Đồ án Nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen và xác định hoạt tính kháng oxy hóa

106 trang thiennha21 12/04/2022 5620

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen và xác định hoạt tính kháng oxy hóa", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_thu_nhan_anthocyanin_tu_phe_lieu_gao_den_va.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen và xác định hoạt tính kháng oxy hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN ANTHOCYANIN TỪ PHẾ LIỆU GẠO ĐEN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN LỆ HÀ Sinh viên thực hiện : LÊ TRÍ KIỂNG MSSV: 1151110478 Lớp: 11DSH05 TP. Hồ Chí Minh, 2015
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Là sinh viên năm năm cuối của Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh, nay được vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học của mình. Tôi cam đoan đây là nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghê Sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. Những số liệu trong bài hoàn toàn trung thực chưa từng có ai công bố. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Lê Trí Kiểng
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuôi dạy con thành người và là người thầy đầu đời của con. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất của con, là người giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống. Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, cùng toàn thể Thầy Cô Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báo về cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ ngày em bước chân vào giảng đường đại học. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS.Nguyễn Lệ Hà, người thầy đáng kính, đã luôn tận tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm của đồ án. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH05 đã luôn khích lệ, động viên và giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trường và trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 SVTH: Lê Trí Kiểng
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ___ v DANH MỤC CÁC BẢNG ___vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH ___ vii MỞ ĐẦU ___ 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ___ 7 1.1 Gạo đen. ___ 7 1.1.1 Khái niệm ___ 7 1.1.2 Thành phần hóa học ___ 7 1.2 Anthocyanin. ___ 8 1.2.1 Giới thiệu chung ___ 8 1.2.2 Cấu trúc phân tử ___ 8 1.2.3 Tính chất, đặc điểm. ___ 12 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của anthocyanin. ___ 13 1.2.4.1 Cấu trúc ___ 13 a) Cấu trúc chuyển hóa trong môi trường lỏng. ___ 13 b) Cấu trúc hóa học ___ 15 1.2.4.2 pH ___ 17 1.2.4.3 Nhiệt độ. ___ 18 1.2.4.4 Oxy. ___ 19 1.2.4.5 Enzyme ___ 20 1.2.4.6 Ánh sáng. ___ 21 1.2.4.7 Đường và các sản phẩm biến tính của chúng ___ 21 1.2.4.8 Các ion kim loại. ___ 22 i
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.9 Sulfurdioxide (SO2) ___ 23 1.2.4.10 Acid ascorbic ___ 24 1.2.5 Sự phân bố của anthocyanin. ___ 25 1.2.6 Các anthocyanin đã được thương mại hóa ___ 27 1.2.7 Ứng dụng của anthocyanin. ___ 27 1.3 Các thành tựu đạt được. ___ 28 1.3.1 Phương pháp tách chiết anthocyanin___ 28 1.3.2 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ quả dâu Hội An ___ 28 1.3.3 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím. ___ 29 1.3.4 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ gạo đen. ___ 30 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. ___ 31 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ___ 31 2.1.1 Thời gian. ___ 31 2.1.2 Địa điểm. ___ 31 2.2 Nguyên liệu– thiết bị - hoá chất. ___ 31 2.2.1 Nguồn gạo đen. ___ 31 2.2.2 Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ___ 31 2.2.3 Một số dụng cụ và thiết bị chủ yếu dùng trong nghiên cứu___ 32 2.2.3.1 Dụng cụ.___ 32 2.2.3.2 Thiết bị. ___ 32 2.3 Phương pháp nghiên cứu. ___ 33 2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu. ___ 34 2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo đen ___ 34 ii
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen. ___ 35 2.3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen. ___ 37 2.3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen. ___ 39 2.3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen. 41 2.3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen. _ 43 2.3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin. ___ 45 2.3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc. ___ 46 2.4 Các phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu ___ 47 2.5 Các phương pháp thống kê và xử lý số liệu ___ 47 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ___ 48 3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu. ___ 48 3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo đen ___ 48 3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen. ___ 49 3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen. ___ 50 3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen. ___ 52 3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen. _ 53 3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen. ___ 55 iii
Đồ án tốt nghiệp 3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin. ___ 56 3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc. ___ 58 KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ ___ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ___ 69 PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CƯU ___ 1 PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM. ___ 11 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl). EtOH (Ethanol) IC50 (Effective concentration of 50%). MeOH (Methanol) v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen. 7 Bảng 1.2. Các nhóm anthocyanin hiện có trong tự nhiên. 10 Bảng 1.3. Một số anthocyanin phổ biến. 11 Bảng 1.4. Bảng các anthocyanin có nguồn gốc thực vật 26 Bảng 3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu. 48 Bảng 3.2. So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và anthocyanin. 57 Bảng 3.3. Kết quả khả năng kháng DPPH của anthocyanin theo thời gian cô quay. 61 Bảng 3.4. Đánh giá sơ bộ cảm quan của dịch chiết anthocynin 67 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1. Gạo đen 7 Hình 1.2. Cation Flavylium (R1 và R2 là OH, H hoặc OCH3, R3 là glucosyl hoặc H, R4 là OH hoặc glucosyl) 9 Hình 1.3. Sự đổi màu của anthocyanin ở các pH khác nhau. 12 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước. 14 Hình 1.5. Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7 18 Hình 1.6. Sự biến tính anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol. 20 Hình 1.7. Phản ứng ngưng tụ của A: Cyanidin và furural; B: Cyanidin ketobase và furural 22 Hình 1.8. Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin. 23 Hình 1.9. Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2 tạo thành từ sự oxy hóa Ascorbic acid 24 Hình 1.10. Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và anthocyanin. 25 Hình 1.11. Quy trình tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím. 30 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm 33 Hình 2.2. Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến 34 Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định kích thước nguyên liệu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen 36 Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu 38 Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen 40 Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen 42 Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly anthocyanin từ gạo đen 44 Hình 3.1. Quét quang phổ mẫu anthocyanin từ bước sóng 400-700nm trong dung môi EtOH:0,1N HCl (85:15, v:v). 48 vii
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Ảnh hưởng của kích thước hạt nguyên liệu đến hàm lưởng anthocyanin từ dịch chiết. 49 Hình 3.3. Ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt cho nguyên liệu đến hàm lượng anthocyanin từ dịch chiết. 50 Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi EtOH:HCl 1% đến hàm lượng anthocyanin từ dịch chiết. 52 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng anthocyanin từ dịch chiết. 53 Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến nồng độ anhthocynin trong dịch chiết. 55 Hình 3.7. Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với Log[nồng độ anthocyanin mg/ml]. 56 Hình 3.8. Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với Log[Ascorbic acid, µg/ml]. 57 Hình 3.9. Sự thay đổi nồng độ của anthocyanin trong dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay. 58 Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi anthocyanin trong quá trình cô quay dịch trích ly theo thời gian. 59 Hình 3.11. Sự thay đổi về khối lượng của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay. 59 Hình 3.12. Sự thay đổi về thể tích của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay. 60 Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian cô quay đến khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen. 61 Hình 3.16. Sơ đồ quy trình trích ly anthocyanin từ gạo đen 64 Hình 3.14. Dịch chiết anthocyanin trước cô quay. 67 Hình 3.15. Dịch chiết sau cô đặc 67 viii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài. 1.1 Đặt vấn đề. Chất màu thực phẩm là một trong những phụ gia quan trọng, được sử dụng không chỉ trong chế biến thực phẩm, mà cả trong công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác Nhu cầu về chất màu thực phẩm rất lớn và không ngừng tăng lên trong những năm gần đây. Do nước ta chưa sản xuất được, nên hầu hết các chất màu đều phải nhập từ nước ngoài. Một số trường hợp, chất màu không rõ nguồn gốc hoặc không đạt tiêu chuẩn gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng. Trong đó, chất màu quan trọng và hiện diện ở hầu hết các loài thực vật là anthocyanin. Mà gạo đen được xem là chứa anthocyanin với nồng độ tương đối cao. Đây là nguồn cung cấp màu triển vọng, an toàn và sự tương tác với thực phẩm tạo ra nhiều màu sắc đẹp mắt. 1.2 Lý do chọn đề tài. Sử dụng tấm gạo đen làm nguồn trích ly anthocyanin bởi vì đây là phế liệu giá thành rẻ, dễ bị hư hỏng do phần phôi gạo gãy chứa nhiều chất béo dễ bị oxy hóa. Đây cũng là xu hướng đã và đang được Trung Quốc sử dụng anthocyanin như một chất màu thực phẩm. Hiện nay trong lĩnh vực thực phẩm, người ta sử dụng dịch uống Chlorophyll như một thực phẩm chức năng có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe. Nếu như đề tài chứn mình được hoạt tính chống oxy hóa, để tạo dịch uống anthocyanin. Đây sẽ là tiền đề cho dịch màu các thực phẩm khác nhau. Những đặc tính quý báu của anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được, đã mở ra một hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong 1
Đồ án tốt nghiệp đời sống hằng ngày, đặc biệt trong công nghệ chế biên thực phẩm. Điều đó hoàn toàn phù hợp với xu hướng hiện nay của các nước trên thế giới là nghiên cứu khai thác chất màu từ thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn cao cho người sử dụng. Vì thế đề tài nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen và hoạt tính chống oxy hóa có ý nghĩa quan trọng đối với việc phát triển kinh tế và xã hội nước ta. Và đó cũng là lý do nhóm nghiên cứu chọn đề tài này để nghiên cứu. 2. Tình hình nghiên cứu. Trong nước. Huỳnh Thị Kim Cúc và cộng sự, Chiết tách anthocyanin từ quả dâu bằng nước sunfured và một số đặc tính của chúng, tiến hành chiết anthocyanin thô với các dung môi có nồng độ SO2 là 500ppm, 700ppm, 900ppm, 1100ppm và 1500ppm, bổ sung 1% HCl, nhiệt độ 30°C, thời gian chiết 30 phút. Kết quả thu được hàm lượng anthocyanin khi nồng độ SO2 đạt 1100ppm là cao nhất. Nguyễn Thị Lan, Lê Thị Lạc Quyên, nghiên cứu ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ dâu tây Hội An, trường Đại Học Bách Khoa, Đại Học Đà Nẳng. Kết quả chọn được hệ dung môi tốt cho quá trình chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ quả dâu là ethanol - nước - HC1, với tỷ lệ dung môi ethanol - nước là 1:1 (với 1 % HC1) để hàm lượng anthocyanin thu được nhiều nhất. Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến màu anthocyanin từ bắp cải tím ứng dụng làm chất chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học và thực phẩm, tạp chí Khoa Học Đà Nẳng. Kết quả khẳng định màu anthocyanin thay đổi từ đỏ đến xanh khi môi trường thay đổi từ acid sang kiềm. Huỳnh Thị Kim Cúc và các cộng sự, xác định hàm lượng anthocyanin trong một sổ nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai, tiến hành nghiên cứu xác định được hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả thuộc khu vực 2
Đồ án tốt nghiệp miền trung Việt Nam bằng phương pháp pH vi sai. Kết quả cho thấy một số nguyên liệu có hàm lượng anthocyanin tương đối cao như: quả dâu ta 1,188 %; bắp cải tím 0,909%; lá tía tô 0,397%; trà đỏ 0,335%, vỏ nho 0,564%, vỏ cà tím 0,441%. Trên thế giới. Hàng năm theo ước tính tại các nước châu Âu khoảng 10000 tấn vỏ quả nho được trích để thu được khoảng 50 tấn anthocyanin. Các phẩm màu gốc anthocyanin có thể là dung dịch cô đặc hoặc dạng bột có chứa các phụ gia khác. Chất nhuộm màu nói chung và chất nhuộm màu thực phẩm nói riêng đã được người dân các nước trên thế giới sử dụng vào cuộc sống từ thời xa xưa. Một chất màu được dùng cho thực phẩm nhất thiết phải hội đủ ba tiêu chuẩn về mặt y tế của chất phụ gia thực phẩm: + Nhuộm thực phẩm thành màu theo mục đích, phù hợp với công nghệ chế biến thực phẩm. + Không có độc tính (gồm cả độc tính cấp, bán cấp và trường diễn) + Không là nguyên nhân hoặc tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, do yêu cầu riêng của thực phẩm, các chất nhuộm màu dùng trong lĩnh vực này không gây mùi lạ và làm thay đổi chất lượng thực phẩm. Sử dụng các chất màu thực phẩm do có quan hệ trực tiếp đến sức khoẻ và tính mạng con người. Vì vậy ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ đã ban hành luật về sử dụng chất màu trong thực phẩm. Trong các Bộ luật về chất màu thực phẩm, các chất màu có nguồn gốc là sắc tố thực vật (chất màu tự nhiên) được quy định ưu tiên. Tóm lại, hiện nay nghiên cứu chất màu thực phẩm trên thế giới được quan tâm rất lớn ở nhiều quốc gia với nhiều hướng nghiên cứu mới. Trong các hướng nghiên cứu đó, tìm kiếm và chiết tách chất màu từ thực vật vẫn được ưu tiên hàng đầu trong các nghiên cứu. Trong đó bao gồm chất màu anthocyanin (E163) với những đặc tính sinh học quý báu và an toàn cao. (Lưu Đàm Cư, 2005) 3
Đồ án tốt nghiệp 3. Mục đích nghiên cứu. Xác định các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu anthocyanin nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích ứng dụng vào thực phẩm. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu. Để thực hiện mục đích nghiên cứu, nhóm nghiên cứu thực hiện các thí nghiệm như sau: - Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu. - Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ gạo đen. - Xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin. - Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin. - Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin. - Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin. - Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin. - Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin. - Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc. 5. Phương pháp nghiên cứu. - Phương pháp thu thập thông tin: Phương pháp nghiên cứu tài liệu làm cơ sở bố trí thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Endnote để tìm tài liệu. - Thực hành trong phòng thí nghiệm. 4
Đồ án tốt nghiệp - Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê Stagraphics Plus 4.0 - Vẽ đồ thị bằng phần mềm excel 2013, GraphPad Prism. 6. Các kết quả đạt được của đề tài Đã xác định được các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu anthocyanin nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích ứng dụng vào thực phẩm: - Xác định được độ ẩm ban đầu của nguyên liệu là 11,26% ± 0,04. - Xác định được bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ gạo đen là λmax=535nm trong dung môi EtOH:HCl 1N. - Kích thước nguyên liệu là 0,0098 inches cho hiệu quả trích ly anthocyanin với hàm lượng cao nhất. - Nguyên liệu ở điều kiện nhiệt độ phòng cho hiệu quả trích ly anthocyanin với hàm lượng cao nhất. - Xác định được tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin là EtOH:HCl 1% 95:5 (v:v). - Xác định được nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin là 55oC. - Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin là 60 phút. - Xác định được hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin với giá trị IC50 = 636 (µg/ml). - Xác định được các thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc. Thời gian cô quay thích hợp là 15 phút. Nhiệt độ cô quay ở 40- 45oC. Nồng độ anthocyanin trong dịch chiết sau cô quay đạt 19,086 mg/ml. Thể tích dịch sau cô quay còn lại 21,288 % so với thể tích ban đầu (100ml). 5
Đồ án tốt nghiệp 7. Kết cấu của đồ án. Nội dung của báo cáo đồ án tốt nghiệp được sắp xếp theo thứ tự như sau: Nội dung báo cáo gồm có 3 chương : - Chương 1 : Tổng quan - Chương 2 : Vật liệu và phương pháp - Chương 3 : Kết quả, thảo luận 6
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Gạo đen. 1.1.1 Khái niệm Gạo sẫm màu có 2 loại là gạo nếp (nếp cẩm) và gạo lứt huyết rồng. Gạo đen khác với gạo lứt (brown rice) và chứa lượng dưỡng chất lớn hơn. Lớp cám bên ngoài chứa một lượng đáng kể vitamin E, có tác dụng tốt cho hệ thống miễn dịch và bảo vệ các tế bào thoát khỏi sự hủy hoại của gốc tự do. Hơn nữa, theo nghiên cứu của Trung tâm Nông nghiệp Đại học bang Louisiana tại Baton Rouge, gạo đen chứa nhiều chất chống oxy hóa anthocyanin hơn các loại gạo khác. Hình 1.1. Gạo đen 1.1.2 Thành phần hóa học Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen. Thành phần Tỷ lệ % Nước 14 Protein 8,2 Lipid 1,5 Glucid 74,9 Acid hữu cơ 0,6 Tro 0,8 7
Đồ án tốt nghiệp 1.2 Anthocyanin. 1.2.1 Giới thiệu chung Các Anthocyanỉn hiện thuộc nhóm các chất màu tự nhiên tan trong nước lớn nhất trong thế giới thực vật. Hiện diện hầu hết ở các thực vật bậc cao, chủ yếu ở lá, hoa, rễ thân. Thường được tìm thấy ở các tế bào bên ngoài. Thuật ngữ anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó Anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos - nghĩa là hoa và Kysanesos - nghĩa là màu xanh. Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh, anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian. Các anthocyanìn khi mất hết nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon. Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Vì thế lượng anthocyanin lớn hơn anthocyanidin từ 15-20 lần. Chúng được sử dụng làm phụ gia thực phẩm với ký hiệu là E613. Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Anthocyanin hòa tan tốt trong nước và trong dịch bão hòa. Khi kết hợp với đường là cho phân tử anthocyanin hòa tan hơn. ( info.net/uk/colour/anthocyanin.htm). 1.2.2 Cấu trúc phân tử Anthocyanin là những glucoside do gốc đường glucose, glactose kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin). Aglucon của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 1. Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3, 5, 7; thường được gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít. Phân tử anthocyanin gắn vào vị trí 3 gọi là monoglycoside, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycoside. Anthocyanin là những hợp chất glycoside của anthocyanidin hiện có trong thiên nhiên bao gồm các dẫn xuất polyhydro và polymethoxy của 2 - phenylbenzopyrylium hoặc muối flavylium. 8
Đồ án tốt nghiệp Sự khác nhau giữa các anthocyanin được xác định bởi sự khác nhau giữa số lượng và vị trí của nhóm hydroxyl trong phân tử; mức độ methyl hóa của nhóm hydroxyl; bản chất, vị trí của các nhóm đường gắn vào phân tử; bản chất số nhóm acid mạch thắng hay mạch vòng gắn vào phân tử. Hình 1.2. Cation Flavylium (R1 và R2 là OH, H hoặc OCH3, R3 là glucosyl hoặc H, R4 là OH hoặc glucosyl) Các aglucon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3. Các anthocyanin khi bị mất hết các nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycone, mỗi anthocyanindin có thể bị glycosyl hóa và acyl hóa bởi các loại đường và các acid khác nhau tại những vị trí khác nhau nên số lượng anthocyanin lớn hơn 10-20 lần so với số lượng anthocyaninidin Sự glycosyl hóa các anthocyanin có thể xảy ra ở vị trí 7, 3’, 4’, 5’ đối với nhóm hydroxyl. Tuy nhiên, do án ngữ không gian nên sự glycosyl hóa không thể xảy ra ở vị trí 3’ và 4’. Căn cứ vào vị trí và số nhóm đường gắn vào anthocyanidin mà người ta phân loại anthocyanin thành 18 nhóm trong đó có dạng thông dụng nhất là 3-monoside, 3- bioside, 3,5-diglycoside và 3,7-diglycoside. Các loại đường thông thường nhất liên kết với anthocyanidin là glucose, các mono saccharide (rhamnose, galactose, xylose, arabinose), các disaccharide 9
Đồ án tốt nghiệp (rutinose, sabubiose, sophorose, ít thông dụng hơn là lathyrose, gentiobiose hoặc laminariobiose). Ngoài ra, các trisacchride cũng có thể liên kết với anthocyaninidin. Bảng 1.2. Các nhóm anthocyanin hiện có trong tự nhiên. Anthocyanidin R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 main E- colour number Apigeninidin -H - -H -H -OH -H -OH orange OH Aurantinidin -H - -H - -OH - -OH orange OH OH OH Capensinidin - - - - - -H -OH bluish- OCH3 OH OCH3 OH OCH3 red Cyanidin -OH - -H - -OH -H -OH magenta E163a OH OH Delphinidin -OH - -OH - -OH -H -OH purple, E163b OH OH blue Europinidin - - -OH - - -H -OH bluish OCH3 OH OH OCH3 red Hirsutidin - - - - -OH -H - bluish- OCH3 OH OCH3 OH OCH3 red Luteolinidin -OH - -H -H -OH -H -OH orange OH Pelargonidin -H - -H - -OH -H -OH orange, E163d OH OH salmon Malvidin - - - - -OH -H -OH purple E163c OCH3 OH OCH3 OH Peonidin - - -H - -OH -H -OH magenta E163e OCH3 OH OH Petunidin -OH - - - -OH -H -OH purple E163f OH OCH3 OH Pulchellidin -OH - -OH - - -H -OH bluish- OH OH OCH3 red Rosinidin - - -H - -OH -H - red OCH3 OH OH OCH3 Triacetidin -OH - -OH -H -OH -H -OH red OH 10
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2 cho thấy sự methyl hóa các anthocyanin và những hợp chất glycoside của chúng thường xảy ra ở vị trí C-3’ và C-5’, đôi khi cũng xảy ra ở vị trí C-5 và C- 7. Tuy nhiên thực tế cho thấy không có anthocyanin mà sự glycosyl hóa hoặc methoxyl hoa xảy ra đồng thời ở các vị trí C-3, -5,-7 và -4’. Nhóm hydroxyl ở một trong các vị trí C-5, C-7 hoặc C-4’ thì thích hợp cho việc hình thành cấu trúc quinonoidal (anhydro) base. Các anthocyanin thường bị acyl hóa bởi acid p-coumaric, cafeic, ferulic, hoặc những acid sinapic, đôi khi anthocyanin cũng bị acyl hóa bới các acid như : p- hydroxybenoic, malonic, hoặc acetic. Sự thay thế nhóm acyl thường xảy ra ở vị trí C- 3 của nhóm hydroxyl đối với đường. Bảng 1.3. Một số anthocyanin phổ biến. Anthocyanin Anthocyanidin Đường Có ở cây Pelargonin Pelargonidin 2 glucose Cúc tây Cianin Cynanindin 2 glucose Hoa hồng Ceraxinanin Cynanindin Glucose, galactose Quả mận Prunixianin Cynanindin Ramnoza, glucose Việt quất Idain Cyrinhindin 2 glucose Cẩm quỳ Delfin Peonidin 2 glucose Mẫu đơn Malvin Enidin glucose Nho Peonin Hirsutidin 2 glucose Anh thảo Anthocyanin tính khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào pH (hình 2), các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác. Tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH của môi trường. Thông thường khi pH 7 thì có màu xanh. Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH 4 ± 5 chúng có thể chuyển về dạng base cacbinol hay base chalcon không màu, ở pH = 7 ± 8 lại về dạng base quinoidal anhydro màu xanh. 11
Đồ án tốt nghiệp Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510 ± 540 nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin. Chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch và nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh. Hình 1.3. Sự đổi màu của anthocyanin ở các pH khác nhau. Trong các chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên thì anthocyanin là họ phổ biến nhất tồn tại trong hầu hết các thực vật bậc cao và tìm thấy được trong một số loại rau, hoa, quả, hạt có màu từ đỏ đến tìm như: gạo đen, quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, hoa hibiscus, đậu đen, quả cà tím 1.2.3 Tính chất, đặc điểm. Màu của anthocyanin hoàn toàn thay đổi khi pH môi trường chuyển từ acid sang base và giống như các chất chỉ thị acid-base (phenolphtalein, methyl đỏ, methyl da cam). 12
Đồ án tốt nghiệp Trong dung dịch acid, anthocyanin tồn tại dạng ở cation flavylium có màu đỏ. Khi pH tăng dần, có sự tấn công của nước vào vòng pyran C, anthocyanin chuyển dần sang dạng base carbinol và chalcone không màu. Đây chính là quá trình hydrat hóa, yếu tố chính tạo nên sự bạc màu của dung dịch màu-nước. trong dung dịch base, có sự dịch chuyển của H+ từ -OH trên vòng B, anthocyanin chuyển sang dạng anion có màu xanh. Khi pH môi trường càng cao, ion H+ trogn nhóm –OH còn lại bị phân hủy và khi ấy điện tử không còn, màu xanh trở nên xanh hơn bởi vì ánh sáng hấp phụ trở thành đỏ hơn. Trong môi trường trung tính, cả hai dạng cùng tồn tại nên dung dịch có màu tím. 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của anthocyanin. So với đa số các chất màu thiên nhiên, anthocyanin là chất màu có độ bền kém hơn, nó chỉ thể hiện tính bền trong môi trường acid. Ngoài ra, nó có thể phân hủy tạo thành dạng không màu và sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy có dạng màu nâu cộng với những sản phấm không tan. Sự phân hủy anthocyanin có thể xảy ra trong quá trình trích ly và tinh chế chúng, đồng thời sự phân hủy này còn xảy ra trong quá trình xử lý và bảo quản các sản phấm thực phẩm. Độ bền của các anthocyanin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cấu trúc hóa học của anthocyanin, pH, nhiệt độ, sự có mặt của copigment, ion kim loại, oxy, acid ascorbic, SO2, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phấm biến tính của chúng. Vì vậy, nghiên cứu các yếu tổ ảnh hưởng đến độ bền của anthocyanin là điều cần thiết trước khi ứng dụng nó như một chất màu thực phẩm. 1.2.4.1 Cấu trúc a) Cấu trúc chuyển hóa trong môi trường lỏng. Trong môi trường nước các anthocyanin tự nhiên giống như chất chỉ thị pH. Đỏ ở pH thấp, đỏ xanh ở pH trung tính, và không màu ở pH cao. 13
Đồ án tốt nghiệp Tại pH đã cho, tồn tại một cân bằng giữa 4 cấu trúc của anthocyanin và aglycone: quinonoidal (anhydro) bazo (A) màu xanh, cation flavylium (AH+) màu đỏ, carbinol pseudobase (B), và chalcone (C) không màu. Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước. Khi pH 3. Cation flavylium tương đối bền ở môi trường acid (như pH < 3). Trong môi trường trung 14
Đồ án tốt nghiệp tính hay acid yếu, anthocyanin tồn tại chủ yếu ớ các dạng không màu. Vì vậy, sự ổn định của các dạng mang màu, đặc biệt là dạng quinonoidal base, một phần là do sự xuất hiện của các gốc acid gắn vào phân tử đường, hay còn gọi là sự co-pigment hóa nội phân tử. Sở dĩ sự co-pigment hóa nội phân tử giúp tăng độ bền của phân tử anthocyanin là do sự xếp chồng của vòng thơm trong gốc acid với vòng pyrylium của phân tử anthocyanin, giảm bớt khả năng bị các phân tử nước tấn công hình thành các hợp chất carbinol, chalcone không màu. Ngoài ra, hiệu ứng copiment hóa ngoại phân tử cũng có thể giúp làm bền các cấu trúc quinoldal base hay ion flavylium do sự có mặt của những phức chất không màu, như các flavone, flavonol. Trong quá trình xử lý nhiệt và ánh sáng, quá trình co-pịgment hóa ngoại phân tử giữ vai trò quan trọng, ngăn chặn sự mất màu có thể xảy ra. Cơ chế phân hủy do nhiệt nói chung do chuyển hóa thuận nghịch của các ion flavylium thành các dạng chalcone. Chalcone là chất trung gian trong cả hai quá trình phân hủy do nhiệt và ánh sáng của anthocyanin. Theo các nghiên cứu gần đây (Davis và cộng sự, 1983; Mazza và Brouiỉìard,1990) hiệu ứng co-pigment hóa chính là cơ chế làm bền màu chính của anthocyanin trong thực vât do nó làm giảm tỉ lệ giữa dạng không mang màu (chalcone) và dạng mang màu thông qua việc tạo phức với dạng mang màu, ngăn chặn quá trình chuyển hóa từ dạng mang màu sang dạng không mang màu. Trong dung dịch, anthocyanin dạng không acyl hóa hay acyl hóa một đơn vị đóng vai trò như một chất chỉ thị pH, tồn tại ở dạng acid hay base tùy thuộc vào giá trị pH. Ở pH acid (pH 6). b) Cấu trúc hóa học Các pigment anthocyanin thường có độ bền thấp trong tế bào sống của chúng. Như đã trình bày ở trên, độ bền của các anthocyanin phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: Cấu trúc hóa học của anthocyaninm, pH, nhiệt độ, sự có mặt của co-pigment, ion kim loại, oxy, acid ascorbic, S02, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phẩm biến tính của chúng. 15
Đồ án tốt nghiệp Độ bền màu và cường độ màu của các anthocyanin phụ thuộc vào vị trí và số lượng của các nhóm hydroxyl, methoxyl, đường và các đường được acyl hóa. Khi số nhóm hydroxyl trong vòng B tăng, cực đại hấp thụ ở vùng thấy được dịch chuyển về phía có bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương. Ví dụ: bước sóng hấp thụ cực đại trong dung dịch HCL 0,01% MeOH là 535 nm (cam) đối với pelgonidin, 535 nm (đỏ cam) đối với cyaniding, 545 nm (đỏ xanh) đối với dephinidin.các nhóm methoxyl thay thế các nhóm hydroxyl cho kết quả ngược lại. Nhóm hydroxyl tại vị trí C-3 đặc biệt có ý nghĩa quan trọng vì nó dịch chuyển từ màu cam vàng đến màu đỏ nhưng 3 - deoxyanthocyanin : luteolinidin và tricetinidin có màu vàng; 3 - deoxyanthocyanidin bền hơn các anthocyanidin khác (Mazza và Brouillard, 1987; Iacobucci và Sueny, 1983). Sự có mặt của nhóm hydroxyl tại vị trí C-5 và nhóm thế ở vị trí C-4, cả 2 bền hóa dạng có màu thông qua sự ngăn cản các phản ứng hydrat hóa dẫn đến dạng không màu. Khi mức độ hydroxyl hóa các aglycone tăng, tính bền của các anthocyanin sẽ giảm. Tuy nhiên khi tăng sự methoxyl hóa,sẽ thu được kết quả ngược lại. Ví dụ: sự có mặt của nhóm OH ở vị trí 4’ và 7 trong phân tử làm bền hóa đáng kể các pigment, trong khi đó, sự methoxyl hóa có nhóm hydroxyl này làm giảm độ bền. Các anthocyanin được glycosyl hóa và acyl hóa sẽ cho dạng màu xanh. Sự glycol hóa những nhóm OH tự do làm tăng tính bền của anthocyanin. Vì vậy, các diglucoside bền hơn các monoglusidc của cùng một anthocyanin. Ví dụ: thời gian bán sống (giảm 50% độ hấp thu tại bước sóng hấp thu cực đại) của các cianidin 3 - utinoside là 65 ngày tại nhiệt độ phòng trong dung dịch acid citric 0,01M, pH = 2,8. Trong khi đó anthocyanidin tự do trong cùng điều kiện có thời gian bán sống chỉ có 12h. 16
Đồ án tốt nghiệp Anthocianin có chứa 2 hay nhiều nhóm acyl (như tematin, platyconin, cinerarrin, gntiodenphin và zebrrinin) là bền trong môi trường trung tính hoặc acid yếu do lien kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của các nhân phenolic trong anthocyanin và acid vòng thơm. Brouillard (1981-1982) và Goto cùng với cộng viên(1982-1983) khảo sát rằng các anthocianin diacylate hóa được bền hóa bởi sự liên kết chặt nhờ sự tương tác giữa vòng anthocyanin và 2 nhóm acyl vòng thơm. 1.2.4.2 pH Trong môi trường nước, pH có ảnh hưởng đáng kể lên màu sắc của anthocyanin (Brouillard 1984,Mzza và Brouillard 1987). Cấu trúc, độ bền màu, màu sắc của anthocyanin thay đổi theo sự thay đối của pH. Sự thay đổi cấu trúc của anthocyanin khi pH thay đổi đã được đề cập trong phần cấu trúc chuyển hóa. Ở pH < 2.0, dung dịch anthocyanin có màu hầu như đỏ (R3 = O-đường) hoặc vàng (R3 = H). Khi tăng pH của dung dịch, màu của các anthocyanin nhạt dần. Khi pH trong khoảng 4.0-6.0, hầu hết các anthocyanin đều có dạng không màu. Nếu tiếp tục tăng pH, dung dịch sẽ có màu tím hoặc xanh dương và màu này có thể chuyển sang màu vàng nếu để yên hoặc xử lý nhiệt. Sự biến tính của các anthocyanin tăng mãnh liệt với sự tăng của pH trong môi trường có oxy. Chẳng hạn : rubrobraxinin cloma là các anthocyanin của bắp cải tím là một triglucozit của xianidin. Khi: pH = 2,4 - 4,0 có màu đỏ thắm. pH = 4 - 6 thì có màu tím. pH = 6 thì có màu xanh lam. pH là kiềm thì có màu xanh lá cây. 17
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.3 Nhiệt độ. Hầu hết, các phản ứng hóa học liên quan đến độ bền anthocyanin và tốc độ phân hủy chúng đều phụ thuộc vào nhiệt độ. Sự tăng theo hàm số logarit của các anthocyanin ứng với sự phân hủy anthocyanin ứng với sự tăng đại số của nhiệt độ. Tính bền nhiệt của các anthocyanin phụ thuộc vào cấu trúc của chúng, pH, sự có mặt của oxy và sự tác động qua lại giữa các thành phần. Hình 1.5. Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7 Khi một cấu trúc của anthocyanin bền với sự gia tăng của pH thì nó cũng bền với sự gia tăng của nhiệt độ. Sự hydroxyl hóa các aglycone làm giảm tính bền của anthocyanin, trong khi sự methoxyl hóa, glycosyl hóa, acyl hóa sẽ cho kết quả ngược lại. Ví dụ: anthocyanin 3-glycoside có độ bền nhiệt lớn nhất tại pH = 1.8 - 2.0 với sự có mặt của oxy trong khi anthocyanidin 3,5-diglycoside có độ bền nhiệt lớn nhất tại pH = 4.0 - 5.0. Cơ chế của sự phân hủy nhiệt xảy ra không những phụ thuộc vào nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào bản thân anthocyanin đó. Drazdina cho rằng coumarin glycoside là sản phẩm phân hủy phổ biến của anthocyanin 3,5 - diglycoside và cơ chế của sự phân hủy là: đầu tiên, cation flavylium chuyển thành dạng quinonidal base, tiếp theo là hình thành nhiều dạng sản phẩm trung gian và cuối cùng thu được dẫn xuất coumarin và thành phần tương ứng với vòng B 18
Đồ án tốt nghiệp của anthocyanidin. Sự biến tính này không những được xúc tiến bởi nhiệt độ mà còn bị ảnh hưởng bởi oxy. Anthocyanidin 3-glycoside thì không hình thành những dẫn xuất coumrin mà bước đầu tiên của sự phân hủy bao gồm sự chuyển hóa của dạng carbinol pseudobase không màu, sau đó là sự mở vòng pyrylium để hình thành dạng chalcone trước khi thủy phân liên kết glycoside. Adams cho rằng, các anthocyanidin 3-glycoside khi được nung nóng ở pH = 2.0-4.0 đầu tiên sẽ bị thủy phân liên kết glycoside (ở 100°C) sau đó là sự biến đổi aglycone thành chalcone. Sự biến tính hơn nữa dẫn đến hình thành dạng sản phấm màu nâu đặc biệt là với sự có mặt của oxy. Khi đun nóng lâu dài các anthocyanin có thể bị phân huỷ và mất màu, đặc biệt là các anthocyanin của dây tây, anh đào, củ cải. Ngược lại các anthocyanin của phúc bồn tử đen cũng trong điều kiện đó lại không bị thay đổi. Nhìn chung khi gia nhiệt, các chất màu đỏ dễ dàng bị phân huỷ, còn các chất màu vàng thì khó hơn. 1.2.4.4 Oxy. Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân hủy của anthocyanin, từ đó sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu. Sự kết tủa và đóng váng trong nước trái cây có thể gây ra từ sự oxy hóa trực tiếp dạng carbinol pseudobase. Oxy hóa mãnh liệt các anthocyanin khi nung nóng. Oxy và nhiệt độ là những tác nhân xúc tiến đăc biệt nhất trong nước ép của blueberry, cherry (anh đào), currant, nho, raspberry và dâu. Lượng anthocyanin còn lại của dâu sẽ lớn hơn khi đóng chai dưới điều kiện chân không hoặc nitrogen (Baravingas và Cain, 1965). Độ bền của các pigment của nho, được sử dụng như là chất màu ở nước giải khát được tăng lên khi đóng hộp với nitrogen. 19
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.5 Enzyme Nhiều enzyme nội sinh trong tế bào của cây có khả năng làm mất màu anthocyanin. Những enzyme này được gọi chung là anthocyanase. Dựa vào đặc tính của các enzyme mà người ta phân làm 2 nhóm: Glycosidase và polyphenol oxidase (PPO). Các enzyme này thu được từ nấm (fugal). +Glycosidase: là enzyme thủy phân liên kết glycoside của anthocyanin tạo ra đường tự do và aglycone này kém bền hơn rất nhiều và mất màu rất nhanh khi có mặt của catecol (Huang 1955). +Polyphenol oxidase (PPO): tác dụng lên anthocyanin với sự có mặt của o- diphenol thông qua cơ chế oxy hóa kết hợp (h 6-6). Theo Gromeck và Markakis, sự thêm vào glycosidase và PPO xúc tác cho quá trình peroxide hóa phân hủy anthocyanin. Hình 1.6. Sự biến tính anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol. Peng và Markakis đã đề nghị một cơ chế mà trong đó o-quinine được tạo thành bởi sự oxy hóa anthocyanin (H-17). Blom phân lập được enzyme anthocyanin - glycosidase từ Aspergillus niger và chỉ ra ảnh hưởng của nó trong quá trình thủy phân liên kết glycoside của anthocyanin. PPO là enzyme có ảnh hưởng yếu lên anthocyanin dạng quinonoidal base dễ bị thủy phân bởi PPO hơn dạng cation flavylium. Tốc độ 20
Đồ án tốt nghiệp phân hủy bởi PPO phụ thuộc vào sự thay thế mô hình của vòng B và mức độ glycosyl hóa. 1.2.4.6 Ánh sáng. Các anthocyanin thường không bền khi tiếp xúc với tia tử ngoại, ánh sáng thấy được và các nguồn phóng xạ khác. Ánh sáng có 2 ảnh hưởng đến anthocyanin: - tăng cường cho quá trình sinh tổng hợp. - xúc tiến sự biến tính của chúng. Những quả táo giống đỏ sẽ không chín đỏ mà xanh trong bóng tối (Siegenman, 1964 ). Vanburen và cộng sự (1948) tường trình rằng các diglycoside được acyl hóa và methyl hóa là các diglycoside không bị acyl hóa là ít bền hơn và monoglycoside là kém bền nhất, Palamidis và Markakis (1975) đã tìm thấy rằng ánh sáng thúc đẩy quá trình phân hủy anthocyanin trong nước giải khát có C02 được phối màu với anthocyanin từ xác nho. Macccarone và cộng sự đã nghiên cứu sự quang hóa của anthocyanin và chỉ ra rằng, anthocyanin diglycosyl hóa tại vị trí C-3 và C-5 là bền hơn các anthocyanin mono glycoyl hóa tại vị trí C-3 đồng thời chúng bền hơn so với các aglycone tương ứng. 1.2.4.7 Đường và các sản phẩm biến tính của chúng Ở nồng độ 100 ppm, đường và các sản phẩm phân hủy của chúng có tác dụng thúc đẩy sự phân hủy các anthocyanin. Fructose, arabinose, lactose và sorbose có khả năng phân hủy anthocyanin mạnh hơn glucose, sucrose,và maltose. Tốc độ phân hủy của anthocyanin liên quan đến tốc độ phân hủy của đường. Các sản phẩm phân hủy của đường gồm có: furfural, 5-hydroxymethyl furfural và acctaldehydc thude từ phản ứng Mailard hoặc từ sự oxy hóa của acid ascorbic, polyuronic hoặc ở bản thân các anthocyanin. Những sản phẩm phân hủy này dễ dàng ngưng tụ với các anthocyanin hình thành những hợp chất phức tạp có màu nâu sẫm. Sự phân hủy anthocyanin với sự có mặt của furfural và HMF trực tiếp phụ thuộc vào nhiệt độ và rõ nét nhất là trong 21
Đồ án tốt nghiệp nước trái cây sự có mặt của oxy làm tăng thêm hiệu quả phân hủy của tất cả các loại đường và các dẫn xuất của chúng. Hình 1.7. Phản ứng ngưng tụ của A: Cyanidin và furural; B: Cyanidin ketobase và furural 1.2.4.8 Các ion kim loại. Một số ion kim loại đa hóa trị có thể tương tác với các anthocyanin có nhóm OH ở vị trí ortho gây ra hiệu ứng sâu màu (bathocromic). Hiện tượng này xảy ra khi kim loại tiếp xúc với anthocyanin trong quá trình chế biến rau quả hoặc sự cho thêm các muối kim loại vào trong thực phẩm. Sistrunk và Cash đã chứng minh rằng có thể bền hóa màu của dịch trích dâu bằng cách thêm vào đó muối thiếc. Francis (1977) công bố rằng, các ion Ca, Fe, Al tạo thêm sự bảo vệ cho anthocyanin của nước ép trái việt quất (cranberry ), nhưng sự biến đổi màu xảy ra là do sự tạo phức giữa ion kim loại và tannin, kết quả sau cùng là không có lợi. Trong công nghiệp đồ hộp, sự mất màu của những trái cây có chứa anthocyanin là do có phản ứng với thiếc của đổ hộp (Culpepper và Caldwell, 1972). Trong phản ứng với thiếc, anthocyanin đóng vai trò như chất khử cực catod hoặc 22
Đồ án tốt nghiệp anod. Chất khử cực catod có thể bị khử bởi hydro mới sinh từ phản ứng giữa kim loại và acid, còn chất khử cực anod thường là các anthocyanin có ít nhất 2 nhóm hydroxyl ở vị trí ortho. 1.2.4.9 Sulfurdioxide (SO2) Các anthocyanin thường bị mất màu khi có mặt của SO2. Hiện tượng này thường xảy ra trong quá trình xử lý các sản phẩm thựcphẩm có chứa anthocyanin bằng SO2. Quá trình khử này có thể là thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch. Trái cây và nước quả được xử lý bằng một lượng trung bình SO2 (500-2000 ppm), làm mất màu các anthocyanin của chúng trước khi chế biến, hơn nữa, chúng được desulfit hóa và màu anthocyanin được phục hồi. Jurd đã đề nghị sơ đồ phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin trong đó, dạng có màu flavylium phản ứng với ion bisulphate tạo thành chromene - 2 - (hoặc 4 ) - sulphonic acid. Hình 1.8. Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin. SO2 ở nồng độ rất thấp (khoảng 30 ppm) có thể ức chế sự biến tính do enzyme của anthocyanin trong quả anh đào nhưng không làm mất màu chúng (Goodman và Markakis, 1965 ). Sự tẩy màu bất thuận nghịch xảy ra trong quá trình tẩy quả với lượng lớn SO2 (0.8 - 1.5% ) và soda (0.4 - 1.0%) được dùng trong quá trình tẩy quả. Phản ứng bất thuận nghịch này chưa được biết hoàn toàn. 23
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.10 Acid ascorbic Nhiều nhà khảo sát (Beatic và cộng sự 1943; Pederson và cộng sự 1947; Kertesz 1952; Meschter 1953; Markakis và cộng sự 1957; Starr và Francis 1968) quan sát sự biến mất đồng thời của acid ascorbic và anthocyanin trong nước trái cây tồn trữ và đề nghị một tương tác có thế có giữa 2 hợp chất này. Acid ascorbic hiện diện trong hầu hết các sản phẩm trái cây, vitamin này bị oxy hóa tạo thành H2O2 và chính H2O2 làm mất màu anthocyanin. Hình 1.9. Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2 tạo thành từ sự oxy hóa Ascorbic acid Shrikhande và Francis đã tìm thấy rằng các ion đồng xúc tiến và các flavonoid làm giảm sự phân hủy của cả hai acid ascorbic và anthocyanin. Những sản phẩm không màu ( hình 1.10 ). Acid dehyroascorbic cũng có thể làm mất màu anthocyanin nhưng tại tốc độ thấp hơn acid ascorbic. 24
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.10. Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và anthocyanin. 1.2.5 Sự phân bố của anthocyanin. Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loại thưc vật này, anthocyanỉn được tìm thấy chủ yếu ở các lóp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì. Các hợp chất anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực vật (Bridle và Timberỉake, 1996). Các họ thực vật như vitaceae (nho) và rosaceae (cherry, dâu tây, mâm xôi, táo ) là các nguồn anthocyanin chủ yếu. Bên cạnh đó còn có các họ thực vật khác như solanceae (cà tím), saxifragaceae (quả lý đỏ và đen), ericaceae (quả việt quốc) và brassicaceae (bắp cải tím). Các loại anthocyanin phô biến nhất là các glucoside của cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và maldivin. số lượng các 3-glucoside nhiều gấp 2,5 lần các 3,5-glucoside. Loại anthocyamn hay gặp nhất chính là Cyaidin-3-glucoside. 25
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4. Bảng các anthocyanin có nguồn gốc thực vật Tên thực vật Tên thông Loại Anthocyanin thưòng Allium cepa Củ hành tím Cy-3-glucoside, 3-galactoside, 3- diglucoside và 3- laminarriobiosidc, Pn-3-glucoside Brassica Bắp cải tím (red Cy-3-sophoroside-5-glucoside cacyl hóa với oleraea cabbage) malonoyl, p-coumaroyl, di- p-coumarol,feruloyl, diferuloyl, sinapoyl và disinapoyl Fragaria spp Dâu tây Pg và Cy-3-glucoside (strawberry) Glycine Đậu nành (vỏ) Cy và Dp-3-glucoside maxima Hibicus Hoa bụt dấm Cy, Pn, mono- và biosides sabdariffa L Raphanus Củ cải đỏ (rễ) Pg và Cy-3-sophoroside-5-glucoside acyl hóa với p- sativus coumaroyl, feruloyl, caffeoyl. Vitis spp Nho Cy, Pn, Dp, Pt và Mv mono và diglucoside; dạng tự do và dạng acyl hóa 26
Đồ án tốt nghiệp Cy = cyanidin, Pg= pelagorindin, Pn= peonidin, Dp= delphinidin, Pt = petunidin, Mv= malvidin. 1.2.6 Các anthocyanin đã được thương mại hóa Encolor liqid DS (công ty Reggianna, Antociani, Italy) là dịch trích vỏ nho cô đặc. Redberry liqid 88-01 được sản xuất bởi công ty Gillette Food Inc, là dịch trích quả của alderberry, blackberry, blueberry, blackcurrant. Sambucus NR 54 được sản xuất bởi công ty Gilette Food Inc, là dịch trích anthocyanin từ elderberry. San Red Liqid RC-EX được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries ( Nhật) là dịch cô đặc từ bắp cải đỏ mà chúng chứa anthocyanin diacyl hóa. Powdered San Red PC được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries là bột sấy khô của dịch tr ích từ bắp cải đỏ. Powdered San Red PC được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries là bột sấy khô của dịch trích từ bắp cải tím. 1.2.7 Ứng dụng của anthocyanin. Anthocyanin được dùng như chất màu thực phẩm với tính an toàn cao và màu sắc đa dạng đẹp mắt. Khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chổng lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, chổng viêm, chổng các tia phóng xạ Hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, sự phát triên của các tế bào ung thư. Athocyanin còn có vai trò thu hút côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây diễn ra tốt hơn. Do đặc tính thay đổi màu theo pH, anthocyanin có thể sử dụng như một chất chỉ thị: pH 1-3: màu đỏ pH 7: tím pH 10-12: xanh lá cây pH 4: màu hồng pH 8: xanh dương pH >12: xanh lá mạ pH 5: hồng tím pH 9: xanh lá + xanh dương 27
Đồ án tốt nghiệp Xác định hàn the Mặc dù dung dịch mẫu có chứa hàn the (pH 9.5), nhưng khi cho anthocyanin vào dung dịch mẫu, dung dịch không chuyển sang màu xanh mà chuyển sang màu xám. Nguyên nhân là do hàn the (Natri borate) phản ứng với nhóm ortho hydroxy trong vòng thơm của anthocyanin tạo thành muối borate. (Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, 2007) Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin còn là hợp chất có nhiều đặc tính sinh học quý như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ. Những đặc tính quý báu của anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được đã mở ra một hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong đời sống hằng ngày, đặc biệt trong công nghệ chế biên thực phẩm. Điều đó hoàn toàn phù hợp với xu hướng hiện nay của các nước trên thế giới là nghiên cứu khai thác chất màu từ thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn cao cho người sử dụng. 1.3 Các thành tựu đạt được. 1.3.1 Phương pháp tách chiết anthocyanin 1.3.2 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ quả dâu Hội An Qua nhiều nghiên cứu cho rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năng chiết tách không giống nhau, tuy có nhiều phương pháp chiết tách anthocyanin từ rau quả nhưng chưa có một kết luận cụ thể khẳng định loại dung môi nào là tốt nhất cho một quy trình chiết tách. Trong quả dâu, anthocyanin được phân bố ở tế bào, với bản chất là một hợp chất thiên nhiên khá phân cực, anthocyanin hòa tan trong dung môi phân 28
Đồ án tốt nghiệp cực. Dưới đây là 5 hệ dung môi thường dùng để tách chiết các hợp chất thiên nhiên khá phân cực: + Methanol - nước - HCl (tỷ lệ 1:1,1% HCl). + Ethanol - nước - HCl (tỷ lệ 1:1,1% HCl). + Nước - HCl (1%). + Nước - formic acid (5%). + Nước - acetic acid (5%) Hệ dung môi ethanol - nước – HCl tỷ lệ 1:1 (với 1% HCl) cho hàm lượng anthocyanin lớn và độ màu tương đối cao. Hơn nữa ethanol ít độc hơn so với methanol và là dung môi thông dụng, rẻ tiền, dễ kiếm. Đó cũng là lý do nhóm nghiên cứu chọn hệ dung môi ethanol - nước - HCl trong quy trình công nghệ chiết tách và làm sạch anthocyanin thô. Hệ dung môi này cũng có thể dùng để tách chất màu anthocyanin từ các loại rau quả tương tự. (Nguyễn Thị Lan, 2010) 1.3.3 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím. Sắc tố chính được chiết xuất từ bắp cải tím đó là cyanidin 3,5-diglucoside của hệ màu anthocyanin và có màu sắc thay đổi rõ rệt theo pH môi trường. Trong môi trường acid nó có màu đó bền và khi môi trường chuyển sang base màu của nó chuyển sang xanh và ổn định trong thời gian dài. đây là đặc tính rất khác so với các anthocyanin của một số nguyên liệu khác (màu thay đổi liên tục tại pH kiềm) như lá tía tô, quả dâu Bằng phương pháp tối ưu hoá thực nghiệm trong quá trình chiết tách, đã xác định được hàm lượng Anthocyanin trong bắp cải tím Đà Lạt chiếm khoảng 1,11%. Tuy nhiên, việc sản xuất bắp cải tím ở khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới còn ở mức hạn chế vì bắp cải tím thích họp với những vùng núi cao hoặc nơi có mùa đông lạnh. 29
Đồ án tốt nghiệp Nguyên Liệu Rửa sạch/để ráo Nghiền nhỏ Xử lý Ngâm trong dung môi Trích ly Dịch trích Phân tích Hình 1.11. Quy trình tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím. 1.3.4 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ gạo đen. -Phương pháp sử dụng dung môi EtOH:HCl 1% tỉ lệ 85:15 (v:v). (Azza A.Abou-Arab, Ferial M.Abu-Salem and Esmat A.bou Arrab, 2011). -Phương pháp sử dụng dung môi kết hợp sóng siêu âm tăng hiệu quả trích ly. 30
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 2.1.1 Thời gian. Từ 25/05/2015 đến 16/08/2015. 2.1.2 Địa điểm. Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 Nguyên liệu– thiết bị - hoá chất. 2.2.1 Nguồn gạo đen. Nguyên liệu gạo đen được sử dụng trong nghiên cứu là tấm gạo đen “Hoa Sữa” của công ty Viễn Phú. Tấm gạo được đóng bao hút chân không và bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng. Có nhiều nguyên liệu chứa anthocyanin, nhưng trong đề tài nhóm nghiên cứu chọn gạo đen làm nguồn thu nhận Anthocyanin. Vì gạo đen là nguồn nguyên liệu chứa nhiều anthocyanin hơn các loại nguyên liệu khác. (Zhaohua Hou, 2013). 2.2.2 Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Sử dụng một số hóa chất chuẩn trong phân tích hãng Merck, Sigma. Ethanol 96o. HCl. Ethanol tuyệt đối. DPPH. KCl. Ascorbic acid. CH3COONa.3H2O. DMSO 31
Đồ án tốt nghiệp 2.2.3 Một số dụng cụ và thiết bị chủ yếu dùng trong nghiên cứu 2.2.3.1 Dụng cụ. - Ống nghiệm. - Bình tam giác. - Đũa thủy tinh. - Pipet. - Nhiệt kế. - Giấy lọc. - Rây Ø 0.0098 và 0.346 inches. - Ống ly tâm. 2.2.3.2 Thiết bị. - Cân phân tích. - Bể điều nhiệt. - Máy cô quay. - Máy quét quang phổ. - Máy ly tâm. - Máy xay nghiền. 32
Đồ án tốt nghiệp 2.3 Phương pháp nghiên cứu. Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm. Các nội dung chủ yếu được thực hiện như sơ đồ hình 2.1. Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến như sơ đồ hình 2.1 Gạo đen Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin Xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen. Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Xác định tỷ lệ HCl để pha dung môi tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Xác định nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Xác định thời gian tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin. Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc. Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm 33
Đồ án tốt nghiệp Gạo đen Nhiệt độ 60oC EtOH:HCl 1% Thời gian 60 p Trích ly Dung môi 85:15 v:v TL 1:20 (w:v) ggggg 4000 rpm Ly tâm Cặn 15 phút Thu dịch Lọc Định mức Định lượng anthocyanin Xác định các thông số tối ưu Hình 2.2. Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến 2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu. Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu tấm gạo đen bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi (còn gọi là phương pháp nhiệt). 2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo đen Mục đích thí nghiệm: Xác định bước sóng λmax của mẫu trong dung môi EtOH:HCl 0,1N (85:15,v:v). Chọn độ pha loãng thích hợp để thực hiện pha loãng mẫu ở các thí nghiệm tiếp theo. 34
Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị thí nghiệm: - Anthocyanin trong dịch trích ly từ gạo đen. - Ta pha loãng mẫu với độ pha loãng lần lượt từ n=10,20,30 bằng EtOH : HCl 0,1N (85:15,v:v). Trong vùng bước sóng từ 400 - 700nm. Chỉ tiêu theo dõi: Phổ hấp thu của dịch trích ly. Xác định λ max. 2.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra kích thước hạt của gạo đen cho hiệu quả trích ly cao nhất. Chuẩn bị thí nghiệm: - Chuẩn bị gạo đen với các kích thước hạt: nguyên hạt, xay và rây đến 0,0098 và 0.346 inches. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm với 1 yếu tố và 3 lần lặp lại. Yếu tố thí nghiệm là kích thước hạt. Tổng số nghiệm thức là 3: + Nguyên hạt + Xay và rây đến kích thước 0.0098 inches + Xay và rây đến kích thước 0.346 inches 35
Đồ án tốt nghiệp Gạo đen Nghiền nhỏ ggggg Nguyên 0,0098 0,346 hạt inches inches Nhiệt độ 60oC EtOH:HCl 1% Thời gian 60 p Trích ly Dung môi 85:15 v:v TL 1:20 (w:v) ggggg 4000 rpm Ly tâm Cặn 15 phút Thu dịch Lọc Định mức Định lượng anthocyanin Chọn kích thước tối ưu Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định kích thước nguyên liệu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen. 36
Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng anthocyanin. 2.3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen. Mục đích thí nghiệm: So sánh và chọn ra nhiệt độ xử lý nguyên liệu cho hiệu quả thu hồi anthocyanin cao nhất. Chuẩn bị thí nghiệm: -Mẫu gạo đen đã nghiền sẵn đến kích thước được lựa chọn từ thí nghiệm 1. -Chuẩn bị hệ dung môi Ethanol: HCl 1% (85:15, v/v). -Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v). -Tỷ lệ nguyên liệu : nước để nấu cách thủy là 1:1,5 (w/v). -Sau giai đoạn xử lý này, các bước tiến hành như sơ đồ hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Yếu tố thí nghiệm là nhiệt độ xử lý nguyên liệu. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Bao gồm: - Nguyên liệu không qua xử lý nhiệt. - Nguyên liệu được nấu cách thủy ở 80oC/5 phút. - Nguyên liệu được nấu cách thủy ở 90oC/5 phút. 37
Đồ án tốt nghiệp Gạo đen 0,0098 Nghiền nhỏ inches ggggg Xử lý nhiệt ggggg o o Nhiệt độ 80 C/5p 90 C/5p phòng/5p ggggg ggggg Nhiệt độ 60oC EtOH:HCl 1% Thời gian 60 p Trích ly Dung môi TL 1:20 (w:v) 85:15 v:v ggggg 4000 rpm Ly tâm 15 phút Cặn Thu dịch Lọc Định mức Định lượng Anthocyanin Chọn chế độ xử lý nhiệt Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu 38
Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai. 2.3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen. Mục đích thí nghiệm: Khảo sát và tìm ra tỷ lệ dung môi thích hợp cho hiệu quả trích ly anthocyanin cao nhất. Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm 3 được tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 1 và 2 sau khi chọn ra được kích thước hạt và nhiệt độ xử lý nguyên liệu. Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v). Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm với 1 yếu tố là tỷ lệ dung môi. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Khảo sát 6 tỷ lệ dung môi Ethanol:HCl 1% (v/v) như hình 2.5 39
Đồ án tốt nghiệp Gạo đen TL 80:20 0,0098 Nghiền nhỏ TL 85:15 inches ggggg Nhiệt độ 60oC TL 90:10 Thời gian 60 p Trích ly Dung môi TL 95:5 TL 1:20 (w:v) ggggg 4000 rpm Ly tâm TL 98:2 15 phút Cặn TL 99:1 Thu dịch Lọc Định mức Định lượng Anthocyanin Chọn tỷ lệ HCl tối ưu Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen. 40
Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng anthocyanin. 2.3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nhiệt độ tối ưu cho hiệu quả trích ly anthocyanin cao nhất. Chuẩn bị thí nghiệm: - Thí nghiệm 4 được tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 1, 2 và 3. Sau khi chọn ra được kích thước hạt, nhiệt độ xử lý nguyên liệu và tỷ lệ HCl để pha chế dung môi thích hợp. - Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v). Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Khảo sát 5 điểm nhiệt độ như sơ đồ hình 2.6 41
Đồ án tốt nghiệp Gạo đen o 50 C Nghiền 0,0098 inches 55oC Thời gian 60 p EtOH:HCl 1% 60oC Trích ly Dung môi TL 1:20 (w:v) 95:5, v:V ggggg 65oC 4000rpm Ly tâm Cặn 70oC 15 phút Thu dịch Lọc Định mức Định lượng Anthocyanin Chọn nhiệt độ trích ly Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen 42
Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng anthocyanin. 2.3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra thời gian trích ly anthocyanin mang lại hiệu quả cao nhất. Chuẩn bị thí nghiệm: - Thí nghiệm 5 được tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 1, 2, 3 và 4. Sau khi chọn ra được kích thước hạt, nhiệt độ xử lý nguyên liệu, tỷ lệ dung môi thích hợp và nhiệt độ trích ly thích hợp. - Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v). Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Khảo sát 5 khoảng thời gian như hình 2.7 43
Đồ án tốt nghiệp Gạo đen 50 phút Nghiền 0,0098 inches 55 phút Nhiệt độ 55oC EtOH:HCl 1% 60 phút Trích ly Dung môi TL 1:20 (w:v) 95:5, v:V ggggg 65 phút 4000rpm Ly tâm Cặn 70 phút 15 phút Thu dịch Lọc Định mức Định lượng Anthocyanin Chọn thời gian trích ly Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly anthocyanin từ gạo đen 44
Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng anthocyanin. 2.3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin. Mục đích thí nghiệm: Xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH và lập đường chuẩn xác định giá trị IC50 của anthocyanin và Ascorbic acid. Chuẩn bị thí nghiệm: Dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trong 24h bảo quản ở 4oC. Tỷ lệ mẫu:dung môi trích ly là: 1:2 (w/v). Bố trí thí nghiệm: Bắt gốc tự do DPPH tiến hành theo S.D.Sanja et al. (2009). Lấy lần lượt 100 µl, 120 µl, 140 µl, 160 µl, 180 µl, 200 µl dịch trích ly vào 6 ống nghiệm. Thêm đến 3000 µl bằng EtOH 100%. Rồi bổ sung 150 µl DPPH vào từng ống nghiệm làm dung dịch mẫu (mẫu). Để trong tối 15 phút, nhiệt độ phòng. Đem đo phổ hấp thu ngay ở bước sóng 516nm. Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng. Lấy 150 µl DPPH thêm 2850 µl EtOH 100% đo phổ hấp thu ngay ở bước sóng 516nm (Blank). Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng. Lấy 150 µl vitC (100µg/ml) thêm 2850 µl EtOH 100% đo phổ hấp thu sau 15 phút (trong tối, nhiệt độ phòng) ở bước sóng 516nm (Blank). Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng. Tiến hành thí nghiệm: - Xác định nồng độ anthocyanin trong dịch trích sau khi pha loãng 10 lần. - Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ khác nhau, cho phản ứng với DPPH ở nhiệt độ phòng, trong tối, 15-30 phút rồi tiến hành đo OD tại 516nm. Sử dụng chất đối chứng là Ascorbic acid (100µg/ml). 45
Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu theo dõi: Đo độ hấp thu màu của lượng DPPH còn lại sau khi phản khi với anthocyanin ở bước sóng 516nm. Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai. 2.3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc. Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian cô quay. Cô quay đến thể tích bao nhiêu là tối ưu nhất. Đồng thời xác định hàm lượng anthocyanin sau khi cô quay. Chuẩn bị thí nghiệm: - 700 ml dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trong 24h bảo quản ở 4oC. - Tỷ lệ mẫu:dung môi trích ly là: 1:20 (w/v). Tiến hành thí nghiệm: -Cân khối lượng bình cô quay khô, m. -Cân lại khối lượng bình sau khi cho 100mL mẫu vào, m0. -Tiến hành cô quay lần lượt 6 bình chứa dịch trích ly cùng thể tích là 100ml. -Nhiệt độ cô quay là 40oC. -Cân lại khối lượng các bình 3 phút, bình 6 phút, bình 9 phút, bình 12 phút, bình 15 phút, bình 18 phút cô quay ta được khối lượng mo, m3, m6, m9, m12, m15, m18. Sau đó định mức lại 100 (ml) mẫu đem xác định hàm lượng anthocyanin và hoạt tính kháng oxy hóa. Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính oxy hóa: Đo độ hấp thu màu của lượng DPPH còn lại sau khi phản khi với anthocyanin ở bước sóng 516nm. Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai. 46
Đồ án tốt nghiệp Thể tích dịch dịch trích ly còn lại xác định bằng tỷ lệ khối lượng mẫu trước và sau cô quay. 2.4 Các phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu - Định lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai. - Thử hoạt tính kháng oxy hóa và xác định giá trị IC50 của anthocyanin bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH. - Phương pháp xác định độ ẩm tương đối của nguyên liệu. 2.5 Các phương pháp thống kê và xử lý số liệu - Vẽ biểu đồ, đồ thị bằng phần mềm Excel 2013. - Kết quả trong nghiên cứu này là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của 3 lần lặp lại. Dữ liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm Statgraphic Plus 4.0. Sự khác biệt giữa các mẫu là có ý nghĩa về mặt thống kê khi giá trị p < 0,05. 47
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu. Bảng 3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu. Mo M1 M2 W(%) Wtb(%) Coc 1 23.3413 28.3450 27.838 11.27 11.26 Coc 2 22.5903 27.5935 27.089 11.21 ±0.04 Coc 3 22.3819 27.3835 26.876 11.29 Độ ẩm cho thấy điều kiện bảo quản nguyên liệu tốt. Chống được nấm mốc các hư tổn khác ảnh hưởng đến hàm lượng và khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin. Nguyên liệu có độ ẩm tương đối trung bình là 11,26% ± 0,04. 3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo đen Hình 3.1. Quét quang phổ mẫu anthocyanin từ bước sóng 400-700nm trong dung môi EtOH:0,1N HCl (85:15, v:v). Do anthocyanin tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau, tương ứng với mỗi dạng cấu hình sẽ có bước sóng hấp thu cực đại khác nhau. Vì thế cần phải xác định λmax 48
Đồ án tốt nghiệp để có thể định lượng được anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai cũng như xác định bằng các phương pháp đo quang khác. Giá trị λmax=535nm lớn hơn khi so sánh với λmax của khoai lang tím là 529nm. Cho thấy thành phần anthocyanin trong khoai lang tím khác với gạo đen. (Trần Thị Ánh Ngọc, 2011) Kết quả trên, có thể dự đoán được thành phần anthocyanin trong dịch trích ly gạo đen có thể là: Cyd-3-ara, Cyd-3-gal. (John Wiley, 2005). Kết quả cũng phù hợp với nghiên cứu của Fuleki và Francis (1965), Sakamura và Francis (1961) trong dung môi EtOH:HCl 1N (85:15, v:v) xác định được λmax=535nm với thành phần anthocyanin là Cyd-3-gal. Xác định được bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin là λmax=535nm. Mẫu cho phổ hấp thu rõ và cao nhất khi pha loãng 10 lần. 3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen. 8.000 7.323 7.000 6.000 5.214 5.000 4.082 4.000 3.000 ng anthocyanin mg/mLng anthocyanin ợ lư 2.000 m m à H 1.000 0.000 Nguyên Hạt 0,394 inches 0,0098 inches Kích thước hạt nguyên liệu, inches Hình 3.2. Ảnh hưởng của kích thước hạt nguyên liệu đến hàm lưởng anthocyanin từ dịch chiết. 49
Đồ án tốt nghiệp Ở kích thước hạt nhỏ nhất là 0,0098 inches cho hiệu quả trích ly anthocyanin với hàm lượng cao nhất là 7,323 ± 0,202 mg/ml. Ta thấy sự sai khác có ý nghĩa giữa hàm lượng anthocyanin trích ly từ 3 kích thước hạt trong thí nghiệm. - Hàm lượng anthocyanin tăng dần theo chiều giảm kích thước hạt nguyên liệu. Có nghĩa là hạt nguyên liệu có kích thước càng nhỏ thì khả năng trích ly của dung môi càng tốt. - Do anthocyanin nằm trong tế bào hiện diện ở lớp cám của hạt nguyên liệu. Vì thế nghiền nhỏ kích thước hạt đóng vai trò tác nhân phá vỡ tế bào, tạo điều kiện cho sự khuếch tán anthocyanin vào dung môi tốt hơn. Chọn kích thước hạt nguyên liệu dùng để trích ly anthocyanin trong các thí nghiệm tiếp theo là 0,0098 inches. 3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của chế độxử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen. 8.000 7.324 7.500 7.000 6.500 6.000 5.500 5.000 4.500 4.000 3.653 3.382 Hàm lượng anthocaynin, mg/ml lượng anthocaynin, Hàm 3.500 3.000 Nhiet do phong 80oC/5p 90oC/5p Nhiệt độ, oC Hình 3.3. Ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt cho nguyên liệu đến hàm lượng anthocyanin từ dịch chiết. 50
Đồ án tốt nghiệp Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng, đối với việc trích ly từ nguyên liệu có xử lý nhiệt trước ở 80oC và 90 oC, thì dịch chiết đó có hàm lượng anthocyanin là rất thấp. Và kết quả hoàn toàn khác khi trích ly từ nguyên liệu thô không qua xử lý nhiệt. Nguyên nhân của sự khác biệt này có thể là do sự hồ hóa của tinh bột gạo đã làm cho quá trình khuếch tán của anthocyanin ra dịch chiết khó khăn hơn So sánh với nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ khoai lang tím cho thấy: - Ở khoai lang tím, xử lý nhiệt nguyên liệu để hồ hóa tinh bột làm tăng hiệu quả cho quá trình trích ly anthocyanin (Hoàng Thị Lệ Hằng, 2014). - Tuy nhiên, từ kết quả thí nghiệm ở gạo đen cho thấy, việc xử lý nhiệt tương tự không những tốn thời gian và công sức mà còn làm giảm đáng kể hàm lượng anthocyanin so với việc không cần xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu. Nguyên nhân có thể là do cấu tạo tế bào của 2 nguyên liệu không giống nhau, thành phần anthocyanidin có thể không giống nhau. Bên cạnh đó việc tách chiết anthocyanin từ các nguồn khác nhau đã được thực hiện nhiều nơi rải rác trên thế giới cũng ghi nhận rằng là người ta thường tách chiết từ nguyên liệu gạo không qua xử lý nhiệt. Ta thấy nguyên liệu gạo đen không cần xử lý nhiệt và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng cho hiệu quả trích ly anthocyanin cao nhất. 51
Đồ án tốt nghiệp 3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen. 14 12.92 12 10 7.848 8 6.826 6 4 3.173 2.923 2.108 2 HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN (MG/ML) ANTHOCYANIN HÀM LƯỢNG 0 80:20 85:15 90:10 95:5 98:2 99:1 TỶ LỆ DUNG MÔI ETOH:HCL1% (V:V) Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi EtOH:HCl 1% đến hàm lượng anthocyanin từ dịch chiết. Anthocyanin là hợp chất phân cực, nên tan tốt trong nước đặc biệt là tan tốt trong MeOH, nhưng vì mục tiêu của đồ án để ứng dụng trong thực phẩm nên không thể sử dụng MeOH do tính độc hại của nó. Thay vào đó hệ dung môi EtOH - nước - HCl cho hàm lượng anthocyanin lớn và độ màu tương đối cao. Hơn nữa EtOH ít độc hơn so với MeOH và là dung môi thông dụng, rẻ tiền, dễ kiếm và dễ bay hơi thu hồi dung môi khi cô đặc dịch chiết. Sự khác nhau về hàm lượng anthocyanin trích ly được khi sử dụng dung môi với tỷ lệ 95:5 so với các tỷ lệ còn lại là có ý nghĩa thống kê. Thực nghiệm cho thấy rằng, cùng với lượng nguyên liệu ban đầu, sự khuyếch tán của chất màu anthocyanin ra dung môi tăng dần khi tăng tỷ lệ thể tích EtOH và giảm tỷ lệ thể tích HCl 1% trong hệ dung môi, đạt giá trị cực đại ở tỷ lệ dung môi EtOH:HCl 1% là 95:5 (v:v), sau đó giảm xuống. Khi sử dụng hệ dung môi với tỷ lệ khác nhau dẫn đến ái lực giữa anthocyanin và từng hệ dung môi cũng khác nhau. Điều đó dẫn đến việc nồng độ 52
Đồ án tốt nghiệp anthocyanin trong dịch trích ly sẽ khác nhau đối với dung môi với tỷ lệ khác nhau. Trong thí nghiệm này, dung môi có tỷ lệ 95:5 (v:v) có khả năng trích ly anthocyanin cực đại (12,92 mg/ml), có sự khác biệt rõ rệt, vượt xa so với các tỷ lệ còn lại; hơn thế nữa dung môi này rẻ tiền, nên việc tăng dung môi EtOH trong tỷ lệ trên là hoàn toàn phù hợp và khả thi. Hệ dung môi EtOH:HCl 1% có tỷ lệ 95:5 (v:v) cho hiệu quả trích ly anthocyanin là cao nhất. 3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen. 9 8.405 8 7.31 7 6 5.543 5 4.237 4.279 4 ng anthocyanin mg/mLng anthocyanin 3 ợ lư 2 m m à H 1 0 50oC 55oC 60oC 65oC 70oC Nhiet do oC Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng anthocyanin từ dịch chiết. Nhiệt độ là một trong các yếu tố làm biến tính và mất màu chủ yếu ở anthocyanin. Nhiệt độ càng cao, khả năng bị oxy hóa và mất màu của anthocyanin tăng dần. Tuy nhiên, trong quá trình trích ly, nhiệt độ lại đóng vai trò khá quan trọng do nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng hoạt động, sự tương tác, khuếch tán và ái lực của dung môi đối với anthocyanin. Từ kết quả thực nghiệm ta thấy rằng: Theo chiều tăng của nhiệt độ, hàm lượng anthocyanin trong dịch trích tăng đến khi đạt giá trị cực đại sau đó bắt đầu giảm dần. 53
Đồ án tốt nghiệp Ở nhiệt độ trích ly ở 50oC, quá trình diễn ra chậm do tốc độ khuếch tán của anthocyanin thấp. Nên hàm lượng anthocyanin thu được còn thấp. Ở nhiệt độ 55oC, hàm lượng anthocyanin trích ly được là cao nhất. Có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về hàm lượng anthocyanin giữa nguyên liệu được trích ly ở 55oC và các thang nhiệt độ còn lại. Ở điều kiện nhiệt độ này, dung môi EtOH:HCl 1% có tốc độ khuếch tán cao. Anthocyanin trong dịch trích ít bị biến tính và tốc độ khuếch tán của anthocyanin vào dung môi lớn hơn tốc độ phân hủy của anthocyanin gây ra bởi các tác nhân khác. Ở nhiệt độ quá 60oC, phản ứng phân hủy anthocyanin diễn ra nhanh hơn tốc độ khuếch tán của anthocyanin vào dung môi. Anthocyanin trong dịch trích bị oxy hóa mạnh. Hạt tinh bột bắt đầu biến đổi về cấu trúc. Vì thế hàm lượng anthocyanin trong dịch trích ly bắt đầu giảm. Trong khoảng nhiệt độ 65-70oC, cấu trúc hạt tinh bột bị biến đổi, diễn ra quá trình hồ hóa, làm cản trở sự khuếch tán của anthocyanin vào dung môi, dẫn đến việc làm giảm đáng kể tốc độ khuếch tán. Đồng thời ở nhiệt độ này, sự phá hủy cấu trúc anthocyanin diễn ra mạnh hơn. Trong trường hợp này nhiệt độ còn là tác nhân cộng hưởng với oxy trong không khí làm anthocyanin bị oxy hóa một cách mạnh mẽ. Ở nhiệt độ 55oC, hàm lượng anthocyanin trích ly được là cao nhất. Ta chọn nhiệt độ này để tiến hành trích ly anthocyanin ở các thí nghiệm sau. 54
Đồ án tốt nghiệp 3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen. 14 13.322 12 10 7.57 8 6.03 5.307 6 4.56 4 M LƯỢNG ANTHOCYANIN M MG/ML LƯỢNG À 2 H 0 50 PHÚ T 55 PHÚ T 60 PHÚ T 65 PHÚ T 70 PHÚ T THỜI GIAN TRÍCH LY (PHÚT) Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến nồng độ anhthocynin trong dịch chiết. Từ thực nghiệm cho thấy, hàm lượng anthocyanin tăng dần theo thời gian trích ly đến khi đạt giá trị cực đại, sau đó giảm xuống. Nguyên nhân hàm lượng anthocyanin trong thời gian đầu (từ 50 đến 60 phút đầu tiên) tăng lên là do: thực chất của quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen đó là quá trình khuếch tán. Vì thế hàm lượng anthocynin trong dịch trích sẽ tăng dần theo thời gian. Sự khuếch tán diễn ra do sự chênh lệch về gradient nồng độ, anthocyanin trong nguyên liệu có nồng độ cao hơn trong dung môi, theo chiều gradient thì anthocyanin sẽ bị khuếch tán vào dung môi và hàm lượng anthocyanin trong dịch trích sẽ tăng theo thời gian đến khi gradient nồng độ cân bằng. Ở thời gian trích ly là 65 phút và 70 phút thì hàm lượng anthocyanin lại giảm mạnh so với thời gian trích ly là 60 phút. Nguyên nhân là do lúc đầu gradient nồng độ lớn, tức là anthocyanin sẽ đi ra dung môi nhiều. Ở thời gian này, chênh lệch về gradient nồng độ gần như cân bằng, quá trình khuếch tán này gần như dừng lại. Đồng thời anthocyanin là chất có tính kháng oxy hóa mạnh. Ở điều kiện nhiệt độ 55oC, thời 55
Đồ án tốt nghiệp gian trích ly trong dung môi càng lâu thì hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết càng giảm do bị oxy hóa. Ở thời gian 60 phút, đủ thời gian cho quá trình khuếch tán xảy ra đến khi gradient nồng độ cân bằng, đủ để hàm lượng anthocyanin không bị giảm do tác nhân oxy hóa và nhiệt độ cao. Cho nên hàm lượng anthocyanin thu được từ dịch trích ly là cao nhất. Thời gian trích ly là 60 phút cho hàm lượng anthocyanin là cao nhất. Ta chọn thời gian trích ly là 60 phút để tiến hành các thí nghiệm sau. 3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin. 120.000 y = 64.182x + 62.614 100.000 R² = 0.9699 80.000 60.000 40.000 % Ức chế chế DPPH Ức % 20.000 0.000 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 -20.000 Log[anthocyanin, mg/ml] Hình 3.7. Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với Log[nồng độ anthocyanin mg/ml]. 56
Đồ án tốt nghiệp 100 90 y = 104.07x - 81.602 R² = 1 80 70 60 50 40 % Ức DPPH chế Ức % 30 20 10 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 Log[Ascorbic acid,µg/ml] Hình 3.8. Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với Log[Ascorbic acid, µg/ml]. Bảng 3.2. So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và anthocyanin. Mẫu Giá trị IC50 với chất oxy hóa DPPH Dịch trích ly anthocyanin gạo đen 636 µg/ml Ascorbic acid 18,145 µg/ml Trong thí nghiệm này, giá trị IC50 của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen cao hơn chất chuẩn đối chứng gấp 35 lần. Cho thấy, khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin ở thí nghiệm này còn thấp. Do chưa có chất chuẩn để lập đường chuẩn nồng độ anthocyanin vì thế hàm lượng anthocyanin được xác định dựa trên phương pháp pH vi sai chỉ mang tính tương đối. Thực tế nếu định lượng anthocyanin bằng phương pháp lập đường chuẩn với quercetin thì hàm lượng anthocyanin trong mẫu phân tích có thể cao hơn 46,200 ± 0,964 (mg/mL). (Suhad s. Humadi1, Viorica Istudor, 2009). Hàm lượng anthocyanin trong dịch trích ly cô đặc là: 46,200 ± 0,964 (mg/mL). 57
Đồ án tốt nghiệp Giá trị IC50 của anthocyanin khi sử dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH là IC50=636 (µg/mL). Và của chất chuẩn Ascorbic acid là IC50=18,145µg/ml. 3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc. 26.795 28 25 22 19.086 19 16 13 10.265 10 8.136 7.062 5.742 Hàm lượng anthocyanin, mg/ml lượng anthocyanin, Hàm 7 4.62 4 0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút Thời gian Hình 3.9. Sự thay đổi nồng độ của anthocyanin trong dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay. Hàm lượng anthocyanin tăng theo thời gian cô quay. Cô quay càng lâu thì dịch chiết càng đặc. 58
Đồ án tốt nghiệp 110 100 99 100 95 94 89 88 90 80 76 70 60 Hiệu suất thu hồi anthocyanin % anthocyanin thu hồi suấtHiệu 50 0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút Thời gian cô quay, phút Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi anthocyanin trong quá trình cô quay dịch trích ly theo thời gian. 90.000 81.871 80.000 y = 0.4365x2 - 15.168x + 95.176 70.000 65.091 R² = 0.9925 60.000 50.989 50.000 43.685 40.000 32.853 30.000 17.429 20.000 Khối lượng dịch cô quay, g cô quay, lượng dịch Khối 10.715 10.000 0.000 0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút Thời gian cô quay, phút Hình 3.11. Sự thay đổi về khối lượng của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay. Khối lượng của dịch cô quay còn lại giảm liên tục theo thời gian cô quay, tuân theo quy luật của hàm đa thức bậc 2: 59
Đồ án tốt nghiệp y = 0.4365x2 - 15.168x + 95.176 với R² = 0.9925 Từ đó, dựa vào thời gian cô quay, ta có thể xác định được tương đối chính xác khối lượng dịch còn lại sau cô quay là bao nhiêu gam. Với hệ số tương quan R² = 0.9925. 120.000 100.000 100.000 79.504 80.000 62.279 60.000 53.358 40.127 40.000 21.288 Thể tích dịch cô quay mL cô quay Thể dịch tích 20.000 13.088 0.000 0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút Thời gian, phút Hình 3.12. Sự thay đổi về thể tích của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay. Từ 100 mL dịch, sau thời gian cô quay là 18 phút/40oC, giảm còn 13.088 mL (giảm 7,64 lần). 60
Đồ án tốt nghiệp 51 49.568 49.535 49.402 49.07 49 48.008 47 45.817 45 43 41 % Ức chế chế DPPH Ức % 39.177 39 37 35 0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút Thời gian cô quay, phút Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian cô quay đến khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen. Bảng 3.3. Kết quả khả năng kháng DPPH của anthocyanin theo thời gian cô quay. Thời gian cô quay (phút) Qtb (%) ± SD 0 phút 49.568 ± 0.527a 3 phút 49.402 ± 0.399a 6 phút 49.535 ± 0.305a 9 phút 49.070 ± 0.304a 12 phút 48.008 ± 0.398b 15 phút 45.817 ± 1.212c 18 phút 39.177 ± 0.414d Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau ở mức ý nghĩa α = 0,05. Khả năng bắt gốc tự do DPPH giảm theo thời gian cô quay. Ở cùng nồng độ 4,62 mg/ml, khả năng bắt gốc tự do của dịch trích ly giảm 10% so với lúc trước khi cô quay. Từ đồ thị hình 3.10, hiệu suất thu hồi anthocyanin giảm theo thời gian cô quay. Nguyên nhân do anthocyanin là chất có hoạt tính kháng oxy hóa, nên thời gian cô quay 18 phút ở 40-45oC làm một phần anthocyanin bị oxy hóa, vì thế hàm lượng giảm 14% so với ban đầu. 61
Đồ án tốt nghiệp Từ đồ thị 3.13 và bảng 3.3 cho thấy: - Sau 15 phút cô quay, khả năng kháng DPPH của anthocyanin trong dịch trích ly giảm 4,8% so với dịch trích ly ban đầu. - Sau 18 phút cô quay, khả năng kháng DPPH của anthocyanin trong dịch trích ly giảm 6,7% so với dịch trích ly ban đầu. Khi thời gian cô quay tăng lên thì dịch chiết bán thành phẩm cũng đồng thời đặc hơn, có nghĩa là hàm lượng anthocyanin trong mỗi 1 ml của dịch chiết đã được cô đặc sẽ tăng dần; điều này xảy ra là do sự giảm của thẻ tích trong thời gian cô quay. (Hình 3.9 và 3.12). Trong thí nghiệm này thì khi dừng ở 18 phút, lúc đó dịch cô quay đã đặc đến 7,64 lần. Tương ứng với hiệu suất thu hồi giảm đến 76% và khả năng kháng oxy hóa đạt 39,18%. Nguyên nhân làm hoạt tính kháng DPPH của dịch trích ly giảm: Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân hủy của anthocyanin, từ đó sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu. Sự kết tủa và đóng váng có thể gây ra từ sự oxy hóa trực tiếp dạng carbinol pseudobase. Oxy sẽ hóa mãnh liệt các anthocyanin khi nung nóng. Cơ chế của sự phân hủy nhiệt xảy ra không những phụ thuộc vào nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào bản thân anthocyanin đó. 62
Đồ án tốt nghiệp Để thu được dịch chiết có các tiêu chí sau: - chứa ít dung môi. - dịch chiết cô đặc có nồng độ athocyanin cao - hoạt tính kháng oxy hóa tốt. Nhóm nghiên cứu đề xuất chọn thông số cho quá trình cô quay dịch trích ly có thể tích 100mL tương đương 81,817 g, nồng độ 4,620 (mg/ml): - thời gian cô quay là 15 phút. - cô quay đến thể tích cuối cùng là 21,288 ml (hoặc khối lượng 17,429g). - cô quay đến nồng độ là 19,086 (mg/ml). - hiệu suất thu hồi anthocyanin dựa trên hàm lương đạt 88%. - hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết cô đặc đạt 45,817%. (giảm 8% so với dịch chiết ban đầu) 63
Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ 1. Kết Luận a. Trong quá trình nghiên cứu đã xây dựng được quy trình trích ly anthocyanin theo quy trình sau: Gạo đen Nhiệt độ 55oC EtOH:HCl 1% Thời gian 60 p Trích ly Dung môi 95:5 v:v TL 1:20 (w:v) ggggg 4000 rpm Ly tâm Cặn 15 phút Thu dịch Lọc Định mức Dịch chiết Anthocyanin Hình 3.14. Sơ đồ quy trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Đã xác định được các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu anthocyanin nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích ứng dụng vào thực phẩm: - Xác định được độ ẩm ban đầu của nguyên liệu là 11,26% ± 0,04. 64
Đồ án tốt nghiệp - Xác định được bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ gạo đen là λmax=535nm trong dung môi EtOH:HCl 1N. - Kích thước nguyên liệu là 0,0098 inches cho hiệu quả trích ly anthocyanin với hàm lượng cao nhất. - Nguyên liệu ở điều kiện nhiệt độ phòng cho hiệu quả trích ly anthocyanin với hàm lượng cao nhất mà không cần xử lý nhiệt sơ bộ. - Xác định được tỷ lệ HCl pha chế dung môi thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin là EtOH:HCl 1% 95:5 (v:v). - Xác định được nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin là 55oC. - Xác định thời gian tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin là 60 phút. - Xác định được khả năng bắt gốc tự do DPPH của anthocyanin với giá trị IC50 = 636 (µg/ml). - Nhóm nghiên cứu đề xuất chọn thông số cho quá trình cô quay dịch trích ly có thể tích 100mL tương đương 81,817 g, nồng độ 4,620 (mg/ml): +Thời gian cô quay là 15 phút. +Cô quay đến thể tích cuối cùng là 21,288 ml (hoặc khối lượng 19,068g). +Nồng độ anthocynin trong dịch chiết bán thành phẩm là 19,086 (mg/ml). +Hiệu suất thu hồi anthocyanin dựa trên hàm lương đạt 88%. +Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết cô đặc đạt 45,817%. (giảm 8% so với dịch chiết ban đầu). 65
Đồ án tốt nghiệp 66
Đồ án tốt nghiệp b. Đánh giá cảm quan của dịch chiết. Bảng 3.4. Đánh giá sơ bộ cảm quan của dịch chiết anthocynin DỊCH CHIẾT MÀU MÙI TRẠNG SẮC THÁI Đỏ tươi Mùi cồn Trong, không nặng bị vẫn đục, không kết cặn Hình 3.15. Dịch chiết anthocyanin trước cô quay. Đỏ đậm Mùi cồn nhẹ Hình 3.16. Dịch chiết sau cô đặc 67
Đồ án tốt nghiệp 2. Kiến Nghị Khảo sát ảnh hưởng của kích thước hạt nguyên liệu đến hàm lượng anthocyanin ở kích thước nhỏ hơn 0,0098 inches. Cần phải chuẩn bị các điều kiện về nhiệt độ thật tốt trước khi làm thí nghiệm để đảm bảo rằng dịch cô quay đạt đúng nhiệt độ dự kiến sẽ cô quay. Xác định lại giá trị IC50 của anthocyanin trong dịch trích ly và chất chuẩn Ascorbic acid. 68
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng việt. 1. Huỳnh thị Kim Cúc, Lê Văn Hoàng, Lê thị Lệ Hường (2010). Chiết anthocyanin từ quả dâu bằng nước sulfured và một số đặc tính của chúng. Trường CĐ LT – TP và ĐH Đà Nẵng 2. Hoàng Thị Lệ Hằng (2014), Nghiên cứu sử dụng enzyme trong quá trình chuẩn bị dịch lên men lactic từ bột khoai lang tím. 3. Lưu Đàm Cư (2005). Nghiên cứu chiết tách chất nhuộm màu thực phẩm từ kinh nghiệm sử dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số. 4. Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên (2004), Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ quả dâu Hội An. Tạp chí khoa học công nghệ, Đại học Đà Nẵng. Số 2 (6)/2009. 5. Nguyễn Thị Thanh Tuyền (2014), Nghiên cứu tách chiết và khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin từ phế phẩm gạo đen. 6. Nguyễn Thọ. Các phương pháp xác định tính chất lý hoá cơ bản của nguyên liệu trong công nghệ thực phẩm. 7. Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, (2007). Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến màu của anthocyanin từ bắp cải tím ứng dụng làm chất chỉ thị an toàn trong phân tích thực phẩm và hoá học. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Đà Nẵng.Số:3(20)/2007. 8. Trần Thị Ánh Ngọc (2011). Nghiên cứu thành phần của chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím. 69
Đồ án tốt nghiệp 2. Tài liệu tiếng Anh. 1. AOAC (2006). Total Monomeric Anthocyanin Pigment Content of Fruit Juices, Beverages, Natural Colorants, and Wines. AOAC Official Method. 2. Azza A.Abou-Arab, Ferial M.Abu-Salem and Esmat A.bou Arrab (2011). Physico-chemical properties of natural pigments (anthocyanin) extracted from Roselle calyces (Hibiscus subdariffa). Department of food technology, national research centre, Dokki, Cairo, Egypt. 3. Giusti. M. M and Wrolstad, R. E. (2001). Characterization and Measurement of Anthocyanin by UV-Visible Spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 4. John Wiley (2005). Handbook of Food Analytical Chemistry: Pigments, Colorants, Flavors, Texture, anh biocative food components. 5. Nguyen Ngoc Mai Trinh, Nguyen Manh Duc, Phan Van Hung (2014), Antioxidant capacity and amylase inhibitory from fresh asiatic pennywort (Centella asiatica). 6. Oliver-Hoyo, M. Allen, D. Solomon, S. Brook, V. Ciraolo, J. Daly, and Jackson. (2001). Qualitative analysis of fourteen white solids and two mixtures using household chemicals. Journal of chemical education 78, 1475-1478. 7. Rodriguez-Saona, L.E and Wrolstad, R.E (2001). Extraction, Isolation, and Purification of Anthocyanins. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 8. Suhad s. Humadi, viorica istudor (2009). Quantitative analysis of bio- active compounds in hibiscus sabdariffa l. extracts. II. quantitative analysis and biological activities of anthocyanins. 9. S.D.SANJA (2009). Characterization and evaluation of antioxidant activity of portulaca oleracea. 10. Zhaohua Hou (2013). Identification of anthocyanins isolated from black rice (Oryza sativa L.) and their degradation kinetics. 70
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CƯU 1) Phương pháp trích ly anthocyanin. - Anthocyanin từ gạo đen được trích ly bằng cách nghiền nhỏ hạt nguyên liệu đến kích thước 0.0098 inches. - Phương pháp sử dụng dung môi EtOH:HCl 1% tỉ lệ 85:15 (v:v). (Nguyễn Thị Thanh Tuyền, 2014). - Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là 85:15 (v:v). - Thời gian trích ly là 60 phút. - Nhiệt độ trích ly là 60oC. - Số lần trích ly là 1 lần. 2) Phương pháp pH vi sai. Xác định hàm lượng anthocyanin thô - Tại pH = 1 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavylium có độ hấp thụ cực đại. - Tại pH = 4,5 chúng ở dạng carbinol không màu. Đo độ hấp thụ cực đại của 2 mẫu ở pH = 1 và pH = 4,5 tại bước sóng của độ hấp thụ cực đại 515 nm, so với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm (độ đục của mẫu). (Suhad s. Humadi1, Viorica Istudor , 2009). A.MW .DF .103 Anthocyanin toàn phần (a, mg/ml) = .l Trong đó: A: mật độ quang (độ hấp thu của anthocyanin). A = (Amax - A700)pH1 - (Amax - A700)pH4,5 1
Đồ án tốt nghiệp Với: Amax(pH=1): độ hấp thu cực đại tại bước sóng λmax nm. A700(pH=4,5): độ hấp thu cực đại tại bước sóng 700 nm. MW: khối lượng phân tử của anthocyanin không kể ion Cl- hay nước tinh thể hóa là 449,2 g/mol. DF: hệ số pha loãng. : độ hấp thụ phân tử là 26900. L · mol–1 · cm–1 l: chiều dày cuvet, 1 cm. 103 chuyển đổi từ g sang mg. 3) Phương pháp DPPH Nguyên tắc: DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 515-517nm. Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại, màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, tím chuyển sang vàng nhạt. Ascorbic acid được sử dụng làm chất đối chiếu. Phương pháp tiến hành xác định giá trị IC50 Thực hiện với mẫu thử DPPH hòa tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM Hòa tan mẫu trong DMSO ở 8 nồng độ khác nhau Cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800µl methanol, sau đó bổ sung 100µl mẫu thử (thực hiện lần lượt cho từng nồng độ) Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng  = 516 nm. 2
Đồ án tốt nghiệp Mỗi nồng độ mẫu được thử nghiệm lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng Hòa tan ascorbic acid (Ascorbic acid) trong DMSO ở 8 nồng độ khác nhau. Mẫu đối chiếu (ascrorbic acid): cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800µl methanol, sau đó bổ sung 100µl dung dịch ascorbic acid Mẫu trắng: cho 100µl DMSO vào 2900µl methanol. Cả hai dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng  = 516 nm. Mỗi nồng độ chất đối chiếu được thử nghiệm lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình. Kết quả tính toán Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của chất nghiên cứu được tính theo công thức sau: (A − Ac) Q(%) = [1 − ] x100 (A0 − Ac) Trong đó: A là độ hấp thu của dung dịch chứa mẫu thử A0 là độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu thử Ac là độ hấp thu của dung dịch chứa chất đối chiếu Giá trị IC50 được tính bằng phần mềm GraphPad Prism thông qua đường chuẩn phần trăm ức chế (đường chuẩn được xây dựng từ 9 nồng độ khác nhau). 3
Đồ án tốt nghiệp 4) IC50 và cách xác định Định nghĩa: IC50 (Effective concentration of 50%) là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, hoặc tế bào, hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp. Cách xác định IC50: - Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau. - Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta vẽ một đường thẳng y = ax+b qua tất cả các điểm (với y là % ức chế, x là nồng độ). - Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dưới 50% và vẽ đường thẳng y=ax+b qua 2 điểm này. - Từ phương trình trên, cho y = 50 ta sẽ suy ra giá trị x chính là IC50. 5) Phương pháp xử lý số liệu thống kê. Phần mềm thống kê Statgraphic Plus 4.0, Excel 2015, GraphPad Prism. Kết quả trong nghiên cứu này là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của 3 lần lặp lại. Dữ liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm Statgraphic. Sự khác biệt giữa các mẫu là có ý nghĩa về mặt thống kê khi giá trị p < 0,05. 6) Chuẩn bị dung dịch đệm pH a) Pha 0,025M KCl buffer, pH 1.0 Cân 1,86g KCl cho vào becher 1 lít, thêm nước cất đến 980ml. Đo pH và chỉnh về pH 1.0 bằng HCl (khoảng 6,3ml). Sau đó cho vào bình định mức 1 lít bằng nước cất. 4
Đồ án tốt nghiệp a) Pha 0,4M CH3COONa buffer pH4.5 Cân 54,43g CH3COONa.3H2O cho vào becher 1 lít thêm nước cất khoảng 960ml Đo và chỉnh pH 4.5 bằng HCl (khoảng 20ml) và định mức bằng nước cất. a) Pha HCl 1% từ HClđđ 37% (d ~ 1,19g/ml) 10ml dd HClđđ + 430ml nước cất. 7) Xác định độ ẩm nguyên liệu. Mục đích thí nghiệm: Xác định độ ẩm nguyên liệu. Phương pháp sấy đến khối lượng không đổi (còn gọi là phương pháp nhiệt). Phương pháp này được coi là phương pháp tiêu chuẩn. Dụng cụ thí nghiệm: - Cốc thuỷ tinh hay hộp kim loại đựng mẫu. - Máy nghiền hoặc cối nghiền, đũa thuỷ tinh - Tủ sấy, bình hút ẩm. - Cân phân tích hoặc cân điện tử, chính xác ±0,001gam. Tiến hành thí nghiệm: - Xử lý nguyên liệu: nghiền nhỏ nguyên liệu. - Dùng cân phân tích hoặc cân điện tử cân chính xác 5 gam mẫu đã xử lý ở trên cho vào hộp hoặc cốc sạch, khô đã biết khối lượng trước (tức là sau khi rửa, sấy khô, để nguội đến nhiệt độ phòng, cân). - Dùng đũa thuỷ tinh san đều lượng mẫu ở hộp đựng mẫu để ẩm bốc hơi nhanh và đều. 5
Đồ án tốt nghiệp - Đưa mẫu vào tủ sấy để lấy ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi. Sau khi sấy, lấy mẫu ra cho vào bình hút ẩm để làm nguội, cân. tiếp tục sấy đến khối lượng không đổi, nghĩa là: sấy lại, làm nguội và cân. Khi kết quả giữa hai lần cân cuối cùng có sai số ±0,5 % là coi như khối lượng không đổi. Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng nguyên liệu tính bằng g. Tính kết quả thí nghiệm: Nếu gọi: G1 : Khối lượng hộp và nguyên liệu trước khi sấy, g. Go : Khối lượng hộp không, g G2 : Khối lượng hộp và mẫu sau khi sấy, g G : Khối lượng mẫu cần xác định, g. G = G1 - Go Độ ẩm tương đối ω hay độ ẩm nguyên liệu được xác định theo biểu thức sau, tính bằng %: 1− 2 ω = 100 % 8) Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo đen 9) Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen. Cân 5g nguyên liệu gạo đen vào chai thủy tinh. Thêm 100ml dung môi Ethanol:HCl (1%) vào chai thủy tinh. Đặt chai thủy tinh vào bể điều nhiệt 600C trong 6
Đồ án tốt nghiệp 60 phút. Sau đó, lấy dịch trích ly đem ly tâm (4000 vòng/15 phút). Lọc dịch trích bằng giấy lọc, thu dịch bỏ cặn. Định mức bằng dung môi Ethanol:HCl (1%) đến 100ml, để yên dung dịch trong 15 phút. Hút dịch đã định mức vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml, hút tiếp 9ml đệm pH = 1 vào ống nghiệm thứ nhất và 9ml đệm pH = 4,5 vào ống nghiệm còn lại. Lắc đều rồi để yên 15 phút cho ổn định dung dịch. Sau đó, đo quang phổ ở 2 bước sóng 535nm và 700nm. Dùng nước cất làm mẫu trắng. Ghi nhận kết quả và tính toán hàm lượng anthocyanin của mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lượng anthocyanin theo công thức pH vi sai. 10) Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Cân 5g gạo đen vào 3 chai thủy tinh. Chai thứ nhất : không xử lý nhiệt; Chai thứ 2 : xử lý nhiệt ở 800C/5 phút, để nguội; Chai thứ 3 : xử lý nhiệt ở 900C/5 phút, để nguội. Thêm 100ml dung môi Ethanol:HCl(1%) vào các chai thủy tinh. Đặt chai thủy tinh vào bể điều nhiệt 600C trong 60 phút. Sau đó, lấy dịch trích ly đem ly tâm (4000 vòng, 15 phút). Lọc dịch trích bằng giấy lọc, thu dịch bỏ cặn. Định mức bằng dung môi Ethanol:HCl (1%) đến 100ml, để yên dung dịch trong 15 phút. Hút dịch đã định mức lần lượt vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml, hút tiếp 9ml đệm pH = 1 vào ống nghiệm thứ nhất và 9ml đệm pH = 4,5 vào ống nghiệm còn lại. Lắc đều rồi để yên 15 phút cho ổn định dung dịch. Sau đó, đo quang phổ ở 2 bước sóng 535nm và 700nm. Lấy nước cất làm mẫu trắng. Ghi nhận kết quả và tính toán hàm lượng anthocyanin của mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lượng anthocyanin theo công thức pH vi sai. 11) Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen. Cân 5g gạo đen vào 6 chai thủy tinh. Thêm 100ml dung môi ethanol:HCl (1%) với các tỷ lệ khác nhau vào các chai thủy tinh. Đặt chai thủy tinh vào bể điều nhiệt 600C trong 60 phút. Sau đó, lấy dịch trích ly đem ly tâm (4000 vòng, 15 phút). Lọc 7
Đồ án tốt nghiệp dịch trích bằng giấy lọc, thu dịch bỏ cặn. Định mức bằng dung môi Ethanol:HCl (1%) cùng tỷ lệ như trên đến 100ml, để yên dung dịch trong 15 phút. Hút dịch đã định mức lần lượt vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml, hút tiếp 9ml đệm pH = 1 vào ống nghiệm thứ nhất và 9ml đệm pH = 4,5 vào ống nghiệm còn lại. Lắc đều rồi để yên 15 phút cho ổn định dung dịch. Sau đó, đo quang phổ ở 2 bước sóng 535nm và 700nm. Lấy nước cất làm mẫu trắng. Ghi nhận kết quả và tính toán hàm lượng anthocyanin của mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lượng anthocyanin theo công thức pH vi sai. 12) Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen. Cân 5g gạo đen vào 5 chai thủy tinh. Thêm 100ml dung môi ethanol:HCl (1%) vào các chai thủy tinh. Đặt chai thủy tinh vào các bể điều nhiệt với các nhiệt độ khác nhau trong 60 phút. Sau đó, lấy dịch trích ly đem ly tâm (4000 vòng, 15 phút). Lọc dịch trích bằng giấy lọc, thu dịch bỏ cặn. Định mức bằng dung môi Ethanol:HCl (1%) đến 100ml, để yên dung dịch trong 15 phút. Hút dịch đã định mức lần lượt vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml, hút tiếp 9ml đệm pH = 1 vào ống nghiệm thứ nhất và 9ml đệm pH = 4,5 vào ống nghiệm còn lại. Lắc đều rồi để yên 15 phút cho ổn định dung dịch. Sau đó, đo quang phổ ở 2 bước sóng 535nm và 700nm. Nước cất sử dụng làm mẫu trắng. Ghi nhận kết quả và tính toán hàm lượng anthocyanin của mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lượng anthocyanin theo công thức pH vi sai. 13) Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen. Cân 5g gạo đen vào 5 chai thủy tinh. Thêm 25ml dung môi ethanol:HCl (1%) vào các chai thủy tinh. Đặt chai thủy tinh vào các bể điều nhiệt với các thời gian khác nhau. Sau đó, lấy dịch trích ly đem ly tâm (4000 vòng, 15 phút). Lọc dịch trích bằng giấy lọc, thu dịch bỏ cặn. Định mức bằng dung môi Ethanol:HCl (1%) đến 100ml, để yên dung dịch trong 15 phút. Hút dịch đã định mức lần lượt vào 2 ống nghiệm mỗi 8
Đồ án tốt nghiệp ống 1ml, hút tiếp 9ml đệm pH = 1 vào ống nghiệm thứ nhất và 9ml đệm pH = 4,5 vào ống nghiệm còn lại. Lắc đều rồi để yên 15 phút cho ổn định dung dịch. Sau đó, đo quang phổ ở 2 bước sóng 535nm và 700nm. Nước cất được sử dụng như mẫu trắng. Ghi nhận kết quả và tính toán hàm lượng anthocyanin của mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lượng anthocyanin theo công thức pH vi sai. 14) Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin. Bắt gốc tự do DPPH tiến hành theo S.D.Sanjaet al. (2009). Lấy lần lượt 100 µl, 120 µl, 140 µl, 160 µl, 180 µl, 200 µl dịch trích ly vào 6 ống nghiệm. Thêm đến 3000 µl bằngEtOH 100%. Rồi bổ sung 150 µl DPPH vào từng ống nghiệm làm dung dịch mẫu (mẫu). Để trong tối 15 phút, nhiệt độ phòng. Đem đo phổ hấp thu ngay ở bước sóng 516nm. Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng. Lấy 150 µl DPPH thêm 2850 µl EtOH 100% đo phổ hấp thu ngay ở bước sóng 516nm (Blank). Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng. Lấy 150 µl vitC (100µg/ml) thêm 2850 µl EtOH 100% đo phổ hấp thu sau 15 phút (trong tối, nhiệt độ phòng) ở bước sóng 516nm (Blank). Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng. Tiến hành thí nghiệm: -Xác định nồng độ anthocyanin trong dịch trích sau khi pha loãng 10 lần. -Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ khác nhau, cho phản ứng với DPPH ở nhiệt độ phòng, trong tối, 15-30 phút rồi tiến hành đo OD tại 516nm. Sử dụng chất đối chứng là Ascorbic acid (100µg/ml). Chỉ tiêu theo dõi: Đo độ hấp thu màu của lượng DPPH còn lại sau khi phản khi với anthocyanin ở bước sóng 516nm. Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai. 9
Đồ án tốt nghiệp 15) Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc. -700 ml dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trong 24h bảo quản ở 4oC. -Tỷ lệ mẫu:dung môi trích ly là: 1:20 (w/v). Tiến hành thí nghiệm: -Cân khối lượng bình cô quay khô, m. -Cân lại khối lượng bình sau khi cho 100mL mẫu vào, m0. -Tiến hành cô quay lần lượt 6 bình chứa dịch trích ly cùng thể tích là 100ml. -Nhiệt độ cô quay là 40-45oC. -Cân lại khối lượng các bình 3 phút, bình 6 phút, bình 9 phút, bình 12 phút, bình 15 phút, bình 18 phút cô quay ta được khối lượng mo, m3, m6, m9, m12, m15, m18. Sau đó định mức lại 100 (ml) mẫu đem xác định hàm lượng anthocyanin và hoạt tính kháng oxy hóa. Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính oxy hóa: Đo độ hấp thu màu của lượng DPPH còn lại sau khi phản khi với anthocyanin ở bước sóng 516nm. Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai. Thể tích dịch dịch trích ly còn lại xác định bằng tỷ lệ khối lượng mẫu trước và sau cô quay. 10
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM. 1. Thí nghiệm 1: Hình 1 Quang phổ mẫu anthocyanin từ bước sóng 400-700nm trong dung môi EtOH:0,1N HCl (85:15, v:v). 2. Thí nghiệm 2: Bảng 1 số liệu OD đo được từ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng kích thước hạt đến hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen. Dạng mẫu pH1 pH45 Hệ số A a TB 535mn 700nm 535nm 700nm pha loãng (mg/L) (mg/L) Nguyên hạt 0.073 0.028 0.050 0.026 10 0.021 3,507 4,082 0.073 0.026 0.050 0.027 10 0.024 4,008 ±0,494 0.072 0.027 0.051 0.028 10 0.022 3,674 0.077 0.025 0.048 0.022 10 0.026 4,342 0.075 0.023 0.049 0.024 10 0.027 4,509 0.072 0.029 0.045 0.031 10 0.029 4,843 0.074 0.021 0.052 0.024 10 0.025 4,175 0.073 0.025 0.047 0.025 10 0.026 4,342 0.071 0.028 0.045 0.022 10 0.020 3,340 Kích thước 0.128 0.048 0.073 0.035 10 0.042 7,014 7,323 hạt 0.130 0.048 0.074 0.035 10 0.043 7,181 ±0,202 0.0098 inches 0.127 0.049 0.070 0.037 10 0.045 7,514 0.129 0.050 0.069 0.035 10 0.045 7,514 0.133 0.046 0.076 0.032 10 0.043 7,181 11