Đồ án Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu

121 trang thiennha21 13/04/2022 5450

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_thiet_lap_quy_trinh_len_men_vi_khuan_serratia_marcesce.pdf

Nội dung text: Đồ án Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH LÊN MEN VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn :T.S NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực hiện : CAO THỊ THANH THÚY MSSV: 1311101044 Lớp: 13DSH05 TP. Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hƣơng. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. TP. HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Cao Thị Thanh Thúy
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho con xin gởi tất cả lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cha mẹ, là ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục, động viên là chỗ vựa tinh thần vững chắc cho con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã để con có đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc tới tập thể quý thầy cô giáo trong trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM nói chung và các thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm-Môi Trƣờng, bộ môn Công Nghệ Sinh Học nói riêng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báo trong suốt thời gian qua. Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cô TS. Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy đáng kinh, cô đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hƣớng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Nguyễn Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn tất cả các bạn đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thời gian học tập tại trƣờng. Cảm ơn chị Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Trƣơng Hoài Nguyên, bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, bạn Lê Thị Thu đã đồng hành chia sẻ buồn vui cùng em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp. Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc! TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Cao Thị Thanh Thúy
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC BẢNG vii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục đích của nghiên cứu 1 3. Nhiệm vụ của nghiên cứu 2 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài 2 5. Kết cấu của đồ án 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 3 1.1.1. Hợp chất thứ cấp 3 1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 3 1.2. Giới thiệu về Prodigiosin 5 1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin 5 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin 6 1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin 9 1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens 10 1.3. Giới thiệu về Serratia marcescens 14 1.3.1. Lịch sử phát hiện 14 1.3.2. Phân loại khoa học của Serratia marcescens 15 1.3.3. Đặc điểm của Serratia marcescens 15 1.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens 19 1.4.1. Sắc tố 19 1.4.2. Biosurfactant 20 1.4.3. Acid béo 20 1.4.4. Enzyme 20 i
Đồ án tốt nghiệp 1.4.5. Yếu tố động lực của Serratia marcescens 21 1.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens 22 1.6. Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens 24 1.7. Thu nhận và tinh sạch prodigiosin 27 1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới 30 1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 30 1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin 30 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 34 2.1.1. Thời gian. 34 2.1.2. Địa điểm 34 2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị 34 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens 34 2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất. 34 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị 35 2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 36 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 41 2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. 41 2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống 44 2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên men 44 2.4.4. Phương pháp phân tích 47 Mục đích 47 Nội dung 47 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất 48 ii
Đồ án tốt nghiệp 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào 48 3.1.2. Trích ly thu prodigiosin 52 3.1.3. So sánh hình thái, sinh lý, khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) 54 3.2. Thiết lập môi trƣờng nhân giống 56 3.3. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men 58 3.3.1. Thiết lập môi trường lên men 58 3.3.2. Thiết lập chế độ lên men 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 1. Kết luận 70 2. Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC 76 A. PHỤ LỤC 1. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ, PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 76 B. PHỤ LỤC 2. HÌNH ẢNH 82 C. PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THỐNG KÊ 87 iii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại LMTL: lên men tiếp liệu PG: peptone glycerol PGTL: peptone glycerol tiếp liệu MT1: môi trƣờng 1 MT2: môi trƣờng 2 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) 6 Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 7 Hình 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009) 9 Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) 11 Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. 13 Hình 1.6 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens. 16 Hình 1.7 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) 16 Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh của enzyme Serralysin metalloprotease của S.marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014). 23 Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens đƣợc ghi nhận bởi Sundaramoorthy và cộng sự (2009) 27 Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodiosin bởi Serratia sp. BTWJ8 đƣợc ghi nhận bởi Krishna (2008) 27 Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm prodigiosin thô. 37 Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật. 38 Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4 39 Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia marcescens SH4 40 Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn 43 Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol 46 Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB 49 Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB 50 Hình 3.3 Khả năng tiết ezyme chitinase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. 51 Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. 53 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của chủng SH4 và SH1 54 Hình 3.6 Kết quả nhuộm Gram hai chủng SH1 và SH4 55 Hình 3.7 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của hai chủng SH4 và SH1 55 Hình 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 theo thời gian trên các môi trƣờng nhân giống khác nhau. 57 Hình 3.9 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. 60 v
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. 61 Hình 3.11 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. 63 Hình 3.12 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. 65 Hình 3.13 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh và OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men peptone glycerol tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. 67 Hình 3.14 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499 nm) của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men PG ở các nồng độ tiếp liệu tại 48h. (số liệu thô xem ở bảng 5 - phụ lục A và hình 9 - phụ lục B) 68 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật 4 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) . 8 Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens 17 Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). 25 Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin 32 Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. 51 Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau xử lý acid và (OD535nm) sắc tố sau trích ly của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. 53 Bảng 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 và SH1 56 Bảng 3.4 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng nhân giống theo thời gian. 57 Bảng 3.5 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. 59 Bảng 3.6 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. 61 Bảng 3.7 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. 62 Bảng 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. 65 vii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Prodigiosin là một sắc tố đỏ có bản chất là một alkaloid, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Prodigiosin đƣợc tìm thấy trong quá trình lên men của một số loài vi sinh vật nhƣ Alteromonas rubra Moss, 2002 ; Rugamonas rubra Gerber, 1975; Serratia rubidaea Moss, 2002; Streptoverticillium rubrireticuli Gerber, 1975 Vibrio gazogenes Moss, 2002 và một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia mar- censcens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3- amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005). Serratia marcescens đƣợc phân lập từ tuyến trùng EPN và đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng peptone glycerol, nutrient broth, môi trƣờng đậu phộng, môi trƣờng hạt mè, Một số nghiên cứu thu prodigiosin từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens thông thƣờng cần trích ly lỏng rắn bằng ethanol/methanol, sau đó trích ly lỏng lỏng bằng dung môi kém phân cực hơn để đƣợc prodigiosin tinh sạch một phần. Việc thu hồi prodigisin và tinh sạch một phần prodigiosin cho mục đích sản xuất thuốc trừ sâu rất tốn kém vì vậy một số nghiên cứu đã sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy (canh trƣờng) Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu Với mục tiêu tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và điều kiện để sinh tổng hợp prodigiosin trong môi trƣờng bằng nuôi cấy lỏng ngƣời thực hiện đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu”. 2. Mục tiêu của nghiên cứu 1
Đồ án tốt nghiệp Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. 3. Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào. Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Thiết lập môi trƣờng lên men để thu prodigiosin nhiều nhất. 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài Chọn lọc đƣợc chủng S.marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại bào protease và lipase cao nhất. Khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Khảo sát thiết lập đƣợc môi trƣờng lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất. Khảo sát thiết lập đƣợc chế độ lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất. 5. Kết cấu của đồ án Đồ án “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu” đƣợc trình bày gồm 3 chƣơng: 1. Tổng quan tài liệu Giới thiệu về prodigiosin các tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ cấp prodigiosin, phân loại loài cũng nhƣ các đặc trƣng sinh hóa của vi khuẩn Serratia marcescens. 2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đồ án. Cách bố trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm. 3. Kết quả và thảo luận Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành. 2
Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1. Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp. 1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997. Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Willliams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula, 3
Đồ án tốt nghiệp Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kiềm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật (fungi, acmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vât. Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật Vi sinh vật Hợp chất thứ Ứng dụng Kiểu tác động cấp ức chế Penicillium Penicilin Ức chế tụ cầu Ức chế tạo notatum, khuẩn, nhiễm polymer vách tế Penicillium trùng kỵ khí, bào vi khuẩn, ức chrysogenum giang mai, hen chế hấp thụ suyễn. amini acid và protein, ứ chế tạo enzyme. Streptomyces Streptomycin Ức chế vi Ức chế ghép nối griceus khuẩn Gram âm một số amino và Gram acid vào dƣơng. Trị bệnh protein, tác lao, bệnh viêm động lên hệ màng não, ho enzyme cả vi gà. khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb, Streptomyces Chloranphenicol Ức chế đối với Ức chế đặc hiệu venezuelas bệnh lỵ, sốt sinh tổng hợp 4
Đồ án tốt nghiệp cao, sốt phát protein vi khuẩn ban. liên quan đến peptidyl transferase trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide. Streptomyces Tetracilin Ức chế phổ Ức chế tổng aureomycin rộng vi khuẩn hợp protein Gram âm, Gram dƣơng Streptomyces Erythromycin Chữa bệnh do Ức chế vi khuẩn erythraeus tụ cầu khuẩn Gram âm và Streptococcal Gram dƣơng gây ra Sttreptomyces Neomycin Tác dụng vi Hơi độc fradiae khuẩn Gram âm và Gram dƣơng Streptomyces Kanamycin Điều trị lao, ức Tác động giống kanamycetius chế vi khuẩn nhƣ Gram âm và Streptomycin và Gram dƣơng Neomycin Streptomyces Cycloserine Điều trị bệnh Cản trở tổng lavendulae lao hơp vách tế bào 1.2. Giới thiệu về Prodigiosin 1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin 5
Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl), uncedylprodigiosin, meta- cycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochlo- ride (cPrG-HCl). 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)- methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Wil- liamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolypyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methane (Qadri và Wil- liams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) 6
Đồ án tốt nghiệp Các sắc tố màu đỏ của S.marcescens đã đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigio- sine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodi- giosin tổng hợp bởi S.marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles, nhƣ thể hiện trong hình 1.4, Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan trong nƣớc. Prodigiosin có thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, 7
Đồ án tốt nghiệp methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một bƣớc sóng nhất định và sự biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ. Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Trọng lƣợng Loài Tên sắc tố Danh pháp phân tử và công prodigiosin thức Serratia Prodigiosine 2-Methyl- 3- marcescens amyl-6-methoxy- 323,4 Da prodigiosene C20H25N3O Serratia Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl- marcescens 6-hydroxy- 309,4 Da prodigiosene C10H23N3O Serratia Dipyrrolyl- 2-(2-pyrryl)-4-6- marcescens dipyrromelhenr dimethoxypy- 334,4 Da prodigiosin prodigiosene C19H18N4O2 Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) methoxy- C23H31N3O madurae prodigiosene Nocardia Cyclononyl- 2,10-Nonano-6- 265,5 Da (Actinomadura) prodigiosin melhoxy- C23H33N3O madurae prodigiosene Nocadia Methylcyclodccyl- 2,10-Nonano-6- (Actinomadura) prodigiosin Methoxy- 391,5 Da pellctieri prodigiosene C25H33N3O Streptomyces Undccyl- 2-Undecyl-6- 393,6 Da longisporusruber prodigiosin Rnethoxy- C25H35N3O và Nocardia prodigiosene 8
Đồ án tốt nghiệp (Actonomadura) pelletieri Streptomyces Metacyclo- 2,4-(9- 391,6 Da longisporusber prodigiosin Ethylnonano)-6- C25H33N3O methoxy- prodigiosene 1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loại vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV, dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009). Hình 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009) A. Đối kháng với Staphylococcus aureus B. Đối kháng với Echerichia Ecoli Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng một số loài vi khuẩn nhƣ: Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). 9
Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả chống ung thƣ (Pandey và cộng sự, 2009; Pe1rez – Tomás và Vias, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự, 2007). 1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serrtia marcescens sản xuất sắc tố thông qua con đƣờng ngƣng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2’-bipyrrile-5- caboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl- 6-methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập đƣợc một chủng Serratia marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này đƣợc báo cáo. Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong Erwinia carotovora subsp. Carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm). trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tính hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000). Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ở hình 1.4. Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. 10
Đồ án tốt nghiệp Thứ tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thƣớc và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001). Hình 1.3 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Strep- tomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí tƣơng đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ đƣợc hiển thị trong màu đen, chịu trách nhiệm tổng hợp phân nữa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng hợp đƣợc thể hiện qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổng hợp đƣợc thể hiện qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm màu đỏ. Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 có chứa thêm một gene bổ sung là PigO. RT-PCR với primer extension sẽ nhận thấy có sự phiên mã qua lại giữa hai gene pigN và pigO (Slater và cộng sự, 2003), điều này phù hợp với pigO là một op- 11
Đồ án tốt nghiệp eron trong chủng. Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đƣợc sao chép dƣới dạng polycistronic thông tin từ một promoter upstream của pigA (Slater er al., 2003) và cụm sắc tố (pigA-pigN) của Sma 274 cũng đƣợc sao chép dƣới dạng polycistronic thông tin. Có một khoảng cách đáng kể giữa hai cụm sắc tố pigC và pigD. Khoảng cách 184 bp giữa pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho thấy khả năng chứa hai đơn vị phiên mã. Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene ở hai bên của khoảng cách này đã chứng minh là tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu dùng lacZ hợp vời pigA và pigH (Crow, 2001). Cụm pig trong Sma 274 có khoảng cách 64 bp giữa pigC và pigD, nhỏ hơn so với Serratia ATCC 39.006, khoảng cách này không có ý nghĩa. Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14-15 gene), có thể phản ánh sự phức tạp hơn về các sản phẩm undecylprodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Streptomyses coelicolor (Harris và cộng sự, 2004). Mƣời hai gene đƣợc lƣu giữ giữa ba cụm, có thể mong đợi con đƣờng tổng hợp cho ra các sản phẩm tƣơng tự. Tuy nhiên, định hƣớng và điều tiết của nó có sự thay đổi rõ rệt (Slater và cộng sự, 2003). Việc bố trí không giống nhau của các gene tƣơng đồng trong cụm sản xuất các sản phẩm hóa học tƣơng tự đặt ra câu hỏi về nguồn gốc và sự tiến hóa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm. Vẫn chƣa rõ liệu các loài trong cùng một họ có vai trò quan trọng ảnh hƣởng đến sự sắp xếp không giống nhau của các gene hay sự khác biệt đã phát sinh một cách ngẫu nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Sự khác biệt ở các gene hiện diện trong những operon có thể giải thích sự khác biệt trong phƣơng thức sản xuất và con đƣờng tổng hợp sinh hóa. PigD và pig E là hai pig gene không có sự tƣơng đồng trong cụm màu đỏ. Tƣơng tự nhƣ vậy, pdtorfL và pdtorf thuộc một phần nhóm gene mã hóa tổng hợp các chất khử clo (carbon tet- rachloride) nhƣ pyridine-2-6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri (Lewis và cộng sự, 2000). PigE tƣơng tự aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ Streptomyces coelicolor A3(2), đƣợc mã hóa bởi một gene không liên kết với cụm màu đỏ (38% giống với PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống với PigE từ Sma 274; cả hai đều là 50% tƣơng đƣơng 460 aa). Thật vậy, nó có thể là gene mã 12
Đồ án tốt nghiệp hóa protein tham gia vào quá trình tổng hợp prodigiosin và undecylprodigiosin có thể không đƣợc liên kết với các cụm gene. RedR, RedQ và RedP không đƣợc mã hóa tƣơng đồng bởi cụm pig, nhƣng chúng đƣợc cho là chỉ đạo tổng hợp acetate từ ba nguyên tử carbon của vòng pyrrole và chuỗi bên undecylprodigiosin (Cerdeno và cộng sự, 2001). Các gene mã hóa tƣơng đồng tƣơng ứng có thể có mặt tại một vị trí trên nhiễm sắc thể Serratia hoặc các enzyme khác có thể thực hiện vai trò xúc tác cần thiết trong sinh trong sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia. Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia coli và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tƣơng ứng của Escherichia coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme đƣợc mã hóa bởi các nhóm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004). Hình 1.4 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. 13
Đồ án tốt nghiệp Đề xuất này cũng tƣơng tự nhƣ đề xuất đối với undercylprodigiosin (Cerdeno và cộng sự, 2001). Mƣời hai Red protein với sự mã hóa trong cụm pig (“lõi” là en- zyme prodigiosin) có kích thƣớc tƣơng tự nhau trong bản sao của Pig. Một ngoại lệ là PigB (670 aa) tƣơng đồng với RedS (Sc3f7.05c), là một protein nhỏ hơn nhiều (146 aa) và tƣơng tự gắn vào cuối đầu N của PigB. Phần còn lại của PigB gắn với các amine oxidase. Các protein PigI và PigJ đều nhỏ hơn RedM và tƣơng đồng với RedX (Harris và cộng sự, 2004). PigA là trình tự tổng hợp một loạt các actyl-CoA dehydrogenase. Chuỗi liên kết với human isovaleryl-CoA dehydrogenase, cấu trúc tinh thể trong đó đã đƣợc xác định, cho thấy rằng phần lớn các acid amin xung quanh flavin và phosphopantetheinyl moiety của CoA đƣợc bảo vệ nhƣng các acid amin tham gia vào liên kết nhóm adenisyl của CoA không đƣợc bảo vệ (Tiffany và cộng sự, 1997). Điều này hỗ trợ cho rằng PigA là một PCP prolyl hơn là prolyl- CoA. 1.3. Giới thiệu về Serratia marcescens 1.3.1. Lịch sử phát hiện Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó vào năm 332 trƣớc công nguyên những ngƣời lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có “máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcrscens, tuy nhiên điều 14
Đồ án tốt nghiệp này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Girbbs, 2011). Bizio một dƣợc sĩ ở padua (Italya), là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên Ser- ratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Sau 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serratia, tên loài mar- cescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại Serratia marsescens là vi khuẩn. 1.3.2. Phân loại khoa học của Serratia marcescens Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae là một nhóm vi khuẩn có liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:  Giới: Bacteria  Ngành: Proteobacteria  Lớp: Gramma proteobacteria  Bộ: Enterobacteria  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Serratia  Loài: Serratia marcescens 1.3.3. Đặc điểm của Serratia marcescens 15
Đồ án tốt nghiệp Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia macecens có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Hình 1.5 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens. Hình 1.6 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) 1.3.3.1. Đặc điểm sinh lý Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar đƣợc mô tả là khuẩn lạc tròn lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính 16
Đồ án tốt nghiệp là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thƣờng bị mất đi trong các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. 1.3.3.2. Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng hiếu khí và kỵ khí. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatas, peroxides, bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trƣờng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Entero- bacteriaceae bởi ba đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinease (Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.7. (Tariq và John, 2010). Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả 1 Di động + 2 Indole - 3 Methyl Red - 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase + 17
Đồ án tốt nghiệp 7 Catalase + 8 Oxidase - 9 Urease - 10 Gelatinase + 11 Chitinase + 12 Triple sugar iron Môi trƣờng chuyển sang acid, không sinh khí và không sinh H2S 13 Hydrogen sulphide - 14 Lysine decarboxylase + 15 Omithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose + 20 Lên men xylose - 21 Lên men rhaminose - 22 Lên men lactose - 23 Lên men arabinose - 1.3.3.3. Đặc điểm phân bố Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực vật, côn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hóa của ngƣời và động vật có xƣơng sống. Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông và Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể đóng một vai trò quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng nhƣ hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964). Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng (Grimont và công sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế. 18
Đồ án tốt nghiệp Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiểm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các loài Steinerma và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia mar- cescens với Steinernema carpocapsae. 1.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens 1.4.1. Sắc tố Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marsescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố đặc biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl), uncedylprodigiosin, meta- cycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochlo- ride (cPrG-HCl) (Krishna, 2008). Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup A1 và A2/6, nó không đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8 hoặc TCT (Gri- mont, 1977). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thƣờng gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Gri- mont, 1977; Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hóa sinh tổng hợp prodigi- osin đã đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Daunehauer và cộng sự, 1984). Các dòng đƣợc tạo thành này có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, có thể chúng sẽ không tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkner, 1977). 19
Đồ án tốt nghiệp Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5- carbonxymethylmuconic semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự,1988). Enzyme này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens. Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp chất thơm để có thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006). 1.4.2. Biosurfactant Các chủng sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất thấm này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30oC nhƣng không đƣợc sản xuất ở 30oC trog phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1 đến W3, có các hoạt động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 đƣợc xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide mà trƣớc đó đã từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng sự (1961). 1.4.3. Acid béo Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic và octadecanoid acid. Các acid béo này chiếm khoảng 50-80% thành phần tế bào, trong đó, n- tetradecanoic acid chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983). 1.4.4. Enzyme Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase, Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa chitin tronrg quá trình sản xuất thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc, (Joshi và cộng sự, 1989). 20
Đồ án tốt nghiệp Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme chitinase (ChiA, ChiB, ChiC) một chitobiase và một protein chitin-bindng (CBP21) (Fuchs và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự, 1996; Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998; Suzuli và cộng sự, 1998), chúng có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 57, 52, 48, 36 và 21 kDa, cùng với các hoạt động chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986). 1.4.5. Yếu tố động lực của Serratia marcescens Yếu tố động lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các tác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân chủ gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trƣởng phát triển, gây ảnh hƣởng đến vật chủ, mà phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss và Hewlett, 1986). Một số yếu tố động lực của Serratia marcescens đã đƣợc nghiên cứu, bao gồm sự bám dính, tính kỵ nƣớc, manose-resistant, mannose-sensitive, LipoPolySaccha- ride (LPS). Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính. Các yếu tố bám dính của vi sinh vật đƣợc gọi là các adhesion, chúng có thể có bản chất polypeptide thì đƣợc chia thành hai nhóm là nhóm có fimbriae và nhóm không có fimbriae. Mà các vi khuẩn Gram âm, nhƣ là Serratia marcescens, thƣờng bám dính nhờ các fimbriae này. Các fimbriae (hay còn gọi là các pili) là những cấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng nhƣ sợi lông trên bề mặt vi khuẩn. Các Finbriae đƣợc cấu tạo bởi nhiều pro- tein xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống nhƣ trụ xoắn ốc. Thƣờng thì chỉ có một loại protein là cấu trúc chính của một phân nhóm fimbriae tuy nhiên các protein phụ trợ khác cũng có thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc fimbriae. Đỉnh của các fimbriae có chức năng gắn với tế bào vật chủ. Bên cạnh đó, LSP hay còn đƣợc gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lƣỡng tính nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ 21
Đồ án tốt nghiệp màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O – an- tigen, lõi oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là các thành phần gây độc của phân tử LPS, gây nên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm. Ngoài ra, việc sản xuất các enzyme khác nhau bởi Serratia marcescens cũng đƣợc xem nhƣ một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme chitinase, lipase, chlorope- roxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997). 1.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens S. marcescens đã đƣợc khảo sát cho sự tăng trƣởng và khả năng gây bệnh của nó trong các ấu trùng sâu bƣớm sáp (Galleria mellonella). Tất cả các chủng gây bệnh cho ấu trùng của G. mellonella dẫn đến tử vong trong vòng 48 giờ. Chủng đã đƣợc chứng minh có một gen mã hóa protein metalloprotease serralysin. Gen mã hóa protein metalloprotease đƣợc xác định là góp phần vào quá trình gây chết côn trùng (J.T. Tambong; Xu, R.; Sadiku, 2014) S. marcescens đƣợc biết đến với khả năng tiết nhiều enzyme ngoại bào nhƣ chitinase, lecthinase, hemolysin, lipase, protease, nuclease Mặc dù S. marcescens có thể sản xuất nhiều protease khác nhau, trong đó có metalloprotease kẽm, serralysin. Meada và cộng sự năm 1995 báo cáo rằng serralysin đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của sinh vật này. Nghiên cứu đã chứng minh serralysin nhanh chóng làm suy giảm một loạt cấu trúc protein và huyết thanh. Theo đó, protease vi khuẩn nhƣ serralysin đóng một vai trò quan trọng nhƣ một yếu tố độc lực (Yutaka Kida và cộng sự, 2007). . Theo K Ishii et al. (J Invertebr Pathol 117, 61-67. 2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm (silkworm larvae). 22
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh của enzyme Serralysin metalloprotease của S.marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014). Serratia marcescens còn đƣợc biết đến với khả năng lây nhiễm cho trứng, ấu trùng, nhộng và sâu trƣởng thành của loài Heliothis-thuộc chi bƣớm đêm gây hại cho nông nghiệp (Sikorowski và Lawrence, 2009) Ấu trùng lớn tuổi bị nhiễm vi khuẩn thƣờng bộc lộ phản ứng là giảm các kích thích bên ngoài, và cái chết xảy ra một hoặc hai ngày sau đó. Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào trong đƣờng máu của vi khuẩn và gây ra nhiễm trùng huyết và gây tử vong. Theo kết quả nghiên cứu của Estrada và cộng sự năm 2012 thì ấu trùng bị nhiễm trở thành màu đỏ sau khi chết, và tỉ lệ sống sót của những ấu trùng bị nhiễm là rất ít. Một số ấu trùng bị nhiễm trong giai đoạn cuối của ấu trùng thì sau khi hóa nhộng nó cũng sẽ bị chết do nhiễm khuẩn và khi chết nó cũng xuất huyết có màu đỏ của S. marcescens. Đến giai đoạn sâu trƣởng thành, nó có thể đƣợc lấy nhiễm bằng cách cho ăn thực phẩm bị ô nhiễm, các vi khuẩn sẽ xâm nhập vào các mô của côn trùng và gây chết. Serratia marcescens có khả năng lây nhiễm và loại bỏ cao đối với bộ H. Zea và H virescens . Serratia marcescens còn có thể kết hợp với một số loại tuyến trùng hay giun tròn để gây bệnh cho côn trùng ví dụ nhƣ: O. Carolinensis kết hợp với Serratia marcescens gây bệnh côn trùng trên lớp biểu bì bên ngoài của nó. 23
Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra cũng có thể tạo đƣợc mối quan hệ nhân tạo giữa vi khuẩn và các tuyến trùng, bằng cách trộn chung tuyến trùng với vi khuẩn và nuôi chúng trong một khoảng thời gian. Cũng trong nghiên cứu của Estrada và cộng sự, năm 2012 thì khi Steinernema carpocapsae kết hợp với S. marcescens mang đến hiệu quả diệt 100% ấu trùng Galleria mellonella chỉ sau 48 giờ. Mặc dù vậy sự tồn tại của S. marcescens cũng không ảnh hƣởng đến vi khuẩn cộng sinh X. Nematophila. 1.6. Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn. Bản chất màu đỏ tƣơi của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng hạn nhƣ: nhiệt độ, pH, độ oxy hòa tan, ánh sáng, phos- phate vô cơ và thành phần môi trƣờng ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự, 1994; Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005). Quá trình sản xuất prodigiosin trong S. marcescens rất nhạy cảm với nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004). Hơn nữa, môi trƣờng thông thƣờng đƣợc sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi các chủng S. marcescens là môi trƣờng phức tạp và rất giàu dinh dƣỡng (Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất dinh dƣỡng nhƣ thia- mine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng đối với sản xuất prodigi- osin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự, 1977), adenosine triphosphate và ri- bose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có tác dụng ức chế quá trình tổng hợp prodi- giosin. Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của S. marcescens trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ: môi trƣờng hạt mè, môi trƣờng hạt đậu phộng, nutrient broth và peptone glycerol broth, Các môi trƣờng cũng đƣợc so sánh tốc độ tăng trƣởng và khả năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan sát vai trò của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng 24
Đồ án tốt nghiệp hợp nhiều prodigiosin hơn. Trên môi trƣờng hạt đậu phộng thì prodigiosin có thể tổng hợp ở nhiệt độ 37oC trong khi trên các môi trƣờng nhƣ nutrient broth, peptone glycerol broth có hoặc không có bổ sung đƣờng cũng không thể làm đƣợc điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bớt lƣợng glucose và các loại đƣờng lên men đƣợc khác do sự giảm pH trong canh trƣờng nuôi cấy (Khanafari và cộng sự, 2006). Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon trong quá trình sản xuất sắc tố. Điểm đầu tiên là trong môi trƣờng nutrient broth, về cơ bản là môi trƣờng này không có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glu- cose làm tăng cƣờng việc sản xuất sắc tố, trong trƣờng hợp sử dụng môi trƣờng hạt mè thì nguồn carbon ở dạng các acid béo. Maltose và glucose đƣợc thêm vào môi trƣờng nutrient broth làm tăng gấp đôi năng suất so với chỉ sử dụng môi trƣờng nu- trient broth hoặc peptone glycerol broth. Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố đƣợc tăng cƣờng trong môi trƣờng peptone glycerol broth ở 30oC và trong môi trƣờng nutrient broth ở 28oC, điều này có thể là do sự hiện diện của glycerol nhƣ là một nguồn carbon. Rõ ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ tăng trƣởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Stt Môi trƣờng sử dụng Nhiệt độ Tham khảo 280C 300C 370C 1 Môi trƣờng dextrose 13,0 - - Pruss và bổ sung casein Matsumura, 1996 2 Ethanol và nguồn 3,0 - - Mandarville, carbon 2001 3 Canh dinh dƣỡng 0,52 0,354 0,111 Giri và cs, 25
Đồ án tốt nghiệp 2004 4 Canh Peptone 0,302 0,569 0,111 Giri và cs, glycerol 2004 5 Môi trƣờng hạt mè 16,68 9,3 0,319 Giri và cs., 2004 6 Canh dinh dƣỡng bổ 1,836 0,79 0,104 Giri và cs, sung 0,5% maltose 2004 7 Canh dinh dƣỡng bổ 1,689 0,29 0.104 Giri và cs, sung 0,5% glucose 2004 8 Môi trƣờng hạt mè 9,43 8,56 1,63 Giri và cs, bổ sung 0,5% 2004 maltose 9 Môi trƣờng hạt mè 1,47 1,16 0,42 Giri và cs, bổ sung 0,5% 2004 glucose 10 Môi trƣờng dầu mè 0,767 1,006 0,107 Giri và cs, 2004 11 Môi trƣờng hạt đậu 38,75 25,98 1,49 Giri và cs, 2004 phộng 12 Môi trƣờng dầu đậu 2,89 0,559 0,111 Giri và cs, 2004 phộng 13 Môi trƣờng từ dừa 1,94 1,39 0,1736 Giri và cs, 2004 14 Môi trƣờng dầu dừa 1,42 0,05 0,177 Giri và cs, 2004 26
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens đƣợc ghi nhận bởi Sundaramoorthy và cộng sự (2009) Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodiosin bởi Serratia sp. BTWJ8 đƣợc ghi nhận bởi Krishna (2008) 1.7. Thu nhận và tinh sạch prodigiosin Các sắc tố không tan trong nƣớc mà tan trong dầu thƣờng đƣợc chiết xuất bằng dung môi hữu cơ pha nƣớc nhƣ: acetone, methanol, ethanol hoặc các hỗn hợp 27
Đồ án tốt nghiệp của các dung môi, để giúp các dung môi này hoạt động tốt hơn. Chiết xuất thƣờng có chứa một lƣợng nƣớc đáng kể, do đó có thể đƣợc loại bỏ bằng cách phân lớp nhờ hexane, petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn hợp các dung môi. Sắc ký, quang phổ hấp thụ ở vùng khả kiến sẽ là cơ sở đầu tiên dùng để xác định các sắc tố. Quang phổ sẽ đƣợc thực hiện, lƣu giữ và sau đó tiến hành so sánh với các phổ chuẩn (Amaya, 2001). Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đây đƣợc đề xuất là nên thực hiện để xác định một hợp chất chƣa biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng sự, 1994). - Phổ hấp thụ (휆 ). - Sắc ký lớp mỏng (Rf). - Sắc ký lỏng cao áp (thời gian lƣu mẫu). - Phƣơng pháp phổ khối (khối lƣợng phân tử). - NMR (chuyển hóa về mặt hóa học). Một số nghiên cứu về thu nhận và tinh sạch prodigiosin đã đƣợc thực hiện: - Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) đƣợc chiết xuất từ môi trƣờng nutrient broth nuôi cấy S. marcescens sau 72 giờ, với ethanol và petroleum ether, tiếp theo loại bỏ dung môi trong bể cách thuỷ và hòa tan phần còn lại vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky, 1980). - Các sắc tố từ tế bào của S. marcescens phân lập từ đất đƣợc chiết xuất bằng acetone, hòa với một ít ethyl acetate và đƣợc sấy khô bằng natri sulfat. Các chất chiết xuất đƣợc hòa tan và đƣợc thực hiện quét từ bƣớc sóng 200 – 700 nm. Hỗn hợp dung môi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5:2,5:0,5 (v:v) đã đƣợc sử dụng để tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với các sắc tố bằng sắc ký lớp mỏng. Cột silicagel có kích thƣớc từ 80 – 100 mesh đã đƣợc sử dụng để phân tách các tạp chất không màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết cho thấy có độ hấp thụ cao duy nhất tại 535 nm trong quang phổ UV. Nó đƣợc tiếp tục phân tích để xác định trọng lƣợng phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ khối. Các sắc tố prodigiosin tinh khiết đƣợc đem phân tích quang phổ khối cho thấy chúng có trọng lƣợng phân tử là 324 Da (Giri và cộng sự, 2004). 28
Đồ án tốt nghiệp - Prodigiosin đƣợc chiết xuất bằng cách lắc môi trƣờng nuôi cấy tế bào Serratia marcescens 2170 với methanol có tính acid với tỷ lệ 24:1 (v:v) và dịch trong suốt đƣợc cô quay chân không. Sắc ký lỏng cao áp của các chiết xuất đƣợc thực hiện trên silicagel với dung môi chloroform và methanol. Các sắc tố thu đƣợc sẽ đƣợc rửa giải trong methanol và phân tích phổ khối (ESI-MS). Sau đó, các sắc tố chƣa tinh khiết đã thu đƣợc sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện phƣơng pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil C18 (250x4 mm, 10 휇m) đã đƣợc sử dụng với một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10 mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% ace- tonitrile). Việc rửa giải đƣợc theo dõi bằng cách sử dụng cả hai máy dò UV diode- array và ESI-MS (Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003). - Sau khi lên men S. marcescens phân lập từ đất, canh trƣờng đƣợc lấy từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v:v) đã acid hóa (pH 3,0) đƣợc thêm vào IAB. Các sắc tố đƣợc chiết xuất bằng cách sử dụng một vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ, rồi đem cô đặc và ly tâm. Sau đó, nó đƣợc thu bằng cách sử dụng nƣớc và chloroform để tách pha. Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dƣới của pha chloroform và đƣợc cô quay chân không. Prodigiosin đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silicagel (2,5 × 30 cm). Nó đƣợc rửa với một hỗn hợp hexane:ethyl acetate (2:1, v:v). Các sắc tố cô đặc đã đƣợc tách ra bởi việc sử dụng hỗn hợp chloroform: methanol 95:5 (v:v) trong TLC. Sau đó, màu đỏ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã đƣợc thu nhận và hòa tan trong acetone. Các sắc tố chƣa tinh khiết sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện phƣơng pháp TLC (với tỷ lệ dung môi chloroform:methanol:diethyl ether là 6:2:2) và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm). Sau đó, nó đƣợc tách rửa với hỗn hợp methanol:nƣớc (7:3, v:v) đã đƣợc điều chỉnh pH = 3,0 bằng HCl 0,1N với tốc độ dòng chảy là 20 ml/phút. Một lƣới thép không gỉ lớn với kích thƣớc lỗ 0,5 cm đã đƣợc sử dụng nhƣ sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng độ của các prodigiosin sản xuất ra đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 535 nm trong methanol đã đƣợc acid hóa (HCl 0,001N 4 ml + 96 ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối lƣợng phân tử của chất màu tinh 29
Đồ án tốt nghiệp khiết đƣợc xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các 1H- và 13C-NMR của các mẫu màu đƣợc ghi nhận sau khi hòa tan trong CDCl3. Các dịch chuyển hóa đã đƣợc đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố đƣợc ghi nhận (Song và cộng sự, 2006). - Các sắc tố đƣợc sản xuất bởi Serratia marcescens SM∆R đã đƣợc tinh sạch thực hiện NMR và phổ khối để xác định cấu trúc hóa học của nó (Wei và Chen, 2005). Các sắc tố đƣợc chiết xuất từ canh trƣờng lên men bằng methanol và sau đó tinh chế bằng cách sử dụng một cột silica gel hexane-balanced để thu các sản phẩm mục tiêu trong cột (Cang và cộng sự, 2000; Montaner và cộng sự, 2000). Sau đó cột đƣợc rửa với ethyl acetate 10M để giải phóng các sản phẩm hấp thụ. Màu cam sau khi rửa giải đã đƣợc thu và làm khô trong máy sấy chân không ở 45oC để có đƣợc những sản phẩm tinh khiết (bột màu đỏ). Các sắc tố thu đƣợc trong nghiên cứu đã đƣợc báo cáo là undecylprodigiosin dựa trên phân tích NMR và MS, còn đƣợc gọi là prodigiosin 25-C, là một trong những sắc tố đỏ đƣợc sản xuất bởi Serratia sp. và Streptomyces sp. Nó có hoạt động ức chế miễn dịch và quá trình apoptosis-inducing tƣơng tự nhƣ prodigiosin, nhƣng ít đƣợc nghiên cứu hơn (Tomas và cộng sự, 2003). 1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới 1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens Brigida và Itamar (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của Serra- tia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng nhƣ ảnh hƣởng của S. marces- cens lên thúc đẩy tăng trƣởng của cây thuộc chi cam chanh. Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm Ser- ratia marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria mellonella và đạt đƣợc kết quả gây chết 100% ấu trùng. 1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin Sundaramoorthy và cộng sự (2009), thực hiện nghiên cứu để sàng lọc những chủng Serratia có hiệu quả sản xuất prodigiosin và đã phân lập đƣợc chủng Serratia marcescens NY1 từ đất. 30
Đồ án tốt nghiệp Helvia và cộng sự (2010), đã tối ƣu hóa quá trình sản xuất prodigiosin bởi Ser- ratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nƣớc thải từ công nghiệp chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l. Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất prodigio- sin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigio- sin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ƣu cho việc sản xuất prodigiosin trong môi trƣờng Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và quá trình chiết xuất prodigiosin đƣợc thực hiện bằng ethanol:hydrochloric acid (9,5:0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận đƣợc có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ Candi- da albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., hơn nữa, prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hƣởng bởi acid, kiềm, chất tẩy rửa, mà có thể ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu. Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất prodi- giosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi trƣờng dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 μg/ml. Một số bằng sáng chế về prodigiosin đƣợc liệt kê trong bảng 1.6 (Krishna, 2008). 31
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin Tên Patent Tóm tắt Tác giả Ngày công bố United States A novel use of prodigiosin Kim Hwanmook, 10/28/2003 Patent for treating diabetes mellitus Han Sangbae, 6638968 without any side effect Lee Changwoo, Lee Kihoon, Park Sehyung, Kim Youngkook. United States The prodigiosin from Kim Hwanmook, 11/11/2003 Patent Serratia marcescens is useful Kim Youngkook, 6645962 as an immunosuppressive in Han Sangbae, various fields, including the Yoo Sungak. treatment of the diseases requiring immunosuppression and the basic research for the diseases, the transplantation of the organs or tissues. and the immune cells. United States The invention relates to novel Kim Hwan- 07/01/2004 Patent use of prodigiosin for the Mook Han Sang- 4266028 treatment of Rheumatic Bac Lee Chang- m1hritis and can provide Woo Lee Ki- excellent treatment effect to Hoon Park Se- Rheumatic arthritis by Hyung Kim Hy- treating composition oung Chin including prodigiosin isolated Kim Young- from Serratia marcescens as Kook an active principle to DBA-l 32
Đồ án tốt nghiệp mouse of collageninduced Rheumatic al1hritis animal model and thereby inhibiting production of internal cytokine which is a important pathogen of Rheumatic 33
Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Thời gian. Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 30/04/2017 đến ngày 16/07/2017. 2.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm Vi sinh Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens Giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4 và SH5 đƣợc phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013 đƣợc lƣu trữ tại trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Giống vi khuẩn Serratia marcescens HB đƣợc phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Lê Quốc Vũ, 2015 đƣợc lƣu trữ tại trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất. a. Môi trƣờng ( Thành phần môi trƣờng xem phụ lục 1) - Môi trƣờng Peptone glycerone agar (PGA) - Môi trƣờng Peptone glycerone broth (PG) - Môi trƣờng Casein - Môi trƣờng Lipit - Môi trƣờng huyền phù Chitin 1% - Môi trƣờng nhân giống 1 (MT1) - Môi trƣờng nhân giống 2 (MT2) - Môi trƣờng lên men (MTLM) b. Hóa chất sử dụng - Cồn 70, cồn 96 - NaCl - HCl, NaOH 34
Đồ án tốt nghiệp - Petroleum ether - Nƣớc muối bão hòa 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị a. Dụng cụ - Phiễu chiết - Ống nghiệm - Đĩa petri - Erlen 50ml, 100ml, 250ml - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml - Pipetman 100μl, 1000μl. - Đầu típ - Đũa thủy tinh - Bao hấp, giấy gói, thun - Đèn cồn, que cấy vòng - Bông không thấm, bông thấm - Chai syrum 100ml. b. Thiết bị - Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh - Cân phân tích - Bếp từ - Máy nƣớc cất - Autolave - Tủ hút - Máy ly tâm - Máy lắc - Máy đo quang phổ - Máy cô quay - Bể điều nhiệt 35
Đồ án tốt nghiệp - Kính hiển vi 2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 2.3.1 Mục đích Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. 2.3.2 Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại bào. Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men để thu prodigiosin nhiều nhất. 2.3.3 Phương pháp luận Prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thƣờng không trễ pha với quá trình tăng trƣởng tế bào. Dịch môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy quyết định nồng độ prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các báo cáo trƣớc đó của các tác giả trong và ngoài nƣớc để xác định môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy cho chủng phân lập của phòng thí nghiệm. 2.3.4 Bố trí thí nghiệm Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau: 36
Đồ án tốt nghiệp Chủng vi sinh vật (S.marcescens SH4, SH5 và HB) Chọn lọc chủng Thiết lập môi trƣờng nhân giống Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men Chế phẩm prodigiosin thô Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm prodigiosin thô. 37
Đồ án tốt nghiệp Chủng vi sinh vật (S.marcescens SH4, SH5 và HB). Nuôi cấy lỏng lắc, MTPG Thử nghiệm enzyme ngoại Trích ly thu prodigiosin bào Lipase Protease Chitinase Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật. 38
Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi Tăng sinh trên môi Tăng sinh trên môi trƣờng MT1 trƣờng MT2 trƣờng PG 0h 4h 8h 16h 20h 24h Đo độ đục (mật độ tê bào) OD = 620nm Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia mar- cescens SH4 39
Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi Tăng sinh trên môi trƣờng MT2 trƣờng PG Lên men Lên men Lên men trên môi Lên men trên trên môi trên môi trƣờng LMTL, môi trƣờng trƣờng trƣờng PG PGTL LMTL, PGTL PG Tiếp liệu Glycerol 0h 9h 24h 33h 48h 57h Đo prodigiosin OD = 499nm Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 620nm Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia mar- cescens SH4 40
Đồ án tốt nghiệp 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. 2.4.1.1. Phương pháp định tính enzyme Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 48h. Thử nghiệm hoạt tính lipase Pha môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50oC đổ ra các đĩa petri. Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đo đƣờng kính vòng tủa trên bề mặt môi trƣờng. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase thì xuất hiện vòng tủa xung quanh điểm cấy. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme lipase thì không xuất hiện vòng tủa xung quanh điểm cấy. Khả năng phân giải lipid đƣợc đánh giá qua đƣờng kính vòng tủa trên đĩa thạch mm. Vòng tủa càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase càng nhiều. Thử nghiệm hoạt tính protease Pha môi trƣờng geltatine agar và môi trƣờng casein agar, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính giếng thạch là 0.5 cm (d). Cho 20μl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm), với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: 41
Đồ án tốt nghiệp Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme protesae thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải casein đƣợc đánh giá qua hiệu số (D- d) mm. Hiệu số càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease càng nhiều. Thử nghiệm hoạt tính chitinase Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0.5 cm (d). Cho 20μl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng thuốc thử lugol. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm), với D là đƣờng lính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D- d) mm. Hiệu số càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase càng nhiều. 2.4.1.2. Phương pháp trích ly thu prodigiosin Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 48h. Sau khi tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH =2 trong 4 giờ; cho 450μl HCl 1N vào trong canh trƣờng, để trên máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vòng/phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng sau khi sử lý acid HCl trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450μl NaOH 1N để đƣa về pH =7, đem đo OD620nm và OD499nm, song song đó tiến hành trích ly lỏng lỏng theo sơ đồ hình: 42
Đồ án tốt nghiệp Canh trƣờng sau nuôi cấy Xử lý acid Trung hòa Đo độ đục (mật độ tế NaOH 1N bào) OD = 600 nm Đo prodigiosin OD = Ly tâm 4000 vòng/phút 499 nm trong 15 phút Ethanol: HCl 1N Dịch trong Sinh khối (95:5; v:v) Ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút Sắc tố thô Dịch trong Trích ly Đo prodigiosin sau trích ly lỏng lỏng OD = 535 nm Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn Sau khi cô quay mẫu sau trích ly lỏng lỏng, định mức lên 25ml và pha loãng mẫu bằng dung môi Ethanol:HCl 1N (95:5, v;v), ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo OD535 nm, xác định nồng độ prodigiosin sau khi thay giá trị OD vào phƣơng trình 43
Đồ án tốt nghiệp 2 đƣờng chuẩn prodigiosin y = 1,1003x + 0.0041 (R = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng 1 (MT1 - môi trƣờng thu sinh khối cực đại theo ĐATN Nguyễn Thị Tâm, 2010), môi trƣờng 2 (MT2 – môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Tiến hành đo mật độ tế bào OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 4h, t = 8h, t =16h, t = 20h, t = 24h. Theo dõi mật độ tế bào tổng hợp đƣợc. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng của chủng vi sinh vật. Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng 620 nm. 2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên men 2.4.3.1. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng lên men (LMTL – môi trƣờng lên men theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol trên môi trƣờng lên men (LMTL) và môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) với nồng độ glycerol là 5g/l. Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h. 44
Đồ án tốt nghiệp Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng nhân giống 2 (MT2 – môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005) vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng lên men (LMTL), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol trên môi trƣờng lên men (LMTL) và môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) tiếp liệu với nồng độ glycerol là 5 g/l. Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. 2.4.3.2. Phương pháp khảo sát thiết lập chế độ lên men Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng nhân giống peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) với nồng độ glycerol là 2.5 g/l, 5 g/l. 7.5 g/l và 10 g/l theo sơ đồ sau: 45
Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi trƣờng PG Lên men trên Lên men trên môi trƣờng môi trƣờng PG PGTL Tiếp liệu Tiếp liệu Tiếp liệu Tiếp liệu Glycerol Glycerol 5 Glycerol Glycerol 2.5 g/l g/l 7.5 g/l 10 g/l 0h 9h 24h 33h 48h 57h Đo prodigiosin OD = 499nm Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 620nm Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol 46
Đồ án tốt nghiệp Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. 2.4.4. Phương pháp phân tích 2.4.4.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin Mục đích Xác định đƣợc lƣợng hợp chất prodigiosin có trong mẫu từ đó đƣa ra kết luận cho thí nghiệm. Nội dung Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và giá trị đo OD tại λmax của hợp chất prodigiosin. 2.4.4.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Các số liệu thô đƣợc xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu sau đó đƣợc phân tích ANOVA và đƣợc trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05. Các số liệu đƣợc tính toán và xử lý trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010. Các biểu đồ cũng đƣợc thể hiện bằng phần mềm này. 47
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất Để đạt mục tiêu trên, các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng peptone glycerol. Dịch nuôi cấy đƣợc đƣa đi khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào protease, chitinase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch và lipase bằng phƣơng pháp cấy điểm. Đồng thời prodigiosin đƣợc trích ly từ dịch nuôi cấy bằng Ethanol:HCl 1N (95:5, vv) và xác định nồng độ nhờ phƣơng pháp đo OD535nm và xác định nồng độ prodigiosin sau khi thay giá trị OD535nm vào 2 phƣơng trình đƣờng chuẩn prodigiosin y = 1,1003x + 0.0041 (R = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào Mục tiêu của lên men S.marcescens trong đề tài là sản xuất chế phẩm prodigi- osin thô từ đó tạo chế phẩm diệt sâu. Xoang máu và ống tiêu hóa của côn trùng đƣợc cấu thành từ các thành phần chính gồm lipid, protein và bộ xƣơng ngoài là chitin. Ngoài việc thu nguồn prodigiosin thì chủng vi sinh vật chọn lọc cần đòi hỏi phải tổng hợp các enzyne ngoại bào có khả năng thủy phân protein, lipid và chitin Thử nghiệm hoạt tính protease Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng chứa casein, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử trichloroacetic acid (TCA), đo vòng phân giải ca- sein. Phần còn lại là casein chƣa bị thủy phân sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục. Kết quả khi tiến hành trên môi trƣờng casein thì tất cả các chủng đều có khả năng phân giải casein là nhƣ nhau . Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA – casein trắng đục dễ dàng nhận thấy (hình 3.1 và bảng 3.1). 48
Đồ án tốt nghiệp SH4 SH5 HB Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB Thử nghiệm hoạt tính lipase Lipase xúc tác thủy phân các cầu nối ether của triacylglycerol để tạo ra glycerol acid béo. Có thể dễ dàng phát hiện enzyme lipase của vi sinh vật trên môi trƣờng đĩa thạch chứa tween 80 và CaCl2. Lipase sẽ thủy phân tween 80 trong môi trƣờng tạo ra các acid béo, các acid béo đƣợc giải phóng sẽ kết tủa với muối calcium trong môi trƣờng. Phức hợp acid béo – calcium sẽ làm đục môi trƣờng xung quanh điểm cấy. 49
Đồ án tốt nghiệp Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase có thấy sự hiện diện của enzyme lipase của các chủng vi sinh vật thử nghiệm. Tween 80 bị enzyme lipase thủy phân tạo ra các acid béo và các acid béo này tạo phức với Ca2+ làm môi trƣờng xung quanh vết cấy trắng đục. Kết quả hình 3.2 và bảng 3.1 thì chủng SH4 và HB là các chủng có khả năng phân giải casein mạnh nhất với đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng tween là 27,3 A ± 1,70 và 24,7 AB ± 1,25, chủng SH5 có khả năng phân giải casein kém nhất với đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng casein là 27,3 A ± 1,70. SH4 SH5 HB Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB Thử nghiệm hoạt tính chitinase Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử lugol, đo vòng phân giải chitin. Khi chitinase có mặt trong môi trƣờng chitin nó sẽ phân giải chitin thành N- acetyl glucosamine và cấu trúc mạch ngắn hơn không băt màu với thuốc thử lugol. Khi tác dụng với thuốc thử lugol, độ lớn của phần môi trƣờng trong suốt phản ánh hoạt tính chitinase của chủng vi sinh vật. Khi bổ sung dịch vi khuẩn vào giếng thạch trên môi trƣờng thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, kết quả hình 3.2 các chủng khảo sát đều không có hoạt tính chitinase. Kết luận các chủng vi sinh vật không có khả năng tiết enzyme chitinase phân giải chitin có trong môi trƣờng. 50
Đồ án tốt nghiệp SH4 SH5 HB Hình 3.3 Khả năng tiết ezyme chitinase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. Stt Chủng Đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng khảo sát tƣơng ứng Casein agar Tween 80 agar Chitin agar 1 SH4 37,0A ± 4,32 24,7 AB ± 1,25 0 2 SH5 32,0A ± 6,68 24,0 B ± 0,82 0 3 HB 37,7A ± 4,11 27,3 A ± 1,70 0 Nhƣ vậy dịch nuôi cấy các chủng S.marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN trên môi trƣờng peptone glycerol chứa enzyme protease và lipase, trong khi đó không thể hiện hoạt tính chitinase. Theo Brurberg và cộng sự, 2010; Shingh và cộng sự, 2007 và nhiều tác giả khác thì S. marcescens có khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinnase. Điều này cho thấy hoạt tính chitinase của các chủng trên là có thể là không ổn định hoặc trong thời gian bảo quản đã mất hoạt tính của enzyme chitinase. Trong 3 hoạt tính enzyme ngoại bào liên quan đến khả năng diệt sâu của các chủng Serratia marcescens thì còn giữ đƣợc 2 trong 3 hoạt tính, điều này cho thấy quá trình giữ giống gốc vô cùng quan trọng đối vi sinh công nghiệp. Theo K Ishii et al. (J Invertebr Pathol 117, 61-67. 2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm (silkworm lar- 51
Đồ án tốt nghiệp vae). Kết quả của thí nghiệm cho thấy hai chủng SH4 và HB có khả năng tổng hợp protease cao nhất, góp phần vào hoạt tinh diệt sâu của các chủng S.marcescens. 3.1.2. Trích ly thu prodigiosin Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố đỏ có bản chất là một chất chuyển hóa thứ cấp chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn S. mercescens, và đƣợc nghiên cứu từ lâu để ứng dụng hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học nhƣ hoạt động ức chế miễn dịch, kháng ung thƣ, kháng khuẩn và một số nấm mốc cũng nhƣ có khả năng diệt sâu Những nghiên cứu trƣớc đó cho thấy prodigiosin thể hiện hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura và sâu xanh da láng Spodoptera exigua. Để sản xuất chế phẩm diệt sâu chứa prodigiosin ta có có hai cách là sử dụng trực tiếp dịch canh trƣờng vi khuẩn sau lên men hoặc trích ly thu hồi prodigiosin. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài so sánh khả năng sinh tổng hợp prodigiosin từ các chủng SH4, SH5 và HB trong môi trƣờng peptone glycerol. Với mục đích tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhằm đảm bảo an toàn sinh học ngƣời thực hiện đề tài tiến hành xử lý dịch canh trƣờng bằng acid HCl 1N và trung hòa bằng NaOH về pH trung tính. Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp prodigiosin của các chủng nghiên cứu ngƣời thực hiện đề tài đo OD499nm và OD620nm dịch canh trƣờng sau xử lý acid (Mekhael và Yuosif, 2009) và song song đó tiến hành trích ly thu prodigiosin bằng dung môi Ethanol:HCl 1N (95:5, v:v) để thu sắc tố đỏ. Sau khi cô quay mẫu sau trích ly lỏng lỏng, định mức lên 25ml và pha loãng 100 lần mỗi mẫu bằng dung môi Ethanol:HCL 1N (95:5, v:v), ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo OD535nm, xác định nồng độ prodigiosin thu đƣợc sau trích ly bằng cách thay giá trị OD vào phƣơng trình đƣờng chuẩn prodigi- 2 osin y = 1,1003x + 0.0041 (R = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 52
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau xử lý acid và (OD535nm) sắc tố sau trích ly của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. STT Chủng vi OD499nm OD620nm hiệu OD535nm hiệu khuẩn hiệu chỉnh chỉnh chỉnh 1 SH4 9,739A±0,25 4,004B±0,06 12,42A±0,49 2 SH5 8,461B±0,5 3,383C±0,04 7,617C±0,14 3 HB 10,21A±0,51 4,480A±0,11 11,13B±0,51 14 12,42 a 11,13 b 12 9,739 a 10,21 a 10 8,461 b 7,617 c 8 OD499nm 6 4,004 b 4,480 a OD620nm 3,383 c OD hiệu chỉnh OD hiệu 4 OD535nm 2 0 SH4 SH5 HB Chủng vi khuẩn Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.4, ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy rằng các chủng có khả năng sinh prodigiosin cao nhất là chủng SH4 và HB thể hiện qua giá trị OD499nm (đo prodigiosin trực tiếp trong canh trƣờng) và kết quả OD535nm (đo pro- digiosin sau trích ly). 53
Đồ án tốt nghiệp Tóm lại hai chủng SH4 và HB vừa có khả năng sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme protease, lipase nhƣ nhau; cao hơn chủng SH5 trong cùng một điều kiện khảo sát. Trong khuôn khổ của đồ án tốt nghiệp ngƣời thực hiện đề tài sẽ sử dụng chủng S.marcescens SH4 để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo. Dựa vào đƣờng chuẩn thì chủng SH4 khi tổng hợp prodigiosin thì nồng độ cực đại thu đƣợc sau trích ly là 13,67 mg/ml trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm. 3.1.3. So sánh hình thái, sinh lý, khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) Hình thái khuẩn lạc A C B D Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của chủng SH4 và SH1 A. Khuẩn lạc của chủng SH4 trên môi trƣờng PGA. B. Khuẩn lạc của chủng SH4 soi nghiêng trên môi trƣờng PGA. Dựa vào kết quả soi khuẩn lạc hình 3.5 thì chủng SH4 tạo khuẩn lạc tròn, lồi, đỏ sẫm, có quầng sáng bao quanh. Chủng SH4 có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ trên môi trƣờng PGA làm cho khuẩn lạc có màu đỏ sậm nhƣ theo mô tả của các tài liệu về khả năng tổng hợp sắc tố của Serratia marcescens (Grimont và Grimont, 2006; Anita và cộng sự, 2006; Chidambaram và cộng sự , 2009; Antony và cộng sự, 2011). Khi so sánh với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) thì cả hai chủng đều không có gì khác nhau. 54
Đồ án tốt nghiệp Kết quả hình thái nhuộm Gram Khi quan sát so sánh hình thái hiển vi với chủng Serratia marcescens SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). Sau khi tiến hành nhuộm Gram kết quả hai chủng Gram bắt màu hồng với thuốc nhuộm fuchsin. Điều này cho thấy hai chủng là Gram âm, phù hợp với những mô tả về Serratia marcescens (Williams và Qadri, 1980; Grimont và Grimont, 2006; David R.C., 2012). Có thể thấy ở hình 3.6, tế bào SH4 và SH1 đều bắt màu hồng và hình que ngắn. SH1 SH4 Hình 3.6 Kết quả nhuộm Gram hai chủng SH1 và SH4 Khả năng tiết enzyme ngoại bào E1 E2 E3 F1 F2 F3 Hình 3.7 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của hai chủng SH4 và SH1 E1, E2, E3: Khả năng tiết enzyme protease, lipase và chitinase của chủng SH1 F1, F2, F3: Khả năng tiết enzyme protease, lipase và chitinaase của chủng SH4 55
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 và SH1 Chủng vi sinh Đƣờng kính vòng phân giải (D – d) Stt vật mm trên môi trƣờng tƣơng ứng Casein agar Tween 80 agar 1 SH1 25,333A ±2,49 53,000A±2,16 2 SH4 29,667A±2,05 57,667A±2,05 Kết quả hình 3.7 và bảng 3.3 cho thấy khi tiến hành trên môi trƣờng casein, cả hai chủng SH4 và SH1 đều có khả vòng phân giải rất lớn. Dựa vào kết quả hình 3.7 và bảng 3.3 khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính li- pase cho thấy khả năng phân giải rất mạnh của hai chủng SH1 và SH4. Tween 80 bị enzyme lipase thủy phân tạo các acid béo các acid béo này tạo phức với Ca2+ làm môi trƣờng xung quanh vết cấy trắng đục. Kết quả so sánh với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) thì chủng SH4 có khả năng sinh enzyme lipase và protease có sự chênh lệch khác nhau với chủng SH1 nhƣng sự sai khác này là không có ý nghĩa thống kê. 3.2. Thiết lập môi trƣờng nhân giống Mục tiêu của nhân giống là sản xuất sinh khối tế bào vi khuẩn chứ không phải là sản phẩm trao đổi chất của chúng vì vậy môi trƣờng nhân giống là môi trƣờng cung cấp đầy đủ dinh dƣỡng cho tăng trƣởng vi khuẩn. Các môi trƣờng nhân giống thử nghiệm đƣợc lựa chọn nhƣ sau: môi trƣờng 1 (MT1 - môi trƣờng thu sinh khối cực đại theo ĐATN Nguyễn Thị Tâm, 2010), môi trƣờng 2 (MT2 - môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (PG - đối chứng). Tại các mốc thời gian t = 0h; t = 4h; t = 8h; t = 16h; t = 20h; t = 24h, OD620nm đƣợc đo và trên cơ sở OD620nm hiệu chỉnh vẽ đƣờng cong tăng trƣởng của vi sinh vật trên các loại môi trƣờng nhân giống trên. 56
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng nhân giống theo thời gian. OD620nm hiệu chỉnh Stt Thời gian (h) Môi trƣờng 1 Môi trƣờng 2 Môi trƣờng PG (ĐC) 1 0 0,444F±0,003 0,225F±0,001 0,096F±0,005 2 4 2,571D±0,051 2,089DE±0,044 0,389F±0,009 3 8 6,021BC±0,092 5,184C±0,227 1,006EF±0,040 4 16 7,203B±0,111 6,610B±0,144 1,936DE±0,207 5 20 8,660A±1,338 8,600A±0,211 2,902D±0,075 6 24 9,321A±1,017 8,641A±0,106 2,232D±0,090 10 9 8 7 6 MT1 5 4 MT2 3 DC (PG) 2 1 OD 620 nm chỉnh hiệu nm OD 620 0 0 5 10 15 20 25 30 Thời gian (h) Hình 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 theo thời gian trên các môi trƣờng nhân giống khác nhau. Trong môi trƣờng peptone glycerol đối chứng phase tăng trƣởng kéo dài đến 20 giờ tuy nhiên mức sinh khối cực đại không cao (OD620nm hiệu chỉnh bằng 57
Đồ án tốt nghiệp 2,902D±0,075) (hình 3.8). Trong môi trƣờng 1 và môi trƣờng 2 phase tăng trƣởng chia làm hai giai đoạn, giai đoạn đầu từ 0 giờ đến 9 giờ, giai đoạn thứ hai từ 9 giờ đến 20 giờ với sinh khối cực đại cao hơn hẳn đối chứng (OD620nm hiệu chỉnh ở môi A trƣờng 1 bằng 8,660 ±1,338), (OD620nm hiệu chỉnh ở môi trƣờng 2 bằng 8,600A±0,21): sinh khối tổng hợp trong hai môi trƣờng này nhìn chung cao hơn môi trƣờng đối chứng nhƣng không khác biệt có ý nghĩa thống kê (P>0,05) khi so sánh giữa hai môi trƣờng. Tuy nhiên, ngƣời thực hiện đề tài quyết định chọn môi trƣờng 2 (MT2 - môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005) làm môi trƣờng nhân giống vì mang tính kinh tế (bảng giá tiền môi trƣờng xem ở phụ lục 1). 3.3. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men Để thực hiện mục tiêu của đề tài thì công việc cần làm là lựa chọn đƣợc môi trƣờng lên men và chế độ lên men vi khuẩn Serratia marcescens SH4 sản xuất pro- digiosin cho hàm lƣợng cao nhất. 3.3.1. Thiết lập môi trường lên men Môi trƣờng thông thƣờng đƣợc sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi các chủng Serratia marcescens là môi trƣờng phức tạp và rất giàu dinh dƣỡng (Yama- shita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Giri và cộng sự (2004) đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ: môi trƣờng hạt mè, nutrient broth và peptone glycerol broth, Kết quả o cho thấy khả năng tổng hợp prodigiosin ở 30 C trong môi trƣờng nutrient broth là 0,345 mg/ml, trong môi trƣờng peptone glycerol là 0,596 mg/l, môi trƣờng hạt mè là 9,3 mg/l và tổng hợp tối đa trên môi trƣờng hạt đậu phộng là 25,98 mg/l. Trong các nghiên cứu trƣớc đó của nhóm sinh viên thì prodigiosin tổng hợp trên môi trƣờng peptone glycerol của chủng SH1 là 10,575 mg/ml (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) chỉ bằng 77,36% so với chủng SH4 (13,67 mg/ml). Prodigiosin là một chất thứ cấp gắn vào màng tế bào vì vậy sự tổng hợp hợp chất này không trễ phase nhiều với sự sinh tổng hợp tế bào để tăng mât độ tế bào cũng nhƣ nồng độ prodigiosin tổng hợp. Quá trình tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật xảy ra dƣờng nhƣ song song với quá trình tổng hợp sinh khối, có thể do sắc tố có liên quan đến 58
Đồ án tốt nghiệp cấu trúc màng tế bào của vi sinh vật (Allen và cộng sự, 1983). Phƣơng pháp nuôi cấy theo mẻ có tiếp liệu đƣợc coi là giải pháp hứa hẹn. Kết quả khi tăng sinh chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 trên môi trƣờng nhân giống MT2 cấy chuyền sang các môi trƣờng lên men: môi trƣờng PG có tiếp liệu, môi trƣờng lên men (thành phần môi trƣờng xem ở phụ lục 1) có tiếp liệu và môi trƣờng PG không tiếp liệu (đối chứng). Dựa vào kết quả ở hình 6 (phụ lục 2) cho thấy khi tăng sinh trên môi trƣờng nhân giống MT2 thì vi sinh vật không tổng hợp đƣợc sắc tố đỏ trong các môi trƣờng lên men. Bản chất màu đỏ tƣơi của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Sinh khối thu đƣợc trong ba môi trƣờng đƣợc biểu diễn trong bảng 3.5 và hình 3.9. Bảng 3.5 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. Stt Thời gian (h) OD620nm hiệu chỉnh Môi trƣờng Môi trƣờng Môi trƣờng PG (ĐC) PGTL lên men 1 0 0,144I±0,003 0,144I±0,003 0,184I±0,008 2 9 1,606GH±0,105 1,041H±0,053 2,691DEF±0,020 3 24 2,733DEF±0,089 2,315±0,059 3,388CD±0,248 4 33 3,043CDE±0,446 2,382FG±0,013 3,758BC±0,386 5 48 3.488C±0,321 2,520EF±0,263 4,328B±0,896 6 57 2,248FG±0,173 2,282±0,068 5,083A±0,691 59
Đồ án tốt nghiệp 6 Môi trường 5 PGTL 4 Môi trường PGĐC 3 Môi trường 2 LMTL 1 OD 620 nm OD chỉnh hiệu nm 620 0 0 20 40 60 Thời gian (h) Hình 3.9 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. Kết quả cho thấy khi sử dụng môi trƣờng MT2 làm môi trƣờng nhân giống, prodigiosin không đƣợc tổng hợp ngay cả trong môi trƣờng peptone glycerol đối chứng cũng nhƣ trong môi trƣờng peptone glycerol tiếp liệu (PGTL) và môi trƣờng lên men tiếp liệu (LMTL). Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài quay lại sử dụng môi trƣờng peptone glycerol làm môi trƣờng nhân giống cho thí nghiệm lên men có tiếp liệu. Kết quả ở hình 7 (phụ lục 2) cho thấy khi sử dụng môi trƣờng peptone glycer- ol làm môi trƣờng nhân giống thì OD620nm hiệu chỉnh đƣợc trình bày trong bảng 3.6 và đƣờng cong tăng trƣởng đƣợc thể hiện ở hình 3.10: 60
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. Stt Thời gian OD620nm hiệu chỉnh (h) Môi trƣờng PG Môi trƣờng Môi trƣờng lên (ĐC) PGTL men 1 0 0,279H ± 0,004 0,279H ± 0,037 0,357H ± 0,009 2 9 0,820FG ± 0,004 0,819FG ± 0,018 2,736B ± 0,823 3 24 1,159EF ± 0,022 1,147EF ± 0,023 3,477A ± 0,033 4 33 1,348DE ± 0,045 1,46DE ± 0,036 3,558A ± 0,223 5 48 1,569D ± 0,041 1,986C ± 0,133 3,262A ± 0,260 6 57 0,532GH ± 0,012 1,980C ± 0,098 3,592A ± 0,654 4 3.5 3 Môi trường 2.5 PGTL Môi trường 2 PGĐC 1.5 Môi trường LMTL nm chỉnh hiệu nm 1 620 0.5 0 OD OD 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (h) Hình 3.10 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. Kết quả hình 3.10 cho thấy sinh khối đƣợc tổng hợp nhiều nhất trong môi trƣờng lên men có tiếp liệu sau đó là môi trƣờng peptone glycerol tiếp liệu, thấp 61
Đồ án tốt nghiệp nhất là môi trƣờng peptone glycerol đối chứng. Tuy nhiên khi sử dụng môi trƣờng peptone glycerol làm môi trƣờng nhân giống, sắc tố đỏ chỉ đƣợc tổng hợp trong môi trƣờng peptone glycerol đối chứng và môi trƣờng peptone glycerol tiếp liệu nhƣng không xuất hiện trong môi trƣờng lên men tiếp liệu (LMTL) (hình 7 phụ lục 2). Bảng 3.7 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. Stt Thời gian OD499nm hiệu chỉnh (h) Môi trƣờng PG Môi trƣờng (ĐC) PGTL 1 0 0,526F± 0,015 0,526F ± 0,015 2 9 1,141F± 0,004 1,147F ± 0,032 3 24 1,505E± 0,035 1,661E ± 0,052 4 33 1,98D± 0,0616 2,422C ± 0,074 5 48 2,351C± 0,078 3,604A ± 0,169 6 57 1,56E± 0,0098 3,364B ± 0,286 (PGTL: là môi trƣờng PG có tiếp liệu glycerol sau 9h, 24h, 48h với nồng độ glycerol tiếp liệu là 5g/l) 62
Đồ án tốt nghiệp 4 3.5 3 Môi 2.5 Trường 2 PGTL 1.5 Môi 1 trường 0.5 PGĐC 0 OD 499 nm chỉnh hiệu nm OD 499 0 20 40 60 Thời gian (h) Hình 3.11 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. Khi đo OD499nm để đánh giá khả năng tổng hợp prodigiosin trên các môi trƣờng trên (bảng 3.7 và hình 3.11), ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy rằng vi khuẩn S.marcescens SH4 có khả năng sinh prodigiosin cao nhất ở môi trƣờng PG có tiếp liệu (PGTL) cao hơn đối chứng 53,3 % sau khi nuôi cấy 48 giờ (thời điểm prodigi- osin tổng hợp cực đại). Từ những kết quả trên ngƣời thực hiện đề tài rút ra những nhận xét sau: - Thứ nhất, môi trƣờng thuận lợi cho phát triển sinh khối nhƣ môi trƣờng nhân giống MT1, MT2 chứa hoặc đƣờng (MT1) hoặc phosphate (MT2) vì vậy khi cấy giống vào môi trƣờng lên men có thể những chất này đã ức chế sự tổng hợp của hợp chất thứ cấp. - Thứ hai, nồng độ prodigiosin đƣợc tổng hợp trong môi trƣờng lên men là peptone glycerol kết hợp với môi trƣờng nhân giống là peptone glycerol đƣợc cải thiện rõ rệt khi áp dụng chế độ nuôi cấy theo mẻ có tiếp liệu glycerol với nồng độ 5 g/l. - Thứ ba, môi trƣờng lên men theo tài liệu chứa tryptone, yeast extract và glycerol mặc dù có tiếp liệu glycerol thì môi trƣờng cũng chỉ thuận lợi cho việc 63
Đồ án tốt nghiệp phát triển sinh khối mà không tổng hợp đƣợc sắc tố có thể do thành phần amino ac- id trong môi trƣờng này khác với môi trƣờng peptone glycerol, không phải là tiền chất của prodigiosin. Tại môi trƣờng PG đối chứng sau khi vi sinh vật bƣớc vào phase cân bằng thì sắc tố vẫn tiếp tục tổng hợp nhƣng rất chậm và ở 57 giờ thì sắc tố giảm mạnh. Ở môi trƣờng peptone glycerol có tiếp liệu sắc tố tổng hợp tăng nhanh sau 48 giờ nuôi cấy và ở 57 giờ thì sắc tố bắt đầu giảm mặc dù có trong quá trình nuôi cấy có tiếp liệu glycerol có thể do pH môi trƣờng thay đổi làm cho cấu trúc sắc tố thay đổi. Williams và cộng sự (1971) đã báo cáo rằng pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp sắc tố của S. marcescens, ở môi trƣờng quá acid (pH dƣới 3,0) hoặc môi trƣờng quá base (pH trên 10) đều ức chế khả năng sản suất sắc tố của S. mar- cescens. Kết luận phƣơng pháp nuôi cấy theo mẻ có tiếp liệu cho thấy kết quả tốt hơn phƣơng pháp nuôi cấy theo mẻ không tiếp liệu. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài quyết định sử dụng môi trƣờng peptone glycerol làm môi trƣờng lên men và kết hợp với phƣơng pháp nuôi cấy theo mẻ có tiếp liệu cho thí nghiêm tiếp theo. 3.3.2. Thiết lập chế độ lên men Sau khi thiết lập đƣợc môi trƣờng lên men ngƣời thực hiện đề tài tiến hành thiết lập chế độ lên men nhằm tăng cƣờng việc sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SH4. Tỷ lệ C/N cũng là một yếu tố ảnh hƣởng đến sự tổng hợp các sản phẩm vi sinh vật thứ cấp từ đó ta mới thay đổi chế độ tiếp liệu. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài thay đổi nồng độ glycerol tiếp liệu là: 2,5 g/l; 5 g/l; 7,5 g/l; 10 g/l. Kết quả OD620nm hiệu chỉnh đƣợc trình bày trong bảng 3.8 và đƣờng cong tăng trƣởng của vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol tiếp liệu tại các nồng độ đƣợc thể hiện ở hình 3.12. 64
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. Stt Thời OD 620nm hiệu chỉnh gian ĐC 2,5 g/l 5 g/l 7,5 g/l 10 g/l (h) 1 0 0,127±0,006 0,127±0,006 0,127±0,006 0,127±0,006 0,127±0,006 2 9 0,908±0,009 1,027±0,083 0,816±0,085 0,945±0,021 0,913±0,027 3 24 1,556±0,030 3,474±0,029 2.114±0,092 1,424±0,051 1,396±0,033 4 33 1,899±0,013 3,325±0,082 2,926±0,041 1,668±0,079 1,483±0,044 5 48 1,866±0,090 4,172±0,218 3,339±0,215 1,413±0,044 1,476±0,019 6 57 1,74±0,008 3,400±0,166 2,907±0,098 1.239±0,068 1,146±0,030 4.5 4 Môi trường PG đối 3.5 chứng 3 Môi Trường PG tiếp 2.5 liệu glycerol 2.5 g/l 2 Môi Trường PG tiếp liệu glycerol 5 g/l 1.5 Môi Trường PG tiếp 1 liệu glycerol 7.5 g/l OD 620nm OD chỉnh hiệu 620nm 0.5 Môi Trường PG tiếp 0 liệu 10 g/l 0 20 40 60 Thời gian (h) Hình 3.12 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. Kết quả hình 3.12 cho thấy sinh khối đƣợc tổng hợp nhiều nhất trong môi trƣờng peptone glycerol tiếp liệu glycerol ở nồng độ 2,5 g/l và cao gấp 2,24 lần môi trƣờng 65
Đồ án tốt nghiệp peptone glycerol đối chứng, sau đó là môi trƣờng peptone glycerol tiếp liệu glycerol ở nồng độ 5g/l cao gấp 1,79 lần môi trƣờng peptone glycerol đối chứng, thấp nhất là môi trƣờng peptone glycerol tiếp liệu ở nồng độ 7,5 g/l và 10 g/l chỉ bằng 0.76 lần và 0.79 lần so với môi trƣờng peptone glycerol đối chứng sau 48 giờ nuôi cấy (thời điểm sinh khối đạt cực đại). Nhƣ vậy ở nồng độ tiếp liệu glycerol là 2,5 g/l nguồn cacbon đƣợc bù đắp để tỷ lệ C/N phù hợp với nhu cầu tăng trƣởng. Hình 3.13 biểu diễn động học tăng trƣởng và tổng hợp prodigiosin của vi khuẩn Serratia marcescens SH4. 66
Đồ án tốt nghiệp OD 499 nm ĐC 0D 620 nm 10 5 OD hiệu chỉnh OD hiệu 0 0 20 40 60 Thời gian (h) OD 499 nm OD 499 nm 2.5 G/L OD 620 nm 5 G/L OD 620 nm 15 10 10 5 5 OD hiệu chỉnh OD hiệu 0 chỉnh OD hiệu 0 0 20 40 60 0 20 40 60 Thời gian (h) Thời gian (h) OD 499 nm OD 499 nm 7.5 G/L OD 620 nm 10 G/L OD 620 nm 10 10 5 5 0 OD hiệuchỉnh 0 OD hiệu chỉnh OD hiệu 0 20 40 60 0 20 40 60 Thời gian (h) Thời gian (h) Hình 3.13 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh và OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men peptone glycerol tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. Nhƣ vậy quá trình tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật xảy ra song song với quá trình tổng hợp sinh khối mà không trễ pha nhiều. Sau khi vi sinh vật bƣớc vào phase cân bằng thì sắc tố vẫn tiếp tục tổng hợp nhƣng rất chậm. Đến 48 giờ thì quá trình tổng hợp sinh khối và prodigiosin ở trong giai đoạn cực đại. Sau 57 giờ thì sắc tố giảm mạnh có thể do pH môi trƣờng thay đổi làm cho cấu trúc sắc tố thay đổi. So 67
Đồ án tốt nghiệp sánh nồng độ prodigiosin tổng hợp sau 48 giờ (hình 3.14), thể hiện qua giá trị OD499nm (hiệu chỉnh) dịch canh trƣờng lên men thì khả năng sinh prodigiosin của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men peptone glycerol ở nồng độ glyc- erol tiếp liệu là 2,5 g/l là cao nhất và cao gấp 2,8 lần so với đối chứng peptone glyc- erol nuôi cấy theo mẻ. Tại nồng độ glycerol tiếp liệu 5 g/l cao 1,8 lần so với đối chứng. Còn tại nồng độ glycerol tiếp liệu 7,5 g/l và 10 g/l chỉ bằng 0,59 lần và 0,64 lần so với môi trƣờng peptone glycerol đối chứng. 277,1 300 ) 250 180,5 200 100 150 58,71 100 64,15 50 0 (% so (% với đối chứng OD 499nm hiệu chỉnh ĐC 2,5 G/L 5 G/L 7,5 G/L 10 G/L Nồng độ Glycerol tiếp liệu Hình 3.14 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499 nm) của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men PG ở các nồng độ tiếp liệu tại 48h. (số liệu thô xem ở bảng 5 - phụ lục A và hình 9 - phụ lục B) Tại các chế độ tiếp liệu ở nồng độ glycerol thấp 2,5 g/l và 5 g/l thì khả năng tổng hợp prodigiosin cao so với đối chứng nhƣng tại các chế độ tiếp liệu nồng độ glycerol cao 7,5 g/l và 10 g/l thì khả năng tổng hợp prodigiosin lại thấp hơn đối chứng có thế do nồng độ glycerol quá cao ức chế khả năng tổng hợp hợp chất thứ cấp ở vi khuẩn. Xét về điều kiện nuôi cấy so với các thí nghiệm trƣớc đó thì trong các thí nghiệm này do thiếu thiết bị nên không thể kiểm soát đƣợc nhiệt độ cũng nhƣ pH trong quá trình lên men mà chủng vi khuẩn S. marcescens lại khá nhạy cảm với nhiệt độ (nhiệt độ phòng trong thời gian khảo sát từ 30-380C) nên hiệu quả lên men 68
Đồ án tốt nghiệp có phần chƣa cao. Nhƣng so với môi trƣờng peptone glycerol đối chứng thì môi trƣờng peptone glycerol có tiếp liệu ở nồng độ glycerol tiếp liệu là 2,5 g/l vẫn cho kết quả tốt hơn. 69
Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Khả năng tiết enzyme ngoại bào protease, lipase và sinh tổng hợp prodigiosin của các chủng S.marcescens SH4 và HB cao hơn chủng SH5. Trong quá trình nhân giống sử dụng môi trƣờng peptone glycerol làm môi trƣờng nhân giống cho chủng S.marcescens SH4 bảo đảm sự tổng hợp prodigiosin trong quá trình lên men chính. Trong quá trình lên men S.marcescens SH4 thu prodigiosin, prodigiosin đƣợc tổng hợp với nồng độ cao nhất (OD499nm hiệu chỉnh = 10,69) trong môi trƣờng pep- tone glycerol tiếp liệu bổ sung 2,5 g/l glycerol sau 48 giờ nuôi cấy. 2. Kiến nghị Khảo sát hoạt lực diệt sâu của chế phẩm chứa prodigiosin. Khảo sát ảnh hƣởng của chế phẩm lên các chế phẩm sinh học dịch bệnh ( nấm Trichoderma spp, nấm Paecilomyces spp, nấm Aspergillus flavus CDP1, nấm Fusarium solani spp). Đánh giá tác động xấu của chết phẩm đối với cây trồng. Tối ƣu hóa quy trình trích ly và tinh sạch prodigiosin. Prodigiosin thu đƣợc là dạng thô, vì vậy cần nghiên cứu quá trình tinh sạch prodigiosin về dạng tinh để có giá trị cao hơn. Prodigiosin sau khi đƣợc tinh sạnh đem thử nghiệm khả năng diệt tế bào ung thƣ. Prodigiosin sau khi đƣợc tinh sạnh đem khảo sát khả năng miễn dịch. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: 70