Đồ án Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic

102 trang thiennha21 12/04/2022 4290

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_ung_dung_chitosan_san_xuat_tu_chitin_thu_hoi_bang_phuo.pdf

Nội dung text: Đồ án Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN/ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG CHITOSAN SẢN XUẤT TỪ CHITIN THU HỒI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN LACTIC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Nhật MSSV: 1151110236 Lớp: 11DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2015
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung bài đồ án tốt nghiệp là do tự bản thân thực hiện. Các thông tin thứ cấp sử dụng trong luận án là có nguồn gốc và trích dẫn rõ ràng, không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, các số liệu trích dẫn trong bài là trung thực. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Nhật
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp được hoàn thành tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. Để hoàn thành bài đồ án tốt nghiệp này, trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn đến Quý Thầy Cô giảng dạy tại khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường – Thực Phẩm đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Đặc biệt, tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới Cô Nguyễn Hoài Hương, người đã tận tình hướng dẫn, động viên và truyền đạt cho tôi những kiến thức chuyên nghành trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Tuyến công tác tại Viện Sinh học Nhiệt Đới, và Cô Ngọc Yên trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã cung cấp cho tôi mẫu chitosan thương mại, bạn Vân Hương, Tuyết Mai lớp 11DSH05 đã cung cấp chủng nấm Aspergillus flavus CĐP1 để tôi có thể thực hiện đồ án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy Thành, thầy Dũng đã hỗ trợ về thiết bị hóa chất, vật tư giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này. Xin cảm ơn sự giúp đỡ rất nhiệt tình của các cộng sự, cảm ơn đến những người bạn đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đồ án này. Sau cùng, tôi xin kính chúc quý Thầy Cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường – Thực Phẩm thật nhiều sức khỏe, niềm tin để tiếp tục sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. Chúc các bạn dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp tương lai. Mặc dù đã cố gắng hết sức để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất. Song bài đồ án vẫn còn nhiều thiếu sót do còn hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm. Vì vậy tôi mong nhận được sự đóng góp, phê bình của Quý Thầy, Cô giáo. Tôi xin chân thành cảm ơn!
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 6 1.1. Tổng quan về tôm sú 6 1.1.1. Cấu tạo của vỏ tôm 6 1.2. Tổng quan về chitin – chitosan 7 1.2.1. Lịch sử phát hiện chitin – chitosan 7 1.2.2. Cấu trúc của chitin – chitosan 9 1.2.3. Tính chất của chittin – chitosan 10 1.2.4. Ứng dụng của chitosan 15 1.2.5. Ứng dụng chitosan kích thích nảy mầm hạt giống 18 1.2.6. Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay 19 1.3. Tổng quan về vi khuẩn lactic 23 1.3.1. Khái niệm 23 1.3.2. Đặc tính chung 24 1.3.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 25 1.3.4. Giới thiệu các nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic vào lên men thu hồi chitin 29 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.1. Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 31 2.1.2. Thời gian thực hiện 31 2.1.3. Vật liệu 31 2.2. Phương pháp luận 32 2.3. Phương pháp thí nghiệm 33 2.3.1. Thu thập mẫu và nguyên liệu 33 i
Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Xác định thông số về thành phần hóa học của nguyên liệu đầu vỏ tôm 34 2.3.3. Quy trình lên men kéo dài 35 2.3.4. Phương pháp tiến hành 37 2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1 trên môi trường nuôi cấy PDA 45 2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt sự ra rễ hạt đậu nành, hạt đậu phộng ở các nồng độ tương ứng. 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1. Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ tôm 48 3.2. Thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi chitin với tỉ lệ rỉ đường 20% 49 3.3. Hiệu quả khử khoáng và khử protein của quá trình lên men lactic với tỉ lệ rỉ đường 20 %, mật độ giống 3,16 x 106 cfu/ ml, 10 ngày. 50 3.4. So sánh một số đặc tính, tính chất vật lý chitosan từ chitin theo phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm 51 3.5. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm Aspergillus flavus CĐP1 53 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu tương 58 Kết luận 69 Kiến nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 ii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ATP: Adenosine triphosphate Ctv : cộng tác viên LAB : Lactic Acid Bacteria NSC : ngày sau cấy PDA : Potato dextrose agar UV: Ultraviolet DD: dung dịch iii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Stt Bảng Nội dung Trang 1 2.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn 42 2 3.1 Thành phần hóa học nguyên liệu vỏ tôm 48 Các thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi 3 3.2 49 chitin của chủng L5 vởi tỉ lệ rỉ đường 20% Hiệu quả khử khoáng của quá trình lên men lactic chủng 4 3.3 L5, tỉ lệ rỉ đường 20%, mật độ giống 3,16x 106 cfu/ml, 10 50 ngày Hiệu quả khử protein (%) của quá trình lên men lactic 5 3.4 chủng L5, tỉ lệ rỉ đường 20%, mật độ giống 3,16 x 106 50 cfu/ml, 10 ngày So sánh chitosan điều chế từ phương pháp lên men lactic và 6 3.5 51 chitosan thương phẩm 7 3.6 Ảnh hưởng nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm (%) 53 Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, 8 3.7 khối lượng hạt của hạt giống đậu tương đối với mẫu 58 chitosan lên men lactic Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, 9 3.8 khối lượng hạt của hạt giống đối với mẫu chitosan thương 61 phẩm 1 Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, 10 3.9 khối lượng hạt của hạt giống đối với mẫu chitosan thương 63 phẩm 2 11 3.10 So sánh nồng độ chitosan 2,0g/l giữa mẫu chitosan lên men 65 iv
Đồ án tốt nghiệp và mẫu chitosan thương phẩm lên tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt đậu tương. v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Stt Hình Nội dung Trang 1 1.1 Công thức cấu tạo của chitin 9 2 1.2 Công thức cấu tạo của chitosan 10 Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ 3 1.3 20 vỏ đầu tôm Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu 4 1.4 tôm bằng phương pháp thuần túy hóa học của Robert, đại 21 học Nottingham Trent ( 1998). Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện 5 1.5 22 nghiên cứu công nghệ thực phẩm Ấn Độ, 2010 6 1.6 Con đường lên men glucose 27 7 2.1 Sơ đồ xử lý vỏ tôm trước khi thí nghiệm 33 Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm xác định thành phần trong nguyên 8 2.2 34 liệu Quy trình lên men bằng phương pháp lên men lactic sử 9 2.3 36 dụng rỉ đường Sơ đồ thí nghiệm kích hoạt nảy mầm của hạt đậu nành, hạt 10 2.4 47 đậu phộng của dung dịch chitosan ở các nồng độ. Kết quả thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng phương 11 3.1 52 pháp lên men lactic sử dụng rỉ đường Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA 12 3.2 có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 54 của mẫu chitosan lên men lactic. vi
Đồ án tốt nghiệp Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA 13 3.3 có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 55 của mẫu chitosan thương phẩm 1. Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA 14 3.4 có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 56 của mẫu chitosan thương phẩm 2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy 15 3.5 mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương 59 đối với mẫu chitosan lên men lactic. Ảnh hưởng của chitosan đến kích thích nảy mầm của hạt 16 3.6 59 giống đậu tương đối với mẫu chitosan lên men lactic Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy 17 3.7 mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương 61 đối với mẫu chitosan thương phẩm 1 Ảnh hưởng của chitosan đến chiều dài rễcủa hạt giống đậu 18 3.8 62 tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy 19 3.9 mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương 63 đối với mẫu chitosan thương phẩm 2 Ảnh hưởng của chitosan đến chiều dài rễ của hạt giống đậu 20 3.10 64 tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 2 Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng của mẫu chitosan lên 67 21 3.11 men lactic Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng 22 3.12 68 kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng của mẫu chitosan thương vii
Đồ án tốt nghiệp phẩm 1 Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng 23 3.13 kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng của mẫu chitosan thương 69 phẩm 2 viii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nước ta có nguồn thủy sản dồi dào, lượng vỏ giáp xác phế liệu hàng năm rất lớn (năm 2005 là 70.000 tấn) trong đó có vỏ tôm. Tôm là mặt hàng chủ lực của thủy sản Việt Nam, chủ yếu là tôm đông lạnh. Theo báo cáo của bộ thủy sản, sản lượng tôm năm 2012 cả nước có 1,529 cơ sở sản xuất tôm sú giống, sản xuất được hơn 37 tỷ con giống và có 185 cơ sở sản xuất tôm chân trắng giống, sản xuất được gần 30 tỷ giống. Hiện nay có 30 tỉnh/thành nuôi tôm nước lợ, đã thả nuôi 657,523 ha; đạt sản lượng 476,424 tấn. Trong đó diện tích nuôi tôm sú chiếm 94,1% và 67,2% sản lượng. Tương ứng với sản lượng tôm hằng năm sẽ có khối lượng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm thải ra môi trường. Hiện nay ở nước ta nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm chưa được tận dụng trên quy mô lớn, chủ yếu là làm thức ăn gia súc hay thải ra môi trường gây ô nhiễm tình trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách là nghiên cứu sử dụng hợp lý và hiệu quả lượng phế liệu để sản xuất ra sản phẩm có giá trị cao. Trên thế giới có nhiều nghiên cứu tái sử dụng vỏ tôm như làm thức ăn gia súc, gia cầm và đặc biệt là thu nhận các hợp chất quý trong vỏ tôm như chitin carotenoid. Hiện nay chitin - chitosan và các sản phẩm nhận được từ chitin – chitosan được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực của đời sống như y học, nông nghiệp, bảo vệ môi trường đặc biệt là trong y học chitin - chitosan được coi là polymer dược phẩm. Chitosan có nhiều ứng dụng trong các nghành công, nông nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường. Trong y dược, từ chitosan vỏ tôm cua có thể sản xuất glucosamine, một dược chất quý đang phải nhập khẩu ở nước ta. Ngoài ra còn sản xuất các loại dược liệu khác như: da nhân tạo, chỉ phẫu thuật tự hoại cũng được nghiên cứu sản xuất từ chitin – chitosan. Chitosan còn được dùng sản xuất kem chống khô da, kem dưỡng da ngăn chặn tia cực tím phá hoại da. Trong công 1
Đồ án tốt nghiệp nghiệp, từ chitosan có thể chế tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị công nghiệp như: vải col dùng cho may mặc, vải chịu nhiệt, chống thấm . Chitosan làm tăng độ bền của giấy, tăng cường độ bám dính của mực in. Chitosan được sử dụng trong sản xuất sơn chống mốc và chống thấm. Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo quản quả, hạt mang lại hiệu quả cao. Trong công nghệ môi trường hiện nay chitosan được sử dụng để xử lý nước thải công nghiệp rất hiệu quả như xử lý nước thải trong công nghiệp nhuộm vải, xử lý nước trong công nghiệp nuôi tôm, cá. Đặc biệt từ chitosan có thể sản xuất ra màng mỏng để bao gói thực phẩm, màng này có thể thay cho PE, màng chitosan có thể tự phân hủy trong môi trường tự nhiên nên vấn đề này rất có ý nghĩa quan trọng trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường. Trong công nghệ sinh học, chitosan dùng làm chất mang cố định enzyme và cố định tế bào Từ khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin - chitosan như đã nói trên mà nhiều nước nghiên cứu sản xuất ra sản phẩm này, trong khi đó sản phẩm này đang phải nhập khẩu ở nước ta. Các quy trình sản xuất chitin – chitosan trước đây là quy trình xử lý vỏ tôm bằng phương pháp hóa học dùng nhiều hóa chất gây ô nhiễm môi trường. Nhưng hiện nay bên cạnh quy trình hóa học xuất hiện quy trình sản xuất chitin – chitosan bằng sinh học dựa trên vi khuẩn lactic, cho hiệu quả cao, thân thiện với môi trường. Quy trình ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất chitin – chitosan đã được bắt đầu chú ý ở Việt Nam. Năm 2008 – 2014 đề tài nghiên cứu “ Hoàn thiện quy trình thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng lên men lactic” đã được nghiên cứu và hoàn thành tại Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM. Căn cứ vào kết quả đạt được của đề tài và nhu cầu thực tiễn về khả năng ứng dụng và những hiệu quả khác mang lại của chitosan, người thực hiện đề tài quyết định thực hiện đề tài “Ứng dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic” trong khóa luận tốt nghiệp này. 2
Đồ án tốt nghiệp 2. Tình hình nghiên cứu Có rất nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này trên thế giới, đặc biệt là ở Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp đều tìm được điểm chung là phương pháp lên men lactic vỏ tôm sẽ thu được nguồn chitin dễ dàng tinh sạch và hiệu suất cao hơn so với phương pháp xử lý hóa học (Rao và Stevens2005; Prameela và cộng sự 2010) Tại Trường Đại học Công Nghệ tp.HCM đã có các nghiên cứu về lên men lactic vỏ tôm từ năm 2012 Nguyễn Thị Ngọc Thu 08DSH: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus xác định tỉ lệ nước là 2,5:1 với vỏ tôm nguyên liệu và thời gian lên men 96 giờ Lê Thị Hồng Thủy 09 DSH: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua cho quá trình lên lactic thu hồi chitin từ vỏ đầu tôm” cho thấy vi khuẩn LAB phân lập được mang kí hiệu L5 cho kết quả lên men vỏ đầu tôm tốt nhất; khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường lên quá trình lên men lactic kết quả cho thấy lượng đường cho kết quả tốt nhất là 20% và không thể giảm hơn nữa; ảnh hưởng của mật độ giống lên quá trình lên men lactic cho thấy mật độ giống cho kết quả lên men tốt nhất là 3,16x106 cfu/g. Dương Quốc Xuân 10DSH: “ Hoàn thiện quy trình thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng lên men lactic đạt hiệu quả cao”. Đề tài đã xác định được thời gian lên men lactic vỏ đầu tôm thu hồi chitin – chitosan cho kết quả tốt nhất là 7- 10 ngày, có thể thay thế nguồn đường glucose bằng rỉ đường sau xử lý cho hiệu quả khử khoáng và hiệu quả khử protein là triệt để. 3. Mục đích nghiên cứu Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi chitin – chitosan bằng phương pháp lên men lactic với nguồn đường rỉ đường. 3
Đồ án tốt nghiệp 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Thực hiện quy trình thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic với nguồn đường rỉ đường. Ứng dụng của chitosan : khảo sát ảnh hưởng của chitosan đến khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1, khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của chitosan lên hạt giống đậu tương và hạt giống đậu phộng. 5. Phương pháp nghiên cứu a. Phương pháp luận Để đạt được mục đích về tính ứng dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic, khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1, sau đó khảo sát ảnh hưởng của chitosan đến khả năng kích thích nảy mầm hạt giống. b. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị Sử dụng phần mềm Statghraphics để xử lý số liệu. 6. Các kết quả đạt được của đề tài So sánh một số đặc tính tính chất vật lý giữa chitosan lên men lactic và chitosan thương phẩm Khảo sát ảnh hưởng chitosan đến khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1. So sánh hiệu quả kháng nấm của 2 nguồn chitosan: lên men lactic và thương phẩm Khảo sát nồng độ chitosan thích hợp để kích thích nảy mầm hạt giống đậu tương và đậu phộng một cách tốt nhất. So sánh hiệu quả của 2 nguồn chitosan kích thích nảy mầm hạt giống: từ lên men lactic và thương phẩm. 4
Đồ án tốt nghiệp 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Ngoài phần mở đầu, kết luận và kiến nghị , nội dung đồ án tốt nghiệp gồm 3 chương như sau : Chương 1: Tổng quan Chương 2 : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận 5
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về tôm sú 1.1.1. Cấu tạo của vỏ tôm Vỏ tôm chia làm 4 lớp chính: - Lớp biểu bì ( epicucle) - Lớp màu - Lớp canxi hóa - Lớp không bị canxi hóa Lớp màu : tính chất của lớp này do sự có mặt của những thể hình hạt của vật chất mang màu giống dạng melanin. Chúng gồm những túi khứ hoặc những không bào. Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh, là con đường cho canxi thẩm thấu vào. Lớp biểu bì (epcuticle): những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đổi bởi fucxxin, có điểm pH = 5,1 không chứa chitin. Nó khác với các vỏ còn lại, bắt màu với anilin xanh. Lớp epicuticle có lipit vì thế nó cản trở tác động của acid hơn là các lớp bên trong. Màu của lớp này thường vàng rất nhạt có chứa polyphenoloxidase và bị hóa cứng bởi puinone – tannin. Lớp epicuticle liên kết với một số màng mỏng bên ngoài cản trở hòa tan ngay cả trong môi trường acid đậm đặc do nó có chứa các mắt xích paratin mạch thẳng. Lớp canxi hóa: lớp này chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp, chitin ở trạng thái tạo phức với canxi. Lớp không bị canxi hóa: trong cùng của lớp vỏ được tạo thành bởi một phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền vững không có canxi và quinine. 6
Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Thành phần hóa học của vỏ tôm Protein : thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở 2 dạng : dạng tự do và dạng liên kết. Dạng tự do : dạng này là tồn tại ở phần thịt từ một số tôm bị biến đổi và vứt đi lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của tôm. Nếu công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu này khó xử lý hơn. Dạng phức tạp : ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chittin, canxicacbonat, với lipid tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit, như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm. • Chitin : tồn tại dưới dạng liên kết bởi những những liên kết đồng hóa trị với các prrotein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng. • Canxi : trong vỏ, đầu tôm, có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3( PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó khăn cho quá trình khử khoáng. Sắc tố trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là astaxanthin. • Enzyme : Hoạt độ enzyme protesae của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/ gam tươi. Các enzyme chủ yếu là enzyme của nội tạng trong đầu tôm và của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu. Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần khác như : nước, lipid, photpho. 1.2. Tổng quan về chitin – chitosan 1.2.1. Lịch sử phát hiện chitin – chitosan Chitin đã được phát hiện bởi Heri braconnot vào năm 1881. Lần đầu tiên ông phân lập được chitin như một hợp chất không tan trong kiềm của một số loại 7
Đồ án tốt nghiệp nấm. Hợp chất do Braconnot phân lập được còn rất nhiều tạp chất nhưng không khẳng định đây không phải là gỗ. Đến năm 1823, Odier đã cô lập được chitin từ cánh cứng của con bọ cánh cứng và cũng phân lập được chitin khi loại khoáng vỏ cua. Từ đó, Odier cho rằng đây là hợp chất cơ bản trong vỏ giáp xác côn trùng. Vào năm 1843 sự tồn tại của nitơ trong phân tử chitin đã được Lassaigne chứng minh. Năm1876, Ledderhose thủy phân vỏ tôm hùm bằng dung dịch HCl và nhận được một muối Clorua của amin 6C. Ông đề nghị cấu trúc CHO.(CHOH)4.CH2NH2.HCl. Năm 1894, Winterstein phát hiện ra khi xử lý nấm với H2SO4 hay NaOH rồi thủy phân trong HCl thì đều thu được cùng loại monosaccharide và acid acetic. Tuy nhiên, ông ta vẫn gọi hợp chất này là “ cellulose”. Cũng trong năm này, khi đun chitin trong dung dịch KOH ở 1080C, Hope – Seyler thu được một hợp chất mới có số nguyên tử giống như trong chitin và gọi nó là chitosan. Năm 1912, Brach và Furth nhận thấy tỉ lệ acid acetic và glucosamine là 1:1, ông gọi nó là “ polymer mono acetyl glucosamine”. Năm 1928, Meyer và Mark dựa trên phổ nhiễu xạ tia X kết luận rằng chitin và chitosan nằm ở dạng liên kết 훽 ( 1 → 4) giữa các mắt xích pyranoz. Vào năm 1948, Matsusshima cũng đã có một phát minh sản xuất glucosamine từ vỏ cua. Năm 1950, người ta đã sử dụng tia X để phân tích nhằm nghiên cứu sâu hơn sự hiện diện của chitin trong nấm và trong thành tế bào. Và đến năm 1951, quyển sách đầu tiên viết về chitin được xuất bản. Bấy giờ, người ta đã phát hiện tiềm năng của các polymer thiên nhiên này. 8
Đồ án tốt nghiệp Vào năm 1978, một hội nghị đầu tiên nói về chitin và chitosan diễn ra tại Mỹ và thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là : Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp. Nhật Bản là nước đầu tiên trên thế giới năm 1973 sản xuất 20 tấn/năm, và đến nay đã lên tới 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300 tấn/năm. Theo Know ( năm 1991) thì thị trường có nhiều triển vọng của chitin, chitosan là Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức. Nhật được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản xuất và buôn bán chitin, chitosan. 1.2.2. Cấu trúc của chitin – chitosan Chitin là sự kết hợp giữa liên kết 훽 (1 → 4) với 2 – acetamido – 2 – deoxy - 훽 − – glucose ( N- acetylglucosamine ) Chitin thường được coi là dẫn xuất cellulose và có chứa 6,9% là N (Black và Schwartz, 1950). Nó có cấu trúc giống cellulose vì có gốc acetamide ( -NH-CO- CH3) ở vị trí C2. Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, sự khác biệt duy nhất giữa chitosan và chitin là ở vị trí C2, ở đó nhóm ( -NH2) thay thế nhóm ( -COCH3) Chitosan là một polymer tuyến tính 훼 ( 1 → 4) − 2 − 푖푛표 − 2 − 푒표 − 훽 − − 푙 표 푛표푠푒. Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin. 9
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Công thức cấu tạo của chitosan 1.2.3. Tính chất của chittin – chitosan 1.2.3.1. Đặc điểm và tính chất hóa lý của chitin Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên và đứng hàng thứ hai chỉ sau cellulose. Chitin tham gia vào thành phần cấu tạo và vách tế bào nấm, cấu tạo nên bộ khung xương của tôm, cua, côn trùng, các động vật giáp xác Trong các nguyên liệu này, chitin liên kết chặt chẽ với protein, lipid và các muối vô cơ ( CaCO3 ) và các sắc tố màu ( astarene, astaxanthin, canthaxanthin, lutin ) Chitin là 1 polysaccharide chứa nito, trắng, cứng, không đàn hồi, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu . Chitin hòa tan được trong dung dịch đậm đặc, nóng của muối thyoxyanat liti ( LiSCN) và muối thyoxyanat canxi ( Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo. Chitin ở thể rắn có độ kết tinh cao do gốc – NHCOCH3 ở vị trí cacbon thứ hai, làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch với nhau. Chitin ổn định với các chất oxy hóa khử như KMnO4, H2O2, NaClO hay Ca(ClO)2 có thể lợi dụng tính chất này để khử màu chitin. Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc chitin bị khử gốc acetyl tạo thành chitosan. Chitin không hòa tan trong hầu hết các dung môi thông thường nên khả năng ứng dụng bị hạn chế. Do đó người ta thực hiện quá trình deacetyl hóa chitosan để tạo ra sản phẩm chitosan nhằm cải thiện độ hòa tan, tăng khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. 10
Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.2. Đặc điểm và tính chất hóa lý của chitosan a. Tính chất vật lý của chitosan Chitosan là dẫn xuất của chitin, nó được tạo thành bởi phản ứng deacetyl chitin. Khi chitin được xử lý với các chất kiềm đặc ở nhiệt độ cao 1200C trong dung dịch, nó sẽ bị loại nhóm acetyl và bị phân hủy khác nhau để cho ra sản phẩm là chitosan. Vậy chitosan không phải là một chất đơn thuần mà nó là một nhóm sản phẩm của chitin bị loại nhóm acetyl từng phần ( Attila E, Pavlath và Dominic W.S.Wong, 1996) Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một chất rắn xốp, nhẹ, hình vảy, màu trắng ngà, không mùi, không vị hay được dùng nhiều nhất trong y tế và trong thực phẩm. Chitosan được khám phá bởi Roughet vào năm 1859, và nó được đặt tên là chitosan bởi nhà khoa học người đức Hoppe Seyler vào năm 1894. Chitosan là polymer hữu cơ tự nhiên duy nhất mang điện tích dương, điều này tạo cho chitosan những thuộc tính đặc biệt nhất. Chitosan là polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và có tính tương thích về mặt sinh học. Trong nhiều năm qua, các polymer có nguồn gốc từ chitin, đặc biệt là chitosan đã được chú ý như một loại vật liệu mới có tính ứng dụng trong các ngành công nghiệp như dược, y học, thực phẩm, xử lý nước thải. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm, hoặc các dung môi hữu cơ khác nhưng hòa tan được trong dung dịch acid loãng như: acid acetic, acid formic, acid lactic, HCl, HI, HNO3 tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hòa tan trong dung dịch acid acetic 1 - 1,5%. Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme. Chitosan hình thành muối tan được trong nước với một nhóm acid hữu cơ. Những nghiên cứu về muối của chitosan và các acid aromatic carboxylic cũng cho thấy khả năng tan được trong nước như chitosan benzoate, chitosan o-amino benzoate và cũng có một số muối không tan hoặc ít tan trong nước như chitosan 11
Đồ án tốt nghiệp phenylacetate Còn muối của chitosan và acid formic, acid acetic tan rất tốt trong nước. Bản chất điện ly cao phân tử của chitosan trong dung dịch acid : Trong dung dịch acid, những nhóm amin của chitosan bị proton hóa và thể hiện bản chất của chất điện ly cao phân tử. Trong dung dịch loãng không có mặt chất điện ly, chỉ số độ nhớt tăng theo sự tăng nồng độ dung dịch chitosan. Đây là đặc trưng của những dung dịch chất điện ly cao phân tử và là kết quả của sự tăng kích thước sợi khi pha loãng dung dịch do lực đẩy tĩnh điện giữa các đoạn mạch. Lực đẩy này có thể bị khử mất nằng cách thêm một chất điện ly trọng lượng phân tử thấp có tác dụng che những phần mang điện trên mặt polymer. Và đồng thời, chỉ số độ nhớt cũng giảm theo nồng độ chitosan cho trước. Chitosan có khả năng tích điện dương do đó nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và acid mật. Chitosan là chất có độ nhớt cao. Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào nhiều yếu tố như mức độ deacetyl hóa, khối lượng nguyên tử, nồng độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ Mức độ deacetylation ( DDA): là độ chuyển hóa chitin thành chitosan. Quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao. Mức độ deacetylation là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi vì nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của chitosan sau này. Thông thường mức độ deacetylation chitosan đạt khoảng 85 – 95 %. Chitosan có mức độ deacetylation khoảng 75 % trở lên thường được gọi là chitosan. Chitosan thương mại ít nhất phải có mức DDA ( degree of deacetylation ) hơn 70 %. Có rất nhiều phương pháp để xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan bao gồm : thử ninhydrrin, chuẩn độ điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ bằng HI Khối lượng phân tử trung bình ( MW) : được xác định qua độ nhớt của dung dịch chitosan và có giá trị biến đổi từ 100000 – 500000 g/mol ( Li, 1997; 12
Đồ án tốt nghiệp Onsoyen và Skaugrud, 1990) tùy theo từng loại chitosan. Thông thường, nhiệt độ cao sự có mặt của oxy và sức kéo có thể dẫn đến phân hủy chitosan. Giới hạn nhiệt độ là 2800C, sự phân hủy do nhiệt độ có thể xảy ra và mạch polymer nhanh chóng bị phá vỡ, do đó khối lượng phân tử giảm. Nguyên nhân quá trình depolymer là sử dụng nhiệt độ cao và acid như HCl, H2SO4 dẫn đến thay đổi khối lượng phân tử. Độ nhớt là nhân tố quan trọng để xác định khối lượng phân tử của chitosan. Chitosan phân tử lượng cao thường làm cho dung dịch có độ nhớt cao. Một số nhân tố trong quá trình sản xuất như mức độ deacetyl hóa, khối lượng nguyên tử, nồng độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sản xuất chitosan và tính chất của nó. Ví dụ, độ nhớt của chitosan tăng khi thời gian khử khoáng tăng. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch acid acetic tăng khi pH của dung dịch này giảm, tuy nhiên nó lại giảm khi pH của dung dịch HCl giảm, việc tăng này đưa đến định nghĩa về độ nhớt bên trong của chitosan, đây là một hàm phụ thuộc của mức độ ion hóa của lực ion. b. Tính chất hóa học của chitosan: Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức –OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-acetyl- D-glucosamine và nhóm-OH, nhóm – NH2 trong các mắt xích D-glucosamine có nghĩa là chúng vừa là ancol vừa là amin. Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế -N, hoặc các dẫn xuất thế O-, N-. Mặt khác chitosan là những polyme mà các monome được nối với nhau bởi các liên kết 훽 − 1 − 4 − 푙 표푠푖 푒, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học như acid, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân. Phản ứng thủy phân trong môi trường acid: - Trong môi trường acid chitosan bị thủy phân nhưng mức độ thủy phân phụ thuộc vào loại acid, nồng độ acid và một số các yếu tố khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng. Những kết quả cho thấy: 13
Đồ án tốt nghiệp - Trong môi trường H2SO4 sự thủy phân chitosan kèm theo quá trình N- Sulphate hóa, cho sự phân hóa ngẫu nhiên các mạch phân tử. - Trong môi trường HF, chitosan cũng bị thủy phân nhưng kém hơn chitin, tạo thành hỗn hợp các oligome sau 19h ở 200 C. - Trong môi trường acid khác như HCl, H3PO4 sự thủy phân cũng xảy ra ở những mức khác nhau. Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên xem làmột polycationic (pH<5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (NH2) ( Knorr, 1984; Muzzanelli, 1996). ➢Các phản ứng của nhóm –OH - Dẫn xuất sunfat - Dẫn xuất O - axyl của chitin/chitosan - Dẫn xuất O - tosyl hóa chitin/chitosan ➢Phản ứng ở vị trí N - Phản ứng N - acetyl hóa chitosan - Dẫn xuất N - sunfat chitosan - Dẫn xuất N - glycochitosan - Dẫn xuất acroleylen chitosan - Dẫn xuất aroleylchitosan ➢Phản ứng xảy ra tại vị trí O, N - Dẫn xuất O, N - cacboxymetyl chitosan - Dẫn xuất N,O-caboxychitosan - Phản ứng cắt đứt liên kết 훽 − (1 − 4) − 푙 표푠푖 푒 - Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo muối khó tan Chitosan phản ứng với iot trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan 14
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4. Ứng dụng của chitosan 1.2.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp Do có tính chất vật lý và hóa học ưu việt, chitosan đang được sử dụng trong một mảng lớn các sản phẩm và ứng dụng khác nhau, từ dược phẩm, mỹ phẩm và bảo vệ thực vật. ➢ Mỹ phẩm: Thông thường, các acid hữu cơ được sử dụng làm dung môi cho các ứng dụng mỹ phẩm như aminopolysaccharide, chitosan được bao phủ trong lớp keo hydrocolloid, tuy nhiên không giống các loại keo hydrocolloid khác, chitosan tạo nhớt khi được trung hòa acid. Chúng tạo điều kiện tương tác với da và tóc tốt hơn. Ngoài ra chitin và chitosan diệt và kháng nấm tốt. Chitosan cũng có thể hấp thụ các chất độc hại như tia UV hoặc các loại thuốc nhuộm khác do có thể dễ dàng liên kết chung với gốc amino của chitosan. Chitin và chitosan và các dẫn xuất của chúng được sử dụng trong ba lĩnh vực mỹ phẩm bao gồm: - Tóc : dầu gội, dầu xả, thuốc nhuộm tóc, kem tạo kiểu tóc, - Da: kem dưỡng da, sữa tắm, son môi, phấn nền, phấn mắt, mascara - Chăm sóc răng : kem đánh răng, nước súc miệng, kẹo cao su ➢ Xử lý nước Do tính chất polycatinic tự nhiên, chitosan được sử dụng như một tác nhân kết bong, hoặc kết tủa chất bẩn.Weltroswki và cộng sự sử dụng chitosan N_ benzyl dẫn xuất của sulphonat như các chất hấp thụ để loại bỏ ion kim loại trong môi trường acid. Năm 1999, Bhavani và dutta sử dụng chúng như chất hấp thụ loại bỏ màu từ nước thải xưởng nhuộm. Ngoài ra, chitosan còn dùng để laoị khỏi chất thải các chất như: kim loại nặng, asen, plutonium, methyl acetate – thủy ngân, acetaldehyde, kể cả dầu mỏ và dầu khí. 15
Đồ án tốt nghiệp ➢ Công nghiệp giấy Do có cấu trúc tương tự cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy.Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn. Do có khả năng phân hủy sinh học nên chitin- chitosan được sử dụng trong nghành sản xuất giấy tái chế thân thiện với môi trường và bao bì thực phẩm. ➢ Chế biến thực phẩm Chitosan được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm vì tính không độc đối với động vật máu nóng. Các hạt tinh tinh thể chitin siêu nhỏ có tính chất nhũ hóa, làm dày và tạo gel cho thực phẩm. Nó còn được sử dụng như chất xơ trong thực phẩm nướng. Việc sử dụng này giải quyết các vấn đề như màu sắc, mùi vị và hạn sử dụng dài hơn các loại chất xơ. Ngoài ra chitin – chitosan còn kháng vi khuẩn, kháng nấm cản trở sự hoạt động của enzyme. 1.2.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp ➢ Xử lý hạt Hạt giống xử lý bằng cách nhúng vào dung dịch chitosan loãng, bao phủ bề mặt hạt bằng một màng chitin hay chitosan mỏng trước khi gieo trồng sẽ thúc đẩy và nâng cao độ tăng trưởng. Bổ sung chitin trong bầu đất sẽ dẫn đến giảm đáng kể sâu hại rễ, vi khuẩn gây bệnh và nấm mốc. ➢ Chất mang trong sản xuất phân bón : Trong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón và chất điều hòa tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết. Chitosan được sử dụng như chất mang tự nhiên để kết hợp và phóng thích từ các hợp chất mong muốn trong đất. Chitosan bị phân hủy sinh học trong đất khoảng hai tháng, kèm theo là sự phóng thích các chất. Do đó, người ta tiết kiệm được đáng kể lượng chất sử dụng và thời gian bón lặp khi sử dụng làm chất mang. ➢ Ứng dụng của màng chitosan trong tồn trữ và bảo quản chất lượng rau quả tươi 16
Đồ án tốt nghiệp Chitosan cũng có tiềm năng là một loại màng bảo quản trái cây. NOCC ( N,O- Carboxymethyl chitosan) một dẫn xuất được tạo ra bởi phản ứng của chitosan với acid monochloroacetic. Lớp phim được tạo ra bằng cách phun dung dịch NOCC hòa tan lên trái cây hoặc bằng cách nhúng trái cây vào trong dung dịch. Kết quả tạo ra màng bán thấm, màng chitosan có thể làm giảm khí quyển bên trong tốt như việc làm giảm sự mất hơi nước thoát ra và làm trì hoãn quá trình chín của trái. ➢ Ứng dụng chống vi sinh vật của chitin, chitosan Chitosan không những ức chế các vi khuẩn gram dương, gram âm mà cả nấm men và nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc một vài yếu tố như loại chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ. Mặc dù chưa có một giải thích đầy đủ cho khả năng kháng khuẩn đối với các đối tượng vi sinh vật, nhưng hầu hết đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan lên bề mặt tế bào. Trong đó, chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn gram âm tốt hơn vi khuẩn gram dương. Khi bổ sung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương. Nhờ +. tác dụng của những nhóm NH3 Trong chitosan lên các vị trí mang điện âm ở trên màng tế bào vi sinh vật, dẫn tới sự thay đổi tính thấm của màng tế bào làm cho quá trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng. Chitosan cũng có tác động sinh học và thấm hút chất dinh dưỡng của vi khuẩn và có thể ức chế sự phát triển của chúng. Chitosan có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn do có khả năng lấy đi các ion kim loại quan trọng như Cu2+, Co2+, Cd+ của tế bào vi khuẩn nhờ hoạt động của các nhóm amino trong chitosan có thể tác dụng với các nhóm amino của bề mặt thành tế bào. Như vậy vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến ion quan trọng. 1.2.4.3. Ứng dụng y sinh Màng chitosan đã được đề xuất làm màng thận trong sản xuất thận nhân tạo vì có độ thấm phù hợp và độ bền cao. 17
Đồ án tốt nghiệp ➢ Mô nhân tạo Chitosan và một số dẫn xuất đã được nghiên cứu để sử dụng trong một số ứng dụng y sinh bao gồm băng bó vết thương và làm đầy không gian cấy ghép. Chitosan được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật mô xương và hệ thần kinh trung ương, ngoài ra chúng còn được nghiên cứu để chữa sụn khớp. Chitosan đã được nghiên cứu để sản xuất chỉ may vết thương và cho thấy tốc độ chữa lành vết thương nhanh hơn bình thường. ➢ Điều trị bỏng Do chitosan có thể hình thành màng thấm nước, có khả năng tương tác sinh học. Màng phim có thể hình thành trực tiếp trên vết bỏng bằng cách sử dụng dịch nước của chitosan acetate. Một lợi thế nữa của chitosan là khả năng thẩm thấu oxy tốt đây là điều quan trọng để các mô bị thương không bị thiếu oxy. Ngoài ra lớp màng phim chitosan có khả năng hấp thụ nước và bị phân hủy tự nhiên bởi các enzyme trong cơ thể nên không cần phẫu thuật loại bỏ. ➢ Da nhân tạo Do nhiều tính chất : tạo màu, có khả năng thẩm thấu oxy, thấm nước, diệt khuẩn, làm mau lành vết thương, hiện nay chitosan đang được nghiên cứu để sản xuất da nhân tạo phục vụ cho y học ➢ Màng bao thuốc Chitosan có đặc tính kháng khuẩn kháng nấm, không độc, chitosan là chất vô cùng thích hợp để sản xuất màng bao thuốc. 1.2.5. Ứng dụng chitosan kích thích nảy mầm hạt giống Chitosan được sử dụng để bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt. Một trong những hoạt tính sinh học quan trọng của chitosan trên thực vật đó là sự kích thích nảy mầm. Trong đậu phộng hạt giống được bao lớp màng chitosan sẽ làm tăng cường khả năng nảy mầm của hạt giống ( Zhou và cộng sự, 2002 trích dẫn bởi Batool Mahdavi và Asghar Rahimi, 18
Đồ án tốt nghiệp 2013). Chitosan có thể thúc đẩy sự tăng trưởng và làm tăng năng suất đậu tương ( Dũng và Thắng, 2002). Các nhà khoa học Nguyễn Thị Huệ, Lâm Ngọc Thụ ( Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQG Hà Nội) và Nguyễn Văn Hoan ( Đại Học Nông Nghiệp 1) đã sử dụng các có hoạt tính sinh học cao từ chitin để kích thích nảy mầm những hạt lúa giống quốc gia DH 60 đã bảo quản được 19 – 21 tháng. Đồng thời khi sử dụng các chất có hoạt tính sinh học này còn có khả năng kích thích cho sự sống của hạt giống cao hơn, chất lượng cây mầm tốt hơn, góp phần nâng cao giá trị gieo trồng của hạt giống. Viện Khoa học nông nghiệp Miền Nam và Trung tâm công nghệ sinh học Thủy sản cùng tham gia nghiên cứu tác dụng của chitosan lên một số loại hạt dễ mất khả năng nảy mầm và góp phần thúc đẩy tăng trưởng, phát triển cây trồng ngoài đồng. Kết quả là có khả năng kéo dài thời gian sống và duy trì khả năng nảy mầm tốt của hạt giống cà chua và hạt đậu cô ve sau thời gian bảo quản 9 – 12 tháng trong điều kiện bình thường Năm 1987, Bentech đã được cấp bằng sáng chế nhờ nghiên cứu dùng chitosan trong việc bọc nang hạt giống để ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất. Trong những vùng mà cây trồng thường bị nấm tấn công vào hệ rễ, nếu hạt giống được bọc nang bằng chitosan sẽ nâng cao được hiệu suất thu hoạch lên 20 % so với không dùng chitosan. 1.2.6. Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay 1.2.6.1. Tình hình sản xuất chitin-chitosan Vỏ đầu tôm chứa 3 thành phần chủ yếu chitin, protein và khoáng chủ yếu là CaCO3. Để thu nhận chitin, phải khử khoáng và khử protein và khử màu. Để được chitosan cần loại bỏ gốc acetyl .Sơ đồ tổng quát công nghệ thu hồi chitin từ vỏ, đầu tôm và sản xuất chitosan được trình bày trên hình 1.3. 19
Đồ án tốt nghiệp Vỏ, đầu tôm Khử protein Khử khoáng Chitin Loại gốc acetyl Chitosan Hình 1.3. Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm 20
Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra còn có nhiều nghiên cứu khác đến từ các nước Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp, Thái Lan Hình 1.4. Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu tôm bằng phương pháp thuần túy hóa học của Robert, Đại học Nottingham Trent ( 1998). Nhận xét: Đây là quy trình tổng hợp từ cả quy trình sản xuất trước đó. Sản phẩm chitosan được sản xuất theo quy trình này có màu sắc đẹp, các chất màu được loại bỏ sạch trong quá trình tẩy màu. Hàm lượng protid và khoáng chất còn lại trong chitin thấp.Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình này là sử dụng quá nhiều hóa chất nồng độ cao với số lượng lớn, dẫn đến tăng giá thánh sản xuất, đồng thời nếu quá trình xử lý nước thải không tốt sẽ ảnh hưởng rất lớn đến môi trường. 21
Đồ án tốt nghiệp 1.2.6.2. Quy trình sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học Hiên nay, việc bảo vệ môi trường đang là vấn đề lớn và được nhiều người quan tâm. Vì vậy, việc tìm ra một quy trình sản xuất chitin ít gây ô nhiễm đang được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới. Thay vì sử dụng các hóa chất với nồng độ cao, các nhà khoa học đang ứng dụng sinh học vào quy trình sản xuất và đã đem lại thành công trong vấn đề này. Hình 1.5. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện nghiên cứu công nghệ thực phẩm Ấn Độ, 2010 Trong phương pháp này, người ta chủ yếu dùng vi khuẩn lên men lactic để ủ tôm. Acid lactic sinh ra sẽ khử khoáng trong nguyên liệu, đồng thời ngăn không cho các vi sinh vậy gây hôi thối phát triển. Đồng thời các vi sinh vật này sẽ phân hủy một phần protein còn lại trong nguyên liệu. Ngoài ra, có thể sử dụng các 22
Đồ án tốt nghiệp enzyme thủy phân protein từ Aspergillus oryzea để thúc đẩy hiệu suất quá trình cao hơn. Ngoài ra, Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) cũng nghiên cứu và tìm được quy trình thu nhận chitin từ đầu – vỏ tôm phế liệu bằng phương pháp enzyme sử dụng dịch ép vỏ dứa phế thải chứ proteinase bromelain và giàu các acid hữu cơ, có tác dụng loại các chất khoáng và protein trong đầu – vỏ tôm. Phương pháp này có ưu điểm không cần aicd để loại khoáng tiêu tốn ít xút cho loại protein, hiệu quả thu hồi chitin cao ít gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên phương pháp này mất nhiều thời gian thực hiện quy trình thu nhận enzyme từ vỏ dứa. So sánh hiệu quả xử lý hóa học và sinh học : chất lượng chitin sản xuất bằng phương pháp hóa học có hàm lượng khoáng và protein thấp hơn nhiều so với xử lý bằng phương pháp sinh học. Theo Bhaskar (2010) thì phương pháp sinh học cho hiệu quả khử protein là 92 % khử khoáng 78 %. Theo Rao (2000), thì hiệu quả khử khoáng có thể đạt 86 % và hiệu quả khử protein cao nhất có thể đạt 86 %. 1.3. Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.3.1. Khái niệm Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có một sự thống nhất về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất. Chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic, acid lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và kết thúc của quá trình lên man carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, aicd hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Một số chủng LAB có thể sinh bacteriocins ức chế sinh vật gây bệnh (Klaenhammer, 1987). Hơn nữa, acid lactic và các sản phẩm trao đổi chất khác góp phần vào tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm. Vi khuẩn lên men lacic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học 23
Đồ án tốt nghiệp (generally recognized as safe – GRAS), do được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ si sinh vậy có ích của con người. 1.3.2. Đặc tính chung Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catalase âm tính và là những vi khuẩn kỵ khí chịu oxy, trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vi khuẩn latic có thể len men được các đường monosaccharid, đường disaccharide, protein tan, pepton và acid. Phần lớn chúng không lên men được tinh bột và các polisaccharid khác. Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2 - 3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8 - 4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5 - 6. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25 - 350C, ưa nhiệt là 40 - 450C và ưa lạnh là thấp hơn 50 C. Khi gia nhiệt khoảng 60 - 800C thì hầu hết chúng bị chết sau 10 - 30 phút. Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm lên men (trên các loại rau, quả, sữa, thịt, ). 24
Đồ án tốt nghiệp 1.3.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 1.3.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ a. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ. b. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém. c. Nhu cầu về vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men 25
Đồ án tốt nghiệp d. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid axetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid axetic dưới dạng các muối axetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic. e. Nhu cầu các muối vô cơ khác Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. f. Nhu cầu dinh dưỡng oxi Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống được trong môi trường không có oxy. Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP. Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn. 26
Đồ án tốt nghiệp 1.3.3.2. Quá trình trao đổi chất Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường). LAB có khả năng lên men các loại đường hexcose (glucose, mannose, galactose, fructose ), disaccharide (lactose, saccharose ), pentose (arabinose, xylose, ribose ) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau (Owen R. Fennema và cộng sự, 2004). Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.6). Hình 1.6. Con đường lên men glucose 27
Đồ án tốt nghiệp (A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB) (B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase) Các enzyme tham gia vào quá trình : 1. Glucokinase; 2. Fructose-1,6-diphosphate aldolase; 3. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4. Pyruvate kinase; 5. Lactate dehydrogenase; 6. Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7. 6- phosphogluconate dehydrogenase; 8. Phosphoketolase; 9. Acetaldehyde dehydrogenase; 10. Alcohol dehydrogenase. a. Lên men lactic đồng hình. Trong lên men đường, LAB sử dụng 2 cách thức chủ yếu là vận chuyển đường tự do (transport) và phosphoryl hóa đường (phosphorylation) bởi glucokinase (cần 1 ATP). Một số loài sử dụng phosphoenolpyruvate : sugar phosphotransferase system (PTS), mỗi phosphoenolpyruvate là một phần tử cho phosphate, trong trường hợp này đòi hỏi một liên kết phosphate có năng lượng cao để hoạt hóa phân tử đường. Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof- Parnas pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli, Oenococci và Weissella) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+ do đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình. b. Lên men lactic dị hình. Ngoài ra còn có một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose 28
Đồ án tốt nghiệp monophosphate, con đường 6-phosphogluconate và được gọi chung là 6- phosphogluconate / phosphoketolase (6-PG/PK). Đặc điểm của con đường này là sự khử hydro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate. GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic. Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm khác như CO2, ethanol thì nó được gọi là lên men lactic dị hình. Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK. Tuy nhiên cần chú ý nhận xét trên không phải đúng cho tất cả các trường hợp (Owen R. Fennema et al. 2004). 1.3.4. Giới thiệu các nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic vào lên men thu hồi chitin Lên men acid lactic là một trong những phương pháp lên men được sử dụng trong quy trình sinh học để khử khoáng của chitin. Nó thu hồi chitin bằng cách thủy phân protein liên kết với chitin trong vỏ đầu tôm (Zakaria et al. 1998, George et al. 1999) Nghiên cứu của Kandra Prameela và cộng sự 2010 cũng nghiên cứu thành công sử dụng các chủng lactobacillus lên men lactic thu hồi chitin từ phế thải tôm. Các tác giả dựa trên khả năng tổng hợp acid lactic của vi khuẩn lactic thông thường nồng độ acid lactic đạt pH 2 – 3 để khử khoáng. Các tác giả khác trên thế giới sử dụng Lactobacillus plantarum(Rao et al. 2000;Prameela et al.2010), Pediococcus acidolactici (Bhaskar et Prameela et al.2010). Các vi khuẩn probiotic LAB và vi khuẩn lên men thịt sữa như Lactobacillus acidophilus, L.plantarum, Lactobacillusbulgaricus, Pediococcus acidilactici,và Streptococcusthermophilus cũng được sử dụng. 29
Đồ án tốt nghiệp Một số vi khuẩn lactic có hoạt tính protease đáng kể, nhất là vi khuẩn lactic lên men thịt. Lê Thị Hồng Thủy phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua dựa trên khả năng lên men lactic đồng hình và hoạt tính protease của vi khuẩn để áp dụng vào xử lý vỏ, đầu tôm thu chitin. Tùy vào hoạt tính protease của vi khuẩn lactic mà có cần bổ sung enzyme hay vi sinh vật phân hủy protein hay không, vì ngoài hoạt tính protease, nhiều vi khuẩn và nấm mốc như Bacillus spp., Aspergillus oryzae còn có hoạt tính chitinase sẽ cắt ngắn mạch chitin, là điều không phải luôn luôn mong muốn cho sản phẩm cuối cùng chitosan, nhất là khi muốn có chitosan có khả năng tạo màng. Thậm chí Waldeck, 2006 phải sử dụng công nghệ di truyền để tạo Bacillus lichenformis không sinh chitinase mà chỉ có protease để khử protein trong vỏ tôm thu chitin, chitosan có độ nhớt cao.Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72(12):7879 Jens Waldeck, Gabriele Daum, Bernward Bisping andViscous ChitinShrimp Shell Waste To Obtain Highly Strains Capable of Deproteinization of Bacillus licheniformis. Như vậy sử dụng vi khuẩn lactic vừa lên men lactic mạnh vừa có hoạt tính protease cao để lên men lactic thu nhận chitin từ vỏ đầu tôm là phương pháp đỡ tốn kém và an toàn môi trường nhất. Tuy nhiên các thông số kỹ thuật của quá trình lên men cần được hoàn thiện. 30
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường Đại học Công nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ 25/ 5/ 2015 đến tháng 16/8/ 2015. 2.1.3. Vật liệu 2.1.3.1. Mẫu thí nghiệm Vi khuẩn lên men lactic L5 do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường Đại Học Công Nghệ TP. HCM cung cấp. Chủng nấm Aspergillus flavus CĐP1 do bạn Vân Hương và Tuyết Mai lớp 11DSH05 cung cấp. Nguyên liệu vỏ tôm của đề tài này thu được từ chợ Bà Chiểu. Mẫu chitosan thương phẩm 1 : ngoại nhập từ Úc Mẫu chitosan thương phẩm 2 từ công ty TNHH Hùng Tiến, QuậnBình Thủy, Cần Thơ. 2.1.3.2. Thiết bị - Tủ cấy vi sinh ( Brlad France ) - Tủ ủ ( Memmert Germany ) - Máy chạy Kjeldahl - Tủ lạnh Toshiba - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Máy đo quang (hach-Germany) 31
Đồ án tốt nghiệp - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Cân phân tích (Orbital Germany) - Bếp từ (Billy-England) - Máy nước cất. 2.1.3.3. Dụng cụ - Ống nghiệm có nắp và không có nắp - Đĩa petri - Cốc thủy tinh 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml - Erlen 100 ml, 250 ml, 500 ml - Ống đong 100 ml - Pipet thủy tinh 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml. - Ống ly tâm lớn, ống ly tâm eppendorf - Que cấy, que gắp, que trang, que đục lỗ thạch - Chai thủy tinh 100 ml. - Bình định mức 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml. - Đũa thủy tinh - Giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa - Bông thấm nước, bông không thấm nước - Bao nilong hấp, dây thun, giấy gói. 2.2. Phương pháp luận Mục tiêu : Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic trong xử lý kích thích nảy mầm hạt giống. Nội dung 1: Lên men kéo dài - Tiến hành thực hiện quy trình thu hồi chitin – chitosan từ vỏ đầu tôm bằng lên men lactic sử dụng nguồn rỉ đường, thời gian lên men 10 ngày. - Phân tích % acid lactic, N- amine, N-protein, hiệu quả khử khoáng, hiệu quả khử protein. 32
Đồ án tốt nghiệp Nội dung 2 : So sánh hiệu quả thu hồi chitosan của phương pháp lên men lactic so với mẫu chitosan thương phẩm. Nội dung 3 : Tiến hành thực hiện ứng dụng chitosan phương pháp lên men lactic và mẫu chitosan thương phẩm. - Khảo sát khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1 của chitosan bằng phương pháp lên men lactic ở các nồng độ 0,1 g/l; 0,5 g/l; 1,0 g/l; 2,0 g/l; 4,0 g/l tại mức pH= 5,5 - Xác định nồng độ tối ưu . - So sánh khả năng ức chế nấm của chitosan bằng phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm. Nội dung 4: - Khảo sát kích thích sự ra rễ hạt đậu nành, hạt đậu phộng của chitosan theo phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm ở các nồng độ tương ứng. - Xác định nồng độ tối ưu - So sánh khả năng kích thích nảy nầm chitosan lên men lactic so với mẫu chitosan thuơng phẩm. 2.3. Phương pháp thí nghiệm 2.3.1. Thu thập mẫu và nguyên liệu Nguyên liệu vỏ tôm của đề tài này thu được từ chợ Bà Chiểu. Quá trình chuẩn bị vỏ tôm được trình bày Vỏ tôm Rửa sơ Xay nhuyễn ≤ 2 mm Tiến hành thí nghiệm Bảo quản ở -40 C Hình 2.1. Sơ đồ xử lý vỏ tôm trước khi thí nghiệm 33
Đồ án tốt nghiệp Vỏ tôm sau khi thu nhận được rửa sơ loại bỏ các tạp chất như sỏi, đá nhỏ, sau đó được xay nhuyễn ( ≤ 2 mm ) và bảo quản -40 C. Quá trình này cần làm nhanh để tránh vỏ tôm bị hư hỏng. 2.3.2. Xác định thông số về thành phần hóa học của nguyên liệu đầu vỏ tôm Tiến hành : 100 g vỏ tôm đã qua xử lý được thêm nước cất, sau đó đem ly tâm 4000 vòng / phút trong 15 phút, lặp lại 2 lần. Phần dịch sau hai lần ly tâm được trộn lẫn và định mức tới 500 ml gọi là dịch D, rắn sau ly tâm gọi là R. Vỏ tôm đã xử lý (100g) Khuấy trộn Nước Ly tâm 4000 vòng, 10 phút Rắn sau ly tâm Thu dịch Khuấy trộn Nước Ly tâm 4000 vòng, 10 phút Rắn R Thu dịch Định mức 500ml Dịch D Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm xác định thành phần trong nguyên liệu 34
Đồ án tốt nghiệp Các yêu cầu thí nghiệm như sau : 1.Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm. 2.Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch trích ly bằng phương pháp Nito formol. 3.Xác định hàm lượng nito tổng có trong vỏ tôm bằng phương pháp Kjeldahl. 4. Xác định hàm lượng N- protein hòa tan có trong vỏ tôm bằng phương pháp Bradford. 2.3.3. Quy trình lên men kéo dài Sử dụng nguồn đường rỉ đường sau xử lý để lên men với thời gian 10 ngày ở 370C Giống : vi khuẩn Lactic L5 do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Môi trường Trường Đại học Công nghệ Tp.HCM cung cấp. Môi trường lên men bằng đường mật rỉ - 500 g vỏ tôm - 2,5 % NaCl - Hàm lượng rỉ đường 20% - Tỉ lệ nước: đầu tôm là 2,5 : 1 - Tỷ lệ cấy giống (so với mật độ giống được xác định bằng giá trị OD là 0,4) 35
Đồ án tốt nghiệp Vỏ tôm Lên men lactic ( 20% đường khử; giống 3,16 x Rỉ đường 106 cfu/g; nước : đầu tôm – 2,5 :1; 2,5% NaCl xử lý 0 37 C; 10 ngày Chitin Ngâm NaOH = 1:10 (w/v), (40%, 1000C, 5h) Rửa trung tính Khử màu bằng H2O2 Phơi khô tự nhiên Chitosan Hình 2.3. Quy trình thu hồi chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic sử dụng rỉ đường 36
Đồ án tốt nghiệp Sau lên men lactic mẫu được rửa lại nằng nước cất 3 lần và hoàn lại thể tích ban đầu và xác định các thông số: • Xác định các thông số chitin : 1. Độ ẩm 2. Xác định hàm lượng khoáng của chitin 3. Xác định hàm lượng N amin có trong dịch trích ly bằng phương pháp Nito formol 4. Xác định hàm lượng Nito tổng có trong chitin bằng phương pháp Kjeldahl. 5. Xác định hàm lượng N- protein hòa tan có trong chitin bằng phương pháp Bradford 6. Xác định lượng acid lactic 7. Xác định hiệu quả khử khoáng 8. Xác định hiệu quả khử protein • Xác định thông số chitosan 1. Độ hòa tan 2. Độ nhớt 3. Mức độ deacetylation 2.3.4. Phương pháp tiến hành 2.3.4.1. Xác định độ ẩm Tiến hành : Cân khối lượng mẫu muốn xác định độ ẩm m1. Cân khối lượng o của chén và mẫu m2. Sấy trong tủ sấy 105 C đến khối lượng không đổi. Làm nguội trong bình hút ẩm 30 phút. Cân được khối lượng mo. 37
Đồ án tốt nghiệp Tính kết quả : X = [(m2 – mo) *100] /m1 Trong đó: X : Hàm lượng ẩm của mẫu (%) m2 : Khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g) mo: Khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g) m1: Khối lượng mẫu thử trước khi nung (g) 2.3.4.2. Xác định hàm lượng khoáng trong mẫu cần phân tích Cho chén nung vào tủ sấy trong 2 giờ. Sau đó lấy chén ra và làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân để xác định khối lượng với độ chính xác 0,001 g (mo). Cân khoảng 2 g mẫu Rx ở trạng thái khô không khí và cho vào chén nung đã biết khối lượng với độ chính xác 0,001 g. Cho chén và mẫu vào tủ sấy, sấy ở 1050 C trong 2 – 3 giờ để cho nước có trong mẫu bay đi hết, sau đó đặt chén mẫu vào trong lò nung và nung ở nhiệt độ 500 – 550 độ C trong 2 giờ. Lấy ra ngoài làm nguội trong bình hút ẩm, đem mẫu đi cân ta có khối lượng m2. Hàm lượng tro thô của mẫu Rx được tính bằng % theo công thức: X = [(m2 – mo) *100]/m1 Trong đó: X : Hàm lượng tro thô của mẫu (%) m2 : Khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g) mo : Khối lượng chén (g) m1: Khối lượng mẫu thử trước khi nung (g) 38
Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.3. Xác định hàm lượng nito amin có trong dịch sau lên men Tiến hành : Lấy 4 ml dịch trịch ly cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất tới ngấn bình, lắc đều. Dùng pipet lấy 10 ml, 15 giọt chỉ thị hỗn hợp sau đó cho từng giọt NaOH 0,1 N đến khi dung dịch có màu phớt xanh, cho tiếp 5 ml formol trung tính, chuẩn độ bằng NaOH 0,05 N đến khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu xanh tím. Tiến hành xác định mẫu trắng, thay 10 ml dịch pha loãng bằng 10 ml nước cất Kết quả: (푛2− 푛1 )×0,0007×100×1000×500 Namin = (4×10×100) Với: n1 : Thể tích NaOH chuẩn mẫu trắng (ml) n2 : Thể tích NaOH mẫu thí nghiệm (ml) 0,0007: Số gam nito tương ứng với 1ml NaOH 0,05 N 100: Dung tích bình định mức (ml) 500: Số ml dung dịch mẫu Dx ban đầu 4: Thể tích mẫu nguyên 10: Thể tích mẫu pha loãng 100: Số gam nguyên liệu ban đầu 39
Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.4. Xác định hàm lượng N tổng số có trong mẫu cần phân tích Vô cơ hóa mẫu Cân 0,1g mẫu bột vỏ tôm cần xác định N tổng, cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5 ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxy -hóa). Cho thêm vào 0,2 g chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh. Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ để kéo hết các phần tử ở trên thành bình còn chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình kjeldahl và định mức đến vạch. Cất đạm Chuyển 50 ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro, lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình cất 20 ml NaOH 45 % cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5 ml NaOH 45% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ). Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20 ml H2SO4 0,1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn có làm xanh giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 45 %. Sau khi cất đạm 20 – 25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi màu xanh là được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa. 40
Đồ án tốt nghiệp Chuẩn độ Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0,1 N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ, ghi nhận thể tích NaOH 0,1N sử dụng. Kết quả: Khối lượng N tổng số có trong mẫu được tính theo công thức: N (g) = {[1,41*(V1 – V2) *100/a] *2/1000}*10/100 Trong đó: V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0,1 đã chuẩn độ a: số g nguyên liệu đem vô cơ hóa mẫu 1,42: hệ số cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42mg Nitơ. 2.3.4.5. Xác định hàm lượng protein hòa tan trong dịch trích ly bằng phương pháp Bradford Nguyên tắc : Các protein khi phản ứng xanh Coomassie (Coomassie Brilliant blue – CBB) sẽ hình thành hợp chất có màu khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với protein trong dung dịch. Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài g protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian. 41
Đồ án tốt nghiệp Tiến hành : Lập đồ thị đường chuẩn Bảng 2.1. Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn Chuẩn Chuẩn Chuẩn Chuẩn Chuẩn Ống nghiệm ĐC Mẫu 1 2 3 4 5 Dung dịch BSA 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 - (0,1 mg / ml) Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 - Mẫu phân tích pha loãng hệ số - - - - - - 1 F (ml) Nồng độ BSA 0 10 20 30 40 50 - (μg/ml) Thuốc thử 2 2 2 2 2 2 2 Bradford (ml) Để yên trong 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu dung dịch ở bước sóng 595 nm, lấy mẫu đối chứng làm mẫu trắng. Kết quả: Từ kết quả đo OD vẽ ra đồ thị đường chuẩn albumin dạng y = ax + b Hàm lượng N protein (mg/g) = [(y-b)/a]*500/100/6,25 Trong đó : y là kết quả OD của mẫu thí nghiệm a và b là hai hằng số trong đường chuẩn albumin. 500: số ml dịch Dx 100: số g nguyên liệu ban đầu 6,25: hệ số chuyển đổi từ protein hòa tan sang N protein 42
Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.6. Xác định lượng acid lactic Xác định lượng acid lacic sinh ra trong quá trình lên men lactic thu hồi chitin.Cho 10ml dịch Dx vào bình tam giác, cho thêm 3 giọt phenolphthalein. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi dịch có pH = 8,3. % khối lượng acid lactic sinh ra được tính theo công thức: % acid lactic = VNaOH /10*50/10*0,1/1000*90*100 Trong đó: VNaOH: Thể tích NaOH 0.1N chuẩn độ được 10: Số ml dịch Dx được đem đi chuẩn độ 0,1: Nồng độ NaOH dùng chuẩn độ 1000: Hệ số chuyển đổi ra g 90: Mỗi ml NaOH chuẩn độ tương đương với 90mg lacid lactic trong dịch Dx. 2.3.4.7. Xác định hiệu quả khử protein và khử khoáng bằng phương pháp lên men lactic Hiệu quả khử khoáng và khử protein được thể hiện bằng tỉ lệ phần trăm như mô tả của Prameela K. và cộng sự (2010) : [ ] % DM = 표× −[ 푅 × 푅] × 100 [ 0 × ] [ ] % DP = 푃0× − [푃푅 × 푅] × 100 [푃0 × ] Với: % DM: Tỷ lệ phần trăm khử khoáng % DP: Tỷ lệ phần trăm khử protein Po và Pr: Nồng độ protein trước và sau lên men 43
Đồ án tốt nghiệp Ao và Ar: % tro trong mẫu trước và sau lên men. O và R: Khối lượng mẫu trước và sau lên men. 2.3.4.8. Xác định độ hòa tan chitosan Cân 0,25 g chitosan hoà tan trong 50 ml acid acetic 1%, khuấy đều trong 15 phút, lọc thu cặn (nếu còn), rửa bằng nước cất, sấy khô và cân lại. Độ hòa tan, %: X (%) = [(M – m) x 100] / M Trong đó M là khối lượng của chitosan trước hòa tan (g), m là khối lượng chitosan còn dư sau phản ứng hoà tan (g). 2.3.4.9. Xác định độ nhớt chitosan và phân tử lượng trung bình Cân 0,25 g chitosan hòa tan trong 50 ml acid acetic 5 % và 0,1 M KCl. Lấy 25 ml hỗn hợp dung dịch trên cho vào nhớt kế Ostwald, đo thời gian dung dịch chitosan chạy từ vạch A xuống vạch B. Thực hiện tương tự với nước cất. Đo độ nhớt động học v/t = vH2O/ t H2O 0 Do đó ( cp) = ( vH2O/ t H2O ) * t (vH2O ở 30 C = 0,801 cp) Độ nhớt đặc trưng và phân tử lượng trung bình của chitosan có mối liên hệ theo công thức mô tả của Chang (1997): ’ ( cp) = K * Ma Trong đó : ’ : Độ nhớt đặc trưng của polyme ’ =  / C C: nồng độ chitosan (g / 100 ml ) K= 3,04 x 10-5; ∝= 1,26 44
Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.10. Xác định độ deacetylation chitosan Cân 0,5 g chitosan hòa tan trong 25 ml HCl 0,1M định mức lên tới 100 ml bằng nước cất. Thêm KCl điều chỉnh cường độ ion đến 0,1. Tiến hành chuẩn độ dd chitosan bằng dung dịch NaOH 0,05 M và xác định điểm tương đương bằng cách đo điện thế dung dịch. Từ đó xác định được DDA % của chitosan (Broussignac, 1968) DDA (%) = (1−161 ×푄) (1+42 ×푄) Với Q = ( ×∆ ) ∆ : Thể tích dd NaOH giữa 2 điểm uốn (lít) : Nồng độ đương lượng NaOH (0,05M/) : Khối lượng chitosan. 2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1 trên môi trường nuôi cấy PDA Nghiên cứu nhằm xác định nồng độ chitosan và pH tối ưu nhất để ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh. Chọn đĩa nấm thuần sau khi phân lập. Chuẩn bị môi trường PDA kết hợp với chitosan ở các nồng độ 0,1 g/l; 0,5 g/l; 1,0 g/l; 2,0 g/l; 4,0 g/l và được điều chỉnh pH bằng NaOH để thu được mức pH tương ứng là 5,5. Sau khi chuẩn bị xong, dung dịch được đun cách thủy ở nhiệt độ khoảng từ 85 – 900C trong 35 phút để tạo điều kiện cho agar tan hoàn toàn và không làm mất hoạt tính của chitosan. Tiến hành cấy nấm dùng ống kim loại khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và đục lỗ có đường kính 6 mm sang môi trường PDA có dịch chitosan và theo dõi sự phát triển của nấm sau 24 h và quan sát liên tục trong vòng 7 ngày, đo kích thước vòng nấm phát triển so với đĩa đối chứng (môi trường PDA không bổ sung chitosan) để xác định nồng độ tối ưu. 45
Đồ án tốt nghiệp Công thức tỷ lệ ức chế nấm % Hoạt lực ức chế nấm: I (%) = − x 100 Với : Da : Đường kính nấm phát triển trên đĩa đối chứng (mm ) Db: Đường kính nấm phát triển của nấm thử nghiệm (mm) 2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt sự ra rễ hạt đậu nành, hạt đậu phộng ở các nồng độ tương ứng. Thí nghiệm được tiến hành như mô tả của Batool Mahdavi, Asghar Rahimi (2013) Hạt giống được ngâm trong dung dịch chitosan với các nồng độ tương ứng ( 0 g/l; 0,1 g/l; 0,5 g/l; 1,0 g/l; 2,0 g/l; 5,0 g/l tan trong dung dịch acid acetic 1 %). pH của dung dịch được điều chỉnh đến pH = 6,0 bằng NaOH 1 % tròng vòng 3 h. Sau đó để khô để tạo màng chitosan. Hạt được rửa bằng nước cất và phơi khô ở nhiệt độ phòng. Hạt được đặt trong lớp đĩa petri có chứa giấy lọc thấm ẩm. Mỗi đĩa đặt 25 hạt. Sau đó đặt đĩa trong buồng tăng trưởng. Sau 7 ngày quan sát bắt đầu kiểm tra các chỉ tiêu : số lượng hạt nảy mầm, trọng lượng của hạt, chiều dài của rễ non. 46
Đồ án tốt nghiệp Hạt giống (đậu nành, đậu phộng) Lựa chọn Nhúng vào dung dịch chitosan 0,1 g/l 0,5 g/l 1,0 g/l 2,0 g/l 5,0 g/l Rửa bằng nước cất Để khô ở nhiệt độ phòng Hạt giống được đặt vào đĩa petri có chứa giấy lọc ẩm Đặt ở buồng tăng trưởng ở nhiệt độ 20 ± 10C Xác định các chỉ tiêu: số lượng hạt nảy mầm, trọng lượng của hạt, chiều dài của rễ non Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm kích hoạt nảy mầm của hạt đậu nành, hạt đậu phộng của dung dịch chitosan ở các nồng độ. 47
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ tôm Để thuận tiện cho các tính toán về sau và xác định hiệu suất quá trình lên men việc xác định các thành phần hóa học trong vỏ tôm là điều cần thiết vì vậy ta tiến hành xác định các thành phần hóa học của vỏ đầu tôm nguyên liệu, kết quả được thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần hóa học nguyên liệu vỏ tôm Nguyên liệu vỏ Thành phần Đơn vị tôm Ẩm độ % khối lượng tươi 79,56 ± 0,31 Khoáng % khối lượng tươi 18,88 ± 0,18 N tổng số (bã vỏ mg/ g 6,15 ± 0,59 tôm) N amin( dịch trích mg/ g 6,24 ± 0,62 ly) N protein ( dịch mg/ g 0,027 ± 0,0013 trích ly) So với kết quả đồ án của Dương Quốc Xuân (2014) ẩm độ 77,43 %; khoáng 24,3 %; N tổng số 6,11 mg/ g, Namin 7,35 mg/ g ta thấy quả kết quả ẩm độ, khoáng, nitơ tổng số, N amin của nguyên liệu vỏ đầu tôm bảng 3.1 trên tương đương với kết quả của Dương Quốc Xuân (10DSH). 48
Đồ án tốt nghiệp 3.2. Thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi chitin với tỉ lệ rỉ đường 20% Bảng 3.2. Các thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi chitin của chủng L5 vởi tỉ lệ rỉ đường 20% Thành phần Đơn vị Kết quả Mùi Không có mùi thối pH 4,8 Ẩm độ % khối lượng 85,15 ± 2,0 Khoáng % khối lượng 3,78 ± 0,15 N tổng số ( bã vỏ mg/ g 3,23 ± 0,44 tôm) N amin( dịch trích mg/ g 26,40 ± 1,4 ly) N protein ( dịch mg/ g 0,0343 ± 0,0024 trích ly) Nồng độ acid lactic (% ) 5,64 ± 0,0687 Kết quả cho thấy N tổng số có trong vỏ tôm giảm từ 6,15 mg/ g (bảng 3.1) xuống còn 3,23 ( bảng 3.2) giảm xuống 2 lần so với ban đầu; % hàm lượng khoáng trong vỏ tôm từ 18,88 % (bảng 3.1) giảm xuống còn 3,78 % ( bảng 3.2) giảm 4,99 lần so với thành phần nguyên liệu ban đầu, N amin cao hơn so với ban đầu. Điều này cho thấy trong quá trình lên men hoạt tính enzyme protease sinh ra đã hòa tan protein trong vỏ đầu tôm thành Namin và Nprotein có trong dịch đồng thời enzyme tiếp tục thủy phân Nprotein có trong dịch thành Namin làm cho hàm lượng Namin trong dịch trích ly tăng lên đáng kể. 49
Đồ án tốt nghiệp 3.3. Hiệu quả khử khoáng và khử protein của quá trình lên men lactic với tỉ lệ rỉ đường 20 %, mật độ giống 3,16 x 106 cfu/ ml, 10 ngày. Bảng 3.3. . Hiệu quả khử khoáng của quá trình lên men lactic chủng L5, tỉ lệ rỉ đường 20%, mật độ giống 3,16x 106 cfu, 10 ngày KL mẫu ban Khối lượng HS khử % Khoáng đầu % Khoáng sau đầu ( g) mẫu sau ( g) khoáng ( %) 18,8 500 3,78 144 94,2093 Bảng 3.4. Hiệu quả khử protein (%) của quá trình lên men lactic chủng L5, tỉ lệ rỉ đường 20%, mật độ giống 3,16 x 106 cfu/ml , 10 ngày % N tổng số KL mẫu ban % N tổng số Khối lượng HS khử protein đầu đầu ( g) sau mẫu sau ( g) ( %) 0,62 500 0,32 144 85,1355 Dựa vào bảng 3.3 và bảng 3.4 nhận thấy hiệu quả khử khoáng của quá trình lên men lactic thu hồi chitin từ vỏ đầu tôm đạt 94,2 %; hiệu quả khử protein đạt 85,1 %. Hiệu suất khử protein và khử khoáng của quá trình lên men cao chứng tỏ quá trình lên men lactic thu hồi chitin đạt hiệu quả tốt. 50
Đồ án tốt nghiệp 3.4. So sánh một số đặc tính, tính chất vật lý chitosan từ chitin theo phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm Bảng 3.5. So sánh chitosan điều chế từ phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm Phương pháp lên Chitosan thương Chitosan thương Thông số men lactic phẩm 1 phẩm 2 Độ hòa tan (%) 91,9a ± 0,89 90,9a ± 0,27 87,6b ± 0,72 Độ nhớt (cp) 1,02a ± 0,059 1,72b ± 0,10 2,76c ± 0,84 576350c ± MW (g/mol) 262027a ± 11952,3 406441b ± 14043,9 3835,34 Độ deacetylation 94,8a ± 0,27 97,5b ± 0,130 97,4b ± 0,24 chitosan (%) Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một dòng Dựa vào bảng 3.5 có thể nhận thấy độ hòa tan giữa mẫu chitosan lên men lactic và chitosan thương phẩm 1 không có sự khác biệt về mặt thống kê. Trong khi đó mẫu chitosan thương phẩm 2 có sự khác biệt so với mẫu chitosan lên men lactic và mẫu chitosan thương phẩm 1 với mức ý nghĩa ∝ = 0,05. Độ nhớt và khối lượng phân tử trung bình giữa chitosan lên men lactic với thương phẩm 1 và thương phẩm 2 cũng có sự khác nhau với mức ý nghĩa ∝ = 0,05. Độ deacetylation chitosan có sự khác biệt giữa mẫu chitosan lên men bằng phương pháp lactic với mẫu chitosan thương phẩm 2 và mẫu chitosan thương phẩm 1 với mức ý nghĩa ∝ = 0,05, sự khác biệt không chênh lệch nhiều ( Độ 51
Đồ án tốt nghiệp deacetylation chitosan lên men lactic là 94,8 %, chitosan thương phẩm 2 là 97,4 %, chitosan thương phẩm 1 là 97,5 %). Độ nhớt của chitosan lên men lactic là 1,02 cp thấp hơn so với mẫu chitosan thương mại 1(1,72 cp), chitosan thương phẩm 2(2,76 cp) do độ hòa tan của mẫu lên men lactic cao hơn so với chitosan thương mại, độ deacetylation của chitosan lên men lactic thấp thì độ nhớt sẽ thấp. Điều này phù hợp với đặc điểm tính chất của chitosan. Kết quả thu nhận chitosan sản xuất từ chitin bằng phương pháp lên men lactic được thể hiện như hình 3.1 . Hình 3.1. Kết quả thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic sử dụng rỉ đường A : Chitin B : Chitosan C: Chitosan sau khi tẩy màu bằng H2O2 52
Đồ án tốt nghiệp 3.5. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm Aspergillus flavus CĐP1 Bảng 3.6. Ảnh hưởng nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm (%) Nồng độ Chitosan thương Chitosan thương Chitosan lên chitosan (g/l) phẩm 1 phẩm 2 men lactic 0,1 g/l 34,85a ± 0,95 34,46a ± 0,47 33,64a ± 1,12 0,5 g/l 36,29a± 0,93 35,28a ±0,75 34,61a ± 1,09 1,0 g/l 39,08b ± 0,76 41,19b ±0,41 37,13b ± 0,57 2,0 g/l 39,79bc ± 1,03 41,67bc±0,41 39,89c ± 0,75 4,0 g/l 41,29c± 0,37 42,48c ± 0,14 40,42c ± 1,0 Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một cột 53
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 của mẫu chitosan lên men lactic. A: Đối chứng chỉ cấy nấm không có chitosan B : Chitosan nồng độ 0,1 g/l C : Chitosan nồng độ 0,5 g/l D : Chitosan nồng độ 1,0 g/l E: Chitosan nồng độ 2,0 g/l F: Chitosan nồng độ 4,0 g/l 54
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3. Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 của mẫu chitosan thương phẩm 1. A: Đối chứng chỉ cấy nấm không có chitosan B : Chitosan nồng độ 0,1 g/l C : Chitosan nồng độ 0,5 g/l D : Chitosan nồng độ 1,0 g/l E: Chitosan nồng độ 2,0 g/l F: Chitosan nồng độ 4,0 g/l 55
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4. Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 của mẫu chitosan thương phẩm 2. A: Đối chứng chỉ cấy nấm không có chitosan B : Chitosan nồng độ 0,1 g/l C : Chitosan nồng độ 0,5 g/l D : Chitosan nồng độ 1,0 g/l E: Chitosan nồng độ 2,0 g/l F: Chitosan nồng độ 4,0 g/l Qua kết quả bảng xử lý số liệu trên Statgraphics bảng 3.6 người thực hiện đề tài thấy : Ở mẫu chitosan thí nghiệm lên men lactic tại nồng độ 2,0 g/l và 4,0 g/l cho tỉ lệ ức chế nấm bệnh là cao nhất. Mặt khác, ở điều kiện pH = 5,5 kết quả ức chế nấm với nồng độ chitosan 2,0 g/l và 4,0 g/l không có sự khác biệt về mặt thống kê ( nồng độ 2,0 g/l tỷ lệ ức chế nấm chiếm 39,89 %, nồng độ 5,0 g/l chiếm 40,42 %). Trên thực tế, nếu xét về mặt kinh tế thì ở pH = 5,5 kết hợp với 4,0 g/l thì giá thành cao hơn so với 2,0 g/l. Bên cạnh đó, kết quả không khác nhiều so với nồng độ 2,0 g/l . 56
Đồ án tốt nghiệp Do vậy dựa trên kết quả thí nghiệm ta chọn nồng độ 2,0 g/l là nồng độ tối ưu để ức chế nấm trên môi trường PDA có bổ sung chitosan của mẫu chitosan lên men lactic. Tương tự ở mẫu chitosan thương phẩm 1 và mẫu chitosan thương phẩm 2 cũng cho tỷ lệ ức chế nấm cao nhất tại nồng độ 2,0 g/l và 4,0 g/l. Sự chênh lệch giữa nồng độ 2,0 g/l và 4,0 g/l của thương phẩm 1 và sự chênh lệch giữa nồng độ 2,0 g/l và 4,0 g/l của thương phẩm 2 không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thông kê. Như vậy, mẫu chitosan thương phẩm 1 và mẫu chitosan thương phẩm 2 khi bổ sung nồng độ chitosan 2,0 g/l cho khả năng ức chế nấm là tốt nhất. Nhìn chung, khi bổ sung chitosan ở các nồng độ từ 1,0 g/l đến 4,0 g/l ở 3 mẫu chitosan đều cho kết quả ức chế nấm tương đối tốt, phần mép tản nấm mọc sát thạch mọc yếu, sợi nấm mọc bung lên tập trung ở phần giữa đĩa peptri. Qua đó người thực hiện đề tài có thể thấy việc sử dụng chitosan ở nồng độ cao hơn đem lại sự ức chế nấm hiệu quả. Với kết quả nồng độ chitosan 2,0 g/l thì chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gần như là tốt nhất sau khi theo dõi 7 ngày ủ. Dựa vào bảng số liệu và kết quả xử lý thống kê phụ lục D2, có thể nhận thấy rằng tại nồng độ 2,0 g/l khả năng ức chế nấm giữa mẫu chitosan lên men sinh học và chitosan thương phẩm 1 không có sự khác biệt về mặt thống kê. Khả năng kháng nấm là khoảng 40 % ở mẫu chitosan thí nghiệm và chitosan thương phẩm 1. Tại nồng độ 2,0 g/l này mẫu chitosan thương phẩm 2 có tỷ lệ ức chế nấm phát triển tốt hơn so với 2 mẫu chitosan còn lại, sự chênh lệch tỷ lệ ức chế giữa chitosan thương phẩm 2 với chitosan lên men lactic và chitosan thương phẩm 1 cũng không quá lớn ( ở nồng độ 2,0 g/l chênh lệch 1,78 % so với thương phẩm 1 và 1,88 % so với mẫu chitosan lên men lactic). 57
Đồ án tốt nghiệp 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu tương Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan lên men lactic Nồng độ chitosan Tỷ lệ hạt nảy Chiều dài rễ Khối lượng hạt (g/l) mầm (%) (cm) (g) Đối chứng 66,7a ± 2,31 4,03a ± 0,06 0,30a ± 0,012 0,1 69,3a ± 2,30 5,17b ± 0,29 0,33ab ± 0,004 0,5 74,7b ± 2,31 5,89c ± 0,07 0,31b ± 0,01 1,0 76,0b ± 4,0 6,03c ± 0,15 0,34b ± 0,02 2,0 78,7bc ± 2,31 6,93d ± 0,12 0,40c ± 0,01 5,0 82,7c ± 2,29 7,17d ± 0,15 0,39c ± 0,02 Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một cột 58
Đồ án tốt nghiệp 90.0 8.0 80.0 7.0 70.0 6.0 60.0 5.0 50.0 tỷ lệ nảy mầm (%) 4.0 40.0 chiều dài rễ (cm) 3.0 tỷ lệ nảy mầm lệ % nảy tỷ mầm 30.0 khối lượng hạt (g) 20.0 2.0 chièu dai rễ (cm), khối lượng (g)khối rễ hạt lượng chièu (cm), dai 10.0 1.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.5 1.0 2.0 nồng độ (g/l)5.0 .Hình 3.5. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan lên men lactic Hình 3.6. Ảnh hưởng của chitosan lên chiều dài rễ của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan lên men lactic 59
Đồ án tốt nghiệp Qua hình 3.6 và kết quả bảng xử lý số liệu 3.7 người thực hiện đề tài có thể kết luận như sau: Với mẫu chitosan lên men lactic ta thấy tại nồng độ chitosan 2,0 g/l; 5,0 g/l cho ra tỷ lệ nảy mầm và chiều dài rễ, khối lượng hạt là tốt nhất. Nồng độ giữa 2,0 g/l và 5,0 g/l không có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa ∝ = 0,05 . Mặt khác, nếu xét về mặt kinh tế sử dụng nồng độ 2,0g/l sẽ tiết kiệm hơn so với nồng độ 5,0 g/l. Vì vậy dựa trên thí nghiệm chọn 2,0 g/l là nồng độ chitosan bổ sung cho tỷ lệ nảy mầm và chiều dài rễ là tối ưu nhất. Qua đó có thể kết luận rằng tại mẫu chitosan lên men lactic tại nồng độ 2,0 g/l cho tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ và khối lượng hạt là tốt nhất. Và rõ rệt nhất là sự kích thích tăng chiều dài rễ của chitosan lên men lactic. 60
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đối với mẫu chitosan thương phẩm 1 Nồng độ Tỉ lệ hạt nảy mầm Chiều dài rễ Khối lượng hạt chitosan (%) (cm) (g) (g/l) Đối chứng 69,3a ± 2,31 4,13a ± 0,15 0,30a ± 0,01 0,1 73,3ab ± 2,30 4,27 a± 0,06 0,29a± 0,006 0,5 74,7b ± 2,29 4,33a ± 0,05 0,35b ± 0,02 1,0 77,3bc ± 2,31 4,83b ± 0,15 0,36b ± 0,01 2,0 82,7cd ± 4,62 5,87c ± 0,15 0,35b ± 0,01 5,0 81,3d ± 2,31 6,07c ± 0,12 0,36b ± 0,01 Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một cột 90.0 7.0 80.0 6.0 70.0 5.0 60.0 50.0 4.0 tỷ lệ nảy mầm (%) 40.0 3.0 chiều dài rễ (cm) 30.0 tỷ lệ nảy mầm % mầm lệ nảy tỷ 2.0 khối lượng hạt (g) 20.0 1.0 10.0 chiều dài rễ (cm), khối lượng (g) hạt khối lượng rễ (cm), dài chiều 0.0 0.0 0.0 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 nồng độ (g/l) Hình 3.7. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 1 61
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8. Ảnh hưởng của chitosan đến chiều dài rễ của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 1 Dựa vào bảng kết quả bảng 3.8 và hình 3.7 ta thấy rằng tại nồng độ 2,0 g/l; 5,0 g/l cho kết quả tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt là tốt nhất. Giữa nồng độ 2,0 g/l và 5,0 g/l không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê ∝ = 0,05. Do đó để tiết kiệm hơn về mặt kinh tế cho nên chọn 2,0 g/l là nồng độ tốt nhất để kích thích nảy mầm hạt đậu tương. 62
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.9. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đối với mẫu chitosan thương phẩm 2 Nồng độ chitosan Tỉ lệ hạt nảy Khối lượng hạt Chiều dài rễ (cm) (g/l) mầm(%) (g) Đối chứng 69,3a ± 2,31 4,13a ± 0,32 0,29a ± 0,014 0,1 72,0ab ± 4,0 5,37b ± 0,32 0,30a ± 0,010 0,5 73,3ab ± 2,31 5,9 c± 0,10 0,31a ± 0,017 1,0 76,0b ± 4,0 6,20c ± 0,26 0,39b ± 0,02 2,0 82,7c ± 2,31 7,17d ± 0,21 0,43c ± 0,01 5,0 84,0c ± 4,0 7,27d ± 0,25 0,41bc± 0,03 Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một cột 100.0 9.0 90.0 8.0 80.0 7.0 70.0 6.0 60.0 5.0 50.0 tỷ lệ nảy mầm (%) 4.0 40.0 chiều dài rễ(cm) 3.0 30.0 khối lượng hạt(g) tỷ lệ nảy mầm lệ (%)nảy tỷ mầm 2.0 20.0 hạt lượng dài (g)rễ(cm),khối chiều 10.0 1.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 nồng độ (g/l) Hình 3.9. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 2 63
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10. Ảnh hưởng của chitosan đến chiều dài rễ của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 2 Tương tự dựa vào bảng kết quả bảng thấy rằng tại nồng độ 2,0 g/l; 5,0 g/l cho kết quả tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt là tốt nhất . Giữa nồng độ 2,0 g/l và 5,0 g/l không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê ∝ = 0,05. Do đó để tiết kiệm hơn về mặt kinh tế cho nên chọn 2,0 g/l là nồng độ tốt nhất để kích thích nảy mầm hạt đậu tương. Như vậy qua ba thí nghiệm trên ba mẫu chitosan : chitosan lên men lactic, chitosan thương phẩm 1, chitosan thương phẩm 2 đều cho kết quả nồng độ 2,0 g/l là tối ưu nhất, kích hoạt nảy mầm hạt đậu tương là tốt nhất. Và ảnh hưởng rõ rệt hơn cả của chitosan là sự tăng chiều dài rễ. 64
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10. So sánh nồng độ chitosan 2,0g/l giữa mẫu chitosan lên men và mẫu chitosan thương phẩm lên tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt đậu tương. Nồng độ 2,0g/l Mẫu chitosan Tỷ lệ nảy mầm Khối lượng hạt Chiều dài rễ (cm) (%) (g) Chitosan 78,7a ± 2,31 6,93a ± 0,12 0,40a ± 0,01 sinh học Chitosan thương 82,7a ± 4,62 5,87b ± 0,15 0,35b ± 0,01 phẩm 1 Chitosan thương 82,7a ± 2,31 7,17a ± 0,21 0,43c ± 0,01 phẩm 2 Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một cột Qua bảng kết quả xử lý số liệu 3.10 người thực hiện đề tài có thể nhận xét rằng: Tỷ lệ nảy mầm hạt đậu tương giữa mẫu chitosan lên men lactic so với mẫu chitosan thương phẩm không có sự khác biệt về mặt thống kê. Ta thấy chiều dài rễ giữa mẫu chitosan lên men sinh học và chitosan thương phẩm 2 không có sự khác biệt về mặt thống kê với mức ý nghĩa ∝ = 0,05. Bên cạnh đó, khối lượng giữa 3 mẫu chitosan có sự khác biệt với nhau tuy nhiên sự khác biệt ấy không có sự chênh lệch nhiều ( mẫu chitosan lên men lactic chênh lệch 0,05 g so với chitosan thương phẩm 1 và chênh lệch với chitosan thương phẩm 2 là 0,03 g). Từ kết quả thu được có thể nói rằng tại nồng độ 2,0 g/l ở mẫu chitosan lên men lactic cho kết quả tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt ở mức tương đương so với kết quả các mẫu chitosan thương phẩm. 65
Đồ án tốt nghiệp 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng Khảo sát này nhằm mục đích xác định ảnh hưởng màng bao chitosan tới khả năng nảy mầm của hạt đậu phộng. Từ đó đưa ra kết luận về khả năng kích thích sự nảy mầm của chitosan lên hạt đậu phộng. Sau thời gian 7 ngày khảo sát, kết quả ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng được thể hiện qua hình 3.11. Hình 3.11. Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng Kết quả cho thấy rằng, thí nghiệm đều không quan sát được sự nảy mầm của hạt đậu phộng. Tại mỗi nồng độ thí nghiệm chitosan bao hạt đậu phộng đều có hiện tượng nhiễm nấm mốc, nồng độ 2,0 g/l; 5,0 g/l ít nhiễm nấm trên hạt đậu phộng. Nồng độ chitosan càng cao thì làm chậm sự nhiễm nấm trên hạt đậu phộng. 66
Đồ án tốt nghiệp So với kết quả của Bin Zhang, Dong-Feng Wang, Hai-Yan Li, Ying Xu, Li Zhang (2009), phương pháp thử nghiệm đánh giá hoạt động chống Aspergillus flavus của chitosan trên hạt đậu phộng vẫn cho thấy Aspergillus flavus có thể nảy mầm và tăng trưởng bình thường, màng bao chitosan không khống chế được sự ức chế và phát triển của Aspergillus flavus trên hạt đậu phộng. Thí nghiệm không thành công có thể do giai đoạn kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng ở dạng ủ trên môi trường ẩm nên xảy ra hiện tượng nhiễm nấm làm ảnh hưởng đến sự kích hoạt phôi hạt đậu phộng nảy mầm. Hình 3.12. Ảnh huởng của chitosan mẫu chitosan thương phẩm 1 khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng 67
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.13. Ảnh huởng của chitosan thương phẩm 2 tới khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng của mẫu Qua hình 3.12 và hình 3.13 nhận thấy rằng thí nghiệm của mẫu thương phẩm 1 và thương phẩm 2 đều không quan sát được sự nảy mầm của hạt đậu phộng. Tại mỗi nồng độ chitosan các hạt đậu phộng đều có hiện tượng nhiễm nấm mốc. Nồng độ 2,0 g/l; 5,0 g/l ít nhiễm nấm trên hạt đậu phộng. Nồng độ chitosan càng cao thì khả năng giảm số lượng hạt đâu phộng nhiễm nấm là ít nhất. Như vậy, qua ba kết quả thí nghiệm trên ba mẫu chitosan: lên men lactic, thương phẩm 1 và thương phẩm 2 đếu cho thấy nồng độ chitosan càng cao thì sự nhiễm nấm của hạt đậu phộng càng ít và đều không thấy có sự nảy mầm của hạt đậu phộng. 68
Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Thông số của chitosan sau khi deacetylation chitosan 94,8 % thu hồi từ chitin bằng phương pháp lên men lactic cho độ hòa tan khoảng 93,2 %; độ nhớt 1,02 cp; khối lượng phân tử trung bình là 262027 g/mol. Đã nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm Aspergillus flavus cho ra kết quả như sau: Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus flavus của mẫu chitosan lên men lactic cho thấy tại nồng độ chitosan 2,0 g/l có khả năng ức chế nấm tốt nhất với tỷ lệ ức chế 39,89 % tương đương với chitosan thương phẩm. Trong ứng dụng chitosan bao hạt giống, chitosan sinh học có tác dụng kích thích nảy mầm hạt giống đậu tương tại các nồng độ thí nghiệm tốt hơn so với mẫu đối chứng không bao, và tốt nhất ở nồng độ 2,0 g/l; làm tăng tỷ lệ nảy mầm từ 66,7% lên 78,7 %, ảnh hưởng rõ rệt đến kích thích sự tăng chiều dài rễ của hạt giống thêm 1,72 % ( từ 4,02 cm lên 6,93cm); khối lượng hạt nảy mầm lên 1,33% từ 0,3 g đến 0,40 g. Kết quả tương tự với mẫu chitosan thương phẩm. Khi bao hạt giống đậu phộng cho nảy mầm có sự xuất hiện nấm mốc ít nhất ở nồng độ chitosan bao gói là 2,0 – 5,0 g/l. Kết quả tương tự với mẫu chitosan thương phẩm Kiến nghị Nghiên cứu kết hợp với các hóa chất bảo quản khác cho hiệu quả cao hơn trong từng lĩnh vực sản xuất và xuất khẩu. Nghiên cứu thêm về các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tạo màng chitosan lên các loại hạt giống cây trồng. Ứng dụng chitosan để bảo quản hạt giống và các loại quả khác. Nghiên cứu dùng màng chitosan bảo quản các sản phẩm thủy sản như cá, mực, thịt 69
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Lê Nguyễn Đoan Duy, Nguyễn Thị Kim Tuyến, Lương Tố Lan, Nguyễn Công Hà (2014). Nghiên cứu ứng dụng chitosan để ức chế nấm Colletotrichum Gloeosporioides phân lập từ xoài cát hòa lộc bị bệnh thán thư. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số 4, 154-161. [2] Lê Thu Hiền, Lê Thị Lan Oanh (1994). Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và vi lượng đến sinh trưởng và phát triển của mạ lúa CR203. Tạp chí Sinh học, số 2. [3] Nguyễn Thị Huệ, Lâm Ngọc Thụ, Nguyễn Văn Hoen (2001). Nghiên cứu tác dụng của các chất có hoạt tính sinh học cao từ chitin đối với sự nảy mầm hạt thóc giống.Tạp chí Hóa học, số 3, 23 – 26. [4] Nguyễn Hoài Hương, Nguyễn Thị Ngọc Thu (2013). Thu nhận chitin từ vỏ đầu tôm sú bằng phương pháp lên men lactic. Kỷ yếu hội thảo Khoa học khoa MT-CNSH 2013 Ứng dụng Khoa học Công nghệ vì mục tiêu phát triển bền vững, 31/05/2013,TpHCM, 247-260. [5] Võ Thị Mai Hương, Trần Thị Kim Cúc (2012). Nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan oligosaccharadie lên sinh trưởng và năng suất cây lạc giống lạc L14. Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, tập 73,số 4. 125- 134. [6] Lê Thanh Long, Nguyễn Hiền Trang (2014). Nghiên cứu khả năng kháng nấm mốc Aspergillus flavus trên ngô của một số hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên.Tạp chí khoa học trường Đại học Huế, số 6. [7] Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (3/2015). Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản. NXB Nông Nghiệp. [8] Võ Hồng Thi, Thái Văn Nam, Nguyễn Hoài Hương (2014). Thực hành hóa phân tích. Trường Đại học Công Nghệ TpHCM. 70
Đồ án tốt nghiệp [9] Dương Quốc Xuân (2014). Hoàn thiện quy trình thu hồi chitin từ vỏ tôm bằng lên men lactic. Luận văn (Đại học). Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm- Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ TpHCM. Tài liệu tiếng Anh [10] Batool Mahdavi, Asghar Rahimi (2013). Seed priming with chitosan improves the germination and growth performance of ajowan (Carum copticum) under salt stress. EurAsian Journal of BioSciences, Eurasia J Biosci 7, 69- 76 . [11] Bin Zhang, Dong-Feng Wang∗, Hai-Yan Li, Ying Xu, Li Zhang (2009). Preparation and properties of chitosan–soybean trypsininhibitor blend film with anti-Aspergillus flavus activity. Industrial crops and products 29 (2009), 541 – 548. [12] Chatterjee, S., Adhya, M., Guha, A.K., Chatterjee, B.P., 2005. Chitosan from Mucor rouxii: production and physico-chemical characterization.Process Biochemistry 40, 395–400. [13] Dzung NA, Thang NT (2002) Effects of oligoglucosamine prepared by enzyme degradation on the growth of soybean. In: Suchiva VK, Chandrkrachang S, Methacanon P, Peter MG (eds.), Advances in Chitin Science, Bangkok, 463-467. [14] Entsar S.Abdou, Khaled S.A. Nagy, Maher Z. Elsabee (2008). Extraction and characterization of chitin and chitosan from local sources. Bioresource Technology 99 (2008) , 1359–1367. [15] Islem Younes, Sabrine Sellimi, Marguerite Rinaudo, Kemel Jellouli, Moncef Nasri. Influence of acetylation degree and molecular weight of homogeneous chitosans on antibacterial and antifungal activities(2014). International Journal of Food Microbiology,185 (2014), 57 – 63. 71
Đồ án tốt nghiệp [16] Khalid Ziani, Beatriz Ursúa , Juan I. Maté. Application of bioactive coatings based on chitosan for artichoke seed protection. Crop Protection 29 (2010) 853 – 859. [17] Makarova, K.; Slesarev, A.; Wolf, Y.; Sorokin, A.; Mirkin, B.; Koonin, E.;Pavlov, A.; Pavlova, N. et al. (Oct 2006). Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 103 (42): 15611–6. [18] Owen R. Fennema et al (2004).Lactic Acid Bacteria.Food Science and Teachnology. [19] Ravi Kumar, M.N.V., 2000. A Review of chitin and chitosan pplications.Reactive and Functional Polymers 46, 1–27. [20] Rafael de Oliveira Pedro, Mirelle Takaki, Teresa Cristina Castilho Gorayeb, Vanildo Luiz Del Bianchi, Jõao Cláudio Thomeo, Marcio José Tieraa, Vera Aparecida de Oliveira Tieraa (2013). Synthesis, characterization and antifungal activity of quaternary erivatives of chitosan on Aspergillus flavus. Microbiological Research 168 (2013), 50–55. 72
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường sử dụng trong các thí nghiệm A.1. Thành phần môi trường MRS – Broth Glucose 20 g Peptone 10 g Beef extract powder 8,0 g Sodium acetate 5,0 g Yeast extract 4,0 g K2HPO4.3H2O 2,0 g MgSO4.7H2O 0,2 g MnSO4.H2O 0,05 g Triamonium citrate 2,0 g Tween 80 1 ml Nước cất 1000 ml A.2. Thành phần môi trường Potato Dextrose Agar ( PDA) D – glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml 1
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: Xử lý rỉ đường Rỉ đường sau khi thu nhận từ nhà máy đường, 100 ml rỉ đường được thêm vào 20ml 0 H2O và 5 ml H2SO4 đậm đặc. Sau đó gia nhiệt đến 90 C trong bể điều nhiệt trong vòng 20 phút. Chỉnh pH của môi trường lên 6,5 bằng CaO giữ trong 1 giờ. Ly tâm bỏ tủa. Xác định đường khử trong dịch đường. Bảo quản lạnh. Nồng độ 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 mg/ml OD 540nm 0 0,300 0,650 0,994 1,342 1,639 1.8 y = 1.6664x - 0.0124 1.6 R² = 0.9993 1.4 1.2 1 Series1 0.8 Linear (Series1) 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 -0.2 Từ kết quả đường chuẩn glucose ta tính được lượng đường trong 1ml rỉ đường là 0,465g. Tính được lượng rỉ đường cần cho vào là 215,05 ml rỉ đường tương ứng 20% rỉ đường so với đầu tôm. 2
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: Kết quả đường kính tản nấm Aspergillus flavus của chitosan trên môi trường PDA có bổ sung chitosan bằng phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm ở các nồng độ 0,1 g/l; 0,5 g/l; 1,0g/l; 2,0g/l; 4,0 g/l tại mức pH = 5,5 pH = 5,5 Nồng độ chitosan ĐC 0,1 g/l 0,5 g/l 1,0 g/l 2,0 g/l 4,0 g/l ĐK tản nấm (cm) 36,2±3,2 24,8±0,3 24,5±0,1 21,7±0,6 24,6±1,1 30,3±1,7 Mẫu 3NSC chitosan thương ĐKtản phẩm 1 nấm (cm) 68,9±1,0 45,7 ± 0,3 44,2 ± 0,3 42,2 ± 0,2 41,7±0,3 40,7± 0,7 7NSC ĐK tản Mẫu nấm (cm) 35,3±0,6 25,2±0,3 25,1±0,1 23,3±0,3 25,9±1,8 28,0±0,8 chitosan 3NSC thương ĐK tản 39,9± phẩm 2 nấm (cm) 69,4±1,0 45,2 ± 0,3 44,9 ± 0,1 40,8 ±0,8 40,5±0,5 0,12 7NSC ĐKtản Mẫu nấm (cm) 45,3±0,5 34,2±0,3 31,5±0,5 35,2±2,3 39,2±1,2 39,6±1,7 chitosan 3NSC lên men ĐK tản sinh học nấm (cm) 68,9 ± 1,0 45,7 ± 0,2 45,1 ± 0,2 43,8 ± 0,8 41,7±0,3 40,7± 0,7 7NSC 3
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: : Kết quả xử lý số liệu Statgraphics D1. So sánh một số đặc tính, tính chất vật lý chitosan từ chitin theo phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm ANOVA Table for DDA by Mau chitosan Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 14.4222 2 7.21111 146.50 0.0000 groups Within 0.295334 6 0.0492224 groups Total (Corr.) 14.7176 8 Method: 95.0 percent LSD Mau Count Mean Homogeneous chitosan Groups 1 3 94.785 X 2 3 3 97.435 X 7 2 3 97.504 X 2 ANOVA Table for MW by Mw.MAU Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 1.48523E11 2 7.42614E1 627.92 0.0000 groups 0 4
Đồ án tốt nghiệp Within groups 7.09597E8 6 1.18266E8 Total (Corr.) 1.49232E11 8 Multiple Range Tests for MW by Mw.MAU Method: 95.0 percent LSD Mw.MAU Count Mean Homogeneous Groups 1 3 262027. X 2 3 406441. X 3 3 576350. X ANOVA Table for do nhot by mau Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 4.56995 2 2.28498 469.35 0.0000 groups Within groups 0.0292101 6 0.00486835 Total (Corr.) 4.59916 8 Multiple Range Tests for do nhot by mau Method: 95.0 percent LSD mau Count Mean Homogeneous Groups 1 3 1.02108 X 2 3 1.72431 X 3 3 2.75619 X 5
Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for dohoatan by mau Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 30.0361 2 15.0181 32.23 0.0006 groups Within 2.79599 6 0.465999 groups Total (Corr.) 32.8321 8 Multiple Range Tests for dohoatan by mau Method: 95.0 percent LSD mau Count Mean Homogeneous Groups 2 3 87.6089 X 1 3 90.8922 X 3 3 91.8837 X D2. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến khả năng ức chế nấm của mẫu chitosan lên men sinh học và chitosan thương phẩm ANOVA Table for %ucchenam tp1 by nong do Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 83.3922 4 20.848 29.22 0.0000 groups Within groups 7.13465 10 0.713465 Total (Corr.) 90.5268 14 6
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for %ucchenam tp1 by nong do Method: 95.0 percent LSD nong Count Mean Homogeneous do Groups 0.1 3 34.8459 X 0.5 3 36.2885 X 1 3 39.0784 X 2 3 39.7969 XX 4 3 41.2969 X ANOVA Table for %ucchenam tp2 by nong do Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 175.282 4 43.8205 111.36 0.0000 groups Within groups 3.93498 10 0.393498 Total (Corr.) 179.217 14 Multiple Range Tests for %ucchenam tp2 by nong do Method: 95.0 percent LSD nong Count Mean Homogeneous do Groups 0.1 3 34.4666 X 0.5 3 35.2785 X 1 3 41.1926 X 2 3 41.6688 XX 7
Đồ án tốt nghiệp 4 3 42.4783 X ANOVA Table for % ucchenamthinghiem by nong do Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 110.666 4 27.6666 31.71 0.0000 groups Within groups 8.72382 10 0.872382 Total (Corr.) 119.39 14 Multiple Range Tests for % ucchenamthinghiem by nong do Method: 95.0 percent LSD nong Count Mean Homogeneous do Groups 0.1 3 33.6448 X 0.5 3 34.6122 X 1 3 37.1331 X 2 3 39.8881 X 4 3 40.4158 X 8