay một nhóm hợp chất “tinh khiết” có thể khác biệt nhiều hay ít, đôi khi khác biệt hoàn toàn với phản ứng của nó trong một hỗn hợp. Trong hỗn hợp, các nhóm hợp chất ảnh hưởng đến kết quả phản ứng của một nhóm hợp chất khác thường được xem là các “tạp chất”. Các “tạp chất” này có thể ảnh hưởng đến kết quả định tính theo hai hướng: - Cản trở phản ứng, làm cho phản ứng khó xảy ra hay không thể xảy ra. - Cản trở việc nhận định kết quả phản ứng do bản thân chúng che lắp kết quả phản ứng hay chúng cũng phản ứng với thuốc thử và tạo ra sản phẩm che lắp kết quả. Vì thế, việc tách các chất có trong nguyên liệu thực vật thành các phân đoạn có các thành phần đơn giản trước khi tiến hành định tính là cần thiết để có thể thu được một kết quả tốt. Trong phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vât, tách các phân đoạn đơn giản chủ yếu dựa vào tính tan của các nhóm hợp chất trong các môi trường (dung môi, pH) khác nhau. Các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành các nhóm theo độ phân cực của chúng. Thông thường chúng được phân thành 3 nhóm: - Nhóm các chất không hoặc kém phân cực. - Nhóm các chất có độ phân cực trung bình. - Nhóm các chất có độ phân cực mạnh. Trong một số trường hợp, sự thay đổi mức độ ion hóa của phân tử (dẫn tới thay đổi tính tan) của một nhóm chất trong môi trường acid hay base cũng được dùng để tách các phân nhóm. Yêu cầu chung của các phản ứng hay các thuốc thử sử dụng trong định tính một hợp chất là chúng phải đặc hiệu, nhạy và dễ phát hiện. Chúng cũng phải không hay ít bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các nhóm hợp chất khác có trong môi trường phản ứng. Có một số quy trình khác nhau để định tính các nhóm hợp chất thường gặp trong thực vật. Các quy trình khác nhau chủ yếu ở việc sử dụng dung môi để chiết tách hỗn hợp và số lượng các nhóm hợp chất được định tính. Một số quy trình phân tích được sử dụng trong sàng lọc các chất vô cơ và hữu cơ đã được sử dụng từ lâu trong các phòng thí nghiệm là quy trình phân tích của Stas - Otto. 29
  41. Quy trình này sử dụng chủ yếu cho các hỗn hợp các chất tổng hợp. Các quy trình phân tích được sử dụng trong phân tích thành phần hóa học của các thực vật có thể kể là quy trình phân tích của Puri (Hungari), của Schreiber (Đức) và quy trình phân tích của I. Ciulei (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) v.v Trong các quy trình trên, quy trình phân tích của I. Ciulei (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) thường được dùng vì những ưu điểm của nó so với các quy trình khác. Nó xác định được nhiều nhóm hợp chất trong nguyên liệu thực vật, cách thực hiện không quá phức tạp và có thể tiến hành trong một khoảng thời gian ngắn, với một lượng nguyên liệu nhỏ (khoảng 5 - 25 g). Kết quả có thể cho một khái niệm về thành phần hóa thực vật của một dược liệu (ĐH Y Dược TPHCM, 2014). 2.3. Một số phương pháp chiết tách Mục đích của việc tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên. Khảo sát thành phần hóa học của một cây mới, trước đó chưa ai nghiên cứu và xem những chất này có hoạt tính sinh học. Muốn biết được điều này cần phải cô lập hợp chất đạt độ tinh khiết > 95 % mới có thể khảo sát cấu trúc hóa học bằng phương pháp quang phổ hiện đại. Cần có thêm lượng mẫu một hợp chất đã biết cấu trúc hóa học, muốn khảo sát thêm về hoạt tính sinh học của chất đó. Nếu việc thử nghiệm cho kết quả hấp dẫn thì sẽ xem xét có thể tổng hợp hóa học hợp chất đó để có số lượng nhiều hơn. Tìm hiểu một hợp chất đã biết và xem chất này được sản sinh ra từ bộ phận nào của sinh vật. Tìm hiểu sự khác biệt của những chất biến dưỡng thứ cấp được sản sinh ra từ cùng một nguồn tự nhiên nhưng không cùng điều kiện sinh thái: Thí dụ tìm hiểu xem hai thực vật cùng họ (family), cùng chi (genus), cùng loài (species) nhưng mọc ở hai nơi có điều kiện khí hậu, đất đai thổ nhưỡng khác nhau có chứa cùng những hợp chất tự nhiên và những chất này có cùng hàm lượng hay không. Có nhiều phương pháp để tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên từ cây cỏ: Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký gel, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc cô lập chất phức tạp hơn vì không biết được cây đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học như thế nào. Biết rằng cây cỏ cần khảo sát có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất phân cực, vì thế nếu muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn. Vì vậy, người ta thường chuẩn bị một loạt các cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết chứa tương đối ít 30
  42. hợp chất, giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng. Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau”: Dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có tính phân cực trung bình sẽ hòa tan các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất. Tùy theo cơ chế và đặc điểm của quá trình chiết mà người ta phân ra: - Chiết lỏng - lỏng (phân bố lỏng - lỏng) với cơ chế chính là quá trình phân bố của chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố. - Chiết rắn - lỏng với cơ chế chính là sự hòa tan của chất tan vào dung môi. Trong chiết rắn - lỏng, chất tan có thể đi vào dịch chiết bằng sự hòa tan đơn giản, nhưng cũng có thể chịu sự tác động bởi nhiều các quá trình khác như khi chiết các chất tan từ một Dược liệu. Trong quá trình chiết thông thường, các tiểu phân chất rắn chịu tác động của dung môi trong điều kiện như nhau. Các chất tan hòa tan trong dung môi thành dung dịch và tạo nên dịch chiết, sự hòa tan này ít bị ảnh hưởng bởi các chất không tan. Trong quá trình chiết các chất từ các tổ chức sống (các mô tế bào động, thực vật và vi sinh vật), các chất nằm bên trong các tế bào, cách biệt với bên ngoài bởi vách tế bào, vì thế các chất tan sau khi hòa tan thành dung dịch còn phải vượt qua vách tế bào ra khỏi các mô để đi vào dịch chiết. Quá trình chiết các chất tan từ các tổ chức sinh học vì thế thường được gọi là quá trình “chiết xuất” (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi. Cao alcol thô ban đầu (thí dụ bột cây được tận trích với metanol 80 %, đuổi dung môi thu được alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ eter dầu hỏa ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo ), dung môi phân cực trung bình (thí dụ như dietyleter, chloroform ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức eter - O -, aldehyd - CH = 31
  43. O, ceton - CO -, ) và dung môi phân cực mạnh (thí dụ metanol ) hòa tan các hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức - OH, - COOH ) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Nguyên tắc cơ bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K. Ca= Nồng độ của chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng. K = Cb= Nồng độ của chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng Mục đích chính của sự chiết bằng dung môi là để sơ bộ, tinh chế hóa một hợp chất nào đó. Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với chất X này có hằng số phân bố tương đối lớn còn các chất tạp bẩn cũng như các chất khác thì có cấu trúc hóa học không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó. Hằng số của chất tan tương đối ít thay đổi theo nhiệt độ hoặc nồng độ của chất tan đó có trong dung dịch ban đầu, tuy nhiên hằng số này thay đổi nhiều tùy thuộc vào dung môi (độ phân cực, đặc tính ái nước của dung môi) và dung dịch nước. Riêng với dung dịch nước, pH của dung dịch có những ảnh hưởng rất quan trọng, nhất là ở pH acid yếu và ở pH base yếu. Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước. Sử dụng các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước, để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau. Và còn tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hay ở lớp dưới so với pha nước. Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi hữu cơ phân cực hơn thí dụ như: Ether dầu hỏa hoặc hexan, ether etyl, chloroform, ethyl acetat, n-butanol Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến không còn chất hòa tan vào dung môi thì chuyển sang chiết với dung môi có độ phân cực cao hơn. Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan với nước như: Na2SO4, MgSO4, CaSO4, , loại dung môi (bằng cách cô thu hồi dung môi) và cuối cùng là thu được cao chiết. Muốn kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp chất nào còn ở lại trong pha nước .thì ta có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng (SKLM); 32
  44. trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và pha hữu cơ. Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ. Song song đó, chúng ta cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên một tấm kiếng sạch, sau khi đuổi bay hết dung môi, thì giọt dung dịch lần thứ n đó không còn để lại vết nào trên tấm kiếng đó. Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng - lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi cũng sẽ tăng lên và những nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều sự thay đổi. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần, nên ở những lần chiết sau, dung môi trong bình lóng sẽ tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp. Để khắc phục nhược điểm này, có thể sử dụng các cách như: dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào bình chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ bọt khí; muối NaCl làm giảm sự hòa tan vào nhau giữa acetonitril và nước, một lượng tối thiểu khoảng 20 g NaCl được cho vào một lít dung dịch gồm acetonitril: nước (1 : 1) sẽ làm dung dịch này tách thành 2 lớp; độ hòa tan của một vài hợp chất thay đổi đáng kể khi có sự hiện diện của nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.2. Kỹ thuật chiết rắn - lỏng Một số phương pháp chiết rắn - lỏng: - Kỹ thuật chiết ngấm kiệt. - Kỹ thuật chiết ngâm dầm. - Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet. - Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Kumagawa. - Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước. - Chiết các nguyên liệu tươi. - Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt. Ngấm kiệt là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua dược liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hòa tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi dịch chiết đi từ nơi dược liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn. 33
  45. Do quá trình chiết xảy ra theo gradient nồng độ nên quá trình chiết xảy ra triệt để hơn, lượng dung môi sử dụng ít hơn phương pháp ngâm và dược liệu được chiết kiệt hơn. Các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, chất diện hoạt v.v có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết. Quá trình ngấm kiệt được thực hiện trong bình chiết được gọi là bình ngấm kiệt. Hình dạng, cấu tạo và kích thước của bình ngấm kiệt có thể thay đổi tùy theo mục đích sử dụng nhưng thông thường phần thân chính của bình ngấm kiệt có dạng hình nón cụt có thể kín và có van điều chỉnh lưu lượng ở một đầu hay có nắp kín với van điều chỉnh ở cả hai đầu. Quá trình ngấm kiệt có thể được tiến hành dưới nhiệt độ thường hay ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Bình được thiết kế với bộ phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi được đưa vào bình ở nhiệt độ cao. Chú ý: Khi ngấm kiệt ở nhiệt độ cao có thể làm tăng tốc độ chiết nhưng có thể dẫn đến phân hủy chất dễ chuyển hóa bởi nhiệt. Có thể thực hiện ngấm kiệt và rút kiệt dịch chiết trên từng bình ngấm kiệt riêng lẻ hay kết hợp nhiều bình ngấm kiệt nối tiếp với nhau (ngấm kiệt ngược dòng). Trong ngấm kiệt ngược dòng, hệ thống được bố trí sao cho dịch chiết loãng của bình chiết trước sẽ là dung môi đầu cho bình chiết sau và mỗi bình chỉ lấy ra một lượng dịch chiết đậm đặc nhất định. Với ngấm kiệt ngược dòng, lượng dịch chiết thu được từ mỗi bình luôn nhỏ hơn nhiều và có nồng độ cao nhất so với ngấm kiệt từng bình riêng lẻ mà vẫn đảm bảo chiết kiệt Dược liệu. Có 3 phương pháp ngấm kiệt: - Ngấm kiệt thường. - Ngấm kiệt kèm sấy phun. - Ngấm kiệt ngược dòng. Ngấm kiệt thường là phương pháp được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp. - Dụng cụ: Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, inox, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết. - Tiến hành: 34
  46. Dược liệu được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm. Mẫu không nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt, mẫu được xay quá mịn hoặc mẫu có tính nhầy nhựa hoặc có thể trương nở sẽ cản trở dòng chảy. Bột dược liệu được làm ẩm với một lượng dung môi chiết với một lượng vừa đủ để trong khoảng 4 giờ. Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ. Đậy bề mặt lớp bột đã làm ẩm bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp trên lớp mặt. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội. Để yên sau một thời gian, thường là 12 - 24 giờ, mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này. Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gì trên mặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì là đã chiết kiệt (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Kỹ thuật chiết ngâm dầm Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong những dụng cụ thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra ở mọi thời điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút ra khỏi thiết bị cùng một lúc. Quá trình ngâm này có thể được lặp lại thêm 1 hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong Dược liệu. Sự khuấy trộn, các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm, vi sóng, chất diện hoạt v.v có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). ❖ Phương pháp ngâm lạnh Trong phương pháp ngâm lạnh, dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm bình thường không dưới 12 giờ với các dược liệu mỏng manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết được căn bản hoàn tất. Trong thời gian này, cân bằng về nồng độ hoạt chất giữa bên trong và bên ngoài thành tế bào được thiết lập và quá trình thẩm thấu sẽ kết thúc. Thời gian ngâm có thể kéo dài hơn, từ một đến nhiều ngày, tùy theo Dược liệu, loại dung môi và yêu cầu chiết xuất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). ❖ Phương pháp ngâm nóng 35
  47. Phương pháp ngâm nóng là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn ở nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn. Quá trình hãm trong y học cổ truyền và trong cuộc sống hằng ngày (hãm thuốc, hãm trà) chính là quá trình ngâm nóng với dung môi là nước. Chưng cũng có thể coi là một biến thể của phương pháp này (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần với một lượng nhỏ dung môi. Kumagawa cho phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet thực ra gần với phương pháp ngâm lạnh hơn. Túi đựng bột dược liệu của kỹ thuật Kumagawa gần nguồn nhiệt hơn. Chiết hồi lưu với quy mô nhỏ. Dụng cụ gồm 3 phần chính. - Bình cầu đun có điều nhiệt. - Thân Soxhlet. - Bộ sinh hàn. Dịch chiết sẽ được thu tại bình cầu đun. Thời gian chiết 12 – 24 – 36 giờ. Ưu điểm: Lượng dung môi sử dụng nhỏ mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất. Nhược điểm: Khó thực hiện cho một lượng lớn Dược liệu. Thông thường, chỉ dùng để chiết trong phòng thí nghiệm hoặc quy mô pilot. Không khấy trộn được trong quá trình chiết xuất. Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước. Kỹ thuật đặc trưng để chiết ra khỏi cây cỏ các loại hợp chất có tính bay hơi được, ví dụ như tinh dầu. Chiết các nguyên liệu tươi 36
  48. Với các mô sống của động vật hay các dược liệu mỏng manh như lá, hoa người ta có thể chiết nhanh các chất trong tế bào với các dung môi nước hoặc thân nước bằng cách xay nhỏ mô động thực vật trong dung môi. Nguyên liệu được cắt nhỏ, ngâm ngập trong dung môi và được xay nhỏ bằng một cánh khuấy quay với tốc độ rất cao (khoảng 10,000 vòng/ phút) trong một thời gian ngắn khoảng 5 - 10 phút. Với tốc dộ này, các mô được phân tán rất nhỏ, tế bào bị vỡ và các chất tan đi thẳng từ dịch tế bào vào dịch chiết chủ yếu bằng quá trình hòa tan. Sự thẩm thấu, nếu có cũng chỉ đóng vai trò thứ yếu. Với cách chiết này, toàn bộ các chất trong tế bào gồm cả các chất chuyển hóa bậc II lẫn các chất đại phân tử đều có mặt trong dịch chiết. Cách chiết này có lợi khi nghiên cứu các protein, các chất mà hoạt tính sinh học phụ thuộc vào cấu trúc lập thể thứ các của phân tử. Trong nghiên cứu Dược liệu, để hạn chế hoạt động của các enzym có thể làm thay đổi cấu trúc các chất và hạn chế các tạp chất như protein, polysaccharid, dung môi sử dụng có thể là cồn hay aceton. Quá trình chiết này do được thực hiện bằng máy khuấy có tốc độ cao nên cũng được gọi là turbo - extraction (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Các phương pháp chiết khác Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, trong thực tế người ta còn dùng các kỹ thuật hỗ trợ khác để đẩy nhanh quá trình hòa tan như chiết xuất sử dụng siêu âm, chiết xuất sử dụng vi sóng, chiết dưới áp suất hay sử dụng các dung môi đặc biệt để chiết như chiết chất lỏng siêu tới hạn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 37
  49. CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Nguyên liệu - Mẫu cây tươi cả lá, thân, rễ Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms). - Thân và rễ Đinh lăng dùng để nghiên cứu thành phần hóa học và chiết phân đoạn. 3.1.2. Hóa chất và dung môi Ngoài một số dung môi hóa chất cơ bản dùng trong phòng thí nghiệm, trong phần thực nghiệm có sử dụng: - Hóa chất khảo sát vi học: Dung dịch javel 50 %, dung dịch acid acetic 1 %, dung dịch iod 0,1 % (son phèn), dung dịch carmin 1 %, nước cất. - Dung môi chiết xuất: EtOH 96 %, MeOH. - Dung môi dùng trong lắc phân bố, sắc ký lớp mỏng: Diethyl ether, ethyl acetat, n-butanol. - Dung môi sắc ký lớp mỏng: Chloroform, methanol, n-hexan, n-butanol, diethyl ether, ethyl acetat, petroleum ether, benzen. - SKLM dùng bản silica gel F254 Merck tráng sẵn trên nền nhôm. - Chất chuẩn: Acid oleanoid chuẩn. - Phát hiện vết chất: Đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm, thuốc thử vanillin sulfuric (VS), thuốc thử acid sulfuric 10 %/EtOH. 3.1.3. Trang thiết bị - Bếp cách thủy. - Bình sắc ký Tây Ban Nha. - Cân phân tích OHAUS PAJ 2102. - Cân phân tích 4 số. - Đèn UV 254 và 365 nm. - Điện thoại di động SAMSUNG J7 Prime. - Kính hiển vi OLYMPUS CX22. - Máy cô quay Shendi RE-52CS-1. - Máy khuấy EMCLAB OS20-Pro. - Tủ lạnh SANYO. 38
  50. - Tủ sấy DRYING OVEN. - Các dụng cụ thông dụng khác trong phòng thí nghiệm. 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Thu hái xử lý và bảo quản Đinh lăng 3.2.1.1. Thu hái Cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) được thu hái ngày 11/11/2016 tại Tri Tôn - An Giang, dược liệu thu hái về được PGS.TS. Trần Công Luận định danh và so sánh với các tài liệu tham khảo xác định được là đúng loài Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) (Đỗ Tất Lợi, 2004; Võ Văn Chi, 2012). 3.2.1.2. Xử lý và bảo quản Để khảo sát cây khô thì rễ tươi và thân tươi sau khi thu hái được làm sạch và phơi khô ở nhiệt độ phòng hoặc sấy trong tủ sấy ở 60 - 80 oC, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời gay gắt vì tia tử ngoại (UV) có trong ánh sáng mặt trời có thể kích thích phản ứng hóa học, tạo nên các hợp chất giả tạo. Tiến hành xay thành bột dược liệu để sử dụng cho nghiên cứu (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; ĐH Y Dược TPHCM, 2014). Để khảo sát cây tươi (khảo sát về đặc điểm vi học), Đinh lăng sau khi được thu hái, làm sạch thì đem đi khảo sát ngay, tránh để trong thời gian lâu vì sẽ làm mất các tế bào hay các tế bào sẽ không còn nguyên vẹn, chọn mẫu phải chính xác, có tính đại diện, không quá già không quá non (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; ĐH Y Dược TPHCM, 2014). Lưu trữ mẫu: Mẫu được lưu trữ tại Bộ môn dược liệu, Trường Đại Học Tây Đô. 3.2.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học 3.2.2.1. Khảo sát hình thái Quan sát các đặc điểm hình thái của toàn cây Đinh lăng tươi và mô tả bộ phận dùng bên ngoài của dược liệu như màu sắc, kích thước, hình dáng, (ĐH Y Dược TPHCM, 2014, Phạm Hoàng Hộ, 2003). 3.2.2.2. Khảo sát vi phẫu Chọn mẫu có tính đại diện, không quá già cũng không quá non. Để quan sát cấu tạo bên trong của những cơ quan thực vật thì nó được thực hiện bằng phương pháp cắt lát mỏng bằng tay và nhuộm hai màu với các cơ quan cắt ra thành từng khoanh (vi phẫu) trước khi quan sát. Nếu mẫu cắt là lá thì thường lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và một phần cuống lá ở hai bên. Nếu là thân thì thường cắt ở lóng. Nếu là rễ thì cắt ở phần rễ non (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Trương Thị Đẹp, 2014). 39
  51. Có 2 loại phẫu thức được sử dụng: Phẫu thức ngang: Lát cắt nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục mẫu cắt. Phẫu thức dọc: Lát cắt nằm trong mặt phẳng song song với trục mẫu cắt, thường sử dụng cho thân và rễ để quan sát các ống tiết hay ống nhựa mủ. Nhuộm mẫu bằng cách nhuộm kép son phèn lục iod: - Ngâm lát cắt vào dung dịch javel cho đến khi thấy lát cắt trắng, sau đó rửa lại bằng nước cất nhiều lần. - Tiếp theo ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic trong vài phút để loại bỏ hết javel. Rửa lại bằng nước cất. - Ngâm lát cắt vào dung dịch son phèn lục iod cho đến khi lát cắt bắt được màu. Rửa lại nhiều lần bằng nước cất cho đến hết màu. - Vi phẫu sau khi nhuộm xong thì được ngâm trong nước cất. Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 4X, 10X, 40X và được ghi nhận lại bằng các thiết bị điện tử như máy ảnh, điện thoại di động, (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Trương Thị Đẹp, 2014). 3.2.2.3. Khảo sát bột Dược liệu Lấy bộ phận lá, thân, rễ dược liệu Đinh lăng khảo sát (cũng là mẫu dùng cắt vi phẫu) cắt nhỏ, phơi sấy ở nhiệt độ 60 oC (hoặc phơi trong bóng râm) đến khô, xay bột mịn, rây qua rây cỡ 32 (rây mịn). Phần còn lại trên rây được đem đi sấy, xay và rây. Bột dược liệu được quan sát bằng cách: Lấy một lượng nhỏ bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm cho lên một phiến kính (lame) rồi nhỏ 1 - 2 giọt nước sau đó khuấy kỹ sau đó đậy lamelle lại và cuối cùng là soi kính hiển vi bắt đầu bằng vật kính 10X, sau đó với vật kính 40X. Trước khi soi kính hiển vi phải quan sát bằng cảm quan để có thêm yếu tố kiểm nghiệm. Các cấu tử tìm thấy được chụp lại bằng điện thoại trực tiếp qua thị kính (ĐH Y Dược TPHCM, 2014). 3.2.3. Thử tinh khiết 3.2.3.1. Xác định độ ẩm Phương pháp: Dùng cân phân tích OHAUS PAJ 2102 để tiến hành xác định độ ẩm của dược liệu. Độ ẩm dược liệu không quá 13,0 %, tiến hành theo phụ lục 9.6 của DĐVN IV (2009). 40
  52. Cách thực hiện bằng cách trải mỏng khoảng 1,5 g dược liệu đã được nghiền mịn lên dĩa cân và tiến hành xác định độ ẩm theo hướng dẫn sử dụng cân phân tích OHAUS PAJ 2102. 3.2.3.2. Xác định tro toàn phần - Không quá 8,0 %. - Cách tiến hành: Cân khoảng 2 g dược liệu tiến hành theo phụ lục 9.8, phương pháp của DĐVN IV (2009). 3.2.3.3. Xác định chất chiết được trong dược liệu - Không được ít hơn 5,0 %. Theo phụ lục 12.10 DĐVN IV. - Cân chính xác khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình nón. Thêm khoảng 50 ml nước cất, đậy kín, cân lại khối lượng, sau đó để yên trong 1 giờ. Đun sôi nhẹ dưới hồi lưu 1 giờ, để nguội, lấy bình ra cân lại khối lượng, dùng nước bổ sung lại khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc thô vào bình lấy khoảng 25 ml vào cốc thủy tinh đã được bì khối lượng cốc. Cô cách thủy đến cắn khô cắn thu được đem sấy ở 105 oC trong 3 giờ lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút. Cân nhanh để xác định khối lượng và tính phần trăm chất chiết được. b x 20,000 X % = % a x (100 − h) Trong đó: b: Khối lượng cắn (g). a: Khối lượng dược liệu cân (g). h: Độ ẩm (%). Tất cả các chỉ tiêu thử tinh khiết nói trên đều được lấy kết quả là giá trị trung bình của 3 lần thử độc lập. 3.2.4. Nghiên cứu về hóa học 3.2.4.1. Định tính Theo Dược Điển Việt Nam IV (2009). ❖ Bột dược liệu Đinh lăng Phản ứng tạo bọt và màu Lấy khoảng 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 1 phút, sẽ thấy bọt bền trong 10 phút. Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol 90 % (TT), ngâm trong 3 giờ, lắc, lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau: - Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5 ml anhydrid acetic (TT), thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric (TT), tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu đỏ. 41
  53. - Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml (TT) Fehling, sau đó đun sôi hiện tủa đỏ gạch. Lấy một ít bột dược liệu đặt trên khay sứ, nhỏ thêm 1 giọt dung dịch Lugol (TT) bột chuyển sang màu xanh đen (Dược điển Việt Nam IV, 2009). ❖ Cao Đinh lăng Phản ứng tạo bọt và màu Lấy khoảng 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 1 phút, sẽ thấy bọt bền trong 10 phút. Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol 90 % (TT), ngâm trong 3 giờ, lắc, lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau: - Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5 ml anhydrid acetic (TT), thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric (TT), tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu đỏ phía trên có màu xanh. - Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml (TT) fehling, sau đó đun sôi hiện tủa đỏ gạch (Dược điển Việt Nam IV, 2009). Phương pháp Sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4): Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Merck. Dung môi khai triển: n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5, lớp trên). Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu và các cao phân đoạn. Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. Dung môi khai triển: Chloroform - methanol - nước (65 : 35 : 10; lớp dưới). Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu và các cao phân đoạn. Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử vanilin sulfuric (TT) và (TT) acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường (Dược điển Việt Nam IV, 2009). Chấm sắc ký với chất chuẩn Acid oleanolic. Dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat (7 : 3). Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu, các cao phân đoạn và chất chuẩn acid oleanolic. 42
  54. Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 100 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường (Dược điển Việt Nam IV, 2009). 3.2.4.2. Định tính sơ bộ các nhóm chính trong thân và rễ Đinh lăng Nguyên tắc: Chiết tách nguyên liệu thành các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần với các dung môi: Ether ethylic, ethanol và nước. Thực hiện trên 20 g dược liệu, chiết phân đoạn thu được 50 ml dịch chiết ether ethylic, 50 ml dịch chiết ethanol, 50 ml dịch chiết nước. Xác định các nhóm chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng (ĐH Y Dược TPHCM, 2014). 43
  55. Mẫu thử Ether ethylic Dịch chiết ether Bã Dược liệu Ethanol / hồi lưu Dịch chiết cồn Bã Dược liệu HCl 10 % / Cách thủy Chiết lại bằng ether Nước / cách thủy Dịch chiết cồn thủy phân Dịch chiết nước Bã Dược liệu HCl 10 % / Cách thủy Chiết lại bằng ether Dịch chiết nước thủy phân Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết 44
  56. Bốc hơi đến cắn. Hòa Có màu Flavonoid tan trong cồn. Làm đỏ phản ứng cyanidin Phản ứng Dung dịch kiềm có màu Anthraquinon Bortrager đỏ Bốc hơi trên chén sứ đến cắn. Cho tác dụng Tăng cường độ phát Coumarin với kiềm, soi trong quang khi soi UV UV Bốc hơi đến cắn, hòa cắn trong nước acid. Có tủa Alkaloid Phản ứng với thuốc thử Dịch chung alkaloid chiết ether Bốc hơi trên chén sứ Lớp phân cách có màu đỏ đến cắn. Làm phản nâu – tím và vòng màu Triterpenoid ứng Liebermann- lục hay tím khuếch tán Burchard lên Acid sulfuric đặc Màu lục – xanh dương Bốc hơi trên chén sứ đậm Carotenoid đến cắn Thuốc thử Carr-Price Màu xanh chuyễn sang đỏ Bốc hơi trên chén sứ. Cắn có mùi Có mùi thơm, thêm Tinh dầu vài giọt cồn, bốc hơi thơm hết cồn Nhỏ lên giấy Có vết mỏng. Chất béo trong mờ Bay hơi ether Hình 3.2. Sơ đồ phân tích các chất trong dịch chiết ether. 45
  57. Thêm một ít tinh Có bọt khí Acid hữu cơ thể Na2CO3 bay lên Phản ứng Có tủa Hợp chất khử với thuốc đỏ gạch thử Fehling Bốc hơi tới Có bọt cắn. Hòa trong bền trên Saponin 15 phút nước, lắc mạnh Phản ứng với dung Xanh rêu-xanh đen dịch FeCl3 và dung với FeCl3 tủa bông Tanin dịch gelatin muối với gelatin muối Thêm vài giọt Đỏ với dung dịch Flav.anthocya Dịch HCl 10 % và acid. Xanh với nin chiết KOH 10 % dung dịch kiềm Đun cách thủy cồn Flav.Proantho 10 phút với Có màu cyanin đỏ HCl 10 % Làm phản ứng Có màu Flavonoid-¥- cyanidin đỏ pyron Bốc hơi đến cắn. Phản Tím với thuốc thử ứng với TT Raymond- Raymond- Glycosid tim Marthoud và Marthoud, đỏ với Xanthydrol xanthydrol Bốc hơi đến cắn. Cho Tăng cường tác dụng với kiềm, độ phát Coumarin soi trong UV 365 quang Phản ứng với thuốc thử chung alkaloid Có tủa Alkaloid Hình 3.3. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn. 46
  58. Phản ứng Có màu Flav-¥-pyron cyanidin đỏ Bốc hơi tới cắn, Tím với thuốc thử làm phản ứng Glycosid tím với thuốc thử Raymond- Raymond- Marthound Marthound Dịch Dịch chiết Phản ứng Có chiết Anthraquinon cồn Borntrager màu đỏ ether Bốc hơi tới cắn. Tăng cường Nhỏ dung dịch độ phát Coumarin kiềm 10 % soi quang trong trong UV365 UV Bốc hơi tới Có màu đỏ nâu- cắn. Làm tím.Màu xanh lục Triterpenoid phản ứng hay màu tím Liebermann- khuếch tán lên từ Burchard lớp phân cách Hình 3.4. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn thủy phân. 47
  59. Pha loãng trong 5 % thể tích cồn 95 Có tủa Polyuronid % hay aceton bông trắng Làm phản ứng với Có tủa Hợp chất thuốc thử Fehling đỏ gạch khử Có bọt khí Thêm một ít Acid hữu bay lên tinh thể cơ Na CO 2 3 Bốc hơi tới cắn, hòa trong cồn 25 %. Pha Có bọt bền Saponin loãng với nước, lắc trong 15 mạnh phút Xanh rêu-xanh đen Phản ứng với với FeCl3, tủa bông Tanin dung dịch FeCl3 trắng ngà với Dịch và gelatin-muối gelatin-muối chiết Thêm vài giọt Đỏ trong môi nước HCl 10 % và Fla.Antho trường acid, KOH 10 % cyanidin xanh trong Đun cách kiềm Có màu Flav.Proa thủy 10 phút đỏ nthocyani với HCl 10% din Bốc hơi tới cắn, hòa lại trong cồn 25 Có màu Flavonoid %.Làm phản ứng đỏ -¥-pyron cyanidin Bốc hơi tới cắn. Làm Tím với phản ứng với TT Raymond- Glycosid Raymond-Marthound Marthound đỏ tim và xanhthydrol mận với Làm phản ứng với TT xanhthydrol Có chung alkaloid Alkaloid tủa Hình 3.5. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết nước. 48
  60. Phản ứng Có màu Flavonoid.¥ - cyanidin đỏ pyron Bốc hơi tới cắn, làm phản ứng Có màu Raymond- Glycosid tim tím Marthoud Dịch Dịch chiết chiết nước ether Phản ứng Có Anthraquinon Borntrager màu đỏ Bốc hơi tới Có màu đỏ nâu – cắn, làm phản tím. Màu xanh lục Triterpenoid ứng hay tím khuếch Liebermann tán từ lên từ lớp phân cách Hình 3.6. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết nước thủy phân. 3.2.4.3. Chiết xuất và tách phân đoạn Quy trình chiết xuất phân đoạn rễ Đinh lăng Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol 96 %. dược liệu sau khi được phơi sấy và xay nhỏ, đem đi làm ẩm bằng ethanol 96 % trong khoảng 2 - 4 giờ. Sau đó dược liệu được cho vào bình ngấm kiệt và cho dung môi chiết ethanol 96 % vào bình ngấm kiệt cách mặt dược liệu từ 2 - 3 cm. Dược liệu được ngăn lại bằng giấy lọc để không để dược liệu nổi trên bề mặt. Bình ngấm kiệt được ngấm kiệt trong vòng 12 - 24 giờ. Dịch chiết được rút với tốc độ 5 ml/phút, chiết kiệt đến khi dịch chiết không còn vết trên bản mỏng (kiểm tra sắc ký lớp mỏng với thuốc thử H2SO4/EtOH 20 %) hoặc được kiểm tra bằng cách nhỏ vài giọt dịch chiết từ bình ngấm kiệt lên lame rồi để cho khô tự nhiên, nếu không còn vết trên lame thì tức là dịch chiết đã được chiết kiệt. Gộp tất cả dịch chiết từ bình ngấm kiệt lại, trộn đều, cô thu hồi dung môi bằng máy cô quay trong điều kiện áp suất giảm ở nhiệt độ khoảng 60 oC để đuổi hết ethanol ta thu được cao toàn phần. Cao được bảo quản trong chai kín, dán nhãn cụ thể. 49
  61. - Dụng cụ chiết xuất: Gồm bình ngấm kiệt hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết. - Thực hành: Bột rễ Đinh lăng và thân Đinh lăng được xay thô và được rây qua lỗ rây 3 mm. Mẫu dược liệu không nên to hơn 3 mm vì sẽ khó chiết kiệt được dược liệu, mẫu dược liệu cũng không được xay quá mịn hoặc mẫu có tính nhầy nhựa hoặc có thể trương nở sẽ cản trở dòng chảy có thể gây ra hiện tượng nghẹt (tắt) van của bình ngấm kiệt. Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông và một tấm lưới. Bột rễ và thân được đặt vào bình, lên trên lớp lưới, lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi cần thiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp trên lớp mặt cách bề mặt dược liệu khoảng 2 - 3 cm. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội. Để yên sau một thời gian, thường là 12 - 24 giờ, mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt thu được dịch chiết từ bình ngấm kiệt cô dịch chiết thu được cao toàn phần của Dược liệu (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Phân tách cao toàn phần thành các phân đoạn bằng kỹ thuật lỏng - lỏng Cao toàn phần được hòa tan trong một lượng nước tối thiểu, sau đó lắc phần dịch này lần lượt với các dung môi sau: Diethyl ether, ethyl acetat, n-butanol. Các phân đoạn thu được đem cô dưới áp suất giảm tới cao đặc bằng máy cô quay thu hồi dung môi. 50
  62. Bột dược liệu Chiết ngấm kiệt với EtOH 96 % Dịch chiết cồn Bã dược liệu Cô quay Cao cồn Hòa với nước Dịch nước Lắc với diethyl ether Dịch diethyl ether Dịch nước Cô quay Lắc với ethyl acetat Cao diethyl ether Dịch ethyl acetat Dịch nước Cô quay Lắc với n-butanol Cao ethyl acetat Dịch n-butanol Dịch nước Cô quay Cô cách thủy Cao n-butanol Cao nước Hình 3.7. Sơ đồ tách chiết phân đoạn 51
  63. 3.2.4.4. Thăm dò hệ sắc ký các cao phân đoạn Sắc ký lớp mỏng cao Diethyl ether Tiến hành : Sắc ký lớp mỏng trên cao diethyl ether với các hệ dung môi: S1= N-hexan - ethyl acetat (4 : 1). S2= Petroleum ether – diethyl ether (2 : 1). S3= Benzen - chloroform (10 : 1). Sắc ký lớp mỏng cao Ethyl acetat Tiến hành: Sắc ký lớp mỏng trên cao ethyl acetat với các hệ dung môi: S1= Chloroform – methanol (95 : 5). S2= N-hexan – ethyl acetat (1 : 1). S3= Petroleum ether - diethyl ether (3 : 7). Sắc ký lớp mỏng cao n-butanol Tiến hành: Sắc ký lớp mỏng trên cao n-butanol với các hệ dung môi: S1= Chloroform – methanol (9 : 1). S2= Chloroform (100 %). S3= Chloroform – methanol (8 : 2). 52
  64. CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. THỰC VẬT HỌC 4.1.1. Đặc điểm hình thái Tiến hành theo mục 3.2.2.1. thì thu được một số kết quả như sau: Hình 4.1. Toàn cây và lá Đinh lăng 53
  65. Hình 4.2. Hình thái bên ngoài của lá Đinh lăng Cây nhỏ dạng bụi, cao từ 0,5 - 2 m. Thân nhẵn màu vàng nâu, ít phân nhánh. Lá màu xanh lục sáng, gân lá màu vàng nhạt, cuống lá màu nâu sáng. Lá kép mọc so le (bề rộng của lá 1,2 cm, bề dài của lá khoảng 3,8 cm) có bẹ, phiến lá xẻ 3 lần lông chim, mép có răng cưa không đều, chóp nhọn, lá chét và các đoạn đều có cuống, cuống lá dài phát triển to thành bẹ lá. Lá có mùi thơm nhẹ khi vò nát. Lá Đinh lăng được mô tả phù hợp với mô tả của Võ Văn Chi (2012). 54
  66. ‘ Hình 4.3. Cụm hoa Đinh lăng 55
  67. Hình 4.4. Hình thái bên ngoài hoa Đinh lăng Cụm hoa mọc ở ngọn thành hình chùy ngắn mang nhiều tán; hoa rất dễ rụng; hoa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám, mép uốn lượn; tràng 5 cánh trái xoan; nhị 5, chỉ nhị ngắn; quả màu nâu đen (dài khoảng 1 cm). Chiều dài của hoa chưa nở khoảng 0,6 cm, chiều ngang khoảng 0,3 cm. Cụm hoa chưa nở có màu xanh nhạt kèm nâu. Các hoa đơn lẻ cụm lại thành cụm hoa tròn đều. Các mô tả phù hợp với mô tả của Phạm Hoàng Hộ (2003). 56
  68. Hình 4.5. Hình toàn cây và thân Đinh lăng Hình 4.6. Hình đường kính thân Đinh lăng Thân Đinh lăng màu vàng nhạt hay nâu rất nhạt, da sần sùi, kích thước của thân tùy thuộc vào số năm mà cây được trồng. Thân cây trồng khoảng được 3 năm có đường kính thân khoảng 1 cm, chiều dài thân cây khoảng 0,5 - 1 m. Tùy vào vị trí thân cây mà có kích thước khác nhau. Thân cây ở gần gốc cây (rễ) có bán kính lớn hơn so với các thân cây ở gần ngọn Mô tả thân Đinh lăng phù hợp với mô tả của Phạm Hoàng Hộ (2003). 57
  69. Hình 4.7. Hình hình thái bên ngoài rễ Đinh lăng 58
  70. Hình 4.8. Hình thái bên ngoài rễ chính và rễ con Đinh lăng Rễ cong queo có màu vàng nhạt, vàng hay mà nâu nhạt, thường được thái thành các lát mỏng, mặt cắt ngang màu vàng nhạt. Mặt ngoài màu trắng xám có nhiều vết nhăn dọc, nhiều lỗ vỏ nằm ngang và vết tích của các rễ con. Rễ khoảng 3 năm tuổi có đường kính rễ chính khoảng 8 cm, các rễ con có đường kính khoảng 3 - 4 cm Mô tả hình thái rễ Đinh lăng tại Tri Tôn - An Giang phù hợp với hình thái mô tả của Phạm Hoàng Hộ (2003) và DĐVN (2009). Nhận xét: - Mẫu Đinh lăng trồng tại An Giang về mặt thực vật học tương tự với miêu tả trong Dược điển Việt Nam IV. - Đường kính và chiều dài của rễ Đinh lăng thì tương đối đồng đều với đường kính và chiều dài của Đinh lăng được mô tả trong Dược điển Việt Nam IV. 4.1.2. Đặc điểm vi phẫu Theo mục 3.2.2.2. khảo sát các đặc điểm về vi phẫu của các bộ phận cây Đinh lăng. Vi phẫu lá Đinh lăng Gân giữa: Lồi ở 2 mặt. Biểu bì tế bào hình chữ nhật không đều, kích thước gần tương đương ở 2 biểu bì trên và dưới, cutin mỏng. Mô dày góc 2 - 3 lớp tế bào đa giác kích thước đều nhau. Mô mềm đạo nhiều lớp tế bào đa giác tròn hoặc gần tròn, kích thước không đều. Bó dẫn xếp hình cung với gỗ ở trên libe ở dưới. Libe xếp thành cụm nhỏ. Mạch gỗ xếp thành dãy 3 - 5 mạch xen kẽ mô mềm gỗ vách cellulose. Túi tiết ly bào kích thước khác nhau nhiều trong vùng mô mềm đạo. Phiến lá: Biểu bì tế bào hình chữ nhật, biểu bì trên kích thước lớn hơn biểu bì dưới, cutin mỏng, lỗ khí ở biểu bì dưới. Mô mềm khuyết 6 - 7 lớp tế bào đa giác tròn, kích thước không đều, chứa lục lạp. Bó dẫn phụ rải rác gỗ ở trên, libe ở dưới. 59
  71. Biểu bì trên Mô dày Mô mềm đạo Tinh thể calci oxalat Gỗ Libe Mô mềm tủy Túi tiết Mô dày góc Biểu bì dưới Hình 4.9. Vi phẫu lá Đinh lăng vật kính 10X Tế bào khí khổng dị bào Vách tế bào Cutin lồi Túi tiết Tinh thể calci oxalat Hình 4.10. Vi phẫu lá Đinh lăng vật kính 40X 60
  72. Vi phẫu cuống lá Vi phẫu tiết diện gần tròn một đầu bằng. Lớp biểu bì hơi dợn sóng, tế bào hình chữ nhật, kích thước lớn hơn tế bào mô dày, đều. Mô dày 2-4 lớp tế bào đa giác gần tròn, kích thước không đều. Mô mềm vỏ đạo nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước lớn hơn tế bào mô dày, không đều, xếp lộn xộn. Nhiều bó libe gỗ xếp thành vòng không liên tục, libe ở ngoài gỗ ở trong. Gỗ và libe có cấu tạo cấp 2. Libe xếp thành từng cụm nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước không đều, xếp thành dãy xuyên tâm; mô mềm gỗ tế bào đa giác xếp thành dãy. Mô mềm tủy đạo tế bào hình đa giác hoặc đa giác gần tròn, kích thước không đều, 2-4 lớp tế bào dưới gỗ vách tẩm chất gỗ mỏng. Biểu bì Mô dày Mô mềm vỏ Tinh thể calci oxalat Libe Mô mềm tủy Gỗ 1 Gỗ 2 Hình 4.11. Vi phẫu cuống lá Đinh lăng vật kính 10X 61
  73. Tế bào biểu bì Gỗ 1 Gỗ 2 Mô dày góc Mô mềm tủy Hình 4.12. Vi phẫu cuống lá Đinh lăng vật kính 40X Nhận xét: Mô tả đặc điểm vi phẫu của cuống lá Đinh lăng có những đặc điểm về mô dày gốc, mô gỗ, mô libe, tế bào biểu bì, mô mềm tủy, tinh thể calxi oxalat, giống với những mô tả về cấu tạo các mô, vị trí sắp xếp, cấu tạo cấp 2 của ngành Ngọc lan (Trương Thị Đẹp, 2014). Vi phẫu thân Đinh lăng Vi phẫu tiết diện tròn. Các mô gồm: Biểu bì hóa mô cứng bên ngoài bần, bị bong ra ở lỗ vỏ. Bần nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, kích thước không đều, vách mỏng uốn lượn, xếp xuyên tâm. Mô dày góc nhiều lớp tế bào đa giác tròn, kích thước không đều. Mô mềm vỏ đạo nhiều lớp tế bào hình đa giác hay bầu dục kích thước không đều, một số tế bào vách uốn lượn. Libe tế bào hình đa giác, vách uốn lượn, xếp thành cụm dẹt, kích thước không đều, vách hơi uốn lượn. Gỗ liên tục, dày gấp 3-4 lần libe; mạch gỗ hình đa giác, kích thước không đều, phân bố đều trong vùng mô mềm gỗ; mô mềm gỗ tế bào đa giác, kích thước nhỏ. Tia tủy hẹp 1-4 dãy tế bào hình chữ nhật có tinh bột rất nhiều. Mô mềm tủy đạo tế bào đa giác kích thước không đều. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai rải rác trong mô mềm vỏ. Đặc điểm vi phẫu cho thấy đối tượng nghiên cứu ở An Giang có những đặc điểm về vi phẫu của thân giống với những miêu tả các tế bào của Dược điển Việt Nam IV (2009) và mô tả của Phạm Hoàng Hộ (2003). 62
  74. Bần Biểu bì Tinh thể calci oxalat Mô dày Mô mềm vỏ Libe Gỗ 1 Gỗ 2 Hình 4.13. Vi phẫu thân Đinh lăng vật kính 10X Vi phẫu rễ Đinh lăng Vi phẫu tiết diện gần tròn. Các mô gồm: Bần gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, vách mỏng uốn lượn xếp xuyên tâm, bong tróc rất nhiều. Mô mềm vỏ nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước khác nhau, vách uốn lượn. Libe gỗ: Libe tế bào đa giác vách uốn lượn dày mỏng xen kẽ nhau thành tầng. Gỗ chiếm tâm không liên tục; mạch gỗ tế bào đa giác tròn, kích thước không đều, phân bố đều trong vùng mô mềm gỗ; mô mềm gỗ tế bào đa giác, vách cellulose. Gỗ thường chiếm phần lớn diện tích của vi phẫu, rễ càng già thì phần gỗ càng nhiều. Tia tủy 1-4 dãy tế bào hình chữ nhật. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai nhiều trong mô mềm vỏ. 63
  75. Bần Mô mềm vỏ Libe 1 Libe 2 Tia tủy Gỗ Hình 4.14. Hình vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 10X Vùng gỗ Toàn thân Đinh lăng 64
  76. Túi tiết ly bào Tia gỗ Lông hút Lớp bần Hình 4.15. Vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 40X Nhận xét: Những mô tả về đặc điểm của các mô, các tế bào, lông hút, kích thước túi tiết, giống với những mô tả của Dược Điển Việt Nam IV (2009). 4.1.3. Đặc điểm bột Dược liệu Soi bột lá Đinh lăng Tiến hành theo mục 3.2.2.3. trên bột lá Đinh lăng thu được kết quả như sau: Bột lá Đinh lăng màu xanh, tơi khô, có mùi thơm nhẹ, có vị ngọt, hơi hăng. Soi dưới kính hiển vi thấy: 65
  77. Hình 4.16. Bột lá Đinh lăng soi vi phẫu - Nhiều hạt tinh bột hình chuông, hình đa giác, đường kính từ 10 - 20 µm nằm riêng lẻ, hạt tinh bột kép 2, 3, 4 hay tụ tập thành khối. - Tinh thể calcioxalat hình khối, hình sao. - Lông che chở đơn bào, đa bào. - Mảnh mô mềm. - Mảnh mạch mạng. - Mạch vạch. - Mạch xoắn. Lông đơn bào Tinh thể calci oxalat Sợi kèm tinh thể hình cầu gai Hạt tinh bột hình chuông Tinh thể calci oxalat Mạch mạng hình khối 66
  78. Mạch điểm Khối nhựa mang màu Mảnh mô mềm Hình 4.17. Soi bột lá Đinh lăng vật kính 40X Soi bột thân Đinh lăng Tiến hành theo mục 3.2.2.3. trên bột thân Đinh lăng thu được kết quả như sau: Bột thân Đinh lăng màu vàng nhạt, tơi khô, có mùi thơm nhẹ, có vị ngọt. . Hình 4.18. Bột thân Đinh lăng soi bột Soi dưới kính hiển vi thấy: - Tinh thể calcioxalat hình khối. - Lông che chở đơn bào, đa bào. - Mảnh mô mềm. - Mảnh mạch mạng. - Mạch vạch. - Mạch xoắn. - Mạch điểm. - Khối tinh bột. 67
  79. Tinh thể calci oxalat Khối nhựa mang màu Mảnh mô mềm Mạch mạng Mạch xoắn Lông đa bào Mạch điểm Lông đơn bào Khối tinh bột Hình 4.19. Soi bột thân Đinh lăng vật kính 40X Soi bột rễ Đinh lăng Tiến hành theo mục 3.2.2.3. trên bột rễ Đinh lăng thu được kết quả như sau: Bột rễ Đinh lăng màu vàng nhạt, tơi khô, có mùi thơm nhẹ, có vị ngọt. Hình 4.20. Bột rễ Đinh lăng 68
  80. Mạch mạng Mạch xoắn Mạch điểm Sợi kèm tinh thể Mảnh mô mềm Hạt tinh bột Bó sợi Sợi mô cứng Mạch vạch Hình 4.21. Soi bột rễ Đinh lăng vật kính 40X Soi dưới kính hiển vi thấy: - Tinh thể calci oxalat hình khối. - Lông che chở đơn bào, đa bào. - Mảnh mô mềm. - Mảnh mạch mạng. - Mạch vạch. - Mạch xoắn. - Mạch điểm. 69
  81. - Khối tinh bột. - Sợi kèm tinh thể. - Bó sợi. - Sợi mô cứng. Nhận xét: Các đặc điểm cấu tử soi bột Đinh lăng cho thấy giống với những mô tả của Dược Điển Việt Nam IV (2009). 4.2. THỬ TINH KHIẾT 4.2.1. Độ ẩm ❖ Độ ẩm bột dược liệu Theo mục 3.2.3.1. Kết quả cho thấy bột dược liệu Đinh lăng có độ ẩm đạt theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV (≤ 13,0 %). Bảng 4.1. Độ ẩm bột dược liệu Đinh lăng Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Thân Đinh lăng 5,0 % 5,8 % 6,2 % 5,7 % Rễ Đinh lăng 5,2 % 6,4 % 7,9 % 6,5 % Nhận xét: Độ ẩm dược liệu đạt với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (2009) chuyên luận Đinh lăng. Độ ẩm của thân và rễ chênh lệch không cao, nằm trong khoảng từ 5,5 - 6,5 %. ❖ Độ ẩm cao Đinh lăng Theo mục 3.2.3.1. Kết quả cho thấy cao Đinh lăng có độ ẩm đạt theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV phụ lục 1.1, độ ẩm cao đặc không được quá 20,0 %. Bảng 4.2. Độ ẩm cao toàn phần Đinh lăng Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Thân Đinh lăng 3,2 % 3,5 % 6,9 % 4,5 % Rễ Đinh lăng 0,4 % 0,5 % 0,7 % 0,5 % Nhận xét: Độ ẩm dược liệu đạt với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV chuyên luận Đinh lăng. 70
  82. 4.2.2. Xác định độ tro Theo mục số 3.2.3.2. Kết quả cho thấy độ tro đo được đạt tiêu chuẩn so với tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV (không quá 8,0 %). Bảng 4.3. Tiêu chuẩn độ tro của Dược liệu Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Thân Đinh lăng 0,7 % 1,1 % 0,9 % 0,9 % Rễ Đinh lăng 0,4 % 0,7 % 0,3 % 0,5 % Nhận xét: Tro toàn phần của thân và rễ Đinh lăng nằm trong khoảng 0,5 - 0,9 %. Dược liệu khô đạt tiêu chuẩn tro toàn phần theo DDVN IV chuyên luận Đinh lăng. 4.2.3. Xác định chất chiết được trong dược liệu Bảng 4.4. Chất chiết được trong dược liệu Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Thân Đinh lăng 17,9 % 16,8 % 18,9 % 17,9 % Rễ Đinh lăng 21,2 % 21,4 % 18, 8 % 20,5 % Nhận xét: Chất chiết được trong thân và rễ Đinh lăng nằm trong khoảng 17 - 20 %. Dược liệu khô đạt tiêu chuẩn chất chiết được theo tiêu chuẩn DĐVN IV chuyên luận cây Đinh lăng. 4.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ TÁCH PHÂN ĐOẠN 4.3.1. Định tính ❖ Định tính trên bột dược liệu Phản ứng tạo bọt Nhận xét: Dịch nước Đinh lăng tạo bọt và cột bọt bền sau 10 phút. Trong khoảng thời gian từ 0 đến 2 phút bọt saponin đạt 0,7 cm, thời gian từ 2 phút đến 5 phút thì bọt saponin đạt 0,5 cm và sau 10 phút bọt đạt 0,3 cm. Sau thời gian 10 phút bọt vẫn bền Chứng tỏ dược liệu Đinh lăng có saponin. Đạt theo mô tả của DĐVN IV (2009). 71
  83. Phản ứng tạo màu Nhận xét: Khi cho từ từ acid sulfuric (TT) vào thành ống nghiệm chứa hỗn hợp dịch lọc và anhydrid acetic (TT) thì tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu đỏ Đạt theo tiêu chuẩn của DĐVN IV chuyên luận Đinh lăng. Và khi cho thuốc thử Fehling vào dịch lọc đun sôi thì xuất hiện tủa đỏ gạch Đạt theo mô tả của DĐVN IV. Khi cho thuốc thử Lugol vào bột dược liệu thì không xuất hiện màu xanh đen Đạt theo mô tả của DĐVN IV. Nhận xét: Tất cả các phản ứng định tính trên bột dược liệu theo tiêu chuẩn của DĐVN IV chuyên luận Đinh lăng đều đạt Chứng tỏ Đinh lăng được trồng tại An Giang đạt theo tiêu chuẩn DĐVN IV. ❖ Định tính trên cao Đinh lăng Tiến hành theo mục 3.2.4.4. thu được kết quả như sau: Phản ứng tạo bọt: Nhận xét: Dịch lọc A tạo bọt và cột bọt bền sau 10 phút. Trong khoảng thời gian từ 0 đến 5 phút bọt saponin đạt 1cm, thời gian từ 5 phút đến 10 phút thì bọt saponin đạt 0,8 cm. Sau thời gian 10 phút bọt vẫn bền Chứng tỏ dược liệu Đinh lăng có saponin. Đạt theo mô tả của DĐVN IV (2009). Phản ứng tạo màu: Nhận xét: Khi cho từ từ acid sulfuric (TT) vào thành ống nghiệm chứa hỗn hợp dịch chiết chloroform và anhydrid acetic (TT) thì có xuất hiện vòng màu hồng đến tím đậm giữa 2 lớp dung dịch. Đạt theo mô tả của bản bổ sung DĐVN IV. Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4): Bản mỏng: Silica gel 60 F254. Dung môi khai triển: n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5) Mẫu thử: Các cao toàn phần và phân đoạn Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. 72
  84. Soi đèn UV 254 nm Soi đèn UV 365 nm Sau khi nhúng thuốc thử Acid sulfuric 10% Hình 4.22. Định tính cao rễ bằng hệ n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5) Nhận xét: Các vết tách rõ nhưng do trong rễ Đinh lăng có nhiều đường nên còn kéo vệt ở phía dưới bản mỏng. Sau khi nhúng thuốc thử các vết có màu tím nhạt hơi hồng chứng tỏ các cao phân đoạn có chứa hàm lượng saponin. Dung môi khai triển: CHCl3 - MeOH - H2O (65 : 35 : 10; lớp dưới) Mẫu thử: cao toàn phần và các cao phân đoạn. 73
  85. Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử vanilin sulfuric (TT) và (TT) acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. UV 254 nm UV 365 nm Vanilin sulfuric (TT) Acid sulfuric 10%/ cồn Hình 4.24. Định tính saponin bằng sắc kí lớp mỏng Nhận xét: Sau khi nhúng thuốc thử các vết hiện màu tím nhạt. Chứng tỏ trong cao toàn phần, cao các phân đoạn có saponin, terpenoid hiện diện. Nhưng do trong rễ Đinh lăng có nhiều đường nên còn kéo vệt ở phía dưới bản mỏng. Chấm sắc ký với chất chuẩn Acid oleanolic. Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat (7 : 3). 74
  86. Mẫu thử: cáo toàn phần, cao phân đoạn và acid chuẩn oleanolic Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 100 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. Soi UV 254 nm Soi UV 365 nm Sau khi nhúng (TT) Acid sulfuric 10% Hình 4.23. Định tính cao rễ bằng hệ Toluen - ethyl acetat (7 : 3) Nhận xét: Sau khi chấm SKLM với acid aloeanolic chuẩn thì phát hiện trong cao tổng rễ, phân đoạn Et2O, phân đoạn EtOAc đều có hiện diện của acid chuẩn, có khoảng Rf giống nhau. Nhưng do hàm lượng ít hơn so với chất chuẩn nên các vết không được rõ nét so với chất chuẩn. 75
  87. Định tính saponin thân Đinh lăng bằng sắc kí lớp mỏng Dung môi khai triển: CHCl3 - MeOH - H2O (65 : 35 : 10; lớp dưới) Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử vanilin sulfuric (TT), sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. UV 245 nm UV 365 nm vanilin sulfuric Hình 4.25. Định tính saponin thân Đinh lăng bằng SKLM Nhận xét: Thân Đinh lăng có chứa saponin như rễ Đinh lăng. Các vết của thân tương tự như rễ Đinh lăng Chứng tỏ thành phần saponin gần giống nhau. 4.3.2. Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong thân và rễ Đinh lăng Xác định các nhóm hợp chất sau: 1. Chất béo 6. Coumarin 11. Triterpenoid thủy phân 2. Carotenoid 7. Anthraquion 12. Saponin 3. Tinh dầu 8. Flavonoid 13. Acid hữu cơ 4. Triterpenoid tự do 9. Glycosid tim 14. Chất khử 5. Alkaloid 10. Tanin 15. Hợp chất polyuronid 76
  88. Bảng 4.5. Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong thân và rễ Đinh lăng Kết quả định tính chung Đinh lăng Nhóm hợp chất Thuốc thử Thân Rễ Chất béo Nhỏ dd lên giấy + + Carotenoid Carr-price - - H2SO4 - - Tinh dầu Bốc hơi tới cắn + ++ Liebermann- Triterpenoid tự do ++ ++ Burchard Alkaloid Thuốc thử chung + ++ Alkaloid Phát quang trong Coumarin ++ ++ kiềm Antraglycosid KOH 10 % + + Flavonoid Mg/ HClđđ + + Glycosid tim TT vòng lacton + + TT đường 2- + + desoxy Anthocyanosid HCl/ KOH + + Pro- anthocyanidin HCl/ to + + Polyphenol DD FeCl3 + - Tanin DD gelatin muối + + Saponin TT Liebermann ++ +++ 77
  89. Lắc với dd nước ++++ ++++ Acid hữu cơ Na2CO3 ++ ++ Chất khử TT Fehling ++ ++ Pha loãng với Hợp chất Polyuronic ++ + cồn 90 % Chú thích: (-): Âm tính. (±): Không rõ. (+): Có ít. (++): Có. (+++): Có nhiều. (++++): Có rất nhiều. Nhận xét: Sau khi tiến hành định tính sơ bộ các nhóm chất thì thu được các nhóm hợp chất như: Saponin, flavonoid, alkaloid, tanin, coumarin, chất béo, tinh dầu, các acid hữu cơ, glycosid tim Trong đó hợp chất saponin chiếm hàm lượng nhiều nhất. So sánh thành phần hóa học giữa thân và rễ Đinh lăng cho thấy thành phần hóa học giữa thân và rễ là như nhau. Song song đó, chúng cũng có sự khác biệt nhưng không đáng kể. Thành phần hóa học trong khóa luận này khảo sát giống với khảo sát của Dược Điển Việt Nam IV (2009) và trong các khảo sát trước đó. Như vậy thành phần hóa học của cây Đinh lăng trồng tại Tri Tôn - An Giang phù hợp với các nghiên cứu trước đó. 4.3.3. Chiết xuất Tiến hành theo mục 3.2.4.3. thu được kết quả như sau: Rễ Đinh lăng (9,3 kg) Ngấm kiệt với cồn 96 % Dịch chiết cồn (137 670 ml) Cô quay Cao cồn (1,75 kg) 78