Đồ án Đánh giá khả năng đối kháng của một số chủng Trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau

Nội dung text: Đồ án Đánh giá khả năng đối kháng của một số chủng Trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG Trichoderma VỚI NẤM GÂY BỆNH LỞ CỔ RỄ TRÊN CÂY RAU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Hữu Nhượng Sinh viên thực hiện : Lê Thị Mỹ Dung MSSV: 1051110198 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2014
2. LỜI CAM ĐOAN Luận văn tốt nghiệp này được em thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS.Phạm Hữu Nhượng và KS. Ngô Thùy Trâm phòng Công Nghệ Vi Sinh, Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. HCM. Em xin cam đoan nội dung và các tài liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp là hoàn toàn trung thực. Em xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình. Tp.HCM, Ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực hiện Lê Thị Mỹ Dung
3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa đồ án tốt nghiệp này ngoài sự nổ lực của bản thân, em còn được sự hỗ trợ từ rất nhiều người, em chân thành gửi lời “CẢM ƠN” tới: Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể thầy cô trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền móng để em thực hiện khóa thực tập tốt nghiệp và làm tốt công việc sau này. Em xin cảm ơn thầy TS. Phạm Hữu Nhượng đã tận tình quan tâm, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Em xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hai người đã chỉ dẫn, dạy bảo, quan tâm và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Em xin cảm ơn KS. Ngô Thùy Trâm đã hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đem tìm hiểu tài liệu cần thiết và thao tác kỹ thuật thực hiện thí nghiệm và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa đồ án này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc tới các anh chị, cán bộ trong Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM đã cung cấp những hóa chất, thiết bị cần thiết, chỉ dẫn và giúp đỡ,tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa đồ án tốt nghiệp. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình những người đã luôn bên cạnh em, cổ vũ tinh thần và đã ủng hộ em trong suốt thời gian qua. Vì thời gian có hạn và còn hạn chế về mặt kiến thức và kinh nghiệm thực tiễn, đồ án còn nhiều thiếu sót. Rất mong được sự đóng góp và phê bình của quý thầy cô cho đồ án của em được hoàn thiện tốt hơn. Tp.HCM, Ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực hiện Lê Thị Mỹ Dung
4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii LỜI MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Phạm vi nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về bệnh lở cổ rễ gây hại trên cây rau 3 1.2. Tình hình bệnh lở cổ rễ trong và ngoài nước 5 1.2.1. Tình hình bệnh lở cổ rễ trên cây rau ngoài nước 5 1.2.2. Tình hình bệnh lở cổ rễ trên cây rau ở trong nước 5 1.3. Nấm bệnh gây lở cổ rễ hại cây trồng 6 1.3.1. Nấm Rhizoctonia sp. 6 1.3.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Rhizoctonia sp. 6 1.3.1.2. Sự phân bố và gây hại 7 1.3.1.3. Ký chủ 9 1.3.2. Nấm Phomopsis sp. 9 1.3.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Phomopsis sp. 9 1.3.2.2. Sự phân bố và gây hại 10 1.3.2.3. Ký chủ 10 1.3.3. Nấm Fusarium sp. 11 1.3.3.1. Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium sp. 11 1.3.3.2. Sự phân bố và gây hại 11 i
5. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3.4. Ký chủ của nấm Fusarium sp. 12 1.4. Biện pháp phòng trừ 12 1.4.1. Biện pháp canh tác 13 1.4.1.1. Làm đất 13 1.4.1.2. Luân canh 13 1.4.1.3. Xen canh 13 1.4.1.4. Sử dụng giống kháng 14 1.4.2. Biện pháp hoá học 14 1.4.3. Biện pháp sinh học 14 1.4.4. Sử dụng nấm đối kháng 15 1.5. Tổng quan về nấm Trichoderma 15 1.5.1. Đặc điểm của nấm Trichoderma 15 1.5.2. Đặc điểm hình thái (Gary J. Samuels, 2004) 16 1.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học 17 1.5.4. Nguồn gốc 18 1.5.5 Một số loài Trichoderma thường gặp ở vùng nhiệt đới 18 1.5.5.1. Trichoderma pseudokoningii Rifai 18 1.5.5.2. Trichoderma atroviride Bissett 18 1.5.5.3. Trichoderma hamatum Bain 18 1.5.5.4. Trichoderma inhamatum Veerkamp & W. Gams 19 1.5.5.5. Trichoderma harzianum Rifai 19 1.5.5.6. Trichoderma koningii Ouden 19 1.5.6. Các cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp. 19 1.6. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma 24 1.6.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng 24 1.6.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường 27 1.6.3. Trong các lĩnh vực khác 28 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1. Điều kiện nghiên cứu 29 ii
6. Đồ án tốt nghiệp 2.2. Dụng cụ, thiết bị 29 2.2.1. Các dụng cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm 29 2.3. Môi trường hóa chất dùng để nuôi cấy và phân lập nấm 29 2.3.1. Môi trường WA (Water Agar) 29 2.3.2. Môi trường PDA ( Potato D-Glucose agar) 30 2.4. Vật liệu nghiên cứu 30 2.4.1. Nấm đối kháng 30 2.4.2. Nấm gây bệnh 30 2.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 30 2.5.1. Phân lập nấm gây bệnh 30 2.5.2. Quan sát hình thái bằng phương pháp phòng ẩm 32 2.5.3. Bảo quản 33 2.6. Phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch 33 2.7. Định danh các chủng nấm tuyển chọn được bằng sinh học phân tử dựa vào vùng trình tự bảo tồn ITS 34 2.8. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với các loài nấm bệnh gây lở cổ rễ trên đĩa petri 37 2.9. Phương pháp xử lí số liệu 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 39 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau 39 3.1.1. Chủng nấm 1 39 3.1.2. Chủng nấm 2 40 3.1.3. Chủng nấm 3 41 3.2. Lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch 42 3.3. Định danh bằng sinh học phân tử mẫu nấm gây bệnh 45 3.4. Các dòng nấm Trichoderma dùng nuôi cấy đối kháng 48 3.5. Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp. với các chủng nấm bệnh trên đĩa petri 51 iii
7. Đồ án tốt nghiệp 3.5.1. Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp. với chủng nấm bệnh Rhizoctonia solani trên đĩa petri 51 3.5.2 Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp., với chủng nấm bệnh Phomopsis vexan trên đĩa petri 63 3.5.3. Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp., với chủng nấm bệnh Fusarium solani trên đĩa petri 74 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 88 4.1. Kết luận 88 4.2. Kiến nghị 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 PHỤ LỤC iv
8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ctv : Cộng tác viên ĐC : Đối chứng DNA : Deoxyribonucleotide Acid - bộ mã di truyền Fu : Fusarium ITS : Internal Trancribed Spacer - vùng dịch mã trong nhân PCR : Polymerase chain reaction - phản ứng khuyếch đại PDA : Potato D-Glucose Agar Phomo :Phomopsis Rhiz : Rhizoctonia solani STT : Số thứ tự T : Trichoderma TAE : Tris Acetic EDTA Tp. HCM : Thành phố Hồ Chí Minh VSV : Vi sinh vật WA : Water agar WTO :World Trade Organization v
9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Diện tích, năng suất, sản lượng rau vụ hè thu 2013 của Tp.HCM (Chi cục bảo vệ thực vật TP.HCM) 4 Bảng 3.1: Phần trăm ức chế của sự phát triển của hệ sợi nấm Rhizoctonia sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày nuôi cấy đối kháng 55 Bảng 3.2. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 3 ngày cấy đối kháng cùng lúc 55 Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 5 ngày cấy đối kháng cùng lúc 57 Bảng 3.4. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 7 ngày cấy đối kháng cùng lúc 59 Bảng 3.5. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 9 ngày cấy đối kháng cùng lúc 61 Bảng 3.6: Phần trăm ức chế của sự phát triển của hệ sợi nấm Phomopsis vexan sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày nuôi cấy đối kháng 67 Bảng 3.7: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 3 ngày cấy đối kháng cùng lúc 67 Bảng 3.8: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 5 ngày cấy đối kháng cùng lúc 69 Bảng 3.9 : Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 7 ngày cấy đối kháng cùng lúc 71 Bảng 3.10: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 9 ngày cấy đối kháng cùng lúc 72 Bảng 3.11: Phần trăm ức chế của sự phát triển của hệ sợi nấm bệnh Fusarium sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày nuôi cấy đối kháng 78 Bảng 3.12: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 3 ngày cấy đối kháng cùng lúc 78 Bảng 3.13: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 5 ngày cấy đối kháng cùng lúc 80 Bảng 3.14: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 7 ngày cấy đối kháng cùng lúc 82 Bảng 3.15: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 9 ngày cấy đối kháng cùng lúc 84 vi
10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1: Tỷ lệ hạt nảy mầm / tổng số hạt gieo 43 Đồ thị 3.2: Tỷ lệ cây con bị nhiễm bệnh 44 vii
11. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 : Sự tác động của Trichoderma spp. lên tác nhân gây bệnh (Pythium) 20 Hình 1.2 : Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia 21 Hình 2.1: Phân lập nấm bệnh từ một mẫu bệnh cây (Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam) 32 Hình 2.2: Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm để làm thuần (Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam) 32 Hình 2.3 : Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp nấm bệnh - Trichoderma spp. 38 Hình 3.1: Hình thái đại thể chủng nấm 1 39 Hình 3.2: Hình thái vi thể chủng nấm 1 dưới kính hiển vi quang học 40X 39 Hình 3.3: Hình thái đại thể chủng nấm 2 40 Hình 3.4: Hình thái vi thể chủng nấm 2 dưới kính hiển vi quang học 40X 40 Hình 3.5: Hình thái đại thể chủng nấm 3 41 Hình 3.6:Hình thái vi thể chủng nấm 3 dưới kính hiển vi quang học 40X 41 Hình 3.7: Mẫu cây trồng trong đất có bổ sung F. 43 Hình 3.8: Mẫu cây trồng trong đất có bổ sung P. 44 Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu F, P, R 45 Hình 3.10: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng B1 48 Hình 3.11: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng B4 48 Hình 3.12: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng B5 49 Hình 3.13: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng B12 49 Hình 3.14: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng T3 49 Hình 3.15: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng TN1 50 viii
12. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.16: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng CĐ02 50 Hình 3.17: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng CĐ08.1 50 Hình3.18: Khả năng đối kháng của Trichoderma với Rhizoctonia solani sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày 54 Hình 3.19: Khả năng đối kháng của Trichoderma với Phomopsis vexan sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày 66 Hình 3.20 : Khả năng đối kháng của Trichoderma sp. với Fusarium solani sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày 77 ix
13. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Rau màu là loại cây ngắn ngày, đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm thiết yếu cho cuộc sống con người. Rau màu có chứa nhiều chất dinh dưỡng, nhưng thân lá lại non mềm, chứa nhiều nước, là môi trường thuận lợi cho các loài nấm, sâu bệnh phá hoại. Vì vậy rau màu đang là đối tượng sử dụng nhiều loại thuốc hóa học. Cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp, ngành trồng rau nước ta đang không ngừng phát triển cả về diện tích, năng suất và chất lượng. Từ đó, hình thành nên nhiều vùng rau chuyên canh, từ sự chuyên canh đó đã hình thành nên nhiều chứng bệnh nguy hiểm. Thực tế cho thấy, khi cây trồng bị nhiễm bệnh, năng suất và chất lượng sản phẩm bị giảm đáng kể và khi nhiễm bệnh nặng có thể mất trắng. Những bệnh gây ra do nấm là khá phổ biến. Trong đó, các bệnh hại trên rau thì bệnh chết cây con, bệnh gây lở cổ rễ, thối rễ do nấm Rhizoctonia sp, Phomopsis sp., Fusarium sp là bệnh rất nghiêm trọng và khá phổ biến hay gặp ở cây trồng. Tổ chức lương thực LHQ (FAO) đã thống kê thấy rằng các bệnh do vi nấm gây thiệt hại cho nông nghiệp chiếm tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp trên thế giới. Bởi vậy, chúng ta phải áp dụng hàng loạt các biện pháp nhằm hạn chế những thiệt hại do tác nhân trên gây ra, trong đó biện pháp hóa học được sử dụng phổ biến trong sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên, biện pháp hóa học gây tác động xấu ảnh hưởng nghiêm trọng môi trường đất, nước, không khí và ảnh hưởng trực tiếp đến sinh vật sống trong các môi trường đó. Dư lượng thuốc tồn trong các nông phẩm còn ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người làm phát sinh nhiều bệnh nan y như ung thư, viêm phổi, thai dị dạng Hơn nữa, do việc quá lạm dụng thuốc còn gây hiện tượng lờn thuốc của vi sinh vật gây bệnh. Đứng trước thực tiễn đó, việc phòng, trị bệnh và tiến tới thay thế dần biện pháp sử dụng chất hóa học bảo vệ thực vật bằng vi sinh vật đối kháng là yêu cầu, đòi hỏi cấp thiết không những để làm giảm thiệt hại do nấm bệnh gây ra, góp phần 1
14. Đồ án tốt nghiệp nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm nông nghiệp mà vì mục đích giải quyết vấn đề môi trường và nâng cao chất lượng cuộc sống con người. Trên cơ sở đó đề tài: “Đánh giá khả năng đối kháng của một số chủng Trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau” được tiến hành, với mong muốn tìm và chọn ra được chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng tốt nhất với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau. 2. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn được chủng nấm Trichoderma có tác dụng đối kháng phòng trừ nấm gây bệnh lơcổ rễ tốt nhất. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và định danh các nấm gây bệnh lở cổ rễ. - Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ trên môi trường PDA - Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Phomopsis vexan gây bệnh lở cổ rễ trên môi trường PDA - Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Fusarium solani gây bệnh lở cổ rễ trên môi trường PDA 4. Phạm vi nghiên cứu Phân lập các dòng nấm gây bệnh lở cổ rễ ở cây cà tím và cà chua. Đồng thời đánh giá khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma trong điều kiện in vitro. 2
15. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về bệnh lở cổ rễ gây hại trên cây rau Bệnh lở cổ rễ hay còn gọi là bệnh thối gốc, một trong những loại bệnh nguy hiểm, gây thiệt hại nhiều nhất, nhanh nhất cho những người sản xuất rau màu nói chung, những người chuyên gieo ươm cây rau giống nói riêng. Triệu chứng: Bệnh chủ yếu gây hại ở phần cổ rễ, phần gốc sát mặt đất. Khi mới xuất hiện, nếu quan sát kỹ có thể thấy những vết bệnh có màu khác với vỏ cây, phần vỏ này bị rộp lên, sau đó lan dần bao quanh toàn bộ phần cổ rễ hoặc gốc cây. Dần dần phần vỏ này khô teo lại, khi gặp trời mưa hoặc độ ẩm cao sẽ bị thối nhũn, bong ra, trơ lại phần lõi gỗ của cây có màu thâm đen, cây sẽ héo dần và chết. Lúc mới bị nhiễm bệnh, lá trên các cây này còn giữ được màu xanh tươi trong vài ngày (nếu trời râm mát), sau đó toàn bộ cây sẽ bị héo rũ gục xuống, chết lụi từng đám rải rác trên ruộng hoặc từng vạt lớn nếu ruộng rau bị nhiễm bệnh nặng. Vào những ngày có nhiều sương mù hoặc lúc sáng sớm ta có thể thấy lớp tơ màu trắng bám nơi vết bệnh. Vài ngày sau, trên thân cây và vùng đất xung quanh gốc cây bị bệnh xuất hiện nhiều đốm hạch màu vàng nâu bám xung quanh đó. Bệnh lở cổ rễ do nhóm nấm bệnh có nguồn gốc trong đất gây ra. Điển hình như nấm Rhizoctonia, Pythium, Fusarium, Phomopsis Các bào tử nấm này thường sống tiềm ẩn trong đất và tàn dư cây trồng khá lâu, nhất là ở những vườn ươm cây giống, những vườn sản xuất đã từng bị bệnh lở cổ rễ mà không được xử lý đất trước khi trồng lại. Các bào tử nấm này thường lây lan trong môi trường nước và xâm nhập qua các vết thương cơ giới hoặc các lỗ khí khổng của lá khi có điều kiện môi trường thuận tiện. Bệnh thường phá hại nhiều trong vườn ươm hoặc sau khi trồng khoảng 1 tháng tuổi, làm chết cây con. Nấm thường tấn công vào cổ rễ, nơi tiếp giáp với mặt đất và cổ rễ bị khô, cây không hút được nước nên đổ rạp và chết rất nhanh. Bệnh thường phát sinh, phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm cao, nhiệt độ cao hoặc 3
16. Đồ án tốt nghiệp mưa, nắng, rét, nóng thất thường. Các nấm bệnh này phát triển và gây thiệt hại nặng về kinh tế. Biện pháp phòng trừ chủ yếu dựa vào các lọai thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học còn biện pháp sinh học được sử dụng để phòng trừ còn rất hạn chế. Hiện nay, riêng vụ hè thu 2013 trên địa bàn Tp.HCM, tổng diện tích canh tác rau chiếm 1638,9 ha, tổng diện tích gieo trồng chiếm 3189 ha và năng suất bình quân đạt 21,03 tấn/ha. Với việc sản xuất độc canh của các vùng chuyên canh trồng rau cũng như các biện pháp chăm sóc, phòng và trị các tác nhân gây bệnh chưa hợp lý đã dẫn tới các dịch bệnh hoành hành, ảnh hưởng tới năng suất và tổn thất về kinh tế. Hiện nay tình hình dịch hại trên rau do tác nhân là sâu và côn trùng gây hại có thể được giám định tương đối rõ ràng và đầy đủ, vì chúng khá dễ dàng trong việc xác định, định danh. Tuy nhiên, tình hình bệnh hại và những tổn thất kinh tế do các tác nhân VSV gây ra trên rau, đặc biệt là các loại nấm gây bệnh thì vẫn chưa được điều tra, nghiên cứu một cách đầy đủ. Một lý do gây nên hạn chế này có thể do việc phân lập được đúng các loài nấm gây bệnh không hề dễ dàng và tốn nhiều công sức. Từ đó dẫn đến việc sử dụng các biện pháp và trị bệnh sẽ kém hiệu quả. Bảng1.1: Diện tích, năng suất, sản lượng rau vụ hè thu 2013 của Tp.HCM (Chi cục bảo vệ thực vật TP.HCM) Chỉ tiêu Diện tích canh Diện tích gieo Năng suất bình Sản lượng Nhóm rau tác (ha) trồng (ha) quân (tấn/ha) (tấn) Rau ăn lá ngắn 953,65 2380,63 20,97 49933,54 ngày Rau ăn lá dài 11,7 13 14,7 216 ngày Rau ăn củ quả 456,9 568,8 20,42 11616,65 ngắn ngày Rau ăn củ quả 216,7 227,2 23.36 5308,5 dài ngày Tổng cộng 1638,95 3189 21,03 67074,7 4
17. Đồ án tốt nghiệp 1.2. Tình hình bệnh lở cổ rễ trong và ngoài nước 1.2.1. Tình hình bệnh lở cổ rễ trên cây rau ngoài nước Theo ước tính FAO - tổ chức lương thực, thực phẩm thế giới - hằng năm thiệt hại do VSV, sâu bệnh và cỏ dại gây ra là rất lớn chiếm tới 34,39%. Trong đó sâu hại chiếm12,4%, nấm gây hại chiếm 11,6%, còn cỏ dại chiếm 10,9%. Tại trung tâm nghiên cứu và phát triển rau ở Thái Lan đã khảo nghiệm trên tập đoàn 50 dòng giống cà chua cho thấy các dòng đều bị nhiễm bệnh này, nặng nhất là FMTT 33 với tỉ lệ bệnh là 23,75%, còn lại là các dòng khác tỉ lệ bệnh từ 5- 12%. Theo Rowshan Alison tỷ lệ bệnh lở cổ rễ trên giống cà chua ở Thái Lan là 13,02%. Theo Branch, W.L and Brunnemen, T.B (1993) ở vùng Georgia Mỹ thiệt hại do bệnh này gây ra hằng năm ước tính lên tới 43 triệu USD. Đây là một vấn đề nan giải ở một số nước trên thế giới như Thái Lan, Myanma, Philippin bệnh xuất hiện nhiều vào mùa mưa, và vào giai đoạn hạt đang nảy mầm. Thiệt hại của nó rất đáng kể lên hàng triệu USD/ năm Bệnh lở cổ rễ một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng trên cây rau tại Indonesia. Ở Malaysia (theo nguồn Agriviet.com 2008) thì bệnh lại xuất hiện vào những vùng đất tái canh tác theo nghiên cứu vào năm 2000 - 2005 có khoảng 80000 ha được tái canh trước đó trồng bắp sau đó trồng cây cải. Hầu hết vùng tái canh thuộc tiểu điền và rất mẫn cảm với bệnh lở cổ rễ. Sự xuất hiện và phân bố của bệnh lở cổ rễ nói chung chưa thể hiện rõ do yếu tố địa lý hay thổ nhưỡng. Tuy nhiên mức độ ảnh hưởng phụ thuộc nhiều vào việc vệ sinh đồng ruộng và thu gom tất cả rễ nhiễm bệnh ra ngoài. 1.2.2. Tình hình bệnh lở cổ rễ trên cây rau ở trong nước Trong điều kiện của Việt Nam, nấm gây bệnh lở cổ rễ cây rau phát sinh và phát triển khá mạnh như Rhizoctonia sp., Phomopsis sp., Pythium sp., Fusarium sp., gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau như lúa, bắp, cà chua, cà tím, khoai 5
18. Đồ án tốt nghiệp tây Tùy theo loại cây và giai đoạn sinh trưởng của cây mà bệnh có nhiều triệu chứng khác nhau như thối đen rễ, lở cổ rễ, thối gốc, thối thân, thối lá. Hại ở thời kỳ cây con ở rễ, cổ rễ úng nước, nâu đen, cây đổ rạp gọi là bệnh lở cổ rễ (tạp chí BVTV, 2002). Bên cạnh đó đối với những loài cây cà tím, cà chua bệnh cũng bị tấn công , cây héo rũ và ngã gục xuống. Nhổ cây con lên ta thấy ở phần cổ rễ có vết bệnh màu nâu sẫm vòng quanh thân, dài 1 - 3 cm. Vì vậy, có thể thấy những ký chủ dễ dàng bị tấn công vào lúc chúng mới nhú rễ mầm. Một yếu tố quan trọng khác không thể thiếu để dẫn đến sự phát triển của bệnh là điều kiện thời tiết ẩm, sợi nấm bệnh có thể mọc ra từ vết bệnh và lan ra hốc cây này sang hốc cây khác. Bệnh này xuất hiện từ khi cây bắt đầu mọc đến khi cây được 20 ngày tuổi. Tuổi cây càng lớn thì khả năng nhiễm bệnh càng giảm (Nguyễn Văn Minh, 2005- 2006). Theo những điều tra về số liệu của bệnh gây ra gần đây thì bệnh thường xuất hiện ở hầu hết các vùng đồng bằng, trung du, miền núi trên các loại đậu bắp, họ cà Bệnh phá hoại xuất hiện thời kỳ sinh trưởng của cây nhưng chủ yếu là vào thời kỳ cây con gây thiệt hại lớn cho nguồn nông sản nước ta (Võ thị Thu Oanh, 2000). 1.3. Nấm bệnh gây lở cổ rễ hại cây trồng 1.3.1. Nấm Rhizoctonia sp. 1.3.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Rhizoctonia sp. Nấm Rhizoctonia sp. có rất nhiều loài, nấm Rhizoctonia sp. thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromyces), là loài gây hại phổ biến trên nhiều loại cây trồng. Ở giai đoạn sinh sản hữu tính loài này có tên gọi là Thanatephorus cucumeris thuộc lớp nấm đảm (Basidiomycetes), được phát hiện rất sớm, nấm phát triển nhanh, phân nhánh tại điểm gần vách ngăn giữa hai tế bào và vuông góc với sợi nấm chính (Mezies, 1970). Nấm R. solani sinh trưởng rất dễ dàng trên các loại môi trường phổ biến, sợi nấm khi còn non không màu, khi trưởng thành có màu nâu vàng nhạt, đường kính 8 6
19. Đồ án tốt nghiệp – 12µm, với những vách ngăn không liên tục (Ou, 1983). Chúng có thể đồng dạng hay khác nhau về kích thước, hình dạng, màu sắc và cách phân bố trên môi trường, đường kính hạch nấm nhỏ hơn 1mm đến vài cm (Menzies, 1970). Khi nấm mọc trên môi trường nuôi cấy có kích thước sợi nấm và hạch nấm lớn hơn so với sợi nấm mọc trên ký chủ trong tự nhiên (Ou, 1983). Hạch nấm là một cấu trúc phức tạp được tạo ra do các sợi nấm cuộn lại, chúng có khả năng duy trì sức sống trong điều kiện môi trường không thuận lợi như: khô hạn, thiếu thành phần dinh dưỡng hay hóa chất độc hại (Ghaffer, 1993). Nấm R. solani trong tự nhiên phần lớn sinh sản bằng hình thức vô tính hiện diện ở dạng sợi nấm và hạch nấm. Trên mô ký chủ hoặc vách ống nghiệm nuôi cấy, các sợi nấm đôi khi mọc ra những tế bào ngắn, phình to và phân nhiều nhánh. Các tế bào đó, có thể có khả năng liên quan tới quá trình gây bệnh hoặc tới giai đoạn sinh sản bào tử (Ou, 1983). Hạch nấm bám sát vào mô cấy, bề mặt sần sùi, sợi nấm to, không màu, phân nhánh vuông góc, đen Hạch nấm lan truyền chủ yếu nhờ nước. Nó có khả năng lan truyền theo hai chiều, đứng và ngang. Sự lây lan theo chiều đứng chủ yếu từ bẹ lá lên lá bằng sợi nấm, còn theo chiều ngang từ chồi này sang chồi khác cũng bằng sợi nấm nhưng từ ruộng này sang ruộng khác thì bằng hạch nấm (Tô Thị Thùy Hương, 1993). Khi hạch nấm bám vào bẹ lá sẽ nẩy mầm ra sợi nấm rất nhỏ, sợi nấm có thể xâm nhập trực tiếp qua biểu bì hay khí khổng. Muốn xâm nhiễm qua khí khổng khuẩn ty phải phát triển để len vào mặt trong của bẹ lá và xâm nhiễm vào. Nhiệt độ cho sự xâm nhiễm của nấm có thể xảy ra là 23 – 25oC, nhưng tối hảo nhất là 30 – 32oC, ẩm độ phải từ 96 – 97%. Ở 32oC nấm xâm nhiễm trong vòng 18 giờ (Võ Thanh Hoàng, 1993). 1.3.1.2. Sự phân bố và gây hại Nấm R. solani gây bệnh đốm vằn trên lúa được tìm thấy lần đầu tiên tại Nhật Bản vào năm 1910. Năm 1934, bệnh xuất hiện ở Trung Quốc và ở nhiều nước Châu Á khác, sau đó là ở Brazil, Surinam, Venezuela, Madagasca và Mỹ. 7
20. Đồ án tốt nghiệp Theo Kozada (1965), ghi nhận có 188 loài thực vật thuộc 32 họ, trong đó có 20 loài cỏ dại thuộc 11 họ có thể bị tấn công do nấm R. solani. Theo Tsai (1970), nhận thấy rằng nấm R. solani gây hại trên lúa cũng xâm nhiễm trên 20 loài cỏ thuộc 11 họ. Bệnh do nấm R. solani gây ra hiện diện ở Châu Âu, Châu Phi và Châu Á. Bệnh gây hại chủ yếu ở những vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới. Bệnh khá phổ biến ở Việt Nam. Bệnh làm giảm 40% năng suất. Bệnh phát triển mạnh khi có mưa nhiều, ẩm độ cao (100%), nhiệt độ cao khoảng 25 – 30oC, gieo trồng với mật độ dày. Bệnh gây hại nặng ở giai đoạn cây con. Điều kiện thích hợp cho sự phát triển của nấm R. solani là: ẩm độ không khí cao và nhiệt độ cao, trồng cây ở mật độ dày, bón nhiều phân hóa học nhất là phân đạm (Ou, 1985). Xâm nhiễm: Trong đất, R. solani tồn tại ở dạng sợi nấm dinh dưỡng cũng như hạch nấm, đó là giai đoạn sinh sản vô tính. Hạch nấm được biết đến là nguồn gốc chính của nhiễm bệnh do Rhizoctonia (Anderson, N.A., 1982). Các cấu trúc màu nâu, hình dạng không xác định, nhỏ (đường kính 1 - 3 mm) chứa một lượng dày đặc các monolioid. Do cấu trúc này nhỏ và có chứa nhiều melanin trong tất cả các thành tế bào, hạch nấm của R. solani có thể chống chịu nhiều điều kiện môi trường không thuận lợi. Ngoài ra hạch nấm R. solanin tiết ra chất lỏng màu nâu là hỗn hợp các chất phenol, acid carboxylic, carbohydrate, acid béo và amino acid góp phần vào hoạt tính kháng nấm và gây độc cho cây trồng (Aliferis và ctv, 2010). Cả hai yếu tố hạch nấm tồn tại lâu và tính đa dạng cao làm cho việc kiểm soát các bệnh do Rhizoctonia gây ra rất khó. Hạch nấm có khả năng nảy mầm nhiều lần, những lần sau sức nảy mầm giảm đi, những hạch nấm bị phân cắt có khả năng gây bệnh cho cây. Hạch và sợi nấm rất dễ hình thành trên các vết bệnh nhất là điều kiện ẩm, lúc đầu màu trắng, sau màu nâu đỏ, đường kính biến động từ 1- 6mm (Ou, 1985). 8
21. Đồ án tốt nghiệp Hemmi và Yokogi (1927) cho rằng nhiệt độ tốt nhất cho sợi nấm R.solani phát triển là 30oC, nhiệt độ cao nhất là 40 – 42oC, ở nhiệt độ 10oC sợi nấm phát triển rất ít hoặc không phát triển. pH thích hợp cho sự phát triển của nấm R.solani là 5,4 – 6,7; pH thấp nhất là 2,5 và cao nhất là 7,8 (Endo, 1931). 1.3.1.3. Ký chủ Những nghiên cứu về sự sinh trưởng ở phòng thí nghiệm cho thấy nấm R. solani cũng gây hại trên những cây trồng khác, bao gồm cây bông vải, cải củ, lúa mì và khoai tây (Carling và ctv, 1994). Nấm R. solani là nguyên nhân gây nên một số bệnh phổ biến trên cây trồng: bệnh héo rũ cây con, thối rễ, thối thân hay loét thân ở giai đoạn cây con hoặc trưởng thành. Ngoài ra, nấm R. solani còn là nguyên nhân gây bệnh trên một số cơ quan khác của cây như thối trái cà chua, khô lá hoặc những đốm đặc biệt trên lá ở gần mặt đất (Agrios, 1997). Các nhóm khác nhau thì không hoàn toàn có ký chủ khác nhau rõ ràng, nhưng cũng giúp chúng ta biết được phạm vi ký chủ của mỗi nhóm khác nhau, tạo điều kiện thuận lợi trong định hướng nghiên cứu: tạo giống cây kháng, sinh thái, bố trí cây trồng thích hợp (Burgess và ctv, 1994 và Agrios, 1997). 1.3.2.NấmPhomopsis sp. 1.3.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Phomopsis sp. Phomopsis thuộc họ Valsaceae, bộ Diaporthales, lớp Sordariomycetes, ngành Ascomycota, loài Phomopsis. Phân bố rộng rãi trên thế giới. Phomopsis gây bệnh thối rễ, tổn thương gốc, héo lá và quả đặc biệt gây ra hiện tượng chết rạp ở giai đoạn cây con do bào tử của nó có thể lây lan qua gió, mưa Phomopsis là loài có phổ kí chủ rộng, có hệ sợi nấm phát triển nhanh, có màu trắng ban đầu và dần chuyển sang màu xám trên môi trường PDA. Bào tử có hai loại: bào tử α và bào tử β. Bào tử α trong suốt như pha lê, hình bầu dục, đơn bào, kích thước 5 - 8 x 2-3 µm trong khi bào tử β không màu, hình sợi hoặc hình 9
22. Đồ án tốt nghiệp lưỡi liềm, có vách ngăn, không nảy mầm, kích thước 18 - 32 x 0,5 - 2 µm (Edgerton and Moreland, 1921; Sherf and Mac Nab, 1986; Singh, 1987) Quả thể thường mọc thành cụm, đường kính 130- 350 µm. Bào tử túi, trong pha lê, hình elip, có vách ngăn 9 -12 x 3-4,5 µm (Gratz, 1942) Ở Phomopsis bào tử α gây bệnh trên cây trồng còn bào tử β không gây bệnh do không nảy mầm được. Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của nấm là 28o C 1.3.2.2. Sự phân bố và gây hại Bệnh bạc lá do Phomopsis vexan gây ra lần đầu được công bố ở Italy năm 1881 và sau đó đã có nhiều nghiên cứu về tác hại của loài nấm này. Bệnh này nghiêm trọng nhất ở miền Nam và miền Đông của Châu Âu. Phomopsis chủ yếu gây hại ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt, gây thiệt hại đáng kể cho mùa màng (Porter, 1943; Vishunavat and Kumar, 1993). Phomopsis phát triển tự nhiên từ đồng bằng đất thấp đến các khu vực miền núi lên đến độ cao 1200m trên mực nước biển (Gellini, 1985). Phomopsis là một tác nhân gây bệnh thực vật phân bố rộng rãi trong đất, gây giảm năng suất trên nhiều loại cây trồng. Ở cây con và cây trưởng thành đều dễ bị mắc bệnh. Bào tử nảy mầm sau 6 giờ và 12 giờ sau khi thâm nhập xảy ra (Divinagracia, 1968). Phomopsis vexan gây bệnh trong điều kiện thời tiết nóng và đất ẩm ướt dễ cho sự phát triển của bệnh. Bào tử nảy mầm tối ưu ở 27oC và tạo thành túi bào tử phấn ở 30- 35oC (Pavar and Patel, 1957). Độ ẩm tối ưu cho bệnh phát triển là 55% (Chaudhary and Hasija, 1979) và nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng nấm là 28oC ( Pawar and Patel, 1957). Bào tử phát tán trong tự nhiên nhờ gió và mưa (Edgerton and Moreland, 1921) 1.3.2.3. Ký chủ Nấm Phomopsis có thể gây bệnh ở rễ, thân, lá hay quả đặc biệt nấm này gây ra hiện tượng chết rạp cây con. Nấm có thể gây hại cuống lá súp lơ, cà rốt, rễ củ 10
23. Đồ án tốt nghiệp cải Đặc biệt, cây cà tím là loại cây bị nấm này tấn công nhiều nhất trên hầu hết các bộ phận của cây. 1.3.3. Nấm Fusarium sp. 1.3.3.1. Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium sp. Fusarium thuộc họ Nectriaceae, bộ Hypocreales, lớp Sordariomycetes, ngành Ascomycota. Nấm Fusarium sp. thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giai đoạn sinh sản hữu tính là Gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes). Fusarium gồm nhiều loài khác nhau, có khả năng gây nhiều loại bệnh trên những cây trồng khác nhau. Chúng hoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau. Nó là nguyên nhân chính làm héo rũ. Hệ sợi nấm lan tỏa khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ. Sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở quá trình vận chuyển nước làm héo cây. Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Cơ thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa. Trong một tế bào có một nhân hoặc nhiều nhân. Vách tế bào bằng chitin, glucan. Nấm sống hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật, gặp phổ biến trong đất, cũng gặp trên các vật liệu cellulose (Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng,1982) . 1.3.3.2. Sự phân bố và gây hại Nấm này phân bố khắp nơi trên thế giới, một vài loài phân bố khắp nơi trong khi những loài khác có xu hướng xuất hiện chủ yếu ở vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới hay ôn đới Nhiệt độ tối ưu cho nấm Fusarium sp. phát triển là 27 – 30oC, tối đa là 36 – 40oC và tối thiểu là 7 – 8oC, nhưng nhiệt độ thích hợp cho sự xâm nhiễm là 35oC (Ou, 1985). Nấm Fusarium sp. gây nhiều bệnh trên cây trồng: bệnh nghẽn mạch (héo), thối rễ, thối thân, thối hạt, thối trái. Nấm Fusarium sp. sống phổ biến trong đất, lưu 11
24. Đồ án tốt nghiệp tồn dưới dạng bào tử áo hoặc khuẩn ty sống trên xác bã thực vật dư thừa hay những chất hữu cơ. Một số loài tạo bào tử đính bay trong không khí, đây là nguyên nhân gây ra những bệnh trên thân, lá và bông (Burgess và ctv, 1994) Xâm nhiễm: Sợi nấm và bào tử vô tính nảy mầm trong tàn dư cây bệnh và đất xâm nhiễm vào rễ con còn non và lan dần vào các mạch xylem. Nấm bệnh sau đó sẽ phát triển trong mạch xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân. Quá trình này gây phản ứng của cây, tạo ra các hợp chất phenol và thể sần có màu nâu. Những hợp chất này gây hiện tượng hóa nâu của mạch dẫn. Hiện tượng tắc mạch xylem làm giảm lượng nước di chuyển lên cây, khiến cây bị héo và teo thắt ở phần thân rễ rồi chết. Nấm Fusarium sp. tấn công chủ yếu vào bộ rễ (Agrios, 1997). Đặc biệt, bệnh gây hại nặng nề trong điều kiện stress nước, dùng phân bón quá nhiều hay rễ cây bị tổn thương (Olsen và ctv, 2000). 1.3.3.4. Ký chủ của nấm Fusarium sp. Nấm Fusarium sp. gây hại ở nhiều loại cây họ đậu, họ cam quít, khoai tây, cà chua. Nấm Fusarium sp. gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây, nhưng chủ yếu là thời kỳ cây con (Porter và ctv, 1984; Vũ Triệu Mẫn và Lê Lương Tề, 1998). Fusarium sp. là tác nhân gây bệnh thối rễ nguy hiểm nhất trên diện rộng trên đậu, cà chua (Nelson và ctv, 1981). 1.4. Biện pháp phòng trừ Không giống như những loại ký sinh khác, ký sinh gây hại vùng rễ cây trồng thường rất khó phát hiện và phòng trị kịp thời, lý do là khi chúng ta phát hiện triệu chứng thể hiện trên cây (héo, vàng lá, ) thì ký sinh đã tấn công và hủy hoại một phần mô cây ký chủ nằm phía dưới mặt đất, do đó việc phòng trị bệnh thường tốn kém nhưng không mang lại hiệu quả cao. Vì vậy, cần phải kết hợp nhiều biện pháp phòng trị để mang lại hiệu quả kịp thời (Phạm Văn Kim và ctv, 2000). 12
25. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1. Biện pháp canh tác 1.4.1.1. Làm đất Đất là nơi lưu tồn của nhiều mầm bệnh khác nhau. Do đó, đất trở thành nguồn dự trữ, tích lũy và lây lan bệnh. Khi cày bừa đất, chúng ta đã làm thay đổi lý tính, cấu trúc, ẩm độ và nhiệt độ của đất từ đó làm thay đổi điều kiện sống và phát triển của mầm bệnh trong đất. Khi cày đất, chúng ta vùi mầm bệnh xuống sâu dưới đất làm cho chúng chết hoặc khó khăn trong hoạt động gây hại cho cây. Việc cày ải phơi đất trong một thời gian nhất định trong năm có ảnh hưởng khá quan trọng đối với bệnh cây (Phạm Văn Kim và ctv, 2000). Vệ sinh đồng ruộng, chú ý diệt cỏ dại. Trồng với mật độ cây thích hợp cho từng giống và từng mùa vụ, nên trồng thưa vào đầu mùa mưa. 1.4.1.2. Luân canh Luân canh nhằm cắt đứt nguồn thức ăn của một số ký chủ chuyên tính, nhờ đó làm giảm bớt sự nhân một số mầm bệnh. Luân canh còn giúp những cây trồng lạ tiết ra những chất ức chế mầm bệnh của hoa màu trồng trước đó, ngoài ra các chất tiết từ rễ cũng có thể giúp kích thích sự phát triển của các vi sinh vật đối kháng trong đất (Phạm Văn Kim và ctv, 2000). 1.4.1.3. Xen canh Việc trồng cây xen canh dẫn đến giảm mật độ ký chủ trên đơn vị diện tích, giảm bớt sự tiếp xúc của các rễ cây lẫn nhau của cây này với các cây lân cận trên cùng một loại cây. Giảm bớt sự lây lan của mầm bệnh ở rễ và các mầm bệnh trong đất, thường được phân bố không đồng đều và thường dưới dạng lưu tồn, khi chúng chuyển sang dạng hoạt động sẽ gây hại cho cây trồng do sự tiếp xúc với rễ của ký chủ, hoặc do các chất từ rễ ký chủ tiết ra kích thích. Do đó, khi xen canh sẽ làm giảm đáng kể tình trạng kích thích này, mầm bệnh chỉ ở dưới dạng lưu tồn chứ không gây hại (Phạm Văn Kim, 2000). 13
26. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.4. Sử dụng giống kháng Nhiều công trình nghiên cứu về giống kháng đối với bệnh khô vằn ở nhiều nước trên thế giới đã cho thấy chưa có giống lúa nào thể hiện tính kháng bệnh cao. Phản ứng của các giống lúa đều nằm trong phạm vi từ nhiễm nặng tới tương đối chống chịu (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Những giống thấp cây, đẻ nhánh nhiều, lá đứng thường nhiễm bệnh nặng hơn những giống cao cây, đẻ nhánh ít (Ou, 1985). 1.4.2. Biện pháp hoá học Có thể phòng trị bệnh vùng rễ với một số loại thuốc hóa học như: khử đất với thuốc Kitazin 10H (1-2 kg/công). Khi có bệnh mới xuất hiện, có thể xịt một trong các loại sau: Copper B, Kitazin 50ND hoặc Validacin. Tuy nhiên việc xử lý đất thường rất tốn kém và lâu dài sẽ có ảnh hưởng bất lợi đến sự cân bằng sinh thái. 1.4.3. Biện pháp sinh học Trong tự nhiên tồn tại rất nhiều sinh vật đối kháng với nấm Rhizoctonia sp., Phomopsis sp., Fusarium sp.,như nhóm nấm đối kháng: Trichoderma spp., Gliocladium spp., Penicillium spp , nhóm xạ khuẩn: Streptomyces spp , và nhóm vi khuẩn đối kháng Baccillus subtilis,Pseudomonas arguginos, Pseudomonas flluorecens. Nhưng để phòng trừ bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia sp., Phomopsis sp, Fusarium sp., trong đề tài này ta sử dụng nấm đối kháng Trichoderma spp. Phòng trừ sinh học là một biện pháp thay thế biện pháp hóa học trong phòng trừ bệnh cây. Vì biện pháp hóa học gây hậu quả lớn ảnh hưởng đến môi trường Tiềm năng sử dụng vi sinh vật vùng rễ để thay thế hoặc bổ sung vào hóa chất diệt nấm đã được nhiều tác giả đề cập đến. Trong số vi khuẩn đối kháng được nghiên cứu về khả năng áp dụng trong kiểm soát sinh học thì Pseudomonas phát huỳnh quang là một trong những nhóm được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều nghiên cứu ở Ấn Độ sử dụng P. fluorescenes NBRI2650 ức chế một số nấm trong đất nhưFusarium, Rhizoctonia, Pythium gây bệnh trên nhiều loại cây trồng như đậu xanh, dưa chuột, cà chua. 14
27. Đồ án tốt nghiệp 1.4.4. Sử dụng nấm đối kháng ➢ Ở ngoài nước Trong nhiều loại nấm đất có tiềm năng đối kháng, Trichodermaspp., là giống được sử dụng trong phòng trừ sinh học vì chúng là những loài nấm ký sinh hay được gọi là siêu ký sinh tức là nấm ký sinh trên nấm. Nghiên cứu về hiện tượng siêu ký sinh của các loài nấm đối kháng (Manibhushanrao và ctv, 1989), đã quan sát thấy sợi nấm của Trichoderma hình thành một cấu trúc nhỏ móc vào sợi nấm R. solani, sau đó cuộn quanh sợi nấm ký chủ hoặc mọc ra những tơ nấm nhỏ buộc chặt ký chủ. IRRI (1976), đã báo cáo rằng các dòng Trichoderma spp., thu thập trên ruộng lúa thì phổ biến ở lúa rẫy hơn là lúa nước. Với khả năng cạnh tranh cao các tàn dư thực vật trên đồng ruộng, các dòng Trichoderma có thể làm cạn kiệt nguồn thức ăn và do đó ức chế nấm gây bệnh trong đất. Tuy nhiên, các tác dụng ức chế cũng có thể thông qua các hợp chất do nấm đối kháng tiết ra. ➢ Ở Việt Nam: Những nghiên cứu phòng trừ sinh học bệnh lở cổ rễ bắt đầu từ những năm cuối của thập niên 1980. Trong thời gian đầu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc đánh giá trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới tính đối kháng của tập đoàn VSV phân lập được trong tự nhiên, trên cơ sở đó xác định được một số dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia sp., Fusarium sp., Pythium sp., và bệnh Phomopsis sp., những đánh giá về hiệu lực phòng trị bệnh lở cổ rễ của các dòng nấm đối kháng Trichoderma spp. 1.5. Tổng quan về nấm Trichoderma 1.5.1. Đặc điểm của nấm Trichoderma Trichoderma là chi khá phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là trong môi trường đất. Theo Gary J.Samuels(1932), Trichoderma ít tìm thấy trong thực vật sống và chúng không sống nội ký sinh với thực vật. Ngày nay, hệ thống phân loại của nấm 15
28. Đồ án tốt nghiệp Trichoderma vẫn chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến đưa ra khi phân loại nấm này. Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp:Deuteromycetes Bộ: Moniliales Họ: Moniliaceae Giống: Trichoderma spp. TheoAgrios G.N (1997), Hrman G.E (2002), hầu như Trichoderma spp., có giai đoạn sinh sản vô tính (đây là lý do Trichoderma spp. được phân loại thuộc nhóm nấm bất toàn Deuteromycetes, bộ: Moniliales), tuy nhiên một vài loài Trichoderma spp., cũng có khả năng sinh sản hữu tính nên được phân vào lớp nấm Ascomycetes, bộ Hypocreales, giống Hypocrea. 1.5.2. Đặc điểm hình thái (Gary J. Samuels, 2004) Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh, trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trường PGA hóa vàng. Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định. Cuống bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau. Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), có kích thước từ 1 - 7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng như bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động như chồi mầm. Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách 16
29. Đồ án tốt nghiệp ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng (như T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình ellip hoặc hình oval (với tỉ lệ dài : rộng từ 1 – 1,1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài : rộng là hơn 1,4 µm), đa số các bào tử trơn láng. Kích thước không quá 5 µm. Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà T. harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học. 1.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5. Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 – 30 0C. Một vài dòng phát triển tốt ở 350C. Một số ít phát triển được ở 400C (Gary J. Samuels, 2004). Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái sợi nấm và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 350C chúng hình thành bào tử nhỏ, ở 370C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy. Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2 enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được biết (Gary J. Samuels, 2004). Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tượng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loài Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây 17
30. Đồ án tốt nghiệp chính là những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật (Gary E. Harman, 2000). 1.5.4. Nguồn gốc Trichoderma được tìm thấy khắp mọi nơi trừ ở những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác (Gary J. Samuels, 2004). Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Gary E. Harman, 2000). 1.5.5 Một số loài Trichoderma thường gặp ở vùng nhiệt đới 1.5.5.1. Trichoderma pseudokoningii Rifai Nấm T. pseudokoningii phát triển rất nhanh, đường kính tản nấm lên đến 8 – 9 cm chỉ sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 20oC. Sợi nấm trong suốt, vách trơn láng, rộng 1 – 2µm. Bào tử áo có vách dày, trơn láng, trong suốt hoặc có màu xanh, hình cầu méo hoặc bầu dục, kích thước thường là (4-12µm) x (3- 9µm) (Bissett, 1984). 1.5.5.2. Trichoderma atroviride Bissett Nấm T.atroviride phát triển rất nhanh, đạt 8 – 9cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 20oC, sợi nấm trong suốt, vách trơn láng, rộng 2 – 14µm. Bào tử áo có vách dày và trơn láng, màu xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục, đường kính 4 – 12µm, đôi khi lên đến 24µm. 1.5.5.3. Trichoderma hamatum Bain Nhiệt độ 24oC và pH 3,7 – 4,7 là những điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của T. hamatum và chúng phát triển chậm lại ở 0oC (Domsch và Gams, 1980). Đường kính tản nấm ở 5 ngày sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ 20oC là 7cm. Thể bình và nhánh rộng 3 – 4µm. Bào tử đính của nấm T. hamatum có hình trụ ngắn, màu xanh lục, vách trơn láng và có kích thước khác nhau tùy theo chủng (Domsch và Gams, 1980). 18
31. Đồ án tốt nghiệp 1.5.5.4. Trichoderma inhamatum Veerkamp & W. Gams Nhiệt độ tối hảo cho sự phát triển của T. inhamatum là 24 – 30oC và nhiệt độ tối đa mà nấm có thể chịu đựng được là 36oC (Bissett, 1984). Nấm T. inhamatum phát triển khá nhanh, đường kính tản nấm có thể đạt tới 9cm sau 3 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ24 – 30oC. Thể bình có hình bầu nậm, kích thước (4,0 – 5,0 µm) x (2,3 – 3,0µm). Bào tử có dạng hình cầu hoặc hình trứng, vách mỏng và trơn láng, màu xanh lục, kích thước (2,3 – 3,0 µm) x (2,0 – 2,6µm). 1.5.5.5. Trichoderma harzianum Rifai T. harzianum là loài nấm rất phổ biến trong đất (Cook và Baker, 1998). Môi trường có nhiệt độ từ 15 – 35oC, pH 3,7 – 4,7 rất thích hợp cho sự phát triển của nấm (Domsch và Gams, 1980). Nấm T. harzianum phát triển nhanh và có đường kính khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 20oC. Bào tử đính có hình cầu méo đến bầu dục ngắn, màu xanh lục, vách trơn láng, kích thước (2,7 – 3,2 µm) x (2,5 – 2,8µm), nẩy mầm tốt nhất trong môi trường mùn cưa có ẩm độ khoảng 30% (Domsch và Gams, 1980). 1.5.5.6. Trichoderma koningii Ouden T. koningii hiện diện nhiều ở lớp đất mặt nhưng ở độ sâu 120 cm vẫn có sự hiện diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 26oC trở lên tùy theo nguồn gốc của loài. pH cho sự phát triển của nấm là 3,7 – 6,0 (Domsch và Gams, 1980). Tản nấm có đường kính 3 – 5 cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 20oC, bào tử đính có dạng hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3,0 – 4,8 µm) x (1,9 –2,8 µm). 1.5.6. Các cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp. Sự tương tác đối kháng giữa Trichoderma và các loại nấm khác được phân loại như sau: tiết ra các chất kháng nấm bệnh (antibiosis), kí sinh lên cơ thể của nấm bệnh (mycoparasitism), cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh (competition for nutrient). Những cơ chế này không tách biệt nhau, và cơ chế đối kháng thực tế có 19
32. Đồ án tốt nghiệp thể là một trong những loại cơ chế này. Cả cơ chế tạo ra các chất kháng nấm và cơ chế kí sinh có thể liên quan đến sự cạnh tranh dinh dưỡng, thật ra sự sản xuất ra các chất độc được biết có ảnh hưởng đến tình trạng dinh dưỡng của môi trường tăng trưởng. Chứng cớ gần đây chỉ ra rằng các chất kháng sinh và các enzyme thủy phân không chỉ được tạo ra đồng thời mà còn hỗ trợ nhau trong cơ chế đối kháng kí sinh. Cơ chế kí sinh (mycoparasitism) Ký sinh nấm có thể được xem như là sự tấn công trực tiếp của một loài nấm trên loài nấm khác và thông thường được định nghĩa là đối kháng trực tiếp (Dix và Webster,1995) . Theo Chet (1990) cơ chế đối kháng kí sinh gồm 4 giai đoạn: Bước thứ nhất sự tăng trưởng có tính chất hướng hóa (chemotrophic growth), trong giai đoạn này tác nhân kích thích hóa học gây ra bởi chủng nấm mục tiêu đã hấp dẫn chủng nấm đối kháng; Bước thứ hai: sự nhận dạng đặc hiệu (specific recognition), tức chủng nấm đối kháng nhận diện được bề mặt tế bào của nấm bệnh gây bệnh (Barak và ctv, 1985); Bước thứ ba: sự tấn công và xoắn vòng của sợi nấm Trichoderma xung quanh vật chủ tế bào nấm bệnh; Bước thứ tư: sự bài tiết các enzyme phân giải , chúng sẽ phân hủy vách tế bào chất của vật chủ (Chet và ctv, 1998). Hệ enzyme phân giải vách tế bào bao gồm chitinases, glucanase, protease Hình1.1: Sự tác động của Trichoderma spp. lên tác nhân gây bệnh (Pythium) Nguồn: Hubbard và ctv, 1983. Phytopathology 73:655-659 20
33. Đồ án tốt nghiệp Hình1.2: Hệ sợi nấm Trichodermakí sinh trên khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia Kháng sinh (antibiosis) Thuật ngữ kháng sinh chỉ sự sản xuất các chất kháng sinh bởi các loài vi nấm và đặc biệt bao gồm cả giống nấm Trichoderma. Kiểu tương tác này được định nghĩa là sự đối kháng gián tiếp vì ở đây sự đối kháng diễn ra mà không yêu cầu sự tiếp xúc với sợi nấm bệnh (Dix và Webster, 1995). Người ta đã chứng minh rằng Trichoderma có khả năng sản xuất lượng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau có đặc tính ức chế nấm và vi khuẩn. Cơ chế kháng sinh thường diễn ra phối hợp với ký sinh nấm (Schirmblock và ctv, 1994), tức những enzyme thủy phân giúp cho các chất kháng sinh xâm nhập được vào tế bào chủ. Các chất kháng sinh có thể ức chế sự thành lập vách tế bào, do đó làm gia tăng sự hoạt động của những enzyme thủy phân (Lorito và ctv, 1996). Các chất kháng sinh cũng có thể tác động đến nấm mục tiêu thông qua hàng loạt cơ chế khác nhau như kiềm hãm sự phát triển, sự sản xuất các chất chuyển hóa sơ cấp, sự hấp thu các chất dinh dưỡng và sự hình thành bào tử (Howell,1998). Kháng sinh có đặc trưng cho từng loài và các loài Trichoderma khác nhau có khả năng kiểm soát sinh học không giống nhau trong việc chống lại các mầm bệnh và tiêu diệt chúng. Theo Howell (1987) thấy rằng những chủng T. virens đột biến mất khả năng kí sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm bệnh Rhizoctonia sp.tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng kí sinh không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh 21
34. Đồ án tốt nghiệp kháng sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nó là một trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này có thể ức chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác. Khả năng sinh kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau, chúng gồm: Gliotoxin: chất kháng sinh này được R.Weindling và O. Emerson mô tả năm 1936 do nấm Trichoderma lignorum sinh ra. Gần đây được xác định lại là do nấm T. virens sinh ra. Chất gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium ). Kháng sinh viridin: Đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm Trichoderma tạo thành trong hoạt động của chúng. Chất kháng sinh này được phát hiện năm 1945. Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và có hoạt tính chống nấm cao. Cơ chế enzyme Ngoài cơ chế kí sinh và kháng sinh, một số tác giả nghiên cứu cho thấy rằng các enzyme ngoại bào do Trichoderma sinh ra đóng vai trò quan trọng trong tính kháng nấm bệnh của chúng. Metcalf và Wilson nghiên cứu chủng T.koningii sinh mạnh các enzyme exochitinase và endochitinase. Khi sử dụng chủng này để sử lí những cây hành bị nhiễm nấm Sclerotium cepivorum thấy hiện tượng: hệ sợi T.koningii thâm nhập vào biểu bì và mô vỏ của rễ, hệ sợi nấm bệnh bị phá hủy. Trong một nghiên cứu tương tự, Woo và ctv đã làm rõ vai trò của enzyme tới khả năng kháng nấm bệnh của Trichoderma bằng cách phá vỡ hoạt động của enzyme chitinase của T.haianum. Kết quả cho thấy chủng mất hoạt tính chitinase biểu hiện giảm hoạt động kiểm soát sinh học chống lại Botrytis cinrea gây bệnh trên lá đậu. Trichoderma hazinum sản sinh ra loại protease có khả năng khử hoạt tính enzyme thủy phân nấm Botrysis cinerea gây bệnh trên lá đậu (Kapat và ctv). Những enzyme protease của T.harianum phá vỡ enzyme thủy phân của nấm bệnh do đó làm mất khả năng xâm nhập vào cây của nấm bệnh. 22
35. Đồ án tốt nghiệp Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự tác động hiệp trợ giữa enzyme và kháng sinh cho hiệu quả điều khiển sinh học cao hơn. Pietro và ctv đã nghiên cứu hiệu quả hiệp trợ của enzyme endochitinase và gliotoxin tác động lên sự nảy mầm của nấm bệnh Botrytis cinerea thấy rằng có sự kết hợp của cả hai cơ chế enzyme và kháng sinh sẽ cho hiệu quả phòng trừ cao hơn khi sử dụng cơ chế enzyme hay kháng sinh đơn lẻ. Loritp và ctv đã mở rộng hơn khái niệm hiệp trợ tác động khi kết hợp một hỗn hợp kháng nấm với một số loại enzyme thủy phân và ứng dụng chúng để làm giảm nguồn bệnh. Hiện tượng hiệp trợ hiệu quả thấp khi enzyme được bổ sung sau phức hợp kháng nấm. Điều đó chỉ ra rằng sự phá hủy thành tế bào nhờ enzyme là cần thiết để tăng hiệu quả của phức hợp kháng nấm. Cơ chế cạnh tranh (competition) Không chỉ có cơ chế kí sinh, sự sinh kháng sinh hay tiết enzyme là hiệu quả trong điều khiển sinh học mà cơ chế cạnh tranh cũng được coi là cơ chế có ý nghĩa hết sức quan trọng vì sự thiếu dinh dưỡng là nguyên nhân gây chết phổ biến đối với vi sinh vật. Cơ chế này cũng ứng dụng nhiều và hiệu quả trong kiểm soát sinh học điều khiển các bệnh do nấm. Một cơ chế khá phổ biến đã được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây là sự cạnh tranh của nấm đối kháng với nấm bệnh tại vùng rễ. Nấm Trichoderma có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua cạnh tranh với nguồn gây bệnh cây về dinh dưỡng và nơi cư trú. Nấm Trichoderma thường định cư trước so với các nguồn bệnh cây. Do đó, chúng chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nguồn gây bệnh. Trichoderma có thể ức chế hoặc làm giảm sự phát triển mầm bệnh cây trông thông qua việc cạnh tranh không gian, cơ chất enzyme, chất dinh dưỡng hoặc oxygen (Dix và Webster,1995) Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đưa ra khái niệm cạnh tranh khai thác và cạnh tranh cản trở vào tương tác giữa quần thể nấm. Sự cạnh tranh cản trở liên quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi vi sinh vật này giới hạn vi sinh vật 23
36. Đồ án tốt nghiệp khác tiếp xúc cơ chất và xảy ra do sự tương tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài hoặc khác loài. Sự cạnh tranh khai thác xảy ra giữa 2 loài cùng khai thác một nguồn lợi nhưng khác nhau về tốc độ và hiệu quả khai thác. Trong trường hợp nguồn lợi là nguồn dinh dưỡng được xem như cạnh tranh dinh dưỡng. Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của Trichoderma Ngoài khả năng bảo vệ giúp thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn trong đất, nhiều loài trong chi Trichoderma được bổ sung vào đất còn có khả năng kích thích cơ chế tự bảo vệ thực vật chống lại virus, vi khuẩn, nấm. Trong trường hợp này, các nấm Trichoderma đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với rễ, kích thích hệ rễ miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật. Cơ chế hoạt động của nấm Trichoderma là tiết ra một enzyme làm tan vách tế bào của các loài nấm hại, sau đó tấn công vào bên trong và tiêu diệt chúng bảo vệ cây trồng. Vì thế, khi sử dụng các chế phẩm có chứa nấm Trichoderma còn có tác dụng tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển trong đất, kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân giải chất xơ, chitin, ligin trong các phế thải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho cây trồng hấp thu dễ dàng. 1.6. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma 1.6.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng • Bảo vệ thực vật Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma spp. được quan tâm nhiều nhất, đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số nấm gây bệnh ở thực vật. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại Trichoderma spp. khác nhau để kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác nhau. Kết quả là các loài Trichoderma spp. kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh sau: Rhizoctonia sp.:gây mục rễ, thân và hạt, Sclerotium rolfsii: xơ cứng ở cà chua và khoai tây. 24
37. Đồ án tốt nghiệp Pythium sp.: gây úng thối ở đậu, thuốc lá, cây con, Armillaria mellea: mục rễ ở cây rừng, cao su, thông. Botrytis cinerea: mốc xám gây hỏng dâu và nho. Penicillium diditatum: hỏng trái ở chanh và chuối. Phytophthora sp.: mục rễ, hỏng trái ở ca cao. Chondeostereum purpureum: bạc lá ở đào và mận. Hiện nay các chủng Trichoderma spp. đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học thương mại như: GlioGard – một chế phẩm với thành phần chính là Trichoderma spp. kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh sau: Rhizoctonia sp., Sclerotium rolfsii, Pythium sp., Armillaria mellea, Phytophthora sp, Phomopsis sp., Fusarium sp Ngoài ra, ở New Zealand, người ta còn trộn nhiều chủng Trichoderma khác nhau để kiểm soát bệnh trên cây nho và các cây dạng quả hạch (Esposito, E. and Silva, 1998). Ở Mỹ, người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống để tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trước khi trồng trọt. Trong nước, đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Trichoderma xử lí đất trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm mốc với phân chuồng hoại mục trước khi bón ruộng 5 - 10 ngày, rồi rải trên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp (Trần Thị Thuần và ctv, 1995) • Cải thiện năng suất cây trồng Cũng như thuốc trừ sâu, phân bón hoá học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị thoái hóa, chai sạn; các loại giun đất không phát triển được, làm hạn chế độ xốp đồng thời, độ thông khí cần thiết cho rễ cây cũng thiếu hụt. Vì vậy, các nước có nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng sử dụng các phân bón hữu cơ sinh học thế hệ mới – thực chất là một sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu 25
38. Đồ án tốt nghiệp sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học. Các loại phân bón hữu cơ vi sinh này có các tác dụng sau: Phòng ngừa các nấm gây bệnh thối mốc, bệnh héo rũ, bệnh chết cỏ, bệnh nấm sương mai, bệnh đốm nâu và hạn chế các tác hại nguy hiểm do các nấm gây mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme của các nấm gây bệnh, đồng thời bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng đục phá thân (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Đăng Diệp, 1998) Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo ra hệ rễ cứng cáp hơn. Gần đây, khi khảo sát các loài Trichoderma spp. ở các lớp đất sâu, người ta còn thấy Trichoderma spp. làm tăng số lượng các rễ sâu (các rễ cách mặt đất khoảng 1m). Điều này góp phần giúp cho các cây lương thực như ngô hay các loài dùng để trang trí như cỏ lát có khả năng chống chịu tốt với hạn hán. Một nghiên cứu gần đây còn cho biết nếu ngô có Trichoderma harzianum T-22 kí sinh ở rễ thì cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có T-22. Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa. Đã có nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Trichoderma harzianum và Trichoderma koningii kích thích sự nẩy mầm và tăng trưởng của cây. Đối với các hoa được trồng trong nhà kính, Trichoderma harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng hoa. Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vật nốt sần cố định nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trong đất; bảo toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng Phân giải từ từ cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường dinh dưỡng và kích thích sinh trưởng của cây. Tăng sức đề kháng của cây trồng, một số chủng Trichoderma harzianum còn có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng. Như vậy, các chủng nấm Trichoderma spp. trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế 26
39. Đồ án tốt nghiệp các bệnh gây hại cây trồng và tạo được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên. 1.6.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường Trichoderma harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng. Sự tồn tại của các hợp chất chloroguaiacols, hợp chất AOX (các hợp chất halogen thấm nước) trong chất thải của các nhà máy sản xuất bột giấy ở hồ Bonney, Đông Nam nước Úc và các sản phẩm phân giải của Trichoderma harzianum đã được nhà khoa học Van Leeuwen cùng các cộng sự nghiên cứu. Chất tẩy trắng chlor của các nhà máy sử dụng sulfit hóa bột giấy được tháo ra hồ một cách gián đoạn đã làm xuất hiện các hợp chất chlorophenol trong nước và cặn bẩn. Hợp chất chlorophenol này rất độc. Trichoderma harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất tự do 2,4,6-trichlorophenol; 4,5-dichloroguaiacol và cả AOX trong môi trường có chứa muối khoáng. Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiacol tự do trong môi trường khoáng mặn. Trichoderma harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng trên ciliatin, glycophosphat và amino methylphosphonic acid (3-methoxyphenyl) ( theo Esposito, E. and Silva, 1998) Trichoderma harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật Trường Đại học California) có thể phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachlorophenol. Nấm này phân giải endosulfan trong nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau trong suốt quá trình sống của nó. Trichoderma harzianum CCT - 4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24 giờ, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong đất và trong đầm lầy. Một công trình nghiên cứu khác sử dụng chủng nấm mốc Trichodermareesei RUT-30 để xử lý chất thải sinh hoạt đô thị, hứa hẹn một nguồn sản xuất enzyme cellulase rẻ tiền, đồng thời giảm lượng rác thải. Các enzyme cellulase thu được từ đây được đánh giá là tốt hơn và kinh tế hơn so với enzyme cellulase được lấy từ các nguồn cơ chất cellulose tinh chế (theo Sạnjoy Silva, Bill B.Emore and Houston K. Huckabay, 1995) 27
40. Đồ án tốt nghiệp 1.6.3. Trong các lĩnh vực khác Trichoderma spp. là nguồn sản xuất hiệu quả các hệ enzyme cellulase ngoại bào. Các enzyme này được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp dệt, do chúng có thể làm cho vải bông mềm và trắng hơn (La Grange, 1996) L.Grange và cộng sự đã biểu hiện gen - xylanase (XYN2) của Trichoderma reesei ở Saccharomyces cerevisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm, tăng khả năng tiêu hóa hemicellulose trong lúa mạch và các cây lương thực khác. Tương tự, có rất nhiều gen được tạo dòng từ Trichoderma spp., mở ra một hướng đi mới trong công tác bảo vệ mùa màng, sản xuất các cây lương thực an toàn và gần gũi với thiên nhiên, tạo ra các cây chuyển gen có khả năng chống chịu bệnh tốt. 28
41. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Điều kiện nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu : Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM -Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 7 -Cây trồng nghiên cứu: cây cà tím và cây cà chua -Mẫu bệnh được thu thập dựa trên đặc điểm bệnh lý của cây: rễ bị teo thắt ở phần cổ rễ, thối rễ 2.2. Dụng cụ, thiết bị 2.2.1. Các dụng cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm Buồng cấy nấm Kính hiển vi quang học Cân kỹ thuật Nồi hấp Các dụng cụ nhỏ: bình tam giác, bình định mức, đũa thủy tinh, đĩa petri, que cấy nấm, đèn cồn, khay đựng, bông, dao, kéo, 2.3. Môi trường hóa chất dùng để nuôi cấy và phân lập nấm 2.3.1. Môi trường WA (Water Agar) Thành phần môi trường: -Nước cất : 1000 ml -Agar: 15g - Chất kháng khuẩn chloramphenicol: 0,25 g/ l Phương pháp điều chế: Thạch được hòa tan trong nước đun sôi và hấp thanh trùng trong điều kiện 1210C trong thời gian 20 phút. Môi trường sau khi hấp xong 29
42. Đồ án tốt nghiệp để nguội dần khoảng 600C rồi đổ vào các đĩa petri, đổ một lượng vừa phải, thích hợp.Môi trường này dùng để phân lập nấm ban đầu, ít bị lẫn tạp nhiễm do nghèo dinh dưỡng và để nuôi cấy đơn bào tử. 2.3.2. Môi trường PDA ( Potato D-Glucose agar) Đây là môi trường giàu dinh dưỡng dùng để nuôi cấy làm thuần nấm. Để quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc, đo kích thước sợi nấm, sắc tố tản nấm sinh ra trên môi trường Thành phần môi trường: -D-glucose: 20g -Potato extract: 4g -Agar: 15g -pH= 6 2.4. Vật liệu nghiên cứu 2.4.1. Nấm đối kháng Các chủng nấm Trichoderma đối kháng được lấy từ bộ giống của Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM, bao gồm 8 chủng: B1, B5, B12, B4, TN1, T3, CĐ02, CĐ08.1. 2.4.2. Nấm gây bệnh Các dòng nấm Rhizoctonia sp. được phân lập từ cà chua, nấm Phomopsis sp.và Fusarium sp. được phân lập từ cà tím có dấu hiệu lở cổ rễ, thối rễ được phân lập từ mẫu bệnh. 2.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Phân lập nấm gây bệnh • Nguyên tắc Trong thiên nhiên hoặc trong vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứuvề hình thái, sinh lý, 30
43. Đồ án tốt nghiệp sinh hóa hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần. Tức là tìm cách phân lập, tách riêng từng tế bào vi sinh vật, nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng nhằm thu được các dòng thuần khiết mục tiêu. • Tiến hành Cách lấy mẫu bệnh Mẫu bệnh được thu thập từ rễ có dấu hiệu bệnh lở cổ rễ, thối rễ có dấu hiệu vằn vện màu nâu. Lưu ý chọn các mẫu mới bị bệnh để phân lập nhằm tránh bị các loại nấm hoại sinh tấn công làm cho quá trình phân lập nấm bệnh gặp khó khăn do các loại nấm hoại sinh phát triển rất nhanh trên môi trường phân lập. Mẫu bệnh được cho vào túi giấy đã hấp khử trùng. Mỗi mẫu bệnh được cho riêng vào một túi. Mẫu lấy về, phân lập sớm nhất trong thời gian có thể, hoặc có thể cất vào tủ mát để tránh bị các loại nấm hoại sinh phát triển và lan nhanh. Các bước phân lập nấm bệnh từ mẫu bệnh như sau: Rửa rễ cây cà tím và rễ cây cà chua dưới nước máy để loại bỏ đất và bụi bẩn. Dùng bông có tẩm cồn 700 để khử trùng bề mặt. Đưa mẫu cấy vào tủ cấy để tiến hành phân lập. Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt nhỏ mẫu bệnh, kích thước 1-2 mm, từ phần ranh giới giữa mô không có dấu hiệu bệnh và mô bệnh còn mới, khử trùng bằng cồn 70o trong 30 giây, tiếp tục rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần, thấm khô bề mặt mẫu bệnh bằng giấy thấm thanh trùng, đặt mẫu bệnh vào đĩa petri chứa môi trường WA, ủ ở nhiệt độ khoảng 25oC. Sau 48 giờ, quan sát khuẩn ty nấm phát triển và cấy truyền sang môi trường PDA trong đĩa petri, lưu trữ các ống nghiệm ở nhiệt độ 40C cho các thí nghiệm tiếp theo. Phương pháp cấy truyền từ các đĩa phân lập Cấy truyền là bước trung gian giữa phân lập từ mẫu bệnh và làm thuần vi sinh vật gây bệnh. Giai đoạn này giúp xác định vi sinh vật nào đã phân lập. 31
44. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1: Phân lập nấm bệnh từ một mẫu bệnh cây (Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam) Sau khi cấy truyền các mẫu nấm có trong mẫu cấy ban đầu, tiến hành làm thuần các mẫu nấm từ các mẫu nấm cấy truyền bằng cách cấy đỉnh sợi nấm sang môi trường dinh dưỡng như môi trường PDA. Dùng que cấy dẹp đã khử trùng, lấy một miếng thạch nhỏ chứa phần đỉnh của sợi nấm cấy sang môi trường PDA. Cách chọn đỉnh đầu sợi nấm để làm thuần được tiến hành như hình 2.2 Hình 2.2: Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm để làm thuần(Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam) 2.5.2. Quan sát hình thái bằng phương pháp phòng ẩm - Chuẩn bị các đĩa petri có đặt bông gòn thấm, giấy lọc, lame và lamelle đã được hấp khử trùng lên đĩa petri. 32
45. Đồ án tốt nghiệp - Đổ nước cất vô trùng lên giấy lọc để tạo độ ẩm. - Dùng dao mổ vô trùng cắt một miếng thạch hình vuông khoảng 6mm từ đĩa thạch PDA cho lên lame. - Dùng que cấy lấy một ít sinh khối nấm mốc cấy lên miếng thạch, cấy lên cả mặt trên và mặt dưới của miếng thạch - Dùng que gắp, gắp lame đậy lên bề mặt khối thạch. - Đậy nắp đĩa petri lại và để ở nhiệt độ phòng - Sau 48h, tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm lactophenol và quan sát tế bào dưới kính hiển vi quang học. 2.5.3. Bảo quản Các chủng nấm thuần sau khi được chọn lọc sơ bộ được tiến hành bảo quản trong môi trường PDA ống thạch nghiêng và được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2003). Bên cạnh đó, các chủng nấm thuần còn được bảo quản lạnh sâu trong glycerol 20% ở - 800C. 2.6. Phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch Tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng phương pháp đưa mầm bệnh trực tiếp vào trong đất. Sinh khối nấm được nhân trên giá thể tự nhiên như vỏ trấu hay hạt lúa từ 2 - 3 tuần. Sau đó trộn vào đất theo tỉ lệ thích hợp 1g nấm bệnh / chậu 500g đất. Tỉ lệ gieo hạt là 10 hạt / chậu.Tiến hành quan sát, kiểm tra sự nảy mầm của hạt so với mẫu đối chứng. Sau 15 ngày tiến hành kiểm tra và so sánh các triệu chứng của cây được lây bệnh với cây đối chứng. Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng đã quan sát được trên đồng ruộng. Phương pháp tính toán và xử lí: TLB = x 100 33
46. Đồ án tốt nghiệp Trong đó: A là số cây bị bệnh nhiễm lở cổ rễ B là Tổng số cây điều tra 2.7. Định danh các chủng nấm tuyển chọn được bằng sinh học phân tử dựa vào vùng trình tự bảo tồn ITS a. Ly trích DNA • Thu sinh khối: Tiến hành thu sinh khối nấm sau 2 ngày nuôi cấy lắc trên môi trường PDB lỏng. Sinh khối được nghiền mịn bằng nitơ lỏng và cho vào eppendorf khoảng 2 ml • Ly trích DNA tổng số: Bước 1: Cho 600 µl dung dịch ly giải tế bào (lysis buffer) vào mỗi eppendorf, vortex mẫu để trộn đều sinh khối nấm với dịch ly giải tế bào, làm sinh khối nấm không bị vón cục, tạo huyền phù sinh khối nấm vào dịch ly giải, từ đó giúp cho việc phá vỡ tế bào nấm tốt hơn. Sau đó, ủ ở 650 C trong 1 giờ, cứ cách 20 phút lắc 1 lần trong quá trình ủ. Bước 2: Lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhiệt, thêm tiếp 450µl phenol:chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1) vào eppendorf mẫu, lắc nhẹ nhàng cho đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng Bước 3: Ly tâm với tốc độ 13000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ 4oC, hút thu khoảng 300 - 400 µl dịch nổi Bước 4: Thêm 180 -240 µl isopropanol lạnh vào dịch mẫu (đảm bảo thể tích isopropanol gấp 0,6 lần thể tích dịch nổi) và ủ ở -200C trong 20 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 13000 vòng trong 7 phút ở nhiệt độ 40C Bước 5: Hút bỏ dịch nổi để thu tủa ở đáy eppendorf Bước 6: Rửa tủa 2 đến 3 lần bằng ethanol 70% Bước 7: Phơi khô mẫu sau đó bảo quản trong 50 µl dung dịch TE 0,5X và trữ lạnh ở -800C 34
47. Đồ án tốt nghiệp Sau bước tách chiết DNA tiến hành điện di để kiểm DNA tổng số, chủ yếu là để biết được bước tách chiết có thành công hay không, chắc chắn có DNA để thực hiện các bước tiếp theo. b. Kiểm tra kết quả ly trích DNA và pha loãng DNA Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1% (w/v) : Cân 1g agarose cho vào bình đã có chứa 100 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong lò viba ở 650W trong 2 phút. Để nhiệt độ trong chai giảm xuống dần (còn khoảng 600C), đổ vào khuôn có gắn lược với số giếng mong muốn. Chờ gel đông (khoảng 30 phút), lấy lược ra cho gel vào buồng điện di và bắt đầu tiến hành nạp mẫu. Bước 2: Nạp mẫu, xác định các thông số điện di và đọc kết quả: Đối với DNA tổng số: dùng micropipette hút lấy 4μl mẫu, trộn đều với 2 μl loading dye, hút tổng lượng thể tích là 6μl bơm vào giếng tương ứng đã bố trí sẵn. Lần lượt bơm các mẫu khác đã được trộn đều với thuốc nhuộm vào tất cả các giếng còn lại. Tiến hành điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế là 100V, cường độ dòng điện 250A trong khoảng 20 - 30 phút. Kết thúc quá trình điện di, bảng gel được chuyển vào thuốc nhuộm ethidium bromide (1%) trong khoảng 15 - 20 phút, rửa sạch gel và đọc kết quả bằng phần mềm Quality One của máy Gel doc 2000 (Biorad). Kết quả điện di thể hiện qua chương trình của máy đọc gel ta có thể dự đoán được độ pha loãng cần thực hiện đối với từng mẫu DNA tổng số để xác định nồng độ dung dịch DNA thích hợp cho phản ứng PCR . Đối với sản phẩm PCR: kiểm tra kết quả phản ứng PCR và lượng DNA được khuyết đại lên trong phản ứng cũng thông qua quá trình nạp mẫu lượng mẫu cần lấy 4 μl, điện di trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế là 100V khoảng 30 phút, nhuộm gel trong ethidium bromide (1%) và đọc kết quả trên máy chụp hình gel doc bằng chương trình Quality One. Band xuất hiện trên miếng gel cho ta kết quả dương tính, chỉ một band duy nhất cho kết quả kiểm tra sản phẩm DNA trong phản ứng PCR. 35
48. Đồ án tốt nghiệp c. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA Sử dụng hai primer ITS4 và ITS5 (White và ctv, 1990) để khuyếch đại vùng ITS - rDNA của nấm bệnh có kích thước khoảng 700 bp. Trình tự hai primer ITS4: 5' TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3' ITS5: 5' GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G 3' Thành phần một phản ứng PCR thể tích 25 µl Thành phần Hàm lượng (µl) 10X buffer 2,5 MgCl2 1,5 dNTP 0,5 Taq polymerase 0,25 Primer ITS4 0,5 Primer ITS5 0,5 DNA mẫu 1 Nước cất 18,25 Tổng thể tích phản ứng 25 Chu trình nhiệt phản ứng PCR Các bước phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động 940 C 5 phút Chạy chu kỳ ( 35 chu kỳ) Tách DNA khuôn ( biến 940 C 30 phút tính) 560 C 45 giây Ủ bắt cặp 720 C 2 phút Kéo dài 720 C 10 phút Giai đoạn kết thúc 40 C ∞ 36
49. Đồ án tốt nghiệp Sau khi phản ứng PCR kết thúc, tiến hành điện di trên gel agarose 1,2 % thời gian 30 phút. Sau đó ta nhuộm gel và chụp hình nhuộm bằng máy geldoc. d. Giải trình tự DNA, xác định loài Mẫu được gửi giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) để xác định loài 2.8. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với các loài nấm bệnh gây lở cổ rễ trên đĩa petri 8 dòng nấm Trichoderma spp.: B1, B4, B5, B12,TN1, T3, CĐ02, CĐ08.1 được đánh giá tính đối kháng đối với sự phát triển của nấm bệnh gây hại trên cây cà chua, cà tím trên môi trường dinh dưỡng PDA, trong điều kiện phòng thí nghiệm. Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5mm, vô trùng, khoan lấy một phần thạch ở rìa khuẩn lạc nấm bệnh và đặt vào đĩa petri có chứa môi trường PDA sao cho điểm thạch cách mép petri 1,5 cm. Tiếp theo, lấy khuẩn lạc Trichoderma spp., theo cách tương tự và đặt vào đĩa petri đã chứa nấm bệnh ở trên. Điểm đặt khoan thạch Trichoderma cũng cách mép đĩa 1,5 cm nhưng ở phía đối diện với nấm bệnh. Đĩa đối chứng khoan thạch nấm bệnh có cùng kích cỡ 5mm, được đặt giống như trên trong các đĩa petri cùng loại chứa môi trường PDA đã khử trùng. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 8 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. Chỉ tiêu theo dõi: - Phần trăm ức chế sự phát triển hệ sợi nấm (percent inhibition of mycelia growth_PIMG): sau 3 ngày nuôi cấy đối kháng trực tiếp, đánh giá mức độ đối kháng bằng cách đo đường kính của khuẩn lạc nấm bệnh trong đĩa petri theo phương khuẩn lạc nấm bệnh (R2) và đường kính của khuẩn lạc nấm bệnh trong đĩa đối chứng(R1) như hình 2.3.Các số liệu được tính toán theo công thức: PIMG= (R1-R2)/R1x100, hoặc mức độ đối kháng với nấm gây bệnh được phân thành 4 cấp và đánh giá mức độ đối kháng (Nguyễn Thị Thuần và ctv,1996; Trần Kim Long và ctv,2009). Tóm tắt như sau: 37
50. Đồ án tốt nghiệp • Đối kháng cao (+++): Bào tử Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh, hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bị ức chế và tàn lụi dần, hiệu quả ức chế nấm bệnh ≥ 60% • Đối kháng trung bình (++): Hiệu quả ức chế nấm bệnh ≥ 40-59% • Đối kháng yếu (+): Hiệu quả ức chế nấm bệnh≤ 40-20% • Không đối kháng (-): Hiệu quả ức chế nấm bệnh≤ 19% -Số ngày đối kháng lại hoàn toàn nấm bệnh của Trichoderma:sau khi đo và tính phần trăm ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm sau 3 ngày, việc theo dõi vẫn tiếp tục ghi nhận thời gian Trichoderma đối kháng lại hoàn toàn nấm bệnh thực vật. Thời gian mọc che kín khuẩn lạc nấm bệnh được ghi nhận cho từng chủng Trichoderma kể cả những chủng mọc che kín sớm nhất và muộn nhất. Tuy nhiên thời gian tối đa cho thí nghiệm là 14 ngày. Hình 2.3: Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp nấm bệnh - Trichoderma spp. R1/ R2: Sự phát triển hệ sợi nấm bệnh và T: Trichoderma spp. 2.9. Phương pháp xử lí số liệu Sử dụng phần mềm Exel vẽ đồ thị biểu diễn Tất cả các số liệu được phân tích thống kê ANOVA và so sánh phép thử DUCAN ở mức ý nghĩa 5% bằng phần mềm Statgraphic 7.0 38
51. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lậpvà tuyển chọn chủng nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau Từ những đĩa petri được cấy mẫu ra, sau 2- 3 ngày các sợi nấm đã mọc trên bề mặt môi trường. Tiến hành quan sát, chọn lọc và làm thuần các nấm nghi ngờ là mẫu nhóm nấm gây bệnh lở cổ rễ dựa vào việc quan sát hình thái đặc trưng ban đầu của hệ sợi nấm Kết quả cho thấy, từ những mẫu bệnh ban đầu, dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc tản nấm, thời gian mọc, cách mọc đã thu được các chủng nấm nghi ngờ gây bệnh lở cổ rễ 3.1.1. Chủng nấm 1 Hình3.1: Hình thái đại thể chủng nấm 1 Sợi nấm khi mới mọc có màu trắng, sau đó có màu vàng nhạt đến vàng nâu khi già. Mặt dưới tản nấm có màu nâu đến nâu đỏ Hình3.2: Hình thái vi thể chủng nấm 1 dưới kính hiển vi quang học 40X 39
52. Đồ án tốt nghiệp Hệ sợi nấm bao gồm các sợi nấm phân nhánh với góc 90o với sự thắt lại ở phần nhánh và phân thành các tế bào riêng biệt có vách ngăn chứa đựng các lỗ . Theo nghiên cứu của Menzies (1970) về bệnh lở cổ rễ, tác nhân gây bệnh này là do nấm Rhizoctonia sp. gây ra. Sợi nấm khi còn non không màu, khi trưởng thành có màu nâu vàng nhạt. Hệ sợi nấm bao gồm các sợi nấm phân nhánh với góc 90o với sự thắt lại ở phần nhánh và phân thành các tế bào riêng biệt có vách ngăn chứa đựng các lỗ. Qua việc so sánh đặc điểm đại thể và vi thể của chủng nấm 1 với kết quả nghiên cứu của Menzies (1970). Sinh viên phân lập được nấm có những đặc trưng giống với mô tả của Menzies (1970). Vì vậy, sinh viên nghi ngờ là nấm Rhizoctonia sp. 3.1.2. Chủng nấm 2 Hình 3.3: Hìnhthái đại thể chủng nấm 2 Phomopsis có màu trắng, sợi tơ mảnh, mọc nổi lên trên mặt thạch.Tạo vòng tròn đồng tâm. Hình 3.4: Hình thái vi thể chủng nấm 2 dưới kính hiển vi quang học 40X 40
53. Đồ án tốt nghiệp Theo nghiên cứu của Gratz (1942) về bệnh lở cổ rễ, nấm Phomopsis sp. là tác nhân gây bệnh lở cổ rễ đặc trưng trên cây cà tím. Nấm Phomopsis có hệ sợi nấm phát triển nhanh, có màu trắng và chuyển sang màu xám trên môi trường PDA. Bào tử hình α và β trong suốt như pha lê. Qua việc so sánh đặc điểm đại thể và vi thể của chủng nấm 2 với kết quả nghiên cứu của Gratz (1942). Sinh viên phân lập được nấm có những đặc điểm giống với mô tả của Gratz (1942). Sinh viên nghi ngờ đây chính là nấm Phomopsis sp. 3.1.3. Chủng nấm 3 Từ những đĩa petri được cấy mẫu, sau 2 - 3 ngày, các sợi nấm đã mọc trên bề mặt môi trường. Tiến hành quan sát, chọn lọc và làm thuần các sợi nấm nghi ngờ, dựa vào việc quan sát hình thái đặc trưng ban đầu của hệ sợi nấm. Hình 3.5: Hình thái đại thể chủng nấm 3 Các tản nấm có màu trắng tới màu kem. Sợi nấm tơi mỏng, không xốp, thường không màu, chuyển màu nâu khi già Hình 3.6: Hình thái vi thể chủng nấm 3 dưới kính hiển vi quang học 40X 41
54. Đồ án tốt nghiệp Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn từ 2 - 3 vách ngăn, bào tử hình elip, thon hai đầu, bào tử có hình lưỡi liềm. Theo nghiên cứu của Agrios (1997) về bệnh lở cổ rễ, nấm Fusarium sp. tấn công chủ yếu vào bộ rễ và gây bệnh lở cổ rễ cho cây trồng, đặc biệt là giai đoạn cây con. Mặt trên tản nấm Fusarium sp.có màu trắng kem, vàng hoặc vàng cam. Mặt dưới có thể không màu, vàng cam hoặc màu nâu. Bào tử có vách ngăn từ 1-3 ngăn, hình elip, hình cầu hoặc hình trứng. Qua việc so sánh đặc điểm đại thể và vi thể của chủng nấm 3 với kết quả nghiên cứu của Agrios (1997)., chủng nấm 3 có những đặc trưng giống mô tả của Agrios (1997). Vì vậy, sinh viên nghi ngờ đây chính là nấm Fusarium sp. 3.2. Lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch Qua quá trình phân lập, kết quả phân lập được 3 chủng nấm gây bệnh lở cổ rễ. Để xác định 3 loại tác nhân gây bệnh lở cổ rễ trên cây cà tím và cà chua. Sinh viên đã tiến hành nhiễm lại các nấm phân lập được trên cây cà tím. Thí nghiệm được thực hiện trong nhà lưới với 1 chủng Phomopsis (P),1 chủng Fusarium (F) trên cây cà tím. Tổng số nghiệm thức là 4, trong đó: - P: 1 nghiệm thức. - F: 1 nghiệm thức. - PF: 1 nghiệm thức . - Đối chứng: 1 nghiệm thức. Thí nghiệm được thực hiện 5 lần lặp lại, mẫu nấm được bổ sung vào đất ngay từ ban đầu theo tỉ lệ 1g nấm bệnh/ 500 g đất. Tỉ lệ gieo hạt là 10 hạt / chậu. Kết quả cho thấy, số hạt nảy mầm trong các nghiệm thức có bổ sung các nấm bệnh Phomopsis và Fusarium thấp hơn so với mẫu đối chứng, tương ứng thấp nhất là nghiệm thức có sự kết hợp của PF (58%).Theo một số nghiên cứu của Franklin Laemmlen (2001) hay Kenneth W. Seebold và ctv (2012), các nấm gây bệnh lở cổ 42
55. Đồ án tốt nghiệp rễ có tác động đến sự nảy mầm của hạt giống, làm cho hạt giống trở nên mềm, thối và không nảy mầm được. Tuy nhiên, theo như kết quả khảo sát,ở nghiệm thức đối chứng, tỷ lệ nảy mầm của hạt cà tím chỉ đạt 86%, vì vậy chưa thể đưa ra kết luận chính xác về ảnh hưởng của nấm bệnh đối với tỷ lệ nảy mầm của hạt trong thí nghiệm này. Tỷ lệ phần trăm % 100 80 60 40 20 0 P F PF ĐC Thí nghi ệm Đồ thị 3.1: Tỷ lệ hạt nảy mầm/tổng số hạt gieo Sau 15 ngày, kiểm tra dấu hiệu bệnh trên các cây con cho thấy: - Các mẫu chứa F có dấu hiệu héo rũ, cây phát triển kém. Hình 3.7: Mẫu cây trồng trong đất có bổ sung F. 43
56. Đồ án tốt nghiệp - Các mẫu P phần cổ rễ có dấu hiệu teo thắt, bộ rễ không phát triển, một số cây có bộ rễ bị hư hại hoàn toàn, cây phát triển kém, còi cọc. Hình 3.8: Mẫu cây trồng trong đất có bổ sung P. Trong số các cây sống, số cây nhiễm bệnh trong các nghiệm thức có bổ sung Phomopsis (P), Fusarium (F) chiếm trên 85 %. Trong đó, tỷ lệ cây con bị nhiễm bệnh thấp nhất là ở nghiệm thức có chứa PF (68,4%) và cao nhất là nghiệm thức có chứa F (95%) Ở nghiệm thức đối chứng, 100% các cây không có dấu hiệu bệnh. Điều này chứng tỏ các kết quả ghi nhận có mức độ tin cậy cao. Tỷ lệ phần trăm % 100 80 60 40 20 0 P F PF ĐC Thí nghiệm Đồ thị3.2: Tỷ lệ cây con bị nhiễm bệnh 44
57. Đồ án tốt nghiệp Từ những kết quả trên, sinh viên tiến hành lấy những mẫu cây bị héo rũ và hư hại rễ đem phân lập lại để so sánh và đã thu nhận được các mẫu nấm bệnh giống với mẫu nấm ban đầu. 3.3. Định danh bằng sinh học phân tử mẫu nấm gây bệnh Tiến hành định danh bằng kĩ thuật sinh học phân tử chủng nấm gây bệnh lở cổ rễ P, F, R. Các chủng nấm được nuôi cấy thu sinh khối trên môi trường PDB lỏng trong 2 – 3 ngày được tiến hành trích ly DNA tổng số và tiến hành khuếch đại vùng trình tự ITS bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR của mẫu P, F, R được thể hiện qua hình: R F P 500 bp 500 bp Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu F, P, R Hình 3.9 cho thấy kết quả điện di sản phẩm PCR của chủng F, P và R chỉ cho 1 vạch duy nhất với kích thước khoảng 700bp đúng với lý thuyết. Điều này chứng tỏvùng trình tự bảo tồn ITS1 – 5,8S – ITS2 của các chủng nấm F, P và Rđã khuếch đại thành công. Các sản phẩm khuếch đại thành công được gửi giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự của F, P và R thu được các peak đẹp, rõ ràng. Sau khi xử lý bằng Bioedit kết quả được blast lên NCBI để so sánh các mẫu F, Pvà R với trình tự DNA các chủng nấm trên ngân hàng gen thu được kết quả cho thấy F là 45
58. Đồ án tốt nghiệp Fusarium solani, P là Phomopsis vexans và R là Rhizoctonia solani mức độ tương đồng là 99%. Kết quả định danh nấm bệnh bằng công nghệ sinh học phân tử (phụ lục B) xác định được 3 chủng nấm gây bệnh lở cổ rễ. -Rhizoctonia solani Kết quả giải trình tự gen: (Phụ lục 1) - Phomopsis vexan Kết quả giải trình tự gen Phomopsis vexan (Phụ lục 2) 46
59. Đồ án tốt nghiệp - Fusarium solani Kết quả giải trình tự gen Fusarium solani (Phụ lục 3) 47
60. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Các dòng nấm Trichoderma dùng nuôi cấy đối kháng Các chủng nấm Trichoderma đối kháng được lấy từ bộ giống của Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. HCM, bao gồm 8 chủng: B1, B4, B5, B12, T3, TN1, CĐ02, CĐ08.1 có những đặc điểm: - Chủng B1 (Trichoderma asperellum): Sợi tơ dạng bông mịn, dày, đan xen vào nhau, màu trắng sữa. Sau 3 ngày nuôi cấy đạt khoảng 57 mm. Bào tử hiện rõ sau 3 ngày nuôi cấy. Hình3.10: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng B1 - Chủng B4 (Trichoderma virens): Tản nấm gồm các sợi tơ dạng bông mảnh, đan xen vào nhau, màu trắng đục. Đường kính tản nấm sau 3 ngày nuôi cấy đạt khoảng 62 mm. Bào tử màu lục, dày ở viền đĩa. Hình3.11: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng B4 - Chủng B5 (Trichoderma asperellum):: Tản nấm gồm các sợi tơ mảnh, mọc nổi lên trên mặt thạch. Các sợi tơ mọc theo dạng tia, hướng ra ngoài. Đường kính tản nấm sau 3 ngày nuôi cấy đạt khoảng 67 mm. Bào tử xuất hiện sau 3 ngày nuôi cấy, màu lục đan xen trong lớp tơ dày. 48
61. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng B5 - Chủng B12 (Trichoderma virens): Tản nấm gồm các sợi tơ mảnh, mọc đan xen vào nhau, màu trắng sữa nhạt, rìa có những sợi tơ trong suốt, mọc sát mặt thạch. Đường kính tản nấm sau 3 ngày đạt 66 mm. Hình 3.13: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng B12 - Chủng T3 (Chưa xác định): Tản nấm gồm các sợi tơ mảnh mọc sát mặt thạch theo dạng tia hướng ra ngoài. Tạo vòng tròn đồng tâm. Bào tử có màu xanh đậm Hình 3.14: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng T3 - Chủng TN1 (Trichoderma asperellum): Đường kính tản nấm sau 3 ngày nuôi cấy đạt 80 mm. Bào tử xuất hiện rõ sau 3 ngày nuôi cấy, tạo vòng tròn đồng tâm, màu xanh rêu đậm. 49
62. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.15: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng TN1 - Chủng CĐ02 (Chưa xác định): Tản nấm gồm các sợi tơ như bông gòn, mọc nổi lên trên mặt thạch, tạo vòng tròn đồng tâm. Bào tử có màu xanh đậm Hình 3.16: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng CĐ02 - Chủng CĐ08.1 (Chưa xác định): Tản nấm gồm các sợi tơ mỏng mọc đan xen vào nhau. Bào tử xuất hiện có màu xanh rêu đậm. Hình 3.17: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng CĐ08.1 50
63. Đồ án tốt nghiệp 3.5. Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp. với các chủng nấm bệnh trên đĩa petri 3.5.1. Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp. với chủng nấm bệnh Rhizoctonia solani trên đĩa petri Các chủng nấm Trichoderma đối kháng được lấy từ bộ giống của Trung tâm Công nghệ sinh học Tp.HCM, bao gồm 8 chủng: B1, B4, B5, B12, T3, TN1, CĐ02, CĐ08.1. Nấm Trichoderma và nấm bệnh được cấy cùng lúc trên đĩa petri môi trường PDA. Thí nghiệm đánh giá đối kháng trực tiếp đối với nấm bệnh Rhizoctonia solani., được lặp lại 3 lần, tiến hành quan sát và đo đường kính tản nấm bệnh theo thời gian 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày Đánh giá mức độ đối kháng (Nguyễn Thị Thuần và ctv,1996; Trần Kim Long và ctv,2009). Tóm tắt như sau: + Đối kháng cao (+++): Bào tử Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh, hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bị ức chế và tàn lụi dần, hiệu quả ức chế nấm bệnh ≥ 60% + Đối kháng trung bình (++): Tương tự (+++),hiệu quả ức chế nấm bệnh ≥ 40-59% + Đối kháng yếu (+):Tương tự (+++),hiệu quả ức chế nấm bệnh≤ 40-20% + Không đối kháng (-):Hiệu quả ức chế nấm bệnh≤ 19% 51
64. Đồ án tốt nghiệp Chủng Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 ĐC B1 - ++ +++ +++ B4 - ++ +++ +++ 52
65. Đồ án tốt nghiệp B5 +++ +++ +++ + B12 - ++ +++ +++ T3 - ++ +++ +++ 53
66. Đồ án tốt nghiệp TN1 - ++ +++ +++ CĐ02 - ++ +++ +++ CĐ08.1 - ++ +++ +++ Hình 3.18: Khả năng đối kháng của Trichoderma với Rhizoctonia solani sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày 54
67. Đồ án tốt nghiệp Bảng3.1: Phần trăm ức chế của sự phát triển của hệ sợi nấm Rhizoctonia sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày nuôi cấy đối kháng Chủng Tỉ lệ ức chế tính theo % (PIGM) 3NSC 5NSC 7NSC 9NSC B1 7,00b±3,73 48,91b±3,75 65,15d±1,40 68,33d±0,99 B4 7,06b±3,73 49,66ab±3,75 71,51b±1,40 74,17b±0,99 B5 27,03a±3,73 60,31a±3,75 78,10a±1,40 80a±0,99 B12 9,23b±3,73 50,77ab±3,75 66,50d±1,40 69,59d±0,99 T3 8,67b±3,73 50,57ab±3,75 70,81bc±1,40 73,33bc±0,99 TN1 13,67b±3,73 52,80ab±3,75 72,89b±1,40 75,42b±0,99 CĐ02 4,44b±3,73 47,46b±3,75 64,21d±1,40 67,5d±0,99 CĐ08.1 12,14b±3,73 52,59ab±3,75 67,59cd±1,40 70,42cd±0,99 Ghi chú: Các ký tự giống nhau theo sau các chữ số trong cùng một cột không khác biệt về ý nghĩa ở mức 5% • Quan sát khuẩn lạc sau 3 ngày cấy đối kháng cùng lúc Bảng3.2.Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 3 ngày cấy đối kháng cùng lúc Chủng Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 3 ngày cấy đối Hình cấy đối kháng cùng lúc kháng B1 Tơ nấm Trichoderma phát triển khá mạnh và tiếp xúc với nấm bệnh. B4 Tơ nấm Trichoderma phát triển có dấu hiệu tiếp xúc với nấm bệnh. Bán kính nấm bệnh hầu như ít thay đổi so với lô đối chứng 55
68. Đồ án tốt nghiệp B5 Nấm bệnh có đường kính thấp hơn so với lô đối chứng Tơ nấm Trichoderma phát triển mạnh B12 Tơ nấm Trichoderma phát triển khá mạnh đã tiếp xúc với nấm bệnh T3 Nấm bệnh không thay đổi nhiều so với lô đối chứng Tơ nấm Trichoderma đã tiếp xúc với nấm bệnh TN1 Tơ nấm Trichoderma bắt đầu tiếp xúc với nấm bệnh CĐ02 Tơ nấm Trichoderma phát triển bắt đầu tiếp xúc với nấm bệnh CĐ08.1 Tơ nấm Trichoderma phát triển bắt đầu tiếp xúc với nấm bệnh Sau 3 ngày cấy đối kháng trực tiếp qua hình 3.18, bảng 3.2: Đường kính nấm bệnh Rhizoctonia ở các nghiệm thức có chứa nấm đối kháng Trichoderma sp., thấp hơn nhưng thấp hơn không nhiều so với bán kính của nấm bệnh Rhizoctonia ở lô đối chứng. Sau 3 ngày cấy đối kháng hầu hết các chủng Trichoderma đã bắt đầu tiếp xúc với nấm bệnh và bắt đầu hình thành baò tử màu xanh. Qua bảng 3.1 ta thấy tỉ lệ ức chế sau 3 ngày biến động từ 4,44 -27,03%. Tỉ lệ ức chế ở các chủng khác 56
69. Đồ án tốt nghiệp nhau cũng rất khác nhau. Tỉ lệ ức chế cao nhất là chủng B5 với tỉ lệ ức chế 27,03%. Tuy nhiên tỉ lệ ức chế sau 3 ngày cấy đối kháng không cao. Do giữa nấm bệnh và Trichoderma giữa các chủng chỉ mới bắt đầu tiếp xúc nên vẫn chưa thể hiện rõ tính đối kháng giữa các chủng với nhau. • Quan sát khuẩn lạc sau 5 ngày cấy đối kháng cùng lúc Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 5 ngày cấy đối kháng cùng lúc Chủng Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 5 ngày cấy đối kháng Hình cấy đối cùng lúc kháng B1 Đường kính nấm bệnh nhỏ hơn so với đối chứng (20,33mm so với đĩa đối chứng 53mm), tơ nấm bệnh hầu như không phát triển. Tơ nấm Trichoderma phát triển mạnh ức chế sự phát triển của nấm bệnh B4 Tơ nấm Trichoderma phát triển mạnh, một phần sợi nấm Trichoderma mọc lan ra viền đĩa thạch và quay ngược lại phủ lên bề mặt nấm bệnh. B5 Tơ nấm Trichoderma phát triển rất mạnh, tạo hình tia bao phủ nấm bệnh, ức chế sự phát triển nấm bệnh B12 Tơ nấm Trichoderma phát triển mạnh bao phủ bề mặt thạch (chỗ không có nấm bệnh) Trên bề mặt nấm bệnh tơ Trichoderma phát triển yếu và thưa thớt. T3 Tơ nấm Trichoderma phát triển mạnh, đồng đều, lấn át nấm bệnh 57
70. Đồ án tốt nghiệp TN1 Tơ nấm Trichoderma phát triển lấn át một phần nấm bệnh, ức chế sự phát triển của nấm bệnh CĐ02 Tơ nấm Trichoderma phát triển mạnh, chưa phủ hết bề mặt nấm bệnh, ức chế sự phát triển của nấm bệnh CĐ08.1 Tơ nấm Trichoderma phát triển khá mạnh, bao phủ phần lớn bề mặt nấm bệnh. Đến ngày thứ 4 quan sát được ở phần tiếp xúc giữa nấm bệnh và Trichoderma spp. nấm bệnh không phát triển thêm nữa nhưng lại mọc sang phần thạch mà hệ Trichoderma chưa lan đến. Đến ngày thứ 5 đường kính nấm bệnh không tăng lên nữa, hệ sợi tơ nấm Trichoderma phủ một phần khuẩn lạc nấm bệnh, hệ sợi tơ nấm Trichoderma và nấm bệnh tiếp xúc với nhau. Qua ngày thứ 5 này đã thể hiện sự đối kháng giữa các chủng với nhau. Trong đó giống B5 có khả năng đối kháng mạnh nhất với nấm bệnh thể hiện tỉ lệ ức chế đạt 60,31% cao nhất trong các chủng Trichoderma thí nghiệm, thể hiện qua đường kính nấm bệnh nhỏ nhất và tơ nấm Trichderma B5 phát triển rất mạnh, tạo hình dạng tia tấn công, hệ sợi nấm dày đặc bao quanh và quấn lấy nấm bệnh. Trong khi các chủng khác thể hiện tính đối kháng ở mức độ trung bình. Thấp nhất là ở chủng B1, CĐ02 với tỉ lệ ức chế đạt 47,46% và 48,91%. Tuy nhiên giữa các chủng Trichoderma còn lại không có sự chênh lệch nhiều về tỉ lệ đối kháng giữa các chủng. Trichoderma cũng đã xâm chiếm lên bề mặt của nấm bệnh nhưng sự xâm chiếm nấm bệnh vẫn còn yếu không mạnh bằng chủng B5. 58
71. Đồ án tốt nghiệp • Quan sát sau 7 ngày cấy đối kháng cùng lúc Bảng 3.4. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 7 ngày cấy đối kháng cùng lúc Chủng Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 7 ngày cấy đối Hình cấy đối kháng cùng lúc kháng B1 Nấm Trichoderma mọc lấn qua vùng phát triển của nấm bệnh, bao phủ bề mặt của chúng B4 Nấm Trichoderma mọc lan qua vùng phát triển Nấm Trichoderma phát triển đồng đều có màu xanh đặc trưng và đã phủ lên bề mặt nấm bệnh B5 Nấm Trichoderma phát triển khá mạnh bao phủ toàn bộ đĩa thạch,ức chế không cho nấm bệnh phát triển, đường kính nấm bệnh nhỏ dần. B12 Nấm Trichoderma phát triển khá mạnh, bao phủ toàn bộ nấm bệnh nhưng vẫn nhìn thấy rõ nấm bệnh T3 Nấm Trichoderma phát triển khá mạnh và đồng đều, xâm lấn nấm bệnh và bao phủ nấm bệnh, ức chế sự phát triển của nấm bệnh. TN1 Nấm Trichoderma đã bao phủ bề mặt nấm bệnh, bào tử nấm có màu xanh đậm đặc trưng 59
72. Đồ án tốt nghiệp CĐ02 Nấm Trichoderma mọc lan qua vùng phát triển của nấm bệnh, bao phủ bề mặt nấm bệnh Nấm Trichoderma phát triển rất mạnh và đồng đều có màu xanh đặc trưng CĐ08.1 Nấm Trichoderma phát triển khá mạnh và đồng đều, xâm lấn nấm bệnh và bao phủ nấm bệnh, ức chế sự phát triển của nấm bệnh. Sau 7 ngày cấy đối kháng trực tiếp qua bảng 3.1: 100% các chủng giống Trichoderma có hiệu quả đối kháng với Rhizoctonia solani. Tỉ lệ đối kháng đã tăng lên sau 5 ngày cấy đối kháng. Tuy nhiên sự gia tăng này giữa các chủng khác nhau cũng rất khác nhau về mặt thống kê. Qua hình 3.18 và bảng 3.4 kết quả ghi nhận được là đường kính nấm bệnh đã không gia tăng thêm nữa. Tại thời điểm 7 ngày cấy đối kháng chủng B5 tương tự tại thời điểm 5 ngày cho tỉ lệ đối kháng cao nhất, tỉ lệ ức chế đạt 78,10%, thể hiện qua B5 có đường kính nấm bệnh Rhizoctonia solani thấp hơn so với nấm bệnh của các chủng nấm Trichoderma cấy đối khángvà thấp hơn nhiều so với đĩa đối chứng. Hệ sợi Trichoderma B5 tạo hình dạng tia, tấn công, quấn quanh nấm bệnh, hệ sợi nấm bệnh thưa dần và bị ức chế hoàn toàn. Các chủng còn lại bào tử Trichodrerma cũng đã mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh và ức chế sự phát triển của chúng một cách nhanh chóng, Trichoderma đã xâm lấn qua vùng phát triển của nấm bệnh, bao phủ một phần nấm bệnh và ức chế sự phát triển của nấm bệnh không cho nấm bệnh phát triển lên nữa. Thể hiện tỉ lệ đối kháng thấp nhất ở chủng B11, B12, CĐ02 với tỉ lệ ức chế lần lượt đạt 65,15%; 66,50%; 64,21% mặc dù Trichoderma cũng đã bao phủ một phần nấm bệnh nhưng trên bề mặt vẫn còn nhìn thấy rõ sự hiện diện của nấm bệnh Rhizoctonia solani. 60
73. Đồ án tốt nghiệp • Quan sát khuẩn lạc sau 9 ngày cấy đối kháng cùng lúc Bảng3.5. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 9 ngày cấy đối kháng cùng lúc Chủng Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 9 ngày cấy đối Hình cấy đối kháng cùng lúc kháng B1 Nấm Trichoderma bao phủ một phần nấm bệnh Nấm bệnh phần còn lại vẫn nhìn rõ trên bề mặt thạch B4 Tơ nấm Trichoderma phát triển mạnh, xâm lấn nấm bệnh B5 Nấm Trichoderma phát triển rất mạnh, tạo hình tia, xâm lấn và bao phủ nấm bệnh, đường kính nấm bệnh dần nhỏ theo thời gian B12 Nấm Trichoderma phát triển mạnh, xâm lấn, bao phủ toàn bộ nấm bệnh nhưng vẫn nhìn thấy rõ nấm bệnh T3 Nấm Trichoderma mọc lấn qua vùng phát triển của nấm bệnh, bao phủ bề mặt tơ nấm bệnh. Tơ nấm Trichoderma phát triển rất mạnh và đồng đều TN1 Nấm Trichoderma mọc lấn qua vùng phát triển của nấm bệnh, ức chế sự phát triển của nấm bệnh 61
74. Đồ án tốt nghiệp CĐ02 Tơ nấm Trichoderma mọc lấn qua vùng phát triển của nấm bệnh nhưng chưa bao phủ hết nấm bệnh CĐ08.1 Tơ nấm Trichoderma mọc lan qua vùng phát triển của nấm gây bệnh và bao phủ toàn bộ bề mặt của chúng. Tuy nhiên, tơ nấm phần lấn sang nấm bệnh phát triển chậm hơn phần còn lại Qua những kết quả ở bảng 3.1 ta thấy 100% các chủng giống Trichoderma có hiệu quả đối kháng với nấm bệnh Rhizoctonia. Sau 7 ngày và 9 ngày thể hiện tỉ lệ đối kháng cao. Tùy từng chủng mà thể hiện tính đối kháng khác nhau và tỉ lệ ức chế của các chủng có ý nghĩa về mặt thống kê. Kết quả ghi nhận được là đường kính nấm bệnh không gia tăng ở các nghiệm thức, trên một số nghiệm thức quan sát thấy nấm Trichoderma phát triển bao phủ lên bề mặt nấm bệnh Rhizoctonia trên môi trường dinh dưỡng PDA. Nhìn chung, kết quả đối kháng của các chủng thể hiện qua hình 3.18; bảng 3.1, bảng 3.5 cho thấy một số chủng có khả năng đối kháng mạnh với nấm bệnh Rhizoctonia ngay từ giai đoạn 3 ngày và khả năng đối kháng vẫn duy trì ổn định sau 9 ngày (ví dụ như chủng B5). Ngoài ra cũng có một số chủng tại thời điểm 3 ngày chưa thể hiện khả năng đối kháng hoặc đối kháng chưa cao nhưng tỉ lệ đối kháng đã tăng lên sau 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày (ví dụ như giống T3, TN1, CĐ08.1). Trong đó chủng Trichoderma B5 luôn cho tỉ lệ ức chế nấm bệnh Rhizoctonia cao nhất và ổn định trong suốt thời gian quan sát. Với tỉ lệ ức chế đạt 80%, hệ sợi Trichoderma B5 tạo hình dạng tia tấn công, bao quanh nấm bệnh, đường kính nấm bệnh Rhizoctonia nhỏ hơn so với các đĩa thí nghiệm khác và nhỏ hơn rất nhiều so với đường kính nấm bệnh ở đĩa đối chứng. Hệ sợi Trichoderma B5 ức chế, bao phủ tơ nấm bệnh làm tàn lụi một phần tơ nấm bệnh. 62
75. Đồ án tốt nghiệp Như vậy, tất cả các chủng Trichoderma thí nghiệm đều có khả năng đối kháng và ức chế cũng như tiêu diệt nấm bệnh trong thời gian ngắn. Tuy nhiên tùy từng chủng mà thể hiện tỉ lệ ức chế là khác nhau. Ở đây giống B5 cho tỉ lệ đối kháng là cao nhất trong các chủng và có ý nghĩa về mặt thống kê. 3.5.2 Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp., với chủng nấm bệnh Phomopsis vexan trên đĩa petri Đánh giá mức độ đối kháng (Nguyễn Thị Thuần và ctv, 1996; Trần Kim Long và ctv,2009). Tóm tắt như sau: + Đối kháng cao (+++):Bào tử Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc của nấm bệnh, hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bị ức chế và tàn lụi dần, hiệu quả ức chế nấm bệnh ≥ 60% + Đối kháng trung bình (++): Tương tự (+++),hiệu quả ức chế nấm bệnh ≥ 40-59% + Đối kháng yếu (+): Tương tự (+++), hiệu quả ức chế nấm bệnh ≤ 40-20% + Không đối kháng (-): Hiệu quả ức chế nấm bệnh ≤ 19% 63
76. Đồ án tốt nghiệp Chủng 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày ĐC B1 - ++ +++ +++ B4 ++ +++ +++ +++ 64
77. Đồ án tốt nghiệp B5 + +++ +++ +++ B12 + ++ +++ +++ T3 + ++ +++ +++ 65
78. Đồ án tốt nghiệp TN1 + ++ +++ +++ CĐ02 + ++ +++ +++ CĐ08.1 + ++ +++ +++ Hình 3.19: Khả năng đối kháng của Trichoderma với Phomopsis vexan sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày 66
79. Đồ án tốt nghiệp Bảng3.6: Phần trăm ức chế của sự phát triển của hệ sợi nấm Phomopsis vexan sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày nuôi cấy đối kháng Chủng Tỉ lệ đối kháng tính theo % ( PIGM) 3NSC 5NSC 7NSC 9NSC B1 18,34de±3,72 48,25cd±2,35 62,42d±1,09 66,87d±0,95 B5 37,72ab±3,72 60,31a±2,36 89,26a±1,09 90,5a±0,95 B4 40,37a ±3,72 62,02a±2,36 87,91a±1,09 89,32a±0,95 B12 15,87e±3,72 46,49d±2,36 61,04d±1,09 65,63d±0,95 T3 25,27cde±3,72 52,54bcd±2,36 67,11c±1,09 70,98c±0,95 TN1 29,17bcd±3,72 55,17abc±2,36 66,37c±1,09 70,30c±0,95 CĐ02 34,95abc±3,72 58,55ab±2,36 87,25a±1,09 88,72a±0,95 CĐ08.1 24,42cde±3,72 51,62bcd±2,36 70,49b±1,09 73,98b±0,95 Ghi chú: Các ký tự giống nhau theo sau các chữ số trong cùng một cột không khác biệt về ý nghĩa ở mức 5% • Quan sát sau 3 ngày cấy đối kháng Bảng3.7: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 3 ngày cấy đối kháng cùng lúc Chủng Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 3 ngày cấy đối Hình cấy đối kháng kháng Phomo- B1 Tơ nấm Trichoderma màu trắng phát triển rất mạnh đã lấn qua nấm bệnh Phomo- B4 Đường kính nấm bệnh nhỏ hơn so với đối chứng. Tơ nấm Trichoderma phát triển mạnh và ức chế sự phát triển nấm bệnh 67
80. Đồ án tốt nghiệp Phomo-B5 Tơ nấm Trichoderma có màu trắng phát triển rất mạnh, đã lấn qua nấm bệnh Phomo-B12 Nấm bệnh phát triển chậm hơn so với lô đối chứng Tơ Trichoderma bắt đầu tiếp xúc với nấm bệnh Phomo-T3 Tơ nấm Trichoderma có một phần đã lấn qua nấm bệnh, bào tử có màu xanh rêu đậm. Đường kính nấm bệnh thấp hơn so với đĩa đối chứng nhưng thấp hơn không đáng kể. Phomo- Nấm bệnh có đường kính thấp hơn so với đĩa TN1 đối chứng nhưng thấp hơn không đáng kể. Tơ nấm Trichoderma phát triển mạnh đã lấn qua nấm bệnh. Phomo- Tơ nấm Trichoderma bắt đầu tiếp xúc với nấm CĐ02 bệnh Phomo- Nấm bệnh phát triển chậm hơn so với lô đối CĐ08.1 chứng. Tơ nấm Trichoderma bắt đầu tiếp xúc với nấm bệnh Sau 3 ngày cấy đối kháng trực tiếp qua hình 3.19, và bảng 3.7: Khuẩn lạc nấm bệnh Phomopsis và Trichoderma bắt đầu tiếp xúc với nhau. Đường kính nấm bệnh Phomopsis ở các nghiệm thức có chủng Trichoderma sp. thấp hơn so với bán kính của nấm bệnh Phomopsis ở lô đối chứng. Qua bảng 3.6 tỉ lệ ức chế sau 3 ngày biến động từ 18,34 - 40,37 %. Tỉ lệ ức chế ở các chủng khác nhau cũng rất khác 68
81. Đồ án tốt nghiệp nhau. Tỉ lệ ức chế cao nhất là ở chủng B5 với tỉ lệ ức chế đạt 40,37%. Tuy nhiên, sau 3 ngày cấy đối kháng giữa các chủng nấm chỉ mới chạm nhau nên vẫn chưa có thể đánh giá được khả năng đối kháng giữa các chủng với nhau. • Quan sát sau 5 ngày cấy đối kháng Bảng3.8: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 5 ngày cấy đối kháng cùng lúc Chủng Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 5 ngày cấy đối Hình cấy đối kháng kháng B1 Trichoderma phát triển mạnh và bào tử phát triển dày đặc bao phủ bề mặt nấm bệnh. Tuy nhiên vẫn chưa tiêu diệt toàn bộ tơ nấm bệnh B4 Tơ nấm Trichoderma có màu xanh đậm dần, bao phủ toàn bộ đĩa thạch và lấn át nấm bệnh B5 Tơ nấm Trichoderma lấn át toàn bộ nấm bệnh, bao phủ toàn bộ nấm bệnh B12 -Tơ nấm Trichoderma phát triển lấn lên bề mặt nấm bệnh. -Vẫn còn nhìn thấy rõ khuẩn lạc nấm bệnh T3 Đường kính nấm bệnh không phát triển lên nữa so với lô đối chứng Tơ nấm Trichoderma đã bao phủ toàn bộ nấm bệnh 69
82. Đồ án tốt nghiệp TN1 Tơ nấm Trichoderma mọc bao phủ toàn bộ đĩa thạch. Có dấu hiệu bao phủ bề mạt nấm bệnh và ức chế sự phát triển của nấm bệnh CĐ02 Nấm Trichoderma mọc lấn sang vùng phát triển của nấm bệnh Tơ nấm Trichoderma phát triển đồng đều có màu xanh đặc trưng và đã phủ toàn bộ nấm bệnh CĐ08.1 Vẫn thấy có dấu hiệu sự có mặt của nấm bệnh. Tơ nấm Trichoderma phát triển lấn át nấm bệnh nhưng chưa đồng đều Sau 5 ngày cấy đối kháng trực tiếp qua hình 3.19 và bảng 3.8: nấm bệnh Phomopsis ở lô thí nghiệm phát triển chậm hơn so với thí nghiệm ở lô đối chứng (đường kính tản nấm ở lô thí nghiệm chỉ đạt 14 - 18,67mm so với lô đối chứng 38,67 mm). Qua bảng 3.6 cho ta thấy tỉ lệ đối kháng của các chủng nấm nghiên cứu đã tăng lên so với thời điểm 3 ngày. Tuy nhiên sự gia tăng này cũng không đồng đều giữa các nghiệm thức. Tỉ lệ đối kháng sau 5 ngày biến động từ 46,49 - 62,02 %. Tỉ lệ ức chế cao là các chủng B4, B5 với tỉ lệ ức chế tương ứng là 62,02 %, 60,31% , thể hiện qua tơ nấm Trichoderma phát triển rất mạnh xâm chiếm và bao phủ lấy toàn bộ nấm bệnh với mật độ dày đặc, đường kính tơ nấm bệnh Phomopsis không phát triển lên nữa, hệ sợi nấm bệnh thưa dần. Trong khi đó các chủng còn lại thể hiện tỉ lệ đối kháng với giống này yếu hơn, ức chế ở tỉ lệ trung bình mặt dù tơ nấm Trichoderma cũng đã bao phủ lấy nấm bệnh nhưng vẫn thấy rõ sự hiện diện của nấm bệnh. 70