Đồ án Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì thay thế hoá chất bảo quản

Nội dung text: Đồ án Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì thay thế hoá chất bảo quản

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM ĐỒNG LÊN MEN VỚI NẤM MEN BÁNH MÌ THAY THẾ HOÁ CHẤT BẢO QUẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương ThS. Huỳnh Phương Quyên Sinh viên thực hiện : Trần Kim Ngân MSSV: 1411100731 Lớp: 14DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2018
2. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì 3 1.1.1 Giới thiệu chung 3 1.1.2 Quy trình làm bánh mì 4 1.1.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì 12 1.1.3.1 Hệ vi sinh vật bánh mì 12 1.1.3.2 Hư hỏng bánh do vi sinh vật 13 1.1.3.3 Tác hại của nấm mốc 13 1.1.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì 14 1.2 Tổng quan về bột chua 16 1.2.1 Đặc tính của bột chua 16 1.2.2 Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua 17 1.2.3 Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với hương vị của bánh mì 18 1.2.4 Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua 19 1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic 21 1.3.1 Giới thiệu chung 21 1.3.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus 23 1.3.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 25 1.3.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 27 1.3.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 28 1.3.2.1 Quá trình trao đổi chất 28 i
3. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 29 1.3.3 Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 30 CHƯƠNG 2. MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Mục tiêu đề tài, nội dung nghiên cứu 32 2.1.1 Mục tiêu 32 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 32 2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 32 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 32 2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn lactic 32 2.2.1.2 Nguồn nấm bệnh 32 2.2.1.3 Nấm men 33 2.2.2 Hoá chất và môi trường sử dụng 33 2.2.2.1 Hoá chất 33 2.2.2.2 Môi trường nuôi cấy (xem ở Phụ lục 1) 33 2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 33 2.2.3.1 Thiết bị 33 2.2.3.2 Dụng cụ 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Phương pháp luận 34 2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 35 2.3.3 Thuyết minh quy trình tổng quát 36 2.4 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 38 2.4.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum 38 2.4.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa 38 2.4.1.2 Khả năng sinh acid 41 2.4.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum in vitro 43 2.4.2 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh mì của vi khuẩn LAB với nấm men 45 2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của LAB 49 2.4.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men của bột nhào 49 2.4.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ nướng bánh 51 ii
4. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích giữa các loại bánh mì 53 2.4.3.4 Phương pháp phân tích các thông số đo 55 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 64 3.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum 64 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát về sinh lý, sinh hóa 64 3.1.2 Khả năng sinh acid 65 3.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum in vitro 66 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì 68 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men của bột nhào. 68 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ nướng bánh. 80 3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích giữa các loại bánh mì 85 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93 1. Kết luận 93 2. Kiến nghị 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 Tài liệu tiếng Việt 95 Tài liệu tiếng Anh 96 PHỤ LỤC A 1 PHỤ LỤC B 3 iii
5. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT − DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol − LAB: Lactic acid bacteria − MRS agar: de Man, Rogosa, Sharpe Agar − MRS broth: de Man, Rogosa, Sharpe Broth − PDA: Potato Dextrose Agar − PDB: Potato Dextrose Broth − VSV: Vi sinh vật iv
6. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 31 Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn L. plantarum 64 Bảng 3.2: Độ acid (% TA) của chủng Lactobacillus plantarum 66 Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế của vi khuẩn Lactobacillus plantarum với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 67 Bảng 3.4: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum L5, bánh mì chứa chất bảo quản và bánh mì không hoá chất bảo quản 69 Bảng 3.5: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1, bánh mì chứa chất bảo quản và bánh mì không hoá chất bảo quản 70 Bảng 3.6: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1 và Lactobacillus plantarum L5 72 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát các thông số hóa lý của bánh mì khi bổ sung Lactobacillus plantarum L5 và C1 trước lên men kết thúc 74 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát các thông số hóa lý của bánh mì khi bổ sung Lactobacillus plantarum L5 sau lên men kết thúc 75 Bảng 3.9: Kết quả khảo sát các thông số hóa lý của bánh mì khi bổ sung Lactobacillus plantarum C1 sau lên men kết thúc 76 Bảng 3.10: Kết quả cảm quan giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum L5 và C1 với các mốc thời gian lên men 78 Bảng 3.11: Kết quả khảo sát nhiệt độ nướng mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum L5-109 80 Bảng 3.12: Kết quả khảo sát nhiệt độ nướng mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1-109 83 Bảng 3.13: Kết quả khảo sát thể tích giữa các mẫu bánh mì 86 Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ acid giữa các mẫu bánh mì 87 Bảng 3.15: Kết quả đánh giá cảm quan giữa các loại bánh mì 88 v
7. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.16: Kết quả khảo sát thời gian bảo quản các mẫu bánh mì 91 Bảng 3.17: Kết quả khảo sát tổng nấm men nấm mốc giữa các mẫu bánh mì 92 vi
8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Quy trình làm bánh mì 5 Hình 1.2: Máy nhào bột 6 Hình 1.3: Khối bột nhào sau khi lên men ổn định sơ bộ 8 Hình 1.4: Bột nhào sau khi tạo hình 9 Hình 1.5: Bột nhào sau khi lên men kết thúc 10 Hình 1.6: Bánh mì thành phẩm 10 Hình 1.7: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid lactic (được chuyển thể từ Liu và cộng sự, 2008) 20 Hình 1.8: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus 23 Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu 35 Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng LAB lên chất lượng bánh mì 36 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus plantarum 38 Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus plantarum 41 Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. 43 Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn 45 Hình 2.7: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì.46 Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men của bột nhào 49 Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nướng bánh 51 Hình 2.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích giữa các loại bánh mì 54 Hình 2.11: Cân sấy ẩm 56 Hình 2.12: Máy đo pH để bàn 57 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar 65 vii
9. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2: Kết quả nhuộm Gram 65 Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1 67 Hình 3.4: Đĩa kháng nấm chủng Lactobacillus plantarum L5 67 Hình 3.5: Đĩa kháng nấm chủng Lactobacillus plantarum C1 68 Hình 3.6: Khảo sát đối kháng in vivo 73 Hình 3.7: Khảo sát các nhiệt độ nướng bánh mì bổ sung vi khuẩn L. plantarum L5 - 109 82 Hình 3.8: Khảo sát các nhiệt độ nướng bánh mì bổ sung vi khuẩn L. plantarum C1 - 109 85 Hình 3.9: Mẫu bánh mì chuẩn bị đánh giá cảm quan 90 Hình 3.10: Tiến hành thí nghiệm cảm quan bằng phép thử Cho điểm thị hiếu (n= 30 người) 91 viii
10. Đồ án tốt nghiệp TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men, nhằm lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín. Aspergillus niger là tác nhân chính gây hư hỏng bánh mì mang lại những thiệt hại lớn về kinh tế đồng thời A.niger sản sinh ra các độc tố gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Song song đó, chất bảo quản được sử dụng để kéo dài thời gian bảo quản nhưng để đảm bảo an toàn sức khỏe cần tạo ra hợp chất tinh khiết vì thế tốn nhiều chi phí cho việc xây dựng quy trình sản xuất. Quy trình sản xuất bột chua truyền thống sử dụng nấm men kết hợp vi khuẩn lên men xâm nhập từ không khí để tạo nên hương vị đặc trưng và cải thiện cấu trúc. Mặt hạn chế là khó kiểm soát được vi khuẩn xâm nhập. Lactobacillus plantarum được phân lập từ nem chua, cơm mẻ lên men truyền thống có khả năng sinh hợp chất ức chế nấm mốc Aspergillus niger. Sử dụng vi khuẩn lactic phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống đồng lên men với nấm men có thể kéo dài thời gian bảo quản, cải thiện cấu trúc đồng thời dễ kiểm soát được quy trình hơn. Dựa vào khả năng lên men acid lactic, sử dụng phương pháp ria 2 đường vi khuẩn, khả năng đối kháng nấm trên bánh mì cũng như khảo sát ảnh hưởng của các mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum và thời gian lên men bột nhào, khảo sát nhiệt độ nướng bánh và đánh giá cảm quan sản phẩm khi đồng lên men bánh mì với nấm men nhằm kéo dài thời gian bảo quản và cải thiện chất lượng sản phẩm. Từ khóa: bột chua, chất bảo quản, lactic acid bacteria (LAB), lên men bánh mì, ức chế nấm mốc. 1
11. Đồ án tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống hiện nay, mọi người đều bận rộn với công việc nên họ không có nhiều thời gian dành cho bữa sáng. Do đó, sự lựa chọn tuyệt vời nhất cho bữa ăn sáng của họ là bánh mì. Vì bánh mì vừa đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng, cung cấp đủ năng lượng vừa tiện dụng, nhanh gọn, không mất nhiều thời gian để chuẩn bị. Ngoài dùng làm bữa sáng, bánh mì còn được sử dụng trong các bữa ăn chính nếu họ không có thời gian nấu nướng hoặc dùng bánh mì ăn kèm với nhiều món khác. Trong những năm gần đây, bảo quản sinh học (dùng vi khuẩn / các chất chuyển hóa của vi khuẩn để ngăn chặn sự hư hỏng) (Stiles, 1996) đã đạt được sự quan tâm của người tiêu dùng vì không độc hại và kéo dài được thời hạn sử dụng của thực phẩm. LAB có lịch sử lâu dài trong việc bảo quản thực phẩm khỏi các vi sinh vật gây hư hỏng - chúng thường được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm, có thể sản sinh ra một số chất chuyển hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe và do đó thường được coi là an toàn (GRAS) (Belal J.Muhialdin , Zaiton Hassan and Nazamid Saari, 2011). Thời hạn bảo quản bánh mì được kéo dài khi một số chủng LAB nhất định được thêm vào các công thức bánh mì (Muhialdin và cộng sự, 2011, Ogunbanwo và cộng sự, 2008, Rizzello và cộng sự, 2010, Ryan và cộng sự, 2011). Trong sản xuất bánh mì, đa phần sử dụng canxi propionate để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì. Canxi propionate là chất bảo quản thông dụng nhất hiện nay với ngưỡng nồng độ cho phép sử dụng < 0.3%. Sử dụng hóa chất bảo quản tiềm ẩn nguy cơ như canxi propionate tạo khối u ở chuột (Pattinson et al., 2004), các acid yếu khác phát triển nấm kháng thuốc (Belal et al., 2013). Việc sử dụng vi khuẩn an toàn trong bánh mì nhằm kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì là một lĩnh vực nghiên cứu tuyệt vời. Vì những lợi ích của LAB mang lại, người thực hiện đề tài đã chọn hướng cho đề tài nghiên cứu là: “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì thay thế hoá chất bảo quản”. 2
12. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì 1.1.1 Giới thiệu chung Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối, nấm men để lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín. Khoảng một nửa số dân trên thế giới dùng bánh mì làm nguồn lương thực chính. Bánh mì cung cấp tinh bột và protein. Bánh mì có nhiều loại với nhiều công thức chế biến khác nhau tùy thuộc thói quen ăn uống của từng vùng như phân loại theo màu sắc của bánh có bánh mì đen, bánh mì trắng, phân loại theo độ cứng của vỏ bánh mì thì có bánh mì vỏ cứng, bánh mì mềm. Một số bánh mì có bổ sung sắt, canxi, omega–3. Nguyên liệu chính làm bánh mì là bột mì và nấm men. Ngoài ra còn có muối, đường, sữa, trứng, chất béo, chất thơm, vitamin C, enzyme. Phụ gia bổ sung có thể vì mục đích dinh dưỡng hay mục đích kĩ thuật. ❖ Hệ enzyme trong bột mì: Enzyme trong bột có đầy đủ các hệ trong hạt mì, tuy nhiên trong sản xuất cần đặc biệt lưu ý protease và amilase. Protease phân giải protein cấu trúc bậc ba, do đó gluten bị vụn nát làm giảm chất lượng bột nhào. Protease bột mì có hoạt độ mạnh ở 45 - 47°C và pH = 4,5 - 5,6. Khi bổ sung chất khử thì hoạt độ của protease tăng nhưng với chất oxy hoá và muối ăn thì bị kìm hãm. Amylase thuỷ phân tinh bột giúp cho bột nhào lên men nhanh và tăng chất lượng bánh vì lượng đường trong bột không đủ cho quá trình lên men. Tác dụng tích cực này chỉ đối với amylase vì nó thuỷ phân tinh bột thành maltose, còn α - amylase thuỷ phân tinh 3
13. Đồ án tốt nghiệp bột thành dextrin mà dextrin thì liên kết với nước kém làm cho ruột bánh bị ướt, do đó làm giảm chất lượng bánh. 1.1.2 Quy trình làm bánh mì ❖ Nguyên liệu: Bột mì số 11 250 gram Men 3 gram Đường 35 gram Sữa tươi không đường 135 ml Bơ Zelachi 15 gram Trứng gà 1⁄2 trứng Muối 2,5 gram 4
14. Đồ án tốt nghiệp ❖ Quy trình làm bánh mì: Nguyên liệu Nhào bột Lên men ổn định sơ bộ Chia bột Vê bột Tạo hình Lên men kết thúc Nướng Làm nguội Sản phẩm Hình 1.1: Quy trình làm bánh mì 5
15. Đồ án tốt nghiệp ❖ Thuyết minh quy trình: 1. Nhào bột Mục đích: Nhào bột là khâu rất quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng bánh thành phẩm. Nhào bột để phân phối nước, gia vị và phụ gia đồng đều trong khối bột nhào nhằm tăng chất lượng sản phẩm và tăng giá trị cảm quan, tạo nên khối bột nhào đồng nhất và giúp các sợi gluten trở nên dẻo dai hơn, chắc chắn hơn. Sợi gluten khỏe sẽ giúp giữ lại các hơi khí bên trong bột, giúp bánh nở khi nướng. Cách tiến hành: Các nguyên liệu khô như bột mì, đường, muối, men sau khi được rây thì trộn chung với nhau trước, sau đó mới cho hỗn hợp nhũ tương sữa, trứng, bơ vào chung vào. Tất cả nguyên liệu đã cho vào máy nhào bột thì tiến hành nhào bột với tốc độ chậm trong vòng 13 phút. Khi đó bột nhào đã hết dình vào thành và đáy máy nhào do nguyên liệu liên kết chặt chẽ với nhau thì độ dính giảm. Yêu cầu: Phải nhào trộn các nguyên liệu đúng công thức tạo điều kiện cho protein bột mì kết hợp với nước tạo gluten ướt. Khối bột nhào xong phải dẻo, đàn hồi tốt. Thử ấn nhẹ lên mặt bột để kiểm tra, sẽ thấy bột đàn hồi (phồng) trở lại và khi nhắc ngón tay lên thì bột sẽ không dính vào tay . Hình 1.2: Máy nhào bột 6
16. Đồ án tốt nghiệp ❖ Các biến đổi trong quá trình nhào trộn Biến đổi vật lý: Trong quá trình nhào trộn xảy ra sự chuyển pha. Từ hỗn hợp các thành phần nguyên liệu ban đầu với các pha khác nhau (hai pha rắn – lỏng) chuyển thành một pha nhão – bột nhào dạng paste, đồng nhất không tách rời, dẻo, có độ xốp nhất định và độ dính giảm. Sau một thời gian nhào còn tạo ra pha khí do sự tích lũy các bọt khí khi nhào và do nấm men tạo ra nên thể tích khối bột tăng. Ngoài ra, sự ma sát và các phản ứng hóa học xảy ra trong quá trình nhào làm cho nhiệt độ của khối bột nhào sẽ tăng. Biến đổi hóa lý: Khi nhào bột, gliadin và glutenin hút nước tạo gluten. Sự trương nở của gluten giúp tạo cấu trúc xốp, dẻo và đàn hồi của ruột bánh. Tinh bột liên kết với nước trong quá trình nhào bột. Đồng thời có sự phân ly của muối ăn thành các ion làm tăng độ chặt của khung gluten. Và còn có sự hòa tan của đường và muối. Biến đổi sinh học: Hô hấp yếm khí sinh thêm khí CO2, rượu ethanol và các sản phẩm phụ có quá trình lên men tạo ra acid hữu cơ như acid lactic, oxalic, acetic, succinic, malic, formic, tạo vị chua và hương đặc trưng. Lượng khí CO2 tích tụ trong khối bột nhào tạo nên những túi khí, do đó khối bột trở nên xốp và thể tích tăng lên rõ rệt. Khi lượng khí sinh ra nhiều, khung gluten có tác dụng giữ cho các túi khí không bị vỡ làm ảnh hưởng đến độ nở của bột. 2. Lên men ổn định sơ bộ Trong quá trình lên men bột nhào, nấm men chuyển đường và tinh bột qua các giai đoạn trung gian và cuối cùng tạo CO2 làm nở bột nhào. Ngoài ra, còn có các 7
17. Đồ án tốt nghiệp sản phẩm phụ như acid lactic, acetic, rượu etylic, aldehyt, ester tạo cho bánh mì có mùi thơm đặc trưng. Trong quá trình lên men bột nhào, tinh bột và chất cao phân tử khác được thủy phân thành những chất có phân tử lượng thấp làm tăng độ tiêu hóa của bánh mì. Cách tiến hành: Sau khi nhào xong, bột nhào đạt yêu cầu thì đem đi lên men sơ bộ. Lên men trong quá trình này là lên men yếm khí, nên cho bột nhào vào tô và sau đó lấy màng bao thực phẩm đậy kín miệng tô lại. Để yên khối bột ủ trong vòng 30 phút ở nhiệt độ thường. Hình 1.3: Khối bột nhào sau khi lên men ổn định sơ bộ 3. Tạo hình Quá trình tạo hình bán thành phẩm gồm có các bước chia, vê, ổn định cấu trúc và tạo hình bánh. Chia bột nhằm định lượng khối bột và tạo ra sản phẩm bánh mì đồng đều. Sai số cho phép là 1 ÷ 1,5%. Sau khi chia, cục bột nhào phải được lăn vê ngay. Lăn vê có tác dụng làm cho cấu trúc của bột nhào trở nên tốt hơn và ruột bánh xốp đều. Đầu tiên, cả khối bột bạt lớn sẽ được chia thành từng phần có khối lượng đồng đều là 50 g. Khi đó, mạng gluten của từng viên bột bị đứt gãy và một phần khí carbonic thoát ra ngoài. Vê tròn viên bột nhào để củng cố lại mạng gluten đã đứt, làm cho cấu trúc bột nhào trở nên tốt hơn, ruột bánh xốp đều hơn. Từng khối bột được vê thành các khối cầu tròn có bề mặt nhẵn mịn để tránh tình trạng bánh bị nứt sau lên 8
18. Đồ án tốt nghiệp men. Hình dáng cầu cũng là hình dáng giúp cho khối bột nở tốt nhất trong quá trình lên men. Hình 1.4: Bột nhào sau khi tạo hình 4. Lên men kết thúc Lên men kết thúc có mục đích là hoàn thiện, đây là một khâu quan trọng trong quy trình sản xuất bánh mì. Trong quá trình chia và tạo hình bánh thì một phần lớn khí CO2 trong chiếc “bánh sống” đã thoát ra ngoài. Lên men cuối nhằm tích lũy thêm lượng khí CO2 tạo thành do nấm men có trong “bánh sống” tạo ra. Lượng khí này sẽ tích tụ làm cho “bánh sống” nở lên và hình thành kết cấu bánh như mong muốn. Bột nhào sau khi được tạo thành hình tròn, xếp đều lên khay nướng có lót giấy nến và rồi cho vào lò nướng ủ ở nhiệt độ 400C, khoảng 40 phút. Đồng thời cho cốc nước vào lò để giữ ẩm cho bột nhào không bị khô trên bề mặt trong quá trình ủ. Sau đó, đóng kín cửa lò lại để giữ hơi ẩm lại trong lò và ổn định được nhiệt độ chính xác. Trong lần lên men này, khi bột ủ xong sẽ nở khoảng gấp rưỡi đến gấp đôi. 9
19. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5: Bột nhào sau khi lên men kết thúc 5. Nướng bánh Mục đích của nướng bánh là để chế biến và bảo quản. Nướng bánh là quá trình làm chín sản phẩm, tạo hương vị, màu sắc cho bánh mì thành phẩm. Nhiệt độ nướng cao còn có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật, ức chế hệ enzyme có trong bột nhào. Cách tiến hành: Sau khi lên men kết thúc xong thì đem đi nướng ở nhiệt độ 1700C trong vòng 13 phút. Trước khi nướng, dùng bình tia phun nước lên khoảng không phía trên bánh và thành lò. Rồi đóng nhanh cửa lò lại, làm như vậy để tạo hơi nước cho quá trình nướng bánh. Hơi nước giúp giữ ẩm cho mặt bánh, để mặt bánh khô cứng chậm hơn, tạo điều kiện cho bánh nở tối đa và giúp cho vỏ bánh vàng chậm hơn. Vì khi mặt bánh cứng lại quá nhanh sẽ kìm hãm độ nở của ruột bánh. Hình 1.6: Bánh mì thành phẩm 10
20. Đồ án tốt nghiệp ❖ Các biến đổi trong quá trình nướng Biến đổi độ ẩm và nhiệt độ của cục bột nhào Trong quá trình nướng, các lớp khác nhau trong bánh như vỏ bề mặt, lớp sát vỏ và ruột bánh có những thay đổi khác nhau. Nước ở lớp ngoài vỏ bánh sẽ di chuyển vào bên trong ruột và một phần bốc hơi. Điều này xảy ra là do quá trình truyền nhiệt từ lớp ngoài vào trung tâm do chuyển ẩm từ nơi có độ ẩm cao (dưới lớp vỏ bánh) đến nơi có độ ẩm thấp (môi trường). Biến đổi sinh hóa và vi sinh vật Trong quá trình nướng bánh, có gần 70 chất gây hương được tạo thành thuộc các nhóm rượu, acid, ester, aldehyde, ceton, tạo hương thơm đặc trưng cho bánh mì. Ở nhiệt độ 700C, nấm men và vi sinh vật sẽ ngừng hoạt động. Nhiệt độ cao có tác dụng thúc đẩy cường độ thủy phân tinh bột. Ngoài ra, phản ứng Maillard ở lớp vỏ tạo màu nâu và các chất thơm khác cho bánh. Cường độ màu của vỏ bánh phụ thuộc vào hàm lượng acid amin và đường khử trong bột nhào. Các quá trình keo hóa xảy ra Quá trình đông tụ protein và hồ hóa tinh bột là hai quá trình keo hóa chủ yếu trong quá trình nướng giúp bánh chín và có giá trị cảm quan. Tinh bột đã hồ hóa liên kết với nước tự do trong bột nhào và nước tách ra từ quá trình biến tính protein. Nước tự do trong bánh giảm đi làm cho ruột bánh mì khi chín trở nên khô ráo. Protein bị biến tính tạo thành bộ khung cho bánh mì, cố định hình dạng của bánh. Các hạt tinh bột đã nở ra trong khi nướng thì bao quanh mạng lưới protein đông tụ. Thay đổi thể tích và khối lượng bánh nướng Việc tăng thể tích bánh là do các chất khí như CO2, chất mùi và hơi nước sinh ra trong quá trình lên men và nướng bánh. Các chất khí này dãn nở trong quá trình nướng và tạo ra các lỗ trong ruột bánh. 11
21. Đồ án tốt nghiệp Trong quá trình nướng, khoảng 95% sự giảm trọng lượng của bánh là do ẩm tách ra khỏi bánh. Ngoài ra còn do quá trình bay hơi của các chất khí khác. 6. Làm nguội Sau quá trình nướng, bánh mì cần được làm nguội trước khi đưa vào bao gói để bảo quản. 1.1.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì Trong điều kiện độ ẩm không khí dưới 79% và nhiệt độ dưới 200C, ẩm độ của bột dưới 15% vi sinh vật trong bột sẽ không tăng lên mà dần dần chết đi khi bảo quản bột trong thời gian dài. Nếu ẩm độ của bột chỉ cần tăng lên 1 – 2% thì vi khuẩn và nấm mốc trong bột sẽ phát triển mạnh. Để bảo quản bột tốt cần bảo quản bột ở độ ẩm không khí dưới 79%, ẩm độ của bột không quá 14 – 15% trong điều kiện nhiệt độ ổn định. Ở điều kiện này, giữ bột được 3 – 5 tháng, ở điều kiện ẩm độ bột từ 12 – 13% giữ được 1 năm. 1.1.3.1 Hệ vi sinh vật bánh mì Hệ vi sinh vật bánh mì bắt nguồn từ bột mì, man bánh mì và tạp nhiễm. Khi làm bột nhào men bánh mì hoạt động mạnh tạo ra rượu và khí carbonic làm nở bột nhào. Khi nắn bánh và đem nướng hầu hết vi sinh vật đều bị tiêu diệt trừ một số bào tử chịu nhiệt còn tồn tại. Khi nướng bánh nhiệt độ bên ngoài tới 180 – 2000C, các vi sinh vật ngoài vỏ bánh chết hết và trong ruột bánh nóng dần lên nhưng bào tử của chúng vẫn còn sống. Khi gặp điều kiện thuận lợi, các bào tử phát triển làm hỏng bánh mì. Trong quá trình vận chuyển và bảo quản còn bị tạp nhiễm các vi sinh vật trong đó có cả trực khuẩn đường ruột rất nguy hiểm. Vì vậy khi vận chuyển và bảo quản cần đảm bảo vệ sinh an toàn. 12
22. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.2 Hư hỏng bánh do vi sinh vật Do bánh mì thành phẩm còn một số bào tử của các trực khuẩn không bị tiêu diệt khi nướng bánh hay các tế bào sinh dưỡng của một số vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Đó chính là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. − Bệnh nhớt ruột bánh mì do vi khuẩn Bacillus: bệnh này do trực khuẩn khoai tây và trực khuẩn cỏ khô gây ra. Khi chúng phát triển sẽ tiết ra enzyme protease thuỷ phân protein làm ruột bánh mì bị dính nhớt, thẫm màu và có mùi khó chịu. Để hạn chế bệnh này cần tăng độ axit của bột nhào, làm pH giảm xuống khoảng 4,5 - 5 sẽ kiềm hãm trực khuẩn Bacillus mesentericus và Bacillus subtilis phát triển. − Ruột bánh mì bị đỏ: có một số vi khuẩn và nấm sinh sắc tố phát triển trong ruột bánh mì và làm ruột bánh mì có màu đỏ. Bệnh này không nguy hiểm đối với người, thường gặp vi khuẩn Bacillus prodigiosum. − Mốc bánh mì: bánh mì thường bị mốc bên ngoài do tạp nhiễm các bào tử nấm mốc và bảo quản trong điều kiện nóng ẩm cũng như ẩm độ của bánh mì cao và xếp quá chặt. − Bệnh say bánh mì: bệnh này do nấm Fusarium sporotrichioides có lẫn trong bột mì từ những hạt lúa mì ở những cây có nấm này ký sinh trên đồng ruộng. Nấm này chịu nhiệt cao và không bị chết khi nướng bánh. Khi chúng phát triển trên bánh mì không thấy dấu hiệu hư rõ rệt nhưng chúng tiết ra độc tố khi ăn phải người bị ngộ độc thấy ngây ngất như say rượu. 1.1.3.3 Tác hại của nấm mốc Những tổn thất về kinh tế và các nguy cơ sức khoẻ do độc tố nấm gây ra là mối quan tâm chính của ngành công nghiệp thực phẩm (Gray & Bemiller, 2003). Theo Gerez và cộng sự (2009) sự hư hỏng do nấm của các sản phẩm bánh mì xảy ra phổ biến nhất ở các nước có độ ẩm và nhiệt độ cao. Pitt và Hocking (1999) ước tính rằng khoảng 5-10% sản lượng lương thực bị hư hỏng do sự tăng trưởng của men và nấm trong các nguyên liệu thực phẩm. Tương tự, ở Tây Âu, sự gia tăng của sự hư 13
23. Đồ án tốt nghiệp hỏng của bánh mì ước tính đạt hơn 200 triệu Euro một năm (Legan, 1993; Schnürer & Magnusson, 2005). Aspergillus và Penicillium là những loại nấm phổ biến nhất gây hư hỏng thức ăn trong khi các loài Fusarium được báo cáo là gây hư hại các hạt ngũ cốc trong ruộng (Samson và cộng sự, 2000). Ngoài ra, nấm tạo ra hương vị khó chịu, sản xuất mycotoxins và các hợp chất gây dị ứng. Có hơn 400 loại độc tố nấm gây ra bởi các loại nấm khác nhau (Filtenborg và cộng sự, 1996). Sáu loại chất độc độc hại thường gặp trong các loại thực phẩm khác nhau là: aflatoxins, fumonisins, ochratoxins, patulin, trichothecenes và zearalenone (Dalié và cộng sự, 2009). Aspergillus niger là một loại nấm và một trong những loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus. Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), ochratoxin A, stermatocystin, axit cyclopianxoic. Aspergillus niger chứa nhiều độc tố, một số vô hại. Các độc tố của nó chứa malformin C và ochratoxin A. 1.1.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì Nấm men được dùng trong sản xuất bánh mì thuộc giống Saccharomyces, loài cerevisae, lớp Ascomycetes, ngành Nấm. Nấm men Saccharomyces cerevisae có khả năng sử dụng glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn carbon; sử dụng acid amin, muối ammonium như nguồn nitơ. Chức năng chính của nấm men là sinh khí CO2 làm tăng thể tích khối bột nhào. Ngoài ra, các sản phẩm của quá trình lên men được tích lũy trong khối bột sẽ tạo nên các hương vị đặc trưng cho bánh mì thành phẩm. Vì vậy, nấm men có vai trò rất quan trọng trong lên men bánh mì. Nấm men sử dụng đường có trong bột mì làm cơ chất chủ yếu để tạo ra sản phẩm là cồn và CO2 theo phương trình: 6 12 6 → 2 2 5 + 2 2 Lượng CO2 tích tụ trong khối bột nhào tạo nên những túi khí, do đó khối bột trở nên xốp và thể tích tăng lên rõ rệt. Khi nướng bánh ở nhiệt độ cao, CO2 có trong mạng lưới gluten tăng thể tích làm cho mạng gluten cũng căng lên và trở thành 14
24. Đồ án tốt nghiệp túi chứa CO2. Nhiệt độ càng tăng, CO2 bắt đầu thoát khỏi mạng gluten sẽ tạo nên những lỗ xốp trong bột bánh làm cho bánh có độ xốp. Trong suốt quá trình lên men bột nhào và lên men kết thúc, luôn xảy ra những phản ứng sinh hóa sinh ra các sản phẩm như: rượu, acid, este, andehyde, ceton, furfurol nhằm tích tụ hương thơm và mùi vị đặc trưng cho bánh mì. Đặc biệt khi nướng bánh, gần 70 chất gây hương vị được tạo thành và có xảy ra phản ứng Maillard sinh ra melanoidin (là các polymer không no hòa tan được trong nước, sau đó là các polymer không no và không hòa tan trong nước, nhưng đều có màu đậm và gọi chung là melanoidin). Nấm men cũng giúp chuyển hóa những chất có cấu trúc phức tạp trong bột mì thành những chất đơn giản giúp cho hệ tiêu hóa của người sử dụng. Các dạng nấm men thường sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì là men ép, men khô, men lỏng và men ủ chua. Men ép và men khô được sản xuất từ nhà máy chuyên sản xuất nấm men. Men lỏng và men ủ chua thường được chuẩn bị ngay trong nhà máy sản xuất bánh mì. Thường trong sản xuất bánh mì, người ta dùng men khô nhập khẩu của nước ngoài. Men khô có hai loại là Active dry yeast và Instant yeast. Nhưng thường được sử dụng nhất là Instant yeast (men Instant), bởi vì có thể trộn thẳng với bột mà không cần phải kích hoạt và có nhiều ưu điểm. Men Instant cũng là men khô, hạt mịn, màu nâu nhưng không cần kích hoạt, giúp tạo ra nhiều hơi khí hơn, hoạt động mạnh hơn và chịu được cồn cao hơn các loại men kia. Cho nên cùng với một lượng bột thì lượng men instant sẽ ít hơn là men Active dry. Cần lưu ý rằng không phải càng nhiều men thì bánh càng nở to mà cho ra kết quả ngược lại, men quá nhiều thì hoạt động càng nhiều sẽ sinh ra nhiều hơi rượu, hơi khí và làm cho bột chua hơn bình thường. Hơn thế nữa, vì có quá nhiều hơi khí 15
25. Đồ án tốt nghiệp trong bột nên khi nướng bánh nở rất nhanh trong khi các sợi gluten chưa kịp cứng lại, có thể làm bánh sẽ xẹp ngay từ trong lò. 1.2 Tổng quan về bột chua Lên men bột và nước dựa trên một quá trình tức thời để tạo ra bột nhào chua là một phương pháp quan trọng hiện nay (Vogel và cộng sự, 1999). Khối bột lỏng sẽ được bổ sung chủng khởi động, sử dụng các công thức và điều kiện lưu giữ để làm mới men cái theo chu kỳ (Hammes & Ganzle, 1995; Onno & Rouseel, 1994; Ottogalli, Galli, & Foschino, 1996). Trong các vi khuẩn lên men chính, ngoại trừ nấm men còn có vi khuẩn sinh acid lactic (LAB). Trong quá trình tạo bột chua truyền thống, một phần bột được trộn lẫn với men và bổ sung đủ nước để tạo độ xốp, sau đó để lên men trong vài giờ, thường là để qua đêm và cho tiếp xúc với không khí. Khối bột xốp sau đó sẽ được trộn chung với phần bột còn lại, ngoài ra còn có nước, muối và chất béo đến một độ dẻo nhất định và được cho lên men trong một thời gian ngắn trước khi kiểm tra lại và đem đi nướng. Kết quả, bánh mì có hương vị tuyệt vời hơn nhờ vi khuẩn lên men xâm nhập từ không khí hoặc do việc bổ sung vào 2-5% phần sản phẩm lên men của mẻ trước (Bruemmer & Lorenz, 1991). Trong quá trình chuẩn bị nướng bánh mì, một khối bột nhào xốp nên có mật độ vi khuẩn lactic vào khoảng 108 – 109 cfu/g còn nấm men thì 106 – 107 cfu/g, để có thể làm acid hóa giúp lên men khối bột và làm nở bột. Tuy nhiên, LAB có thể nhiễm vào bột 1 cách tự nhiên, từ 1 sản phẩm sữa lên men hoặc từ các chủng khởi động thương mại có chứa các dòng LAB đặc trưng được sản xuất trong quá trình lên men công nghiệp (Vuyst & Neysens, 2005). 1.2.1 Đặc tính của bột chua Đặc trưng điển hình bột chua (bột bánh mì) chủ yếu là do VSV của nó, về cơ bản đại diện bởi LAB và nấm men. Do sự có mặt của VSV, bột được chuyển hóa. Những VSV này đảm bảo sản xuất acid khi đun sôi hỗn hợp bột và nước. Cơ chế chua rất phức tạp (Hammes và Gänzle, 1998). Trong quá trình lên men, các thay đổi 16
26. Đồ án tốt nghiệp sinh hóa xảy ra trong các thành phần carbohydrate và protein của bột nhờ hoạt động của vi khuẩn và các enzyme (Spicher, 1983). Nhiều tính chất vốn có của bột chua dựa vào các hoạt động trao đổi chất của LAB: lên men lactic, thủy phân protein, và tổng hợp các hợp chất dễ bay hơi, chất chống mốc là một trong những hoạt động quan trọng nhất trong quá trình lên men chua (Hammes và Gänzle, 1998; Gobbetti và cộng sự, 1999). Sự lên men bột, cụ thể là bột chua, bị chi phối bởi LAB đặc biệt với nồng độ thích hợp 108 cfu/g, có thể cùng tồn tại hoặc có thể cộng sinh với các loại nấm men thông thường có nồng độ thấp hơn (Gobbetti và cộng sự, 1999; Vogel và cộng sự, 2002). Nấm men thường kết hợp với LAB trong bột chua với tỷ lệ nấm men / LAB thường là 1:100 (Gobbetti và cộng sự, 1994; Ottogalli và cộng sự, 1996). 1.2.2 Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua Quá trình lên men bột chua là yếu tố quan trọng trong việc tạo ra mùi vị cho bánh mì (Lund và cộng sự, 1989; Rothe & Ruttloff, 1983). Các hoạt động trao đổi chất kết hợp của các vi sinh vật, tạo ra sự acid hóa hoặc tạo chua có ảnh hưởng đến đặc tính của bánh mì, đặc biệt là kết cấu, tăng thời hạn sử dụng bằng cách giảm sự tăng trưởng của nấm mốc trong quá trình bảo quản (Corsetti và cộng sự, 2000; Oura, Soumalainen & Wiskari, 1982; Rochenck và Voysey, 1995) và tạo ra các thành phần hương vị điển hình mang lại đặc điểm cảm quan chua đặc trưng (Gobbetti, 1998; Katina và cộng sự, 2005). Trong quá trình lên men có hai loại hợp chất hương vị được sản xuất. Hợp chất không bay hơi bao gồm acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn đồng hình (Gobbetti, Corsetti, & De Vincenzi, 1995a) và dị hình (Gobbetti, Corsetti, & De Vincenzi, 1995b) làm acid hóa, giảm độ pH và đóng góp hương vị cho bột bánh mì (Barber, Benedito de Barber, Martinez-Anaya, Martinez, và Alberola, 1985; Galal, Johnson, và Varriano-Marston, 1978). Loại thứ hai các hợp chất dễ bay hơi của bánh mì từ bột chua chứa rượu, aldehyde, ketones, este và lưu huỳnh. Tất cả các hợp chất này được sản xuất bằng phương pháp sinh học và các hoạt động sinh hóa trong quá trình lên men và đóng góp vào hương vị (Spicher, 1983). 17
27. Đồ án tốt nghiệp ❖ Hợp chất không bay hơi Phản ứng giữa vi khuẩn lactic với các enzyme ngoại bào ảnh hưởng đến hoạt tính của vi sinh vật trong quá trình acid hóa, sản sinh acid acetic và các đặc tính kết cấu bánh mì. Nó thể hiện sự tăng cường các hoạt động enzyme nội sinh trong bột đã thu được khi kết hợp LAB với glucose oxidase, lipase, endo xylanase, amylase và protease. ❖ Hợp chất bay hơi Sự chuyển hóa ở vi khuẩn chứng minh việc sản xuất các hợp chất dễ bay hơi khác nhau cho sự lên men của nhóm vi khuẩn lactic. Các sản phẩm được tạo ra của quá trình lên men là 2-metyl-1-propanol; 2,3 methyl-1-butanol và các iso-alkoho khác. Các dòng LAB có sự khác biệt trong sự trao đổi chất và các hợp chất thơm. Sản xuất các hợp chất thơm dễ bay hơi trong quá trình lên men với sự kết hợp của các chủng đơn lẻ S. cerevisiae và C. guilliermondii, L. plantarum đã được thử nghiệm, được sử dụng trong cả bột lúa mì và các chất nền đơn giản như maltose và glucose (Stolz và cộng sự, 1993). Chỉ sử dụng men trong bánh mì, bảy chất dễ bay hơi đã được tìm thấy nhiều: acetaldehyde, aceton, ethyl acetat, ethanol, hexanal, rượu isobutyl, và propanol. 1.2.3 Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với hương vị của bánh mì Các phản ứng Maillard và Caramel hóa ảnh hưởng chính đối với sự hình thành hương vị trong các sản phẩm khi có sự đun nóng thì phản ứng liên quan đến các tiền chất đơn giản như acid amin và aldose đơn giản hoặc ketose đường (Rothe & Ruttloff, 1983). Số lượng acid amin tự do cao nhất đã được tạo ra trong quá trình lên men bột chua với sự kết hợp giữa LAB và S. exigus M14 (Gobbetti, Corsetti và cộng sự, 1994; Gobbetti, Simonetti và cộng sự, 1994; Kratochivil & Holas, 1983, Rothe, 1974). Các acid amin này là đơn chất của iso-alcohols (Gobbetti, Corsetti, & De Vincenzi, 1995b; Hansen & Schieberle, 2005) góp phần trực tiếp cho hương vị 18
28. Đồ án tốt nghiệp bánh mì trong quá trình lên men và nướng bánh mì (Bredie, Mottram & Guy, 2002; Damiani và cộng sự, 1996). Các sản phẩm phản ứng Maillard từ quá trình xử lý nhiệt độ cao bao gồm pyrazines, pyrrole, furan và các hợp chất chứa sunfur và các sản phẩm khác như alkanals, alkenals 2 và 2,4-alkadienal (Parker, Hassell, Mottram, & Guy, 2000). Hơn nữa, ở nhiệt độ cao hơn thì pyrrole, thiophenes, thiophenones, thiapyrans và thiazolines tăng lên và furan và aldehyde giảm (Bredie và cộng sự, 2002). Pyrazin là các hợp chất có chứa nitơ có đặc tính mùi và hương vị rất mạnh (Ji và Berhard, 1992). Do đó, việc sản xuất các hợp chất này có ảnh hưởng đáng kể đến hương vị của bánh mì. 1.2.4 Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua Các carbohydrate có trong bột mì gồm maltose tiếp theo sucrose, glucose, fructose và, cùng với một số trisaccharides như maltotriose và raffinose. Lượng glucose tăng trong quá trình lên men, trong khi giảm sucrose trong sự hiện diện của nấm men do tác động của VSV. Các nấm men có mặt trong bột chua không thể lên men maltose, một loại đường phổ biến trong bột. Tuy nhiên, tế bào nấm men vẫn có thể phát triển vì glucose cung cấp vào môi trường bởi một số loài LAB, đáng chú ý L. sanfranciscensis. Bắt đầu từ glucose, LAB lên men đồng hình sản xuất acid lactic qua đường phân (lên men đồng hình), trong khi LAB lên men dị hình cũng sản xuất, ngoài acid lactic, CO2, acid acetic, và/hoặc ethanol thông qua con đường 6- phosphogluconate/phosphoketolase(6-PG/PK) (lên men dị hình). Hexoses khác với glucose đi vào những con đường chính ở mức glucose-6-phosphate hoặc fructose-6- phosphate sau khi đồng phân hóa và/hoặc phosphoryl (Axelsson, 1999). Disaccharides được chia bởi hydrolases và/hoặc phosphohydrolases cụ thể đối với monosacarit, sau đó nhập vào con đường chính. Pentoses là phosphoryl hóa và chuyển đổi sang ribulose-5-phosphate hoặc xylulose-5-phosphate bởi epimerases hoặc isomerase và sau đó chuyển hóa phần sau của con đường 6-PG/PK (Axelsson, 1999). Sử dụng pentoses không chỉ giới hạn đối với các loài LAB có chứa phosphoketolase cấu thành, các enzyme quan trọng của con đường 6-PG/PK (lên men 19
29. Đồ án tốt nghiệp dị hình bắt buộc); LAB lên men dị hình tùy nghi, tạo ra hexose lên men thông qua glycolysis vì chúng có chứa một aldolase fructose-1,6-diphosphate cấu thành (enzyme chính của glycolysis), pentoses lên men giống như loài lên men dị hình bắt buộc. Trong những trường hợp như vậy, phosphoketolase của LAB lên men dị hình tùy nghi được gây ra bởi các đường pentose sẵn có (Hammes và Vogel, 1995). Quá trình lên men của pentoses tạo ra một lượng cân bằng của acid lactic và acid axetic; không có CO2 được hình thành, và vì không có bước khử là cần thiết để đạt được các trung gian xylulose-5-phosphate, acetyl phosphate được sử dụng bởi kinase acetate trong một bước phosphoryl mức bề mặt năng suất acetate và adenosine triphosphate, buộc LAB lên men đồng hình không lên men pentoses (Axelsson, 1999). Cho đến nay, một số nghiên cứu đã được nhắm vào các trình tự của bộ gen hoàn chỉnh của Lactobacilli, bao gồm L. brevis (Makarova và cộng sự, 2006), L. plantarum (Kleerebezem và cộng sự, 2004), và L. reuteri cũng được tìm thấy trong bột chua hoàn chỉnh. Hình 1.7: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid lactic (được chuyển thể từ Liu và cộng sự, 2008) 20
30. Đồ án tốt nghiệp Các con đường trao đổi chất của LAB ảnh hưởng đến chất lượng bánh mì được kết hợp với nguồn cacbon trung tâm sẵn có của các đồng yếu tố ảnh hưởng đến thế oxi hóa khử tế bào và môi trường. Chuyển hóa đồng hình và dị hình khác nhau về yêu cầu tái tạo đồng phân giảm, giảm nicotinamide adenine dinucleotide hoặc nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. Việc sử dụng các chất đồng nhất, như oxy hoặc fructose, như chất nhận electron bởi LAB lên men dị hình bắt buộc phải kết hợp với việc gia tăng sản xuất acetat trong bột nhão. Dựa trên các yêu cầu trao đổi chất khác nhau cho sự tái tạo cofactor, LAB lên men đồng hình và dị hình có ảnh hưởng đến các phản ứng oxi hóa khử trong bột chua ảnh hưởng đến chất lượng bánh mì ngoài sự hình thành của acetate. 1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.3.1 Giới thiệu chung Lịch sử phát hiện ra vi khuẩn lactic: − Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hoá học người Thuỵ Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua. − Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. − Vào năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic). − Đến năm 1881, ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình thành. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năng tạo bào tử. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ nghi, không chứa cytochrom và enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng phân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển. Chính do sự sinh acid lactic, một acid yếu nên vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong các thực phẩm lên men, dùng để ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây hư hỏng. LAB có thể lên men các loại 21
31. Đồ án tốt nghiệp đường monosaccharide và disaccharide nhưng không phải bất cứ chủng vi khuẩn lactic nào cũng có thể lên men đường disaccharide: một số chủng không thể lên men saccharose, một số lại không thể sử dụng được lactose, các vi khuẩn latic không lên men được tinh bột (ngoại trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các loại polysaccharide khác. Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, quy trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại. Theo khóa phân loại của Bergey, họ Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacieae. − Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc. − Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus. Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên. Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là cỏ khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột. Một số loài trong họ vi khuẩn lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hình que Phân biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 – 8 μm. Trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi. Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%). Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (5 oC hoặc thấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25 - 35 oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 45 oC. Khi gia nhiệt tới 60 – 80 oC hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Sự phát triển của nó cần 22
32. Đồ án tốt nghiệp có sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amin. Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease: phân huỷ protein của sữa thành các peptit và acid amin. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn cao hơn. Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit. Một số loài có khả năng tạo thành màng nhầy. Một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic, các loài này còn có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta gọi các hợp chất này là bacteriocin). Những chất kháng sinh này không dùng trong y học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan. Các vi khuẩn lactic ngoài việc tạo thành acid còn có 1 số loài tạo được chất thơm ( diacetyl, acetoin, acid bay hơi ) như Streptococcus diacetylactic. 1.3.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus Tuỳ theo hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thước của chúng cũng thay đổi tuỳ theo từng loài. Hình 1.8: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus 23
33. Đồ án tốt nghiệp Phân loại khoa học: - Giới: Vi khuẩn - Ngành: Firmicutes - Lớp: Bacilli - Bộ: Lactobacillales - Họ: Lactobacillacea - Giống: Lactobacillus Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus, Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes. Các loài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này. Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, plantarum. Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm. − Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, chúng được gọi là Thermobacterium, có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase). Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 450C. − Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic. 24
34. Đồ án tốt nghiệp − Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có phosphoketolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus có vai trò hữu ích trong điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy khi đi du lịch, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng không dung nạp lactose, bệnh về da như: bang đỏ do sốt, chàm, mụn trứng cá, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp. 1.3.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình thường, ngoài nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như nguồn carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà chúng còn có nhu cầu về một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng. ❖ Nhu cầu dinh dưỡng carbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các monosaccharide (glucose, fructose, manose) và các disaccaride (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccaride (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn carbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic, ❖ Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, Hiện nay, cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém. 25
35. Đồ án tốt nghiệp ❖ Nhu cầu về vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men. ❖ Nhu cầu các chất hữu cơ khác Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ.
Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic. ❖ Nhu cầu các muối vô cơ khác Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. ❖ Nhu cầu dinh dưỡng oxy Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiếu khí (microaerophile), sinh trưởng trên bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí (B.J.B Wood and Holzapfel W.H, 1995). Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí. 26
36. Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này. ❖ Thành phần môi trường nuôi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men. ❖ Yếu tố môi trường − Ảnh hưởng của nhiệt độ Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng rất lớn đối với vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40℃. Một số có thể sinh trưởng dưới 15℃ và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5℃ (B.J.B 27
37. Đồ án tốt nghiệp Wood and Holzapfel W.H, 1995). − Ảnh hưởng của pH Vi khuẩn lactic nói chung có thể phát triển được trong môi trường acid, khoảng pH của chúng có thể từ 4,5 – 8,5. Trong quá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh ra acid lactic, khi pH thấp hơn 4 một mặt nó sẽ ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nó cũng ức chế sự phát triển của chính nó, do đó cần phải theo dõi suốt quá trình lên men, dùng bazơ để điều chỉnh pH về thích hợp. − Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men. 1.3.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 1.3.2.1 Quá trình trao đổi chất Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: ❖ Vi khuẩn lên men lactic đồng hình: Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men: 4 6 12 6 → 2 3CHOHCOOH + 21,8.10 J . Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose được chuyển hóa theo chu trình EMP (Embden - Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho 28
38. Đồ án tốt nghiệp quy trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đến pyruvat. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên acid pyruvic không thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic. ❖ Lên men lactic dị hình: Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài các sản phẩm phụ như acid acetic, ethanol, acid succinic, CO2. Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men: 6 12 6 → 3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3 + 2 5 + 2 Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20%, đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích lũy một lượng lớn acid formic. Như vậy, trong quá trình lên men lactic dị hình có nhiều sản phẩm phụ khác nhau đáng kể được tạo thành, chứng tỏ quá trình này phức tạp hơn nhiều so với quá trình lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm tiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học, người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình. 1.3.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ 29
39. Đồ án tốt nghiệp như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngoài ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như reuretin, acid lactic, 1.3.3 Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic LAB được biết đến bởi khả năng kháng nấm của chúng, điều đó liên quan đến việc sản xuất 1 loạt các loại hợp chất bao đồm acid, alcohol, CO2, diacetyl, H2O2, phenyllactic acid, bacteriocin và cycle peptide. Đặc tính nổi bật của hợp chất bề mặt của LAB là tính ổn định nhiệt của các hợp chất kháng nấm có trong nó. Điều này thúc đẩy việc sử dụng các hợp chất bề mặt của LAB hoặc các hợp chất chống nấm trong các thực phẩm được xử lý nhiệt. Các hợp chất bề mặt của LAB hoạt động trong phổ pH rộng, kéo dài từ 3 đến 9 tùy thuộc vào từng chủng khác nhau. Đây có thể coi là một yếu tố chính khi LAB được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm khi so sánh với chất bảo quản hóa học (Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari, 2011). Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt động kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3 - 4,5 (Magnusson và cộng sự, 2001). Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (bảng 1.1); Lavermicocca và cộng sự, 2000; Niku- Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003; Sjogren, 2005). Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996). 30
40. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất 4-hydroxy-phenyllacticacid 3- Lactobacillusplantar 21B phenyllacticacid 3 -hydroxydecanoicacid 3 - hydroxydodecanoicacid 3 - Lactobacillusplantarum MILAB14 hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis – dodecenoicacid cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin Lactobacillusplantarum VTTE- mevalonolactone 78076 Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, Lactibacillus sanfranciscensis CB1 formic- and n- valeric acid. 31
41. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu đề tài, nội dung nghiên cứu 2.1.1 Mục tiêu Sử dụng Lactobacillus plantarum kết hợp nấm men trong lên men bánh mì nhằm kéo dài thời gian bảo quản bánh mì và khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì. 2.1.2 Nội dung nghiên cứu Khảo sát đặc điểm hình thái; sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1, khả năng kháng nấm mốc của vi khuẩn LAB in vitro. Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men bánh mì với nấm men. Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì: + Khảo sát mật độ của LAB bổ sung vào bánh mì. + Khảo sát thời gian lên men của bột nhào. + Khảo sát nhiệt độ nướng bánh. + Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích giữa các loại bánh. 2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn lactic Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và C1 được phân lập từ nem chua, cơm mẻ (Nguyễn Hoài Hương và Huỳnh Phương Quyên, 2018). 2.2.1.2 Nguồn nấm bệnh Nấm mốc Aspergillus niger được phân lập từ đậu nành nhiễm mốc do phòng thí nghiệm trường cung cấp. 32
42. Đồ án tốt nghiệp 2.2.1.3 Nấm men Nấm men Saccharomyces cerevisiae của nhà sản xuất Saf-Instant. 2.2.2 Hoá chất và môi trường sử dụng 2.2.2.1 Hoá chất − Thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal violet), Fushin, Malachite green. − Chất bảo quản Natri benzoate và Canxi propionate. − NaOH 0,01N − NaCl − Cồn 70, cồn 96 2.2.2.2 Môi trường nuôi cấy (xem ở Phụ lục 1) − Môi trường de Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS – broth). − Môi trường de Man, Rogosa, Sharpe cải tiến (MRS cải tiến). − Môi trường de Man, Rogosa, Sharpe Agar (MRS agar). − Môi trường Potato Dextrose agar (PDA). − Môi trường Potato Dextrose broth (PDB). − Môi trường Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC). 2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 2.2.3.1 Thiết bị − Tủ cấy vi sinh (Brlad France) − Tủ ủ (Memmert Germany) − Tủ lạnh Toshiba − Tủ sấy (Memmert Germany) − Máy ly tâm (Tuttligen Germany) − Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 henesis (USA) − Autoclave (Memmert Germany) − Bếp từ (Billy – England) 33
43. Đồ án tốt nghiệp − Máy nước cất (Branstead USA) − Bể điều nhiệt 2.2.3.2 Dụng cụ − Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ tinh. − Pipet thuỷ tinh 5 ml, 10 ml, 20 ml, pipetman 100 – 1000 μl − Que cấy, que trang, cây đục thạch, đèn cồn, eppendorf 1 ml, ống ly tâm lớn. − Bông thấm nước, bông không thấn nước, giấy lọc, lam, lamell, buồng đếm hồng cầu, giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa. 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp luận Chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ nem chua, cơm mẻ nên bản thân chủng vi khuẩn đã có tính an toàn thực phẩm. Từ đó ứng dụng chủng vi khuẩn lactic đồng lên men với nấm men kéo dài thời gian bảo quản bánh mì thay thế chất bảo quản hoá học. Để thực hiện nhiệm vụ đó, các thông số sau cần được xác định: mật độ vi khuẩn lactic đồng lên men nấm men, thời gian lên men, nhiệt độ nướng. Các chỉ tiêu hoá lý bột nhào trước và sau lên men cũng như bánh sau nướng như thể tích, pH, độ ẩm, acid tổng được theo dõi. Thí nghiệm sản xuất bánh mì có và không cảm nhiễm nấm mốc được thực hiện với trường hợp bổ sung vi khuẩn lactic để so sánh với bánh mì bổ sung chất bảo quản hoá học và bánh mì không chất bảo quản nhằm làm rõ vai trò ức chế nấm mốc của vi khuẩn lactic trên bánh mì. Các thí nghiệm cảm quan cũng được thực hiện nhằm chọn mật độ vi khuẩn lactic và chủng vi khuẩn lactic thích hợp để đồng lên men với nấm men trong sản xuất bánh mì. 34
44. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus - Khả năng sinh acid. plantarum L5 và C1 - Khả năng đối kháng Aspergillus niger in vitro. Khảo sát khả năng kháng nấm Mật độ LAB A.niger của vi khuẩn LAB khi - 1010 (cfu/ml) đồng lên men bánh mì với nấm - 109 (cfu/ml) men - 108 (cfu/ml) - 107 (cfu/ml) − Khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men bột nhào Khảo sát ảnh hưởng của − Khảo sát nhiệt độ nướng bánh LAB − Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích các loại bánh Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu 35
45. Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn Nguyên lactic liệu Khảo sát mật độ LAB tối ưu bổ sung Nhào bột vào sản phẩm. Chỉ tiêu theo dõi: − Độ ẩm bột nhào Lên men sơ bộ − Thể tích khối bột nhào − pH bột nhào − Hàm lượng Acid Lactic Chia bột Vê bột Khảo sát thời gian lên men. Chỉ tiêu theo dõi: Tạo hình − Độ ẩm bột nhào − Thể tích khối bột nhào − pH bột nhào Lên men kết thúc − Hàm lượng Acid Lactic Nướng Khảo sát nhiệt độ nướng bánh. Chỉ tiêu theo dõi: − Độ ẩm bánh mì − Thể tích bánh mì Làm nguội − Hàm lượng Acid Lactic − Mật độ vi khuẩn Lactic Bao gói − Mật độ nấm men nấm mốc Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích Bánh mì Chỉ tiêu theo dõi: − Mật độ nấm men nấm mốc Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng LAB lên chất lượng bánh mì 2.3.3 Thuyết minh quy trình tổng quát 36
46. Đồ án tốt nghiệp − Khảo sát hình thái vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1. − Khả năng đối kháng in vitro và đối kháng in vivo. − Khảo sát ảnh hưởng các mật độ của LAB lên tính chất bột nhào trước và sau lên men, thời gian lên men bột nhào. − Khảo sát ảnh hưởng các mật độ của LAB lên cảm quan sản phẩm.  Chọn mật độ lab tối ưu và thời gian lên men đáp ứng các yêu cầu về cảm quan và độ nở của bánh mì. − Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nướng bánh lên tính chất hoá lý và cảm quan. − Khảo sát thời gian bảo quản và đánh giá cảm quan mức độ ưa thích giữa các loại bánh mì. 37
47. Đồ án tốt nghiệp 2.4 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 2.4.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum 2.4.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa ❖ Quy trình thí nghiệm: Chủng vi khuẩn LAB Tăng sinh trong môi trường MRS-broth Ủ 24-48h Cấy truyền sang môi Quan sát hình thái trường MRS agar khuẩn lạc - Nhuộm Gram Khảo sát đặc điểm - Nhuộm bào tử sinh lý, sinh hóa - Catalase Chủng LAB thuần khiết Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus plantarum ❖ Thuyết minh quy trình: Mục đích: Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi sinh vật khác trong quá trình bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng. 38
48. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành: ❖ Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc: Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi trường MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 15 phút và ủ ở 37℃ trong 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển sang môi trường MRS agar để ủ ở 37℃ trong 48 giờ, sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc lactic. Tiếp theo, tiến hành khảo sát lại các đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn lactic bao gồm các phương pháp: nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase. • Môi trường giữ giống: Sau khi đã khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng, tiến hành cấy chuyển khuẩn lạc sang môi trường MRS agar trong ống thạch nghiêng, ủ ở 37℃ trong 24 đến 48 giờ và bảo quản trong tủ lạnh phòng thí nghiệm. ❖ Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá ➢ Nhuộm Gram Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến − Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. − Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần. − Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. − Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. − Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước, thấm khô. − Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 30 giây, rửa nước, để khô trong không khí. − Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. 39
49. Đồ án tốt nghiệp  Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ. ➢ Nhuộm bào tử Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton − Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 - 7 ngày. − Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram. − Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, rửa nước. − Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô. − Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.  Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ. ➢ Thử nghiệm catalase Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3 - 10%, nhỏ một giọt lên phiến kính. Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính.  Kết quả: Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính. Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự. 40
50. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1.2 Khả năng sinh acid ❖ Quy trình thí nghiệm: Chủng vi khuẩn LAB Tăng sinh trong môi trường MRS - broth Ủ 370C 24h Ly tâm Sinh khối Dịch sau ly tâm Phenolphthalein Chu ẩn độ NaOH 0,1N Acid tổng (%TA) Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus plantarum ❖ Thuyết minh quy trình: Mục đích: Xác định khả năng sinh acid của chủng Lactobacillus plantarum Tiến hành: − Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi trường MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 15 phút và ủ ở 37℃ trong 24 giờ. − Hút 10 ml dịch tăng sinh vào ống Falcon (lặp lại 3 lần). Ly tâm 4000 vòng / 15 phút, phần dịch sau ly tâm cho vào erlen. 41
51. Đồ án tốt nghiệp − Bổ sung 3 giọt phenolphthalein, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi dung dịch có màu hồng nhạt và pH = 8 – 8,3.  Kết quả: 푠ố 푙 × 0.1 × 90 × 100 % = 푡ℎể 푡í ℎ ẫ 1000 Trong đó: - %TA: độ acid - Số ml NaOH: thể tích NaOH 0,1N đã sử dụng đổ chuẩn độ. - Thể tích mẫu (ml): dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus plantarum Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4 42
52. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum in vitro ❖ Quy trình thí nghiệm: Hoạt hóa A.Niger trên Hoạt hóa chủng vi khuẩn môi trường PDB LAB trên môi trường MRS - broth Tăng sinh A.Niger trên môi trường PDB Tăng sinh chủng vi khuẩn LAB trên môi trường Cấy vào đĩa petri MRS - broth chứa môi trường PDA Đặt thạch nấm Đặt thạch nấm ĐC âm Ria 2 (Không đường ria vi LAB khuẩn) Ủ 72h ở nhiệt độ phòng Đo đường kính ức chế nấm Tỷ lệ ức chế nấm bệnh Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. 43
53. Đồ án tốt nghiệp ❖ Thuyết minh quy trình: Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của chủng vi khuẩn theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn. Tiến hành: • Chuẩn bị môi trường vi khuẩn: Hoạt hóa 2 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. • Chuẩn bị chủng nấm để đối kháng: Hoạt hóa chủng nấm mốc có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi trường PDB ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường PDB ở 370C trong 24h. Cấy điểm vào đĩa petri chứa môi trường PDA và ủ 72h ở nhiệt độ phòng. • Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng: Môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó, phối vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa 15 ml. Khi thạch đã đông, ta tiến hành đục thạch ở đĩa nấm mốc đặt vào tâm các đĩa. Mỗi đĩa lặp lại 3 lần. Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng. Sau 24h, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn cách ngoài mép đĩa 1,5 cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đường kính) cần thử đối kháng vào. Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm đĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng. Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày. Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm: 44
54. Đồ án tốt nghiệp 1,5 1,5 Dđc Dtn cm cm Đường cấy vi khuẩn Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn Trong đó: - Dđc: đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng - Dtn: đường kính (cm) đĩa thí nghiệm Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4 2.4.2 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh mì của vi khuẩn LAB với nấm men ❖ Quy trình thí nghiệm 45
55. Đồ án tốt nghiệp Lactobacillus plantarum L5 và C1 C1C1 Aspergillus niger Tăng sinh trong môi trường MRS - Broth Cấy truyền sang môi trường PDA Ủ + lắc 24h Cạo bào tử trên đĩa petri Pha loãng 2 lần Định mức 100 ml Đo OD600nm Đo OD620nm Ly tâm Xịt nấm lên bề mặt mẫu Rửa nước muối sinh lý Ly tâm TH2: Không 3 TH1: 10 cảm nhiễm Sinh khối Bánh mì Theo dõi ngày đầu tiên xuất hiện tơ nấm sau nướng Hình 2.7: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì. 46
56. Đồ án tốt nghiệp ❖ Thuyết minh quy trình: Mục đích: Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum trên bánh mì. Tiến hành: Chủng Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1 cấy truyền 5% sang môi trường MRS để tăng sinh, sau đó được đem đi ủ và lắc đồng thời ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 tiếng. Hút 2 ml dịch tăng sinh đem ly tâm, bỏ dịch và pha loãng bằng nước muối sinh lý 0,9% vô trùng. Tiếp tục pha loãng 2 lần bằng nước muối sinh lý 0,9% vô trùng, sau đó đo OD600nm. Ghi nhận kết quả và thế vào phương trình đường chuẩn tính được lượng tế bào cần bổ sung vào bánh mì. Lấy thể tích dịch tăng sinh cần ly tâm đem ly tâm 4000 vòng trong 15 phút trong ống Falcon, sau đó bỏ dịch. Cho nước muối vô trùng vào ống, lắc nhẹ để rửa sạch sinh khối sau đó đem ly tâm 4000 vòng trong 15 phút. Lặp lại thao tác rửa nước muối vô trùng rồi ly tâm thêm 1 lần nữa để loại bỏ tối ưu các tạp chất của môi trường nuôi cấy còn sót. Sinh khối thu được sẽ được hòa với sữa không đường, lắc nhẹ cho hòa tan rồi bổ sung vào với các thành phần bánh mì. ➢ Trường hợp 1: Có cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 103 (tb/ml) − Giống được cấy truyền sang môi trường PDA agar và được ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 đến 4 ngày để nấm có thể mọc kín đĩa môi trường. − Sau khi ta thu được đĩa nấm nuôi cấy, hút 5 ml nước muối sinh lý 0,9% có bổ sung Tween 80 vô trùng vào đĩa nấm, dùng muỗng inox đã được hấp khử trùng cạo bề mặt đĩa nấm sau đó đổ vào bình định mức 100 ml. Lặp lại thao tác cạo khoảng 5 lần đến khi bề mặt đĩa nấm được cạo sạch. − Định mức dịch nấm bằng nước muối sinh lý có Tween 80 đến 100 ml, ta 47
57. Đồ án tốt nghiệp được mẫu dung dịch nấm cần. − Sau đó đo OD620nm, ghi nhận kết quả đo và tính toán lượng bào tử cần phun lên bề mặt bánh. − Cho 11 mẫu bánh mì vào từng bao khác nhau và tiến hành xịt nấm lên bề mặt mẫu. − Đóng kín miệng bao rồi theo dõi từng ngày đến khi bánh mì có dấu hiệu nổi mốc và ghi nhận kết quả. ➢ Trường hợp 2: Không cảm nhiễm nấm, để ngoài tự nhiên − Cho 11 mẫu bánh mì vào từng bao khác nhau và đóng kín miệng bao. − Theo dõi từng ngày đến khi bánh mì có dấu hiệu nổi mốc và ghi nhận kết quả. Số liệu được xử lí bằng phần mềm JMP. 48
58. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của LAB 2.4.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men của bột nhào ❖ Sơ đồ bố trí thí nghiệm L. plantarum L5 L. plantarum C1 - 1010 cfu/ml - 1010 cfu/ml - 109 cfu/ml - 109 cfu/ml - 108 cfu/ml - 108 cfu/ml - 107 cfu/ml - 107 cfu/ml Vi khuẩn lactic Nguyên Nhào bột liệu Lên men sơ bộ Chia bột Vê bột 30’ Chỉ tiêu theo dõi: bột − Độ ẩm bột nhào − Thể tích bột nhào Lên men kết thúc 40’ − pH bột nhào bột − Hàm lượng Acid Lactic 50’ bột Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men của bột nhào 49
59. Đồ án tốt nghiệp a) Mục đích Xác định ảnh hưởng của các mật độ vi khuẩn lactic và thời gian lên men đến thể tích bột nhào, độ ẩm, pH, acid tổng trong khối bột nhào lúc trước và sau lên men. Đánh giá cảm quan các mẫu bánh của từng mật độ vi khuẩn ứng với ba mức thời gian lên men khác nhau. Lựa chọn ra mật độ vi khuẩn lactic và thời gian lên men tối ưu làm cho thể tích bột nhào nở cao nhất, pH thấp, sinh acid nhiều, độ ẩm cao nhất. b) Quy trình thực hiện − Cân các nguyên liệu làm bánh mì chính xác theo công thức, sau đó trộn các nguyên liệu chung lần lượt các mẻ bột với từng mật độ vi khuẩn (Lactobacillus plantarum L5-107, L5-108, L5-109, L5-1010 và Lactobacillus plantarum C1-107, C1-108, C1-109, C1-1010). − Khi trộn tất cả nguyên liệu lại với nhau, bắt đầu nhào bột bằng máy nhào trộn trong 13 phút ở tốc độ chậm nhất của máy. − Sau khi nhào, ủ sơ bộ khối bột nhào trong 30 phút ở nhiệt độ thường, rồi chia bột 50 g, vê bột, tạo hình khối cầu tròn. o − Tiến hành lên men kết thúc ở 40 C với ba mốc thời gian khác nhau: T1 = 30 phút, T2 =40 phút, T3 =50 phút. − Lấy mẫu bột nhào trước và sau lên men đem đi khảo sát các chỉ tiêu, từ đó chọn ra mật độ vi khuẩn tối ưu và thời gian lên men đáp ứng yêu cầu về cảm quan và độ nở của bánh mì. − Sau đó, đem nướng bánh để khảo sát cảm quan bánh mì thành phẩm. c) Khảo sát các thông số đo − Thể tích − Độ ẩm − pH − Acid tổng − Đánh giá cảm quan. 50
60. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ nướng bánh ❖ Sơ đồ bố trí thí nghiệm Mật độ tối ưu Mật độ tối ưu Lactobacillus Lactobacillus plantarum L5 plantarum C1 Vi khuẩn lactic Nguyên Nhào bột liệu Lên men sơ bộ Chia bột Vê bột Lên men kết thúc 1600 Chỉ tiêu theo dõi: − Thể tích bánh Nướng 1700 − Độ ẩm bánh − Hàm lượng Acid lactic 1800 − Mật độ vi khuẩn lactic Bánh mì Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nướng bánh 51
61. Đồ án tốt nghiệp a) Mục đích Xác định ảnh hưởng của các mức nhiệt độ nướng đến thể tích bột nhào, độ ẩm, độ acid tổng, màu sắc và mật độ vi khuẩn lactic còn lại trong bánh mì thành phẩm sau khi nướng. Lựa chọn ra nhiệt độ nướng thích hợp. b) Quy trình thực hiện − Khi có kết quả của thí nghiệm 1, chọn ra một mật độ vi khuẩn lactic của Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1 tốt nhất và chọn ra được thời gian lên men thích hợp ứng với hai con vi khuẩn lactic đó. − Sau đó, đem sinh khối vi khuẩn lactic trộn với các nguyên liệu bánh mì theo công thức ở mục 1.1.2, rồi thực hiện quy trình làm bánh mì như sơ đồ hình 1.1. − Đến công đoạn nướng sẽ nướng bánh với ba mức nhiệt độ nướng khác 0 0 0 nhau: t1 = 160 C, t2 = 170 C, t3 = 180 C. − Bánh mì sau khi nướng đem đi khảo sát các chỉ tiêu. c) Khảo sát các thông số đo − Thể tích − Độ ẩm − Acid tổng − Mật độ vi khuẩn lactic của bánh mì sau khi nướng. 52
62. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích giữa các loại bánh mì ❖ Sơ đồ bố trí thí nghiệm Nguyên liệu Nhào bột Lên men sơ bộ Chia bột Vê bột Lên men kết thúc Nướng Làm nguội Bao gói Chỉ tiêu theo dõi: Bánh mì − Mật độ nấm men nấm mốc Khảo sát mức độ ưa thích 53
63. Đồ án tốt nghiệp Bánh bổ sung Canxi Bánh mì vi khuẩn Natri benzoate propionate thường Lactic D0 D1 D0 D1 D0 D1 D0 D1 bộ bộ bộ bộ bộ bộ bộ Hình 2.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích giữa các loại bánh mì a) Mục đích Xác định sự khác nhau về mật độ nấm men, nấm mốc của bánh mì bổ sung vi khuẩn lactic sau khi nướng và sau 5 ngày giữa các loại bánh mì có chất bảo quản (Canxi propionate và Natri benzoate) và bánh mì thường. Ngoài ra, xác định sự khác nhau về đánh giá cảm quan của các loại bánh mì: bánh mì bổ sung vi khuẩn lactic, bánh mì có chất bảo quản và bánh mì thường. b) Quy trình thực hiện − Khi có kết quả của thí nghiệm 1 và 2, chọn ra một mật độ vi khuẩn lactic của Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1 tốt nhất và chọn ra được thời gian lên men và nhiệt độ nướng thích hợp ứng với hai con vi khuẩn lactic đó. − Sau đó, đem sinh khối của vi khuẩn lactic trộn với các nguyên liệu bánh mì theo công thức, rồi thực hiện quy trình làm bánh mì như sơ đồ hình 1.1. − Lần lượt làm thêm 3 mẻ bánh mì: bánh mì bổ sung Natri benzoate, Canxi propionate và bánh mì thường. Các loại bánh mì sau khi nướng đem đi khảo sát các chỉ tiêu và đánh giá cảm quan. 54
64. Đồ án tốt nghiệp c) Khảo sát các thông số đo Mật độ nấm men, nấm mốc của mẫu bánh mì sau khi nướng (D0) và mẫu bánh mì sau 5 ngày bảo quản (D1). Tiến hành đánh giá cảm quan mức độ ưa thích giữa các loại bánh mì sau khi nướng. 2.4.3.4 Phương pháp phân tích các thông số đo a) Thể tích Định hình bánh mì dưới dạng hình tròn: − Dùng thước đo đường kính và chiều cao của khối bột trước lên men. − Bột sau khi lên men dùng thước đo lại đường kính và chiều cao của khối bột. − Bánh sau khi nướng, dùng thước đo đường kính và chiều cao để xem sự thay đổi của bánh. Sau đó lấy đường kính và chiều cao tính thể tích khối bột nhào theo công thức: πH 3 D2 V= ( + H2) 6 4 Trong đó: - D: là đường kính khối bột trước và sau khi lên men /s au khi nướng (cm). - H: là chiều cao khối bột trước và sau khi lên men / sau khi nướng (cm). b) Độ ẩm Dùng cân sấy ẩm đo độ ẩm của bột nhào/bánh mì thành phẩm, cân bột nhào / bánh mì thành phẩm 0,3 g trên miếng nhôm của cân sấy ẩm. Sau đó, bắt đầu sấy cho hết nước trong mẫu thì sẽ cho ra kết quả ẩm trong bột nhào / bánh mì thành phẩm. Riêng với mẫu bột nhào cần dàn thật mỏng mẫu trước khi bắt đầu sấy tách hết nước. 55
65. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.11: Cân sấy ẩm c) Độ acid tổng (Phương pháp tiến hành theo Tài liệu tham khảo: “Giáo trình Phân tích hóa lý thực phẩm 1” Lê Thị Hồng Ánh (chủ biên)) Chuẩn bị mẫu để đem đo acid tổng bằng cách nghiền nhỏ mẫu bằng cối sứ. Cân chính xác khoảng 10 g mẫu vào cốc 100 ml. Cho khoảng 40 ÷ 50 ml nước cất ấm trung tính vào cốc đã có mẫu. Lắc đều khoảng 1 giờ, chuyển dung dịch vào bình định mức 100 ml và thêm nước cất tới vạch. Lắc đều và lọc vào bình tam giác sạch, khô (bỏ 10 ml dịch lọc đầu). Tiến hành chuẩn độ như sau: lấy chính xác 25 ml dịch sau khi lọc cho vào bình tam giác (nếu dung dịch đậm màu thì cho thêm 50 ml nước cất trung tính), thêm 3 giọt Phenolphtalein 1% lắc đều. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền sau 30 giây. Ghi lại thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn (ml). ➢ Tính kết quả: Độ acid (độ chua) tính bằng % theo công thức: K × V ×V X = 2 1 × 100 V × m 56
66. Đồ án tốt nghiệp Trong đó: - V: thể tích mẫu chuẩn độ (ml) - V2: thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn trong chuẩn độ (ml) - m: khối lượng mẫu (g) - V1: thể tích bình định mức (ml) - K: hệ số của loại acid (là lượng acid tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N) - Với sữa và thực phẩm lên men chua, kết quả biểu thị bằng acid lactic K = 0,009. d) pH Mẫu đã được trích ly đem đi đo pH bằng máy đo pH để bàn. Hình 2.12: Máy đo pH để bàn e) Đánh giá cảm quan Phép thử cho điểm thị hiếu ❖ Mục đích: Phép thử cho điểm thị hiếu cho phép đánh giá mức độ ưa thích sản phẩm của người thử đối một dãy các mẫu khác nhau về các đặc tính cảm quan, bằng cách cho điểm theo thang điểm đã được quy ước (thang điểm 9). 57
67. Đồ án tốt nghiệp ❖ Nguyên tắc: Người thử sẽ nhận được lần lượt một dãy mẫu đã được mã hóa bằng ba chữ số, yêu cầu người thử cho điểm lần lượt từng mẫu theo thang điểm đã được quy ước (thang điểm 9). Khi giới thiệu mẫu, các trật tự mẫu phải được trình bày ngẫu nhiên đối với tất cả người thử và xuất hiện cùng một số lần như nhau đảm bảo sự cân bằng đối với nhóm người thử. Người thử không cần huấn luyện. 58
68. Đồ án tốt nghiệp PHIẾU HƯỚNG DẪN Xin vui lòng thanh vị bằng nước lọc trước khi thử mẫu. Bạn sẽ nhận được lần lượt 5 mẫu “bánh mì”. Hãy nếm các mẫu bánh này và cho biết mức độ ưa thích của bạn đối với từng mẫu “bánh mì” đó lên thang 9 điểm trong phiếu đánh giá bằng cách đánh dấu chéo vào ô điểm mà bạn cho là thích hợp nhất. Ghi mã số mẫu vào phiếu trả lời. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Trong đó: Điểm 1: cực kì không thích 6: hơi thích 2: rất không thích 7: thích 3: không thích 8: rất thích 4: hơi không thích 9: cực kì thích 5: không thích cũng không ghét Hãy sắp xếp các mẫu theo thứ tự từ ưa thích nhất đến ít được ưa thích nhất bằng cách điền mã số các mẫu vào thang trong phiếu đánh giá. Ví dụ: Ưa thích nhất PHIẾU TRẢ LỜI Ít được ưa thích nh ất Mã số người thử: Ngày: ./ ./ 2018 Mã s ố m ẫ u: Màu sắc: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Độ xốp: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Mùi: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Vị: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Đánh giá chung: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Xin cảm ơn các bạn đã tham gia buổi đánh giá cảm quan! 59
69. Đồ án tốt nghiệp f) Mật độ vi khuẩn lactic • Quy trình phân tích 10 g mẫu + 90 ml nước muối vô trùng → đồng nhất → độ pha loãng 10-1 Pha loãng trong nước muối vô trùng → độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 Từ mỗi độ pha loãng trên hút 0,1 ml cho vào 3 đĩa petri có chứa môi trường MRS agar Sau đó trang đều mẫu cho đến khi khô Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ Đọc kết quả các kết quả từ 25 – 250 khuẩn lạc 푵 A (cfu/g) = 풏 .푽.풇 + +풏풊.푽.풇풊 • Thuyết minh quy trình 1. Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 10 g mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 90 ml dung dịch nước muối sinh lí đã được hấp khử trùng. Tiến hành đồng nhất mẫu, khi đó ta được dung dịch pha loãng là 10-1. Dịch pha loãng được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm có chứa 9 ml dung dịch pha 60
70. Đồ án tốt nghiệp loãng → đồng nhất, ta có được dung dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện để có được độ pha loãng cần thiết. 2. Cấy mẫu Dùng micropipette chuyển 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng vào đĩa môi trường MRS. Dùng que cấy trang trang đều trên bề mặt cho đến khi khô. Thực hiện lặp lại 3 đĩa MRS ở mỗi nồng độ pha loãng. 3. Ủ Các đĩa lật ngược và ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. 4. Đọc và tính toán kết quả Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 khuẩn lạc để tính. Mật độ LAB trong 10 g mẫu được tính như sau: 푵 A (cfu/g) = 풏 .푽.풇 + +풏풊.푽.풇풊 Trong đó: − A: số khuẩn lạc trong 1 g mẫu − N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn − n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i − V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường − f: độ pha loãng tương ứng 61
71. Đồ án tốt nghiệp g) Mật độ nấm men, nấm mốc • Quy trình phân tích 10 g mẫu + 90 ml SPW → đồng nhất → độ pha loãng 10-1 Pha loãng trong nước muối sinh lý vô trùng → độ pha loãng 10-2, 10-3 Từ mỗi độ pha loãng trên hút 0,1 ml cho vào 3 đĩa petri có chứa môi trường DRBC Sau đó trang đều mẫu cho đến khi khô Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 - 72 giờ Đọc kết quả các kết quả từ 25 - 250 khuẩn lạc 푵 A (cfu/g) = 풏 .푽.풇 + +풏풊.푽.풇풊 • Thuyết minh quy trình 1. Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 10 g mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 90 ml dung dịch pha loãng mẫu. Tiến hành đồng nhất mẫu, khi đó ta được dung dịch pha loãng là 10-1. Dịch pha loãng được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette vô trùng chuyển 1 ml vào ống nghiệm có chứa 9 ml dung dịch pha loãng 62
72. Đồ án tốt nghiệp → đồng nhất, ta có được dung dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện để có được độ pha loãng cần thiết. 2. Cấy mẫu Dùng micropipette chuyển 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng vào đĩa môi trường DRBC. Dùng que cấy trang trang đều trên bề mặt cho đến khi khô. Thực hiện lặp lại 3 đĩa DRBC ở mỗi nồng độ pha loãng. 3. Ủ Các đĩa lật ngược và ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 - 72 giờ. 4. Đọc và tính toán kết quả Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ. Mật độ nấm men, nấm mốc trong 10 g mẫu được tính như sau: 푵 A (cfu/g) = 풏 .푽.풇 + +풏풊.푽.풇풊 Trong đó: − A: số khuẩn lạc trong 1 g mẫu − N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn − n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i − V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường − f: độ pha loãng tương ứng 63
73. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát về sinh lý, sinh hóa Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi sinh vật khác trong quá trình bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, catalase âm tính (theo khóa phân loại Bergey). Các thử nghiệm catalase tạo điều kiện cho việc phát hiện các enzyme catalase trong vi khuẩn. Phản ứng catalase là rất cần thiết để phân biệt từ catalase âm Streptococcaceae đến catalase dương Micrococcaceae. Một số báo cáo ghi nhận giá trị của phản ứng catalase trên các chủng Enterobacteriaceae. Các thử nghiệm catalase cũng rất có giá trị trong việc phân biệt các vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí bắt buộc, ví dụ như các vi khuẩn kỵ khí thường thiếu các enzyme này. Qua các khảo sát (Bảng 3.1), 2 chủng Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1 đã đảm bảo được chủng thuần khiết lactic để có thể thực hiện đề tài, kết quả được thể hiện qua bảng sau: Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn L. plantarum Lactobacillus plantarum L5 Lactobacillus plantarum C1 Khuẩn lạc trên MRS Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn, lồi, Khuẩn lạc to, tròn, nhẵn, lồi, mép agar bóng, màu trắng đục, rìa tròn gợn sóng, màu trắng đục Mô tả hình thái vi Vi khuẩn hình que hơi ngắn Vi khuẩn hình que dài khuẩn Nhuộm gram (+) (+) Nhuộm bào tử (-) (-) Catalase (-) (-) Chú thích: (+) dương tính, (-) âm tính 64
74. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar Trái: Lactobacillus plantarum L5 – Phải: Lactobacillus plantarum C1 Hình 3.2: Kết quả nhuộm Gram Trái: Lactobacillus plantarum L5 – Phải: Lactobacillus plantarum C1 3.1.2 Khả năng sinh acid Vì đề tài khảo sát sự ảnh hưởng của vi khuẩn lactic khi đồng lên men với nấm men mà acid lactic (0,1 - 0,3%) có tác dụng làm gluten trương nở và liên kết với tinh bột tốt hơn, làm chậm quá trình thoái hoá tinh bột (Bùi Đức Hợi, 2009). Để khảo sát chủng lactic sử dụng có khả năng bảo quản tốt bánh mì về mặt tính chất, người 65
75. Đồ án tốt nghiệp thực hiện đề tài khảo sát khả năng sinh acid lactic của Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1. Chủng Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1 thuộc nhóm vi khuẩn lên men đồng hình (Lưu Đại Kim Phượng, 2016). Hàm lượng % acid lactic của 2 chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS broth ở 37oC trong 24 giờ (Bảng 3.2). Kết quả cho thấy được với chủng Lactobacillus plantarum L5 (1,128%) sinh acid cao hơn Lactobacillus plantarum C1 (0,96%). Bảng 3.2: Độ acid (% TA) của chủng Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum L5 Lactobacillus plantarum C1 %TA 1,128a ± 0,02 0,96b ± 0,02 (Kết quả được so sánh theo dòng dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%) Kết quả cho thấy cả hai chủng tổng hợp acid lactic trung bình (Odu et al. 2017: acid tổng (% TA) trong thực phẩm lên men có thể lên đến 2,6%). 3.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum in vitro Aspergillus niger là một loại nấm nhiệt có khả năng sinh trưởng mạnh trong điều kiện thời tiết nóng ẩm (Metzger, 2008). A.niger là một loại nấm phổ biến phát triển rất nhanh của các chi Aspergillus. Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm mốc đen lên bánh mì. Phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method) trên môi trường rắn theo mô tả của Brunner và cộng sự (2005) là phương pháp dễ thực hiện và thể hiện rõ nét sự ức chế của vi khuẩn đối với nấm trong thời gian ngắn. Nên người thực hiện đề tài chọn phương pháp ria 2 đường vi khuẩn cùng với nấm A.niger làm vi sinh vật chỉ thị trong khảo sát in vitro. Kết quả được thể hiện qua Bảng 3.3. Ta có tỷ lệ đối kháng Lactobacillus plantarum L5 (64,31%) và Lactobacillus plantarum C1 (59,74%) tương đương nhau. 66
76. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế của vi khuẩn Lactobacillus plantarum với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn Vi khuẩn Tỷ lệ đối kháng (%) a Lactobacillus plantarum L5 64,31 ± 4,80 Lactobacillus plantarum C1 59,74a ± 5,30 (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%) TỶ LỆ ĐỐI KHÁNG NẤM 70 65 60 55 50 L5 C1 Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1 Hình 3.4: Đĩa kháng nấm chủng Lactobacillus plantarum L5 67
77. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5: Đĩa kháng nấm chủng Lactobacillus plantarum C1 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men của bột nhào. Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men bánh mì với nấm men Sự hư hỏng của bánh mì chủ yếu là do sự phát triển của nấm mốc. Khảo sát tiến hành xác định mật độ tế bào sau đó bổ sung vi khuẩn lactic ở các mật độ 107, 108, 109, 1010 (cfu/g) lần lượt đồng thời lên men bánh mì với nấm men để quan sát thời gian bắt đầu xuất hiện tơ nấm sau nướng (ngày). Cùng với 3 đối chứng BMT, BMCa, BMNa ở 2 trường hợp không cảm nhiễm và cảm nhiễm A.niger (103 bt/g) nhằm kéo dài thời gian bảo quản bánh mì không sử dụng hoá chất bảo quản. Kết quả thể hiện qua các bảng: 68
78. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum L5, bánh mì chứa chất bảo quản và bánh mì không hoá chất bảo quản Mật độ nấm Cảm nhiễm (bt/g) nấm A.niger 3 Không cảm nhiễm Mẫu mật độ 10 Mật độ Thời gian sau nướng bắt đầu xuất (cfu/g) hiện tơ nấm (ngày) BML5-7 107 3,5ab ± 0,00 7,33c ± 0,29 BML5-8 108 3,67ab ± 0,29 7,67bc ± 0,29 BML5-9 109 3,83a ± 0,58 7,83abc ± 0,29 BML5-10 1010 3,67ab ± 0,29 8,5ab ± 0,50 BMNa 3,00b ± 0,00 8,17abc ± 0,29 BMCa 3,67ab ± 0,29 8,83a ± 0,58 BMT 3,00b ± 0,00 6,17d ± 0,29 Chú thích: BML5: bánh mì bổ sung L. plantarum L5 – BMNa: bánh mì bổ sung Natri benzoate – BMCa: bánh mì bổ sung Canxi propionate – BMT: bánh mì không chất bảo quản Biện luận: Đối với trường hợp bánh mì bổ sung các mật độ Lactobacillus plantarum L5, khi không cảm nhiễm, BMT có số ngày bảo quản thấp nhất là 6,17 ngày và sai khác có ý nghĩa thống kê so với mẫu bánh mì có chất bảo quản và bánh mì lactic. Mẫu bánh mì bổ sung L5 109, 1010 và BMNa, BMCa có số ngày bảo quản dài nhất (7,83 - 8,83 ngày) và sai khác không có ý nghĩa thống kê, trong khi đó khi bổ sung L5 107, 69
79. Đồ án tốt nghiệp 108 có thời gian bảo quản là 7,33 - 7,67 ngày sai khác giữa 2 mật độ này không có ý nghĩa thống kê nhưng thấp hơn so với mật độ 109 và 1010. Khi nhiễm nấm lên bánh mì với mật độ 103 bt/g, ở mẫu bổ sung L5 mật độ 109 và 1010 thì số ngày bảo quản là 3,67 – 3,83 ngày trong khi BMT và BMNa chỉ sau 3 ngày đã nhiễm nấm và sai khác không có ý nghĩa thống kê. BMCa nhiễm nấm sau 3,67 ngày sai khác không có ý nghĩa thống kê so với bánh mì bổ sung L5 mật độ 107 và 108 và 1010 nhưng thời gian này ngắn hơn có ý nghĩa thống kê so với bánh mì bổ sung L5 109. Như vậy, kết hợp kết quả thí nghiệm cảm nhiễm và không cảm nhiễm chọn ra được mật độ L5 109 đồng lên men với nấm men để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì thay thế chất bảo quản hoá học. Bảng 3.5: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1, bánh mì chứa chất bảo quản và bánh mì không hoá chất bảo quản Mật độ nấm Cảm nhiễm (bt/g) nấm A.niger Không cảm 3 Mẫu mật độ 10 nhiễm Mật độ Thời gian sau nướng bắt đầu xuất (cfu/g) hiện tơ nấm (ngày) BMC1-7 107 3,67bc ± 0,29 6,33c ± 0,29 BMC1-8 108 4,00abc ± 0,50 6,5bc ± 0,00 BMC1-9 109 5,00a ± 0,50 7,83ab ± 0,58 BMC1-10 1010 4,17ab ± 0,58 8,5a ± 0,87 BMNa 3,0b± 0,00 8,17abc ± 0,29 70
80. Đồ án tốt nghiệp BMCa 3,67ab ± 0,29 8,83a ± 0,58 BMT 3,0b ± 0,00 6,17d ± 0,29 Chú thích: BMC1: bánh mì bổ sung L. plantarum C1 – BMNa: bánh mì bổ sung Natri benzoate – BMCa: bánh mì bổ sung Canxi propionate – BMT: bánh mì không chất bảo quản Biện luận: Đối với trường hợp bánh mì bổ sung các mật độ Lactobacillus plantarum C1, khi không cảm nhiễm, mẫu BMT có số ngày bảo quản thấp nhất là 6,17 ngày và sai khác có ý nghĩa thống kê so với mẫu bánh mì có chất bảo quản và bánh mì lactic. Mẫu bánh mì bổ sung C1 109, 1010 và BMNa, BMCa có số ngày bảo quản dài nhất (7,83 - 8,83 ngày) và sai khác không có ý nghĩa thống kê, trong khi đó mẫu bổ sung C1 mật độ 107, 108 có thời gian bảo quản là 6,33 - 6,5 ngày và sai khác giữa 2 mật độ này không có ý nghĩa thống kê nhưng thấp hơn đáng kể so với mẫu bổ sung mật độ 109 và 1010. Khi nhiễm nấm lên bánh mì với mật độ 103 bt/g, ở mẫu bổ sung C1 mật độ 109 thì số ngày bảo quản là 5 ngày và sai khác có ý nghĩa thống kê so với BMT và BMNa. Bánh mì bổ sung C1 các mật độ 107, 108, 1010 và BMCa có thời gian bảo quản nhỏ hơn bánh mì bổ sung C1 109 nhưng sai khác không có ý nghĩa thống kê. Mặc dù vậy C1 ở mật độ 109 thể hiện sự nổi trội trong bảo quản chống nấm mốc. Khi mật độ vi khuẩn lactic thấp (107 và 108) lượng chất ức chế nấm mốc không đủ nhiều, khi mật độ LAB quá cao (1010) có thể lượng cơ chất không đủ cho vi khuẩn phát triển để sinh ra lượng chất chống mốc thích hợp. Như vậy, kết hợp kết quả thí nghiệm cảm nhiễm và không cảm nhiễm chọn ra được mật độ C1 109 đồng lên men với nấm men để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì thay thế chất bảo quản hoá học. 71
81. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1 và Lactobacillus plantarum L5 Mật độ nấm Cảm nhiễm (bt/g) nấm A.niger 3 Không cảm nhiễm Mẫu mật độ 10 Mật độ Thời gian sau nướng bắt đầu xuất (cfu/g) hiện tơ nấm (ngày) BML5-7 107 3,5b ± 0,00 7,33abc ± 0,29 BML5-8 108 3,67b ± 0,29 7,67ab ± 0,29 BML5-9 109 3,83ab ± 0,58 7,83a ± 0,29 BML5-10 1010 3,67b ± 0,29 8,5a ± 0,50 BMC1-7 107 3,67b ± 0,29 6,33c ± 0,29 BMC1-8 108 4,00ab ± 0,50 6,5bc ± 0,00 BMC1-9 109 5,00a ± 0,50 7,83a ± 0,58 BMC1-10 1010 4,17ab ± 0,58 8,5a ± 0,87 Chú thích: BMC1: bánh mì bổ sung L. plantarum C1 – BML5: bánh mì bổ sung L. plantarum L5 Biện luận: So sánh mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus plantarum L5 và C1 ở mật độ 109 và 1010, ở cả hai trường hợp không cảm nhiễm và cảm nhiễm số ngày không quan sát thấy tơ nấm để sai khác không có ý nghĩa thống kê. Điều này cho thấy cả hai chủng thuộc loài Lactobacillus plantarum đều có khả năng tổng hợp hợp chất kháng nấm gần như nhau. 72
82. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6: Khảo sát đối kháng in vivo Khảo sát các thông số hóa lý của bánh mì khi bổ sung Lactobacillus plantarum L5 và C1 của quá trình lên men kết thúc: Mục đích của quá trình lên men là tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic lên men sinh acid lactic làm giảm pH bột nhào (pH= 5÷6) tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men hoạt động sinh khí CO2 làm nở khối bột nhào, đồng thời tích lũy thêm lượng acid hữu cơ có trong bột nhào tạo hương vị đặc trưng cho bánh. 73
83. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7: Kết quả khảo sát các thông số hóa lý của bánh mì khi bổ sung Lactobacillus plantarum L5 và C1 trước khi lên men kết thúc Chỉ Thể pH Độ Chỉ Thể pH Độ tiêu tiêu tích acid tích acid Mẫu (m3) (%) Mẫu (m3) (%) L5-107 26,89b 5,87a 0,216b C1-107 45,460a 5,74b 0,216b L5-108 27,19b 5,83a 0,228b C1-108 45,463a 5,97a 0,210b L5-109 30,82ab 5,02b 0,324a C1-109 42,84a 5,30c 0,252b L5-1010 32,75a 4,78c 0,336a C1-1010 43,24a 4,65d 0,426a Biện luận: Về thể tích: Các mẫu bánh mì bổ sung vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và C1 ở các mật độ 107, 108, 109, 1010 trước khi lên men kết thúc không có sự khác biệt về thể tích. Về độ pH và độ acid: Thông thường pH thích hợp cho quá trình lên men của nấm men là từ 5,0 ÷ 6,0. Acid lactic làm cho bánh có mùi vị đặc trưng. Trái lại, acid acetic và một số acid bay hơi khác ảnh hưởng không tốt đến mùi vị bánh mì. Dựa vào bảng cho thấy khi tăng mật độ L5 thì pH sản phẩm giảm tương ứng với lượng acid lactic sinh ra tăng, mật độ vi khuẩn lactic không có sự khác biệt ý nghĩa. Đối với các mẫu C1 thì khi tăng mật độ vi khuẩn 107, 108 thì pH tăng nhưng ở mật độ 109, 1010 thì pH giảm. Các mẫu bánh mì L5 mật độ 1010 và C1 mật độ 1010 sinh ra nhiều acid nên có pH thấp (4,78 và 4,65) nên tạo mùi vị không tốt cho bánh. 74
84. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8: Kết quả khảo sát các thông số hóa lý của bánh mì khi bổ sung Lactobacillus plantarum L5 sau khi lên men kết thúc Mẫu Thời Chỉ tiêu gian L.plantarum Thể tích pH Độ acid Lên men L5 (cfu/g) (m3) (%) (phút) 30' 106,13fg 5,64b 0,192c L5-107 40' 124,45ef 5,51c 0,180c 50' 175,82ab 5,82a 0,072d 30' 87,31g 5,84a 0,180c L5-108 40' 121,21ef 5,83a 0,186c 50' 155,02bcd 5,66b 0,198c 30' 127,86ef 5,15d 0,288b L5-109 40' 150,62cd 5,03e 0,324ab 50' 190,75a 4,85f 0,36a 30' 109,05fg 5,00e 0,288b L5-1010 40' 135,36de 4,98e 0,30ab 50' 165,68bc 5,00e 0,294ab Biện luận: Về thể tích: Khi tăng thời gian lên men thì thể tích sau lên men tăng và giữa các mẫu có sự khác biệt. Mẫu bánh mì bổ sung vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 mật độ 107, 108, 109, 1010 khi lên men 30, 40, 50 phút thì thể tích của các mẫu L5-107, 108, 1010 không có sự khác biệt nhưng lại thấp hơn mẫu L5-109. Về độ pH: Đối với mẫu L5-108, 109 thì pH giảm theo thời gian lên men, chứng tỏ có sự sinh ra acid lactic trong quá trình lên men. Tuy nhiên, mẫu L5-107 thì pH giảm dần 75
85. Đồ án tốt nghiệp nhưng khi lên men 50 phút thì pH lại tăng. Mẫu L5-1010 thì pH không thay đổi ở các thời gian lên men. Về độ acid: Ở các khoảng thời gian lên men 30, 40, 50 phút, độ acid của các mẫu L5-108, 109 tăng dần theo thời gian và không có sự khác biệt có ý nghĩa, tương tự ở các khoảng thời gian như vậy thì mẫu L5-107 lượng acid sinh ra có sự khác biệt có ý nghĩa nhưng lượng acid giảm dần theo thời gian lên men. Còn mẫu L5-1010 thì độ acid tăng dần nhưng lên mên đến 50 phút thì độ acid giảm. Tuy nhiên, lượng acid của các mẫu L5- 109 lên men 40 và 50 phút cao hơn cả các mẫu còn lại. Khi so sánh các mẫu bánh mì bổ sung vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 trước lên men và sau lên men cho thấy hàm lượng acid giữa các mẫu sau lên men giảm. Nguyên nhân do acid hữu cơ tham gia vào quá trình thủy phân tinh bột thành đường và tham gia phản ứng với rượu tạo ester thơm. Bảng 3.9: Kết quả khảo sát các thông số hóa lý của bánh mì khi bổ sung Lactobacillus plantarum C1 sau khi lên men kết thúc Mẫu Thời Chỉ tiêu gian L.plantarum Thể tích pH Độ acid Lên men C1 (cfu/g) (m3) (%) (phút) 30' 111,98fg 5,86d 0,187ef C1-107 40' 151,21bc 5,92c 0,168f 50' 188,57a 5,79e 0,180ef 30' 116,61efg 6,08a 0,204de C1-108 40' 136,04cd 5,94bc 0,222d 50' 185,39a 5,96b 0,180ef 30' 101,93g 5,14g 0,234cd C1-109 40' 127,65de 5,12g 0,258c 76
86. Đồ án tốt nghiệp 50' 157,81b 5,24f 0,227cd 30' 123,73def 4,74h 0,384ab C1-1010 40' 153,07b 4,73h 0,372b 50' 198,58a 4,63i 0,408a Biện luận: Về thể tích: Khi tăng thời gian lên men thì thể tích tăng và giữa các mẫu có sự khác biệt. Mẫu bánh mì bổ sung vi khuẩn Lactobacillus plantarum C1-107, 108, 109, 1010 thì thấy khi lên men 30 phút thì thể tích không có sự khác biệt. Khi tăng thời gian lên men 40 phút thì mẫu C1-108 và 109 không có sự khác biệt nhưng thể tích cao hơn so với mẫu C1-107 và 1010. Tiếp tục tăng thời gian lên men 50 phút thì ba mẫu C1-107, 108, 1010 thể tích bánh không có sự khác biệt nhưng cao hơn C1-109. Về độ pH: Nhỉn chung pH giảm theo thời gian lên men, chứng tỏ có sự sinh ra acid lactic trong quá trình lên men, và ở mẫu bánh mì C1-109 và 1010 thì lượng acid sinh ra cao hơn C1-107 và 108. Về độ acid: Ở các khoảng thời gian lên men 30, 40, 50 phút, độ acid của các mẫu C1-107 và 108 không có sự khác biệt có ý nghĩa, tương tự ở các khoảng thời gian như vậy thì mẫu C1-109 lượng acid sinh ra ở 40 phút cao hơn so với 30 và 50 phút nhưng khi xử lý thống kê thì cũng không có sự khác biệt có ý nghĩa. Tuy nhiên, hàm lượng acid của các mẫu C1-109 cao hơn các mẫu C1-107 và 108 nhưng thấp hơn các mẫu C1- 1010. Khi so sánh các mẫu bánh mì bổ sung vi khuẩn Lactobacillus plantarum C1 trước lên men và sau lên men cho thấy hàm lượng acid giữa các mẫu sau lên men 77