Khóa luận Phân lập và nuôi trồng nấm Linh chi trong điều kiện bán tự nhiên

41 trang thiennha21 13/04/2022 3990

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Phân lập và nuôi trồng nấm Linh chi trong điều kiện bán tự nhiên", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_phan_lap_va_nuoi_trong_nam_linh_chi_trong_dieu_kie.pdf

Nội dung text: Khóa luận Phân lập và nuôi trồng nấm Linh chi trong điều kiện bán tự nhiên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HÀ MY Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NUÔI TRỒNG GIỐNG NẤM LINH CHI TRONG ĐIỀU KIỆN BÁN TỰ NHIÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: K47-CNSH Khoa: CNSH-CNTP Khóa học: 2015-2019 Người hướng dẫn: ThS. Vi Đại Lâm Thái Nguyên – năm 2020
i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Ban Chủ Nhiệm khoa CNSH- CNTP, cùng toàn thể các thầy cô giáo khoa CNSH-CNTP đã giảng dạy, hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm để em có những kiến thức như ngày hôm nay. Mặc dù đã cố gắng thực hiện đề tài để hoàn thành một cách hoàn chỉnh nhất. Nhưng do cá nhân em chưa đủ kinh nghiệm trong công tác nghiên cứu, cũng như những hạn chế về thời gian và kiến thức chuyên môn nên không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất định mà bản thân chưa thấy được. Vì vậy, em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo và các bạn sinh viên để khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Hà My
ii DANH MỤC HÌNH Hình 1: Thể quả nấm Linh chi 3 Hình 2. Nuôi cấy mô thể quả nấm Linh chi trên môi trường PDA 25 Hình 3. Nuôi cấy hệ sợi trên tăm bông 26 Hình 4. Nuôi cấy mô thể quả nấm Linh chi 26 Hình 5. Sự phát triển của sợi nấm Linh chi trên môi trường YEPD bổ sung muối 27 Hình 6. Sản xuất meo nấm trên cơ chất 29 Hình 7. Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ mùn cưa phối trộn với cơ chất thóc trong sản xuất meo nấm 30 Hình 8. Sản xuất thể quả 31 Hình 9. Bịch nấm khử trùng theo phương pháp Tyndall 32 Hình 10. Bịch nấm Linh chi cấy ở vị trí miệng túi 32
iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC HÌNH ii MỤC LỤC iii Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về nấm linh chi 3 2.1.1. Phân loại 3 2.1.2. Đặc điểm sinh học 4 2.1.3 Công dụng của nấm Linh chi 8 2.1.4. Cách phân lập giống nấm từ thể quả 11 2.1.5. Các nguồn cacbon, nito, vitamin 14 2.1.6. Các điều kiện thích hợp nuôi cấy nấm Linh chi 15 2.1.7. Các hình thức nuôi trồng 15 2.2 Tình hình nghiên cứu nấm trên thế giới và trong nước 16 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16 2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 20 3.2. Nội dung nghiên cứu 20
iv 3.3. Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1. Nội dung 1: Phân lập giống nấm Linh chi 20 3.3.2. Nội dung 2: Sản xuất meo nấm 22 3.3.3 Nội dung 3: Sản xuất thể quả nấm linh chi 23 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1. Phân lập giống nấm Linh chi 25 4.2. Sản xuất meo nấm 28 4.3. Sản xuất thể quả nấm Linh chi 31 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 5.1. Kết luận 34 5.2. Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới, nắng ẩm mưa nhiều, rất thuận lợi cho các loài nấm phát triển. Tùy vào từng loại nấm mà mục đích sử dụng khác nhau, có thể sử dụng làm nấm ăn hay làm nấm dược liệu. Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) là loài dược liệu quý có từ lâu đời. Linh chi là một vị thuốc đã được ghi trong tập sách “Thần nông bản thảo” viết cách đây khoảng 2000 năm. Lý Thời Trân, tác giả bộ “Bản thảo cương mục” nổi tiếng thế giới, cũng đã giới thiệu vị Linh chi với khoảng 2000 từ và 6 loại linh chi khác nhau: Thanh chi, Hồng chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi và Tử chi. [1] Loài nấm quý này có khả năng nâng cao tính miễn dịch của cơ thể, có tác dụng nhất định đối với hệ thần kinh trung ương, hệ hô hấp, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa, hệ bài tiết, giúp tăng tuổi thọ. Ngoài ra còn có tác dụng đối với bệnh gan, cao huyết áp, suy nhược thần kinh, giảm bạch cầu. Nấm Linh Chi còn hỗ trợ cho việc điều trị ung thư, thấp khớp, đau thận, đau dạ dày, tiểu đường, đau nửa đầu [2]. Giá thành nấm Linh chi hiện nay vẫn khá cao dẫn tới việc nhiều người dân chưa có khả năng sử dụng loại nấm dược liệu có giá trị này. Đặc biệt là những người có thu nhập thấp hoặc những bệnh nhân ung thư vốn đã cạn kiệt kinh tế do các chi phí tốn kém của quá trình điều trị bệnh. Vì vậy, việc mở rộng quy mô trồng nấm cũng như đơn giản hóa kỹ thuật để phố biến phương pháp nuôi trồng tới người dân là việc làm cần thiết. Hiện nay nấm Linh chi được nuôi trồng với nhiều hình thức như trong các lán trại với các bịch mùn cưa hoặc trên các thân gỗ. Gần đây nhiều nước trên thế giới phát triển hình thức nuôi trồng nấm Linh chi bán tự nhiên trong các nhà lưới. Các khối cơ chất có sợi nấm Linh chi phát triển tốt được vùi trong các luống đất có bổ sung các thành phần dinh dưỡng. Hình thức nuôi
2 cấy này cho kích thước thể quả to hơn, sản phẩm nấm thu được tương tự với những sản phẩm nấm thu hái trong tự nhiên. Tuy nhiên hình thức nuôi cấy này chưa được phổ biến ở Việt Nam. Xuất phát từ giá trị dược liệu và kinh tế của nấm Linh chi cũng như nhu cầu thực tế xã hội, đề tài: “Phân lập và nuôi trồng nấm Linh chi trong điều kiện bán tự nhiên” được thực hiện nhằm khai thác những tiềm năng vốn có của loại nấm dược liệu này. 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nuôi trồng nấm Linh chi trong điều kiện ngoài trời, không sử dụng hệ thống lán trại. Bước đầu xây dựng quần thể nấm Linh chi có sự tương tác với hệ sinh thái môi trường, có giá trị về cảnh quan và dược liệu. 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Phân lập giống nấm Linh chi - Nhân giống nấm sản xuất trên các nguyên liệu: Thóc, mùn cưa, tăm bông. - Sản xuất thể quả nấm Linh chi, sử dụng lớp đất che phủ 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài phát triển quy trình nuôi trồng nấm Linh chi mới, dễ chăm sóc, dễ sử dụng, thân thiện với môi trường tự nhiên. 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Nâng cao chất lượng sống cho người dân, giá trị dinh dưỡng từ nấm mang lại rất tốt cho sức khỏe con người. - Định hướng cho người dân hướng tới những mô hình nuôi trồng lớn hơn, đa dạng hơn, có ý nghĩa kinh tế. - Phát triển thị trường cho các loại giống nấm (hay meo nấm) thương mại, tăng thu nhập cho người sản xuất.
3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về nấm linh chi 2.1.1. Phân loại Nấm linh chi có tên khoa học: Ganoderma lucidum ((Leyss sx Fr.) Karst) (Hình 1). Hình 1: Thể quả nấm Linh chi Phân loại học: - Ngành: Eumycota - Lớp: Hymenomycetes - Bộ: Ganodermatales - Họ: Ganodermataceea - Chi: Ganoderma Linh chi là một vị thuốc đã được ghi trong tập sách “Thần nông bản thảo” viết cách đây khoảng 2000 năm. Lý Thời Trân, tác giả bộ “Bản thảo cương mục” nổi tiếng thế giới (Lần đầu tiên in năm 1595), cũng đã giới thiệu vị Linh chi với khoảng 2000 từ và 6 loại Linh chi mang màu sắc và tên khác nhau: Thanh chi (Linh chi màu xanh), hồng chi (màu hồng) còn gọi xích chi,
4 đơn chi, hoàng chi (còn gọi là kim chi) màu vàng, bạch chi (con gọi là ngọc chi) màu trắng, hắc chi (còn gọi huyền chi) màu đen, tử chi – Linh chi màu tím. Tuy có ghi trong các sách cổ nhưng ít người thấy, được sử dụng, nên Linh chi từ lâu vẫn thuộc loại thuốc quí hiếm, chỉ có vua chúa, người giàu mới có để sử dụng [2]. 2.1.2. Đặc điểm sinh học Về thực vật, người ta xác định nấm Linh chi không phải một loại cỏ, mà là một loại nấm hóa gỗ có cuống dài hoặc ngắn, mũ nấm có dạng hình thận, có dạng hình tròn hay hay quạt. Cuống thường cắm không ở giữa mũ nấm mà cắm lệch sang một phía mũ. Hình trụ tròn hay dẹt có thể phân nhánh cuống và cuống có màu khác nhau tùy theo loài, loài đỏ thay đổi từ nâm đến đỏ vàng, đỏ cam, mặt trên bóng loáng như đánh vecni, trên mặt mũ có những vân đồng tâm. Thụ tầng màu trằng ngà, khi già ngả màu nâu vàng, mang nhiều lỗ nhỏ li ti là các ống thụ tầng mang bài tử. Bào tử loài xích chi hình trứng, được bao bọc bởi 2 lớp màng, màng ngoài nhẵn, không màu, màng trong màu gỉ sắt, lôc nảy mầm có hình gai nhọn. Toàn nấm gồm những sợi nấm không màu trong sáng, đường kính 1-3mm, có phân nhánh. Cấu tạo của sợi nấm Nấm Linh chi và các nấm ăn có cấu tạo chủ yếu là hệ sợi nấm. Các sợi nấm ăn có dạng ống tròn, đường kính khoảng 2-4 micromet. Các ống này có vách ngăn ngang. Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty. Hệ sợi nấm còn gọi là khuẩn ty thể (mycelium). Khoảng cách giữa hai vách ngăn ngang được gọi là tế bào. Trong tế bào sợi nấm khi quan sát dưới kính hiển vi quang học (phóng đại 1000- 1500 lần) hoặc kính hiển vi điện tử có thể thấy rõ các bào quan. Tế bào nấm có những đặc trưng riêng, khác biệt với tế bào thực vật, động vật. Trước hết là thành phần của thành tế bào. Dưới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy thành tế bào cấu tạo bởi nhiều lớp. Nếu như thành tế bào thực vật cấụ tạo chủ yếu bởi xenluloza thì thành tế bào của nhũng nhóm nấm
5 khác nhau lại cấu tạo bởi những thành phần khác nhau. Các nấm ăn và nấm Linh chi có thành tế bào cấu tạo chủ yếu bởi kitin-glucan. Tế bào nấm không có đời sống độc lập trong sợi nấm vì giữa các tế bào có vách ngăn có lỗ thủng. Ở một số loại nấm như nấm túi chỉ có 1 lỗ ở giữa vách ngăn, lỗ này có đuờng kính khoảng 0,1-0,2 µm. Ở nấm Linh chi hay nấm đảm nói chung, lỗ thông giữa vách ngăn có cấu tạo phức tạp hơn - lỗ có gờ cao và hai phía lỗ còn có nắp đậy. Trên nắp đậy có nhiều lỗ nhỏ với đường kính khoảng 0,09-0,18 µm. Thông qua các lỗ ở vách ngăn và nắp đậy vách ngăn, chất nguyên sinh có thể di chuyển dễ dàng trong sợi nấm. Ngay nhân tế bào có khi cũng thắt nhỏ lại để chui qua được các lỗ này, sợi nấm trở thành một ống sống. Ở đầu sợi nấm, nơi thực hiện quá trình tăng trưởng, chất nguyên sinh thường tập trung dày đặc. Có 3 cấp sợi nấm, sợi nấm cấp một (sơ sinh), sợi nấm cấp hai (thứ sinh) và sợi nấm cấp ba (tam sinh). Sợi nấm cấp một lúc đầu không có vách ngăn và có nhiều nhân, dần dần sẽ tạo vách ngăn và phân thành những tế bào đơn nhân trong sợi nấm. Sợi nấm cấp hai được tạo thành do sự phối trộn giữa hai sợi nấm cấp một. Khi đó nguyên sinh chất giữa hai sợi nấm khác dấu sẽ trộn với nhau (chất phối plasmogamy). Hai nhân vẫn đứng riêng rẽ làm cho các tế bào có hai nhân. Người ta còn gọi sợi nấm loại này là sợi nấm song nhân. Sợi nấm cấp ba là do sợi nấm cấp hai phát triển thành. Các sợi nấm liên kết lại chặt chẽ với nhau và tạo thành quả nấm (quả thể) [1], [2]. Thể quả nấm Quả nấm hay quả thể (fruit body) là cơ quan sinh sản, cũng tức là cơ quan sinh bào tử của các loại nấm bậc cao. Đó chính là phần thu hái để ăn của các loại nấm ăn, hay phần thu hái để làm dược liệu ở nấm Linh chi. Quả nấm ở nấm đảm gọi là quả đảm (basidiocarp) còn quả nấm ở nấm túi gọi là quả túi (ascocarp). Tuỳ loại nấm mà quả nấm có hình thái cấu tạo, màu sắc, kích thước không giống nhau. Phần trên cùng của quả nấm là mũ nấm (pileus, cap). Mũ
6 nấm được mọc trên cuống nấm (stipe). Mặt dưới của mũ nấm có rất nhiều phiến nấm (gill, lamellae). Khi cuống nấm và mũ nấm chưa xòe rộng thì quả nấm được gọi là nụ nấm (button). Ở nấm đảm trên phiến nấm có thể có dạng nang nối liền hai phiến gần nhau, hoặc dạng thể nang tự tiêu, có đảm (basidium), có bào tử đảm (basidiospore), có ống sữa. Có loài nấm đảm không có phiến nấm mà lại có ống nấm. Trong ống nấm cũng có các thể dạng nang (cystidia), có đảm, có bào tử đảm. Đảm là tế bào đỉnh phình to lên của một sợi nấm song nhân mọc ở phiến nấm trong quả thể. Tế bào này gọi là nguyên đảm. Nhân trong nguyên đảm tiến hành quá trình phối nhân để tạo ra hợp tử 2n (nhị bội thể). Hợp tử này phân cắt giảm nhiễm để tạo ra 4 nhân đơn bội (1n). Bốn nhân này chui vào 4 mấu lồi phình to ở phía đầu đảm và sau đó phát triển thành 4 bào tử đảm. Nấm và vai trò trong hệ sinh thái Các loại hình dinh dưỡng nấm ăn và dược liệu có vị trí quan trọng đối với các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Dựa vào phương thức hấp thu thức ăn có thể chia nấm ăn thành các loại hoại sinh (saprophytism), ký sinh (parastism) và cộng sinh (symbiosis). Loại hoại sinh chiếm ưu thế trong các loài nấm ăn và dược liệu, chúng sử dụng các loại chất hữu cơ khác nhau và góp phần vào các vòng tuần hoàn carbon, nitơ trong tự nhiên. Các loài nấm ăn chỉ sinh trưởng, phát triển được trong những môi trường sống xác định, tách ra khỏi những môi trường như vậy chúng không thể sinh tồn được. Căn cứ vào môi trường sinh thái nấm, có thể phân biệt ra các loại nấm ở đất rừng (mushrooms in forest land), nấm làm mục gỗ (wood- attacking fungi, wood rotting), nấm ăn ở đồng ruộng (mushrooms in open field), nấm ăn ở đồng cỏ (mushrooms in grassland), nấm ở phân chuồng (coprophilous fungi), nấm dạng khuẩn căn (mycorrhizal -mushrooms), nấm sống trên côn trùng (entomofungi), nấm trên cát (sand dune fungi), nấm hang động (cave fụngi) Giữa các điều kiện sinh thái này có những dạng trung gian khó phân biệt một
7 cách rạch ròi. Hiểu rõ các loại hình sinh thái này sẽ dễ dàng thuần hoá và nuôi cấy các loại nấm vốn mọc hoang dại. Ảnh hưởng của môi trường sinh thái tới nấm rất rõ rệt. Sự phân bố của nấm có quan hệ mật thiết đến vĩ độ địa lý, độ cao, địa hình, loại thực bì, loại cấu trúc đất, độ axit của đất, độ phì nhiêu của đất, khu hệ vi sinh vật đất. Ở độ cao 2000 m so với mặt biển số cá thể và chủng loại nấm đều rất ít. Các nấm ăn ở độ cao dưới 2000 m có tính phong phú cao về loài và số lượng cá thể. Mối quan hệ theo hướng tác dụng hoặc phản tác dụng giữa các loài nấm với các nhóm sinh vật khác. Trong một hệ thống sinh thái nhất định quan hệ giữa nấm ăn và các nhóm loài sinh vật khác là rất phức tạp. Lấy quan hệ giữa nấm ăn, nấm dược liệu và các nhóm vi sinh vật khác để làm ví dụ: Quan hệ trung tính (neutralism): Nhìn qua thì thấy không có quan hệ trực tiếp nhưng trên thực tế vẫn có vô số mối quan hệ chẳng hạn như vấn đề chuỗị thức ăn (food Chain). Trong chuỗi thức ăn thì xác của một loại vi sinh vật hoặc sản phẩm phân giải của cơ chất lại trở thành thức ăn của một loại vi sinh vật khác. Việc phân giải tầng lá rụng trong rừng sâu là do sự xuất hiện liên tiếp và sự tác động của nấm sợi, vi khuẩn và nấm bậc cao (nấm có quả thể). Sự hình thành quả thể (quả nấm) của một số loại nấm ví dụ như nấm mỡ (Agaricus spp.) cũng là do kết quả tác dụng chung của sợi nấm mỡ với vi sinh vật trong lớp đất phủ [2]. Quan hệ cạnh tranh (competition): Rất có thể có sự cạnh tranh về không gian, về thức ăn, về việc sản sinh chất kháng sinh giữa nấm với các nhóm vi sinh vật khác trong đất. Quan hệ ký sinh (parasitsm): Một số nấm ăn, nấm dược liệu lại trở thành nấm hại cho cây trồng, cây rừng (ví dụ nấm đầu khỉ, nấm linh chi ). Một số nấm sợi như lại ký sinh trên nấm mỡ, nấm hương, nấm sò, nấm đầu khỉ
8 Quan hệ cộng thê (commensation): Hai loài có thể tồn tại độc lập nhưng lại sống chung với nhau, loài này có thể ảnh hưởng tốt hoặc không ảnh hưởng gì tới loài kia, tuy nhiên không gây hại gì cả. Quan hệ cộng sinh (symbiosis): Hai loài không thể tồn tại một cách độc lập mà phải sống cộng sinh với nhau theo nguyên tắc hai bên cùng có lợi. Trường hợp cộng sinh giữa khuẩn căn và thực vật là một ví dụ. Khuẩn căn rất cần thiết cho sự phát triển của cây rừng, việc chủ động nhiễm khuẩn căn là một trong những biện pháp có tác dụng tích cực đối với cây chủ. Ảnh hưởng của các nhân tố vật lý, hoá học đối với sự phát triển cá thể của nấm ăn. Đó là các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, độ chiếu sáng, mức độ thông khí v.v Mỗi loại nấm ăn có một phạm vi thích ứng riêng với từng yếu tố, có giới hạn thấp nhất (minimum), có giới hạn cao nhất (maximum) và có giới hạn thích hợp nhất (optimum). Căn cứ vào nhiệt độ thích hợp cho việc hình thành quả nấm người ta chia các loại nấm ăn, nấm dược liệu ra làm 3 loại: loại ưa nóng, loại ưa ấm, loại ưa lạnh. Cũng có thể chia thành các loại tương tự như vậy đối với các yếu tố khác (độ ẩm, độ pH, độ chiếu sáng ). 2.1.3 Công dụng của nấm Linh chi Tính chất và tác dụng của nấm Linh chi theo Thần nông bản thảo và Bản thảo cương mục như sau: Thanh chi tính bình, không độc chủ trị sáng mắt, bổ can khí, an thần, tăng trí nhớ, cường khí, chữa viêm gan cấp và mãn tính. Hổng chi (xích chi, đơn chi) vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, chữa các bệnh về huyết và thần kinh, tim. Hoàng chi (kim chi) vị ngọt, tính bình, không độc, chủ trì bí tiểu tiện, sỏi thận, bệnh ở cơ quan bài tiết. Bạch chi (ngọc chi) vị cay, tính bình, không độc, chủ trì hen, ích phế khí. Tử chi (Linh chi tím) vị ngọt, tính ôn, không có độc, chủ trì đau nhức khớp xương, gân cốt. [1]
9 Đối với hệ miễn dịch: Nấm Linh Chi sản sinh các loại vitamin, chất khoáng, chất đạm cần thiết cho cơ thể giúp tăng cường hoạt động của hệ thống miễn dịch và kháng siêu vi, giúp cơ thể luôn tươi trẻ và tăng tuổi thọ. Nấm Linh Chi tăng chức năng sản xuất interferon giúp nâng cao hoạt tính của đại thực bào và lympho bào trong điều trị viêm gan siêu vi. Ngoài ra, Nấm Linh Chi cũng có tác dụng giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc, kể cả các kim loại nặng và có thể chống ảnh hưởng của các tia chiếu xạ. Đối với các hệ tuần hoàn: Giúp chống nhiễm mỡ, xơ mạch và các biến chứng (bệnh xơ vữa động mạch vành). Có tác dụng đặc biệt trong việc loại trừ chất cholesterol trong máu và các thành mạch, trợ tim, lọc sạch máu, làm giảm cholesterol, giảm xơ cứng thành động mạch, thúc đẩy quá trình lưu thông máu, tăng cường tuần hoàn máu. Linh chi có tác dụng hạ huyểt áp, hạ mỡ trong máu. Linh chi có tác dụng làm giảm độ tạo huyết khối của máu và phòng ngừa tắc mạch máu, chủ yếu là nhờ: - Linh chi có thể làm tăng lượng lipoprotein mật độ cao trong máu, từ đó dần dần chuyển hóa, hòa tan và đào thải cholesterol mật độ thấp. - Linh chi có thể nâng cao khả năng hòa tan trong máu, làm tan các khối tiểu cầu trong máu nhằm ngăn ngừa tạo huyết khối và tắc mạch máu. Đối với hệ thần kinh: Nấm linh chi có tác động rất lớn đối với hệ thần kinh, giúp an thần, làm giảm chứng đau đầu, mất ngủ hay stress, suy nhược cơ thể, đẩy lùi căng thẳng vô cùng hiệu quả. Linh chi có tác dụng an thần, giảm đau và chống co thắt cơ trơn. Ngoài ra, còn có tác dụng kháng viêm, có thể giảm viêm mô thần kinh nên cũng có khả năng phục hồ trí nhớ. Đối với các bệnh về gan: Nấm Linh Chi có chứa nhóm steroid vì vậy có tác dụng tích cực với hệ bài tiết, có thể bảo vệ gan, thải độc, ức chế nhiều loại nấm gây bệnh. Nấm Linh Chi còn có hiệu quả rất lớn trong việc điều trị các bệnh về gan mật như xơ gan, viêm gan hay gan nhiễm mỡ. Ngoài ra, nấm Linh Chi có tác dụng nâng cao khả năng miễn dịch cơ thể, nâng cao khả năng
10 phân biệt, sát thương và nuốt chửng virus viêm gan và tế bào miễn dịch nâng cao khả năng tái sinh các tế bào gan. Đối với tác dụng chống ung thư: Nấm linh chi được nghiên cứu chuyên sâu về việc ngăn ngừa và phòng chống ung thư. Những lợi ích sức khỏe chính của loại thảo dược này được thể hiện trong việc ” ức chế sự phát triển khối u ” và “kiềm chế sự lây lan của các tế bào ung thư”. Khi sử dụng kết hợp với thuốc tây, nấm linh chi không chỉ giúp bạn đạt được kết quả điều trị tốt hơn. Nó cũng làm giảm đáng kể những tác dụng phụ do thuốc tây gây nên. Đối với bệnh u bướu: Sau khi uống Linh Chi hoặc bào tử Linh Chi các bệnh nhân u bướu triệu chứng giảm thấy rõ, ăn uống và giấc ngủ được cải thiện, các triệu chứng như sốt nhẹ, ho, tức ngực, đại tiện lỏng đều chuyển biến tốt, khối u bị ức chế, chức năng miễn dịch được phục hồi. tinh thần và thể lực được cải thiện, tuổi thọ kéo dài. Dùng phối hợp với hóa trị, xạ trị, nâng cai hiệu quả của hóa trị và xạ trị. Đối với làm đẹp: Làm chậm quá trình lão hóa: Ling Zi 8-protein và axit Ganodermic có trong nấm linh chi là những chất chống viêm và chống dị ứng phong phú. Cả hai thành phần này hoạt động hài hòa, trao quyền cho hệ thống miễn dịch và thúc đẩy lưu thông máu. Một hệ thống miễn dịch mạnh hơn, lần lượt, làm giảm các hoạt động gốc tự do, ngăn ngừa lão hóa. Làm mờ nám, vết sạm trên da: Công dụng làm đẹp của nấm linh chi là giúp bạn khắc phục những hư tổn. Một chức năng hài hòa của các đặc tính chống histamin, chống viêm, chống vi khuẩn và chống dị ứng. Khi sự kết hợp bắt đầu hoạt động, khả năng miễn dịch của bạn tăng lên khi dùng nấm linh chi thường xuyên. Giảm cân: Dưỡng chất trong nấm linh chi làm tăng tốc độ cơ thể cung cấp máu cho oxy, cung cấp cho bạn thêm năng lượng, nhưng không tăng mỡ thừa mà còn hỗ trợ giảm cân.
11 2.1.4. Cách phân lập giống nấm từ thể quả 2.1.4.1 Nguyên tắc chung khi thu thập thể quả nấm Nguyên tắc 1: Khi thu nhận nấm phải chắc chắn là thu nhận toàn bộ cây nấm chứ không phải chỉ lấy một phần, việc thiếu đi một vài bộ phận rất có thể sẽ làm mất đi những đặc điểm quan trọng mà dựa vào đó để xác định chính xác loại nấm. Khi thu nhận nấm thì đào nấm lên chứ không được kéo nấm khỏi vị trí mọc để tránh làm đứt thân nấm. Nguyên tắc 2: Sau khi đào nấm lên, gói nấm ở trong giấy sáp hoặc giấy bạc không sử dụng giấy bóng, túi nilong bởi vì giấy bóng không có khả năng thoát hơi nước và làm nước bám quá nhiều vào nấm, dễ gây ra tình trạng thối hỏng. Dùng giấy sáp sẽ chỉ giữ lại 1 lượng hơi nước phù hợp và vẫn giữ được nấm tươi, không bị nhũn. Gói nấm trong một mảnh giấy sáp sau đó cuộn tròn giấy thành dạng hình trụ xoắn hai đầu của hình trụ. Không được cất nhiều hơn một loại nấm trong một cuộn giấy gói, đặc biệt là khi không chắc chắn được đấy là loại nấm gì, mỗi một loại nấm phải được gói tách biệt nhau. Nguyên tắc 3: Trong quá trình vận chuyển nấm nên sử dụng các loại rổ nông sao cho nấm được đứng thẳng. Nguyên tắc 4: Khi thu thập các loại nấm nên tránh thu các loại côn trùng bám vào, các loại hạt hay các loại cây bị thối rữa. Trong nhiều trường hợp người ta thu tất cả cất vào túi bóng và tưởng nhầm đó là nấm. Nguyên tắc 5: Cần phải ghi chú lại các thông số về kích thước, hình dạng, màu sắc, mùi vị, các đặc điểm mà nấm mọc lên ở đúng thời gian mà người ta thu nhận nó. Có nhiều loại nấm khi khô hoặc bị thối nhũn nhìn rất khác so với bình thường. Nguyên tắc 6: Làm tiêu bản bào tử: màu sắc của bào tử là một thông tin cần thiết để xác định nhiều loại nấm, nên sử dụng để xác nhận cho các giả thiết khi mình xác định loài. Nhiều bào tử đơn lẻ quá nhỏ để có thể quan sát được vì vậy cần sử dụng kính hiển vi, nhưng cũng có thể cắt mũ nấm để thu
12 nhận được một khối các bào tử sau đó đặt phần chứa khối bào tử đó lên tiêu bản. Phía chứa bào tử thì tiếp xúc với bề mặt của tờ giấy trắng phải chắc chắn rằng trên bề mặt của tờ giấy trắng không có màu gì để không bị lẫn với màu bào tử. Các tiêu bản bào tử màu trắng thường rất khó quan sát trên tờ giấy màu trắng nhưng có thể được phát hiện ra bằng kĩ thuật cấy ria. Có một số loại nấm độc có bào tử không thể phát hiện trên tiêu bản giấy màu. Những nấm này thường cần rất nhiều thời gian để giải phóng bào tử vì vậy cần phải kiên nhẫn. Nguyên tắc 7: Nghiên cứu kĩ hình dạng để mô tả thể quả của nấm: Cố gắng tìm ra những điểm phù hợp giữa mẫu nấm thu được với những loại nấm đã được nghiên cứu trước đó. Nguyên tắc 8: Khi phát hiện ra một nhóm nấm dường như rất gần với mẫu nấm đang được xem xét (gần như là cùng loài). Sử dụng một que cấy nhọn để phân tách các mẫu nấm sau đó mô tả ngắn gọn những đặc điểm chủ chốt để thu hẹp phạm vi xác định loài (làm trên đĩa thủy tinh hoặc một dụng cụ phù hợp). Nguyên tắc 9: Mô tả chi tiết hơn để cố gắng xác nhận giả thiết về loài của mình, chắc chắn là đã kiểm tra các thông tin với những loài tương tự. Nguyên tắc 10: Kiểm tra về giá trị thực phẩm để xem loại nấm thu nhận được có phải là nấm ăn hay không, vì có rất nhiều người khá là nhạy cảm với độc tố của nấm do vậy phải chắc chắn là đã kiểm tra những cảnh báo về độ an toàn trước khi nếm thử bất kì loại nấm hoang dại nào. Không bao giờ ăn một loại nấm hoang dại nào khi chưa qua chế biến [6]. 2.1.4.2. Phương pháp phân lập nấm truyền thống Phương pháp phân lập từ bảo tử Cắt một mũ nấm sắp chín cắm lên một đầu dây thép, đầu kia uốn vòng để có thể đứng được trên hộp lồng đựng 3-5ml nước vô trùng. Đậy một chuông thuỷ tinh lên trên. Để 1-2 ngày khi quả thể chín, bào tử từ các phiến
13 nấm bắn ra và rơi vào nước. Lấy nước này dùng que cấy cấy gạt trên thạch đĩa để tạo điều kiện tách rời các bào tử ra. Giữ ở tủ ấm 20-25°C đợi cho bào tử phát triển thành khuẩn lạc thì dùng que cấy đầu nhọn cấy chấm ra thạch nghiêng. Cũng có thể cuốn mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm sò vào một đầu sợi dây thép, đầu kia gài ở nút bông của một bình tam giác, bên dưới có đựng một ít nước vô trùng. Bào tử bắn ra sẽ rơi vào nước. Có thể dùng nước này đê cấy gạt theo cách nói trên. Cũng có thể dùng cách đưa cuống dây thép qua cuống phễu (phía trên có đậy kín) và úp phễu xuống một khay bên trong có một hộp lồng đựng một ít nước vô trùng. Khi bào tử bắn ra ta sẽ phân lập như cách nói trên hoặc pha loãng ra trong các ống nuóc vô trùng rồi lấy 1 giọt cấy gạt bằng que thuỷ tinh vô trùng trên bề mặt môi trường thạch đĩa, hoặc có thể dùng dao vô trùng và bằng thao tác vô trùng cắt một mẩu nhỏ tổ chức ở mũ nấm rồi dùng que cấy đưa vào hộp lồng hay ống nghiệm thạch nghiêng. Khi nào thấy sợi nấm mọc ra thì dùng que cấy đầu nhọn, cấy cắm sang ống nghiệm thạch nghiêng khác. Còn có thể cắt các đoạn gỗ trên đó có mộc nhĩ hay ngân nhĩ mọc, khử trùng mặt ngoài bằng cách ngâm vào dung dịch HgCl, nồng độ 0,1% trong 1-2 phút. Rửa lại bằng nước vô trùng. Dùng dao sắc cắt thành những mẩu gỗ nhỏ, sau đó cấy vào bề mặt thạch đĩa hay thạch nghiêng. Khi có sợi nấm mọc ra, cấy ngay sang ống thạch nghiêng khác. Khi sợi nấm mọc ra trên ống thạch nghiêng này sau khoảng 5-7 ngày lại cấy tiếp sang ống thạch nghiêng mái. Phương pháp nuôi cấy mô Quả thể nấm Linh chi cũng có thể là nguồn thu nhận các mảnh mô. Từ các mảnh mô này sẽ nuôi cấy và thu nhận được hệ sợi tinh sạch. Quy trình chung gồm: Thể quả được rửa sạch và khử trùng bằng cồn 70% từ 1-4 phút, tách một phần mũ nấm 2x2 mm cấy vào môi trường phân lập giống. Sau khi sợi nấm gốc ăn kín môi trường, giống gốc sẽ được cấy chuyển sang môi
14 trường nhân giống cấp 1. Phương pháp này có ưu điểm dễ tiến hành, giống không phát sinh các biến dị di truyền, chất lượng ổn định. 2.1.5. Các nguồn cacbon, nito, vitamin Nguồn cacbon: Nấm Linh chi có khả năng sản sinh các men (enzyme) phân giải xenlulo (cellulose), linhin (lignin), hemixenlulo (hemicellulose), tinh bột (starch), pectin thành đường đơn, sau đó mới được hấp thụ làm nguồn dinh dưỡng. Trong mùn cưa của các loại gỗ tạp hoặc trong các khúc gỗ thường được dùng để nuôi trồng Linh chi có chứa khoảng 40% xenlulô, 24% lignin. 20% pentozan (pentosan) và 1% metil pentozan (meihyl-pentosan). Có thể bổ sung thêm đường mía khi nuôi trổng Linh chi trên mùn cưa nhưng không bao giờ được dùng quá nồng độ 5%. Nồng độ đường cao sẽ ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm. Chỉ nên dùng nồng độ đường khoảng 1-2%. Nguồn nito: Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ như pepton, axit amin, hệ sợi nấm của Linh chi còn có thể trực tiếp hấp thụ trong các hợp chất vô cơ như canxi nitrat, urê, ammôn sunphat, ammôn clorua, điamôn photphat, tức là các loại phân đạm thường dùng trong nông nghiệp. Khi nuôi cấy trên mùn cưa lượng urê không nên dùng quá 0.5%. Hiệu quả đổng hoá amôn sunphat thường không cao cho nên ít được sử dụng. Nếu có điều kiện nên dùng 0,1% canxi nitrat. Nguồn vitamin: Linh chi cần có vitamin để phát triến hệ sợi nấm, nhất là vitamin B1, vitamin B6 và vitamin H (B7). Ngoài các nguồn dinh dưỡng nói trên để phát triển hệ sợi nấm còn cần được cung cấp thêm canxi (Ca), magiê (Mg), lân (P) và kali (K). Ngoài ra còn cần cả nguyên tố vi lượng sắt (Fe) mặc dù với lượng rất nhỏ. Khi nuôi trồng Linh chi trên mùn cưa người ta thường thêm bột nhẹ (CaCO3) hoặc thạch cao (CaSO4. 2H2O). Có khi còn thêm một lượng nhỏ KH2PO4 (để bổ sung thêm P và K).
15 2.1.6. Các điều kiện thích hợp nuôi cấy nấm Linh chi Điều kiện nuôi cấy chủ yếu gồm có: Nhiệt độ tối ưu để phát triển sợi nấm là 20-350C, để ra thể quả là 25-300C. Lượng chứa nước tối ưu trong cơ chất là 55-60%, độ ẩm tương đối của không khí là 90-95%, pH thích hợp nhất trong khoảng 4,5-6,0, nồng độ CO2 trong không khí không được vượt quá 0,1%. Sợi nấm khi phát triển không có nhu cầu ánh sáng, tuy nhiên khi hình thành thể quả thì lại có nhu cầu chiếu sáng tán xạ. 2.1.7. Các hình thức nuôi trồng Nuôi trồng trên túi màng mỏng (túi nilon): mùn cưa đã ủ vào các túi màng mỏng (túi PP). Trước đó phải lộn ngược túi và tạo ra hình tròn cho đáy túi. Vừa đưa nguyên liệu vào vừa nén chặt để tạo thành một khối hình trụ, bề mặt phẳng và cách mép trên 1/3 chiều dài của túi (nói cách khác phần nguyên liệu chiếm 2/3 chiều cao của túi). Dùng một cán gỗ đầu có hình nón thuôn dài ấn vào chính giữa khối nguyên liệu để tạo ra một “giếng” rỗng, trên to dưới nhỏ. Mỗi túi thưởng chứa khoảng 1,1-1,2 kg nguyên liệu. Hấp bằng hơi nước sôi trong 3 giờ. Sau đó đợi nguội trong 30 giờ (để các bào tử tạp khuẩn chưa bị diệt sẽ có cơ hội nảy mầm), rồi lại hấp tiếp trong 3 giờ nữa. Đây là phương pháp diệt khuẩn kiểu Tyndall (Tyndallization), cho phép diệt hết tạp khuẩn, kể cả bào tử của chúng, mặc dù nhiệt độ trong nổi hấp chỉ vào khoảng 85-1000C Nồi hấp cần có chỗ để cắm nhiệt kế nhằm theo dõi nhiệt độ khi diệt khuẩn (khử trùng). Đợi nguội hẳn (sau 20-30 giờ) mới đưa vào phòng cấy giống. Nếu lấy ra sớm khi màng mỏng còn mềm thì rất dễ làm rách các túi này. Nuôi trồng trên gỗ tươi: Các cành gỗ được cưa thành từng khúc dài khoảng 1,0 đến l,2m, vạt hết các cành bên. Để cho lượng nước trong cành gỗ chỉ còn 45-50% chúng ta phải xếp các khúc gỗ thành các cũi hình vuông hay hình tam giác phơi cho khô bớt. Khoảng 10-15 ngày đảo lại các khúc gỗ ở trên xếp xuống dưới, các khúc gỗ ở dưới xếp lên trên. Các tổ chức gỗ bắt đầu chết, lượng nước giảm xuống đến 45-50%. Khi đó bắt đầu tiến hành đục lỗ
16 bằng các búa chuyên dụng. Lấy giống cấp 2 từ chai ra một tờ báo sạch, rửa tay và khử trùng bằng cồn 75%, đợi khô, lấy giống bằng 2 ngón tay và nhét vào từng lỗ. Lấy các nút gỗ đã đục ra trước đó để nút lại, giống đưa vào lỗ chỉ cần to bằng hạt ngô là được. Sau đó hoà xi mãng loãng như bột trẻ em phết một lớp mỏng lên trên phần nút đã đóng vào để hạn chế sự xâm nhiễm của tạp khuẩn. Nẻn nhớ là đục được khúc gỗ nào thì cấy ngay khúc gỗ đó, không đục tràn lan một lúc và nhất là không để qua đêm mới cấy giống. Sau khi cấy hết nguyên liệu ta đưa cây gỗ vào chỗ mát, ít gió và xếp thành hình cũi hay hình nơm, không nên tạo thành đống cao quá l,5cm, giữa các khúc gỗ cùng hàng nên cách nhau 2- 3cm. Sau đó dùng bao tải sạch hay chăn dạ nhúng nước, vắt ráo rồi phủ lên đống gỗ.[2] Nấm Linh chi có chất lượng cao nhất thường được trồng bằng cách sử dụng phương pháp khai thác gỗ tự nhiên. Chủng nấm Linh chi chất lượng cao được nuôi cấy trong trong khoảng 85 ngày. Các nấm phát triển tốt được cấy vào lỗ khoan, những khúc gỗ này sau đó được đặt trong nhà kính và chôn dưới đất giàu dinh dưỡng 5 tháng. Trong giai đoạn tăng trưởng này, nấm Linh chi hấp thụ hầu như tất cả các chất dinh dưỡng từ đất [7]. Hình thức nuôi cấy này đòi hỏi những đầu tư nhất định về nhà ươm, nhà lưới và hệ thống giữ ẩm. 2.2. Tình hình nghiên cứu nấm trên thế giới và trong nước 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Nấm Linh chi có tác dụng nâng cao hệ miễn dịch cơ thể, có tác dụng tích cực tới hệ thần kinh, hệ tim mạch, hệ hô hấp, hệ tiêu hóa và kéo dài tuổi thọ. Các thử nghiệm ở Trung Quốc từ thời Hán cho tới nay đã khẳng định nấm Linh chi có tác dụng tích cực trong điều trị một số bệnh phức tạp thường gặp như bệnh tim, viêm phế quản mãn tính, thừa cholesterol, bệnh gan, cao huyết áp, suy nhược thần kinh. Nhiều ý kiến chuyên môn hiện nay cho biết nấm Linh chi có tiềm năng trong việc điều trị hoặc tham gia quá trình điều trị
17 bệnh tiểu đường, đau nửa đầu, đau mật và tích cực trong việc hỗ trợ điều trị ung thư. Các chất có dược tính của nấm Linh chi đã được nghiên cứu tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Năm 2013, nhóm tác giả gồm Chi H.J. Kao và cộng sự tại đại học Auckland, New Zealand đã công bố những thông tin quan trọng về các chất triterpenes và polysaccharides tách chiết từ Linh chi cùng 05 cơ chế hoạt động của các chất này được cho là có liên quan tới quá trình điều trị ung thư. [5] Điều này đưa ra những phương hướng cho quá trình phát triển chất chống ung thư từ nấm Linh chi cũng như các nguồn dược liệu tự nhiên khác. Năm 2016, Ahmet Unlu và cộng sự tại đại học Akdeniz, khoa Y dược, Thổ Nhĩ Kỳ cũng đưa ra những nghiên cứu theo hướng ứng dụng Y dược học nhằm kiểm chứng các thông tin về loại “thần dược” Linh chi được ghi chép trong các tài liệu cổ của Trung Quốc. Nhóm nghiên cứu cũng có những đồng tình với ý kiến về tiềm năng có thể có ích trong quá trình điều trị ung thư của nấm Linh chi. Tuy nhiên cũng đưa ra những khuyến cáo về việc tuân thủ chặt chẽ cách sử dụng loại nấm này cho tới khi các tính năng của các hoạt chất sinh học trong dịch chiết nấm Linh chi được hoàn toàn làm rõ. [4]. Do có nhiều giá trị trong Y dược học liên quan trực tiếp tới đời sống thực tiễn, các sản phẩm từ Linh chi có giá thành cao. Việc nuôi trồng và khai thác nấm nhiều nơi trên thế giới như Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan đã trở thành một nghề mưu sinh của các hộ sản xuất. Các dạng sản phẩm như Trà Linh chi, thể quả Linh chi khô, tươi, bột viên nang đang ngày càng đa dạng về hình thức và chủng loại. Các nghiên cứu khoa học, thị hiếu và nhu cầu của người dân cũng như các luồng thông tin dư luận tại nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Á đang khiến Linh chi trở thành một mặt hàng kinh tế ngày càng được chú ý và khai thác trên quy mô lớn.
18 2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Sự phát triển của Công nghệ sinh học Nông nghiệp và Công nghệ thực phẩm tại Việt Nam hiện nay đang tạo đà cho sự phát triển các quy trình nuôi cấy nấm ăn và nấm dược liệu. Từ các thể quả nấm, nhiều dạng sản phẩm giàu chất dinh dưỡng hoặc thực phẩm chức năng được nghiên cứu và phát triển. Năm 2003, tác giả Nguyễn Lân Dũng, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội đã công bố các phương pháp nuôi trồng nấm Linh chi từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có như mùn cưa, cám gạo. Phương pháp nuôi trồng nấm đã được đơn giản hóa từ các trang thiết bị hiện đại của phòng thí nghiệm chuyển sang các lò hấp thủ công hoặc tự chế thích hợp với điều kiện của người dân. Nguồn giống nuôi trồng nấm Linh chi đã được viện Di Truyền Nông Nghiệp, Việt Nam phát triển và lưu trữ, cung cấp số lượng lớn cho nhiều địa phương trên cả nước. Về mặt kỹ thuật, các phương pháp nuôi cấy nói chung được công bố và áp dụng tại Việt Nam đều có sự thống nhất tương đối từ khâu sản xuất giống tới giai đoạn chăm sóc tạo thể quả và đã thu nhận được những kết quả đáng ghi nhận. Năm 2018, Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên công bố quy trình nhân giống nấm từ quá trình nuôi cấy mô thể quả trên tăm bông. Thời gian nhân giống sản xuất được giảm từ khoảng 25 – 30 ngày xuống từ 14-15 ngày, giảm tỉ lệ nát hỏng của giống nấm sản xuất. Phương pháp này được áp dụng thành công trên nấm Dai (Lentinus tigrinus) và đang được thử nghiệm trên nhiều loại nấm khác trong đó có nấm Linh chi [1],[2]. Nhìn chung, quá trình trồng nấm Linh chi không có tính mới về mặt khoa học, tuy nhiên phạm vi ứng dụng còn hạn chế với nhiều người dân, đặc biệt là nhân dân lao động tại Việt Nam. Mặc dù các cơ quan nghiên cứu đã nỗ lực đơn giản hóa quy trình nuôi trồng để phổ biến cho các hộ gia đình có thể chủ động sản xuất, tuy nhiên mới chỉ dừng lại ở các cơ sở sản xuất quy mô
19 nhỏ. Với giá thành các sản phẩm trên thị trường hiện nay, nấm Linh chi vần còn khoảng cách lớn với nhiều người dân. Vì vậy cần tiến hành những mô hình sản xuất với định hướng cải tiến các kỹ thuật hiện hành nhằm phổ biến kiến thức từ trong môi trường nghiên cứu tới điều kiện thực tế sản xuất, phục vụ cho các định hướng truyền bá thông tin, giới thiệu sản phẩm, cung cấp địa chỉ tin cậy, thúc đẩy sự phát triển cân đối giữa các yếu tố sản xuất và nghiên cứu.
20 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Nấm Linh Chi - Địa điểm: Khoa CNSH-CNTP, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên 3.2. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Phân lập giống nấm Linh chi - Nội dung 2: Sản xuất meo nấm - Nội dung 3: Sản xuất thể quả nấm Linh chi 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Nội dung 1: Phân lập giống nấm Linh chi Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau tới khả năng phát triển của mảnh mô thể quả nấm Linh chi Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại môi trường khác nhau gồm môi trường PDA (Potato dextrose agar), môi trường YEPD (Yeast extract peptone dextrose) và môi trường PDA trên tăm bông. Cách chuẩn bị như sau: Môi trường PDA (Potato dextrose agar): Khoai tây: 200g/l, đường: 20g/l, Agar: 15g/l, hấp khử trùng 1210C trong 30 phút ở áp suất 1atm. Quả thể tươi được xịt cồn 700C trước khi cho vào box cấy. Hơ dao và kẹp vô trùng trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nóng đỏ, để nguội. Dùng tay xé đôi thể quả, dùng dao cắt lấy mảnh mô lõi kích thước khoảng 0,5-1cm2. Cấy mảnh mô vào môi trường đã chuẩn bị. Bọc kín bằng túi nilon vô trùng. Nuôi cấy trong điều kiện không ánh sáng ở 20-300C. Môi trường PDA trên tăm bông: Chuẩn bị môi trường PDA lỏng: Khoai tây: 200g/l, Đường: 20g/l. Chọn tăm bông loại thân gỗ, ngâm tăm bông trong môi trường 5 phút. Chuyển sang túi nilon hoặc chai thủy tinh, hấp khử trùng 1210C trong 30 phút ở áp suất 1 atm. Quả thể tươi được xịt cồn 700C trước khi cho vào box cấy. Hơ dao và kẹp trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội.
21 Dùng tay xé đôi thể quả, dùng dao cắt lấy mảnh mô lõi kích thước khoảng 0,5- 1cm2. Cấy mảnh mô vào môi trường đã chuẩn bị. Nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ở 20-300C [3]. Môi trường YEPD (Yeast extract peptone dextrose): Đường: 20g/l, Agar: 20g/l, Peptone: 5g/l, Cao nấm men: 3g/l, hấp khử trùng 1210C trong 30 phút ở áp suất 1 atm. Quả thể tươi được xịt cồn 700C trước khi cho vào box cấy. Hơ dao và kẹp trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội. Dùng tay xé đôi thể quả, dùng dao cắt lấy mảnh mô lõi kích thước khoảng 0,5-1cm2. Cấy mảnh mô vào môi trường đã chuẩn bị. Nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ở 20-300C. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả năng phát triển của mốc xanh trên môi trường phân lập nấm Linh chi Mốc xanh là loại vi sinh vật lây nhiễm phổ biến trong quá trình nuôi trồng và tạo thể quả nấm Linh chi. Để tìm phương án hạn chế sự lây nhiễm của loại nấm mốc này, môi trường YEPD được bổ sung NaCl với nồng độ: 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, hấp khử trùng 1210C trong 30 phút ở áp suất 1 atm. Mẫu nấm mốc xanh được thu nhận từ từ bịch nấm lây nhiễm được cấy lên môi trường. Nuôi cấy trong điều kiện thường, đánh giá khả năng phát triển của nấm mốc xanh sau 3-5 ngày nuôi cấy. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả năng phát triển của sợi nấm Linh chi Muối ăn là một chất được kỳ vọng có tác dụng ức chế một số loại vi sinh vật lây nhiễm, tuy nhiên cũng có thể có những ảnh hưởng nhất định tới nấm Linh chi. Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sự phát triển của nấm, môi trường YEPD được bổ sung NaCl theo các nồng độ lần lượt 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Hấp khử trùng 1210C trong 30 phút ở áp suất 1 atm. Cấy 1 mảnh thạch có sợi nấm có kích thước khoảng 0,5-1cm2, vào môi trường, nuôi cấy trong điều kiện không ánh sáng ở 20-300C.
22 3.3.2. Nội dung 2: Sản xuất meo nấm Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của loại cơ chất tới khả năng sinh trưởng của nấm Linh chi Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại cơ chất khác nhau gồm hỗn hợp thóc và CaCO3, hỗn hợp mùn cưa và cám, hỗn hợp thóc và mùn cưa. Sản xuất meo nấm từ hỗn hợp thóc và bột CaCO3: Cân lượng thóc cần dùng, đem rửa sạch với nước để loại bỏ bụi bẩn và hạt lép. Ngâm thóc với nước sạch khoảng 12 tiếng. Cho thóc vào nồi và tiến hành luộc đến khi nào vỏ hạt thóc nứt. Vớt thóc ra để khô 20 - 30 phút cho bay hơi bớt hàm lượng nước. 0 Bổ sung 1% bột CaCO3, trộn đều và cho vào túi nilon. Hấp khử trùng 121 C trong 3 giờ ở áp suất 1atm. Từ môi trường agar cấy một mảnh thạch chứa sợi nấm vào túi thóc. Nuôi cấy trong điều kiện ít ánh sáng, ở nhiệt độ phòng, theo dõi theo chu kỳ 3 ngày. Sản xuất meo nấm từ hỗn hợp mùn cưa và cám: Lấy lượng mùn cưa đủ dùng, tưới nước để tạo độ ẩm. Bổ sung 5% cám gạo, trộn đều và cho vào túi nilon. Hấp khử trùng 1210C trong 3 giờ ở áp suất 1atm. Từ môi trường agar cấy một mảnh thạch chứa sợi nấm vào túi thóc. Nuôi cấy trong điều kiện ít ánh sáng, ở nhiệt độ phòng, theo dõi theo chu kỳ 3 ngày. Sản xuất meo nấm từ hỗn hợp thóc và mùn cưa: Cân lượng thóc cần dùng, đem rửa sạch với nước để loại bỏ bụi bẩn và hạt lép. Ngâm thóc với nước sạch khoảng 3 giờ. Cho thóc vào nồi và tiến hành luộc đến khi nào vỏ hạt thóc nứt. Vớt thóc ra để khô 20 - 30 phút cho bay hơi bớt hàm lượng nước. Bổ sung 10% mùn cưa, trộn đều. Cho hỗn hợp thóc và mùn cưa vào túi nilon lượng vừa đủ, hấp khử trùng 1210C trong 3 giờ ở áp suất 1atm. Từ môi trường agar cấy một mảnh thạch chứa sợi nấm vào túi thóc. Nuôi cấy trong điều kiện ít ánh sáng, ở nhiệt độ phòng, theo dõi theo chu kỳ 3 ngày.
23 Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của loại giống cấy Chuẩn bị hỗn hợp thóc bổ sung 10% mùn cưa, trộn đều, hấp khử trùng 1210C trong 3 giờ ở áp suất 1atm. Sử dụng hai loại giống gồm giống nấm trên môi trường agar và giống nấm mọc trên tăm bông cấy vào túi cơ chất. Nuôi cấy trong điều kiện ít ánh sáng, ở nhiệt độ phòng, theo dõi theo chu kỳ 3 ngày. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ mùn cưa phối trộn với cơ chất thóc trong sản xuất meo nấm Cân lượng thóc cần dùng, đem rửa sạch với nước để loại bỏ bụi bẩn và hạt lép. Ngâm thóc với nước sạch khoảng 3 giờ. Cho thóc vào nồi và tiến hành luộc đến khi nào vỏ hạt thóc nứt. Vớt thóc ra để khô 20 - 30 phút cho bay hơi bớt hàm lượng nước. Bổ sung lần lượt 0%, 5%, 10%, 15% và 20% mùn cưa, trộn đều. Cho hỗn hợp thóc và mùn cưa vào túi nilon lượng vừa đủ, hấp khử trùng 1210C trong 3 giờ ở áp suất 1atm. Hơ kẹp trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội. Từ môi trường nuôi cấy hệ sợi trên tăm bông, cấy 2 tăm bông vào 2 mặt đối diện của túi thóc. Buộc miệng túi và nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng yếu. 3.3.3 Nội dung 3: Sản xuất thể quả nấm Linh chi Thí nghiệm 1: Sản xuất thể quả nấm Linh chi sử dụng lớp đất che phủ Nguyên liệu sản xuất thể quả trong nghiên cứu này là mùn cưa và các thân gỗ keo. Các đoạn gỗ keo đường kính khoảng 10 cm trở lên được cắt thành các đoạn ngắn khoảng 20-30 cm, ngâm trong nước 12 giờ, để ráo nước, hấp khử trùng 1210C trong 3 giờ ở áp suất 1atm. Cấy giống cấp 2 với số lượng xấp xỉ 2-3 thìa giống/1 bịch nấm. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, ít hoặc không có ánh sáng. Khi sợi nấm lan phủ kín cơ chất, loại bỏ túi bóng, chuyển vào các khay đất ẩm, có lỗ thoát nước. Phần đầu khối gỗ keo để hở lên mặt đất. Nuôi cấy dưới các bóng cây, tưới nước đẫm không để bề mặt đất bị khô. Với cơ chất mùn cưa, phối trộn cám tỉ lệ 5%, hấp khử trùng 1210C trong 3 giờ ở áp suất 1atm. Cấy giống cấp 2 với số lượng xấp xỉ 2-3 thìa
24 giống/1 bịch nấm. Những bịch mùn cưa có sợi nấm đã bao phủ toàn bộ bề mặt cơ chất, dùng dao rạch các đường dài trên thân bịch. Vùi xuống đất và tưới đẫm nước thường xuyên cho đến khi hình thành thể quả nấm. Thí nghiệm 2: Sản xuất thể quả nấm Linh chi sử dụng lớp đất được trộn với mùn cưa che phủ Sử dụng những bịch mùn cưa mà sợi nấm đã bao phủ toàn bộ bề mặt, dùng dao rạch các đường dài trên thân bịch. Phối trộn đất với 10% mùn cưa, bịch nấm được vùi xuống hỗn hợp này và tươi đẫm nước thường xuyên cho đến khi hình thành thể quả nấm. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm phương pháp khử trùng Tyndall Để tìm kiếm hình thức khử trùng bịch nấm thích hợp các khối gỗ keo được hấp khử trùng theo phương pháp Tyndall, cụ thể: Các khối gỗ keo có khích thước khoảng 20-30cm chiều dài, 15-30mm chiều rộng, được ngâm nước qua đêm và khử trùng 2-3 lần ở nhiệt độ 1000C. Mỗi lần cách nhau 24 giờ. Cấy bằng giống nấm Linh chi trên cơ chất thóc. Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm phương pháp cấy giống Các khối gỗ keo có kích thước khoảng 20-30cm chiều dài, 15-30mm chiều rộng, được ngâm nước qua đêm và khử trùng 2-3 lần ở nhiệt độ 1000C. Mỗi lần cách nhau 24 giờ. Cấy bằng giống nấm trên cơ chất thóc theo hai hình thức: Hình thức thứ nhất: Cấy sao cho giông nấm phân bố đều ở 2 đầu bịch nấm. Hình thức thứ hai: Cấy giống ở phần miệng túi. Điều kiện nuôi cấy ít ánh sáng, nhiệt độ phòng. Theo dõi thời gian sợi nấm lan phủ toàn bộ cơ chất.
25 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập giống nấm Linh chi 4.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau tới khả năng phát triển của mảnh mô thể quả nấm Linh chi Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại môi trường khác nhau gồm môi trường PDA (Potato dextrose agar), môi trường YEPD (Yeast extract peptone dextrose) và môi trường PDA trên tăm bông, kết quả như sau: Trên môi trường PDA, sau 2 ngày nuôi cấy có thể quan sát thấy sợi nấm mọc ra từ mảnh mô (Hình 2). Sau 10 ngày nuôi cấy sợi nấm đã phủ kín bề mặt đĩa petri. Sợi nấm có màu trắng đồng nhất không lẫn mốc xanh, vàng, Hình 2. Nuôi cấy mô thể quả nấm Linh chi trên môi trường PDA Trên cơ chất tăm bông, mảnh mô thể quả nấm phát triển tốt, sau 2 ngày nuôi cấy quan sát thấy sợi nấm mọc ra từ mảnh mô (hình 3A). Sau 10 ngày nuôi cấy sợi nấm bao phủ toàn bộ khối tăm bông (hình 3B).
26 A. Sau 2 ngày nuôi cấy B. Sau 10 ngày nuôi cấy Hình 3. Nuôi cấy hệ sợi trên tăm bông Trên môi trường YEPD, sau 2 ngày nuôi cấy có thể quan sát thấy sợi nấm mọc ra từ mảnh mô. Sau 10 ngày nuôi cấy sợi nấm đã phủ kín bề mặt đĩa petri (Hình 4A và 4B). Sợi nấm có màu trắng đồng nhất không lẫn mốc xanh, vàng, A. Sau 4 ngày nuôi cấy B. Sau 10 ngày nuôi cấy Hình 4. Nuôi cấy mô thể quả nấm Linh chi 4.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả năng phát triển của mốc xanh trên môi trường phân lập nấm Linh chi Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sự sinh trưởng của vi sinh vật lây nhiễm, điển hình và phổ biến nhất là nấm mốc xanh, mẫu nấm mốc xanh được thu nhận từ bịch nấm lây nhiễm được cấy lên môi trường YEPD
27 bổ sung các nồng độ NaCl lần lượt là 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Kết quả cho thấy tại các nồng độ NaCl 1%, 2%, 3%, 4%, nấm mốc xanh phát triển bình thường, không có dấu hiệu bị ức chế. Trên môi trường YEPD bổ sung nồng độ NaCl 5% nấm mốc xanh có dấu hiệu phát triển chậm. Điều này cho thấy có thể hạn chế phần nào sự lây nhiễm bằng việc bổ sung những thành phần có khả năng ức chế sự phát triển của nấm hoang dại. Tuy nhiên những thành phần bổ sung này cần đảm bảo không ức chế sự phát triển của nấm Linh chi. Các nồng độ NaCl cao hơn sẽ tiếp tục được thử nghiệm trong tương lai. 4.1.3. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả năng phát triển của sợi nấm Linh chi Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả năng phát triển của sợi nấm Linh chi, giống nấm Linh chi được nuôi cấy trên môi trường YEPD được bổ sung các nồng độ NaCl lần lượt là 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Kết quả như sau: Ở nồng độ NaCl 1% và 2% sợi nấm phát triển tốt, sợi nấm mọc trắng đều. Ở nồng độ NaCl 3%, 4% sợi nấm phát triển kém dần và không phát triển ở nồng độ NaCl 5% (Hình 5). 5% 3% 4% Hình 5. Sự phát triển của sợi nấm Linh chi trên môi trường YEPD bổ sung NaCl
28 Từ kết quả trên cho thấy, nồng độ NaCl có ảnh hưởng tới sợi nấm Linh chi theo những tỉ lệ nhất định. Trong những môi trường nuôi cấy hoặc những điều kiện thí nghiệm nồng độ NaCl không nên vượt quá 3%. Khi sử dụng NaCl như một yếu tố nhằm hạn chế sự lây nhiễm bịch nấm. Vị trí phun dung dịch NaCl nên tránh vị trí cấy giống để tránh những ảnh hưởng tiêu cực tới sự phát triển của meo nấm. 4.2. Sản xuất meo nấm 4.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của loại cơ chất tới khả năng sinh trưởng của nấm Linh chi Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại cơ chất khác nhau gồm hỗn hợp thóc và CaCO3, hỗn hợp mùn cưa và cám, hỗn hợp thóc và mùn cưa, kết quả như sau: Trên cơ chất thóc, được phối trộn 1% CaCO3 theo công thức của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự [2]. Sau 3-4 ngày, sợi nấm phát triển từ mảnh mô với màu sắc và hình thái đặc trưng. Tuy nhiên khi tới phần giữa túi cơ chất, tốc độ nấm phát triển chậm, xuất hiện mùi chua do thóc ở phần đáy túi có độ ẩm cao. Các giọt nước đọng trên thành túi làm thóc bị nát, gây dính sợi nấm. Tỉ lệ giống bị hỏng cao, lên tới 100%. Điều này có thể do quá trình chuẩn bị nguyên liệu, thóc bị luộc quá nát hoặc quá trình phơi thóc chưa đạt độ ẩm thích hợp. Việc này yêu cầu kinh nghiệm tích lũy trong thời gian lâu dài. Trên cơ chất mùn cưa bổ sung 5% cám và cơ chất hỗn hợp thóc bổ sung 10% mùn cưa sau khoảng 3 ngày nuôi cấy, sợi nấm phát triển mạnh từ mảnh mô. Sợi nấm có màu trắng, mùi thơm nhẹ. Sợi nấm mọc dày. Không xuất hiện các màu bất thường như màu mốc xanh, mốc vàng, mốc đen. Trên cơ chất mùn cưa bổ sung 5% cám, sợi nấm bao phủ khoảng hơn 80% túi cơ chất sau 40 ngày nuôi cấy (Hình 6A), tỉ lệ bịch thành công 100%. Như vậy thời gian sản xuất meo nấm theo phương pháp này có tỉ lệ thành công cao, tuy
29 nhiên thời gian sản xuất lâu dài. Vì vậy cần có những phương pháp cải tiến thích hợp hơn. Với cơ chất là hỗn hợp thóc bổ sung 10% mùn cưa, sợi nấm mọc kín sau khoảng 25-30 ngày nuôi (Hình 6B). Kết quả này phù hợp với phương pháp sản xuất meo giống của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự. Mùn cưa có khả năng hút ẩm, nhờ vậy có thể giảm thiểu nguy cơ chua hỏng thóc nguyên liệu. Phương pháp này có thể áp dụng cho những người chưa có nhiều kinh nghiệm trong quá trình sản xuất meo giống. Dù vậy, do mùn cưa chứa ít chất dinh dưỡng, tỉ lệ mùn cưa cần được tối ưu hóa để đảm bảo chất lượng giống nấm trong sản xuất trong tương lai. A. Sợi nấm phát triển trên hỗn hợp B. Sợi nấm phát triển trên hỗn hợp mùn cưa, cám sau 40 ngày nuôi cấy thóc, mùn cưa sau 30 ngày nuôi cấy Hình 6. Sản xuất meo nấm trên cơ chất 4.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của loại giống cấy Để đánh giá ảnh hưởng của loại giống cấy. Hai loại giống gồm giống nấm trên môi trường agar và giống nấm mọc trên tăm bông được thử nghiệm. Với giống cấy từ môi trường agar, sợi nấm lan phủ kín túi cơ chất trong khoảng thời gian 25-30 ngày. Trên túi cơ chất cấy bằng tăm bông, thời gian lan phủ kín sợi nấm khoảng 15 ngày. Với giống bằng tăm bông sợi nấm được cấy dọc theo bịch nấm nhờ vậy sẽ lan phủ bịch cơ chất ở cả vị trí đáy túi và
30 miệng túi. Nhờ vậy rút ngắn được thời gian lan phủ cơ chất. Từ kết quả trên giống nấm cấy trên tăm bông sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 4.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ mùn cưa phối trộn với cơ chất thóc trong sản xuất meo nấm Để đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ mùn cưa phối trộn với cơ chất thóc trong sản xuất meo nấm. Phối trộn thóc và mùn cưa với tỉ lệ lần lượt là 0% 5%, 10%, 15% và 20%. Kết quả như sau: Sau 2-4 ngày nuôi cấy, quan sát thấy sợi nấm bắt đầu mọc ra từ que tăm bông (Hình 7A). Sợi nấm mọc lan kín bịch thóc trong 15 ngày nuôi cấy (Hình 7B). Sự phát triển sợi nấm Linh chi ở 4 tỷ lệ cho kết quả không khác biệt về thời gian lan phủ cơ chất. Vì vậy, để khai thác tốt nguồn dinh dưỡng của thóc cho giống nấm đồng thời khai thác tốt vai trò hút ẩm của mùn cưa, tỉ lệ mùn cưa 5% được lựa chọn để sản xuất meo nấm với giống cấy tăm bông, trên có chất chính là thóc. A. Sau 4 ngày nuôi cấy A. Sau 15 ngày nuôi cấy Hình 7. Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ mùn cưa phối trộn với cơ chất thóc trong sản xuất meo nấm
31 4.3. Sản xuất thể quả nấm Linh chi Để sản xuất thể quả nấm Linh chi, các bịch mùn cưa và các thân gỗ keo được cấy giống và nuôi cấy trong các khay/túi đất ẩm. Kết quả cho thấy sau khoảng 15 ngày, thể quả trên các bịch mùn cưa nhú qua lớp đất mỏng (Hình 8A). Thể quả có hình dạng và màu sắc đặc trưng của nấm Linh chi, thể quả trên các bịch mùn có kích thước nhỏ do khối lượng cơ chất thử nghiệm hạn chế (nhỏ hơn 1kg). So sánh bịch nấm được phủ đất với bịch nấm không phủ đất, thể quả của bịch nấm có lớp đất phủ có thời gian tăng trưởng dài hơn, thể quả có kích thước lớn hơn (Hình 8B). Với các bịch nấm phủ hỗn hợp đất và mùn cưa (Thí nghiệm 2), sau 3-4 tuần quan sát thấy mầm thể quả nhú lên trên lớp đất bao phủ. Tuy nhiên do thời gian có giới hạn nên chưa tạo thành thể quả hoàn chỉnh. Vì vậy cần tiếp tục theo dõi và đánh giá. A. Sản xuất thể quả khi B.Sản xuất thể quả trên bịch vùi xuống đất nấm phủ đất và không phủ đất Hình 8. Sản xuất thể quả Để tìm kiếm phương án khử trùng thích hợp và đơn giản, phương pháp Tyndall được thử nghiệm trên các bịch mùn cưa gỗ keo. Kết quả, sau 1 tuần nuôi cấy không xuất hiện các giống nấm mốc xanh, mốc đen. Sợi nấm phát triển tốt, che phủ hơn 50% diện tích cơ chất (Hình 9).
32 Hình 9. Bịch nấm khử trùng theo phương pháp Tyndall Để thử nghiệm hình thức cấy thích hợp các bịch nấm được cấy theo hai hình thức: Cấy ở cả 2 phía và cấy ở 1 phía của khối cơ chất. Kết quả cho thấy bịch nấm được cấy từ 2 phía có thời gian lan phủ nhanh. sau 1 tuần nuôi cấy đã lan phủ phần lớp diện tích bề mặt cơ chất (Hình 9). Trong khi đó bịch nấm cấy ở diện tích trên miệng túi có tốc độ lan phủ cơ chất chậm. Ở các vị trí không có sợi nấm bao phủ, các loại nấm mốc nhiễm xuất hiện làm giảm chất lượng của bịch nấm(Hình 10). Hình 10. Bịch nấm Linh chi cấy ở vị trí miệng túi
33 Những kết quả thử nghiệm trên cho thấy quá trình nuôi trồng nấm có thể nuôi trồng trong những điều kiện thiết bị đơn giản với nhiệt độ khoảng 1000C. Tuy nhiên cần kết hợp nhiêu kỹ thuật, phương pháp nuôi trồng phù hợp để có kết quả tốt nhất.
34 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Đã phân lập được giống nấm Linh chi từ thể quả bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô. Đã nuôi cấy thành công giống nấm sau phân lập trên tăm bông, giúp giảm thời gian sản xuất meo nấm từ khoảng 25-30 ngày xuống khoảng 14- 15 ngày. Đã sản xuất thành công meo nấm trên cơ chất thóc phối trộn với mùn cưa và trên cơ chất mùn cưa phối trộn với cám. Đã sản xuất thành công thể quả nấm Linh chi khi sử dụng lớp đất che phủ. 5.2. Kiến nghị Tiếp tục tối ưu hóa quy trình nuôi cấy nấm Linh chi với lớp đất che phủ. Đánh giá ảnh hưởng ức chế của nồng độ muối tới sự phát triển của sợi nấm mốc lây nhiễm trong bịch cơ chất nấm Linh chi. Tách chiết dược chất trong nấm Linh chi nuôi trồng bán tự nhiên và so sánh với các mẫu nấm thu nhận trong môi trường tự nhiên và môi trường lán trại.
35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tiếng Việt 1. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 2. Nguyễn Lân Dũng (2001), Công nghệ trồng nấm, Tập 1 và 2. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 3. Vi Đại Lâm, Nguyễn Xuân Vũ, Đinh Văn Thiện, Nguyễn Thị Trang, Vũ Đình Hợi, Bùi Thanh Ngọc (2018), Phân lập và sản xuất thử nghiệm giống nấm da báo tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN, 180(04): 117 - 121. Tiếng Anh 4. Ahmet Unlu, Erdinc Nayir, Onder Kirca, Mustafa Ozdogan (2016) Ganoderma Lucidum (Reishi Mushroom) and Cancer, J BUON, Jul-Aug, 21(4):792-798.] 5. Chi H.J. Kao, Amalini C. Jesuthasan, Karen S. Bishop, Marcus P. Glucina, Lynnette R. Ferguson (2013), Anticancer activities of Ganoderma lucidum: active ingredients and pathways, Functional Foods in Health and Disease; 3(2):48-65 6. Kent H. McKnight ( 1987) Peterson field guides-Mushroom, Library of Congress cataloging in publication data 7. Wong Shu Sing (2003), Red Reishi, World Health Publishing Inc.
36 XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Thái Nguyên ngày . tháng .năm Người nhận xét phản biện Người hướng dẫn (chữ ký và ghi rõ họ tên) chữ ký và ghi rõ họ tên)