›

Đồ án Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa

pdf 150 trang thiennha21 13/04/2022 5070
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_tao_phan_bon_la_tu_phu_phe_pham_ca_tra_va_vo_dua.pdf

Nội dung text: Đồ án Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO PHÂN BÓN LÁ TỪ PHỤ PHẾ PHẨM CÁ TRA VÀ VỎ DỨA Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Trương Huệ Mẩn MSSV: 1411100599 Lớp: 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2018
  2. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. LỜI CAM ĐOAN Chúng tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng chúng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Chúng tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Đồ án này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Đồ án đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 08 năm 2018. Sinh Viên Trương Huệ Mẩn
  3. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập tại trường, dưới sự dìu dắt tận tình của các thầy cô Viện Khoa Học Ứng Dụng của trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM đã truyền đạt cho chúng em những kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong chuyên môn cũng như trong nhiều lĩnh vực khác. Sự tận tụy, say mê, lòng nhân ái nhiệt thành của quý thầy cô là động lực giúp chúng em cố gắng trau dồi thêm kiến thức và vượt qua những khó khăn trong học tập. Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của trường ĐH Công Nghệ TP. HCM, đặc biệt là cô TS. Nguyễn Thị Hai người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho chúng em hoàn thành tốt chuyên đề này. Cuối cùng, chúng em xin chân thành cám ơn đến các anh chị và các bạn sinh viên đã hỗ trợ chúng em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện chuyên đề tốt nghiệp một cách hoàn chỉnh. Chúng em xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 08 năm 2018. Sinh Viên Trương Huệ Mẩn
  4. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH SÁCH CÁC BẢNG v DANH SÁCH CÁC HÌNH vii TÓM TẮT 1 MỞ ĐẦU 2 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 5 1.1. Giới thiệu về cá Tra. 5 1.1.1. Đặc điểm sinh học cá Tra. 5 1.1.2. Các đặc điểm hóa học của cá. 7 1.1.3. Tình hình nuôi cá Tra trong nước. 8 1.2. Giới thiệu về cây dứa. 9 1.3. Giới thiệu về enzyme Bromelain. 11 1.3.1. Đặc điểm enzyme Bromelain. 11 1.3.2. Tính chất enzyme Bromelain. 12 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng của enzyme Bromelain. 13 1.4. Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc trong việc sử dụng enzyme protease thủy phân protein cá. 15 1.5. Quá trình thủy phân cá. 19 1.5.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá. 20 i
  5. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. 1.6. Tình hình sản xuất rau quả ở Việt Nam. 22 1.7. Giới thiệu về rau. 25 1.7.1. Giới thiệu về cây cải. 25 1.7.2. Giới thiệu về cây đậu bắp. 26 1.8. Một số nghiên cứu về sử dụng phân bón trên cây trồng. 29 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 32 2.2. Nội dung nghiên cứu. 32 2.2.1. Đánh giá chất lượng nguyên liệu đầu vào (phụ phế phẩm cá Tra). . 32 2.2.2. Xác định hoạt tính enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain có trong thành phần vỏ dứa. 32 2.2.3. Khảo sát hiệu quả thuỷ phân của enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain vỏ dứa. 33 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. 34 2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. 35 2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. 35 2.2.7. Ổn định dịch thủy phân bằng sorbic acid. 36 2.2.8. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cây cải xanh trồng ngoài đồng. 39 2.2.9. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cây đậu bắp trồng ngoài đồng. 39 2.2.10. Xử lý số liệu 40 ii
  6. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. Đánh giá chất lƣợng nguyên liệu đầu vào (phụ phế phẩm cá Tra). 41 3.2. Xác định hàm lƣợng enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain có trong thành phần vỏ dứa bằng phƣơng pháp Anson cải tiến. . 41 3.3. Khảo sát hiệu quả thuỷ phân của enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain vỏ dứa. 42 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. 43 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra 45 3.6. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. 47 3.7. Ổn định dịch thủy phân bằng sorbic acid 48 3.8. Phối chế dung dịch thủy phân thành phân bón lá để dùng cho rau. 52 3.9. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cải xanh trồng ngoài đồng. 54 3.10. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho đậu bắp trồng ngoài đồng. 63 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 4.1. Kết luận. 72 4.2. Đề nghị. 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 iii
  7. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT ĐC Đối chứng ĐVT Đơn vị tính NSLT Năng suất lý thuyết NSTT Năng suất thực thu NT Nghiệm thức NTS Nitơ tổng số iv
  8. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. DANH SÁCH CÁC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 1.1 Thành phần dinh dưỡng trong cá Tra (trên trọng lượng khô). 8 1.2 Thành phần có trong phế phẩm fillet cá Tra. 8 Tỷ lệ khối lượng, hàm lượng chất khô tổng số và hoạt lực protease 1.3 11 các phần quả dứa. 1.4 Hoạt tính phân giải casein của Bromelain. 13 Hoạt tính phân giải Benzoyl – L – Arginine amide (BAA) của 1.5 13 Bromelain. 1.6 Tình hình xuất khẩu rau quả của Việt Nam. 24 1.7 Lượng phân bón cho cải xanh. 26 1.8 Lượng phân bón cho đậu bắp. 28 Bảng nghiệm thức khảo sát hiệu quả thuỷ phân của enzyme 2.1 33 Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain vỏ dứa. Bảng nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình 2.2 34 thuỷ phân phụ phế phẩm cá Tra. Bảng nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình 2.3 35 thuỷ phân phụ phế phẩm cá Tra. Bảng nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thuỷ 2.4 36 phân cá Tra. Bảng nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của sorbic acid trong việc 2.5 37 ổn định dung dịch thuỷ phân. Bảng nghiệm thức khảo nghiệm phân bón lá cho cây cải xanh 2.6 39 ngoài đồng. Bảng nghiệm thức khảo nghiệm phân bón lá cho cây đậu bắp 2.7 40 ngoài đồng. 3.1 Kết quả phân tích N tổng số và Protein tổng số của nguyên liệu 41 v
  9. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. đầu vào. Hoạt tính enzyme Bromelain có trong vỏ dứa và enzyme công 3.2 41 nghiệp. Khảo sát hiệu quả thủy phân phụ phẩm cá Tra của của enzyme 3.3 42 Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain trong vỏ dứa. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm 3.4 43 cá Tra. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá 3.5 45 Tra. 3.6 Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. 47 Ảnh hưởng của nồng độ sorbic acid đến độ ổn định của dịch thủy 3.7 48 phân. 3.8 Hàm lượng các chất trong dịch thủy phân trước phối trộn. 52 3.9 Chi phí sản xuất chế phẩm (1L) từ dịch thủy phân cá Tra. 53 3.10 Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến chiều cao cây rau cải. 54 3.11 Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến số lá cây rau cải. 58 Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến trọng lượng và năng 3.12 61 suất cây cải. Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến ngày ra hoa đầu tiên và 3.13 64 ngày thu hoạch đầu tiên của cây đậu bắp. Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến chiều cao của cây đậu 3.14 65 bắp. Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến số lượng quả và trọng 3.15 69 lượng trung bình của cây đậu bắp. 3.16 Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến năng suất cây đậu bắp. 70 vi
  10. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. DANH SÁCH CÁC HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1.1 Cá Tra. 5 1.2. Cấu trúc sợi hydrate carbon của Bromelain. 12 1.3 Trình tự acid amin trong phân tử Bromelain. 13 1.4 Quá trình thủy phân cá. 19 Hàm lượng N formol và N tổng số trong khảo sát hiệu quả của 3.1 enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain trong vỏ 42 dứa Hàm lượng N formol và N tổng số trong ảnh hưởng của thời gian 3.2 44 đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. Hàm lượng N formol và N tổng số trong ảnh hưởng của nhiệt độ 3.3 45 đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. Hàm lượng N formol và N tổng số trong ảnh hưởng của pH đến 3.4 47 quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. Hàm lượng N formol và N tổng số trong ảnh hưởng của nồng độ 3.5 49 sorbic acid đến độ ổn định của dịch thủy phân. 3.6 Chế phẩm phân sinh học cá. 53 3.7 Chiều cao cây rau cải sau 10 ngày. 55 3.8 Chiều cao cây rau cải sau 18 ngày. 56 3.9 Chiều cao cây rau cải sau 26 ngày. 57 3.10 So sánh kết quả thu hoạch của cải xanh. 59 – 60 3.11 Khối lượng trung bình của cải. 62 3.12 Năng suất lý thuyết của cải. 62 3.13 Năng suất thực thu của cải. 63 3.14 Đậu bắp ngày thứ 42. 66 3.15 Đậu bắp ngày thứ 57. 67 vii
  11. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. 3.16 Đậu bắp ngày thứ 72. 68 3.17 Kết quả thu hoạch của đậu bắp ở từng công thức. 70 3.18 Năng suất cây đậu bắp. 71 viii
  12. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. TÓM TẮT Đề tài “Tạo bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa” đã được tiến hành từ tháng 4/2018 đến hết tháng 7/2018. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là sử dụng dịch thô từ vỏ dứa để thủy phân từ phụ phế phẩm cá Tra tạo phân bón lá, nhằm tận dụng các nguồn vật liệu này để sử dụng trong nông nghiệp, giảm nguồn chất thải ra môi trường và tiết kiệm chi phí nhập khẩu phân bón trong nông nghiệp. Đề tài được thực hiện trong phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng, trường ĐH Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh bằng cách sử dụng enzyme Bromelain thu được từ dịch thô vỏ dứa để thủy phân phụ phẩm cá Tra và thử nghiệm chế phẩm phân bón lá ngoài đồng ruộng. Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy: Khả năng thủy phân của dịch thô từ vỏ dứa tương đương với enzyme Bromelain công nghiệp. Sử dụng enzyme có trong vỏ dứa để thủy phân cá Tra tối ưu trong điều kiện pH = 5,5, nhiệt độ 50 thời gian thủy phân là 150 phút với vỏ dứa là 56g dứa (tương đương 35IU) hay 15ml dịch enzyme thô, 10g cá Tra. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: - Xác định chất lượng của nguồn nguyên liệu phế phẩm. - Xác định hiệu quả thủy phân phụ phế phẩm cá Tra giữa enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain trong vỏ dứa. - Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian, pH đến hiệu quả thủy phân phụ phế phẩm ca Tra của enzyme Bromelain có trong vỏ dứa. - Tạo chế phẩm phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và enzyme Bromelain có trong vỏ dứa. - Xác định hiệu quả của chế phẩm phân bón lá từ chế phẩm dịch thủy phân cá Tra từ enzyme Bromelain có trong vỏ dứa trên cây rau cải và đậu bắp. 1
  13. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Sản xuất nông nghiệp đóng vai trò trong nền kinh tế của Việt Nam. Trong sản xuất nông nghiệp, phân bón là yếu tố góp phần tăng năng suất cây trồng. Hàng năm nước ta đã tốn một khoản ngoại tệ lớn để nhập khẩu phân bón. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT), ước tính khối lượng nhập khẩu phân bón các loại 5 tháng đầu năm 2018 đạt 1,83 triệu tấn và 524 triệu USD (báo Công thương ngày 30/05/2018) chủ yếu là phân vô cơ. Trong tổng số 7.711 loại phân bón, có 4.683 loại phân bón lá, chiếm 60,1% tổng số các loại phân bón. Đây là con số rất lớn, song lại chưa được quan tâm đến chất lượng và hướng dẫn sử dụng (Cục Trồng trọt - Trung tâm Khuyến nông Quốc gia, 2007). Tuy nhiên, sử dụng phân hóa học thiếu khoa học không chỉ làm lãng phí tiền của mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường và vấn đề an toàn thực phẩm. Do đó, nền sản xuất nông nghiệp thế giới đang quay trở lại vào con đường sản xuất nông nghiệp hữu cơ, trong đó phân bón vô cơ được thay bằng phân bón hữu cơ. Nhằm tạo ra những sản phẩm phân bón lá chất lượng, tăng năng suất sản phẩm và đảm bảo an toàn cho con người, hiện nay với sự tiến bộ của khoa học ứng dụng, các nhà khoa học đã nghiên cứu một số chế phẩm sinh học hiệu quả cao được sử dụng làm phân bón lá như: phân bón lá làm từ trùn quế, phân bón lá từ dịch thủy phân protein cá bằng acid hoặc bằng enzyme (N. Wisuthiphaet, S. Klinchan, và S. Kongruang, 2016; Bhaskar và Mahendrakar, 2008; Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm, 2013), Trong những năm gần đây xuất khẩu thủy hải sản đang trở thành ngành xuất khẩu mũi nhọn lớn nhất trong kim ngạch toàn ngành của đất nước. Theo Tổng cục Thủy sản tính đến ngày 30/9/2017, cả nước có 104 cơ sở sản xuất giống cá Tra và có 23 nhà máy chế biến cá Tra được Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA) công nhận đủ điều kiện xuất khẩu vào Mỹ. Sản lượng thu hoạch 11 tháng đầu năm 2017 đạt 1.207,5 ngàn tấn (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2017). Lượng phụ phẩm sau phi lê bao gồm: thịt vụn, đầu, xương, vây, tăng tỷ lệ thuận với lượng cá fillet xuất khẩu. Trung bình sản xuất 1kg thành phần cá fillet đông lạnh cần khoảng 2,6kg 2
  14. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. cá nguyên liệu. Như vậy, lượng phụ phẩm từ công nghiệp chế biến cá Tra fillet đông lạnh khoảng 450.000 - 480.000 tấn phụ phẩm/năm. Đây là nguồn chất thải có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường rất lớn nếu không có biện pháp tận dụng và xử lý. Trước tình hình hiện tại, việc nghiên cứu tận dụng phụ phẩm cá Tra sau fillet là rất cần thiết. Bên cạnh đó, hằng năm ở nước ta, một lượng lớn phế phẩm dứa cũng được thải bỏ. Với 15 nhà máy chuyên về sản xuất các sản phẩm từ dứa và sản lượng dứa hằng năm đạt khoảng 300 nghìn tấn. Trong đó, lượng phế phẩm (lõi, chồi, vỏ và lá) chiếm đến 70% tổng khối lượng nguyên liệu đầu vào đã trở thành một vấn đề đối với các nhà máy chế biến (Nguyễn Bá Mùi, 2002; Lại Thị Ngọc Hà, 2009). Đặc biệt, enzyme Bromelain có mặt trong toàn bộ quả dứa (Lại Thị Ngọc Hà, 2009). Bromelain có thể phân huỷ protein và được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp. Liệu có thể sử dụng nguồn phế phẩm từ vỏ dứa thay cho enzyme công nghiệp để thủy phân phụ phẩm cá Tra sau fillet để tạo phân bón hữu cơ giảm lượng phân bón hóa học sử dụng trong nông nghiệp. Xuất phát từ thực tiễn trên, nhóm sinh viên tiến hành đề tài “Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa”. Phƣơng pháp nghiên cứu. - Phương pháp tổng hợp tài liệu: Thu nhập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên quan đến đề tài. Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài. - Phương pháp nghiên cứu: Thực hiện một số khảo sát ảnh hưởng như nhiệt độ, thời gian, pH, chất bảo quản đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra để tìm được điều kiện thủy phân tối ưu khi sử dụng enzyme từ dịch thô vỏ dứa. Bố trí thí nghiệm ngoài đồng nhằm khảo sát hiệu quả của dịch thủy phân và chế phẩm so với phân bón thương mại trên cải xanh và đậu bắp. 3
  15. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. - Phương pháp thu nhập và xử lý số liệu: Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát. Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS). Đối tƣợng nghiên cứu - Vỏ dứa: Vỏ dứa lấy từ chợ TP. Hồ Chí Minh đem ép bằng máy ép trái cây để lấy dịch enzyme thô. - Phụ phế phẩm cá Tra (nội tạng, thịt đỏ) lấy từ công ty cổ phần Gò Đàng GODACO – SEAFOOD TP. Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang. - Enzyme Bromelain công nghiệp do Viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp: - Phần tóm tắt. - Phần mở đầu. - Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. - Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. - Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được. - Chương 4: Kết luận và đề nghị - nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài. 4
  16. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cá Tra. - Tên tiếng anh: Pangasius catfish. - Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus. - Chi: Pangasius. - Họ: Pangasidae. - Bộ: Siluriformes. - Lớp: Actinopterygi. - Ngành: Chordata. Cá Tra có đặc điểm phân loại như sau: - Bộ cá nheo Silurformes. - Họ cá Tra Pangasiidae. - Giống cá Tra dầu Pangasianodon. - Loài cá Tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). 1.1.1. Đặc điểm sinh học cá Tra. Hình 1.1. Cá Tra. Nguồn: Cá Tra là cá da trơn (không vẩy), thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, có hai đôi râu dài. Cá Tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước hơi lợ (nồng độ muối 7 - 10), có thể chịu được nước phèn với pH > 5, dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 150C, nhưng chịu nóng tới 390C (Nguyễn Chung, 2007). 5
  17. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Cá Tra phân bố ở lưu vực sông Mê Kông bao gồm các nước Lào, Việt Nam, Cam-pu-chia và Thái Lan. Ở Thái Lan còn gặp cá Tra ở lưu vực sông Mê Kông và ở sông Chao Praya. Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột và cá giống Tra được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong tự nhiên địa phận Việt Nam, do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê Kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Khảo sát chu kỳ di cư của cá Tra ở địa phận Cam-pu-chia cho thấy cá ngược dòng từ tháng 10 đến tháng 5 và di cư về hạ lưu từ tháng 5 đến tháng 9 hằng năm (Nguyễn Chung, 2007). Cá Tra thích ăn mồi tươi sống, vì vậy chúng ăn thịt lẫn nhau khi còn nhỏ và chúng vẫn tiếp tục ăn nhau nếu không được cho ăn đầy đủ. Ngoài ra, khi khảo sát cá bột vớt trên sông, còn thấy trong dạ dày của chúng có rất nhiều phần cơ thể và mắt cá con của các loài cá khác. Dạ dày của cá phình to hình chữ U và co giãn được, ruột cá Tra ngắn, không gấp khúc lên nhau mà dính vào màng treo ruột ngay dưới bóng khí và tuyến sinh dục, là đặc điểm của cá thiên về ăn thịt. Cá lớn thể hiện tính ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi loại thức ăn. Trong điều kiện thiếu thức ăn, cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật. Trong ao nuôi cá Tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn khác nhau như cám, rau, động vật đáy. Khi phân tích thức ăn trong ruột cá đánh bắt ngoài tự nhiên, cho thấy thành phần thức ăn khá đa dạng, trong đó cá Tra ăn tạp thiên về động vật. Cá Tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài. Cá ương trong ao sau 2 tháng đạt chiều dài 10 - 12cm. Từ khoảng 2,5kg trở đi, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với tăng chiều dài cơ thể. Cỡ cá trên 10 tuổi tự nhiên (ở Cam-pu-chia) tăng trọng rất ít. Cá Tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm hoặc có mẫu cá dài tới 1,8m. Độ béo Fulton của cá tăng dần theo trọng lượng và nhanh nhất ở những năm đầu, cá đực thường có độ béo cao hơn cá cái và độ béo thường giảm đi khi vào mùa sinh sản (Nguyễn Chung, 2007). 6
  18. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. 1.1.2. Các đặc điểm hóa học của cá. Thành phần hóa học của cá phụ thuộc vào vùng đánh bắt vào thời gian trong năm và độ lớn của cá. Thành phần hóa học của cơ thịt cá gồm có nước, protein, lipid, glucid, muối vô cơ, vitamin, enzyme, hormone. Với thành phần hóa học của da cá: nước 60 - 70%, một ít chất vô cơ còn chủ yếu là protein và chất béo. Protit của da cá gồm nguyên keo, elastin, keratin, albulin, albumin trắng và albumin đen. Da cá dùng để nấu keo (Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm, 2013). Thành phần hóa học của vây cá: tương tự như xương sụn, protein trong vây cá chủ yếu là chondromucoid, collagen, chondroalbumin, đối với vây cá sau khi chế biến các chất tan phân ly thành arginin, histidin và lysine chiếm 1/3 tổng lượng acid amin. Thường lấy vây đuôi, bụng, ngực của một số loài cá nhám để đem chế biến thành sản phẩm vây cá. (Phạm Đình Dũng, Trần Văn Lâm, 2013). Thành phần hóa học của xương cá: xương cá được chia làm hai nhóm, đó là xương cứng và xương sụn. - Xương sụn gồm: thành phần chủ yếu là protein phức tạp, keo và albumin; chất vô cơ nhiều nhất là Na, Ca, K, Mg, Fe Các acid amin cấu tạo thành protein trong xương sụn chủ yếu là acid amin tính bazơ như arginin, histidin, lysin (Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm, 2013). - Xương cứng gồm: lượng chất hữu cơ và vô cơ tương đương, muối vô cơ chủ yếu là Ca3(PO4)2 ngoài ra còn có CaCO3, Ca(OH)2, (Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm, 2013). Thành phần hóa học của bong bóng cá: chủ yếu là collagen, dùng để nấu keo hoặc phơi khô làm dược phẩm (Viện Cisdoma, 2005). 7
  19. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong cá Tra (trên trọng lượng khô). Chỉ tiêu Kết quả Protein thô (%) 46 N (%) 7,36 Đạm amin (%) 0,56 K2O (%) 1,07 P2O5 (%) 6,33 Nguồn: Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013). Bảng 1.2. Thành phần có trong phế phẩm fillet cá Tra. Loại phân tích Kết quả Độ ẩm (%) 67,05 ± 5.13 Hàm lượng tro (%) 0,82 ± 0.31 Hàm lượng chất béo (%) 18,00 ± 1.00 Hàm lượng protein (%) 12,51 ± 10.5 Nguồn: Chaijana et al. (2010). 1.1.3. Tình hình nuôi cá Tra trong nước. Đồng bằng sông Cửu Long vốn có truyền thống nuôi cá Tra từ lâu đời. Cá Tra được nuôi phổ biến trong ao, đăng quầng, bãi bồi và nuôi lồng bè trên các con sông lớn thuộc tỉnh An Giang, Đồng Tháp.Trong những năm qua, ngành hàng cá Tra có sự phát triển nhanh chóng, đóng góp lớn cho phát triển ngành thuỷ sản nói chung cũng như phát triển kinh tế - xã hội vùng đồng bằng sông Cửu Long nói riêng. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tính đến 30/11/2016, (Bộ NN& PTNT, 2016) diện tích nuôi cá Tra thương phẩm tính đến hết tháng 11/2016 đạt 4.552 ha, sản lượng đạt 1,047 triệu tấn. Ước tính diện tích nuôi cả năm có thể đạt gần 5.000 ha, sản lượng ước đạt 1,2 triệu tấn (tăng 9% so với 2015). Ước tổng giá trị xuất khẩu năm 2016 đạt 1,67 tỷ USD, tăng 6,6% so với năm 2015. Kết quả điều tra tại các nhà máy chế biến, phần phụ phẩm và phế phẩm như: xương, da, thịt vụn, nội tạng, mỡ, dè cá, tăng tỷ lệ thuận với lượng fillet xuất 8
  20. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. khẩu. Hầu hết các ngành thủy sản chỉ sử dụng phần thịt cá khoảng 40% trọng lượng cá, phần còn lại là phụ phế phẩm từ cá chiếm khoảng 50% - 60% tổng trọng lượng cá (DGAF – Tổng cục thủy sản Jakarta,2013). Theo ước tính, mỗi năm ngành công nghiệp cá sau khi chế biến fillet có khoảng 75% tổng trọng lượng cá được xuất khẩu còn lại 25% tổng trọng lượng vẫn giữ nguyên phụ phế phẩm ở dạng da và xương bị loại bỏ tương đương khoảng 21,72 triệu tấn (FAO, 2014). Mặc dù, phần phụ phế phẩm này là một nguyên liệu tuyệt vời cho việc chuẩn bị các sản phẩm có giá trị cao bao gồm thực phẩm protein. Chất thải của cá là một nguồn protein tốt (Arnesen và Gildberg, 2006), nhưng rất lớn lượng chất thải vẫn đang được loại bỏ không có nhiều nỗ lực để phục hồi protein của nó (Kristinsson và Rasco, 2002). Theo nghiên cứu của Nesse và cộng sự (2011) sản phẩm thủy phân protein được tạo ra từ các protein cá có khả năng bổ sung dinh dưỡng tốt vì hợp chất có hoạt tính sinh học, dễ dàng hấp thụ và được sử dụng cho các hoạt động trao đổi chất khác nhau. Ngoài ra, sản phẩm thủy phân protein cá còn có những đặc tính quan trọng khác như khả năng giữ nước, khả năng hấp thụ dầu, khả năng hòa tan protein, hoạt động keo hóa, khả năng tạo bọt và khả năng nhũ hóa (Chalamaiah et al., 2010). Do đó, nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn phụ và phế phẩm này là một yêu cầu cấp thiết nhằm gia tăng giá trị sử dụng của cá da trơn và giữ gìn môi trường sống của cộng đồng. 1.2. Giới thiệu về cây dứa. - Tên gọi khác: Thơm, khóm. - Tên tiếng Anh: Pineapple. - Tên khoa học: Ananas comosus (L.) Merr. Hiện nay, trên thế giới dứa là một loại cây trồng phổ biến. Khoảng 90% sản lượng dứa của thế giới được trồng ở các nước đang phát triển và xuất khẩu tới các nước phát triển EU (Anh, Bỉ, Đức, ), Mỹ, Nhật Bản, Năm 2004 tổng cộng có gần 130 quốc gia xuất khẩu dứa. Mặt hàng dứa tươi chiếm vị trí đầu trong cơ cấu sản phẩm quả tươi trên thị trường (trên 50%, theo số liệu của FAO 2004), trong đó phần lớn là dứa Cayenne. Dứa là một trong những loại cây ăn quả quan trọng trên 9
  21. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. thế giới đứng hàng thứ 3 sau chuối và cây có múi, với tổng sản lượng dứa đạt 20 triệu tấn/năm. Trong đó, châu Á chiếm 50% sản lượng, châu Mỹ chiếm khoảng 33% sản lượng tại Việt Nam, dứa được trồng khắp từ Bắc đến Nam, trên diện tích khoảng 40.000 ha, với sản lượng trên 500.000 tấn/năm, 90% diện tích tập trung ở phía Nam. Các tỉnh có diện tích trồng dứa lớn gồm: Tiền Giang (14.800 ha), Kiên Giang (10.000ha), Hậu Giang (gần 1.600 ha), Long An (1.000 ha) (Theo Mai Thành Phụng, Trưởng Bộ phận Thường trực phía Nam - Trung tâm khuyến nông quốc gia, báo Công an nhân dân 2013). Các giống dứa (thơm) và vùng trồng tại Việt Nam gồm: Nhóm hoàng hậu (Queen), nhóm Cayen (Cayenne), nhóm dứa Tây Ban Nha (Spanish). Thực tế cho thấy lượng phế phẩm (lõi và vỏ dứa) luôn là một vấn đề đối với các nhà máy chế biến bởi cho đến nay chúng ta vẫn chưa có hướng xử lý thích hợp đối với lượng phế phẩm chiếm đến 2/3 tổng khối lượng nguyên liệu đầu vào này. Cứ 1 tấn dứa đưa vào trong quy trình chế biến dứa đông lạnh cho ra 0,25 tấn chính phẩm và 0,75 tấn phụ phẩm, tức là cứ 4kg dứa nguyên liệu sau khi chế biến cho ra 1kg dứa thành phẩm; một tấn dứa đưa vào quy trình đóng hộp cho ra 0,35 tấn chính phẩm và 0,65 tấn phụ phẩm (Phạm Thị Hồng, 2013). Phụ phế phẩm dứa chiếm 71,14% khối lượng của dứa trong đó vỏ quả chiếm 51,94%. Đây là nguồn quan trọng để thu nhận enzyme Bromelain một dạng enzyme protease (Phạm Thị Hồng, 2013). Hoạt tính protease có trong tất cả các phần phụ phẩm và ở vỏ dứa là 0,4236 U/g (Lại Thị Ngọc Hà, 2009). 10
  22. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Bảng 1.3. Tỷ lệ khối lượng, hàm lượng chất khô tổng số và hoạt lực protease các phần quả dứa. Tỷ lệ khối lƣợng Chất khô tổng số Hoạt lực protease Bộ phận (%) (%) (U/g) Chồi ngọn 2,11 10,37 0,6170a Vỏ 51,94 13,12 0,4236b Lõi quả 4,16 11,30 0,2804c Thịt quả 28,86 14,70 0,2238d Lá 12,93 Nguồn: Lại Thị Ngọc Hà (2009). 1.3. Giới thiệu về enzyme Bromelain. 1.3.1. Đặc điểm enzyme Bromelain. Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein và nhiều ứng dụng trong y học và thực phẩm. Bromelain là một hỗn hợp protease thiol có trong thực vật họ Bromeliaceae trong đó có cây dứa (Hebbar et al., 2008). Trong y học, Bromelain có thể ngăn chặn tăng huyết áp, tình trạng máu vón cục, xơ vữa động mạch, các cơn đau tim và đột quỵ, trị viêm họng, giảm các triệu chứng dị ứng và can thiệp vào sự tăng trưởng của các tế bào ác tính, hữu hiệu trong việc chữa lành vết thương, giảm chứng phù, chứng viêm khớp và tăng cường hấp thu thuốc (Tochi et al., 2008). Trong công nghiệp thực phẩm, Bromelain được sử dụng như một tác nhân làm mềm thịt; thủy phân gan bò; làm đông tụ sữa; phá đục bia; thủy phân protein gluten trong sản xuất bánh mỳ làm khối bột nhào mềm dẻo hơn, tăng hương và chất lượng bánh (Lê Thanh Mai và Nguyễn Kiêu Hùng, 2005; Rabeloet al, 2004; Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004; Lê Ngọc Tú, 2004). Bromelain có mặt trong phế phụ phẩm của dứa như lõi, chồi, vỏ và lá. Phần phế phụ phẩm này chiếm một tỷ lệ lớn của lượng dứa nguyên liệu đưa vào chế biến, khoảng 70% (Nguyễn Bá Mùi, 2002). Trên thế giới nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành chiết tách, tinh sạch Bromelain từ phế phụ phẩm bằng nhiều cách khác 11
  23. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. nhau như kết tủa bằng amoni sulfat, sắc kí trao đổi ion, đông khô, sấy phun (Devakateet al., 2009; Evens, 2006); tách bằng dùng màng ái lực cố định kim loại (immobilizedmetal affinity membrance) (Huali et al., 2008), chiết hai pha lỏng - lỏng (Ravindra et al., 2008), nhiều chế phẩm thương mại đã ra đời. Tuy nhiên, ở Việt Nam, một đất nước nhiệt đới có sản lượng dứa lớn, việc tách Bromelain từ phế phụ phẩm tạo chế phẩm thương mại ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm chưa nhiều (Lại Thị Ngọc Hà, 2009). Bromelain chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6 – 8. Bromelain có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây họ Sung (Nguyễn Ích Tuấn, 2014). 1.3.2. Tính chất enzyme Bromelain. Thành phần chủ yếu của Bromelain có chứa nhóm sulfhydryl thủy phân protein. Trong dịch chiết Bromelain còn có chứa một ít peroxidase, acid phosphatase và chất cản protease.  Cấu tạo hóa học của Bromelain. Polypeptide của Bromelain trích từ thân cây dứa có acid amin đầu –NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với Bromelain quả, acid amin đầu –NH2 là alanine (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Hình 1.2. Cấu trúc sợi hydrate carbon của Bromelain. Nguồn: Nguyễn Đức Lượng (2004). 12
  24. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Khi phân tích cấu trúc bậc một của enzyme Bromelain Murachi và Busan nhận thấy cách sắp xếp acid amin trong phân tử Bromelain như hình 1.3 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Hình 1.3. Trình tự acid amin trong phân tử Bromelain. Nguồn: Nguyễn Đức Lượng (2004).  Hoạt tính phân giải của Bromelain. Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của Bromelain trong thân cao hơn trong quả xanh và quả chín. Bảng 1.4. Hoạt tính phân giải casein của Bromelain. Hoạt tính phân giải casein (UI/mg) Cơ chất Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelain quả chín Casein 7,4 4,0 3,0 Nguồn: Nguyễn Đức Lượng (2004). Nghiên cứu khả năng phân giải cơ chất nhân tạo Benzoyl - L - Arginine amide (BAA) của Bromelain (Nguyễn Đức Lượng, 2004) cho biết Bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải cao (9,1 UI/mg) hơn trong thân (7,2 UI/mg) và quả chín (3,7 UI/mg). Bảng 1.5. Hoạt tính phân giải Benzoyl – L – Arginine amide (BAA) của Bromelain. Hoạt tính phân giải BAA (UI/mg) Cơ chất Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelain quả chín BAA 3,7 9,1 7,2 Nguồn: (Nguyễn Đức Lượng (2004). 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng của enzyme Bromelain. Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, Bromelain chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: loại cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion 13
  25. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. kim loại, thời gian phản ứng một số nhóm chức của enzyme và độ tinh khiết của enzyme  Ảnh hưởng bởi cơ chất: Trên những loại cơ chất khác nhau, Bromelain có hoạt tính khác nhau. Nếu là cơ chất hemoglobin thì khả năng phân giải của Bromelain mạnh hơn papain 4 lần. Nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của Bromelain tương tự papain. Đối với các cơ chất tổng hợp như: BAA (Benzoyl – L – Arginine amide), BAEE (Benzoyl – L – Arginine ethyl ester) thì khả năng phân giải của Bromelain yếu hơn papain (Nguyễn Đức Lượng, 2004).  Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme bị mất hoạt tính trên 700C. Nhiệt độ của phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố đặc biệt là thời gian phản ứng. Thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004).  Ảnh hưởng của pH: Khi thu nhận Bromelain, nếu dùng tác nhân kết tủa của amonium sulfate hoặc molypdeum carbonate thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH 4,8 và ổn định ở pH 4,6 – 5,4. Bromelain thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6,0 và pH 8,0, ổn định ở pH 3,5 – 5,6 với nhiệt độ 63 . Enzyme Bromelain đã tinh sạch chỉ còn lại 60 - 70% hoạt tính (Nguyễn Đức Lượng, 2004).  Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Bromelain và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ muối (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế Bromelain do chúng kết hợp với nhóm –SH của trung tâm phản ứng của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 14
  26. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. 1.4. Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc trong việc sử dụng enzyme protease thủy phân protein cá. Việc sử dụng các enzyme protease để thủy phân protein phụ phẩm cá đã được ứng dụng rất phổ biến trên thế giới do những ưu điểm là rút ngắn được thời gian cho quá trình sản xuất, tăng lượng protein không hòa tan chuyển thành protein hòa tan và tận dụng được các nguồn phụ phế phẩm của cá. Trong điều kiện thủy phân thích hợp, các mô cá được biến đổi nhanh chóng thành chất lỏng. Phản ứng thủy phân thường bao gồm 2 bước: bước đầu là những phân tử enzyme kết hợp với protein của cơ chất và bước 2 là sự thủy phân xảy ra dẫn tới sự phóng thích các polypeptide và acid amin tự do (Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm, 2013). Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn Bao gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (Protein nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy (Protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất trong quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và trong y học. Có thể thu nhận protease từ nhiều loài vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc. Hiện nay trên thế giới sản xuất khoảng trên 600 tấn protease tinh khiết từ vi sinh vật, trong đó có 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Nhịp độ sản xuất enzyme vi sinh vật ở quy mô công nghiệp ở các nước phát triển tăng trung bình hàng năm từ 5 - 15% và doanh thu sản xuất hàng năm ở các nước này khoảng 1,5 tỉ USD. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến nhất trên thế giới hiện nay là Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đan Mạch, Đức, Áo, Các nước này đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng các chế phẩm protease của vi sinh vật. Nguồn nguyên liệu rất dồi dào để sản xuất enzyme nói chung và protease nói riêng. Người ta sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da, Dùng protease để thủy phân protein thường ít 15
  27. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. bị hao hụt acid amin so với dùng phương pháp hóa học. Thủy phân protein bằng acid thường mất 10 - 25% các acid amin như tryptophan, tyrosin, cystein, arginin, histidin, serin, treonin. Theo Winarno và Hwa (1964), khi sử dụng enzyme papain với nồng độ 4% để thủy phân phụ phế phẩm cá da trơn trong điều kiện nhiệt độ tối ưu là 600C, pH =5, và thời gian thủy phân là 48 giờ. Sản phẩm thủy phân chứa hàm lượng protein cao nhất là 39,03%. Theo Diniz (1998), khi sử dụng enzyme endopeptidase từ vi khuẩn để thủy phân mô thịt cá mập (Squalus acanthias) trong 2 giờ thì lượng N thu được 76,2%. Điều kiện để thủy phân tốt nhất là nhiệt độ 550C, pH = 8 với tỷ lệ enzyme là 40 mg/g cơ chất và hiệu suất thủy phân 18,6%. Theo Salwanee và cộng sự (2013) khi sử dụng enzyme Alcalase thủy phân protein của nội tạng cá ngừ ở điều kiện nhiệt độ 40 trong thời gian 240 phút, pH 8 với nồng độ enzyme 1,5% thì hàm lượng protein thu được khá cao từ phụ phẩm nội tạng cá ngừ là 78,17 2,91% và hàm lượng chất béo thấp 0,23 0,15%. Dong (2005), khi sử dụng enzyme papain để thủy phân cá mối dài thì sản phẩm thủy phân chứa 84,7% protein thô, 7,1% tro và 3,5% mỡ. Sản phẩm thủy phân chứa 20 loại acid amin, trong đó tỷ lệ của 8 loại acid amin thiết yếu chứa 41,5% lượng acid amin. Bhaskar và Mahendrakar (2008), khi sử dụng enzyme Alcalase thủy phân chất thải nội tạng của cá Hô (Catla catla) thì kết quả cho thấy tỷ lệ enzyme là 1,5% (v/w), pH 8,5, nhiệt độ 500C và thời gian thủy phân trong 135 phút là điều kiện tối ưu để có được mức độ thủy phân cao khoảng 50%. Theo Mahmoudreza và cộng sự (2009), khi sử dụng enzyme Alcalase để thủy phân protein của nội tạng cá tầm trắng ở điều kiện nhiệt độ 500C trong thời gian 120 phút thì sản phẩm thủy phân có hàm lượng protein khá cao (66,43%), lipid thấp (1,34%) và hàm lượng amino acid cao. 16
  28. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Theo See (2011), khi dùng enzyme Alcalase với hàm lượng 2,5% để thủy phân da cá hồi trong điều kiện nhiệt độ 55,30C, pH = 8,39 cho hiệu suất thủy phân cao nhất (77,03%). Sản phẩm thủy phân chứa hàm lượng protein cao (89,53%). Theo Muzaifa và cộng sự (2012), khi sử dụng enzyme Alcalase và Flavourzyme thủy phân phụ phẩm cá thì kết quả cho thấy, sử dụng Alcalase tạo ra lượng protein nhiều hơn (82,66%) so với 73,5% khi dùng Flavourzyme. Bên cạnh đó thì độ tan, độ tạo bọt của sản phẩm thủy phân khi dùng Alcalase cũng tốt hơn khi dùng Flavourzyme. Theo Bagus Sediadi Bandol Utomo và cộng sự (2014), nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra là 600C, pH 5, enzyme papain nồng độ là 4% (w/w) và thời gian thủy phân là 48 giờ. Kết quả thu được hàm lượng protein cao nhất của sản xuất theo điều kiện tối ưu là 39,03%. Theo Nguyễn Thị Nếp (2005), tỷ lệ enzyme protease từ B. subtilis S5 sử dụng để thủy phân với cơ chất là phụ phẩm đầu xương cá da trơn đạt hiệu quả cao là 2,5 - 3%, nhiệt độ thủy phân thích hợp là 500C, pH = 8 và trong thời gian là 10 giờ, hiệu suất thủy phân cao nhất là 25,68%. Theo Đặng Thị Mộng Quyên (2006) và Trần Thị Xô (2006), để thủy phân cá phèn, cá ngân dạng cá phế liệu thu được sau công đoạn fillet bằng phương pháp thủy phân kết hợp, thủy phân bằng enzyme trước, thủy phân bằng acid sau. Trong đó, sử dụng chế phẩm enzyme protease từ vi khuẩn B. subtilis C10. Kết quả với điều kiện thủy phân bằng enzyme tỷ lệ muối 3%, tỷ lệ dịch chiết enzyme 20% (dạng lỏng), tỷ lệ nước 30%, nhiệt độ 500C, điều kiện thủy phân bằng acid tỷ lệ muối 3%, 0 nhiệt độ thủy phân 90 C, thể tích HCl 7N là 20%, trung hòa bằng Na2CO3 20% cho hiệu quả thủy phân cao. Dịch đạm thu được có hàm lượng đạm tổng số 39 g/l, đạm formol 21,6 g/l, đạm amoniac 3,95 g/l. Dương Thị Hương Giang (2006), sử dụng enzyme papain thô ly trích trực tiếp từ mủ đu đủ để thủy phân bánh dầu đậu nành tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi. Kết quả thí nghiệm cho thấy điều kiện tối ưu cho enzyme papain trên cơ chất bánh dầu đậu nành là nhiệt độ 550C và pH = 7. Với tỉ lệ 17
  29. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. enzyme/cơ chất là 0,75/100 (w/w), hoạt tính đặc hiệu của enzyme là 91,12 IU/mg, thời gian thủy phân là 24 giờ cho hiệu suất thủy phân cao nhất 11,8%. Lê Công Toàn (2007), phối trộn phế phẩm cá và mùn cưa theo các tỷ lệ 4 cá : 1 mùn cưa; 3 cá : 1 mùn cưa và 9 cá : 4 mùn cưa sau đó phun chế phẩm PMET vào các mẫu đã phối trộn với liều lượng 1 lít/m3 và đem ủ kị khí. Trong quá trình ủ có đảo trộn và phun PMET định kỳ. Kết quả cho thấy các mẫu phân phối rộng theo tỷ lệ 3 : 1 và 9 : 4 đều đạt tiêu chuẩn quy định trong sản xuất phân bón về hàm lượng chất hữu cơ và acid humic. Tuy nhiên cũng có một vài chất không đạt như hàm lượng kali vì vậy các tác giả khuyến cáo cần bổ sung thêm chất này trong quá trình ủ phân. Võ Thị Hạnh (2009) đã nghiên cứu chế phẩm sinh học từ trùn quế để làm thức ăn cho gia súc, gia cầm, làm phân bón cho cây Một ưu điểm nổi trội của các chế phẩm này là vẫn giữ nguyên mùi trùn tươi, các chất dinh dưỡng không bị mất đi hoặc biến chất theo thời gian. Chế phẩm BIO-BL, đã được dùng để bón cho cây trà ô long và một số cây hoa màu, cây kiểng Kết quả sau khi sử dụng cho thấy búp trà tươi, màu sắc đẹp hơn, mùi hương của trà cũng thơm hơn. BIO-BL được tạo thành từ trùn quế tươi phối trộn với hỗn hợp vi sinh vật hữu ích và enzyme dùng trong trồng trọt, lên men tạo sản phẩm có mùi trùn, giàu đạm protein và amin cao, enzyme tiêu hóa có hoạt lực cao, vi khuẩn có lợi. Nhóm tác giả cho biết ưu điểm của phương pháp chế biến trùn quế bằng công nghệ vi sinh là không cần dùng thiết bị đông lạnh hay thiết bị sấy nên không tốn chi phí điện, năng lượng, đem lại hiệu quả kinh tế cao. Với công nghệ đơn giản, các hộ nông dân ở các vùng xa xôi có thể áp dụng dễ dàng. Việc có thêm các chế phẩm sinh học mới có giá thành rẻ góp phần làm cho ngành chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và trồng trọt phát triển tốt hơn. Hiện nay, để xử lý các loại phế phẩm nông nghiệp, rác thải sinh hoạt thì có các chế phẩm như BIMA (Trichoderma), Active cleaner (xạ khuẩn Streptomyces sp nấm Trichoderma sp, vi khuẩn Bacillus sp) được sử dụng để ủ phân gia súc, chất thải hũu cơ như rơm, rạ, rác thải sinh hoạt hữu cơ (đã tách riêng rác vô cơ). Việc sử 18
  30. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. dụng chế phẩm có thể giúp rút ngắn thời gian ủ hoai phân chuồng, phân xanh, rác từ 2 - 3 lần so với cách ủ thông thường. Theo Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013), sử dụng enzyme Alcalase thủy phân phụ phẩm cá Tra trong điều kiện pH = 8, nhiệt độ 650C và thời gian là 120 phút. Sản phẩm chứa hàm lượng protein cao (N tổng số 1,94% và N formol 12,13%). 1.5. Quá trình thủy phân cá. Là quá trình tác dụng của hệ enzyme protease trong bản thân cá hoặc bên ngoài tác động vào thủy phân thịt cá từ dạng protein qua các dạng trung gian như pepton, polypeptide, peptide và cuối cùng là acid amin. Enzyme phân giải Polipeptide peptidase Protein Acid amin Protein ngoại bào Oligopeptide Các acid amin nội bào Khử amin và phân giả i Khử amin Chuyển amin và Trực tiếp sử dụng mạch carbon phân giải carbon trong quá trình sinh tổng hợp protein Hình 1.4. Quá trình thủy phân cá. Nguồn: Bên cạnh quá trình thủy phân protein là chủ yếu còn có sự thủy phân của đường và chất béo thành các acid hữu cơ, rượu Quá trình thủy phân protein trong thịt cá chủ yếu là do enzyme tác dụng nhưng cũng có thể có sự tham gia của vi sinh vật. Những vi sinh vật hữu ích tiết ra protease thúc đẩy cho quá trình thủy phân nhưng các vi sinh vật gây thối thì có tác dụng làm rữa nát thịt cá có khi ở ngay giai đoạn đầu hay trong quá trình chế biến. 19
  31. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Quá trình thủy phân tiếp tục là quá trình thối rữa do vi sinh vật gây thối thủy phân acid amin thành các chất cấp thấp như: indol, phenol và các loại acid có đạm và acid béo thủy phân thành H2S, NH3, CO2, (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990). 1.5.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá.  Ảnh hưởng của pH. pH có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng của protease. Enzyme có pH tối thích khác nhau nếu chúng có nguồn gốc khác nhau. Nói chung, pH tối thích đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hoặc trung tính. Protease acid có pH tối thích 4,0 - 5,5. Protease kiềm có pH tối thích từ 9,0 - 11 trong khi pH tối thích của protease trung tính là 5,5 - 7,2 (Phạm Thị Hải Ân, 2011).  Ảnh hưởng của thời gian thủy phân. Thời gian thủy phân là yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến chất lượng của kết quả thủy phân. Quá trình thủy phân nhiều giờ sẽ gây giảm số lượng peptide và acid amin (Pigott và Tucker, 1990).  Ảnh hưởng của bản thân nguyên liệu. Thủy phân hai loại cá gồm cá béo và cá không béo có nhiều mỡ và không mỡ bằng enzyme thủy phân là papain được bổ sung 5% so với lượng cá. Kết quả là các loại cá không hoặc ít béo đã cho hàm lượng protein trong nước bổi cao hơn so với cá có mỡ và khi chế biến thì mỡ thường nổi lên trên (Nguyễn Đình Khôi, 2003 trích trong Mackie, 1982).  Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất. Tốc độ phản ứng của protease tỉ lệ thuận với nồng độ phức chất trung gian. Nồng độ enzyme/cơ chất càng cao, tốc độ phản ứng càng lớn. Khi toàn bộ lượng enzyme trong phản ứng đều tham gia vào phức enzyme/cơ chất, tốc độ sẽ đạt cực đại. Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ enzyme, khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng cũng tăng. Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì dù có tăng nồng độ enzyme lên thì tốc độ phản ứng vẫn không thay đổi (Phạm Thị Hải Ân, 2011). 20
  32. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa.  Ảnh hưởng của nhiệt độ. Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, tốc độ phản ứng enzyme càng tăng khi tăng nhiệt độ. Do enzyme có bản chất là protein nên khi tăng nhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm do sự biến tính của protein. Tại giá trị mà nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng cực đại gọi là nhiệt độ tối thích. Nhiệt độ mà tại đó enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn. Nhiệt độ quá thấp cũng làm giảm hoạt tính của enzyme nhưng không làm biến tính enzyme, vì vậy khi đưa nhiệt độ trở lại điều kiện thích hợp thì hoạt tính của enzyme lại được phục hồi. Các enzyme mang hoạt tính proteolytic có nguồn gốc khác nhau thì khác nhau về nhiệt độ tối thích (Phạm Thị Hải Ân, 2011).  Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa. Hoạt động của một số enzyme mang hoạt tính proteolytic phụ thuộc vào sự có mặt của các ion kim loại và một số hợp chất khác. Trong đó, một số chất có tác dụng làm tăng tính hoạt động, số khác lại có tác dụng kìm hãm hoạt động của các enzyme (Phạm Thị Hải Ân, 2011).  Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung vào hỗn hợp enzyme/cơ chất. Nước không những là môi trường để khuếch tán hỗn hợp enzyme/cơ chất mà còn là tác nhân tham gia vào phản ứng. Nước không những ảnh hưởng đến vận tốc mà còn ảnh hưởng đến chiều hướng của phản ứng thủy phân từ enzyme (Phạm Thị Hải Ân, 2011). Nhờ có nước bổ sung thêm vào hỗn hợp enzyme/cơ chất, enzyme protease chuyển protein thành các thể trung gian như pepton, polypeptide đến các dạng acid amin (Phạm Thị Hải Ân, 2011). Thông thường, các enzyme protease hoạt động mạnh trong điều kiện muối nhạt. Ngoài ra, nước còn làm cho nhiệt độ phân phối đều nguyên liệu làm chúng mau nát (Lương Hữu Đồng, 1975). Bổ sung thêm nước tạo môi trường lỏng giúp cho enzyme và vi sinh vật tốt hỗ trợ quá trình thủy phân hoạt động được dễ dàng, làm cho tế bào thịt cá được thủy phân nhanh chóng và dễ dàng. 21
  33. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Lượng nước cho vào nếu ít quá thì tác dụng thủy phân của enzyme kém nhưng nếu nhiều quá thì không khống chế được quá trình thối rữa gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Lượng nước bổ sung vào tùy thuộc vào đặc điểm của nguyên liệu, thông thường từ 20 - 30% có khi tới 40 - 200% so với nguyên liệu là cá (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990). Theo Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013) tỷ lệ cá : nước tối ưu nhất được sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme Alcalase làm phân bón cho một số loại rau trong nhà màng là tỷ lệ 1 : 1.  Ảnh hưởng của vi khuẩn. Mật số vi khuẩn khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân. Mật số vi khuẩn cao sẽ thúc đẩy tốc độ thủy phân cơ chất nhanh hơn. Khi mới đưa vào môi trường thủy phân, đây là giai đoạn vi khuẩn làm quen với môi trường và chuẩn bị cho sự tăng trưởng, hoạt động vượt bậc sau đó. Khi đã quen với môi trường mới, vi khuẩn bắt đầu nhân mật số lên với tốc độ rất nhanh theo cấp số nhân. Đến một lúc nào đó mật số vi khuẩn không tăng thêm mà giữ ổn định ở một mức trong thời gian nhất định (Phan Thiên Tùng, 2006 trích trong Nguyễn Hữu Thanh và Nguyễn Thị Thanh Xuân, 2003).  Ảnh hưởng diện tích tiếp xúc Khi thời gian thủy phân bằng enzyme, yếu tố quan trọng để thúc đẩy quá trình thủy phân là diện tích tiếp xúc. Để tạo điều kiện tốt hơn cho sự thủy phân của enzyme làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, muốn vậy phải làm nhỏ kích thước cơ chất là phế liệu cá trước khi thủy phân (Nguyễn Xuân Dung, 2006). 1.6. Tình hình sản xuất rau quả ở Việt Nam. Rau là một trong những cây thực phẩm quan trọng, là loại thức ăn cần thiết không thể thiếu được trong bữa ăn hàng ngày. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đến hết tháng 5/2018, kim ngạch xuất khẩu hàng rau quả ước đạt 1,7 tỷ USD, tăng 19,7% so với cùng kỳ năm 2017.Trong thời gian qua, nhất là kể từ đầu thập kỷ 90, diện tích rau, quả của Việt Nam phát triển nhanh chóng và ngày càng có 22
  34. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. tính chuyên canh cao. Tính đến năm 2004, tổng diện tích trồng rau, đậu trên cả nước đạt trên 600 nghìn ha, gấp hơn 3 lần so với năm 1991. Nguyên nhân là trong một thời gian khá dài, từ cuối thập niên 1990, đầu thập niên 2000, việc xuất khẩu mặt hàng rau quả tăng trưởng rất chậm. Từ năm 2007 trở lại đây, việc xuất khẩu mặt hàng này bắt đầu khởi sắc khi tốc độ tăng trưởng nhanh hơn bình quân 20 - 25% năm. Nếu như năm 2007 kim ngạch xuất khẩu rau quả chỉ đạt 305 triệu USD, thì đến năm 2012 tăng lên 770 triệu USD. Những tháng đầu năm 2013 kim ngạch xuất khẩu đạt 187 triệu USD, tăng 10% so với cùng kỳ năm 2012. Như vậy, có thể thấy vị trí quan trọng của cây rau trong đời sống và đối với nền kinh tế. Tuy nhiên, năng suất rau của nước ta còn thấp, chỉ bằng 87% so với trung bình của thế giới. Chất lượng rau chưa đảm bảo tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm đang là vấn đề bức xúc của xã hội. Sản xuất rau an toàn hiện nay đang là vấn đề được hầu hết các địa phương quan tâm. Các tỉnh đều đã xây dựng chương trình sản xuất rau an toàn. Tuy nhiên, tình hình ngộ độc thức ăn do rau gây ra vẫn thường xuyên xảy ra và là mối lo ngại cho người tiêu dùng. 23
  35. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Bảng 1.6. Tình hình xuất khẩu rau quả của Việt Nam. Số liệu thống kê sơ bộ của Tổng cục Hải quan về xuất khẩu rau quả tháng 1/2017. ĐVT: USD. Thị trƣờng T1/2017 T1/2016 +/- (%) T1/2017 so với T1/2016 Tổng kim ngạch 233.530.579 199.394.533 +17,12 Trung Quốc 174.159.938 144.198.656 +20,78 Hoa Kỳ 8.234.965 7.828.016 +5,20 Nhật Bản 6.016.562 4.681.718 +28,51 Thái Lan 5.740.865 5.340.835 +7,49 Hàn Quốc 5.622.149 5.762.318 -2,43 Malaysia 4.543.059 2.991.020 +51,89 Nga 3.145.657 1.465.340 +114,67 Hà Lan 3.092.631 3.767.772 -17,92 Singapore 2.963.314 2.081.142 +42,39 UAE 2.577.025 1.523.722 +69,13 Đài Loan 1.942.757 2.715.490 -28,46 Australia 1.942.372 2.425.807 -19,93 Canada 1.365.596 1.468.010 -6,98 Pháp 1.095.929 810.332 +35,24 Hồng Kông 902.871 930.670 -2,99 Đức 892.943 1.022.720 -12,69 Lào 759.148 360.295 +110,70 Anh 629.575 859.811 -26,78 Indonesia 153.969 274.401 -43,89 Italia 141.791 282.096 -49,74 Ucraina 85.000 144.633 -41,23 Campuchia 66.426 542.712 -87,76 Nguồn: 24
  36. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. 1.7. Giới thiệu về rau. 1.7.1. Giới thiệu về cây cải. Cải bẹ xanh Brassica juncea (L.). Cây thảo hằng năm, cao 40 - 60cm hay hơn, rễ trụ ít phân nhánh. Lá mọc từ gốc, hình trái xoan, tù, có cuống lá có cánh với 1 - 2 cặp tai lá; có răng không đều; các lá ở thân tiêu giảm hơn; các lá phía trên hình dải. Hoa vàng nhạt, khá lớn, cao 1,5cm, xếp thành chùm dạng ngủ. Quả cải 35mm, tận cùng bởi một mũi nhọn, dài 4 - 5mm, mở thành các van lồi, có đường gân giữa rõ. Hạt hình cầu, có mạng màu đen đen, dài 2mm. Loài của miền nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, có nhiều ở vùng Trung Á. Ở nước ta, cải xanh được trồng phổ biến khắp cả nước (Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm, 2003). Theo Đông y cải bẹ xanh có vị cay, tính ôn, có tác dụng giải cảm hàn, thông đàm, lợi khí Thành phần dinh dưỡng trong cải bẹ xanh gồm có: vitamin A, B, C, K, acid nicotic, catoten, abumin Cải bẹ xanh được các chuyên gia dinh dưỡng khuyên dùng vì có nhiều lợi ích đối với sức khỏe cũng như có tác dụng phòng chống bệnh tật ( ThS. Trần Thị Ba (2001), cải xanh trồng được trên nhiều loại đất. Tuy nhiên đất nhiều cát, trồng mùa mưa nên dùng giống chịu mưa và nếu có thể được, nên dùng rơm phủ hoặc lưới nylon che để hạn chế đất cát bắn lên lá và hạn chế sâu bệnh cỏ dại. Chuẩn bị đất kỹ tơi xốp, nhặt sạch cỏ dại tàn dư cây trồng vụ trước, phơi khô khoảng một tuần và đảo lớp mặt xuống dưới để thoáng khí cho cây trồng sinh trưởng tốt đồng thời hạn chế các sâu bệnh cư trú trong đất. Khoảng 5 - 6 tháng một lần nên xử lý đất chống sâu bệnh bằng cách bón 50 - 60 kg vôi/1.000m2 đất. Lên liếp cao 20 - 30cm trong mùa mưa để chống rễ không bị úng. Mùa khô lên liếp cạn để giữ ẩm cho cây. Tổng lượng phân bón cho 1.000m2 ruộng trồng: 500 - 1.000kg phân chuồng, 10kg Urea, 10kg super lân, 5kg KCl, 10 kg hỗn hợp 16 - 16 - 8 và 10kg DAP. 25
  37. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa.  Bón lót. Vườn ươm: lót 2 - 3kg phân chuồng hoai mục + 15g phân lân/1m2. Ruộng trồng: Toàn bộ phân chuồng + super lân + 2kg KCl. Rãi trên mặt liếp và xới trộn đều.  Bón thúc. Vườn ươm: Không cần thiết cung cấp phân, nếu cây con phát triển hơi kém có thể tưới thúc nhẹ 1 lần khoảng 10 - 15 ngày sau khi gieo bằng nước phân hỗn hợp NPK 16 - 16 - 8 pha loãng (20 - 30g/10 lít nước). Cây con 18 - 20 ngày tuổi có thể cấy, cấy từng đợt riêng cây tốt và xấu để tiện chăm sóc. Trồng ngoài đồng ruộng: Bón phân dựa theo sự sinh trưởng của cây, do cải xanh rất ngắn ngày nên chia phân ra nhiều lần tưới sẽ có hiệu quả hơn. Có thể dùng phân cá ủ pha loãng tưới thêm trong thời gian gần thu họach. Bảng 1.7. Lượng phân bón cho cải xanh. Lƣợng phân bón (kg/1.000m2) Ngày sau khi gieo Urea 16 - 16 - 8 KCl Phân chuồng 0 (Bón lót) 0 10 0 1.000 10 1 2 0 0 15 2 3 0 0 20 2 3 1 0 25 5 2 4 0 Tổng 10 20 5 1.000 Nguồn: ThS. Trần Thị Ba, Đại học Cần Thơ (2001). 1.7.2. Giới thiệu về cây đậu bắp. Đậu bắp còn có các tên khác như mướp tây, bắp còi và gôm (Abelmoschus esculentus) (Ts. Đặng Minh Quân, 2008). Thân thảo mọc thẳng đứng, nhiều lông, rỗng, cao từ 1 - 2m, phân thành nhiều nhánh, thân màu xanh đôi khi có vệt đỏ, lá màu xanh, hình tim hoặc xẻ chân vịt, mép có răng cưa lớn, có lông nhám. Có một rễ chính và nhiều rễ phụ, ăn sâu từ 40 - 50cm. Hoa mọc ở nách lá, đường kính 4 - 8cm, với 5 cánh hoa màu trắng hay vàng, thường có các đốm đỏ hay tía tại phần gốc mỗi 26
  38. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. cánh hoa. Trái xanh sáng, đôi khi có màu đỏ. Quả nang, dài 20 - 25cm, mọc dựng đứng gồm 3 - 5 vách ngăn kết với nhau tạo thành các đường gờ dọc, chứa nhiều hạt. Trong trái có 10 - 20 hạt đường kính 2 - 3mm (Nguyễn Mạnh Chinh và Phạm Anh Cường, 2007). Theo Đông Y, toàn cây có mùi thơm của Ðinh hương quả hạt, lá đều có tác dụng làm dịu, làm nhầy, lợi tiểu. Hạt có tác dụng kích thích, trợ tim và chống co thắt; nước hãm hạt rang lên có tác dụng làm ra mồ hôi. Quả xanh cắt ra từng miếng, đun nóng trong canh hay nước chấm có chất nhầy thoát ra làm thức ăn đặc và có vị chua. Hạt dùng để ăn. Khô dầu dùng làm thức ăn cho gia súc, hạt khô và rang thật kỹ được dùng thay cà phê. Dịch lá tươi giã nát dùng điều trị bệnh tăng tiết bã nhờn của da đầu và dùng đắp nhọt ( Ngoài ra, chất nhầy và chất xơ có trong đậu bắp giúp điều chỉnh lượng đường huyết bằng cách điều hoà sự hấp thu của chúng từ ruột non. Đậu bắp giúp cơ thể tái hấp thu nước. Chất nhầy trong đậu bắp “bắt giữ” những phân tử cholesterol vượt chỉ tiêu cùng những độc chất phát sinh trong quá trình chuyển hoá rồi “áp giải” chúng đến phân để thải ra ngoài. Đậu bắp chứa calories thấp nên là thức ăn lý tưởng cho những người đang muốn giảm cân. Khi vào hệ tiêu hoá đậu bắp sẽ là mảnh đất màu mỡ cho những vi khuẩn có lợi, có thể sánh ngang tầm với sữa chua, giúp tổng hợp các vitamin nhóm B. Protein và dầu có trong hạt đậu bắp được xem là protein hạng nhất trong rau cải, rất nhiều amino acid thiết yếu cho cơ thể như tryptophan (giúp tinh thần thoải mái, ngủ ngon ), cystein ( Năng suất bình quân từ 20 - 25 tấn/ha/vụ. Chúng cho thu nhập khá cao từ 60 – 100 triệu đồng/ha/vụ. Đậu bắp trồng thích hợp vào thời vụ Đông Xuân, gieo vào tháng 9 - 12, vụ Hè thu gieo tháng 5 - 6. Hiện nay trên thị trường có các giống đậu bắp như: VN1; ĐB1; TN 75 do trong nước sản xuất hoặc các giống nhập nội như: Jubilee 047; Lionseeds của Ấn Độ, Đài Loan ( Theo Trần Khắc Thi và Trần Ngọc Hùng (2005), để cây đậu bắp phát triển bình thường cần nhiệt độ trên 20 . Nhiệt độ thích hợp cho hạt nảy mầm là 30 - 35 , độ ẩm đất từ 80 - 85% và pH 5,5 - 6,8 trong suốt quá trình thu hái. Tuyệt đối không 27
  39. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. được dùng phân chuồng tươi, phân bắc tươi và nước phân tươi để bón hoặc tưới. Có thể dùng phân hữu cơ sinh học hoặc phân rác chế biến thay thế phân chuồng với lượng bằng 1/3 lượng phân chuồng. Bảng 1.8. Lượng phân bón cho đậu bắp. Tổng lƣợng phân bón Bón thúc (%) Loại Bón lót Kg nguyên Kg/sào Lần Lần Lần Lần Lần phân (%) chất/ha qui đổi 1 2 3 4 5 Phân 100 - 120 8 - 10 Urea 0 20 20 20 20 20 đạm Phân 14 supe 60 100 0 0 0 0 0 lân lân Phân 7,4 sulfat 100 30 30 30 10 0 0 kali kali Nguồn: Trần Khắc Thi và Trần Ngọc Hùng (2005).  Làm đất. Khi trồng nên chọn loại đất cát pha, thịt nhẹ, hoặc đất thịt trung bình. Đất phải bằng phẳng, dễ tưới và tiêu nước được cày bừa kỹ, làm sạch cỏ trước khi gieo. Trong mùa mưa cần lên luống 1,4 - 1,5m, mặt luống rộng 1,1 - 1,2m, chiều cao luống 25 -30cm và dốc để dễ thoát nước. Bón vôi với liều lượng 250 - 500 kg/ha. Mùa nắng cần làm đất kỹ rạch hàng và gieo theo hốc.  Bón lót. Lượng phân bón cho 1000m2: phân chuồng hoai mục 1 - 2 tấn; super lân 30kg; urê 15kg; kali clorua 10kg. Nếu đất chua cần bón 50 - 100kg vôi bột trước khi bừa ngả. Bón lót toàn bộ phân chuồng, lân, đạm, kali. Nên bón theo rãnh, dùng cuốc rạch rãnh sâu 10 - 12cm, cho phân vào rãnh, lấp đất phủ lên rồi gieo hạt vào.  Gieo hạt. Trồng hai hàng cách nhau 70 - 80cm, cây trên hàng cách nhau 40 - 50cm. Trước khi xuống hạt, phải ủ trước cho hạt nứt mầm và trộn với thuốc sát trùng dạng để 28
  40. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. tránh côn trùng cắn phá mỗi hốc gieo 2 hạt, sau đó chọn để lại 1 cây khoẻ mạnh; gieo hạt xong lấy tay xoa đất lấp kín hạt 1000m2 cần 2 - 3 kg hạt giống. Cần tưới nước thường xuyên sáng và chiều để giữ độ ẩm cho cây phát triển tốt. Đậu bắp có thể trồng xen với các loại rau ăn lá khác, xen vào hai bên mép luống. Trước khi gieo nên tưới nước sơ qua trên mặt luống cho đất ẩm sau đó gieo hạt giúp hạt nhanh nảy mầm. 1.8. Một số nghiên cứu về sử dụng phân bón trên cây trồng. Theo Neri (2002), phun phân bón lá có các thành phần hữu cơ hoặc acid humic giúp duy trì khả năng phát triển của cây ở giai đoạn cuối của quá trình sinh trưởng. Acid humic thể hiện vai trò quan trọng trong việc kích thích sự hình thành và tích lũy các sắc tố trong lá, tích lũy lượng diệp lục tố cao hơn và làm lá xanh hơn (Hancock, 1999). Nghiên cứu sử dụng phân bón lá chiết xuất từ rong biển (seaweed) của nhiều tác giả cho thấy phun seaweed làm tăng năng suất thực thu của đậu đỗ lên trung bình khoảng 24% (Temple, 1989), cho thời gian thu trái sớm hơn ở dưa leo trồng trong nhà kính (Passam và cộng sự, 1995), tăng tổng khối lượng tươi của trái cà chua trồng trong nhà kính lên 17% (Crouch và Van Staden, 1992). Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả Chen và Aviad, 1990; Fagbenro và Agboole, 1993 đều cho thấy phun các chế phẩm chứa acid humic giúp cây tăng khả năng hấp thu các nguyên tố đa và vi lượng. Theo Gopi (2005), việc xử lý Triazole đã làm tăng sự phát triển của bộ rễ ở dưa leo và từ đó làm tăng lượng Cytokinin nội sinh. Lượng Cytokinin nội sinh tăng đã dẫn đến làm tăng quá trình phân chia tế bào từ đó làm tăng khối lượng chất khô. Theo Cồ Khắc Sơn (2005) việc bổ sung phân bón lá hữu cơ sinh học (K-humate và Fish emulsion) có chiều hướng làm tăng trọng lượng trái, năng suất trái thương phẩm đối với một số loại rau. Sử dụng phối hợp giữa các loại phân hữu cơ sinh học bón gốc (Biorganic, Fish fertilizer) và phân bón lá (Fish emulsion và K-Humate) có tác dụng làm tăng năng suất trái từ 11,2 đến 11,3% đối với cây cà tím; 15 đến 18,7% với dưa leo; 15,5 đến 15,9% với khổ qua và 14,3 đến 14,9% đối với đậu đũa. 29
  41. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Công ty Hưng Trung đã sản xuất và đưa ra thị trường chế phẩm phân bón lá chiết xuất từ Trùn quế (HT5). Chế phẩm HT5 hiệu quả cao trên nhiều loại cây trồng, phù hợp với sản xuất nông nghiệp an toàn. Ngoài ra công ty còn sản xuất ra nhiều sản phẩm khác như phân hữu cơ vi sinh, hữu cơ khoáng Sở khoa học và công nghệ Đăklăk đã nghiên cứu và sản xuất phân bón lá từ trùn quế và than bùn. Sản xuất phân bón lá theo các công thức phối trộn N, P, K vi lượng, kích thích sinh trưởng cho cây lúa (5:10:5), cây ngô (8:3:3; 3:5:7) và rau (7:1:1). Phân bón lá BM05 do công ty Ban Mai sản xuất được chiết xuất từ phế thải chế biến thực phẩm động vật, có hàm lượng NPK (4:4:3); Mg: 0,5%; Cu: 0,07; Zn: 0,05; Mn: 0,02; B: 0,05 và acid amin 1500 ppm. Công ty Ni Việt có nhiều sản phẩm phân bón lá cho rau, cây ăn quả và cây công nghiệp như: Gugo-L: 3 – 0 – 10 + 10% hữu cơ và một số vi lượng B 100ppm; Mn 330 ppm; Cu 1 ppm. GRO: 30 – 10 – 10; B 100ppm; Mn 330ppm; Zn 200ppm; Cu 1ppm; Mo 12 ppm và Fe 500ppm. TC - MOBI: 18 – 2 – 20; B 250ppm; Mn 250 ppm; Zn 28 ppm; Cu 12 ppm; Fe 120ppm. Trần Thanh Dũng (2006) đã nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis thủy phân phụ phẩm cá da trơn tạo ra dịch đạm cao làm phân bón sinh học phục vụ sản xuất rau sạch và an toàn. Sử dụng dịch đạm thủy phân làm phân bón lá và phân bón viên bón cho cây hẹ. Kết quả cho thấy khi sử dụng phân bón này cho cây hẹ đã cho năng suất cao (2,61kg/m2 ) và hàm lượng nitrat thấp (281,95mg/kg rau tươi) ở nghiệm thức phân bón lá của dịch đạm thủy phân (2,54 kg rau tươi/m2). Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013) đã tạo ra 2 chế phẩm phân bón lá từ dịch thủy phân phẩm cá Tra bằng enzyme Alcalase: • Chế phẩm 1: dùng cho rau ăn lá: 5,06% N; 1,13% P2O5; 1,1% K2O; 252 ppm Fe; 209 ppm Zn; 206 ppm Mn; 107 ppm Cu; 110 ppm Bo. • Chế phẩm 2: dùng cho rau ăn quả: 3,25% N; 2,2% P2O5; 4,17% K2O; 323 ppm Fe; 109 ppm Cu; 214 ppm Zn; 317 ppm Mn; 536 ppm Bo. Trong 2 chế phẩm phân bón lá từ dịch thủy phân cá Tra có hàm lượng acid amin khá cao (3,19%). 30
  42. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa.  Đánh giá của phân bón lá chứa acid amin lên cây trồng: Shafeek et al (2016), cho biết phun phân bón lá với nồng độ acid amin 2% đã làm tăng khả năng sinh trưởng, năng xuất, khả năng tạo hạt, hàm lượng các chất trong hạt N, K, P, Tiến hành thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và trên đồng ruộng năm 2012 – 2013 để đánh giá ảnh hưởng của phân bón amino acid lên sản lượng và chất lượng của hạt lúa mì, Malgorzata et al (2018) cho biết sử dụng phân bón acid amin làm tăng rõ rệt sản lượng của cây lúa mì lên 11% và nghiên cứu còn cho biết rằng việc sử dụng phân bón acid amin làm tăng chất lượng của hạt. Vì vậy phân bón lá được khuyến khích trong sản xuất nông nghiệp. Đánh giá ảnh hưởng của phân bón acid amin lên sự phát triển và khả năng cho năng xuất cũng như là chất lượng của cây củ cải. Thí nghiệm chỉ ra rằng phun phân bón có chứa acid amin với nồng độ 500 - 700ppm đã làm tăng trọng lượng chồi, trọng lượng rễ và chiều dài của rễ cũng như hàm lượng N, K, P được tăng lên rõ rệt (Doaa et al 2015). 31
  43. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Đề tài được tiến hành từ tháng 4/2018 đến hết tháng 7/2018 tại phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng, trường ĐH Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh 2.2. Nội dung nghiên cứu. 2.2.1. Đánh giá chất lượng nguyên liệu đầu vào (phụ phế phẩm cá Tra).  Nguyên liệu: Phụ phẩm cá Tra sau fillet lấy từ nhà máy GODACO – SEAFOOD (Tiền Giang) được trộn đều và lấy ra 3 mẫu (xem như 3 lần lặp lại). Mỗi mẫu 100g đem đi xử lý sơ bộ để loại bỏ mỡ và các tạp chất, xay nhuyễn, trộn đều. Sau đó, lấy ra 5g/ mẫu để đi xác định N tổng số và protein thô.  Chỉ tiêu theo dõi: Định lượng N tổng bằng phương pháp Kjeldhal (%). Protein thô (%). Protein thô (%) = NTS x 6,25 2.2.2. Xác định hoạt tính enzyme Bromelain công nghiệpvà enzyme Bromelain có trong thành phần vỏ dứa.  Vật liệu: - Vỏ dứa lấy từ chợ TP. Hồ Chí Minh đem ép bằng máy ép trái cây để lấy dịch enzyme thô. - Enzyme Broelain công nghiệp do Viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp.  Phƣơng pháp thực hiện: Phương pháp dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzyme có trong dịch thô được ép bằng máy ép trái cây lấy nước rồi tiếp đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid triloroacetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo nên. 32
  44. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Vỏ dứa ở chợ được đem đi ép bằng máy ép trái cây lấy nước, sau đó pha loãng 10 lần để xác định hoạt tính enzyme. Theo phương pháp Anson cải tiến. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần 2 kg vỏ dứa. Đối chứng là enzyme Bromelain công nghiệp do Viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp. Cân10g enzyme Bromelain công nghiệp đem pha loãng 100 lần. Sau đó xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.  Chỉ tiêu theo dõi: - Xác định hoạt tính enzyme IU/ml, IU/mg bằng phương pháp Anson cải tiến. Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme trong thời gian 1 phút ở 37 chuyển hóa được một lượng casein tương đương 1 mol tyrosine thành dạng không bị kết tủa bởi acid trichloacetic. 2.2.3. Khảo sát hiệu quả thuỷ phân của enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain từ vỏ dứa.  Vật liệu: Vỏ dứa, enzyme Bromelain công nghiệp và phụ phế phẩm cá Tra.  Phƣơng pháp thực hiện: Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 2 nghiệm thức và lặp lại 3 lần.  Các nghiệm thức: Bảng 2.1. Bảng nghiệm thức khảo sát hiệu quả thuỷ phân của enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain vỏ dứa. Nghiệm thức Enzyme NT1 Enzyme Bromelain công nghiệp NT2 Enzyme Bromelain vỏ dứa Cách tiến hành: Dựa theo phương pháp của Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013). Nguyên liệu phụ phẩm cá Tra được xử lý sơ bộ để loại bỏ mỡ và các tạp chất, xay nhuyễn, cân vào bình tam giác 50g phụ phẩm cá Tra, cho thêm 75ml nước cất và bổ sung 0,7g enzyme Bromelain công nghiệp có hoạt tính 250 IU/g đối với NT1. Riêng đối với NT2 thì không bổ sung nước mà chỉ bổ sung 75ml dịch 33
  45. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. enzyme thô. Tiến hành thuỷ phân ở điều kiện 500C và pH = 5,5 trong thời gian 150 phút. Đến thời gian cố định, kết thúc quá trình thuỷ phân, bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thuỷ trong 15 phút, để nguội. Sau đó hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu.  Chỉ tiêu theo dõi: - Hàm lượng N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal (%). - Hàm lượng N Formol bằng phương pháp Sorensen (%). 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra.  Vật liệu: Vỏ dứa và phụ phế phẩm cá Tra và hóa chất điều chỉnh pH (NaOH 0,1N, HCl 0,1N).  Phƣơng pháp thực hiện: Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 4 nghiệm thức và lặp lại 3 lần.  Các nghiệm thức: Bảng 2.2. Bảng nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thuỷ phân cá Tra. Nghiệm thức Thời gian (phút) NT1 90 NT2 120 NT3 150 NT4 180 Cách tiến hành: Nguyên liệu phụ phẩm cá Tra được xử lý sơ bộ để loại bỏ mỡ và các tạp chất, xay nhuyễn, cân vào bình tam giác 50g phụ phẩm cá Tra, cho thêm 75ml dịch enzyme thô. Tiến hành thuỷ phân ở điều kiện nhiệt độ 500C, pH = 5,5, trong thời gian lần lượt là 90, 120, 150, 180 phút (bố trí thí nghiệm như bảng 2.2). Đến thời gian cố định, kết thúc quá trình thuỷ phân, bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thuỷ trong 15 phút, để nguội. Sau đó hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu. 34
  46. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa.  Chỉ tiêu theo dõi: - Xác định N tổng bằng phương pháp Kjeldhal (%). - Xác định N formol bằng phương pháp Sorensen (%). 2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra.  Vật liệu: Vỏ dứa, phụ phế phẩm cá Tra và hóa chất điều chỉnh pH (NaOH 0,1N, HCl 0,1N).  Phƣơng pháp thực hiện: Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 5 nghiệm thức và lặp lại 3 lần.  Các nghiệm thức: Bảng 2.3. Bảng nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân phụ phế phẩm cá Tra. Nghiệm thức Nội dung NT1 400C NT2 500C NT3 600C NT4 650C Cách tiến hành: Nguyên liệu phụ phẩm cá Tra được xử lý sơ bộ để loại bỏ mỡ và các tạp chất, xay nhuyễn, cân vào bình tam giác 50g phụ phẩm cá Tra, cho thêm 75ml dịch enzyme thô. Tiến hành thuỷ phân ở điều kiện 40 , 50 , 60 , 65 , 70 (bố trí thí nghiệm như bảng 2.3) và pH = 5,5 trong thời gian 150 phút. Đến thời gian cố định, kết thúc quá trình thuỷ phân, bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thuỷ trong 15 phút, để nguội. Sau đó hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu.  Chỉ tiêu theo dõi: - Hàm lượng N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal (%). - Hàm lượng Formol bằng phương pháp Sorensen (%). 2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của pH thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. 35
  47. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa.  Vật liệu: Vỏ dứa, phụ phế phẩm cá Tra và hóa chất điều chỉnh pH (NaOH 0,1N, HCl 0,1N).  Phƣơng pháp thực hiện: Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 4 nghiệm thức và lặp lại 3 lần.  Các nghiệm thức: Bảng 2.4. Bảng nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thuỷ phân phụ phế phẩm cá Tra. Nghiệm thức pH NT1 5 NT2 5,5 NT3 6 NT4 6,5 Cách tiến hành: Nguyên liệu phụ phẩm cá Tra được xử lý sơ bộ để loại bỏ mỡ và các tạp chất, xay nhuyễn, cân vào bình tam giác 50g phụ phẩm cá Tra, cho thêm 75ml dịch enzyme thô. Xác định pH ban đầu và điều chỉnh pH bằng hóa chất HCl 0,1N và NaOH 0,1N để được pH lần lượt là 5, 5,5, 6, và 6,5 (bố trí thí nghiệm như bảng 2.4). Tiến hành thuỷ phân ở điều kiện 500C trong thời gian 150 phút. Đến thời gian cố định, kết thúc quá trình thuỷ phân, bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thuỷ trong 15 phút, để nguội. Sau đó hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu.  Chỉ tiêu theo dõi: - Xác định N tổng bằng phương pháp Kjeldhal (%). - Xác định N formol bằng phương pháp Sorensen (%). 2.2.7. Ổn định dịch thủy phân bằng sorbic acid.  Vật liệu: Vỏ dứa, phụ phế phẩm cá Tra, hóa chất điều chỉnh pH (NaOH 0,1N, HCl 0,1N) và sorbic acid.  Mục tiêu: Hạn chế sự hao hụt của đạm của dịch thủy phân trong quá trình bảo quản. 36
  48. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa.  Phƣơng pháp tiến hành: Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 7 nghiệm thức và lặp lại 3 lần.  Các nghiệm thức: Bảng 2.5. Bảng nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của sorbic acid trong việc ổn định dung dịch thuỷ phân. Nghiệm thức Chất chống nấm (%) NT1( đối chứng) Trước ổn định NT2 0 NT3 0,25 NT4 0,5 NT5 0,75 NT6 1 NT7 1,5 Cách tiến hành: Dung dịch sau thủy phân hoàn toàn được phối trộn với chất chống nấm (sorbic acid) có tỉ lệ lần lượt như bảng 2.5. Sau 1 tháng tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu.  Chỉ tiêu theo dõi: - Xác định N tổng bằng phương pháp Kjeldhal (%). - Xác định N formol bằng phương pháp Sorensen (%). 37
  49. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Phụ phẩm cá Tra Vỏ dứa Định lượng N tổng số, Xác định hoạt tính protein tổng số. enzyme. Xác định thời gian, nhiệt độ, pH thủy phân tối ưu. Dịch thủy phân Chế phẩm Chất bảo quản 38
  50. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. 2.2.8. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cây cải xanh trồng ngoài đồng.  Phƣơng pháp nghiên cứu: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), gồm 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, diện tích mỗi ô là 5m2.  Các nghiệm thức: Bảng 2.6. Bảng nghiệm thức khảo nghiệm phân bón lá cho cây cải xanh ngoài đồng. Nghiệm thức Loại phân NT1 Phun nước lã NT2 Dịch thủy phân 5% NT3 Dịch thuỷ phân 10% NT4 Chế phẩm 5% NT5 Chế phẩm 10% Chế phẩm phân bón đang sử dụng trên thị trường sử dụng NT6 theo liều khuyến cáo. Các tiến hành: Tiến hành trồng cải xanh trong các luống đất. Thời gian phun 2 lần phun (sáng và chiều) ở các thời điểm 7, 14, và 21 ngày sau khi trồng. Lượng phân sử dụng 0,1 lít trong một lần phun trên 1m2 cải.  Chỉ tiêu theo dõi: - Chiều cao cây (cm). - Số lá (lá/cây). - Trọng lượng trung bình cây (g/cây). - Năng suất (kg/m2). 2.2.9. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cây đậu bắp trồng ngoài đồng.  Phƣơng pháp nghiên cứu: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), gồm 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, diện tích mỗi ô là 3m2. 39
  51. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa.  Các nghiệm thức: Bảng 2.7. Bảng nghiệm thức khảo nghiệm phân bón lá cho đậu bắp ngoài đồng. Nghiệm thức Loại phân NT1 Phun nước lã NT2 Dịch thủy phân 5% NT3 Dịch thuỷ phân 10% NT4 Chế phẩm 5% NT5 Chế phẩm 10% Chế phẩm phân bón đang sử dụng trên thị trường sử dụng NT6 theo liều khuyến cáo. Các tiến hành: Tiến hành trồng cải xanh trong các luống đất. Thời gian phun 2 lần phun (sáng và chiều) ở các thời điểm 10, 20, 30, 38, 50 và 65 ngày sau khi trồng. Lượng phân sử dụng 0,1 lít trong một lần phun trên 1m2 đậu bắp  Chỉ tiêu theo dõi - Ngày ra hoa đầu tiên (ngày). - Ngày thu hoạch đầu tiên (ngày). - Chiều cao cây (cm). - Số lượng quả trung bình (quả/cây). - Trọng lượng trung bình quả (g/quả). - Năng suất (kg/m2). 2.2.10. Xử lý số liệu Số liệu thu nhập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1. 40
  52. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá chất lƣợng nguyên liệu đầu vào (phụ phế phẩm cá Tra). Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, nguồn phụ phẩm cá Tra có hàm lượng dinh dưỡng cao 12,567%. Hàm lượng protein thô trong phụ phẩm cá Tra ở nghiên cứu này tương đương với công bố của Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013) và Chajana et al (2010). Theo các tác giả này thì hàm lượng protein trong phụ phẩm cá Tra lần lượt là 12,13% và 12,51% ± 10,5. Kết quả cho thấy, đây là nguồn nguyên liệu quý để sản xuất phân bón lá, phục vụ cho sản xuất nông nghiệp hữu cơ, hạn chế ô nhiễm môi trường và tiết kiệm ngoại tệ nhập khẩu phân bón từ nước ngoài. Bảng 3.1. Kết quả phân tích N tổng số và Protein tổng số của phụ phẩm cá đầu vào. Chỉ tiêu theo dõi Giá trị (%) NTS 2,011 0,006 Protein tổng số 12,567 0,034 3.2. Xác định hàm lƣợng enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain có trong thành phần vỏ dứa bằng phƣơng pháp Anson cải tiến. Bảng 3.2. Hoạt tính enzyme Bromelain có trong vỏ dứa và enzyme công nghiệp. Hoạt tính dung dịch enzyme Hoạt tính chế phẩm Nguyên liệu pha loãng (IU/ml) thô (IU/g) Vỏ dứa 2,362 0,187 0,626 0,05 Enzyme Bromelain 25 1,586 250 15,861 công nghiệp Số liệu ở bảng 3.2 cho thấy, vỏ dứa có hoạt tính enzyme Bromelain khá cao. Trung bình 1ml dịch thô từ vỏ dứa có khoảng 2,362IU và trong vỏ dứa thô có trung bình 0,626IU/g. Trong khi đó enzyme của Viện Sinh học Nhiệt đới có hoạt tính rất cao (250IU). Theo Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013) để thủy phân 10g phụ phẩm cá cần 35IU enzyme Bromelain. Như vậy, để thủy phân 10g phụ phẩm cá Tra sẽ sử dụng một lượng vỏ dứa là 56g dứa (tương đương 35IU) hay 15ml dịch 41
  53. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. enzyme thô và lượng enzyme công nghiệp là 0,14g. Lượng dịch thô từ vỏ dứa tương ứng này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Khảo sát hiệu quả thuỷ phân của enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain vỏ dứa. Bảng 3.3. Khảo sát hiệu quả thủy phân phụ phẩm cá Tra của của enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain trong vỏ dứa. N formol N formol/NTS Nghiệm thức NTS (%) (%) (%) Enzyme Bromelain công nghiệp 0,955 ns 0,412 a 43,273 b (0,70g) Enzyme Bromelain vỏ dứa (280g) 0,906 ns 0,403 b 44,466 a CV (%) 0,414 0,317 0,373 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,01 đối với N tổng số và p < 0,05 đối với N formol và tỷ lệ N formol/ N tổng số. Số liệu tỷ lệ (%) được chuyển về arsin để tính. 1,2 (%) 0,955 1 0,906 0,8 0,6 0,412 0,403 0,4 0,2 0 Enzyme Bromelain công nghiệp Enzyme Bromelain vỏ dứa N tổng số N formol ( ) Hình 3.1. Hàm lượng N formol và N tổng số trong khảo sát hiệu quả thủy phân của enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme Bromelain trong vỏ dứa. 42
  54. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Kết quả từ 3.3 cho thấy hàm lượng N formol và tỷ lệ N formol/NTS ở công thức sử dụng enzyme có trong dịch thô của vỏ dứa có sự chênh lệch ít so với enzyme công nghiệp. Tuy nhiên, hàm lượng N tổng số của cả hai công thức không có sự sai khác. Điều này cho thấy, với cùng hoạt độ thì khả năng thủy phân của enzyme Bromelain công nghiệp và enzyme có trong vỏ dứa là tương đương nhau. Vì vậy, có thể sử dụng enzyme Bromelain từ vỏ dứa làm nguồn nguyên liệu enzyme thay cho enzyme công nghiệp vừa tiết kiệm chi phí vừa giảm lượng vỏ dứa thải ra gây ô nhiễm môi trường. 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. Nghiệm thức NTS(%) N formol (%) N formol/NTS (%) 90 phút 0,792 c 0,302 c 37,914 b 120 phút 0,874 b 0,321 b 36,723 b 150 phút 0,893 ab 0,387 a 43,376 a 180 phút 0,929 a 0,393 a 41,917 a CV (%) 2,149 0,867 1,467 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,01. Số liệu tỷ lệ (%) được chuyển về arsin để tính. 43
  55. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. (%) 1 0,929 0,8 0,874 0,893 0,792 NTS(%) 0,6 N formol (%) 0,4 0,393 0,387 0,2 0,302 0,321 0 90 phút 120 phút 150 phút 180 phút (phút) Hình 3.2. Hàm lượng N formol và N tổng số trong ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. Trong thời gian ủ, hoạt lực của Bromelain giảm theo thời gian nhưng mức giảm là khác nhau tùy thuộc vào nhiệt độ ủ (Lại Thị Ngọc Hà, 2009). Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy ở 50 , khả năng thủy phân phụ phẩm cá của enzyme trong vỏ dứa tăng dần và đạt hiệu quả cao nhất sau 150 phút. Ở thời điểm 150 phút sau thủy phân, lượng N formol đạt đến 0,387%, tỷ lệ N formol/NTS đạt đến 43,376%. Đến 180 phút, hàm lượng NTS và N formol cũng như tỷ lệ N formol/NTS không sai khác so với thủy phân trong vòng 150 phút. Như vậy, thời gian tối ưu cho sự thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng vỏ dứa là 150 phút ở 500C. Sử dụng enzyme Alcalase để thủy phân phụ phẩm cá Tra ở điều kiện 600C, Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013) cũng cho rằng, khi tăng thời gian thủy phân thì lượng N tổng số và N formol cũng có xu hướng tăng dần và thời gian thủy phân tối ưu là 120 phút. Đánh giá vai trò của enzyme Bromelain, Nguyễn Công Hà và cs (2015) cho biết, enzyme Bromelain thủy phân phụ phẩm cá Tra thành dạng peptide phân tử lượng thấp cũng như hỗn hợp các acid amin với hàm lượng cao. Sau 150 phút khả năng thủy phân của enzyme tăng không đáng kể. 44
  56. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. Nghiệm thức NTS(%) N formol (%) N formol/NTS (%) 40 0,734 b 0,235 b 32,786 b 50 0,898 a 0,387 a 43,127 a 60 0,869 a 0,383 a 44,044 a 650C 0,761 b 0,201 c 26,395 c CV (%) 2,032 1,743 1,66 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,01. Số liệu tỷ lệ (%) được chuyển về arsin để tính. (%) 1 0,898 0,869 0,761 0,8 0,734 NTS (%) 0,6 N formol (%) 0,387 0,383 0,4 0,235 0,201 0,2 0 ( ) C40 C50 C60 C65 Hình 3.3. Hàm lượng N tổng số và N formol trong ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. 45
  57. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến sự thủy phân phụ phẩm cá Tra và enzyme Bromelain trong vỏ dứa. Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy với khoảng nhiệt độ biến động từ 400C đến 650C thì N tổng số biến động từ 0,734% - 0,898%. Ở nhiệt độ 400C thì N tổng số đạt 0,734% và N fomol đạt 0,235%, tỷ lệ N fomol/N tổng số là 32,786% nhưng khi tăng nhiệt độ lên đến 500C thì lượng N tổng số và N fomol tăng lên hẳn với số liệu tương ứng là 0,898% đối với N tổng số và 0,387% đối với N fomol. Số liệu ở bảng 3.5 cũng cho thấy không có sự khác nhau về N tổng số cũng như N fomol và tỷ lệ N fomol/N tổng số giữa nhiệt độ 500C và 600C. Tuy nhiên khi tăng nhiệt độ lên 650C thì N tổng số giảm còn 0,761% và N fomol giảm còn 0,201%. Giải thích điều này thì tác giả Lê Thanh Hải (2013), cho biết nhiệt độ cao làm biến tính phân tử protein – enzyme và làm vận tốc phản ứng giảm, làm giảm lượng đạm amin được chuyển hóa. Nhiệt độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc enzyme phá vỡ các liên kết trong phân tử enzyme Bromelain, làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí không gian nhóm –SH bị biến đổi nên không kết hợp được với cơ chất. Tốc độ phản ứng tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme Bromelain sẽ giảm dần đến mức triệt tiêu (Lê Thanh Hải, 2013). Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme Bromelain trong vỏ dứa là 50 tới 600C, nhưng xét về N tổng số và N fomol thì nhiệt độ tối ưu là 500C. 46
  58. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. 3.6. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. Nghiệm thức NTS(%) N formol (%) N formol/NTS (%) pH 5 0,864 b 0,376 b 43,504 b pH 5,5 0,886 a 0,410 a 46,329 a pH 6 0,881 ab 0,303 c 34,698 c pH 6,5 0,836 c 0,208 d 24,841 d CV (%) 0,849 2,343 1,105 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,01. Số liệu tỷ lệ (%) được chuyển về arsin để tính. (%) 1 0,9 0,8 0,886 0,881 0,864 0,836 0,7 NTS(%) 0,6 0,5 N formol 0,4 (%) 0,3 0,376 0,41 0,2 0,303 0,208 0,1 0 pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 6,5 (pH) Hình 3.4. Hàm lượng N formol và N tổng số trong ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra. pH môi trường phản ứng ảnh hưởng lớn đến hoạt động xúc tác của enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, mức độ ion hóa enzyme, do đó ảnh hưởng đến sự tạo phức hợp enzyme – cơ chất. Ngoài ra, pH còn ảnh hưởng đến độ bền phân tử protein enzyme (Lê Thanh Hải, 2013). Số liệu ở bảng 3.6 cho thấy, khi 47
  59. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. tăng pH từ 5 đến 5,5 lượng N formol đã tăng lên đáng kể (từ 0,376% lên đến 0,410%). Tỷ lệ N formol/NTS tăng từ 43,504% lên đến 46,329%. Tuy nhiên, khi tăng pH lên đến 6 và 6,5 thì khả năng thủy phân của enzyme giảm hẳn, thể hiện ở sự giảm rõ rệt của hàm lượng N formol cũng như tỷ lệ N formol/NTS. Như vậy, ở điều kiện nhiệt độ 500C, pH = 5,5 là tối ưu cho sự thủy phân phụ phẩm cá Tra của enzyme có trong vỏ dứa. Kết quả này cũng phù hợp với công bố của Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013). 3.7. Ổn định dịch thủy phân bằng sorbic acid Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ sorbic acid đến độ ổn định của dịch thủy phân. Nghiệm thức NTS(%) N formol (%) N formol/NTS (%) Trước ổn định 0,945 a 0,390 a 41,294 ab 0 0,397 c 0,107 d 27,091 c 0,25 0,661 b 0,282 c 42,937 a 0,5 0,889 a 0,333 b 37,527 b 0,75 0,963 a 0,378 a 39,236 ab 1 0,960 a 0,385 a 40,245 ab 1,5 0,916 a 0,386 a 42,166 ab CV (%) 5,296 2,4 3,074 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác suất p < 0,01. Số liệu tỷ lệ (%) được chuyển về arsin để tính. 48
  60. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. % (%) 1 0,945 0,916 0,9 0,963 0,96 0,8 0,889 0,7 NTS(%) 0,661 0,6 N formol 0,5 (%) 0,4 0,39 0,397 0,385 0,3 0,378 0,386 0,333 0,2 0,282 0,1 0,107 0 Trước 0 0,25 0,5 0,75 1 1,5 (%) ổn định Hình 3.5. Hàm lượng N formol và N tổng số trong ảnh hưởng của nồng độ sorbic acid đến độ ổn định của dịch thủy phân. Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, hàm lượng N tổng số và N formol trong dịch thủy phân giảm hẳn sau 1 tháng nếu không bỏ sung chất bảo quản. Việc bổ sung sorbic acid ít nhiều ảnh hưởng đến sự ổn định của dịch thủy phân. Bổ sung sorbic acid 0,25% làm giảm N tổng số gần 1/3 và N fomol hơn 25% so với lúc ban đầu. Nếu bổ sung sorbic acid vào dịch thủy phân với nồng độ 0,5% thì hàm lượng N tổng số không sai khác so với trước ổn định nhưng hàm lượng N formol thì giảm rõ. Khi tăng nồng độ sorbic acid lên từ 0,75% đến 1,5% thì hàm lượng N tổng số và N formol không sự sai khác so với trước bảo quản. Tuy nhiên, các chỉ số N tổng số và N formol trong dịch thủy phân bổ sung sorbic acid 0,75, 1, 1,5% lại không sai khác nhau. Điều này cho thấy, việc bổ sung sorbic acid từ 0,75% - 1,5% cho khả năng ổn định của dịch thủy phân cao. Mặt khác, trong quá trình bảo quản thì mùi hôi ở công thức không sử dụng sorbic acid nặng hơn nhiều so với khi sử dụng sorbic acid. Sở dĩ có kết quả này vì khi bổ sung sorbic acid vào dịch thủy phân thì đã làm hạn chế sự hoạt động của các vi sinh vật nên lượng đạm mất đi ít và hạn chế sinh ra các khí 49
  61. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. gây mùi như H2S Tuy nhiên để tăng hiệu quả kinh tế, thì lựa chọn nồng độ sorbic acid là 0,75% để ổn định dịch thủy phân cá. 50
  62. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỦY PHÂN PHỤ PHẨM CÁ TRA 50g cá Tra + 75ml dịch thô enzyme Xay nhuyễn Thủy phân ở 50 , pH=5,5 trong 150 phút Đun cách thủy 15 phút Để nguội Cặn, mỡ Dịch thủy phân 51
  63. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Phụ phẩm cá Tra sau khi lấy từ nhà máy chế biến thì tiến hành loại bỏ mỡ và các vật rắn lẫn tạp chất và phân loại tách mỡ. Sau đó, xay nhỏ phụ phẩm cá và trộn đều. Lấy 10 kg phụ phẩm cá Tra thêm 15L dịch enzyme Bromelain đã được ép từ máy ép trái cây đem khuấy đều. Tiến hành thủy phân hỗn hợp này trong điều kiện pH = 5,5, nhiệt độ 50 trong thời gian 150 phút. Đến thời gian cố định, kết thúc quá trình thuỷ phân, ta tiếp tục đun cách thủy để bất hoạt enzyme, sau đó để nguội. Khi dịch thủy phân đã nguội thì đem đi lọc để loại bỏ mỡ và cặn còn sót lại. Cuối cùng thu được là dịch thủy phân với lượng khoảng 12L. Sản phẩm thu được là dịch thủy phân làm nguyên liệu để sản xuất phân bón lá mới từ phụ phẩm cá Tra. 3.8. Phối chế dung dịch thủy phân thành phân bón lá để dùng cho rau. Bảng 3.8. Hàm lượng các chất trong dịch thủy phân trước phối trộn. STT Chỉ tiêu ĐVT Kết quả 1 N % 0,94 2 P2O5 % 0,37 3 K2O mg/Kg 3.198 Nguồn: Kết quả phân tích tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển nông nghiệp công nghệ cao. Nguồn nguyên liệu từ dịch thủy phân cá để sản xuất phân bón lá có hàm lượng các chất tương đối cao (N khoảng 1%, P2O5 0,37% và K2O 3.198 mg/Kg). Kết quả phân tích ở bảng 3.8 cho thấy hàm lượng P2O5 và K2O ở nghiên cứu này cao hơn so với nghiên cứu của Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013), còn hàm lượng N là tương đương. Bên cạnh đó, trong dịch thủy phân còn chứa một lượng amino acid cao mà cây trồng có thể hấp thụ trực tiếp (N fomol khoảng 0,4%). Tuy nhiên, để đem lại hiệu quả kinh tế cho người sản xuất phân bón và người sử dụng thì vẫn cần bổ sung thêm hàm lượng vào dịch thủy phân cá để tạo thành chế phẩm. Dựa theo nghiên cứu của Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm (2013), nhóm nghiên cứu đã bổ sung thêm hàm lượng N dưới dạng NaNO3 với liều lượng 61g/l tạo chế phẩm phân bón có khoảng 2% hàm lượng N. 52
  64. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Bảng 3.9. Chi phí sản xuất chế phẩm (1L) từ dịch thủy phân cá Tra. STT Vật tƣ ĐVT Số lƣợng Đơn giá Thành tiền 1 Phụ phẩm cá kg 0,67 5.000 3.350 2 Vỏ dứa kg 3800 0 0 3 Hóa chất 3.1 NaNO3 g 61 13,7 835.7 4 Điện, nước 2.000 5 Chai bao bì cái 2 3500 7.000 Tổng thu (đồng/ lít) 40000 80.000 chai 2 Lợi nhuận 66.814 Ghi chú: Chi phí chưa tính khâu hao thiết bị và công lao động. Chi phí để sản xuất ra chế phẩm từ dịch thủy phân cá Tra (1L) chiếm 16,48% giá thành sản phẩm. Hình 3.6. Chế phẩm phân sinh học cá Tra. 53
  65. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. 3.9. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cải xanh trồng ngoài đồng. Dịch thủy phân từ phụ phẩm cá Tra chưa phối trộn và dịch thủy phân sau khi được phối thành chế phẩm phân bón lá được sử dụng cho cải xanh trồng ngoài đồng kết quả thu được, được trình bày ở bảng 3.10, 3.11 và 3.12. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến chiều cao cây rau cải. Chiều cao cây (cm) ở các giai đoạn Công thức Sau trồng 10 ngày Sau trồng 18 Sau trồng 26 (cm) ngày (cm) ngày (cm) Phun nước (ĐC) 5,700 d 12,730 e 22,443 e Dịch thủy phân 5% 6,803 c 15,460 d 27,297 d Dịch thủy phân 6,817 c 18,067 c 28,500 c 10% Chế phẩm 5% 7,143 b 18,460 b 29,217 b Chế phẩm 10% 7,533 a 19,907 a 30,623 a Phân bón lá Grow 7,523 a 19,913 a 30,583 a 6-6-6 CV (%) 1, 520 1,127 0,599 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,05. Qua theo dõi chiều cao cây ở các thời kỳ được trình bày ở bảng 3.10 cho thấy sau trồng 10 ngày ở các công thức có sự chênh lệch ít, nhưng sau trồng 18 và 26 ngày chiều cao cây đã cao hơn rõ rệt khoảng từ 3 - 8cm so với phun bằng nước. Như vậy, với công thức sử dụng chế phẩm có liều lượng 10% đạt hiệu quả cao nhất 19,907cm (sau trồng 18 ngày) và 30,623cm (sau trồng 26 ngày) nhưng không có sự khác biệt so với tưới bằng phân bón lá Grow 6-6-6. 54
  66. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. a. Phun nước (ĐC) b. Dịch thủy phân 5% c. Dịch thủy phân 10% d. Chế phẩm 5% e. Chế phẩm 10% f. Phân bón lá Grow 6-6-6 Hình 3.7. Chiều cao cây rau cải sau 10 ngày. 55
  67. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. a. Phun nước (ĐC) b. Dịch thủy phân 5% c. Dịch thủy phân 10% d. Chế phẩm 5% e. Chế phẩm 10% f. Phân bón lá Grow 6-6-6 Hình 3.8. Chiều cao cây rau cải sau 18 ngày. 56
  68. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. a. Phun nước (ĐC) b. Dịch thủy phân 5% c. Dịch thủy phân 10% d. Chế phẩm 5% e. Chế phẩm 10% f. Phân bón lá Grow 6-6-6 Hình 3.9. Chiều cao cây rau cải sau 26 ngày. 57
  69. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến số lá cây rau cải. Số lá/cây ở các giai đoạn Công thức Sau trồng 10 Sau trồng 18 Sau trồng 26 ngày ngày (lá) ngày (lá) (lá) Phun nước (ĐC) 4,867 c 5,867 c 7,233 c Dịch thủy phân 5% 5,500 b 7,300 b 8,267 b Dịch thủy phân 5,800 a 7,600 ab 9,000 a 10% Chế phẩm 5% 5,733 a 7,600 ab 9,000 a Chế phẩm 10% 5,767 a 7,800 a 9,100 a Phân bón lá Grow 5,733 a 7,867 a 9,133 a 6-6-6 CV (%) 2,117 2,467 2,009 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,05. Số lá của rau cải qua các giai đoạn có sự chênh lệch ít khi sử dụng các loại chế phẩm phân bón lá khác nhau sau trồng 10 ngày. Nhưng kết quả ở bảng 3.11 cho thấy sau trồng 18 và 26 đã có sự khác biệt rõ rệt. Việc phun bổ sung dịch thủy phân và chế phẩm đều cho số lá trên cây cao hơn đối chứng phun nước, đối chứng, dịch thủy phân 5% ít hơn từ 1 – 3 lá so với các công thức khác. So sánh giữa các công thức thì phun dịch thủy phân 10% và chế phẩm 5, 10% đều cho số lá/cây không sai khác so với loại phân bón lá sử dụng trên thị trường. 58
  70. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. a. Kết quả thu hoạch của cải xanh ở từng công thức b. So sánh cải xanh khi phun bằng c. So sánh cải xanh khi phun bằng chế nước và phân bón lá Grow 6-6-6 phẩm 10% và phân bón lá Grow 6-6-6 59
  71. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. d. So sánh cải xanh khi phun bằng e. So sánh cải xanh khi phun bằng nước và chế phẩm 5% nước và chế phẩm 10% f. So sánh cải xanh khi phun bằng h. So sánh cải xanh khi phun bằng nước và dịch thủy phân 5% nước và dịch thủy phân 10% Hình 3.10. So sánh kết quả thu hoạch của cải xanh 60
  72. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Bảng 3.12. Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến trọng lượng và năng suất cây cải. Khối lƣợng trung Năng suất lý Năng suất thực Công thức bình (g/cây) thuyết (kg/m2) thu (kg/m2) Phun nước (ĐC) 35,783 d 2,147 d 1,593 d Dịch thủy phân 5% 50,267 c 3,016 c 2,390 c Dịch thủy phân 64,950 b 3,887 b 2,897 b 10% Chế phẩm 5% 65,333 b 3,947 b 2,957 b Chế phẩm 10% 82,883 a 4,973 a 4,013 a Phân bón lá Grow 83,133 a 4,988 a 4,067 a 6-6-6 CV (%) 1,676 1,687 5,054 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,05. Kết quả bảng 3.12 cho thấy, việc phun bổ sung dịch thủy phân hoặc chế phẩm đều là tăng trọng lượng cây cải cũng như năng suất lý thuyết và năng suất thực thu so với phun bằng nước lã. Phun dịch thủy phân 10% cho năng suất tương đương với phun chế phẩm 5% và thấp hơn so với phun phân bón lá thương phẩm. Tuy nhiên, nếu phun chế phẩm 10% thì năng suất tương đương với phun phân bón lá thương phẩm đang bán trên thị trường. 61
  73. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. (g/cây) 90 80 83,133 70 82,883 60 64,95 65,333 50 40 50,267 Khối 30 35,783 lượng trung bình 20 (g/cây) 10 0 Phun Dịch Dịch Chế Chế Phân bón (Phân nước thủy thủy phẩm phẩm lá Grow bón) (ĐC) phân 5% phân 5% 10% 6-6-6 10% Hình 3.11. Khối lượng trung bình của cải. (Kg/m2) 6 5 4,973 4,988 4 3,887 3,947 3 Năng suất 3,016 Năng suất lý 2 lý thuyết thuyết (kg/m2) 2,147 (kg/m2) 1 0 Phun Dịch Dịch Chế Chế Phân nước thủy thủy phẩm phẩm bón lá (Phân bón) (ĐC) phân 5% phân 5% 10% Grow 6- 10% 6-6 Hình 3.12. Năng suất lý thuyết của cải. 62
  74. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. (Kg/m2) 4,5 4 4,013 4,067 3,5 3 2,957 2,5 2,897 NăngNăng suất suất thực 2 2,39 thuthự (kg/mc thu 2) (kg/m2) 1,5 1,593 1 0,5 0 Phun Dịch Dịch Chế Chế Phân nước thủy thủy phẩm phẩm bón lá (Phân bón) (ĐC) phân 5% phân 5% 10% Grow 6- 10% 6-6 Hình 3.13. Năng suất thực thu của cải. 3.10. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho đậu bắp trồng ngoài đồng. Dịch thủy phân từ phụ phẩm cá Tra chưa phối trộn và dịch thủy phân sau khi được phối thành chế phẩm phân bón lá được sử dụng cho đậu bắp trồng ngoài đồng kết quả thu được, được trình bày ở bảng 3.13, 3.14, 3.15 và 3.16. 63
  75. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Bảng 3.13. Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến ngày ra hoa đầu tiên và ngày thu hoạch đầu tiên của cây đậu bắp. Ngày ra hoa đầu tiên Ngày thu hoạch đầu tiên Công thức (ngày) (ngày) Phun nước (ĐC) 62,330 a 69,053 a Dịch thủy phân 5% 55,727 b 62,833 b Dịch thủy phân 10% 55,610 b 62,610 b Chế phẩm 5% 48,390 c 55,557 c Chế phẩm 10% 47,667 c 54,667 c Phân bón lá Grow 6-6-6 47,610 c 54,610 c CV (%) 1,935 1,727 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,05. Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy, đậu bắp khi được phun dịch thủy phân và chế phẩm ra hoa sớm hơn khi phun bằng nước từ 7 – 15 ngày. Ngoài ra, đậu bắp ở công thức phun chế phẩm 5, 10% không sai khác so với phun bằng phân bón lá Grow 6- 6-6 (khoảng 48 ngày). Tương tự ở ngày thu hoạch, đậu bắp được phun dịch thủy phân thu hoạch sớm hơn 7 ngày (thu hoạch ở ngày thứ 69), còn phun chế phẩm và phân bón thương mại thu hoạch đậu bắp sớm hơn nửa tháng (thu hoạch ở ngày thứ 55 khi phun chế phẩm 5%, ngày thứ 56 ở chế phẩm 10% và phân bón thương mại). Sự chênh lệch rõ rệt về số ngày ra hoa và ngày thu hoạch ở các công thức cho thấy với công thức sử dụng chế phẩm lần lượt là 5% và 10% đạt hiệu quả cao nhất (sớm hơn đối chứng khoảng 15 ngày). 64
  76. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Bảng 3.14. Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến chiều cao của cây đậu bắp. Công thức Chiều cao cây (cm) Phun nước (ĐC) 63,333 d Dịch thủy phân 5% 77,780 c Dịch thủy phân 10% 82,777 c Chế phẩm 5% 115,557 b Chế phẩm 10% 128,333 a Phân bón lá Grow 6-6-6 118,887 ab CV (%) 5,907 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,05. Qua theo dõi chiều cao cây ở bảng 3.14 cho thấy, chiều cao ở các công thức có sự khác biệt rõ rệt khoảng từ 14 – 65cm so với phun bằng nước. Ngoài ra, đậu bắp ở công thức phun chế phẩm 5% có chiều cao (115,557cm) không sai khác so với phun bằng phân bón lá Grow 6-6-6 (118,887cm), nhưng đạt hiệu quả cao nhất là ở công thức sử dụng chế phẩm có liều lượng 10% cho chiều cao cây đậu bắp là 128,333cm. 65
  77. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. a. Phun nước (ĐC) b. Dịch thủy phân 5% c. Dịch thủy phân 10% d. Chế phẩm 5% e. Chế phẩm 10% f. Phân bón lá Grow 6-6-6 Hình 3.14. Đậu bắp ngày thứ 42. 66
  78. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. a. Phun nước (ĐC) b. Dịch thủy phân 5% c. Dịch thủy phân 10% d. Chế phẩm 5% e. Chế phẩm 10% f. Phân bón lá Grow 6-6-6 Hình 3.15. Đậu bắp ngày thứ 57. 67
  79. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. a. Phun nước (ĐC) b. Dịch thủy phân 5% c. Dịch thủy phân 10% d. Chế phẩm 5% e. Chế phẩm 10% f. Phân bón lá Grow 6-6-6 Hình 3.16. Đậu bắp ngày thứ 72. 68
  80. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Bảng 3.15. Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến số lượng quả và trọng lượng trung bình của cây đậu bắp. Số lƣợng quả trung bình Trọng lƣợng trung bình Công thức (quả/cây) quả (g/quả) Phun nước (ĐC) 5,943 c 24,307 c Dịch thủy phân 5% 10,667 b 28,717 b Dịch thủy phân 12,277 b 29,923 ab 10% Chế phẩm 5% 19,610 a 30,120 ab Chế phẩm 10% 20,890 a 30,497 a Phân bón lá Grow 20,223 a 30,150 a 6-6-6 CV (%) 13,729 2,750 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,05. Kết quả ở bảng 3.15 cho thấy, số quả/cây và trọng lượng trung bình quả có sự khác biệt khi sử dụng dịch thủy phân và chế phẩm phân bón ở các nồng độ khác nhau. Tuy nhiên, số lượng quả/cây và trọng lượng trung bình quả không có sự khác biệt lớn khi phun bằng chế phẩm với liều lượng 5% và 10% so với khi phun bằng phân bón thương mại. Trong đó, có hiệu quả tốt nhất là khi sử dụng chế phẩm với nồng độ 10%. 69
  81. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Hình 3.17. Kết quả thu hoạch của đậu bắp ở từng công thức Bảng 3.16. Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến năng suất cây đậu bắp Công thức Năng suất cây đậu bắp (kg/m2) Phun nước (ĐC) 0,289 c Dịch thủy phân 5% 0,611 b Dịch thủy phân 10% 0,734 b Chế phẩm 5% 1,181 a Chế phẩm 10% 1,274 a Phân bón lá Grow 6-6-6 1,219 a CV (%) 13,701 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột có cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác xuất p < 0,05 70
  82. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. Kết quả bảng 3.16 cho thấy khi tăng nồng độ sử dụng ở các công thức thì năng suất đậu bắp tăng dần, đạt cao nhất ở công thức 4 và 5 (khoảng 1,2 kg/m2) và khác hơn hẳn so với đối chứng (0,289 kg/m2). (Kg/m2) 1,4 1,2 1,274 1,181 1,219 1 0,8 0,734 0,6 0,611 NăngNăng suất suấ tcây cây 0,4 đậuđậ ubắp bắ p(kg/m 2) 2 0,2 (kg/m ) 0,289 0 Phun Dịch Dịch Chế Chế Phân nước thủy thủy phẩm phẩm bón lá (Phân bón) (ĐC) phân 5% phân 5% 10% Grow 6- 10% 6-6 Hình 3.18. Năng suất cây đậu bắp 71
  83. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận. Có thể sử dụng vỏ dứa để thủy phân phụ phẩm cá Tra thay thế cho enzyme Bromelain công nghiệp. Điều kiện tối ưu để thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme có trong dịch chiết từ vỏ dứa là tỷ lệ cá : vỏ dứa là 1 : 5,6 (w/w) hay cá : dịch chiết là 1 : 1,5 (w/v), nhiệt độ 500C, pH là 5,5, với thời gian thủy phân là 150 phút. Dịch thủy phân có thể ổn định bằng sorbic acid với nồng độ là 0,75%. Phun dịch thủy phân 10% có khả năng làm tăng năng suất của cải bẹ xanh và đậu bắp tương đương với phân bón lá thương mại trên thị trường. 4.2. Đề nghị. - Tạo phân bón lá từ dịch thủy phân phụ phẩm cá Tra. - Nghiên cứu ủ compost từ phế phẩm sau thủy phân. - Nghiên cứu quá trình loại bỏ mỡ cá Tra cho sản xuất ở dạng quy mô lớn. - Thử nghiệm phân bón lá từ phụ phẩm cá Tra trên một số loại cây trồng khác. - Phân tích chỉ tiêu chế phẩm để đưa ra hàm lượng phối trộn phân bón hợp lý. 72
  84. Tạo phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và vỏ dứa. TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu trong nƣớc 1. Đặng Thị Mộng Quyên và Trần Thị Xô (2006). Nghiên cứu tận dụng cá phế liệu để sản xuất dịch cao đạm dùng trong thức ăn nuôi tôm. Cá, Tạp chí Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn 16, (2): 41 - 43. 2. Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh (1997). Thí nghiệm Hóa sinh công nghiệp. Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, tr. 19-20, 73 - 78. 3. Dương Thị Hương Giang, Nguyễn Thị Xuân Dung, Phan Thị Bích Trâm (2006). Nghiên cứu sử dụng enzyme papain thô từ nhừa đu đủ để thủy phân protein trong bánh dầu đậu nành, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ – vol. 05. 4. Ks. Nguyễn Mạnh Chinh, Ts. Phạm Anh Cường (2007). Kỹ thuât trồng, chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh, NXB Nông Nghiệp, quyển 33: Đậu rau, tr 60 – 70. 5. Lại Thị Ngọc Hà (2009). Nghiên cứu tách và tạo chế phẩm Bromelain từ phụ phế phẩm dứa, Tạp chí khoa học và phát triển: tập 7, số 2: 203 – 211. 6. Lê Ngọc Tú (2004). Hóa công nghiệp, NXB. Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 7. Lê Thanh Hải (2013). Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh, TP.Hồ Chí Minh. 8. Lê Thanh Mai, Nguyễn Kiêu Hùng (2005). Khảo sát khả năng làm mềm thịt của enzyme Bromelain thu được từ phần phế liệu dứa – chồi ngọn, Đề tài nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh. 9. Lương Hữu Đồng (1975). Kỹ thuật sản xuất nước mắm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 10. Nguyễn Bá Mùi (2002). Nghiên cứu phụ phẩm dứa ủ chua làm thức ăn gia súc, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp, Hà Nội. 11. Nguyễn Chung (2007). Kỹ thuật sinh sản và nuôi cá Tra, Nhà xuất bản nông nghiệp, 142 trang. 12. Nguyễn Công Hà, Lê Nguyễn Đoan Duy, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Bích Phượng (2015). Khảo sát khả năng thủy phân ptrotein từ phụ phẩm cá Tra 73