Đồ án Tối ưu hóa quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp giấm, khảo sát khả năng kháng oxy hóa và độ bền của dịch chiết anthocyanin

Nội dung text: Đồ án Tối ưu hóa quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp giấm, khảo sát khả năng kháng oxy hóa và độ bền của dịch chiết anthocyanin

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT ANTHOCYANIN TỪ HOA BỤP GIẤM, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ĐỘ BỀN CỦA DỊCH CHIẾT ANTHOCYANIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S Chu Thị Bích Phượng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hồng Cúc MSSV: 1151110077 Lớp: 11DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2015
2. Đồ án tốt nghiệp
3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Chúng tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của chúng tôi được thực hiện dựa trên cơ sở lý thuyết, kiến thức và khảo sát thực tế dựa theo sự hướng dẫn của Th.S Chu Thị Bích Phượng. Các số liệu sử dụng trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu do chúng tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kì nghiên cứu nào khác. Một lần nữa chúng tôi xin khẳng định sự trung thực về lời cam đoan trên, nếu có bất kì sự sao chép nào chúng tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. 1
4. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, chúng tôi muốn bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến Th.S Chu Thị Bích Phượng đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu để chúng tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này. Chúng tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong hội đồng bảo vệ đã dành thời gian xem xét và cho những nhận xét quý báo về kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Tiếp theo, chúng tôi chân thành cảm ơn tất cả các quý thầy cô trường Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô thuộc khoa Công nghệ sinh học, thực phẩm, môi trường đã hết lòng truyền đạt cho chúng tôi những kiến thức quý báo và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi học tập và nghiên cứu trong suốt những năm vừa qua. Xin được gửi lời cảm ơn đến Th.S Huỳnh Văn Thành phụ trách tại Trung tâm thí nghiệm hóa sinh trường Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng hỗ trợ chúng tôi trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận án tại trung tâm. Một lần nữa chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã động viên giúp chúng tôi hoàn thành tốt đề tài này. Cuối cùng là những lời cảm ơn đến các bạn là thành viên lớp 11DSH01 và 11DSH02 cũng như tất cả các bạn thực hiện đồ án tại Trung tâm thí nghiệm hóa sinh đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và hỗ trợ để chúng tôi có thể hoàn thành tốt đồ án này. 2
5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC 3 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 7 DANH MỤC CÁC BẢNG 8 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH 9 MỞ ĐẦU 9 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 13 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY BỤP GIẤM 13 Tên gọi 13 Phân loại thực vật 13 Hình thái, đặc điểm sinh trưởng 14 Phân bố 15 Giá trị sử dụng của cây bụp giấm 15 Thành phần hóa học của hoa bụp giấm 17 1.2. Tổng quan về anthocyanin 20 Giới thiệu 20 Cấu trúc hóa học của anthocyanin 20 Tính chất của anthocyanin 21 Sự phân bố của anthocynin 22 Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ màu của anthocyanin 23 3
6. Đồ án tốt nghiệp Vai trò của hợp chất anthocyanin 28 1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin 30 Phương pháp DPPH (Scavenging ability ability towards DPPH radicals) 30 Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity) 32 Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential) 32 Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power) 33 Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) 33 Phương pháp polyphenol tổng 33 1.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 34 Trên thế giới 34 Trong nước 35 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37 2.1. Thời gian và địa điểm. 37 2.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 37 Vật liệu 37 Hóa chất và thiết bị 38 2.3. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 39 Sơ đồ nghiên cứu 39 Nội dung 1: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly và thu nhận anthocyanin từ đài hoa bụp giấm 40 4
7. Đồ án tốt nghiệp Nội dung 2: Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết anthocyanin bằng phương pháp DPPH 45 Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của dịch chiết anthocyanin. 45 Phương pháp nghiên cứu 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1. Nội dung 1: Kết quả khảo sát các yêu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly và thu nhận anthocyanin từ đài hoa bụp giấm 53 Thí nghiệm 1: Kết quả khảo sát hệ dung môi thích hợp cho quá trình tách chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm. 53 Thí nghiệm 2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu dung môi đến quá trình tách chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm. 56 Bảng 3.2. Hàm lượng anthocyanin thu được khi khảo sát ở các tỷ lệ nguyên liệu dung môi tách chiết khác nhau Error! Bookmark not defined. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc trong quá trình tách chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm. 58 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng trích ly anthocyanin từ bụp giấm. 60 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng trích ly anthocyanin 63 3.2. Nội dung 2: Kết quả xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết anthocyanin bằng phương pháp DPPH. 64 3.3. Nội dung 3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến độ bền của anthocyanin. 68 5
8. Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của dịch chiết anthocyanin 68 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian gia nhiệt đến độ bền của dịch chiết anthocyanin. 70 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích anthocyanin sau khi gia nhiệt. 73 3.4. Bước đầu ứng dụng đài hoa bụp giấm trong sản xuất trà túi lọc 75 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 4.1. Kết luận 78 4.2. Kiến nghị 78 6
9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 7
10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số loại anthocyanin trong một số loại thực vật phổ biến. 22 Bảng 3.1 Hàm lượng anthocyanin thu đươc khi tách chiết ở các hệ dung môi khác nhau 53 Bảng 3.2 Hàm lượng anthocyanin thu được khi khảo sát ở các tỷ lệ nguyên liệu dung môi tách chiết khác nhau. 56 Bảng 3.3 Hàm lượng anthocyanin thu được khi khảo sát ở các thời gian lắc khác nhau 58 Bảng 3.4 Hàm lượng anthocyanin thu được khi tách chiết ở các khoảng pH khác nhau. 60 Bảng 3.5 Hàm lượng anthocyanin thu được khi trích ly ở các khoảng thời gian khác nhau. 63 Bảng 3.6 Bảng giá trị nồng độ phần trăm bắt gốc DPPH của mẫu anthocyanin. 65 Bảng 3.7 Giá trị IC50 của một số mẫu thực vật 67 Bảng 3.8 Hàm lượng anthocyanin thu được ở các khoảng nhiệt độ khác nhau . 68 Bảng 3.9 Hàm lượng anthocyanin thu được ở các khoảng thời gian gia nhiệt khác nhau. 71 Bảng 3.10 Khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết anthocyanin sau khi gia nhiệt. 73 . 8
11. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình dạng, đặc điểm của cây bụp giấm. 14 Hình 1.2 Đài hoa bụp giấm sau khi được tách khỏi hạt 19 Hình 1.3 Cấu trúc của một số anthocyanin tự nhiên. Các anthocyanin tương ứng luôn được glycosyl hóa ở nhơm hydroxy C-3 21 Hình 1.4 Cấu trúc chuyển hóa của anthocyanin trong nước 24 Hình 1.5 ảnh hưởng của pH lên tốc độ thủy phân của quả dâu được đun nóng tại 450C trong oxygen và nitrogen 25 Hình 1.6 Sự biến tính của anthocyanin 3,5-di glucoside tại pH 3,7. 26 Hình 1.7 Sự biến tính của anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol. 26 Hình 1.8 Phản ứng ngưng tụ của 27 Hình 1.9 Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin . 28 Hình 1.10 Phản ứng giữa DPPH với một chất chống oxy hóa 31 Hình 2.1 Bột hoa bụp giấm sau khi được nghiền mịn và rây. 37 Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin thu được khi trích ly bằng các hệ dung môi khác nhau. 54 Hình 3.2 Màu sắc của dịch chiết anthocyanin ở các hệ dung môi khác nhau 55 Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin thu được khi trích ly bằng các tỷ lệ nguyên liệu/100ml dung môi khác nhau. 57 Hình 3.4 Màu sắc của dịch trích anthocyanin khi khảo sát các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi khác nhau. 58 9
12. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5 Mẫu dịch chiết anthocyanin được khảo sát ở các thời gian lắc khác nhau. 59 Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin thu được khi lắc ở các khoảng thời gian khác nhau. 59 Hình 3.7 Màu sắc của dịch chiết khi trích ly ở các pH = 1 và pH = 4. 61 Hình 3.8 Màu sắc của dịch chiết khi trích ly ở các pH = 7 và pH = 9. 62 Hình 3.9Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin thu được khi trích ly ở các khoảng pH khác nhau 62 Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin thu được ở các khoảng thời gian khác nhau. 64 Hình 3.11 Dịch trích anthocyanin khi tiến hành đo DPPH 65 Hình 3.12 Sự đổi màu của dịch trích anthocyanin khi cho dung dịch DPPH vào. 66 Hình 3.13 Đồ thị thể hiện sự liên quan giữa nồng độ anthocyanin và khả năng kháng oxy hóa 66 Hình 3.14 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin khi gia nhiệt ở các khoảng nhiệt độ khác nhau. 69 Hình 3.15 Dịch trích anthocyanin khi gia nhiệt ở 700C 70 Hình 3.16 Hàm lượng anthocyanin khi gia nhiệt ở các thời gian khác nhau. 72 Hình 3.17 Dịch trích anthocyanin khi gia nhiệt ở 700C trong 5 phút. 72 Hình 3.18 Sơ đồ tóm tắt kết quả thí nghiệm 75 Hình 3.19 Sơ đồ quy trình bước đầu sản xuất trà túi lọc từ đài hoa bụp giấm. . 76 10
13. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Song song với sự phát triển của khoa học thì đời sống của con người ngày càng được nâng cao và đặc biệt sức khỏe luôn là vấn đề được quan tâm hàng đầu, con người ngày càng muốn hướng đến những loại thực phẩm hoặc dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên và mang lại hiệu quả tối ưu cho sức khỏe người sử dụng. Chính vì vậy, việc chiết xuất các hợp chất chống oxy hóa từ thiên nhiên đang ngày càng được quan tâm. Anthocyanin là chất chống oxy hóa rất phổ biến tồn tại hầu hết trong các thực vật bậc cao và được tìm thấy trong một số loại rau, hoa, quả, hạt có màu đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, đài hoa bụp giấm, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ, Trong số đó đài hoa bụp giấm là nguyên liệu có hàm lượng anthocyanin khá cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy bụp giấm không những là chất tạo màu tốt mà còn có tác dụng tốt đối với sức khỏe vì thế nên nó được sử dụng rộng rãi để làm thuốc, và điều chế các sản phẩm thực phẩm như trà, mứt, rượu, nước cốt quả. Đặc biệt đài hoa bụp giấm là là một loại dược liệu rất có lợi cho sức khỏe. Tính theo hàm lượng chất khô đài hoa bụp giấm chứa khoảng 1,5% anthocyanin, axit hữu cơ khoảng 15 – 30%, các vitamin A, B1, B2, C, E, F và nhiều loại khoáng chất như sắt, đồng, canxi, magiê, kẽm Đài hoa bụp giấm chứa một loại chất chống oxy hóa rất hiếm là flavonoid lên tới 12%. Chất này oxy hóa chậm hay ngăn cản một cách hữu hiệu quá trình oxy hóa của các gốc tự do, có thể là nguyên nhân khiến các tế bào hoạt động khác thường. Từ đó giúp làm chậm quá trình lão hóa. Cho đến nay, việc nghiên cứu về cây bụp giấm, đặc biệt là anthocyanin từ cây bụp giấm ở Việt Nam còn hạn chế. Đặc biệt, các nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết anthocyain từ hoa bụp giấm cũng như khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của dịch chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm vẫn chưa 11
14. Đồ án tốt nghiệp được thực hiện. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Tối ưu hóa quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp giấm, khảo sát khả năng kháng oxy hóa và độ bền của dịch chiết anthocyanin”. 2. Mục tiêu của đề tài - Tối ưu hóa quá trình tách chiết anthocyanin và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin từ đó tìm ra điều kiện chiết tách phù hợp nhất để thu nhận được lượng lớn anthocyanin từ đài hoa bụp giấm. - Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin trích ly từ đài hoa bụp giấm - Bước đầu ứng dụng đài hoa bụp giấm trong sản phẩm trà túi lọc, tạo cơ sở khoa học ban đầu cho các nghiên cứu về sau. 3. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly và thu nhận anthocyanin từ đài hoa bụp giấm. - Nội dung 2: Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết anthocyanin bằng phương pháp DPPH. - Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của dịch chiết anthocyanin. 4. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết đài hoa bụp giấm. Phương pháp xác định tính kháng oxy hóa của anthocyanin. 12
15. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY BỤP GIẤM Tên gọi Tên khoa học: Hibiscus sabdariffa Linn Tên tiếng Anh: Roselle Tên thường gọi: Atiso đỏ, bụp giấm, hoa vô thường, hoa lạc thần, lạc tể quỳ, mai côi gia, đay nhật, cây me chua, me chua đỏ. Tên đồng nghĩa: Abelmoschus cruentus, Hibiscus digitatus, Hibiscus gossypiifolius, Hibiscus sanguineus, Sabdariffa rubra. Phân loại thực vật Theo phân loại thực vật học, cây bụp giấm được sắp xếp theo trình tự: - Giới (kingdom): thực vật (Plantae) - Không được xếp hạng: cây hạt kín (Angiosperm) - Không được xếp hạng: Eudicots - Không được xếp hạng: Rosids - Bộ (order): Malvales - Họ (family): Bông (Malvaccae) - Chi (genus): Dâm bụt (Hibiscus) - Loài (Species): Sabdariffa - Binomial name: Hibiscus Sabdariffa 13
16. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Hình dạng, đặc điểm của cây bụp giấm. Hình thái, đặc điểm sinh trưởng Bụp giấm là loại cây sống một năm thân thảo dạng thẳng, rậm rạp, mọc dạng bụi nhỏ, với thân mịn gần như nhẵn, hình trụ, cao 1,5 – 2m, có rễ cái ăn sâu vào đất, thân phân nhánh gần gốc thân có màu xanh lá cây hoặc đỏ thẫm, phần đài hoa màu vàng hoặc đỏ nhạt có thể ăn được (Brouk, 1975; Purseglove, 1986; Morton, 1987). Hoa đơn độc, mọc gần nách có màu vàng hoặc màu da bò và chuyển sang màu hồng khi tàn lụi vào cuối ngày, đường kính hoa từ 8 - 10cm. Tràng hoa màu vàng hồng hay tía có khi màu trắng. Lá hình trứng, mép có răng, lá có màu xanh với các gân đỏ và cuống lá dài khoảng 7,5 – 12,5cm. Quả nang hình trứng, có lông nhung và có màu xanh lá khi chưa trưởng thành, mỗi quả được chia thành 5 van, với mỗi van có chứa từ 3- 4 hạt, các hạt chuyển sang màu nâu và tách ra khỏi van khi trưởng thành và khô. Cây ra hoa từ tháng 7 đến tháng 10 hằng năm (Omobuwajo và cộng sự, 2000). Chu kì sinh trưởng và phát triển của cây bụp giấm từ 4 - 6 tháng, là một trong những loài hoa được trồng phổ biến nhất hiện nay, được trồng thành công ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, sinh trưởng tốt nhất ở môi trường đất tơi xốp, tốt nhất là 14
17. Đồ án tốt nghiệp một phần đất thịt pha với cát và một ít mùn, tuy nhiên nó vẫn thích ứng tốt với nhiều loại đất đồi xấu khô cằn khác nhau nó có hơn 300 loài phân bố khắp thế giới. Bụp giấm có thể chịu nóng và khí hậu ẩm ướt với nhiệt độ ban đêm dưới 21 độ, và dễ chết khi nhiệt độ quá lạnh, băng giá và sương mù (Robert, 2005). Phân bố Bụp giấm là loài cây trồng rất phổ biến, nó có thể được tìm thấy ở tất cả những vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới như: Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Việt Nam, Sudan, Philippin, Mexico, Indonesia (Mat Isa và cộng sự, 1985). Cây bụp giấm có nguồn gốc từ Angola, sau lan sang Ấn Độ, Malaysia, Philppin, Indonexia, Thái Lan, Trung Mỹ và Bắc Phi và hiện đang là một loại cây trồng thương mại lớn của Malaysia (Abu – Tarboush và cộng sự, 1997). Ở nước ta, cây được trồng thử nghiệm để phủ đất trống, đồi trọc cho kết quả ở Hà Tây, Hòa Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên, Ba Vì và một số tỉnh sau này như Bà Rịa Vũng Tàu, Đồng Nai. Tuy nhiên, cây được trồng thành công ở Việt Nam chủ yếu thuộc các tỉnh miền Trung, thích hợp với đất đồi núi và trung du. Nó được trồng xen với các loại cây trồng chủ lực khác như lúa, mè, ngô, đậu và không đòi hỏi phải chăm sóc kĩ. Giá trị sử dụng của cây bụp giấm Theo các nhà khoa học, hoa bụp giấm có rất nhiều tác dụng dược lý có ích cho sức khỏe, hiện nay nó được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm cũng như trong ngành dược phẩm, cụ thể như sau: Hạ huyết áp: kết quả nghiên cứu của Herrera và cộng sự (Phytomedicine, 2004), cho thấy khi uống 10g đài hoa bụp giấm khô hãm với 519ml nước nóng mỗi ngày trước bữa sáng liên tục bốn tuần, huyết áp tâm thu giảm 11% và huyết áp tâm trương giảm 12,5%, tương đương với bệnh nhân đối chứng uống Captoril liều 50mg/ngày. 15
18. Đồ án tốt nghiệp Bảo vệ gan: dịch chiết nước và anthocyanin (200mg/kg) của đài hoa bụp giấm làm giảm men gan ALS, AST trên bệnh nhân rối loạn chuyển hóa. Dịch chiết ethanol cũng làm giảm đáng kể peroxide lipid trên mô hình hoại tử gan bằng carbon tetracholorid (Dahiru và cộng sự, 2003). Hạ đường huyết: bụp giấm có khả năng ức chế alpha-glucoside và alpha- amylase, hai enzyme liên quan mật thiết đến chuyển hóa nhóm bột đường (carbohydrate) của cơ thể (Ademiluyui, J Med Food, 2012). Trên mô hình tăng đường huyết bằng streptozotocin hoặc alloxan, uống 100 - 200mg/kg/ngày, nồng độ glucose máu giảm 60 - 65% (Peng và JAgric Food Chem, 2011; Farombi, Fundam Clin Pharmacol, 2007). Hạ mỡ máu: khá nhiều nghiên cứu thực hiện trên các dạng chế phẩm khác nhau từ bụp giấm (đài hoa khô, dịch chiết cồn, viên nang, trà), thời gian theo dõi từ 1 - 3 tháng, cho thấy bụp giấm thể hiện tác dụng giảm cholesterol toàn phần (7,6 - 26%), giảm triglyceride (23 - 48%), giảm LDL-C (8 - 32%), tăng HDL-C (10 - 16,7%) giảm cholesterol trong máu, có tác dụng chống viêm, sưng, tăng cường chức năng tiêu hóa. Chống oxy hóa bảo vệ tế bào cơ thể, chống sự oxy hóa và các gốc tự do bảo vệ tế bào. Sửa đổi những đột biến gen, ngăn ngừa ung thư, nâng đỡ chức năng gan, mật, hạn chế sự béo phì do tích tụ mỡ trong máu, bảo vệ thành mạch thay đổi thành phần nước tiểu, góp phần ngăn ngừa và làm giảm sỏi thận. Ở Ai Cập và Sudan, hoa bụp giấm được sử dụng như là thức uống giúp làm giảm nhiệt độ cơ thể, điều trị tim mạch. Trong y học dân gian Châu Phi, người ta sử dụng hoa bụp giấm để trị chứng chống co thắt, lợi tiểu và thuốc trừ giun sán. Các ứng dụng khác được sử dụng rộng rãi ở Bắc Phi bao gồm: dùng hoa bụp giấm để trị ho và đau họng, trong khi đó bột lá được dùng để trị vết thương ngoài da. Ngoài ra, cây bụp giấm có thể dùng để làm cây hoa cảnh hoặc có thể sử dụng để làm thảo dược và thực phẩm chức năng. Cây bụp giấm dễ trồng bằng hạt, thích hợp 16
19. Đồ án tốt nghiệp với điều kiện khí hậu nước ta, có thể trồng trong các vườn gia đình để lấy đài hoa làm nước uống và làm thuốc. Thành phần hóa học của hoa bụp giấm Hoa bụp giấm là một loại cây dược liệu giàu dinh dưỡng. Tính theo hàm lượng chất khô bụp giấm chứa hàm lượng anthocyanin khoảng 1,5%, acid hữu cơ khoảng 15 - 30%, các vitamin A, B1, B2, C, E, F và nhiều loại khoáng chất như sắt, đồng, canxi, magiê, kẽm, photpho, Thành phần dinh dưỡng chủ yếu được chứa trong đài hoa. 1.1.6.1 Các hợp chất chủ yếu trong hoa bụp giấm Hợp chất anthocyanin: anthocyanin mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác nhau theo độ pH như xanh, hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian. Anthocyanin trong đài hoa bụp giấm gồm cyanidin-3-sambubiosid, cyaniding-3- glucoside, delphinidin-3-sambubiosid, delphidin-3-glucoside và một ít sắc tố khác. Ngoài ra, còn có dephinidin là athocyanin mất hết nhóm đường gọi là anthocyadin hay aglycon. Hibiscin: Hibiscin đã được xác định có sắc tố chủ yếu là daphniphylline. Ngoài ra còn có các lượng nhỏ myrtillin (delphinidin-3-monoglucoside), chrysanthenin (cyannidin-3-monoglucoside) và delphinidin. Chất hibiscin có trong đài hoa được xác định có tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn, kháng nấm, chống độc Gossypetin: Gossypetin là một flavonol, một loại flavonoid. Được phân lập từ hoa và đài hóa bụp giấm. Gossypetin có tính kháng khuẩn mạnh. Quercetin: Quercerin được biết đến như một hoạt chất có khả năng chống oxy hóa mạnh, có tác dụng tốt đối với bệnh xơ vữa động mạch, ức chế tăng tính thấm thành mạch, làm bền vững thành mạch. 17
20. Đồ án tốt nghiệp Các acid hữu cơ  Acid protocatechuic Acid protocatechuic là một acid dihydroxybenzoic, một loại acid phenolic. Acid protocatechuic có tác dụng hỗn hợp lên các tế bào bình thường và ung thư, có tác dụng chống oxy hóa cao, kháng nấm, tăng cường sức đề kháng nội sinh chống lại nấm.  Acid ascorbis (vitamin C) Vitamin C, tên hóa học là acid ascorbic có rất nhiểu trong các loại thực vật. Vitamin C được hấp thụ chủ yếu ở ruột non và tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa quan trọng trong cơ thể. Giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sức đề kháng chống nhiễm khuẩn và chống oxy hóa (khử các gốc tự do).  Aicd citric Acid citric là một chất bảo quản tự nhiên. Trong hóa sinh học, nó là một tác nhân trung gian hóa học quan trọng và vì thế nó xuất hiện gần như ở mọi sinh vật.  Acid malic Acid malic là một hợp chất hữu cơ thuộc loại acid dicaboxylic. Tinh thể không màu, rất háo nước nên dễ tan trong nước và ethanol.  Acid tartaric Aicd tartaric là tinh thể không màu, tan tốt trong nước, acid tartaric có tác dụng tạo hương vị chua tương hỗ với các chất có tác dụng chống oxy hóa nên được xem như là một chất chống oxy hóa. 1.1.6.2 Các thành phần hóa học trong đài hoa bụp giấm Đài hoa là bộ phận quan trọng nhất được hầu hết các nhà máy khai thác và thu nhận, hoa bụp giấm sau khi được thu hoạch được loại bỏ các hạt và cánh hoa chỉ lấy phần thịt đài. Màu đỏ từ đài hoa và hương vị độc đáo của bụp giấm làm cho các sản 18
21. Đồ án tốt nghiệp phẩm thực phẩm có giá trị và tăng tính cảm quan cho sản phẩm (Tsai và cộng sự, 2002). Ở phương Tây, các đài hoa tươi được sử dụng để làm rượu vang, mứt, sirô, galetin, đồ uống, bánh pudding và bánh ngọt, ngoài ra đài hoa khô còn được sử dụng để làm chè, thạch, mứt, kem, bơ, bánh nướng, nướt sốt, bánh và các món tráng miệng khác. Đài hoa cũng được sử dụng phổ biến ở Tây Ấn để tạo hương vị và là thành phần chính trong “rum”. Hình 1.2 Đài hoa bụp giấm sau khi được tách khỏi hạt. Không chỉ có ứng dụng trong thực phẩm, đài hoa bụp giấm còn được sử dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm để làm giảm các triệu chứng của viêm phế quản và ho, điều trị tăng huyết áp, tiêu chảy (Chewonarin và cộng sự, 1999). Đài hoa rất giàu vitamin C, được sử dụng để sản xuất các loại nước ép. Theo nghiên cứu (Duke và cộng sự, 1984) cho thấy trong 100g đài hoa tươi chứa 84,5% độ ẩm, 49 calo, 1,9g prôtêin, 0,1g chất béo, 12,3g carbohydrate, 2,3g chất xơ, 1,2g tro 2,85mg vitamin D, 0,04mg vitamin B1, 0,6mg vitamin B2 1,72mg canxi, 57mg sắt, 300mg carotene tương đương, 14mg acid ascorbic/100g và 0,5mg vitamin B phức tạp, ngược lại trong đài hoa khô chứa một lượng cao acid ascorbic khoảng 280 – 360mg/100g (Mat Isa, 1985). 19
22. Đồ án tốt nghiệp Điều này cho chúng ta thấy rằng, đài hoa bụp giấm có chứa có chứa một hàm lượng acid ascorbic cao hơn cam và ổi (Tee và cộng sự, 1997). Theo Morton (1987), trong đài hoa bụp giấm khô chứa các flavonoid gosypetine và daretine, các sắc tố như: anthocyanin, hibiscin, cyaniding và delphinidin. Các anthocyanin là sắc tố chủ yếu tạo nên màu đỏ cho đài hoa bụp giấm và là chất tạo màu tốt trong các loại nước trái cây được chiết xuất từ thiên nhiên, nó cũng là một nguồn tiềm năng của các thành phần chống oxy hóa tốt (Tsai và Ou, 1996). Ngoài ra, các nghiên cứu khác cũng cho rằng đài hoa bụp giấm chứa hàm lượng vitamin C nhiều gấp ba lần so với nho đen (Ribes- nigrum L., 1990) và hơn chín lần so với cam quýt (Citrus Sinensis L, 1989). 1.2. Tổng quan về anthocyanin Giới thiệu Các anthocyanin hiện thuộc nhóm các chất màu tự nhiên tan trong nước lớn nhất trong giới thực vật. Anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc khác nhau như hồng, đỏ, cam, và các gam màu trung gian. Các anthocyanin khi mất hết các nhóm đường được gọi là anhthocyanin hay aglycon. Mỗi anthocyanin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Vì thế lượng anthocyanin lớn hơn anthocyanidin từ 15 - 20 lần. Cấu trúc hóa học của anthocyanin Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid, có khả năng hòa tan trong nước và chứa trong các không bào. Về bản chất, các anthocyanin là những hợp chất glucoside của dẫn xuất polyhydroxy và polymethoxy của 2-phenylbenzopyrylium hoặc muối flavylium. Cho đến nay, người ta đã xác định được 18 loại aglycon khác nhau, trong đó có 6 loại phổ biến nhất là pelargonidin, cyaniding, delphinidin, peonidin, pentunidin và maldivin. 20
23. Đồ án tốt nghiệp Trong tự nhiên, anthocyanin rất hiếm gặp khi ở trạng thái tự do. Nhóm hydroxyl tự do ở vị trí C-3 làm cho phân tử anthocyanin trở nên không ổn định và làm giảm khả năng hòa tan của nó so với anthocyanin tương ứng. Vì vậy, sự glycosyl hóa luôn diễn ra, đầu tiên ở vị trí nhóm 3-hydroxy. Nếu có thêm một phân tử đường nữa, vị trí tiếp theo bị glycosyl hóa thường gặp nhất là ở C-5. Ngoài ra, sự glycosyl hóa còn có thể gặp ở các vị trí C-7, C-3’, C-5’. Hình 1.3 Cấu trúc của một số anthocyanin tự nhiên. Các anthocyanin tương ứng luôn được glycosyl hóa ở nhơm hydroxy C-3 Tính chất của anthocyanin Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Anthocyanin hòa tan tốt trong nước và trong dịch bão hòa. Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, các chất màu và nhiều yếu tố khác, khi tăng số lượng nhóm OH trong vòng benzene thì màu xanh càng đậm. Mức độ metyl hóa các nhóm OH ở vòng benzene càng cao thì màu càng đỏ. Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít. Các anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường: • Khi pH > 7 các anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các anthocyanin có màu đỏ. 21
24. Đồ án tốt nghiệp • Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ. • Ở pH = 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng bazo cacbinol hay chalcon không màu • Ở pH = 7 - 8 anthocyanin về lại dang bazo quinoidal anhydro màu xanh Màu sắc của anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ ở trên polysaccharide. Khi đun nóng lâu các anthocyanin có thể bị phá hủy và mất màu đặc biệt là các anthocyanin của dâu tây, anh đào, củ cải. Ngược lại anthocyanin của phúc bồn tử đen không thay đổi. Nhìn chung khi gia nhiệt các chất màu đỏ dễ bị phá hủy, còn chất màu vàng khó bị phá hủy hơn. Sự phân bố của anthocynin Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những thực vật có hoa, phần lớn nằm ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loài thực vật này, anthocyanin được tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế nào nằm bên ngoài như biểu bì. Các hợp chất anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài và trong nhiều giống thực vật thường có trong những loại rau quả có màu đỏ, xanh và tím như: dâu tây, bắp cải , nho Bảng 1.1 Một số loại anthocyanin trong một số loại thực vật phổ biến. Cây Anthocyanin Bắp cải tím Rubrobraxinin Cúc tây Pelargonin Hoa hồng Xianin Quả anh đào Ceraxianin Quả việt quất Idanin Quả nho Enin Hoa cẩm quỳ Malvin Hoa mẫu đơn Peonin 22
25. Đồ án tốt nghiệp Hoa anh thảo Hirxutin Hoa bụp giấm Cyanidin, peonidin, mono- và biosides Đậu nành (vỏ) Cyanidin, peonidin Củ hành đỏ Cyaniding-3-glucoside, 3-galactoside, 3-diglucoside và 3-laminarriobioside, peonidin-3-glucoside Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ màu của anthocyanin So với đa số các chất màu thiên nhiên, anthocyanin là chất màu có độ bền kém hơn, nó chỉ thể hiện tính bền trong môi trường acid. Ngoài ra, nó có thể bị phân hủy tạo thành dạng không màu và sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy có dạng màu nâu cộng với những sản phẩm không tan. Độ bền của các anthocyanin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cấu trúc hóa học của anthocyanin, pH, nhiệt độ, sự có mặt của các chất đồng sắc tố, ion kim loại, oxy, acid ascorbic, SO2, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phẩm biến tính của chúng. Vì vậy, nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin là điều cần thiết trước khi ứng dụng nó như một chất màu thực phẩm. 1.2.5.1 Cấu trúc  Cấu trúc chuyển hóa Trong môi trường nước các anthocyanin tự nhiên giống như chất chỉ thị pH. Đỏ ở pH thấp, đỏ xanh ở pH trung gian và không màu ở pH cao. 23
26. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4 Cấu trúc chuyển hóa của anthocyanin trong nước. Khi pH < 2,0, các anthocyanin tồn tại chủ yếu ở dạng cation flavylium màu đỏ hoặc màu vàng. Khi pH tăng sự mất proton xảy ra nhanh thành dạng quinononidal màu xanh dương hoặc màu đỏ. Dạng quinononidal thường tồn tại như hỗn hợp vì pKa của nhóm OH ở vị trí 4’,7 và 5 là tương tự.  Cấu trúc hóa học Độ bền màu và cường độ màu của các anthocyanin phụ thuộc vào vị trí và số lượng của các nhóm hydroxyl, methoxyl, đường và các đường được acyl hóa. Khi số nhóm hydroxyl trong vòng B tăng, cực đại hoặc thu ở vùng nhìn thấy được dịch chuyển về phía có bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương. 1.2.5.2 pH Cấu trúc, độ bền màu, màu sắc của anthocyanin thay đổi theo sự thay đổi của pH. Sự thay đổi cấu trúc của anthocyanin khi pH thay đổi đã được đề cập trong phần cấu trúc chuyển hóa. 24
27. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5 ảnh hưởng của pH lên tốc độ thủy phân của quả dâu được đun nóng tại 450C trong oxygen và nitrogen Khi pH=2,4 - 4,0 có màu đỏ thẫm pH= 4 - 6 thì có màu tím pH= 6 thì có màu xanh lam pH là kiềm thì có màu xanh lá cây 1.2.5.3 Nhiệt độ Hầu hết các phản ứng hóa học liên quan đến độ bền anthocyanin và tốc độ phân hủy chúng đều phụ thuộc vào nhiệt độ. Tính bền nhiệt của các anthocyanin phụ thuộc vào cấu trúc của chúng, pH, có sự có mặt của oxy, và sự tác động qua lại giữa các thành phần. 25
28. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6 Sự biến tính của anthocyanin 3,5-di glucoside tại pH 3,7. 1.2.5.4 Oxy Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân hủy của anthocyanin, từ đó sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu. 1.2.5.5 Enzyme Nhiều enzyme nội sinh trong tế bào của cây có khả năng làm mất màu của anthocyanin. Những enzyme này được gọi chung là anthocyanase. Dựa vào đặc tính của các enzyme mà người ta chia làm 2 nhóm: glycosidase và polyphenol oxidase, các enzyme này thu được từ nấm (fulgal). Hình 1.7 Sự biến tính của anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol. 26
29. Đồ án tốt nghiệp 1.2.5.6 Ánh sáng Các anthocyanin thường không bền khi tiếp xúc với tia tử ngoại, ánh sáng thấy được và các nguồn phát xạ khác. Ánh sáng có 2 ảnh hưởng đến anthocyanin: - Tăng cường cho quá trình sinh tổng hợp. - Xúc tiến sự biến tính của chúng. 1.2.5.7 Đường và các sản phẩm biến tính của chúng Ở nồng độ 100 ppm, đường và các sản phẩm phân hủy của chúng có tác dụng thúc đẩy sự phân hủy các anthocyanin. Những sản phẩm phân hủy này dễ dàng ngưng tụ với các anthocyanin với sự có mặt của furfural và HMF trực tiếp phụ thuộc vào nhiệt độ, và rõ nét nhất là trong nước trái cây sự có mặt của oxy làm tăng thêm hiệu quả phân hủy của tất cả các loại đường và các dẫn xuất của chúng. Hình 1.8 Phản ứng ngưng tụ của a) Cyanidin và furfural b) Cyanidin ketobase và furfural 1.2.5.8 Các ion kim loại Một số ion kim loại đa hóa trị có thể tương tác với các anthocyanin có nhóm OH ở vị trí ortho gây ra hiệu ứng sâu màu (bathocromic). Hiện tượng này xảy ra khi kim 27
30. Đồ án tốt nghiệp loại tiếp xúc với các anthocyanin trong quá trình chế biến rau quả hoặc sự cho thêm các muối kim loại vào trong thực phẩm. 1.2.5.9 Sunphurdioxide Các anthocyanin thường bị mất màu khi có mặt của SO2. Quá trình khử này có thể là thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch. Jurd đã đề nghị sơ đồ phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin trong đó, dạng có màu flavylium phản ứng với ion bisulphate tạo thành chromene -2-(hoặc 4) – sulphonic acid. Hình 1.9 Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin 1.2.5.10 Acid ascorbic Acid ascorbic hiện diện trong hầu hết các sản phẩm trái cây, vitamin này bị oxy hóa tạo thành H2O2 và chính H2O2 làm mất màu anthocyanin. Vai trò của hợp chất anthocyanin 1.2.6.1 Đối với thực vật Anthocyanin đem đến những màu sắc khác nhau tạo ra sự tương phản, thu hút các loài động vật, tạo điều kiện cho quá trình thụ phấn và phát tán hạt giống của cây. Các nghiên cứu mới đây đã chứng minh được rằng các anthocyanin giúp che chở các diệp lạp, bảo vệ các diệp lạp chống lại cường độ ánh sáng cao, giúp ngăn sự ức chế quá trình quang hợp. 28
31. Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, người ta còn phát hiện ở anthocyanin một số vai trò khác như: hàm lượng chất màu tăng thì khả năng tích tụ molybden và tungsten ở loài bắp cải cũng tăng (Hale và cộng sự, 2002); hay ở các mô có chứa anthocyanin khả năng bị tấn công bởi nấm mốc giảm đi (Coley và Aide, 1989). Nói chung người ta tin rằng anthocyanin có khả năng tăng cường phản ứng chống oxy hóa của tế bào đối với các yếu tố gây stress. 1.2.6.2 Đối với sức khỏe con người Ngoài những vai trò sinh lý đối với thực vật, các hợp chất anthocyanin còn được chứng minh là mang lại nhiều lợi ích về sức khỏe cho con người. Mặc dù chỉ được cơ thể hấp thu một lượng rất nhỏ, các phân tử anthocyanin sau khi được chuyển hóa có biểu hiện những hoạt tính như chống ung thư, chống xơ vữa động mạch, chống viên, giảm mức độ thẩm thấu, độ vỡ của các mao mạch, ức chế sự đông tụ của các tiểu huyết cầu và thúc đẩy sự tạo thành cytokine từ đó điều hòa các phản ứng miễn dịch. Tất cả những hoạt tính này đều dựa trên khả năng chống oxy hóa của các anthocyanin. Cũng nhờ khả năng này, các hợp chất anthocyanin còn giúp bảo vệ màng dạ dày chống lại những tổn thương do sự oxy hóa, vì vậy hoãn lại giai đoạn đầu của bệnh ung thư dạ dày, ung thư ruột và ung thư ruột kế. Hoạt tính và thành phần của hệ vi khuẩn đường ruột có thể bị thay đổi sau khi dùng các dịch trích từ quả mọng có chứa các hợp chất flavonoid gồm cả anthocyanin.  Hoạt tính chống oxy hóa Một số cơ chế chống oxy hóa của anthocyanin có được từ các nghiên cứu như: ➢ Ngăn chặn các gốc hoạt động bằng cách cho hydro. ➢ Chelate các ion kim loại xúc tác cho các phản ứng oxy hóa ➢ Liên kết với các protein, tạo phức chất bền. Các hợp chất flavonoid nói chung trong đó có anthocyanin chống oxy hóa bằng cách quét các gốc O2 tự do, hay phản ứng với các gốc peroxy tham gia vào phản ứng 29
32. Đồ án tốt nghiệp oxy hóa dây chuyền. Nhờ vào khả năng cho các gốc tự do H+, các hợp chất này có thể ức chế được phản ứng peroxy hóa lipid.  Hoạt tính chống ung thư Trong nghiên cứu in vitro và in vivo, các hợp chất anthocyanin đều cho thấy khả năng giảm sự tăng trưởng của tế bào ung thư và ức chế sự hình thành khối u một cách đáng ểk . Cơ chế chống ung thư của anthocyanin nói riêng và các hợp chất phenolic nói chung vẫn chưa được xác định chắc chắn, có thể liên quan đến khả năng ức chế của enzyme cyclooxygenase và hoạt tính chống oxy hóa. Một số nghiên cứu về khả năng chống ung thư của anthocyanin như: ➢ Các anthocyanin trong khoai lang và bắp cải tím ức chế ung thu ruột kết trong chuột. ➢ Các anglycon có trong anthocyanin phổ biến nhất như cyaniding, delphinidin, maldvin đều có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư dạ dày, ruột kết, phổi, lồng ngực ở người.  Hoạt tính chống các bệnh tim mạch Các hợp chất flavonoid nói chung và các anthocyanin nói riêng được cho là có khả năng làm giảm nguy cơ mắc bệnh động mạch vành bởi khả năng ngăn chặn sự oxy hóa các lipoprotein có tỉ trong thấp trong huyết tương. Sự oxy hóa được xem như một bước quan trọng trong sự hình thành các khối xơ động mạch và từ đó dẫn đến căn bệnh động mạch vành. 1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin Phương pháp DPPH (Scavenging ability ability towards DPPH radicals) Phương pháp DPPH do Marsden Blois (đại học Standford) giới thiệu năm 1958. 30
33. Đồ án tốt nghiệp 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tía và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517nm. Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng. Đo dộ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa. Dung dịch DPPH trộn với chất có khả năng cho nguyên tử hydro, quá trình này làm tăng dạng khử, làm mất màu tím (phần còn lại có màu vàng nhạt do còn sự hiện diện của nhóm picryl). Hình 1.10 Phản ứng giữa DPPH với một chất chống oxy hóa Đánh giá ạho t tính kháng oxy hóa bằng cách cho chất nghiên cứu phản ứng với DPPH. Các chất nghiên cứu có tác dụng kháng oxy hóa theo cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của DPPH. Độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng λmax. Hoạt tính kháng oxy hóa được tính bằng phần trăm ức chế của mẫu thử so với mẫu đối chiếu. Hoạt tính sàn lọc gốc tự do được tính theo phương trình sau: Acontrol (0 phút) = độ hấp thụ của mẫu đối chứng ngay sao khi pha chế. Acontrol (30 phút) = độ hấp thu của mẫu đối chứng sau 30 phút ủ. Asample (30 phút) = độ hấp thu của mẫu thí nghiệm sau 30 phút ủ. 31
34. Đồ án tốt nghiệp Ablank (30 phút) = độ hấp thu của mẫu trắng sau 30 phút ủ. Lượng mẫu cần thiết để phản ứng với một nữa lượng DPPH (hay độ hấp thu 50%) được gọi là đương lượng tương đối Trolox phản ứng. Khi đó, hoạt tính chống oxy hóa của mẫu có thể diễn tả bằng thuật ngữ số micromole bằng Trolox/100g mẫu hay đơn vị Trolox/100g hay TE/100g. (TE: trolox equivalent) hay IC50. Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity) Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của gốc peroxy. Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong hiện dện của mẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt tính. Khi fluorescein bị oxy hóa, cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất oxy hóa vào. Khi có mặt chất chống oxy hóa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán. Kết quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu. Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential) Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2’-azobis(2- amidinopropane) dihydrochloride (APPH) vào trong môi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxy hóa. Quá trình oxy hóa này được đo đạt thông qua hàm lượng oxy tiêu thụ bằng một điện cực. Khi có mặt chất chống oxy hóa trong môi trường plasma, quá trình oxy hóa sẽ xảy ra chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/L mẫu lỏng. 32
35. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power) Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hóa trong việc khử phức Fe3+ -TPTZ [2,4,6- + tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tím) thành phức Fe2 -TPTZ (màu xanh) ở pH thấp. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 593nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene). Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) Cation ABTS+ [2,2’-azinobis (3-ethybenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền. Đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thu 734nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxy hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm hấp thu của đung dịch ở bước sóng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxy hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox[6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid]. Trong môi trường kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối. Phương pháp polyphenol tổng Có rất nhiều phương pháp dùng để phân tích hàm lượng phenolic tổng. Sử dụng Folin - ciocalteu là phương pháp có nhiều ưu điểm hơn cả, nó có thể tương thích được nhiều loại phenolic, nhưng có nhược điểm là bị gây ảnh hưởng bởi sulfur dioxide và đường. Dùng phương pháp quang phổ hấp thu trực tiếp để tiến hành quy trình này. Phép so màu Folin - Ciocalteu (FC) dựa trên phản ứng khử của các tác chất, một hỗn hợp của tungsten và molybdenum oxyde. Sản phẩm của sự khử metal oxyde có màu xanh bước sóng hấp thu cực đại λ = 760nm. Cường độ hấp thu tại bước sóng cực đại tỉ lệ với nồng độ của phenol. 33
36. Đồ án tốt nghiệp Từ đó, bằng việc đo đọ hấp thu của mẫu tại bước sóng cực đại ta sẽ xác định được nồng độ của phenol trong mẫu, dựa vào đường chuẩn được dựng trước. 1.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới Trên thế giới Với các thành phần và công dụng phong phú như trên, ngày nay việc chiết xuất anthocyanin từ đài hoa bụp giấm đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm: Năm 2007, một nghiên cứu lâm sàng được thực hiện bởi một nhóm nghiên cứu tại Đài Loan cho thấy dịch chiết từ đài hoa bụp giấm có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol (từ 8,3% đến 14,4%) trên người thử nghiệm. Với viên nang chiết xuất từ bụp giấm khô được thực hiện bằng cách ngâm 150 g hoa bụp giấm trong 6 lít nước nóng trong 2 giờ và sau đó làm khô và lọc chiết lấy dịch thì kết quả cho thấy viên nang được chiết xuất từ hoa bụp giấm có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol khi sử dụng mỗi ngày ba lần, liều lượng tối ưu nhất để giảm hàm lượng cholesterol là 1000mg mỗi ngày. Trong năm 2009, nhóm nghiên đến từ Saudi Arabia đã thực hiện thử nghiệm về khả năng giảm đường huyết của trà được chiết xuất từ bụp giấm trên 60 bệnh nhân tiểu đường cấp độ 2, chủ yếu là phụ nữ. Hoa bụp giấm tươi được tách lấy đài và sấy khô sau đó được nghiền thành dạng bột mịn, pha với nước sử dụng hai lần mỗi ngày trong vòng một tháng. Sau thời gian thử nghiệm kết quả cho thấy cho thấy lượng cholesterol HDL trong đường huyết của nhóm sử dụng trà bụp giấm giảm đáng kể tổng số cholesterol trung bình (236,2 - 218,6), LDL cholesterol (137,5 - 128,5), triglycerides (246,1 - 209,2) và Apo-B100 (80,0 - 77,3). Nghiên cứu này mở ra triển vọng mới cho các bệnh nhân bệnh tiểu đường trong việc giảm hàm lượng cholesterol HDL trong đường huyết, chỉ với hai chén trà mỗi ngày mà không cần dùng thuốc. 34
37. Đồ án tốt nghiệp Năm 2012, Liuqing Yang và cộng sự đã nghiên cứu tách chiết chất chống oxy hóa từ đài hoa bụp giấm khô, sử dụng dung môi ethanol và nước cất với các tỉ lệ khác nhau (30, 60 và 95%). Trong nghiên cứu này các đặc tính chống oxy hóa của đài hoa bụp giấm với dung môi nước và ethanol được thử nghiệm và so sánh với chất chống oxy hóa acid ascorbic. Sử dụng phương pháp DPPH để xác định khả năng kháng oxy hóa. Kết quả cho thấy chất chiết sử dụng dung môi trong ethanol 30% luôn luôn có các gốc tự do hoạt động cao nhất, trong khi chiết trong ethanol 95% cho thấy mức thấp nhất. Nghiên cứu này cho thấy rằng chiết xuất này có thể được sử dụng như một chất chống oxy hóa an toàn hiệu quả. Nghiên cứu khảo sát về sự ổn định màu của anthocyanin tách chiết từ đài hoa bụp giấm thuộc các loài khác nhau (H.sabdariffa, M.malabathricum và Batatas Ipomoea) được Aishah, Nursabrina và các cộng sự thực hiện vào năm 2012. Nghiên cứu này nhằm xác định sự ổn định màu của anthocyanin được tách chiết từ đài hoa bụp giấm khô ở pH có tính axit khác nhau (pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 và 4.5). Tổng số hàm lượng anthocyanin, chỉ số thoái hóa, mật độ màu sắc và phần trăm màu được phân tích để xác định sự biến đổi màu sắc của chúng. Những kết quả nghiên cứu này chứng minh rằng việc sử dụng màu của các loài bụp giấm được sử dụng tiềm năng như những chất tạo màu tự nhiên để thay thế các chất màu tổng hợp trong ngành công nghiệp thực phẩm và nước giải khát. Trong nước Tại Việt Nam những nghiên cứu về anthocyanin đã được bắt đầu từ những thập niên 90. Năm 1998 - 1999, Trần Thúy viện trưởng viện y học dân tộc cổ truyền đã nghiên cứu các chế phẩm từ bụp giấm để điều trị cho các bệnh nhân. Nhưng với điều kiện khó khăn và thiếu thốn nên việc tách các hoạt chất trong bụp giấm để sử dụng trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm hoặc dược phẩm không thành công. Từ đó, một 35
38. Đồ án tốt nghiệp số sản phẩm thực phẩm thông thường, dễ được người tiêu dùng chấp nhận như: trà, nước giải khát, mứt quả, đã được các nhà nghiên cứu và được kết quả vô cùng khả quan, các sản phẩm từ hoa bụp giấm có mùi vị cảm quan và chức năng vô cùng phong phú đối với sức khỏe con người. Năm 2012, Nguyễn Thị Hiển và cộng sự đã nghiên cứu thành công đề tài chiết tách anthocyanin từ đài hoa bụp giấm ứng dụng để sản xuất giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm. Trong nghiên cứu này tác giả đã tiến hành xác định một số chỉ tiêu lý, hóa học của hoa bụp giấm và tách chiết anthocyanin; sau đó, tác giả tiến hành xây dựng quy trình sản xuất giấy chỉ thị nhanh hàn the trong thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy giấy chỉ thị này có ưu điểm là phát hiện được ngưỡng tối thiểu tốt hơn so với giấy nghệ. Mở ra một hướng triển vọng về những chất chỉ thị chiết xuất từ thiên nhiên sử dụng an toàn trong thực phẩm. Tuy nhiên cho đến nay các nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết anthocyain từ hoa bụp giấm cũng như khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của dịch chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm vẫn chưa được thực hiện. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này. 36
39. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm. Chúng tôi thực hiện thí nghiệm khảo sát quá trình chiết và khả năng kháng oxy hóa từ hoa bụp giấm từ ngày 14/4/2015 đến 1/8/2015, tại trung tâm thí nghiệm hóa sinh trường ĐH Công Nghệ tp Hồ Chí Minh tại số 475 Điện Biên Phủ, phường 25, quận Bình Thạnh, tp Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị Vật liệu Đài hoa bụp giấm được thu mua tại TPHCM vào tháng 5/2015. Hoa tươi sau khi mua về được lựa chọn loại bỏ những hoa dập hư. Sau đó được rửa sạch và để ráo nước, bụp giấm được tách đài và hạt riêng, đài được đem đi sấy với nhiệt độ từ 40 – 43oC trong vòng từ 24 đến 48 giờ cho hoa khô hoàn toàn. Đài hoa khô sau khi sấy được nghiền mịn và rây qua lỗ rây với kích thước lỗ Ø = 1mm. Hình 2.1 Bột hoa bụp giấm sau khi được nghiền mịn và rây. 37
40. Đồ án tốt nghiệp Hóa chất và thiết bị Cồn 700 Acid citric Acid clohidric Acid sunfuric Kaliclorua Natritetraborac Natrihidroxit Nước cất Pipet Erlen Ống đong Đũa thủy tinh Cốc thủy tinh Bếp điện Nhiệt kế Máy đo OD Phiễu Giấy lọc Bông lọc 38
41. Đồ án tốt nghiệp 2.3. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Sơ đồ nghiên cứu Chúng tôi thực hiện đề tài này theo sơ đồ nghiên cứu sau: Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu 39
42. Đồ án tốt nghiệp Nội dung 1: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly và thu nhận anthocyanin từ đài hoa bụp giấm 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hệ dung môi thích hợp cho quá trình tách chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm  Mục đích thí nghiệm Khảo sát các hệ dung môi khác nhau với mục đích lựa chọn được hệ dung môi tách chiết phù hợp nhằm thu được lượng anthocyanin trích ly là cao nhất. Anthocyanin vốn có các gốc hidrocacbon kị nước, chỉ tan tốt trong các dung môi hữu cơ, tuy nhiên nó lại có các nhóm chức polyphenol phân cực tan tốt trong dung môi phân cực. Do đó muốn chiết anthocyanin phải dùng hệ dung môi gồm: dung môi hữu cơ và một chất phân cực (thường là nước) (Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên, 2004). Do đó, trong thí nghiệm này chúng tôi chọn dung môi tách chiết anthocyanin là nước:ethanol. Các hệ dung môi được lựa chọn khảo sát bao gồm: Nước:ethanol 1:0 Nước:ethanol 1:1 Nước:ethanol 2:1 Nước:ethanol 3:1  Cách tiến hành: - Cân chính xác 4g bột hoa bụp giấm. - Chuẩn bị các hệ dung môi với nồng độ và tỉ lệ như trên. - Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly là 4% (4g/100ml). - Cho mẫu đã cân vào erlen 250ml sau đó cho dung môi thích hợp vào định mức đến 100ml. 40
43. Đồ án tốt nghiệp - Bịch kín erlen bằng giấy bạc để tránh hiện tượng mất màu và tiến hành lắc trên máy lắc với tốc độ 250 vòng/phút trong thời gian là 60 phút. - Thu dịch lọc và tiến hành đo màu - Tính toán kết quả hàm lượng anthocyanin thu được. Thí nghiệm được tiến hành hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố và số lần lặp lại là 3. Nhân tố thay đổi duy nhất trong thí nghiệm này là hệ dung môi. Tổng số thí nghiệm là 12.  Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm này là: - Cảm quan dịch chiết - Hàm lượng anthocyanin thu được 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu dung môi đến quá trình tách chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm.  Mục đích thí nghiệm Khảo sát các tỉ lệ nguyên liệu và hệ dung môi khác nhau với mục đích chọn ra được tỉ lệ nguyên liệu thích hợp nhất cho quá trình trích ly và thu nhận được hàm lượng anthocyanin là cao nhất. Trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn các tỷ lệ nguyên liệu để khảo sát lần lượt là 2%,3%,4% và 5% (tương đương 2,3,4,5g/100ml).  Cách tiến hành: - Cân lần lượt các tỉ lệ nguyên liệu bột hoa bụp giấm như trên. - Chuẩn bị các hệ dung môi với nồng độ và tỉ lệ như đã khảo sát ở thí nghiệm 1. - Cho mẫu đã cân vào erlen 250ml sau đó cho dung môi thích hợp vào định mức đến 100ml. - Bịch kín erlen bằng giấy bạc để tránh hiện tượng mất màu và tiến hành lắc trên máy lắc với tốc độ 250 vòng/phút trong thời gian là 60 phút. 41
44. Đồ án tốt nghiệp - Thu dịch lọc và tiến hành đo OD, tính toán kết quả hàm lượng anthocyanin. Thí nghiệm được tiến hành hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố và số lần lặp lại là 3. Nhân tố thay đổi duy nhất trong thí nghiệm này là tỉ lệ nguyên liệu. Tổng số thí nghiệm là 12.  Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm này là: - Cảm quan dịch chiết - Hàm lượng anthocyanin thu được 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc trong quá trình tách chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm.  Mục đích thí nghiệm Chúng tôi thực hiện thí nghiệm này với mục đích tìm ra thời gian thích hợp cho quá trình trích ly nhằm thu được hàm lượng anthocyanin cao nhất. Đối với thí ngiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gia lắc bằng cách tiến hành thay đổi các giá trị thời gian khác nhau như gian 30 phút, 60 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút để đánh giá sự thay đổi của hàm lượng anthocyanin thu nhận.  Tiến hành thí nghiệm - Các yếu tố như hệ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu dung môi được sử dụng trong thí nghiệm này là các thông số tố ưu được sử dụng từ 2 thí nghiệm 1 và 2. - Cho mẫu đã cân vào erlen 250ml sau đó cho dung môi thích hợp vào định mức đến 100ml. - Dùng giấy bạc bịt kín erlen để tánh hiện tượng mất màu. - Đem hỗn hợp lắc trên máy lắc trong các khoảng thời gian 30 phút, 60 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút. - Sau mỗi khoảng thời gian đem dịch ra li tâm bỏ cặn. - Đem dịch thu được đo OD để phân tích hàm lượng anthocyanin thu được. 42
45. Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với số lần lặp lại là 3 lần. Nhân tố thay đổi duy nhất trong thí nghiệm này là thời gian lắc dung dịch và số thí nghiệm thực hiện là 15.  Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm này: - Cảm quan dịch chiết anthocyanin - Hàm lượng anthocyanin thu được sau các khoảng thời gian lắc. 2.3.2.4 Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng trích ly anthocyanin từ bụp giấm.  Mục đích thí nghiệm: Chúng tôi thực hiện thí nghiệm này nhằm tìm ra giá trị pH mà ở đó thu nhận được hàm lượng anthocyanin là cao nhất. Đối với thí nghiệm này các giá trị pH được lựa chọn khảo sát lần lượt là 1, 4, 7 và 9, các thông số còn lại như khối lượng nguyên liệu, hệ dung môi hay thời gian lắc là các thông số tối ưu thu nhận từ các thí nghiệm trước.  Cách tiến hành thí nghiệm Các bước tiến hành được thực hiên tương tự như ở thí nghiêm 1 và 2. - Cân chính xác khối lượng mẫu, trong thí nghiệm này là 4g (4%). - Cho mẫu đã cân vào erlen 250ml sau đó cho dung môi đã được điều chỉnh pH thích hợp bằng dung dịch HCL 1N vào định mức đến 100ml. - Bịch kín erlen bằng giấy bạc để tránh hiện tượng mất màu và tiến hành lắc trên máy lắc với tốc độ 250 vòng/phút trong thời gian là 60 phút. - Sau thời gian lắc tiến hành li tâm. - Thu dịch trong và tiến hành đo màu. - Tính toán kết quả hàm lượng trích ly anthocyanin. Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với số lần lặp lại là 3 và số thí nghiệm thực hiện là 12. 43
46. Đồ án tốt nghiệp  Chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm này: - Cảm quan của dịch chiết: - Hàm lượng anthocyanin thu nhận. 2.3.2.5 Thí nghiệm 5: khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ủ đến hàm lượng trích ly anthocyanin.  Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm nhằm tìm ra khoảng thời gian thích hợp để thu nhận hàm lượng anthocyanin sau trích ly là cao nhất. Thời gian tiếp xúc của dung môi và nguyên liệu càng dài thì khả năng trích ly càng cao khi đó nồng độ chất tan đạt giá trị cân bằng. Ở thí nghiệm này chúng tôi chỉ khảo sát thời gian ủ dịch chiết sau khi lắc, các thông số còn lại như khối lượng nguyên liệu, hệ dung môi hay thời gian lắc hay pH tối ưu của dịch chiết được sử dụng là các thông số tối ưu thu nhận từ các thí nghiệm trước. Thời gian được lựa chọn để khảo sát lần lượt là 24, 48, 72, 96 giờ.  Cách tiến hành thí nghiệm: - Cân chính xác 4 g (4%) bột bụp giấm đã nghiền mịn và rây. - Dung môi sử dụng là nước:ethanol với tỷ lệ 2:1 và chỉnh pH về giá trị 4. - Hòa tan nguyên liệu vào dung môi. - Lắc trên máy lắc với vận tốc 200 vòng/phút trong thời gian 60 phút. - Bịt kín bình chứa dung môi bằng giấy bạc và tiến hành cất vào tủ ủ với nhiệt độ 4oC, với thời gian từ 24h, 48h, 72h và 96h. Sau mỗi 24h đem mẫu ra ly tâm thu dịch và quan sát màu sắc của dung dịch sau đó tiến hành đo OD để xác định hàm lượng anthocyanin thu nhận được. Thí nghiệm được thực hiện một cách ngẫu nhiên và lập lại 3 lần, tổng các thí nghiệm thực trong khảo sát này là 12.  Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm này: - Cảm quan của dịch chiết: 44
47. Đồ án tốt nghiệp - Hàm lượng anthocyanin thu nhận. Nội dung 2: Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết anthocyanin bằng phương pháp DPPH Sau quá trình tiến hành thí nghiệm ở nội dung 1, chúng tôi thu nhận được dịch chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm ở những điều kiện tối ưu nhất. Tiến hành đo DPPH và IC50 để khảo sát khả năng kháng oxy hóa của dung dịch anthocyanin. Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của dịch chiết anthocyanin. 2.3.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình biến đổi của dịch chiết anthocyanin từ đài hoa ụb p giấm.  Mục đích thí nghiệm: Khi đun nóng lâu anthocyanin có thể bị phá hủy và mất màu. Vì vậy, chúng tôi thực hiện thí nghiệm này nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của dịch trích anthocyanin Các giá trị nhiệt độ được khảo sát ở thí nghiệm này là 60oC, 70oC, 80oC, 90oC và 100oC.  Cách tiến hành Sử dụng dịch trích anthocyanin thu được khi trích ly bằng các thông số tối ưu ở nội dung 1 để tiến hành khảo sát. - Hút 100ml dịch trích anthocyanin cho vào erlen 250ml. - Đun sẵn nước, cho erlen chứa sẵn dịch trích anthocyanin vào đun cách thủy cho đến khi dịch trích đạt được ở các khoảng nhiệt độ cần khảo sát và gia nhiệt trong vòng 15 phút. - Sau khi đun đạt đến các nhiệt độ trong khảo sát đem dịch chiết đi đo OD nhằm xác định sự thay đổi của nồng độ anthocyanin theo từng nhiệt độ khác nhau. 45
48. Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với số lần lặp lại là 3, giá trị thay đổi duy nhất trong khảo sát này là nhiệt độ, số thí nghiệm được thực hiện là 15.  Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm này: - Hàm lượng anthocyanin còn lại trong dịch trích. - Cảm quan của dịch trích. 2.3.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát thời gian đun đến quá trình biến đổi của dịch chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm.  Mục đích thí nghiệm: Chúng tôi thực hiện thí nghiệm này nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của thời gian gia nhiệt đến hàm lượng và độ bền của anthocyanin trong dịch trích, từ đó tìm ra được thời gian đun thích hợp để bảo toàn lượng anthocyanin trong dịch trích. Các khoảng thời gian được khảo sát trong thí nghiệm này là 5, 10, 15, 20 và 30 phút.  Cách tiến hành: - Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng dịch chiết anthocyanin với các yêu tố đã được khảo sát trong thí nghiệm 1 của nội dung 2, sau đó tiến hành đun cách thủy ở 70oC (theo kết quả của thí nghiệm 1) và giữ trong các khoảng thời gian là 5, 10, 15, 20 và 30 phút. - Sau mỗi khoảng thời gian đem dịch ra quan sát sự thay đổi màu sắc và bỏ vào chậu đã để sẵn đá để làm lạnh nhanh sau đó đem đi đo OD xác định hàm lượng anthocyanin. Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với số lần lặp lại là 3 lần với từng nhiệt độ và thời gian tương ứng, số thí nghiệm thực hiện là 12.  Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm này: - Hàm lượng anthocyanin còn lại sau khi gia nhiệt ở các khoảng thời gian khác nhau. 46
49. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.3 Thí nghiệm 3: khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích anthocyanin sau khi gia nhiệt.  Mục đích thí nghiệm Anthocyanin là hợp chất dễ bị pha hủy và mất màu bởi nhiệt độ và thời gian. Vì vậy, chúng tôi thực hiện thí nghiệm này nhằm khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích anthocyanin sau khi gia nhiệt 700 trong vòng 15 phút.  Tiến hành thí nghiệm Sử dụng dịch trích anthocyanin thu được sau khi gia nhiệt ở thí nghiệm 1 và thời gian gia nhiệt ở thí nghiệm 2 để tiến hành khảo sát. - Thực hiện với mẫu thử ở nồng độ (Co/30) • DPPH hoà tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM • Dịch mẫu giữ nguyên ở nồng độ ban đầu C0 • Cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800µl methanol, sau đó bổ sung 100µl dịch mẫu • Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm. - Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng • Hoà tan ascorbic acid (vitamine C) trong DMSO ở nồng độ ban đầu 3mg/ml • Mẫu đối chiếu (ascorbic acid): Cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800µl methanol, sau đó bổ sung 100µl dung dịch ascorbic acid nồng độ 3mg/ml • Mẫu trắng: Cho 100µl DPPH vào 2900µl methanol. Cả hai dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517nm. Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của chất nghiên cứu được tính theo công thức sau: 47
50. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp nghiên cứu 2.3.5.1 Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết đài hoa bụp giấm. Phương pháp pH vi sai Nguyên tắc Dựa trên nguyên tắc chất màu anthocyanin thay đổi theo pH. Tại pH=1 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH=4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu. Sự khác biệt về độ hấp thu các chất màu ở các bước sóng 520nm tỷ lệ với nồng độ chất màu trong mẫu. Thí nghiệm nhằm xác định hàm lượng anthocyanin có trong các mẫu đã khảo sát. Chuẩn bị thí nghiệm: - Dung dịch anthocyanin đã được khảo sát ở các điều kiện nhiệt độ, pH, thời gian khác nhau - Máy đo độ hấp thụ. - Dung địch đệm pH=1, pH=4,5. • Đệm pH=1: Cân 1,86g KCL cho vào becher 1L, thêm nước cất đến khoảng 980ml. Đo pH và điều chỉnh đến pH 1.0 bằng HCL (khoảng 6,3ml). Chuyển toàn bộ dung dịch buffer vào bình định mức 1L, thêm nước cất đến vạch. • Đệm pH=4,5: Cân 54,43g CH3COONa.3H2O cho vào becher 1L, thêm nước cất đến khoảng 960ml. Đo pH và điều chỉnh đến pH 4.5 bằng HCL (khoảng 20ml). Chuyển toàn bộ dung dịch buffer vào bình định mức 1L, thêm nước cất đến vạch. Tiến hành thí nghiệm: - Pha mẫu trắng: cho 1,2ml nước cất vào bình định mức 50ml. Định mức tới vạch bằng dung dịch đệm. - Pha loãng mẫu: để xác định nồng độ của anthocyanin trong dịch chiết, pha loãng dịch chiết trong đệm có pH=1 và pH=4,5 48
51. Đồ án tốt nghiệp • Hút 1,2ml dịch chiết cho vào bình định mức 50ml. Định mức tới vạch bằng dung dịch đệm KCL hoặc CH3COONa. • Sau khi pha loãng, để yên dung dịch trong 15 phút để tạo trạng thái cân bằng. - Đo mật độ quang của mẫu bụp giấm đã pha loãng ở các bước sóng hấp thu cực đại (520nm), và bước sóng 700nm (trước khi đo, đo mẫu trắng ở các bước sóng). - Xác định nồng độ anthocyanin theo công thức: . . 퐾. = ; / 퐿 휀. 푙 Trong đó: A: mật độ quang (độ hấp thụ của anthocyanin) A= (Aλ520-pH=1 - Aλ700-pH=1 ) – (Aλ520-pH=4.5 - Aλ700-pH=4.5 ) M: khối lượng phân tử của anthocyanin không kể ion Cl- hay nước. (M=449,2g/mol). ε: độ hấp thụ phân tử (ε=26900Lmol-1cm-1). l: chiều dài cuvet, cm K: độ pha loãng của dung dịch anthocyanin. 2.3.5.2 Phương pháp xác định tính kháng oxy hóa của anthocyanin. Phương pháp DPPH Nguyên tắc: DPPH là một gốc tự do bền màu, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517nm. Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Mục đích thí nghiệm: 49
52. Đồ án tốt nghiệp Chúng tôi thực hiện thí nghiệm này nhằm nghiên cứu xác định khả năng kháng oxy hóa của dung dịch anthocyanin được trích ly từ đài hoa bụp giấm. Tiến hành thí nghiệm Chúng tôi tiến hành đo DPPH mẫu dịch chiết anthocyanin có hàm lượng cao nhất: dịch chiết anthocyanin được tách chiết từ hoa bụp giấm sử dụng dung môi là ethanol : nước (1:2). - Thực hiện với mẫu thử ở nồng độ (C0/30) • DPPH hoà tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM • Dịch mẫu giữ nguyên ở nồng độ ban đầu C0 • Cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800µl methanol, sau đó bổ sung 100µl dịch mẫu • Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm. - Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng • Hoà tan ascorbic acid (vitamine C) trong DMSO ở nồng độ ban đầu 3mg/ml • Mẫu đối chiếu (ascorbic acid): Cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800µl methanol, sau đó bổ sung 100µl dung dịch ascorbic acid nồng độ 3mg/ml • Mẫu trắng: Cho 100µl DPPH vào 2900µl methanol. Cả hai dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517nm. Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của chất nghiên cứu được tính theo công thức sau: 50
53. Đồ án tốt nghiệp Trong đó: A là độ hấp thu của dung dịch chứa mẫu thử A0 là độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu Ac là độ hấp thu của dung dịch chứa chất đối chiếu. Thực hiện các bước tương tự với 2 mẫu còn lại. Phương pháp đo IC50 IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do hoặc tế bào hoặc enzyme. Mẫu có hoạt tính càng cao thi IC50 sẽ càng thấp. Tiến hành thí nghiệm: Sau khi đo kết quả DPPH, chúng tôi tiến hành đem mẫu dịch chiết anthocyanin có khả năng kháng oxy hóa cao nhất đo IC50. Mẫu đo IC50 trong thí nghiệm này là dịch chiết anthocyanin được chiết xuất từ đài hoa bụp giấm sử dụng hệ dung môi ethanol:nước (1:2). - Thực hiện với mẫu bụp giấm • DPPH hòa tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM. • Hòa tan mẫu cao trong DMSO ở các nồng độ khác nhau 4000; 2000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625µg/ml. • Cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800µl methanol, sau đó bổ xung 100µl mẫu bụp giấm (thực hiện lần lượt cho từng nồng độ). • Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517nm. • Mỗi nồng độ mẫu được thử nghiệm lặp 3 lần để tính giá trị trung bình. - Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng • Hòa tan acid ascorbic (vitamin C) trong DMSO (dimethyl sulfoxide) ở nồng độ 3mg/ml. 51
54. Đồ án tốt nghiệp • Mẫu đối chiếu (acid ascorbic): cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6Mm vào 2800µl methanol, sau đó bổ sung 100µl dung dịch acid ascorbic. • Mẫu trắng: cho 100µl dung dịch DPPH nồng độ 6Mm vào 2800µl methanol, sau đó bổ sung 100µl dung dịch methanol . • Cả hai dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo hấp thu ở bước sóng λ = 517nm. • Mỗi nồng độ chất đối chiếu và mẫu trắng được thử nghiệm lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình. 52
55. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nội dung 1: Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly và thu nhận anthocyanin từ đài hoa bụp giấm Thí nghiệm 1: Kết quả khảo sát hệ dung môi thích hợp cho quá trình tách chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm. Sau khi khảo sát các hệ dung môi chúng tôi thu được hàm lượng anthocyanin được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Hàm lượng anthocyanin thu được khi tách chiết ở các hệ dung môi khác nhau Hệ dung môi Hàm lượng anthocyanin (mg/ml) Nước : ethanol (1:1) 0,867 ± 0,038ab Nước : ethanol (2:1) 0,961 ± 0,007b Nước : ethanol (3:1) 0,824 ± 0,026a Nước : ethanol (4:1) 0,826 ± 0,069a a,b: sự biễu diễn khác nhau có ý nghĩa về hàm lượng anthocyanin trích ly từ hoa bụp giấm ở các hệ dung môi khác nhau. Qua bảng 3.1 và hình 3.1 chúng tôi nhận thấy hàm lượng anthocyanin thu được cao nhất khi sử dụng dung môi nước:ethanol tỷ lệ 2:1 (0,961 mg/ml), tỷ lệ này phù hợp cho sự phân tách pha và khả năng hòa tan của nguyên liệu vào dung môi là tối đa. Hệ dung môi thu được hàm lượng anthocyanin thấp nhất là nước:ethanol (1:1) (0,824 mg/ml). Khi hàm lượng dung môi nước tiếp tục tăng lên 3:1 thì hàm lượng anthocyanin lại giảm nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (0,826 mg/ml). Do đó, trong thí nghiệm này chúng tôi chọn dung môi tách chiết anthocyanin là nước:ethanol (2:1) vì anthocyanin vốn có các gốc hidrocacbon kị nước, chỉ tan tốt trong các dung môi hữu cơ, tuy nhiên nó lại có các nhóm chức polyphenol phân cực tan tốt trong dung môi phân cực. Do đó muốn chiết anthocyanin phải dùng hệ dung 53
56. Đồ án tốt nghiệp môi gồm: dung môi hữu cơ và một chất phân cực (thường là nước). Nước vừa có tính phân cực tốt, giá thành rẻ rất thích hợp để sử dụng. (Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên, 2004). Vì vậy, chúng tôi chọn dung môi nước : ethanol (2:1) để tách chiết anthocyanin cho các thí nghiệm tiếp theo. 1 0.961 0.95 0.896 0.9 0.85 0.824 0.826 0.8 Hàm lượng lượng mg/ml Hàm anthocyanin 0.75 N:C(1:0) N:C(1:1) N:C(2:1) N:C(3:1) Hệ dung môi Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin thu được khi trích ly bằng các hệ dung môi khác nhau. 54
57. Đồ án tốt nghiệp a b c d Hình 3.2 Màu sắc của dịch chiết anthocyanin ở các hệ dung môi khác nhau (a, b, c, d tương ứng với dịch chiết trong các hệ dung môi nước: cồn 1: 1, 1:2; 1: 3; 1:4) 55
58. Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu dung môi đến quá trình tách chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm. Sau khi khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến quá trình tách chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm chúng tôi thu được những hàm lượng anthocyanin như sau, kết quả được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2 Hàm lượng anthocyanin thu được khi khảo sát ở các tỷ lệ nguyên liệu dung môi tách chiết khác nhau. Tỷ lệ nguyên liệu dung môi (g/100ml) Hàm lượng anthocyanin (mg/ml) 2% 0,709 ± 0,008c 3% 0,721 ± 0,040b 4% 0,788 ± 0,019b 5% - a,b: sự biễu diễn khác nhau có ý nghĩa về hàm lượng anthocyanin trích ly từ hoa bụp giấm ở các tỷ lệ nguyên liệu dung môi khác nhau. (-): màu sắc của dịch trích quá đậm, vượt quá phổ hấp thụ của bước sóng OD. Qua bảng số liệu 3.2 và hình 3.2 chúng tôi thấy: Hàm lượng anthocyanin thu được cao nhất khi sử dụng tỷ lệ nguyên liệu dung môi là 4% (0,787 mg/ml). Khi tăng tỷ lệ nguyên liệu thì hàm lượng anthocyanin tăng đáng kể, cụ thể khi sử dụng tỷ lệ nguyên liệu dung môi là 2% thì hàm lượng anthocyanin thu được thấp nhất (0,709 mg/ml) sau đó tăng lên (0,722 mg/ml) khi tăng lượng nguyên liệu 3%, có sự khác biệt về mặt thống kê nhưng khi tăng lượng nguyên liệu lên 5% thì màu sắc anthocyanin quá đậm, do đó không thể đo được hàm lượng anthocyanin tách chiết được. Vì vậy, chúng tôi chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 4% là thích hợp nhất để tách chiết anthocyanin cho các thí nghiệm tiếp theo. Vì khi lượng nguyên liệu càng nhiều thì lượng chất màu thu được càng lớn không thể đo được bước 56
59. Đồ án tốt nghiệp sóng hấp thụ, khi lượng nguyên liệu càng ít thì màu dịch chiết càng loãng, hàm lượng anthocyanin càng giảm. Ở mức tỷ lệ 4% thì thu được hàm lượng anthocyanin cao nhất là vì lúc này lượng nguyên liệu tan vào dung môi đã đạt tối đa vì vậy tỷ lệ 4% sẽ được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. 0.9 0.8 0.7 0.787 0.709 0.722 0.6 0.5 0.4 0.3 hàm lượng lượng anthocyaninhàm 0.2 0.1 0 0 2g 3g 4g 5g Khổi lượng nguyên liệu Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin thu được khi trích ly bằng các tỷ lệ nguyên liệu/100ml dung môi khác nhau. b a 57
60. Đồ án tốt nghiệp d c Hình 3.4 Màu sắc của dịch trích anthocyanin khi khảo sát các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi khác nhau. a). Màu sắc dịch trích khi tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 2% b). Màu sắc dịch trích khi tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 3% c). Màu sắc dịch trích khi tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 4% d). Màu sắc dịch trích khi tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 5% Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc trong quá trình tách chiết anthocyanin từ đài hoa bụp giấm. Sau khi khảo sát ở các khoảng thời gian lắc khác nhau, chúng tôi thu được các hàm lượng anthocyanin được thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3 Hàm lượng anthocyanin thu được khi khảo sát ở các thời gian lắc khác nhau Thời gian lắc (phút) Hàm lượng anthocyanin (mg/ml) 30 0,743 ± 0,051a 60 0,867 ± 0,038b 120 0,683 ± 0,069a 150 0,701 ± 0,077a 180 0,748 ± 0,033a 58
61. Đồ án tốt nghiệp a,b: sự biễu diễn khác nhau có ý nghĩa về hàm lượng anthocyanin trích ly từ hoa bụp giấm ở các thời gian lắc khác nhau. Hình 3.5 Mẫu dịch chiết anthocyanin được khảo sát ở các thời gian lắc khác nhau. 1 0.869 0.9 0.8 0.743 0.748 0.683 0.701 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 hàm lượng anthocyanin mg/ml lượng anthocyaninhàm 0.1 0 30 phút 60 phút 120 phút 150 phút 180 phút Thời gian lắc Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin thu được khi lắc ở các khoảng thời gian khác nhau. 59
62. Đồ án tốt nghiệp Từ bảng 3.3 và hình 3.6 chúng tôi nhận thấy rằng: Hàm lượng anthocyanin thu được cao nhất khi lắc ở thời gian 60 phút (0,869 mg/ml) nhưng khi lắc đến 120 phút thì lại giảm xuống còn 0,683 mg/ml và lại tăng nhẹ khi lắc đến thời gian 150 phút (0,701 mg/ml), khi lắc càng lâu thì hàm lượng anthocyanin càng tăng nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê, cụ thể khi lắc tới thời gian 150 phút thì hàm lượng anthocyanin tăng từ 0,701 đến 0,748 mg/ml. Do đó, thời gian lắc thích hợp cho quá trình tách chiết anthocyanin là 60 phút, vì thời gian này là phù hợp cho nguyên liệu tan vào dung môi tối đa, cấu trúc của các gốc anthocyanin chưa bị phá vỡ vì vậy độ hấp thu ở thời gian này là tốt nhất, nên hàm lượng anthocyanin thu được là cao nhất. Vì vậy, chúng tôi chọn thời gian lắc là 60 phút cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng trích ly anthocyanin từ bụp giấm. Sau khi tiến hành tách chiết ở các giá trị pH: 1,4,7,9 chúng tôi thu được các hàm lượng anthocyanin khác nhau, kết quả được thể hiện ở bảng sau: Bảng 3.4 Hàm lượng anthocyanin thu được khi tách chiết ở các khoảng pH khác nhau. Giá trị pH Hàm lượng anthocyanin (mg/ml) 1 0,653 ± 0,043a 4 0,812 ± 0,059b 7 0,647 ± 0,074a 9 0,684 ± 0,051a a,b: sự biễu diễn khác nhau có ý nghĩa về hàm lượng anthocyanin trích ly từ hoa bụp giấm ở các giá trị pH khác nhau. Từ bảng 3.4 và hình 3.9 chúng tôi nhận thấy rằng: 60
63. Đồ án tốt nghiệp Ở giá trị pH=4 hàm lượng anthocyanin thu được là cao nhất 0,812 mg/ml vì ở khoảng pH này các anthocyanin có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay base chalcon nên có độ hấp thụ lớn, độ hấp thụ càng lớn thì nồng độ anthocyanin thu được càng nhiều. Một nghiên cứu của Adams vào năm 1972 cũng cho thấy rằng ở pH= 2 - 4 ít ảnh hưởng đến sự phân hủy của anthocyanin nên chúng vẫn giữ được các tính chất ban đầu không ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng thu được. Ở pH=1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ nên độ hấp thụ giảm vì vậy nên lượng anthocyanin thu được giảm 0,653 mg/ml. Thông thường khi pH > 7 các anthocyanin có màu xanh anthocyanin bị biến tính mạnh ảnh hưởng đến cấu trúc cùng với độ bền màu nên hàm lượng anthocyanin giảm nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê, cụ thể ở pH=7 hàm lượng thu được là 0,647 mg/ml và ở pH=9 hàm lượng anthocyanin là 0,684 mg/ml. Do đó, chúng tôi chọn dung môi có giá trị pH=4 để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo. a b Hình 3.7 Màu sắc của dịch chiết khi trích ly ở các pH = 1 và pH = 4. a).Màu sắc của dịch chiết khi trích ly ở pH =1. b).Màu sắc của dịch chiết khi trích ly ở pH =4. 61
64. Đồ án tốt nghiệp a b Hình 3.8 Màu sắc của dịch chiết khi trích ly ở các pH = 7 và pH = 9. a). Màu sắc của dịch trích khi trích ly ở pH =7. b). Màu sắc của dịch trích khi trích ly ở pH =9 0.9 0.812 0.8 0.684 0.7 0.653 0.647 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 hàm lượng anthocyanin mg/ml lượng anthocyaninhàm 0.1 0 1 4 7 9 Giá trị pH Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin thu được khi trích ly ở các khoảng pH khác nhau 62
65. Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến hàm ợlư ng trích ly anthocyanin. Quá trình thu nhận anthocyanin cũng phụ thuộc vào thời gian trích ly, nếu thời gian quá ngắn thì dung môi và nguyên liệu không hòa tan hoàn toàn vào nhau ngược lại nếu thời gian tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu quá lâu sẽ ảnh hưởng đến màu sắc từ đó ảnh hưởng đến độ hấp thụ và hàm lượng anthocyanin. Sau đây là hàm lượng anthocyanin thu được ở các thời gian khác nhau. Bảng 3.5 Hàm lượng anthocyanin thu được khi trích ly ở các khoảng thời gian khác nhau. Thời gian (giờ) Hàm lượng anthocyanin (mg/ml) 24h 0,771 ± 0,022b 48h 0,642 ± 0,059a 72h 0,631 ± 0,031a 96h 0,635 ± 0,051a a,b: sự biễu diễn khác nhau có ý nghĩa về hàm lượng anthocyanin trích ly từ hoa bụp giấm ở các hệ dung môi khác nhau. Qua bảng số liệu 3.5 và hình 3.10 chúng tôi nhận thấy rằng: Hàm lượng anthocyanin thu được cao nhất khi để ở thời gian ngắn nhất (24h) là 0,771 mg/ml, càng ủ ở thời gian càng lâu thì hàm lượng anthocyanin càng giảm. Cụ thể khi để đến 48h thì hàm lượng anthocyanin giảm còn 0,642mg/ml, qua 72h thì giảm còn 0,635 mg/ml và sau 96h thì hàm lượng thu được là 0,631mg/ml nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê. Vì anthocyanin là chất dễ bị oxy hóa và mất màu nên khi để càng lâu khả năng tiếp xúc với ánh sáng và môi trường bên ngoài càng nhiều ảnh hưởng đến cấu trúc của anthocyanin gây biến tính và tăng quá trình sinh tổng hợp từ đó làm giảm khả năng hấp thụ và vì vậy mà hàm lượng anthocyanin từ đó cũng giảm theo. 63
66. Đồ án tốt nghiệp Do đó, chúng tôi lựa chọn thời gian chiết 24h là phù hợp nhất và áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 0.9 0.8 0.771 0.7 0.642 0.631 0.635 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 hàm lượng anthocyanin (mg/ml) lượng anthocyaninhàm 0.1 0 24 48 72 96 Thời gian ủ (giờ) Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin thu được ở các khoảng thời gian khác nhau. 3.2. Nội dung 2: Kết quả xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết anthocyanin bằng phương pháp DPPH. Ngoài tác dụng dược lý, sinh học tuyệt vời; hoạt tính chống oxy hóa cũng là một đặc trưng của hoa bụp giấm và dịch chiết của nó. Khả năng bắt gốc tự do của anthocyanin có trong đài hoa bụp giấm đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu. Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát khả năng kháng oxy hóa của dịch trích anthocyanin chiết xuất từ đài hoa bụp giấm sử dụng môi nước:ethanol (2:1) và đem kết quả thu được tiến hành đo IC50 thu được kết quả đem so sánh với khả năng kháng oxy hóa của vitamin C. 64
67. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6 Bảng giá trị nồng độ phần trăm bắt gốc DPPH của mẫu anthocyanin. Nồng độ (mg/ml) Qtb 0.064733333 97.088 0.032366667 95.363 0.021577778 85.486 0.016183333 71.363 0.010788889 47.738 0.008091667 39.538 0.006473333 32.444 0.005394444 28.279 0.003236667 18.158 0.002157778 9.535 Hình 3.11 Dịch trích anthocyanin khi tiến hành đo DPPH 65
68. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12 Sự đổi màu của dịch trích anthocyanin khi cho dung dịch DPPH vào. Trong thử nghiệm DPPH, các mẫu thử tác dụng với DPPH làm giảm màu của DPPH chứng tỏ trong dịch chiết anthocyanin được trích ly từ đài hoa bụp giấm có các nhóm chất có hoạt tính kháng oxy hóa, kết hợp với gốc tự do của DPPH dẫn đến hiện tượng giảm màu. Hình 3.13 Đồ thị thể hiện sự liên quan giữa nồng độ anthocyanin và khả năng kháng oxy hóa 66
69. Đồ án tốt nghiệp Giá trị IC50 được tính bằng chương trình GraphPad Prim 6 thu được giá trị là IC50 = 0,01154 mg/ml. Năng lực khử cũng là một phép phân tích nhằm đánh giá khả năng kháng oxy hóa in vitro, thể hiện qua giá trị IC50 của dịch trích anthocyanin từ đài hoa bụp giấm cao hơn đáng kể so với vitamin C. Giá trị IC50 là 0,0154 mg/ml. Kết quả cho thấy mẫu dịch chiết anthocyanin từ bụp giấm có hoạt tính kháng oxy hóa cao. Khi so sánh với chất đối chiếu vitamin C (0,0089 mg/ml) chỉ số IC50 của vitamin C nhỏ hơn rất nhiều. Kết quả này phù hợp cho nghiên cứu của Liuqing Yan và cs, 2012. IC50 càng thấp thì khả năng kháng oxy hóa càngạ m nh, điều đó có nghĩa là anthocyanin từ đài hoa bụp giấm có khả năng kháng oxy hóa thấp hơn vitamin C do có năng lực khử (IC50) cao hơn. Sau đây là bảng thể hiện khả năng kháng oxy hóa của một số loài thực vật khác nhau. Bảng 3.7 Giá trị IC50 của một số mẫu thực vật Tên thực vật IC50 (mg/ml) Trà xanh 0,0067 ± 0,1 Trà đen 0,0097 ± 0,1 Hoa roi đỏ 0,0099±0,2 Tiêu thất (trầu thuốc) 0,0113±0,3 Ngô 0,0179±0,2 Hồ tiêu 0,1441±2,2 Acid ascorbic 0,0089±0,1 (Nguồn: Asian J. Res. Pharm. Sci. 2012; Vol. 2: Issue 3, Pg 98-100) Qua bảng giá trị trên ta thấy rằng khả năng kháng oxy hóa của bụp giấm (0.01154mg/ml) thấp hơn so với trà xanh (0,0067 mg/ml), trà đen (0,0097 mg/ml), hoa roi đỏ (0,0099 mg/ml) và cao hơn ngô (0,0179 mg/ml) cao hơn nhiều so với hồ tiêu (0,1441 mg/ml). 67
70. Đồ án tốt nghiệp 3.3. Nội dung 3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến độ bền của anthocyanin. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của dịch chiết anthocyanin. Trong quá trình thu nhận và chế biến, anthocyanin dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ. Chúng tôi thực hiện khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của dịch chiết anthocyanin kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.8. Bảng 3.8 Hàm lượng anthocyanin thu được ở các khoảng nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ (o C) Hàm lượng anthocyanin (mg/ml) 60 0,627 ± 0,045a 70 0,721 ±0,036b 80 0,636 ± 0,019a 90 0,658 ± 0,022a 100 0,611 ± 0,043a a,b: sự biểu diễn khác nhau có ý nghĩa về hàm lượng anthocyanin trích ly từ hoa bụp giấm ở các nhiệt độ khác nhau. 68
71. Đồ án tốt nghiệp 0.74 0.721 0.72 0.7 0.68 0.658 0.66 0.636 0.64 0.627 0.62 0.61 0.6 0.58 hàm lượng anthocyanin (mg/ml) lượng anthocyaninhàm 0.56 0.54 60 70 80 90 100 Nhiệt độ khảo sát (độ C) Hình 3.14 Biểu đồ thể hiện hàm lượng anthocyanin khi gia nhiệt ở các khoảng nhiệt độ khác nhau. Qua kết quả ở bảng trên và biểu đồ ta thấy được: Hàm lượng anthocyanin còn lại trong dịch trích ly từ đài hoa bụp giấm khi gia nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau là khác nhau. Khi gia nhiệt ở nhiệt độ cao thì anthocyanin có thể bị phá hủy hay mất màu. Cụ thể, hàm lượng anthocyanin cao nhất trong mẫu gia nhiệt ở 70oC (0,721mg/ml). Tuy nhiên, khi nhiệt độ tiếp tục tăng thì hàm lượng anthocyanin lại giảm (từ 0,721 ở 70oC xuống còn 0,636; 0,658 và 0,611 khi tăng nhiệt độ lên đến 80, 90 và 100oC). Điều này cho thấy rằng hàm lượng anthocyanin không bền bởi nhiệt độ. Do đó, khi sử dụng dịch trích anthocyanin từ hoa bụp giấm nên chế biến ở nhiệt độ ở 700 để bảo toàn hàm lượng anthocyanin. 69
72. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.15 Dịch trích anthocyanin khi gia nhiệt ở 700C Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian gia nhiệt đến độ bền của dịch chiết anthocyanin. Anthocyanin là hợp chất dễ bị oxy hóa bởi các tác nhân như ánh sáng, nhiệt độ, kết quả của thí nghiệm trên đã cho thấy chúng dễ bị biến đổi ở các nhiệt độ khác nhau. Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian gia nhiệt đến độ bền màu của dịch trích anthocyanin, kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.9. 70
73. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.9 Hàm lượng anthocyanin còn lại ở các khoảng thời gian gia nhiệt khác nhau. Thời gian gia nhiệt (phút) Hàm lượng anthocyanin (mg/ml) 0 0,714 ± 0,049c 5 0.744 ± 0.021c 10 0.698 ± 0.064bc 15 0.634 ± 0.024ab 20 0.597 ± 0.038a 30 0.592 ± 0.013a a,b: sự biểu diễn khác nhau có ý nghĩa về hàm lượng anthocyanin trích ly từ hoa bụp giấm ở các thời gian gia nhiệt khác nhau. Từ bảng kết quả và biểu đồ cho thấy: Khi thời gian gia nhiệt càng lâu thì hàm lượng anthocyanin càng giảm, nhưng khi gia nhiệt trong thời gian ngắn (5 phút, 10 phút) thì hàm lượng anthocyanin thay đổi không đáng kể và sự thay đổi này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Khi kéo dài thời gian đun lên tới 15 phút thì hàm lượng anthocyanin giảm nhưng sự khác biệt không lớn so với khoảng thời gian 10 phút. Hàm lượng anthocyanin còn lại trong dịch chiết sau khi gia nhiệt ở 700C sau 15 phút là 0,634 mg/ml, nếu tiếp tục tăng thời gian gia nhiệt lên đến 20, 30 phút thì hàm lượng anthocyanin giảm đáng kể (0,597, 0,592 mg/ml) và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Gia nhiệt càng lâu thì các phân tử anthocyanin càng bị oxy hóa, dễ bị mất màu, cấu trúc cũng bị phân hủy không còn giữ được tính chất như ban đầu nên lượng anthocyanin trong dịch trích vì thế cũng giảm dần. Qua đó, ta thấy rằng anthocyanin là hợp chất không bền bởi nhiệt độ và thời gian, thời gian tối đa có thể sử dụng để gia nhiệt dịch chiết ở 700C được kiến nghị sau nghiên cứu này là 15 phút. 71
74. Đồ án tốt nghiệp 0.8 0.744 0.714 0.698 0.7 0.634 0.597 0.592 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 hàm lượng anthocyanin (mg/ml) lượng anthocyaninhàm 0.1 0 0 5 10 15 20 30 Thời gian (phút) Hình 3.16 Hàm lượng anthocyanin khi gia nhiệt ở các thời gian khác nhau. Hình 3.17 Dịch trích anthocyanin khi gia nhiệt ở 700C trong 5 phút. 72
75. Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích anthocyanin sau khi gia nhiệt. Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của dịch trích anthocyanin, chúng tôi tiến hành xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch trích thu được kết quả như bảng 3.6. Bảng 3.10 Khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết anthocyanin sau khi gia nhiệt. Hệ dung môi Nồng độ mẫu thử Qtb Dịch trích anthocyanin bị tác động Co/30 76,04 bởi nhiệt độ, thời gian. Co/15 89,79 Dịch trích anthocyanin ban đầu Co/30 90,325 Co/15 97,511 Qua bảng số liệu 3.10 chúng tôi nhận thấy rằng: Khả năng kháng oxy hóa của dịch trích anthocyanin sau khi gia nhiệt thấp hơn khả năng kháng oxy hóa của dịch trích anthocyanin ban đầu. Do anthocyanin là hợp chất phân cực nên dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và thời gian, khi bị gia nhiệt ở nhiệt độ cao và thời gian lâu thì cấu trúc của anthocyanin càng bị phá hủy vì vậy mà khả năng kháng oxy cũng giảm đáng kể. Ngoài ra, đài hoa bụp giấm có chứa hàm lượng vitamin C đáng kể, nhưng vitamin C lại dễ bị mất đi trong quá trình sơ chế và bảo quản. Do đó, khi sử dụng anthocyanin trong đời sống và thực phẩm cần tránh gia nhiệt ở nhiệt độ quá cao và thời gian quá lâu làm ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin cũng như hoạt tính kháng oxy hóa mà hợp chất này mang lại. 73
76. Đồ án tốt nghiệp 74
77. Đồ án tốt nghiệp Tóm tắt kết quả thí nghiệm Hình 3.18 Sơ đồ tóm tắt kết quả thí nghiệm 3.4. Bước đầu ứng dụng đài hoa bụp giấm trong sản xuất trà túi lọc Qua những khảo sát đã ếti n hành ở 3 nội dung trên chúng tôi nhận thấy bụp giấm là loài dược liệu quý, vừa tốt cho sức khỏe vừa có giá trị sử dụng trong công nghiệp. Sau đây chúng tôi tiến hành một số khảo sát ban đầu nhằm mục đích tìm ra quy trình có thể ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, cụ thể chúng tôi sẽ khảo sát quy trình chế biến trà túi lọc từ đài hoa bụp giấm. 75
78. Đồ án tốt nghiệp Quy trình sản xuất trà túi lọc thử nghiệm được tiến hành như sau: Hình 3.19 Sơ đồ quy trình bước đầu sản xuất trà túi lọc từ đài hoa bụp giấm. Thuyết minh quy trình: Làm héo: hoa bụp giấm sau khi thu hoạch về có chứa nhiều nước. Nếu đem tiến hành nghiền ngay thì bụp giấm sẽ bị nát, nước thoát ra mang theo một số chất hòa tan làm ảnh hưởng đến chất lượng trà thành phẩm. Do đó, làm héo để cho lượng nước 76
79. Đồ án tốt nghiệp trong bụp giấm bay hơi bớt, nguyên liệu trở nên mềm và dẻo dai hơn, do đó tăng cường khả năng hoạt động của các enzyme có trong nguyên liệu. Sấy khô: khi bụp giấm đã được làm héo tiến hành sấy khô để làm giảm độ ẩm của bụp giấm thuận lợi cho quá trình nghiền mịn và giúp cho việc bảo quản sản phẩm được lâu hơn. Nghiền, xay: đây là công đoạn tăng độ dập tế bào, làm cho toàn bộ hoa có tính đăc trưng nổi bật về hương vị và màu sắc của nước pha. Sàng: sau khi nghiền nhỏ, hoa bụp giấm được sàng trong những thiết bị thungf quay, phần nào không lọt qua sàng thì đưa trở lại nghiền tiếp. Kích thước lỗ rây khoảng 1,4mm. Phối trộn: công đoạn này rất quan trọng bởi nó làm cho mùi vị của túi trà được can bằng và hòa hợp hơn, bụp giấm cho vị chua thanh nên chúng tôi bổ sung la hán quả với tỉ lệ 1:1 vào trà để tăng thêm vị ngọt và cảm quan cho túi trà. Đóng gói: trà được cho vào túi đựng trà (khối lượng 2g/túi trà), túi này được sản xuất chuyên để đựng các loại trà, có sẵn cả dây để chúng ta cầm nhúng vào nước sôi. Sau khi cho trà vào túi thì đóng miệng trà bằng máy hàn miệng túi. Gói trà được hút chân không để đảm bảo không có không khí làm ẩm mốc trà. Đánh giá sản phẩm trà túi lọc: - Màu sắc: trà túi lọc khi pha có màu đỏ nhạt. - Mùi vị: có mùi thơm đặc trưng của hoa bụp giấm, vị chua thanh nhẹ không quá gắc hòa quyện vào vị ngọt của la hán quả. - Trạng thái cảm quan: trà khi pha ở dạng lỏng. 77
80. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau khi thực hiện đề tài, chúng tôi thu được một số kết quả như sau: - Các thông số thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin từ hoa bụp giấm bao gồm: hệ dung môi nước: cồn (2: 1); tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (4%); thời gian lắc 60 phút, pH = 4; thời gian ủ 24 giờ. - Dịch chiết anthocyanin từ hoa bụp giấm có hoạt tính kháng oxy hóa cao. IC50= 0,01154 mg/ml. - Để tránh sự thất thoát anthocyanin, chỉ nên gia nhiệt dịch chiết ở nhiệt độ 70ºC trong thời gian tối đa là 15 phút. 4.2. Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu còn hạn chế nên chúng tôi xin đề nghị khảo sát thêm một số vấn đề như sau: - Khảo sát ảnh hưởng các chất màu anthocyanin trong các điều kiện khác nhau nhằm ứng dụng trong thực phẩm. - Nghiên cứu các quy trình sản xuất các dạng sản phẩm khác nhau từ đài hoa bụp giấm ứng dụng trong đời sống. 78
81. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Huỳnh Thị Kim Cúc, Phạm Châu Quỳnh, Nguyễn Thị Lan, Trần Khôi Nguyên (2004). Xác định hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai, Tạp Chí Khoa Học và Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, số 3(7), 47 – 54. Nguyễn Thị Lan, Lê Thị Lạc Quyên (2004). Anhr hưởng của hệ dung môi đến khả năng chiết chất màu anthocyanin từ quả dâu. Tạp chí khoa học công nghệ, Đại học Đà Nẵng, số 2, 41 – 44. Hồ Viết Quý (2006). Giáo trình phân tích lí hóa. Nhà xuất bản giáo dục Alarcon-Aguilar, F.J.,Zamilp, Perez-Garcia, M.D., Almanza-Perez, J.C., Romero-Carrillo, L.I., Roman-Ramos, R. (2007). Effect of Hibiscus sabdariffa on obesity in MSG mice. Journal of Ethnopharma 114:66-71. Chien-Ning Huang, Kuei-Chuan Chan, Wei-Ting Lin, Shi-Li Su, Chau-Jong Wang and Chiung-Huei Peng (2009). Hibiscus sabdariffa Inhibits Vascular Smooth Muscle cell Proliferation and Migration Induced by High Glucose. A Mechanism Involes Connective Tissue Growth Factor Signals. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57 (8), 3073-3079. Chien-Ning Huang, Kuei-Chuan Chan, Wei-Ting Lin,Shi-Li Su, Chau-Jong Wang and Chiung-Huei Peng (2009). Hibiscus sabdariffa Inhibits Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation and Migration Induced by High Glucose. A Mechanism Involves Connective Tissue Growth Factor Signals. Journal of Agricultural and Food Chemistry57 (8), 3073- 3079. Chiung-Huei Peng, Charng-Cherng Chyau, KueiChuan Chan, Tsung-Hsien Chan, Chau-Jong Wang, and Chien-Ning Huang (2011). Hibiscus sabdariffa 79
82. Đồ án tốt nghiệp polyphenolic extract inhibits hyperglycemia, hyperlipidemia, and glycationoxidative stress while improving insulin resistance. Journal of Agricultural and Food Chemistry Morton, J.F. (1987). Roselle, Hibiscus sabdariffa L. In: Morton, J.F. (Ed.). Fruits of Warm Climates. Miami, Fl. USA, pp. 281-286. Ologundudu, A., A.O. Lawal, O.G. Adesina, F.O. Obi, (2006a). Effect of ethanolic extract of Hibiscus sabdariffa L. on 2, 4-dinitrophenylhydrazineinduced changes in blood parameters in rabbits. Global J. Pure Appl. Sci. 12(3): 335-338. Ologundudu, A., A.O. Lawal, O.G. Adesina, F.O. Obi (2006b). Effect of ethanolic extract of Hibiscus sabdariffa L. on 2, 4-dinitrophenylhydrazineinduced low glucose level and high malondialdehyde levels in rabbit brain and liver. Global J. Pure Appl. Sci. 12(4): 525-529. Tseng, T.H., E.S. Kao, F.P. Chu, H.W. Lin-Wa, C.J. Wang (2000). Protective effect of dried flower extracts of Hibiscus sabdariffa L. against oxidative stress in rat primary hepatocytes. Food and Chemical Toxicology 35(12):1159-1164. Julia F, Roselle, In: Fruits of warm climates, edited by Morton J, Miami, 1987, 281-286 (also available on http:// www.hort.purdue.edu/newcrop/morton/ roselle.html). Duke JA and Atchley AA, Proximate analysis, In: Christie, BR (ed), The handbook of plant science in agriculture, CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984. Vilasinee H, Anocha U, Noppawan PM, Nuntavan B, Hitoshi S, Angkana H and Chuthamanee S, Antioxidant Effects of aqueous extracts from dried calyx of Hibiscus sabdariffa L. (Roselle) in vitro using rat low-density lipoprotein (LDL), Biol Pharm Bull, 2005, 28(3), 481-484. Muller BM and Franz G, Chemical structure and biological activity of polysaccharides from Hibiscus sabdariffa, Planta Med, 1992, 58(1), 60-67. 80
83. Đồ án tốt nghiệp Mohamed R, Fernandez J, Pineda M and Aguilar M, Roselle (Hibiscus sabdariffa) seed oil is a rich source of -Toco pherol, J Food Sci, 2007, 72(3), 207-211. Samy MS, Chemical and nutritional studies on roselle seeds (Hibiscus sabdariffa L.), Z Ernahrungswiss 1980, 19(1), 47-49. Akiyoshi S, Chiaki N, Masanori M, Sadayoski M, Yoshiharu M and Sadao K, Glycosides in African dietary leaves, Hibiscus sabdariffa, J Oleo Sci, 2005, 54(3), 185- 191. Odigie IP, Ettarh RR and Adigun SA, The effect of aqueous extract of petals of Hibiscus sabdariffa (HS) on the established stages of 2-Kidney, 1-Clip renovascular hypertension, J Ethnopharmacol, 2003, 86(2-3), 181-185. Onyenekwe PC, Ajani EO, Ameh DA and Gamaniel KS, The antihypertensive effect of roselle (Hibiscus sabdariffa) calyx infusion in spontaneously hypertensive rats and a comparison of its toxicity with that in Wistar rats, Cell Biochem Funct, 1999, 17(3),199-206. Faraji MH and Haji Tarkhani A, The effect of sour tea (Hibiscus sabdariffa) on essential hypertension, J Ethnopharmacol, 1999, 65(3), 231-236. Adegunloye BJ, Omoniyi JO, Owolabi OA, Ajagbonna OP, Sofola OA and Coker HA, Mechanisms of the blood pressure lowering effect of the calyx extract of Hibiscus sabdariffa in rats, Afr J Med Sci, 1996, 25(3), 235-238. Ajay M, Chai HJ, Mustafa AM, Gilani AH and Mustafa MR,Mechanisms of the anti- hypertensive effect of Hibiscus sabdariffa L. calyces, Ethnopharmacol, 2007, 109(3), 388-393. Ezugwu CO, Haemostatic activity of the leaf extract of Hibiscus sabdariffa, J Trop Med Plants, 2002, 3(2), 175-180. 81
84. Đồ án tốt nghiệp Tseng TH, Wang CJ, Kao ES and Chu HY, Hibiscus protocatechuic acid protects against oxidative damage induced by tert- butylhydroperoxide in rat primary hepatocytes, Chem-Biol Inter, 1996, 101(2), 137-148. Asagba SO, Adaikpoh MA, Kadiri H and Obi FO, Influence of aqueous extract of Hibiscus sabdariffa L. petal on cadmium toxicity in rats, Biol Trace Elem Res, 2007, 115(1), 47-58. Ali BH, Mousa HM and El-Mougy S, The effect of a water extract and anthocyanins of Hibiscus sabdariffa L. on paracetamol- induced hepatoxicity in rats, Phytother Res, 2003, 17(1), 56-59. Dahiru D, Obi OJ and Umaru H, Hibiscus sabdariffa extract enhances the recovery from hepatic damage induced by carbon tetrachloride, Biokemistri, 2003, 15(1), 27-33. Chau Jong W, Fen Pi C, Chang Che C, Yung Chyan H, Wea Lung L, Chin Pin W, Erl Shyh K and An Chung H, Inhibitory effects of Hibiscus sabdariffa L extract(HSE) on low-density lipoprotein oxidation and anti- hyperlipidemia in fructose- fed and cholesterol-fed rats, J Sci Food Agric, 2004, 84(15), 1989-1996. Brunold C, Deters A, Sidler FK, Hafner J, Müller B and Hensel A, Polysaccharides from Hibiscus sabdariffa Flowers Stimulate Proliferation and Differentiation of Human Keratinocytes, Planta Med, 2004, 70, 370-373. Mounnissamy VM, Kavimani S and Gunasegaran R, Antibacterial activity of gossypetin isolated from Hibiscus sabdariffa, The Antiseptic, 2002, 99(3), 81-82. 82
85. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 83