›

Đồ án Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4

pdf 111 trang thiennha21 12/04/2022 5340
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_thu_nghiem_che_pham_diet_sau_to_plutella_xylostella_tu.pdf

Nội dung text: Đồ án Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN MSSV: 1311100520 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN MSSV: 1311100520 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hương ( Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM). Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN
  4. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ con trong 23 năm qua, người đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trong cuộc sống và luôn qua tâm con, chăm sóc cho con. Người luôn bên con những lúc khó khăn nhất. Em cũng xin cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hướng và ủng hộ em trên con đường học tập. Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Hoài Hương, người luôn nhiệt tình với học trò, luôn định hướng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn em xuyên suốt quá trình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai người đã cho em lời khuyên trong quá trình nuôi sâu tơ thí nghiệm và cung cấp cho em giống nấm thí nghiệm. Em cũng xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm. Đồng thời, xin cảm ơn đến bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, Cao Thị Thanh Thúy đã hổ trợ mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất cả các bạn cùng thực hiện đồ án trong thời gian mình thực hiện đồ án ở phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt quá trình làm thí nghiệm. Cảm ơn em Hồ Trung Lộc lớp 14DSH, em Trần Nguyễn Tuấn Minh 14DSH, em Bùi Nhật Minh 14DSH đã phụ giúp anh trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn ! TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN
  5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 4 DANH MỤC HÌNH ẢNH 5 DANH MỤC CÁC BẢNG 6 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 9 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học 9 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay 9 1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học 10 1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin 10 1.1.4.1 Ưu điểm 11 1.1.4.2 Nhược điểm 11 1.1.4.3 Cơ chế tác động 12 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 12 1.2.1 Lịch sử phát hiện 12 1.2.2 Phân loại 13 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens 13 1.2.4 Đặc điểm sinh lí 14 1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa 15 1.1.3.2 Đặc điểm phân bố 16 1.2 Giới thiệu về Prodigiosin 17 1.3.1 Khái niệm về prodigiosin 17 1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin 17 1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin 20 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens 20 1.4 Enzyme 25 1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens 25 1.6 Một số nghiên cứu trên thế giới 26 1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 26 1
  6. Đồ án tốt nghiệp 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin 27 1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh 27 1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp 27 1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp 28 1.6.3.3 Nấm Trichoderma 28 1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus 29 1.7 Khái quát về sâu tơ Plutella xylostella 29 1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học 29 1.7.2 Tập quán sinh sống và cách gây hại 30 1.7.3 Biện pháp phòng trừ 30 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 32 2.1.1 Thời gian 32 2.1.2 Địa điểm 32 2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 32 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens 32 2.2.2 Nguồn nấm 32 2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii 32 2.2.4 Nguồn cải ngọt Brassica integrifolia. 32 2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate 32 2.2.6 Môi trường nuôi cấy và hóa chất 32 2.2.7 Dụng cụ, thiết bị 33 2.3 Mục tiêu nghiên cứu 34 2.4 Nội dung nghiên cứu 34 2.5 Phương pháp thí nghiệm 34 2.5.1 Phương pháp luận 34 2.5.2 Bố trí thí nghiệm 35 2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 36 2.6.1 Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm 36 2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens 37 2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 37 2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme 37 2
  7. Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm 42 2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá 44 2.6.3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii 45 2.6.3.5 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cải ngọt Brassica integrifolia 47 2.6.3.6 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cá bảy màu 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 51 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào 51 3.2 Hoạt tính kháng nấm 52 3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm 55 3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii 57 3.5 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cải ngọt Brassica integrifolia 58 3.6 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cá bảy màu Poecilia reticulata 61 1.Kết luận 65 2. Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG 71 PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH 74 PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ 86 PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ 89 3
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Artemia nauplii : A.nauplii Brassica integrifolia : B. integrifolia Serratia mascescens : S.mascescens Plutella xylostella : P.xylostella Pepton glycerol : PG QCVN : Quy chuẩn Việt Nam. BNNVPTNT : Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn. 4
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) 14 Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens 14 Hình 1.3 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008) 18 Hình 1.4 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 18 Hình 1.5 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) 21 Hình 1.6 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. 24 Hình 1.7 Vòng đời của sâu tơ Plutella xylostella 30 Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của chế phẩm. 36 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Casein 38 Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Lipit 40 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Chitin 41 Hình 2.3 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA 43 Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P. xylostella phẩm bằng phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012). 45 Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella của chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925). 56 Hình 3.2 Tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplli theo Log nồng độ prodigiosin (mg/ml). 58 Hình 3.3. Tỉ lệ nảy mầm của cải ngọt B. integrifolia sau khi ngâm chế phẩm 59 Hình 3.4. Tỉ lệ nảy chết của cải ngọt B. integrifolia sau khi phun chế phẩm 60 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serrastia marcescens SH4 63 5
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens 15 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) 19 Bảng 3.1 các enzyme ngoại bào trong canh trường lên men sau xử lí acid. 52 Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1 52 Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. 53 Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp 54 Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. 54 Bảng 3.5 Tỉ lệ chết của sâu tơ tuổi 3. 56 Bảng 3.6 Độc tính của chế phẩm đối với cây cải ngọt sau 9 ngày thử nghiệm. 61 Bảng 3.7 Tỉ lệ chết của cá sau 5 ngày thử nghiệm. 62 6
  11. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Theo thống kê của tổ chức Lương – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồng hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Đây quả là một lực lượng hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng. Để giải quyết vấn đề trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại. Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầm bệnh cho cây trồng. Tuy nhiên, người nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều lượng quá mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, sâu tơ Plutella xylostella là loài sâu đa thực và gây hại nặng đến màu màng, chúng gây hại trên hầu hết các loại rau cải, đặc biệt có nhiều trên cây cải ngọt . Chúng có khả năng kháng thuốc hóa học nếu người dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học không đúng cách. Vì vậy, xu hướng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đã và đang trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, an toàn cho sức khỏe con người, đồng thời không gây ô nhiễm môi trường. Những năm gần đây, việc trích ly được hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chưa có nghiên cứu nào về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc đã nghiên cứu nhưng vẫn chưa hoàn thiện được sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Dựa trên cơ sở đó mà người thực hiện đề tài đã chọn hướng cho Đồ ÁN tốt nghiệp là: “Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4” 2. Mục đích nghiên cứu 7
  12. Đồ án tốt nghiệp Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH4 Thử nghiệm tính an toàn sinh học của chế phẩm lên cây cải ngọt để đánh giá an toàn sinh học của chế phẩm. Thử nghiệm độc tính của chế phẩm lên ấu trùng Artemia nauplii và thủy sinh đại diện là cá bảy màu 4. Kết quả cần đạt được Khảo sát được ảnh hưởng của việc xử lý acid lên enzyme ngoại bào của vi khuẩn S.marcesscens trong dịch nuôi cấy. Khảo sát được hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: kháng nấm, kháng sâu tơ. Khảo sát được độc học của vi khuẩn tác động lên ấu trùng A.nauplii. Khẳng định tính an toàn của chế phẩm trong việc ứng dụng chế phẩm ngoài thực tế. 8
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học. Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các hợp chất thứ cấp do vi sinh vật tiết ra ( thường là các chất kháng sinh), các chất có trong cây cỏ (chất độc hoặc dầu thực vật). 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay 1. NPV là chế phẩm trừ sâu hoạt lực cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc chuyên dùng để diệt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu xanh đốm trắng, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây công nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV có nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tương đối dễ dàng: chỉ cần hoà thuốc vào bình và phun bình thường với liều lượng 1,0- 1,2 kg/ha. 2. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu thuộc họ Leptidopera. 3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium anisopliae 1,6- 2,5 x 109Bt/gr bọ hại dừa. Thử nghiệm tại Đà Nẵng, Phú Yên đạt hiệu quả tới 86,5%. Dạng nấm xanh được dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa và cây ăn quả đạt 70- 90%, dạng nấm trắng đạt 50- 85%. Chế phẩm Beauveria chuyên dùng để trị sâu róm thông và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%. TS. Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thông đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”. 4. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15- 20 x 106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã được đưa vào ứng dụng để diệt trừ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hoá). 9
  14. Đồ án tốt nghiệp 5. Chế phẩm hoá sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trừ các loại sâu hại rau màu đạt 45- 50%. 6. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004) 1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học Ưu điểm Không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát dịch côn trùng. Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thường có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc như ớt, tỏi, hành, rừng Chi phí sản xuất khi tự làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừ sâu hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao. Hạn chế Các thuốc vi sinh thường thể hiện hiệu quả diệt sâu tương đối chậm hơn so với thuốc hóa học. Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thường yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn. 1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin Abamectin là thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới, là hỗn hợp của Avermectin B1a (80%) và Avermectin B1b (20%) được phân lập từ quá trình lên men của vi khuẩn Streptomycin avermitilis được sử dụng phổ biến để phòng trừ sâu hại trên nhiều loại cây trồng đặc biệt là rau, hoa, chè, lúa. Hoạt chất Abamectin được 97 công ty đăng ký với 534 loại thuốc thương phẩm, gồm 294 thuốc thương phẩm đơn chất Abamectin (Abatin 1.8 EC; Alfatin 1.8 EC; Binhtox 1.8 EC; Reasgant 1.8EC; Tervigo 020SC ) và 240 thuốc thương phẩm 10
  15. Đồ án tốt nghiệp dạng hỗn hợp với các hoạt chất khác như Emamectin benzoate (Sieufatoc 36EC), Azadirachtin (Goldmectin 36EC), Alpha – cypermethrin (Shepatin 18EC), Acetamiprid (Acelant 4EC) dầu khoáng (Đầu trâu Bihopper 24.5EC), Bacillus thuringiensis var.kurstaki (Kuraba WP ) 1.1.4.1 Ưu điểm - Hoạt chất Abamectin có hiệu lực diệt sâu nhanh, mạnh, kéo dài và ít chịu tác động của điều kiện thời tiết. - Thuốc ít hình thành tính kháng của dịch hại, ít gây độc cho người sử dụng. - Phổ tác động rộng, trừ được nhiều loài sâu miệng nhai, miệng chích hút thuộc bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh đều như ruồi đục lá, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ, nhện ở liều lượng 5,4 -25gai/ha trên nhiều loại cây trồng như rau họ thập tự, họ cà, cây ăn quả (cam, quýt, chè ), lúa. 1.1.4.2 Nhược điểm - Các loại thuốc hoạt chất Abamectin thuộc nhóm độc II, LD50 qua miệng 300 mg/kg, LD50 qua da > 1800 mg/kg, dễ kích thích da và mắt. Thời gian cách ly ngắn nhất là 3 ngày, phổ biến là 7 ngày. - Hoạt chất Abamectin có chỉ số tác động môi trường (EIQ 36,68) cao hơn so với nhiều hoạt chất khác, kể cả một số thuốc thuộc nhóm lân hữu cơ như Acephate (EIQ 24,88), Chlopyriphos( EIQ 26,85). - Thuốc thuộc nhóm độc II, thời gian cách ly tương đối dài (7 ngày), mức độ ảnh hưởng của thuốc đối với người phun thuốc, người tiêu dùng không lớn nhưng độc đối với cá và ong. Vì vậy, mặc dù đã được đăng ký phòng trừ sâu hại trên cây rau nhưng Abamectin không có trong Danh mục các hoạt chất thuốc BVTV khuyến cáo lựa chọn để sử dụng trên rau an toàn khi cần thiết (Ban hành kèm theo văn bản số 580/BVTV- QLT ngày 17/4/2014 của Cục Bảo vệ thực vật). 11
  16. Đồ án tốt nghiệp 1.1.4.3 Cơ chế tác động Thuốc ngăn chặn chất truyền luồng thần kinh gamma aminobutyric acid (GABA) tại chỗ nối cơ thần kinh của côn trùng. Thuốc làm côn trùng ngừng ăn hoặc ngừng đẻ trứng ngay, chúng có thể chết sau vài ngày. 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.1 Lịch sử phát hiện Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, vào năm 332 trước công nguyên, những người lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dường như có “máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tượng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố như vậy được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh được sử dụng trong Thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia marcescens. Tuy nhiên, điều này lại khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011). Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya), là người đầu tiên phát hiện và đặt tên Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều được bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà vật lý nổi tiếng người Italya đã phát minh ra tàu hơi nước là Serrati, tên loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. 12
  17. Đồ án tốt nghiệp Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens như một loại nấm, do ông nhìn thấy những đốm đỏ dưới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn. 1.2.2 Phân loại Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens được phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Serratia Loài: Serratia marcescens 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia marcescens có hình que, đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). 13
  18. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.4 Đặc điểm sinh lí Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar được mô tả là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính là sắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thường bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trường thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. 14
  19. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trường hiếu khí và kỵ khí. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lượng và nhờ có các enzyme như superoxide dismutase, calatas, peroxides, bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào như nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein. Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả 1 Di động + 2 Indole - 3 Methyl Red - 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase + 7 Catalase + 8 Oxidase - 9 Urease - 10 Gelatinase + 11 Chitinase + 15
  20. Đồ án tốt nghiệp 12 Triple sugar iron Môi trường chuyển sang không sinh khí và không sinh H2S 13 Hydrogen sulphide - 14 Lysine decarboxylase + 15 Ornithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose - 20 Lên men xylose - 21 Lên men rhaminose - 22 Lên men lactose - 23 Lên men arabinose - 1.1.3.2 Đặc điểm phân bố Trong nước và đất: đã có 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông và Serratia marcescens chiếm 75%. Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ưu thế. Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bênh tiềm năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng chết bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, người ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới 16
  21. Đồ án tốt nghiệp nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae. 1.2 Giới thiệu về Prodigiosin 1.3.1 Khái niệm về prodigiosin Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin được tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin được tổng hợp từ vi khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochlodride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI). 1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)- methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và 17
  22. Đồ án tốt nghiệp Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và được miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). Hình 1.4 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008) Hình 1.3 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) Các sắc tố màu đỏ của S. marcescens đã được phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin tổng hợp bởi S. marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thường gắn trở lại để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles. Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Được phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước. Prodigiosin có thể tan tương đối trong alcohol và ether. Bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một số bước sóng nhất định và sự biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ. 18
  23. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Loài Tên sắc tố Danh pháp Trọng prodigiosin lượng phân tử và công thức Serratia Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da marcescens methoxy-prodigiosene C20H25N3O Serratia Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da marcescens hydroxy-prodigiosene C10H23N3O Serratia Dipyrrolyldipyrromelh 2-(2-pyrryl)-4,6- 334,4 Da marcescens enr prodigiosin dimethoxypyprodigiosen C19H18N4O2 e Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) methoxyprodigiosene C23H31N3O Nocardia Cyclononylprodigiosin 2,10-Nonano-6- 265,5 Da (Actinomadura) melhoxy-prodigiosene C23H33N3O Nocardia Methylcyclode 2,10-Nonano-6- 391,5 Da (Actinomadura) cylprodigiosin Methoxy-prodigiosene C25H33N3O Streptomyces Undccyl- prodigiosin 2-Undecyl-6- 393,6 Da Longisporusr Rnethoxyprodigiosene C25H35N3 uber O Streplonlyces Metacycloprodigiosin 2,4-(9-Ethylnonano) -6- 391,6 Da longisporusr methoxyprodigiosene C25H33N3 uber O 19
  24. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme như DNA gyrase, topoisomerase IV, dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira,2009). Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng một số loài vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). Theo nghiên cứu của Chandni và cộng sự (2012) về khả năng kháng nấm của hợp chất màu thu nhận từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens cho thấy hợp chất màu có khả năng kháng một số loài nấm men như Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp. Prodigiosin khi được đưa vào cơ thể sâu sẽ thấm vào tế bào và ức chế quá trình phát triển của tế bào, từ đó, dẫn đến sự từ vong của sâu Spodoptera litura (Nguyễn Hiếu Dân, 2013) Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả năng chống ung thư (Pandey và cộng sự 2009; Pérez – Tomás và Vi ̃as, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự 2007) 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã được báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serratia marcescens sản xuất sắc tố thông qua con đường ngưng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5- carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, 20
  25. Đồ án tốt nghiệp được gọi là 2-methyl-3-amyl-6- methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập được một chủng Serratia marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này được báo cáo. Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 được biểu hiện trong Erwinia carotovora subsp. carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã được thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000). Nhóm sắc tố Serratia được quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và Streptomyces coelicolor và được bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốm gene tổng hợp MAP (màu xanh), được mô tả ở hình 2.18. Hình 1.5 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) 21
  26. Đồ án tốt nghiệp Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thước và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001). Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí tương đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ được hiển thị trong màu đen, chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng hợp được thể hiện qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổng hợp được thể hiện qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm màu đỏ. Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 có chứa thêm một gene bổ sung là PigO. RT-PCR với primer extension sẽ nhận thấy có sự phiên mã qua lại giữa hai gene pigN và pigO (Slater và cộng sự, 2003), điều này phù hợp với pigO là một pig operon trong chủng. Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đƣợc sao chép dưới dạng polycistronic thông tin từ một promoter upstream của pigA (Slater et al., 2003) và cụm sắc tố (pigA-pigN) của Sma 247 cũng đƣợc sao chép dưới dạng polycistronic thông tin. Có một khoảng cách đáng kể giữa hai cụm sắc tố pigC và pigD. Khoảng cách 184 bp giữa pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho thấy khả năng chứa hai đơn vị phiên mã. Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene ở hai bên của khoảng cách này đã chứng minh là tương tự như trong nghiên cứu dùng lacZ hợp với pigA và pigH (Crow, 2001). Cụm pig trong Sma 274 có khoảng cách 64 bp giữa pigC và pigD, nhỏ hơn so với Serratia ATCC 39.006, khoảng cách này không có ý nghĩa. Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14 – 15 gene), có thể phản ánh sự phức tạp hơn về các sản phẩm undecylprodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Streptomyces coelicolor (Harris và cộng sự, 2004). Mười hai gene được lưu giữ giữa ba cụm, có thể mong đợi con đường tổng hợp cho ra các sản phẩm tương tự. Tuy nhiên, định hướng và điều tiết của nó có sự thay đổi rõ rệt (Slater và cộng sự, 2003). Việc bố trí không giống nhau của các gene tương đồng trong cụm sản xuất các sản phẩm hóa học tương tự đặt ra câu hỏi về 22
  27. Đồ án tốt nghiệp nguồn gốc và sự tiến hóa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Vẫn chưa rõ liệu các loài trong cùng một họ có vai trò quan trọng ảnh hưởng đến sự sắp xếp không giống nhau của các gene hay sự khác biệt đã phát sinh một cách ngẫu nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Sự khác biệt ở các gene hiện diện trong những operon có thể giải thích sự khác biệt trong phương thức sản xuất và con đường tổng hợp sinh hóa. PigD và pigE là hai pig gene không có sự tương đồng trong cụm màu đỏ. Tương tự như vậy, pdtorfL và pdtorf thuộc một phần nhóm gene mã hóa tổng hợp các chất khử clo (carbon tetrachloride) như pyridine-2,6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri (Lewis và cộng sự, 2000). PdtorfL và pdtorfM nằm cạnh nhau, giống như pigD và pigE trong cụm pig. PigE tương tự aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ Streptomyces coelicolor A3(2), được mã hóa bởi một gene không liên kết với cụm màu đỏ (38% giống với PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống với PigE từ Sma 274; cả hai đều là 50% tương đương 460 aa). Thật vậy, nó có thể là gene mã hóa protein tham gia vào quá trình tổng hợp prodigiosin và undecylprodigiosin có thể không được liên kết với các cụm gene. RedR, RedQ và RedP không được mã hóa tương đồng bởi cụm pig, nhưng chúng được cho là chỉ đạo tổng hợp acetate từ ba nguyên tử carbon của vòng pyrrolr và chuổi bên undecyl của undecylprodigiosin (Cerdeno và cộng sự, 2001). Các gene mã hóa tương đồng tương ứng có thể có mặt tại một vị trí trên nhiễm sắc thể Serratia hoặc các enzyme khác có thể thực hiện vai trò xúc tác cần thiết trong sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia. Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia coli và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tương ứng của Escherichia coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme được mã hóa bởi các nhóm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004) 23
  28. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. Đề xuất này cũng tương tự như đề xuất đối với undecylprodigiosin (Cerdeno cộng sự, 2001) Mười hai Red protein với sự mã hóa trong cụm pig (“lõi” là enzyme prodigiosin) có kích thước tương tự nhau trong bản sao của Pig. Một ngoại lệ là PigB (670 aa) tương đồng với RedS (Sc3f7.05c), là một protein nhỏ hơn nhiều (146 aa) và tương tự gắn vào cuối đầu N của PigB. Phần còn lại của PigB gắn với các amine oxidase. Các protein PigI và PigJ đều nhỏ hơn RedM và tương đồng với RedX (Harris và cộng sự, 2004). PigA là trình tự tổng hợp một loạt các acyl-CoA dehydrogenases. Chuỗi liên kết với human isovaleryl-CoA dehydrogenases, cấu trúc tinh thể trong đó đã được xác định, cho thấy rằng phần lớn các acid amin xung quanh flavin và phosphopantetheinyl moiety của CoA được bảo vệ nhưng các acid amin tham gia vào liên kết các nhóm adenisyl của CoA không được bảo vệ (Tiffany và cộng sự, 1997). Điều này hỗ trợ cho ý kiến cho rằng PigA là một PCP prolyl hơn là prolyl-CoA . 24
  29. Đồ án tốt nghiệp 1.4 Enzyme Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease, chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase, Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng như kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước, (Joshi và cộng sự, 1989). Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme chitinase (ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding (CBP21) (Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự, 1988; Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự, 1996; Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998), chúng có khối lượng phân tử lần lượt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với các hoạt động chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986). 1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens Yếu tố độc lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các tác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trưởng phát triển, gây ảnh hưởng đến vật chủ, mà phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss và Hewlett, 1986). Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã được nghiên cứu, bao gồm sự bám dính, tính kị nước, mannose - resistant, mannose - sensitive, LipoPolySaccharide (LPS). Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính. Các yếu tố bám dính của vi sinh vật được gọi là các adhesion, chúng có thể có bản chất polypeptide hoặc polysaccharide. Đối với các adhesin có bản chất polypeptide thì được chia thành hai nhóm là nhóm có khuẩn mao và nhóm không có khuẩn mao. Mà các vi khuẩn Gram âm, như là Serratia marcescens, thường bám dính nhờ các khuẩn mao này. 25
  30. Đồ án tốt nghiệp Các khuẩn mao là những cấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng như sợi lông trên bề mặt vi khuẩn. Các khuẩn mao được cấu tạo bởi nhiều protein xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống như trụ xoắn ốc. Thường thì chỉ có một loại protein là cấu trúc chính của một phân nhóm khuẩn mao tuy nhiên các protein phụ trợ khác cũng có thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc khuẩn mao. Đỉnh của các khuẩn mao có chức năng gắn với tế bào vật chủ. Bên cạnh đó, LPS hay còn được gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lưỡng tính nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS được coi như nội độc tố, bảo vệ màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O – antigen, lõi oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là thành phần gây độc của phân tử LPS, gây bên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm. Ngoài ra, các enzyme khác của Serratia marcescens tạo ra cũng được xem như một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme lipase, chitinase, chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997). Theo Kenichi Ishii và cộng sự (2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thương, dẫn đến tổn thất lớn huyết tương từ ấu trùng tằm silkworm larvae. 1.6 Một số nghiên cứu trên thế giới 1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của S. marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng như ảnh hưởng của S. marcescens lên thúc đẩy tăng trưởng của cây thuộc chi cam chanh. Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát Pyricularia oryzae gây bệnh trên cây lúa bằng cách sử dụng S. marcescens. Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm S. marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria mellonella và đạt được kết quả gây chết 100% ấu trùng. 26
  31. Đồ án tốt nghiệp 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hóa sản xuất prodigiosin bởi S. marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết quả cho thấy prodigiosin thu nhận được có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự. (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp Nghiên cứu của San và cộng sự (2012) cho thấy prodigiosin có khả năng diệt côn trùng. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn như Alteromonas sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 g/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 g/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 g/ml. 1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh 1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp Theo Claridge, Dawah, Wilson (1997) cũng đã chỉ ra rằng các dòng Fusarium tìm thấy từ cây đại kích là nguyên nhân gây hại kinh tế (làm mất năng suất lên tới 92%) ở vùng cỏ ở Bắc Mỹ, bằng chứng chứng minh rằng các loài Fusarium có khả năng xuất hiện và phát triển ở các vùng đất không canh tác. Các loài Fusarium phân bố rộng khắp ở hầu hết các vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Chi nấm Fusarium bao gồm các loài hoại sinh, nội ký sinh và cả các loài ký sinh gây hại thực vật. Cũng một nghiên cứu khác của Burgess et al (1994) cho thấy chúng là nguyên nhân gây ra rất nhiều loại bệnh cây trong đó có thối rễ, cổ rễ, thân, sẹo, cháy bông, thối bắp và các bệnh héo Theo tác giả Moore et al (2001) thì các bệnh héo do các dạng chuyên hoá thuộc loài Fusarium oxysporum gây ra trên rất nhiều loài thực vật thuộc nhiều họ khác nhau. 27
  32. Đồ án tốt nghiệp Ví dụ: Bệnh Panama trên chuối do Fusarium oxysporum Schlecht f. sp. Cubense (E. F. Smith) Snyd. & Hans và héo trên bông do Fusarium oxysporum f. sp vasinfectum (Atk.) Snyd. & Hans đã gây thiệt hại to lớn cho ngành công nghiệp bông ở Australia. 1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp. Nấm Paecilomyces sp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Ngoài ra, có thể tìm thấy loài nấm này ở các loại đất nông nghiệp (Brand et al., 2010). Chúng hiện diện ở những nơi khá ẩm ướt, trong đất, không khí, trong phòng thí nghiệm hay ngoài tự nhiên. Ở Mỹ, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu và sử dụng nấm Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ nhiều loại sâu hại, bao gồm sâu hại khoai tây, bông, lúa mì đậu đỗ và ngô (Campell và CS., 1985; Hajek và CS., 1987; Anderson và CS., 1988; Quintela và CS., 1990; Bing, 1991) (theo Nguyễn Thị Lộc, 2009) Ở Canada đã nghiên cứu ứng dụng nấm Paecilomyces farinosus để phòng trừ châu chấu hại lúa (Khachatourians G. G., 1992) Hiện nay trên thế giới đã sản xuất sử dụng thành công nhiều loại chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng quan trọng như sâu tơ (Plutella xyllostella) (Yin Fei và CS., 2010), sâu khoang (Spodoptera litura) hại rau thập tự (Ma J. và CS., 2007; Hu Q. B. và CS.,2007) và các loài bọ phấn (Bemisiamtabaci, Bemisia argentifolii) hại cây trồng (Wraight S. P. và CS., 1998; Huang Zhen và CS., 2004). 1.6.3.3 Nấm Trichoderma Nấm Trichoderma sp. có khu vực phân bố rất rộng chúng hiện diện khắp nơi trong đất, trên bề mặt rễ, trên vỏ cây mục nát. Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm của nhiều loài nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma (Klein và Eveleigh, 1998). Các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất acid nhiều hơn ở vùng đất trung tính hoặc kiềm (Papavizas, 1985). Nấm Trichoderma có khả năng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào như chitinase, 1-3-glucanse đây là 2 loại enzyme quan trọng trong quá trình ký sinh lên nấm gây hại (Muhammad và Amusa, 2003). 28
  33. Đồ án tốt nghiệp Trichoderma sp ký sinh lên sợi nấm R. solani và làm chết sợi nấm là do tác dụng của enzyme ngoại bào làm phá hủy màng tế bào của nấm bệnh (Phạm Văn Kim, 2000). 1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus Nấm Aspergillus flavus tồn tại tự nhiên trong không khí và đất. Trong thời kỳ hạn hán, nấm này mọc trên các cây trồng còn xanh như lạc, ngũ cốc, ngô và ớt. Nấm CDP1 sinh độc tố Aflatoxin có phổ hoạt động rất rộng, lây nhiễm trên nhiều loại nông sản. Aspergillus flavus cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho thực vật và động vật, trong đó có con người và vật nuôi. Nấm có thể nhiễm trên bắp, đậu phụng, cotton và cây đậu. Nấm thường thấy dưới dạng các mảng nấm và có thể nhìn thấy được. Các bệnh nhân nhiễm nấm A. flavus thường là suy giảm miễn dịch. Những nghiên cứu của Ablas K và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm Aflatoxin trên ngô do nấm A.flavus gây nên là một vấn đề quan trọng ở các vùng trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. 1.7 Khái quát về sâu tơ Plutella xylostella Sâu tơ (Plutella xylostella ) là loài bướm đêm có nguồn gốc từ Địa Trung Hải. Có vòng đời ngắn khoảng 14 ngày, chúng có thể di cư với cự li khá xa. Sâu tơ là một trong những loài gây hại nhiều nhất trên thực vật thuộc họ Cải, chủ yếu là những cây sinh glucosinolat. 1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học Sâu tơ trưởng thành dài 6 -7 mm, có hai cánh. Cánh trước có thể xòe rộng 13 – 16 mm, màu nâu có những sọc dọc màu sáng. Cánh sau có màu xám, mép ngoài có lông. Sâu tơ sinh trưởng từ trứng, mỗi con cái đẻ từ 50 – 400 trứng. Trứng sâu hình bầu dục dài từ 0.3 – 0.5 mm, màu trắng ngà. Trứng đẻ rời rạc ở mặt dưới lá, gần gân chính và nở trong vòng 3 – 4 ngày. Ấu trùng màu xanh lục, mình nở to chính giữa, 2 đầu nhọn, thân chia đốt rõ ràng và có 3 cặp chân giả từ đốt bụng thứ 5. 29
  34. Đồ án tốt nghiệp Sâu có 4 tuổi với thời gian phát triển lâu từ 7 – 10 ngày. Thời gian làm nhộng từ 4 – 7 ngày. Khi mới hình thành nhộng có màu xanh nhạt, khoảng 2 ngày sau thành màu vàng nhạt, chiều dài nhộng từ 5 – 7 mm, chung quanh nhộng có kén bằng tơ bao phủ. Hình 1.7 Vòng đời của sâu tơ Plutella xylostella 1.7.2 Tập quán sinh sống và cách gây hại Sâu non mới nở bò lên bề mặt lá gặm biểu bì tạo thành những rảnh nhỏ ngoằn ngoèo. Từ tuổi 2, sâu ăn thịt lá để lại lớp biểu bì tạo thành những vết trong mờ. Sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì lá làm lá thủng lỗ, giảm năng suất và chất lượng rau. Khi mật độ sâu cao, ruộng rau bị hại xơ xác, chỉ còn trơ lại gân lá. Khi bị động đến sâu thường nhả tơ buông mình xuống đất nên còn được gọi là “ sâu đù”. 1.7.3 Biện pháp phòng trừ Thường xuyên vệ sinh đồng ruộng, tỉa bỏ các lá già, làm cỏ. 30
  35. Đồ án tốt nghiệp Bố trí mùa vụ thích hợp, vụ đông xuân ít sâu hơn vụ hè. Luân canh với cây không cùng ký chủ, dùng bẫy dính màu vàng theo dõi bướm sâu tơ, trồng xen với cây họ cà sẽ đuổi được bướm của sâu tơ. Dùng lưới cao 2m bao xung quanh để hạn chế bướm sâu tơ từ bên ngoài bay vào đẻ trứng. Kết hợp thuốc BT với thuốc hóa học như MATCH 050EC, SUCCESS 25EC và tạo điều kiện cho thiên địch phát triển. Sử dụng chế phẩm nấm diệt bướm của sâu tơ. 31
  36. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 21/12/2016 đến ngày 31/07/2017. 2.1.2 Địa điểm Phòng thí nghiệm Vi sinh Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học, trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens Giống vi khuẩn Serratia mascescens SH4 được phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Lê Quốc Vũ (2015), lưu trữ tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh. 2.2.2 Nguồn nấm Nấm Trichoderma sp, Paecilomyces sp, Aspergillus flavus CDP1, Fusarium sp. do cô Nguyễn Thị Hai cung cấp tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh. 2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii Trứng bào xác A.nauplii được cung cấp tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh. 2.2.4 Nguồn cải ngọt Brassica integrifolia. Hạt cải ngọt thương phẩm được cung cấp bởi công ty TNHH Hạt giống Thuận Điền địa chỉ 588/50A tỉnh lộ 10, phường Bình Trị Đông quận Bình Tân TP.HCM. 2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate Cá được thu mua ở cửa hàng cá cảnh số 217 Lê Văn Quới phường Bình Trị Đông quận Bình Tân thành phố Hồ Chí Minh. 2.2.6 Môi trường nuôi cấy và hóa chất a. Môi trường (Thành phần môi trường xem phụ lục 1) Môi trường Peptone glycerone agar (PGA) Môi trường Peptone glycerone broth (PG) Môi trường lipid Môi trường Casein 32
  37. Đồ án tốt nghiệp Môi trường huyền phù Chitin b. Hóa chất sử dụng Cồn 70, cồn 96 NaCl HCl, NaOH Petroleum ether N- Hexan Nước muối bão hòa Ethyl acetate, Acetone 2.2.7 Dụng cụ, thiết bị a. Dụng cụ Phễu chiết Ống nghiệm Đĩa petri Erlen 50ml, 100 ml, 250ml Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml Pipetman 100μl, 1000μl. Đầu típ Đũa thủy tinh Bao hấp, giấy gói, thun Đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng Bông không thấm, bông thấm Chai syrum 100ml. b. Thiết bị Tủ cấy vi sinh Tủ lạnh Cân phân tích Bếp từ 33
  38. Đồ án tốt nghiệp Máy nước cất Autoclave Tủ hút Máy ly tâm Máy cô quay Bể điều nhiệt 2.3 Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát hoạt lực diệt sâu tơ của chế phẩm và ảnh hưởng của chế phẩm lên cây cải ngọt, nấm gây bệnh, nấm có lợi và thủy sinh: A.nauplii, cá bảy màu. 2.4 Nội dung nghiên cứu Định tính enzyme protease, lipase, chitinase của dịch nuôi cấy sau xử lý acid. Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm lên các chế phẩm sinh học diệt sâu bệnh ( nấm Trichoderma sp., nấm Paecilomyces sp.) và nấm bệnh Aspergillus flavus CDP1 và nấm Fusarium sp.). Khảo sát hoạt lực diệt sâu tơ Plutella xylostella của chế phẩm chứa prodigiosin. Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm lên cây cải ngọt Brassica integrifolia. Thử nghiệm độc lực của chế phẩm lên ấu trùng Artemia nauplii, cá bảy màu Poecilia reticulata. 2.5 Phương pháp thí nghiệm 2.5.1 Phương pháp luận Các nghiên cứu trước đã chứng minh prodigiosin từ Serratia marcescens (phân lập từ tuyến trùng EPN) có hiệu lực diệt sâu khá mạnh. Để phát triển một chế phẩm diệt sâu cần đơn giản hóa tối đa các quá trình downtream processing đối với dịch nuôi cấy lên men vi khuẩn. Vì vậy việc sử dụng phương pháp xử lý acid để tiêu diệt tế bào S. marcescens SH4 và sau đó làm chế phẩm mang lại hiểu quả cao, giữ lại phần lớn các hoạt tính từ dịch nuôi cấy vi khuẩn và không làm ảnh hưởng đến prodigiosin trong dịch nuôi cấy vi khuẩn. (Lê Thị Ngọc Dung, Tạo chế phẩm diệt sâu khoang từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marces SH1 2016) 34
  39. Đồ án tốt nghiệp Khảo sát hoạt tính kháng nấm được sử dụng có ý nghĩa thăm dò khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy S. marcescens SH4 có khả năng kháng nấm khi sử dụng chế phẩm đồng thời với chế phẩm từ nấm trên đồng ruộng hay không. Hoạt tính diệt sâu được thử nghiệm trên sâu tơ Plutella xylostella. Chế phẩm được sản xuất bằng cách bổ sung Tween 80 phá vỡ màng nhốt prodigiosin, CMC là tác nhân tạo độ nhớt, độ kết dính, rỉ đường kích thích sâu ăn tăng hiệu lực diệt sâu. Bên cạnh đó đề tài khảo sát khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy lên tác nhân diệt bệnh như Trichoderma sp. và diệt sâu hại như Paecilomyces sp. cũng được đề cập. Qua đó khẳng định chế phẩm diệt sâu có khả năng sử dụng đồng thời với hai chế phẩm sinh học diệt trừ bệnh và sâu hại cho cây khi sử dụng đồng thời hai loại chế phẩm sinh học này cùng với chế phẩm diệt sâu tơ Plulella xylostella hay không. Tính an toàn sinh học cũng được chú trọng và được khảo sát qua thí nghiệm thử độc tính trên cây cải ngọt Brassica integrifolia, ấu trùng Artemia nauplii và thủy sinh đại diện là cá bảy màu Poecilia reticulate cũng được quan tâm đến trong bài nghiên cứu này. 2.5.2 Bố trí thí nghiệm Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ 35
  40. Đồ án tốt nghiệp Giống vi khuẩn S.marcescens Tăng sinh 48 giờ, lắc 150 vòng /phút Xử lý acid HCl pH 2, 4giờ Trung hòa NaOH về pH 7 Enzyme Khảo sát hoạt tính Kháng nấm Chuẩn bị dịch Thử nghiệm khả năng diệt sâu Thử độc tính Khảo sát độc tính trên Khảo sát độc tính trên cây Khảo sát độc tính trên cá ấu trùng A.nauplii cải ngọt B.integrifolia bảy màu P.reticulata Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của chế phẩm. 2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 2.6.1 Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm Phòng nuôi sâu phải đảm bảo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sâu tơ phát triển 25 ± 2oC, và ẩm độ 70 ± 5%. Sâu tơ Plutella xylostella được thu mẫu từ vườn cải ngọt tại huyện hóc môn, Tp.HCM, sâu tơ ngoài đồng mang về nuôi được tính là sâu thế hệ P. 36
  41. Đồ án tốt nghiệp Thế hệ P được nuôi trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá cải ngọt cho tới khi hóa nhộng. Khi sâu vào giai đoạn hóa nhộng, lót khăn giấy trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá cải ngọt cho tới khi 4 - 7 ngày hóa nhộng trong hộp. Sau khi vũ hóa, ngài thuộc thế hệ P được ghép cặp với nhau trong các hộp nhựa được lót lá cải ngọt và cung cấp thức ăn dưới dạng lỏng là nước đường pha loãng (tỉ lệ 1:10). Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh hàng ngày. Thu lá cải ngọt khoảng 2 ngày 1 lần để thu trứng từ thế hệ P đã được ghép cặp. Tiếp tục cho lá cải ngọt mới vào hộp để tạo diều kiện cho ngài đẻ trứng. Sau 2 ngày, trứng nở ra sâu non F1, sâu non được nuôi với thức ăn là lá cải ngọt. Nhân nuôi sâu tơ Plutella xylostella cho đến khi đủ số lượng để tiến hành thí nghiệm. 2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh 48 giờ trong chai có chứa 20 ml môi trường peptone glycerol broth vô trùng, với tỉ lệ cấy giống 1%. Nuôi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút, tránh ánh sáng, trong 48 giờ. Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy và đem xử lí với acid HCl 1N. Với mục đích đưa môi trường về pH = 2, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dùng pipetman hút 450 휇푙 dung dịch acid HCl 1N cho vào chai dịch nuôi cấy lên men. Lắc 150 vòng / phút, ủ trong tối trong 4 giờ. Sau đó, đưa môi trường về pH = 7 với 450 휇푙 dung dịch NaOH 1N. (Lê Thị Ngọc Dung, 2016 Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia mascescens SH1, Đồ án tốt nghiệp, trường Đại học Công nghệ TP. HCM) 2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trong môi trường PG ở nhiệt độ phòng, ủ tối trong 48 giờ. Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lí: 37
  42. Đồ án tốt nghiệp Sau khi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường PG broth vô trùng, dùng pipetman hút 450 휇푙 HCl 1N cho vào dịch nuôi cấy lên men, lắc 150 vòng/ phút, trong 4 giờ. Tiến hành thêm 450 휇푙 NaOH 1N để đưa dịch nuôi cấy về pH = 7. Hút 20 휇l Tween 80 vô trùng cho vào 10 ml dịch nuôi cấy đã được xử lý acid. Chuẩn bị Tween 80 0,02%: Hút 20 휇l Tween 80 cho vào lần lượt các dịch pha loãng với thể tích 10 ml. Thử nghiệm hoạt tính protease Pha môi trường casein agar, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trường nguội đến khoảng 65oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d). Đối chứng dương: Dùng pipetman hút 20 휇푙 dịch nuôi cấy lên men vi khuẩn thử nghiệm cho vào giếng thạch. Ủ 24 giờ, tráng TCA 10%, đo đường kính vòng phân giải. Các thử nghiệm: Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10ml, tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ pha loãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 휇푙 ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính casein, như hình 2.3 Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. ĐC Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Casein 38
  43. Đồ án tốt nghiệp Đọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng TCA 10% lên đĩa môi trường: Nếu dịch nuôi cấy có enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme lipase thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải casein được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme protease sau xử lí acid càng lớn. Trong đó : D: đường kính vòng phân giải (mm) d: đường kính giếng thạch (mm) Thử nghiệm hoạt tính enzyme Lipase Pha môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 1210C trong 15 phút. Để môi trường nguội đến khoảng 650C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d). Đối chứng dương: Hút 20 휇푙 sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đo đường kính vòng tủa trên bề mặt môi trường. Các thử nghiệm: Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10 ml, tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy lên men đã qua xử lí acid thành dãy các nồng độ pha loãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipet man hút 20 휇푙 ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính lipit, như hình 2.2 Thí nghiệm lặp lại 3 lần. 39
  44. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Lipit Đọc kết quả: Nếu dịch nuôi cấy có enzyme lipase thì xuất hiện vòng tủa xung quanh giếng thạch. Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme lipase thì không xuất hiện vòng tủa xung quanh giếng thạch Khả năng phân giải lipit được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme lipit sau xử lí acid càng lớn. Trong đó : D: đường kính vòng phân giải (mm) d: đường kính giếng thạch (mm) Thử nghiệm hoạt tính Chitinase Pha môi trường thạch huyền phù chitin 1%, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trường nguội đến khoảng 65oC, đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d). Đối chứng dương: Dùng pipetman hút 20 sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào đĩa petri môi trường thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đường kính vòng phân giải trên bề mặt môi trường. 40
  45. Đồ án tốt nghiệp Các thử nghiệm: Canh trường vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10 ml, tiến hành pha loãng canh trường lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ phaloãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính lipit, như hình 2.4 Thí nghiệm lặp lại 3 lần. ĐC Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Chitin Đ ọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa môi trường: Nếu dịch nuôi cấy có enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid càng lớn. Trong đó : D: đường kính vòng phân giải (mm) d: đường kính giếng thạch (mm) 41
  46. Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm Thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp đục giếng thạch dựa vào khả năng khuếch tán của các hợp chất có khả năng kháng khuẩn vào môi trường thạch. Phương pháp này được thực hiện như sau: Nấm thử nghiệm – Trichoderma sp., Paecilomyces sp., Aspergillus flavus CDP1, Fusarium sp. Pha môi trường PDA bổ sung thêm kháng sinh choramphenycol 0,25%, vô trùng que cấy thẳng, tiến hành cấy điểm nấm bệnh từ môi trường thạch nghiêng sang môi trường PDA có bổ sung kháng sinh, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó, đục thạch có đường kính 5 mm cấy sinh khối nấm vào đĩa PDA không bổ sung kháng sinh. Nuôi ủ tơ nấm trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính enzyme như mục 2.6.3.1. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy thành dãy các nồng độ pha loãng: 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha loãng. Pha loãng dịch nuôi cấy đã xử lý acid thêm 20 휇푙 Tween 80 vô trùng vào 10 ml dịch. Chuẩn bị 10 ml môi trường PG vô trùng thêm 20 휇푙 Tween 80 vào các môi trường PG pha loãng vô trùng để đạt nồng độ Tween 80 0,02% ở dãy các nồng độ pha loãng: 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Đối chứng âm : chuẩn bị 20 ml PG vô trùng đã bổ sung Tween 80 0,02%. Đối chứng dương : Chế phẩm Carbenzim hút 0,15 ml pha loãng với 100 ml nước cất vô trùng. Tiến hành kháng nấm: Chuẩn bị môi trường PDA vô trùng. Tiến hành đục giếng thạch 5mm. Vô trùng cây đục thạch và đục lấy khối thạch với đường kính 5mm có sinh khối nấm từ đĩa PDA phía trên và đặt vào trung tâm đĩa PDA như hình 2.3 Hút 20 휇l dịch nuôi cấy đã xử lí acid ở các nồng độ pha loãng cho vào giếng thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng, từ 3 – 5 ngày. 42
  47. Đồ án tốt nghiệp Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. Nấm Hình 2.3 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA Đọc kết quả thí nghiệm: Nếu xảy ra hiện tượng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ bị ức chế và đường kính nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đường kính của nấm ở đĩa đối chứng Nếu không xảy ra hiện tượng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ không bị ức chế, phát triển bình thường như nấm ở đĩa đối chứng. Tỷ lệ ức chế được đánh giá theo công thức sau (Pander và cộng sự, 1982) Đo đường kính khuẩn lạc (cm) trong 3, 5 và 7 ngày sau cấy Tỷ lệ (%) ức chế được tính theo công thức: − U = x100 Trong đó: U: % khuẩn lạc bị ức chế. D: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng. X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. 43
  48. Đồ án tốt nghiệp Trong đó: đường kính khuẩn lạc bằng đường kính sau khi đo trừ đi đường kính khối thạch Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989): Cấp 1: không ảnh hưởng ( 90%) 2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá Sâu thí nghiệm – sâu tơ Plutela xylostella Sâu tơ đầu tuổi 3 được chọn ra 30 con, tiến hành cân trọng lượng cả 30 con rồi cho vào hộp có thể tích 950ml. Các hộp nuôi sâu đã được thanh trùng. Lặp lại 24 hộp Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính enzyme như mục 2.6.3.1. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 2 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lý acid pha loãng với 18 ml PG vô trùng. Hút 9 ml dịch pha loãng ở các nồng độ rồi tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha loãng. Sau đó, hút 1 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% cho vào 9 ml dịch pha loãng còn lại. Tiến hành thí nghiệm. Phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012) phương pháp này mô phỏng gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngoài đồng nhằm khảo sát khả năng diệt sâu qua đường tiêu hoá của hợp chất prodigiosin của chủng SH4. Lá cải ngọt được rửa sạch và để ráo nước, cắt với diện tích 15 × 10 (cm2). Hút 100 휇l dịch pha loãng lên lá, vô trùng que cấy để tiến hành trang đều dịch ở các nồng độ pha loãng lên lá cải ngọt. Sau đó cho lá vào hộp nuôi sâu. Theo dõi số lượng sâu 44
  49. Đồ án tốt nghiệp chết và trọng lượng của sâu trong 5 ngày theo các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. Thí nghiệm được bố trí như hình 2.6 Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P. xylostella phẩm bằng phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012). Ở hộp đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá cải ngọt được trang đều 100 휇푙 PG vô trùng được bổ sung 450 휇푙 HCl 1N, 450 휇푙 NaOH 1N. Hút 1ml phụ gia chứa Tween 80 0,02%, rỉ đường 1%, dịch CMC 1% vào 9ml dịch trên. Ở hộp đối chứng dương: tiến hành cho sâu tơ ăn lá cải ngọt được trang đều 100 휇푙 thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC (abamectin) đã được pha loãng đạt nồng độ 7.5 ng/cm2. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần Đọc kết quả kháng sâu: Dựa vào số lượng sâu tơ P. xylostella chết ở từng mốc thời gian để đánh giá hiệu quả diệt sâu của chế phẩm. Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott (1925). 2.6.3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii Ấu trùng thử nghiệm: Artemia nauplii. 45
  50. Đồ án tốt nghiệp Trứng bào xác Artemia nauplii được ấp nở bằng nước biển có độ mặn 30‰, pH 7,5 – 8,5. Tỷ lệ trứng là 0,5g – 1g/ lít nước biển. Quá trình ấp nở trứng để nơi thoáng mát, có ánh sáng, nhiệt độ 26 – 300C sục khí liên tục. Trứng nở sau 20 - 35 giờ. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính enzyme như mục 2.6.3.1. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 2 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lý acid pha loãng với 18 ml nước muối 30‰ vô trùng thành dãy nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Sau đó, hút 2 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% cho vào các dịch pha loãng trên. Tiến hành thí nghiệm Đếm chính xác 30 ấu trùng A.nauplii cho vào cốc nhựa đã kẻ vạch 20 ml đã chuẩn bị. Cho dịch pha loãng ở các nồng độ vào các cốc có chứa ấu trùng A.nauplii, tiếp tục cho các dịch pha loãng theo dãy các nồng độ. Cốc đối chứng âm : chuẩn bị 20 ml PG vô trùng có bổ sung 450 휇푙 HCl 1N, 450 휇푙 NaOH 1N. Hút 2 ml dịch PG có bổ sung 450 휇푙 HCl 1N, 450 휇푙 NaOH 1N cho vào 18 ml nước muối 30‰ vô trùng. Thêm 2 ml phụ gia vào dịch trên rồi cho vào cốc chứa 30 ấu trùng A.nauplii. Cốc đối chứng dương : hút 100 휇푙 thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC đã được pha loãng đạt nồng độ 7.5 ng/cm2 cho vào cốc chứa 30 ấu trùng A.nauplii. Định mức thể tích ở cốc đối chứng dương sao cho đạt cốc đạt 20 ml. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần với thể tích thực của cốc là 20 ml. Đọc kết quả thử độc tính từ ấu trùng A.nauplii Đếm số lượng ấu trùng A.nauplii sống sau 4 giờ. Tính LC50, LC90 46
  51. Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.5 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cải ngọt Brassica integrifolia Hạt cải ngọt - Brassica integrifolia Hạt cải ngọt Brassica integrifolia thời vụ quanh năm, chu kì sinh trưởng từ 32 - 35 ngày sau khi gieo độ sạch ≥ 98%, độ nảy mầm ≥85%, độ ẩm ≤10%. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính enzyme như mục 2.6.3.1. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 4 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lý acid pha loãng với 36 ml nước cất vô trùng thành dãy nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10- 4, 10-5 và 10-6. Hút 4 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% vào các dịch pha loãng. Đối chứng âm : Chuẩn bị 40 ml PG vô trùng hút 900 휇푙 HCl 1N và 900 휇푙 NaOH 1N. Hút bỏ 4 ml PG dịch trên rồi thêm 4 ml phụ gia chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1%. Đối chứng dương: Hút 0,75 m푙 Reagants 3.6EC pha loãng vào 100ml nước cất vô trùng. Tiến hành thí nghiệm Đếm chính xác 40 hạt cải ngọt thương phẩm cho vào ống nghiệm. Hút 1 ml dịch pha các nồng độ thí nghiệm ngâm hạt cải trong 2 giờ, pha nước ấm với tỉ lệ nước 3 sôi : 2 lạnh ở 20 – 350C. Cân 1 kg đất trồng cho vào các hộp nhựa diện tích 15 x 21cm. Dùng thun chia hộp thành 3 lô với diện tích mỗi lô là 7 x 15 cm với mỗi lô gieo 40 hạt cải ngọt. Dùng giấy thấm khô hạt và gieo hạt đã ngâm vào các hộp đất đã chuẩn bị. Dùng bình xịt phun 1ml các nồng độ thí nghiệm khi cây ra lá sau 3 ngày ngâm. Phun chế phẩm định kì sau 3, 6, 9 ngày theo dõi. Chỉ phun 1 lần trong các ngày theo dõi. 47
  52. Đồ án tốt nghiệp Quan sát cây, tưới nước 2 ngày một lần vào buổi sáng sớm và lúc chiều tối cho các nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần. Đọc kết quả thí nghiệm: Đếm số lượng hạt nảy mầm sau khi gieo. Tỉ lệ nảy mầm được tính theo công thức Tổng số hạt nảy mầm sau khi gieo ( ) × 100 Tổng số hạt ban đầu trước khi gieo Đọc kết quả thử độc tính ở cải ngọt sau 3 ngày phun. Tỉ lệ chết của cây được tính theo công thức Abbott (1925), theo dõi biểu hiện của cây sau khi phun chế phẩm. Nếu cây có biểu hiện ngộ độc như cháy, vàng lá, héo, chết cây thì ước lượng độ độc theo thang đánh giá như sau: Phân cấp mức độ độc của thuốc khảo nghiệm đối với cây trồng Cấp Triệu chứng nhiễm độc. 1 Cây chưa có biểu hiện ngộ độc. 2 Ngộ độc nhẹ, sinh trưởng của cây giảm nhẹ. 3 Có triệu chứng ngộ độc nhẹ nhìn thấy bằng mắt. 4 Triệu chứng ngộ độc như (mất diệp lục) nhưng chưa ảnh hưởng đến năng suất. 5 Cành lá biến màu hoặc cháy, thuốc gây ảnh hưởng đến năng suất. 6 Thuốc làm giảm năng suất ít. 7 Thuốc gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất. 8 Triệu chứng ngộ độc tăng dần tới làm chết cây. 9 Cây bị chết hoàn toàn. QCVN 01 – 143 : 2013/BNNVPTNT 2.6.3.6 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cá bảy màu Cá bảy màu - Poecilia reticulate 48
  53. Đồ án tốt nghiệp Tuyển chọn cá mái, chiều dài 2,0 ± 1,0 cm, bơi nhanh linh hoạt, không bị dị tật ở vây, đuôi Chọn cá hoàn toàn khỏe mạnh sạch bệnh. Pha môi trường nước nuôi cá thử nghiệm theo tiêu chuẩn (ISO 6341 – 1982). Nước có độ cứng với tổng nồng độ ion Ca và Mg trong nước là 2,5mmol/l. Tỉ lệ Ca : Mg là 4 : 1 và ion Na : K là 10 : 1, chỉ số acid KS4.3 là 0,8mmol/l (Fish, Acute Toxicity Test, 1992). Thiết lập hệ thông bán tĩnh thay nước 2 ngày/lần, thay ¾ lượng nước. Tỉ lệ nước và trọng lượng cá là 25 g/lít. Chiếu sáng liên tục 12 giờ/ngày. Cá được nuôi trong môi trường nước thử nghiệm trong 7 ngày để cá thích nghi, nhiệt độ duy trì ở 21 - 250C, lượng oxi hòa tan ≥ 60%. Cá được cho ăn mỗi ngày 1 lần, khối lượng thức ăn được cho ăn bằng 1% trọng lượng cá thí nghiệm Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính enzyme như mục 2.6.3.1. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 1 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lý acid pha loãng với 9 ml PG vô trùng thành dãy nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Hút 1 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% vào các dịch pha loãng. Ở các nồng độ thí nghiệm pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 hút 1,7 ml mẫu cho vào 10g thức ăn cho cá, tiếp tục cho 3 ml nước cất vô trùng vào hỗn hợp. Dùng thìa vô trùng tán mạnh, trộn đều hỗn hợp tới khi hỗn hợp hoàn toàn đồng nhất. Sấy mẩu thức ăn cho cá ở 450C trong 5 giờ. Đối chứng âm : Chuẩn bị 20 ml PG vô trùng hút 450 휇푙 HCl 1N và 450 휇푙 NaOH 1N. Hút 9 ml PG rồi thêm 1 ml phụ gia chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1%. Hút 1,7 ml đối chứng âm cho vào 10g thức ăn cho cá, tiếp tục cho 3 49
  54. Đồ án tốt nghiệp ml nước cất vô trùng vào hỗn hợp. Dùng thìa vô trùng tán mạnh, trộn đều hỗn hợp tới khi hỗn hợp hoàn toàn đồng nhất. Sấy mẩu thức ăn cho cá ở 450C trong 5 giờ. Tiến hành thí nghiệm Thiết lập hệ thống thử nghiệm bán tĩnh, thay nước 2 ngày/lần, thay ¾ lượng nước thí nghiệm cá. Tỉ lệ nước và trọng lượng cá là 25 g/lít. Chiếu sáng liên tục 12 giờ/ngày. Đếm chính xác 10 con cá bảy màu mái, tuyển chọn cá không dị tật ở vây, đuôi, mang Cá có chiều dài 2,0 ± 1,0 cm cho vào các hộp chứa nước thử nghiệm chuẩn bị sẳn. Sục khí liên tục tạo lượng oxi hòa tan trong nước ≥ 60%. Nhiệt độ thích hợp thử nghiệm cho cá trong khoảng 21 - 250C Cá được cho ăn mỗi ngày 1 lần, khối lượng thức ăn được cho ăn bằng 1% trọng lượng cá thí nghiệm. Theo dõi cá thí nghiệm theo các mốc thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ. Mỗi nghiệm thức lập lại 2 lần. Đọc kết quả thí nghiệm : Đọc kết quả thử nghiệm độc tính của chế phẩm trên cá sau 5 ngày theo dõi. Tỉ lệ chết của cá thử nghiệm được tính theo công thức Abbott (1925). Theo dõi biểu hiện của cá sau khi ăn thức ăn có chế phẩm theo dãy nồng độ thí nghiệm. Quan sát tất cả biểu hiện trên cơ thể cá, dị tật, hành vi bơi. 50
  55. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào Ngoài prodigiosin là tác nhân gây chết côn trùng thì enzyme Serralysin metalloprotease cũng được coi là yếu tố độc lực của S. marcescens trên sâu vì vậy dịch nuôi cấy phải thể hiện hoạt tính này. Thử nghiệm hoạt tính protease Sau quá trình ủ, khả năng phân giải casein của vi sinh vật bằng trichloroacetic acid (TCA). Casein sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục do enzyme protease có mặt trong canh trường lên men vi khuẩn, enzyme này phân giải casein trong môi trường nên TCA tạo phức với casein.Vùng có sự phân giải casein sẽ trong suốt vì không có phức hợp tủa giữa casein với TCA 10% Kết quả khi tiến hành trên môi trường casein thì tất cả các nồng độ đều có khả năng phân giải casein. Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA 10% – casein trắng đục dễ dàng nhận thấy. Thử nghiệm hoạt tính Chitinase Tiến hành thí nghiệm trên môi trường huyền phù Chitin 1%, kết quả cho thấy khi hạ pH môi trường về pH 2 để diệt tế bào vi khuẩn đã làm ảnh hưởng đến enzyme chitinase, làm enzyme này bị bất hoạt hoặc biến tính, mất khả năng phân giải chitin trong môi trường. Thử nghiệm hoạt tính lipase Enzyme lipase xúc tác thủy phân các cầu nối ether của triacylglycerol để tạo ra glycerol acid béo. Có thể dễ dàng phát hiện enzyme lipase của vi sinh vật trên môi trường đĩa thạch chứa tween 80 và CaCl2. Lipase sẽ thủy phân tween 80 trong môi trường tạo ra các acid béo, các acid béo được giải phóng sẽ kết tủa với muối calcium trong môi trường. Phức hợp acid béo – calcium sẽ làm đục môi trường xung quanh điểm cấy. Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase không có thấy sự hiện diện của enzyme lipase của các chủng vi sinh vật thử nghiệm. 51
  56. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1 các enzyme ngoại bào trong canh trường lên men sau xử lí acid. Đường kính vòng phân giải (D-d) mm trên môi Hệ số pha Stt trường tương ứng loãng Casein agar Tween 80 agar Chitin agar 1 21 12 ± 0,1b 0 0 2 22 11,3 ± 0,1b 0 0 3 23 11,3 ± 0,6b 0 0 4 24 10 ± 0,1bc 0 0 5 25 10,0 ± 0,2bc 0 0 6 26 7,3 ± 0,6c 0 0 Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm: lipase, protease và chitinase. Kết quả cho thấy việc hạ đột ngột pH môi trường từ trung tính (pH 7) về acid pH 2 không gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme protease. Enzyme chitinase và lipase của vi khuẩn bị bất hoạt. Tóm lại, enzyme ngoại bào là protease đã giữ được hoạt tính trong suốt quá trình xử lí acid HCl 1N. 3.2 Hoạt tính kháng nấm Nấm Aspergillus flavus CDP1 và nấm Fusarium sp được xem là loài nấm gây bệnh, sinh ra độc tố gây hại cho cây trồng. Vì vậy thử nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm bệnh để đánh giá khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lý acid. Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1 Khả năng kháng nấm Aspergillus flavus CDP1 Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%) 21 30,0 ± 2,6 17,1 ± 2,8bc 22 29,6 ± 4,1 10,8 ± 4,8cd 23 28,0 ± 1,0 19,0 ± 1,6bc 24 28,0 ± 3,6 19,0 ± 10,0bc 25 27,3 ± 2,5 24,4 ± 3,6b 52
  57. Đồ án tốt nghiệp 26 28,6 ± 1,5 18,4 ± 4,3bc Đối chứng 31,0 ± 4,0 0 Carbenzim 0 100a Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. Khả năng kháng nấm Fusarium sp. Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%) 21 25 ± 0,2 26,6 ± 3,3bc 22 25,6 ± 1,5 25,1 ± 2,0bc 23 29,0 ± 2,6 19,0 ± 5,9c 24 25,6 ± 6,6 29,8 ± 2,7b 25 28,3 ± 1,1 19,7 ± 3,1c 26 26,6 ± 0,6 24,1 ± 1,5bc Đối chứng 32,6 ± 2,5 0 Carbenzim 0 100a Dựa trên chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989) thì tỉ lệ kháng nấm của dịch nuôi cấy sau xử lý acid với nấm Aspergillus flavus CDP1 cao nhất ở hệ số pha loãng 25 là 24,4 ± 3,6b (%) ≤ 50 (%) ở cấp độ 1 được xem là không kháng. Tương tự với nấm Fusarium sp. 29,8 ± 2,7b (%) ≤ 50 (%) ở cấp độ 1 được xem là không kháng. Ở thí nghiệm kháng nấm Trichoderma sp. cho thấy enzyme protease vốn có của vi khuẩn trong dịch nuôi cấy đã xử lí, vẫn còn khả năng ức chế việc phát tiển của tơ nấm Trichoderma sp. nhưng không cao. Điều này chứng tỏ chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens có thể được sử dụng đồng thời cùng chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma sp., nấm có lợi trong việc hổ trợ sự phát triển của cây trồng và tăng khả năng diệt trừ các loại côn trùng gây hại, cạnh tranh với các loại nấm gây hại cây trồng. Tuy nhiên chế phẩm này có thể ức chế nấm Pacelopmyces sp. ở nồng độ pha loãng 24 với tỷ lệ kháng là 34,8 ± 11,5 %. 53
  58. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp. Khả năng kháng nấm Trichoderma sp. Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%) 21 69,6 ± 0,5b 9,5 ± 0,7bc 22 73,6 ± 3,5b 4,3 ± 4,6bc 23 73,6 ± 3,0b 4,3 ± 3,9bc 24 62,6 ± 10,6a 18,6 ± 13,8b 25 70,3 ± 0,5ab 8,6 ± 0,7bc 26 68,3 ± 2,5ab 11,2 ± 3,2bc Đối chứng 73,6 ± 3,0b 0 Carbenzim 0 100 Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. Khả năng kháng nấm Paecilomyces sp. Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%) 21 20,0 ± 1,0 13,0 ± 4,3cd 22 20,3 ± 0,5 11,6 ± 2,5cd 23 15,3 ± 3,2 33,3± 14,0bc 24 15,0 ± 2,6 34,8 ±11,5b 25 16,0 ± 2,6 28,3 ± 7,8bc 26 20,3 ± 2,5 17,4 ± 19,2bcd Đối chứng 23,0 ± 0,4 0 Carbenzim 0 100a Kết quả thí nghiệm cho thấy tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. cao nhất ở hệ số pha loãng 24 là 34,8 ± 11,5 (%), với đường kính vòng nấm 15,0 ± 2,6 (mm) Dựa trên chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989) thì tỉ lệ kháng nấm của dịch nuôi cấy sau xử lý acid với nấm 54
  59. Đồ án tốt nghiệp Trichoderma sp. cao nhất ở hệ số pha loãng 24 là 18,6 ± 13,8 (%) ≤ 50 (%) ở cấp độ 1 được xem là không kháng. Tương tự với nấm Paecilomyces sp. dịch nuôi cấy sau xử lý acid kháng nấm ở hệ số pha loãng 24 là 34,8 ± 11,8 ≤ 50 (%) ở cấp độ 1 là không kháng. 3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu được thực hiện bằng phương pháp quét lá với các nồng độ theo hệ số pha loãng để xác định giá trị nồng độ nào diệt sâu tốt nhất. Tiến hành thử nghiệm với 1 đối chứng dương là thuốc trừ sâu sinh học Reasgant 3.6EC và 1 đối chứng âm là môi trường PG broth vô trùng có bổ sung Tween 80 0,02%, rỉ đường 1 % và CMC 1 % , cùng 6 nghiệm thức chế phẩm ở nồng độ pha loãng là 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6 , theo dõi số lượng sâu chết mỗi 24 tiếng trong vòng 6 ngày. Ngoài hoạt chất diệt sâu là prodigiosin thì chế phẩm được bổng sung phụ gia trong đó có rỉ đường, CMC và Tween 80 giúp nâng cao khả năng kháng sâu tơ. Bổ sung CMC 1% giúp tăng độ kết bám của chế phẩm lên trên lá, giảm thất thoát prodigiosin. Bên cạnh đó, rỉ đường kích thích khẩu vị của sâu giúp sâu ăn ngon miệng nên sâu ăn nhiều hấp thu lượng prodigiosin lớn trên bề mặt lá. Đồng thời rỉ đường còn là chất che giúp bảo vệ prodigiosin dưới tác dộng của ánh sáng, đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu dễ gây biến tính prodigion ngoài tự nhiên. Khi sâu tơ tiêu hóa chế phẩm, lượng Tween 80 bổ sung vào trong chế phẩm giúp prodigiosin khuếch tán tốt vào cơ thể sâu, ngoài ra còn có các enzyme ngoại bào như protease, lipase giúp cho hoạt chất prodigiosin hoạt động tốt và gây chết sâu nhanh hơn. 55
  60. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5 Tỉ lệ chết của sâu tơ tuổi 3. Tỉ lệ chết (%) Nồng độ pha loãng 0h 24h 48h 72h 96h 120h Đối chứng âm 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 10-1 0,0 18,9 51,1 61,8 69,3 83,7 10-2 0,0 22.2 60,0 60,0 84,1 91,9 10-3 0,0 26,7 52,2 73,0 85,2 95,3 10-4 0,0 48,9 70,0 86,5 100,0 100,0 10-5 0,0 27,8 55,6 73,0 85,2 91,9 10-6 0,0 55,6 73,3 78,7 86,4 91,9 Reagant 3.6 EC 0,0 43,3 78,9 88,8 100,0 100,0 KHẢ NĂNG DIỆT SÂU CỦA CHẾ PHẨM 120,0 100,0 80,0 60,0 Reagants 3.6 EC 7,5 ng/cm2 2607,89 ng/cm2 40,0 1491,34 ng/cm2 149,13 ng/cm2 TỈ LỆ CHẾT (%) TỈCHẾT LỆ 14,91 ng/cm2 20,0 1,49 ng/cm2 0,15 ng/cm2 Đối chứng âm 0 ng/cm2 0,0 0 24 48 72 96 120 THỜI GIAN (GIỜ) Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella của chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925). 56
  61. Đồ án tốt nghiệp Kết quả cho thấy, hệ số pha loãng 10-4 có nồng độ prodigiosin 14.91 ng/cm2 cho kết quả kháng sâu là tốt nhất, kết quả này tương tự như kết quả của Lê Thị Ngọc Dung (2016). Tương đương với khả năng diệt sâu của thuốc trừ sâu sinh học Reasgant. Trong 24 giờ đầu, so với thuốc trừ sâu Reasgant chỉ đạt 43,3%, tỉ lệ chết của sâu tơ đạt giá trị 48,9% ở nồng độ pha loãng 10-4, cao gấp 1,13 lần đối chứng Reasgant. Song hiệu lực cao nhất trong 24 giờ đầu lại là nồng độ pha loãng 10-6 cao gấp 1,28 lần đối chứng Reasgant. Xuyên suốt quá trình theo dõi tỉ lệ chết của sâu tơ theo thời gian thì nồng độ pha loãng 10-4 đã chứng tỏ hiệu lực diệt sâu cao tương đương đối chứng dương (Reasgant). Sau 3 ngày, tỉ lệ sâu chết đã đạt 100% cho kết quả tương đương với đối chứng Reasgant 3.6EC. Điều đó cũng khẳng định rằng nồng độ pha loãng 10-4 thích hợp cho việc chọn làm nó làm thông số kĩ thuật khi sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens SH4 3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii Thử nghiệm khảo sát khả năng ảnh hưởng của chế phẩm khi sử dụng có ảnh hưởng đến các sinh vật phiêu sinh đại diện là ấu trùng Artemia nauplli hay không ? Chúng được biết đến là nguồn thức ăn của các sinh vật khác trong nước, đóng vai trò khá quan trọng trong chuỗi thức ăn của hệ sinh thái tự nhiên. Vì vậy cần đánh giá mức độ an toàn để hệ sinh thái trong nước nói riêng cũng như môi trường nói chung là cần thiết. 57
  62. Đồ án tốt nghiệp 100 a 90 80 70 60 50 b 40 c Tỉ lệ chết (%) chết lệ Tỉ 30 cd d cd 20 10 0 -3,6074 -2,6074 -1,6074 -0,6074 0,3926 1,3926 log nồng độ prodigiosin (mg/ml) Hình 3.2 Tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplli theo Log nồng độ prodigiosin (mg/ml). Kết quả thử nghiệm cho thấy chế phẩm có độc tính khá cao ở nồng độ đậm đặc tuy nhiên nồng độ thích hợp diệt sâu ở độ pha loãng 10-4 cho tỉ lệ ấu trùng chết khá thấp so với đối chứng dương là Reagants 3.6EC và nồng độ pha loãng 10-1 lần lượt là 100a và 93,3a ± 8,8. Liều gây chết 50% số ấu trùng A. nauplli của chế phẩm IC50 = 0,2587 ± 0,1065 (mg/L). 3.5 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cải ngọt Brassica integrifolia Hạt nảy mầm sau khi ngâm ngập trong chế phẩm 2 giờ với khoảng nhiệt 20 – 350C không ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt, trong khi đó chế phẩm Reasgant với nồng độ khuyến cáo lại ảnh hưởng đến tỉ lệ nảy mầm. 58
  63. Đồ án tốt nghiệp Tỉ lệ nảy mầm của cải ngọt Brassica integrifolia sau khi ngâm chế phẩm a a a a 100 a aa a a 90 80 70 b 60 50 40 Tỉ lệ nảy mầm (%) mầm lệnảy Tỉ 30 20 10 0 Reagants Đối chứng Đối chứng 2607,89 1491,34 149,13 14,91 1,49 0,15 3.6EC nước âm ng/cm2 ng/cm2 ng/cm2 ng/cm2 ng/cm2 ng/cm2 Hình 3.3. Tỉ lệ nảy mầm của cải ngọt B. integrifolia sau khi ngâm chế phẩm Tỉ lệ nảy mầm của hạt cải ngọt B. integrifolia sau khi ngâm ở các nồng độ thử nghiệm được xử lý thống kê là không khác nhau ở các nồng độ, tương đương với đối chứng nước. Nồng độ cho tỉ lệ hạt nảy mầm cao nhất là nồng độ pha loãng 10-5 là 94,16a ± 1,44 tương đương với nước 95,00a ± 2,00. Tỉ lệ nẩy mầm ở các nồng độ cao hơn so với đối chứng Reagants 3.6EC 59
  64. Đồ án tốt nghiệp TỈ LỆ CHẾT CỦA CÂY SAU KHI PHUN CHẾ 80 PHẨM Reagants 3.6 EC 7,5 ng/cm2 70 2607,89 ng/cm2 1491,34 ng/cm2 60 149,13 ng/cm2 14,91 ng/cm2 50 1,49 ng/cm2 0,15 ng/cm2 40 Đối chứng âm 0ng/cm2 30 TỈ LỆ CHẾT (%) CHẾT LỆ TỈ 20 10 0 0 N G À Y 3 N G À Y 6 N G À Y 9 N G À Y THỜI GIAN (NGÀY) Hình 3.4. Tỉ lệ nảy chết của cải ngọt B. integrifolia sau khi phun chế phẩm Tuy nhiên nồng độ pha loãng 10-4 cho kết quả diệt sâu cao nhất, diệt 100% số sâu thí nghiệm trong 3 ngày tương đương với đối chứng Reagants 3.6EC nên khả năng ưu tiên cho việc chọn nồng độ này làm nồng độ diệt sâu tối ưu cho chế phẩm là hợp lý nhất. Vì vậy nếu chọn nồng độ này làm nồng độ tối ưu cho chế phẩm thì có thể ngâm hạt trong chế phẩm để kích thích hạt nảy mầm nhưng tỉ lệ nảy mầm hạt không cao chỉ đạt 86,66a ± 2,69. Xong về mặt thống kê thì giữa các nồng độ và đối chứng nước là như nhau. Tỉ lệ chết của cây được theo dõi sau 3 lần phun với chế độ chỉ phun 1 lần trong ngày theo chu kì cách 3 ngày phun 1 lần. Tỉ lệ chết của cây được tính theo công thức Abbott (1925). Các nghiệm thức ở các nồng độ theo dõi theo hầu hết cho tỉ lệ chết ở cây không quá 10% số cây non. Thấp nhất là nồng độ pha loãng 10-6 với tỉ lệ chết 4,16 ± 3,81. 60
  65. Đồ án tốt nghiệp Cao nhất là nồng độ pha loãng 10 lần với tỉ lệ chết ở cây non là 10,83 ± 3,81 sau khoảng thời gian 3 ngày phun chế phẩm. Độ độc của chế phẩm được đánh giá như bản theo QCVN 01 – 143 : 2013/BNNVPTNT như bảng 3.6 Bảng 3.6 Độc tính của chế phẩm đối với cây cải ngọt sau 9 ngày thử nghiệm. Số lô thử Nồng độ pha loãng thử nghiệm nghiệm ĐC âm 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Reasgant 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 7 2 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 7 3 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 7 Theo dõi thí nghiệm sau 9 ngày, ở nồng độ pha loãng 10-5 với nồng độ prodigiosin 1,49 ng/cm2 có tỉ lệ cây chết cao nhất trong các nồng độ thí nghiệm 11,40 ± 5,48 và thấp nhất ở nồng độ pha loãng 10-2 với nồng độ prodigiosin 149,13 ng/cm2 với tỉ lệ chết thất nhất 7,02 ± 3,03. Dựa trên thang đánh giá độ độc thì chế phẩm ở cáp độ 1 và Reasgant 3.6EC ở cấp độ 7 theo QCVN 01 – 143 : 2013/BNNVPTNT. Kết quả khảo sát độc tính của chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 trên cây cải ngọt B.integrifolia nồng độ pha loãng 10-4 cho kết quả triển vọng sẽ được chọn làm hệ số pha loãng trong sản xuất trong tương lai. 3.6 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cá bảy màu Poecilia reticulata Cá bảy màu - Poecilia reticulata, thuộc họ Cá khổng tước Poeciliidae. Đây là giống cá dễ nuôi, sinh trưởng mạnh, sinh sản nhanh, đa dạng và phong phú. Cá bảy màu còn được biết đến là loài cá được ứng dụng trong các công trình nghiên cứu, thử độc tính chế phẩm thuốc trừ sâu Sau ngày thứ 3 theo dõi, xuất hiện cá chết ở nồng độ 10-3 và 10-4 tương ứng với nồng độ prodigiosin 149,13 ng/cm2 và 14,9 ng/cm2 ở thí nghiệm diệt sâu tơ. Tỉ lệ cá chết là 10 % trên tổng số cá ở cả hai nồng độ trên. Thử nghiệm độc tính bằng phương pháp phối trộn chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 vào thức ăn nuôi cá bảy màu P. 61
  66. Đồ án tốt nghiệp reticulata, sau 5 ngày quan sát, biểu hiện ở cá bình thường, hành vi bơi và khả năng linh hoạt không thay đổi. Cá không xuất hiện dị tật, các bệnh khác trên cơ thể Bảng 3.7 Tỉ lệ chết của cá sau 5 ngày thử nghiệm. Tỉ lệ chết (%) Nồng độ pha loãng 0h 24h 48h 72h 96h 120h 10-1 0 0 0 0 0 0 10-2 0 0 0 0 0 0 10-3 0 0 0 5,5 5,5 5,5 10-4 0 0 0 5,5 5,5 5,5 10-5 0 0 0 0 0 0 Đối chứng PG 0 0 0 0 0 0 Cá bảy màu sau thử nghiệm cho ăn thức ăn có phối trộn chế phẩm ở các nồng độ thử nghiệm. chỉ có 2 trường hợp chết ở hai nồng độ 10-3 và 10-4 trên tổng số 10 con trong mỗi trường hợp. Hai nồng dộ gây cá chết trùng với nồng độ hiệu lực diệt sâu lớn nhất tuy nhiên tỉ lệ chết là không đáng kể. Như vậy, dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens sau xử lý acid với pH 2 sau 4 giờ có hiệu lực diệt sâu cao nhưng không ảnh hưởng đến các tác nhân sinh học diệt nấm, không tác động tiêu cực đến cây, sự nảy mầm của hạt hay trạng thái cây trồng. So với abamectin thì chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens ít ảnh hưởng lên nảy mầm hạt giống và cây con hơn. Thí nghiệm trên A. nauplii cho thấy avermectin B1 và B2 (các chất tương tự abamectin) có IC100 rất nhỏ, 155-277 ng/mL tương ứng; trong khi trong thí nghiệm của đề tài, IC50 là 0,2587 ± 0,1065 mg/L Chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 còn thể hiện độc tính yếu trên cá bảy màu khi cho ăn, cụ thể là tỉ lệ chết rất nhỏ sau 3 ngày, trong khi đó abamectin được báo cáo là rất độc trên cá. Ngoài ra chế phẩm từ dịch nuôi cấy S. marcescens SH4 chứa hoạt chất chủ yếu là prodigiosin - một hợp chất kị nước nên khó có thể gây ô nhiễm muôi trường nước. 62
  67. Đồ án tốt nghiệp Bước đầu hoàn thiện sơ đồ quy trình công nghệ để sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 được thiết lập như sơ đồ như hình 3.5. Vi khuẩn Serrastia marcescens Nuôi cấy trong PG, lắc 150 vòng/phút ở 250C, 48 giờ Xử lý acid HCl pH 2,4 giờ Trung hòa về HCl pH 7 Phối trộn và tiệt Điều chỉnh về OD 499 trùng phụ gia vào khoảng 0,924 (Tween 80, rỉ đường, dịch CMC) 10 ml pha loãng 100 lần với PG tiệt trùng Phối trộn Chế phẩm Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serrastia marcescens SH4 Vi khuẩn Serrastia marcescens SH4 được nuôi cấy trong môi trường PG ở nhiệt độ 250C, 150 vòng/phút để tạo độ khuếch tán oxi tốt cho vi khuẩn phát triển sinh tổng hợp prodigiosin trong 48 giờ. Tiến hành xử lý acid đưa về pH 2 để diệt tế bào hoàn toàn vì lý do an toàn sinh học. Điều chỉnh dịch nuôi cấy sau xử lý acid ở OD 499 vào khoảng 0,924, tiến hành pha loãng 10 lần rồi phối trộn với phụ gia. 63
  68. Đồ án tốt nghiệp Chế phẩm thu được có khối lượng là 1500g khi sử dụng cần pha loãng 100 lần để nồng độ prodigiosin đạt hiệu lực diệt sâu cực đại (14,9 ng/cm2) và tỉ lệ các thành phần Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1%. 64
  69. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận Dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens đã xử lí acid vẫn thể hiện hoạt tính protease, một trong những yếu tố độc lực của vi khuẩn S. marcescens. Dịch nuôi cấy từ vi khuẩn đã xử lý acid đều không có khả năng kháng tất cả các chủng nấm khảo sát: dịch có khả năng kháng cao nhất là 34,8 % đối với nấm Pacelopmyces sp., thấp nhất là 18,6 % đối với Trichoderma sp., chứng tỏ có thể sử dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 có thể được sử dụng đồng thời cùng chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma sp. và Pacelopmyces sp. Hiệu quả diệt sâu của dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 xử lý acid có bổ sung phụ gia rỉ đường 0,02 % Tween 80 0,004 %và CMC 0,02 % và chế phẩm sinh học diệt sâu tốt nhất ở nồng độ pha loãng 104 dịch nuôi cấy OD 499 = 0,924 có nồng độ prodigiosin 14,9 ng/cm2 . Sau 3 ngày, tỉ lệ sâu chết đã đạt 100 % cho kết quả tương đương với đối chứng Reasgant 3.6EC. Kết quả thử nghiệm trên A. nauplii cho thấy tỉ lệ chết cao nhất ở nồng độ đậm đặc pha loãng 10 lần dịch nuôi cấy OD 499 = 0,924 tuy nhiên nồng độ thích hợp diệt sâu ở độ pha loãng 10-4 cho tỉ lệ ấu trùng chết khá thấp so với đối chứng dương là Reagants 3.6EC Khi xử lý hạt giống bằng chế phẩm từ dịch vi khuẩn đã qua xử lý cho thấy không ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt giống và ảnh hưởng đến sự phát triển của cây. Các nghiệm thức ở các nồng độ theo dõi theo hầu hết cho tỉ lệ chết ở cây non, cao nhất là (10,83 ± 3,81) % ở nồng độ pha loãng 10 lần dịch nuôi cấy OD 499 = 0,924 sau 3 ngày phun chế phẩm. Kết quả thử nghiệm cá cho thấy Khảo sát độc tính trên cá cho tỉ lệ chết không cao ở hệ số pha loãng 10-4 và 10-3 với tỉ lệ chết ko quá 10% trên số cá thí nghiệm. Prodigiosin là hợp chất thứ cấp không tan nên khó có khả năng gây ô nghiễm môi trường. 65
  70. Đồ án tốt nghiệp 2. Kiến nghị - Khảo sát độc tính trên chuột thí nghiệm, thiên địch của sâu như: ong kí sinh, bọ rùa - Khảo sát thời gian và hiệu lực bảo quản của chế phẩm để bảo quản chế phẩm lâu dài. - Thay đổi thành phần phụ gia nâng cao hoạt tính của chế phẩm. - Mở rộng phổ ký chủ cho chế phẩm sinh học diệt sâu: sâu xám, sâu xanh, sâu cuốn lá - Mở rộng thí nghiệm trên qui mô lớn, thí nghiệm trên đồng ruộng. 66
  71. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thị Ngọc Dung (2016) Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1, đồ án tốt nghiệp, trường Đại học Công nghệ TP.HCM. Nguyễn Hoài Hương, Nguyễn Hoàng Anh Kha(2015) Khả năng diệt sâu khoang Spodoptera litura của vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất thứ cấp prodigiosin của vi khuẩn này, Tạp chí phát triển KH & CN, tập 18. Nguyễn Hoàng Anh Kha (2013) Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN, Đồ án tốt nghiệp, trường Đại học Công nghệ TP. HCM. Trần Văn Mão (2002). Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích. Tập II. Hà Nội: Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Tài liệu nước ngoài Anuradha V Giri et al (2004), A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil, BMC Microbiology 2004, 4:11. Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr (2006), Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, Online Journal of Biological Sciences 6 (1): 1-13, 2006. Cang S., Sanada M., Johdo O., Ohta S., Nagamatsu Y., Yoshimoto A. (2000). High production of prodigiosin by Serratia marcescens grown on ethanol, Biotechnol Lett, 22: 1761-1765. Chidambaram Kulandaisamy et al (2009), An Insightful Overview on Microbial Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, 2009, Vol. 5(3): 49-61. Giri, A. V., Anandkumar, N., Muthukumaran, G. and Pennathur, G. (2004). A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil. BMC Microbiology 4: 1- 10. 67
  72. Đồ án tốt nghiệp Grimont, P.A.D., Grimont, F., Irino, K.1982a. Biochemical characterization of Serratia liquefaciens sensu stricto, Serratia proteamaculans, and Serratia grimesiisp. nov.Current Microbiology 7:69–74. Grimont, P.A.D., Grimont, F., Lysenko, O. 1979b. Species and biotype identification of Serratiastrainsassociated with insects.Current Microbiology 2:139– 142. Grimont, P.A.D., Grimont, F., Richard, C., Davis, B.R., Steigerwalt, A.G., Brenner, D.J. 1978a. Deoxyribonucleic acid relatedness between Serratia plymuthica and other Serratia specieswith a description of Serratia odorifera sp. Hejazi, A. and Falkiner, F. R. (1997). Serratia marcescens. Journal of Medical Microbiology 46, 903-912. Hubbard, R. and Rimington, C. (1950). The biosynthesis of prodigiosin, the, tripyrrylmethene pigment from Bacillus prodigiosus (Serratia marcescens). Biochemical Journal 46: 220-225. Helvia W. Casullo de Araújo, K. Fukushima, and Galba M. Campos Takaki (2010), Prodigiosin Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using RenewableResources as a Low Cost Substrate, Molecules 2010, 15, 6931-6940. Hyung Wook Jeong, Hye Yeon Mun, Hyung Keun Oh, Seung Bum Kim, Kwang Yeol Yang, Iksoo Kim, and Hyang Burm Lee, Evalutation Evaluation of Insecticidal Activity of a Bacterial Strain, Serratia sp. EML-SE1 against Diamondback Moth, 2010, Vol. 48, No. 4, pp. 541-545 Jatala, P.1986. Biological control of plant parasitic nematodes. - Ann.Rev.Phytopath. 24: 453-489. Kamble K.D, Hiwarale V.D (2012), Prodigiosin production from Serratia marcescens strains obtained from farm soil, INTERNATIONAL JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCES Volume 3, No 1, 2012. Khanafari A., Assadi M.M. and Fakhr F.A. (2006). Review of prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens, Online J Biol Sci, 6: 1-13. 68
  73. Đồ án tốt nghiệp Kenichi Ishii, Tatsuo Adachi, Takashi Hara, Hiroshi Hamamoto, Kazuhisa Sekimizu (2014), Identification of a Serratia marcescens virulence factor that promotes hemolymph bleeding in the silkworm, Bombyx mori, Journal of Invertebrate Pathology 117 (2014) 61–67. Krishna J.G. (2008) Pigment production by marine Serratia sp. BTWJ8, PhD dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotechnology Cochin University of Science and Technology, Kerala, India. Lapenda Lins et al (2014), Production and toxicological evaluation of Prodigiosin from Serratia marcescens UCP/WFCC1549 on Mannitol Solid Medium, International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol. 7 (2), pp. 32-38. Lewis S.M., Corpe W.A. (1964). Prodigiosin producing bacteria from marine sources, Appl Microbiol, 12: 13-17. Mekhael, R., Yousif, S. Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent. Journal of Duhok University12: 268-274. OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS, Fish Acute Toxicity Test 203, 1992. Qadri S.M.H. and Williams R.P. (1972). Induction of Prodigiosin Biosynthesis after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia marcescens, Appl. Microbiol, 23: 704-709. Ramina M. và Samira Y.Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of Duhok, vol 12: 268- 274. SamsonR. A. (1974) Paecilomyces and some allied Hyphomycetes, Studies in Mycology, 1 –199. Vijayalakshmi et al (2016), Production of Prodigiosin from Serratia marcescens and its antioxidant and anticancer potential, International Journal of Advanced Research in Biological Sciences Volume 3, Issue 3 – 2016, 3(3): 75 – 88. 69
  74. Đồ án tốt nghiệp Zong Qi Liang , Yan Feng Han, Hua Li Chu and Ai Ying Liu (2005).Studies on the genus Paecilomyces in China. 70
  75. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG Môi trường Peptone glycerone agar Peptone 5,00 gram/lít Glycerone 10,00 ml/lít Agar 18,00 gram/lít Môi trường Peptone glycerone broth Peptone 5,00 gram/lít Glycerone 10,00 ml/lít Môi trường Potato dextro agar Khoai tây 200,00 gram/lít Glucose 20,00 ml/lít Agar 20,00 gram/lít Môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase (gram/lit) Glucose 1,00 Yeast extract 3,6 Tween 80 30,00 ml NH4Cl 5,00 K2HPO4 0,10 MgCl2 0,01 CaCl2 0.444 pH cuối ở 250C là 7,0 ± 0,2 Thành phần môi trường casein (gram/lít) Casein 10,00 Agar 15,00 Thành phần môi trường thạch huyền phù chitin Dịch huyền phù chitin 1% 100ml Agar 1,50g Chuẩn bị dịch huyền phú chitin 1% theo phương pháp của Dai et al., (2011) 71
  76. Đồ án tốt nghiệp Do đặc tính của chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính của enzyme chitinase cần huyền phù chitin. Lấy 1g chitin hòa tan trong 20ml HCl đậm đặc đặc khuấy đều và để ở 40C qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh (-100C) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Dịch huyền phù được thu lại bằng cách lọc hoặc ly tâm (4000 vòng/phút trong 20 phút). Huyền phù này được được rửa với nước cất nhiều lần cho đến khi pH trung tính. Thêm vào tủa nước cất cho đến thể tích 100ml. Sau đó bảo quản lạnh dịch huyền phù. Thức ăn cho cá được sản xuất tại công ty Cao Quý 2 số 122/5A ấp 5 xã Xuân Thới Thượng, Hóc Môn. Thành phần dinh dưỡng Phần trăm (%) Protein 38 Chất béo 5 Chất tro 10 Chất xơ 4 Thành phần khác 43 Thành phần môi trường nước trong 1 lít nước nuôi cá thử nghiệm độc tính: Dung dịch stock Caxi (gram/lít) CaCl2.2H20 11,76 g Nước cất 1 lít Dung dịch stock Magie (gram/lít) MgSO4.7H20 4,93 g Nước cất 1 lít Dung dịch stock Natri (gram/lít) NaHCO3 2,59 g 72
  77. Đồ án tốt nghiệp Nước cất 1 lít Dung dịch stock Kali (gram/lít) KCl 0,23 g Nước cất 1 lít Với mối dung dịch stock muối tan, hút 25 ml của từng dung dịch stock định mức tới 1000 ml nước không có khoáng. Sao cho tổng nồng độ ion Ca : Mg trong nước là 2,5mmol/l. Tỉ lệ Ca : Mg là 4 : 1 và ion Na : K là 10 : 1, chỉ số acid KS4.3 là 0,8mmol/l theo tiêu chuẩn ISO 6341-1982 (Fish, Acute Toxicity Test, 1992). 73
  78. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH A1 A2 A3 Khả năng phân giải enzyme Protease A4 A5 A6 Hình 1.1: Khả năng phân giải Protein. A1 , A2, A3, A4, A5, A6: Khả năng phân giải Casein theo nồng độ pha loãng: 21, 22, 23, 24, 25, 26 B1 B2 B3 B4 B5 B6 Hình 1.2: Khả năng phân giải chitin. B1, B2, B3, B4, B5, B6: Khả năng phân giải Chitinase theo nồng độ pha loãng tương ứng: 21, 22, 23, 24, 25, 26 74
  79. Đồ án tốt nghiệp C1 C2 C3 C4 C5 C6 Hình 1.3: Khả năng phân giải lipit của enzyme lipase B1, B2, B3, B4, B5, B6: Khả năng phân giải Chitinase theo nồng độ pha loãng tương ứng: 21, 22, 23, 24, 25, 26 75