Đồ án Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả trừ sâu chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus

84 trang thiennha21 13/04/2022 5770

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả trừ sâu chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_san_xuat_va_danh_gia_hieu_qua_tru_sau_chich.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả trừ sâu chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TRỪ SÂU CHÍCH HÚT CỦA NẤM PAECILOMYCES LILACINUS Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện: Nguyễn Ngọc Lâm MSSV: 1411100754 Lớp: 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2018
Đồ án tốt nghiệp ___ LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của chúng em dưới sự hướng dẫn của tiến sĩ Nguyễn Thị Hai Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH của trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kỳ hình thức nào. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực hiện Thái Thiện Ngọc Đức ___ 1
Đồ án tốt nghiệp ___ LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình chúng em đã tạo điều kiện cho chúng em học tập để chúng em có thành quả như ngày hôm nay. Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng em đã được các thầy cô trong Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình thực hiện đồ án. Chúng em xin chân thành cám ơn đến Thầy Cô, nhờ có Thầy Cô đã trang bị kiến thức cho chúng em để có thể thực hiện đồ án này. Chúng em cũng xin cảm ơn Thầy Cô trong phòng thí nghiệm, các bạn cùng khóa và Chị Nguyễn Như Quỳnh, em Đặng Thị Như Quỳnh đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để chúng em hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo chúng em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn các Thầy Cô trong hội đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này. Chúng em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe trân trọng nhất. Trong quá trình làm đồ án, do kinh nghiệm còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong các thầy cô bỏ qua. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực hiện Thái Thiện Ngọc Đức ___ 2
Đồ án tốt nghiệp ___ MỤC LỤC MỤC LỤC 3 DANH MỤC BẢNG 6 DANH MỤC HÌNH ẢNH 7 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 9 LỜI MỞ ĐẦU 10 1. Tính cấp thiết của đề tài: 10 2. Mục đích nghiên cứu: 10 3. Nội dung nghiên cứu: 11 ĐẶT VẤN ĐỀ 12 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 14 1.1. Tổng quan về cây Sắn: 14 1.1.1. Tình hình trồng sắn ở Việt Nam: 14 1.1.2. Tình hình tiêu thụ sắn trong và ngoài nước: 15 1.1.3. Một số giống sắn đang sản xuất phổ biến tại Việt Nam: 17 1.1.4. Những rủi ro trong việc trồng Sắn: 17 1.1.5. Tình hình sâu bệnh hại chính trên cây sắn tại Việt Nam: 18 1.1.5.1. Bệnh chổi rồng trên cây sắn: 18 1.1.5.2. Rệp sáp bột hồng hại sắn: 20 1.1.5.3. Bệnh thối củ sắn: 22 1.1.5.4. Bệnh khảm virus trên Sắn (Cassava mosaic disease): 23 1.2. Tổng quan về Bọ Phấn Trắng: 25 1.2.1. Phân loại khoa học: 25 1.2.2. Đặc điểm sinh thái: 25 1.2.3. Đặc điểm hình thái: 26 1.2.4. Tổng quan về tác hại do bọ phấn trắng gây ra: 27 1.2.5. Tình trạng kháng thuốc trừ sâu ở Bọ phấn trắng Bemisia tabaci: 29 1.3. Tổng quan về nấm Paecilomyces: 31 1.3.1. Phân loại khoa học: 31 1.3.2. Đặc điểm hình thái: 32 1.3.3. Đặc điểm sinh thái: 33 1.3.4. Cơ chế tác động lên côn trùng: 35 1.4. Một số kết quả nghiên cứu nấm Paecilomyces spp trừ sâu hại cây trồng: 36 1.5. Một số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống: 37 1.5.1. Sản xuất enzyme: 37 1.5.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp: 38 ___ 3
Đồ án tốt nghiệp ___ 1.5.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật: 39 1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp: . 39 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu: 42 2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu: 42 2.2.1. Thiết bị - hóa chất: 42 2.2.2. Vật liệu: 43 2.2.3. Các môi trường sử dụng: 43 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 45 2.3.1. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Paecilomyces sp. trên môi trường thạch (Nguyễn Thị Hà, 2012): 45 2.3.2. Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm Paecilomyces sp trên môi trường thạch: 45 2.3.3. Xác định lượng nước bổ sung vào cơ chất trong sản xuất nấm Paecilomyces lilacinus: 46 2.3.4. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ bổ sung vào môi trường gạo tấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus: 46 2.3.5. Ảnh hưởng của nguồn Khoáng bổ sung vào môi trường gạo tấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus: 47 2.3.6. Xác định nhiệt độ sấy phù hợp để tạo chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus: 47 2.3.7. Đánh giá hiệu quả trừ rầy xanh trên cây đậu bắp của chủng nấm Paecilomyces trong điều kiện phòng thí nghiệm: 47 2.3.8. Đánh giá khả năng gây chết Bọ phấn trắng Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài đồng: 48 2.4. Phướng pháp xử lý số liệu: 50 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1. Khả năng sinh tổng hợp enyme của nấm Paecilomyces lilacinus: 51 3.1.1. Khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường thạch. 51 3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp protease của nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường thạch. 52 3.2. Xác định lượng nước bổ sung vào cơ chất trong sản xuất nấm Paecilomyces lilacinus: 53 3.2.1. Xác định độ ẩm cơ chất – Gạo tấm: 53 3.2.2. Xác định lượng nước bổ sung vào cơ chất để nhân sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus: 54 3.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ bổ sung vào môi trường gạo tấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus: 56 3.4. Ảnh hưởng của nguồn Khoáng bổ sung vào môi trường gạo tấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus: 58 ___ 4
Đồ án tốt nghiệp ___ 3.5. Xác định nhiệt độ sấy phù hợp để tạo chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus: 60 3.6. Đánh giá hiệu quả trừ rầy xanh Amrasca devastans trên cây đậu bắp của chủng nấm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm: 62 3.7. Đánh giá khả năng gây chết Bọ phấn trắng Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài đồng: 65 3.7.1. Đánh giá khả năng gây chết Bọ phấn trắng Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm: 65 3.7.2. Đánh giá khả năng gây chết Bọ phấn trắng Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus ở Ngoài đồng: 67 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 4.1. Kết luận: 72 4.2. Đề nghị: 72 TÀI LIỆU LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC 80 ___ 5
Đồ án tốt nghiệp ___ DANH MỤC BẢNG Bảng 3. 1: Đường kính vòng phân giải chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. 51 Bảng 3. 2: . Đường kính vòng phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus. 52 Bảng 3. 3: Kết quả đo độ ẩm cơ chất (Gạo tấm ) bằng tủ sấy. 53 Bảng 3. 4: Sự sinh trưởng của nấm Paecilomyces lilacinus ở các lượng nước bổ sung. 55 Bảng 3. 5: Sự sinh trưởng của nấm Paecilomyces lilacinus ở các nguồn Nito. 57 Bảng 3. 6: Sự sinh trưởng của nấm Paecilomyces lilacinus ở các nguồn Khoáng. 59 Bảng 3. 7: Các mức nhiệt độ sấy của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. 61 Bảng 3. 8: Hiệu lực gây Rầy xanh trong điều kiện phòng thí nghiệm của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacnus. 63 Bảng 3. 9: Hiệu lực gây chết Bọ phấn trong điều kiện phòng thí nghiệm của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacnus. 65 Bảng 3. 10: Tình hình bệnh khảm lá Sắn. 68 Bảng 3. 11: Mật độ bọ phấn (con/cây) trên cây sắn tại các công thức thí nghiệm (Tân Châu, Tây Ninh). 70 Bảng 3. 12: Hiệu lực gây chết bọ phấn trên cây sắn của chế phẩm nấm Paeciloyces lilacinus (Tân Châu, Tây Ninh tháng 4/2018). 71 ___ 6
Đồ án tốt nghiệp ___ DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1. 1: Tình hình sản xuất khoai mì từ năm 1960 – 2010 15 Hình 1. 2: Vòng đời bọ phấn trắng 25 Hình 1. 3: Đại thể nấm Paecilomyces spp 32 Hình 1. 4: Đặc điểm vi thể của nấm Paecilomyces lilacinus 32 Hình 1. 5: Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces farinosus 33 Hình 1. 6: Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces varioti 34 Hình 1. 7: Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus 35 Hình 3. 1: Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus (vòng phân giải chitin của nấm Paecilomyces lilacinus qua 4 ngày sau cấy) 51 Hình 3. 2: Khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus (vòng phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus qua 4 ngày sau cấy) 52 Hình 3. 3: Gạo tấm sấy trong tủ sấy ở 105oC 53 Hình 3. 4: Gạo tấm sấy bằng cân sấy ẩm KERN DBS 53 Hình 3. 5: Môi trường tăng sinh lỏng (Cz). dịch huyền phù bào tử nấm 10ml dịch 54 Hình 3. 6: Sinh khối nấm được nhân sinh khối trên môi trường gạo tấm tương ứng với các lượng nước 40ml, 50ml, 60ml 54 Hình 3. 7: Kết quả cấy trang kiểm tra mật độ bào tử nấm tương ứng với các lượng nước 40ml, 50ml, 60ml 55 Hình 3. 8: Sinh khối nấm được nhân sinh khối trên môi trường gạo tấm với lượng nước bổ sung 50ml và được bổ sung các nguồn Nito khác nhau 56 Hình 3. 9: Kết quả cấy trang kiểm tra mật độ bào tử nấm của các nguồn Nito 57 ___ 7
Đồ án tốt nghiệp ___ Hình 3. 10: Sinh khối nấm được nhân sinh khối trên môi trường gạo tấm với lượng nước bổ sung 50ml và được bổ sung các nguồn Khoáng khác nhau58 Hình 3. 11: Kết quả cấy trang kiểm tra mật độ bào tử nấm của các nguồn Khoáng 59 Hình 3. 12: Chế phẩm nấm sử dụng cân sấy ẩm KERN DBS để đo độ ẩm 60 Hình 3. 13: Kết quả cấy trang kiểm tra mật độ bào tử nấm ở các mức nhiệt độ sấy 61 Hình 3. 14: Rầy xanh trên lá đậu bắp 62 Hình 3. 15: Rầy xanh bị nấm ký sinh và cành bào tử mọc ra từ Rầy xanh bị chết khi nhìn dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x và 100x 63 Hình 3. 16: Bọ phấn trắng chết trên lá sắn 65 Hình 3. 17: Bọ phấn bị nấm ký sinh (a) và cành bào tử (b) mọc ra từ bọ phấn bị chết khi nhìn dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x và 100x 66 Hình 3. 18: Nấm Paecilomyces lilacinus được hoạt hoá từ Bọ phấn trắng 66 Hình 3. 19: Cây Sắn bị khảm lá 67 Hình 3. 20: Ruộng thí nghiệm được bố trí tại Tân Châu, Tây Ninh 67 Hình 3. 21: Sinh viên điều tra bọ phấn và khảm lá sắn tại Tây Ninh 67 Hình 3. 22: Bọ phấn trắng trưởng thành trên lá sắn tại Tân Châu, Tây Ninh (4/2018) 69 Hình 3. 23: Bọ phấn trắng chết trên lá sắn tại Tân Châu, Tây Ninh (4/2018) . 71 ___ 8
Đồ án tốt nghiệp ___ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CZ: Czapeck - Dox CT: Công thức PDA: Potato D - Glucose Agar BVTV: Bảo vệ Thực vật Ops: Organophosphates CIAT: Trung tâm Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc tế ___ 9
Đồ án tốt nghiệp ___ LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: Sâu hại là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng và là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của nền nông nghiệp Việt Nam. Vì vậy, một lượng đáng kể hóa chất bảo vệ thực vật đã được nhập khẩu và sử dụng để phòng trừ sâu hại cây trồng. Ưu điểm của thuốc trừ sâu hoá học là phổ tác dụng rộng, hiệu quả nhanh. Nhưng thuốc hoá học ngày càng bộc lộ nhiều nhược điểm như sâu hại nhanh kháng lại thuốc sau chỉ một thời gian sử dụng, tồn dư thuốc trong nông sản cao gây mất an toàn thực phẩm, gây ảnh hưởng đến sức khoẻ cho người người tiêu dùng và thuốc hoá học cũng là một trong những nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường sống. Trong thời gian gần đây nhiều nông sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam như gạo, hồ tiêu, sắn bị trả về là do tồn dư hoá chất bảo vệ thực vật. Với ưu điểm vượt trội về độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người, thuốc trừ sâu sinh học đang là lựa chọn có tiềm năng lớn trong xu hướng phát triển nền nông nghiệp bền vững. Trong số các tác nhân đã được nghiên cứu thì nấm Paecilomyces được đánh giá có triển vọng do hiệu lực diệt sâu cao, mức độ lây lan trong quần thể rộng và kéo dài lại không độc hại với con người và môi trường, (U.S. Environmental Protection Agency, 2005). Vì vậy, gần đây chi nấm này đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và nhiều chủng thuộc chi Paecilomyce đã được thương mại hoá để trừ sâu chích hút ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài nấm có ích này vẫn còn khá hạn chế. Vì vậy, việc tìm kiếm và sử dụng các chủng nấm Paecilomyces sp để trừ sâu chích hút hại cây trồng là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tiễn trên, nhóm sinh viên thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả trừ sâu chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus”. 2. Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả trừ sâu chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus. ___ 10
Đồ án tốt nghiệp ___ 3. Nội dung nghiên cứu: - Nội dung 1: Kiểm tra hoạt tính Enzyme. - Nội dung 2: Xác định lượng nước bổ sung vào cơ chất trong sản xuất nấm Paecilomyces lilacinus. - Nội dung 3: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ bổ sung vào môi trường gạo tấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. - Nội dung 4: Ảnh hưởng của lượng khoáng bổ sung đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus - Nội dung 5: Xác định nhiệt độ sấy phù hợp để tạo chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. - Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả trừ Rầy xanh Amrasca devastans trên cây đậu bắp của chủng nấm Paecilomyces trong điều kiện phòng thí nghiệm và trong chậu. - Nội dung 7: Đánh giá hiệu quả trừ Bọ phấn trắng Bemisia tabaci của chủng nấm Paecilomyces lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài đồng. ___ 11
Đồ án tốt nghiệp ___ ĐẶT VẤN ĐỀ Sâu chích hút là nhóm sâu hại nguy hiểm cho sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam vì ngoài tác hại trực tiếp đến sinh trưởng phát triển của cây trồng, nhiều loài sâu chích hút còn là vecto truyền bệnh virus cho cây trồng. Ngày nay các loại cây trồng có giá trị xuất khẩu và mang lại hiệu quả kinh tế cao luôn được chú trọng sản xuất và phát triển. Sắn hay khoai mì (cassava) là loại cây mang lại hiệu quả kinh tế rất cao giúp người dân phần nào bớt đi được gánh nặng kinh tế gia đình, ổn định cuộc sống. Trong năm 2015 diện tích trồng sắn ở nước ta là khoảng 560.000ha, thu được 19tấn/ha và đạt tổng giá trị xuất khẩu tầm 1,5 tỉ USD (sau gạo và cafe) (Lê Huỳnh Nam và cộng sự 2016). Do lợi ích kinh tế mang lại khá cao nên sắn được trồng ở nhiều vùng trên cả nước. Trong đó, Tây Ninh là nơi có truyền thống về trồng sắn, năng suất sắn ở Tây Ninh cao nhất nước (31,6 tấn/ha). Tây Ninh cũng có số lượng nhà máy chế biến khoai mì và tinh bột mì cao nhất, kim ngạch xuất khẩu chiếm khoảng 40% tổng kim ngạch xuất khẩu cả nước (Tây Ninh online 2015). Tuy nhiên, trong thời gian vừa qua bệnh khảm lá phát triển mạnh ở Tây Ninh, nguy cơ mất vùng nguyên liệu sắn ở Tây Ninh là rất lớn. Theo Cục BVTV, đây là đối tượng dịch hại mới và lần đầu tiên xuất hiện gây hại tại Việt Nam. Tác nhân gây bệnh do virus có tên khoa học là Sri Lanka Cassava Mosaic Virus. Môi giới truyền bệnh là bọ phấn trắng Bemisia Tabaci Genn (Cục Bảo vệ Thực vật, 2017). Vì vậy, việc sử dụng thuốc hóa học cho hiệu quả rất thấp đối với loài dịch hại này. Trong khi đó, theo Nguyễn Thị Xuân Hương (2015) và Đỗ Anh Duy (2016), chủng nấm Paecilomyces lilacinus có hiệu quả cao đối với bọ phấn trắng và một số loài sâu chích hút như rệp Aphis gosypii, rầy nâu hại lúa Nilaparvata lugens trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu về quy trình sản xuất chế phẩm từ chủng nấm này cũng như thử nghiệm hiệu lực của nấm trên đồng ruộng, đặc biệt là thử nghiệm hiệu lực trừ bọ phấn trên cây khoai mì. Xuất phát từ tình hình trên, nhóm sinh viên tiến hành đề tài “Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả trừ sâu chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus”. Nhằm đưa loài nấm ___ 12
Đồ án tốt nghiệp ___ có ích này lây lan trong cộng đồng bọ phấn trắng giúp hạn chế quần thể vectơ lan truyền bệnh và cuối cùng là hạn chế thiệt hại do bệnh khảm lá gây ra cho cây sắn nói riêng và cây trồng nói chung. ___ 13
Đồ án tốt nghiệp ___ CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây Sắn: Nguồn gốc – Lịch sử: Sắn (phương ngữ miền Bắc) hay khoai mì (phương ngữ miền Nam, sắn ở miền Nam lại là củ đậu) là cây lương thực ăn củ có thể sống lâu năm, thuộc họ Đại kích (Euphorbiaceae). Cây khoai mì (sắn) có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ La tinh (Crantz, 1976) và được trồng cách đây khoảng 5.000 năm (CIAT, 1993). Trung tâm phát sinh cây khoai mì được giả thiết tại vùng đông bắc của nước Brasil thuộc lưu vực sông Amazon, nơi có nhiều chủng loại khoai mì trồng và hoang dại (De Candolle 1886; Rogers, 1965). Bằng chứng về nguồn gốc khoai mì là những di tích khảo cổ ở Venezuela niên đại 2.700 năm trước Công nguyên, di vật thể hiện củ khoai mì ở cùng ven biển Peru khoảng 2000 năm trước Công nguyên, những lò nướng bánh khoai mì trong phức hệ Malabo ở phía Bắc Colombia niên đại khoảng 1.200 năm trước Công nguyên, những hạt tinh bột trong phân hóa thạch được phát hiện tại Mexico có tuổi từ năm 900 đến năm 200 trước Công nguyên (Rogers 1963, 1965). Đặc điểm: Cây khoai mì cao 2–3 m, lá khía thành nhiều thùy, rễ ngang phát triển thành củ và tích luỹ tinh bột, thời gian sinh trưởng 6 đến 12 tháng, có nơi tới 18 tháng, tùy giống, vụ trồng, địa bàn trồng và mục đích sử dụng. 1.1.1. Tình hình trồng sắn ở Việt Nam: Sắn là cây trồng truyền thống ở Việt Nam, được trồng trên toàn quốc gia. 1 mùa ở miền Bắc và 3 mùa/ năm ở miền Nam Việt Nam. Trong năm 2015 diện tích trồng sắn là 560.000 ha. 19 tấn/ha và 10.5 triệu tấn củ tươi trên cả nước. Diện tích và khối lượng sản xuất sắn thứ 3 sau gạo và ngô. Xuất khẩu thứ 3 sau gạo và cafe 1,5 tỉ USD trong 2015. Được trồng với diện tích nhỏ ở quy mô hộ gia đình và diện tích lớn với quy mô trang trại, 70% là để xuất khẩu. (Lê Huỳnh Ham và cộng sự - 2016). ___ 14
Đồ án tốt nghiệp ___ 1.1.2. Tình hình tiêu thụ sắn trong và ngoài nước: Sản lượng khoai mì trong năm 2014 là 9,7 triệu tấn. Trong đó 30% phục vụ nhu cầu trong nước như cung cấp lương thực thức ăn gia súc, tinh bột dược phẩm, nhiên liệu sinh học và rượu công nghiệp, 70% còn lại để xuất khẩu. Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất chế biến, tiêu thụ là cơ hội triển vọng để nông dân phát triển. Khu vực trồng khoai mì tăng từ 237600ha năm 2000 lên 560000ha năm 2014 trong khi sản lượng khoai mì tăng từ 8,4tấn/ha lên 19tấn/ha. Giá trị xuất khẩu khoai mì khoảng 1,3-1,5 tỉ USD/ năm. (Nguyen Van Bo, Hoang Kim 2013) Trong 20 năm qua khoai mì trở thành cây xuất khẩu quan trọng thứ 3 trên cả nước. Đó là 1 cuộc cách mạng thật sự. Từ năm 1960 -2000 sản lượng khoai mì đạt khoảng 8 tấn/ha là khá thấp vì: • Khoai mì được coi là cây làm đất xuống cấp gây xói mòn đất • Không có giá trị kinh tế, không được khuyến khích mở rộng • Kể từ khi hợp tác với CITA, năng suất khoai mì tăng đáng kể ở cuối thập niên 80 của thế kỉ 20. • Đến năm 2015 năng suất đã tăng gấp đôi 19tấn/ năm. Hình 1. 1: Tình hình sản xuất khoai mì từ năm 1960 – 2010 ___ 15
Đồ án tốt nghiệp ___ Sản lượng khoai mì được sản xuất cao hơn Châu Phi nhưng thấp hơn Thái Lan, Indonesia. Có sự khác biệt giữa miền Nam và miền Bắc: trong 1 năm miền bắc đạt 12tấn/ha miền Nam 32tấn/ha. Diện tích trồng khoai mì tăng từ 164300ha năm 1995 đến 560000 năm 2015, tăng hơn 3 lần sau 20 năm. Sản lượng tăng từ 1,62 triệu tấn năm 1995 lên 10,5 triệu tấn năm 2015, tăng gấp 6 lần. Giá trị Xuất khẩu đạt 1,5 tỷ USD năm 2015. Cung cấp việc làm và nguồn thu nhập cho hàng triệu người dân. (FAOSTAT, 2014, cited by Hoang Kim et al., 2014a). Chương trình nhiên liệu sinh học từ 2015 – 2025: Theo quyết định của Thủ Tướng số 177/2007/ QĐ-TT ngày 20 tháng 11 năm 2007 thì: năm 2015: 5% được sử dụng làm nhiên liệu sinh học và đến năm 2025: 10% được sử dụng làm rượu và xăng sinh học. Khoai mì được xác định là cây trồng thích hợp cho nhiên liệu sinh học ở trong những thập kỷ tới. Điều này làm cho Việt Nam trở thành quốc gia đặc biệt trong việc lựa chọn nguyên liệu đầu vào trong việc sản xuất nhiên liệu sinh học. (Tran Cong Khanh, 2015). Việc cải thiện năng xuất và mở rộng diện tích trồng khoai mì ở những năm gần đây khiến khoai mì trở thành loại cây xóa đói giảm nghèo và phát triển nông thôn ở Việt Nam. Trước đây khoai mì được xem là cây trồng không mong muốn do lợi nhuận thấp làm xói mòn và suy thoái đất. nhưng việc trồng khoai mì trong thập kỷ qua cho thấy khoai mì cho năng suất ổn định 60-80tấn/ha là khả thi và không làm suy thoái hay xói mòn đất. Vì vậy khoai mì trở thành cây trồng hứa hẹn và cạnh tranh cao trong việc mang lại thu nhập cho cho các tỉnh thành ở Việt Nam. Bảo tồn và phát triển bền vững khoai mì ở Việt Nam đã mang lại kết quả ngoạn mục và được thử nghiệm ở Tây Ninh, Phú Yên, Dak Lak và Đồng Nai. Những nơi này được sử dụng công nghệ cải tiến làm tăng sản lượng từ 8.5 tấn/ha thành 36tấn/ha. (Hoàng Kim 2015) ___ 16
Đồ án tốt nghiệp ___ Theo Jin Shu Ren. 2015. Năm 2015 diện tích trồng khoai mì ở Việt Nam khoảng 0,56 triệu ha. Năm 2014 Việt Nam xuất khẩu khoảng 3.4 triệu tấn khoai mì. Năm 2015 Việt Nam xuất khẩu khoảng 4.0 triệu tấn khoai mì. Khoảng 90% khoai mì được xuất khẩu sang trung quốc. Trung Quốc là thị trường khoai mì lớn nhất thế giới. 13 nhà máy sản xuất cồn sinh học với công suất 1067,7 triệu lít cồn sinh học mỗi năm. 66 nhà máy chế biến tinh bột công nghiệp. Hơn 2000 đơn vị chế biết tinh bột sắn thủ công. Sản xuất chế biến và tiêu thụ khoai mì là cơ hội triển vọng của nông dân và các doanh nghiệp ở Việt Nam cũng như các quốc gia trên thế gới. 1.1.3. Một số giống sắn đang sản xuất phổ biến tại Việt Nam: Một số giống sắn do Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc- Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam giới thiệu cho sản xuất, đang được trồng phổ biến trên phạm vi cả nước như giống sắn: KM94, SM937-26, KM98-1, KM60, KM98-5, KM140, KM101, HL-S10, HL-S11 và KM7. Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh gần đây giới thiệu chuyển giao cho sản xuất giống sắn KM419. Ở phía Bắc nghiên cứu chọn tạo giống của Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Cây có củ, Viện Di truyền Nông nghiệp đã giới thiệu cho sản xuất giống sắn như: KM98-7, NA1, Sa06, Sa21-12, HL2004-28, BK. 1.1.4. Những rủi ro trong việc trồng Sắn: - Sự cạnh tranh về các cây trồng khác. - Bệnh tật. - Yêu cầu lao động cao. - Ô nhiễm trong chế biến. - Biến động giá cả và sự bất ổn của thị trường. (Nguyen Van Bo, Hoang Kim et al. 2013) ___ 17
Đồ án tốt nghiệp ___ 1.1.5. Tình hình sâu bệnh hại chính trên cây sắn tại Việt Nam: Chiều hướng diện tích sản xuất sắn gia tăng liên tục trong những năm qua đã dần xuất hiện những sâu bệnh và rủi ro cao trong canh tác sắn của nông dân. Hiện nay đã xuất hiện những sâu bệnh nguy hiểm nếu không quan tâm kịp thời và phòng trừ có thể ảnh hưởng lớn đến năng suất. Những dịch hại mới đây xuất hiện trên sắn như: Bệnh chổi rồng, rệp sáp bột hồng, bệnh thối củ, bệnh khảm lá do vi rút, Ngày càng gia tăng mạnh ở diện rộng hơn và phân bổ ra nhiều vùng, làm thiệt hại đáng kể đến năng suất, chất lượng và thu nhập của nông dân trồng sắn. 1.1.5.1. Bệnh chổi rồng trên cây sắn: Nguyên nhân: Bệnh do Phytoplasma (Candidatus phytoplasma aurantifolia) gây ra, bệnh xuất hiện tại Việt Nam từ năm 2005 và phát triển thành dịch trên diện rộng từ năm 2008- 2013. Bệnh hại chủ yếu trên giống sắn KM94 và gây thiệt hại trên diện rộng ở các tỉnh phía nam như: Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh, Bà Rịa- Vũng Tàu, Quảng Trị, Quảng Ngãi, Phú Yên, Bình Định và Kon Tum. Triệu chứng của cây sắn bị bệnh chổi rồng: - Giai đoạn cây con: Hom giống bị nhiễm bệnh sau khi trồng lên mầm kém, sinh trưởng kém, lóng thân ngắn, lá ngắn và nhỏ. Chồi ngọn rụt ngắn lại, cây thấp lùn, các mầm ngủ trên thân mọc nhiều chồi, cây sinh trưởng kém, lá chuyển màu vàng, rụng hoặc chết khô. Khi bệnh nặng bên trong thân gỗ của cây và hom sắn thâm đen, phần bấc trong thân cây chuyển màu nâu vàng, sau đó cây héo dần, rụng lá và chết cả cây. - Giai đoạn cây sắn thu hoạch: Những cây nhiễm bệnh nhẹ, mặc dù cây sinh trưởng bình thường nhưng đến thời kỳ thu hoạch ngọn cây bị chết khô, phần thân đoạn dưới bị chết, các chồi mọc thành dạng chùm, hình dạng dù, biểu hiện sinh trưởng của từng chồi giống như triệu chứng của giai đoạn cây con nhiễm bệnh chổi rồng, cây sắn ít củ và củ nhỏ hơn cây bình thường (năng suất giảm từ 30- 90%). ___ 18
Đồ án tốt nghiệp ___ Điều kiện phát sinh và lây nhiễm: - Bệnh do Phytoplasma (Candidatus phytoplasma aurantifolia) gây ra, theo tài liệu nghiên cứu trên thế giới, phytoplasma còn gây hại trên các loài thực vật khác như cây hoa cẩm quỳ (Malvaviscus arborrus), dâm bụt (Hibicus rosasinensis), chanh leo (Passiflora) - Bệnh chổi rồng hại sắn lan truyền chủ yếu qua 2 con đường: • Hom giống đã nhiễm bệnh. • Môi giới truyền bệnh là loài rầy được ghi nhận trên thế giới, tuy nhiên tại Việt Nam các nghiên cứu vẫn chưa kết luận. - Bệnh thường xuất hiện gây hại vào đầu mùa mưa (tháng 5- 6) và phát triển mạnh vào các tháng 1, 3 năm sau. - Bệnh gây hại nặng trên giống sắn KM 94 và hại nặng ở những vườn sắn không đầu tư chăm sóc. Dùng hom giống bị bệnh để làm giống. - Giai đoạn thu hoạch bệnh nặng hơn giai đoạn cây sắn non, bệnh gây hại nặng trên những ruộng sắn không có điều kiện thu hoạch để qua 2 năm. Biện pháp phòng trừ: - Sử dụng những giống sắn từ vùng chưa bị bệnh và cây sắn sạch bệnh để làm giống, không vận chuyển hom sắn giống từ vùng bệnh sang vùng khác. - Vườn bị bệnh, thu gom đốt triệt để thân và tàn dư của cây sắn bị bệnh để tiêu diệt nguồn bệnh, luân canh với cây trồng khác họ từ 1- 2 vụ, sau đó mới trồng lại sắn. - Đối với diện tích sắn non, giai đoạn phát triển thân lá bị nhiễm bệnh nhẹ, cần nhổ tiêu hủy cây bệnh và rắc vôi vào hốc những cây bị bệnh để hạn chế sự lây lan. - Bón phân đầy đủ và cân đối N, P, K theo qui trình canh tác sắn bền vững, trồng xen cây họ đậu để bổ sung dinh dưỡng cho đất, hạn chế xói mòn rửa trôi đất. ___ 19
Đồ án tốt nghiệp ___ - Thường xuyên kiểm tra sâu bệnh trên cây sắn để phòng trừ kịp thời, đặc biệt với rầy môi giới truyền Phytoplasma. 1.1.5.2. Rệp sáp bột hồng hại sắn: Nguyên nhân: Do loài rệp sáp có tên khoa học là Phenacoccus manihotis gây hại trên cây sắn; Rệp sáp bột hồng xuất hiện tại Việt Nam vào năm 2012, trong đó tỉnh Tây Ninh xuất hiện sớm nhất sau đó các tỉnh Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Thuận, Nghệ An cùng xuất hiện lây lan thành dịch. Đặc điểm sinh học của Rệp sáp bột hồng: - Ở điều kiện nhiệt độ môi trường khoảng 280C, thời gian phát triển từ trứng đến trưởng thành đẻ trứng khoảng 33 ngày (vòng đời). - Mỗi trưởng thành cái có thể đẻ 300- 500 trứng. - Rệp sáp bột hồng hại sắn phát sinh phát triển mạnh trong các tháng mùa khô và các tháng có lượng mưa thấp (< 30mm). - Trong quá trình sinh sống Rệp sáp bột hồng sống cộng sinh với một số loài kiến; Rệp phát sinh phát triển mạnh trong các tháng mùa khô. - Cũng như một số loài rệp sáp giả khác, Rệp sáp bột hồng có khả năng sinh sản đơn tính, trưởng thành cái không cần giao phối vẫn có thể đẻ trứng và nở thành con. - Rệp non màu hồng, có 3 tuổi, râu đầu của rệp non tuổi 1 có 6 đốt, các tuổi tiếp theo có 9 đốt. - Rệp trưởng thành cơ thể có dạng hình trứng, màu hồng và bao phủ bởi lớp sáp bột màu trắng; mắt hơi lồi; chân rết phát triển, cơ thể mang nhiều các tua sáp trắng rất ngắn ở phần bên mép thân và đuôi. Đôi tua sáp ở đuôi dài hơn các tua sáp khác. Chính điều này làm cho cơ thể rệp nhìn bên ngoài như có gai. Kích thước rệp trưởng thành dài khoảng 1,0 - 2,60mm rộng khoảng 0,5 - 1,4mm, râu đầu thường có 9 đốt. ___ 20
Đồ án tốt nghiệp ___ Triệu chứng, tác hại và lây nhiễm: Rệp sáp bột hồng gây hại ở điểm sinh trưởng của cây sắn, gây hiện tượng chùn ngọn, cây lùn. Trên lá, Rệp bám ở mặt sau lá, gây hại làm các lá sắn bị xoăn, biến vàng. Khi bị nhiễm với mật độ cao, toàn bộ lá cây bị rụng, cây chết và làm năng suất củ giảm tới 80%. Ngoài sắn là ký chủ chính, Rệp sáp bột hồng còn gây hại một số cây ký chủ: Cây nam sâm (Boerhavia diffusa), cây cói lác (Cyperus sp.), cây trạng nguyên (Euphorbia pulcherrima), cây cao su ceare (Manihot glaziovii). Rệp sáp bột hồng lây lan qua hom giống, phát tán theo gió, trôi theo nguồn nước, kiến, bám dính trên cơ thể động vật, người, công cụ và phương tiện vận chuyển Biện pháp phòng trừ: - Thường xuyên theo dõi đồng ruộng để phát hiện sớm các ổ rệp mới xuất hiện, tiến hành tiêu hủy triệt để. - Khoanh vùng những diện tích bị nhiễm, thu gom cây bị nhiễm, áp dụng các biện pháp (đốt, phun thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) cho toàn bộ diện tích nhiễm và lân cận). Có thể sử dụng các loại thuốc có các hoạt chất Thiamethoxam hàm lượng 350g/l, dạng thành phẩm SC; Imidacloprid hàm lượng 25%w/w, dạng thành phẩm WP; Nitenpyram hàm lượng 50% w/w, dạng thành phẩm; Dinotefuran hàm lượng 20% w/w, dạng thành phẩm WP. Sử dụng theo nồng độ khuyến cáo với lượng dung dịch nước thuốc đã pha là 600 lít/ha. - Không vận chuyển cây sắn từ vùng nhiễm Rệp sáp bột hồng sang vùng khác. - Không sử dụng sắn ở vùng bị nhiễm Rệp sáp bột hồng làm hom giống. - Xử lý hom giống sắn bằng cách ngâm trong dung dịch nước thuốc BVTV 30 phút trước khi trồng. - Thu gom, diệt nguồn Rệp sáp bột hồng trên đồng ruộng để hạn chế phát tán của chúng. ___ 21
Đồ án tốt nghiệp ___ - Tạo vườn sắn thông thoáng, bón phân cân đối để cây sắn sinh trưởng phát triển tốt. Bảo vệ thiên địch (bọ rùa, bọ cánh gân, ong ký sinh ), nhân thả ong ký sinh Apoanagyrus lopezi, sử dụng chế phẩm sinh học để kiểm soát rệp. - Nghiên cứu, chọn lọc đưa vào sản xuất các giống sắn chống chịu đối với rệp sáp bột hồng. 1.1.5.3. Bệnh thối củ sắn: Nguyên nhân: Bệnh thối củ sắn có nhiều tác nhân gây bệnh, ngoài bệnh thối nhũn củ do bị úng nước còn có loại bệnh thối củ khác, theo các nhà khoa học, bệnh thối củ khoai sắn (không bị úng nước) do nhóm nấm Fusarium sp, Rhizoctonia sp, nhóm vi khuẩn Xanthomonas sp, Erwinia sp, Pseudomonas sp, bệnh xuất hiện trong điều kiện mưa nắng thất thường trong mùa mưa, và bệnh xuất hiện trên những ruộng sắn thâm canh cao, canh tác sắn nhiều năm. Đặc biệt tại tỉnh Tây Ninh đã xuất hiện bệnh thối củ sắn trên diện tích rộng tại các huyện Châu Thành, Dương Minh Châu, Tân Biên, Tân Châu. Khi bị bệnh sắn giảm năng suất (có những vụ sắn năng suất giảm đến 40- 50% và hàm lượng tinh bột thấp (ảnh hưởng đến giá bán). Biện pháp ngăn ngừa bệnh thối củ sắn: - Chọn đất trồng sắn ở những nơi cao không bị ngập úng cục bộ. - Không chọn hom giống ở những vườn sắn bị bệnh (hom khỏe). - Vệ sinh đồng ruộng sau khi đã thu hoạch xong vụ, tốt nhất luân canh một vụ cây trồng khác sau đó như lúa, cây đậu hoặc cho đất nghỉ một thời gian. - Bón phân NPK cân đối, không quá lạm dụng phân đạm nhất giai đoạn hình thành củ. - Khi bị bệnh phun tưới thuốc trừ bệnh có gốc đồng, nhóm thuốc có Carbendazim (thuốc Carmanthai 80 WP), hoặc kasumin. ___ 22
Đồ án tốt nghiệp ___ 1.1.5.4. Bệnh khảm virus trên Sắn (Cassava mosaic disease): Triệu chứng của bệnh khảm virus trên sắn lần đầu tiên được báo cáo vào năm 1894 tại Tanzania sau đó nhanh chóng xuất hiện ở hầu hết các nước trồng sắn của Châu Phi và Châu Mỹ La Tinh. Tại khu vực châu Á, bệnh này xuất hiện tại Ấn Độ, Sarilanca, Campuchia. Lần đầu tiên xuất hiện tại Việt Nam vào tháng 5/2017, cây sắn có các triệu chứng điển hình của bệnh bao gồm: khảm bông, biến dạng lá và tăng trưởng còi cọc, được quan sát thấy ở cánh đồng ở Tây Ninh, Việt Nam tại 3 huyện biên giới của tỉnh Tây Ninh giáp với Campuchia là Tân Châu, Tân Biên, Châu Thành sau đó lan nhanh ra các huyện khác, tính đến tháng 07/2017 diện tích sắn bị nhiễm bệnh này lên đến 1.581 ha. Đây là báo cáo đầu tiên về bệnh khảm sắn do Sri Lanka Cassava Mosaic Virus gây ra ở Việt Nam và báo cáo thứ hai về bệnh khảm do Sri Lanka Cassava Mosaic Virus ở Đông Nam Á gây ra. (Wang và cộng sự, 2016) Triệu chứng bệnh và phương thức lan truyền: Theo Cục BVTV, đây là đối tượng dịch hại mới và lần đầu tiên xuất hiện gây hại tại Việt Nam. Tác nhân gây bệnh do virus có tên khoa học là Sri Lanka Cassava Mosaic Virus. Môi giới truyền bệnh là bọ phấn trắng Bemisia Tabaci Genn (Cục Bảo vệ Thực vật, 2017) Bệnh lây truyền phổ biến qua bọ phấn trắng và qua hom giống lấy từ cây bị bệnh. Biểu hiện của bệnh khảm là trên lá cây sắn xuất hiện những vết vàng loang lổ xen lẫn phần xanh. Khi cây trồng bệnh nặng, vết vàng loang rộng ra trên phiến lá sắn, làm lá biến dạng nhăn nheo, cuốn lại và nhỏ dần. Đây là loại bệnh rất nguy hiểm và khó phòng trừ, làm giảm năng suất và chất lượng củ sắn. Nếu cây sắn bị nhiễm bệnh lúc còn non sẽ không cho thu hoạch, không phòng trị kịp thời, bệnh này sẽ lây lan nhanh ra các vùng khác. Biện pháp phòng trừ: - Cần làm tốt công tác kiểm dịch thực vật nhập khẩu và kiểm dịch nội địa. - Sử dụng những giống sắn khỏe, sạch bệnh để làm giống, không vận chuyển hom sắn giống từ vùng bệnh sang vùng khác. ___ 23
Đồ án tốt nghiệp ___ - Vườn bị bệnh, thu gom đốt triệt để thân và tàn dư của cây sắn bị bệnh để tiêu diệt nguồn bệnh. Đối với diện tích sắn giai đoạn phát triển thân lá bị nhiễm bệnh nhẹ, cần nhổ tiêu hủy cây bệnh và rắc vôi vào hốc những cây bị bệnh để hạn chế sự lây lan. - Bón phân đầy đủ và cân đối N, P, K theo qui trình canh tác sắn bền vững. - Luân canh cây sắn với cây trồng khác phù hợp như các loại cây họ đậu, không nên trồng sắn độc canh trên một chân đất. - Thường xuyên kiểm tra sâu bệnh trên cây sắn để phòng trừ kịp thời, đặc biệt với bọ phấn trắng môi giới truyền vi rút khảm lá sắn. - Để phòng trừ loại sâu này phải sử dụng thuốc phun theo khuyến cáo hướng dẫn của Cục BVTV như thuốc; Ikuzu 20WP với liều lượng 320g/ha và Longanchess 750WP liều lượng 300g/ha phun 400 lít/ha, phun ướt đều toàn bộ tán lá sắn ___ 24
Đồ án tốt nghiệp ___ 1.2. Tổng quan về Bọ Phấn Trắng: 1.2.1. Phân loại khoa học: Giới: Animanila Ngành: Arthropoda Lớp: Insecta Bộ: Hemiptera Họ: Sternorrhyncha Chi: Bemisia Loài: B.tabaci Hình 1. 2: Vòng đời bọ phấn trắng 1.2.2. Đặc điểm sinh thái: Bọ phấn là một trong những dịch hại nguy hiểm đối với nhiều loài cây trồng. Ký chủ của bọ phấn chủ yếu là thực vật hạt kín hai lá mầm, trong đó cây họ cam quýt (Rutaceae) là ký chủ của hơn 60 loài, cây họ dâu tằm (Moracea) là ký chủ của hơn 80 loài. Ở các nước ôn đới, Bọ phấn Trialeurodes vaporariorum gây hại nặng cho cây trồng trong nhà kính và ngoài đồng ruộng, Bọ phấn Aleyrodes proletella gây hại nặng cho rau họ thập tự. Ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, các loài ___ 25
Đồ án tốt nghiệp ___ Aleurodicus dispersus, Trialeurodes vaporariorum và Bemisia tabaci gây hại thiệt nghiêm trọng cho bông và nhiều loại cây trồng khác có giá trị kinh tế cao. Cho đến nay trên thế giới đã ghi nhận 1556 loài, chúng thuộc 161 giống của 3 phân họ Aleurodicinae, Aleyrodinae, Udamoselinae (Evans,2008). Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (BVTV) các năm 1967 - 1968, 1977 - 1978, 1997 - 1998, ở nước ta có 7 loài bọ phấn với tên khoa học là: Aleurocanthus spiniferus, Aleurocanthus woglumi, Aleurocanthus spp. gây hại trên cam quýt; Aleurocybotus indicus gây hại trên lúa; Dialeurodes citri gây hại trên na; Parabemisia myricae gây hại trên đậu tương, thuốc lá, đậu đỗ, dưa chuột, cà chua, cà tím. 1.2.3. Đặc điểm hình thái: Trưởng thành có kích thước nhỏ, thích bay và thường có màu trắng đục, có lớp sáp phấn trên cánh, chiều dài cơ thể 1 -3 mm. Trưởng thành của bọ phấn trắng cái có màu vàng nhạt hoặc trắng . Lá non chưa hoàn chỉnh (chưa mở) là nơi con cái ưa thích đẻ trứng, giao phối ngay sau khi vũ hóa. Trứng có hình quả lê hoặc quả trứng, có cuống gắn chặt cố định trên các mô lá và thời gian pha trứng từ 8-31 ngày. Phần mở rộng của cuống nhỏ móc dính này là phương tiện để thụ tinh. Mỗi con cái có thể đẻ 80 trứng, số lượng trứng thay đổi theo mùa. Ấu trùng tuổi 1 - 3 có thể di chuyển và gây hại trong phạm vi ngắn; Tuổi 4 thường được gọi là nhộng. Ấu trùng mới nở có màu kem nhạt và dần dần chuyển sang một màu đen bóng. Chúng hình thành các tua sáp và phủ một lớp sáp trên cơ thể. Ngay sau khi nở, các ấu trùng di chuyển tìm vị trí thích hợp để định cư gây hại. Thời gian phát dục của tuổi 1: 4 - 7 ngày, tuổi 2: 3 - 7 ngày và tuổi 3: 3 - 8 ngày. Mỗi lần lột xác là có sự thay đổi màu sắc từ màu nhạt chuyển sang hơi đen. Hầu hết tuổi 2, 3 của ấu trùng có hình bầu dục hoặc thuôn dài và có những khe (nếp gấp) thở cạn ở thành bụng và lưng. Đó là các lỗ thở và có thể hỗ trợ cho việc dẫn truyền không khí. ___ 26
Đồ án tốt nghiệp ___ Giai đoạn nhộng (ấu trùng tuổi 4) là nhộng giả vì chúng có hoạt động ăn trong giai đoạn đầu, kéo dài 9-14 ngày sau đó vũ hóa thông qua khe hình chữ 'T' trên lưng vào buổi sáng. Cả ấu trùng và trưởng thành đều chích vào mô cây trồng và hút dịch nhưng giai đoạn ấu trùng gây thiệt hại nặng nhất cho cây mía. Khi ấu trùng phát triển, chúng phủ một lớp bọc bằng sáp trắng giúp bảo vệ khỏi các tác động bên ngoài, nhất là thuốc trừ sâu, đây là đặc điểm riêng biệt của bọ phấn trắng ở các pha phát dục, trừ pha trứng. 1.2.4. Tổng quan về tác hại do bọ phấn trắng gây ra: Bọ phấn trắng (B. tabaci) là một trong những loài loài dịch hại nông nghiệp nguy hiểm nhất trên phạm vi toàn cầu (Philip A. Stansly et.al, 2010). Chúng gây hại cho hầu hết các loài cây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Luko Hilje et al, 2001). Các cây trồng là kí chủ của bọ phấn trắng lên đến 600 loài thuộc 5 họ cây phổ biến bao gồm cây họ đậu (99 loài), cây họ cúc, họ bông, họ cà và họ thầu dầu. Ngoài tác hại trực tiếp đến sinh trưởng phát triển của cây, bọ phấn trắng còn là vecto truyền bệnh virus cho cây. Đây chính là tác hại quan trọng nhất của bọ phấn trắng. Các tác giả cho biết, bọ phấn trắng là vector truyền hơn 150 loại virus gây bệnh cho cây trồng (Polston and Anderson 1997; Jones 2003). Trên cây cà chua, các cây họ ớt, bọ phấn trắng là vecto duy nhất truyền virus gây xoăn vàng ngọn cà chua (virus Tomato Yellow Leaf Curl Virus: TYLCV) (Ghanim M et al. 1998; Ghanim M, Czosnek H, 2000; Liu et al, 2013; Rubinstein G, Czosnek H., 1997). Cùng quan điểm này, Muniyappa et al (2000); Sylvia Jelinex (2010) cho biết, bệnh xoăn lá cà chua do virus (Tomato leaf curl virus: ToLCV) và bệnh xoăn vàng ngọn cà chua (TYLCV) gây hại nặng cho sản xuất cà chua tại Ấn Độ, Úc và nhiều nước Châu Á được lan truyền bởi bọ phấn trắng. Chúng tấn công cây trồng từ khi cây mới mọc và phát triển, gây hại cho đến khi thu hoạch. Tỷ lệ cây bị bệnh chiếm từ 50 đến 100%. Nhiều diện tích cây trồng bị đốn bỏ vì tác hại của virus. Thiệt hại do bọ phấn trắng lên đến hàng tỷ đô la/năm (Gill, 1992; Zalom et al. 1995; Heinz 1996; Henneberry et al. 1997; Henneberry et al. 1998; Chu and Henneberry 1998. ___ 27
Đồ án tốt nghiệp ___ Bọ phấn trắng là dịch hại nguy hiểm nhất cho hầu hết các loại cây trồng trong nhà kính (Premalatha K. và Rajangam. J, 2010). Trong điều kiện nhà kính, bọ phấn trắng tấn công mạnh trên cây rau ăn trái như cà chua, ớt ngọt, cà tím, dưa leo (Cock, 1986). Tại Mỹ, bọ phấn trắng gây hại làm giảm 13% năng suất dưa lê (Jetter et al. 2001). Bọ phấn trắng đã hình thành tính kháng đối với khoảng 35 hoạt chất thuốc trừ sâu được báo cáo trên ít nhất 20 nước trên thế giới. Mất mát do bọ phấn trắng gây ra trên toàn cầu, ước tính trên 300 triệu đô la Mỹ/năm (De Barro and Driver 1997; White 1998). Vì vậy, việc nghiên cứu để xây dựng biện pháp phòng trừ bọ phấn trắng đã và đang được đặc biệt chú ý (Philip A et.al, 2012). Một chương trình quản lý tổng hợp bọ phấn trắng mang tính quốc tế (Tropical Whitefly IPM Project) đã được triển khai từ năm 1996 đến năm 2004 và đã xác định được rằng việc lạm dụng thuốc hóa học nguyên nhân gây nên sự bùng phát của loài dịch hại này ở các nước vùng nhiệt đới (Francisco J. Morales, 2006). Tại Việt Nam, Bọ phấn trắng được coi là dịch hại chính và là vecto truyền bệnh virus trên nhiều loại cây trồng (Lê Thị Liễu, Trần Đình Chiến, 2005; Trần Đình Phả et al. 2009). Trên cây cà chua ở miền Bắc, chúng xuất hiện và gây hại trong suốt cả vụ. Trong số 33 loài bọ phấn trắng thu được trên các cây trồng ở Hà Nội, Bemisia tabaci là luôn xuất hiện thường xuyên, gây hại nặng trên nhiều loại cây trồng như đậu đỗ, cà chua, bắp cải, xu hào, súp lơ (Đàm Ngọc Hân, 2010). Theo Cục BVTV, đây là đối tượng dịch hại mới và lần đầu tiên xuất hiện gây hại trên cấy sắn tại Việt Nam. (Cục Bảo vệ Thực vật, 2017). Bọ phấn trắng non và bọ phấn trưởng thành thường tập trung ở mặt dưới lá cà chua, ổi, ớt, cây Sắn. Chích hút dịch cây. Khi mật độ bọ phấn cao làm cây suy yếu, có thể bị héo, vàng lá, thậm chí có thể chết. Chất bài tiết của bọ phấn trắng có đường tạo điều kiện cho nấm bồ hóng phát triển hại cây. Bọ phấn thường gây hại trong mùa khô, chúng có phân tán trên phạm vi rộng nhờ gió. Ngoài ra, bọ phấn còn là vật trung gian truyền bệnh xoăn lá do virus gây ra và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Bệnh xoăn lá có thể xuất hiện ngay từ khi cây còn nhỏ trong vườn ươm cho đến khi trồng ra ruộng và thu hoạch. Bệnh ___ 28
Đồ án tốt nghiệp ___ xuất hiện càng sớm thì mức độ thiệt hại càng nặng. Cây bị bệnh còi cọc, lá biến màu vàng nhạt, trong khi gân lá còn xanh tạo thành những vết xanh vàng loang lổ, lá nhỏ lại, nhăn nheo và thô cứng, các lá ngọn bị xoăn, cây sinh trưởng kém, thấp nhỏ, phân nhiều nhánh cằn không phát triển được. Đốt thân hoặc các đốt ngắn lại và hơi uốn cong. Cây bị bệnh sớm và nặng có thể chết. Nếu bị muộn và nhẹ thì những lá non ra sau mới bị xoăn, cây có thể ra hoa và trái nhưng rụng nhiều. Nếu có trái thì trái nhỏ, méo mó, cứng, chất lượng kém. Virus lây lan bằng dịch cây, bằng tiếp xúc cơ giới và chủ yếu là do bọ phấn chích hút từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe. Bọ phấn trắng Bemisia tabaci là côn trùng môi giới truyền bệnh. Virus lan truyền rất nhanh, khi bọ phấn bắt đầu ăn cây, virus được truyền đi trong vòng 15 - 30 phút. Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều. Hàng năm, bệnh thường phát sinh mạnh từ tháng 10 đến đầu tháng 11 đặc biệt khi trời ấm và nắng, ít mưa. 1.2.5. Tình trạng kháng thuốc trừ sâu ở Bọ phấn trắng Bemisia tabaci: Bemisia tabaci là một trong 100 loài gây hại cây trồng hàng đầu thế giới. Nó gây ra thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho hơn 60 cây trồng. Ngoài gây hại trực tiếp đến sinh trưởng phát triển của cây, bọ phấn trắng còn là vector truyền các bệnh virus nguy hiểm. (De Barro, P. J., Liu, S.-S., Boykin, L. M. & Dinsdale, 2011). B. tabaci đã phát triển tính kháng với nhiều loại thuốc trừ sâu. Theo các tác giả, Cho đến nay, B. tabaci đã kháng với hơn 40 hoạt tính của thuốc trừ sâu. (Whalon, M. E., Mota-Sanchez, D., Hollingworth, R. M. & Gutierrez, 2016). Trước đây việc phòng trừ B. tabaci trong các hệ thống sản xuất nông nghiệp chủ yếu là Organophosphates (OPs) và thuốc trừ sâu organochlorine. Tuy nhiên vào cuối những nắm 70 và 80 Ops và organochlorine dần được thay thế bằng pyrethroids. OPs và pyrethroids đã được thay thế bằng neonicotinoids và các hóa chất mới khác trong cuối những năm 90, trên toàn thế giới. (Jeschke, P., Nauen, R., Schindler, M. & Elbert, 2010). Tuy nhiên, việc tiếp tục sử dụng các hợp chất này để kiểm soát côn trùng chích hút như B. tabaci vẫn xảy ra trên tiểu lục địa Ấn Độ. Một số vấn đề như lựa ___ 29
Đồ án tốt nghiệp ___ chọn hóa chất kém và thao tác thiếu chuyên môn đã khiến sự thất bại trong việc kiểm soát dịch bệnh chống lại B. tabaci ở Ấn Độ thêm nặng hơn. (Peshin, R. & Zhang, 2014). Việc sử dụng lặp lại các hợp chất có cùng thành phần hoạt tính và áp dụng liều lượng thuốc trừ sâu quá mức trong một mùa vụ đã dẫn đến kết quả là sự phát triển tính kháng thuốc trừ sâu chống lại các thuốc nhóm Organophosphates và pyrethroid ở B. tabaci. (Kranthi, K. R, 2015). Các nghiên cứu đã chỉ ra sự phát triển của tính kháng ở bọ phấn với các hợp chất hóa học mới ở một số nước Brazil, Burkina Faso, China, Colombia, Cypru, Egypt, Germany, Greece, Guatemala, India, Ira, Israel, Italy, Malaysia, Nicaragua, P, 2009). Ấn Độ có một lịch sử lâu dài về tính kháng với Organophosphates, pyrethroids và carbamates của bọ phấn trắng. (Kranthi, K. R. et al. 2002) ___ 30
Đồ án tốt nghiệp ___ 1.3. Tổng quan về nấm Paecilomyces: 1.3.1. Phân loại khoa học: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Paecilomyces Loài: Paecilomyces sp Chi Paecilomyces do Bainier mô tả vào 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Chuyên luận về chi nấm này của Samson (1974) chấp nhận 16 loài đã mô tả, đồng thời tổ hợp mới 9 loài và đề nghị 6 loài mới, tất cả tập hợp trong 2 nhóm loài. Nhóm loài thứ nhất là nhóm loài Paecilomyces có các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R. Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các loài ưa nhiệt ôn hòa (mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, có khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu khác. Nhóm loài thứ hai là nhóm loài Isarioides gồm các loài không có giai đoạn bào tử túi, ưa nhiệt ôn hòa và có khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng. Nhiều loài trong nhóm hai này kí sinh gây bệnh côn trùng (Samson R.A.,1974,2005). Đến năm 2004, dựa trên các kỹ thuật phương tiện hiện đại các loài trong chi Paecilomyces được Samson R.A. hệ thống lại với 26 loài. Năm 2005 nhóm tác giả Liang Z.Q., Y.F., Chu, H.L. và Liu, A. Y. đã tiến hành đề tra và thu thập các nguồn nấm Paecilomyces tại Trung Quốc. Kết quả điều tra thu thập đã phát hiện ra một số loài mới như Paecilomyces cylindricosporus sp. nov, Paecilomyces gunnii Z. Q. Liang, v.v. Các loài này được thu thập từ đất và xác côn trùng bị nấm ký sinh tại vùng cao của tỉnh Hồ Bắc. Cùng với các loài đã được ghi nhận trước đó, nhóm tác giả đã xây dựng khóa định loại của 28 loài trong chi Paecilomyces thu thập tại Trung Quốc. ___ 31
Đồ án tốt nghiệp ___ 1.3.2. Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc của nấm Paecilomyces sp có thể ở dạng thảm nhung, dạng bó sợi, có màu trắng, hồng nhạt, màu tím đinh hương (nên còn được gọi là nấm tím), màu nâu vàng, màu nâu xám, thỉnh thoảng có màu lục nhạt (tùy loài). Hình 1. 3: Đại thể nấm Paecilomyces spp (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, gốc cuống dạnh bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002). Hình 1. 4: Đặc điểm vi thể của nấm Paecilomyces lilacinus (Nguồn: ___ 32
Đồ án tốt nghiệp ___ 1.3.3. Đặc điểm sinh thái: Nấm Paecilomyces spp có phổ ký sinh côn trùng rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Chúng có thể dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ, và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như: Paecilomyces farinosus: gây bệnh nhiều loài côn trùng, phân bố rộng rãi nhiều vùng trên thế giới, đã được phân lập từ một số loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) ở nước ta (Tạ Kim Chính, 1996). Khuẩn lạc trên môi trường thạch Malt, nhiệt độ nuôi cấy 27oC, 10 ngày, đường kính 4 – 5 cm, mặt dạng bột, đôi chỗ dạng xếp bông nhẹ, trắng sau chuyển màu vàng nhạt với các bó sợi màu vàng. Giá bào tử trần hầu hết mọc từ các sợi nấm nên nhẵn, không màu, 1,0 – 2,5 x 100 - 300µm, mang 1 – 5 nhánh ở đỉnh và phần ngọn. Thể bình ở đỉnh hoặc các nhánh thành cụm. Bảo tử trần hình elip, hình thoi, đôi khi hình hạt chanh, 1,0 – 1,8 x 2 – 3µm, nhẵn, không màu, thành chuỗi. Trên côn trùng, P. farinosus có dạng lớp bột màu trắng, trắng vàng (Trần Văn Mão, 2002). Hình 1. 5: Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces farinosus Nguồn: Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson ( ___ ___ 33
Đồ án tốt nghiệp ___ Paecilomyces varioti: Khuẩn lạc trên môi trường thạch Malt (nhiệt độ nuôi cấy 27oC, 10 ngày), đường kính 6 – 8 cm, mặt dạng bột, đôi khi xốp bông hoặc có ít bó sợi, màu lục nâu, vàng lục. Giá bào tử trần nhẵn hoặc hơi xù xì, 4 – 7 x 12 – 30µm, mang các nhánh xếp thành vòng hoặc không đều. Thể bình 2,5 – 5,0 x 15 – 25µm mọc thành cụm 2 – 7 chiếc hoặc đơn độc, phần gốc hình trụ hoặc gần elip, phần cổ hình trụ dài. Bào tử trần hình gần trụ, hình elip, 2,5 – 4,0 x 3,5 – 5,0µm, nhẵn, không màu hoặc màu vàng nhạt thành chuỗi (Trần Văn Mão, 2002). Hình 1. 6: Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces varioti Nguồn: Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson Paecilomyces lilacinus( Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng ___ 34
Đồ án tốt nghiệp ___ 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phòng 27oC. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và Hình 1. 7: Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus Nguồn: Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson ( 1.3.4. Cơ chế tác động lên côn trùng: Nấm Paecilomyces sp. có một cơ chế lây nhiễm duy nhất là tấn công vào xoang máu thông qua lớp biểu bì hoặc có thể thông qua đường miệng côn trùng. Côn trùng chết là sự kết hợp từ các yếu tố như tổn thương mô cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do nấm tiết ra khi ở trong cơ thể côn trùng. Quá trình bám vào cơ thể côn trùng là một quá trình thụ động với sự giúp đỡ của gió và nước (Qian M. H., 2007) Bào tử nấm được phát tán trong tự nhiên, rơi trên thân côn trùng và dính chặt vào da côn trùng theo cơ chế bám dính không chuyên biệt thông qua tính kỵ nước ___ 35
Đồ án tốt nghiệp ___ của vách tế bào. Lớp kỵ nước này xuất hiện đặc biệt ở giai đoạn bào tử. Độ bám dính của các bào tử trên bề mặt biểu bì là nhờ lớp kỵ nước. Lectins, một loại cacbohydrate glycoprotein được phát hiện trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề mặt biểu bì của bào tử. Sau 24 giờ, gặp điều kiện thuận lợi bào tử nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm qua vỏ chitin và các lỗ thông hơi của côn trùng. Trong quá trình đó, sợi nấm tiết ra phức hệ enzyme phân huỷ protein, lipid, chitin của côn trùng. Các enzyme đó là exoproteases, endoproteases, esterases, lipase, chitinases và chitobiases. Trong đó, chitinases và endoprotease là hai emzym giữ vai trò quan trọng nhất (Sandhu S.S, 2012). Sau đó, sợi nấm phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiện tế bào nấm đầu tiên. Ở giai đoạn này, lympho của côn trùng chứa đầy sợi nấm, các hồng cầu bị phá vỡ, dinh dưỡng bị đình trệ. Đồng thời, độc tố nấm tác động vào hệ thần kinh và làm tê liệt hoạt động của côn trùng. Các ngoại độc tố với bản chất hóa học là destruxin A (C29H47O7N5) và destruxin B (C30H51O7N5) và overixin (C45H57O9N3), gây hiện tượng tê liệt thần kinh, phá huỷ quá trình hô hấp, làm cho côn trùng có những thay đổi về bệnh lý và chết. Sau khi côn trùng chết, nấm vẫn tiếp tục sinh trưởng phát triển trên xác của vật chủ, vì đây là nguồn cơ chất giàu hữu cơ (Yin Fei, 2010). 1.4. Một số kết quả nghiên cứu nấm Paecilomyces spp trừ sâu hại cây trồng: Nấm Paecilomyces spp. gây bệnh cho các loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy thường gây dịch bệnh trên ruộng đậu. Nấm Paecilomyces spp. còn được sử dụng để diệt sâu đo Trichoplusia ni, sâu xanh Spodoptera frugiperda, sâu ăn tạp Spodoptera litura (Yoshinori Tanada và Harry K. Kaya,1993). Nấm Paecilomyces spp. có hiệu quả cao đối với việc phòng trị sâu do có độc tố gọi là Mycotoxin. Ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã chứng minh được nếu sử dụng nấm Paecilomyces spp. với nồng độ 108 bào tử/ml chủng vào sâu non, sâu non sẽ chết sau 6-8 ngày. Khi chết xác sâu sẽ bị khô lại, sau đó nấm sẽ phát triển và cơ thể của sâu sẽ bị bao phủ bởi lớp nấm màu tím (Vimala Devi, P.S. 1994). Ngoài ra, người ta còn sử dụng nấm Paecilomyces spp. để phòng trừ sâu hại bông, sâu cuốn lá lúa, sâu đục thân bắp (Trần Văn Mão, 2002). ___ 36
Đồ án tốt nghiệp ___ Từ năm 2011 đến nay, nhóm nghiên cứu Nấm có ích thuộc Trung tâm đấu tranh sinh học, viện BVTV Việt Nam đã thu thập và khởi xướng nghiên cứu nấm Paecilomyces javanicus tại một số tỉnh đồng Bằng Bắc Bộ, đã đánh giá xác định loài nấm P. javanicus có tiềm năng ký sinh gây chết rầy nâu cao đạt từ 79,1% đến 84,4% trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới sau 10 ngày phun chế phẩm (Trần Văn Huy và cs., 2012). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế phẩm loài nấm có ích này vẫn còn khá hạn chế. Và chưa có sản phẩm nấm nào được thương mại hoá để trừ sâu hại cây trồng. 1.5. Một số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống: 1.5.1. Sản xuất enzyme: Paecilomyces spp. được biết đến như một chủng nấm sản xuất và cung cấp nguồn enzyme tiềm năng. Paecilomyces spp. tiết ra enzyme để dễ xâm nhập vào ký chủ hơn và giúp chúng phát triển nhờ thủy phân cơ chất hay thâm chí còn lấn át các loài vi sinh vật khác phát triển. Đã có nhiều nghiên cứu về sự sản sinh enzyme của Paecilomyces spp., nhiều nhất là về các enzyme hydrolase: protease, cellulase, dextranase Paecilomyces spp. sinh ra ba loại protease: acid, trung tính và kiềm. Các protease acid và trung tính có thể ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia và bánh kẹo. Protease kiềm thì ứng dụng trong công nghiệp thuộc da. Paecilomyces spp. thuộc nhóm nấm Ascomycetes có mặt trong đất, nước, không khí, gỗ, tàn dư thực vật, đất Paecilomyces spp. còn gọi là nấm thối mềm, vì chúng có khả năng phân hủy cellulose. Dextranase (α -1,6–D–glucan, 6glucanohydrolase; EC: 3.2.1.11) có nhiều ứng dụng trong y học và nền công nghiệp vì nó thủy phân dextran. Sự hiện diện của dextran có nhiều tác động tiêu cực ở mức độ chế biến như mất sucrose, tăng độ nhớt của quá trình siro và phục hồi kém của sucrose. Sử dụng dextran sẽ giải quyết được các vấn đề này. Dextranase có thể thủy phân hay ức chế quá trình tổng hợp glucans, có thể được sử dụng trong điều trị mảng bám răng. Nó cũng được sử dụng để tạo ra ___ 37
Đồ án tốt nghiệp ___ các dextran có trọng lượng phân tử thấp và gây độc cho tế bào. Hơn nữa, dextranase có ảnh hưởng tiêu cực đến sự tổng hợp isomaltooligosaccharides, chất ức chế hoạt động của các cơ chất có lợi cho vi khuẩn đường ruột probiotic. Và loại enzyme này cũng đã được tiết ra bởi nhiều loài nấm trong đó có nấm Paecilomyces spp. 1.5.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp: Paecilomyces spp. là nguồn quan trọng cho việc sản xuất các hợp chất thứ cấp. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng một số loài Paecilomyces spp. có thể tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học rất hữu ích. Fingolimod là hợp chất được tổng hợp dựa trên chất chuyển hóa thứ cấp do nấm tổng hợp là myriocin (ISP–I), là một chất ức chế miễn dịch mạnh đã được phê duyệt bởi FDA (U.S. Food and Drug Administration) như là một loại thuốc điều trị mới cho chứng đa sơ cứng. Fingolimod đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Tetsuro Fujita ở Đại học Kyoto (1992). ISP–Iđược thu nhận từ P. cicadae. Fingolimod có tiềm năng được sử dụng trong liệu pháp ghép cơ quan. Các nhà khoa học cho rằng nó có thể ngăn ngừa mạnh các phản ứng miễn dịch thông qua trung gian lympo bào để đáp ứng việc cấy ghép cơ quan mới. Ngoài ra, fingolimod còn được cho rắng làm tăng tế bào nội mô và bảo vệ chức năng của chúng. Một chất tương tự như anarcadic acid được tách chiết từ P. variotii. Hợp chất này lần đầu tiên được cô lập từ nguồn tự nhiên và được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chống lại các tác nhân gây bệnh cho người bao gồm cả các chủng đa kháng thuốc MDR (Multidrugresistan). Paecilomyces farinosus B05 đã được nghiên cứu để tách chiết các thành phần polysaccharide ngoại bào từ môi trường lên men và sản xuất để ứng dụng vào sản xuất các chất chống oxy hóa. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các polysaccharide được chiết xuất từ P. farinosus có hoạt tính chống oxy hóa cao, chỉ thấp hơn vitamin C một ít. ___ 38
Đồ án tốt nghiệp ___ 1.5.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật: Việc sử dụng các vi sinh vật tự nhiên để phòng trừ các dịch hại là một công việc quan trọng hiện nay trong ngành nông nghiệp vì sự an toàn, thân thiện với môi trường và hiệu quả cao. Ở Ai Cập đã sản xuất Priority - một sản phẩm từ P. fumosoroseus để diệt trừ các loại côn trùng. Đây là thuốc trừ sâu sinh học giúp diệt trừ bướm trắng để bảo vệ cây cà chua, dưa leo, cây cảnh. Sản phẩm chứa bào tử của chủng nấm P. fumosoroseus, và được xem là có khả năng lây nhiễm ở tất cả giai đoạn (trứng, ấu trùng, nhộng, bướm trưởng thành). Ngoài ra trên thị trường còn có một số sản phẩm như Pelicide, Bio - Nematon, PL Plus chứa bào tử nấm P. lilacinus nhằm phòng trừ tuyến trùng gây hại cho cây nằm trong đất. 1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp: Điều kiện cần thiết cho quá trình hình thành bào tử cũng như hệ sợi nấm côn trùng là ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, độ pH trong môi trường, cũng như phương pháp nuôi cấy. Quá trình tác động đến đất như sử dụng phân bón hữu cơ, thuốc trừ sâu hóa học đều có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của một số chủng vi nấm sống trong đất. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát tiển của nấm: - Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của nấm. Nếu môi trường không tốt nấm mọc yếu hoặc không mọc và sẽ hạn chế khả năng gây bệnh đối với côn trùng. Trong quá trình hình thành bào tử, nấm cần các nguồn C, N. Các nguồn Carbon đã được nghiên cứu ảnh hưởng là: glucose, sucrose, arabinose, mannose và acid citric đều ảnh hưởng đến sự phát triển của Paecilomyces spp. (Bharati et al., 2007). Kết quả cuối cùng thu được: sucrose là cơ chất tốt nhất (87,25 cm) cho sự tăng trưởng; tiếp theo là glucose (56,25 cm). Mannose có khả năng thấp nhất, các cơ chất khác có tác dụng vừa phải. Còn đối với nguồn Ni-tơ, Bharati et al. (2007) đã sử dụng các nguồn Nitơ thử nghiệm: ammonium photphase, sodium nitrate, glycin, calcium nitrate, ammonium nitrate để nghiên cứu khả ___ 39
Đồ án tốt nghiệp ___ năng sử dụng Nitơ của Paecilomyces spp. Kết quả thu được Calcium nitrate là nguồn Nitơ tốt nhất rồi đến glycin, natri nitrate, ammonium nitrate. Ammonium phosphate được vi nấm sử dụng ít nhất. - Ảnh hưởng của ẩm độ và nhiệt độ là yếu tố cần cho sự hình thành và phát triển của bào tử nấm Paecilomyces spp: Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 – 250C, nhưng ở 250C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999), còn nhiệt độ phù hợp cho sự hình thành bào tử lại là ở 240C. Đối với nấm Paecilomyces papillata, khi lây nhiễm thì ở 180C có tỷ lệ ký sinh cao hơn đến 18% so với nhiệt độ 250C. Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình dị hóa, tăng quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần văn Mão, 2002). Gần đây, Statbers, T.E, D.Moore và C.Prior (2004) đã cho công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. và xác định loài này thích hợp ở nhiệt độ 280C (Phạm Thị Thùy, 2004). Nếu nhiệt độ quá cao thì bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành. Julio J.D et al. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12, 16 và 300C. Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn công vào cơ thể côn trùng nếu gặp điều kiện không thích hợp về nhiệt và ẩm độ hay ánh sáng thì sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường (Penland, 1982). Ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80 - 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Độ ẩm cao sẽ có lợi cho sự sinh trưởng của sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử. Tuy nhiên, độ ẩm thấp sẽ duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm có khả năng sống lâu trong điều kiện độ ẩm từ 0 - 34% hơn là khi ẩm độ 75% (Trần Văn Mão, 2002). - Ảnh hưởng của ánh sáng: Nấm côn trùng phát triển tốt trong điều kiện phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong thời gian 6 - 8 giờ cũng đủ cho nấm côn trùng phát triển. Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình sinh bào tử của nấm. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp. sẽ không tạo nhiều bào tử. Theo như nghiên cứu của Li Gao et al (2009) thì thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng đến sự phát triển nấm ___ 40
Đồ án tốt nghiệp ___ và hình thành bào tử đối với Paecilomyces lilicinus IPC - P, cụ thể như sau: nấm phát triển tốt nhất ở điều kiện tối hoàn toàn (49,96 mg/cm2), còn ở điều kiện 12h sáng/12h tối thì thấp hơn rất nhiều (29,75 mg/cm2). Tương tự cho sự hình thành bào tử, ở điều kiện tối hoàn toàn thì bào tử tạo thành nhiều nhất 91,7.105 bào tử/cm2; trong điều kiện 12h sáng/12h tối thì thấp hơn (46,79 bào tử/cm2). Đối với chủng P. lilacinus M-14 thì trong điều kiện tối hoàn toàn nấm phát triển tốt (56,58 mg/cm2); còn điều kiện 12h sáng/12h tối nấm đạt giá trị 55,05 mg/cm2. Đối với sự hình thành bào tử thì lượng bào tử tạo thành nhiều ở điều kiện 12h sáng/ 12 tối (121,57.105 bào tử/cm2); còn ở điều kiện tối hoàn toàn thì lượng bào tử tạo thành thấp hơn (55,91. 105 bào tử/cm2). - Ảnh hưởng của độ pH: thường nấm sống trong phạm vi pH = 3,5 - 8. Nhưng nấm côn trùng ưa pH acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 - 6. Theo như nghiên cứu của Sung Mi Shim et al. (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P. fumosoroseus nằm trong khoảng 6 - 9, còn nấm P. japonica phát triển tối ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003). - Ảnh hưởng của độ thoáng khí: nấm côn trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí, khi nấm phát triển chúng đòi hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt. – Ảnh hưởng của Nitrogen đến sự hình thành và phát triển của bào tử nấm Paecilomyces spp. Nitrogen tham gia vào các thành phần cấu trúc nên tế bào vi sinh vật, giúp tế bào hoàn thiện được mọi chức năng của hoạt động sống. Nguồn nitrogen là nguồn dinh dưỡng quan trọng không kém gì nguồn cacbon. Nitrogen được cung cấp cho tế bào dưới nhiều dạng khác nhau: Dưới dạng các hợp chất vô cơ và hữu cơ khá thuần khiết như: NH4+, NO3-, pepton, các amino acid. ___ 41
Đồ án tốt nghiệp ___ CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ ngày 3/2018 đến ngày 10/8/2018 tại phòng thí nghiệm của trường. 2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu: 2.2.1. Thiết bị - hóa chất: 2.2.1.1. Thiết bị: - Nồi hấp khử trùng - Đĩa petri - Máy đo quang phổ UV-Vis - Micropipet 2550 - Erlen - Máy ly tâm Universal 320 - Hộp nuôi côn trùng. - Que cấy điểm - Lame đếm Thoma, kính hiển - Đèn cồn vi, kính lúp sôi nổi, máy lắc - Ống nghiệm Voltex. - Falcon - Pipet, cốc thủy tinh, micropipet - Đũa thủy tinh 1000µl, 100µl và đầu tuýp. - Kính hiển vi quang học - Bông thấm nước, bông không - Dao cấy thấm nước - Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm - Bao nhựa, dây thun, giấy báo 2.2.1.2. Hóa chất: - Dịch TCA 5% - KNO3 - Lugol - NaCl - - Tween 80 FeSO4.7H2O - Cồn 960, 700 - Glucose - Methylene blue - Pepton - MgSO4.7H2O - KCl - K2HPO4 - CaCl2 – NaNO3 ___ 42
Đồ án tốt nghiệp ___ 2.2.2. Vật liệu: Nguồn bọ phấn phấn trắng được thu từ vườn cây khoai mì (cây sắn) của nhà dân ở Xã Tân Hưng, Huyện Tân Châu, Tây Ninh. Rầy xanh 2 chấm thu tại vườn đậu băp ở Củ Chi và Bình Chánh của nhà dân. Gạo tấm mua ở chợ Thủ Đức. 2.2.3. Các môi trường sử dụng: 2.2.3.1. Môi trường phân lập nấm: PDA (Potato D - Glucose Agar): D-glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml Cách chuẩn bị dịch chiết khoai tây: Cân 200 g khoai tây đã được gọt vỏ, sau đó thái nhỏ thành hình vuông. Đong vào cốc thủy tinh 1000ml nước cất, thêm khoai tây đã thái ở trên vào đun sôi trong 20 phút. Sau đó, để nguội, dùng bông thấm nước lọc phần dịch, gạn bỏ phần xác khoai tây để thu dịch chiết khoai tây, bổ sung agar và đường theo tỉ lệ và đem hấp khử trùng ở 1210C, 1atm, trong 15 phút. Song song đó chuẩn bị các đĩa Petri đã được rửa sạch và sấy khô, đem gói bằng giấy báo, rồi đem hấp khử trùng ở 1210C, 1atm, trong 15 phút. Đổ môi trường ra đĩa petri và chờ thạch đông trong 15 phút, sau đó đem bảo quản, sẵn sàng cho sử dụng. 2.2.3.2. Môi trường PSA (Potato Sucrose Agar): Sucrose 20 g Agar 20 g Khoai tây 200 g Phần chuẩn bị môi trường cũng được tiến hành tương tự như đã nêu ở phần trên. 2.2.3.3. Môi trường thử nghiệm hoạt tính protase sử dụng casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thương, 2001): Casein 1 % MgSO4.7H2O 3 g K2HPO4 3 g ___ 43
Đồ án tốt nghiệp ___ KNO3 1 g NaCl 0,5 g FeSO4.7H2O 0,01 g Agar 15 g Chloramphenicol 0,1 g Nước cất: bổ sung cho đủ 1000ml 2.2.3.4. Môi trường định tính sự sinh tổng hợp enzyme chitinase (Lê Thị Huệ, 2010): NaNO3 3,5 g K2HPO4 1,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g KCl 0,5 g FeSO4.7H2O 0,01 g Cloramphenicol 0,005 g Bổ sung dịch chitin huyền phù 1% đến 1000ml Cách pha dịch chitin huyền phù 1%: Theo phương pháp của Dai et al. 2011 (dẫn theo Nguyễn Thị Hà, 2012) dung dịch chitin huyền phù 1% được chuẩn bị như sau: 1g bột chitin được cho dần vào 20ml HCl đậm đặc, để ở 40C và để qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 50ml ethanol (-200C) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 5000 vòng/phút, trong 20 phút, thu lấy tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi pH trung tính. Thu dịch huyền phù và bổ sung nước cất đến 100ml. 2.2.3.5. Môi trường Czapeck – Dox: Glucose 1 % NaNO3 3,5 g K2HPO4 1,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g KCl 0,5 g FeSO4.7H2O 0,01 g Agar 20 g ___ 44
Đồ án tốt nghiệp ___ Bổ sung nước cất đến 1000ml 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 2.3.1. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Paecilomyces sp. trên môi trường thạch (Nguyễn Thị Hà, 2012): Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung chitin 1% làm chất cảm ứng, nấm sợi sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn là N-acetyl- D-glucosamine. Các dạng đơn phân này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol. Do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt bao quanh nấm phản ảnh khả năng sinh tổng hợp chitinase. Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng đã hấp ở 1210C trong 15 phút, cho môi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cho thuốc thử Lugol vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ Lugol đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân giải và đường kính nấm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri. 2.3.2. Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm Paecilomyces sp trên môi trường thạch: Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung casein 1%, nấm sợi sẽ sinh enzyme protease phân giải casein thành các amino acid. Các dạng amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 5%, chỉ có casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 5%. Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng đã hấp ở 1210C trong 15 phút, cho môi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cho thuốc thử TCA 5% vào, để yên 10 phút ___ 45
Đồ án tốt nghiệp ___ rồi sau đó đổ thuốc thử đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân giải và đường kính nấm. 2.3.3. Xác định lượng nước bổ sung vào cơ chất trong sản xuất nấm Paecilomyces lilacinus: Thí nghiệm bố trí trên gạo tấm với lượng nước bổ sung tương ứng là 40ml, 50ml và 60ml. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần là 1 túi PE chứa 100g gạo tấm. CT1: 40ml CT3: 60ml CT2: 50ml Cách thực hiện: Xác định độ ẩm ban đầu của gạo tấm sau đó cho nước vào và ngâm 2h sao cho đạt độ ẩm theo bố trí ở trên rồi cho gạo vào hấp khử trùng. Để gạo hấp nguội và cấy giống với tỷ lệ 10ml/100g. Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 14 ngày. Sau đó, lấy mẫu cho vào nước muối sinh lý, pha loãng và cấy trang để tính mật độ bào tử có trong 1g chế phẩm. Chỉ tiêu theo dõi: Lượng bào tử (bào tử/g) 2.3.4. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ bổ sung vào môi trường gạo tấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus: Chuẩn bị chất bổ sung: Hòa 0,1mol NH4NO3, (NH4)2SO4, urea- (NH2)2CO (riêng đối với NH4Cl thì hòa 0,2mol) vào 40ml nước cất. Chuẩn bị môi trường: Gạo tấm có độ ẩm ban đầu 10% được cho vào các túi PE chịu nhiệt, mỗi bọc là 100g cơ chất. Bổ sung 40ml dung dịch nitơ theo các nghiệm thức: CT1: NH4NO3 CT3: urea- (NH2)2CO CT2:(NH4)2SO4 CT4: NH4Cl CT5: Đối chứng là môi trường gạo tấm không bổ sung nitơ. Mỗi Công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần là 1 túi PE chứa 100g gạo tấm. Tạo dịch huyền phù bào tử nấm (nt), mật độ 108 bào tử/ml. Cấy dịch huyền phù bào tử nấm vào môi trường: với tỷ lệ 10ml/ 100g cơ chất. Ủ ở nhiệt độ phòng, sau 14 ngày, thu lấy bào tử, và kiểm tra mật độ bào tử bằng buồng đếm hồng cầu hoặc cây trang. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. ___ 46
Đồ án tốt nghiệp ___ 2.3.5. Ảnh hưởng của nguồn Khoáng bổ sung vào môi trường gạo tấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus: Nghiệm thức: CT1: Bổ sung Czapek CT3: Bổ sung MgSO4 CT2: Bổ sung KH2PO4 CT4: Không bổ sung Mỗi Công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần là 1 túi PE chứa 100g gạo tấm. Chuẩn bị dung dịch khoáng: Cân 25g các chất khoáng cho vào 1 lít nước cất để được dung dịch khoáng 2,5%. Môi trường gạo tấm được hấp khử trùng và cho vào các túi PE, bổ sung nguồn khoáng lần lượt là Czapek, KH2PO4, MgSO4 tỷ lệ 1% tương ứng với 3 nghiệm thức. Đối chứng là môi trường gạo tấm không bổ sung khoáng. Mỗi Công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần là 1 túi PE chứa 100g gạo tấm. Tạo dịch huyền phù bào tử nấm (nt), mật độ 108 bào tử/ml Cấy dịch huyền phù bào tử nấm vào môi trường: với tỷ lệ 10ml/ 100g cơ chất và ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 14 ngày, thu lấy bào tử, kiểm tra mật độ trong buồng đếm hồng cầu hoặc cấy trang. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 2.3.6. Xác định nhiệt độ sấy phù hợp để tạo chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus: Nấm Paecilomyces lilacinus được nhân lên trong môi trường gạo tấm trong các túi PE. Sau đó chia ra thành các phần tương ứng với các mức nhiệt độ sấy là 40, 50 và 600C và sấy khô (ẩm độ <10%) (sấy trong tủ sấy). Sau đó, lấy 1g chế phẩm pha loãng ở các nồng độ và đem trang để tính số bào tử nẩy mầm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần là 100g. 2.3.7. Đánh giá hiệu quả trừ rầy xanh trên cây đậ u bắp của chủng nấm Paecilomyces trong điều kiện phòng thí nghiệm: Trong phòng thí nghiệm. Tiến hành theo phương pháp của Ayhan và Kubilay (2005) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. ___ 47
Đồ án tốt nghiệp ___ Thu thập các lá đậu bắp có rầy trưởng thành về nuôi. Sau khi âu trùng tuổi 2 của thế hệ thứ nhất thu từ các cây đậu bắp ở trong lồng được sử dụng để làm thí nghiệm. Thu lá đậu bắp có sẵn ấu trùng bọ phấn tuổi 2 được bỏ các hộp có nắp đậy được đục lỗ. Sau đó, hút 1ml phân NPK 16:16:8 nồng độ (0,66g/ml) cho vào bông thấm nước quấn trên cuống lá giúp lá tươi lâu hơn. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 2 công thức: CT1: Phun nước cất CT2: Phun dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces sp có nồng độ 2,1×108 bào tử/ml. 2.3.8. Đánh giá khả năng gây chết Bọ phấn trắng Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài đồng: v Trong phòng thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức: CT1: Phun chế phẩm nấm nồng độ 1g/ml (tương ứng với nồng độ bào tử là 107 bào tử/ml). CT 2: Phun nước cất. Thu bọ phấn trắng trên đồng sắn không phun thuốc hóa học và chế phẩm sinh học để trừ sâu, bệnh và đem về nuôi trên lá sắn ở phòng thí nghiệm, cuống lá được quấn bằng bông hút ẩm để giữ lá tươi, không bị héo. Tiến hành phun chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus hằng ngày quan sát và thu bọ phấn bị chết. Các cá thể bọ phấn bị chết được cho vào đĩa petri có đặt giấy hút ẩm. Tiến hành thu thập cá thể bị chết và được bao bọc bởi sợi nấm màu trắng. Sau đó tiến hành phân lập nấm ký sinh trên môi trường PDA theo phương pháp của Lawrence (1997) để khẳng định lại tác nhân gây chết. Hiệu lực gây chết bọ phấn được tính theo công thức công thức Abbot (1925). v Ngoài đồng: Điều tra tình hình bệnh khảm lá sắn: ___ 48
Đồ án tốt nghiệp ___ Việc điều tra được tiến hành từ 28/03/2018 đến 28/04/2018 tại Xã Tân Hưng, Tân Phú, Tân Bình, Thạnh Tân, huyện Tân Châu và xã Suối Đá huyện Dương Minh Châu. Định kỳ điều tra: 7 ngày/lần Số điểm điều tra: 10 điểm, tương ứng với 10 ruộng ở các xã của huyện, Mỗi ruộng điều tra 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra ngẫu nhiên 100 cây và đánh giá mức độ nhiễm bệnh theo QCVN 01-62: Không nhiễm ( 76% số cây có vết bệnh). Đánh giá cấp bệnh từ 0 – 4 theo Zang et al (2005): (0, không có biểu hiện bệnh; 1, vết khảm chưa rõ ràng; 2, lá vàng và có rút 5 - 10% kích thước lá; 3, lá bị khảm nặng, cong queo và giảm đến 50% diện tích lá; 4, Khảm nặng, lá co rút, méo mó và giảm 50-80% diện tích lá). Điều tra mật độ bọ phấn trên lá sắn: Việc điều tra mật độ bọ phấn dựa vào QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT và có điều chỉnh cho phù hợp. Việc điều tra được tiến hành tại huyện Tân Châu tỉnh Tây Ninh. Chọn 5 ruộng đại diện cho vùng, mỗi ruộng điều tra 50 cây nằm trên hai đường chéo góc. Mỗi cây điều tra 10 lá phân bố đều trên toàn cây. Đếm số bọ phấn non có trên các lá. Định kỳ điều tra 7 ngày/lần. Thí nghiệm bố trí trên diện rộng tại xã Tân Hưng, huyện Tân Châu và có nhắc lại 3 lần. Diện tích ô là 500m2 gồm có các công thức sau: CT1: Đối chứng: Không phun thuốc CT2: Phun chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus liều lượng 1,2kg/ha, với lượng nước phun là 600 lít/ha, tương đương với nồng độ nấm là 2 x 107 CFU/ml. ___ 49
Đồ án tốt nghiệp ___ CT3: Phun thuốc Hopkill (Fenobucarb) 50ND liều lượng 1,8 lít/ha. Lượng nước phun là 600 lít/ha. Tiến hành điều tra mật độ bọ phấn trên cây sắn vào thời điểm trước phun và sau phun lần thứ nhất 1 tuần. Sau phun tuần thứ nhất, tiến hành điều tra, nếu mật độ bọ phấn còn cao (do trứng nở ra) thì tiếp tục phun lần 2. Hiệu lực gây chết bọ phấn được tính theo công thức Henderson- Tilton (1955). 2.4. Phướng pháp xử lý số liệu: Dùng phần mềm SAS 9.1.3 và Excel 2016 để xử lý số liệu có được. Tiến hành xử lý số liệu thống kê trong SAS 9.4 (Statistical Analysis System) theo trình tự: - Xử lý số liệu của kết quả nghiên cứu - So sánh các tham số đặc trưng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu. Phép phân tích phương sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với độ tin cậy 95%. ___ 50
Đồ án tốt nghiệp ___ CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khả năng sinh tổng hợp enyme của nấm Paecilomyces lilacinus: Lớp cuticle của côn trùng cấu tạo chủ yếu từ protein, chitin và lipid và nấm trừ côn trùng phải có khả năng sinh các enzyme ngoại bào để thủy phân protein, chitin và lipid (Charnley và St. Leger, 1991; St leger et al, 1996). Nhiều nghiên cứu khác nhau đều cho rằng khả năng sinh protease và chitinase là tiêu chí chủ yếu để xác định khả năng diệt côn trùng của các loài nấm ký sinh côn trùng (Fang et al., 2007; Gillespie et al., 1998; Gillispie et all., 2000; Young et al., 2007). 3.1.1. Khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường thạch. Bảng 3. 1: Đường kính vòng phân giải chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. Chitinase Đĩa D (cm) d (cm) D - d (cm) 1 1.5 1.15 0.35 2 1.5 1.2 0.3 3 1.9 1.6 0.3 4 1.7 1.45 0.25 5 1.7 1.4 0.3 Trung bình 1.66 1.36 0.3 Chú thích: Đường kính vòng phân giải (D), đường kính nấm (d) của nấm Paecilomyces lilacinus Hình 3. 1: Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus (vòng phân giải chitin của nấm Paecilomyces lilacinus qua 4 ngày sau cấy) ___ 51
Đồ án tốt nghiệp ___ Số liệu Bảng 3.1 và Hình 3.1 cho thấy nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng sinh enzyme chitinase. Ngày thứ 4 sau khi cấy, đường kính vòng phân giải trung bình của nấm đã đạt 1.66cm. Điều này cho thấy, nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase, enzyme cần thiết đối với nấm ký sinh côn trùng. 3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp protease của nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường thạch. Bảng 3. 2: Đường kính vòng phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus. protease Đĩa D (cm) d (cm) D - d (cm) 1 3 1.5 1.5 2 3.1 1.7 1.4 3 3.4 1.7 1.7 4 3 1.6 1.4 5 3 1.7 1.3 Trung bình 3.1 1.64 1.46 Chú thích: Đường kính vòng phân giải (D), đường kính nấm (d) của nấm Paecilomyces lilacinus Hình 3. 2: Khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus (vòng phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus qua 4 ngày sau cấy) ___ 52
Đồ án tốt nghiệp ___ Số liệu Bảng 3.2 và hình 3.2 cho thấy nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng sinh enzyme protease. Ngày thứ 4 sau khi cấy, đường kính vòng phân giải trung bình của nấm đã đạt 3.1cm. Điều này cho thấy, nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease, enzyme cần thiết đối với nấm ký sinh côn trùng. Như vậy, nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng sinh enzyme protease và chitnase, đáp ứng được yêu cầu của nấm ký sinh côn trùng. 3.2. Xác định lượng nước bổ sung vào cơ chất trong sản xuất nấm Paecilomyces lilacinus: Nhóm thực hiện trên cơ chất là Gạo tấm. (Đỗ Anh Duy, 2016) 3.2.1. Xác định độ ẩm cơ chất – Gạo tấm: Bảng 3. 3: Kết quả đo độ ẩm cơ chất (Gạo tấm) bằng tủ sấy. mo (g) m đĩa (g) m sau (g) W (%) Đĩ a 1 3.0044 43.5916 46.2466 11.63 Đĩa 2 3.0052 45.1152 47.7778 11.40 Đĩa 3 3.0026 45.4350 48.0807 11.89 Hình 3. 3: Gạo tấm sấy 11.64% trong tủ sấy ở 105oC Sử dụng cân sấy ẩm KERN DBS ð W = 10,15% Như vậy độ ẩm ban đầu của cơ chất (Gạo tấm) đạt 10,15%. Hình 3. 4: Gạo tấm sấy bằng cân sấy ẩm KERN DBS ___ 53
Đồ án tốt nghiệp ___ 3.2.2. Xác định lượng nước bổ sung vào cơ chất để nhân sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus: Lượng nước bổ sung vào cơ chất ảnh hưởng rất lớn tới mật độ bào tử sau khi nhân nuôi, nếu lượng nước quá ít, sẽ làm gạo bị khét trong khi hấp khử trùng, không cung cấp đủ nước cho nấm sinh trưởng và phát triển. Ngược lại khi lượng nước quá nhiều, môi trường bị nhão và dính bết lại, hạn chế sự trao đổi oxy của nấm với môi trường bên ngoài. Do đó, thí nghiệm này nhằm mục đích xác định lượng nước bổ sung thích hợp cho quy trình nhân nuôi nấm Paecilomyces lilacinus. Hình 3. 5: Môi trường tăng sinh lỏng (Cz). Dịch huyền phù bào tử nấm 10ml dịch Hình 3. 6: Sinh khối nấm được nhân sinh khối trên môi trường gạo tấm tương ứng với các lượng nước 40ml, 50ml, 60ml. ___ 54
Đồ án tốt nghiệp ___ Bảng 3. 4: Sự sinh trưởng của nấm Paecilomyces lilacinus ở các lượng nước bổ sung. Lượng nước Mật độ (Cfu/g cơ chất) Log mật độ bào tử 40ml 2,08x1010 10,32b 50ml 3,68x1010 10,57a 60ml 1,43x109 9,15c LSD 0,1 0,01 CV(%) 3,7 Số liệu ở Bảng 3.4 cho thấy, bổ sung 50ml nước vào gạo tấm là thích hợp nhất cho chủng nấm Paecilomyces lilacinus phát triển. Mật độ bào tử nấm đạt xấp xỉ 3,68x1010 CFU/g cơ chất khi nhân nuôi trên môi trường gạo tấm với mức lượng nước bổ sung là 50ml. Trong môi trường tương tự, mật độ bào tử chỉ đạt 2,08x1010 CFU/g cơ chất khi bổ sung 40ml nước và đạt thấp nhất là 60ml (1,43x109CFU/g cơ chất). Hình 3. 7: Kết quả cấy trang kiểm tra mật độ bào tử nấm tương ứng với các lượng nước 40ml, 50ml, 60ml. ___ 55
Đồ án tốt nghiệp ___ 3.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ bổ sung vào môi trường gạo tấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus: Nguồn Nito cũng ảnh hưởng một phần đến tới mật độ bào tử sau khi nhân nuôi, nếu nguồn Nito thích hợp sẽ làm nấm phát triển tốt trên môi trường nhân sinh khối. Ngược lại khi nguồn Nito không thích hợp sẽ làm nấm phát triển không tốt trên môi trường nhân sinh khối. Do đó, thí nghiệm này nhằm mục đích xác định nguồn Nito bổ sung thích hợp cho quy trình nhân nuôi nấm Paecilomyces lilacinus. Hình 3. 8: Sinh khối nấm được nhân sinh khối trên môi trường gạo tấm với lượng nước bổ sung là 50ml và được bổ sung các nguồn Nito khác nhau. ___ 56
Đồ án tốt nghiệp ___ Bảng 3. 5: Sự sinh trưởng của nấm Paecilomyces lilacinus ở các nguồn Nito. Nguồn Nito Mật độ (Cfu/g cơ chất) Log mật độ bào tử 10 NH4NO3 4,97x10 10,69 b 10 NH4Cl 4,63x10 10,66b 11 (NH4)2SO4 2,1x10 11,32a (NH2)2CO 0 0c LSD0,01 0,1 CV(%) 3,5 Số liệu ở Bảng 3.5 cho thấy, trong 4 nguồn Nito đã khảo sát, (NH4)2SO4 là thích hợp nhất cho chủng nấm Paecilomyces lilacinus phát triển. Mật độ bào tử nấm đạt xấp xỉ 2,1x1011 CFU/g (cơ chất) khi nhân nuôi trên môi trường gạo tấm với lượng nước bổ sung là 50ml. Trong môi trường điều kiện tương tự, mật độ bào tử 10 chỉ đạt 4,97x10 CFU/g (cơ chất) ở nguồn nito là NH4NO3, tiếp đến là NH4Cl với 10 mật độ bào tử đạt 4,63x10 CFU/g (cơ chất) và đạt thấp nhất là ở (NH2)2CO khi nấm không sinh trưởng. Hình 3. 9: Kết quả cấy trang kiểm tra mật độ bào tử nấm của các nguồn Nito ___ 57
Đồ án tốt nghiệp ___ 3.4. Ảnh hưởng của nguồn Khoáng bổ sung vào môi trường gạo tấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus: Nguồn Khoáng cũng ảnh hưởng một phần đến tới mật độ bào tử sau khi nhân nuôi, nếu nguồn Khoáng thích hợp sẽ làm nấm phát triển tốt trên môi trường nhân sinh khối. Ngược lại khi nguồn Khoáng không thích hợp sẽ làm nấm phát triển không tốt trên môi trường nhân sinh khối. Do đó, thí nghiệm này nhằm mục đích xác định nguồn khoáng bổ sung thích hợp cho quy trình nhân nuôi nấm Paecilomyces lilacinus. Hình 3. 10: Sinh khối nấm được nhân sinh khối trên môi trường gạo tấm với lượng nước bổ sung là 50ml và được bổ sung các nguồn Khoáng khác nhau ___ 58
Đồ án tốt nghiệp ___ Bảng 3. 6: Sự sinh trưởng của nấm Paecilomyces lilacinus ở các nguồn Khoáng. Nguồn khoáng Mật độ (Cfu/g cơ chất) Log mật độ bào tử Cz 5,03x1010 10,70a 10 MgSO4 1,67x10 10,21b 10 KH2PO4 5,53x10 10,71a LSD0,01 0,5 CV(%) 3,7 Số liệu ở Bảng 3.6 cho thấy, trong 3 nguồn khoáng đã khảo sát, Cz và KH2PO4 là thích hợp nhất cho chủng nấm Paecilomyces lilacinus phát triển. Mật độ bào tử nấm đạt xấp xỉ 5,03x1010 CFU/g(cơ chất) và 5,53x1010 CFU/g (cơ chất) khi nhân nuôi trên môi trường gạo tấm với lượng nước bổ sung là 50ml. Trong môi trường điều kiện tương tự, mật độ bào tử chỉ đạt 1,67x1010 CFU/g (cơ chất) ở nguồn khoáng là MgSO4 Hình 3. 11: Kết quả cấy trang kiểm tra m ật độ bào tử nấm của các nguồn Khoáng ___ 59
Đồ án tốt nghiệp ___ 3.5. Xác định nhiệt độ sấy phù hợp để tạo chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus: Nhiệt độ sấy đối với chế phẩm nấm là khâu rất quan trọng vì nếu nhiệt độ sấy quá cao sẽ làm giảm đi mật độ bào tử trong chế phẩm. Ngược lại nhiệt độ quá thấp sẽ không đủ nhiệt để sấy khô chế phẩm điều này sẽ gây khó khăn trong việc xay và tạo chế phẩm. Việc khảo sát nhiệt độ sấy nhóm sử dụng bịch chế phẩm khảo sát nguồn Nito để khảo sát nhiệt độ sấy ((NH4)2SO4) Hình 3. 12: Chế phẩm nấm sử dụng cân sấy ẩm KERN DBS để đo độ ẩm ___ 60
Đồ án tốt nghiệp ___ Bảng 3. 7: Các mức nhiệt độ sấy của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. Nhiệt độ sấy Mật độ (Cfu/g cơ chất) Log mật độ bào tử 40oC 9,63x1010 10,98a 50oC 4,83x1010 10,67a o 10 60 C 1,77x10 10,22b LSD0,01 0,4 CV(%) 3,7 Số liệu ở Bảng 3.7 cho thấy, trong 3 mức nhiệt độ sấy đã khảo sát, 40oC và o 50 C là thích hợp nhất cho chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. Mật độ bào tử nấm đạt xấp xỉ 9,63x1010CFU/g (cơ chất) và 4,83x1010CFU/g (cơ chất). Còn lại là 60oC mật độ bào tử chỉ đạt 1,77x1010CFU/g. Hình 3. 13: Kết quả cấy trang kiểm tra m ật độ bào tử nấm ở các mức nhiệt độ sấy ___ 61
Đồ án tốt nghiệp ___ 3.6. Đánh giá hiệu quả trừ rầy xanh Amrasca devastans trên cây đậu bắp của chủng nấm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm: Hình 3. 14: Rầy xanh trên lá đậu bắp ___ 62
Đồ án tốt nghiệp ___ Bảng 3. 8: Hiệu lực gây chết Rầy xanh trong điều kiện phòng thí nghiệm của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacnus. Số Rầy xanh còn sống Công thức Trước phun Sau phun 4 ngày Hiệu lực (%) 1. Đối chứng 31 28 - 2. Phun chế phẩm 31 10 64.3% Hình 3. 15: Rầy xanh bị nấm ký sinh và cành bào tử mọc ra từ Rầy xanh bị chết khi nhìn dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x và 100x ___ 63
Đồ án tốt nghiệp ___ Rầy xanh (Amrasca devastans) là dịch hại nguy hiểm trên nhiều loại cây trồng. Trên cây đậu bắp, rầy xanh là đối tượng gây hại chính, ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng, phát triển và khả năng cho năng suất của cây đậu bắp. Để phòng trừ rầy xanh, kể từ khi cây còn nhỏ cho đến khi mang trái, nông dân phải phun thuốc trừ sâu liên tục với định kỳ 3-5 ngày/lần và chỉ ngừng thu hoạch khi cây đã già. Kết quả thử nghiệm hiệu lực trừ rầy xanh hại đậu bắp của chế phẩm nấm P. lilacinus cho thấy, ấu trùng rầy non khá mẫm cảm với chế phẩm nấm. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, hiệu lực gây chết rầy xanh đạt trung bình 64% ở 4 ngày sau phun nấm. Hiệu lực này cũng xấp xỉ so với với hiệu lực gây chết trên rầy nâu hại lúa (Nilaparvata lugens) trong nghiên cứu trước của Đỗ Anh Duy (2016). Bên cạnh đó, kiểm tra bên trong cơ thể rầy xanh bị chết dưới kính hiển vi, dễ dàng nhận thấy sự lấp đầy khoang cơ thể của sợi nấm và cũng dễ dàng nhận thấy sợi nấm, cành bào tử và bào tử phủ đầy trên cơ thể các cá thể rầy xanh bị chết (hình 3.15) Như vậy, chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng gây chết rầy xanh (Amrasca devastans) hại đậu bắp.trong điều kiện invitro. ___ 64
Đồ án tốt nghiệp ___ 3.7. Đánh giá khả năng gây chết Bọ phấn trắng Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài đồng: 3.7.1. Đánh giá khả năng gây chết Bọ phấn trắng Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm: Bảng 3. 9: Hiệu lực gây chết bọ phấn trong điều kiện phòng thí nghiệm của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacnus. Công thức Số bọ phấn còn sống Trước phun Sau phun 4 ngày Hiệu lực (%) 1. Đối chứng 50 47 - 2. Phun chế phẩm 50 6 87,3 Ghi chú: Hiệu lực được tính theo công thức Abbot (1925) Số liệu ở Bảng 3.9 cho thấy, hiệu lực gây chết bọ phấn Bemisia tabaci của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus chậm nhưng rất cao. Ở 4 ngày sau khi nhiễm tỷ lệ gây chết đạt 87,3%. Điều này cho thấy rằng nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng diệt bọ phấn trắng rất cao. Hình 3. 16: Bọ phấn trắng chết trên lá sắn ___ 65
Đồ án tốt nghiệp ___ A B Hình 3. 17: Bọ phấn bị nấm ký sinh (a) và cành bào tử (b) mọc ra từ bọ phấn bị chết khi nhìn dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x và 100x Hình 3. 18: Nấm Paecilomyces lilacinus được hoạt hoá từ Bọ phấn trắng ___ 66
Đồ án tốt nghiệp ___ 3.7.2. Đánh giá khả năng gây chết Bọ phấn trắng Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus ở Ngoài đồng: 3.7.2.1. Tình hình bệnh khảm lá Sắn tại Tây Ninh: Việc điều tra được tiến hành từ ngày 28/03/2018 đến 28/04/2018 tại huyện Tân Châu một huyện biên giới có diện tích trồng mì cao nhất tỉnh và xã Suối Đá huyện Dương Minh Châu. Số liệu ở Bảng 3.10 cho thấy, hầu hết các ruộng khoai mì đều bị bệnh từ trung bình đến nặng theo thang đánh giá của Zang et al (2005). Theo Legg et al., 2006, đây một trong những bệnh virus hại cây trồng nguy hiểm nhất trên thế giới. Vì vậy cần có biện pháp Hình 3. 19: Sinh viên điều tra bọ hữu hiệu để quản lý loài dịch hại này, tránh lây lan phấn và khảm lá sắn tại Tây Ninh cho cây sắn ở các vùng khác cũng như lây lan cho vụ sau. Hình 3. 21: Ruộng thí nghiệm được Hình 3. 20: Cây Sắn bị khảm lá bố trí tại Tân Châu, Tây Ninh ___ 67
Đồ án tốt nghiệp ___ Bảng 3. 10: Tình hình bệnh khảm lá Sắn. Giai Tỷ lệ Địa điểm Tên đoạn Chỉ số STT Thời điểm bệnh Xã, huyện, tỉnh giống sinh bệnh (%) (%) trưởng Tân Hưng, Tân 1 31/03/2018 KM94 70 ngày 100 47,25 Châu Xã Suối Đá, KM 419, 2 Huyện Dương 28/04/2018 100 ngày 93 41 KM94 Minh Châu Xã Tân Phú, Tân KM98-1, 3 28/04/2018 90 ngày 100 48 Châu KM94 Xã Tân Bình, KM94, 4 28/04/2018 90 ngày 98 46,5 Tân Châu KM419 Xã Thạnh Tân, KM98-1, 5 28/04/2018 90 ngày 95 43,5 Tân Châu KM94 3.7.2.2. Tình hình bọ phấn trắng trên cây sắn: Bọ phấn trắng (B. tabaci) là một trong những loài dịch hại nông nghiệp nguy hiểm nhất trên phạm vi toàn cầu (Philip A. Stansly et.al, 2010). Chúng gây hại cho hầu hết các loài cây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Luko Hilje et al, 2001). Ngoài gây hại trực tiếp, bọ phấn trắng còn là tác nhân truyền virus gây bệnh cho nhiều loại cây trồng. Cả ấu trùng và thành trùng đều chích hút nhựa cây làm chết mô lá và tiết nước bọt làm lan truyền mầm bệnh đặc biệt là virus gây bệnh khảm lá sắn (Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2017). Kết quả điều tra bọ phấn trắng được tiến hành từ cuối tháng 3 đến cuối tháng 4 năm 2018 tại huyện Tân Châu, Tây Ninh được trình bày ở (hình 3.21) cho thấy, bọ phấn xuất hiện trong suốt cả tháng với mật số bình quân từ 5,5 đến 12,6 con/lá (hình 3.21). Mặc dù nông dân ___ 68
Đồ án tốt nghiệp ___ đã sử dụng khá nhiều biện pháp như phun thuốc hóa học trừ bọ phấn trắng, nhổ bỏ cây bị bệnh nhưng với mật số cao như vậy, thì khả năng lây lan và phát triển. Điều này cũng cho thấy, việc sử dụng thuốc hóa học cho hiệu quả không cao trong việc phòng trừ bọ phấn trắng ở quy ô trên diện rộng. Mặt khác với mức độ phổ biến của bệnh khảm lá cộng mật độ bọ phấn trắng (vectơ truyền bệnh) cao thì nguy cơ lây truyền bệnh khảm lá cho các vùng trồng sắn là khó tránh khỏi. Không chỉ trên cây sắn, bọ phấn trắng còn gây hại và truyền virus cho nhiều loại cây trồng như cây thuốc lá, bông, cà chua, cà pháo, bí, khoai tây, ớt nên nguy cơ tấn công và lây lan của bọ phấn sang các cây trồng khác là rất lớn. Cần phải có biện pháp hữu hiệu để làm giảm mật số bọ phấn tại Tân Châu, Tây Ninh. Mật số (con/lá) 15 10 5 0 29/3 8/4 15/4 22/4 29/4 Ngày điều tra Hình 3. 22: Bọ phấn trắng trưởng thành trên lá sắn tại Tân Châu, Tây Ninh (4/2018) ___ 69
Đồ án tốt nghiệp ___ 3.7.2.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ bọ phấn trắng (Bemisia tabaci) của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trên đồng: Bảng 3. 11: Mật độ bọ phấn (con/cây) trên cây sắn tại các công thức thí nghiệm (Tân Châu, Tây Ninh). Mật số bọ phấn (con/lá) Công thức Trước phun 7 ngày sau phun 1 tuần 7 ngày sau phun 2 tuần 1. Đối chứng không 5,62 ns 6,98 a 13,2 a xử lý 2. Phun thuốc hóa 6,40 ns 3,03 b 6,27b học 3. Phun chế phẩm Paecilomyces 5,53 ns 1,76 c 3,15c lilacinus 1x 108CFU/ml CV (%) 9,8 13,5 13,5 Do dịch bọ phấn phát triển khá cao nên chúng tôi quyết định tiến hành phun nấm vào cuối tháng 3 đầu tháng 4 mặc dù đây là thời điểm trời nắng nóng, nhiệt độ cao và ẩm độ thấp, chưa thật sự thích hợp để nấm phát triển. Số liệu ở Bảng 3 cho thấy, mật số bọ phấn trước phun bình quân đạt từ 5 – 6 con/lá và không có sự sai khác giữa các công thức. Sau 1 tuần làm thí nghiệm, mật độ bọ phấn trên cây sắn ở lô đối chứng vẫn tiếp tục tăng. Tuy nhiên, ở lô phun chế phẩm và lô phun thuốc, đặc biệt là ở lô phun chế phẩm, mật độ bọ phấn trắng giảm rõ rệt và sai khác có ý nghĩa so với lô đối chứng và lô phun thuốc. Do mật số bọ phấn trắng ngoài tự nhiên có xu hướng tăng, nên chúng tôi tiếp tục phun chế phẩm và phun thuốc lần thứ 2 để quản lý mật độ bọ phấn trắng. Kết quả cho thấy, vào ngày thứ 7 sau phun lần thứ hai, mật độ bọ phấn trắng ở lô thí nghiệm tăng cao và đạt đến 13,2 con/lá. Trong khi đó, mật độ bọ phấn trắng ở phun thuốc hoá học đạt 6,27 con/lá và ở lô phun chế phẩm chỉ đạt 3,15 con/lá (Bảng 3.11). Như vậy, mặc dù điều kiện thời tiết không thuận lợi, nhưng chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus vẫn cho hiệu quả trừ bọ phấn trắng ___ 70
Đồ án tốt nghiệp ___ tốt. Hiệu quả này đạt 77% ở 7 ngày sau khi phun lần 1 và 79% ở 7 ngày sau khi phun lần thứ 2, tức 14 ngày sau khi phun lần thứ nhất. So với chế phẩm nấm P. lilacinus, thuốc hóa học cho hiệu quả thấp hơn, chỉ đạt khoảng 50 và 56 % (Bảng 3.12). Do bọ phấn là loài đa thực, gây hại trên 600 loại cây trồng (Oliveira et al. 2001). Việc sử dụng thuốc hóa học đã khiến bọ phấn ngày càng kháng với nhiều chủng, loại thuốc hóa học (Naveen et al, 2017). Whalon et al, 2013 cho biết, hiện nay, bọ phấn đã kháng lại với 40 hoạt chất hóa học. Có lẽ do vậy, mà hiệu lực của thuốc hóa học đối với bọ phấn trắng không cao. Vì vậy, việc tìm kiếm các tác nhân sinh học để quản lý tác nhân này là rất cần thiết. Bảng 3. 12: Hiệu lực gây chết bọ phấn trên cây sắn của chế phẩm nấm Paeciloyces lilacinus (Tân Châu, Tây Ninh tháng 4/2018). Công thức Hiệu lực gây chết (%) 7 ngày sau phun lần 1 7 ngày sau phun lần 2 1. Đối chứng - - 2. Phun nấm P. 77,46 78,86 lilacinus 3. Phun thuốc 56,08 50,27 hóa học Hình 3. 23: Bọ phấn trắng chết trên lá sắn tại Tân Châu, Tây Ninh (4/2018) ___ 71
Đồ án tốt nghiệp ___ CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận: - Chủng Paecilomyces lilacinus có khả năng sinh enzyme chitinase và protease. - Chủng Paecilomyces lilacinus nhân sinh khối trên môi trường gạo tấm với lượng nước bổ sung thích hợp là 50ml. - Nguồn Nito (NH4)2SO4 là thích hợp nhất cho chủng nấm Paecilomyces lilacinus phát triển khi được bổ sung vào môi trường gạo tấm với độ ẩm 60%. - Nguồn khoáng Cz và KH2PO4 là thích hợp nhất cho chủng nấm Paecilomyces lilacinus phát triển khi được bổ sung vào môi trường gạo tấm với lượng nước bổ sung là 50ml. - Nhiệt độ sấy phù hợp nhất cho chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus là sấy ở nhiệt độ 40oC. - Chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng diệt được rầy xanh Amrasca devastans trong điều kiện phòng thí nghiệm với hiệu lực gây chết là 64,3%. - Chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng diệt được Bọ phấn trắng trong điều kiện phòng thí nghiệm với hiệu lực gây chết là 87.3% và ở ngoài đồng là 77,46% sau khi phun 7 ngày lần 1 và 78,86% sau khi phun 7 ngày lần thứ 2. 4.2. Đề nghị: - Tiếp tục hoàn thiện quy trinh sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. - Khảo sát kết hợp nguồn Khoáng và Nito khi bổ sung vào môi trường gạo tấm. - Khảo sát chất mang phù hợp để tạo chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. - Khảo sát chất chống tia cực tím phù hợp để tạo chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus. ___ 72
Đồ án tốt nghiệp ___ - Tiếp tục đánh giá khả năng gây chết của chủng Paecilomyces lilacinus trên Rầy xanh ở điều kiện ngoài đồng. - Nghiên cứu thử nghiệm chế phẩm nấm trên diện rộng phòng trừ các loại sâu hại hút chích. ___ 73
Đồ án tốt nghiệp ___ TÀI LIỆU LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: Đỗ Anh Duy (2015). Lê Huỳnh Ham và cộng sự - 2016. Cao Văn Chí (2013). Sổ tay hướng dẫn phòng trừ sâu bệnh hại trên cây ăn quả có múi, Nhà xuất bản Hà Nội. Nguyễn Thị Chắt (2003). Một số đặc điểm hình thái và sinh học của rệp sáp giả cacao Planococcus lilacinus, Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2003. Nguyễn Thị Thu Cúc, Nguyễn Hữu Tho (2010). Sự gây hại của rệp sáp (Homoptera Pseudococcidae) trên rễ cây có múi (Citrus) vùng Đồng bằng song Cửu Long, Tạp chí Khoa học 2010:13 221-229. Võ Thị Bích Chi (2006), Tiềm năng phòng trừ sinh học của nấm ký sinh côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok đối với sâu hại họ thập tự tại Đồng bằng sông Cửu Long. Luận án Thạc sỹ trồng trọt. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nhà Xuất bản Khoa học kỹ thuật. Nguyễn Văn Đĩnh, Hà Quang Hùng, Nguyễn Thị Thu Cúc, Phạm Văn Lầm (2012). Côn trùng và động vật hại nông nghiệp Việt Nam, Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Lê Thị Huệ (2010). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Thị Hà (2012). Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp enzyme chitinase được phân lận từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Thị Xuân Hương (2015), Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Công Nghệ TpHCM – HUTECH. ___ 74
Đồ án tốt nghiệp ___ Trần Văn Huy (2012). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Paecilomyces sp. và khả năng sử dụng trong phòng trừ rầy nâu hại lúa, Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp, Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003). Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003). Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM. Nguyễn Thị Lộc (2009), “Kết quả ứng dụng chế phẩm sinh học Metarhizum anisopliae và Beauveria bassiana trừ sâu hại cây trồng tại Đồng bằng sông Cửu Long”, Kỷ yếu hội thảo định hướng phát triển ứng dụng BPSH trong phòng chống dịch hại cây trồng, Sóc Trăng, tháng 6/2009, Tr. 90- 98. Trần Ngọc Mai (2009). Hiệu lực của một số loài nấm ký sinh trên rệp sáp (Planococcus citri Risso) gây hại bưởi năm roi. Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa Nông Nghiệp và SHƯD, trường Đại học Cần Thơ. Trần Văn Mão (2002). Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích. Tập II: Sử dụng vi sinh vật có ích. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. Vũ Khắc Nhượng (1991), Sâu bệnh hại bông và biện pháp phòng trừ, thông tin BVTV số 4/1991. Chu Hồng Quảng (2013), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm bào tử nấm kí sinh côn trùng từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii L439 và đánh giá đặc điểm sinh học của chế phẩm. Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Thái Nguyên. Hồ Khắc Tín (1981), Giáo trình Côn trùng nông nghiệp (Phần côn trùng chuyên khoa). NXB Nông Nghiệp Hà Nội. Lê Lương Tề (2005), Giáo trình Bảo vệ thực vật. Phần II: Bảo vệ thự vật chuyên khoa, Nhà xuất bản Hà Nội 2005, tr 167-168 Lê Thị Thanh Thảo (2006). Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng nấm Beauveria bassiana (Bals) Vuillemin, Nomuraea rileyi (Farlow) Samson, ___ 75
Đồ án tốt nghiệp ___ Paecilomyces sp., Verticillium sp. Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa Nông Nghiệp và SHƯD trường ĐHCT. Nguyễn Thị Hồng Thương (2001). Khảo sát một số yếu tố tác động quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma, Đề tài dự thi giải thưởng " Sinh viên nghiên cứu khoa học". Đại học KHTN TPHCM. Phạm Thị Thùy (2004). Công nghệ sinh học trong Bảo Vệ Thực Vật. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội. Nguyễn Phước Vĩnh (2008). Hiệu lực của một số nấm ký sinh đối với một số loại sâu ăn lá trên cây đậu phộng tại xã Mỹ Long Nam, huyện Cầu Ngang, tỉnh Trà Vinh. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Nông Học. Khoa Nông Nghiệp và SHUD trường ĐHCT. Viện Bảo Vệ Thực Vật (2003), Atlat côn trùng hại cây trồng nông nghiệp ở Việt Nam. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội, tr 85 – 86. TÀI LIỆU TIẾNG ANH: Rogers 1963, 1965. De Candolle 1886; Rogers, 1965. De Barro, P. J., Liu, S.-S., Boykin, L. M. & Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1–19 (2011) Whalon, M. E., Mota-Sanchez, D., Hollingworth, R. M. & Gutierrez, R. Michigan State University, Arthropod Pesticide Resistance Database (2013). Available at: January 5, 2016. Jeschke, P., Nauen, R., Schindler, M. & Elbert, A. Overview of the status and global strategy for neonicotinoids. J. Agric. Food Chem. 59, 2897–2908 (2010) .( Peshin, R. & Zhang, W. Integrated pest management and pesticide use in Integrated Pest Management (ed. Pimentel, D. & Peshin, R.) 1–46 (Springer, 2014). Peshin, R. & Zhang, W. Integrated pest management and pesticide use in Integrated Pest Management (ed. Pimentel, D. & Peshin, R.) 1–46 (Springer, 2014). ) ___ 76
Đồ án tốt nghiệp ___ Kranthi, K. R. Cotton statistics and news (2015). Silva, L. D., Omoto, C., Bleicher, E. & Dourado, P. M. Monitoramento da suscetibilidade a inseticidas em populações de Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) no Brasil. Neotrop. Entomol. 38, 116–125 (2009). Kranthi, K. R. et al. Insecticide resistance in five major insect pests of cotton in India. Crop Prot. 21, 449–460 (2002). Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson ( =11812&Fields=All) Alter JA, Vandenberg JJD (2000). Factors that Influencing the Infectivity of Isolates of Paecilomyces fumosoroseus Agains Diamond Back Moth, J. Invertebr Pathol., 78: 31-36. Avery PB, Faulla J, Simmands MSJ (2004). Effect of Different Photoperiods on the Infectivity and Colonization of Paecilomyces fumosoroseus, J. Insect Sci. 4: 38. Ayhan GÖKÇE và M. Kubilay ER. (2004). Pathogenicity of Paecilomyces spp. to the Glasshouse Whitefly, Trialeurodes vaporariorum, with Some Observations on the Fungal Infection Process. Babu V, Murugan S, Thangaraja P (2001). Laboratory Studies on the Efficacy of Neem and the Entomopathogenic Fungus Beauveria bassiana on Spodoptera litura”. Entomology, 56: 56-63. Bainier, G. 1907. Paecilomyces, Genre Noveau De Mucedinees. Mycotheque de l’Ecole de Pharmacie – XI. Bulletin de la Societe Mycologique de France. 23: 26- 27. Brownbridge M (1995). Prospect for mycopathogens in thrips management. In: Parker M, Skinner M, Lewis T (Eds.), Thrips Biology and Management. Plenum Press, New York, pp. 281-295. ___ 77