›

Đồ án Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long

pdf 104 trang thiennha21 13/04/2022 4470
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_tuyen_chon_cac_chung_trichoderma_doi_khang_nam_benh_tr.pdf

Nội dung text: Đồ án Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG TRICHODERMA ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH TRÊN CÂY THANH LONG VÀ TĂNG CƯỜNG QUÁ TRÌNH Ủ COMPOST TỪ CÀNH THANH LONG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : THÁI QUỐC ĐÔNG MSSV: 1615101003 Lớp: 16HSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2018
  2. LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của chúng em dưới sự hướng dẫn của tiến sĩ Nguyễn Thị Hai tại Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH của trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kỳ hình thức nào. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện THÁI QUỐC ĐÔNG
  3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã tạo điều kiện học tập để chúng em có thành quả như ngày hôm nay. Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, chúng em được các thầy cô trong Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình thực hiện đồ án. Chúng em xin được gửi đến các Thầy Cô lời cảm ơn chân thành nhất, nhờ có Thầy Cô đã trang bị kiến thức cho chúng em để có thể thực hiện đồ án này. Chúng em cũng xin cảm ơn Thầy Cô trong phòng thí nghiệm và các bạn cùng khóa đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để chúng em hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo chúng em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn các Thầy Cô trong hội đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này. Chúng em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe trân trọng nhất. Trong quá trình làm đồ án, do kinh nghiệm còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong các Thầy cô bỏ qua. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện THÁI QUỐC ĐÔNG
  4. MỤC LUC MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 1 3. Mục tiêu nghiên cứu 1 4. Nội dung nghiên cứu 2 5. Đối tượng nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình sản xuất thanh long ở Việt Nam 3 1.1.1. Tình hình trồng thanh long ở Việt Nam 3 1.1.2. Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long 4 1.2. Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. 4 1.2.1. Phân loại nấm Neoscytalidium dimidiatum. 4 1.2.2. Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum 5 1.3. Giới thiệu nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long. 7 1.3.1. Phân loại 7 1.3.2. Hình thức xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp 8 1.4. Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm nâu và thán thư trên cây thanh long 10 1.5. Giới thiệu về nấm Trichoderma spp đối kháng với nấm bệnh. 11 1.5.1. Phân loại 11 1.5.2. Các chủng nấm Trichoderma spp. 11 1.5.3. Đặc điểm hình thái 14 1.5.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 15 1.5.5. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của Trichoderma spp. 16 1.5.6. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma spp phòng trừ nấm gây bệnh .16 1.5.7. Một số nghiên cứu của nấm Trichoderma spp trên thế giới và ở Việt Nam. 18 1.5.8. Ứng dụng Trichoderma trong nông nghiệp 19 1.6. Khái niệm về ủ compost và sử dụng xác bã hữu cơ để ủ compost 21 1.6.1. Định nghĩa compost 21 1.6.2. Cấu trúc và cơ chế phân giải cellulose 21 1.6.3. Các thông số quan trọng trong quá trình ủ compost. 24 i
  5. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 25 2.2. Vật liệu 25 2.2.1. Nguồn nấm đối kháng, nấm gây bệnh 25 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 25 2.2.3. Hóa chất 25 2.3. Phương pháp nhiên cứu. 28 2.3.1. Quan sát khả năng sinh trưởng của Trichoderma 30 2.3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp . 30 2.3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh. 32 2.3.4. Thử nghiệm ủ compost cành thanh long của nấm Trichoderma spp 34 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Đặc điểm sinh trưởng nấm Trichoderma spp 38 3.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp 45 3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng nấm Trichoderma spp 45 3.2.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng Trichoderma spp. 47 3.3. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma spp với nấm bệnh 49 3.3.1. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum. 49 3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên thanh long. 52 3.4. Thử nghiệm ủ compost từ cành thanh long của chủng nấm Trichoderma T3 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 4.1.Kết luận 57 4.2.Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 62 Phụ lục A: Bảng số liệu thô 62 ii
  6. A.1. Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. 62 A.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. 63 A.3. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. 64 A.4. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy. 65 A.5. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy. 66 A.6. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy. 67 A.7. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 5 ngày. 68 A.8. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 7 ngày. 68 A.9. Hàm lượng C, N trong cành thanh long. 69 Phụ lục B: Số liệu xử lý 70 B.1. Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. 70 B.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. 71 B.3. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. 73 B.4. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy. 74 B.5. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy. 76 B.6. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy. 78 B.7. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 5 ngày nuôi cấy. 80 B.8. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 7 ngày nuôi cấy. 81 Phụ lục C: Hình ảnh 82 C.1. Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 82 iii
  7. C.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) và chitinase (cm) sau 2 ngày nuôi cấy của các chủng Trichoderma spp. 83 C.3. Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum. 89 C.4. Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp 93 iv
  8. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma 12 Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí 24 Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy 38 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng nấm Trichoderma spp 45 Bảng 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma sau 2NSC 47 Bảng 3.4 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum 49 Bảng 3.5 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với nấm Colletotrichum sp. 52 Bảng 3.6 Kết quả phân tích hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ tổng của nguyên liệu ban đầu và 30 ngày sau ủ. 55 v
  9. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái vi thể của Neoscytadium dimidiatum. 5 Hình 1.2 Hình thái vi thể của Colletotrichum gleoesporioides 7 Hình 1.3 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum. 11 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử cellulose 22 Hình 3.1 Chủng nấm Trichoderma T22, T26 và T3 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA. 45 Hình 3.2 Vòng phân giải enzyme cellulase của chủng Trichoderma T3,T22,T26,TC6,TC15 47 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma T3,T22,T7. 49 Hình 3.4. Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). 51 Hình 3.5 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). 51 Hình 3.6 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). 51 Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). 52 Hình 3.8 Đĩa nấm đối chứng Colletotrichum sp ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 53 Hình 3.9 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 53 Hình 3.10 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 54 Hình 3.11 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 54 Hình 3.12 Thanh long trước khi ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm. 55 Hình 3.13 Thanh long ở công thức đối chứng 30 ngày sau ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm 56 vi
  10. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CMC: Carboxymethyl cellulose NT: nghiệm thức ĐC: đối chứng PDA: Potato D-glucose Agar VSV: vi sinh vật NSC: ngày sau cấy vii
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết đề tài Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất châu Á và cũng là nước xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới. Thanh long hiện đang được trồng tại các vùng chuyên canh quy mô lớn như các tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An. Diện tích ba tỉnh này chiếm 92% tổng diện tích cả nước. Trong đó, Bình Thuận là tỉnh có diện tích trồng thanh long cao nhất nước. Theo số liệu mới nhất của sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Bình Thuận, tính đến ngày 31/12/2017, toàn tỉnh có khoảng 27.845 ha thanh long với sản lượng 696.125 tấn. Đi kèm với sự gia tăng về diện tích và sản lượng thanh long là sự gia tăng về dịch bệnh và lượng phế thải từ cành thanh long. Trong số các dịch bệnh hại trên thanh long, bệnh đốm nâu và bệnh thán thư là hai bệnh hại chính gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của thanh long. Việc sử dụng thuốc hóa học có hiệu quả thấp đối với bệnh, đặc biệt trong điều kiện mưa. Vì vậy các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm các tác nhân sinh học để quản lý bệnh hại thanh long. Trong bộ sưu tập các chủng Trichoderma của phòng thí nghiệm Viện khoa học ứng dụng, trường Đại học Công nghệ TP.HCM, có nhiều chủng có khả năng đối kháng cao với bệnh đốm nâu (Nguyễn Thị Bích Tuyền, 2016). Tuy vậy, chưa có nghiên cứu đánh giá nào trên bệnh thán thư. Vì vậy, để làm cơ sở chọn tạo các chủng tốt làm chế phẩm trừ bệnh đốm nâu và thán thư (hai bệnh hại chính trên thanh long) cũng như hỗ trợ ủ cành thanh long sinh viên tiến hành đề tài “Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long”. 2. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn các chủng Trichoderma spp có khả năng đối kháng nấm bệnh trên phế phẩm thanh long và chủng có khả năng sinh enzyme cellulase để tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long. 3. Mục tiêu nghiên cứu Xác định khả năng sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng Trichoderma spp. 1
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xác định khả năng đối kháng với nấm bệnh Neoscytadium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Xác định khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long. Ứng dụng chủng nấm Trichoderma spp ủ compost. 4. Nội dung nghiên cứu Đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng nấm Trichoderma spp. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào cellulase và chitinase của chủng nấm Trichoderma spp. Đánh giá khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của các chủng nấm Trichoderma spp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Đánh giá khả năng đối kháng nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long của các chủng nấm Trichoderma spp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Xử lý các phế phẩm của cây thanh long bằng phương pháp ủ compost ở phạm vi phòng thí nghiệm. 5. Đối tượng nghiên cứu Các chủng nấm đối kháng Trichoderma spp. Nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long. Phế phẩm thanh long lấy từ Bình Thuận. 2
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình sản xuất thanh long ở Việt Nam 1.1.1. Tình hình trồng thanh long ở Việt Nam Cây thanh long là cây ăn trái thuộc họ xương rồng, có nguồn gốc ở vùng sa mạc thuộc Mexico và Columbia, thuộc nhóm cây nhiệt đới khô. Thanh long được người Pháp mang đến Việt Nam từ thế kỷ 19, trồng rải rác trong sân vườn, đến thập niên 1980 mới được trồng thương mại. Phần lớn thanh long được trồng ở Việt Nam là loài Hylocereus undatus, có vỏ đỏ hay hồng/ruột trắng còn lại là loại ruột đỏ. Loại vỏ đỏ ruột trắng chiếm 95%, 5% còn lại là loại vỏ đỏ, ruột đỏ. Mùa thanh long từ tháng 4 đến tháng 10, rộ nhất từ tháng 5 đến tháng 8. Nhiều giống thanh long được lai tạo để tăng năng suất, chất lượng và phù hợp đất đai và khí hậu từng vùng. Tại Viện Cây ăn quả Miền Nam hiện đang bảo tồn 20 giống thanh long từ nguồn thu thập trong nước và du nhập từ nước ngoài cùng 40 giống thanh long lai, phục vụ công tác nghiên cứu, bảo tồn gen, chọn tạo giống. Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất châu Á và cũng là nước xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới. Diện tích trồng thanh long ở Việt Nam tăng khá nhanh từ 5.512 ha năm 2000 lên đến 35.665 ha diện tích trồng thanh long với tổng sản lượng đạt khoảng 614.346 tấn vào năm 2014. Theo số liệu ước tính sơ bộ năm 2015, diện tích trồng mới gần 5.000 ha, sản lượng đạt khoảng 686.195 tấn. Hiện tại, thanh long đã được trồng rộng rãi ở các tỉnh thành trên toàn quốc. Tuy nhiên, diện tích tập trung lớn nhất là: Bình Thuận, Long An, Tiền Giang (3 tỉnh này đã có hơn 37 ngàn ha) tiếp theo là Tây Ninh, Đồng Nai, một số tỉnh Tây Nguyên và các tỉnh phía Bắc. Phát triển mạnh thành các vùng chuyên canh quy mô lớn tập trung ở các tỉnh như Bình Thuận, Tiền Giang, và Long An. Diện tích thanh long của ba tỉnh này chiếm 92% tổng diện tích và 96% sản lượng của cả nước, phần diện tích thanh long còn lại phân bố ở một số tỉnh miền nam như Vĩnh Long, Trà Vinh, Tây Ninh, Bà Rịa – Vũng Tàu và một số tỉnh Miền Bắc. Bình Thuận là nơi có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất chiếm 63,2% diện tích và 68,4% sản lượng cả nước, kế đến là Long An (chiếm 17,3% diện tích và 14,2% sản lượng) và đứng thứ ba là Tiền Giang (chiếm 10,9% diện tích và 13,7% sản lượng). 3
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.2. Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long Thanh long là cây trồng có giá trị xuất khẩu cao của Việt Nam. Bình Thuận là tỉnh có diện tích trồng thanh long nhiều nhất trong cả nước. Trong quá trình canh tác, nông dân gặp khó khăn trong khâu đảm bảo vệ sinh môi trường. Một trong nhưng nguyên do là sau lượng lớn cành thanh long, bông lép, trái thối sau khi được cắt tỉa không có chỗ tiêu hủy. Như vậy, bình quân mỗi năm có từ 3 – 4 vụ nên lượng phế phẩm từ cây thanh long lớn, nhiều hộ dân đã dùng biện pháp tủ dưới gốc thanh long, hoặc đổ đống ngay tại vườn gây hôi thối, là nguồn phát sinh gây bệnh cho cây thanh long. Điều này vừa ảnh hưởng đến môi trường, vừa không đảm bảo đúng quy trình sản xuất theo tiêu chuẩn ViệtGAP (Theo thời báo Úc, 2017). 1.2. Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. 1.2.1. Phân loại nấm Neoscytalydium dimidiatum. Bệnh đốm trắng hay còn gọi là bệnh đốm nâu, tắc kè, bệnh ma là những tên gọi khác nhau mà bà con nông dân trồng thanh long ở Bình Thuận, Tiền Giang và Long An đặt cho một loại dịch hại mới phát sinh. Theo ghi nhận của Viện Nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam thì trên thực tế bệnh đốm trắng bệnh này đã xuất hiện rải rác đầu tiên vào năm 2008 tại Bình Thuận và Tiền Giang và đến năm 2011 trở lại đây thì bệnh tấn công mạnh và lây lan nhanh hơn. Sau khi phân lập và định danh theo mô tả hình thái của Crous và cộng sự (2006), xác định nguyên nhân gây bệnh đốm trắng là nấm Neoscytalidium dimidiatum. Kết quả này tương tự như với các nghiên cứu ở Đài Loan (Chuang, et al. 2012) và ở Malaysia (Masratul Hawa, et al. 2013). Đặc điểm vị trí phân loại của nấm Neoscytalidium dimidiatum (Agrios, 2005; Crous & Slippers, 2006). 4
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ngành: Ascomyta Lớp: Dothideomycetes Bộ: Botryosphaeriales Họ: Botryosphaeceae Chi: Neoscytalidium Loài: Neoscytalidium dimidiatum Hình 1.1 Hình thái vi thể của N.dimidiatum thuộc ngành nấm túi Neoscytadium dimidiatum. (nguồn internet) (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thư ờng có một nhân, đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắ t đầu đứt đoạn ra tạo thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào cấu tạo bằng chitin và glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất, trong nước, trên cạn, thực vật, động vật, một số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật, động vật, người gây nên những thiệt hại lớn. Ascomyta sinh sản sinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào, nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính (conidia) và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+,-) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi. Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế. Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lỗ và quả thể hở. Cơ chế gây bệnh của nấm Neoscytalidium dimidiatum: Bào tử nấm nảy mầm trên bề mặt tiếp xúc rồi xâm nhập vào trong mô gây hoại tử, bệnh gây hại trên thân cành và quả thanh long. 1.2.2. Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum 1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu nước ngoài Theo báo cáo đầu tiên về nấm Neoscytalidium dimidiatum trên cây có múi tại Italya (G. Polizzi et al, 2009) vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện và chú ý ở phía Sicily, Italy trong vườn cây có múi, cam ngọt 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh 5
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP mới với triệu chứng điển hình là chồi kém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm. Theo nghiên cứu viện nghiên cứu sở nông nghiệp, Đại học quốc gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh đốm trắng đã xuất hiện ở một số cây Thanh long tại Đài Loan. Triệu chứng của bệnh là các vết nhỏ, tròn, vết bệnh lõm, màu cam. Bệnh được xác định do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Năm 2008, nấm Neoscytalidium dimidiatum đã phát hiện trên các quả Thanh long trồng ở Malaysia. Neoscytalidium dimidiatum đã gây ra triệu chứng như chấm tròn nhỏ, thối và sau đó mục nát. Mẫu bệnh đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 250C trong 7 ngày. Nấm thu được nuôi cấy trên môi trường PDA, nấm có quả cành màu đen, đường kính 90mm, hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn trong pha lê có 2 vách ngăn. DNA chiết từ sợi nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA thực hiện phản ứng khuếch đại sử dụng mồi ITS4 và ITS5. Cuối cùng thực hiện lây bệnh nhân tạo để so sánh đánh giá bệnh. 1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Sự xuất hiện một loại dịch hại mới phát sinh gần đây gây thiệt hại nghiêm trọng và có xu hướng càng ngày lan rông, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả là mối lo ngại cho người nông dân trồng thanh long. Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền nam (2011), bệnh đốm trắng do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra, nấm này còn có tên khác là Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea, (Crous et al. 2006) bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh và mùa mưa, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển từ 20 – 30˚C. Ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan mạnh. Bệnh lây theo gió và nguồn nước nhiễm bệnh. Qua theo dõi thấy bệnh hại nặng ở những vùng có mực nước ngầm cao, những vườn vệ sinh kém, rậm rạp và bị che mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay phân bón phân chuồng chưa ủ hoai, vườn sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng hay vườn bón thiếu trung, vi lượng đều có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi có bệnh thì khó phòng trừ hơn. Vết bệnh ban đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, hơi lõm, về sau chuyển sang màu vàng cam và khi bệnh phát triển nặng đốm bệnh trở thành vết loét có màu nâu, hơi nổi lên và gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây, năng suất 6
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP và giá trị thương phẩm của quả. Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Theo Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2014) khi so sánh trình tự vùng gen ITS- RADN của mười một mẫu phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum tại Viện Nghiên Cứu CNSH và Môi Trường - trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh cho thấy các mẫu phân lập tương đồng rất cao với trình tự của loài Neoscytalidium dimidiatum đã được định danh về hình thái. Hà Thị Thúy và các cộng sự (2016) tại Viện Môi trường Nông nghiệp đã nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long do nấm Neodiumdimidiatum gây ra. Nghiên cứu đã xác định được 2 chủng vi sinh vật có khả năng ức chế Neoscytalidium dimidiatum cao là chủng Bacillus polyfermenticus và Streptomyces fradiea và đảm bảo an toàn sinh học khi đưa ra môi trường. 1.3. Giới thiệu nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long. 1.3.1. Phân loại Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Glomerellales Họ: Glomerellaceae Chi: Colletotrichum Loài: Colletotrichum sp Hình 1.2 Hình thái vi thể của Colletotrichum gloeosporioides (nguồn intrernet) Nấm Colletotrichum có hệ khuẩn ty thật, gồm có sự phát triển sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu và vách ngăn sợi nấm. Hệ sợi nấm có gian bào và nội bào, mỗi tế bào chứa nhiều nhân. Nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm. Khi chín, sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng (Nguyễn Văn Bá và cs, 2005). Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là bào tử hậu (= bào tử áo = chlamydospores), nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới (Nguyễn Văn Bá và cs, 2005). 7
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Theo Agrios (2005) thì ở giai đoạn vô tính chúng cho ra các bào tử đính đơn bào, có dạng hình thoi, hình liềm hoặc hình trụ không màu và đôi khi có giọt dịch trong bên trong bào tử. Bào tử vô tính được sinh ra trong đĩa đài (acervulus) chứa nhiều đính bào đài (conidiophore) và gai cứng (setae) ở mép bìa đĩa đài hoặc giữa các cành bào đài. Đĩa đài dạng tròn hoặc dạng gối, có sáp, màu đen, có thể được quan sát trên bề mặt môi trường thạch agar bằng kính hiển vi. Trên mô bệnh, đĩa đài được tìm thấy bên dưới lớp biểu bì. Cành bào đài đơn giản, thon dài, bào tử trong suốt, một tế bào, dạng trứng hoặc dạng thon đến dạng liềm (Barnett và Hunter, 1998). Colletotrichum thường sản xuất khối bào tử nhày dính bên trong đĩa đài. Khối bào tử màu hồng hay màu da cam và đĩa đài đôi khi nhầm lẫn với ổ bào tử của nấm Fusarium. Những loài trong chi nấm Colletotrichum có thể hoặc không thể sinh ra gai . Theo Barnett và ctv(1998), trong nuôi cấy, gai cũng có thể không xuất hiện. Các gai dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ. Riêng ở loài Colletotrichum gloeosporioides, Padman và Janardhna còn ghi nhận thêm là mỗi loài nấm đều có bào tử và gai đặc trưng, sự sinh ra gai của nấm Colletotrichum chịu ảnh hưởng của ẩm độ không khí, gai được sinh ra nhiều ở điều kiện ẩm độ không khí tương đối thấp (Nguyễn Văn Bá và ctv., 2005). Phần lớn các chủng nấm Colletotrichum phân lập được ở Việt Nam thuộc loài C. gloeosporioides, chúng có khả năng gây bệnh trên cây thanh long cao hơn so với các loài khác. Các chủng của loài C. gloeosporioides chủ yếu được phân nhóm về mặt di truyền theo nguồn gốc địa lý. Thán thư (Anthracnose) mang nghĩa là “thui đen”, là bệnh hại trên tán lá cây, thân cành hoặc trái với đặc điểm là sự xuất hiện của những đốm màu đen hoặc những vết thương lõm xuống với mép rìa mảnh nhô lên (Agrios, 2005). Nó cũng là nguyên nhân của một số hiện tượng chết ngược của cành non, nhánh. Trong sự xâm nhiễm ở trái, triệu chứng thán thư thường có giai đoạn tiềm ẩn kéo dài. Triệu chứng ở một số cây ăn trái là những đốm nhô cao và có hóa bần trên bề mặt (Agrios, 2005). 1.3.2. Hình thức xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp Để nấm Colletotrichum xâm nhập vào mô kí chủ, chúng có 2 hình thức: Bằng cách bào tử đính nảy mầm và hình thành đĩa áp để xâm nhập trực tiếp 8
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong chi Colletotrichum có cấu trúc xâm nhiễm đặc biệt giúp nấm xâm nhập vào mô kí chủ được gọi là đĩa áp. Đĩa áp được xem là bộ phận rất quan trọng và cần thiết cho sự xâm nhiễm thành công của nấm (Perfec et al, 1990). Trong điều kiện môi trường thích hợp, ống mầm sẽ được tạo ra từ bào tử. Điều này được gọi là nảy mầm hay mọc mầm của bào tử. Với sự tăng trưởng liên tục của ống mầm, đĩa áp sẽ được phân biệt ở hai đầu của nó và dần dần tối màu lại (O'Connell et al, 2000). Trong đó, tín hiệu đầu tiên của bào tử nảy mầm là tiết ra chất extracellular matrix (ECM), chất ECM được coi là dấu hiệu trong suốt quá trình nảy mầm và hình thành đĩa áp, tổng thời gian để bào tử nảy mầm và tạo thành đĩa áp là 6 ˗ 9 giờ. Quá trình hình thành và phát triển của đĩa áp trải qua 7 giai đoạn: (1) Tiết ECM (2) Phân chia nhân (3) Tạo thành vách ngăn đầu tiên (4) Mầm nhú ra (5) Đỉnh phồng lên (6) Tạo thành vách thứ cấp (7) Sự hình thành melanin của đĩa áp Bằng cách xâm nhập thụ động vào mô kí chủ Bên cạnh xâm nhiễm trực tiếp bằng cách hình thành đĩa áp, nấm còn có thể xâm nhiễm bằng các con đường khác một cách thụ động. Nấm có thể xâm nhập qua các lỗ hở tự nhiên hoặc qua các vết thương trên cây (Đường Hồng Dật, 1984). Vết thương trên cây có thể do côn trùng, sâu bọ, tuyến trùng chích hút, cắn phá hoặc do các động vật lớn gây ra (trâu, bò, chim, chuột, gà, vịt, ) ở các bộ phận trên mặt đất và trong đất. Vết thương còn do dụng cụ trong quá trình chăm sóc cây gây ra hoặc do bứng cây đem trồng, Vết thương cũng có thể là vết nứt trong lúc chồi non, mầm hoa đâm ra từ thân, cành của cây. Ngoài ra, vết thương còn do yếu tố tác động của giông bão, lũ lụt. Sự tích tụ các muối độc trong điều kiện đất ẩm cũng có thể làm cho rễ và cổ rễ bị tổn thương do tế bào ở nơi tiếp xúc với các chất độc đó bị chết đi. Cũng theo ông, các vết thương nhỏ li ti sẽ nhanh chóng được hàn gắn lại nên ít bị kí sinh xâm nhập vào, còn các vết thương to là nơi thuận lợi nhất cho tất cả các mầm bệnh xâm nhập vào. 9
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các cửa ngõ tự nhiên trên cây bao gồm các khí khẩu (Stoma) ở lá, bì khẩu (Lenticles) ở thân, cành và các thủy khẩu (Hydathodes) ở trên lá của một số loài cây. Các cửa ngõ này do không có các bộ phận bao che tốt như lớp cutin hoặc lớp sáp, chúng được cấu tạo hở nên rất dễ bị các loại mầm bệnh lợi dụng và xâm nhập vào một cách dễ dàng. 1.4. Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm nâu và thán thư trên cây thanh long. Để đảm bảo cây thanh long sinh trưởng và phát triển tốt hạn chế bệnh hại cây cần kiểm soát và quản lý từ giống, môi trường, biện pháp canh tác trong phòng trừ và trị bệnh cho cây trồng. Trồng các giống sạch bệnh, cần lựa chọn kỹ các cây con trước khi trồng, các cây có dấu hiệu nhiễm bệnh cần loại bỏ. a. Biện pháp canh tác Trước khi trồng cần làm sạch vườn để loại bỏ các nguồn có nguy cơ gây bệnh cho cây từ đất, nước, xác bã thực vật, dọn dẹp cỏ và các loại dây leo hoang dại xung quanh vườn thanh long. Tỉa cành tạo độ thông thoáng, thu gom và tiêu hủy các bộ phận của cây bệnh bằng cách chôn sâu hoặc đốt, ngoài ra, có thể xử lý bằng các chế phẩm sinh học làm phân bón, không vứt cành, quả bệnh xuống mương nước sẽ làm mầm bệnh dễ lây lan. Bón phân hữu cơ đã ủ hoại mục, cung cấp thêm vôi trước và sau mùa mưa. Bổ sung thêm vi lượng ( Bo, Canxi, Magie, Silic, Bo ) tăng sức kháng chịu cho cây. Cuối mùa khô, những cành còn phấn non nên tiến hành cắt 2 – 3 cm ở đầu mút cành để thoát nước đọng trên cành, giúp thúc nhanh quá trình già hóa cành nhằm hạn chế bệnh gây hại. Không để chồi non trong mùa mưa, nếu chồi non ra phải cắt tỉa hết và khử trùng ngay vết cắt bằng thuốc có chứa gốc đồng, tăng cường chăm sóc cây trong mùa mưa. b. Biện pháp sinh học Các tác nhân sinh học có khả năng phòng bệnh tốt không kém hơn thuốc hóa học nhưng lại an toàn và tiết kiệm chi phí hơn. Có thể bổ sung chế phẩm sinh học Trichoderma trộn với phân hữu cơ bón cho đất nhằm cung cấp nguồn dinh dưỡng cần thiết đồng thời tăng khả năng kiểm soát nguồn bệnh. 10
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP c. Biện pháp hóa học Khi cây ra đọt non có thể phun ngừa luân phiên các loại thuốc bảo vệ thực vật có chứa hoạt chất Propiconazole, Trifloxystrobin, Iprodione, Mancozeb 7 – 10 ngày/lần (tuỳ vào điều kiện mưa bão). Thường xuyên kiểm tra vườn để kịp thời phát hiện bệnh khi mới xuất xuất hiện để phun thuốc kịp thời. Ngoài ra, nên rút râu bông thanh long sớm ở thời điểm 2 – 3 ngày sau trổ và tương tự phun ngừa các loại thuốc nêu trên cho giai đoạn trái non và trái chuẩn bị thu hoạch. Lưu ý khi phun xịt thuốc ở giai đoạn chuẩn bị thu hoạch trái phải tuyệt đối tuân thủ và đảm bảo thời gian cách ly thuốc an toàn. 1.5. Giới thiệu về nấm Trichoderma spp đối kháng với nấm bệnh. 1.5.1. Phân loại Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc phân loại: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ Hypocreaceae Chi: Trichoderma Trichoderma thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes) không có giai đoạn sinh sản Hình 1.3 Hình thái vi thể của hữu tính, sinh sản vô tính bằng bào tử. Nhóm nấm Trichoderma harzianum. (nguồn internet) bất toàn là những nấm sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử. 1.5.2. Các chủng nấm Trichoderma spp. Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma, ông cho rằng tùy từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau. 11
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma Tên loài Đặc điểm Hình ảnh Đại thể: Khuẩn lạc phát triển nhanh, đạt 8 – 9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở 20˚C, sợi nấm trong suốt, vách dày, trơn láng rộng 2 – 14µm. Bào tử màu Trichoderma xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục atroviride đường kính từ 4 – 12µm, khi nấm già thường mất màu hay màu vàng nhạt hoặc xám, bào tử già phát ra mùi hương dừa (Kubicek và Harman, 1998). Đại thể: Môi trường có nhiệt độ từ 15 – 35˚C, pH: 3,7 – 4,7 rất thích hợp cho sự phát triển của nấm Kubicek và Harman (1998). Khuẩn lạc phát triển nhanh, đường kính khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 20˚C. Bào tử đính có hình Trichoderma cầu méo đến bầu dục ngắn, màu hazianum xanh lục, vách trơn láng, kích thước (2,7 – 3,2) x (2,5 – 2,8)µm Sinh hóa: Là loài nấm rất phổ biến trong đất (Cook và Baker, 1983), nảy mầm tốt nhất trong môi trường mùn cưa có độ ẩm khoảng 30% (Domsch và Gams,1980). 12
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính 3 – 5cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 20˚C, bào tử có hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3,0 – 4,8) x (1,9 – 2,8)µm. Trichoderma Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp đất koningii mặt, nhưng ở độ sâu 120cm vẫn có sự hiện diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 26˚C trở lên tùy theo nguồn gốc của loài, pH: 3,7 – 6,0 (Cook và Baker, 1983). Đại thể: Đường kính khuẩn lạc đạt 7 cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 20˚C Bào tử màu xanh lục, trơn, dạng elip, có kích thước khác nhau tùy theo chủng Trichoderma (Domsch và Gams,1980). hamatum Sinh hóa: Nhiệt độ 24˚C và pH: 3,7 – 4,7 là những điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của Trichoderma hamatum và chúng phát triển chậm lại ở 00C (Domsch và Gams,1980). Đại thể: Bào tử màu xanh lục, vách xù xì, dạng hình cầu, kích thước (4 – 5) x (2,5 – 3)µm (Cook và Trichoderma Baker, 1983). viride Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai nguồn nitrogen đơn giản và phức tạp. Khi Trichoderma tăng trưởng trên nguồn carbonhydrate như là 13
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nguồn carbon cho dinh dưỡng thì ammonium được sử dụng tốt hơn là nitrate (Danielson và Davey, 1973). 1.5.3. Đặc điểm hình thái Sinh thái học của Trichoderma cho chúng ta biết sự phân bố của chúng trong đất. Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong đất, trên vỏ cây mục nát. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma (Klein và Eveleigh,1998). Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có liên hệ mật thiết với nhau. Nhìn chung các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất trung tính hoặc kiềm. Cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy từng loài. Bào tử đính ở đỉnh của cành. Bào tử của hầu hết các loài có hình elip, 3 – 5 x 2 – 4 µm (L/W=1,3), bào tử hình cầu (L/W < 1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài. Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5 µm. Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 25˚C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998). Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%). Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả năng này mất dần đi. Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của Trichoderma. Bào tử sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ duy trì cân bằng trong đất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào đất). Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà Trichoderma harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học (Nguyễn Hoàng 14
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Anh, 2013). 1.5.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là monosaccharide, disaccharide, polysaccharide .NH3 là nguồn đạm mà nấm Trichoderma dễ sử dụng, nên trong môi trường nuôi cấy Trichoderma người ta thường bổ sung NH3, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiều dinh dưỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma (Gary, 2005). Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 30˚C, có một vài loài Trichoderma tăng trưởng được ở 35˚C. Một số ít phát triển tốt ở 40˚C. Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5 – 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5 và phát triển tốt ở pH trung tính (Vũ Triệu Mân, 2007). Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5. Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ tối ưu của Trichoderma trong khoảng 25 – 30˚C. Một vài dòng phát triển tốt ở 35˚C, một số ít phát triển được ở 40˚C. (Gary J.Samuels, 2004). Theo Prasun K.M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau ở những nhiệt độ khác nhau. Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau. Ví dụ: Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu ấm áp. Ánh sáng có tác động sâu sắc trên nhiều loại nấm bằng cách ảnh hưởng đến quá trình sống đa dạng của chúng, chẳng hạn như: tác động đến tốc độ tăng trưởng, quá trình chuyển hóa, sắc tố, và sự chuyển hóa. Tác động của ánh sáng trên nấm đã là chủ đề được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và bàn luận (Kubicek và Harman, 1998). Quá trình hình thành bào tử được cảm ứng theo hai con đường khác nhau: thiếu dinh dưỡng hoặc ánh sáng. Khi khuẩn lạc của Trichoderma viride phát triển trong cảm ứng tối do thiếu dinh dưỡng, hình thành bào tử màu xanh đậm và bắt đầu khuếch tán từ trung tâm của khuẩn lạc, tại đó chất dinh dưỡng đã bị sử dụng hết. Mặt khác, việc hình thành bào tử được 15
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP cảm ứng bởi các xung ánh sáng tạo điều kiện cho các khuẩn lạc phát triển trong tối, trước khi để chiếu (Gary,2004). 1.5.5. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của Trichoderma spp. Theo Lynch và Harper (1985) thì Trichoderma có khả năng phân hủy xác bã thực vật còn sót lại sau mùa vụ và chuyển chúng thành đường, đồng thời chúng còn có khả năng ký sinh và diệt một số nấm bênh gây hại cho cây trồng. Những chất do nấm Trichoderma tiết ra bao gồm: endochitinase, chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucusaminidase (NADase), trypsin chymotrypsin, glucan 1,3-β- glucosida, cellulase, proterase, lypase (Marco, 2002; Kredics và ctv, 2003). Enzyme cellulase thuộc lớp Hydrolase (phản ứng thủy phân), tố Gycosidases (thủy phân liên kết glucoside), nhóm hydrolyzing O-glycosyl compounds (Phạm Thị Trân Châu và cộng sự, 2006). Cellulase là enzyme thủy phân cellulose, là hệ thống enzyme phức hợp bao gồm cellulase C1, cellulase Cx và glucosidase. Trong đó, cellulase C1 và Cx thủy phân cellulose thành cellobiose, còn glucosidase tiếp tục thủy phân cellsobiose thành glucose (Trần Minh Tâm, 2000). Trichoderma là nấm hoại sinh trong đất có khả năng tiết enzyme cellulase nên trong hệ sinh thái vi sinh vật có vai trò quan trọng trong xử lý xác bã thực vật. Khả năng phân hủy cellulose của nấm Trichoderma bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như: ẩm độ, độ thoáng khí, pH, hàm lượng nitrogen. Bên cạnh đó hiệu quả của sự phân hủy này còn phụ thuộc vào cơ chất sử dụng và sự sinh trưởng của nấm. 1.5.6. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma spp phòng trừ nấm gây bệnh. Nấm Trichoderma còn được sử dụng như một tác nhân sinh học bảo vệ cây trồng chống lại các loại nấm gây hại như: Pythium spp., Phytophthora spp., sclerotinia spp., Botrytis spp. và Fusarium spp gây bệnh khô vằng ở lúa, bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, sầu siêng,bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lú, hồ tiêu, bắp đậu, cà rốt, cà chua (Bùi Xuân Đồng,1982). Theo Harman (1996), nấm Trichoderma spp. có các cơ chế đối kháng như: cơ chế ký sinh, tiết kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và cạnh tranh không gian sống. 1.5.6.1. Ký sinh 16
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ tính hướng hóa chất, nó ký sinh phân nhánh hướng về những nấm đã được định trước (do những nấm này tiết ra các hóa chất). Ngoài ra, vật ký sinh và vật đối kháng được Trichiderma nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể tự nhiên hay hóa học (qua trung gian lectin trên bề mặt tế bào của mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời, Trichoderma ký sinh và cuộn quanh sợ nấm vật chủ thông qua hình thành các dạng móc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β-glucanase, protease, những enzyme này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công trực tiếp của Trichoderma. 1.5.6.2. Tiết kháng sinh Sản xuất kháng sinh giúp ngăn cả sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào, ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. (Nguyễn Hoàng Anh, 2013). Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides, isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do T. harzianum sinh ra; các kháng sinh gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do T. virens sinh ra. 1.5.6.3. Cạnh tranh Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết chất dinh dưỡng một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chóng chịu (chlamydospores). Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Brotrysis spp. và Slerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng, từ đó xâm nhập vào những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử dụng những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và nấm Sclerotina spp. Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào 17
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tử Pythium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết của cây vì thế mà các bào tử Pythium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Trần Thị Thanh Thuần, 2009). Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn carbon, nitơ và yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng khác với nấm bệnh. T. harzianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại những vùng bị nhiễm, đã chứng minh rằng sự cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T. harzianum sử dụng để kiểm soát nấm bệnh F. oxysporum . 1.5.7. Một số nghiên cứu của nấm Trichoderma spp trên thế giới và ở Việt Nam. 1.5.7.1. Nghiên cứu trên thế giới Eman R. Hamed, 2015 đã phân lập và sử dụng Trichoderma Asperellum nhưng một tác nhân sinh học kích thích sinh trưởng và có khả năng đối kháng với nấm bệnh trên đậu đũa. Theo Buimistru (1997) dùng chế phẩm Trichoderma spp. có tác dụng phòng trừ bệnh hại cây trồng, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh rõ rệt, chế phẩm nấm đối kháng nấm Trichoderma có thể giúp cây khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác dụng kích thích sinh trưởng đối với cây. Năm 2010, Vinit Kumar Mishra đã chọn được 10 chủng Trichoderma để đối kháng với Pythium aphanidermatum bằng phương pháp đồng nuôi cấy. 1.5.7.2. Nghiên cứu ở Việt Nam Tricoderema đã được biết đến gần đây, có ảnh hưởng lớn đến nền nông nghiệp Việt Nam. Các chế phẩm Trichoderma đã được sử dụng trong quá trình canh tác cây trồng, góp phần làm giảm đáng kể nấm gây bệnh. Có tác dụng lâu dài không ảnh hưởng đến sức khỏe do việc sử dụng thuốc hóa học. Một số nghiên cứu về nấm Trichoderma: Năm 2006, Huỳnh Văn Phục với đề tài nghiên cứu “ Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và bắp”. Kết quả thu được là phân lập được 17 dòng nấm Trichoderma spp. có khả năng đối kháng tốt với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum . 18
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trần Thị Thanh Thuần và cộng sự (2009) đã nghiên cứu enzyme cellulase và pectinase chủng Trichoderma Viride và Aspergillus Niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê cho thấy điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase của T.vỉide là 4 ngày, độ ẩm 58%, hàm lượng giống là 8%. Điều kiện tối ưu cho sự phân giải trên vỏ cà phê là 14 ngày, độ ẩm 60% hàm lượng giống 8%. Hồng Châu, (2009) cho rằng nấm Trichoderma giúp thúc đẩy tiến trình phân giải chất hữu cơ nhanh hơn được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh sẽ rút ngắn thời gian hoại mục. Năm 2017 Nguyễn Đức Huy và cộng sự đã phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của Trichoderma asperellum đối với tác nhân gây bệnh cây có nguồn gốc trong đất. Kết quả thu được nấm T.asperllum có khả năng ức chế tốt sự phát triển của nấm R. solani gây bệnh lở cổ rễ và nấm S. clerotiorum gây bệnh thối hạch bắp cải trong điều kiện invitro. Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2017) đã tiến hành đề tài đánh giá khả năng đối kháng của một số dòng Trichoderma đối với Phytopythium helicoides trong điều kiện phòng thí nghiệm. Các chế phẩm sinh học của Viện Sinh học nhiêt đới như BIO-F, chế phẩm sinh học chứa các VSV do nhóm phân lập và tuyển chọn: xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm mốc Trichoderma sp. và vi khuẩn Bacillus sp Những VSV trên trong chế phẩm sinh học có tác dụng phân hủy nhanh các hợp chất hữu cơ trong phân lợn, gà và bò (protein và xenlulo), gây mất mùi hôi. Trước đó, chế phẩm sinh học BIO-F đã được sử dụng để sản xuất thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ bùn đáy ao, vỏ cà phê và xử lý rác thải sinh hoạt. 1.5.8. Ứng dụng Trichoderma trong nông nghiệp Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ. 1.5.8.1. Khả năng kiểm soát bệnh cây 19
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhiều chủng nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát các loài nấm gây bệnh cho cây trồng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với các loại nấm gây bệnh thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium (Dương Xô Hoa, 2005). Các loài nấm Trichoderma nói chung phát triển trong môi trường tự nhiên trên bề mặt của rễ cây, do đó có tác dụng kiểm soát sinh học với một số bệnh trên rễ gây ra bởi tuyến trùng và nấm, nó còn giúp tái tạo, phục hồi các rễ bị tổn thương do tuyến trùng hoặc rệp sáp gây ra. Nấm Trichoderma còn tạo ra các chất có hoạt tính tương tự như “thuốc kháng sinh”, có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh đồng thời Trichoderma còn ký sinh các loài nấm gây bệnh, tiết ra các enzyme phân hủy chúng. Ngoài ra nấm Trichoderma phòng trừ được các bệnh trên lá do loài nấm này kích thích bộ rễ tổng hợp chất đề kháng để chống lại các tác nhân vi sinh vật xâm nhập, các chất đề kháng này từ rễ di chuyển đến các bộ phận phía trên của cây (Dương Xô Hoa, 2005). Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số chủng nấm Trichoderma có khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những chủng nấm này cũng có khả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm. 1.5.8.2. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng Nấm Trichoderma kích thích sự tăng trưởng và phát triển của bộ rễ. Trichoderma bám vào những vùng rễ cây như những sinh vật cộng sinh khác. Nó tiết ra đất những chất kích thích để rễ cây ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành một lớp thành bảo vệ vùng rễ tránh sự xâm nhập của nấm bệnh, làm giảm khả năng nhiễm bệnh nhờ Trichoderma bám vào các đầu rễ cây, tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều cao của cây, tăng năng suất cây trồng. Hiện nay, một chủng nấm Trichoderma đã được phát hiện có khả năng tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán. 1.5.8.3. Khả năng phân hủy cellulose , phân giải lân chậm tan 20
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lợi dụng khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân của nấm Trichoderma mà trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân hủy hữu cơ được nhanh chóng. Sử dụng chế phẩm Trichoderma ủ phân hữu cơ để bón cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất. Phân giải nhanh các chất hữu cơ thành dạng dễ tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số nấm bệnh gây hại cho cây trồng, chất lượng phân cao hơn. Chế phẩm nấm Trichoderma được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm rạ, sau đó được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ. Phân hữu cơ được bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng. Kết quả nghiên cứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân hữu cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50% phân hữu cơ với 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46%. Khi bón 100% phân hữu cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trễ hơn và ít gây hại cho cây lúa và quần thể vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn so với bón 100% phân vô cơ . Với những hiệu quả mà chế phẩm Trichoderma mang lại, bà con nông dân nên sử dụng chế phẩm sinh học thay cho việc dùng các loại phân bón hóa học để cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng, góp phần bền vững môi trường đất canh tác nông nghiệp. 1.6. Khái niệm về ủ compost và sử dụng xác bã hữu cơ để ủ compost 1.6.1. Định nghĩa compost Ủ phân (composting): Là quá trình phân hủy chất hữu cơ tự nhiên chủ yếu là cenlulose bởi quần thể vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, ) dưới tác động của nhiệt độ, độ ẩm, không khí tạo nên sản phẩm cuối cùng là chất mùn và chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể hấp thụ được (Haug,1993). 1.6.2. Cấu trúc và cơ chế phân giải cellulose Cellulose là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ gốc β–D– glucose bằng cầu nối β–1,4–glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng của thực vật. Vì vậy, cellulose là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên. Cellulose có cấu trúc mạch thẳng dạng sợ rất bền, khó bị phân hủy. 21
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.4 Cấu trúc phân tử cellulose (nguồn internet) Theo cơ chế thủy phân của King (1969) và Reese (1952) ngoài 3 enzyme chính của quá trình thủy phân : Exo–β–1,4D glucanaza (hay 1,4–β–D glucan4–glucanohydrolaza). Enzyme này thủy phân Cellulose vô định hình hoặc Cellulose đã biến tính như Cacboxymethylcelluloza (CMC). Exo–β–1–4 glucanaza (hay exocellobbiohydrolaza) tấn công lên các liên kết Cellilose kết tinh vô định hình như các xenlo-saccarit từ các đầu không thử của chuỗi Cellulose. Exo–glucanaza tác động rất yếu lên các Cellulose biến tính như CMC.HEC (hydroxyl etyl celluloza). β–1–4glucanaza (hay xenlobioaza) thủy phân các xenlobiaza và xenlo-sacarit mạch ngắn. Glucoza là sản phẩm thủy phân duy nhất của enzyme này. Còn có C1 là tiền nhân tố thủy phân có tác dụng làm trương nở Cellulose tự nhiên làm cho phân tử trở nên hoạt động. Chuỗi cellulose hoạt động sẽ bị phân cắt bởi endo và exo-glucanaza thành các xenlo-oligosacarit tạo cơ chất cho xenlobiaza thủy phân tiếp thành đường glucoza. Cenlulose bị VSV phân hủy thành các thành phần có phân tử lượng nhở hơn. Chính những thành phần nhỏ này kết hợp với những thành phần khác trong đất tạo thành mùn. Cơ chế phân giải: Cenlulose → disaccarit → monosaccarit (glucose) Khi mùn được hình thành, vi sinh vật lại tiếp tục phân hủy mùn bằng quá trình amon hóa, sự chuyển hóa này giúp đất tích lũy NH3. Sự tạo thành NH3 trong đất xảy ra 22
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP chậm chạp và điều này rất có lợi cho cây trồng vì quá trình cây hấp thụ NH3 cũng chậm, không làm dư đạm dễ phát sinh dịch bệnh. Chất mùn + O2 + Vi sinh vật ==>CO2 + H2O + NH3 Trong tự nhiên, nhiều loài vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc phân giải cellulose rất mạnh nhờ tiết ra cenlulase ngoại bào. Nấm Trichoderma có thể phân giải 48% cellulose trong 10 ngày lên men nguyên liệu lingo-cellulose. Nấm Phnerochaete chrysosporium phân giải 69% cellulose tự nhiên trong 28 ngày. Trong điều kiện thoáng khí, cellulose được phân giải bởi các vi sinh vật hiếu khí. Ngoài ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia tích cực vào quá trình phân giải cellulose. Các sinh vật như: Cytophaga, Cellulomonas, Bacillus, Clostridium, Aspergillus, Penicillium, • Các nhóm vi sinh vật có mặt trong quá trình ủ phân Vi khuẩn: trong đất người ta phân lập được các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí như Brevibacllus, PaeniBacillus, Bacillus và Geobacillus. Đối với các dòng ưa ấm, pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và 550C còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 750C (Rastogi, G., et al. 2009) Xạ khuẩn: có vai trò trong việc phân hủy các chất hữu cơ phức tạp như cellulose, lignin, chitin và protein trong quá trình ủ. Enzyme của chúng cho phép xạ khuẩn phân hủy hóa học các mảnh vụn như thân cây, vỏ cây. Một vài loài xuất hiện trong giai đoạn chịu nhiệt trung bình, những loài khác đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn làm mát và ổn định. Nấm: có vai trò quan trọng trong việc phân hủy các mảnh vụn, tạo cho các vi khuẩn tiếp tục quá trình phân hủy hết các cellulose còn lại. Các loài nấm có số lượng lớn trong cả 2 giai đoạn: nhiệt độ trung bình và nhiệt độ cao. Hầu hết nấm sống ở lớp bên ngoài của đống ủ khi nhiệt độ cao. Động vật nguyên sinh: tìm thấy ở trong nước rỉ rác của đống ủ, chúng ăn các hợp chất hữu cơ, vi khuẩn và nấm. 23
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6.3. Các thông số quan trọng trong quá trình ủ compost. Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí Thông số Giá trị Quá trình ủ đạt hiệu quả tối ưu khi kích thước cơ chất khoảng 25 – 1. Kích thước 75mm Tỉ lệ C/N tối ưu dao động trong khoảng 25 – 40 2. Tỉ lệ C/N Ở tỉ lệ thấp hơn, dư NH3, hoạt tính sinh học giảm Ở tỉ lệ cao hơn, chất dinh dưỡng bị hạn chế. 3. Pha trộn Thời gian ủ ngắn hơn Nên kiểm soát trong phạm vi 50 – 60% trong suốt quá trình ủ. Tối 4. Độ ẩm ưu là 55% Nhằm ngăn ngừa hiện tượng khô, đóng bánh và sự tạo thành các 5. Đảo trộn rảnh khí, trong quá trình làm phân hữu cơ, cơ chất phải được xáo trộn định kỳ. Tần suất đảo trộn phụ thuộc vào quá trình thực hiện Nhiệt độ phải được duy trì trong khoảng 50 – 550C đối với một vài 6. Nhiệt độ ngày đầu và 55 – 600C trong những ngày sau đó. Trên 660C, hoạt tính vi sinh vật giảm đáng kể. 7. Kiểm soát Nhiệt độ 60 – 700C, các mầm bệnh đều bị tiêu diệt mầm bệnh Lượng oxy cần thiết được tính toán dựa trên cân bằng tỷ lượng. 8. Nhu cầu về Không khí chứa oxy cần thiết phải được tiếp xúc đều với tất cả các không khí phần của cơ chất Tối ưu: 7 – 7,5. Để hạn chế sự bay hơi Nitơ dưới dạng NH3, pH 9. pH không được vượt quá 8,5 10. Mức độ Đánh giá qua sự giảm nhiệt độ vào thời gian cuối phân hủy 24
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Thời gian: Tháng 3/2018 đến tháng 8/2018. Địa điểm: Phòng thí nghiệm Viện khoa học ứng dụng của trường Đại học Công nghệ TP.Hồ Chí Minh 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn nấm đối kháng, nấm gây bệnh 2.2.1.1 Nấm đối kháng Các chủng nấm Trichiderma của phòng thí nghiệm Viện khoa học Ứng dụng HUTECH cung cấp. 2.2.1.2. Nấm gây bệnh Nấm Neoscytilidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu và nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long do phòng thí nghiệm Viện khoa học Ứng dụng HUTECH cung cấp. 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 2.2.2.1. Dụng cụ Ống nghiệm Cốc thủy tinh Đĩa petri Ống đong Que cấy Đèn cồn Đũa thủy tinh Khay nhựa Khoan thạch hình trụ Bình xịt nước Thùng xốp 2.2.2.2. Thiết bị Tủ cấy Kính hiển vi Máy hấp Autoclave Cân phân tích Tủ lạnh Bếp từ Lò nung Hệ thống chưng cất mẫu kjeldahl Tủ hút khí độc 2.2.3. Hóa chất 25
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP D-Glucose NaOH CMC ZnSO4 Bột chitin KCl NaNO3 FeSO4 K2HPO4 Agar MgSO4 Nước cất 0 0 MgSO4.7H2O Cồn 70 , 96 NH4NO3 2.2.4. Các loại môi trường 2.2.4.1 Môi trường nuôi cấy nấm mốc PDA. Thành phần: Khoai tây 200g D-glucose 20g Agar 20g Nước cất 1000ml Cách pha môi trường: Khoai tây gọt vỏ rửa sạch cắt thành hạt lựu, cân 200g rồi cho nước cất vào đun sôi khoảng 20 phút từ lúc bắt đầu sôi. Sau đó lọc bỏ bã, lấy dịch chiết, tiếp tục đun sôi bổ sung thêm đường và agar, khuấy đều để tránh agar vón cục. Đem môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. 2.2.4.2. Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase Thành phần môi trường: NaNO3 0,4g K2HPO4 0,2g MgSO4 0,1g KCl 0,1g CMC 1% Agar 2% Nước cất 1000ml Cách pha môi trường: 26
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đun tan CMC trong nước cất rồi cho các thành phần môi trường còn lại vào chai thủy tinh và khấy đều sau đó đậy nắp rồi đem hấp khử trùng ở 1210C, 15 phút, 1atm. Sau khi hấp khử trùng xong lấy ra chờ nguội trong tủ cấy vô trùng.Trên ngọn lửa đèn cồn, lần lượt đổ môi trường vào đĩa đã hấp vô trùng, chờ cho môi trường nguội và đặc lại. 2.2.4.3. Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase Thành phần môi trường: NaNO3 3,5g K2HPO4 1,5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4.7H2O 0,01g Cloramphenicol 0,005 g Dịch chitin huyền phù 1%: bổ sung đến 1 lít pH: 7 Cách pha huyền phù chitin 1% Cân 1g bột chitin cho dần vào 20ml HCl đậm đặc, ủ ở 40C và để qua đêm Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh(-200C) khấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 4000 vòng/phút, trong 10 phút thu lấy kết tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi pH trung tính. Thêm vào tủa nước cất cho đến thể tích 100ml. 2.2.4.4. Môi trường Czapeck dox để nhân giống cấp 2 Trichoderma Thành phần môi trường: Sacchorose 30g NaNO3 3g K2HPO4 1g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4.7H2O 0,01g Nước cất 1000ml pH 6 27
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cách pha môi trường: Cân và cho lần lượt từng chất vào erlen khuấy đều để tránh các chất phản ứng vào nhau tạo tủa, thêm nước cất, điều chỉnh pH 6. Đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, áp suất 1atm. 2.3. Phương pháp nhiên cứu. Các chủng nấm Trichoderma Các chủng nấm bệnh đã đã được hoạt hóa từ ống giống được hoạt hóa từ ống giống Khảo sát khả năng sinh trưởng Test sinh hóa Thử nghiệm đối kháng ở điều kiện phòng thí nghiệm Sàng lọc Lên men tạo chế phẩm Xử lí cành và phế phẩm thanh long Sơ đồ tổng quát nội dung thí nghiệm Thuyết minh sơ đồ Các chủng nấm Trichoderma được giữ giống trong ống thạch nghiêng. Các chủng này sẽ lần lượt cấy lên đĩa petri môi trường PDA để hoạt hóa sự phát triển sau thời gian giữ giống. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 1 tuần để nấm phát triển và hình thành bào tử. 28
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sử dụng các chủng nấm này để tiến hành quan sát sự sinh trưởng, hình thái vi thể, kiểm tra khả năng sinh enzyme và khả năng đối kháng với nấm bệnh ở điều kiện invitro. Sàng lọc lựa chọn các chủng nấm đạt yêu cầu theo mục tiêu đã đề và tiến hành lên men tạo chế phẩm. Sử dụng môi trường nhân giống cấp 2 Czapeck dox được trình bày ở mục 2.2.4.4 để nhân sinh khối nấm. Sau khi cẩn đúng khối lượng từng chất, hòa tan từng chất với nước cất theo đúng thứ tự tránh kết tủa khi pha, kết thúc pha dịch trong không màu. Đổ 200ml môi trường vào các erlen đã chuẩn bị sẵn, đem hấp khử trùng nhiệt độ 1210C trong 15 phút, áp suất 1atm. Sau hấp xong để môi trường nguội từ từ đến nhiệt độ phòng rồi tiến hành cấy giống Trichoderma đã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA, với mỗi erlen chứa 200ml 1 môi trường cấy /4 đĩa nấm đã cấy và ủ 7 ngày trước đó. Lắc đều trên máy lắc với tốc độ 60 vòng/phút, trong 48 giờ, ở nhiệt độ phòng. Giống sau khi được nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng Czapeck dox sẽ được cấy vào 200g môi trường rắn với cơ chất lúa bổ sung D-glucose 3% và (NH4)2SO4 1% ủ ở nhiệt độ phòng. Quá trình lấy mẫu được thực hiện khi tơ nấm đã ăn lan và bảo tử bắt đầu phủ kín cơ chất trên môi trường nhân sinh khối, tiến hành lấy 10g mẫu sau đó đem đi pha loãng với nồng độ thích hợp và đếm số bào tử bằng phương pháp đếm gián tiếp từ đó xác định được (số bào tử)/g chế phẩm theo công thức sau: N A(CFU / g) = ++ nn1VfVf1 n n Trong đó: A: số khuẩn lạc trong 1g mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n là số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ i V là thể tích mẫu (ml) cấy vào mô trường F là hệ số pha loãng tương ứng 29
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chế phẩm Trichoderma sau quá trình lên men thể rắn được sử dụng cho thử nghiệm ủ compost từ cành thanh long. 2.3.1.Quan sát khả năng sinh trưởng của Trichoderma. Dùng que cấy thẳng đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, gạt nhẹ lấy một ít bào tử nấm Trichoderma trong ống giống cấy chuyền vào tâm đĩa petri chứa môi trường PDA, ủ ở nhiệt độ phòng. Dùng khoan thạch hình trụ đường kính 5mm đục một miếng thạch (từ đĩa nấm thí nghiệm đã ủ 7 ngày) đặt lên tâm đĩa petri môi trường PDA rồi đem ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát hình thái tản nấm (hình dạng, màu sắc) ở mặt trên và mặt dưới theo từng ngày cho tới khi tản nấm mọc đầy đĩa. 2.3.2.Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp. 2.3.2.1.Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Nguyên tắc Cellulase tác động lên cơ chất CMC trong môi trường thạch. CMC bị phân hủy thành các đường khử là độ đục của môi trường bị giảm và trở nên trong suốt khi nhuộm bằng Lugol. Đường kính của vòng phân giải phản ánh hoạt tính của enzyme. Tiến hành Các chủng nấm thí nghiệm đã được cấy chuyền trên môi trường PDA, ủ 7 ngày ở nhiệt độ phòng. Dùng khoan thạch hình trụ đường kính 5mm đục một miếng thạch (từ đĩa nấm thí nghiệm đã ủ 7 ngày) đặt lên tâm đĩa môi trường CMC và ủ trong thời gian 2 ngày ở 28- 320C. Sau 2 ngày, nhuộm màu môi trường bằng cách đổ dung dịch lugol vào đĩa thí nghiệm, để yên 5 phút rồi đổ lugol thừa ra, cho nước cất vào tráng đĩa, đổ nước cất ra và tiến hành đo đường kính vòng phân giải. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng phân giải (dựa theo Trần Thị Thuần, 1996). D – d ≥ 2,5 cm: hoạt tính enzyme rất mạnh. D – d ≥ 2 cm: hoạt tính enzyme mạnh. 30
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP D – d ≥ 1,5 cm: hoạt tính enzyme trung bình. D – d ≥ 1 cm: hoạt tính enzyme yếu. Trong đó: D: đường kính vòng phân giải (cm). d: đường kính khoanh thạch chứa nấm thí nghiệm (cm). 2.3.2.2. Khảo sát khả năng tổng hợp chitinase của Trichoderma trên môi trường thạch. Nguyên tắc Enzyme chitinase có khả năng phân giải chitin thành N-acetyl glucosamine và cấu trúc mạch ngắn hơn không bất màu với thuốc thử lugol. Khi tác dụng với thuốc thử lugol, đường kính phần môi trường trong suốt do chitinase phân hủy chitin phản ánh khả năng sinh enzyme của Trichoderma. Phương pháp này chỉ dùng để định tính, đánh giá sơ bộ khả năng sinh tổng hợp enzyme chứ không xác định chính xác hoạt độ của enzyme. Tiến hành Chuẩn bị các chủng nấm thí nghiệm đã được nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA, ở nhiệt độ phòng. Dùng khoan thạch hình trụ đã khử trùng có đường kính 5mm đục 1 miếng thạch chứa chủng nấm thí nghiệm. Sau đó đặt miếng thạch vừa được đục sang môi trường có chứa chitin, đặt ngay tại tâm đĩa và ủ ở 28-320C. Sau 2 ngày tiến hành nhuộm lugol quan sát vòng phát triển, đổ lugol ngập bề mặt đĩa, để 5 phút rồi đổ lugol thừa ra, cho nước cất vào tráng đĩa, đổ nước cất ra và tiến hành quan sát. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần mỗi lần 1 đĩa petri. Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng phân giải (dựa theoTrần Thị Thuần, 1996). D – d ≥ 2,5 cm: hoạt tính enzyme rất mạnh. D – d ≥ 2 cm: hoạt tính enzyme mạnh. D – d ≥ 1,5 cm: hoạt tính enzyme trung bình. D – d ≥ 1 cm: hoạt tính enzyme yếu. Trong đó: D: đường kính vòng phân giải chitin (cm). d: đường kính khoanh thạch chứa nấm thí nghiệm (cm). 31
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh. 2.3.3.1. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long. Phương pháp đồng nuôi cấy: Hoạt động đối kháng invitro của chủng nấm Trichoderma với nấm Neoscytalidium Dimidiatum đã được đồng nuôi cấy bằng cách làm theo phương pháp mô tả bởi Upadhyay and Rai (1987). Cách tiến hành: Chuẩn bị nguồn nấm Các chủng nấm Trichoderma đã được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày làm nguồn đối kháng nấm bệnh. Nấm Neoscytalidium dimidiatum từ ống giống được cấy chuyền sang đĩa môi trường PDA và ủ trong 7 ngày để làm vật liệu thí nghiệm. Thí nghiệm đối kháng trực tiếp. Đĩa đối kháng: dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5mm đục 1 miếng thạch có chứa nấm đối kháng Trichoderma từ đĩa nấm đã chuẩn bị và đặt vào đĩa chứa môi trường PDA (đặt cách mép đĩa 1cm). Sau đó, làm tương tự đặt miếng thạch có chứa nấm Neoscytalidium dimidiatum đối xứng với miếng thạch có chứa nấm đối kháng Trichoderma qua tâm đĩa và cách mép đĩa 1 cm. Đĩa đối chứng: cấy khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm lên môi trường PDA đặt cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát ghi nhận kết quả sau 3, 5, 7 ngày sau cấy. Chỉ tiêu theo dõi: Bán kính khuẩn lạc nấm bệnh (cm) Khả năng ức chế của nấm Trichoderma với nấm Neoscytalidium dimidiatum được tính theo công thức của Fokkema 푅1−푅2 PMIG = × 100(%) 푅2 Trong đó: 32
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP R1: Bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh ở công thức đối chứng (không cấy nấm đối kháng) (cm). R2: Bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh ở công thức đối kháng (cm). PIMG (Percent Inhibition of Mycelial Grow): Chỉ số đối kháng của Trichoderma. PIMG ≤ 50: Đối kháng thấp. 51 ≤ PIMG ≤ 60: Đối kháng trung bình. 61 ≤ PIMG ≤ 75: Đối kháng cao. PIMG > 75: Đối kháng rất cao. 2.3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long. Phương pháp đồng nuôi cấy: Hoạt động đối kháng invitro của chủng nấm Trichoderma với nấm Colletotrichum sp đã được đồng nuôi cấy bằng cách làm theo phương pháp mô tả bởi Upadhyay and Rai (1987). Cách tiến hành: Chuẩn bị nguồn nấm Các chủng nấm Trichoderma đã được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày làm nguồn đối kháng nấm bệnh. Nấm Colletotrichum sp sau khi phân lập được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ trong 7 ngày để làm vật liệu thí nghiệm. Thí nghiệm đối kháng trực tiếp Đĩa đối kháng: dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5mm đục 1 miếng thạch có chứa nấm Colletotrichum sp đặt vào đĩa chứa môi trường PDA (đặt cách mép đĩa 1cm) đem ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 ngày, cấy nấm đối kháng Trichoderma và đặt vào đĩa môi trường PDA đã cấy Colletotrichum sp 2 ngày trước đó, đối xứng với nhau qua tâm đĩa và cách mép đĩa 1 cm. Đĩa đối chứng: cấy khoanh thạch nấm bệnh Colletotrichum sp, đường kính 5mm lên môi trường PDA đặt cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma. Đĩa đối chứng và đối kháng cấy nấm Colletotrichum sp cùng thời gian với nhau. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng. 33
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Quan sát ghi nhận kết quả sau 3, 5, 7 ngày sau cấy. Chỉ tiêu theo dõi: Bán kính khuẩn lạc nấm bệnh (cm) Khả năng ức chế của nấm Trichoderma với nấm Colletotrichum sp được tính theo công thức của Fokkema. 푅1−푅2 PMIG = × 100(%) 푅2 Trong đó: R1: Bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh ở công thức đối chứng (không cấy nấm đối kháng) (cm). R2: Bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh ở công thức đối kháng (cm). PIMG (Percent Inhibition of Mycelial Grow): Chỉ số đối kháng của Trichoderma. PIMG ≤ 50: Đối kháng thấp. 51 ≤ PIMG ≤ 60: Đối kháng trung bình. 61 ≤ PIMG ≤ 75: Đối kháng cao. PIMG > 75: Đối kháng rất cao. 2.3.4. Thử nghiệm ủ compost cành thanh long của nấm Trichoderma spp. Các phế phẩm thanh long được băm thành những đoạn 5 ˗ 10cm và được phơi nắng để giảm độ ẩm. Sau đó, các phế phẩm này được cho vào thùng xốp để ủ có kích thước 30x50x25cm. Trong quá trình ủ có đảo trộn thường xuyên. Theo dõi và ghi nhận kết quả sau 30 ngày ủ. 2.3.4.1. Xác định độ tro a. Nguyên tắc: Xác định lượng tro tổng hoặc tro không tan trong acid bằng cách nung mẫu ở nhiệt độ 5500C đến khối lượng không đổi. b. Tiến hành Nung cốc sứ 1 giờ ở 5500C, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút. Cân khối lượng cốc với độ chính xác 0,1mg (m1). Cân chính xác 5g mẫu (m) đã được nghiền và đồng nhất vào cốc. Đặt cốc lên bếp điện và đốt cho đến khi hết khói. 34
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đưa cốc vào tủ nung ở 5500C trong 4 giờ. Sau khi nung nếu mẫu chưa hóa tro hoàn toàn thì làm nguội tro và thêm vài giọt H2O2. Đặt cốc nung lên bếp và đun cho đến khi hết sủi bọt, tiếp tục đốt cho đến khô. Đưa cốc đun trở lại lò nung, tiếp tục nung cho đến khi tro hóa hoàn toàn. Làm nguội trong bình hút ẩm. Lặp lại quá trình này cho đến khi đạt khối lượng không đổi (m2). c.Tính toán kết quả Hàm Lượng tro được tính bằng số gam tro còn lại sau khi đốt trên 100g mẫu. (m − m ) Hàm lượng tro (%) = 2 1 x 100 m m: khối lượng mẫu đã sấy khô (g) m1: khối lượng cốc (g) m2: khối lượng cốc có chứa tro sau khi nung (g). 2.3.4.2. Xác định hàm lượng carbon Hàm lượng carbon được xác định theo công thức sau: 100 − %tro %C = 1,8 2.3.4.3. Xác định độ ẩm a. Nguyên tắc Dùng sức nóng làm bay hết hơi nước trong mẫu. Độ ẩm được xác định bởi sự chênh lệch về khối lượng mẫu tươi trước khi sấy và sau khi sấy ở 105±20C đến khi khối lượng không đổi. b. Tiến hành Mở nắp cốc sấy và để chúng trong tủ sấy, sấy ở 105±20C trong 1 giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm 30 phút, cân khối lượng cốc (m1). Cân chính xác 5 gam mẫu (m) đã nghiền nhỏ vào cốc sấy. Mở nắp cốc sấy có chứa mẫu và để chúng trong tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105±20C trong thời gian 4 giờ kể từ lúc nhiệt độ đạt 1050C. Đậy nắp (không kín) lại và để nguội trong bình hút ẩm 30p. 35
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đậy nắp thật kín lấy ra khỏi bình hút ẩm và cân xác định khối lượng. Lặp lại quá trình từ bước 3 đến bước 5 cho tới khi xác định được khối lượng không đổi (m2). (Chênh lệch giữa hai lần cân liên tiếp không quá 0.1%). c.Tính toán kết quả mmm+− Ẩm độ (%) = ( 12)*100 m Trong đó: m: là khối lượng mẫu tươi đem sấy (gam) m1 : là khối lượng cốc khô (gam) m2 : là khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (gam) 2.3.4.4. Xác định hàm lượng Nitơ a. Vô cơ hóa mẫu Cân 100g chất hữu cơ. Lưu ý: giai đoạn này phải thực hiện trong tủ hút Hottle, đặt bình hơi nghiêng trên bếp, khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất bắn ra ngoài, không bị thất thoát ammoniac. Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo phần chất hữu cơ bám trên thành bình còn chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình kjeldahl và định mức đến vạch. b. Cất đạm: Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu hồng tím. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NAOH40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NAOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ). 36
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tiến hành lắp hệ thống cất đam, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0,1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Sau khi cất đạm 10 ˗ 12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi màu xanh là được, ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa. c.Chuẩn độ: Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0,1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0,1N đã sử dụng. Công thức tính hàm lượng % nitơ tổng số: 1,42 ∗ (V1 − V2) ∗ 100 % = Trong đó: V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng. V2: số ml NaOH 0,1N đã chuẩn độ. a: số miligam nguyên liệu. 1,42: hệ số; cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg Nitơ. 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu Tất cả số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 và SAS (Stattistical Anlysis System) 9.1 37
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm sinh trưởng nấm Trichoderma spp Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy. Đường kính tản nấm Các chủng Trichoderma spp. Hình ảnh đại thể của các (cm) sau 2 ngày nuôi Trichoderma chủng Trichoderma cấy bcde T1 5,40 ±0,40 ab T3 5,67 ±0,06 abcd T7 5,57 ±0,71 38
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP de T9 5,03 ±0,06 abcde T11 5,47 ±0,21 bcde T12 5,33 ±0,31 bcde T13 5,37 ±0,15 bcde T15 5,33 ±0,12 39
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP abcde T21 5,43 ±0,25 a T22 5,97 ±0,12 abcd T23 5,57 ±0,06 bcde T25 5,10 ±0,26 40
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ab T26 5,70 ±0,10 abcde TC1 5,43 ±0,15 bcde TC2 5,33 ±0,25 e TC3 4,97 ±0,15 abcd TC5 5,53 ±0,21 41
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP abcd TC6 5,53 ±0,15 bcde TC7 5,33 ±0,12 f TC8 4,30 ±0,20 bcde TC9 5,40 ±0,36 42
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP e TC10 5,03 ±0,21 abcd TC11 5,53 ±0,12 bcde TC13 5,27 ±0,25 abcde TC15 5,47 ±0,32 43
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP bcde TCC1 5,23 ±0,15 abc TCC6 5,60 ±0,10 CV (%) 4,56 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có có có cùng chữ cái theo sau giống nhau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%, không khác biệt thống kê ở α = 0,01. Sự sinh trưởng của Trichoderma là một chỉ tiêu quan trọng để ứng dụng tạo chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh và ủ compost. Kết quả bảng 3.1 cho thấy hầu hết các chủng Trichoderma đều phát triển tốt trên môi trường PDA. Sau 2 ngày nuôi cấy, tản nấm phát triển từ 4,30 – 5,97 (cm). Đặc biệt tốc độ tăng trưởng T22 và T26 là cao nhất. So với kết quả của Nguyễn Thị Bích Tuyền (2016), sự sinh trưởng của nấm trong luận văn này có chiều hướng yếu hơn, có lẽ do thời gian chuyển phòng thí nghiệm từ Bình Thạnh sang quận 9, một số tủ lạnh bị hư, các mẫu không giữ lạnh được nên sự sinh trưởng của các chủng bị suy yếu. Vì vậy, cần phải có biện pháp tăng sinh phục hồi lại các chủng này. 44
  55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.1 Chủng nấm Trichoderma T22, T26 và T3 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA. 3.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp. 3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng nấm Trichoderma spp. Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng nấm Trichoderma spp. Các chủng Đường kính vòng phân giải cellulose của Trichoderma các chủng Trichoderma 2NSC klm T1 3,00 ±0,17 a T3 4,27 ±0,12 abcd T7 4,00 ±0,10 hijklm T9 3,27 ±0,25 bcdef T11 3,83 ±0,06 jklm T12 3,07 ±0,06 hijklm T13 3,30 ±0,26 ghijk T15 3,40 ±0,17 hijkl T21 3,33 ±0,21 ab T22 4,20 ±0,20 efghi T23 3,57 ±0,32 45
  56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP abcde T25 3,90 ±0,10 abc T26 4,13 ±0,12 lm TC1 2,93 ±0,15 hijkl TC2 3,33 ±0,42 m TC3 2,90 ±0,10 bcdef TC5 3,83 ±0,15 abc TC6 4,10 ±0,10 abcd TC7 4,03 ±0,06 abcdef TC8 3,87 ±0,06 abc TC9 4,07 ±0,12 fghij TC10 3,47 ±0,06 cdefg TC11 3,77 ±0,35 ijklm TC13 3,17 ±0,35 abc TC15 4,10 ±0,10 defgh TCC1 3,63 ±0,15 abcd TCC6 4,00 ±0,10 CV(%) 5,24 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%, không khác biệt thống kê ở α = 0,01 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của Trichoderma là một trong những chỉ tiêu lựa chọn để ủ compost. Kết quả trên cho thấy tất cả các chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase. Khả năng sinh enzyme cellulase đều từ mạnh đến rất mạnh, đường kính vòng phân giải từ 2,90 – 4,27 cm. Trong đó khả năng phân giải cơ chất mạnh nhất là Trichoderma T3 (4,27 cm), T22 (4,20 cm), T26 (4,13 cm), TC15 (4,10 cm), TC6 (4,10 cm). Kết quả này cũng trùng với kết quả của Nguyễn Thị Bích Tuyền (2016). Vì vậy có thể sử dụng các chủng này để tăng cường sự phân hủy cành thanh long. 46
  57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.2. Vòng phân giải enzyme cellulase của chủng Trichoderma T3,T22,T26,TC15,TC6. 3.2.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng Trichoderma spp. Bảng 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma sau 2NSC. Đường kính vòng phân giải chitin Các chủng của các chủng Trichoderma Trichoderma 2NSC defghi T1 3,17 ±0,15 a T3 4,10 ±0,10 ab T7 3,93 ±0,15 efghi T9 3,10 ±0,20 bcde T11 3,53 ±0,25 hij T12 2,77 ±0,25 ij T13 2,73 ±0,15 k T15 2,23 ±0,25 cdefg T21 3,30 ±0,20 47
  58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ab T22 3,93 ±0,06 ghij T23 2,90 ±0,10 defgh T25 3,20 ±0,10 ab T26 3,83 ±0,15 efghi TC1 3,10 ±0,17 jk TC2 2,63 ±0,23 defg TC3 3,23 ±0,25 fghij TC5 2,97 ±0,06 cdef TC6 3,37 ±0,21 fghij TC7 2,93 ±0,40 abc TC8 3,70 ±0,10 defgh TC9 3,20 ±0,26 bcde TC10 3,53 ±0,32 ij TC11 2,73 ±0,25 defghi TC13 3,13 ±0,23 bcde TC15 3,53 ±0,15 bcd TCC1 3,57 ±0,06 bcde TCC6 3,53 ±0,21 CV(%) 6,26 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ±SD trong cùng một cột có cùng chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%., không khác biệt thống kê ở α= 0,01. Thành tế bào nấm được cấu tạo từ chitin và glucan. Trichoderma spp có khả năng tổng hợp enzyme chitinase có tác dụng phân hủy chitin ở thành tế bào nấm bệnh. Kết quả khảo sát vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma cho thấy đều có khả năng sinh enzyme mạnh và rất mạnh với đường kính vòng phân giải 2,2 – 4,1cm. Trong đó mạnh nhất với chủng Trichoderma T3 có đường kính vòng phân giải là 4,10cm, chủng T22 và chủng T7 là 3,93cm. Nguyễn Thị Bích Tuyền (2016) cho rằng chủng T3 là chủng 48
  59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP có khả năng sinh chitinase mạnh nhất. Ngoài chủng T3 thì nghiên cứu này còn cho thấy các chủng T7, T22, T26 là các chủng có hoạt tính chitinase mạnh. Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma T3,T22,T7. 3.3. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma spp với nấm bệnh. 3.3.1. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum. Bảng 3.4 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum. Các chủng Tỉ lệ đối kháng (%) sau các ngày theo dõi Trichoderma 3NSC 5NSC 7NSC abcde bcdefgh bcdef T1 39,20 ±4,03 62,08 ±0,72 75,00 ±5,00 abc a a T3 45,04 ±5,18 72,92 ±3,61 87,50 ±6,25 ab abcdefg ab T7 45,13 ±3,32 65,42 ±3,15 85,42 ±3,61 cde efgh abcde T11 32,36 ±1,19 57,50 ±2,17 79,17 ±7,22 abcde abcdefgh abcde T12 41,15 ±3,79 63,75 ±2,17 81,25 ±6,25 abcde bcdefgh efg T13 39,13 ±9,78 63,33 ±1,44 70,42 ±2,89 abcde abcdefgh cdefg T15 42,16 ±9,90 63,75 ±3,31 72,92 ±3,61 abcde cdefgh abcd T21 42,26 ±2,94 61,67 ±6,41 82,08 ±1,44 49
  60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP a ab a T22 50,69 ±6,77 71,25 ±3,75 86,67 ±5,05 abc abcd bcdef T23 44,88 ±7,43 68,33 ±5,64 75,42 ±1,91 abcd abcdef abcde T25 43,89 ±7,03 66,25 ±3,31 77,92 ±3,15 ab abcd a T26 46,96 ±7,45 68,75 ±3,75 87,08 ±6,88 abc cdefgh defg TC1 44,46 ±9,36 62,50 ±6,25 72,08 ±3,15 abcd abcdefg abcd TC2 42,66 ±5,99 64,58 ±3,61 82,50 ±4,51 abcde bcdefgh abc TC3 42,01 ±7,12 62,50 ±2,50 83,33 ±7,22 abcde defgh abcde TC5 39,19 ±5,03 60,00 ±5,00 77,92 ±3,15 abcde abcdefg efg TC6 42,26 ±2,94 65,42 ±3,15 70,42 ±7,32 abc abc ab TC7 45,04 ±5,18 70,83 ±3,61 85,42 ±3,61 de gh fg TC8 30,03 ±3,81 56,25 ±6,25 64,58 ±3,61 abcde bcdefgh abcde TC9 38,63 ±3,67 63,33 ±1,44 77,92 ±3,15 abcd bcdefgh abcd TC10 42,91 ±6,99 62,50 ±2,50 82,50 ±4,51 cde fgh g TC11 31,76 ±1,36 57,08 ±5,05 63,75 ±4,50 e h fg TC13 28,25 ±16,14 54,58 ±4,02 65,42 ±8,51 bcde abcdefg fg TC15 34,17 ±2,36 65,00 ±5,45 66,67 ±3,61 bcde defgh ab TCC1 33,88 ±8,40 62,50 ±6,25 85,42 ±3,60 abcde abcde abcde TCC6 42,01 ±7,12 66,67 ±7,22 80,00 ±6,62 CV (%) 16.31 6.69 6,40 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ±SD trong cùng một cột có cùng chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%, không khác biệt thống kê ở α=0,01. 50
  61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long là chỉ tiêu quan trọng quyết định hiệu quả phòng trừ trên cây trồng. Khả năng đối kháng các chủng Trichoderma ở bảng 3.4 cho thấy sau 7 ngày nuôi cấy hầu hết các chủng đều có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum. Các chủng có khả năng ức chế mạnh sau 7 ngày là chủng T3, T26, T22. Hình 3.4. Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). Hình 3.5 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). Hình 3.6 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). 51
  62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). 3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên thanh long. Bảng 3.5 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với nấm Colletotrichum sp. Các chủng Tỷ lệ đối kháng % sau các ngày theo dõi Trichoderma 5NSC 7NSC ab a T3 32,47 ±4,70 71,96 ±3,15 a a T7 34,19 ±1,04 69,75 ±4,53 a a T22 34,68 ±3,59 71,01 ±4,57 abc a T26 30,94 ±4,34 71,01 ±11,41 c b TC1 25,67 ±2,92 47,04 ±7,34 abc a TC3 30,83 ±6,78 69,76 ±4,53 abc a TC7 30,38 ±3,15 68,87 ±3,90 TCC1 27,16bc±4,27 52,84b±6,02 CV(%) 13,47 9,49 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ±SD trong cùng một cột có cùng chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%., không khác biệt thống kê ở α=0,01. 52
  63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tỷ lệ đối kháng các chủng Trichoderma khảo sát được trình bày ở bảng 3.5 cho thấy sau 7 ngày nuôi cấy các chủng Trichoderma hầu hết các chủng đều có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên thanh long trong điều kiện phòng thí nghiệm. Trong đó, các chủng có khả năng đối kháng mạnh nấm bệnh là chủng T3,T22, T26 Như vậy, các chủng T3, T22, T26 vừa có khả năng đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum vừa đối kháng với nấm Colletotrichum sp. Thể hiện triển vọng tốt để sử dụng phòng trừ nấm bệnh trên thanh long. Đặc biệt là chủng T3, đã được định danh là loài Trichoderma asperellum (Nguyễn Thị Bích Tuyền, 2016) vừa sinh enzyme cellulase mạnh nhất vừa đối kháng với nấm bệnh, đây là chủng có triển vọng để sử dụng trong ủ compost cành thanh long. Hình 3.8 Đĩa nấm đối chứng Colletotrichum sp ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). Hình 3.9 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). 53
  64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.10 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). Hình 3.11 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua). 3.4. Thử nghiệm ủ compost từ cành thanh long của chủng nấm Trichoderma T3 Trong quá trình trồng thanh long, người nông dân thường tỉa cành tạo độ thông thoáng và trong đấy có những cành, hoa, trái non bị nhiễm bệnh cũng bị loại bỏ vứt ngay tại vườn nên đây là nguồn gây ô nhiễm môi trường, cũng là nguồn phát tán mầm bệnh. Chính vì vậy nguồn phế phẩm này cần được thu gom xử lý bằng biện pháp ủ compost. Sau khi khảo sát các đặc điểm của các chủng Trichoderma khả năng sinh enzyme cellulase, chitinase và khả năng đối kháng với 2 loại nấm bệnh phổ biến trên cây thanh long thì chủng T3 là phù hợp nhất để tiến hành ủ compost cành thanh long. 54
  65. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.6 Kết quả phân tích hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ tổng của nguyên liệu ban đầu và 30 ngày sau ủ. Nguyên liệu Thành phẩm 30 ngày sau ủ Chỉ tiêu phân tích ban đầu Đối chứng Thí nghiệm Hàm lượng carbon (%) 55,52±0,03 45,64±1,24 37,15±0,96 Hàm lượng nitơ tổng (%) 2,11±0,04 2,42±0,18 2,85±0,14 Tỷ lệ C/N 26,42±0,69 18,97±1,88 13,07±0,98 Ẩm độ 63,90%±2,55 Nguyên liệu ban đầu khi mới cắt cành có độ ẩm 86,51%, không thuận lợi cho quá trình ủ phân, sau 2 ngày phơi nắng nguyên liệu giảm độ ẩm còn 63,90%±2,55 thích hợp cho quá trình ủ phân. Kết quả phân tích tỷ lệ C/N 30 ngày sau ủ của đối chứng và công thức thí nghiệm có sự khác biệt. Ở công thức đối chứng tỉ lệ C/N là 18,97 còn ở công thức thí nghiệm 13,07. Như vậy chủng nấm T3 có khả năng phân hủy cành thanh long ủ compost, ngoài ra còn có khả năng đối kháng với nấm bệnh. a b Hình 3.12 Thanh long trước khi ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm 55
  66. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP a b Hình 3.13 Thanh long ở công thức đối chứng 30 ngày sau ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm. 56
  67. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận Các chủng Trichoderma đều có khả năng sinh trưởng mạnh. Trong đó chủng T22, T26, T3 có sinh trưởng mạnh nhất. Hầu hết các chủng đều có khả năng sinh enzyme cellulase và chitinase. Các chủng có khả năng tổng hợp enzyme cellulase mạnh là T3,T22,T26. Tổng hợp enzyme chitinase mạnh là các chủng T3, T7, T22 và T26. Tất cả các chủng đều có khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng và nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trong điều kiện phòng thí nghiệm. Các chủng T3, T22, T26 là những chủng có khả năng đối kháng mạnh với cả 2 loại bệnh trên. Dùng chủng T3 Trichoderma asperellum ủ compost xử lý phế thải từ cành thanh long cho kết quả tốt. Sau 30 ngày ủ tỷ lệ C/N chỉ còn 13,07 ở công thức bổ sung Trichoderma so với 18,97 ở công thức không bổ sung nấm. 4.2.Kiến nghị Thử nghiệm chế phẩm nấm Trichoderma ở quy mô ngoài đồng đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh từ môi trường ảnh hưởng đến chế phẩm. Thử nghiệm sự kết hợp của các chủng Trichoderma spp với nhóm vi khuẩn Bacillus spp trong đất để tăng hiệu suất ủ compost. 57
  68. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƯỚC Nguyễn Hoàng Anh (2013). Tối ưu hóa điều kiện thu nhận bào tử nấm Trichoderma sp. nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học trừ nấm bệnh trên cây trồng, Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2005). Giáo trình môn Nấm học. Trường Đại học Cần Thơ Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2006. Công nghệ sinh học tập 3 Enzyme và ứng dụng. Nhà xuất bản Giáo dục. Hồng Châu (2009). Ứng dụng chế phẩm Trichoderma, Trạm khuyến nông Tân Trụ,tr 1. Đường Hồng Dật (1984). Cơ sở khoa học bảo vệ cây, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Bùi Xuân Đồng (1982). Vi nấm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Nguyễn Đức Huy, Phạm Quang Nguyên, Nguyễn Thị Thanh Hồng, Hà Giang, Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Tất Cảnh (2017). Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của Trichoderma asperellum đối với tác nhân gây bệnh cây có nguồn gốc trong đất. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2017, p.1593-1603. Vũ Triệu Mân (2007). Giáo trình Bệnh cây chuyên khoa, Chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội. Võ Thị Thu Oanh, Lưu Từ Đoan Trang (2017). Đánh giá khả năng đối kháng của một số dòng Trichoderma đối với Phytopythium helicoides trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 5/2017. P1-8. Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Võ Thị Thu Oanh, Cách Tuyến Nguyễn, Phan Thành Lê, Đình Đôn Phan, Thị Thu Hiền (2014). Xác định tác nhân gây bệnh đốm nâu (Neoscytalidium dimidiatum) trên cây thanh long dựa vào trình tự vùng ITS-RADN , Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 2014, số 21 tr.17-23. Huỳnh Văn Phục (2006). Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúc và bắp. Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. 58
  69. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trần Minh Tâm (2000). Công nghệ vi sinh ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. Trần Thị Thuần (1996). Kết quả nghiên cứu bước đầu về nấm đối kháng Trichoderma Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 1990-1995, Nxb. Hà Nội Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng, 2009. Nghiên cứu enzyme cellulase và pectinase từ chủng Trichoderma Viride và Aspergillus Niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê. Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, Tập 12, Số 13 – 2009 p50-56. Hà Thị Thúy,Lương Thành Hữu, Vũ Thúy Nga, Hứa Thị Sơn, Tống Hải Vân (2016). Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu thanh long, Hội thảo quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai. p.1167-1172. Nguyễn Thị Bích Tuyền (2016). Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium đimidiatum trên thanh long của các chủng Trichoderma spp. Luận văn tốt nghiệp trường Đại học công nghệ TP. Hồ Chí Minh. Dương Hoa Xô, (2005). Vai trò nấm đối kháng Trichoderma trong kiểm soát vi sinh, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Agrios G.N, (2005). Plant pathology, 5th edition, Elsevier Academic Press: San Diego, California. Barnett H. L., Barry B. Hunter. (1998). Illustrated genera of imperfect fungi. APS Pess, The American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, 1-218 Crous & Slippes, 2006. Neoscytalidium dimidiatum ( Penz), Studies in Mycology 55 :244 Chuang M.F., Ni H.F., Yang H.R., Shu S.L., and Lai S.Y. 2012. First Report of Stem Canker Disease of Pitaya (Hylocereus undatus and H. polyrhizus) Caused by Neoscytalidium dimidiatum in Taiwan. The American Phytopathological Society. Cook R.J., and Baker K. F. 1983. The Nature and Practice of Biological Coltrol of plant Pathogens. American Phythopathological Society, St. Paul, MN. 539 pp 59
  70. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Danielson, R.M. and Davey, C.B., 1973a. Carbon and nitrogen nutrition of Trichoderma. Soil Biol. Biochem. 5: 505 – 515 Domsch, K.H., Gams, W., 1980. Compendium of soil fungi. Academic Press Gary E. Harman, C. P. Kubicek (2005). Trichoderma And Gliocladium: Enzymes, Biological Control and commercial applications, Volume 2, This edition published in the Taylor & Francis e-Library. Gary J. Samuels, 2004. Trichoderma aguide to identification and biology, United States Department of Agriculture Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA. Harman, G.E., 1996. Trichoderma for biocontrol of plant pathogens: from basic research to comercialized production. Deparments of Horticultural Science and of Plant Pathology, Cornell University NYSASE. Cornell community cofenrence on biological control. Kubicek, C.P. and Harman, G.E. (1998). Trichoderma and Gliocladium. Vol. 1, Basic Biology, Taxonomy and Genetics. Taylor & Francis, London. Kredics, L., Antal, Z., Manczinger, L., Szekres, A., Kevei, F., Nagy, E., 2003. Influence of environmental parameter on Trichoderma strains with biocontrol potential. Food Technol. Biotechnol. 41(1): 37 - 41. Lynch, J.M and Harper, S.H.T., 1985. The Microbiol Upgrading of Straw for Agriculture Use. Philosophycal Transactions of the Royal Society of London 310: 1144, 221 - 226. Masratul Hawa M., Salleh B. and Latiffah Z. (2013). Identification and Molecular Characterizations of Neoscytalidium dimidiatum Causing Stem Canker of Red-fleshed Dragon Fruit (Hylocereus polyrhizus) in Malaysia. Journal of phytopathology Marco, J.L.D., Valadares-Inglis, M.C., Felix, C.R., 2002. Production of hydrolytic enzyme by Trichoderma isolates with antagonistic activity against Crinipellis perniciosa, the causal agent of Witches’ broom of cocoa. Brazillian journal of Microbiology. 34: 33 - 38. 60
  71. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP O'connell, R.; Perfect, S.; Hughes, B.; Carzaniga, R.; Bailey, J.; Green, J. Dissecting the cell biology of Colletotrichum infection processes. In: Prusky, D.; Freeman, S.; Dickman, M.B. (Ed.) 2000. Colletotrichum: host specificity, pathology and host- pathogen interation. Minnessota: APS Press. cap. 5, p. 57-77. Perfect SE, Hughes HB, O’Connell RJ, Green JR, 1999. Colletotrichum: a model genus for studies on pathology and fungal–plant interactions. Fungal Genetics and Biology 27:186–198 Polizzi, G., Aiello, D., Vitale, A., Guiffrida, F., Groenewald, J.Z., Crous, P.W. 2009. First Report of Shoot Blight, Canker, and Gummosis Caused by Neoscytalidium dimidiatum on Citrus in Italy. Plant disease 2009 v.93 no.11 pp. 1215-1215 Prasun K. Mukherjee, B.A. Horwitz, U.S. Singh (2013). Trichoderma: Biology and Applications. Prasun K. Mukherjee and Kanthadai Raghu, 1997. Effect of temperature on antagonistic and biocontrol pontential of Trichoderma sp. on Sclerotium rolfsii. Mycopathologia. 139: 151-155. Rastogi, G., et al. ,2009. Isolation and characterization of cellulose-degrading bacteria from the deep subsurface of the Homestake gold mine, Lead, South Dakota, USA. Journal of industrial microbiology & biotechnology 36, 585-598 Vinit Kumar Mishra, 2010. In vitro antagonism of Trichjoderma species against Pythium aphanidermatum Phytology, 9: p. 28-35. TÀI LIỆU INTERNET sinh-hoc-15798.html thoi/c/11650958.epi 61
  72. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ngua-sinh-hoc-cho-vuon-thanh-long-394.html PHỤ LỤC Phụ lục A: Bảng số liệu thô A.1. Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. Vòng phát triển (cm) Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3 T1 5,0 5,4 5,8 T3 5,7 5,6 5,7 T7 5,7 4,8 6,2 T9 5,0 5,0 5,1 T11 5,4 5,7 5,3 T12 5,4 5,0 5,6 T13 5,4 5,2 5,5 T15 5,2 5,4 5,4 T21 5,4 5,2 5,7 T22 5,9 6,1 5,9 T23 5,6 5,6 5,5 T25 4,9 5,4 5,0 T26 5,6 5,7 5,8 TC1 5,6 5,4 5,3 TC2 5,1 5,6 5,3 TC3 5,0 4,8 5,1 TC5 5,6 5,3 5,7 TC6 5,4 5,5 5,7 TC7 5,4 5,2 5,4 TC8 4,3 4,1 4,5 TC9 5,5 5,7 5,0 TC10 4,8 5,2 5,1 TC11 5,4 5,6 5,6 TC13 5,0 5,5 5,3 TC15 5,7 5,6 5,1 TCC1 5,1 5,4 5,2 TCC6 5,7 5,5 5,6 62
  73. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A.2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. Vòng phân giải cellulose (cm) Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3 T1 2,9 3,2 2,9 T3 4,4 4,2 4,2 T7 4,0 3,9 4,1 T9 3,3 3,5 3,0 T11 3,8 3,9 3,8 T12 3,0 3,1 3,1 T13 3,1 3,2 3,6 T15 3,2 3,5 3,5 T21 3,4 3,1 3,5 T22 4,4 4,0 4,2 T23 3,8 3,7 3,2 T25 4,0 3,8 3,9 T26 4,2 4,0 4,2 TC1 3,1 2,9 2,8 TC2 3,8 3,2 3,0 TC3 2,8 3,0 2,9 TC5 3,7 3,8 4,0 TC6 4,0 4,2 4,1 TC7 4,0 4,1 4,0 TC8 3,8 3,9 3,9 TC9 4,0 4,0 4,2 TC10 3,5 3,4 3,5 TC11 3,8 4,1 3,4 TC13 3,2 3,5 2,8 TC15 4,1 4,0 4,2 TCC1 3,8 3,6 3,5 TCC6 4,1 3,9 4,0 63
  74. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A.3. Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. Vòng phân giải Chitin (cm) Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3 T1 3,3 3,0 3,2 T3 4,1 4,0 4,2 T7 3,9 3,8 4,1 T9 3,1 2,9 3,3 T11 3,5 3,8 3,3 T12 2,8 2,5 3,0 T13 2,7 2,6 2,9 T15 2,0 2,2 2,5 T21 3,1 3,3 3,5 T22 3,9 4,0 3,9 T23 3,0 2,8 2,9 T25 3,1 3,3 3,2 T26 4,0 3,7 3,8 TC1 3,3 3,0 3,0 TC2 2,5 2,5 2,9 TC3 3,0 3,2 3,5 TC5 3,0 2,9 3,0 TC6 3,2 3,3 3,6 TC7 2,5 3,3 3,0 TC8 3,8 3,6 3,7 TC9 3,0 3,5 3,1 TC10 3,3 3,9 3,4 TC11 2,5 2,7 3,0 TC13 3,0 3,4 3,0 TC15 3,7 3,5 3,4 TCC1 3,6 3,6 3,5 TCC6 3,3 3,6 3,7 64
  75. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A.4. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy. CHỦNG Đối kháng (cm) Đối kháng (phần trăm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 ĐC 5,8 5,5 6,0 T1 3,4 3,6 3,5 41,38 34,55 41,67 T3 3,5 3,0 3,0 39,66 45,45 50,00 T7 3,0 3,0 3,5 48,28 45,45 41,67 T11 4,0 3,7 4,0 31,03 32,73 3333 T12 3,5 3,0 3,7 39,66 45,45 38,33 T13 4,0 3,5 3,0 31,03 36,36 50,00 T15 4,0 3,0 3,0 31,03 45,45 50,00 T21 3,5 3,0 3,5 39,66 45,45 41,67 T22 3,0 3,0 2,5 48,28 45,45 58,33 T23 3,0 3,5 3,0 48,28 36,36 5000 T25 3,7 3,0 3,0 36,21 45,45 50,00 T26 3,5 2,5 3,2 39,66 54,55 46,67 TC1 3,6 3,0 3,0 37,93 45,45 50,00 TC2 3,0 3,5 3,4 48,28 36,36 43,33 TC3 3,5 3,5 3,0 39,66 36,36 50,00 TC5 3,7 3,5 3,3 36,21 36,36 45,00 TC6 3,5 3,0 3,5 39,66 45,45 41,67 TC7 3,5 3,0 3,0 39,66 45,45 50,00 TC8 4,3 3,8 4,0 25,86 30,91 33,33 TC9 3,5 3,6 3,5 39,66 34,55 41,67 TC10 3,0 3,0 3,9 48,28 45,45 35,00 TC11 4,0 3,8 4,0 31,03 30,91 33,33 TC13 5,2 3,7 3,5 10,34 32,73 41,67 TC15 3,8 3,5 4,1 34,48 36,36 31,67 TCC1 4,0 4,0 3,4 31,03 27,27 43,33 TCC6 3,5 3,5 3,0 39,66 36,36 50,00 65
  76. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A.5. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy. Đối kháng (cm) Đối kháng (phần trăm) CHỦNG Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 ĐC 9,0 9,0 9,0 T1 3,0 3,1 3,0 62,50 61,25 62,50 T3 2,0 2,5 2,0 75,00 68,75 75,00 T7 2,5 2,8 3,0 68,75 65,00 62,50 T11 3,5 3,5 3,2 56,25 56,25 60,00 T12 3,0 2,7 3,0 62,50 66,25 62,50 T13 3,0 2,8 3,0 62,50 65,00 62,50 T15 3,2 2,8 2,7 60,00 65,00 66,25 T21 3,5 2,5 3,2 56,25 68,75 60,00 T22 2,3 2,6 2,0 71,25 67,50 75,00 T23 2,1 3,0 2,5 73,75 62,50 68,75 T25 2,5 2,6 3,0 68,75 67,50 62,50 T26 2,8 2,5 2,2 65,00 68,75 72,50 TC1 3,5 3,0 2,5 56,25 62,50 68,75 TC2 3,0 3,0 2,5 62,50 62,50 68,75 TC3 3,2 2,8 3,0 60,00 65,00 62,50 TC5 3,6 3,2 2,8 55,00 60,00 65,00 TC6 3,0 2,5 2,8 62,50 68,75 65,00 TC7 2,5 2,0 2,5 68,75 75,00 68,75 TC8 4,0 3,0 3,5 50,00 62,50 56,25 TC9 3,0 3,0 2,8 62,50 62,50 65,00 TC10 2,8 3,0 3,2 65,00 62,50 60,00 TC11 3,0 3,8 3,5 62,50 52,50 56,25 TC13 4,0 3,5 3,4 50,00 56,25 57,50 TC15 3,3 2,5 2,6 58,75 68,75 67,50 TCC1 3,0 3,5 2,5 62,50 56,25 68,75 TCC6 3,0 3,0 2,5 62,50 62,50 75,00 66
  77. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A.6. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy. Đối kháng (cm) Đối kháng (phần trăm) CHỦNG Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 ĐC 8,0 8,0 8,0 T1 1,6 2,4 2,0 80,00 70,00 75,00 T3 1,5 1,0 0,5 81,25 87,50 93,75 T7 1,0 1,0 1,5 87,50 87,50 81,25 T11 2,0 2,0 1,0 75,00 75,00 87,50 T12 2,0 1,5 1,0 75,00 81,25 87,50 T13 2,1 2,5 2,5 73,75 68,75 68,75 T15 2,0 2,5 2,0 75,00 68,75 75,00 T21 1,5 1,5 1,3 81,25 81,25 83,75 T22 1,5 0,7 1,0 81,25 91,25 87,50 T23 2,1 2,0 1,8 73,75 75,00 77,50 T25 1,8 2,0 1,5 77,50 75,00 81,25 T26 1,6 1,0 0,5 80,00 87,50 93,75 TC1 2,0 2,2 2,5 75,00 72,50 68,75 TC2 1,5 1,7 1,0 81,25 78,75 87,50 TC3 1,0 1,0 2,0 87,50 87,50 75,00 TC5 1,5 2,0 1,8 81,25 75,00 77,50 TC6 2,8 2,6 1,7 65,00 67,50 78,75 TC7 1,0 1,0 1,5 87,50 87,50 81,25 TC8 3,0 2,5 3,0 62,50 68,75 62,50 TC9 1,8 2,0 1,5 77,50 75,00 81,25 TC10 1,5 1,7 1,0 81,25 78,75 87,50 TC11 3,2 3,0 2,5 60,00 62,50 68,75 TC13 3,3 2,0 3,0 58,75 75,00 62,50 TC15 2,5 2,5 3,0 68,75 68,75 62,50 TCC1 1,5 1,0 1,0 81,25 87,50 87,50 TCC6 2,0 1,0 1,8 75,00 87,50 77,50 67
  78. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A.7. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 5 ngày. Đối kháng 5NSC (cm) Đối kháng 5NSC (phân trăm) ĐC 4,8 4,5 4,5 4,9 T3 3,2 3,2 3,2 3,0 33,33 28,89 28,89 38,78 T7 3,1 3,0 3,0 3,2 35,42 33,33 33,33 34,69 T22 2,9 3,0 3,1 3,2 39,58 33,33 31,11 34,69 T26 3,2 3,4 3,0 3,3 33,33 24,44 33,33 32,65 TC1 3,5 3,5 3,2 3,7 27,08 22,22 28,89 24,49 TC3 2,9 3,4 3,3 3,3 39,58 24,44 26,67 32,65 TC7 3,2 3,3 3,2 3,3 33,33 26,67 28,89 32,65 TCC1 3,5 3,3 3,5 3,3 27,08 26,67 22,22 32,65 A.8. Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 7 ngày. Đối kháng 7NSC (cm) Đối kháng 7NSC (phân trăm) ĐC 5,8 5,6 5,5 5,6 T3 1,5 1,5 1,8 1,5 74,14 73,21 67,27 73,21 T7 1,5 2,0 1,5 1,8 74,14 64,29 72,73 67,86 T22 1,5 1,5 1,5 2,0 74,14 73,21 72,73 64,29 T26 1,0 2,5 1,5 1,5 82,76 55,36 72,73 73,21 TC1 2,6 3,5 2,8 3,0 55,17 37,50 49,09 46,43 TC3 1,5 1,8 1,5 2,0 74,14 67,86 72,73 64,29 TC7 1,7 2,0 1,8 1,5 70,69 64,29 67,27 73,21 TCC1 2,5 3,0 2,8 2,3 56,90 46,43 49,09 58,93 68