›

Đồ án Xác định phương pháp tinh sạch NPV (nuclear polyhedrosis virus)

pdf 87 trang thiennha21 12/04/2022 5490
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Xác định phương pháp tinh sạch NPV (nuclear polyhedrosis virus)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_xac_dinh_phuong_phap_tinh_sach_npv_nuclear_polyhedrosi.pdf

Nội dung text: Đồ án Xác định phương pháp tinh sạch NPV (nuclear polyhedrosis virus)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NPV (NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Trương Hùng Phong MSSV: 1151110260 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015 i
  2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN - - - - - - - - -- - - - - - - - - Tôi tên: Trương Hùng Phong Sinh ngày 17 tháng 09 năm 1993 Sinh viên lớp 11DSH04 - Công Nghệ Sinh Học - Trường ĐH Kỹ Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Tôi xin cam đoan : Đề tài "Xác định phương pháp tinh sạch NPV (Nuclera Polyhedrosis Virus)" do Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai hướng dẫn là đề tài của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây. Những thông tin tham khảo trong khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng. Tất cả những nội dung trong đồ án đúng như nội dung đề tài và yêu cầu của giáo viên hướng dẫn. Nếu có sai sót tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng. Sinh viên thực hiện Trương Hùng Phong i
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN - - - - - - - - -- - - - - - - - - Để hoàn thành đề tài này ngoại sự nổ lực, cố gắng của bản thân, em còn nhận được sự hỗ trợ rất nhiều từ nhiều người, tôi chân thành gửi lời "CẢM ƠN" tới : Con xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những người thân trong gia đình đã nuôi con khôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho con được học tập cho đến ngày hôm nay. Ngôi trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn năm học qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong cuộc sống. Ban chủ nhiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM đã trang bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để tôi thực hiện đề tài và làm tốt công việc sau này. Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai, đã tận tình hướng dẫn, cung cấp những tư liệu quý giá. truyền đạt kinh nghiệm và động viên tinh thần để em có thể hoàn thành đồ án của mình. Thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng phòng thí nghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM đã quan tâm, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài. Các bạn trong tập thể lớp 11DSH04 cùng tập thể các bạn cùng thực hiện trong phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh Học trường Đại học Kỹ Thuật Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh, các bạn đã luôn quan tâm, ủng hộ và động viên tinh thần giúp em vượt qua những khó khăn trong quá trình thực hiện đồ án. Em xin chân thành "CẢM ƠN" những sự giúp đỡ đó. ii
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu chung về sâu khoang (Spodoptera litura) 4 1.1.1. Phân bố 4 1.1.2. Ký chủ 4 1.1.3. Đặc điểm hình thái và sinh học 4 1.1.4. Tập tính sống và cách gây hại 8 1.1.5. Thiên địch và biện pháp phòng trừ 9 1.2. Khái quát về virus diệt côn trùng 11 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu virus diệt côn trùng 11 1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng virus diệt côn trùng trong đấu tranh sinh học 11 1.2.3. Hình thái và cấu trúc chung của virus 12 1.2.4. Những nhóm virus chính gây bệnh côn trùng 14 1.2.4.1. Nhóm Baculovirus (Baculoviridae) 14 1.2.4.2. Nhóm Cytoplasmic polyhedrosis virus - CPV (Reoviridae) 16 1.2.4.3. Nhóm iridovirut (iridoviridae) 16 1.2.4.4. Nhóm Densevirut (Parvoviridae) 17 1.2.4.5. Nhóm các virut RNA (picornaviridae) 17 1.2.4.6. Nhóm sigmavirut (Rhabdoviridae) 17 1.2.4.7. Nhóm ascoviridae 17 1.2.5. Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng 17 iii
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.5.1. Cấu trúc 18 1.2.5.2. Cơ chế gây bệnh của NPV 19 1.2.5.3. Phương thức lây truyền nguồn bệnh virus 21 1.2.5.4. Triệu chứng của bệnh virus trên sâu khoang 21 1.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực của virus và cách hạn chế khi sử dụng chế phẩm virus 23 1.2.5.5. Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ dịch hại . 24 1.3. Giới thiệu về phương pháp ly tâm 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28 2.2 Vật liệu 28 2.2.1 Dụng cụ 28 2.2.2 Hóa chất 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Thí nghiệm 1 :Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dịch gốc tới chất lượng của virus 29 2.3.1.1 Bố trí thí nghiệm 29 2.3.1.2 Tiến hành 30 2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định số vòng ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và các thể hòa tan 35 2.3.2.1 Bố trí thí nghiệm 35 2.3.2.2 Tiến hành 36 2.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định số vòng ly tâm lần thứ 2 để tinh sạch NPV 39 2.3.3.1 Bố trí thí nghiệm 39 2.3.3.2 Tiến hành 39 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 . Ảnh hưởng của dịch gốc đến hiệu quả nhân NPV trong sâu khoang 41 iv
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2 Xác định số vòng ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và các thể hòa tan 44 3.3 Xác định số vòng ly tâm lần 2 để tinh sạch virus NPV 52 3.4 Tối ưu hóa công thức ly tâm tinh sạch NPV 59 CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 4.1. Kết luận 62 4.2. Kiến nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 v
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT NPV Virus đa diện nhân (Nuclear Polyhedrosis Virus) SENPV Spodoptera exigua Nuclear Polyhedrosis Virus BVTV Bảo vệ thực vật DDT Thuốc trừ sâu (Dichloro diphenyl trichlorothane) EPN Tuyến trùng ký sinh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes) PPI Chất kiềm hãm sinh trưởng CT Công thức IPM Biện pháp phòng trừ dịch hại tổng hợp (Integrated Pest Management CPVs Virus đa diện tế bào chất (Cytoplasmic polyhedrosis viruses). IB Thể vùi (Inclusion Body) OB Thể vùi (Occlusion Body) PIB Thể vùi (Polyhedral inclusion body) DNP Deoxyribo Nucleo Protein PCA Plate Count Agar vi
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần công thức thức ăn nhân tạo 33 Bảng 3.1 Số sâu chết sau các ngày phơi nhiễm dịch NPV (con) 42 Bảng 3.2 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch NPV 43 Bảng 3.3 Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong dịch virus 43 Bảng 3.4 Tổng vi sinh vật hiếu khí trong dịch NPV sau khi li tâm lần 1 45 Bảng 3.5 Số PIB của dịch virus NPV ở các chế độ li tâm 47 Bảng 3.6 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch NPV 50 Bảng 3.7 Hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của dịch virus ở các công thức ly tâm 51 Bảng 3.8 Tổng vi sinh vật hiếu khí trong dịch NPV sau khi li tâm lần 2 53 Bảng 3.9 Số PIB của dịch virus NPV ở các chế độ li tâm 54 Bảng 3.10 Hiệu lực diệt sâu (%) của các công thức ở các ngày sau nhiễm 56 Bảng 3.11 Hiệu lực diệt sâu, tổng số vi sinh vật hiếu khí và số PIB của các CT ở các chế độ ly tâm 2 lần 58 Bảng 3.12 Hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của dịch virus 60 vii
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình1.1: Vòng đời sâu khoang 5 Hình1.2: Trứng sâu khoang 6 Hình1.3: Ấu trùng sâu khoang 7 Hình1.4: Nhộng sâu khoang 7 Hình1.5: Bướm sâu khoang 8 Hình1.6: Một số hình dạng của virus 13 Hình1.7: Cấu trúc của virus 14 Hình1.8: Cấu trúc của thể vùi (Kalmakoff et al,2003) 18 Hình1.9: Sâu khoang chết do nhiễm virus 22 Hình 2.1: Các bước tiến hành phương pháp đổ đĩa 32 Hình 2.2: A: Hộp nhựa 20x12x7 cm; B: Sau khi cho thức ăn nhân tạo; C: Sâu được nuôi trong thức ăn nhân tạo sau khi quét dịch virus 35 Hình 2.3: Buồng đếm hồng cầu 36 Hình 2.4: Cấu tạo buồng đếm hồng cầu 37 Hình 2.5: Quy tắc đếm bằng buồng đếm hồng cầu 38 Hình 2.6: Hình dáng virus trên buồng đếm hồng cầu (vật kính 40X) 39 Hình 3.1: Diễn biến số sâu chết qua các ngày phơi nhiễm 42 Hình 3.2: Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí của dịch virus NPV 46 Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA 46 Hình 3.4: PIB virus trong buồng đếm hồng cầu (vật kính 40X) 48 Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện lượng PIB trong dịch virus ở các CT ly tâm 48 Hình 3.6: Hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm 50 Hình 3.7: So sánh hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của các công thức .52 Hình 3.8: Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí của dịch virus NPV 53 Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện lượng PIB trong dịch virus NPV 55 viii
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.10: Sâu chết với các dấu hiệu đặc trưng của nhiễm virus 56 Hình 3.11: Diễn biến hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm 57 Hình 3.12: Diễn biến hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm 61 ix
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sâu khoang Spodoptera litura là đối tượng gây hại nghiêm trọng trên phạm vi toàn thế giới cũng như ở Việt Nam. Trong những năm gần đây sâu khoang xuất hiện khá phổ biến ở các ruộng rau màu tại địa bàn thành phố Hồ Chí Minh và các vùng lân cận. Phạm vi ký chủ của sâu sâu khoang khá rộng với trên 290 loài cây bao gồm cả cây thực phẩm, rau quả, cỏ dại và cây cảnh. Chúng tấn công trên lá, ăn hết phần thịt lá chỉ còn lại gân lá. Để phòng trừ sâu khoang thì biện pháp hóa học là biện pháp được sử dụng phổ biến hơn cả bởi tính tiện lợi, đơn giản, dễ sử dụng lại cho hiệu quả . Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học không hợp lý trong một thời gian dài và không đúng cách đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của sâu khoang, gây hậu quả nghiêm trọng tới môi trường quan trọng hơn hết còn là vấn đề sức khỏe của con người. Lượng thuốc hóa học còn tồn đọng trong nông sản sẽ gây ra những ảnh hưởng rất nghiêm trọng tới sức khỏe. Đứng trước thực trạng như hiện nay, thì việc nghiên cứu và tìm ra những tác nhân sinh học phòng trừ sâu khoang an toàn cho con người là một điều hết sức cần thiết. Trong số các tác nhân đã được nghiên cứu thì virus NPV được xem là có triển vọng vì hiệu lực diệt sâu cao, mức độ lây lan trong quần thể rộng và kéo dài lại không độc hại với con người và môi trường. Trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về virus NPV. Việc sản xuất NPV cho đến nay chủ yếu là lây nhiễm trên sâu ký chủ và thu nhận virus thông qua cơ thể sâu chết. Do vậy, dịch NPV thường bị tạp nhiễm cao bởi nhiều thành phần như da, thể mỡ và có cả các vi sinh vật khác. Các tác nhân này ảnh hưởng xấu đến chất lượng dịch gốc dùng để nhiễm sâu, hiểu quả sản xuất chế phẩm NPV cũng như việc bảo quản chế phẩm này. Tại Việt Nam, việc nghiên cứu quy 1
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP trình ly tâm tinh sạch NPV phục vụ cho sản xuất chế phẩm này vẫn chưa được quan tâm. Xuất phát từ thực tiễn trên sinh viên tiến hành nghiên cứu và thực hiện đề tài “XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus)”. 2. Tình hình nghiên cứu Đối với loài sâu khoang Spodoptera litura thì virus NPV được coi là tác nhân hứa hẹn nhất và cho kết quả tương đương với thuốc hóa học (Ravishanka and Venkatesha, 2010). NPV đã được quan tâm nghiên cứu và sử dụng ở Việt Nam từ đầu những năm 1980. Khởi đầu là việc nghiên cứu và sử dụng NPV để trừ sâu xanh hại bông của Viện nghiên cứu Bông và Viện bảo vệ Thực vật. Sau đó là SENPV trừ sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) trên bông, nho, hành tỏi cũng được phát triển khá mạnh và sử dụng rất hiệu quả. Các kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng NPV có hiệu lực trừ sâu tương đương hoặc cao hơn so với thuốc hóa học (Phạm Hữu Nhượng và CTV, 2005; Hoàng Thị Việt và ctv,1999, 2000; Ngô Trung Sơn, 2001; Nguyễn Văn Tuất, 2004). Chính vì vậy, virus NPV đã dành được nhiều mối quan tâm của các tác giả trong nước cũng như ngoài nước. Các nghiện cứu đều chỉ ra rằng NPV có hiệu lực gây chết rất cao trên sâu khoang. Sâu càng nhỏ mức độ mẫn cảm càng cao (Mohammad et al, 2002). Cụ thể Tran Thi Kieu Trang et al (2002) cho biết, sâu 2 ngày tuổi mẫn cảm gấp 1.500.000 lần so với sâu 8 ngày tuổi. Năm 2000, Monobrullah và Nagata nghiên cứu và cho biết, sản lượng NPV cao nhất khi sử dụng sâu 9 ngày tuổi (trọng lượng 125 – 155mg) để nhiễm virus. Và sau 7 ngày nhiễm sản lượng virus đạt cao nhất. Sâu gần chết thích hợp hơn để thu nhận virus so với sâu chết. Việc phối trộn NPV với nhiều sản phẩm khác như: thuốc trừ sâu, chế phẩm Neem, acid boric, rỉ đường sẽ làm tăng hiệu lực trừ sâu và rút ngắn thời gian ủ 2
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP bệnh do virus NPV. Rabindra và cộng sự (1997) cho biết phối hợp NPV (liều lượng 5 x 105 PIB/ml) + mật đường (1%) + dịch chiết neem (0,1%) cho hiệu quả diệt sâu khoang tăng hơn so với không trộn. Ngoài ra, nhằm kích thích sự ăn của sâu ký chủ hoặc tăng cường hiệu lực gây chết của virus thì các chất phụ gia cũng được cho thêm Bên cạnh các vần đề về việc tăng cường hiệu lực diệt sâu khoang của các virus NPV, sản xuất virus NPV, quy trình sản xuất tạo chế phẩm thì những vấn đề liên quan đến bảo quản chế phẩm virus NPV cũng đang được quan tâm. Các nghiên cứu đều cho rằng, hiệu lực của virus ảnh hưởng bởi thời gian và biện pháp bảo quản. Rodrigo Lasa và cộng sự (2008) cho biết, hiệu lực trừ sâu xanh da láng của virus SENPV bị giảm 16,67 lần sau 18 tháng bảo quản ở nhiệt độ 250C và hiệu lực không thay đổi nếu bảo quản virus ở điều kiện 40C và -200C. Nhóm tác giả cũng cho biết thêm, bổ sung các chất kháng khuẩn và chất chống oxy hóa có thể duy trì hiệu lực của virus trong vòng 18 tháng ở điều kiện bảo quản trong tủ lạnh. 3. Mục tiêu nghiên cứu - Tìm ra công thức ly tâm phù hợp nhằm làm giảm lượng vi sinh vật hiếu khí có trong dịch virus - Xác định công thức ly tâm phù hợp để thu nhận virus (số PIB) - Tối ưu hóa số vòng li tâm để tinh sạch virus NPV 4. Mục đích nghiên cứu Mục đích của đề tài là tìm ra được công thức ly tâm virus để loại bỏ tối đa lượng vi sinh vật hiếu khí bước đầu tinh sạch dịch NPV. 3
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về sâu khoang (Spodoptera litura) Tên khoa học: Spodoptera litura Họ: Ngài đêm (Noctuidae) Bộ: Cánh vẩy (Lepidoptera) 1.1.1. Phân bố Sâu khoang phân bố khắp nơi trên thế giới và gây hại nặng cho nhiều nước nhiệt đới như : Ấn Độ, Pakistans, Banglades, Srilanca, Indonesia, Philippin, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Úc, Hawaii, các nước Đông Nam Á. Ở Việt Nam sâu khoang hiện diện khắp nơi. 1.1.2. Ký chủ Sâu khoang là loài đa thực, chúng phá hoại trên 290 loài cây trồng thuộc 99 họ thực vật khác nhau. Gây hại phổ biến nhất trên đậu nành, bắp, cải xanh, cải bắp, rau muống và đậu phộng. Ngoài ra còn có trên ớt, cà chua, khoai lang, khổ qua và lúa non (Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh, 2001). Sâu non tuổi nhỏ thường gây hại nghiêm trọng nhất bởi vì hàng trăm con sâu non tập trung lại ăn lá cây và nhanh chóng làm lá cây xơ xác. Sâu non còn có thể gặm ăn vỏ quả làm giảm phẩm chất. 1.1.3. Đặc điểm hình thái và sinh học 4
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình1.1: Vòng đời sâu khoang Vòng đời trung bình 35 - 40 ngày, trong đó thời gian sâu non sống và phá hoại khoảng 20 - 25 ngày (Phạm Văn Biên et al., 2003). * Giai đoạn trứng Trứng có hình bán cầu, đường kính 0,4 - 0,5 mm. Bề mặt trứng có những đường dọc từ đỉnh trứng xuống đến đáy và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo thành những ô nhỏ. Trứng mới đẻ có màu trắng vàng, sau chuyển thành màu tro, lúc sắp nở có màu tro đậm. Ổ trứng có phủ lông từ bụng bướm mẹ. Sau khi đẻ khoảng 2 - 3 ngày trứng sẽ nở. 5
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình1.2: Trứng sâu khoang * Giai đoạn ấu trùng Sâu có 5 - 6 tuổi tùy điều kiện môi trường và phát triển trong thời gian từ 20 - 25 ngày. Sâu lớn đủ sức dài 35 - 53 mm, hình ống tròn. Sâu tuổi nhỏ có màu xanh lục, càng lớn sâu chuyển dần thành màu nâu đậm (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). Điểm đặc trưng nhất của ấu trùng sâu khoang là chấm đen ở đốt thân thứ nhất rất to, rõ gần như giao nhau tạo thành khoang do đó sâu còn được gọi là sâu khoang. Trên các đốt còn lại vẫn có chấm đen nhưng không lớn như ở đốt thứ nhất. Trên cơ thể sâu có 4 sọc màu vàng cam (2 sọc nằm trên lưng và 2 sọc nằm 2 bên hông). Ở mỗi đốt, lỗ khí khổng nằm ở bên hông và lớn dần theo tuổi của sâu. Sâu có phần bụng màu nhạt hơn phần lưng (Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh, 2001). Sâu non lột xác 5-6 lần, sâu tuổi nhỏ ăn biểu bì của lá, sâu tuổi lớn ăn cả thịt lá chỉ chừa lại gân lá. Khi mật độ sâu cao có thể làm cho lá rụng nhanh. Tuy nhiên sự gây hại thường không nghiêm trọng lắm do khả năng tự đền bù của cây. 6
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình1.3: Ấu trùng sâu khoang * Giai đoạn nhộng Nhộng dài 18 - 20 mm, màu nâu tươi hoặc nâu tối, hình ống tròn. Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Minh (2001), khi mới được hình thành nhộng sâu khoang có màu xanh đọt chuối, rất mềm sau đó chuyển dần sang màu vàng xanh, cuối cùng có màu nâu, thân cứng dần và có màu nâu đỏ. Khi sắp vũ hóa nhộng có màu nâu đen, các đốt cuối cùng của nhộng có thể cử động được. Thời gian nhộng là 7 ± 1 ngày. Hình1.4: Nhộng sâu khoang * Giai đoạn thành trùng 7
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bướm có chiều dài thân 20 - 25 mm, sải cánh rộng 35 - 45 mm. Cánh trước màu nâu vàng. Phần giữa từ cánh trước đến cánh sau có một vân ngang rộng, màu trắng. Trong vân trắng này có 2 vân màu nâu. Cánh sau màu trắng óng ánh. Bướm có đời sống trung bình từ 1 - 2 tuần tùy điều kiện thức ăn. Trung bình một bướm cái đẻ 300 trứng, nhưng điều kiện thích hợp bướm có thể đẻ từ 900 - 2000 trứng. Thời gian đẻ trứng trung bình của bướm kéo dài từ 5 - 7 ngày, đôi khi đến 10 hoặc 12 ngày (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). Hình1.5: Bướm sâu khoang 1.1.4. Tập tính sống và cách gây hại Bướm thường vũ hóa vào buổi chiều và bay ra hoạt động vào lúc vừa tối, ban ngày bướm đậu ở mặt sau lá hoặc trong các bụi cỏ. Bướm bay rất nhanh, có khi xa đến vài chục mét và cao đến 6 - 7 m. Sau khi vũ hóa vài giờ bướm có thể bắt cặp và một ngày sau thì đẻ trứng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). Bướm có xu tính thích các chất có mùi chua ngọt và ánh sáng bước sóng ngắn. Sâu khoang phá nhiều loại cây nên có mặt quanh năm trên đồng ruộng. Sâu cắn phá mạnh vào lúc sáng sớm nhưng khi có ánh nắng sâu chui xuống dưới tán lá để ẩn nắp. Chiều mát sâu bắt đầu hoạt động trở lại và phá hại suốt đêm. 8
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sâu khoang thường phát sinh phá hại nhiều trong điều kiện thời tiết ấm, ít nắng và nhiệt độ không cao lắm, khoảng 20 - 25oC (Phạm Văn Biên et al., 2003). Theo Nguyễn Đức Khiêm (2006), Sâu khoang là loài ưa điều kiện nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp nhất cho sâu sinh trưởng phát dục là 29 - 30oC và độ ẩm không khí thích hợp là trên 90%. Sâu vừa nở sống tập trung, nếu bị khua động nhẹ chúng có thể bò phân tán ra chung quanh hoặc nhả tơ buông mình xuống đất. Ở giai đoạn này sâu chỉ gặm mặt dưới lá, chừa biểu bì trên và gân. Sang tuổi 2 sâu bắt đầu phân tán và ăn gặm lá nhiều hơn. Từ tuổi 4 sâu bắt đầu có phản ứng rõ rệt đối với ánh sáng nên ban ngày sâu ẩn ở những nơi tối hoặc chui xuống kẻ đất nứt, ban đêm sâu leo lên cây. Ở tuổi lớn sâu có tập quán ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân cây, cành và trái non. Khi sắp làm nhộng sâu chui xuống đất làm thành một khoang và nằm yên trong đó hóa nhộng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). 1.1.5. Thiên địch và biện pháp phòng trừ * Thiên địch - Các loài ăn mồi: Bọ rùa, kiến, bọ xít ăn thịt, bọ cánh cứng. - Ong kí sinh: Cotesia prodeniae, Telenomus remus. - Vi khuẩn BT, virus NPV. * Biện pháp phòng trừ Biện pháp canh tác: Vệ sinh đồng ruộng, sau thu hoạch phải thu gôm các tàn dư cây trồng đem đốt hoặc ủ làm phân. Đất trước khi trồng cần phải được cày, phơi và xử lý thuốc trừ sâu hoặc cho ruộng ngập nước 2 - 3 ngày để diệt nhộng, sâu non có trong đất. Phải thường xuyên đi thăm ruộng để kịp thời phát hiện sâu nếu sâu phát sinh nhiều thì ban đêm có thể soi đèn để bắt, ngắt bỏ ổ trứng hoặc tiêu diệt sâu non mới nở khi chưa phát tán đi xa. Ngài sâu khoang có khuynh 9
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP hướng thích mùi chua ngọt và ánh sáng đèn, do đó có thể dùng bả chua ngọt để thu hút bướm khi chúng phát triển rộ. Biện pháp hóa học: Atabron được dùng làm nền phối hợp với các loại thuốc còn lại hoặc với các loại thuốc Cúc tổng hợp sẽ cho hiệu quả phòng trị rất tốt. Sâu khoang cũng rất dễ kháng thuốc, nên luân phiên nhiều loại thuốc để phun. Biện pháp Phòng trừ Dịch hại tổng hợp (IPM): - Vệ sinh đồng ruộng, tiêu diệt nhộng, phơi đất hay ngâm ruộng một thời gian. - Dùng hoa hướng dương hay các loài cây có thể dẫn dụ sâu khoang trồng xung quanh ruộng canh tác để dễ dàng tiêu diệt. - Hàng ngày theo dõi dự báo sự phát triển của sâu qua bẫy pheromone, thường xuyên ngắt bỏ ổ trứng và diệt ấu trùng trên những ruộng dẫn dụ. Biện pháp sinh học: Hiện nay có nhiều tác nhân đặc trưng được sử dụng để làm giảm mật độ sâu khoang nhưng bảo tồn thiên địch, một số tác nhân như chất điều hòa sinh trưởng côn trùng hoặc vi khuẩn Bt, các tác nhân này chỉ có hiệu quả trên ấu trùng rất nhỏ và cần áp dụng nhiều trên một thế hệ. Do đó pheromone giới tính được kết hợp sử dụng không chỉ làm giảm thành trùng mà còn để theo dõi sự xuất hiện của ấu trùng và dự đoán được sự nở của ấu trùng (Shinoda, 2001). Dùng sản phẩm sinh học có nguồn gốc nấm (Beauveria sp. và Nomureasp. ), vi khuẩn (vi khuẩn Bt), virus (NPV), protozoa, khi có những dấu hiệu cắn phá lá đầu tiên và thông thường 10 ngày sau phải phun thuốc lại 1 lần. Tuy nhiên vẫn chưa được áp dụng rộng rải do chi phí sản xuất cao, bảo quản còn khó khăn, và ảnh hưởng của yếu tố môi trường và sinh vật và còn ngần ngại vì đưa ra một tác nhân lạ có thể gây rủi 10
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ro như tác động môi trường và chuyển gen vào các sinh vật bản địa (Munoz et al., 1997). 1.2. Khái quát về virus diệt côn trùng 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu virus diệt côn trùng Lịch sử cổ đại đã ghi nhận những phát hiện về bệnh do virus trên tằm dâu và ong khi con người bắt đầu nuôi dưỡng hai loài côn trùng có ích này để phụ vụ đời sống. Năm 384 - 322 trước công nguyên Aristolte đã miêu tả bệnh của ong, tuy nhiên người Trung Quốc đã có những quan sát về bệnh tằm dâu từ 2.700 năm trước Công Nguyên (Tanada và Kaya, 1993). Sau đó năm 1856 hai nhà khoa học trên thể giới là Cornilia và Maestri đã mô tả thật kỹ lưỡng bệnh này trên tằm nghệ. Chính hai nhà khoa học này đã tìm thấy thể đa diện trên cơ thể tằm. Tuy nhiên, vào năm 1898 Bolle lại là người đầu tiên phát hiện ra sự hòa tan thể đa diện (thể vùi) trong ruột tằm và giải phóng ra các hạt virus nhỏ (thể siêu vi). Tiếp sau đó Akkva (1919), Komarek và Breindl (1924) đã tiến hành lọc chất dịch từ tằm và sâu róm (Lymmantria monacha) bị bệnh và khẳng định bản chất virus của các bệnh tạo nên thể đa diện ở côn trùng. Người đầu tiên nhìn thấy virus gây bệnh côn trùng là Bergold trong những công trình công bố 1943-1947 sau khi có kính hiển vi điện tử. 1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng virus diệt côn trùng trong đấu tranh sinh học Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các virus nhân lên ngay trong nhân hoặc trong chất nguyên sinh của tế bào, phá huỷ các mô và làm cho vật chủ chết. Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài vũ hoá bị biến dạng), trong giai đoạn ngài (khả năng đẻ trứng giảm) và ảnh hưởng tới 11
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP các thế hệ sau. Nguồn virus tồn đọng trong tự nhiên lại gây lây nhiễm cho các thế hệ mới. Trên cơ sở khoa học này, virus gây bệnh côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp đấu tranh sinh học phòng chống sâu hại cây trồng trong tương lai. Năm 1923, Tanaka và Kaya đã miêu tả hơn 20 nhóm (họ) virus gây bệnh cho côn trùng. Trong đó 2 họ được nghiên cứu nhiều là Baculoviridae và Reoviridae. Đại diện của họ Baculoviridae là virus đa diện nhân (NPV- Nuclear polyhedrosis viruses) và đại diện của họ Reoviridae là virus đa diện tế bào chất (CPV - Cytoplasmic polyhedrosis viruses). Theo Hukuhara và Bonami (1991) thì CPVs ký sinh trong 4 bộ côn trùng hay gặp nhất là bộ cánh vảy - Lepidoptera có 201 vật chủ, bộ hai cánh - Diptera - 39 vật chủ Mặc dù thuốc CPV có hiệu quả diệt sâu, nhưng người ta vẫn ít quan tâm để phát triển nó hơn Baculovirut, vì lí do chủ yếu là CPVs chỉ tấn công tế bào biểu mô ruột của sâu và có xu hướng gây ra nhiễm trùng mãn tính. Hơn nữa trong điều kiện tự nhiên, chúng gây bệnh dịch với tỷ lệ thấp và ít ảnh hưởng tới quần thể vật chủ như Baculovirut. Tuy nhiên chúng có thể nhân nuôi theo qui mô lớn trong công nghiệp. Theo các tác giả Tanada và Kaya (1993), có hơn 600 loài sâu thuộc bộ Lepidoptera, Hymenoptera, Coleoptera, Diptera là vật chủ của Baculovirut. Do đó có rất nhiều nghiên cứu và sản xuất thuốc trừ sâu virus tập trung vào nhóm virus này. Hầu hết Baculovirus thuộc tính chuyên hoá cao, chỉ ký sinh trong một loài sâu, thậm chí ký sinh một số mô nhất định nào đó của sâu. Những tác động có hại của Baculovirus đối với thiên địch và các ong kí sinh trưởng thành chưa được phát hiện trong tự nhiên (Groner, 1990). 1.2.3. Hình thái và cấu trúc chung của virus 12
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tất cả các virus đều có cấu tạo gồm hai thành phần cơ bản: lõi là acid nucleic (tức genome) và vỏ là protein gọi là capsid bao bọc bên ngoài để bảo vệ acid nucleic. Capsid bao gồm nhiều capsomer. Phức hợp bao gồm acid nucleic và vỏ capsid gọi là nucleocapsid. Genome của virus có thể là AND hoặc ARN, sợi đơn hoặc sợi kép. Một số loại virus có màng bao (envelop). Virus có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau. Hình thái của virus do vỏ capsid qui định. Vỏ capsid có kích thước và cách sắp xếp khác nhau khiến cho virus có hình dạng khác nhau. Hình1.6: Một số hình dạng của virus (Presscott L. M. et al. , Microbiology. 6th ed. Intern. Ed. 2005) Khi có bộ gen trong vỏ capsid thì gọi là virion hoặc là hạt virus. Vậy virion là hạt virus đầy đủ về hình thái, nó có thể là một nucleocapsid có vỏ bọc gọi là virus có vỏ, hoặc là một nucleocapsid trần gọi là virus không vỏ 13
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình1.7: Cấu trúc của virus 1.2.4. Những nhóm virus chính gây bệnh côn trùng Phân loại virus hại côn trùng gắn liền với lịch sử phát minh và những cấu trúc đặc trưng của chúng. Virus ký sinh trên vật chủ riêng biệt cho nên tên của virus được gắn với tên của ký chủ. Ví dụ, virus đa diện nhân của sâu xanh đục quả có tên virus đa diện nhân Helicoverpa armigera, viết tắt là HaNPV Virus côn trùng được phân thành 14 nhóm. Mỗi nhóm được miêu tả như một “họ” mặc dù phân loại virus côn trùng vẫn đang phát triển, đặc biệt là các đặc điểm hóa sinh, cho nên việc phân nhóm này không nên coi như là một quyết định cuối cùng. 1.2.4.1. Nhóm Baculovirus (Baculoviridae) Nhóm Baculovirut này được nghiên cứu rất kỹ do khả năng diệt sâu của chúng. Hơn nữa, gần đây những nghiên cứu về vai trò của vectơ biểu hiện đối với một số gen có hoạt tính sinh học. Đặc điểm cơ bản của Baculovirus thuộc họ này là có mặt một sợi đôi DNA trong hệ gen (genome) của chúng. Cho tới nay người ta đã xác định bệnh do nhóm virus này gây ra ở côn trùng thuộc 6 bộ sau: 14
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Lepidoptera - Bộ cánh vẩy - Diptera - Bộ hai cánh - Coledoptera - Bộ cánh cứng - Hymenoptera - Bộ cánh màng - Orthoptera - Bộ cánh thẳng - Neuroptera - Bộ cánh mạch Theo Jayaraj (1985) có khoảng 300 mẫu virus phân lập ở bộ cánh vảy, cánh màng và bộ hai cánh. Baculovirus bao gồm một vỏ lipoprotein bao quanh 1 protein lõi DNA (Nucleocapsid). Các virion được bao bọc một tinh thể dạng lưới có bản chất protein được gọi là thể vùi (Inclusion Body - IB). Hệ gen của Baculovirut bao gồm một sợ đôi DNA vòng với trọng lượng phân tử từ 50 - 100 x 106. Theo Kelly (1985), Baculovirus bao gồm một số loại sau: - Virus đa diện nhân (Nuclear polyhedrosis virus - NPV) là virus gây bệnh cho côn trùng có thể protein hình khối đa diện, trong chứa nhiều hạt virus (virion) hình que. - Virus hạt (Granulos virus - GV) là virus có thể protein dạng hạt hoặc dạng viên, trong chỉ chứa 1 virion, rất hiếm khi có hai virion. Virion hình que, chúng xâm nhiễm chủ yếu vào tế bào lớp hạ bì, mô mỡ và huyết tương. Nuclear polyhedrosis virus (NPV) và Granulosis virus (GV) với virion có các thể vùi (PIB) dạng protein tinh thể được gọi là polyhedral và granulin. - Virus có các thể protein khác nhau và cũng chứa các virion. - Virus không tạo thành thể vùi hoặc rất mỏng (virus không thể tạo thể protein). 15
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Triệu chứng sâu bị nhiễm bệnh do NPV: Sâu bị bệnh do NPV trở nên ít hoạt động, ngừng ăn. Cơ thể chúng có màu sắc trắng hơn hoặc vàng hơn ở vùng ruột. Cơ thể căng phồng, trương phù, chứa nhiều nước. Sau khi chết thân sâu chuyển từ màu nâu sang màu đen, da dễ bị nứt vỡ khi có tác động cơ học, dịch virus giải phóng ra ngoài có mùi rất thối. 1.2.4.2. Nhóm Cytoplasmic polyhedrosis virus - CPV (Reoviridae) Nhóm virus đa diện tế bào chất (CPV) gây bệnh cho hơn 200 loài côn trùng, chủ yêu đối với bộ Lepidoptera và Diptera. Virus trong họ Reoviridae có đặc điểm hình thái giống virus của NPV, nhưng chúng khác ở chổ chúng chứa sợi đôi RNA trong bộ gen. CPV tạo thành các thể protein chứa các virion hình cầu có đường kính 50 - 65 nm (hoặc 68 - 69 nm). Các virion có một số gai ở đỉnh với chiều dài 20 nm. Trong thể vùi có thể bao gồm một hay nhiều virion. Mạng lưới protein của thể vùi phần lớn chỉ có một polypeptide, trọng lượng phân tử là 25.000 - 31.000 kDa. Trong bộ gen của virus CPV có sợi đôi RNA gồm 10 đoạn có trọng lượng phân tử 0,34 - 2,59 x 106. Người ta cho rằng mỗi đoạn có một gen. Dựa trên cơ sở phân đoạn của bộ gen, có ít nhất 12 loại (tip) của CPV được phân loại. Triệu chứng sâu chết do CPV: biểu hiện kém ăn, còi cọc, đôi khi phần đầu quá to so với cơ thể, ở giai đoạn cuối cùng của bệnh, màu sắc cơ thể sâu bị biến đổi, thường trở nên trắng hoặc vàng. Những triệu chứng khác bao gồm sự phát triển kéo dài và giảm ăn dẫn đến chết. 1.2.4.3. Nhóm iridovirut (iridoviridae) Đặc điểm chủ yếu của nhóm này là phát ngủ sắc từ màu xanh, xanh lam, đến màu tím trong các cá thể bị nhiễm. Các virion, bao gồm một lõi sợi đôi DNA, kích thước từ 130 - 180 nm và khi được sắp xếp trong dãy tinh thể thì biểu hiện phát màu ngũ sắc đặc 16
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP trưng của nhóm này. Có ít nhất 32 typ của nhóm iridoviridae được phát hiện dựa trên kích thước và mối quan hệ huyết thanh. 1.2.4.4. Nhóm Densevirut (Parvoviridae) Người ta mới phát hiện densevirut chỉ có ở trên loài côn trùng: Galleria mellonella, Junoia coenia và Agraulis vanillae. Virion chứa sợi đơn DNA có trọng lượng phân tử từ 1,6 - 2,2 x 106. Densovirut là những virus nhỏ nhất có đường kính khoảng 18 - 26 nm. Dựa trên cơ sở hình thái các virion và triệu chứng nhiễm bệnh, nhóm này chia thành typ 1 (nhiễm bệnh và chết nhanh) và typ 2 (chỉ nhiễm trong ruột và chết tương đối chậm). 1.2.4.5. Nhóm các virut RNA (picornaviridae) Nhóm virut có sợi đơn RNA này có hạt virut kích thước 20 - 30 nm. Phần lớn các virut RNA được tách chiết từ nhiều loại côn trùng, chúng ký sinh trong tế bào chất và biểu mô tế bào ruột không tạo thể vùi. Người ta nhận thấy sự giống nhau của virut này với picornavirut, đặc biệt giống Enterovirut ký sinh ở động vật có xương sống. 1.2.4.6. Nhóm sigmavirut (Rhabdoviridae) Virut sigma là một tác nhân gây nhiễm di truyền có mặt thường xuyên trong quần thể sâu Drosophila melanogaster. Các hạt virut hình gậy với kích thước 75 x 200 nm với các gai trên bề mặt có chiều dài 8nm. Triệu chứng duy nhất đối với virut này là sự mẫn cảm của các ruồi dấm trưởng thành với CO2. 1.2.4.7. Nhóm ascoviridae Virut thuộc nhóm này có bộ gen gồm một sợi đôi DNA không có thể vùi. Hạt virion có kích thước 130 x 400 nm có cấu trúc phức tạp. Virut chỉ ký sinh trong côn trùng thuộc bộ cánh vảy - Lepidoptera. Nhóm virut này gây bệnh kém. 1.2.5. Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng 17
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NPV thuộc nhóm Baculovirus, họ Baculoviridae, nên nó mang những đặc điểm cấu tạo đặc trưng của họ này. NPV có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau. Các axit nucleic (ADN, ARN) gồm dạng sợi đơn và sợi đôi. 1.2.5.1. Cấu trúc Hình1.8: Cấu trúc của thể vùi (Kalmakoff et al,2003) Kelly (1985) cho rằng, virus có dạng hình que, kích thước từ 35 - 50 nm x 200 - 320 nm có một hoặc nhiều nucleocapsid được bao bọc bởi một lớp vỏ capsid, nếu là một nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn - Single Nucleocapsid (NPV - SNPV), nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein (gọi tắc là Deoxyribo Nucleo Protein - DNP). Thể vùi đa diện là những khối kết tinh có nhiều cạnh, có dạng gần giống như hình cầu. Phân tử DNA gồm hai sợi có dạng vòng, dài khoảng 40 µm (Burgess, S., 1977) 18
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một phân tử DNA, phân tử DNA có chiều dài gấp 2 - 3 lần chiều dài nucleocapsid (Skuratovskaya et al, 1977). * Cấu tạo deoxyribo nucleo protein (DNP): Theo kết quả nghiên cứu của Bud, H.M et al (1977) DNP được tạo thành do sự kết hợp giữa DNA và protein, sự kết hợp này không đồng nhất. Đường kính DNP đo được 32 nm. DNP ở trong capsid được sắp xếp chắc chắn, gọn gàng. * Cấu tạo của nucleocapsid: Nucleocapsid có dạng hình que, dáng hơi cong, đường kính 40 nm, dài 350 nm, có màng bọc bên ngoài (capsid). Nucleocapsid bao gồm hai loại protein, đó là một lõi DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8 polypeptid nhỏ (Summer, M.D et al, 1978). * Cấu tạo của thể virus: Thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc, mỗi vỏ bao có thể có một hoặc nhiều nucleocapsid, có loại có tới 30 nucleocapsid. Lớp vỏ bao gồm có lipid, trong vỏ còn có 8 - 10 polypeptid (Harrap, K.A., 1972., Kelly, D.C., 1982, 1985). * Cấu tạo của khối đa diện (polyhedra): Theo Crook, N.E. et al (1982) thì polyhedra là những khối kết tinh lớn, kích thước từ 1 - 4 µm, có dạng hình vuông hoặc gần như hình cầu, bên trong có chứa nhiều hạt virus, có khi lên tới 100 hạt, bao quanh các virus đó là mạng lưới kết tinh hình mắt cáo. Polyhedra còn bao gồm nhiều polypeptide. Protein polyhedron có trọng lượng phân tử thay đổi từ 27.000 - 34.000 million , phụ thuộc vào loại virus (Bergold, G.H., 1963 Harrap, K.A., 1972). Polyhedra có đặc điểm là ổn định ở pH trung tính, pH kiềm 9,5 trở lên sẽ làm nó bị hòa tan (Faust, R.M. et al ,1966). 1.2.5.2. Cơ chế gây bệnh của NPV 19
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sau khi NPV vào cơ thể ký chủ côn trùng bằng đường tiêu hoá, sâu non ngừng ăn. Cơ thể sâu biến đổi về màu sắc. Sau 1-2 ngày cơ thể sâu căng phồng, mọng nước. Cơ thể có màu vàng hoặc trắng. Hạ bì dễ bị nứt, chuyển động chậm, chết nhanh. Ngoài đồng ruộng sâu chết do virut thường quan sát thấy đầu chúc xuống dưới, dịch trắng chảy ra ngoài Theo Phạm Thị Thùy (2004) khi thức ăn có chứa virus NPVs vào ruột sâu non, cũng như Bacillus thuringiensis bằng con đường tiêu hóa virus đã thực hiện quá trình hủy toàn bộ chức năng của sâu làm sâu chết. Cơ chế được mô tả như sau: khi vào ruột các thể vùi PIB của virus sẽ giải phóng ra các virion, dưới tác dụng của dịch tiêu hóa, qua biểu bì mô ruột giữa, các virion xâm nhập vào dịch huyết tương, chúng tiếp xúc với các tế bào và xâm nhập vào bên trong để thực hiện quá trình gây bệnh cho sâu hại, quá trình này trải qua 3 giai đoạn: - Giai đoạn tiềm ẩn: kéo dài từ 6 - 12 giờ, đây là giai đoạn xâm nhập của các thể vùi polyhedral inclusion body xâm nhập vào trong tế bào, các virion được phóng thích ra, chúng tự đính vào các vị trí thích hợp trên màng nhân tế bào thành ruột của sâu. - Giai đoạn tăng trưởng (sinh sản): kéo dài 12 - 48 giờ, đây là giai đoạn tăng nhanh của các virion mới trong dịch ruột của sâu. Đối với sâu tuổi nhỏ chỉ sau 32 giờ trong cơ thể sâu đã chứa đầy các virion trần. - Giai đoạn cuối: đây là giai đoạn tạo thể vùi tức là các thể virion được bao bọc trong thể protein, côn trùng trong giai đoạn này có màu sáng bóng, màu sắc nhạt và đôi khi có màu hồng. Sự phân giải tế bào và sự phân giải của mô cơ thể bắt đầu ngay sau khi virus tạo thể vùi. Thời kỳ ủ bệnh của các côn trùng bị bệnh thường kéo dài từ 3-12 ngày. Sâu tuổi nhỏ chết trong khoảng 3 - 5 ngày sau khi ăn phải thức ăn bị nhiễm virus. Nhưng sâu 20
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tuổi lớn thời gian ủ bệnh từ 4 - 6 ngày, có khi dài hơn phụ thuộc vào tuổi của vật chủ, lượng thức ăn lây nhiễm, nhiệt độ, độ ẩm và các điều kiện khác của môi trường. Hết thời kỳ ủ bệnh, sâu đã bị nhiễm bệnh hoàn toàn, cơ thể yếu dần rồi chết. Ngay sau khi sâu chết sâu trở nên mềm nhũn, da bị vỡ và giải phóng ra hàng tỷ thể vùi bám trên các bộ phận của cây trồng, đó là nguồn virus lan truyền sang cá thể khác. 1.2.5.3. Phương thức lây truyền nguồn bệnh virus Phần lớn các thể vùi của NPV được giải phóng từ cơ thể sâu bị bệnh đã rơi xuống đất hoặc bám trên các bộ phận của thực vật tạo thành những nguồn virus lan truyền bệnh. Theo Chu Thị Thơm el al. (2006), việc lây truyền nguồn bệnh virus ở côn trùng xảy ra theo 2 hướng: Lây truyền ngang: nguồn bệnh lây lan giữa các cá thể trong cùng một thế hệ trong điều kiện bệnh phát thành dịch, nguồn virus có thể bám bên ngoài vỏ trứng của vật chủ. Khi nở, ấu trùng gặm vỏ trứng chui ra và bị nhiễm nguồn bệnh. Lây truyền dọc: là sự truyền bệnh qua trứng (qua phôi). Nhưng virus không tạo thành thể vùi cũng có thể truyền bệnh qua trứng. Ngoài ra, virus còn có thể nhiễm trực tiếp vào dịch máu qua các vết thương trên cơ thể như vết chọc đẻ trứng của ong kí sinh, lỗ xâm nhiễm của một số ấu trùng kí sinh vào bên trong cơ thể. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu đang được thực hiện để chứng minh rằng virus có thể sống tiềm ẩn bên trong trứng của kí chủ để tạo ra khả năng lây bệnh hàng dọc. 1.2.5.4. Triệu chứng của bệnh virus trên sâu khoang Theo mô tả của Jayarasjs (1985): 21
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Trong thời gian 2-3 ngày đầu của thời kỳ ủ bệnh, sâu non bị nhiễm bệnh không có biểu hiện triệu chứng bệnh rõ rệt và không có sự thay đổi về sức ăn. - Các ngày sau, các đốt thân của sâu non căng phồng và mọng nước dần, sâu chuyển động nhiều. - Cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục, da bở, dễ bị vỡ. - Trước khi chết sâu thường trèo lên ngọn cây, bám chân vào cành cây chúc đầu xuống phía dưới. - Dịch trắng chảy ra ngoài và sâu chết. - Dịch trắng không có mùi hôi. - Thời gian từ khi cơ thể mọng nước đến khi sâu chết không quá 1 ngày. Hình1.9: Sâu khoang chết do nhiễm virus ( Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001), từ việc khảo sát những mẫu sâu thu được ở điều kiện ngoài đồng và trong phòng thí nghiệm ghi nhận các triệu chứng như sau: - Dạng 1: Sâu có màu trắng sang đôi khi vàng hồng, cơ thể căng phồng lên, da dễ vỡ và dịch màu sữa không có mùi hôi. 22
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Dạng 2: Sâu có màu đen, thân căng, da vỡ, dịch màu cà phê sữa, không hôi hoặc có mùi hôi. - Dạng 3: Sâu màu nâu đen hoặc đen, cơ thể căng phồng, da không vỡ chỉ rách ở các ngắn trên thân, dịch màu nâu đen, không có hoặc có mùi hôi. Nhộng sâu khoang bị nhiễm SpltNPV thường bị méo mó, chảy nước màu vàng, rất mềm, dễ bị nhũn. Một số nhộng bị nhiễm có thể chết hoặc vũ hóa thì khả năng sinh sản giảm và truyền virus sang trứng (Nguyễn Thị Diễm Trang, 2008). 1.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực của virus và cách hạn chế khi sử dụng chế phẩm virus Tia cực tím của ánh sáng mặt trời là yếu tố quan trọng làm giảm hiệu lực của NPV (Phạm Thị Thùy, 2004). Hầu hết những virus hiện diện trên lá sẽ bị bất hoạt trong vòng vài ngày, nếu bị chiếu sáng trực tiếp liên tục thì có thể bị bất hoạt chỉ trong vòng vài giờ (Evan, 1986). Người ta cũng phát hiện ra tia sáng có bước sóng ngắn 215-216 nm có khả năng khử hoạt tính PIB của NPV. Ignoffo, C.M. et al (1971) đã phát hiện : Dưới tác dụng của ánh nắng mặt trời, thể vùi đa diện bị khử hoạt tính là do các peroxide hoặc các gốc peroxide sản sinh từ các amino acid bị chiếu bức xạ bởi tia X. Điều đó cho thấy sau khi phun càng nhiều ngày, hiệu lực của NPV trên cây càng giảm. Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu lực của NPV. Nhiệt độ cao rất dễ làm giảm hoạt tính của virus. Kobayashi et al. (1981) đã tiến hành trên chủng nhộng của con tằm (Bombyx mori) với NPV và quan sát chúng ở các nhiệt độ khác nhau. Kết quả những con nhộng được chủng NPV khi được ủ ở 35oC thì sống lâu hơn những con nhộng được ủ ở 25oC. Johnson et al. (1982) cũng thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ cao lên loài Anticarsia gemmatalis, kết quả cho thấy ở nhiệt độ trên 32oC làm chậm tiến trình bệnh của ký chủ. Ở 40oC, tất cả các con sâu đều không phát triển bệnh. 23
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Knittel and Faibrother cũng đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH lên NPV của loài Autographa californica đã chỉ ra rằng virus bị bất hoạt ngay lập tức ở pH = 2, và bị bất hoạt trong vòng 1 giờ ở pH = 4. Virus bị suy yếu ở pH = 5 và sống sót ở pH = 6. Ngoài ra, trong quần thể sâu hại tự nhiên côn trùng không chỉ bị một bệnh do một loại virus gây ra mà còn bị nhiễm bệnh hỗn hợp của 2 loại virus. Thông thường đó là hỗn hợp giữa NPV và CPV. Tác động qua lại giữa các virus trong quá trình nhiễm bệnh biểu hiện theo ba kiểu: Đồng tác động, tác động không phụ thuộc vào nhau và tác động gây nhiễu cho nhau. Khi có hiện tượng đồng tác động các virus trong cùng một cơ thể vật chủ sẽ làm tăng tỷ lệ chết của sâu và rút ngắn thời gian gây chết xuống 50%. Ngược lại hiện tượng tác động nhiễu làm giảm hiệu lực gây bệnh của virus và làm giảm hiệu quả của chế phẩm. Vì vậy chế phẩm NPV không được dùng trong quần thể sâu hại có bệnh CPV vì giữa hai nhóm này thường có tác động nhiễu lên nhau. 1.2.5.5. Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ dịch hại Ưu Điểm: - Hiệu lực diệt sâu của NPV tương đương như thuốc hóa học nhưng không độc hại cho người và gia súc, thân thiện với môi trường. - Không làm mất đi những nguồn tài nguyên sinh vật có ích như các loại ký sinh thiên dịch và những vi sinh vật có lợi với con người. - Chưa tạo nên tính kháng thuốc của sâu hại. - Không ảnh hưởng đến chất lượng, phẩm chất nông sản, không ảnh hưởng đến đất trồng, không khí trong môi trường. 24
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Nếu sử dụng hợp lý, đúng phương pháp, đúng kỹ thuật trong điều kiện nhiệt độ thích hợp sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao. - Hiệu quả thuốc vi sinh thường kéo dài vì chúng không chỉ tiêu diệt trực tiếp lứa sâu đang phá hoại mà chúng còn có thể lan truyền cho thế hệ tiếp theo. - Hiệu lực diệt sâu của virus là không thay đổi theo thời gian. Nhược Điểm: - Chế phẩm virus rất khó bảo quản, chúng đòi hỏi điều kiện môi trường phải thích hợp để giữ chúng ở trạng thái nghỉ, đồng thời sản phẩm rất dễ bị nhiễm vi khuẩn gây thối. - So với thuốc hóa học thì hiệu lực trừ sâu của virus chậm hơn nhiều. Nông dân muốn rằng sau khi phun thuốc thì sâu phải bị tiêu diệt ngay do đó chế phẩm virus chưa được người dân ưa thích sử dụng. - Phổ tác dụng của thuốc hẹp nên gặp khó khăn về vấn đề thương mại. Thường trên cùng một mùa vụ có nhiều loài dịch hại cùng xuất hiện, sẽ rất tốn kém nếu phải dùng mỗi loại thuốc cho một loài dịch hại riêng biệt. Hơn nữa việc sản xuất chế phẩm virus cũng khó khăn hơn thuốc hóa học vì virus phải được nuôi từ cơ thể sống, chúng không thể phát triển trong môi trường nhân tạo do đó giá thành sản phẩm sẽ tăng lên. - Do là tác nhân sinh học nên Baculovirus dễ bị mất tác dụng khi điều kiện ngoài đồng không thích hợp (nhiệt độ, độ ẩm, ) do đó việc sử dụng chúng không thuận lợi bằng thuốc hóa học - NPV có công nghệ sản xuất phức tạp thủ công nên giá thành cao nên giá thành cao ở Việt Nam. 1.3. Giới thiệu về phương pháp ly tâm 25
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ly tâm là quá trình sử dụng lực ly tâm để phân riêng các cấu tử có khối lượng riêng khác nhau, thường là tách pha lỏng và pha rắn trong dịch huyền phù. Động lực của quá trình này là lực ly tâm và yếu tố khác biệt để phân riêng là khối lượng riêng. Sự khác biệt khối lượng riêng càng lớn thì quá trình phân riêng được thực hiện càng dễ dàng. Trong công nghệ vi sinh, phương pháp ly tâm thường được sử dụng để tinh sạch, thu sinh khối sinh vật hay thu nhận sản phẩm lên men. Riêng đối với dịch gốc NPV việc tinh sạch bằng phương pháp ly tâm có ý nghĩa rất quan trọng trong việc sản xuất chế phẩm sau này. Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến việc sản xuất virus kém hiệu quả là sử dụng nguồn dịch gốc kém chất lượng, không tinh khiết. Virus được thu nhận từ cơ thể sâu ký chủ có thể chứa tới 90% chất gây ô nhiễm và chỉ chứa 10% là virus. Vì vậy, dịch virus cần được ly tâm tinh sạch trước khi được đưa vào sản xuất hạn chế sự nhiễm bẫn các mầm bệnh như nấm, vi sinh vật, GV (Grzywacz et al, 2011). Grzywacz cũng cho biết thêm, việc ly tâm tốt sẽ giúp loại bỏ vi khuẩn, protein, chất béo cơ của cơ thể côn trùng và các chất ô nhiễm khác (chất thải của côn trùng,da ). Chính các tác nhân này là nguyên nhân gây ra mùi hôi, và ảnh hưởng đến hiệu quả diệt sâu của virus. Phương pháp ly tâm tinh sạch virus sẽ phụ thuộc vào tính chất và độ tinh khiết của dịch gốc. Trên thế giới đã có nhiều tác giả đưa ra nhiều phương pháp ly tâm khác nhau. Ignoffo (1992) cho biết NPV cần trải qua hai lần ly tâm để tinh sạch, ly tâm lần một với vận tốc 500 vòng/phút trong vòng 5 phút thu phần dịch nổi, loại bỏ cặn. Lần hai tiến hành 12000 vòng/phút trong 5 phút thu phần cặn. Jiang jie - Xian và Liu Juin - Jun (2002) cho rằng có thể loại bỏ xác sâu và các thể tan trong dịch NPV bằng cách ly tâm hai lần, lần một 1000 vòng/phút trong vòng 10 phút và lần hai 7000 vòng/phút trong vòng 25 phút. Cũng với chế độ ly tâm này Sanfeev et al (2005) thực hiện để thu nhận OB của Hyblaea puera NPV. 26
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cũng với hai lần ly tâm, Kao và Meher (2004) đã thu nhận PIB của virus trên Helicovespa armigera NPV với tốc độ quay lần lượt 1000 vòng/phút trong vòng 1 phút và 5000 vòng/phút trong vòng 15 phút. Flávío et al (1997) cũng làm sạch virus bằng cách li tâm 2 lần , lần 1 ở 1500 vòng phút/ 2 phút và lần ở 7000 vòng/ phút trong 20 phút. Khác với các tác giả ở trên, S. Arivudainambi et al (2000) thu nhận NPV của S.litura bằng cách ly tâm 1 lần ở 6000 vòng/ phút trong 15 phút bỏ dịch nổi, thu cặn. Kieu Trang et al (2002) cũng chỉ ly tâm 1 lần với vận tốc 6000 vòng/phút nhưng kéo dài tới 1 giờ. Ly tâm trong vòng 5 phút với vận tốc 12000 vòng/phút là phương pháp tinh sạch virus NPV của Sasumu Maeda et al (1990). 27
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ ngày 25/5/2015 đến ngày 17/8/2015, tại phòng thí nghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học của trường Đại Học Công Nghệ TP HCM. 2.2 Vật liệu 2.2.1 Dụng cụ - Hộp nuôi sâu - Đĩa petri - Panh, chổi lông bắt sâu - Cân điện tử - Máy xay sinh tố - Các loại cốc thủy tinh - Các loại pipep - Đầu túyp - Ống nghiệm - Bút long ghi mẫu - Bông gòn, khăn giấy - Ống falcon, eppendorf - Bao nhựa, giấy báo - Đèn cồn Thiết bị - Kính hiển vi - Buồng đếm hồng cầu 28
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Tủ lạnh - Máy ly tâm - Nồi hấp khử trùng - Bếp từ - Bể ủ 2.2.2 Hóa chất - Acid ascorbic - Acid sorbic - Cồn 700, 960 - Methyl paraben - Men mì - Tinh bột tan - Agar - Môi trường tổng hợp PCA (Plate Count Agar) 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dịch gốc tới chất lượng của virus 2.3.1.1 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 3 CT được bố trí như sau: CT1: Ly tâm một lần ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch, bỏ cặn (Arivudainambi et al,2000) CT2: Ly tâm hai lần, lần 1 500 vòng/phút trong 5 phút thu dịch bỏ cặn, lần 2 ly tâm 5000 vòng/phút trong vòng 15 phút, thu cặn bỏ dịch (Theo khuyến cáo của ngành nông nghiệp Ấn Độ). 29
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CT đối chứng (Không ly tâm). 2.3.1.2 Tiến hành Chuẩn bị dịch gốc virus NPV: NPV được phân lập bằng cách sử dụng sâu tuổi 4 để nhiễm virus bằng phương pháp nhiễm bề mặt trên thức ăn nhân tạo và để ở nhiệt độ phòng cho đến khi sâu chết. Thu sâu chết và cho vào trong lọ (1 sâu/ml nước) và để ở nhiệt độ phòng 1 ngày cho tới khi xác sâu rữa ra. Lọc qua 2 lớp vải mỏng để loại bỏ xác sâu. Dịch gốc virus được bảo quản trong tủ lạnh. Ly tâm: Dùng pipet lấy một lượng dịch gốc virus vừa đủ cho vào ống falcon. Sau đó đem đi ly tâm với các vận tốc cần khảo sát. Dịch virus sau ly tâm sẽ tách lớp, tiến hành loại bỏ phần cặn và định mức phần dịch nổi bằng nước cất sao cho đúng bằng lượng dịch gốc ban đầu. Phần dịch nổi sau khi ly tâm ta tiến hành đánh giá các chỉ tiêu sau: *Tổng số vi sinh vật hiếu khí (cfu/ml) Tiến hành theo theo phương pháp đổ đĩa dựa trên TCVN 5165-1990 có điều chỉnh một số thao tác cho phù hợp, cụ thể như sau: Mổi công thức đổ 3 nồng độ, mỗi nồng độ 3 đĩa, lặp lại 3 lần. Chuẩn bị: - Môi trường nuôi cấy: Môi trường tổng hợp Plate Count Agar (PCA) - Dịch pha loãng: Nước muối sinh lý 0.85% Tiến hành: Dịch mẫu đem đi pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette vô trùng hút 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng lắc đều, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-1. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Sau khi pha loãng dịch mẫu, chọn 3 mẫu pha loãng liên tiếp dự kiến chứa từ 25 - 250 tế bào vi sinh vật. Dùng micropipette hút 1ml dịch pha loãng vào đĩa petri vô 30
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP trùng. Tương ứng, với mỗi độ pha loãng ta cấy 3 đĩa. Sau khi cấy, ta đổ vào mỗi đĩa 10- 15ml môi trường PCA đã nấu chảy và làm nguội đến 55 ± 50C. Trộn đều mẫu vào môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ vài lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông. Đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 để tính. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1ml dịch mẫu ban đầu được tính theo công thức. A (CFU/ml) = n1Vf1 + + niVfi Trong đó: A: Số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1 ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường F: độ pha loãng tương ứng 31
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Mẫu đã 55±50C pha loãng 1 ml 10-15 ml Xoay đều ủ Hình 2.1: Các bước tiến hành phương pháp đổ đĩa * Kiểm tra hiệu lực diệt sâu của dịch virus áp dụng theo phương pháp lây nhiễm bề mặt. trên thức ăn nhân tạo theo FAO (2011) và Lawrenceet al (2007). Mỗi công thức nhiễm 20 sâu, lặp lại 3 lần. Sâu non: Sâu non được lấy từ một ổ trứng của một ổ bướm và được nuôi bằng lá thầu dầu cho đến tuổi cần thí nghiệm. Thức ăn nhân tạo nuôi sâu: được pha chế theo công thức: M.A.Sorour et al (2011) 32
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.1: Thành phần công thức thức ăn nhân tạo Thành phần Số lượng Đậu trắng 200g Tinh bột tan 30g Men mì 30g Ascorbic acid 3g Methyl – paraben 1.9g Sorbic acid 1g Formalin 2cc Nước cất 400ml Agar 4g Thức ăn sau khi được xay xong, đổ cẩn thận 100 ml thức ăn vào trong các hộp nhựa kích thước 20x12x7cm, sao cho bề mặt thức ăn không bị rỗ để tránh sự phân bố không đều của dịch nhiễm. Thức ăn được để nguội ở nhiệt độ phòng rồi cho vào tủ lạnh đến khi sử dụng mới lấy ra để tránh bị hư. Dùng micropipette cho vào mỗi hộp thức ăn 1ml dịch NPV đã được pha loãng bằng nước cất để được 4 x 106 PIP/ml sau đó dùng chổi lông để quét đều dịch virus lên bề mặt thức ăn. Đợi cho bề mặt thức ăn khô, tiến hành chọn những cá thể sâu tuổi 3 để phơi nhiễm. Phơi nhiễm sâu với thức ăn nhân tạo có virus trong vòng 2 ngày. Sau đó, chuyển sâu sang thức ăn mới không nhiễm virus và theo dõi cho đến khi sâu chết hết. 33
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Hiệu lực diệt sâu trong phòng được tính theo công thức công thức Abbott (1925). Hiệu lực diệt sâu: H% = (1 − ) x 100 표 Trong đó: + H: tỷ lệ sâu chết (%) + T: số sâu sống ở các nghiệm thức sau thí nghiệm + Co: số sâu sống ở nghiệm thức đối chứng sau thí nghiệm * Chú ý: Trong thí nghiệm này, ta tiến hành thêm một công thức gọi là mẫu trắng. công thức này không quét dịch virus lên thức ăn, mà chỉ quét nước cất vô trùng. 34
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A B C Hình 2.2: A: Hộp nhựa 20x12x7 cm; B: Sau khi cho thức ăn nhân tạo; C: Sâu được nuôi trong thức ăn nhân tạo sau khi quét dịch virus 2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định số vòng ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và các thể hòa tan 2.3.2.1 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo các công thức sau: CT1: Ly tâm 500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch CT2: Ly tâm 1000 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch CT3: Ly tâm 1500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch CT4: Ly tâm 2500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch ĐC: Dịch gốc (không ly tâm). 35
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.2.2 Tiến hành Thí nghiệm được tiến hành và theo dõi tương tự như thí nghiêm 1 có theo dõi thêm chỉ tiêu mật độ virus. * Mật độ virus (PIB/ml) tiến hành theo phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu.(Nguyễn Đức Lượng, 2005). Là phương pháp định lượng dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng kính hiển vi và buồng đếm. Hình 2.3: Buồng đếm hồng cầu Nguyên tắc cấu tạo của buồng đếm là một phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng, khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng này, có kẽ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông. Mỗi ô vuông lại được chia thành 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, và chiều dày là 1/10 mm, như vậy thể tích một ô vuông nhỏ là 1/4000 mm3 hay 1/4000.000 ml. buồng đếm có lá kính dày để đậy. Tiến hành: Pha loãng mẫu (dịch virus) đã ly tâm theo dãy thập phân sao cho nồng độ dịch huyền phù pha loãng có mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 bào tử. Số bào tử đếm được trong 5 ô phải lớn hơn 200 mới đảm bảo tính chính xác của phương pháp. 36
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu. - Đậy lá kính lên lưới đếm Hình 2.4: Cấu tạo buồng đếm hồng cầu - Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho một giọt vào mép lá kính, do sức mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lưới đếm, chú ý không để tạo bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh. - Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3-5 phút, sau đó tiến hành đếm trong 5 ô lớn chéo nhau (4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa). - Sử dụng vật kính x10 để tìm buồng đếm. Chỉnh thật rõ sau đó chuyển sang vật kính x 40 để đếm. - Điều chỉnh cường độ ánh sáng sao cho để có thể nhìn rõ tế bào lẫn các đường kẻ. * Chú ý: Ta sẽ đếm tế bào trong mỗi ô lớn như sau, ta sẽ đếm theo hình zigzag, đếm các ô từ trái sang phải, từ hàng trên xuống hàng dưới rồi đổi chiều, mỗi ô nhỏ có 4 37
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP cạnh giới hạn, ta chỉ đếm những tế bào nằm trọn trong ô và những tế bào nằm trên 2 cạnh bên trái và ở trên (hình 2.3). Hình 2.5: Quy tắc đếm bằng buồng đếm hồng cầu Số PIB/ml dịch mẫu ban đầu được tính theo công thức: .4000.1000.푛 N= Trong đó: N: Số lượng bào tử trong 1 ml huyền phù. A : Số lượng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con). B : Số ô con trong 5 ô lớn (16 ô X 5 = 80 ô con). 1000 : Số chuyển mm3 thành ml ( 1000mm3 = 1 ml) n : Số lần pha loãng dịch huyền phù. 4000 = 400*10 (1/400 mm2 : diện tích 1 ô nhỏ; 1/10 chiều cao từ mặt buồng đếm tới lammelle) 38
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.6: Hình dáng virus trên buồng đếm hồng cầu (vật kính 40X) 2.3.3 Thí nghiệm 3:Xác định số vòng ly tâm lần thứ 2 để tinh sạch NPV 2.3.3.1 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với các CT sau: CT5: Ly tâm lần 1: 500 vòng/5 phút loại cặn, thu dịch. Ly tâm lần 2: 5000 vòng/15 phút, thu cặn, bỏ dịch. CT6: Ly tâm lần 1: 500 vòng/5 phút loại cặn, thu dịch. Ly tâm lần 2: 10000 vòng/15 phút, thu cặn, bỏ dịch. CT7: Ly tâm lần 1: 500 vòng/5 phút loại cặn, thu dịch. Ly tâm lần 2: 12000 vòng/15 phút, thu cặn, bỏ dịch. ĐC: Dịch gốc (không ly tâm). 2.3.3.2 Tiến hành Tiến hành theo theo dõi 3 chỉ tiêu như ở thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 Sau khi có kết quả của thí nghiệm 2 và thí nghiệm 3 ta sẽ dự đoán và chọn ra một công thức triển vọng để tiếp tục tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí, số PIB và hiệu lực diệt sâu. 39
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu đều được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statgraphics Centurion XVI. 40
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 . Ảnh hưởng của dịch gốc đến hiệu quả nhân NPV trong sâu khoang Dịch gốc virus sẽ ảnh hưởng rất nhiều tới việc sản xuất NPV. Mục đích của thí nghiệm này là tìm hiểu sự ảnh hưởng của dịch gốc lên hiệu lực diệt sâu của virus. Đồng thời khảo sát và đánh giá việc tinh sạch bằng phương phương pháp ly tâm có ý nghĩa như thế nào trong việc tinh sạch virus. Từ đó sẽ đưa ra phương pháp tinh sạch thích hợp cho nguồn dịch gốc. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.1 cho thấy, ở công thức nhiễm dịch thô, sâu chết chậm và rãi rác hơn so với công thức nhiễm dịch đã ly tâm. Công thức ly tâm 1 lần và 2 lần, sâu chết nhanh và tập trung vào ngày thứ 7 sau khi nhiễm, thuận lợi cho việc thu nhận sâu chết trong việc sản xuất NPV. Trái lại, sâu chết rãi rác, làm ảnh hưởng đến việc thu nhận sâu chết. Ngoài ra, số liệu ở bảng 3.2 cũng cho thấy so với không ly tâm, hiệu lực diệt sâu cả hai công thức ly tâm 1 lần và ly tâm 2 lần đều rất cao. Chọn ngày thứ 8 sau khi phơi nhiễm làm điển hình, kết quả xử lý số liệu ở bảng 3.2 cho thấy cả hai công thức ly tâm đều có hiệu lực ≥ 95% trong khi dịch gốc không được ly tâm chỉ dừng lại ở con số 60%. Sự chênh lệch là quá cao và hoàn toàn có ý nghĩa thống kê. Giải thích điều này, kết quả theo dõi thực tế cho thấy, ở công thức không ly tâm, thức ăn có mùi hôi và bị biến màu nhanh hơn các công thức còn lại nên sâu ăn ít hơn hẳn. Ở các công thức nhiễm bằng dịch ly tâm, sâu ăn nhiều, lượng virus đưa vào nhiều nên sâu chết nhanh và nhiều hơn so với công thức không ly tâm. 41
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.1 Số sâu chết sau các ngày phơi nhiễm dịch NPV (con) CT Số sâu chết ở các ngày sau nhiễm 6 NSN 7 NSN 8 NSN 9 NSN 10 NSN CT1 4 9,667 3 0 0 CT2 5,333 10 2,667 0 0 CT KLT 1,667 4,667 5,667 4,333 2 Ghi chú: NSN: ngày sau nhiễm 12 10 8 Không li tâm 6 Li tâm 1 lần Li tâm 2 lần 4 2 0 Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8 Ngày 9 Ngày 10 Hình 3.1: Diễn biến số sâu chết qua các ngày phơi nhiễm 42
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.2 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch NPV Công thức Hiệu lực diệt sâu (%) ở các ngày sau nhiễm 6 NSN 7 NSN 8 NSN 9 NSN CT1 (Ly tâm 1 lần 20 80 95 ± 5,0a 96,667 CT2 (Ly tâm 2 lần) 26,667 85 98,333 ± 2,887a 96,667 CT (KLT) 8,333 31,667 60 ± 10b 81,667 * Ghi chú: Số liệu trong các bảng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có cùng chữ theo sau thì khác biệt không ý nghĩa. Những cột có chữ “ns (non sighnificant)” thì số liệu trong cột đó cũng không có sự khác biệt, với độ tin cậy 95% Bảng 3.3 Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong dịch virus CT TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (x 109cfu/ml) CT1 0,134 ± 0,056b CT2 0,0956 ± 0,0340b ĐC (KLT) 1,1 ± 0,0404a Xét chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí, ta thấy tổng vi sinh vật trong dịch NPV (bảng 3.3) không trải qua quá trình ly tâm là cao so với hai công thức ly tâm. Trong khi, lượng vi sinh vật ở công thức 1 và công thức 2 lần lượt là 1,34 x108 và 9,56 x107, còn ở công thức đối chứng, lượng vi sinh vật đạt tới 1,1 x109, cao hơn khoảng 10 lần. Và sự chênh lệch này là có ý nghĩa. Như vậy, chỉ cần theo dõi và đánh giá thông qua 2 chỉ tiêu hiệu lực diệt sâu và tổng vi sinh vật hiếu khí, ta cũng đủ thấy rằng: dịch gốc nếu trải qua quá trình ly 43
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tâm tinh sạch thì hiệu lực diệt sâu sẽ cao hơn, sâu chết tập trung hơn đồng thời lượng vi sinh vật hiếu khí sẽ giảm xuống. Từ đó, chất lượng virus sẽ được nâng lên rõ rệt. Chính vì vậy, nhằm tìm ra chế độ ly tâm phù hợp nhất để loại bỏ những tác nhân ảnh hưởng đến chất lượng virus đồng thời cải thiện chất lượng virus, sinh viên tiếp tục tiến hành các thí nghiệm xác định công thức ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và vi sinh vật hiều khí, nâng cao hoạt tính virus. 3.2 . Xác định số vòng ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và các thể hòa tan Qua thí nghiệm ở trên ta nhận thấy rằng: sâu chết do nhiễm virus sẽ được thu nhận, xử lý để sản xuất thành nguồn virus mới. Nguồn virus mới này càng “sạch” thì hiệu lực diệt sâu càng cao. Khi nguồn virus không được xử lý “sạch” thì xác sâu chứa các chất dinh dưỡng như protein, lipid, sẽ trở thành môi trường lý tưởng cho sự phát triển của các vi khuẩn. Điều này sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng của nguồn virus. Không những vậy khi nguồn virus càng ít “sạch” thì khi trộn với thức ăn nhân nuôi, thức ăn càng dễ bị hư hỏng, dẫn đến làm giảm độ bền của virus, do đó giảm hiệu quả diệt sâu, cũng như đem đến nguy cơ gây ô nhiễm vi sinh vật cho môi trường (Lasa R. et al., 2008). Một trong những phương pháp trích ly hiệu quả virus NPV là phương pháp ly tâm (Grzywacz et al, 2011). Lực ly tâm nhỏ với số vòng < 4000 vòng/ xác sâu với khối lương lớn sẽ lắng xuống bên dưới, virus sẽ nằm trong phần dịch nổi bên trên. Vì vậy ta dễ dàng loại bỏ được xác sâu. Thí nghiệm được tiến hành ở các tốc độ ly tâm khác nhau 500, 1000, 1500, và 2500 vòng/ phút với mục đích tìm ra công thức ly tâm phù hợp nhất để loại bỏ xác sâu nhưng lại không làm ảnh hưởng quá nhiều tới chất lượng của virus. Kết quả thí nghiệm cho thấy, so với đối chứng (không ly tâm), các công thức tăng dần tốc độ ly tâm, tổng số vi sinh vật hiếu khí giảm rõ rệt. Nếu lấy số lượng VSV hiếu khí trong mẫu đối chứng làm chuẩn 100 % (11,4 ± 31,6 x 109 cfu/ml) thì ở CT1 (500 v/ 44
  55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP phút), tổng vi sinh vật hiếu khi vẫn không thay đổi nhiều bởi vì khi ly tâm ở tốc độ nhỏ, dịch virus không phân lớp rõ nên không thể loại bỏ được xác sâu nhiều, vì vậy hai công thức này sai khác không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Bảng 3.4). Khi tăng vận tốc ly tâm lên 1000 v/phút thì tổng số vi sinh vật hiếu khí giảm từ 11,4 x 109 còn 4,23 x 109 cfu/ml giảm tới 7,17 x109 và sai khác đã có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Tương tự như vậy, tiếp tục tăng vận tốc ly tâm lên 1500 v/phút ở công thức 3 và 2500 v/phút ở công thức 4, tổng vi sinh vật hiếu khí tiếp tục giảm mạnh chỉ còn 0,97 x 109 cfu/ml và 0,76 x 109 cfu/ml, và hai công thức này hoàn toàn có sai khác so với các công thức trước đó, tuy nhiên sai khác giữa công thức 3 và công thức 4 lại không có ý nghĩa thống kê. Điều này có thể giải thích như sau, tổng số vi sinh vật hiếu khí sẽ giảm đến một giá trị nhất định nào đó thì sẽ không thay đổi nhiều nữa nếu như không có sự tăng đột phá vận tốc ly tâm.Vì vậy, ta nếu muốn giảm một lượng đáng kể vi sinh vật hiếu khí ta nên tăng mạnh vận tốc ly tâm. Bảng 3.4 Tổng vi sinh vật hiếu khí trong dịch NPV sau khi ly tâm lần 1 Công thức Tổng vi sinh vật hiếu Tổng VSV hiếu khí/ml khí (x 109 CFU/ml) chuyển đổi sang Log (x+1) Không ly tâm (Đ/C) 11,4 ± 3,16 10,05 ± 0,13 a CT1:500 v/5 phút, loại cặn, thu dịch 12,7 ±1,99 10,10 ± 0,07 a CT2:1000 v/5 phút, loại cặn, thu dịch 4,23 ± 3,03 9,56 ± 0,29 b CT3: 1500 v/5 phút, loại cặn, thu dịch 0,97 ± 0,17 8,98 ± 0,08 c CT4:2500 v/5 phút, loại cặn, thu dịch 0,76 ± 0,22 8,87 ± 0,12 c 45
  56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SỐ VSV 1.60E+10 1.40E+10 1.20E+10 1.00E+10 8.00E+09 SỐ VSV 6.00E+09 4.00E+09 2.00E+09 0.00E+00 CT1 CT2 CT3 CT4 DC (KLT) -2.00E+09 Hình 3.2: Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí của dịch virus NPV Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA Mặc khác, khi ta tăng dần vận tốc ly tâm, ta cũng cần phải quan tâm đến chỉ tiêu thể hiện chất lượng của virus, đó chính là số PIB có trong dịch. Vì rất có thể khi tăng vận tốc ly tâm, tổng số vi sinh vật hiếu khí sẽ giảm đồng thời cũng sẽ ảnh hưởng tới số PIB thu hồi. Xét bảng 3.5 ta thấy, khi ly tâm với vận tốc lần lượt 500, 1000, 1500 v/phút thì số PIB thu hồi có giảm nhưng con số là không đáng kể và không có sự sai khác so với 46
  57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP công thức đối chứng (không có ý nghĩa thống kê), Nhưng khi tăng vận tốc ly tâm lên 2500 v/phút, số PIB đã giảm còn 1,30 x109 trong khi công thức đối chứng là 1.99 x 109 và sai khác này đã có ý nghĩa thống kê (p<0,05), Nguyên nhân chính là do số vòng ly tâm cao làm cho dịch virus phân lớp mạnh, lượng PIB lẫn trong lớp cặn bị thất thoát nhiều. Như vậy, dựa vào những số liệu trên có thể nhận định, khi ly tâm với vận tốc 1500 v/phút (CT3) để thu hồi virus trong dịch nổi sẽ không làm giảm số PIB nhưng lại giảm đáng kể tổng VSV hiếu khí. Như vậy, so với các công thức còn lại CT3 là công thức ly tâm loại bỏ xác sâu phù hợp. Bảng 3.5 Số PIB của dịch virus NPV ở các chế độ li tâm Công thức Số PIB (x 109PIB/ml) Số PIB/ml chuyển đổi sang Log (x+1) Không li tâm (Đ/C) 1,99 ± 0, 68 9,27744 ± 0,172 a CT1: 500vòng/5 phút, loại cặn, 1,77 ± 0,03 9,24711 ± 0,008 ab thu dịch CT2:1000 vòng/5 phút, loại 1,77 ±0,18 9,24526 ± 0,05 ab cặn, thu dịch CT3:1500 vòng/5 phút, loại 1,54 ±0,81 9,18618 ± 0,023 ab cặn, thu dịch CT4:2500 vòng/5 phút, loại 1,30 ± 0,06 9,11357 ± 0,022 b cặn, thu dịch 47
  58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.4: PIB virus trong buồng đếm hồng cầu (vật kính 40X) SỐ PIB 3.00E+09 2.50E+09 2.00E+09 1.50E+09 SỐ PIB 1.00E+09 5.00E+08 0.00E+00 CT1 CT2 CT3 CT4 DC (KLT) Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện lượng PIB trong dịch virus ở các CT ly tâm 48
  59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Để làm rõ thêm điều này, ta tiến hành đánh giá hiệu lực diệt sâu của các công thức (sau khi điều chỉnh nồng độ virus như nhau giữa các công thức). Thông qua kết quả bảng 3.6, 3.7 và hình 3.7, ta thấy lượng vi sinh vật hiếu khí có trong dịch virus hoàn toàn có ảnh hưởng tới hiệu lực diệt sâu. Cụ thể như sau, hiệu lực diệt sâu của các công thức tăng dần từ ngày thứ 6 tới ngày thứ 11 và tăng vọt từ ngày 8 chuyển sang ngày 9. Nếu ta chọn đại diện ngày cuối cùng (ngày thứ 11) để so sánh thì dễ dàng thấy rằng ởcông thức đối chứng ( không ly tâm) và công thức 1 ly tâm với vận tốc quá nhỏ (chỉ loại bỏ được một phần ít xác sâu) thì lượng vi sinh vật hiếu khí có trong dịch virus nhiều hơn đáng kể so với các công thức còn lại nên cho hiệu quả diệt sâu kém hơn (chỉ đạt ở mức 87,78% và 88,33%), nhưng khi tăng số vòng ly tâm lên 1000v/phút lượng vi sinh vật giảm còn 4,23 x109cfu/ml đồng thời hiệu quả diệt sâu tăng 94,5%. Và khi tăng vận tốc lên 1500v/phút (công thức 3) thì lượng vi sinh vật thấp nhất (0,97 x109 cfu/ml),hiệu lực diệt sâu của công thức 3 cao nhất và đạt tới 97,22%. Và so với công thức đối chứng, công thức 1 và cả công thức, thì sự sai khác về hiệu lực diệt sâu của công thức 3 với các công thức này là có ý nghĩa. Mặc dù so với công thức 2, sự sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê nhưng tổng hợp dữ liệu từ những gì ta có được thì công thức 3 là thích hợp nhất khi ta tiến hành ly tâm loại bỏ sác sâu, và loại bỏ một phần tổng vi sinh vật hiếu khí 49
  60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.6 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch NPV Công thức Hiệu lực diệt sâu (%) ở các ngày sau nhiễm 4 NSN 6 NSN 7 NSN 8 NSN 9 NSN 10 NSN 11 NSN CT1 0 15,757 28,787 43,183 70,077 78,89 88,333b CT2 0 39,593 63,807 69,363 74,243 85 94,447ab CT3 0 30,453 53,34 58,713 71,717 93,89 97,223a CT4 0 24,393 34,34 48,74 68,687 82,777 88,333b DC(KLT) 0 21,887 38,973 45,453 45,453 72,777 87,777b 120 100 80 CT1 CT2 60 CT3 CT5 40 CT10 (KLT) 20 0 4 6 7 8 9 10 11 Hình 3.6: Hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm 50
  61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.7 Hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của dịch virus ở các công thức ly tâm Tổng vi sinh Số PIB/ml chuyển Hiệu lực diệt sâu vật hiếu khí/ml đổi sang Log (%) sau 11 ngày Công thức chuyển đổi (x+1) phơi nhiễm. sang Log (x+1) Không li tâm (Đ/C) 10,05 ± 0,13 a 9,27744a 87.78 ± 2.22 b CT1: 500 vòng/5 phút, 10,10 ± 0,07 a 9,24711 ab 88.33 ± 1.67 b loại cặn, thu dịch CT2: 1000 vòng/5 phút, 9,56 ± 0,29 b 9,24526 ab 94.44 ± 2.22 ab loại cặn, thu dịch CT3: 1500 vòng/5 8,98 ± 0,08 b 9,18618 ab 97,22 ± 1.47 a phút, loại cặn, thu dịch CT4: 2500 vòng/5 phút, 8,87 ± 0,12 b 9,11357 b 88.33 ± 4.41 b loại cặn, thu dịch Như vậy, trong số các công thức khảo sát thì công thức ly tâm 1 lần: 1500 vòng/phút (trong vòng 5 phút) thu dịch nổi, cho kết quả tốt hơn hẳn so với đối chứng vì không làm giảm số PIB nhưng lại loại bỏ vi sinh vật hiếu khí tốt hơn và tăng hiệu lực diệt sâu của NPV. 51
  62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 10.2 98 10 96 9.8 94 9.6 92 9.4 SỐ VSV 9.2 90 SỐ PIB 9 88 HIỆU LỰC DIỆT SÂU 8.8 86 8.6 84 8.4 8.2 82 CT1 CT2 CT3 CT4 DC (KLT) Hình 3.7: So sánh hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của các công thức 3.3 Xác định số vòng ly tâm lần 2 để tinh sạch virus NPV Mục đích của thí nghiệm này là một lần nữa loại bỏ lượng vi sinh vật hiếu khí xuống mức thấp nhất vì ở thí nghiệm ly tâm lần nhất lượng vi sinh vật hiếu khí còn lại vẫn còn khá cao (xấp xỉ 90%), chất lượng dịch virus chưa được nâng lên đáng kể. Vì vậy lần này, sẽ kết hợp 2 lần ly tâm, ly tâm lần 1 vẫn giữ nguyên vận tốc 500v/phút, ly tâm lần 2 tăng dần vận tốc 5000v/phút, 10000v/phút và 12000v/phút. Như đã nói, việc ly tâm lần 1 với số vòng ly tâm nhỏ nhằm loại bỏ các mảnh xác sâu lớn, thu dịch nổi chứa virus. Ly tâm lần 2 với vận tốc ly tâm lớn (>4000v/phút) sẽ thu virus ở dạng cặn, loại bỏ các hạt lipid hoặc nhũ tương nhỏ còn sót lại, một lần nữa làm sạch dịch virus. 52
  63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.8 Tổng vi sinh vật hiếu khí trong dịch NPV sau khi ly tâm lần 2 Công thức Tổng vi sinh vật hiếu Tổng vi sinh vật hiếu khí (x 109 CFU/ml) khí/ml chuyển đổi sang Log (x+1) Không li tâm (Đ/C) 11,4 ± 3,16 10,05 ± 0,13 a CT5: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 0,21 ± 0,10 8,28 ±0,23 b phút, thu dịch, lần 2:5000 vòng/15phút, thu cặn. CT6: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 0,39 ± 0,18 8,55 ± 0,24 b phút, thu dịch, lần 2:10000 vòng/15 phút, thu cặn. CT7: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 0,44 ± 0,24 8,58 ±0,30 b phút, thu dịch, lần 2:12.000 vòng/15 phút, thu cặn. TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.60E+10 1.40E+10 1.20E+10 1.00E+10 8.00E+09 SỐ VSV 6.00E+09 4.00E+09 2.00E+09 0.00E+00 CT5 CT6 CT7 DC (KLT) Hình 3.8: Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí của dịch virus NPV 53
  64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Từ kết quả trong bảng 3.8 và hình 3.8 ,ta dễ dàng nhận thấy việc ly tâm 2 lần như vậy cho kết quả rất khả quan, tổng vi sinh vật hiếu khí giảm rõ rệt so với mẫu đối chứng không qua ly tâm. Cụ thể như sau: lượng vi sinh vật hiếu khí ở 3 công thức ly tâm 5000v/phút, 10000v/phút, và 12000v/phút giảm xuống còn 82 – 85%. Mặc dù sự sai khác giữa 3 các công thức này không có ý nghĩa thống kê nhưng lương vi sinh vật hiếu khí thấp hơn nhiều so với các công thức ở thí nghiệm ly tâm 1 lần. Điều này đã phần nào chứng tỏ được việc kết hợp 2 lần ly tâm sẽ cho kết quả cao hơn so với 1 lần ly tâm . Bảng 3.9 Số PIB của dịch virus NPV ở các chế độ ly tâm Công thức Số PIB (x Số PIB/ml chuyển đổi 109PIB/ml) sang Log (x+1) Không li tâm (Đ/C) 1,99 ± 0, 68 9,27744 ± 0,172 ns CT5: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 1,36 ± 0,03 9,13453 ± 0,01 ns phút, thu dịch, lần 2:5000 vòng/15 phút, thu cặn. CT6: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 1,50 ± 0,13 9,17511 ± 0,036 ns phút, thu dịch, lần 2:10000 vòng/15 phút, thu cặn. CT7: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 1,66 ± 0,06 9,219 ± 0,018 ns phút, thu dịch, lần 2:12.000 vòng/15 phút, thu cặn. 54
  65. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SỐ PIB 3.00E+09 2.50E+09 2.00E+09 1.50E+09 SỐ PIB 1.00E+09 5.00E+08 0.00E+00 CT5 CT6 CT7 DC (KLT) Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện lượng PIB trong dịch virus NPV Mặc khác kết quả từ bảng 3.9 cũng đã thể hiện, lương PIB thu hồi sau khi ly tâm vẫn giữ ở mức cao (99% so với mẫu đối chứng) và sự sai khác giữa các công thức ly tâm là không có ý nghĩa. Cụ thể lượng PIB thu hồi ở cong thức 5, 6 và 7 lần lượt là 1,36 x 109,1,5 x 109 và 1,66 x 109. Điều này cho thấy lượng PIB thu hồi tồn tại trong phần cặn của dịch virus khi ly tâm và do vận tốc ly tâm lần 1 quyết định. Ở thí nghiệm ly tâm lần hai ta loại bỏ phần dịch nổi, thu phần cặn nên lượng PIB sẽ gần như không bị hao hụt. 55
  66. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.10: Sâu chết với các dấu hiệu đặc trưng của nhiễm virus Bảng 3.10 Hiệu lực diệt sâu (%) của các công thức ở các ngày sau nhiễm Hiệu lực diệt sâu (%) ở các ngày sau nhiễm Công thức 4 NSN 6 NSN 7 NSN 8 NSN 9 NSN 10 NSN 11 NSN CT5 0 16,05 52,443 73,107 81,693 91,11 97,223ns CT6 0 40,15 62,88 71,467 71,467 82,223 91,11 CT7 0 27,677 65,66 67,3 67,3 88,89 94,443 DC (KLT) 0 21,887 38,973 45,453 45,453 72,777 87,777 56
  67. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 100 90 80 70 60 CT5 50 CT6 40 CT7 30 DC (KLT) 20 10 0 4 6 7 8 9 10 Hình 3.11: Diễn biến hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm Xét về hiệu lực diệt sâu của các công thức, kết quả cho thấy, tuy hiệu lực diệt sâu giữa các công thức không có ý nghĩa thống kê nhưng ta vẫn nhận thấy hiệu lực diệt sâu của công thức 5 cao nhất với 97,22%. Ở công thức 6 và 7 hiệu lực diệt sâu có phần giảm hơn so với công thức 5. Điều này chứng minh rằng khi ta tăng vận tốc ly tâm lên 10000v/phút (CT6) và 12000v/phút (CT7) có thể lực ly tâm cao đã làm cho cấu trúc của virus bị tổn thương,virus bị mất chức năng, ảnh hưởng đến hiệu lực diệt sâu của virus. Vì vậy, ở thí nghiệm 2 này công thức ly tâm tối ưu để thu nhận virus là công thức 5 ly tâm 2 lần, lần 1 với 500 v/phút thu dịch nổi và lần 2 vận tốc 5000 v/phút thu cặn ly tâm. 57
  68. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.11 Hiệu lực diệt sâu, tổng số vi sinh vật hiếu khí và số PIB của các CT ở các chế độ ly tâm 2 lần Công thức Tổng vi sinh Số PIB/ml chuyển Hiệu lực diệt vật hiếu đổi sang Log (x+1) sâu (%) sau 11 khí/ml ngày phơi chuyển đổi nhiễm sang Log (x+1) Không li tâm (Đ/C) 10,05 ± 0,13 a 9,28 ± 0,172 ns 87,78 ± 10,72 a CT5: Ly tâm 2 lần, lần 8,28 ± 0,23 b 9,13 ± 0,01 97.22 ± 4,81 a 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:5000 vòng/15 phút, thu cặn. CT6: Ly tâm 2 lần, lần 8,26 ± 0,24 b 9,18 ± 0,036 91,11 ± 8,39 a 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:10000 vòng/15 phút, thu cặn. CT7: Ly tâm 2 lần, lần 8,46 ± 0,30 b 9,22 ± 0,018 94,44 ± 9,62a 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:12.000 vòng/15 phút, thu cặn. Tóm lại, lượng vi sinh vật hiếu khí tồn tại trong dịch virus sẽ làm ảnh hưởng tới chất lượng của dịch virus (hiệu lực diệt sâu). Cụ thể là lượng vi sinh vật hiếu khí tỷ lệ nghịch với chất lượng của virus. Cho nên, để duy trì hiệu lực diệt sâu của dịch virus ta cần phải hạn chế lượng vi sinh vật xuống mức thấp nhất bằng cách ly tâm. Với các chế độ ly tâm khảo sát,việc ly tâm sẽ không làm ảnh hưởng nhiều đến lượng PIB có trong 58
  69. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP dịch virus nhưng lai có tác động đến lượng vi sinh vật hiếu khí. Cụ thể khi ta tăng vận tốc ly tâm lên đến một con số thích hợp, hay ta kết hợp ly tâm 2 lần lượng vi sinh vật hiếu khí sẽ bị giảm xuống, từ đó hiệu lực diệt sâu sẽ tăng lên. Như vậy, ly tâm lần 2 với tốc độ li tâm từ 5000 vòng/phút đến 12.000 vòng/phút thu cặn, giúp làm giảm rõ số vi sinh vật hiếu khí nhưng không làm giảm số PIB và hiệu lực trừ sâu của virus. Mặc khác, trong khoảng tốc độ khảo sát, không có sự sai khác về tổng vi sinh vật hiếu khí cũng như số PIB thu hồi và hiệu lực diệt sâu của virus giữa các công thức ly tâm. Chính vì vây, dựa trên kết quả của 2 lần ly tâm, sinh viên tiến hành thêm thí nghiệm nữa với công thức ly tâm lần 1 là 1500 vòng/phút và lần 2 là 5000 vòng/phút. Thí nghiệm này, sinh viên tạm gọi là tối ưu hóa công thức ly tâm tinh sạch NPV. 3.4 Tối ưu hóa công thức ly tâm tinh sạch NPV Mục đích của thí nghiệm lần này không gì khác ngoài việc kiểm tra công thức kết hợp hai lần ly tâm với vận tốc ly tâm lần 1 là 1500 vòng/phút và lần 2 là 5000 vòng/phút (dựa trên kết quả của thí nghiệm 2 và thí nghiệm 3) với hy vọng công thức ly tâm này sẽ là công thức ly tâm tối ưu nhất để tinh sạch NPV, vừa có thể làm giảm lượng vi sinh vật xuống mức thấp nhất lại vừa không làm ảnh hưởng đến số PIB có trong dịch đồng thời nâng cao hiệu lực diệt sâu của virus. Kết quả thí nghiệm sau khi xử lý T Test thể hiện trong bảng 3.12 hoàn toàn đúng với những dự doán ban đầu, lượng PIB sau khi ly tâm ở công thức thí nghiệm (1,13 x 109) không có sự sai khác so với công thức đối chứng (KLT) (1,87 x 109). Nghĩa là lượng PIB vẫn được duy trì ở mức cao, không bị ảnh hưởng nhiều bởi vận tốc ly tâm. Xét về tổng vi sinh vật hiếu khí, ở công thức thí nghiệm lượng vi sinh vật giảm rất đáng kể, chỉ còn 6.47 x 107 đã giảm hơn 30 lần so với đối chứng (2,00 x 109) loại bỏ 59
  70. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP hơn 96% tổng vi sinh vật hiếu khí so với không li tâm. Lượng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu thí nghiệm giảm đồng nghĩa với hiệu lực diệt sâu của sẽ tăng. Thật vậy, chỉ sau 4 ngày phơi nhiễm thì sâu đã có dấu hiệu nhiễm virus và chết và chỉ sau 9 ngày phơi nhiễm lượng sâu chết do nhiễm phải virus đạt 95,5% (công thức thí nghiệm) trong khi ở công thức đối chứng chỉ đạt 78,19%. Sự chênh lệch này khá cao và hoàn toàn có ý nghĩa thống kê. Không chỉ riêng ngày thứ 9 mà ở tất cả các ngày còn lại lượng sâu chết do nhiễm virus ở công thức thí nghiệm luôn cao hơn công thức đối chứng, điều này hoàn toàn được thể hiện ở hình 3.12 Bảng 3.12 Hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của dịch virus Công thức Tổng vi sinh vật Số PIB/ml chuyển Hiệu lực diệt sâu hiếu khí/ml chuyển đổi sang Log (x+1) (%) sau 9 ngày phơi đổi sang Log (x+1) nhiễm Không li tâm (Đ/C) 9.291 ± 0.173a 9.270 ± 0.04ns 78.193 ±4.258b CTKC: Ly tâm 2 7.8 ± 0.105b 9.048 ± 0.069 95.5533 ±3.851a lần, lần 1: 1500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:5000 vòng/15 phút, thu cặn. 60
  71. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 120 100 80 60 DC (KLT) CT1 40 20 0 4 5 6 7 8 9 10 Hình 3.12: Diễn biến hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm Như vậy, khi kết hợp 2 lần ly tâm với vận tốc ly tâm thích hợp, sẽ cho ta kết quả cao hơn so với khi ly tâm 1 lần. Cụ thể, như ở công thức thí nghiệm, ly tâm 2 lần, lần 1: 1500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:5000 vòng/15 phút, thu cặn, sẽ loại bỏ được 1 lượng đáng kể vi sinh vật hiếu khí có trong dịch virus mà không làm thiệt hại đến lượng PIB có trong đó, từ đó chất lượng của dịch virus sẽ nâng lên. Việc bảo quản dịch virus phần nào được cải thiện. 61
  72. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Ly lâm dịch NPV gốc sử dụng nhiễm sâu khoang làm cho sâu chết nhanh và tập trung hơn so với dịch không ly tâm. - Ly tâm 1500 vòng/phút (trong vòng 5 phút) thu dịch nổi, cho kết quả tốt hơn hẳn so với đối chứng vì không làm giảm số PIB nhưng lại loại bỏ vi sinh vật hiếu khí tốt hơn và tăng hiệu lực diệt sâu của NPV. - Không có sự sai khác về tổng vi sinh vật hiếu khí, số PIB cũng như hiệu lực diệt sâu của NPV khi ly tâm lần 2 với tốc độ từ 5000 đến 12000 vòng/phút trong vòng 10 phút. - Công thức ly tâm 2 lần, lần 1 với 500 vòng/phút trong vòng 5 phút thu dịch nổi và lần 2 với tốc độ 5000 vòng/phút trong vòng 10 phút làm giảm > 96% tổng vi sinh vật hiếu khi nhưng không làm giảm số PIB mà còn làm tăng hiệu lực diệt sâu của NPV so với không ly tâm. 4.2. Kiến nghị Nghiên cứu và tìm hiểu sự ảnh hưởng của vi sinh vật hiếu khí đến hoạt lực và thời gian bảo quản virus Tiến hành khảo sát thêm nhiều CT ly tâm khác nhau nhằm tìm ra công thức ly tâm phù hợp để loại bỏ nhiều nhất có thể lượng vi sinh vật hiếu khí có trong dịch virus. Mở rộng nghiên cứu, tìm ra phụ gia thích hợp có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật đồng thời cải thiện mùi của dịch virus. Dịch gốc virus nên định kỳ kiểm tra mức độ nhiễm vi sinh vật và hoạt hóa lại trên cơ thể sâu ký chủ nhằm đảm bảo được chất lượng của virus 62
  73. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIẾNG ANH [1] Baskaran R.K. M., 2001. In vivo screening of optical brighteners as UV protectants and their efficacy in enhancing the virulence of Maduri isolate of NPV of Amascata albistriga (Walker).Lepidoptera: Arctiidae. Journal of Biological Control.2 (1):169-174. [2] Burges, H. D., G. Croizier, J. Huber (1980), “A review of safery tests on baculoviruses”, Entomophaga, 25: 329 - 339. [3] Bergold, G. H., 1963a. Fine structure of some insect viruses. Journal Insect Pathology, 5: 111 – 128. [4] Bergold, G. H., 1963b. The molecular structure of some insect virus inclusion bodies. Journal Ultrastructs. Res., 8: 360 – 378. [5] Bud, H. M and M. D. Kelly (1980), “Nuclear polyhedrosis virus DNA infectious”, Micro-biologycal, 3, 103 - 108. [6] Bud, H.M, 1977. The DNA contained by nuclear polyherosis virus isolated from four Spodoptera spp. (Lepidoptera, Noctuidae): genome size and configuration assessed by electron microscopy, 135 – 143. [7] Burges, H. D., G. Croizier, J. Huber (1980), “A review of safery tests on baculoviruses”, Entomophaga, 25: 329 - 339. [8] Crook, N. E. and Jarrett P. (1991), “Viral and bacterial pathogens of insects”. Socirty for Applied Bacteriology 20: 91-96. [9] Evans, H. F. (1986), “ The biology of Baculovirus” (eds Granados, R. R. and Federici, B. A.), CRC Press, Boca Raton, Fl, vol. II, pp. 89 - 132. [10] Flavio et al (1997) Production of Nuclear Polyhedrosis Virus of Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera:Noctuidae): Effect of Vírus Dosage, Host Density and Age 63
  74. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [11] Grzywacz D., Rabindra R. J. Brown M., Jones K.A. 2011. The Helicoverpa armigera NPV production manual. [12] Harrap, K. A., and B. E. Juniper. 1966. The internal structure of an insect virus. Virology 29:175-178. [13] Ignoffo, C. M., Rice, W. C. and Mcintoch, A. H. (1989): Inactivation of non occluded and occluded baculovirus and baculovirus-DNA exposed to simulated sunlight .Environmental Entomology.18(1)177-183 [14] Ignoffo, C.M (1992) Combination of environmental factor and simulated sunlight affect-ing inclusion bodies of the Heliothis (Lepidotera: Noctuidae) nucleopolyhedrosis virus. Environmental entomology 21,210-213. [15] Jayaraj (1985), “Symptoms and pathologies of insect diseases inMicrobial control and integrated pest management”, Tamil Nadu Agricultural University, Coimbatorem, India, p 30 - 33. [16] Johnson D. W., D. B. Boucias, C. S. Barfield, and G. E. Allen (1982), “A temperature dependent developmental model for a nucleopolyhedrosis virus of the velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae)”, J. Invertebr. Pathol 40, pp. 292 - 298. [17] Kao và Meher (2004) Optimization of Helicoverpa annigera NPV inoivo mass production and regulation ofmalodor associated with the process. [18] Kelly, D. C. (1985), “Insect iridescent viruses”, Current Topics in Microbiology and Immunology, 116, 23 - 35. [19] Kobayashi M., S. Inagaki and S. Kawase (1981), “Effect of high temperature on the development of nuclear polyhedrovirus in the silkworm, Bombyx”, J. Invertebr. Pathol 38, pp. 386 - 394. 64
  75. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [20] Lansing M. Prescott, john P. Harley, Đonal A. Klein, 2005 Microbiology. Mc Graw Hill [21] Lawrence A. Lacey, Hary K. Kaya., 2007. Book: Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology - Application and Evaluation of Pathogens for Control of Insects and other Invertebrate Pests. Springer, Second edition. [22] M.A.Sorour, O.Khamiss, A.S.Abd El-Wahab, M.A.K.El-Sheikh and S.Abul-Ela( 2011). An Economically Modified Semi-Synthetic Diet for Mass Rearing the Egyptian Cotton Leaf Worm Spodoptera littolaris, Academic Journal of Entomology 4 ( 3), 118- 120 [23] Mohammad et al, 2002. BIOLOGICAL CONTROL Field Efficacy of the Nucleopolyhedrovirus of Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae): Effect of Formulations, Water pH, Volume and Time of Application, and Type of Spray Nozzle [24] Monobrullah Md. and Masao Nagata, 2000. Optimisation of Spodoptera litura Fab. Nucleopolyhedrovirus Production in Homologous Host Larvae. International Journal of Tropical Insect Science Science , Volume 20, Issue 02, pp 157-165 [25] Ravishankar B. S. and Venkatesha M. G., 2010. Effectiveness of SlNPV of Spodoptera litura (Fab.) (Lepidoptera:Noctuidae) on different host plants. Journal of Biopesticides 3 (1 Special Issue): 167 – 171 [26] Sasumu Maeda et all (1990), Characteristically distinct isolates of nuclear polyhedrosis virus from Spodoptera litura (Fab) polyhedrosis virus using UV irradiation protectants [27] S. Arivudainambi et al (2000), enhancing the efficacy and persistency of Spodoptera litura 65
  76. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [28] Shinoda, T., 2001. Spodoptera litura Fabricius. In: Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council (Ed.), The Pest of Vegetables. Asociation of Agriculture and Forestry Staistics, Tokyo, pp 112 - 125. [29] Summers, M. D., R. Engler, L. A. Falcon and P. V. Vail (Eds) (1975). Baculoviruses for Insect Pest Control: Safety Considerration. Amerrican Society of Microbiology, Washington. [30] Tanada, Y. and H. K. Kaya (1993), Insect pathology. Academic press, IRC. Harcount brace Jovanovich, publishrs, San Diego/ New Yourk/ Boston/ London/ Sydney/ Tokyo/ Toronto [31] Trang T.T.K., Chaudhari S. and Gautam R.D., 2003. “A note on the spread of Spodoptera litura (Fab.) Nuclear polyhedrosis virrsu through Cotesia (Apanteles) angaleti Muesbeck (Hymenoptera: Braconidae)”. Omonrice 11: 151-152 (2003) [32] Trang, T. T. K. and Chaudhari, S., 2002. “Bioassay of nuclear polyhedrovirus (npv) and in combination with insecticide on Spodoptera litura (Fab)”. Omonrice, 10: 45-53. B. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài và Nguyễn Văn Tó (2006), Tìm hiểu về chế phẩm vi sinh vật dùng trong nông nghiệp, Tủ sách khuyến nông phục vụ người lao động, Nhà xuất bản lao động, Hà Nội. [2] Hoàng Thị Việt et al., (2000), “Một số kết quả nghiên cứu về NPV (Nuclear polyhedrosis virus) và khả năng sử dụng trong phòng trừ sâu hại cây trồng”, Tuyển tập công trình nghiên cứu Bảo Vệ Thực Vật 2000-2002, Viện Bảo Vệ Thực vật, Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, Trang 110-130 66
  77. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [3] Ngô Trung Sơn (1999), Nghiên cứu sử dụng HaNPV trong phòng trừ tổng hợp sâu xanh hại bông tại Ninh Thuận. Luận án tiến sỹ nông nghiệp, Viện Khoa học và Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. [4] Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004), Giáo trình Côn trùng Nông nghiệp, phần B: Côn trùng gây hại cây trồng chính ở Đồng bằng sông Cửu Long, Tủ sách Đại Học Cần Thơ. [5] Nguyễn Văn Tuất, 2004. Nghiên cứu sản xuất sử dụng thuốc sinh học đa chức năng cho một số loại cây trồng bằng kỹ thuật Công nghệ sinh học. Báo cáo tổng kết đề tài Khoa học công nghệ. Viện bảo vệ Thực vật. [6] Phạm Hữu Nhượng và ctv 2005. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm NPV trừ sâu xanh da láng. Tạp chí NNCNTP. [7] Phạm Huỳnh Thanh Vân, Lê Thị Thuỳ Minh, 2001. Sâu Ăn Tạp (Spodoptera litura) một số đặc điểm hình thái, sinh học và thành phần thiên địch trên một số loại rau màu tại vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn Tốt nghiệp Đại Học. [8] Phạm Thị Thùy (2004), Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. [9] Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến và Nguyễn Mạnh Chinh (2003), Cẩm nang sâu bệnh hại cây trồng (Quyển 1), Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh. [10] Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2007) Công nghệ sinh học, tập 5, Nxb Giáo dục, Hà Nội. C. TÀI LIỆU INTERNET [1] thuc-pham-phuong-phap-xac-dinh-tong-so-vi-khuan-vb902237.aspx 67
  78. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [2] [3] thuoc-sau-sinh-hoc-da-chuc-nang-cho-mot-so-loai-cay-trong-bang-ky-thuat- cong-nghe-54104/ [4] [5] 92011/Thuoc_BVTV_co_nguon_goc_sinh_hoc_ung_dung_cua_Hoa_hoc_xanh _cho_nong_nghiep_ben_vung/ [6] -pt1.pdf [7] gay_7/GTSuDungThuocBVTV_SVquanlydat.com.pdf [8] [9] [10] dung-trong-thuc-pham-25277/ 68
  79. PHỤ LỤC A. HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN Hình 1: Sâu khoang nuôi trên lá thầu dầu để chuẩn bị nhiễm Hình 2: Thức ăn nhân tạo sau khi đổ ra hộp 1
  80. Hình 3: Sâu được nuôi bằng thức ăn nhân tạo sau khi nhiễm virus 2
  81. Hình 4: Sâu chết do nhiễm virus Hình 4: Thao tác đỗ đĩa 3
  82. B. BẢNG XỬ LÝ SỐ LIỆU THÔ BẰNG PHẦN MỀM STATGRAPHICS CENTURION XV * Thí nghiệm 1: Khảo Sát sự ảnh hưởng của dịch gốc virus tới hiệu lực diệt sâu 1. Hiệu lực diệt sâu sau 8 ngày phơi nhiễm Summary Statistics for HLDIETSAUN8 CTHUC Count Average Standard deviation Coeff. of variation CT1 3 95.0 5.0 5.26316% CT2 3 98.3333 2.88675 2.93568% KLT 3 60.0 10.0 16.6667% ANOVA Table for HLDIETSAUN8 by CTHUC Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2705.56 1352.78 30.44 0.0007 Multiple Range Tests for HLDIETSAUN8 by CTHU Method: 95.0 percent LSD CTHUC Count Mean Homogeneous Groups KLT 3 60.0 X CT1 3 95.0 X CT2 3 98.3333 X 2. Tổng vi sinh vật hiếu khí CTHUC Count Average Standard deviation Coeff. of variation CT1 3 1.34367E8 5.59527E7 41.6418% CT2 3 9.56E7 3.39575E7 35.5204% KLT 3 1.10333E9 4.04145E7 3.66295% ANOVA Table for TONGVSV by CTHUC Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.95593E18 9.77963E17 495.83 0.0000 Multiple Range Tests for TONGVSV by CTHUC CTHUC Count Mean Homogeneous Groups CT2 3 9.56E7 X CT1 3 1.34367E8 X KLT 3 1.10333E9 X 4
  83. * Thí nghiệm ly tâm lần 1, loại bỏ xác sâu 1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí Summary Statistics for VSV CONGTHUC Count Average Standard deviation Coeff. of variation CT1 3 10.0989 0.0714921 0.707922% CT2 3 9.55708 0.292368 3.05918% CT3 3 8.98226 0.0770068 0.857322% CT4 3 8.86708 0.122017 1.37607% DC 3 10.0457 0.130937 1.30341% ANOVA Table for VSV by CONGTHUC Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3.9835 4 0.995875 38.73 0.0000 CONGTHUC Count Mean Homogeneous Groups CT4 3 8.86708 X CT3 3 8.98226 X CT2 3 9.55708 X DC 3 10.0457 X CT1 3 10.0989 X 2. Khảo sát số PIB Summary Statistics for PIB CT Count Average Standard deviation Coeff. of variation CT1 3 9.24711 0.00794017 0.0858666% CT2 3 9.24526 0.0502188 0.543184% CT3 3 9.18618 0.0227109 0.247229% CT4 3 9.11357 0.0220509 0.241957% DC 3 9.27744 0.171709 1.85082% Total 15 9.21391 0.0914237 0.992235% ANOVA Table for PIB by CONGTHUC Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0508742 0.0127185 1.92 0.1831 Multiple Range Tests for PIB by CONGTHUC CONGTHUC Count Mean Homogeneous Groups CT4 3 9.11357 X 5
  84. CT3 3 9.18618 XX CT2 3 9.24526 XX CT1 3 9.24711 XX DC 3 9.27744 X 3.Hiệu lực diệt sâu sau 11 ngày phơi nhiễm Summary Statistics for HIEULUCDIETSAU CT Count Average Standard deviation Coeff. of variation CT1 3 88.3333 2.88675 3.26802% CT2 3 94.4467 3.85093 4.07736% CT3 3 97.2233 2.54551 2.61821% CT4 3 88.3333 7.63763 8.64637% DC 3 87.7767 3.85093 4.38719% Total 15 91.2227 5.54547 6.07905% ANOVA Table for HIEULUCDIETSAU by CONGTHUC Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 224.921 56.2302 2.73 0.0897 Multiple Range Tests for HIEULUCDIETSAU by CONGTHUC CONGTHUC Count Mean Homogeneous Groups DC 3 87.7767 X CT1 3 88.3333 X CT4 3 88.3333 X CT2 3 94.4467 XX CT3 3 97.2233 X * Thí nghiệm ly tâm 2 lần, loại bỏ vi sinh vật, thu nhận virus 1.Khảo sát tổng số vi sinh vật hiếu khí Summary Statistics for TONGVSVHIEUKHI CT Count Average Standard deviation Coeff. of variation CT5 3 8.28252 0.232432 2.80629% CT6 3 8.5525 0.238566 2.78943% CT7 3 8.58051 0.300379 3.50071% KLT 3 10.0457 0.130937 1.30341% 6
  85. ANOVA Table for TONGVSVHIEUKHI by CT Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5.73593 1.91198 35.03 0.0001 Multiple Range Tests for TONGVSVHIEUKHI by CT CT Count Mean Homogeneous Groups CT5 3 8.28252 X CT6 3 8.5525 X CT7 3 8.58051 X KLT 3 10.0457 X 2.Khảo sát số PIB Summary Statistics for TONGSOPIB CT Count Average Standard deviation Coeff. of variation CT5 3 9.13453 0.00976775 0.106932% CT6 3 9.17511 0.0355981 0.387986% CT7 3 9.219 0.0176619 0.191582% KLT 3 9.27744 0.171709 1.85082% ANOVA Table for TONGSOPIB by CT Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0337652 0.0112551 1.44 0.3004 Multiple Range Tests for TONGSOPIB by CT Method: 95.0 percent LSD CT Count Mean Homogeneous Groups CT5 3 9.13453 X CT6 3 9.17511 X CT7 3 9.219 X KLT 3 9.27744 X 3. Hiệu lực diệt sâu sau 11 ngày phơi nhiễm Summary Statistics for DIETSAU CT Count Average Standard deviation Coeff. of variation 7
  86. CT5 3 97.2233 4.80933 4.94668% CT6 3 91.11 8.39025 9.20892% CT7 3 94.4433 9.62443 10.1907% KLT 3 87.7767 10.7159 12.2081% ANOVA Table for DIETSAU by CT Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 150.756 50.2519 0.67 0.5951 Multiple Range Tests for DIETSAU by CT Method: 95.0 percent LSD CT Count Mean Homogeneous Groups KLT 3 87.7767 X CT6 3 91.11 X CT7 3 94.4433 X CT5 3 97.2233 X * Thí nghiệm 3: Kiểm chứng CT dự đoán Summary Statistics for TPC CTHUC=KLT CTHUC=TN Count 10 10 Average 2.0036E9 6.468E7 Standard deviation 8.53219E8 1.50498E7 Coeff. of variation 42.5843% 23.268% Comparison of Means for TPC t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 7.18508 P-value = 0.00000109263 Reject the null hypothesis for alpha = 0.05. Summary Statistics for PIB CTHUC=KLT CTHUC=TN Count 10 10 Average 1.87E9 1.13E9 Standard deviation 1.71917E8 1.75119E8 Coeff. of variation 9.19344% 15.4973% 8
  87. Comparison of Means for PIB t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 9.53572 P-value = 1.84679E-8 Reject the null hypothesis for alpha = 0.05. Summary Statistics for %DIETSAU MAU=KLT MAU=TN Count 3 3 Average 78.1933 95.5533 Standard deviation 4.25789 3.85093 Coeff. of variation 5.44534% 4.03013% Comparison of Means for %DIETSAU t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = -5.23747 P-value = 0.00635114 Reject the null hypothesis for alpha = 0.05. 9