Khóa luận Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC)

71 trang thiennha21 13/04/2022 6330

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_bieu_hien_he_vector_tai_lap_trinh_tren_te_bao_goc.pdf

Nội dung text: Khóa luận Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÙY LINH Tên đề tài: BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG CẢM ỨNG (iPSC) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: CNSH - CNTP Khóa học: 2015 – 2019 THÁI NGUYÊN, 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÙY LINH Tên đề tài: BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG CẢM ỨNG (iPSC) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: K47 – CNSH Chuyên ngành: CNSH - CNTP Khóa học: 2015 – 2019 Giảng viên hướng dẫn: 1. TS Nguyễn Xuân Hưng 2. PGS.TS Dương Văn Cường THÁI NGUYÊN, 2019
i LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Hưng – Phó viện trưởng kiêm Trưởng phòng Nghiên cứu khoa học Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec và PGS.TS Dương Văn Cường – giảng viên Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ths Trần Thị Tuyết Trinh – kỹ thuật viên Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen TS. Nguyễn Hồng Thanh, TS Đào Thị Mai Lan đã hỗ trợ nhiệt tình cho tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các thầy cô, cán bộ trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những người đã giúp đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua. Thái Nguyên, ngày 27 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thùy Linh
ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng 10 Bảng 2.1: Phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa 11 Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 21 Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 23 Bảng 3.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm 24 Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm trong Flow cytometry 28 Bảng 3.5: Thành phần của vector tái lập trình pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O 29 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR 35 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 35 Bảng 3.8: Trình tự mồi sử dụng trong thí nghiệm 37 Bảng 3.9. Thành phần phản ứng Real time PCR 37 Bảng 4.1: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid mini 39 Bảng 4.2: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid maxi 40 Bảng 4.3: Kết quả đo OD sau mỗi lần tách RNA 50
iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc 4 Hình 2.2: Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng 5 Hình 2.3: Ứng dụng của iPSC trong các lĩnh vực trị liệu gen, mô hình bệnh và khám phá thuốc 9 Hình 2.4: Cấu trúc miền của protein OCT4 12 Hình 2.5: Cấu trúc miền của protein của SOX2 13 Hình 2.6: Cấu trúc miền của protein KLF4 14 Hình 2.7: Cấu trúc miền protein của MYC 15 Hình 2.8: Cấu trúc miền protein của LIN28 16 Hình 2.9: Cấu trúc miền protein của GLIS1 17 Hình 2.10: Một số loại tế bào được dùng để tạo iPSC 18 Hình 2.11: So sánh các phương pháp biểu hiện gene trong tái lập trình 20 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong đề tài 25 Hình 3.2: DNA Plasmid dùng để tái lập trình 28 Hình 3.3: Chu trình nhiệt PCR cDNA 36 Hình 3.4: Chu trình nhiệt cài đặt cho máy Real-time PCR 37 Hình 4.1: Kết quả tách chiết DNA plasmid mini 39 Hình 4.2: Kết quả tách chiết DNA plasmid maxi 40 Hình 4.3: Tế bào CD34+ sau khi rã đông 41 Hình 4.4: Tế bào CD34+ sau 6 ngày nuôi tăng sinh 42 Hình 4.5: Tế bào CD34+ sau 2 ngày nuôi tăng sinh 43 Hình 4.6: Tế bào CD34+ sau 5 ngày nuôi tăng sinh 43 Hình 4.7. Sự biểu hiện tế bào CD34 trên bề mặt của quần thể tế bào nuôi tăng sinh 45 Hình 4.8: Tế bào sau 1 ngày xung điện 47 Hình 4.9: Quần thể tế bào sau 2 ngày chuyển gen (A), sau 3 ngày chuyển gen (B) và sau 7 ngày chuyển gen (C) 48
iv Hình 4.10: Tế bào sau 1 ngày xung điện 49 Hình 4.11: Quần thể tế bào sau 4 ngày chuyển gen (A), sau 5 ngày chuyển gen (B), sau 8 ngày chuyển gen (C). 49 Hình 4.12: (A)Biểu hiện của các gen SOX2-KLF4 và LMYC- LIN28 (B) Cấu trúc vector pCEB-hSK-O và pCEB-hUL-G 51
v DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ BSA Bovine serum albumin cDNA complementary DNA DMSO dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli ESC Embryonic stem cell hiPSC Human induced pluripotent stem cell HMG High mobility group HSC Hematopoietic stem cell ICM Inner cell mass iPSC Induced pluripotent stem cell LB Laria Broth mESC Mouse embryonic stem cell PBMC Peripheral blood mononuclear cell PCR Polymerase chain reaction qRT-PCR Quantitative polymerase chain reaction Ref Reference RNA Ribonucleic acid RT Reverse transcription Tg Target
vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT v Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1.Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 1.3.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài 2 1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 .Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 4 2.1.1 Tế bào gốc 4 2.1.2. Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng 4 2.1.3. Phân loại tế bào gốc 5 2.2. Các nhân tố tái lập trình 12 2.2.1. OCT4 12 2.2.2. SOX2 13 2.2.3. KLF4 14 2.2.4. MYC 15 2.2.5. LIN28 16 2.2.6. GLIS1 17 2.3 Tế bào nguồn dùng để tạo iPSC 18 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 21 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 21
vii 3.1.2. Địa điểm và thời gian 21 3.2. Nội dung nghiên cứu 21 3.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 3.3.1. Vật liệu 21 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu 25 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 4.1 Kết quả nhân plasmid lần 1 39 4.2. Kết quả nhân plasmid lần 2 40 4.3 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 1 41 4.4 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 2 43 4.5. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 1 46 4.6. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 2 48 4.7. Kết quả kiểm tra biểu hiện gen 50 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 5.1. Kết luận 53 5.2. Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cell - ESC) là những tế bào vạn năng, có khả năng tự làm mới và có nguồn gốc từ khối tế bào bên trong (inner cell mass – ICM) của phôi nang đang phát triển [44]. Tế bào gốc phôi có thể được nuôi cấy vô thời hạn trong khi vẫn duy trì khả năng tạo ra bất kỳ loại tế bào nào trong cơ thể, và do đó cung cấp một công cụ mạnh mẽ để mô hình hóa bệnh ở người [8] tuy nhiên tế bào gốc phôi vướng phải nhiều tranh cãi về đạo đức khi sử dụng trực tiếp nguồn phôi người [3]. Việc Yamanaka khám phá ra rằng các tế bào trưởng thành nguyên vẹn có thể được tái lập trình để trở thành các tế bào gốc vạn năng ngay lập tức được coi là một bước đột phá lớn. Các tế bào gốc vạn năng cảm ứng (induced pluripotent stem cell - iPSC) là đại diện thay thế cho nguồn tế bào gốc phôi, không gây tranh cãi về đạo đức và mang đầy đủ các đặc tính của một tế bào gốc phôi. Một lợi thế quan trọng của iPSC là khả năng tương thích miễn dịch khi sử dụng liệu pháp tế bào tự thân [30]. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng có thể được tạo ra từ nhiều loại tế bào sinh dưỡng khác nhau và có sự tương đồng cao với tế bào gốc phôi. Với các nguồn tế bào sinh dưỡng dễ tiếp cận, iPSC từ người không chỉ loại bỏ các vấn đề về đạo đức vướng phải khi sử dụng ESC mà còn cho phép tạo ra nguồn tế bào gốc vạn năng đơn giản hơn, cũng như biệt hóa thành nhiều loại tế bào chuyên biệt cho từng bệnh nhân. Tương tự như ESC, iPSC của người có khả năng tăng sinh mạnh mẽ trong ống nghiệm trong khi vẫn giữ được tiềm năng phát triển và biệt hóa thành mọi tế bào trong cơ thể. Do đó, các tế bào này có thể cung cấp một số lượng không giới hạn nguồn tế bào biệt hóa dành riêng cho bệnh nhân để tạo mô hình nghiên cứu bệnh, xét nghiệm độc tính, sàng lọc thuốc và sử dụng cho các liệu pháp cấy ghép. Việc tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm ứng bằng cách đưa các yếu tố tái lập trình vào tế bào sinh dưỡng là một phương pháp đầy hứa hẹn cho liệu pháp tế bào trong y học tái tạo.
2 Các dòng iPSC từ người đã bắt đầu được phát triển, quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới, tuy nhiên chủ yếu vẫn là các dòng được phát triển từ tế bào sinh dưỡng có hệ gen của người da trắng, tính đến nay chưa có dòng iPSC của người Việt Nam. Hệ gene của người Việt Nam khác với các nước trên thế giới do vị trí địa lý, khí hậu, phong tục tập quán, chính vì thế chúng tôi tiến hành tạo các dòng iPSC phù hợp với hệ gene của người Việt Nam, làm công cụ hữu ích để nghiên cứu cơ chế bệnh, khám phá và sàng lọc độc tính các loại thuốc mới và đặc biệt là trở thành một nguồn tế bào vô hạn sử dụng cho cấy ghép và y học tái tạo. Mặc dù tiến bộ nhanh chóng, nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam vẫn đang giới hạn trong việc sử dụng tế bào gốc đa năng với khả năng biệt hoá thành một số hữu hạn dòng tế bào, các nghiên cứu về iPSC mới chỉ bắt đầu ở chuột từ năm 2016. Từ các cơ sở khoa học nêu trên, tôi lựa chọn đề tài: “Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC)”. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Biểu hiện thành công hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc tạo máu của người. - Điện biến nạp hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, GLIS1 vào quần thể tế bào gốc tạo máu của người. - Kiểm tra biểu hiện gen của các yếu tố tái lập trình trong tế bào gốc tạo máu sau khi điện biến nạp. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Là tiền đề để tạo thành công dòng tế bào gốc vạn năng cảm ứng đầu tiên từ tế bào có hệ gen của người Việt Nam, đánh dấu một bước phát triển quan trọng trong lĩnh vực này tại Việt Nam.
3 - Tạo dòng iPSC đầu tiên của người Việt Nam để cung cấp một khối lượng lớn tế bào làm mô hình cho nghiên cứu biệt hóa, nghiên cứu sàng lọc thuốc. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Chuyển gen thành công là bước đầu quan trọng và cần thiết trong quy trình tạo dòng tế bào gốc vạn năng cảm ứng.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 .Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Tế bào gốc Tế bào gốc là một loại tế bào đặc biệt trong cơ thể. Hai đặc điểm đặc trưng của tế bào này là khả năng nhân đôi vô hạn và khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào sinh dưỡng khác [43]. Nhờ thế chúng có khả năng tái tạo, sửa chữa và thay thế các tế bào chết, tổn thương trong cơ thể. Tên gọi tế bào gốc được hình thành cũng vì khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau khiến người ta liên tưởng đến hình ảnh gốc cây phân nhánh, mỗi nhánh hình thành cành, lá, quả. Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc 2.1.2. Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng - Năm 1962, John B. Gurdon đã phát hiện DNA trong tế bào trưởng thành của ếch có lưu ọm i thông tin để phát triển thành mọi tế bào trong cơ thể ếch và điều này có nghĩa là tế bào của người trưởng thành cũng có thể tái lập trình [3]. - Năm 1981, Martin Evans và Martin Kaufman, Gail Martin phân lập được tế bào gốc phôi từ phôi của chuột [3].
5 - Năm 1997, Sir Ian Wilmut và cộng sự đã chuyển nhân vào tế bào sinh dưỡng để lập trình lại tế bào nhằm nhân bản cừu Dolly, loại động vật có vú đầu tiên được tạo bằng nhân bản tế bào sinh dưỡng [3]. - Năm 1998, James Thomson phân lập được tế bào gốc phôi người [3]. - Năm 2001, Tada và cộng sự đã dung hợp tế bào sinh dưỡng với tế bào gốc phôi để tạo ra các tế bào có khả năng biểu hiện gen liên quan đến các tế bào đa năng cho thấy ESC có chứa một số yếu tố có thể lập trình lại các tế bào sinh dưỡng [3]. - Năm 2006, các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ đã tạo ra tế bào gốc phôi hoàn toàn mới từ tế bào trưởng thành. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng này được tạo ra nhờ chuyển bốn gen kích hoạt tái lập trình để tạo ra tế bào có đặc tính giống tế bào gốc thu nhận ở phôi [3]. Hình 2.2: Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng 2.1.3. Phân loại tế bào gốc Có thể phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa hoặc phân loại theo nguồn gốc [48]. Theo tiềm năng biệt hóa (differentiation potency) đa dạng của tế bào, các nhà nghiên cứu đã chia tế bào gốc thành 4 loại khác nhau [8]: tế bào gốc toàn năng (Totipotent), tế bào gốc vạn năng (Pluripotent), tế bào gốc đa năng (Multipotent) và tế bào gốc đơn năng (Unipotent).
6 a. Tế bào gốc toàn năng Các tế bào thuộc giai đoạn từ bốn đến tám tế bào trong quá trình phát triển của phôi sau thụ tinh được gọi là tế bào gốc toàn năng, chúng chỉ tồn tại trong giai đoạn phát triển phôi sớm. Với tế bào gốc toàn năng, mỗi tế bào ban đầu có thể hình thành một cơ thể hoàn chỉnh. Chúng có tiềm năng cao nhất và nhiều nhất để có thể trở thành tất cả các tế bào của cơ thể. Ở động vật có vú trưởng thành (bao gồm cả người), có khoảng 200 loại tế bào thuộc các nhóm như tế bào thần kinh, tế bào cơ, tế bào biểu mô, tế bào máu, Những tế bào khác, bản chất cũng phát triển từ phôi, nhưng không hợp nhất tạo cơ thể gồm: mô ngoài phôi, nhau thai, dây rốn. Các dạng trên được tạo ra từ một tế bào toàn năng. Những tế bào ở giai đoạn phôi sớm đến giai đoạn phôi nang cũng có tính toàn năng và cũng có thể tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh [1]. b. Tế bào gốc vạn năng - Tế bào gốc phôi Cuối thập niên 20 được đánh dấu bằng sự bùng nổ của một hướng nghiên cứu non trẻ nhưng đầy tiềm năng, đó là công nghệ tế bào gốc, với khởi điểm là việc James Thomson phân lập được các tế bào gốc từ phôi người (1998) [18]. Các tế bào gốc phôi là các tế bào đa năng có thể được phân lập từ khối tế bào bên trong của tiền phôi. Tế bào gốc phôi đã nổi lên như một ứng cử viên hấp dẫn cho các liệu pháp dựa trên tế bào có khả năng phục hồi chức năng tế bào và mô bị mất. Những tế bào độc đáo này có thể tự làm mới vô thời hạn và có khả năng biệt hóa thành cả ba lớp mầm phôi (lá trong, lá giữa, lá ngoài). Ba lá mầm phôi này là nguồn gốc của tất cả các loại tế bào chuyên biệt khác nhau của cơ thể. Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên của tế bào gốc phôi để điều trị chấn thương tủy sống và thoái hóa điểm vàng trong năm 2010 đánh dấu sự khởi đầu của một kỷ nguyên mới trong y học tái tạo [40]. Tuy nhiên nghiên cứu này châm ngòi cho cuộc tranh luận về vấn đề đạo đức khi nguồn sử dụng là phôi người. Tế bào gốc phôi khi tiêm vào vị trí tổn thương có khả năng hình thành nên khối u quái (teratomas) tại vị trí tiêm. Do đó tế bào gốc cần được định hướng biệt
7 hóa thành các tế bào mong muốn trước khi được tiêm vào vị trí tổn thương. Hiện nay có một số kỹ thuật được dùng để kiểm soát sự biệt hóa tế bào gốc trên nuôi cấy thực nghiệm, ví dụ: thay đổi thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy, tác động vào bề mặt của đĩa nuôi cấy (tạo các giá thể), hay gài các gen đặc hiệu vào những tế bào này. - Tế bào gốc vạn năng cảm ứng Vào năm 1962, John B. Gurdon đã phát hiện DNA trong tế bào trưởng thành của ếch có lưu ọm i thông tin để phát triển thành mọi tế bào trong cơ thể ếch và điều này có nghĩa là tế bào của người trưởng thành cũng có thể tái lập trình. Gurdon đã phát hiện rằng có thể đảo ngược sự chuyên môn hóa của các tế bào. Trong một thí nghiệm cổ điển, ông đã thay thế nhân tế bào chưa trưởng thành trong tế bào trứng của ếch bằng nhân từ tế bào ruột trưởng thành. Tế bào trứng biến đổi này phát triển thành một con nòng nọc bình thường. Kết quả thí nghiệm này chứng minh rằng DNA của tế bào trưởng thành mang thông tin cần thiết để phát triển thành tất cả các tế bào trong ếch và nguyên sinh chất của tế bào trứng chứa các tác nhân cảm ứng quá trình phát triển đảo ngược từ tế bào trưởng thành [19]. Phát hiện mang tính bước ngoặt của Gurdon ban đầu bị hoài nghi nhưng đã được chấp nhận khi các nhà khoa học khác xác nhận, dẫn tới khởi xướng nghiên cứu mạnh mẽ và kỹ thuật này đã được phát triển hơn nữa, cuối cùng dẫn đến việc nhân bản của động vật có vú. Nghiên cứu của Gurdon đã cho thấy hạt nhân của một tế bào trưởng thành, chuyên biệt có thể được đưa trở lại trạng thái đa năng, chưa trưởng thành. Nhưng thí nghiệm của ông liên quan đến việc loại bỏ nhân tế bào, sau đó là việc đưa chúng vào các tế bào khác. Liệu có thể biến một tế bào nguyên vẹn trở lại thành tế bào gốc đa năng không? Shinya Yamanaka đã trả lời câu hỏi này trong một bước đột phá khoa học 40 năm sau phát hiện của Gurdon. Năm 2006 Shinya Yamanaka đã sử dụng các vector retrovirus để biểu hiện rất nhiều yếu tố phiên mã, đơn lẻ và kết hợp, trong nguyên bào sợi (fibroblasts) của chuột trong điều kiện nuôi cấy. Đáng lưu ý là ông đã phát hiện ra rằng cả tế bào người và chuột có thể được lập trình lại về trạng thái vạn
8 năng, được gọi là tế bào gốc vạn năng cảm ứng, tương tự như tế bào gốc phôi, sau khi xâm nhiễm (transduction) bằng retrovirus chỉ mã hóa 4 yếu tố : KLF4, SOX2, OCT4, và c-MYC [13]. Ngoài ra, James Thomson báo cáo rằng tổ hợp các yếu tố khác (OCT4, SOX2, NANOG và LIN28) có khả năng tái lập trình các tế bào sinh dưỡng của con người thành iPSC [28]. Các phòng thí nghiệm trên khắp thế giới đã nhanh chóng sử dụng kỹ thuật mang tính cách mạng này và đến năm 2009, chỉ sau 3 năm khi Yamanaka tạo thành công iPSC, khoảng 300 bài báo về iPSC được xuất bản [15]. Giải Nobel về Y Sinh học năm 2012 đã vinh danh 2 nhà khoa học Gurdon và Yamanaka với công trình tạo ra iPSC. Đến năm 2007, hai nhóm nghiên cứu độc lập đã tạo ra iPSC từ nguyên bào sợi của người [28], [32]. Việc phát hiện ra công nghệ tế bào gốc vạn năng cảm ứng đã mở ra những cơ hội chưa từng có trong y học tái tạo, mô hình bệnh và khám phá thuốc [7]. Đối với mô hình bệnh, tế bào sinh dưỡng sở hữu đặc điểm của các tế bào bị bệnh từ bệnh nhân được sử dụng để tạo ra iPSC và được tiếp tục sử dụng để nghiên cứu các bệnh [7]. Các tế bào sinh dưỡng từ bệnh nhân được sử dụng để tạo ra các iPSC. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng này có thể được sửa chữa bằng liệu pháp gen và tiếp tục được sử dụng để tạo ra các tế bào sinh dưỡng khỏe mạnh được cấy ghép cho bệnh nhân, hoặc chúng có thể được sử dụng để tạo ra các tế bào sinh dưỡng chưa được chỉnh sửa để mô hình hóa bệnh hoặc sàng lọc thuốc [7]. Ví dụ, vào năm 2012, các tế bào gốc thần kinh được tạo ra từ những người mắc bệnh Familial dysautonomia - một rối loạn di truyền hiếm gặp, ảnh hưởng đến các dòng tế bào thần kinh, phát triển tế bào thần kinh đã được sử dụng để sàng lọc gần 7000 phân tử nhỏ và xác định phân tử nhỏ sử dụng mô hình bệnh dựa trên iPSC có thể xác định thuốc bổ trợ để can thiệp điều trị bệnh Familial dysautonomia [9]. Các nghiên cứu phát triển thuốc trong đó gồm sàng lọc các phân tử nhỏ, kiểm tra độc tính để đánh giá sự an toàn, đã khai thác thành công dựa trên kỹ thuật iPSC [7]. Công nghệ này đã mở ra một trang sử mới đối với các liệu pháp tế bào gốc sử dụng tế bào gốc vạn năng cảm ứng trên người (human induced pluripotent stem cell- hiPSC)
9 của chính bệnh nhân do tránh được nguy cơ đào thải miễn dịch cũng như các vấn đề đạo đức đi kèm với việc sử dụng tế bào gốc phôi [45]. Hình 2.3: Ứng dụng của iPSC trong các lĩnh vực trị liệu gen, mô hình bệnh và khám phá thuốc Năm 2014, Nhật Bản lần đầu tiên sử dụng các tế bào biểu mô sắc tố võng mạc có nguồn gốc iPSC để điều trị thoái hóa điểm vàng [15]. Năm 2019, tại Nhật Bản đã thử nghiệm liệu pháp iPSC cho chấn thương tủy sống. Liệu pháp này thu tế bào đã biệt hóa từ bệnh nhân và tái lập trình chúng thành tế bào thần kinh thông qua tế bào gốc vạn năng cảm ứng, sau đó các bác sĩ lâm sàng sẽ tiêm 2 triệu tế bào vào vị trí tổn thương của mỗi bệnh nhân [53]. Hiện tại, có một nhu cầu được công nhận để đảm bảo an toàn cho bất kỳ liệu pháp có nguồn gốc iPSC nào và cần phải xác minh một cách có hệ thống các đặc điểm và sự an toàn của các dòng, bằng cách
10 kiểm tra bộ gen và biểu hiện của gen [54]. Ví dụ, nghiên cứu của Bhutani và cộng sự năm 2006 lần đầu tiên đánh giá sự an toàn của ba phương pháp tái lập trình phổ biến (retroviral vector, non-integrating Sendai virus, synthetic mRNAs). Ưu điểm quan trọng nhất của iPSC so với ESC là khả năng sử dụng tế bào sinh dưỡng trưởng thành từ những bệnh nhân mắc bệnh do di truyền xác định [23],[6]. So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng được trình bày ở bảng 1.1. Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng Tế bào gốc vạn năng Tế bào gốc phôi Tế bào gốc vạn năng cảm ứng Nguồn thu nhận Phôi thai Tế bào sinh dưỡng Vấn đề đạo đức Có Không Tốc độ tăng sinh Cao Cao Tính tiện dụng Cao Cao Khả năng tự biệt hóa Có Có Khả năng tạo dòng tế bào khác Cao Cao Khả năng gây đào thải miễn dịch Có Không c. Tế bào gốc đa năng Tế bào gốc đa năng (Multipotent) là những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào của cơ thể. Các tế bào được tạo thành nằm trong một hệ tế bào có liên quan mật thiết. Ví dụ như tế bào gốc trung mô có thể biệt hóa thành tế bào xương, sụn, mỡ. Các tế bào gốc đa năng có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như mô mỡ, cuống rốn, tủy xương, tủy răng sữa, Mặc dù có giới hạn về khả năng biệt hóa, nhưng gần đây, loại tế bào này cũng đã được y sinh học tập trung khai thác, và qua đó đã được ứng dụng rất thành công trong nhiều liệu pháp dựa vào tế bào gốc (stem cell therapy). Tế bào gốc trưởng thành có khả năng biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào có chức năng khác như thế bào gan, biểu bì, xương, giác mạc. Những tế bào này có thể rất hữu ích
11 trong việc sửa chữa mô, cơ quan bị tổn thương một cách trực tiếp cho chính bệnh nhân [1]. Các chức năng chính của tế bào gốc đa năng: Có mặt với số lượng nhỏ trong các mô chuyên biệt Chức năng chính là bổ sung các tế bào bị hư hỏng Vẫn hoạt động cho đến khi chúng nhận thấy tín hiệu để phân biệt thành các các loại tế bào cụ thể d. Tế bào gốc đơn năng Tế bào gốc đơn năng còn được gọi là tế bào gốc định hướng đơn dòng hay tế bào đầu dòng (progenitor cells) là những tế bào gốc chỉ có khả năng biệt hóa theo một dòng. Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc trưởng thành trong nhiều tổ chức đã biệt hóa thành một dòng tế bào. Khả năng biệt hóa theo dòng này cho phép duy trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo mô, thay thế các tế bào mô chết vì già cỗi bằng các tế bào phôi mới. Tóm lại, theo tiềm năng biệt hóa, tế bào gốc được phân loại thành 4 loại, và được tóm tắt tại bảng 2.1. Bảng 2.1: Phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa Số kiểu tế bào Tên gọi Số tế bào biệt hóa Ví dụ biệt hóa Toàn năng Hợp tử (trứng Tất cả những tế Tất cả (Totipotent) được thụ tinh) bào trong cơ thể Những tế bào thu Vạn năng Tất cả, trừ tế bào Những tế bào thu nhận từ ba lớp (Pluripotent) màng phôi nhận từ lớp ICM phôi Đa năng Tế bào gốc Nhiều Tất cả tế bào máu (Multipotent) tạo máu Tiền thân dưỡng Đơn năng Một bào (Mast cell Dưỡng bào (Unipotent) precursor)
12 2.2. Các nhân tố tái lập trình 2.2.1. OCT4 Miền protein của OCT4 được trình bày ở hình 2.4. Hình 2.4: Cấu trúc miền của protein OCT4 OCT4 (yếu tố phiên mã gắn với octamer 4) còn được gọi là POU5F1, là một nhân tố phiên mã thuộc họ POU (POU trancription factor family), lớp 5, yếu tố phiên mã 1, thuộc họ protein liên kết DNA POU (Pit, Oct, Unc). OCT4 nằm trên NST số 6 ở người (6p21.33), gene dài 6.4 kbp. OCT4 chứa một trình tự nhận diện octamer (8bp) được thấy trong promoter và enhancer của nhiều gen chuyên biệt và biểu hiện thường xuyên [24]. OCT4 dường như chỉ biểu hiện ở các dòng tế bào vạn năng [50]. OCT4 biểu hiện trong phôi chuột ở các giai đoạn phôi sớm từ 4-8 tế bào, đến khi “ngoại phôi bì” bắt đầu biệt hóa. Phôi chuột đột biến OCT4 sẽ chết sau khi làm tổ bởi thiếu khối tế bào bên trong (inner cell mass - ICM) [24] và phôi này chỉ có duy nhất một tế bào là tế bào túi phôi (trophoblast). Tế bào gốc phôi ở chuột (mouse embryonic stem cell - mESC) bị giảm biểu hiện của OCT4 sẽ biệt hóa thành tế bào túi phôi [16] và nếu gia tăng sự biểu hiện của OCT4 trong mESC có thể làm các tế bào này biệt hóa. Có thể OCT4 ức chế biệt hóa thành tế bào túi phôi và hoạt động cùng các nhân tố phiên mã khác hay các yếu tố đồng điều hòa (co-regulator), và tỷ lệ giữa nồng độ của các nhân tố đó sẽ quyết định số phận của tế bào [1]. Vai trò của OCT4 trong sự duy trì tính đa năng của tế bào gốc phôi người (human embryonic stem cell - hESC) giống với vai trò của nó trong mESC. Sự phiên mã OCT4 bị hạn chế ở tế bào gốc phôi và trong tế bào vạn năng invitro. Sự biểu hiện ở mức độ thấp các marker OCT4 đã được phát hiện trong nhiều dòng tế bào ngoại bì hay ngoại bì thần kinh (octoderm/neurooctoderm) cả ở invitro và invivo. Thí nghiệm trên chuột loại bỏ gen OCT4 cho thấy, OCT4 giữ vai trò quyết định trong sự thiết lập tính đồng nhất của tế bào gốc vạn năng [26].
13 Hai tiểu phần của OCT4 được tổng hợp bằng cách cắt nối thay thế (alternative splicing) Pou5f1 mRNA. Hai tiểu phần, OCT4-IA và OCT4-IB có kích thước lần lượt là 360 và 265 axit amin, trong đó có 225 axit amin tại đầu C giống hệt nhau, khác nhau về trình tự ở đầu N. OCT4-IA phải đạt đến ngưỡng nhất định để duy trì khả năng tự đổi mới và toàn năng của tế bào gốc, OCT4-IB đã được chứng minh không liên quan đến việc này. Trong cơ thể, mRNA của OCT4 có măt trong các giai đoạn phôi sớm, từ noãn bào chưa được thụ tinh cho đến hình thái chưa hoàn chỉnh (uncompacted morula). OCT4 có vai trò quyết định sự phân cực của hợp tử bằng cách cùng với yếu tố phiên mã SOX2, KLF4 tạo thành phức hợp ba trên DNA điều khiển sự biểu hiện của một số gene liên quan đến phát triển phôi như YES1, FGF4, UTF1 và ZFP [24]. Cách hoạt hóa của các gen mục tiêu OCT4 và duy trì tính đa năng vẫn chưa rõ. Bằng cách kết hợp với yếu tố đồng điều hòa khác, OCT4 có thể hoạt động vừa như một nhân tố hoạt hóa phiên mã, vừa như một nhân tố ức chế phiên mã. 2.2.2. SOX2 Miền protein của SOX2 được trình bày ở hình 2.5. Hình 2.5: Cấu trúc miền của protein của SOX2 SOX2 là thành viên họ gen SOX (box HMG liên quan đến SRY), mã hóa nhân tố phiên mã với một miền gắn DNA HMG đơn (singer high mobility group DNA-binding domain), có vị trí 3q26.33 trên nhiễm sắc thể số 3 cánh q băng 26.33, nằm ở sợi dương, kích thước gene 2513 bp và 317 axit amin [17], [30]. Giống với OCT4, SOX2 biểu hiện trong các tế bào đa năng của phôi chuột trong giai đoạn phôi sớm, ICM, ngoại phôi bì và tế bào mầm sinh dục. Nhưng khác với OCT4, SOX2 cũng biểu hiện trong nhiều tế bào ngoại bì và phôi, và trong các tế bào tiền thân thần kinh, và quan trọng cho sự duy trì tính đồng nhất của chúng. Sự
14 biểu hiện giảm của SOX2 liên quan đến quá trình biệt hóa. Phôi chuột loại bỏ gen SOX2 sống bình thường ở giai đoạn phôi nang, nhưng chết nhanh sau khi phôi làm tổ. Các phôi này thiếu cấu trúc xi lanh trứng (egg cylinder) và thiếu các tế bào biểu mô. Khi nuôi cấy in vitro để thiết lập dòng gốc phôi, phôi nang loại bỏ gen SOX2 phát triển bình thường vào ngày đầu, nhưng sau đó biệt hóa thành tế bào tế bào túi phôi (trophectoderm) và tế bào nội mô vách. Vai trò in vitro của SOX2 là duy trì quần thể tế bào đa năng ở giai đoạn sớm của phôi [1]. Các phôi sớm biểu hiện ở mức cao các protein SOX2 có nguồn gốc từ mẹ. Ngay trong chuột loại bỏ gen SOX2, các protein SOX2 từ mẹ vẫn được duy trì cho đến giai đoạn phôi nang. Do đó, nguyên nhân mà các phôi đột biến vẫn sống sót đến khi làm tổ có thể là do mức biểu hiện hiệu quả của SOX2 có nguồn gốc từ bố mẹ đến giai đoạn đó. Do vậy, có thể SOX2 không cần thiết cho sự duy trì hay tạo ra tính đa năng trong các giai đoạn phôi sớm, nhưng không thể được phát hiện trong chuột bị loại bỏ bởi vì sự hiện diện của SOX2 có nguồn gốc từ mẹ. Hơn nữa, SOX2 có vai trò trong sự suy trì của các tế bào tế bào túi phôi [1]. 2.2.3. KLF4 Miền protein KLF4 được trình bày ở hình 2.6. Hình 2.6: Cấu trúc miền của protein KLF4
15 KLF4 mã hóa một loại protein thuộc họ yếu tố phiên mã Kruppel. Protein ngón tay kẽm (zinc finger protein) được mã hóa là cần thiết cho sự phát triển bình thường của chức năng bảo vệ cơ học của da, có vị trí 9q31.2, nhiễm sắc thể số 9 cánh q băng số 31.2, có kích thước gene 5,631 bp, 513 axit amin và nằm ở sợi âm. Protein KLF4 kiểm soát quá trình chuyển đổi từ pha G1 sang pha S của chu trình tế bào sau tổn thương DNA bằng cách làm trung gian gen ức chế khối u p53. Chuột thiếu gen này có ngoại hình bình thường nhưng giảm cân nhanh chóng và chết ngay sau khi sinh do bốc hơi chất lỏng do chức năng hàng rào biểu bì bị tổn thương [29]. KLF4 có miền kích hoạt phiên mã đầu N, tiếp theo là miền ức chế phiên mã, chứa hai gốc lysine K225 và K229. Các gốc này được acetyl hóa bởi p300/CBP, tương tác với miền kích hoạt. Có một chuỗi PEST tiềm năng giữa các miền kích hoạt. Đầu C có một miền liên kết DNA chứa ba ngón tay kẽm, nhận biết và liên kết với các chuỗi mục tiêu của GC/CACCC trong nhân. Tín hiệu hướng nhân (Nuclear Localization Signal - NLS) (6 aa) nằm giữa các miền liên kết và ức chế DNA, tạo điều kiện cho việc vận chuyển KLF4 vào hạt nhân [14]. 2.2.4. MYC Cấu trúc miền protein của gen MYC được trình bày ở hình 2.7. Hình 2.7: Cấu trúc miền protein của MYC Họ MYC của các yếu tố sao chép dây kéo xoắn ốc xoắn ốc cơ bản bao gồm MYC, MYCN và MYCL [21]. MYC (homelocytomatosis virus oncogene homolog) đại diện cho một trong những mục tiêu thuốc được tìm kiếm nhiều nhất trong ung
16 thư. Yếu tố phiên mã MYC là một yếu tố điều hòa thiết yếu cho sự phát triển của tế bào, nhưng trong hầu hết các bệnh ung thư, nó được biểu hiện quá mức và liên quan đến kết quả kháng trị và kháng thuốc. Gen MYC dài khoảng 6 kb, được tìm thấy tại locus 8q24,21 trên nhiễm sắc thể 8 và có 439 axit amin. MYC chứa ba exon – exon 1 có kích thước lớn và không được dịch mã, tiếp theo là exon mã hóa 2 và 3, bốn trình khởi động riêng biệt - P0, P1, P2 và P3 - điều khiển phiên mã MYC, hai bộ ba mở đầu là (CTG và ATG), từ đó phát sinh hai protein MYC được biểu hiện [34]. Yếu tố phiên mã này kiểm soát sự biểu hiện của hàng trăm gen mục tiêu, nhiều trong số đó cũng là gen gây ung thư hoặc ức chế khối u và có vai trò trong sự tăng sinh tế bào và chu kỳ tế bào [9]. 2.2.5. LIN28 Miền protein của LIN28 được trình bày ở hình 2.8. Hình 2.8: Cấu trúc miền protein của LIN28 LIN28 là protein liên kết với RNA có vai trò thúc đẩy tính đa năng thông qua sự điều tiết của microRNA let-7 [25]. Ở động vật có vú, có hai loại gen LIN28 là LIN28A và LIN28B. Các gen LIN28A và LIN28B của con người có 209 và 250 axit amin [20]. LIN28 nằm ở vị trí 1p36.11 có kích thước 18,951 bp và nằm ở sợi dương [13]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LIN28A là một yếu tố đa năng của tế bào gốc. Sử dụng OCT4, SOX2, NANOG và LIN28A, các nguyên bào sợi ở người trưởng thành đã được tái lập trình lại thành công thành các tế bào gốc đa năng cảm
17 ứng [14]. Đáng chú ý, ba trong số bốn yếu tố Yamanaka sử dụng để tái lập trình có LIN28 [22]. 2.2.6. GLIS1 Miền protein của GLIS1 được trình bày ở hình 2.9. Hình 2.9: Cấu trúc miền protein của GLIS1 GLIS1 kết hợp với một số yếu tố tái lập trình khác, đã được chứng minh là làm tăng đáng kể hiệu quả của việc tạo ra các tế bào gốc vạn năng cảm ứng từ các tế bào sinh dưỡng [7]. GLIS1 có vị trí 1p32.3, kích thước 231 874 bp, 620 axit amin và nằm trên sợi âm [11]. Sự biểu hiện quá mức ban đầu của OCT3/4 (POU5F1), SOX2 và KLF4 (OSK) được sử dụng rộng rãi để tái lập trình các tế bào sinh dưỡng thành iPSC. Tuy nhiên, hiệu quả của việc tạo ra iPSC rất thấp, điều này được cho là do những khó khăn trong việc vượt qua các rào cản biểu sinh trong tế bào khởi đầu. Sự biểu hiện của C-MYC làm tăng hiệu quả, nhưng cũng tăng cường khả năng gây khối u tiềm tàng của các tế bào biệt hóa có nguồn gốc iPSC. GLIS1 làm tăng đáng kể số lượng khuẩn lạc iPSC được tạo ra khi được biểu hiện với OSK (gọi là OSKG) trong nguyên bào sợi của người hoặc chuột [39]. Ngược lại, giảm biểu hiện GLIS1 bằng shRNA (short hairpin RNA) làm giảm hiệu suất tạo ra các khuẩn lạc iPSC do OSK gây ra trong các nguyên bào sợi chuột, cho thấy GLIS1 nội sinh có thể thúc đẩy quá trình tái lập trình qua trung gian OSK. Hơn nữa, cấy ghép gen OSKG iPSC dưới da đã hình thành các khối u có chứa các tế bào biệt hóa từ cả ba lớp mầm. Những dữ liệu này đã chứng minh rằng GLIS1 hoạt động như một công cụ thúc đẩy mạnh mẽ việc lập trình lại tế bào sinh dưỡng. Hơn nữa GLIS1 được tinh chế cùng với OCT3/4, SOX2 và KLF4 cho thấy rằng nó là một phần của phức hợp lớn hơn của các protein này [7]. Sự gia tăng hiệu quả lập trình bởi GLIS1 cũng được thể hiện bởi Yoshioka và cộng sự khi ông sử dụng một số thí nghiệm khác nhau để tạo ra iPSC sử dụng virus RNA viêm não ngựa ở Venezuela (Venezuelan equine encephalitis)
18 đã biểu hiện OCT4, SOX2, KLF4 và GLIS1 (OSKG) [42]. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng GLIS1 biểu hiện trong một số quần thể tế bào gốc và tế bào tiền thân, cho thấy vai trò có thể có của các protein này trong việc điều hòa duy trì, biệt hóa hoặc tự đổi mới của các tế bào này [7]. 2.3 Tế bào nguồn dùng để tạo iPSC Hiện nay, rất nhiều loại tế bào đã được sử dụng để tạo dòng iPSC thành công [9]. Độ phổ biến dòng tế bào để tái lập trình như: tế bào đơn nhân máu ngoại vi (Peripheral blood mononuclear cell - PBMC), nguyên bào sợi (Fibroblast), tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell), tế bào gốc tủy răng sữa (Dental pulp stem cells), tế bào gốc dây rốn (Cord blood cells), tế bào gan (hepatocytes), tế bào nước ối (Amniotic fluid cells), tế bào mầm sinh dục (Germline stem cell). Độ phổ biến dòng tế bào để tái lập trình tế bào gốc vạn năng cảm ứng được thể hiện tại hình 2.10. Hình 2.10: Một số loại tế bào được dùng để tạo iPSC Có nhiều nguồn thu nhận tế bào gốc vạn năng cảm ứng như nguyên bào sợi, máu cuống rốn, máu ngoại vi. Nguyên bào sợi là một nguồn chủ yếu để tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng với khả năng tăng sinh qua nhiều lần cấy chuyển trong nuôi cấy, và khả năng tiếp nhận hiệu quả các virus biểu hiện tổ hợp các yếu tố phiên mã cho tái lập trình [8]. Tuy nhiên, nguyên bào sợi sinh thiết từ da đòi hỏi các thủ thuật xâm lấn, tốn nhiều công sức và lấy đủ số lượng tế bào để tái lập trình cần có thời
19 gian. Ngoài ra, khả năng tạo iPSC từ da có tương quan nghịch với tuổi của người hiến tặng do khả năng gây đột biến bên ngoài lớp da [12]. Cuống rốn là một bộ phận giúp cung cấp dinh dưỡng nuôi thai nhờ sự kết nối thai nhi với nhau thai trong tử cung người mẹ. Máu cuống rốn là máu được lấy từ cuống rốn và nhau thai sau khi sinh con và cắt rốn. Trước đây, cuống rốn và nhau thai thường được bỏ đi sau mỗi ca sinh nở như một loại rác thải y tế. Tuy nhiên, thực tế máu cuống rốn là nguồn cung cấp dồi dào tế bào gốc tạo máu. Lấy máu cuống rốn được xem là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và không gây đau cho cả mẹ và bé, có thể áp dụng cho cả sinh mổ và sinh thường. Trong máu cuống rốn chứa một lượng lớn tế bào gốc tạo máu có khả năng tái tạo các tế bào máu và tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể. Việc tái lập trình các tế bào CD34+ trong máu cuống rốn thành các tế bào gốc vạn năng cảm ứng có các ứng dụng tiềm năng trong y học tái tạo bằng cách chuyển đổi các ngân hàng máu cuống rốn thành ngân hàng iPSC để điều trị thay thế tế bào dị ghép [49]. Tế bào CD34+ từ máu ngoại vi cũng đã tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm ứng [49] Một trong những dấu hiệu để nhận biết tế bào tạo máu (hematopoietic) là protein bám màng (marker) - CD34. Nhiều dòng iPSC ở người được tạo ra từ máu dây rốn đông lạnh từ tế bào CD34+ của các bệnh nhân khỏe mạnh và có thể được chuyển hướng đến biệt hóa tạo máu [52]. CD34 được biểu hiện trên bề mặt tế bào tủy xương ở người từ 1-5%, máu cuống rốn là ~1% và <0,1% từ máu ngoại vi [55]. Mặc dù CD34 được biểu hiện với cường độ cao ở tế bào tủy xương, nhưng việc lấy tế bào gốc tủy xương cần thủ thuật xâm lấn gây ra những tác dụng phụ không mong muốn cho bệnh nhân, vì thế trong thí nghiệm này tôi đã sử dụng tế bào CD34 được phân lập từ máu cuống rốn. Tế bào sinh dưỡng phải được biểu hiện các gene của tế bào gốc để tạo thành iPSC. Hiện nay có nhiều biện pháp khác nhau để tế bào biểu hiện những gene mong muốn như: lentivirus, excisable lentivirus, RNA, transposon, episomal vector, các phân tử nhỏ (Small molecule, ví dụ: mi RNA), Protein. Lentivirus chèn vào hệ gene
20 của tế bào nhận vì thế iPSC rất dễ bị thay đổi kiểu nhân, và lo ngại gây ra khối u khi sử dụng iPSC trong liệu pháp tế bào. Tạo iPSC bằng protein có độ an toàn rất cao nhưng hiệu quả lại thấp. Sử dụng mRNA có tính an toàn cao nhưng cần nhiều thời gian để thao tác và hiệu suất thành công không cao. Episomal vector là một phương pháp chuyển gene mà không chèn vào hệ gene của tế bào đích. Episomal vector là vector DNA tồn tại trong nhân tế bào và có khả năng tự tái bản độc lập với DNA của tế bào đích [41]. Các yếu tố tái lập trình có thể chuyển vào tế bào sinh dưỡng bằng cách sử dụng episomal vector như plasmid hoặc DNA nhỏ dạng vòng (minicircle DNA). Không như retrovirus và lentivirus, phương pháp này đơn giản hơn, dễ tiến hành và gây biến đổi hệ gene của tế bào đích. Bên cạnh đó, RNA, transposon, các phân tử nhỏ (Small molecule) là các phương pháp tạo iPSC mà không tác động đến hệ gene của tế bào chủ nhưng lại có những nhược điểm như: thời gian tiến hành thí nghiệm lâu hơn, hiệu suất thấp hơn, tỉ lệ thành công không cao, chi phí đắt [51]. Chính vì thế chúng tôi đã sử dụng Episomal vector với tính an toàn cao, giá thành rẻ, hiệu quả tốt và thời gian thao tác thí nghiệm nhanh [3]. Tuy nhiên, biểu hiện của episomal không kéo dài, nên hiệu quả tái lập trình của nó thấp khi so sánh với minicircle DNA. Các phương pháp biểu hiện gen được trình bày ở hình 2.11. Hình 2.11: So sánh các phương pháp biểu hiện gene trong tái lập trình
21 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu Tế bào gốc tạo máu CD34 (80% tinh sạch) trữ đông thu từ máu cuống rốn được cung cấp bởi Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec. 3.1.2. Địa điểm và thời gian Địa điểm: Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec Time City – Hà Nội Thời gian thực hiện: 01/01/2019 – 31/5/2019. 3.2. Nội dung nghiên cứu - Nhận vector tái lập trình - Nuôi cấy tế bào gốc tạo máu của người - Biểu hiện hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, L-MYC, GLIS1 trên tế bào gốc tạo máu 3.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Vật liệu 3.3.1.1. Hóa chất và sinh phẩm Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm Tên hóa chất Hãng sản xuất Công dụng imMediaTM Amp Blue for InvitrogenTM life Môi trường nuôi cấy chọn lọc lacZ+ AmpR recombinant E. technologies E. coli coli strains imMediaTM Amp Liquid for InvitrogenTM life Môi trường nuôi cấy tăng sinh AmpR recombinant E. coli technologies E. coli strains QiAprepR Spin Miniprep Kit QIAGEN Tinh sạch DNA RedSafeTM Nucleic Acid iNtRON Thuốc nhuộm DNA
22 Tên hóa chất Hãng sản xuất Công dụng Staining Solution Biotechnology 10X FastDigest Green Buffer Themo Scientific DNA Loading dye GeneRuler 1kb DNA Ladder Themo Scientific Thang DNA cho điện di Agarose InvitrogenTM life Gel chạy điện di phân tích technologies DNA TBE 0,5X Việt Nam Đệm cho chạy điện di Isopropanol Emsure Tủa DNA trong quá trình phân tách Cồn 70 Việt Nam Khử trùng các dụng cụ thí nghiệm Tripan blue solution Gigma Life Science Dung dịch nhuộm để đếm tế bào Stem Kit Reagents Beckman coulter Xác định tỷ lệ tế bào CD34+ sau khi nuôi tăng sinh 7-AAD Beckman coulter Phân biệt tế bào sống chết trong chạy flow cytometry iPS Brew XF 50X Stem MACSTM Các thành phần dinh dưỡng bổ Supplement sung cho môi trường nuôi cấy iPS Brew XF Stem MACSTM Môi trường cơ bản để nuôi cấy tế bào sau chuyển gene Nuclease Free Water Themo Scientific Nước cất không chứa nuclease sử dụng cho sinh học phân tử QiAprepR Spin Maxiprep Kit QIAGEN Kit tinh sạch DNA plasmid từ vi khuẩn Power SYBR™ Green PCR Themo Scientific qRT-PCR kit sử dụng để xác Master Mix định biểu hiện của các gene tái lập trình
23 3.3.1.2. Thiết bị Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm Hãng sản Tên thiết bị Công dụng xuất Tủ an toàn sinh học cấp 2 Esco, Mỹ Bảo vệ mẫu tế bào nuôi cấy khỏi các tác nhân gây nhiễm Tủ nuôi cấy tế bào Thermo Cung cấp nhiệt độ, nồng độ CO2 phù Scientific hợp cho tế bào tăng sinh Kính hiển vi quang học Carl Zeiss Quan sát tế bào trong quá trình nuôi cấy Bể ổ nhiệt Memmert Rã đông hoặc làm ấm mẫu và môi trường nuôi cấy Pipet man Eppendorf Hút xả chất lỏng với thể tích xác định Máy li tâm lạnh loại nhỏ Eppendorf Tách hỗn hợp hai pha rắn - lỏng hoặc lỏng - lỏng thành các phần riêng biệt. Vortex Eppendorf Trộn đều mẫu, hóa chất thí nghiệm Máy lắc nhiệt nuôi vi Thermo Nuôi tăng sinh vi khuẩn. khuẩn Scientific BD FACS Canto II: Flow BD Xác định kích thước, độ hạt và các Cytometer kháng nguyên biểu hiện trên bề mặt tế bào Máy đo nồng độ Thermo Xác định nồng độ và độ tinh sạch của Nanodrop 2000 Scientific nucleic acid Máy chuyển gen 4D X- Lonza Chuyển plasmid mang gen tái lập trình unit vào tế bào đích Máy li tâm lạnh loại nhỏ Beckman Sử dụng trong quá trình phân tách và Coulter tinh sạch DNA, RNA Máy điện di ngang Optima Kiểm tra plasmid sau khi tinh sạch Lò vi sóng Sharp Pha gel chứa agar sử dụng cho nuôi cấy vi khuẩn Nồi hấp khử trùng Daihan Khử trùng, tiệt trùng dụng cụ thí Autoclave nghiệm. Tủ sấy dụng cụ Memmert Sấy dụng cụ làm thí nghiệm sau khi khử trùng hơi nước Tủ lạnh 40 và -200 Toshiba Bảo quản hóa chất, mẫu thí nghiệm. Tủ -800 Sanyo Bảo quản hóa chất, mẫu thí nghiệm. Cân điện tử HR200 A&D Cân hóa chất có độ chính xác 0,001g trở lên. Máy soi gel Bio rad Phát hiện DNA dưới tia UV. Máy 7500 Real time PCR Thermo Xác định các biểu hiện của các gen tái System Scientific lập trình PCR Proflex 3 block Thermo Tổng hợp cDNA cho phản ứng Scientific Realtime PCR
24 3.3.1.3.Dụng cụ vật tư tiêu hao Bảng 3.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm Tên Hãng sản xuất Công dụng Micropipette loại 10μl, 20μl, 100μl, Corning Hút, trộn đều dung dịch 200μl, 1000μl Ống ly tâm 50 ml Corning Chứa tế bào, môi trường Ống ly tâm 15 ml Corning nuôi cấy, hóa chất trong các Ống Eppendorf 2 ml Corning thí nghiệm Buồng đếm tế bào Incyto Đếm số lượng tế bào Serological pipette 5 ml Thermo Fisher Serological pipette 10 ml Thermo Fisher Hút dung dịch Serological pipette 25 ml Thermo Fisher Gạc sạch/ giấy sạch Bảo Thạch Vệ sinh dụng cụ và khu vực thí nghiệm bằng cồn 70 Ống 5 ml chạy Flow cytometry BD Science Đựng tế bào để chạy flow cytometry Que cấy trải vô trùng Sarstedt Cấy E. coli lên đĩa thạch Đĩa peptri Biologix Đĩa nuôi cấy E. coli Đĩa 6 giếng An Nhiên Đĩa nuôi cấy tế bào Ống PCR 0.2 ml Bimetech Đựng phản ứng tổng hợp cDNA Dãy ống realtime PCR 0.2 ml Bimetech Đựng phản ứng realtime PCR
25 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.3.2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong đề tài 3.3.2.2. Các phương pháp sử dụng trong đề tài 3.3.2.2.1 Tế bào gốc tạo máu CD34+ trữ đông thu từ máu cuống rốn của người (CD34+ 80%) Tế bào CD34 trữ đông thu từ máu cuống rốn của người (80% tế bào dương tính với marker tế bào gốc tạo máu CD34+ sau khi tinh sạch bằng cột) được cung cấp bởi Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec
26 3.3.2.2.2. Rã đông và nuôi tăng sinh tế bào CD34+ a. Chuẩn bị: Làm ấm môi trường cơ bản nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc tạo máu (StemSpan-ACF) và rã đông ống chứa hỗn hợp các cytokine bổ sung (StemSpan CC110) Tế bào gốc tạo máu trữ đông Đĩa 6 giếng b. Quy trình nuôi tăng sinh - Pha môi trường nuôi cấy tế bào bằng cách trộn đều StemSpan-ACF với StemSpan CC110 với tỉ lệ phù hợp - Cho 2 ml vào đĩa 6 giếng. Để vào tủ ấm. - Lấy ống tế bào trữ đông ra khỏi tủ -800C, làm ấm nhanh để dịch chứa tế bào tan ra. - Hút hết dịch tế bào cho vào ống falcon 15ml chứa môi trường đã ủ ấm - Ly tâm falcon tế bào 400G/4 phút và đổ bỏ dịch nổi - Hòa lại cặn tế bào trong 1ml môi trường và hút vào giếng có chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn - Hút môi trường ở đĩa 6 giếng vào ống eppendorf 2 ml. Trộn nhẹ 0 - Cho vào đĩa 6 giếng/ lắc nhẹ sau đó để vào tủ ấm 37 , nồng độ CO2 5%. c. Phương pháp thay môi trường tế bào Trong quá trình nuôi tăng sinh tế bào, khi mật độ tế bào phủ trên đĩa nuôi cấy 70-80% (sau khoảng 24-48 giờ), môi trường cũ được thay bằng môi trường mới để cung cấp dinh dưỡng cho tế bào phát triển. Quy trình bổ sung môi trường trong quá trình nuôi cấy: - Hút bỏ môi trường cũ. - Thêm môi trường mới. - Huyền phù và nuôi tiếp. d. Phương pháp cấy chuyển tế bào
27 Khi tế bào đạt mật độ 70-80% bề mặt diện tích bình nuôi, tế bào được cấy chuyển để tạo không gian cho tế bào phát triển và tăng sinh. Quy trình cấy chuyển - Hút hết môi trường cũ. - Ly tâm 3000 vòng/ 5 phút loại môi trường. - Huyền phù lại cặn tế bào trong môi trường mới và nuôi tiếp. e. Phương pháp xác định tế bào sống chết bằng thuốc nhuộm Trypan Blue - Hút 10 µl dung dịch tế bào, thêm vào 10 µl dung dịch Trypan Blue, trộn đều bằng micropipette. - Hút dịch đã trộn nạp vào buồng đếm hồng cầu. - Đếm tế bào ở 4 vùng 16 ô ở 4 góc của buồng đếm, tính mật độ tế bào theo công thức: 푠ố đế Số tế bào = x độ pha loãng x 104 4 3.3.2.2.3. Phân tích tỷ lệ tế bào CD34+ trong quần thể tế bào tăng sinh bằng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry) “Cytometer” là thuật ngữ có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, “κντοζ” nghĩa là cơ thể (theo nghĩa hiện đại tức là tế bào), và “μετρον” mang nghĩa đo đạc. Phân tích tế bào theo dòng chảy là một kỹ thuật phổ biến trong tế bào học dùng để đánh giá các đặc điểm của tế bào như: đếm số lượng tế bào, đo kích thước, đánh giá độ phức tạp bên trong tế bào, phát hiện các kháng nguyên bề mặt của tế bào khi được nhuộm huỳnh quang. Khi dòng chảy đơn bào đi qua chùm laser, máy thu được hai loại ánh sáng là tán xạ trước (forward scatter – FC) và ánh sáng tán xạ ngang (side scatter – SC). FC dùng để xác định kích thước của tế bào; SC dùng để xác định độ phức tạp bên trong tế bào và phát hiện các kháng nguyên bề mặt của tế bào qua ánh sáng huỳnh quang [52]. Chuẩn bị: Quy trình chuẩn bị ống và kháng thể chạy trong Flow cytometry: - Tế bào được ly tâm 3000 G/5 phút thu cặn - Huyền phù lại cặn tế bào trong 150 ul PBS
28 - Bổ sung kháng thể - Ủ tối 20 phút - Bật máy phân tích dòng chảy tế bào - Rửa lại máy bằng nước sạch - Vontex ống trước khi đặt vào máy phân tích dòng chảy tế bào - Chạy mẫu cần phân tích Thiết kế thí nghiệm được trình bày bảng 3.4: Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm trong Flow cytometry Ống 3 Ống 1 Ống 2 (CD45/IsoClonic (ống đối chứng) (CD45/CD34) Control - PE) CD45-FITC/CD34-PE X 10 ul X CD45-FICT/IsoClonic X X 10 ul Control-PE 7-AAD X 10 ul 10 ul 105 tế bào/ống 50 ul 50 ul 50 ul Sau đó, ếk t quả được phân tích bằng phần mềm FlowJo. 3.3.2.2.4. Chuyển các vector chứa các nhân tố phiên mã cảm ứng tái lập trình vào tế bào CD34+ bằng phương pháp Nucleofector  Nhận vector từ Yamanaka (Nhật Bản) Hai vector pCEB-hUL-G và pECB-hSK-O đã được thử nghiệm lâm sàng trên bệnh thoái hóa điểm vàng do tuổi tác [51], chính vì thế mà nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã liên hệ với Yamanaka để mua 2 vector trên. Hình 3.2: DNA Plasmid dùng để tái lập trình
29 Các thành phần của vector pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O, vai trò và chức năng của chúng được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5: Thành phần của vector tái lập trình pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O Thành phần Mục đích OriP Điểm khởi đầu sao chép Promoter thúc đẩy mức độ biểu hiện gen cao trong các vector biểu CAG hiện WPRE Vector WPRE làm tăng biểu hiện gen từ vector retroviral CoIE1 ori Điểm khởi đầu sao chép có nguồn gốc từ vi khuẩn Ampr Gene kháng kháng sinh Thông qua việc định hướng của cặp loxP cho phép gen được kích loxP hoạt, trao đổi và ức chế các gen khác Đuôi polyA-bảo vệ m RNA khỏi tác dụng của nuclease trong tế bào pA chất Protein liên kết trực tiếp với DNA và có một phần thì bám vào EBNA-1 chuỗi xoắn vòng xoắn của DNA Protein ngón tay kẽm (zinc finger protein) có chức năng như một hGLIS1 chất kích hoạt và ức chế phiên mã hLin28 Yếu tố thúc đẩy tính đa năng Làm cho chất bị nhiễm sắc tạo ra để tạo thành các chỗ cho các hL-MYC protein khác gắn vào hSOX2 Phục hồi chức năng của tế bào, giúp cho tế bào bình thường biểu hiện protein quan trọng cho tính gốc của tế bào, kích thích sự biểu OCT3/4 hiện của chính nó để tạo ra nhiều protein SOX2 và OCT3/4 hơn hKLF4 Kìm hãm sự chết có chương trình a. Biến nạp Có hai phương pháp để biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào khả biến đó là xung điện và shock nhiệt. Xung điện có ưu điểm hơn shock nhiệt là có hiệu suất biến nạp cao, tuy nhiên lại có nhược điểm làm chết nhiều tế bào. Tôi thực hiện quá trình biến nạp plasmid dùng để tái lập trình vào tế bào khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt. - Tế bào khả biến (Competent cell) ( 3 ống) ở tủ -80cho vào khay đá - Plasmid : PGEF (1 µg) vào ống tế bào khả biến (đối chứng) SK- O (3 µg) vào ống tế bào khả biến
30 UL- G (5 µg) vào ống tế bào khả biến - Hỗn hợp được xử lý sốc nhiệt ở 420/45 giây - Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp được đặt ngay vào đá - Bổ sung 400 µg môi trường LB (không có kháng sinh). Hỗn hợp được nuôi ở 370/ lắc 170 vòng/phút trong vòng 1 giờ. - Sử dụng que cấy trải vô trùng trải 200 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB có agar (imMedia TM Amp Liquid for AmpR recombinant E. coli strains). Ủ đĩa peptri ở 370 qua đêm. Sau khi nuôi qua đêm ở 37 oC, thu được khuẩn lạc. Chọn một khuẩn lạc phát triển nhanh nhất để nuôi tăng sinh trong LB lỏng để tách chiết plasmid. b. Tách plasmid Tiến hành tách chiết plasmid dựa trên nguyên lí của việc biến tính bằng kiềm đối với DNA plasmid và DNA nhân và sự hồi tính một cách chọn lọc DNA plasmid sau khi trung hòa dung dịch. Cách tiến hành: Thực hiện theo quy trình tách plasmid bằng bộ kit QiAprepR Spin Miniprep của QIAGEN. - Ly tâm 6000 vòng/5 phút thu cặn tế bào - Bổ sung 250 µl Buffer P1 (Pesuspension buffer : bổ sung RNA A solution và LyseBlue, lắc đều hỗ hợp), vontex đến khi hết cặn khuẩn, chuyển sang ống eppendorf mới. - Bổ sung 300 µl vào mỗi ống eppendorf. - Bổ sung 250 µl Buffer P2 vào mỗi ống, đảo ống 4-5 lần. - Bổ sung 350 µl Buffer N3/ lắc nhẹ - Ly tâm 15.000 vòng/10 phút/ 16 o - Thu dịch nổi cho vào cột - Ly tâm 15.000 vòng/1 phút/ loại dịch đi qua cột - Lấy 2 ống epppendorf còn lại thu dịch nổi, bỏ tiếp lên 2 cột tương ứng - Ly tâm 15.000 vòng/1 phút sau đó loại bỏ dịch đi qua cột
31 - Bổ sung 750 µl Buffer PB. Ly tâm 15.000 vòng/1 phút. Đổ dịch qua cột - Chuyển 2 cột sang 2 eppendorf sạch - Cho 50 µl Elusion Buffer, để nhiệt độ phòng 5 phút - Ly tâm 15.000 vòng/5 phút - Bỏ cột, bổ sung 50 µl Elusion Buffer bảo quản 2 eppendorf chứa mẫu Thực hiện theo quy trình tách plasmid bằng bộ kit QiAprepR Spin Maxiprep của hãng QIAGEN - Ly tâm 6000 G/15 phút thu cặn tế bào - Bổ sung 10 ml Buffer P1 (Pesuspension buffer : bổ sung RNA A solution và LyseBlue, lắc đều hỗ hợp), vontex đến khi hết cặn khuẩn, chuyển sang ống eppendorf mới. - Bổ sung 10 ml Buffer P2, đảo ống 4-5 lần. - Bổ sung 350 µl Buffer P3/ lắc nhẹ. Để ở tủ 4 o /20 phút - Ly tâm 11.000G/30 phút/ 4 o Hút dịch trong - Ly tâm 11.000G/30 phút/4 o. Thu dịch nổi - Cho 10 ml Buffer QBT vào cột để rửa cột - Thu dịch nổi cho vào cột. Bỏ dịch, giữ lại cột - Bổ sung 60 ml Buffer QC. Giữ cột, thay ống mới - Bổ sung 15 ml Buffer QF - Bổ sung 10,5 ml isopropanol. Trộn nhẹ - Ly tâm 11.000 G/30 phút/ loại dịch đi qua cột - Rửa bằng 5 ml cồn 70 o. Ly tâm 11.000G/10 phút - Bổ sung 500 µl Nuclease Free Water và bảo quản mẫu. Phương pháp định tính, định lượng DNA Phương pháp định lượng DNA bằng máy quang phổ. Sử dụng máy đo quang phổ NanoDrop 2000 để kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA sau khi tách chiết ở 2 bước sóng 260 nm và 280 nm. Nguyên lý: Máy kiểm tra độ tinh sạch NanoDrop 2000 hoạt động dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các bazơ purine và
32 pyrimidine. Giá trị mật độ quang phổ ở bước sóng 260 nm của các mẫu đó cho phép xác định nồng độ ADN trong các mẫu dựa vào mối tương quan sau: - Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA trong dung dịch, đo giá trị OD ở bước sóng 280. OD280 là bước sóng ở đó các protein cóứ m c hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 như các phân tử acid nucleic do đó có thể làm sai lệch giá trị nồng độ thật của acid nucleic. - Để đảm bảo chính xác nồng độ CDNA người ta sử dụng giá trị A260/280. Khi giá trị A260/280 =1,8 – 2,0 dịch chiết DNA được coi là tinh sạch [54]. Phương pháp điện di agarose. Phương pháp này dựa vào đặc tính của các nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trường với điện thế và cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Phương pháp điện di được thực hiện phụ thuộc vào kích thước, cấu hình của DNA, loại gel, nồng độ gel và cường độ dòng điện. Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển về phía cực dương nhanh hơn các phân tử có kích thước lớn. Đây cũng chính là cơ sở để có thể sàng lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp so sánh kích thước. Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau: Chuẩn bị gel - Cân 0,5 gam agarose cho vào 50 ml dung dịch TBE 0,5X, đun sôi trong lò vi sóng sao cho agarose tan hoàn toàn. - Để gel nguội đến 60 oC, cho 2,5 µl Redsafe. Đổ hỗn hợp vào khuôn đã cài sẵn lược và đợi cho gel đông lại. - Nhấc lược khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di. - Đổ dung dịch đệm TBE vào bể điện di sao cho ngập bản gel. Tra mẫu điện di - Tỷ lệ tra: Trộn theo tỉ lệ 2,5 µl mẫu, 1,5 µl ladder 1 µl Green Buffer - Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế 135 V trong 30 phút (khi vị trí vạch màu chạy được khoảng 2/3 bản gel).
33 - Kiểm tra gel bằng máy chụp ảnh gel Bio-Rad. c. Phương pháp xung điện Phương pháp xung điện hay còn được gọi là điện biến nạp (electroporation). Phương pháp xung điện là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào. Xung điện theo quy trình Lonza Nucleofector - Chuẩn bị đĩa 6 giếng bằng cách đổ đầy số lượng giếng thích hợp với 1,5 ml môi trường nuôi cấy bổ sung vào đĩa trước khi ủ trong tủ ấm 370/5% CO2. - Đếm tế bào và xác định mật độ tế bào. - Ly tâm ở 200G/10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ phần nổi thu cặn. - Để cặn cẩn thận trong dung dịch Nucleofection. - Cho 100 µl tế bào với 1 µg DNA. - Chuyển tế bào/ DNA vào cuvette. Chạy máy chuyển gen 4D-Nucleofactor. Thêm 500 µl môi trường nuôi cấy vào cuvette một cách nhẹ nhàng sau đó chuyển sang đĩa 6 giếng (đã phủ bề mặt nuôi cấy với cơ chất với tỷ lệ CELLstart 1:50 PBS) 3.3.2.2.5. Cảm ứng tái lập trình bằng cách chuyển đổi từ từ môi trường chuyên biệt Môi trường chuyên biệt: iPS Brew XF 50X Supplement và iPS Brew XF được trộn đều. Bảo quản môi trường ở nhiệt độ 4℃ có thể sử dụng được 2 tuần, - 20℃ có thể sử dụng được trong 1 tháng. 3.3.2.2.6. Thu một phần tế bào để kiểm tra hiệu suất chuyển gen bằng phương pháp Real time PCR 3.3.2.2.6.1 Tách RNA RNeasy Mini là bộ kit tách RNA tổng số trên vi khuẩn có chứa Guanidine isothiocyanate để làm bất hoạt RNase, được sử dụng cho hầu hết các phương pháp
34 ly giải ban đầu khác nhau. Ethanol sau đó được thêm vào lysate để RNA liên kết với màng silica-gel của các cột. Lysate sau đó được thêm vào cột và ly tâm. RNA liên kết với cột được rửa với đệm thứ nhất và hai lần đệm thứ hai, một lần nữa ly tâm loại bỏ dịch nổi. Cuối cùng RNA được rửa bằng cách thêm nước không có Rnase [55]. Phương pháp tách RNA theo bộ kit của QIAGEN - Ly tâm 2000 vòng/ 10 phút thu cặn tế bào. - Pha 1 ml RLT buffer + 10 µl B – mercaptoehanol. Thêm 350 µl hỗn hợp rồi vontex kỹ. - Ly tâm 15.000 vòng/ 3 phút. - Cho 350 µl dung dịch sang ống mới. Bổ sung 350 µl cồn 700. Trộn đều và cho qua cột. - Ly tâm 15.000 vòng/15 giây. - Bỏ dịch dưới cột. Giữ cột. - Thêm 700 µl Buffer RW1. Ly tâm 15.000 vòng/15 giây. Bỏ dịch ở dưới cột. - Bổ sung 500 µl RPE buffer. - Ly tâm 15.000 vòng/2 phút. Bỏ dịch ở dưới cột. - Ly tâm 15.000 vòng/10 giây. Bỏ dịch. - Bổ sung 30 µl RNase – free water. Ly tâm 15.000 vòng/1 phút sau đó đi kiểm tra nồng độ RNA và độ tinh sạch bằng máy đo nồng độ NanoDrop 2000. Mức độ tinh sạch của RNA được xác định bằng giá trị A260/280. Khi giá trị A260/280 =1,8 – 2,1 dịch chiết RNA được coi là tinh sạch [59]. 3.3.2.2.6.2 Phương pháp Realtime quantitive RT-PCR 3.3.2.2.6.2.1 Enzyme phiên mã ngược Giai đoạn phiên mã ngược (reverse transcription – RT) là một giai đoạn hết sức quan trọng quyết định sự thành công của real time PCR. Enzyme được sử dụng trong giai đoạn này là Reverse transcriptase được tách chiết từ Moloney murien leukemia virus (M-MLV) gây bệnh ung thư bạch cầu trên chuột, hay từ Avian myeloblastosis virus (AMV) gây bệnh ung thư tủy trên gia cầm. Enzyme reverse
35 transcriptase là một loại DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA đơn làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA đơn làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (complementary DNA – cDNA), do vậy giai đoạn phiên mã ngược còn được gọi là giai đoạn tổng hợp cDNA. Để enzyme reverse transcriptase có thể tổng hợp được cDNA từ sợi khuôn là mạch đơn RNA, cần phải có mồi đặc hiệu bám lên trên sợi khuôn RNA và cũng cần dNTP để enzyme reverse trancriptase khi trượt lên mạch khuôn RNA có thể kéo dài được mạch cDNA. Các thành phần để kết hợp phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 3.6 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích 50 ng/ µl random hexamers 1 µl 10 mM dNTP mix (10 mM each) 1 µl mRNA Up to 11 µl H20 To 13 µl Các hỗn hợp trên được ủ 650 trong 5 phút, sau đó ỗh n hợp được ủ trên đá 1 phút. Các thành phần tổng hợp cDNA được trình bày tại bảng 3.7. Bảng 3.7: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA Thành phần Thể tích 5X SSIV Buffer 4 µl 100 mM DTT 1 µl Ribonuclease Inhibitor 1 µl SuperScript™ IV Reverse Transcriptase (200 U/ µl) 1 µl Thành phần kết hợp phản ứng PCR (bảng 3.6) và các thành phần tổng hợp cDNA (bảng 3.7) được trộn đều và cài chu trình nhiệt PCR cDNA như hình 3.3 và chạy máy PCR Proflex 3 block.
36 Hình 3.3: Chu trình nhiệt PCR cDNA Sản phẩm cDNA được dùng để thực hiện phản ứng Real time PCR. 3.3.2.2.6.2.2. Real time PCR sử dụng SYBR Green phát hiện và định lượng tế bào chuyển gen. Real-time PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction – PCR), nhằm khuếch đại và cùng lúc định lượng được số lượng của phân tử DNA mong muốn. Áp dụng kỹ thuật Real time PCR người dùng không cần thiết phải thực hiện thao tác điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để xác định sản phẩm sau khuếch đại. Kỹ thuật Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận hoặc nghịch với số đoạn DNA tạo thành. SYBR Green là nguyên nhân phát huỳnh quang, có thể liên kết với mạch đôi DNA và phát huỳnh quang với cường độ mạnh mẽ hơn dạng tự do trong dung dịch. Do đó, quá trình nhân bản DNA thể hiện trực tiếp trên máy luân nhiệt qua từng chu kỳ. Tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ tỉ lệ với lượng sản phẩm tạo thành qua mỗi chu kỳ đó [57].
37 Ct (cycle threshold) được định nghĩa là số chu kỳ cần thiết để tín hiệu huỳnh quang vượt qua ngưỡng (tức là vượt quá mức nền). Các mức độ Ct tỷ lệ nghịch với lượng axit nucleic mục tiêu trong mẫu (tức là mức độ Ct càng thấp thì lượng axit nucleic mục tiêu trong mẫu càng lớn) [60]. Các trình tự mồi được sử dụng được trình bày dưới bảng 3.8. Bảng 3.8: Trình tự mồi sử dụng trong thí nghiệm STT Tên mồi Trình tự mồi hSOX2-S875-F 5’-TTCACATGTCCCAGCACTACCAGA-3’ Cặp mồi 1 hKLF4-82-R 5’-CTTGACGCAGTGTCTTCTCCCT-3’ hMYCL1-S861-F 5’-CTTCCTGGAGCGCAAGA-3’ Cặp mồi 2 hLIN28-AS150-R 5’-GCGCACGTTGAACCACTTAC-3’ Thành phần phản ứng với thể tích như bảng 3.9. Bảng 3.9. Thành phần phản ứng Real time PCR 2X SYBR Green Master Mix 10 µl Mồi 3 µl Nước 5 µl cDNA 2 µl Chu trình nhiệt chạy Real-time PCR được trình bày dưới hình 3.3. Hình 3.4: Chu trình nhiệt cài đặt cho máy Real-time PCR
38 Xử lí số liệu Realtime: Phương pháp 2-ΔΔCt của Livak [33]: Phương pháp này có thể dùng để nghiên cứu biểu hiện một gene trong mẫu cấy tế bào ung thư, so với mẫu cấy tế bào bình thường, hay cũng có thể nghiên cứu biểu hiện một gene nào đó trên cấy tế bào có thử chất gây ung thư X so với cấy tế bào không thử X. Trong phương pháp này, người làm thí nghiệm sẽ định lượng không chỉ gene cần nghiên cứu (Target = Tg) mà cả một gene tham chiếu (reference = Ref) tức là gene mà các nghiên cứu trước đó đã xác định là có biểu hiện như nhau giữa hai mẫu tế bào (Ví dụ: tế bào ung thư hay có thử chất X, gọi là mẫu T. Đối chứng: tế bào không ung thư hay không thử chất X, gọi là mẫu C). Như vậy ứng với mẫu T và mẫu C sẽ có các kết quả định lượng cho cả gene Tg và gene Ref qua các thông số: Ct(T/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gene đích (Tg) trong mẫu thử (T), Ct(T/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gene tham chiếu (Ref) trong mẫu thử (T), Ct(C/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gene đích (Tg) trong mẫu chứng (C), Ct(C/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gene tham chiếu (Ref) trong mẫu chứng (C). Dựa trên các thông số này, chúng ta sẽ thường hóa (normalized) chu kỳ ngưỡng của gene đích trên mẫu thử (T) và mẫu chứng (C) bằng cách tính hiệu số chênh lệch Ct của gene đích với gene tham chiểu trên các mẫu: Mẫu thử: ΔCt(T) = Ct(T/Tg) - Ct(T/Ref) Mẫu đối chứng: ΔCt(C) = Ct(C/Tg) - Ct(C/Ref) Sau đó ẽs thường hóa ΔCt mẫu thử bằng hiệu số chênh lệch ΔCt(T) với ΔCt ΔΔCt = ΔCt (T) - ΔCt (C) Từ đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của gene đích trên mẫu thử so với mẫu chứng nội, nếu hiệu quả PCR của cả hai đều đạt 100%, là R = 2-ΔΔCt Sau đó ẽv biểu đồ và đánh giá.
39 Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Kết quả tách chiết plasmid bằng KIT Qiagen Miniprep Để có thể sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen tái lập trình, DNA plasmid cần đạt yêu cầu theo cả hai tiêu chí về nồng độ (>400 ng/µl) và độ tinh sạch (A260/280 trong khoảng 1.8-2). Hai plasmid SK-O và UL-G được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5훼 , chọn lọc dòng, nuôi tăng sinh và tách chiết bằng KIT Miniprep của hãng QIAGEN. Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của hai vector bằng phương pháp quang phổ được trình bày tại bảng 4.1. Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA plasmid OD SK-O UL-G A260/280 1.85 1.81 Conc (ng/µl) 243 370 Kết quả cho thấy nồng độ DNA đạt được ở mức 243 ng/µl và 370 ng/µl còn thấp hơn so với mức tối ưu được khuyến nghị là 400 ng/µl. Về mức độ tinh sạch, giá trị A260/280 nằm ở trong khoảng chấp nhận được. Tiếp theo, DNA plasmid được kiểm tra mức độ nguyên vẹn bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Kết quả được trình bày ở hình 4.1. Hình 4.1: Kết quả tách chiết DNA plasmid sử dụng KIT Qiagen Miniprep
40 Kết quả trên hình 4.1 cho thấy 2 plasmid SK-O (đường chạy 2) và UL-G (đường chạy 3) thu được đều chứa mạch vòng (vạch trên) và siêu soắn (vạch dưới). Tuy nhiên, DNA plasmid bị đứt gãy thể hiện ở các vệt (smear). Nguyên nhân DNA plasmid bị đứt gãy có thể do thao tác chưa đúng kỹ thuật và KIT miniprep chưa phù hợp để sử dụng cho mục đích thu lượng lớn DNA. Do đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm tách chiết plasmid lần 2 sử dụng bộ KIT Qiagen Maxiprep với mục tiêu thu được DNA plasmid có nồng độ cao hơn và ít bị đứt gãy. 4.2. Kết quả tách chiết DNA plasmid bằng KIT Qiagen Maxiprep Thí nghiệm được tiến hành thí nghiệm theo tài liệu hướng dẫn của KIT Qiagen Maxiprep. Nồng độ và độ tinh sạch của hai vector được kiểm tra trên máy NanoDrop 2000 và được trình bày tại bảng 4.2. Bảng 4.2: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid maxi OD SK-O UL-G A260/280 1.9 1.91 Conc (ng/µl) 450,6 419.1 Kết quả cho thấy nồng độ DNA đạt được ở mức 450,6 ng/µl và 419,1 ng/µl đã đạt mức tối ưu được khuyến nghị là 400 ng/µl. Về mức độ tinh sạch, giá trị A260/280 nằm ở trong khoảng chấp nhận được. Tiếp theo, DNA plasmid được kiểm tra mức độ nguyên vẹn bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Kết quả được trình bày ở hình 4.2. Hình 4.2: Kết quả tách chiết DNA plasmid sử dụng KIT Qiagen Maxiprep
41 Kết quả trên hình 4.2 cho thấy 2 plasmid SK-O (đường chạy 2), UL-G (đường chạy 3) thu được đều chứa 2 dạng là mạch vòng (vạch trên) và siêu xoắn (vạch dưới) và không lẫn DNA hệ gen. Như vậy, chúng tôi đã thu được DNA plasmid đạt yêu cầu cả về số lượng và chất lượng để sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen tái lập trình. 4.3 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 1 Để thực hiện chuyển vector tái lập trình thì cần có 106 tế bào CD34+ (tế bào gốc tạo máu). Tế bào gốc tạo máu được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec và được nuôi tăng sinh 6 ngày để tế bào phục hồi sau rã đông và đạt được số lượng tế bào cần thiết cho chuyển gen. Hình 4.3: Tế bào CD34+ sau khi rã đông Ở ngày 0 (hình 4.3) tế bào sau khi rã đông và cho vào môi trường nuôi tăng sinh thì tất cả tế bào quan sát được đều có hình dạng tròn, sáng, là các đặc điểm điển hình của tế bào gốc tạo máu trong điều kiện nuôi cấy huyền phù, mật độ 5-10% trôi nổi trong môi trường.
42 Hình 4.4: Tế bào CD34+ sau 6 ngày nuôi tăng sinh Sau 6 ngày nuôi cấy (hình 4.4) và 1 lần thay môi trường ở ngày thứ 3, mật độ tế bào đạt được thuộc khoảng 80% bề mặt đĩa nuôi cấy. Tổng số tế bào đạt được là 1,78 x 106 tế bào. Trong tổng số lượng tế bào khoảng 1 triệu tế bào được đông lạnh trong dung dịch đông lạnh chứa 10% DMSO (dimethylsulfoxide) và BSA (Bovine serum albumin). 5 x 105 tế bào trong tất cả số tế bào còn lại được sử dụng để nuôi cấy tiếp trong đĩa 6 giếng, nuôi cấy trong 3 ngày để đạt số lượng tế bào để điện biến nạp. Khoảng 3 x 105 tế bào còn lại cuối cùng được sử dụng để xác định phần trăm tế bào gốc tạo máu biểu hiện CD34 trên bề mặt, sử dụng kỹ thuật phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry). Tuy nhiên do làm thiếu bước phần bù tín hiệu trên máy Flow cytometry nên đã không có kết quả cho đợt kiểm lượng tế bào CD34+ trên bề mặt quần thể tế bào gốc tạo máu. Do đó, chúng tôi tiến hành nuôi tăng sinh tế bào CD34+ lần 2 với mong muốn kiểm tra lượng tế bào có chất lượng tế bào tốt hơn và phân tích tỷ lệ tế bào
43 CD34+ trong quần thể tế bào tăng sinh bằng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry). 4.4 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 2 Hình 4.5: Tế bào CD34+ sau 2 ngày nuôi tăng sinh Ở hình 4.5, chúng ta có thể thấy tế bào sau khi rã đông và cho vào môi trường nuôi tăng sinh thì sau 2 ngày, tất cả tế bào quan sát được đều có hình dạng tròn, sáng, là các đặc điểm điển hình của tế bào gốc tạo máu trong điều kiện nuôi cấy huyền phù, mật độ tế bào đạt khoảng 10-20% bề mặt đĩa nuôi cấy. Hình 4.6: Tế bào CD34+ sau 5 ngày nuôi tăng sinh
44 Sau 5 ngày nuôi cấy (hình 4.6) và 1 lần thay môi trường ở ngày thứ 3, mật độ tế bào bao phủ khoảng 80% bề mặt đĩa nuôi cấy. Kết quả đếm số lượng tế bào cho thấy tổng số lượng tế bào đạt được là 1,57 x 106 tế bào. Trong đó, khoảng 1 triệu tế bào được trữ đông trong dung dịch đông lạnh chứa 10% DMSO (dimethylsulfoxide) và 7,5 % BSA (Bovine serum albumin). 2,7 x 105 tế bào được sử dụng để nuôi cấy tiếp trong đĩa 6 giếng với thời gian 3 ngày với mục đích đạt số lượng tế bào để điện biến nạp. Khoảng 3 x 105 tế bào cuối cùng được sử dụng để xác định phần trăm tế bào gốc tạo máu biểu hiện CD34 trên bề mặt, sử dụng kỹ thuật phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry) để kiểm tra. Tác dụng của các kháng thể như sau. Kháng nguyên CD34 thuộc họ glycoprotein chuỗi đơn xuyên màng, biểu hiện hầu như tất cả trên các tế bào tiền thân tạo máu bao gồm cả tế bào gốc đa năng. Kháng thể CD45 nhận diện các kháng nguyên CD45 trên bề mặt các tế bào bạch cầu với trọng lượng phân tử 180, 190, 210 và 220 KD. Nó còn được gọi là kháng nguyên bạch cầu chung (leukocyte common antigen – LCA) được biểu hiện trên mọi loại tế bào tạo máu ngoại trừ hồng cầu trưởng thành và các tế bào tiền thân của chúng. Thuốc nhuộm 7AAD là một đồng phân của Actinomycin D có chứa một nhóm amino thay thế ở vị trí 7 của chromophore. Các tế bào chết là nguồn gây nhiễu trong phân tích các tế bào bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy. Các tế bào chết sẽ được đánh giá và phân biệt bằng cách bắt màu nhuộm 7AAD trong khi các tế bào sống thì không. Kết quả chạy Flow cytometry được biểu hiện trên hình 4.7.
45 Hình 4.7. Sự biểu hiện tế bào CD34 trên bề mặt của quần thể tế bào nuôi tăng sinh
46 Theo hình 4.7, trục tung thể hiện mức độ phức tạp của tế bào. Trục hoành là tín hiệu huỳnh quang thu được. Mầu sắc thể hiện mật độ tế bào với mầu đỏ, xanh lá cây và xanh dương lần lượt đại diện cho mật độ cao, trung bình và thấp. Hàng trên cùng là đối chứng chỉ có tế bào CD34. Hàng thứ hai là tế bào CD34 được bổ sung kháng thể CD45 và nhuộm bởi 7AAD. Hàng thứ ba là tế bào CD34 được bổ sung đồng thời hai loại kháng thể CD34, CD45 và nhuộm bởi 7AAD. Đối với hàng trên cùng, cột bên trái là tín hiệu huỳnh quang cho thấy tỉ lệ tế bào sống đạt mức 99,9%. Cột ở giữa là tín hiệu huỳnh quang tương ứng với CD45, do không có kháng thể tương ứng với kháng nguyên CD45 trên bề mặt tế bào nên không thu được tín hiệu. Cột bên phải là tín hiệu huỳnh quang tương ứng với CD34, do không có kháng thể tương ứng với kháng nguyên CD34 trên bề mặt tế bào nên không thu được tín hiệu. Đối với hàng thứ hai, cột bên trái vẫn cho thấy tỉ lệ tế bào sống cao ở mức 97,7%. Cột ở giữa cho thấy khi bổ sung kháng thể CD45 gắn huỳnh quang, kháng thể sẽ bắt cặp với kháng nguyên CD45 trên bề mặt tế bào và phát sáng. Tín hiệu thu được đạt mức cao 99,7% chứng tỏ các thành phần trong thí nghiệm hoạt động tốt. Ở cột bên phải, khoảng 5% tín hiệu thu được ở bước sóng tương ứng với CD34 là tín hiệu giao thoa bởi bước sóng của CD45. Đối với hàng thứ ba, cột bên trái và ở giữa được giải thích tương tự như hàng thứ hai. Ở cột cuối cùng, tín hiệu thu được là do sự bắt cặp của kháng thể và kháng nguyên CD34. Mức độ dương tính với CD34 56,6%. Fukuda và cộng sự đã dùng lượng tế bào CD34+ là 78% để tái lập trình [27]. Tuy nhiên lượng dương tính với CD34 trên 50% nên lượng CD34+ còn lại vẫn có thể sử dụng cho tái lập trình. 4.5. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 1 Có nhiều phương pháp chuyển gen từ episomal vector tuy nhiên chúng tôi sử dụng phương pháp điện biến nạp do chương trình và kit của hãng Lonza đã lập trình sẵn các chương trình để chuyển gen cho tế bào gốc tạo máu.
47 Tế bào CD34+ sau khi nuôi tăng sinh 3 ngày đạt được tổng số tế bào là 0,46 x 106 tế bào. Tổng cộng 1 µg plasmid (500 ng plasmid ULG và 500 ng plasmid SKO) được chuyển vào 106 tế bào bằng phương pháp điện biến nạp sử dụng chương trình Dz-100 của máy 4D-Nucleofector X Unit (Lonza). Tế bào sau chuyển gen nuôi trên đĩa 6 giếng được phủ bởi chất nền ngoại bào thương mại (CELLstart) và nuôi trong điều kiện 37o/5 % CO2. Tế bào 1 ngày sau chuyển gen được biểu hiện ở hình 4.8. Có 2 dạng tế bào điển hình xuất hiện: Hình 4.8: Tế bào sau 1 ngày xung điện i. Dạng thứ nhất quan sát được là những tế bào tròn, sáng chiếm phần lớn số lượng tế bào trong đĩa (mũi tên vàng). Có thể là quần thể tế bào gốc tạo máu ii. Dạng thứ hai quan sát được là những tế bào có hình dạng tương tự như nguyên bào sợi có hình dạng hình thoi thuôn dài (mũi tên đen). Có thể là quần thể các tế bào gốc trung mô có lẫn trong quần thể tế bào ban đầu vì độ tinh sạch của quần thể tế bào trước khi chuyển gen không đạt 100%.
48 Tế bào ngày thứ 2, thứ 3 và thứ 7 sau chuyển gen được thể hiện trên hình 4.9. Hình 4.9: Quần thể tế bào sau 2 ngày chuyển gen (A), sau sau 3 ngày chuyển gen (B) và sau 7 ngày chuyển gen (C) Có thể thấy số lượng tế bào tròn, sáng tăng lên và tạo thành các cụm tế bào, rõ ràng nhất ở ngày 7. Số lượng tế bào hình thoi dài bắt đầu từ ngày thứ 2 sau khi chuyển gen đã xuất hiện rất nhiều và mọc trải đều trên khắp bề mặt giếng nuôi cấy. Điều này cho thấy những tế bào này đã tồn tại sẵn trong quần thể tế bào được chuyển gen và chất nền sử dụng để phủ đĩa là điều kiện thuận lợi để chúng bám và tăng sinh, chúng tôi dự đoán những tế bào này không phải tế bào mong muốn vì trong hình thái tế bào gốc tạo máu không có tế bào thuôn dài mà chỉ có quần thể tế bào tròn, sáng. Tuy nhiên chúng tôi vẫn tách RNA để kiểm tra biểu hiện gene. Do đó, chúng tôi tiếp tục chuyển gen lần thứ 2 với lượng DNA plasmid và lượng tế bào cao hơn để mong muốn đạt được chất lượng tế bào tốt hơn. 4.6. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 2 106 tế bào được chuyển gen lần 2 với 2 µg plasmid (1 µg plasmid chứa các yếu tố phiên mã ULG và 1 µg plasmid chứa các yếu tố phiên mã SKO) bằng phương pháp điện biến nạp sử dụng chương trình Dz-100 của máy 4D-Nucleofector X Unit (Lonza). Tế bào sau chuyển gen nuôi trên 3 giếng của đĩa 6 giếng (3,3 x 105 tế bào/giếng) được phủ bởi chất nền ngoại bào thương mại (CELLstart) và nuôi trong điều kiện 37℃/5 % CO2.
49 Hình 4.10: Tế bào sau 1 ngày xung điện Hình ảnh chụp tế bào bằng kính hiển vi quang học 1 ngày sau chuyển gen được trình bày ở hình 4.10. Phần lớn tế bào quan sát được trong đĩa vẫn là những tế bào tròn, sáng điển hình của tế bào gốc tạo máu. Dạng thứ hai quan sát được là những tế bào chết có hình tròn, màu đen và là kết quả được dự đoán trước do sử dụng xung điện với cường độ cao. Tỉ lệ tế bào chết được xác định bằng cách đếm với thuốc nhuộm Trypan blue và cho thấy chúng chiếm khoảng 20% so với tổng số tế bào. Tế bào ngày thứ 4, thứ 5 và ngày 8 sau chuyển gen được thể hiện trên hình 4.11. Hình 4.11: Quần thể tế bào sau 4 ngày chuyển gen (A), sau 5 ngày chuyển gen (B), sau 8 ngày chuyển gen (C).
50 Có thể thấy số lượng tế bào tròn, sáng vẫn chiếm ưu thế sau 4 ngày chuyển gen (Hình 4.11 A). Tuy nhiên, đến ngày thứ 5 (hình 4.11 B), ta có thể thấy bắt đầu xuất hiện các tế bào bám xuống bề mặt đĩa nuôi cấy (mũi tên vàng). Những tế bào bám bắt đầu có hình dạng giống với tế bào biểu mô và mọc thành cụm vào ngày 8 (hình 4.11 C). Nhóm nghiên cứu hi vọng sau 2 tuần, các khuẩn lạc tiền thân iPSC sẽ hình thành và phát triển dần thành các khuẩn lạc giống kiểu hình của iPSC và sẽ được đánh giá bằng các phương pháp kiểm định phù hợp. 4.7. Kết quả kiểm tra biểu hiện gen 7 ngày sau chuyển gen, toàn bộ tế bào trong 1 giếng được sử dụng để tách chiết RNA phục vụ cho phản ứng Real-time PCR để kiểm tra biểu hiện của các gen chuyển. RNA từ các tế bào gốc tạo máu không được chuyển gen cũng được tách chiết để làm nhóm đối chứng. Kết quả tách chiết RNA được trình bày tại bảng 4.3. Bảng 4.3: Kết quả đo OD sau mỗi lần tách RNA Tế bào nuôi Tế bào sau 7 ngày Tế bào sau 7 ngày Nồng độ và chất tăng sinh 6 chuyển gen lần thứ chuyển gen lần lượng RNA ngày nhất (1 µl) thứ hai (2 µl) Conc (ng/µl) 35,1 17,9 12,2 A260/280 1,95 2,13 1,85 Từ kết quả trên cho thấy, mẫu tách được có độ tinh sạch nằm trong khoảng 1.8-2.1, riêng tế bào sau 7 ngày chuyển gen (1 µl) A260/280 đạt 2,13 vượt qua khoảng 1.8-2.1, tuy nhiên độ chênh lệch không đáng kể nên vẫn có thể tiến hành phản ứng Real time PCR. 135ng RNA từ mẫu tế bào đối chứng và mẫu tế bào chuyển gen được sử dụng để tổng hợp cDNA. 2 µl cDNA trong tổng số 20 µl trong phản ứng từ mỗi mẫu được sử dụng trong mỗi phản ứng Real time PCR. Kết quả Realtime PCR cho thấy: - Đối chứng âm (thay bằng nước) thì phản ứng khuếch đại không hề xảy ra (không thể xác định giá trị Ct). Kết quả này chứng tỏ rằng thao tác chuẩn bị phản ứng không bị nhiễm chéo giữa các mẫu và các cặp mồi không hề tạo sản phẩm thứ cấp.
51 - Điểm khác biệt trong thí nghiệm này là thay vì mỗi gen 1 cặp mồi xuôi và mồi ngược thì chúng tôi sử dụng cặp mồi xuôi của SOX2 và mồi ngược của KLF4 để bắt vào hai đầu của đoạn gen mã hóa cho SOX2-KLF4 trên vector SK-O và tương tự cho cặp mồi L-MYC-LIN28 trên vector UL-G để tiết kiệm chi phí và thời gian làm thí nghiệm. Mức độ biểu hiện của gen GapDH được kiểm tra. Sự khác biệt trong mức độ biểu hiện của 2 cặp gen SOX2-KLF4 và L-MYC-LIN28 trong tế bào được chuyển gen so với các tế bào đối chứng được tính toán theo công thức của Livak và trình bày trên sơ đồ hình 4.12. Hình 4.12: (A)Biểu hiện của các gen SOX2-KLF4, LMYC- LIN28 (B) Cấu trúc vector pCEB-hSK-O và pCEB-hUL-G Kết quả trên cho thấy, trục tung biểu hiện số lần thay đổi sau chuyển gen (định mức theo gen chứng nội GapDH - gen có biểu hiện đồng đều giữa tất cả các tế bào ngay cả những điều kiện thí nghiệm khác nhau). Trục hoành là biểu hiện của gen
52 SOX2-KLF4 và LMYC-LIN28 sau 2 lần chuyển gen với lượng chuyển gen lần lượt là 1 µg plasmid (màu đỏ) và 2 µg plasmid (màu xanh). Biểu hiện của các gen tái lập trình tăng rất nhiều so với các tế bào không chuyển gen (control). Cụ thể, biểu hiện của chuyển gen với 1 µg plasmid và 106 tế bào CD34+ của cặp gen SOX2-KLF4 tăng khoảng 30957 lần và cặp gen L-MYC-LIN28 tăng khoảng 5841 lần, biểu hiện của chuyển gen với 2 µg plasmid và 106 tế bào CD34+của cặp gen SOX2-KLF4 tăng khoảng 26000 lần và cặp gen L-MYC-LIN28 tăng khoảng 2900 lần. Như vậy có thể kết luận rằng chúng tôi đã chuyển thành công vector tái lập trình vào tế bào CD34+ bằng phương pháp xung điện.
53 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Đã biểu hiện thành công các gen SOX2-KLF4 và L-MYC-LIN28 trên tế bào gốc tạo máu của người. 5.2. Kiến nghị - Sử dụng nguồn tế bào CD34+ có độ tinh sạch cao hơn để việc tái lập trình có hiệu suất cao và dễ dàng tạo thành khuẩn lạc iPSC. - Kiểm tra biểu hiện của 2 gen GLIS1 và OCT4. - Sử dụng tế bào máu ngoại vi để tái lập trình do máu ngoại vi gây xâm lấn không đáng kể. - Tiếp tục nuôi cấy để chờ khuẩn lạc iPSC để có thể biệt hóa thành các loại tế bào khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Phan Kim Ngọc (2008), Công nghệ tế bào gốc, Nxb Giáo Dục Việt Nam. Tiếng anh 2. A. A. Mack, S. Kroboth, D. Rajesh, and W. B. Wang (2011), “Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from CD34+ Cells across Blood Drawn from Multiple Donors with Non-Integrating Episomal Vectors,” PLoS One, vol. 6, no. 11, p. 27956. 3. A. E. Omole and A. O. J. Fakoya (2018), “Ten years of progress and promise of induced pluripotent stem cells: historical origins, characteristics, mechanisms, limitations, and potential applications.,” PeerJ, vol. 6, p. e4370. 4. A. Kamath, S. Ternes, S. McGowan, A. English, R. Mallampalli, and A. B. Moy (2017), “Efficient method to create integration-free, virus-free, Myc and Lin28-free human induced pluripotent stem cells from adherent cells.,” Futur. Sci. OA, vol. 3, no. 3, p. FSO211. 5. D. Maetzel et al. (2014), “Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells.,” Stem cell reports, vol. 2, no. 6, pp. 866–80. 6. D. Zeineddine, A. A. Hammoud, M. Mortada, and H. Boeuf (2014), “The Oct4 protein: more than a magic stemness marker.,” Am. J. Stem Cells, vol. 3, no. 2, pp. 74–82. 7. D. W. Scoville, H. S. Kang, and A. M. Jetten (2017), “GLIS1-3: emerging roles in reprogramming, stem and progenitor cell differentiation and maintenance,” Stem Cell Investig., vol. 4, no. 9, pp. 80–80. 8. G. Huang, S. Ye, X. Zhou, D. Liu, and Q.-L. Ying (2015), “Molecular
basis of embryonic stem cell self-renewal: from signaling pathways to pluripotency network.,” Cell. Mol. Life Sci., vol. 72, no. 9, pp. 1741–57. 9. F. González, S. Boué, and J. C. Izpisúa Belmonte (2011), “Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming à la carte.,” Nat. Rev. Genet., vol. 12, no. 4, pp. 231–42. 10. G. Lee et al. (2012), “Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression,” Nat. Biotechnol., vol. 30, no. 12, pp. 1244–1248. 11.G. Nakanishi, Y.-S. Kim, T. Nakajima, and A. M. Jetten (2006), “Regulatory role for Krüppel-like zinc-finger protein Gli-similar 1 (Glis1) in PMA-treated and psoriatic epidermis.,” J. Invest. Dermatol., vol. 126, no. 1, pp. 49–60. 12. I.-H. Park et al. (2008), “Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors,” Nature, vol. 451, no. 7175, pp. 141– 146. 13. I. Heo, C. Joo, J. Cho, M. Ha, J. Han, and V. N. Kim (2008), “Lin28 mediates the terminal uridylation of let-7 precursor MicroRNA.,” Mol. Cell, vol. 32, no. 2, pp. 276–84. 14. H. Vangapandu and W. Ai (2009), “Kruppel like factor 4 (KLF4): a transcription factor with diverse context-dependent functions,”. 15 H. Kanemura et al. (2014), “Tumorigenicity Studies of Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration,” PLoS One, vol. 9, no. 1, p. e85336. 16 H. Niwa, J. Miyazaki, and A. G. Smith (2000), “Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells,” Nat. Genet., vol. 24, no. 4, pp. 372–376.
17. H. F. Gu, A. Alvarsson, S. Efendic, and K. Brismar (2009), “SOX2 has gender-specific genetic effects on diabetic nephropathy in samples from patients with type 1 diabetes mellitus in the GoKinD study.,” Gend. Med., vol. 6, no. 4, pp. 555–64. 18. J. A. Thomson et al. (1998), “Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.,” Science, vol. 282, no. 5391, pp. 1145–7. 19. J. B. GURDON (1962), “The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles.,” J. Embryol. Exp. Morphol., vol. 10, pp. 622–40. 20. J. Balzeau, M. R. Menezes, and C. S. Hagan (2017), “The LIN28/let-7 Pathway in Cancer,” Cancer. Front. Genet, vol. 8, p. 31. 21. J. Chappell and S. Dalton (2013), “Roles for MYC in the Establishment and Maintenance of Pluripotency,” Cold Spring Harb. Perspect. Med., vol. 3, no. 12, pp. a014381–a014381. 22. J. Hanna et al. (2009), “Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration,” Nature, vol. 462, no. 7273, pp. 595–601. 23. J. Jin (2017), “Stem Cell Treatments,” JAMA, vol. 317, no. 3, p. 330. 24. J. Nichols et al. (1998), “Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.,” Cell, vol. 95, no. 3, pp. 379–91. 25. J. Tsialikas and J. Romer-Seibert (2015), “LIN28: roles and regulation in development and beyond,”. 26. J. Rathjen and P. D. Rathjen (2002), “Formation of Neural Precursor Cell Populations by Differentiation of Embryonic Stem Cells In Vitro,” Sci. World J., vol. 2, pp. 690–700. 27. J. Fukuda, T. Kaneko, M. Egashira, and K. Oshimi (1998), “Direct measurement of CD34+ blood stem cell absolute counts by flow
cytometry.,” Stem Cells, vol. 16, no. 4, pp. 294–300. 28. J. Yu et al. (2007) “Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells,” Science (80-. )., vol. 318, no. 5858, pp. 1917– 1920. 29. K. D. Rainsford and M. W. Whitehouse (1976), “Gastric mucus effusion elicited by oral copper compounds: potential anti-ulcer activity.,” Experientia, vol. 32, no. 9, pp. 1172–3. 30. K. Takahashi et al. (2007), “Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors,” Cell, vol. 131, no. 5, pp. 861–872. 31. K. Takahashi and S. Yamanaka (2006), “Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors,” Cell, vol. 126, no. 4, pp. 663–676. 32. K. Takahashi et al. (2007), “Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors,” Cell, vol. 131, no. 5, pp. 861–872. 33. K. J. Livak and T. D. Schmittgen (2001), “Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2 C T Method,” METHODS, vol. 25, pp. 402–408. 34. K. Van Craenenbroeck, P. Vanhoenacker, and G. Haegeman (2000), “Episomal vectors for gene expression in mammalian cells,” Eur. J. Biochem., vol. 267, no. 18, pp. 5665–5678. 35. M. L. Lan et al. (2012), “Characterizing the Radioresponse of Pluripotent and Multipotent Human Stem Cells,” PLoS One, vol. 7, no. 12, p. e50048. 36. M. Scudellari (2016), “How iPS cells changed the world,” Nature, vol. 534, no. 7607, pp. 310–312. 37. M. Arya, I. S. Shergill, M. Williamson, L. Gommersall, N. Arya, and H.
R. Patel (2005), “Basic principles of real-time quantitative PCR,” Expert Rev. Mol. Diagn., vol. 5, no. 2, pp. 209–219. 38. M. Stevanovic, O. Zuffardi, J. Collignon, R. Lovell-Badge, and P. Goodfellow (1994), “The cDNA sequence and chromosomal location of the human SOX2 gene.,” Mamm. Genome, vol. 5, no. 10, pp. 640–2. 39. M. Maekawa and S. Yamanaka (2011), “Glis1, a unique pro- reprogramming factor, may facilitate clinical applications of iPSC technology,” Cell Cycle, vol. 10, no. 21, pp. 3613–3614. 40. N. Desai, P. Rambhia, and A. Gishto (2015), “Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems,” Reprod. Biol. Endocrinol., vol. 13, no. 1, p. 9. 41. L. Carabet, P. Rennie, and A. Cherkasov (2018), “Therapeutic Inhibition of Myc in Cancer. Structural Bases and Computer-Aided Drug Discovery” 42. N. Yoshioka et al. (2013), “Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA,” Cell Stem Cell, vol. 13, no. 2, pp. 246– 254. 43. P. Reinhardt et al. (2013), “Genetic correction of a LRRK2 mutation in human iPSCs links parkinsonian neurodegeneration to ERK-dependent changes in gene expression.,” Cell Stem Cell, vol. 12, no. 3, pp. 354–67. 44. R. A. Young (2011), “Control of the Embryonic Stem Cell State,” Cell, vol. 144, no. 6, pp. 940–954. 2011. 45. S. Yamanaka (2009), “A fresh look at iPS cells.,” Cell, vol. 137, no. 1, pp. 13–7. 46. S. Fernandes, S. Tembe, P. Shinde, S. Melinkeri, V. Kale, and L. Limaye (2018), “Establishment of human iPSC line NCCSi003-A from CD34 + cells of peripheral blood collected during apheresis of healthy donor from
Indian ethnicity,” Stem Cell Res., vol. 27, pp. 1–4. 47. T. M. Schlaeger et al. (2015), “A comparison of non-integrating reprogramming methods,” Nat. Biotechnol., vol. 33, no. 1, pp. 58–63. 48. V. K. Singh, M. Kalsan, N. Kumar, A. Saini, and R. Chandra (2015), “Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery,” Front. Cell Dev. Biol., vol. 3, p. 2. 49. X. Meng et al. (2012), “Efficient reprogramming of human cord blood CD34+ cells into induced pluripotent stem cells with OCT4 and SOX2 alone.,” Mol. Ther., vol. 20, no. 2, pp. 408–16. 50. Y. I. Yeom et al. (1996), “Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells.,” Development, vol. 122, no. 3, pp. 881–94, Mar. 51. Y. Mu, M. Zhao, and G. Su (2014), “Stem cell-based therapies for age- related macular degeneration: current status and prospects.,” Int. J. Clin. Exp. Med., vol. 7, no. 11, pp. 3843–52. 52. Z. Ye et al. (2009), “Human-induced pluripotent stem cells from blood cells of healthy donors and patients with acquired blood disorders.,” Blood, vol. 114, no. 27, pp. 5473–80. Trang web 53. therapy-trial-for-spinal-cord-injury-65484. 54. look-back/. 55. lp.html 56. cytometry-facs-analysis/. [Accessed: 18-Apr-2019].
57. purification-analysis/genomic-dna 58. RNeasy-Mini-Kit/. [Accessed: 24-Apr-2019]. 59. support/rna-isolation/general-articles/the-basics-rna-isolation.html 60. [Accessed: 30-May-2019].