Đồ án Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp. trong thức ăn chăn nuôi thủy sản

Nội dung text: Đồ án Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp. trong thức ăn chăn nuôi thủy sản

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP. TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI THỦY SẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NHỚ MSSV: 1151110243 Lớp: 11DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2015
2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những nội dung trong bài đồ án là do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của cô CN. Đỗ Thị Tuyến. Tôi cam đoan các kết quả nghiên cứu đưa ra trong luận án này dựa trên các kết quả thu được trong quá trình thực hiện đề tài, hoàn toàn trung thực không sao chép bất kì kết quả nghiên cứu nào của tác giả khác. Nội dung trong đồ án có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu từ các nguồn sách hay công trình nghiên cứu khác đều được đều được trích dẫn rõ ràng và liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo. Nếu có vi phạm quy chế hay gian trá tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Sinh viên thực hiện Trần Thị Nhớ
3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với Ban Giám Hiệu cùng các thầy cô của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm tôi học tập tại trường cũng như đã tạo điều kiện cho tôi thực tập để tích lũy kinh nghiệm cho công việc sau này. Để hoàn thành tốt khóa luận này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cô CN. Đỗ Thị Tuyến đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài. Bên cạnh sự cố gắng hết mình của bản thân, tôi cũng thầm biết ơn sự ủng hộ, quan tâm và động viên của gia đình, bạn bè – những người thân yêu luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý. Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Viện Sinh Học Nhiệt Đới luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc. Tôi xin chân thành cảm ơn! TP. HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực hiện Trần Thị Nhớ
4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục các hình vi Danh mục các bảng vii Danh mục các sơ đồ viii Danh mục các đồ thị viii Chương 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 2 1.3. Yêu cầu 2 1.4. Phương pháp nghiên cứu 2 1.5. Kết cấu của đồ án 2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp. 3 2.1.1. Phân loại 3 2.1.2. Đặc điểm chung của chi Bacillus 4 2.1.3. Khả năng tạo bào tử 4 2.1.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản 6 2.1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp. 7 2.2. Enzyme protease 8 2.2.1. Giới thiệu chung về protease 8 2.2.2. Phân loại protease 10 2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật 12 2.2.4. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease 13 2.2.5. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease 15 2.2.6. Ứng dụng protease vi sinh vật 16 2.3. Trùn quế 17 2.3.1. Phân loại và đặc điểm của trùn quế 17 2.3.2. Đặc tính sinh học của trùn quế 18 i
5. Đồ án tốt nghiệp 2.3.3. Đặc tính sinh lý của trùn quế 19 2.3.4. Sự sinh sản và phát triển 20 2.3.5. Tác dụng của trùn quế 20 2.3.6. Bổ sung Trùn quế và BIO – T trong chăn nuôi 22 2.4. Chế phẩm probiotics 24 2.4.1. Định nghĩa về Probiotics 24 2.4.2.Vai trò của probiotics trong chăn nuôi thủy sản 24 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26 3.2. Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 26 3.2.1. Vật liệu 26 3.2.2. Hóa chất 27 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 28 3.3. Môi trường phân lập, định danh và giữ giống 28 3.4. Phương pháp nghiên cứu 29 3.4.1. Sơ đồ tổng quan thí nghiệm 29 3.4.2. Phương pháp phân lập Bacillus sp. 30 3.4.2.1. Hoạt hóa giống Bacillus sp. 30 3.4.2.2. Phân lập các chủng Bacillus sp 30 3.4.2.3. Cấy giữ gống Bacillus sp 30 3.4.2.4. Tăng sinh chủng Bacillus sp. 30 3.4.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 31 3.4.3. Phương pháp định danh bằng đặc điểm sinh lý, sinh hóa 31 3.4.3.1. Phương pháp nhuộm Gram 31 3.4.3.2. Test khả năng di động 33 3.4.3.3. Test catalase 33 3.4.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh Indol 34 3.4.3.5. Thử nghiệm Methyl Red (MR) 35 3.4.3.6. Thử nghiệm khả năng sử dụng đường 36 ii
6. Đồ án tốt nghiệp 3.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 36 3.4.4.1. Khả năng kháng khuẩn 36 3.4.4.2. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease 37 3.4.4.3. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease 37 3.4.4.4. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease 38 3.4.5.Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cơ bản cho trùn quế 38 3.4.5.1. Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu 38 3.4.5.2. Phương pháp định lượng khoáng tổng số bằng quang phổ kế 39 3.4.5.3. Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng Nitơ tổng số) 40 3.4.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson cải tiến 41 3.4.5.5. Phương pháp Lowry xác định hàm lượng acid amin 44 3.4.6. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease 45 3.4.6.1. Xác định nhiệt độ tối ưu 45 3.4.6.2. Xác định pH tối ưu 45 3.4.7. Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn quế 46 3.4.7.1. Khảo sát nồng độ cơ chất 46 3.4.7.2. Khảo sát nồng độ enzyme 47 3.4.7.3. Khảo sát thời gian thủy phân 47 3.4.8. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm. 48 3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu 49 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp 50 4.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm Probiotic 50 4.1.2. Nhuộm Gram 52 4.1.3. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa 52 4.1.3.1. Khả năng di động 52 4.1.3.2. Khả năng sinh catalase 53 iii
7. Đồ án tốt nghiệp 4.1.3.3. Khả năng sinh indol 54 4.1.3.4. Thử nghiệm methyl red 54 4.1.3.5. Khả năng lên men các loại đường 55 4.2. Đánh giá các hoạt tính sinh học 58 4.2.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn 59 4.2.2. Định tính khả năng sinh enzyme protease 59 4.3. Xác định thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế 60 4.4. Kết quả xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme thu được từ chế phẩm 61 4.4.1. Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease 61 4.4.2. Kết quả xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease 62 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân 63 4.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy phân 65 4.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân 67 4.8. Thủy phân trùn quế với các điều kiện tối ưu đã chọn 70 4.9. Quy hoạch thực nghiệm 71 4.10. Đánh giá hiệu quả sản phẩm 77 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 5.1. Kết luận 78 5.2. Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 iv
8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT OD Optical density UI Unit International MR Methyl red CFU Colonies Form Unit TCA Trichloroacetic acid EDTA Etilendiamin tetraaxetic axit NL Nguyên liệu CPE Chế phẩm enzyme v
9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1. Bacillus sp. 3 Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử 5 Hình 2.3. Cấu trúc 3D của protease 8 Hình 2.4. Trùn quế 18 Hình 2.5. Trùn quế trong chăn nuôi 22 Hình 3.1. Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập 26 Hình 3.2. Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus – Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP. HCM 27 Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc phân lập từ các mẫu 50 Hình 4.2. Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng 1, 5 và 6 52 Hình 4.3. Kết quả thử khả năng di động của chủng 1, 5 và 6 53 Hình 4.4. Kết quả thử khả năng tạo catalase của 3 chủng 1, 5 và 6 53 Hình 4.5. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh indol của 3 chủng 1, 5 và 6 54 Hình 4.6. kết quả thử nghiệm methyl red của 3 chủng 1, 5 và 6 54 Hình 4.7. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 1 55 Hình 4.8. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 5 56 Hình 4.9. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 6 57 vi
10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease 13 Bảng 2.2. Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá 22 Bảng 3.1. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin 42 Bảng 3.2. Xác định hàm lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu 42 Bảng 3.3. Lập đường chuẩn Albumin 44 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (% w/v) 46 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (%) 47 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 48 Bảng 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm 51 Bảng 4.2. Kết quả thử nghiệm các đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng đã khảo sát 58 Bảng 4.3. Kết quả vòng tan xác định khả năng kháng khuẩn của 3 chủng 59 Bảng 4.4. Kết quả xác định vòng phân giải casein của enzyme protease thu nhận từ 3 chủng sau 48 giờ 59 Bảng 4.5. Thành phần sinh hóa trong thịt trùn quế dùng để thủy phân 60 Bảng 4.6. Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt trùn quế bằng enzyme thương phẩm và enzyme chế phẩm 70 Bảng 4.7. Kết quả so sánh các chỉ tiêu giữa hai sản phẩm thịt trùn sau thủy phân 70 Bảng 4.8. Mã hóa các biến số thực nghiệm theo các yếu tố ảnh hưởng 71 Bảng 4.9. Ma trận kế hoạch hóa đối với 4 yếu tố 71 Bảng 4.10. Kết quả hàm lượng acid amin theo thực nghiệm và theo phương trình hồi quy 72 Bảng 4.11. Kết quả bj và bij 73 Bảng 4.12. Xử lý số liệu tại tâm 73 Bảng 4.13. Bảng kiểm định Student 74 Bảng 4.14. Kết quả so sánh một số chỉ tiêu giữa các tỷ lệ trộn 77 vii
11. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân loại protease 10 Sơ đồ 3.1. Quá trình tiến hành thí nghiệm 29 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chế phẩm 61 Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme chế phẩm 63 Đồ thị 4.3. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng độ cơ chất khác nhau 64 Đồ thị 4.4. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng độ enzyme khác nhau 66 Đồ thị 4.5. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qua trình thủy phân với các mức thời gian khác nhau 68 viii
12. Đồ án tốt nghiệp Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme sản xuất ngày càng nhiều và được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của đời sống con người như: Công nghệp da, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế, và là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình thúc đẩy sự phát triển của ngành chế biến thức ăn thủy sản. Trong những năm gần đây thủy sản đã trở thành nền kinh tế mũi nhọn ở nước ta, sản lượng thủy sản ngoài đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường các nước Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc Để tăng năng suất và lợi nhuận người nuôi đã tăng mật độ giống, sử dụng thuốc hóa học để phòng và trị bệnh đã làm xáo trộn hệ sinh học tự nhiên, ô nhiễm môi trường và thêm vào đó là ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản. Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, mà thay vào đó là các sản phẩm sinh học giúp tăng cường sức đề kháng bệnh, tăng khả năng hấp thụ dưỡng chất, hay làm sạch môi trường nước bằng cách bổ sung thêm những vi sinh vật có lợi. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là “probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại. Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá (nhờ những hệ enzyme vi sinh vật, hoặc những sản phẩm chuyển hóa trong quá trình lên men của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh. Thêm vào đó, việc ứng dụng trùn quế vào thức ăn làm tăng hàm lượng đạm hữu cơ trong thức ăn chăn nuôi cũng là một trong những hướng nghiên cứu chính nhận được nhiều sự quan tâm của cả các nhà khoa học và người chăn nuôi. Với hàm lượng protein thô cao, hàm lượng đạm của trùn tương đương với bột cá, là thức ăn lý tưởng để nuôi thủy sản. Trùn còn chứa nhiều loại acid amin,vitamin, chất khoáng cần thiết cho gia súc, gia cầm và thủy sản. Đặc biệt, thịt trùn còn có các loại kích thích tố sinh trưởng tự nhiên mà trong bột cá không có. Thức ăn chăn nuôi có bột trùn sẽ không 1
13. Đồ án tốt nghiệp có mùi tanh và khét của cá và dầu cá, hấp dẫn với vật nuôi, lại bảo quản được lâu hơn thức ăn có dùng bột cá. Tuy nhiên protein có trong thịt trùn tươi thường khó tiêu hóa nên thủy phân bằng protease mang lại nhiều ưu điểm như: Không độc hại, cắt đứt các liên kết peptid tạo các amino acid đơn giản giúp quá trình tiêu hóa, hấp thụ tốt hơn. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp. trong thức ăn chăn nuôi thủy sản”. 1.2. Mục đích nghiên cứu Chọn lọc được chủng Bacillus sp. có khả năng sinh enzyme protease cao. Xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân trùn quế bằng enzyme protease để ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp. 1.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng Bacillus sp. từ các chế phẩm thức ăn chăn nuôi thủy sản. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein trùn quế bằng enzyme protease: nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân. So sánh khả năng thủy phân của enzyme protease thương phẩm và enzyme protease từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp. Tối ưu hóa thực nghiệm quá trình thủy phân trùn quế. 1.4. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng các phương pháp như: phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2013 và phần mềm statgraphics. 1.5. Kết cấu của đồ án Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương: Chương 1: Mở đầu. Chương 2: Tổng quan tài liệu. Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chương 4: Kết quả và thảo luận. Chương 5: Kết luận và kiến nghị. 2
14. Đồ án tốt nghiệp Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp. 2.1.1. Phân loại Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong thời gian dài ở điều kiện bất lợi, nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn. Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus được phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Fimicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Chi Bacillus là một chi lớn, đa dạng và thuộc họ Bacillaceae. Với một số loài thường gặp trong tự nhiên như: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus mensentericus, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, bacillus Brevis, Bacillus simplex, Hình 2.1. Bacillus sp. ( sp-trong.html) 3
15. Đồ án tốt nghiệp 2.1.2. Đặc điểm chung của chi Bacillus (Nguyễn Thị Yến Thu, 2011) Vi khuẩn Bacillus là một chi gồm các vi khuẩn hình que hay trực khuẩn, Gram (+), đường kính khoảng 0,2 – 2 µm, dài 2 – 8 µm, thường ở dạng đơn hoặc chuỗi dài, chiều dài của chúng phụ thuộc vào điều kiện môi trường trong suốt quá trình phát triển. Phần lớn các chủng vi khuẩn Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng ở mức trung bình, với nhiệt độ tối ưu vào khoảng 35 – 45oC, cũng có một số chủng có nhiệt độ tối ưu khá cao khoảng 65oC. Là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có khả năng sinh catalase, bất động hay di động nhờ tiêm mao, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, muối rộng, tồn tại được ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài như một số loài ưa lạnh có thể sinh trưởng và hình thành nội bào tử ở 0oC, pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2 – 11 nên đa số chúng rất phổ biến trong tự nhiên và có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như: đất, nước, thức ăn, Hầu hết là vi khuẩn hoại sinh, có mặt khắp nơi trong tự nhiên, phần lớn chúng cư trú trong đất. Vi khuẩn Bacillus có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, amino acid, các acid hữu cơ và có thể chuyển hóa các nguồn carbon như methanol, cellulose hay lên men các hỗn hợp carbonhydrat tạo glycerol và butanediol. Các chủng Bacillus được nghiên cứu nhiều do có khả năng tổng hợp được nhiều loại enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose, phytase, tùy thuộc vào nguồn cơ chất khác nhau sẽ sinh enzyme khác nhau như nguồn cơ chất là cellulose thì sẽ sinh tổng hợp enzyme cellulase, Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là enzyme thủy phân của các phân tử hữu cơ lớn, chính vì thế vi khuẩn này có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như công nghệ sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thực phẩm, bánh kẹo, đồ uống, công nghệ dược phẩm, công nghệ thuộc da, công nghệ dệt và trong xử lý chất thải. 2.1.3. Khả năng tạo bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bào tử không hình thành trong suốt quá trình hoạt động tăng trưởng và phân chia tế bào, thường khi gặp điều kiện bất lợi về môi trường, thiếu 4
16. Đồ án tốt nghiệp dinh dưỡng, thì nội bào tử mới được hình thành. Bào tử có hình oval và có khuynh hướng phình ra ở một đầu, do đặc điểm cấu tạo và đặc tính sinh lý nên bào tử được cho là dạng tồn tại bền vững nhất được tìm thấy trong tự nhiên của tế bào, tồn tại lâu dài trong điều kiện khắc nghiệt. Quá trình hình thành bào tử gồm các bước:  Hình thành vách ngăn.  Sự tạo tiền bào tử.  Tạo lớp vỏ bào tử.  Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử.  Sự giải phóng bào tử. Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử www.biol.lu.se/cellorgbiol/membprot/pop sv.html Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo thành tiền bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra. Sau đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát 5
17. Đồ án tốt nghiệp triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004). 2.1.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản Sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus trong môi trường với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Thuận, 1976). Triển vọng ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. trong nhiều lĩnh vực đời sống, đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn. Một số loài thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus như: B. subtilis, B. aterrimus. B. niger, B. pumilis, B. panis, B. vulgarus, B. nigrificans, B. natto, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B. mesentericus đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản với vai trò: Cải thiện sức khỏe, cung cấp nguồn dinh dưỡng trực tiếp và hỗ trợ tiêu hóa. Tăng cường các phản ứng miễn dịch và cải thiện môi trường nước như phân hủy các chất thải hữu cơ, giảm chất độc NH3 và H2S, giảm chất dư thừa tích tụ ở đáy ao, giảm phát sinh khí độc và mùi hôi. Ức chế các tác nhân gây bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và môi trường sống. Khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh (như vi khuẩn Vibrio) giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng là đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này. Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh ra các hoạt chất có hoạt tính sinh học và ứng dụng được trong nhiều lĩnh vực. Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp. đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong quá trình chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2. Do vậy, Bacillus sp. làm giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). Một số loài của nhóm vi khuẩn Bacillus sp. (B. Subtilis, B. Licheniformis, B. Megaterium, ) dùng để làm 6
18. Đồ án tốt nghiệp sạch môi trường nhờ khả năng sinh các enzyme (protease, amylase, cellulase, kitinase) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính, Đinh Thị Kim, 2006). Bacillus còn có khả năng tổng hợp các chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật phát triển quá mức như Vibrio, Aeromnas, (Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012). 2.1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp. Vijayabaska et al. (2008) ứng dụng thành công các vi sinh vật có lợi mà cụ thể là nhóm vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi cá rô phi nhằm hạn chế mầm bệnh do vi khuẩn A. Hyrophila gây ra. Sugama, Tsumura (1998) đã sử dụng chủng Bacillus BY – 9 bổ sung vào bể (18 m3) nuôi ấu trùng tôm sú với mật độ 106 CFU/ml. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng ức chế được vi khuẩn Vibrio harveji và tỉ lệ sống của tôm ở giai đoạn OL 10 ở bể bổ sung vi khuẩn đạt cao hơn (46,1%) so với đối chứng (10,6%). Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2011) về quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất lượng nước ao nuôi được cải thiện, đồng thời mật độ Vibrio ở các nghiệm thức bổ sung Bacillus thấp hơn so với đối chứng. Graslund et al., cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái Lan đã sử dụng chế phẩm vi sinh hoặc dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng nước và bùn đáy ao nuôi (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012). Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước và mùn bã hữu cơ trong bể nuôi tôm sú đã được nghiên cứu. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức bổ sung 3 loài vi khuẩn Bacillus bao gồm Bacillus B8, B37 và B38 với mật độ 105 CFU/ml và 1 đối chứng (không bổ sung vi khuẩn). Kết quả cho ta thấy tỉ lệ sống ở nghiệm thức B37 cao nhất (93,33 ± 1,65%), còn đối chứng thấp nhất (69,52 ± 1,65%) (p < 0,05). Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về chiều dài và trọng lượng của tôm cao nhất ở B37 lần lượt là 1,659 ± 0,034 mm/ngày và 0,45 ± 0,02 g/ngày, trong khi đó ở nghiệm thức đối chứng là thấp nhất với các chỉ số tương ứng là 0,677 ± 0,017 mm/ngày và 0,14 ± 0,01 g/ngày. Như vậy hiệu quả xử lí môi trường của các chủng vi khuẩn bổ 7
19. Đồ án tốt nghiệp sung được khẳng định, trong đó hiệu quả xử lý tốt nhất ở nghiệm thức dòng B37 (Phạm Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú, 2010). Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus: Trong chăn nuôi: viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con. Từ năm 1983 đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng. Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, Probiotic. Trồng trọt: Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae Ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất, Bộ Nông Nghiệp tại TP. HCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải. Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế phẩm Subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia furnacalis trên bắp. 2.2. Enzyme protease 2.2.1. Giới thiệu chung về protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010) Hình 2.3. Cấu trúc 3D của protease ( cuu/1241-ung-dung-enzyme-trong-nganh-cong-nghiep-.html) 8
20. Đồ án tốt nghiệp Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptide CO NH của phân tử protein và cắt liên kết peptide giữa các L acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptide ngắn, pepton. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ). Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ưu điểm nhất như vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc đã được gia tăng sử dụng như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện được đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Đặc biệt vi khuẩn là nguồn sản xuất protease tương đối lí tưởng vì những ưu điểm như: có hoạt tính mạnh như chỉ với một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng cơ chất lớn, có cường độ sinh sản rất mạnh và tổng hợp enzyme với tốc độ rất nhanh chóng, trong thời gian ngắn có thể thu được một lượng lớn enzyme. Hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học. Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus, và một số loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein gồm nhiều các amino acid nối với nhau bằng liên kết peptide tạo nên một hay nhiều chuỗi polypeptide có cấu trúc rất phức tạp và chúng phân giải các liên kết peptide tạo các acid amin đơn giản, dễ hấp thu. Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng, đậu tương 9
21. Đồ án tốt nghiệp 2.2.2. Phân loại protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010) Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4). Peptidase (Protease) (E.C.3.4) Exopeptidase Endopeptidase (E.C. 3.4.11-17) (E.C. 3.4.21-99) Serine proteinase Aminopeptidase Cystein proteinase Aspartic proteinase Carboxypeptidase Metallo proteinase Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân loại protease  Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất có thể chia protease thành hai nhóm: Endopeptidase: protease thủy phân peptide ở giữa mạch. Exopeptidase: protease phân cắt các liên kết peptide ở đầu mạch.  Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.  Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: 10
22. Đồ án tốt nghiệp Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc Serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các Serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cysteine proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspartic proteinase: hầu hết các Aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các Aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các Metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.  Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: Protease acid: pH = 2 – 4 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease trung tính: pH = 7 – 8 chúng thường được sản xuất từ các loài vi khuẩn như Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus. Protease kiềm: pH = 9 – 11, trong trung tâm hoạt động của các enzyme protease này có serin. Nhưng tác dụng tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất. Vì cùng một protease của cùng một chủng vi khuẩn khi thủy phân casein, hemoglobin hay gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau. 11
23. Đồ án tốt nghiệp  Dựa vào nguồn thu nhận enzyme: Protease động vật: có trong tụy tạng (đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất) và dạ dày bê. Protease thực vật: có 3 loại protease thực vật như Bromelain (thu từ quả, chồi và vỏ dứa), Papain (có trong nhựa của lá, thân, quả đu đủ) và Ficin (thu được từ nhựa cây cọ). Protease vi sinh vật: phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số loại nấm men. 2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật Protease có thể ở 2 dạng chính là protease nội bào (hiện diện trong tế bào) và protease ngoại bào (được tiết vào môi trường nuôi cấy) và có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Protease ngoại bào thường phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ. Cho đến nay, các loại protease ngoại bào được nghiên cứu kĩ hơn nhiều so với protease nội bào. Vi sinh vật tiết ra enzyme ngoại bào phân giải protein và chuyển hóa thành các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide, oligopeptide). Các chất này tiếp tục phân hủy thành các acid amin nhờ Peptidase ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào tế bào rồi mới chuyển hóa thành acid amin. Một phần các acid amin này được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng, phần khác được phân giải tạo thành NH3 và các sản phẩm khác. Protease Peptidase Protein Polypeptid Acid amin NH3 Quá trình này được gọi là sự khoáng hóa hay amon hóa. Đó là quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành dạng vô cơ (NH3) (trích Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012). 12
24. Đồ án tốt nghiệp Protease nội bào thì cho đến nay còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng như phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào để hình thành các acid amin và để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S. Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có thể có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật. Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích dẫn bởi Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005). Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc Bacillus subtilis Streptomyces grisus Aspergillus oryzae Bac. cereus Str. rimous Asp. niger Bac. thermophillus Str. fradiae Asp. owamori Bac. circulans Str. feacatis Asp. candidus Bac. brevis Str. rectus var proteolyticus Asp. favus Clostridium perfriugens Mucor pusilus Cl. histoluticum Rhizopus niveus Cl. porogens (Nguyễn Đức Lượng, 2002) 2.2.4. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất 13
25. Đồ án tốt nghiệp đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác. Về phương pháp nuôi cấy hiện nay người ta thường dùng hai phương pháp sau:  Nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Sử dụng môi trường nuôi dạng rắn hoặc bán rắn hay trên bề mặt dạng lỏng. Môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành váng khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Ở môi trường bán rắn để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp enzyme nội bào và ngoại bào. Độ ẩm thích hợp của môi trường đặc là 55 65%. Ưu điểm của phương pháp bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm vi sinh vật lạ thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ vì vậy ta dễ dàng xử lý. Nhưng nhược điểm là tốn nhiều diện tích, khó cơ giới hóa và tự động hóa.  Nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm) Phương pháp này sử dụng môi trường dạng lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men. Trong thiết bị lên men thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống diều hòa không khí và khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn do chúng làm xáo trộn môi trường làm tế bào vi sinh vật phân bố đều, tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế 14
26. Đồ án tốt nghiệp bào vi sinh vật đồng thời dòng khí được cung cấp và thải ra liên tục giúp cho sự sinh sản và phát triển, làm tăng khả năng tạo enzyme của vi sinh vật. Ưu điểm của phương pháp này là ít tốn diện tích và dễ cơ giới hóa nhưng nhược điểm là dễ bị nhiễm và khó kiểm soát. 2.2.5. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease (Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009) Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, thời gian hoạt động, thành phần môi trường Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp và có khác nhau trong khoảng từ 40oC – 60oC, đa số hoạt độ của protease cao nhất ở 50oC. Tuy nhiên, hầu hết các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ, bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp và chịu ảnh hưởng của cơ chất, pH môi trường và thời gian tác dụng Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ hoạt động thích hợp thì hoạt động của protease giảm vì nhiệt độ cao làm biến đổi hay hư hỏng cấu trúc của enzyme. Nhiệt độ mà protease mất hoàn toàn hoạt độ gọi là nhiệt độ tới hạn. Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0oC đa số protease vi khuẩn bị giảm hoạt tính nhưng không bị mất hoạt độ, do đó hoạt động của protease có thể tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên cũng có một số protease bị mất hoạt tính trong quá trình đông khô. Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại, trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự tích luỹ protease trong môi trường. Vì pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, trung tâm hoạt động của protease, phức chất protease – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của protease. Đa số protease vi khuẩn đều bền ở pH trung tính từ 6,2 – 7,4, pH thích hợp cho nhiều protease gần bằng 7. 15
27. Đồ án tốt nghiệp Ảnh hưởng của độ thông khí: có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp protease và khác nhau tùy theo từng loài vi sinh vật. Trong một số trường hợp thiếu oxi tuy kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại tăng quá trình tổng hợp protease, tuy nhiên sự thiếu khí mạnh sẽ kìm hãm sự sinh tổng hợp protease và lượng oxi thích hợp cho sự tổng hợp protease khác nhau ở các loại vi sinh vật. Ảnh hưởng của độ ẩm: thông thường các loài vi khuẩn đòi hỏi độ ẩm cao hơn nấm mốc, độ ẩm thích hợp nhất là khoảng 60 – 70%. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian nuôi cấy đối với vi khuẩn để sinh tổng hợp enzyme cực đại là khoảng 36 – 48 giờ. Tuy nhiên để phân giải protein đạt hiệu suất cao nhất, đòi hỏi thời gian lâu hơn, để enzyme phân giải đối với cơ chất tự nhiên. Ảnh hưởng thành phần môi trường: thành phần môi trường như nguồn carbon, nitơ, khoáng chất và các yếu tố vi lượng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme. Nếu trong môi trường có chứa các yếu tố gây biến tính protease như acid hoặc kiềm đặc hay muối kim loại nặng ở nồng độ cao thì protease sẽ bị mất hoạt tính. 2.2.6. Ứng dụng protease vi sinh vật (Trần Thị Nhã Uyên, 2010) Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như: ngành chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì, thuộc da, dệt, phim ảnh, dùng làm trong bia và nước quả hay trong sản xuất rượu Ngoài ra protease còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem bôi mặt có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc làm sạch cao răng chữa viêm lợi. Các loại xà phòng chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như vết máu ở quần áo, drap ở bênh viện Trong công nghệ thực phẩm: protease ứng dụng trong công nghệ chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa. Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất. Các sản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến. Từ nguyên liệu sữa, người ta đã cho ra vô vàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau. Các sản phẩm từ sữa có thể ở dạng rắn như các fomat với kết cấu hình thù và tính 16
28. Đồ án tốt nghiệp cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng như trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường. Trong đó, mảng sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú như là bơ, fomat, kefir, yoghurt, Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người bị bệnh tiêu hoá kém do dạ dày, tuỵ tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch. Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Sản xuất các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng. Trong chăn nuôi: sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn cho gia cầm và thủy sản. Trong công nghiệp da: thành phần quan trọng nhất của da là collagen, dưới tác dụng của protease các chất nhờn được tách ra, một số sợi liên kết collagen bị phá hủy. Kết quả là da có độ mềm nhất định giúp tách lông thú ra khỏi da dễ dàng mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng của da. 2.3. Trùn quế 2.3.1. Phân loại và đặc điểm của trùn quế Trùn quế có tên khoa học là Perionyx excavates, có vị trí phân loại: Ngành: Annelides (ngành giun đốt) Phân ngành: Clitellata (phân ngành có đai) Lớp: Olygochaeta (lớp giun ít tơ) Họ: Megascocidae (họ cự dẫn) Chi: Pheretima Loài: Perionyx excavatus (trùn quế) Trùn quế là động vật không xương sống, cơ thể phân đốt, phần đầu thoái hóa, có mang đai sinh dục, các hệ bên trong cơ thể như hệ tuần hoàn, hệ thần kinh, hệ bài tiết cũng sắp xếp theo đốt. Mỗi đốt mang một đôi hạch thần kinh giúp cho trùn ghi 17
29. Đồ án tốt nghiệp nhận cảm giác và phản ứng đáp trả của cơ thể đối với môi trường ngoài rất nhạy bén. Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với phần thể lớn và không có khả năng cải tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địa phương sống trong đất. Trùn quế là một trong những giống trùn đã được thuần hóa, nhập nội và đưa vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ. Đây là loại trùn mắn đẻ, xuất hiện rải rác ở vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch. Hình 2.4. Trùn Quế 2.3.2. Đặc tính sinh học của trùn quế Kích thước trùn quế trưởng thành từ 10 – 15 cm, bề ngang của con trưởng thành có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, thân hơi dẹt, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn. Cơ thể trùn có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ (Bùi Minh Tuấn, 2012). Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu oxy và thải CO2 trong môi trường nước, điều này giúp cho chúng có khả năng sống trong nước nhiều tuần, thậm chí trong nhiều tháng. Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, các cơ quan này bảo đảm cho việc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng amoniac và urea. Trùn quế nuốt thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày được nhiều nhà khoa học ghi nhận là tương đương với trọng lượng cơ thể của nó. Sau khi qua hệ thống tiêu hóa với nhiều vi sinh vật cộng sinh, chúng thải qua phân ra bên ngoài và rất giàu dinh dưỡng, những vi sinh vật cộng sinh có ích trong hệ thống tiêu hóa này theo phân ra 18
30. Đồ án tốt nghiệp khỏi cơ thể trùn nhưng vẫn còn có thể hoạt động ở “màng dinh dưỡng” trong một thời gian dài. Đây là một trong những nguyên nhân làm cho phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao và có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường trong tự nhiên (Nguyễn Thị Xuân Thanh, 2009). 2.3.3. Đặc tính sinh lý của trùn quế (Bùi Minh Tuấn, 2012) Trùn quế rất nhạy cảm, thường sống trên mặt đất, thích sống nơi môi trường ẩm ướt, tối, có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy và độ pH ổn định. Chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn.Tế bào da của trùn quế rất mỏng, thường xuyên tiết ra chất nhờn để bảo vệ cơ thể và thích ứng với điều kiện chui rúc trong môi trường tối và ẩm. Những điều kiện môi trường ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của trùn quế:  pH: trùn quế chịu được phổ pH khá rộng từ 4 9 thích hợp nhất là 6,8 7,5; nếu pH quá thấp chúng sẽ bỏ đi.  Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp nhất với trùn quế nằm trong khoảng từ 20 – 35oC, ở nhiệt độ khoảng 30oC và độ ẩm thích hợp, chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh. Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng hoạt động và có thể chết, hoặc khi nhiệt độ của luống nuôi lên quá cao cũng bỏ đi hoặc chết. Chúng có thể chết khi điều kiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúng lại có thể tồn tại trong môi trường nước có thổi oxy.  Độ ẩm: nước là thành phần quan trọng chiếm 75 – 90% khối lượng cơ thể trùn quế, độ ẩm thích hợp nhất cho trùn quế sinh trưởng và sinh sản là 60 – 70%.  Không khí: trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu oxy và thải CO2, do đó môi trường sống của chúng đòi hỏi phải thoáng khí, lưu ý loại bỏ các chất khí có hại cho trùn như: Clo (Cl2), amoniac (NH3), H2S, SO2, SO3, CH4, Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ nào có thể phân hủy trong tự nhiên như rác đang phân hủy, phân gia súc, gia 19
31. Đồ án tốt nghiệp cầm Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn, giúp cho chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn. Trong tự nhiên, trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rảnh, hoặc nơi có nhiều chất hữu có dễ phân hủy và thối rữa như trong phân động vật, rác hoai mục. Chúng rất ít hiện diện trên các đồng ruộng canh tác dù nơi đây có nhiều rác thải hữu cơ, có lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất thải này thường cao, không hấp dẫn và không đảm bảo độ ẩm môi trường thường xuyên. 2.3.4. Sự sinh sản và phát triển (Tiêu Thị Ngọc Thảo, 2008) Trùn quế sinh sản rất nhanh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn định và có độ ẩm cao như điều kiện của khu vực phía Nam. Theo nhiều tài liệu, từ một cặp ban đầu trong điều kiện sống thích hợp có thể tạo ra từ 1.000 – 1.500 cá thể trong một năm. Trùn quế là sinh vật lưỡng tính, chúng có đai và các lỗ sinh dục nằm ở phía đầu của cơ thể, có thể giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con, kén được hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 – 20 trứng. Kén có hình dạng thon dài, hai đầu túm nhọn lại gần giống như hạt bông cỏ, ban đầu có màu trắng đục, sau chuyển sanh xanh nhạt rồi vàng nhạt, mỗi kén có thể nở từ 2 – 10 con. Khi mới nở, con nhỏ như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3 mm, sau 5 – 7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một vằn đỏ thẫm trên lưng. Khoảng từ 15 – 30 ngày sau, chúng trưởng thành và bắt đầu xuất hiện đai sinh dục, từ lúc này chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản. Con trưởng thành khỏe mạnh có màu mận chín và có sắc ánh kim trên cơ thể. 2.3.5. Tác dụng của trùn quế Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy: hiếm có loài động vật nào có giá trị hấp dẫn như trùn quế. Trùn quế được sử dụng trực tiếp hoặc phối trộn làm thức ăn cao cấp nuôi gia súc, gia cầm, thủy sản; thậm chí làm thực phẩm cho con người; dùng sản xuất mỹ phẩm, dược phẩm; trùn phân hủy rác hữu cơ, bảo vệ môi trường; phân trùn thải ra là một trong những loại phân hữu cơ thiên nhiên giàu dinh dưỡng nhất mà con người từng biết. 20
32. Đồ án tốt nghiệp Ứng dụng trong chăn nuôi: trùn quế là loại thức ăn giàu đạm, chất lượng cao để tăng hàm lượng dinh dưỡng trong thức ăn cho gia súc, gia cầm và nhất là đối với các loài thủy sản đồng thời còn có thể giảm chi phí cho thức ăn chăn nuôi. Với hàm lượng protein cao của trùn quế tương đương với trong bột cá thường dùng làm thức ăn chăn nuôi, thêm vào đó là thịt trùn quế có chứa các acid amin, lipit, vitamin, khoáng chất, hay các loại kích thích tố sinh trưởng cao hơn trong bột cá (A.F.Md. Hasanuzzaman, Sk.Z. Hossian, M. Das, 2010). Bột thức ăn chứa thịt trùn quế không có mùi tanh hay mùi khét như bột cá nên có thể hấp dẫn được vật nuôi tốt hơn và dễ bảo quản trong thời gian dài. Trùn quế nhất là trùn tươi rất tốt làm thức ăn cho gà, lợn, thỏ và như một nguồn bổ sung dinh dưỡng cho các loài thủy sản. Thêm vào đó trong thịt trùn quế còn chứa một lượng thấp acid glutamic nên khi dùng làm thức ăn chăn nuôi hàng ngày sẽ giúp tăng tốc độ sinh trưởng, tăng năng suất trứng, tăng khả năng sinh sản và sức kháng bệnh của tôm, cá. Trùn quế rất dễ nuôi và sinh sản nhanh nên có thể sản xuất một lượng lớn trùn trong thời gian ngắn giúp giảm giá thành thức ăn, có tiềm năng thay thế cho nguồn protein động vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, đóng vai trò quan trọng trong nuôi trồng và sản xuất thủy sản hiện nay. Theo W.T.Mason (Đại học Phlorida – Mỹ): trùn, nhất là trùn tươi, là thức ăn lý tưởng để nuôi thủy sản, nhất là sản xuất con giống ba ba, rùa, lươn, tôm, cá chình, đặc biệt là nuôi cá tầm – một loài cá quý để ăn và sản xuất món trứng cá muối đắt tiền. Nếu cho chúng ăn trùn tươi hằng ngày bằng 10 – 15% trọng lượng cơ thể sẽ tốt hơn bất cứ loại thức ăn nào khác, tốc độ sinh trưởng sẽ tăng từ 15 – 40%, năng suất trứng tăng lên 10%. Nếu trộn 2 – 3% bột trùn dùng để nuôi, năng suất sẽ tăng trên 30%, giá thành thức ăn giảm 40 – 60%, đồng thời tăng sức sinh sản và khả năng kháng bệnh của tôm, cá. Điều này rất có ý nghĩa khi thức ăn chăn nuôi đắt đỏ như hiện nay. Hiệp hội nuôi gà của Mỹ cho rằng: trùn là phương án hàng đầu cung cấp protein chất lượng cao, rẻ nhất, dễ nhất cho vật nuôi, đặc biệt là gà, thì năng suất trứng tăng 17 – 25%, tốc độ sinh trưởng tăng 56 - 100%. Đặc biệt nếu nuôi gà bằng thức ăn có 21
33. Đồ án tốt nghiệp trùn tươi thì hầu như gà không bị bệnh; trong khi nếu nuôi gà không có trùn thì tỷ lệ mắc bệnh cúm gà 16 – 40%. Trùn quế còn chứa trên 8% axit glutamic, nên khi sử dụng làm thức ăn chăn nuôi thì vật nuôi khỏe, chóng lớn, đẻ khỏe, ít bệnh tật và sẽ cho thịt thơm ngon hơn hẳn so với vật nuôi thông thường. Vì vậy ngày càng có nhiều hãng sản xuất thức ăn công nghiệp quan tâm đưa bột trùn vào thức ăn chăn nuôi để tạo sự khác biệt so với thức ăn thông thường, nâng cao khả năng cạnh tranh sản phẩm trên thị trường. Bảng 2.2. Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá Chỉ tiêu Bột trùn Bột cá Protein (%) 45,60 – 47,53 37,87 – 61,28 Lipit (%) 7,59 – 8,47 4,18 – 8,88 Tro (%) 23,54 – 24,88 18,68 – 44,36 Độ ẩm (%) 67,84 – 74,08 8,26 – 31,53 (A.F.Md. Hasanuzzaman, Sk.Z. Hossian, M. Das, 2010) 2.3.6. Bổ sung trùn quế và BIO – T trong chăn nuôi Hình 2.5. Trùn quế trong chăn nuôi ( 22
34. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Minh Triết (2008) thử nghiệm trùn quế và chế phẩm vi sinh lên sinh trưởng và phát triển của vịt xiêm. Khảo sát mức độ trùn quế 5%, chế phẩm vi sinh 5‰ và 10‰ vào khẩu phần thức ăn cho vịt xiêm trong giai đoạn từ 1 – 84 ngày. Kết quả cho thấy trọng lượng bình quân của các nghiệm thức thí nghiệm (1886,9; 1723,1; 1891,9) cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (1400,6) và hệ số chuyển hóa thức ăn của nghiệm thức thí nghiệm (3,7765; 3,8601; 3,4928) cũng thấp hơn hẳn so với nghiệm thức đối chứng (5,54). Trong nghiên cứu của Sakthika.T, Ronald. J, Siva Kumar.V, Felicitta. J (2014) khảo sát sự ảnh hưởng trong bữa ăn của cá cho ăn thức ăn viên (NT1) và cá cho ăn 2 bữa ăn khác nhau từ trùn quế được nuôi bằng cây lục bình nước (NT2), kiểm tra các thông số tăng trọng của cá sau 60 ngày cho thấy: cá được nuôi ở NT2 cho tỉ lệ tăng trọng lên 51,87%, tốc độ tăng trưởng tăng 22,22%, giảm 51,43% tỷ lệ chuyển đổi thực phẩm và tăng hiệu quả protein lên 55,29% so với NT1. Điều này có ý nghĩa về mặt sinh thái và giá trị kinh tế trong ngành thủy sản. Theo tác giả C.O. Monebi và A. Ugwumba (2013) khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ thức ăn bột trùn thay cho bột cá đến trọng lượng và tốc độ tăng trưởng của cá giống từ 0, 5, 25, 50, 75, 100% bột trùn (NT1, NT2, NT3, NT4, NT5). Kết quả cho thấy trọng lượng cơ thể cá giống tăng 5% mỗi ngày trong vòng 9 tuần và giảm dần từ tuần thứ 10 trừ cá nuôi ở NT5, tốc độ tăng trưởng cao nhất trong cá nuôi ở NT3 là 1,5% còn thấp nhất đối với cá nuôi ở NT1 là 1,2%. Tỷ lệ cá sống cao từ 72 – 73,3% ở NT3, NT4, NT5 và thấp nhất ở NT1 và NT6. Tỷ lệ hiệu quả protein cao nhất ở NT3 (1,0) và thấp nhất ở NT6 (0,5), tỷ lệ chuyển đổi thức ăn cao nhất ở NT6 (3,1) và thấp nhất ở NT4 (1,6). Sự khác biệt giữa NT1 và NT6 là không đáng kể nhưng khác nhau đáng kể so với NT3, NT4, NT5. Vậy việc thay thế bột cá sang bột trùn từ 50 – 75% phù hợp với hiệu suất tăng trưởng và khả năng sử dụng chất dinh dưỡng của cá giống. 23
35. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Chế phẩm probiotics 2.4.1. Định nghĩa về Probiotics Có rất nhiều định nghĩa về probiotics như probiotics là những vi khuẩn hoặc nấm men có ích hỗ trợ khôi phục lại sự cân bằng trong đường ruột. Chúng còn được gọi là “vi khuẩn thân thiện” hay “lợi khuẩn”, những vi khuẩn này được bổ sung vào chế độ ăn nhằm cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột để cải thiện sức khỏe. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001): “Probiotics là các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khỏe tốt cho vật chủ”. Định nghĩa của Tổ chức Lương Nông Thế giới (FAO): “Probiotics là những vi sinh vật sống khi được sử dụng với một lượng tương thích sẽ mang lại lợi ích cho sức khỏe của vật chủ”. Định nghĩa khác: “Probiotics là vi sinh vật sống bổ sung trong thức ăn vật nuôi, gây tác động có lợi cho vật chủ bởi sự cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột” (Isolauri et al., 2004). 2.4.2. Vai trò của probiotics trong chăn nuôi thủy sản (Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012) Theo Phạm Thị Tuyết Ngân (2007) probiotic là hỗn hợp bổ sung mang bản chất của các vi sinh vật sống tác động có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ hoặc sống tự do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi trường sống. Probiotics là công nghệ thân thiện với môi trường và đang có xu hướng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam. Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăng khả năng phân giải các chất hữu cơ, làm sạch và ổn định môi trường nước mà còn làm tăng năng suất gấp hai lần so với đối chứng. 24
36. Đồ án tốt nghiệp Ngày nay việc đưa những sản phẩm probiotics vào nuôi trồng thủy sản đang được quan tâm và ứng dụng nhiều với những lợi ích như:  Cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh hay tạo ra những hoạt chất ức chế kìm hãm sự phát triển của chúng.  Cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của động vật thủy sản.  Giúp cải thiện hệ tiêu hóa cho vật nuôi nhờ những vi sinh vật hữu ích đường ruột có trong thức ăn.  Hấp thu hay phân hủy các thức ăn thừa, vật chất hữu cơ thải ra trong môi trường nước giúp cải thiện môi trường.  Kích thích hệ miễn dịch không đặc hiệu của tôm cá, nâng cao sức đề kháng. Ngoài ra, việc ứng dụng những vi sinh vật hữu ích vào môi trường ao nuôi không những cải thiện chất lượng nước, phát triển bền vững mà còn gia tăng năng suất, gia tăng tỷ lệ sống, giảm thiểu mầm bệnh trong môi trường và cải thiện hệ số thức ăn. 25
37. Đồ án tốt nghiệp Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian tiến hành từ tháng 5/2015 đến tháng 8/2015 tại phòng thí nghiệm trường đại học Công Nghệ TP. HCM. 3.2. Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu Trùn quế tươi được mua tại trại nuôi trùn ở trung tâm công nghệ sinh học Quận 12 Thành phố Hồ Chí Minh. Enzyme thương phẩm: enzyme Alcalase (sản phẩm thương mại của công ty Novozyme, thành phố Hồ Chí Minh). Nguồn vi sinh vật: phân lập các chủng Bacillus sp. từ những chế phẩm đang được lưu hành tại các đại lý buôn bán thức ăn thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long. Hình 3.1. Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập 26
38. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus– Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP. HCM 3.2.2. Hóa chất Hóa chất dùng pha môi trường: Agar, pepton, giá đậu, cao nấm men, NaCl. Hóa chất khảo sát đặc tính sinh hóa: MgSO4, K2HPO4, NH4H2PO4, phenol red, bromothymol blue. Thuốc thử: H2O2, methyl red, phenol red, Kovacs’. Thuốc nhuộm Gram: Gentian violet, Lugol, Fucshin Hóa chất chuẩn pH: NaOH (0,1 N), HCl (0,1 N). Dung dịch Tyrosine chuẩn Dung dịch casein 1% Dung dịch trichloroacetic acid (TCA) 5% Dung dịch albumin: 0,1% Thuốc thử Folin đã được pha sẵn. Dung dịch thuốc thử Lowry gồm: Dung dịch A: cân 2 g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0,1 N thành 100 ml. Dung dịch B: cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch citrate natri 1% tạo thành 100 ml. 27
39. Đồ án tốt nghiệp Dung dịch C: là hỗn hợp của dung dịch A và B theo tỷ lệ 49 : 1 (sử dụng trong ngày). 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu Các máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu được sử dụng trong phòng thí nghiệm của trường đại học Công Nghệ TP. HCM. - Cân điện tử - Tủ sấy, tủ ấm - Kính hiển vi quang học - Bể ủ nhiệt - Nồi hấp thanh trùng - Tủ cấy vô trùng - Bình tam giác - Máy lắc - Tủ lạnh, tủ lạnh sâu - Máy đo pH - Máy đo OD - Máy khuấy từ - Máy Kjeldahl - Máy li tâm Các dụng cụ khác như: Ống nghiệm, đĩa petri, đầu tuýp, đũa thủy tinh, lam kính, cốc thủy tinh, que trang, que cấy, pipetman, pipet, ống đong, nồi đun, bếp điện, giấy lọc, bông thấm 3.3. Môi trường phân lập, định danh và giữ giống Môi trường phân lập và giữ giống (MT1): môi trường nước chiết giá đậu pepton cao nấm men agar. (Phụ lục 1.1) Môi trường nhân giống: môi trường nước chiết giá đậu pepton cao nấm men (MT2). (Phụ lục 1.2) Môi trường khảo sát đặc điểm sinh học: môi trường Clark cluck, môi trường lên men các loại đường. (Phụ lục 1.6; 1.7) 28
40. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Sơ đồ tổng quan thí nghiệm Mẫu chế phẩm Probiotic Hoạt hóa giống Cấy giống Phân lập chủng Bacillus sp. Pha loãng mẫu Thuần khiết giống Quan sát, nhuộm Test IMVIC Gram Định danh bằng phương pháp sinh lý, sinh hóa Test khả năng sử Test khả năng di dụng đường động Định tính khả năng Xác định hoạt tính Xác định hoạt tính sinh enzyme protease kháng khuẩn sinh học Xác định nhiệt độ tối ưu: 35oC đến 65oC Xác định điều kiện Xác định hoạt tính tối ưu cho hoạt động protease bằng phương Xác định pH tối ưu: của chế phẩm pháp Anson cải tiến 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; protease 8,0; 8,5 Khảo sát nồng độ Xác định thành phần Enzyme tối ưu: 0,5; nguyên liệu trùn tươi 1; 1,5; 2; 2,5; 3(%) Tối ưu hóa quá trình Khảo sát nồng độ cơ Thủy phân trùn quế Khảo sát thời gian chất tối ưu: 5, 10, thủy phân: Từ 0 15, 20, 25, 30 (%) 20 giờ Xác định hàm lượng acid amin bằng phương pháp Lowry Sơ đồ 3.1. Quá trình tiến hành thí nghiệm 29
41. Đồ án tốt nghiệp 3.4.2. Phương pháp phân lập Bacillus sp. 3.4.2.1. Hoạt hóa giống Bacillus sp. Tiến hành hoạt hóa giống vi sinh vật từ 6 chế phẩm vi sinh: cân 0,1 g cho mỗi chế phẩm bổ sung vào môi trường MT2, sau đó ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng từ 18 – 24 giờ. Mẫu trước khi nuôi cấy đều phải đem hoạt hóa giống với mục đích: giúp cho quá trình nuôi cấy diễn ra nhanh hơn và vi sinh vật hoạt động trở lại sau thời gian bảo quản trong chế phẩm. 3.4.2.2. Phân lập các chủng Bacillus sp. Phân lập chủng Bacillus sp. từ chế phẩm sinh học thức ăn chăn nuôi thủy sản trên môi trường MT1. Hút 1 ml mẫu đã hoạt hóa cho vào 9 ml nước muối sinh lý (đã khử trùng), lắc đều để có độ pha loãng 10-1. Sau đó pha loãng thành các nồng độ 10-2,10-3, 10-4,10-5, 10-6, 10-7. Hút 0,1 ml mẫu từ 3 nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 cho vào môi trường thạch MT1 đã chuẩn bị trong các đĩa petri vô trùng, dùng que trải dàn đều dịch trên bề mặt đĩa thạch. Đĩa sau khi cấy được ủ từ 1 đến 2 ngày ở nhiệt độ 37oC. Mỗi nồng độ được trải trên 2 đĩa môi trường MT1. Khi khuẩn lạc mọc, quan sát hình thái, màu sắc để lựa chọn sơ bộ khuẩn lạc thuộc chủng Bacillus sp. Khuẩn lạc đặc trưng được tách ra và cấy ria nhiều lần để tạo dòng thuần chủng, sau đó cấy vào môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm, giữ giống ở nhiệt độ thấp (< 4oC). 3.4.2.3. Cấy giữ gống Bacillus sp. Cấy các giống Bacillus sp. đã được hoạt hóa cấy sang ống thạch nghiêng chứa môi trường MT1. Ủ khoảng 37oC trong 48 giờ. Sau đó đem giữ lạnh và cấy chuyền giống hàng tháng. 3.4.2.4. Tăng sinh chủng Bacillus sp. Cấy giống từ ống thạch nghiêng sang erlen có chưa môi trường MT2, nuôi cấy lắc ở nhiệt độ thường trong vòng 2 giờ. Dịch tăng sinh sau đó được được xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. 30
42. Đồ án tốt nghiệp 3.4.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2006)  Nguyên tắc Trên môi trường MT1, xem như mỗi tế bào sẽ phát triển thành 1 khuẩn lạc, dựa vào số khuẩn lạc mà ta xác định được số lượng tế bào trong một lượng mẫu ban đầu.  Cách tiến hành Chuẩn bị 15 – 20 ml dung dịch môi trường MT1 đã được hấp khử trùng và đổ MT vào mỗi đĩa petri, để nguội. Pha loãng thập phân mẫu bằng nước cất đã hấp khử trùng để được dịch pha loãng từ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7. Hút 0,1 ml các dung dịch trên vào từng đĩa môi trường MT1 đã được chuẩn bị trước, mỗi nồng độ cấy vào 2 đĩa. để tránh mất nước cho môi trường, ủ ở nhiệt độ phòng và sau 48 giờ ghi nhận kết quả số khuẩn lạc trên các đĩa (25 – 300). Nhân số khuẩn lạc đếm đươc trên đĩa petri với hệ số pha loãng, tính giá trị trung bình số khuẩn lạc từ 1 g hay 1 ml mẫu. Số khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu ban đầu được tính theo công thức: ∑ N Số khuẩn lạc = (CFU/ml) n1∗ v1 ∗f1 + n2∗ v2∗ f2+ . . .+ ni ∗ vi ∗ fi Với: N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa có từ 25 – 300 khuẩn lạc. ni: số đĩa có khuẩn lạc trong khoảng đếm được ở một nồng độ pha loãng i. vi: thể tích dịch pha loãng I cho vào mỗi đĩa petri. fi: bậc pha loãng. CFU: (Colonies Form Unit) đơn vị hình thành khuẩn lạc. 3.4.3. Phương pháp định danh bằng đặc điểm sinh lý, sinh hóa 3.4.3.1. Phương pháp nhuộm Gram  Mục đích Giúp ta phân biệt vi khuẩn thành hai nhóm lớn: vi khuẩn Gram dương (Gram positive) bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm (Gram genative) bắt màu hồng. Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống. 31
43. Đồ án tốt nghiệp  Nguyên tắc Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptodoglycan có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể iod. Trong khi đó lớp thành tế bào của vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có lớp màng lipid đôi bên ngoài. Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể iod, mẫu được xử lý tiếp với cồn 96o, làm mất nước của lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến tế bào giữ phức hợp tím tinh thể iod bên trong tế bào. Đối với vi khuẩn Gram âm, cồn 96o đóng vai trò làm chất hòa tan lớp lipid đôi bên ngoài. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể iod. Sau đó khi nhuộm lại với thuốc thử Fuchsin thì tế bào vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng của thuốc thử Fushin.  Cách tiến hành Bước 1: cho một giọt nước cất lên lam kính sạch, dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc, trang đều và để khô tự nhiên hoặc hơ qua ngọn lửa đèn cồn (nhằm làm vết bôi mau khô, giết chết tế bào vi sinh vật, cố định vi sinh vật). Bước 2: nhỏ một giọt thuốc nhuộm Crystal/Gentian Violet lên vết mẫu đã được cố định trong vòng 30 giây, rửa lại bằng nước cất (tránh để tia nước tiếp xúc trực tiếp với mẫu). Bước 3: nhỏ một giọt dịch Iot/Lugol lên vết mẫu trong vòng 1 phút đến, sau đó rửa lại bằng nước cất. Bước 4: tẩy cồn 96o cho đến khi hết màu thuốc nhuộm (khoảng 30 giây), sau đó rửa ngay bằng nước cất. Bước 5: nhỏ một giọt thuốc thử Fuchsin lên vết mẫu trong khoảng một phút, sau đó rửa bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô và đem mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100X với lớp dầu khoáng.  Quan sát: Gram “+” sẽ bắt màu tím; Gram “ ” sẽ bắt màu hồng. 32
44. Đồ án tốt nghiệp 3.4.3.2. Test khả năng di động  Mục đích Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm.  Nguyên tắc Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiêm mao có nhiều ở vi khuẩn hình que, một số vi khuẩn hình cầu. Khả năng di động là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt vi sinh vật. Khả năng này được quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di động của vi sinh vật vào bên trong môi trường thạch mềm. (+) khi vi sinh vật mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. Là ( ) khi vi sinh vật chỉ mọc theo đường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong.  Tiến hành Sử dụng môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar. Môi trường được đun tan và phân phối vào ống nghiệm. Các ống nghiệm này được hấp khử trùng và làm nguội ở trạng thái đứng. Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần chủng, cấy bằng cách đâm sâu đầu que cấy vào giữa ống thạch đứng chứa môi trường thạch có 0.5% agar. Các ống môi trường được ủ ở 37oC trong 24 48 giờ rồi quan sát. Nếu vi khuẩn mọc dọc theo vết cấy và mọc lan ra xung quanh, chứng tỏ chúng có khả năng di động. Còn nếu vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy mà không mọc lan ra xung quanh thi chứng tỏ chúng không có khả năng di động. 3.4.3.3. Test catalase  Mục đích Xác định xem vi sinh vật có enzyme catalase hay không.  Nguyên tắc Các vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy ý chứa chuỗi chuyền điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase (trừ Streptococcus sp.). Enzyme này là một trong các thành viên của hệ thống các enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào hiếu khí và kị khí tùy ý. 33
45. Đồ án tốt nghiệp Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyền điện tử tạo H2O2. Phần lớn các chủng vi khuẩn lactic có phản ứng catalase âm tính nhưng đặc biệt có một số loài thuộc chi Pedioccocus lại có phản ứng catalase dương tính gọi là “catalase giả” như P. pentosaceus do chúng không nhạy cảm với cyanide và azidem và không chứa nhóm giả của Hame (C34H32O4N2Fe).  Tiến hành Dùng que cấy lấy sinh khối khuẩn lạc thuần trên môi trường MT1 đặt lên lam sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên khuẩn lạc. Hoặc có thể thử trên đĩa petri, nhỏ trực tiếp H2O2 30% lên khuẩn lạc trên bề mặt thạch và quan sát hiện tượng sủi bọt bằng mắt thường. Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện. Phản ứng ( ): không có bọt khí xuất hiện.  Lưu ý Khi thử nghiệm trên lame không được đảo lộn trình tự tiến hành. Nên dùng khuẩn lạc đã nuôi trong thời gian từ 18 – 24 giờ để tránh phản ứng âm tính giả. H2O2 30% không bền và dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng nên cần giữ lạnh dung dịch và kiểm tra hoạt tính trước khi dùng. 3.4.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh indol  Mục đích Phát hiện các vi sinh vật có khả năng sinh indol các vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase.  Nguyên tắc Tryptophan là một acid amin có thể bị chuyển hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm có chứa gốc indol và các dẫn xuất của chúng trong môi trường canh trypton. Trong môi trường nuôi cấy bằng thuốc thử Kovacs’ hay Ehrlish’s. Indol sẽ kết hợp với thuốc thử para – dimethylaminobenzaldehyde (có trong thuốc thử Kovacs’) tạo thành phức chất quinon có màu đỏ. 34
46. Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị: môi trường canh Trypton, thuốc thử Kovacs’.  Cách tiến hành Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn từ môi trường thạch cấy vào trong môi trường canh Trypton và nuôi vi khuẩn ở 37oC khoảng 24 – 48 giờ, nhỏ vài giọt ether vào canh khuẩn để kéo indol lên trên bề mặt môi trường, thêm thêm vài giọt thuốc thử Kovacs’. Để yên 3 phút, quan sát hiện tượng và đọc kết quả. Quan sát môi trường: Phản ứng dương tính (+): xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường. Phản ứng âm tính (-): không xuất hiện vòng màu đỏ (môi trường không đổi màu). 3.4.3.5. Thử nghiệm Methyl Red (MR)  Mục đích Xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các sản phẩm acid trong môi trường glucose.  Nguyên tắc Một số vi sinh vật có khả năng sử dụng đường glucose có trong môi trường làm cho pH môi trường giảm (sinh axit). Khi đó, thuốc thử methyl-red vẫn giữ nguyên màu đỏ (MR dương tính). Ngược lại, nếu vi sinh vật không sử dụng nguồn glucose mà chỉ sử dụng nguồn nitrogen trong môi trường làm cho pH môi trường trở nên kiềm và thuốc thử methyl-red chuyển từ màu đỏ sang màu vàng (MR âm tính). Chuẩn bị: môi trường Clark Lubs, thuốc thử methyl-red, ống giống vi khuẩn.  Cách tiến hành Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy vào trong ống nghiệm chứa môi trường Clark Lubs, nuôi ở nhiệt độ 37oC – 2 - 5 ngày. Sau đó, nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử methyl – red vào ống nghiệm và đọc kết quả. Quan sát môi trường: Phản ứng MR dương tính: môi trường có màu đỏ. Phản ứng MR âm tính: môi trường màu vàng. 35
47. Đồ án tốt nghiệp 3.4.3.6. Thử nghiệm khả năng sử dụng đường  Mục đích Thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn carbonhydrate của các vi sinh vật.  Nguyên tắc Vi sinh vật có khả năng khác nhau trong việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau để tăng trưởng, khi sử dụng các nguồn carbon để lên men, tùy vào phương thức lên men mà các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2 . Trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH của môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.  Phương pháp Môi trường lên men các loại đường: glucose, saccharose, galactose và lactose với pH 7,4. Chỉ thị pH môi trường là phenol red, màu đỏ sẽ chuyển sang vàng khi pH môi trường dưới 6,8 (môi trường bị acid hóa). Bổ sung đường với nồng độ 1% và chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm và khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 10 phút. Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm, ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ và đọc kết quả. Quan sát môi trường: Phản ứng (-): môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ. Phản ứng (+): môi trường chuyển sang vàng. 3.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 3.4.4.1. Khả năng kháng khuẩn  Nguyên tắc Dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trong môi trường thạch, nơi có chất kháng sinh khuếch tán đến thì nơi đó vi sinh vật kiểm định không phát triển được và tạo ra vòng vô khuẩn trên môi trường thạch đĩa (Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007).  Cách tiến hành Trong thí nghiệm chúng tôi dùng phương pháp đục lỗ thạch và đo vòng kháng khuẩn. Chọn 3 vi khuẩn gây bệnh đường ruột gồm: E.coli, Salmonella và Staphylococcus để khảo sát tính kháng khuẩn của các chủng Bacillus sp. 36
48. Đồ án tốt nghiệp Nuôi vi khuẩn Bacillus sp. trong môi trường MT2 ở nhiệt độ phòng, sau 36 giờ lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng. Sau đó, đổ 15 ml môi trường MT1 vào các đĩa petri đã khử trùng, để nguội chờ môi trường đông đặc. Tiếp theo dùng khuyên đục lỗ đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng (đường kính khoảng 0,5 cm). Dùng pipet hút 1 ml vi khuẩn kiểm định vào môi trường và trải đều, sau đó dùng pipet hút 0,1ml dịch vi khuẩn Bacillus sp. đã được lọc nhỏ vào các giếng trong đĩa petri, để khô và ủ trong 48 giờ trong tủ ấm. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, đo đường kính vòng kháng khuẩn. 3.4.4.2. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease Để xác định khả năng thủy phân protein của các chủng vi khuẩn Bacillus sp chúng tôi tiến hành thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường MT1 có bổ sung 1% cơ chất casein. Nuôi vi khuẩn Bacillus sp. trong môi trường MT2 ở nhiệt độ phòng, sau 36 giờ lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng. Sau đó, đổ 15 ml môi trường MT1 có chứa casein vào các đĩa petri đã khử trùng, để nguội chờ môi trường đông đặc. Tiếp theo dùng khuyên đục lỗ đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng (đường kính khoảng 0,7 cm). Dùng pipet hút 0,1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn Bacillus sp. đã được lọc nhỏ vào các giếng trong đĩa petri, để đĩa vào tủ lạnh 2 tiếng để dịch có thể khuyếch tán đều vào môi trường, sau đó để vào tủ ấm. Sau 48 giờ thử bằng thuốc thử HgCl2 1% nhỏ lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh enzyme protease thì sẽ tạo một vòng trong suốt xung quanh giếng, do các protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các vùng chưa phân giải sẽ có màu trằng đục mờ. 3.4.4.3. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease Chuẩn bị và cấy vào môi trường MT3 với lượng giống sử dụng là 10%, độ ẩm 60 – 65%. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. 37
49. Đồ án tốt nghiệp 3.4.4.4. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease Sau khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp protease, đem sấy khô ở nhiệt độ 45oC trong 48 giờ sau đó say thành bột và cho vào túi kín. Bảo quản ở nhiệt độ phòng, tránh nơi ẩm thấp. Cân 10 g bột xay nhuyễn trên rồi bổ sung nước cất cho đủ 100 ml, ta thu được dịch enzyme pha loãng 10 lần. Nghiền, lắc cho enzyme tan đều vào trong nước và đem đi ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút và thu dịch lỏng phía trên. Tiếp tục kết tủa enzyme bằng cồn trong điều kiện lạnh và ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút và thu tủa. Tiếp tục hòa tan kết tủa vào dung dịch đệm và pha loãng sao cho OD đo được bằng phương pháp Anson cải tiến trong khoảng giữa của đường chuẩn. 3.4.5. Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cơ bản cho trùn quế 3.4.5.1. Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu  Nguyên tắc Thịt trùn quế sau khi xay và sấy ở 105oC thì toàn bộ lượng nước trong nguyên liệu bị bốc hơi. Từ đó ta xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu.  Tiến hành Sấy đĩa hoặc khay men ở 90oC – 100oC trong 30 phút, để nguội trong không khí và cân chính xác đến 0,01 g. Tùy thuộc vào lượng nước có mẫu mà lấy khoảng 100 – 500 g mẫu vào đĩa. Cho đĩa đựng mẫu vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 60 – 65oC trong 4 – 5 giờ. Sau khi sấy, lấy đĩa ra và để nguội trong không khí 3 – 4 giờ cho mẫu trở lại trạng thái khô tự nhiên trong không khí, đem cân. Tiếp theo cho đĩa mẫu vào tủ sấy và sấy cho đến lúc khối lượng giữa hai lần liên tiếp không chênh lệch nhau quá.  Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng nước ban đầu (X1 ) tính bằng phần trăm theo công thức: ( 1− 2) ∗ 100 X1 = Trong đó: G1: khối lượng đĩa hoặc khay có mẫu thử trước khi sấy, tính bằng g. G2: khối lượng đĩa hoặc khay có mẫu thử sau khi sấy, tính bằng g. G: khối lượng mẫu thử, tính bằng g. 38
50. Đồ án tốt nghiệp 3.4.5.2. Phương pháp định lượng khoáng tổng số bằng quang phổ kế  Nguyên tắc Tro thô là phần vật chất của mẫu còn lại sau khi nung (vô cơ hóa) ở nhiệt độ 550oC – 700oC trong 4 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm, sau đó cân tính sự chênh lệch trước và sau khi nung, xác định hàm lượng khoáng trong mẫu.  Dụng cụ và hóa chất Cân phân tích có độ chính xác 0,002 g. Chén nung bằng sứ chịu nhiệt có dung tích 30 – 35 ml. Chén nung đã được nung o ở nhiệt độ 500 – 550 C trong 1 giờ, để nguội trong bình hút ẩm, cân P0. Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (± 10oC). HNO3 đậm đặc. Kẹp sắt, bình hút ẩm, nước cất.  Tiến hành Mẫu trùn tươi, xử lý sơ bộ (cô cạn, sấy 150oC nghiền lấy mẫu trung bình) thời gian 12:00 – 12:30 giờ. Cân 1 ± 0,001 g vào chén nung đã biết P0 (trọng lượng bì). Đặt chén nung vào lò nung (t = 100oC) để mẫu cháy hết khói đen, đóng cử lò nung, điều chỉnh nhiệt độ 600oC và nung trong 4 giờ đến khi mẫu có màu trắng hay màu xám xanh là được. Nếu mẫu chưa cháy hết, tiếp tục nung thêm 1 giờ. Làm nguội tro (thấm ướt tro bằng o nước cất và thêm vào 10 – 15 giọt HNO3 đậm đặc). Nung chén mẫu ở nhiệt độ 600 C cho đến khi được tro hóa hoàn toàn. Hạ nhiệt độ khoảng 200oC, làm nguội trong bình hút ẩm (15 phút) và đem cân P2 lặp lại quá trình nung mẫu cho đến khi khối lượng không đổi.  Chỉ tiêu theo dõi Khối lượng mẫu trước và sau khi nung, khối lượng chén P0. % Chất mất khi nung = ( P1 – P2 ) x 100/ mg mẫu % Khoáng tổng số = ( P2 – P0) x 100/mg mẫu Trong đó: P0: khối lượng chén nung trước khi nung. 39
51. Đồ án tốt nghiệp P1: khối lượng mẫu và chén trước khi nung. P2: khối lượng mẫu và chén sau khi nung. 3.4.5.3. Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng Nitơ tổng số)  Nguyên tắc Dưới tác dụng của H2SO4 đặc và các chất xúc tác, tất cả các dạng đạm hữu cơ + + đều chuyển thành NH4 . Đẩy NH4 bằng dung dịch kiềm và hứng NH3 thoát ra bằng dung dịch acid.  Vật liệu thí nghiệm Mẫu được sấy khô. Hóa chất: H3BO4 4%, HCl 0,25 N, H2SO4 đậm đặc, NaOH 32%, methyl đỏ, bromocresol xanh lá, cồn 96o, nước cất. Dụng cụ: bộ phá mẫu Kjeldahl, bếp đun, cối chày sứ, bình định mức, bình tam giác, ống hút, máy cất đạm Parnas Wargner.  Tiến hành Xác định và phá mẫu (vô cơ hóa mẫu) Cân 0,1 g mẫu đã sấy khô, nghiền kĩ rồi cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1 g chất súc tác (selenium 60 g, K2SO4 865 g, CuSO4 75 g) và 5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, nối vào bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu bằng cách đun nhẹ cho hỗn hợp tan ra vào dung dịch bên trong. Khi thời gian phá mẫu kết thúc, để ống phá mẫu nguội (khoảng 5 phút), trộn đều, để nguội và tiến hành chưng cất mẫu. Chưng cất mẫu Lắp ống phá mẫu vào bộ chưng cất, bổ sung thêm 30 ml dung dịch NaOH 32%. Khởi động quy trình chưng cất, dịch chưng cất được thu từ bình thu có bổ sung trước 20 ml acid boric 4% và hỗn hợp chất chỉ thị. Ngừng cất khi thu được khoảng 125 – 150 ml dịch chưng cất. Chuẩn độ: bằng HCl 0,25 N. Dừng chuẩn độ khi xuất hiện mất màu xanh. 40
52. Đồ án tốt nghiệp  Chỉ tiêu theo dõi Dung dịch mất màu xanh Thông qua số HCl 0,25 N người ta biết được lượng acid boric kết hợp với NH3 và do vậy biết được số lượng NH3 giải phóng từ mẫu: trung bình cứ 1 ml HCl 0,25 N tương ứng với 0,0035 g nitơ hữu cơ. Kết quả tính toán thể hiện theo Nitơ hữu cơ hoặc Nitơ tổng số. 푙 0,25 ∗0,0035 %Nts = ∗ 100 Với m: trọng lượng mẫu. Phần trăm Nitơ tổng số (%): thông thường protein chứa khoảng 16% N. Khí NH3 nhận được khi chưng cất nhân với hệ số quy đổi là 100/16 gần = 6,25 sẽ cho biết giá trị protein tương đương (hay NH3 tổng). Protein Ʃ = 푙 0,25 ∗0,35 ∗ 6,25 Với m: trọng lượng mẫu. 3.4.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson cải tiến  Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzyme protease có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloacetic (TCA). Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosine để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo nên.  Hóa chất HCl 0,2 N. Đệm phosphate pH 7 (0,05M). Dung dịch casein 1%: hòa tan 1 g casein vào 90 ml dung dịch đệm phosphate 0,05 M. Đun tan casein, sau đó điều chỉnh pH bằng HCl 1 N hoặc NaOH 1 N tới pH = 7. Chuyển sang bình định mức 100ml và bổ sung dung dịch đệm phosphate tới vạch. Na2CO3 6%: hòa tan 6 g Na2CO3 trong nước cất và định mức tới 100 ml. Dung dịch (TCA) 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cất, sau đó chuyển sang bình định mức và định mức tới 100 ml, lắc đều. 41
53. Đồ án tốt nghiệp Dung dịch Tyrosine 1 mM (1 µmol/ml): cân 181,19 mg/ml tyrosine tinh khiết hòa tan trong dung dịch HCl 0,2 N và chuyển sang bình định mức 100 ml, định mức tới vạch ta được dung dịch gốc 10 mM. Khi sử dụng pha loãng dung dịch gốc 10 lần bằng HCl 0,2 N thu được dung dịch tyrosine 1 mM. Thuốc thử Folin-Ciocalteu (FC) (pha loãng 5 lần). Dung dịch enzyme chế phẩm thô.  Cách tiến hành Dựng đường chuẩn Tyrosine theo bảng Bảng 3.1. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin Ống nghiệm Dung dịch hóa chất ĐC 1 2 3 4 5 Dung dịch Tyrosine chuẩn (1 µmol/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dung dịch HCl 0,2 N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Dung dịch Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử FC (ml) 1 1 1 1 1 1 Nồng độ Tyrosine tương ứng (1 µmol/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Lắc đều, để yên ở 37oC/30 phút. Sau Đó đo độ hấp thu dung dịch ở bước sóng 750 nm, lấy mẫu đối chứng (ĐC) làm mẫu trắng. Vẽ đường chuẩn Tyrosine bằng phần mềm excel, xác định phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan R2. Bảng 3.2. Xác định hàm lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng Dung dịch enzyme (ml) 1 0 Ổn định nhiệt độ enzyme: 37oC/5 phút Casein 1% ở 37oC (ml) 2 2 Phản ứng enzyme: Ủ ở 37oC/20 phút TCA (ml) 2,5 2,5 Dung dịch enzyme (ml) 0 1 42
54. Đồ án tốt nghiệp Kết tủa cơ chất còn dư: Lắc đều, ủ ở 37oC/30 phút. Lọc lấy dịch loại bỏ kết tủa Dịch lọc (ml) 1 1 Na2CO3 (ml) 5 5 FC pha loãng (ml) 1 1 Phản ứng tạo phức với FC: Ủ ở 37oC/30 phút Đo độ hấp thu ở 750 nm ATN AĐC = 0  Cách tính Định nghĩa đơn vị Anson: Một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (37oC, pH 7,6 ) thủy phân Casein trong một phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 750 nm tương ứng với 1 µmol Tyrosine trong đường chuẩn. Hàm lượng Tyrosine được giả phóng do enzyme protease thủy phân được tính dựa vào đường chuẩn Tyrosine (từ (ATN-AĐC) suy ra X µmol/ml Tyrosine sinh ra). Hoạt tính dung dịch enzyme pha loãng: X ∗ 5,5 ∗ F HT (U⁄ml) = 1 푣 ∗ 20 Hoạt tính chế phẩm enzyme thô X∗5,5 ∗ F ∗ V HT0 (U/g) = v∗20∗m Trong đó: X: nồng độ tyrosine suy ra từ đường chuẩn (µmol/ml). 5,5: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng thủy phân (ml). V: thể tích dung dịch toàn bộ enzyme thu được từ chế phẩm (ml). 푣: thể tích dịch lọc đem phản ứng tạo màu (1ml). 20: thời gian thủy phân cơ chất (phút). m: khối lượng chế phẩm enzyme đem đi xác định hoạt tính (g). F: độ pha loãng mẫu enzyme. 43
55. Đồ án tốt nghiệp 3.4.5.5. Phương pháp Lowry xác định hàm lượng protein  Nguyên tắc Hầu hết các protein đều chứa tyrosin và tryptophan. Hàm lượng của các acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau. Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu. Cường độ màu của phức chất này tỷ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng là hàm lượng acid amin). Vì thế ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng acid amin.  Tiến hành thí nghiệm Hóa chất: Dung dịch mẫu protein có trong thịt trùn quế. Dung dịch thuốc thử Folin (pha loãng 2 lần) Dung dịch Albumin 0,1% Dung dịch A: cân 2 g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0,1 N thành 100 ml. Dung dịch B: cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch Citrat natri 1% tạo thành 100 ml. Dung dịch C: là hỗn hợp của 2 dung dịch A và B được pha theo tỷ lệ 49 : 1 (chỉ pha để dùng trong ngày). Dụng cụ, thiết bị: buret 25 ml, ống nghiệm, pipet, bình định mức, erlen, Bảng 3.3. Lập đường chuẩn Albumin Ống 1 2 3 4 5 ĐC Nồng độ protein µg/ml 50 100 150 200 250 0 Albumin 0,1% (ml) 0,5 1 1,5 2 2,5 0 H2O 9,5 9 8,5 8 7,5 10 Dung dịch C (49:1) (ml) 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Folin (9 ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Lắc đều và để yên một lúc sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 750 nm. Từ đó dựng đường chuẩn. Cách xác định hàm lượng protein trong dịch nghiên cứu ta tiến hành tương tự như phần xây dựng đồ thị chuẩn. 44
56. Đồ án tốt nghiệp  Chỉ tiêu theo dõi Trị số mật độ quang (OD) của những ống mẫu được đối chiếu với đường biểu diễn biến thiên để suy ra hàm lượng protein có trong dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml). Hàm lượng protein trong một g mẫu được tính theo công thức: a ∗ 10−3 ∗ n mg protein/g = m Trong đó: a*10-3 : nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (mg/ml). n: độ pha loãng mẫu. m: khối lượng mẫu sử dụng (g). 3.4.6. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease 3.4.6.1. Xác định nhiệt độ tối ưu Sau khi thu được dịch chiết enzyme protease, tiến hành thực hiện các thí nghiệm xác định hoạt tính protease của enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến. Hút 1 ml dung dịch enzyme mẫu, để ổn định ở các nhiệt độ trong 5 phút, sau đó hút 2 ml dung dịch casein (1%) giữ ở các mức nhiệt độ khác nhau trong 20 phút, sau đó hòa tan vào 2,5 ml dung dịch TCA 5% lắc đều và giữ ở các mức nhiệt độ khác nhau trong 30 phút. Sau đó lọc và hút 1 ml dịch lọc và thêm vào ống nghiệm 5 ml dung dịch Na2CO3, 1 ml thuốc thử FC rồi để yên 30 phút sau đó đo OD ở bước sóng 750 nm. Nhiệt độ phản 35 40 45 50 55 60 65 ứng (oC) Sau đó xác định được nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease dựa vào đồ thị chuẩn. 3.4.6.2. Xác định pH tối ưu Dựa vào mức nhiệt độ tối ưu để thực hiện thí nghiệm xác định hoạt tính protease với các giá trị pH khác nhau. Hút 1 ml dung dịch enzyme mẫu, để ổn định ở các nhiệt độ trong 5 phút, sau đó hút 2 ml dung dịch casein (1%) giữ ở các mức nhiệt độ khác nhau trong 20 phút, sau đó hòa tan vào 2,5 ml dung dịch TCA 5% lắc đều và giữ ở 45
57. Đồ án tốt nghiệp các mức nhiệt độ khác nhau trong 30 phút. Sau đó lọc và hút 1 ml dịch lọc và thêm vào ống nghiệm 5 ml dung dịch Na2CO3, 1 ml thuốc thử FC rồi để yên 30 phút sau đó đo OD ở bước sóng 750 nm. pH 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 Xác định được pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease thu được dựa vào đồ thị chuẩn. 3.4.7. Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein Trùn quế 3.4.7.1. Khảo sát nồng độ cơ chất Sau khi xác định được nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt tính của enzyme ở thí nghiệm 3.4.6.1 và 3.4.6.2, ta tiến hành thí nghiệm thủy phân với thời gian thủy phân là 4 giờ, thể tích dịch cơ chất là 30ml và nồng độ enzyme cho vào mẫu là 1%. Tiến hành thủy phân cơ chất với các nồng độ như sau: Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (% w/v) Nghiệm thức Nồng độ cơ chất (%) 1 5 2 10 3 15 4 20 5 25 6 30 Thể tích dùng cho quá trình khảo sát là 30 ml/erlen gồm cả cơ chất và enzyme, ở mỗi nồng độ gồm 1 erlen thử không và 3 erlen thử thật. Sau khi cho enzyme vào mỗi nồng độ cơ chất khác nhau, đối với erlen thử không thì sau 4 giờ mới bổ sung enzyme đã bất hoạt bằng cách đun sôi, rồi tiến hành pha loãng để đo hàm lượng acid amin. Đối với mẫu thử thật thì sau khi ủ 4 giờ trong bể ủ nhiệt ở 50oC ta tiến hành pha loãng 100 lần. Sau khi bất hoạt và pha loãng, tiến hành ly tâm ở 4000 vòng/15 phút để thu dịch nổi. Dịch thu được sau khi ly tâm, pha loãng 50 lần và cho vào các 46
58. Đồ án tốt nghiệp ống nghiệm tương ứng 1 ml (không cho vào ống thử không), thêm vào mỗi ống 2 ml dung dich C đã được pha và 0,2 ml thuốc thử Folin, sau đó thêm nước vào các ống nghiệm để được 5 ml. Các ống nghiệm được để yên trong vòng 10 phút rồi đem đo OD (750 nm) và dựa vào đồ thị chuẩn để xác định hàm lượng acid amin trong dịch thủy phân. Thực hiện đối với enzyme thương phẩm và enzyme chế phẩm (enzyme thu được từ chế phẩm lên men bán rắn vi khuẩn Bacillus sp.). 3.4.7.2. Khảo sát nồng độ enzyme Sau khi xác định được nồng độ cơ chất tối ưu cho từng enzyme. Nhiệt độ, thời gian thủy phân và thể tích dịch thủy phân tương tự như ở thí nghiệm 3.4.7.1 với nồng độ cơ chất tối ưu ta tiến hành thay đổi nồng độ enzyme với các các nồng độ khảo sát như sau: Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (%) Nghiệm thức Nồng độ enzyme(%) 1 0,5 2 1 3 1,5 4 2 5 2,5 6 3 Quá trình thủy phân và thu được dịch khảo sát được thực hiện như ở thí nghiệm 3.4.7.1, dịch li tâm được đo OD (750 nm). Sau đó dựa vào đồ thị chuẩn để chọn nồng độ enzyme tối ưu. 3.4.7.3. Khảo sát thời gian thủy phân Sau khi chọn được nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme tối ưu ta tiến hành khảo sát thời gian thủy phân để xác định độ bền nhiệt của enzyme ở các thời điểm khác nhau từ 0 giờ tới 20 giờ, mỗi thời điểm khảo sát cách nhau 2 giờ. Quá trình thực hiện và thu nhận dịch khảo sát tương tự như ở thí nghiệm trên. Sau đó cũng đem đi đo OD (750 nm) và dựa vào đồ thị chuẩn để chọn thời gian thủy phân tối ưu. 47
59. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Nghiệm thức Thời gian thủy phân (giờ) 1 0 2 2 3 4 4 6 5 8 6 10 7 12 8 14 9 16 10 18 11 20 3.4.8. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm. (Nguyễn Cảnh, 1993), (N.X. ÊGÔRÔV và Nguyễn Lân Dũng, 1976) Sau khi thực hiện các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân đến khả năng thủy phân của enzyme protease lên protein của Trùn quế, xác định được điều kiện tối ưu để tối ưu hóa quá trình thủy phân. Từ điều kiện cơ sở tiến hành tối ưu hóa các yếu tố trên. Qui hoạch thực nghiệm theo yếu tố 2n là việc thể hiện tất cả các tổ hợp có thể có giữa n các yếu tố nghiên cứu. Mỗi yếu tố đều được kiểm tra đồng thời và không phụ thuộc lẫn nhau ở hai mức độ là trên (+) và dưới (-). Trung tâm của thực nghiệm là điều kiện cơ sở đã xác định được. 48
60. Đồ án tốt nghiệp 3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu Các thí nghiệm trên đều được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả thí nghiệm được xử lý sai số, vẽ biểu đồ, đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 và xử lí trống kê bằng phần mềm stragraphic 7.0 để so sánh các nghiệm thức trong mỗi thí nghiệm. Sau khi thu nhận kết quả của phương pháp quy hoạch thực nghiệm, tiến hành thủy phân protein của Trùn quế trong điều kiện tối ưu nhất để phục vụ cho các ứng dụng trong chăn nuôi sau này. Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát từng thông số kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein. Qua kết quả từ các thí nghiệm, lấy kết quả trung bình để chọn ra thông số tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo và cũng chính là thông số tối ưu của quá trình nghiên cứu. 49
61. Đồ án tốt nghiệp Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp. 4.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm Probiotic Trong quá trình tiến hành nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus sp. từ nguồn chế phẩm sinh học dùng trong nuôi trồng thủy sản đang được lưu hành trên thị trường với mục đích chính làm tăng khả năng thu nhận được các chủng có đặc tính probiotic cao cũng như khả năng sinh enzyme protease, khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh, có khả năng chống chịu tốt với môi trường đã được các nhà sản xuất tuyển chọn trước đó. Quá trình phân lập được thực hiện trên môi trường MT1 (phụ lục 1), ủ ở 37oC, 24 giờ trong tủ ấm. Sau khi khuẩn lạc mọc, chọn các khuẩn lạc đặc trưng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo và cấy chuyền giữ giống dùng cho các thí nghiệm sau này. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.1 và hình 4.1. Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc phân lập từ các mẫu Kí hiệu: W ZYME (1), VIME BITECH (2), EPICIN PONDS (3), PROBIOTIC (4), BIO MORAR’S (5), BIO PRO (6) 50
62. Đồ án tốt nghiệp Bảng 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm STT TÊN CHẾ PHẨM Mật độ Mật độ trên nhãn (CFU/g) (CFU/g) 1 W – ZYME 4,3 x 105 9 x 108 2 VIME - BITECH 2,5 x 105 6 x 109 3 EPICIN – PONDS 7,6 x 105 5 x 109 4 PROBIOTIC 0 7 x 108 5 BIO – MORAR’S 7 x 105 7 x 108 6 BIO - PRO 9 x 105 8 x 108  Kết luận: Chế phẩm PROBIOTIC: Không phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus sp. như đã được công bố trên nhãn sản phẩm. Các mẫu chế phẩm còn lại: Phân lập được một chủng Bacillus sp. nhưng mật độ không đạt so với mật độ được công bố trên nhãn sản phẩm. Từ 6 chế phẩm trên, sau khi tiến hành phân lập theo phương pháp ở mục 3.4.2, ủ ở 37oC trong 48 giờ, kết quả cho thấy: Mẫu 1 (W-zyme), 5 (Bio – Morars) và 6 (Biopro) có khuẩn lạc màu trắng ngà, bề mặt khô hơi nhăn, mép rìa của khuẩn lạc hơi nhăn và bám chặt vào bề mặt môi trường thạch. Mẫu 2 (Vime – Bitech) và mẫu 3 (Epicin – ponds) có nhiều khuẩn lạc không đồng nhất, bề mặt ướt tạo nhớt. Tiếp theo tiến hành thu nhận các chủng thuần khiết bằng phương pháp cấy ria trên đĩa thạch môi trường MT1 (phụ lục 1), mật độ tế bào giảm dần theo vết cấy và các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, các khuẩn lạc mọc riêng rẽ được cấy và bảo quản trong ống thạch nghiêng để tiếp tục khảo sát các đặc tính sinh lý, sinh hóa đặc trưng của chủng vi khuẩn Bacillus sp. 51
63. Đồ án tốt nghiệp 4.1.2. Nhuộm Gram Vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn Gram dương nên trong bước tiến hành định danh chúng ta thực hiện nhuộm Gram đầu tiên. Tiến hành nhuộm Gram khi vi khuẩn còn non (trong 24 giờ nuôi cấy) vì khi già vi khuẩn có thể trở thành Gram âm. Sau khi làm tiêu bản nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào của 3 chủng dưới kính hiển vi quang học, kết quả được thể hiện ở hình 4.2. Hình 4.2. Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng 1, 5 và 6 Kết quả cho thấy vi khuẩn bắt màu tím của thuốc nhuộm (Gram dương), có dạng hình que ngắn, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi. 4.1.3. Kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa Tiến hành thí nghiệm khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus sp: Thử nghiệm khả năng di động, khả năng sinh catalase, khả năng sinh indol, thử nghiệm methyl red và khả năng lên men các loại đường. 4.1.3.1. Khả năng di động Các chủng được cấy thẳng vào môi trường thạch đứng chứa 0,5% agar, ủ ở 370C, sau 24 giờ quan sát vết cấy. Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc theo vết cấy. Kết quả được thể hiện trên hình 4.3. 52
64. Đồ án tốt nghiệp Hình 4.3. Kết quả thử khả năng di động của chủng 1, 5 và 6 Kết quả cho thấy trong 3 mẫu thử nghiệm, chủng vi khuẩn 5 và 6 m ọc dọc theo vết cấy và lan ra môi trường xung quanh, chủng 1 mọc dọc theo vết cấy từ đáy ống nghiệm lên đầu bề mặt thạch và không lan ra môi trường xung quanh.  Kết luận: Chủng 5 và 6 có khả năng di động và là vi khuẩn hiếu khí. 4.1.3.2. Khả năng sinh catalase Ở loài vi khuẩn có enzyme catalase thì vi khuẩn có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2, khi cho H2O2 lên sinh khối của vi khuẩn sẽ có hiện tượng sủi bọt khí do sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2. Thử trên đĩa petri: nhỏ trực tiếp H2O2 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt thạch, ghi nhận nếu có sự sủi bọt xung quanh sinh khối. Kết quả được thể hiện ở hình 4.4. Hình 4.4. Kết quả thử khả năng tạo catalase của 3 chủng 1, 5 và 6 Kết quả ở thí nghiệm trên cho thấy chủng số 1 không sủi bọt khí (catalase âm tính), hai chủng 5 và 6 đều sủi bọt khí (catalase dương tính). 53
65. Đồ án tốt nghiệp  Kết luận: hai chủng 5 và 6 đều có khả năng sinh enzyme catalase và là vi khuẩn hiếu khí. 4.1.3.3. Khả năng sinh indol Nuôi cấy 3 chủng trong môi trường canh Trypton. Sau 24 – 48 giờ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’. Kết quả thể hiện ở hình 4.5. Hình 4.5. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh Indol của 3 chủng 1, 5 và 6  Kết luận: Kết quả thí nghiệm trên cho thấy cả 3 chủng đều âm tính (không có khả năng sinh indol). 4.1.3.4. Thử nghiệm methyl red Cấy một ít sinh khối vào môi trường Clark – Clubs, ủ ở nhiệt độ thích hợp trong khoảng 2 – 5 ngày. Nhỏ lên môi trường 2 – 3 giọt thuốc thử methyl – red và đọc kết quả. Kết quả thể hiện ở hình 4.6. Hình 4.6. Kết quả thử nghiệm Methyl red của 3 chủng 1, 5 và 6 54
66. Đồ án tốt nghiệp  Kết luận: Kết quả cả 3 chủng đều dương tính với thuốc thử Methyl – red. 4.1.3.5. Khả năng lên men các loại đường Vi khuẩn Bacillus có khả năng lên men các loại đường thông thường là saccharose và glucose, làm giảm pH môi trường. Là một trong những phản ứng để đánh giá nhóm vi khuẩn Bacillus. Thí nghiệm được được thực hiện trên các loại đường sau: saccharose, maltose, mannitol, galactose, glucose, lactose, xylose, rhamnose, sorbitol, arabinose. Ủ ở 37oC trong vòng 24 – 48 giờ, quan sát khả làm đổi màu phenol red. Kết quả được thể hiện ở hình 4.7, 4.8, 4.9. Hình 4.7. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 1 55
67. Đồ án tốt nghiệp Hình 4.8. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 5 56
68. Đồ án tốt nghiệp Hình 4.9. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 6  Kết luận: Đối với đường glucose, maltose, xylose, rhamnose, arabinose, manitol: cả 3 chủng 1, 5 và 6 đều có khả năng lên men và đổi màu phenol red. Đối với đường saccharose, galactose, lactose: chỉ có chủng 5 và 6 có khả năng lên men và làm đổi màu phenol red. Đối với đường sorbitol: cả 3 chủng 1, 5 và 6 đều không có khả năng lên men và đổi màu phenol red. 57
69. Đồ án tốt nghiệp Từ các thí nghiệm khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa trên chúng tôi có bảng kết quả sau: Bảng 4.2. Kết quả thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng đã khảo sát Ký hiệu chủng Đặc điểm 1 5 6 Nhuộm Gram Gram + Gram + Gram + Khả năng di động - + + Catalase - + + Indol - - - Methyl red + + + Khả năng len men các loại đường Saccharose - + + Galactose - + + Glucose + + + Lactose - - + Maltose + + + Xylose + + + Rhamnose + + + Arabinose + + + Manitol + + + Sorbitol - - - (Chú thích: “+”: Dương tính; “ ”: Âm tính)  Kết luận: theo khóa phân loại Bergey qua các bước quan sát hình thái , thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hóa có thể kết luận 2 chủng vi khuẩn 5 và 6 được phân lập trên 2 mẫu chế phẩm Bio – Morars và Biopro là Bacillus sp. 4.2. Đánh giá các hoạt tính sinh học Tiếp tục thực hiện các thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn và khả năng sinh enzyme protease để tuyển chọn được chủng có hoạt tính sinh học cao sử dụng trong lên men trên môi trường bán rắn. 58
70. Đồ án tốt nghiệp 4.2.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn Dùng phương pháp đục lỗ thạch và đo vòng kháng khuẩn để xác định khả năng kháng khuẩn của 3 chủng 5 và 6 đối với các vi khuẩn kiểm định: Chủng E.coli, Salmonella sp, S. aureus. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả vòng tan xác định khả năng kháng khuẩn của 3 chủng Kí hiệu chủng Hoạt tính kháng khuẩn (D – d, mm) E. coli Salmonella S. aureus 1 10 5 2 5 16 8 5 6 20 10 12 Từ kết quả trên cho thấy cả 3 chủng đều có khả năng kháng khuẩn và mạnh nhất là chủng số 6 với các vi khuẩn kiểm định: E.coli, Salmonella, S. aureus lần lượt (D – d = 20, 10, 12), và thấp nhất ở chủng số 1 (D – d = 10, 5, 2). 4.2.2. Định tính khả năng sinh enzyme protease Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường có chứa 1% casein. Định tính khả năng sinh enzyme protease của 3 chủng Bacillus sp. bằng phương pháp đục lỗ thạch. Nhỏ dịch nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng đã được ly tâm ở 4000 vòng/ phút trong 15 phút để thu dịch chiết enzyme ngoại bào (loại bỏ cặn ở dưới) vào giếng, sau 48 giờ tiến hành thử thuốc thử và theo dõi sự xuất hiện của vòng phân giải xung quanh giếng và đo đường kính vòng phân giải của các enzyme quanh giếng. Kết quả đo được thể hiện ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả xác định vòng phân giải Casein của enzyme protease thu nhận từ 3 chủng sau 48 giờ STT Enzyme protease (D – d, mm) 1 22 5 24 6 27 59
71. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả trên cho thấy cả 3 mẫu vi khuẩn đã phân lập được đều có khả năng sinh enzyme protease, tốt nhất ở chủng số 6 (D – d = 27 mm) và thấp nhất ở chủng số 1 (D – d = 22 mm). Theo Brown (2005), vi khuẩn không thể thực hiện sự thực bào do thành tế bào cứng nên chúng bài tiết ra các enzyme ngoại bào đê thủy phân các đại phân tử lớn, như protease thủy phân protein, amylase thủy phân tinh bột thành các amino acid và monosaccharide sau đó vận chuyển vào tế bào cho quá trình trao đổi chất. (trích Lê Mỹ Phương, 2008). Sau các kết quả khảo sát, chủng số 6 có khả năng kháng khuẩn mạnh và khả năng sinh enzyme protease cao nên được chọn để tiếp tục tiến hành lên men bán rắn thu enzyme protease thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 4.3. Xác định thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế Dùng thịt trùn quế tươi để làm cơ chất cho các thí nghiệm khảo sát quá trình thủy phân. Tiến hành xác định những thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế dùng để thủy phân. Kết quả được trình bày trong bảng 4.5. Bảng 4.5. Thành phần sinh hóa trong thịt trùn quế dùng để thủy phân Chỉ tiêu phân tích Hàm lượng Nitrogen tổng số (g/100g NL) 10,99 Protein tổng (%) (Nts x 6,25) 68,54 Độ ẩm (%) 80,04 Khoáng tổng số (%) 23,77 Theo kết quả phân tích ở trên cho thấy trong thịt trùn có hàm lượng đạm tổng số và protein tổng số cao. Ứng dụng trùn quế vào thức ăn chăn nuôi làm tăng hàm lượng đạm hữu cơ và với hàm lượng protein thô cao, hàm lượng đạm của trùn tương đương với bột cá, làm thức ăn lý tưởng để nuôi thủy sản đang được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên protein có trong thịt trùn tươi thường khó tiêu hóa nên thủy phân bằng protease mang lại nhiều ưu điểm và hết sức cần thiết, vì trùn quế là nguồn cơ chất khá phong phú và phổ biến ở nước ta. 60
72. Đồ án tốt nghiệp 4.4. Kết quả xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme thu được từ chế phẩm. Sau khi lên men bán rắn để thu chế phẩm enzyme (CPE), chế phẩm được phơi khô bằng quạt gió rồi xay nhuyễn để vào túi kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng, dùng để xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho quá trình thủy phân protein trùn quế. 4.4.1. Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease Mỗi loại enzyme có một khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp và khi nhiệt độ tăng trong khoảng nhiệt độ tối thích thì tốc độ phản ứng thủy phân tăng, đến một ngưỡng nhất định hoạt động của enzyme sẽ giảm mạnh. Với từng enzyme, nhiệt độ thích hợp có thể thay đổi khi thay đổi pH, cơ chất, thời gian phản ứng, Kết quả thí nghiệm được ghi nhận ở đồ thị 4.1. Theo kết quả phân tích ANOVA và bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát cho thấy có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức khảo sát nhiệt độ (P value < 0,05). Trong đó, ở nhiệt độ 55oC cho hoạt tính enzyme cao nhất (phụ lục 3, 4, 5). Ảnh hưởng của nhiệt độ 250 200 150 100 50 Hoạt tính enzyme Protease (U/g) Proteasetính enzymeHoạt 0 30 40 50 60 70 Nhiệt độ (0C) Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính enzyme chế phẩm 61