Đồ án Định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ dầu tiếng

pdf 66 trang thiennha21 13/04/2022 3320
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ dầu tiếng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_dinh_danh_vung_gene_16s_dna_chung_vi_khuan_lam_co_kha.pdf

Nội dung text: Đồ án Định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ dầu tiếng

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỊNH DANH VÙNG GENE 16S DNA CHỦNG VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TỐ Ở HỒ DẦU TIẾNG Ngành: Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS. Hoàng Quốc Khánh HVCH. Ngô Đức Duy Sinh viên thực hiện : Khưu Văn Quang MSSV: 1311101028 Lớp: 13DSH06 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. LỜI CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài xin cam đoan những nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, dưới sự hướng dẫn của TS.Hoàng Quốc Khánh và HVCH.Ngô Đức Duy. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo nào đã được công bố trước đây. Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí khoa học và các trang web theo danh mục tài liệu của đồ án. Nếu sai người thực hiện đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm và mọi kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra. Sinh viên thực hiện Khưu Văn Quang
  3. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt bài báo cáo này. Em xin chân thành cảm ơn đến: Thầy Ngô Đức Duy phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM. đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Nguyễn Hoàng Dũng phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em làm đồ án tốt nghiệp tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ để em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp. Chị Lê Quỳnh Loan đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẽ kiến thức, kinh nghiệm và tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho em nhiều điều trong suốt quá trình nghiên cứu. Toàn thể các Thầy Cô khoa CNSH-TP-MT trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh là những người đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em được ngày hôm nay. Các bạn trong lớp 13SH06 đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẽ mọi thứ với tôi trong suốt quãng đường thời sinh viên. Cuối cùng, con xin cảm ơn Ba Mẹ đã nuôi nấng, chăm sóc, dạy dỗ và cho con ăn học thành người có ích cho xã hội. Sinh Viên Thực Hiện Khưu Văn Quang
  4. 1 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 5 1.1. Tổng quan về tin sinh học 5 1.1.1. Sự ra đời của tin sinh học 5 1.1.2. Khái niệm Tin sinh học 5 1.1.3. Vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học 6 1.1.4. Cây phát sinh loài 6 1.1.5. Công cụ và cách tiến hành 7 1.1.6. Đánh giá kết quả 8 1.2. Tổng quan về định danh sinh học phân tử 8 1.2.1. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số 9 1.2.2. Phương pháp PCR và ứng dụng 11 1.3. Tổng quan về vi khuẩn lam 13 1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lam 13 1.3.2. Hình thái và cấu trúc tế bào 14 1.3.3. Phân loại vi khuẩn lam 15 1.3.4. Hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam 16 1.3.5. Độc tố microcystins 17 1.3.6. Hai hợp chất gây mùi hôi geosmin và 2-methylisoborneol 20 1.3.7. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn lam và độc tố của vi khuẩn lam 21 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Thời gian và địa điểm 25 i
  5. 2.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất 25 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị 25 2.2.2. Nguồn mẫu 25 2.2.3. Hóa chất 25 2.3. Phương pháp thu mẫu 27 2.3.1. Phương pháp phân lập 27 2.3.2. Phương pháp nuôi tăng sinh khối và thu sinh khối vi khuẩn lam 27 2.3.3. Định danh chủng vi khuẩn lam bằng sinh học phân tử 28 Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1. Kết quả ly trích và thu nhận DNA bộ gene của hình thái vi khuẩn lam 35 3.2. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau khi ly trích và thu nhận 36 3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gen 16S DNA bằng kỹ thuật PCR 37 3.3.1. PCR với cặp mồi CYA371F, 373R 37 3.3.2. PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R 38 3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn lam 39 3.5. Kết quả giải trình tự vùng gen 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam 39 3.5.1. Mẫu 2 (chủng Microsystis) 39 3.5.2. Mẫu 10 (chủng Anabaena) 40 3.5.3. Mẫu 29 (chủng Cylindropermopsis) 40 3.5.4. Mẫu 31(chủng plantothrix) 41 3.6. Kết quả so sánh trình tự gen trên ngân hàng NCBI và xây dựng cây phát sinh loài 41 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 4.1. Kết luận 44 4.2. Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC ii
  6. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DNA Deoxyribo Nucleic Axit RNA Ribonucleic Acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction UV Ultraviolet TAE Tris acetate ethylenediaminetetraacetic acid MCs Microcystins MIB Methylisoborneol ITB Institute of Tropical Biology CTAB Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide Cs Cộng sự SDS Sodium dodecyl sulfate Bp Base pairs UV Ultra violet iii
  7. DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Vi khuẩn lam nở hoa ở Hồ Dầu Tiếng 17 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 3 loại độc tố microcystins thường gặp 18 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Geosmin và 2-methylisoborneol MIB 21 Hình 2.1. Sinh khối vi khuẩn lam 28 Hình 2.2. Quy trình phản ứng PCR 31 Hình 3.1. Kết quả thu nhận DNA bộ gene của vi khuẩn lam gồm 4 chủng trên gel agarose 1,5 35 Hình 3.2. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi CYA371F, 373R 37 Hình 3.3. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R 38 Hình 3.4. Kết quả điện di trên gel agarose của các chủng vi khuẩn lam sau khi tinh sạch 39 Hình 3.5. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene 16S DNA của các chủng Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis với vi khuẩn lam trên ngân hàng NCBI . 42 iv
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA371F và 373R 32 Bảng 2.2.Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA-F và CYA-R 33 Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau thu nhận 36 v
  9. Đồ Án Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việc gia tăng dân số, phát triển các ngành công nghiệp, nông nghiệp đã và đang làm gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là ni tơ và phốt pho) đáng kể vào các thủy vực. Ô nhiễm dinh dưỡng diễn ra ngày càng quan trọng tại các thủy vực như sông, hồ, đầm nuôi trồng thủy sản luôn đi kèm với hiện tượng nở hoa nước mà thực chất là sự phát triển mạnh mẽ của quần xã thực vật nổi trong đó chủ yếu do vi khuẩn lam (VKL). Vi khuẩn lam là một trong những sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đất cách đây hàng tỷ năm và tồn tại cho đến ngày nay. Cùng với vi tảo, vi khuẩn lam đóng một vai trò quan trọng trong sinh thái thủy vực như cung cấp nguồn năng lượng sơ cấp cho các chuỗi thức ăn trong thủy vực, đồng thời giải phóng một lượng oxy vào không khí thông qua quá trình quang hợp. Tuy nhiên, bên cạnh những đóng góp tích cực thì hiện tượng tăng trưởng bùng phát hay còn gọi là nở hoa của vi khuẩn lam gây nhiều ảnh hưởng xấu lên chất lượng môi trường nước, tài nguyên thủy sản và cân bằng hệ sinh thái. Trong đó một số loài nhóm vi sinh này có khả năng sản sinh độc tố. Ở nước ta, vi khuẩn lam sinh độc và độc tố của chúng thường xuất hiện trong các thủy vực nước ngọt. Chúng có khả năng sản sinh ra các loại độc tố như neurotoxin (độc tố thần kinh) và hepatotoxin (độc tố gan). Độc tố nhóm vi sinh này tác động nguy hiểm tới sinh vật thủy sinh và sức khỏe con người. Do đó Tổ chức Y tế thế giới (WHO) quy định nồng độ giới hạn trong nước uống không được vượt quá là 1 µg/L. Ngoài ra một số chủng này còn sinh ra các hợp chất gây mùi hôi trong nước. Ở Việt Nam ô nhiễm môi trường nước mà chủ yếu là ô nhiễm chất hữu cơ, chất dinh dưỡng, kéo theo bùng nổ thực vật nổi, trong đó có tảo độc đang diễn ra rất phổ biến do tác động của các hoạt động con người trong các lưu vực sông, hồ Tại các hồ như hồ Ba Bể, hồ Tây, hồ hoàn Kiếm, hồ Dầu Tiếng, hồ Trị An, hồ Núi Cốc 1
  10. Đồ Án Tốt Nghiệp đều quan sát thấy sự hiện diện của vi khuẩn lam độc chủ yếu là các loài thuộc Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis Hồ Dầu Tiếng là hồ chứa nước nhân tạo có chức năng như ngăn lũ, cấp nước sinh hoạt, tưới tiêu, rửa mặn, cải thiện chất lượng nước và nuôi trồng thủy sản. Là nguồn cung cấp trực tiếp hoặc gián tiếp nước sinh hoạt và tưới tiêu cho hàng triệu dân ở Tây Ninh, Bình Dương và TP.Hồ Chí Minh. Hiện nay, các nghiên cứu đã cho thấy thành phần vi khuẩn lam tại hồ Dầu Tiếng rất đa dạng và hiện tượng nở hoa tại đây đang là một vấn đề quan trọng và mang tính cấp bách. Vi khuẩn lam nở hoa và độc tố của chúng sinh ra sẽ gây ảnh hưởng rất lớn tới sinh vật thủy sinh, động vật sống xung quanh hồ và sức khỏe con người. Phần lớn các nghiên cứu ở nước ta hiện nay chỉ tập trung vào đánh giá sự đa dạng của nhóm vi sinh này tại các thủy vực, đặc điểm hình thái cũng như chỉ nghiên cứu độc tính trên thực vật hoặc động vật thủy sinh. Chưa có nhiều nghiên cứu tập trung về định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam. Và đây là đề tài khảo sát về sự hiện diện của các chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ Dầu Tiếng hiện nay. 2. Mục đích nghiên cứu Mục đích của đề tài là định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở Hồ Dầu Tiếng. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập một số loài vi khuẩn lam tại hồ Dầu Tiếng. Định danh vi khuẩn lam tới chi dựa theo hình thái học và sinh học phân tử. Khảo sát sự hiện diện có mặt chủ yếu của loài vi khuẩn lam ở hồ Dầu Tiếng. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp thu mẫu, phân lập mẫu và nuôi tăng sinh khối, thu sinh khối vi khuẩn lam. 2
  11. Đồ Án Tốt Nghiệp Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gene DNA (theo phương pháp CTAB). Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi 16S DNA. Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gene 16S DNA loài vi khuẩn lam. Đề tài có sử dụng các phần mềm như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0. Ngân hàng gene Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet. 5. Các kết quả đạt đƣợc Sau quá trình nghiên cứu đề tài đã tách chiết được 4 chủng vi khuẩn lam dựa vào các bước định danh sinh học phân tử, dựa trên các nghiên cứu trong và ngoài nước thì cả 4 loài vi khuẩn lam này đều có khả năng gây bệnh nguy hiểm trên thực vật, động vật nguyên sinh và cả con người. Và đã chọn lọc được đoạn mồi thích hợp để định danh 4 chủng vi khuẩn lam là Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis. 6. Kết cấu đề tài Đề tài gồm 4 chương Chương 1: Tổng quan Trình bày về sự ra đời, khái niệm, vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học để dựng cây phát sinh loài. Giới thiệu về kỹ thuật PCR và các ứng dụng chủ yếu của PCR để sử dụng trong định danh vi khuẩn lam. Giới thiệu tổng quan về vi khuẩn lam, hình thái, cấu trúc tế bào, phân loại và hiện tượng nở hoa của loài vi khuẩn lam, tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam trong và ngoài nước. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3
  12. Đồ Án Tốt Nghiệp Trình bày thời gian và địa điểm thu mẫu, những hóa chất, máy móc thiết bị phục vụ nghiên cứu và toàn bộ các quy trình, thao tác thực hiện các phương pháp nghiên cứu như thu mẫu, phân lập, nuôi tăng sinh khối, thu sinh khối, định danh, phương pháp ly trích DNA, đo OD, điện di, tinh sạch DNA và giải trình tự gene. Chương 3: Kết quả và biện luận Trình bày và biện luận những kết quả chi tiết của toàn bộ quá trình thực hiện nghiên cứu. Chương 4: Kết luận và đề nghị Tổng kết lại những kết quả nghiên cứu đã đạt được và đưa ra những đề nghị liên quan nhằm hoàn thiện đề tài. 4
  13. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về tin sinh học 1.1.1. Sự ra đời của tin sinh học Do sự xuất hiện của các thông tin về cấu trúc, chức năng và trình tự protein, DNA từ đó dẫn tới nhu cầu quản lý, so sánh và dự đoán cấu trúc và chức năng của chúng. Ngoài ra, sự phát triển của các ngành khoa học khác như là công nghệ thông tin, máy tính đã hình thành môn khoa học mới đó là Tin sinh học (bioinformatics). 1.1.2. Khái niệm Tin sinh học Tin sinh học (bioinformatics) là môn học về cách sử dụng máy tính để giải quyết những vấn đề của khoa học sự sống, chủ yếu là vấn đề cơ sở dữ liệu phong phú của bộ gen, trình tự protein Tin sinh học (bioinformatics) là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính, trí tuệ nhân tạo, hóa học và hóa sinh (biochemistry) để giải quyết các vấn đề sinh học. Một thuật ngữ thường được dùng thay thế cho tin sinh học là sinh học tính toán (computational biology). Tuy nhiên, tin sinh học thiên về việc phát triển các giải thuật, lý thuyết và các kĩ thuật thống kê và tính toán để giải quyết các bài toán bắt nguồn từ nhu cầu quản lý và phân tích dữ liệu sinh học. Trong khi đó, sinh học tính toán thiên về kiểm định các giả thuyết (hypothesis) được đặt ra của một vấn đề trong sinh học nhờ máy tính thực nghiệm trên dữ liệu mô phỏng, với mục đích chính là phát hiện và nâng cao tri thức về sinh học (ví dụ: dự đoán mối quan hệ tương tác giữa các protein, dự đoán cấu trúc bậc 2 phân tử của protein, v.v.). Ngoài ra nó còn giải quyết những vấn đề về kỹ thuật như mô hình cấu trúc ba chiều của phân tử và các hệ thống sinh học. 5
  14. Đồ Án Tốt Nghiệp Các ngành của Tin sinh học bao gồm: tin sinh học genome, tin sinh học protein, tin sinh học tiến hóa, tin sinh học nông nghiệp, tin sinh học y học, phát triển các công cụ và cơ sở nền. Thuật ngữ bioinformatics có thể định nghĩa một cách ngắn gọn là sự kết hợp giữa công nghệ sinh học và công nghệ thông tin với mục tiêu giúp hiểu biết và khám phá những nguyên lý trong sinh học (National Center for Biotechnology Information). 1.1.3. Vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học 1.1.3.1. Vai trò của Tin sinh học - Tập hợp, lưu trữ, sắp xếp, truy xuất cơ sở dữ liệu. - Hỗ trợ cho việc tìm kiếm, phân tích, xử lý và dự đoán các kết quả nghiên cứu. - Hỗ trợ trong các nghiêm cứu về cấu trúc không gian phân tử. - Hỗ trợ trong nghiên cứu đa dạng và tiến hóa của sinh vật 1.1.3.2. Xu hướng phát triển của Tin sinh học Những lĩnh vực của Tin sinh học đang được tập trung nghiên cứu: + Quản lí cơ sở dữ liệu. + Phân tích, biên dịch dữ liệu. + Phát triển các thuật toán. + Các cấu trúc cơ sở dữ liệu. + Thiết kế các giao diện và hiển thị. 1.1.4. Cây phát sinh loài Cây phát sinh loài là (tiếng Anh: phylogenic tree) miêu tả lịch sử tiến hóa của một nhóm các loài (species) với những đặc tính khác nhau nhưng cùng có mối quan hệ họ hàng với nhau và cùng hình thành từ một tổ tiên chung trong quá khứ. Có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau để chứng minh đặc điểm phát sinh chủng loại này. Trước hết, người ta có thể so sánh trình tự các đoạn DNA (thuộc sinh học phân 6
  15. Đồ Án Tốt Nghiệp tử hay hệ gene học (genomics); hoặc so sánh các hóa thạch (fossil) hoặc các di chỉ (record) của cổ sinh vật học (thuộc khảo cổ học - paleontology). Các nhà sinh học tổ chức và phân tích các mối quan hệ tiến hóa thông qua các phương pháp khác nhau, bao gồm phát sinh chủng loài học (phylogenetics), ngoại hình học (phenetics) và miêu tả theo nhánh học (cladistics). Các sự kiện chính xảy ra trong quá trình tiến hóa của sự sống được xây dựng thành biểu đồ thời gian của tiến hóa (evolutionary timeline) dựa trên các hiểu biết hiện nay của khoa học. Chúng ta có thể tạo cây phát sinh loài từ các trình tự đoạn gene có được so sánh với những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gene bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần mềm tin sinh học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp những thông tin có liên quan đến tiến hóa. Một cây phát sinh loài gồm các thành phần sau: - Một nhánh (một đơn vị huyết thống) là một nhóm vi sinh vật hay nhóm gene bắt nguồn từ tổ tiên chung. Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài. - Nút giao điểm của các nhánh. - Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gene được sử dụng phổ biến trong định danh phân loại. 1.1.5. Công cụ và cách tiến hành Seaview 4 là một phần mềm (giao diện Windows) dùng để so sánh tương đồng nhiều trình tự DNA và protein. Nó mô tả kết quả bằng hệ thống các màu sắc và làm nổi bậc những nét đặc trưng trong những đoạn tương đồng. MEGA5 5.0.1.120 là một phần mềm dùng để vẽ cây phát sinh loài. Phần mềm này thực hiện đọc kết quả so sánh từ những tập tin dạng PHYLIP hoặc MEGA của chương trình seaview 4.32.0.0. 7
  16. Đồ Án Tốt Nghiệp Mở chương trình seaview 4 trên desktop. Lựa chọn chức năng Multiple Alignment Mode. Từ menu File, chọn Load Sequences. Trong hộp Open, chọn các tập tin chứa các trình tự cần so sánh. Nhấn nút Open. Chọn Do Complete Alignment trong Menu Alignment. Xác định vị trí cho tập tin xuất rồi nhấn nút Align. 1.1.6. Đánh giá kết quả Kết quả xuất hiện các trình tự so sánh tương đồng. Các vị trí trình tự giống nhau sẽ được thể hiện cùng một màu sắc (mỗi loại nucleotide một màu) và được đánh dấu *. Vị trí giống nhau. Ta có thể nhận xét mức độ tương đồng của các trình tự thông qua sự tương đồng về màu sắc và dạng đồ thị bên dưới. Để tạo cây phát sinh loài dạng PHYLIP chúng ta cần thực hiện các bước: + Trong menu Trees, chọn chức năng Draw N-J Trees. + Trong hộp DRAW TREE ta chọn nút OK để lưu tập tin dạng *.ph + Mở chương trình Tree View trên desktop. Từ menu File, chọn Open. + Trong hộp Open chọn tập tin *.ph và File of type là All tree files. Một trang kết quả cây phát sinh loài bằng cách nhấn vào các nút Phylogram, Rectanglar Cladogram, Cladogram, Radial tree. 1.2. Tổng quan về định danh sinh học phân tử Có nhiều cách để định danh sinh học phân tử như: PCR, southern blotting, northern blotting, western blotting, immunohistochemistry, microarray nhưng phương pháp chủ yếu định danh đối với loài vi khuẩn lam là PCR. 8
  17. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.2.1. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số 1.2.1.1. Nguyên tắc và yêu cầu Ly trích và thu nhận DNA tổng số là nhu cầu cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gene đều tiến hành với DNA (hay RNA). Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease - RNase). 1.2.1.2. Một số phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gene hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Sự ra đời của kỹ thuật dựa trên phân tử acid nucleic đã dẫn tới sự thay đổi lớn trong việc phát hiện vi sinh vật trong môi trường tự nhiên. Với những kỹ thuật này đã phát hiện một số thay đổi lớn về việc tìm hiểu cấu trúc và sự vận động của các vi sinh vật cộng đồng trong môi trường tự nhiên. Ly trích DNA thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như không ly trích hoàn toàn tế bào vi khuẩn hoặc DNA bị hư hỏng. Rõ ràng việc áp dụng một quy trình ly trích DNA phù hợp với các mẫu cụ thể là rất cần thiết cho việc đánh giá đúng đa dạng vi sinh vật. Phương pháp ly trích DNA cần 9
  18. Đồ Án Tốt Nghiệp phải đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả. Chất lượng DNA là rất quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại DNA về sau. Do đó ly trích DNA được coi như một bước phân tích độc lập trong phân tích đa dạng vi sinh vật. Việc ly trích thường kết hợp với các chất tẩy, các tác nhân vật lý, các dung môi và enzyme để thu được nucleic acid (Haruta và cộng sự (2002); Tomoyukihori và cộng sự (2006). Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Quá trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp. Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên thường được sử dụng: - Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): Được xem là phương pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. J Zhou và cộng sự (1996) đã sử dụng phương pháp ly trích với nồng độ muối cao (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyl trimethyl ammonium bromide, và proteinase K. - Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA của vi khuẩn sử dụng phương pháp CTAB được mô tả bởi Ausubel và cộng sự (1992). Ly trích DNA cần phải có cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết. Trong nghiên cứu của Jara C. (2008), phương pháp ly trích tốt nhất là phương pháp CTAB. - Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu quả. Nó có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia 10
  19. Đồ Án Tốt Nghiệp nhiệt đến 650C. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại kết quả khá cao. Phương pháp này được Zhu và cộng sự (1993) sử dụng để ly trích DNA của cả thực vật, nấm và vi khuẩn. - Phương pháp đóng băng và tan băng: Là phương pháp do Ellingsue và cộng sự (2002). Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở - 65oC trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. 1.2.2. Phương pháp PCR và ứng dụng 1.2.2.1. Kỹ thuật PCR Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh (1985) tạo nên bước tiến nhảy vọt trong sinh học phân tử và kỹ thuật gene. Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gene, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gene. PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao mà không qua tạo dòng, nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược. 11
  20. Đồ Án Tốt Nghiệp Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Mồi xuôi (forward primer): Bắt cặp với mạch khuôn DNA và kéo dài theo chiều phiên mã. Mồi ngược (reverse primer): Bắt cặp mạch mã của DNA và kéo dài ngược chiều phiên mã. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm có: DNA mẫu, mồi xuôi, mồi ngược, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR buffer, MgCl2, Taq polymerase. 1.2.2.2. Các ứng dụng chủ yếu của PCR Có thể nói sinh học hiện đại nói chung, sinh học phân tử nói riêng không thể thiếu ứng dụng của kỹ thuật PCR. Trong kỹ thuật gene, PCR sử dụng thường xuyên trong tách dòng gene, xây dựng ngân hàng gene, lập bản đồ gene và giải trình tự bộ gene. PCR được dùng trong chẩn đoán bệnh do virus, vi khuẩn và các đột biến di truyền. PCR được dùng để tạo đột biến invitro, trong công nghệ protein tái tổ hợp, tạo ra nhiều protein có tính năng vượt trội mà trong tự nhiên chưa hề có. Nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài và phân loại phân tử. 1.2.2.3. Đoạn gene 16S rDNA Gene rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một gene có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho bất kì protein nào. Các bản sao của gene nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ 12
  21. Đồ Án Tốt Nghiệp sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh sinh vật. Gene rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gene, khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA. Để phát hiện sự hiện diện DNA của vi khuẩn lam, cặp mồi CYA (Urbach và cộng sự, 1992; Hotto và cộng sự, 2005; Pham và cộng sự, 2015) đã được sử dụng để khuếch đại một đoạn 1200 bp của đoạn gene 16S rDNA phổ biến cho hầu hết các chủng vi khuẩn lam. Ngoài ra một số loài vi khuẩn lam thuộc chi Planktothricoides và Microcystis được phát hiện dựa trên cặp mồi CYA371F và 373R (Savichtcheva và cộng sự, 2011) khuếch đại một đoạn gen khoảng 1500 bp. 1.3. Tổng quan về vi khuẩn lam 1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lam Vi khuẩn lam (danh pháp khoa học: Cyanobacteria) hay Tảo Lam (blue – green algae) là một trong những nhóm sinh vật có sức sống mãnh liệt, có khả năng thích ứng với hầu hết các điều kiện môi trường nên chúng có mặt ở mọi nơi: trên mặt đất, ao hồ, sông suối và ven biển (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2007). Vi khuẩn lam đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái thủy vực, là sinh vật sơ cấp trong môi trường nước. Cùng với vi tảo, vi khuẩn lam cung cấp năng lượng sơ cấp cho những sinh vật ở bậc cao hơn trong tháp năng lượng (Đào Thanh Sơn và cộng sự, 2013). Khi chết chúng tạo ra nhiều bùn bã hữu cơ, là nguồn thức ăn quan trọng cho nhiều loài sinh sinh vật. Nhiều loài vi khuẩn lam làm tăng độ phì nhiêu của đất bằng khả năng cố định đạm (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2007). Ngoài ra, một số loài vi khuẩn lam còn dùng để làm sạch các nguồn nước thải (Dương Thị Hoàng Oanh và 13
  22. Đồ Án Tốt Nghiệp cộng sự, 2011). Trong điều kiện môi trường thuận lợi ở các thủy vực giàu dinh dưỡng, vi khuẩn lam dễ dàng phát triển mạnh và gây hiện tượng “nước nở hoa” gây độc cho môi trường và ảnh hưởng bất lợi đến các sinh vật khác (Đặng Ngọc Thanh và cộng sự, 2002; Dương Thị Hoàng Oanh và cộng sự, 2011). Bằng việc tạo ra oxy ở dạng khí như là một phụ phẩm của quá trình quang hợp, các vi khuẩn lam được người ta cho là đã chuyển đổi khí quyển mang tính khử ở thời kỳ đầu thành khí quyển mang tính ôxi hóa, một công việc đã thay đổi mãnh liệt thành phần sự sống trên Trái Đất bằng sự kích thích đa dạng sinh học và dẫn tới sự gần như tuyệt chủng của các sinh vật không chịu được ôxy. Theo thuyết nội cộng sinh, các lục lạp được tìm thấy trong thực vật và tảo nhân chuẩn đã tiến hóa từ các tổ tiên là vi khuẩn lam thông qua cơ chế nội cộng sinh. 1.3.2. Hình thái và cấu trúc tế bào Hình thái của vi khuẩn lam có thể được chia thành nhiều dạng bao gồm đơn bào, đa bào, dạng tập đoàn hay dạng sợi. Tế bào nhóm vi sinh này không mang roi. Sinh sản bằng cách chia đôi. Các tế bào có thể được bao bọc trong một khối nhầy có màu vàng nhạt hoặc không màu trong suốt quá trình sinh trưởng để tạo thành tập đoàn. Một số chủng dạng sợi, dạng chuỗi. Cấu trúc đa bào bao gồm một chuỗi các tế bào gọi là trichome. Trichome có thể thẳng hoặc cuộn xoắn. Cấu trúc tế bào khá đơn giản, chưa có nhân điển hình, chưa có màng phân cách giữa nhân và tế bào chất, cấu trúc thành tế bào là lớp peptidoglycan tương tự như cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn gram âm; bao gồm 2 lớp: Lớp peptidoglican cứng, dính liền với màng tế bào. Lớp lipopolisacharide ở phía ngoài. Một đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn lam là sự hiện diện của không bào khí (khí thể) trong tế bào, chúng có thể làm cho tế bào nổi. Một số chủng thuộc các chi như Anabaena thường sẽ hình thành những tế bào đặc biệt khác với tế bào dinh dưỡng gọi là dị bào, đây là nơi xảy ra quá trình cố định nitơ. Ngoài ra nhóm vi sinh vật này còn có tế bào nghỉ. 14
  23. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.3.3. Phân loại vi khuẩn lam Trước đây thường nhầm lẫn là Tảo lam (Cyanophyta). Thực ra đây là những cơ thể nhân nguyên thuỷ, không liên quan gì đến tảo , ngoài khả năng quang hợp hiếu khí (quang tự dưỡng vô cơ) và dùng H2O làm chất cho điện tử trong quá trình quang hợp. Vi khuẩn lam chứa chlorophyll a và phycocyanin - phycobiliprotein. Một số loài có sắc tố đỏ phycoerythrin. Chúng phối hợp với sắc tố lục tạo nên màu nâu. Màng liên kết với phycobilisom. Đơn bào hoặc đa bào dạng sơi. Không di động hoặc di động bằng cách trườn (gliding), một số loài có túi khí (gas vesicles). Nhiều loại có dị tế bào (heterocysts) và có khả năng cố định nitơ. Vi khuẩn lam có mặt ở khắp mọi nơi, trong đất, trên đá, trong suối nước nóng, trong nước ngọt và nước mặn. Chúng có năng lực chống chịu cao hơn so với thực vật đối với các điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp. Một số loài có khả năng sống cộng sinh với các cơ thể khác như Rêu, Dương xỉ, Tuế Nhiều loài cộng sinh với nấm để tạo ra Địa y (Lichen). Vi khuẩn lam có thể là sinh vật xuất hiện sớm nhất trên Trái Đất. Vi khuẩn lam được chia thành 5 bộ theo đặc điểm hình thái: Chroococcales, Oscillatorriales, Nostocales, Stigonematales và Pleurocapsales (theo NCBI; 2005): 1.3.3.1. Bộ Chroococcales Hình que hoặc hình cầu đơn bào, không có dạng sợi hay dạng kết khối (aggregate), phân đôi hoặc nẩy chồi, không có dị tế bào (heterocytes). Hầu hết không di động. Tỷ lệ G+C là 31-71%. Các chi tiêu biểu là: Chamaesiphon, Chroococcus, Gloeothece, Gleocapsa, Prochloron. 1.3.3.2. Bộ Oscillatorriales Dạng sợi (filamentous), dạng lông (trichome) không phân nhánh chỉ có ở các tế bào dinh dưỡng, phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn (fragmentation), không có dị tế bào, thường di động. Tỷ lệ G+C là 34-67%. Các chi tiêu biểu là: Lyngbya, Osscillatoria, Prochlorothrix, Spirulina, Pseudanabaena. 15
  24. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.3.3.3. Bộ Nostocales Dạng sợi, dạng lông (trichome) không phân nhánh có thể chứa các tế bào biệt hoá (specialized cell), phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn tạo thành đoạn sinh sản (hormogonia), có tế bào dị hình, thường di động có thể sản sinh bào tử màng dày (akinetes). Tỷ lệ G+C là 38-47%. Các chi tiêu biểu là : Anabaena, Cylindrospermum, Aphanizomenon, Nostoc, Scytonema, Calothrix. 1.3.3.4. Bộ Stigonematales Lông (trichome) dạng sợi, phân nhánh hoặc do các tế bào nhiều hơn một chuỗi tạo thành, phân đôi theo nhiều mặt phẳng, hình thành đoạn sinh sản (hormogonia), có tế bào dị hình, có thể sản sinh bào tử màng dày ( alkinetes), có hình thái phức tạp và biệt hóa (differentiation). Tỷ lệ G+C là 42-44%. Các chi tiêu biểu là: Fischerella, Stigonema, Geitlerinema. 1.3.3.5. Bộ Pleurocapsales Hình que hoặc hình cầu đơn bào, có thể tạo dạng kết khối (aggregate), phân cắt nhiều lần tạo ra các baeocytes, không có dị tế bào. Chỉ có các baeocytes là có di động. Tỷ lệ G+C là 40-46%. Các chi tiêu biểu là: Pleurocapsa, Dermocapsa, Chroococcidiopsis. 1.3.4. Hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam Hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam xảy ra rất nhiều các thủy vực bị phú dưỡng. Nguyên nhân là do sự gia tăng đột biến số lượng tế bào trôi nổi như Microcystis, Anabaena, Oscillatoria trên mặt nước. Hiện tượng nở hoa thường xảy ra vào mùa hè ở vùng ôn đới khi nhiệt độ môi trường cao. Tuy nhiên ở vùng nhiệt đới, sự nở hoa của nhóm vi sinh này có thể xảy ra quanh năm. Nguyên nhân của hiện tượng nở hoa là sự gia tăng hàm lượng nitơ và photpho trong nước tạo điều kiện thuận lợi cho chúng phát triển mạnh. Tuy nhiên do có khả năng nổi trên mặt nước nên có lợi thế trong việc hấp thu lượng ánh sáng mạnh hơn, bên cạnh đó khả năng cố định nitơ của một số loài khi hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường giảm giúp cho chúng cạnh tranh tốt hơn so với các loài tảo khác. Hiện tưởng nở hoa gây 16
  25. Đồ Án Tốt Nghiệp ra rất nhiều vấn đề cho hệ sinh thái thủy vực như biến đổi màu của nước, gây mất mỹ quan ao/hồ, làm ô nhiễm nguồn nước, gây mùi hôi, đặc biệt là gây độc các sinh vật sống khác trong hệ thống thủy sinh. Ở Việt Nam hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam cùng với sản sinh ra nhiều loại độc tố trong đó có MCs thường có hàm lượng cao nhất đã được ghi nhận ở nhiều thuỷ vực khác nhau như hồ Thành Công, hồ Núi Cốc, hồ Hoàn Kiếm, hồ Dầu Tiếng, hồ Trị An. Hình 1.1. Vi khuẩn lam nở hoa ở hồ Dầu Tiếng (Nguồn: Phạm Thanh Lưu) 1.3.5. Độc tố microcystins Microcystins (MCs) là độc tố vi khuẩn lam phát hiện ở hầu hết các thủy vực nước ngọt và nước lợ khắp nơi trên thế giới. Đây là độc tố được nghiên cứu nhiều nhất. MCs là loại độc tố dạng vòng hepatotoxic peptides thuộc nhóm độc tố cylic peptides (Hình 1.2). Có cấu tạo gồm 7 amino acid khác nhau, với 2 amino acid cuối cùng của dãy peptide nối liền lại hình thành nên phức hợp vòng. Có trọng lượng 17
  26. Đồ Án Tốt Nghiệp phân tử dao động từ 500 – 4000 Da (Marian và ctv, 2007). Cấu trúc chung của MCs là Cyclo-(D-Alanine1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D-glutamate6-Mdha 7 trong đó: - X và Z là các L – axit amin khác nhau như Leucine (L), Ariginine (R), Tyrosine (T), Alanine (A) hoặc Methionine (M). - D-MeAsp3 là axit D-erythro-b-methylaspartic - Mdha là N-methyldehydroalanine và Adda là axit (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino- 9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 3 loại độc tố microcystins thường gặp. (nguồn: Duy và cộng sự, 2000). Có 3 dạng MCs phổ biến nhất, hiện diện hầu hết ở các chủng gây độc là MC- LR, MC-YR và MC-RR, có trọng lượng phân tử từ 900 – 1100 Da. Hợp chất này được phân lập lần đầu tiên từ loài tảo lam Microcystis aeruginosa, sau đó được đặt tên là Microcystins. Còn nhiều loài tảo lam thuộc chi Microcystis có khả năng sinh ra MCs như Microcystis viridis, Microcystis flos aquae,). Tùy thuộc vào loại độc tố và nồng độ xâm nhiễm, các tác động đến sức khỏe con người cũng như các triệu chứng lâm sàng biểu hiện khác nhau. Hậu quả tác động tức thời từ ngứa, sưng tấy ngoài da, đến các triệu chứng chóng mặt, buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy, đau đầu, tê liệt, suy hô hấp, và nặng có thể tử vong. Những tác động lâu dài đến sức khỏe con người như viêm nhiễm dạ dày, viêm gan, ung thư 18
  27. Đồ Án Tốt Nghiệp Nhiều ca ngộ độc do độc tố lam đã được ghi nhận ở các quốc gia, trên thế giới cho thấy sự nguy hiểm của loại độc tố này (Chorus và cộng sự, 1999). Điển hình vào năm 1959 ở Cannada, 13 người ở vùng Saskatchewan bị ngộ độc với các triệu chứng như co rút dạ dày, nôn mửa, tiêu chảy, sốt, đau đầu; ở Mỹ năm 1975, xấp xĩ 62% số người sử dụng nguồn nước cấp nhiễm độc tố tảo lam từ sông Ohio có triệu chứng đau bụng và tiêu chảy, năm 1998 ở Brazil, 2000 trường hợp ở bang Bahia bị viêm nhiễm dạ dày, 88 trường hợp tử vong do sử dụng nguồn nước từ đập Itaparita, mặc dù đã qua đun sôi. Kết quả điều tra cho thấy nguyên nhân là do sử dụng nguồn nước có chứa tảo Microcystis và Anabaena ở mật độ cao tương đương tế bào . Năm 1996 cũng tại nước này ở khu vực Caruaru, hơn 100 trường hợp bị viêm gan cấp, 52 trường hợp tử vong sau khi sử dụng nguồn nước cấp tính, các triệu chứng lâm sàng như hoa mắt, chóng mặt, đau đầu, đau bụng, nôn mửa, tê liệt Microcystins và Cylindropermopsis được tìm thấy trong nguồn nước cấp, trong máu và trong các tế bào gan của các bệnh nhân (Chorus và cộng sự, 1999). Hậu quả tác động lâu dài của MCs cũng đã được ghi nhận trong các công trình nghiên cứu dịch tễ tại Trung Quốc, nơi người ta phát hiện tỷ lệ ung thư gan sơ cấp ở những người sử dụng nước uống từ nguồn nước bề mặt bị nhiễm Microcystins cao hơn nhiều so với những người sử dụng nguồn nước từ giếng khoan (Chorus và cộng sự, 1999). Cơ chế gây độc của độc tố MCs là làm ức chế enzyme protein phosphatase 1A và 2A trong tế bào động thực vật, đặc biệt là tế bào gan. Độc tố MCs thường phá vỡ cấu trúc tế bào gan, mất cấu trúc thể xoang, tăng trọng lượng gan do xuất huyết và gây sốc sự vận chuyển máu, rối loạn nhịp tim dẫn đến chết ở động vật (Dương Đức Tiến, Trịnh Tam Kiệt (Trung Tâm CNSH Việt Nam, Đại Học Quốc Gia Hà Nội)). Theo số liệu thống kê ở Tp Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận như Bình Dương và Tây Ninh có đến 70% dân số xấp xĩ 6-7 triệu người sử dụng nước cấp sinh hoạt từ hồ Dầu Tiếng và sông Sài Gòn. Một số nghiên cứu gần đây đã ghi nhận tảo lam 19
  28. Đồ Án Tốt Nghiệp nở hoa với tần suất ngày càng cao trong nguồn nước ở một số thủy vực quanh Thành Phố Hồ Chí Minh (Dao và cộng sự, 2010; Dương Đức Tiến, 1996). Tuy nhiên, trong tiêu chuẩn an toàn cấp nước ở nước ta chưa có tiêu chuẩn quy định về nồng độ của độc tố tảo, việc quan trắc độc tố tảo lam cũng chưa được quan tâm. Trong khi đó tình hình về bệnh có nghi can nhiều đến độc tố tảo như các bệnh về gan, thần kinh, tiêu hóa, ung thư, và nhiều dấu hiệu bệnh khác nhưng nguyên nhân từ độc tố tảo thường không được nhắc đến. 1.3.6. Hai hợp chất gây mùi hôi geosmin và 2-methylisoborneol Geosmin còn gọi là 1,2,7,7-tetramethyl-2-norborneol là một alcohols bậc ba. -1 Công thức phân tử C12H22O. Khối lượng phân tử là 182,3 g.mol . Hợp chất 2- methylisoborneol là dẫn xuất của hợp chất hóa học isoborneol. Công thức phân tử -1 C11H20O. Khối lượng phân tử là 168,28 g.mol là hợp chất hữu cơ phổ biến dễ bay hơi gây mùi hôi, mùi bùn trong thủy vực. Cả geosmin và 2-MIB đều là hợp chất terpenoid và tổng hợp bởi enzyme terpene. Có thể được phát hiện bởi những người nhạy cảm ở nồng độ rất thấp (<10 ng.L-1). Geosminvà 2-MIB phát tán vào môi trường thông qua sự phân hủy sinh học của một số loại vi khuẩn lam nở hoa chủ yếu là dạng sợi và một số loài xạ khuẩn. Tuy nhiên có một số loài khi tế bào khỏe mạnh vẫn phát tán được geosmin và 2-MIB vào môi trường nước. Geosmin và 2- MIB không gây nguy hại nhiều tới sức khỏe công cộng nhưng sự hiện diện của chúng trong nước có thể gây ra mối lo ngại nghiêm trọng đối với chất lượng và cảm quan của nguồn nước do chúng rất khó bị loại bỏ trong quá trình xử lý nước. Geosmin 2-methylisoborneol Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Geosmin và 2-methylisoborneol MIB. (Nguồn: Friedrich và susan, 2007). 20
  29. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.3.7. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn lam và độc tố của vi khuẩn lam 1.3.7.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam và độc tố vi khuẩn lam trên thế giới Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam và độc tố của chúng đang được quan tâm hàng đầu. Sivonen và cộng sự (1988) đã đưa ra nghiên cứu về độc tố của chủng vi sinh vật này trong nước ngọt và ven biển ở Phần Lan. Độc tính của các mẫu nở hoa được kiểm tra cấp tính trên chuột và cho thấy 83/188 mẫu (44%) có những dấu hiệu đặc trưng của độc thần kinh hoặc độc gan. Tiến hành phân lập các chủng này cho thấy Anabaena là chi được tìm thấy thường xuyên nhất trong cả mẫu nở hoa có độc hoặc không có độc. Đặc biệt là Anabaena có mặt hầu hết các mẫu gây độc thần kinh và độc gan. Ngoài ra các chi Microcystis và Oscillation cũng xuất hiện ở các mẫu gây độc cho gan. Nghiên cứu này khẳng định nhóm vi sinh này gây độc là rất phổ biến ở các hồ nước ngọt và ven biển ở Phần Lan gây ảnh hưởng tới sinh vật và cả con người. Các nghiên cứu độc tính của vi khuẩn lam ở giai đoạn đầu thường chỉ sử dụng các phương pháp thử nghiệm sinh học. Tuy nhiên không phải tất cả các chủng đều gây độc, trong cùng một loài cũng có những chủng sinh độc tố và có những chủng không sinh độc tố mà không thể phân biệt được bằng phương pháp hình thái học vì thế những nghiên cứu sau này thường tập trung phân tích theo hướng sinh học phân tử do khả năng dự đoán nhanh và chính xác hơn. Davis và cộng sự (2009) đã đưa ra báo cáo kiểm tra sự ảnh hưởng của nhiệt độ và dinh dưỡng đối với tốc độ tăng trưởng và xác định khả năng gây độc của các chủng Microcystis bằng định lượng đoạn gene mcyD và 16S rDNA từ 4 hồ thuộc vùng Đông Bắc Mỹ trong 2 năm. Nghiên cứu cho thấy Microcystis độc hại chiếm trong khoảng từ 12% đến 100% so với tổng số loài tại hồ RonkonKoma, New York và từ 0,01% đến 6% ở ba hồ còn lại. Và khi nhiệt độ, nồng độ nitơ và photpho tăng thì các chủng gây độc cũng tăng trưởng cao chiếm 83%. Điều này cho thấy hiện tượng ấm lên và phú dưỡng trong tương lai cũng góp phần tăng các chủng Microcystis gây độc. 21
  30. Đồ Án Tốt Nghiệp Ngoài nghiên cứu về độc tố của vi khuẩn lam còn có các nghiên cứu về các hợp chất gây mùi hôi là geosmin và 2-MIB. Chúng là nguyên nhân chính gây ra mùi hôi trong nước. Tuy nhiên, các nghiên cứu về hai hợp chất này của chưa có nhiều. Năm 2014, Suvi Suurnakki và cộng sự đã nghiên cứu xác định sự hiện diện của 2 hợp chất gây mùi hôi geosmin và 2-MIB trong 100 chủng vi khuẩn lam bằng phương pháp sắc ký khối phổ vi chiết pha rắn (SPME-GCMS). Kết quả cho thấy có 21/100 chủng nghiên cứu thuộc 6 chi có khả năng sản xuất geosmin và 2 trong số đó cũng sản xuất 2-MIB. Tiếp theo, nghiên cứu sử dụng các phản ứng PCR để phát hiện đoạn gen geoA và mib tham gia quá trình tổng hợp geosmin và 2-MIB. Nghiên cứu cho thấy 2 đoạn gen geoA và mib đã được phát hiện trong tất cả các chủng tương ứng với kết quả của phương pháp sắc ký khối phổ vi chiết pha rắn. 1.3.7.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam và độc tố vi khuẩn lam ở Việt Nam Những nghiên cứu về vi khuẩn lam trước đây ở Việt Nam chỉ dừng lại ở việc xác định loài bằng hình thái học và chưa có nhiều các nghiên cứu về khả năng sinh độc tố đặc biệt là bằng phương pháp sinh học phân tử. Từ 1998 – 2003 các nghiên cứu chỉ tập trung khảo sát, phân loại thành phần và kiểm tra số lượng loài vi khuẩn lam tại các ao, hồ (Đặng Đình Kim và Dương Thị Thủy, 2014). Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về độc tính của nhóm vi sinh này lên động thực vật thuỷ sinh bắt đầu được quan tâm nghiên cứu. Điển hình như nghiên cứu của Đào Thanh Sơn và cộng sự (2013) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam MCs từ mẫu nước mặt và mẫu vi khuẩn lam tạo váng tại hồ Dầu Tiếng lên sự phát triển của cải bông xanh ở giai đoạn nảy mầm đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về độc tố của nhóm vi sinh này trên thực vật. Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cho thấy nồng độ độc tố MCs trong mẫu nước mặt tại hai lần lấy mẫu lần lượt là 20 và 1000 µg/L và mẫu tạo váng là 250 µg/g trọng lượng khô sinh khối vi khuẩn lam. Kết quả cho thấy độc tố MCs ức chế sự phát triển của rễ, chiều dài thân và trọng lượng của cải bông xanh. 22
  31. Đồ Án Tốt Nghiệp Bên cạnh nghiên cứu độc tố của vi khuẩn lam lên thực vật. Độc tính lên động vật đặc biệt là vi giáp xác và cá sọc ngựa cũng đã được báo cáo (Đào Thanh Sơn và cộng sự, 2013). Kết quả phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đã cho thấy mẫu tạo váng và chủng M. aeruginosa chứa độc tố MCs lần lượt là 250 và 3700 µg/g trọng lượng khô sinh khối. Đây là một hàm lượng vượt rất cao so với tiêu chuẩn thế giới (1µg/L) và chứa đựng mối nguy hại tiềm ẩn. Vi khuẩn lam từ mẫu tạo váng và loài Microcystis aeruginosa phân lập từ hồ Dầu Tiếng gây độc mạnh lên cá sọc ngựa. Điển hình là với hàm lượng độc tố 200 µg/L làm suy giảm tỉ lệ nở của phôi cá sọc ngựa. Bên cạnh các nghiên cứu thành phần khảo sát độc tính của vi khuẩn lam tại một số thủy vực dựa vào phương pháp thử nghiệm sinh học. Các nghiên cứu theo hướng đánh giá đa dạng di truyền của các chủng gây độc cũng như khả năng phát hiện sớm các chủng gây độc dựa bằng sinh học phân tử đã bước đầu tiến hành. Trong đó sử dụng phương pháp PCR đã cho thấy khả năng phát hiện các chủng gây độc nhanh chóng và chính xác hơn hẳn các phương pháp khác thông qua việc phát hiện các gene mã hóa cho sinh tổng hợp độc tố. Điển hình là nghiên cứu Phạm Thanh Lưu và cộng sự (2015) đã phân lập và đưa ra đặc điểm của vi khuẩn lam sản xuất độc tố gan MCs tại hồ Dầu Tiếng. Nghiên cứu đã phân lập được 68 loài thuộc 5 chi: Microcystis, Dolichospermum, Arthrospira, Pseudarabaena, Cylindrospermopsis trong đó đây là lần đầu tiên mô tả hình thái loài Dolichospermum nygaardii trong nước ở Việt Nam. Đồng thời nghiên cứu cũng xác định khả năng sinh độc tố MCs ở các chủng này bằng phương pháp PCR sử dụng 3 gene quy định khả năng sinh độc tố MCs là mcyA, mcyB, mcyD. Hàm lượng độc tố được đo đạt bằng phương pháp HPLC. Kết quả phân tích PCR cho thấy trong 59 chủng thuộc Microcystis có 25 chủng dương tính với cả 3 gene mcyA, mcyB và mcyD; 12 chủng dương tính với mcyA, mcyB nhưng âm tính với mcyD và 22 chủng âm tính với cả 3 gene. Các chủng thuộc 4 chi còn lại được báo cáo âm tính với cả 3 gene. Và hàm lượng MCs trong 25 chủng nuôi cấy chứa hàm lượng MCs từ 39-2129 μg/g sinh khối khô. 23
  32. Đồ Án Tốt Nghiệp Năm 2016, Đào Thanh Sơn và cộng sự đã đưa ra những ghi nhận đầu tiên về về độc tố của vi khuẩn lam Planktothrix rubescens ở Việt Nam. Nghiên cứu cung cấp những mô tả hình thái đầu tiên cho loài P. rubescens ở Việt Nam. Bằng phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay) đã cho thấy rằng cả 5 chủng (S1-S5) thuộc loài P. rubescens phân lập được đều có khả năng sản sinh MCs với nồng độ từ 0,06-0,42 μg/g sinh khối khô. Đồng thời dịch chiết của chủng S1 cũng bước đầu thử nghiệm phơi nhiễm mãn tính trên vi giáp xác D. aphnia magna cho thấy có sự suy giảm số lượng sinh vật ở nồng độ 0,028 μg/L. 24
  33. Đồ Án Tốt Nghiệp 2 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm Đề tài được thực hiện từ 13/03/2017 – 14/07/2017 tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị Các dụng cụ được sử dụng: micropipette, đầu tuýp, cân phân tích, ống đong, eppendorf, cột QIA Các thiết bị được sử dụng: Tủ lạnh, nồi hấp khử trùng, máy PCR sprint thermo Cycler , hộp đèn soi UV Uvitec, máy vortex, lò vi sóng, máy li tâm lạnh MIKRO 220R, nguồn EC105 và Bể điện di QS-710 2.2.2. Nguồn mẫu Mẫu vi khuẩn lam được thu tại hồ Dầu Tiếng nằm chủ yếu trên địa phận huyện Dương Minh Châu và một phần nhỏ trên địa phận huyện Tân Châu thuộc tỉnh Tây Ninh. Hồ Dầu Tiếng nằm ở vị trí 11°27'31" vĩ độ Bắc, 106°19'48" kinh độ Đông. 2.2.3. Hóa chất 2.2.3.1. Hóa chất dùng trong nuôi tăng sinh khối (môi trường WC) NaNO3 1 mM Vitamin B1 1 mL/L CaCl2.2H2O 0,25 mM Vitamin B6 1 mL/L MgSO4.7H2O 0,15 mM Vitamin B12 1 mL/L NaHCO3 0,15 mM Dung dịch khoáng 1 mL/L Na2SiO3.9H2O 0,1 mM K2HPO4 0,05 mM H3BO3 0,39 mM 25
  34. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.2.3.2. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA Đệm CTAB (0,2 M Tris-Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,05M EDTA, 2 % CTAB). Phenol:chloroform:isoamylalcohol tỷ lệ (25:24:1) hoặc Chloroform isoamyl alchol tỷ lệ (24:1). Isopropanol. Etanol 70 %, etanol 100 %. Nước khử ion. 2.2.3.3. Hóa chất dùng trong điện di 6X LB Loading dye. TAE 1X. Agarose. Ethidium bromide. Thang DNA 1kb. 2.2.3.4. Hóa chất dùng trong PCR Nước khử ion. Master Mix (2x My taq Mix). Mồi xuôi CYA371F: CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCC Mồi ngược 373R: CTAACCACCTGAGCTAAT Mồi xuôi CYA-F: ACGGGTGAGTAACGCGTRA Mồi ngược CYA-R: CTTCAYGYAGGCGAGTTGCAGC 2.2.3.5. Hóa chất dùng trong tinh sạch mẫu DNA Nước khử ion. Buffer PB. Buffer PE. 26
  35. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.3. Phƣơng pháp thu mẫu Mẫu vi khuẩn lam được thu bằng lưới vớt thực vật phiêu sinh hình nón với kích thước mắt lưới 25 µm, đường kính miệng lưới 40 cm. Thu mẫu bằng cách quăng và kéo lưới trong vòng bán kính 5-7 m. Mẫu được cố định ngay tại hiện trường bằng dung dịch formaline, nồng độ formaline cuối cùng trong mẫu vào khoảng 4% (Pham và cộng sự, 2015). Mẫu tảo lam nở hoa được lọc qua giấy lọc sợi thủy tinh GF/C, sấy khô qua đêm ở 45°C và lưu trữ ở điều kiện phòng thí nghiệm cho đến khi phân tích (Pham và cộng sự, 2015). Các mẫu thu được ghi các kí hiệu gồm ngày, giờ thu mẫu, kí hiệu mẫu. 2.3.1. Phương pháp phân lập Vi khuẩn lam được phân lập bằng phương pháp hút rửa trực tiếp (pipetting and washing). Theo đó một tập đoàn vi khuẩn lam được hút/bắt bằng micropipette. Từng sợi riêng lẻ hoặc tập đoàn được hút/bắt, rửa một vài lần qua môi trường đã khử trùng và chuyển vào nuôi trong môi trường WC. Mẫu được nuôi trong điều kiện sáng : tối là 12:12h, nhiệt độ khoảng 25°C. Lắc nhẹ ống nghiệm mỗi ngày một lần. Sau thời gian từ 2 tới 4 tuần thì kiểm tra xem ống nghiệm nào có dấu hiệu tăng sinh của nhóm vi sinh này thì tiến hành kiểm tra quan sát và phân loại trên kính hiển vi. Sau đó tiến hành nuôi tăng sinh. 2.3.2. Phương pháp nuôi tăng sinh khối và thu sinh khối vi khuẩn lam Nuôi tăng sinh khối Mẫu vi khuẩn lam sau khi phân lập trong ống nghiệm được cấy chuyền và nuôi tăng sinh khối trong các bình tam giác thể tích 0,5 – 1 L có chứa môi trường nuôi WC. Mẫu được nuôi trong cùng điều kiện phòng thí nghiệm đã mô tả ở trên. Thu sinh khối Sinh khối được thu bằng giấy lọc sợi thủy tinh GF/C từ 100 mL dịch nuôi cấy (hình 2.1) và lưu trữ eppendorf ở nhiệt độ -20°C (Kurmayer và cộng sự, 2003). 27
  36. Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 2.1. Sinh khối vi khuẩn lam 2.3.3. Định danh chủng vi khuẩn lam bằng sinh học phân tử Các chủng vi khuẩn lam phân lập được quan sát trên kính hiển vi quang học Olympus CK40-F200 ở độ phóng đại ×100-400. Định loại vi sinh vật này dựa trên cơ sở hình thái học theo hệ thống phân loại của các tác giả trong và ngoài nước như Dương Đức Tiến (1996), Komárek và Anagnostidis (1999; 2005), Cronberg (2006). Quá trình định danh bao gồm các bước tách chiết DNA, khuếch đại đoạn DNA bằng phản ứng PCR, điện di kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự gene và so sánh đoạn trình tự này với trình tự gene trên ngân hàng NCBI. 2.3.3.1. Phương pháp ly trích DNA bằng CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) Phương pháp ly trích DNA của vi khuẩn lam được thực hiện theo các bước như sau: Cắt nhỏ mẫu giấy lọc cho vào eppendorf. Hút thêm vào 800 - 900 đệm CTAB Vortex 30 giây, sau đó shot sprins. 28
  37. Đồ Án Tốt Nghiệp Ủ -800C trong 30-60 phút. Sau khi ủ đem đi đun sôi 15 phút. Votex, ly tâm 14.000 rpm/5 phút/4oC. Sau khi ly tâm thu dịch nổi. Hút 500 μL dịch nổi cho vào eppendorf mới. Thêm phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) tương đương với thể tích phần dịch lấy ra (500µl). Tiếp tục đem vortex, ly tâm 14.000 rpm/5 phút/4oC. Thu dịch nổi và cho vào eppendorf mới. Thêm 500 μL isopropanol lạnh (tỷ lệ thể tích 1:1) để kết tủa DNA. Vortex nhẹ, ly tâm 14.000 rpm/5 phút/4oC. Thu tủa. Rửa tủa DNA bằng ethanol 70% rồi ly tâm 14.000 rpm/4°C/1 phút. Loại bỏ dịch nổi. Tiếp tục rửa tủa với ethanol 100% rồi ly tâm 14.000 rpm/4°C/1 phút. Hút bỏ ethanol thật sạch. Để khô tự nhiên, thu tủa. Thêm vào 30 μL và bảo quản -20°C. Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1.5%. 2.3.3.2. Phương pháp điện di kiểm tra DNA trên gel agarose Điện di ở bước này nhằm mục đích xem sản phẩm ly trích DNA có bị gãy hay không và tiến hành điện di sản phẩm ly trích trên gel agarose 1,5%. Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5%, cân 1,5g agarose vào 100ml TAE1X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong microwave ở 650W trong 2 phút. Để chai nguội khoảng 50 - 600C, đổ nhẹ dung dịch vào khay điện di, khoảng 45 phút thì gel đông lại, gel có màu trắng đục. 29
  38. CM CDN 1 CSG Đồ Án Tốt Nghiệp Bước 2: Tiến hành điện di. Trộn dung dịch gồm 5µl DNA sau ly trích và 3µl loading dye 6X. Bơm dung dịch này vào giếng trên gel. Khởi động nguồn điện, chỉnh 90 voltage, chạy điện di khoảng 30 - 40 phút. Bước 3: Nhuộm gel. Bảng gel được chuyển vào khay chứa thuốc nhuộm ethidium bromide trong khoảng 10 - 15 phút, sau đó rửa lại bằng nước. Bước 4: Quan sát kết quả chạy điện di dưới hộp đèn UV 312nm. Nếu sản phẩm ly trích có DNA thì trên gel điện di sẽ có band DNA phát sáng dưới dạng vạch. Mức độ tập trung và độ đậm nhạt của bảng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. 2.3.3.3. Phản ứng PCR Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gene (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp đi lặp lại nhiều lần, thông thường kéo dài 20 - 35 chu kì. Một chu kỳ gồm có 3 giai đoạn được mô tả ở hình 2.2 bao gồm: Giai đoạn 1 (biến tính DNA): Đầu tiên, phản ứng PCR thường được gia nhiệt đến nhiệt độ 94 - 96oC, nhiệt độ này được giữ 1 - 9 phút nhằm đảm bảo tất cả DNA mục tiêu và mồi bị biến tính , DNA được làm tách mạch bởi sự phá vỡ liên kết hydrogen giữa các base bổ sung của chuỗi DNA, tạo thành các chuỗi DNA mạch 30
  39. Đồ Án Tốt Nghiệp đơn. Sau đó, chu trình bắt đầu với một bước có nhiệt độ 94 - 980C khoảng 20 - 30 giây. Giai đoạn 2 (bắt cặp): Nhiệt độ phản ứng được làm thấp để mồi có thể bắt cặp với mạch khuôn DNA đơn. Liên kết hydrogen giữa mạch khuôn và mồi bắt đầu được hình thành. Liên kết này chỉ được bền vững khi mồi bắt cặp chính xác với mạch khuôn và đoạn ngắn DNA mạch đôi này là nơi DNA polymerase gắn vào và bắt đầu tổng hợp DNA. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi và thông thường khoảng 50-65oC trong thời gian 30 - 60 giây. Giai đoạn 3 (kéo dài): DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung đối với DNA mạch khuôn. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ hoạt động tối ưu của DNA polymerase. Taq DNA polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu 70 - 74oC, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72oC. Nối hydrogen giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ cao. Mồi đã lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và không được kéo dài. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử dụng và chiều dài đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Bước kéo dài cuối cùng kéo dài khoảng 5 - 15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu), chu kì cuối cùng này được dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có thể được kéo dài hoàn toàn. Hình 2.2. Quy trình phản ứng PCR. 31
  40. Đồ Án Tốt Nghiệp Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR: Cặp mồi CYA371F và 373R Thành phần: Tổng 25 μL gồm: 12.5 μL Master mix, 1 μL primer F, 1 μL primer R, 1-2 μL DNA mẫu, 8,5 - 9,5 μL H2O. Chu trình nhiệt được thiết lập theo phương pháp của Savichtcheva (2011) như mô tả ở bảng 2.1 Bảng 2.1. Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA371F và 373R Chu kỳ lặp lại Nhiệt độ Thời gian 1 94°C 5 phút 94°C 1 phút 30 60°C 1 phút 72°C 1 phút 1 72°C 7 phút Cặp mồi CYA-F và CYA-R Thành phần: Tổng 25 μL gồm: 12.5 μL Master mix, 1 μL primer F, 1 μL primer R, 1-2 μL DNA mẫu, 8.5-9.5 μL H2O. Chu trình nhiệt được thiết lập theo phương pháp của Pham và cộng sự (2015) như mô tả ở bảng 2.2 32
  41. Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 2.2. Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA-F và CYA-R Chu kỳ lặp lại Nhiệt độ Thời gian 1 95°C 10 phút 94°C 30 giây 30 60°C 1 phút 72°C 1 phút 1 72°C 7 phút 2.3.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR Trước khi giải trình tự đoạn gen đã được khuếch đại, ta phải tinh sạch mẫu nhằm loại bỏ các tạp chất còn lại trong lúc thực hiện phản ứng PCR và các bước thực hiện như sau: Bước 1: Lấy eppendorf có chứa DNA mẫu (mẫu đã PCR và điện di) cho buffer PB vào (tỷ lệ 1:5). Bước 2: Sau đó vortex, short spring. Nếu có màu cam hoặc tím ta cho vào 10 μL 3M sodium acetate pH 5.0 để chuyển sang màu vàng nhạt, còn nếu có màu vàng nhạt thì không cần thêm. Bước 3: Cho dung dịch ở bước 1 vào cột QIA, sau đó ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, hút bỏ dịch dưới đáy giữ lại cột. Bước 4: Thêm 700-750 μL buffer PE vào cột QIA. Bước 5: Ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, bỏ dịch thu cột. Bước 6: Tiếp tục ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, sau đó bỏ dịch giữ lại cột. Bước 7: Lấy cột cho vào eppendorf mới, cho vào 30 μL O vào cột QIA. 33
  42. Đồ Án Tốt Nghiệp Bước 8: Để khoảng 10 phút. Bước 9: Đem đi ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, thu được DNA tinh sạch. 2.3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự vùng gene 16S DNA Mẫu sau khi tinh sạch, điện di trên gel agarose xem kết quả thì được gửi mẫu qua công ty Nam Khoa, địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, Quận 7 – Thành Phố Hồ Chí Minh để giải trình tự. Sau khi giải trình tự thì kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0 và Ngân hàng gene để định danh loài và xây dựng cây phát sinh loài. 34
  43. Đồ Án Tốt Nghiệp 3 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả ly trích và thu nhận DNA bộ gene của hình thái vi khuẩn lam Chủng vi khuẩn lam sau khi phân lập được quan sát trên kính hiển vi quang học. Phân loại vi sinh vật này dựa trên cơ sở hình thái học theo hệ thống phân loại của Dương Đức Tiến (1996), Komárek và Anagnostidis (1999; 2005), Cronberg (2006) và từ khoảng 30 mẫu đã qua sơ bộ xác định hình thái học, trong nghiên cứu này chọn ra 4 loài đại diện cho loài sau: 2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis, 31: Plantothrix. Sau khi phân loại, tiến hành tách chiết và thu nhận DNA của 4 chủng. Kết quả thu nhận được thể hiện trong hình 3.1. 2 10 29 31 Hình 3.1. Kết quả thu nhận DNA bộ gene của vi khuẩn lam gồm 4 chủng trên gel agarose 1,5%. (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và 31: Plantothrix). Dựa vào hình 3.1, cho thấy kết quả tách chiết và thu nhận DNA của 4 chủng Cylindropermopsis, Plantothrix, Microsystis và Anabaena khá tốt. Kết quả ly trích trên có thể dùng cho phản ứng nhân bản vùng gene định loại loài. 35
  44. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.2. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau khi ly trích và thu nhận Mẫu số 2, 10, 29 và 31 được pha loãng và đo nồng độ DNA, kết quả được thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau thu nhận Mẫu 2 1,429 0,724 1,974 10 1,358 0,729 1,863 29 1,017 0,508 2,002 31 2,003 1,188 1,686 Tỷ lệ đo nằm trong khoảng 1,7-2,0 là có độ tinh khiết tốt nhất. Kết quả đo nồng độ DNA: = 1,429 x 50 x 10 = 714,5 ng/ml = 1,358 x 50 x 10 = 679,0 ng/ml = 1,017 x 50 x 10 = 508,5 ng/ml = 2,003 x 50 x 10 = 1001,5 ng/ml Qua kết quả từ bảng 3.1 cho thấy nồng độ DNA trong mẫu 2, 10, 29, 31 thu được là cao. Tỷ lệ 260nm/280nm của mẫu 2 và 10 lần lượt là 1,974 và 1,863 nằm trong khoảng 1,7-2,0 chứng tỏ lượng DNA thu được có độ tinh sạch tốt. Mẫu 29 và 31 có tỷ lệ là 2,002 và 1,686 chênh lệch không quá cao so với khoảng 1,7-2,0 chứng tỏ lượng DNA thu được khá sạch. 36
  45. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gene 16S DNA bằng kỹ thuật PCR 3.3.1. PCR với cặp mồi CYA371F, 373R 10 29 T 2 31 Hình 3.2. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi CYA371F, 373R (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và 31: Plantothrix ). Dựa vào hình 3.2 sau khi khuếch đại đoạn gene 16S DNA của 4 mẫu (2, 10, 29 và 31) bằng phương pháp PCR với cặp mồi CYA371F, 373R. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy 2 mẫu số 2 và 31 cho kết quả dương tính, mẫu số 10 và 29 cho kết quả âm tính, điều này cho thấy cặp mồi CYA371F, 373R là cặp mồi có độ nhạy cao hơn khi sử dụng nhân bản đoạn gene cho 2 chủng Microsystis và Plantothrix, kết quả này phù hợp với công bố kết quả nghiên cứu của Savichtcheva và cộng sự với kích thước khoảng 1500 bp (Savichtcheva và công sự, 2011). Từ kết quả khuếch đại đoạn gene 16S DNA chứng tỏ rằng đoạn mồi CYA371F, 373R thích hợp để khuếch đại đoạn gene đối với chủng Microsystis và Plantothrix. 37
  46. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.3.2. PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R T 10 29 2 31 Hình 3.3. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và 31: Plantothrix ). Theo hình 3.3 trong nghiên cứu này cho thấy rằng sau khi khếch đại đoạn gene 16S DNA của 4 mẫu (2, 10, 29, 31) bằng phương pháp PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy cả 4 mẫu đều dương tính, điều này cho thấy cặp mồi CYA-F, CYA-R là cặp mồi được sử dụng để khuếch đại một đoạn 1200 bp của đoạn gene 16S DNA phổ biến cho hầu hết các chủng vi khuẩn lam theo công bố kết quả nghiên cứu (Urbach và cộng sự, 1992; Hotto và cộng sự, 2005; Pham và cộng sự, 2015). Từ kết quả khuếch đại đoạn gene 16S DNA chứng tỏ rằng đoạn mồi CYA-F, CYA-R thích hợp để khuếch đại đoạn gene đối với hầu hết các chủng vi khuẩn lam, nhưng so về độ nhạy thì chủng Microsystis, Anabaena, Cylindropermopsis nhạy hơn so với chủng Plantothrix. 38
  47. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn lam 2 10 29 31 1500 1000 Hình 3.4. Kết quả điện di trên gel agarose của các chủng vi khuẩn lam sau khi tinh sạch (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và 31: Plantothrix ). Theo hình 3.4 cho thấy kết quả tinh sạch DNA của các chủng vi khuẩn lam khá tốt. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với công bố kết quả nghiên cứu của (Urbach và ctv, 1992; Hotto và ctv, 2005; Pham và ctv, 2015) và (Savichtcheva và ctv, 2011). 3.5. Kết quả giải trình tự vùng gene 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam 3.5.1. Mẫu 2 (chủng Microsystis) TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCA GGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAG CAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGA AAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGG ATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGA CCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAG TGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAAT TCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGC TAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC 39
  48. Đồ Án Tốt Nghiệp GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATT AAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG TCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAA GGGCAGCGAACTCGCGAG 3.5.2. Mẫu 10 (chủng Anabaena) GGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCG CGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAAAAAATG ACGGTACCTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG AGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCAGGTGGCATTGAA AGTCTGCTGTTAAAGAGTTTGGCTCAACCAAATAAAAGCAGTGGAAACTACAAAGCT AGAGTTTGGTCGGGGCAGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCA GGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTGCTAGGCCGAGACTGACACTGAGGGACG AAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATG GATACTAGGCGTAGCTCGTATCGACCCGAGCTGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTAT CCCGCCTGGGGAGTACGCAGGCAACTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG CACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGC TTGACATGTCACGAATTCTGTGGAAACATAGGAGTGCCTTAGGGAGCGTGAACACAG GTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG AGCGCAACCCTCGTTTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGCACTCTAGAGAGACTGC CGGGTGACAAACCGGAGGAAGGGTGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCCTTT ACGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAAAGGGCAGCTACACAGCTG AAG 3.5.3. Mẫu 29 (chủng Cylindropermopsis) AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGC TCTTGGGTCGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGAAAGTGACGGTACTTGAGGAAT AAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTAT CCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCTGCAGGTGGAACTGAAAGTCTGCTGTTAAAGA GTTTGGCTTAACCAAATAAAAGCGGTGGAAACTACAGAACTAGAGTGTGGTAGGGGC AAAAGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCGGTG GCGAAAGCGTTTTGCTAGACCATAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCG AATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCT TGTATCGACCCGAGCCGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTAC GCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTA TGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATCCTGCGAAT CCTGGTGAAAGCTGGGAGTGCCTTAGGGAGCGCAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTC GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTTT 40
  49. Đồ Án Tốt Nghiệp TTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG AACGGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCCTTACGTCTTGGGCTACCACACGT ACTACAATGCTACGGACAGAGGGCAGCGAGCCAGGGTATG 3.5.4. Mẫu 31(chủng plantothrix) CCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAAAGATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCG CTCTACTGGACTGCAACTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAACGAATGGGATTA AATACCCCAGTAATCCTAACCGTAAACGATGGATACTAAGTGTTGTCTGTATCGACCC AGACAGTGCCCCAGCTAACGCGATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTG TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAATATGTGGTTTAATT CCATGCAACGCGAAAAACCTTACCAGGGCTTGACATGTCCCGAACCTCGCTGAAAGG TGAGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCATCA TTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATG ACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTACTACAATGGGTGGG ACAAAGGGCAGCGAACTCGCAAGAGCCAGCTAATCCCATAAACCCATCCTCAGTTCA GATTGCTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAG CATACTGCGGTGAATACGTTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGA AGTTGGCCATGCCCGAAGTCATTACTCTAACCCCTCGGGGAGGAGGATGCCGAAGGC AGGGCTGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGTGGC 3.6. Kết quả so sánh trình tự gene trên ngân hàng NCBI và xây dựng cây phát sinh loài Sau đó sản phẩm PCR được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa Biotek Company. Sử dụng phần mềm ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0. và ngân hàng gene NCBI để phân tích dữ liệu đoạn gene và thiết lập cây phát sinh loài. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam (2, 10, 29, 31) được phân lập ở hồ Dầu Tiếng và các loài vi khuẩn lam trong ngân hàng gene NCBI. Kết quả giải trình tự của các chủng đều có sự tương đồng cao khi so sánh với ngân hàng gene, sự tương đồng được thể hiện rõ qua cây phát sinh loài (Hình 3.5). Đồng thời kết quả giải trình tự hoàn toàn phù hợp với kết quả định danh hình thái. 41
  50. Đồ Án Tốt Nghiệp Cylindrospermopsis raciborskii CHAB1351 Raphidiopsis mediterranea 07-04 73 Cylindrospermopsis catemaco CHAB148 29 53 Raphidiopsis curvata CHAB3413 2 Microcystis panniformis 51 98 Microcystis smithii CHAB1459 14591CHAB1459 99 Planktothricoides raciborskii T1-6-2 Phormidium cf. aerugineo-coeru 18 Oscillatoriales cyanobacterium 94 Lyngbya hieronymusii N-929 31 Microcystis aeruginosa LMECYA 147 100 Microcystis ichthyoblabe VN461 Sphaerocavum brasiliense CCIBt3094 66 10 87 Dolichospermum circinale 25 Anabaena ucrainica CHAB1431 27 Sphaerospermopsis kisseleviana CHAB332 10 Hình 3.5. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene 16S DNA của các chủng Microcystis, Anabaena, Cylindrospermopsis, Plantothrix với các chủng vi khuẩn lam trên ngân hàng gene NCBI. Tiến hành so sánh vùng gene của các mẫu phân lập được với vùng gene 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam trên ngân hàng NCBI, các đặc điểm hình thái học của các chủng tương đồng và có được kết quả như sau: 42
  51. Đồ Án Tốt Nghiệp Mẫu 2 có mối quan hệ gần nhất với chủng Sphaerocavum brasiliense CCIBt3094, Microcystis aeruginosa LMECYA 147, Microcystis ichthyoblabe VN461, Microcystis panniformis và Microcystis smithii CHAB1459 với mức độ gene tương đồng là 99%. Mẫu 10 có mối quan hệ gần nhất với loài Dolichospermum circinale và Anabaena ucrainica CHAB1431 với mức độ gene tương đồng là 99%, còn với loài Sphaerospermopsis kisseleviana CHAB332 với mức độ gene tương đồng là 98%. Mẫu 29 có mối quan hệ gần nhất với loài Cylindrospermopsis catemaco CHAB148, Cylindrospermopsis raciborskii CHAB1351, Raphidiopsis mediterranea 07-04 và Raphidiopsis curvata CHAB3413 với mức độ gene tương đồng là 99%. Mẫu 31 có mối quan hệ gần nhất với loài Planktothricoides raciborskii T1-6-2 với mức độ gene tương đồng là 99%, với Phormidium cf. aerugineo-coeruleum, Oscillatoriales cyanobacterium Alignment_Isolate4 và Lyngbya hieronymusii N- 929 với mức độ gene tương đồng là 93%. 43
  52. Đồ Án Tốt Nghiệp 4 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Sau khi so sánh các mẫu phân lập được và định danh vùng gene 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam: Microcystis, Anabaena, Cylindrospermopsis, Plantothrix ở hồ Dầu Tiếng với các chủng vi khuẩn lam trên ngân hàng NCBI đã cho kết luận sau: - Mẫu 2 có mối quan hệ gần nhất với chủng Sphaerocavum brasiliense CCIBt3094, Microcystis aeruginosa LMECYA 147, Microcystis ichthyoblabe VN461, Microcystis panniformis và Microcystis smithii CHAB1459 với mức độ gene tương đồng là 99%. - Mẫu 10 có mối quan hệ gần nhất với loài Dolichospermum circinale và Anabaena ucrainica CHAB1431 với mức độ gene tương đồng là 99%, còn với loài Sphaerospermopsis kisseleviana CHAB332 với mức độ gene tương đồng là 98%. - Mẫu 29 có mối quan hệ gần nhất với loài Cylindrospermopsis catemaco CHAB148, Cylindrospermopsis raciborskii CHAB1351, Raphidiopsis mediterranea 07-04 và Raphidiopsis curvata CHAB3413 với mức độ gene tương đồng là 99%. - Mẫu 31 có mối quan hệ gần nhất với loài Planktothricoides raciborskii T1-6-2 với mức độ gene tương đồng là 99%, với Phormidium cf. aerugineo-coeruleum, Oscillatoriales cyanobacterium Alignment_Isolate4 và Lyngbya hieronymusii N-929 với mức độ gene tương đồng là 93%. Dựa trên các nghiên cứu trước nay và đề tài nghiên cứu này thì cho thấy rằng sự hiện diện của các chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố vẫn còn hiện diện trong hồ Dầu Tiếng. Định danh được 4 nhóm vi khuẩn lam. So sánh giữa hai cặp mồi CYA371F, 373R và CYA-F, CYA-R dùng trog khuếch đại đoạn gene của 4 chủng trên. 44
  53. Đồ Án Tốt Nghiệp 4.2. Đề nghị Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu các thông tin từ các nghiên cứu trong nước và trên thế giới về các loài vi khuẩn lam đã được định danh thì ngoài các chủng vi khuẩn lam trên còn có các chủng khác như: Gloeotrichia, Desmonostoc và Arthronema Vì thời gian còn hạn chế nên có nhiều phương pháp và quy trình mà đồ án vẫn chưa tiến hành thử nghiệm hết được, cần có những nghiên cứu sau:  Cần xác định mức độ hiện diện của các nhóm vi khuẩn lam gây bệnh, nhằm có biện phát hạn chế sự phát triển của chúng trong nguồn nước cấp sinh hoạt cho người dân.  Khảo sát khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn lam phân lập được.  Khảo sát khả năng gây độc tố của các chủng trên. 45
  54. Đồ Án Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tiếng việt [1] Dương Đức Tiến, 1996. Phân loại vi khuẩn lam ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp. Hà Nội. [2] Dương Thị Hoàng Oanh, Vũ Ngọc Út và Nguyễn Thị Kim Liên, 2011. Nghiên cứu khả năng xử lý nước thải của tảo Spirulina platensis. Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Thủy sản lần IV. Trường Đại học Cần Thơ, trang 15-27. [3] Đào Thanh Sơn, Bùi Bá Trung và Đỗ Hồng Lan Chi, 2013. Đa dạng sinh học vi khuẩn lam ở hồ Dầu Tiếng. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần V. Nxb Nông nghiệp, trang 660-665. [4] Đặng Ngọc Thanh, Hồ Thanh Hải, Dương Đức Tiến, và Mai Đình Yên, 2002. Thủy sinh học ở các thủy vực nước ngọt nội địa Việt Nam. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, 399 trang. [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty, 2007. Vi sinh vật học. Nxb Giáo dục, 519 trang. [6] Đặng Đình Kim, Dương Thị Thủy. 2014. Vi khuẩn lam độc nước ngọt. Khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội. [7] Đào Thanh Sơn, Trần Trúc Ly, Phạm Thanh Lưu. 2013. Nguy cơ ngộ độc bởi độc tố vi khuẩn lam ở hồ Dầu Tiếng. Tạp chí STINFO số 1&2: 52-53. [8] Đào Thanh Sơn, Lê Thái Hằng, Phạm Thanh Lưu. 2013. Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam từ hồ Dầu Tiếng. Tạp chí STINFO số 7: 28-36. [9] Trần Cẩm Xô (chủ biên), Nguyễn Thị Lan (2005), Cơ sở di truyền và công nghệ gen, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.  Tiếng nƣớc ngoài [10] Baxevanis, A.D. and Ouellette, B.F.F., eds., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, third edition. Wiley, 2005. ISBN 0-471-47878-4. 46
  55. Đồ Án Tốt Nghiệp [11] Claverie, J.M. and C. Notredame, Bioinformatics for Dummies. Wiley, 2003. ISBN 0-7645-1696-5. [12] World Health Organization (WHO), 1996. Guidelines for drinking water quality. Volume 2. World Health Organization, Geneva. [13] Komárek J., Anagnostidis K., 2005. Cyanoprokaryota 1. Teil: Oscillatoriales. In Büdel, B., Gärtner, G., Krienitz, L., Schagerl, M. (Eds): Süβwasserflora von Mitteleuropa. 19/2: 1-759. Gustav Fischer Verlag Jena. [14] Komárek J. & Anagnostidis K. 1999. Susswasserflora von Mitteleuropa,Cyanoprokaryota. 1. Teil: Chroococcales. Gustav Fischer Verlag Jena. 548p. [15] Chorus I., J. Bartram, 1999. Toxic cyanobacteria in water: A guide to their public health consequences, monitoring and management. Published on behalf of WHO, Spon Press, London, 416 pp. [16] Dao, T. S., G. Cronberg, J. Nimptsch, L. C. Do-Hong, C. Wiegand, 2010. Toxic cyanobacteria from Tri An Reservoir, Vietnam. Nova Hedwigia, 90: 433–448. [17] Sivonen K., Niemela S. I., Niemi R. M., Lepisto L., Luoma T. H. & Rasanenl L. A 1988. Toxic cyanobacteria (blue-green algae) in Finnish fresh and coastal waters. Hydrobiologi 190: 267-275. [18] Suvi Suurnakki, Gonzalo V. Gomez-Saez, Anne Rantala-Ylinen, Jouni Jokela, David P. Fewer, Kaarina Sivonen. 2014. Identification of geosmin and 2-methylisoborneol in cyanobacteria and molecular detection methods for the producers of these compounds. Water research 68: 56-66. [19] Thanh-Luu Pham, Thanh-Son Dao, Kazuya Shimizu, Do-Hong Lan-Chi and Motoo Utsumi. 2015. Isolation and characterization of microcystin- producing cyanobacteria from Dau Tieng Reservoir, Vietnam. Nova Hedwigia 101: 1–2, 3–20. 47
  56. Đồ Án Tốt Nghiệp [20] Thanh-Luu Pham, Thanh-Son Dao, Ngoc-Dang Tran, Jorge Nimptsch, Claudia Wiegand and Utsumi Motoo. 2016. Influence of environmental factors on cyanobacterial biomass and microcystin concentration in the Dau Tieng Reservoir, a tropical eutrophic water body in Vietnam. Ann. Limnol. - Int. J. Lim. 0 (2016) 1–12. [21] Thanh-Son Dao, Jorge Nimptsch and Claudia Wiegand. 2016. Dynamics of cyanobacteria and cyanobacterial toxins and their correlation with environmental parameters in Tri An Reservoir, Vietnam. Journal of Water and Health 14.4: 699-712. [22] Duy T. N., Paul K. S. Lam, Glen R. Shaw, Des W. Connell. 2000. Toxicology and risk assessment of freshwater cyanobacterial (bluegreen algal) toxins in water, Rev. Environ. Contam. Toxicol 163: 113 –186. [23] Ena Urbach, Deborah L. Robertson, Sallie W. Chisholm. 1992. Multiple evolutionary origins of prochlorophytes within the cyanobacteria radiation. Nature Publishing Group 355: 1-4. [24] Kitching IJ, Forey PL., Humphries CJ., Williams DM. 1998. Clasdistics, the theory and practice of parsimony analysis. Oxford University Press. 228pp. Occurrence of the toxic cyanobacterium (blue-green alga) Microcystis aeruginosa in Central China. Arch. Hydrobiol 114: 21-30. [25] Page, R.D.M., Holmes, E.C. 1998. Molecular Evolution. Blackwell Publishing. 346pp. [26] Salemi M., Vandamme A-M. 2006. The phylogenetic handbook, a practical approach to DNA and protein phylogeny. Cambridge University Press. 398pp. [27] Ye SQ. 2008. Bioinformatics: A Practical Approach. CRC Press, Taylor & Francis Group. Amber Hotto, Mike Satchwell, Gregory Boyer. 2005. Seasonal Production and Molecular Characterization of Microcystins in Oneida Lake, New York, USA. Environ. Toxicol 20: 243–248.Carmichael, W.W., Yu, M. J., He, Z.R, He, J.W. and Yu, J-L 1988. 48
  57. Đồ Án Tốt Nghiệp [28] Friedrich Jüttner, Susan B. Watson. 2007. Biochemical and Ecological Control of Geosmin and 2-Methylisoborneol in Source Waters. Appl. Environ. Microbiol 73: 4395-4406. [29] Olga Savichtcheva, Didier Debroas, Rainer Kurmayer, Clement Villar, Jean Philippe Jenny, Fabien Arnaud, Marie Elodie Perga, and Isabelle Domaizon. 2011. Quantitative PCR Enumeration of Total/Toxic Planktothrix rubescens and Total Cyanobacteria in Preserved DNA Isolated from Lake Sediments. Appl. Environ. Microbiol Vol. 77, No. 24: 8744–8753.6. [30] Amber Hotto, Mike Satchwell, Gregory Boyer. 2005. Seasonal Production and Molecular Characterization of Microcystins in Oneida Lake, New York, USA. Environ. Toxicol 20: 243–24. [31] Kurmayer, R., G. Christiansen, and I. Chorus. 2003. The abundance of microcystin-producing genotypes correlates positively with colony size in Microcystis and determines its microcystin net production in Lake Wannsee. Appl. Environ. Microbiol. 69:787–795. [32] Cronberg G., H. Annadotter, 2006. Manual on aquatic cyanobacteria: A photo guide and a synopsis of their toxicology. Kerteminde Tryk A/S, 106 pp. [33] Zhou J. et al (1996). DNA recovery from soils of diverse composition, Applied and Environmental Microbiology, 62 (2), 316 – 322. [34] Jara C. et al (2008). Analysis of several methods for the extration of high quality DNA from acetic acid bacteria in wine and vinegar for characterization by PCR-based methods, International Journal of Food Microbiology, 128 (2), 336 - 341. [35] Zhu H, Qu F, Zhu LH. Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride. Nucleic Acids Res 1993; 21(22), 5279-80. [36] Haruta S. (2002). Construction of a stable microbial community with high cellulose – degradation ability, Appl Microbiol Biotechnol, 59 (4), 529 – 534. [37] Tomoyukihori, Shin Haura, Yohiyuki Ueno, Masaharuishii, Yasuo Igarashi (2006). Direct comparinson of singlesstand conformation 49
  58. Đồ Án Tốt Nghiệp polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to characterize a microbial community on the basis of 16S RNA gene fragment, Journal of Microbiological Methods, 66, 165 – 169. [38] Friedrich Jüttner, Susan B. Watson. 2007. Biochemical and Ecological Control of Geosmin and 2-Methylisoborneol in Source Waters. Appl. Environ. Microbiol 73: 4395-4406.  Tài liệu từ Internet [1] [2] [3] luan-1672608.html 50
  59. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC A. Hình ảnh các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu Máy li tâm lạnh MIKRO 220R Nguồn EC105 và Bể điện di QS-710 Hộp đèn soi UV Uvintec Máy PCR sprint thermo Cycler 1
  60. Đồ Án Tốt Nghiệp B. Kết quả so sánh trình tự 16S DNA của loài vi khuẩn lam với ngân hàng gene NCBI. 1. Kết quả so sánh mẫu 2 với chủng Microcystis aeruginosa LMECYA 147 trên trình tự đoạn gene 16S DNA Score Expect Identities Gaps Strand 1602 bits (867) 0.0 884/891(99%) 6/891(0%) Plus/Plus Query 1 AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 277 AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTT 336 Query 61 GGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 337 GGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCG 396 Query 121 GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 397 GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATT 456 Query 181 GGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 457 GGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGA 516 Query 241 CCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 517 CCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTG 576 Query 301 TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 577 TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCT 636 Query 361 GTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTC 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 637 GTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTC 696 Query 421 CTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTA 480 2
  61. Đồ Án Tốt Nghiệp |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 697 CTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTA 756 Query 481 ACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGAC 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 757 ACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGAC 816 Query 541 GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTAC 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 817 GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTAC 876 Query 601 CAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACA 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 877 CAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACA 936 Query 661 CAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGGTTAAGTCCCGCAAC 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| Sbjct 937 CAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-GGGTTAAGTCCCGCAAC 995 Query 721 GAGCGCAACCCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGGGACTCTAAGGAGACTGC 780 |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 996 GAGCGCAA-CCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTT GGGGACTCTAAGGAGACTGC 1052 Query 781 CGGTGACAAACCCGGAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTT 840 |||||||||| |||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1053 CGGTGACAAA-CCGGAGGAAGGT-GGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTT 1110 Query 841 GGGCGACACACGTACTACAATAGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAG 891 ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1111 GGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAG 1161 2. Kết quả so sánh mẫu 10 với chủng Anabaena ucrainica CHAB1431 trên trình tự đoạn gene 16S DNA. Score Expect Identities Gaps Strand 1624 bits (879) 0.0 899/907(99%) 8/907(0%) Plus/Plus 3
  62. Đồ Án Tốt Nghiệp Query 1 GGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTG 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 222 GGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTG 281 Query 61 AGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGaaaaaaaTGACGGTAC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 282 AGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAAAAAATGACGGTAC 341 Query 121 CTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 342 CTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAG 401 Query 181 CGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCAGGTGGCATTGAAAGTCTGCTGTTAA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 402 CGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCAGGTGGCATTGAAAGTCTGCTGTTAA 461 Query 241 AGAGTTTGGCTCAACCAAATAAAAGCAGTGGAAACTACAAAGCTAGAGTTTGGTCGGGGC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 462 AGAGTTTGGCTCAACCAAATAAAAGCAGTGGAAACTACAAAGCTAGAGTTTGGTCGGGGC 521 Query 301 AGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCAGTGGCGA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 522 AGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCAGTGGCGA 581 Query 361 AGGCGCTCTGCTAGGCCGAGACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGAT 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 582 AGGCGCTCTGCTAGGCCGAGACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGAT 641 Query 421 TAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTAGCTCGTATCGACCC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 642 TAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTAGCTCGTATCGACCC 701 Query 481 GAGCTGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCAGGCAACTGTGA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 702 GAGCTGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCAGGCAACTGTGA 761 Query 541 AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGC 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 762 AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGC 821 4
  63. Đồ Án Tốt Nghiệp Query 601 AACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGTCACGAATTCTGTGGAAACATAGGAGTGC 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 822 AACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGTCACGAATTCTGTGGAAACATAGGAGTGC 881 Query 661 CTTAGGGAGCGTGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 882 CTTAGGGAGCGTGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG 941 Query 721 GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGCA 780 |||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| ||||| Sbjct 942 GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG-TTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTT-GGGCA 999 Query 781 CTCTAGAGAGACTGCCGGGTGACAAACCGGAGGAAGGGTGTGGGGATGACGTCAAGTCAG 840 |||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| Sbjct 1000 CTCTAGAGAGACTGCC-GGTGACAAACCGGAGGAAG GTGGGGATGACGTCAAGTCAG 1055 Query 841 CATGCCCCCTTTACGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAAAGGGCAGCT 900 |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1056 CATGCCCC TTACGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAAAGGGCAGCT 1113 Query 901 ACACAGC 907 ||||||| Sbjct 1114 ACACAGC 1120 3. Kết quả so sánh mẫu 29 với chủng Cylindrospermopsis catemaco CHAB148 trên trình tự đoạn gene 16S DNA. Score Expect Identities Gaps Strand 1615 bits (874) 0.0 887/892(99%) 5/892(0%) Plus/Plus Query 1 AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 321 AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTT 380 Query 61 GGGTCGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGAAAGTGACGGTACTTGAGGAATAAGCATC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 381 GGGTCGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGAAAGTGACGGTACTTGAGGAATAAGCATC 440 5
  64. Đồ Án Tốt Nghiệp Query 121 GGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGAT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 441 GGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGAT 500 Query 181 TGGGCGTAAAGGGTCTGCAGGTGGAACTGAAAGTCTGCTGTTAAAGAGTTTGGCTTAACC 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 501 TGGGCGTAAAGGGTCTGCAGGTGGAACTGAAAGTCTGCTGTTAAAGAGTTTGGCTTAACC 560 Query 241 AAATAAAAGCGGTGGAAACTACAGAACTAGAGTGTGGTAGGGGCAAAAGGAATTCCTGGT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 561 AAATAAAAGCGGTGGAAACTACAGAACTAGAGTGTGGTAGGGGCAAAAGGAATTCCTGGT 620 Query 301 GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAAGCGTTTTGCTAGAC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 621 GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAAGCGTTTTGCTAGAC 680 Query 361 CATAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGT 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 681 CATAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGT 740 Query 421 CCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGGAGCT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 741 CCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGGAGCT 800 Query 481 AACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 801 AACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGA 860 Query 541 CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 861 CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTA 920 Query 601 CCAAGACTTGACATCCTGCGAATCCTGGTGAAAGCTGGGAGTGCCTTAGGGAGCGCAGAG 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 921 CCAAGACTTGACATCCTGCGAATCCTGGTGAAAGCTGGGAGTGCCTTAGGGAGCGCAGAG 980 Query 661 ACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 981 ACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC 1040 6
  65. Đồ Án Tốt Nghiệp Query 721 GAGCGCAACCCTCGTTTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCG 780 |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1041 GAGCGCAACCCTCG-TTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCG 1099 Query 781 GTGACAAACCGGAGGAACGGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCCTTACGTCTTGG 840 ||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| Sbjct 1100 GTGACAAACCGGAGGAA-GGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATG-CCCCTTACGTCTTGG 1157 Query 841 GCTACCACACGTACTACAATGCTACGGACAGAGGGCAGCGAGCCAGGGTATG 892 |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| Sbjct 1158 GCTA-CACACGTACTACAATGCTACGGACAGAGGGCAGCGAGCCAGGG-ATG 1207 4. Kết quả so sánh mẫu 31 với chủng Planktothricoides raciborskii T1-6-2 trên trình tự đoạn gene 16S DNA. Score Expect Identities Gaps Strand 1443 bits (781) 0.0 804/815(99%) 1/815(0%) Plus/Plus Query 2 CCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAAAGATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGCTCTA 61 |||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 549 CCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGCTCTA 608 Query 62 CTGGACTGCAACTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAACGAATGGGATTAAATACCCC 121 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| ||||||| Sbjct 609 CTGGACTGCAACTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCC 668 Query 122 AGTAATCCTAACCGTAAACGATGGATACTAAGTGTTGTCTGTATCGACCCAGACAGTGCC 181 |||| ||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 669 AGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTTGTCTGTATCGACCCAGACAGTGCC 728 Query 182 CCAGCTAACGCGATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGG 241 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 729 GCAGCTAACGCGATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGG 788 Query 242 AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAATATGTGGTTTAATTCCATGCAACGCGAAAA 301 ||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| |||||||||||||| Sbjct 789 AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAA 848 7
  66. Đồ Án Tốt Nghiệp Query 302 ACCTTACCAGGGCTTGACATGTCCCGAACCTCGCTGAAAGGTGAGGGTGCCTTCGGGAGC 361 ||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 849 ACCTTACCAGGGCTTGACATGTCGCGAACCTCGCTGAAAGGTGAGGGTGCCTTCGGGAGC 908 Query 362 GCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC 421 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 909 GCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC 968 Query 422 CGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGAC 481 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 969 CGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGAC 1028 Query 482 TGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCC 541 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1029 TGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCC 1088 Query 542 TGGGCTACACACGTACTACAATGGGTGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCAAGAGCCAGCT 601 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1089 TGGGCTACACACGTACTACAATGGGTGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCAAGAGCCAGCT 1148 Query 602 AATCCCATAAACCCATCCTCAGTTCAGATTGCTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGAGG 661 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1149 AATCCCATAAACCCATCCTCAGTTCAGATTGCTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGAGG 1208 Query 662 AATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTTCCCGGGCCTTGTACAC 721 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| Sbjct 1209 AATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACG-TTCCCGGGCCTTGTACAC 1267 Query 722 ACCGCCCGTCACACCATGGAAGTTGGCCATGCCCGAAGTCATTACTCTAACCCCTCGGGG 781 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1268 ACCGCCCGTCACACCATGGAAGTTGGCCATGCCCGAAGTCATTACTCTAACCCCTCGGGG 1327 Query 782 AGGAGGATGCCGAAGGCAGGGCTGATGACTGGGGT 816 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1328 AGGAGGATGCCGAAGGCAGGGCTGATGACTGGGGT 1362 8