Đồ án Phân lập và tuyển chọn chủng nấm Trichoderma sp trên đất hồ tiêu ở Đồng Nai

97 trang thiennha21 12/04/2022 5250

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập và tuyển chọn chủng nấm Trichoderma sp trên đất hồ tiêu ở Đồng Nai", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_phan_lap_va_tuyen_chon_chung_nam_trichoderma_sp_tren_d.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập và tuyển chọn chủng nấm Trichoderma sp trên đất hồ tiêu ở Đồng Nai

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA SPP. TỪ ĐẤT HỒ TIÊU Ở ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHÚNG VỚI CÁC NẤM GÂY BỆNH TRONG ĐẤT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Nguyễn Hoàng Vũ MSSV: 1151110426 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015 1
LỜI CAM ĐOAN - - - - - - - - -- - - - - - - - - Tôi tên: Nguyễn Hoàng Vũ Sinh ngày 29 tháng 07 năm 1993 Sinh viên lớp 11DSH04 - Công Nghệ Sinh Học - Trường ĐH Kỹ Công Nghệ TP Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan : Đề tài "Phân lập và tuyển chọn chủng nấm Trichoderma sp trên đất hồ tiêu ở Đồng Nai" do Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai hướng dẫn là đề tài của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây. Những thông tin tham khảo trong khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng. Tất cả những nội dung trong đồ án đúng như nội dung đề tài và yêu cầu của giáo viên hướng dẫn. Nếu có sai sót tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng. Sinh viên thực hiện Nguyễn Hoàng Vũ 2
LỜI CẢM ƠN - - - - - - - - -- - - - - - - - - Để hoàn thành đề tài này ngoại sự nổ lực, cố gắng của bản thân, em còn nhận được sự hỗ trợ rất nhiều từ nhiều người, tôi chân thành gửi lời "CẢM ƠN" tới : Con xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những người thân trong gia đình đã nuôi con khôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho con được học tập cho đến ngày hôm nay. Ngôi trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn năm học qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong cuộc sống. Ban chủ nhiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM đã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản, làm nền móng để tôi thực hiện đề tài và làm tốt công việc sau này. Cô T.S Nguyễn Thị Hai đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện tốt đề tài này. Các bạn trong lớp đã cỗ vũ, khích lệ tinh thần cho em trong suốt thời gian thực hiện đồ án. 3
MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1. 1 Giới thiệu chung về nấm Trichoderma 3 1. 1.1. Vị trí phân loại Trichoderma 3 1. 1.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc Trichoderma 4 1. 1.3. Đặc điểm một số chủng Trichoderma ở Việt Nam 5 1. 1.4. Vai trò tiêu diệt các loài nấm gây bệnh trên thực vật 8 1.1.4.1 Nguyên tắc chung 8 1.1.4.2 Cơ chế đối kháng 9 1. 2 Hiệu quả phòng trừ nấm gây hại của nấm Trichoderma 18 1. 3 Giới thiệu về cây hồ tiêu 19 1.3.1 Nguồn gốc cây tiêu 19 1.3.2 Công dụng của cây tiêu 19 1.3.3 Đặc điểm hình thái của cây tiêu (Phạm Văn Biên và cộng sự, 1990. 20 1. 4 Bệnh hại trên cây hồ tiêu và biện pháp phòng trừ 22 1.4.1 Bệnh hại chính trên hồ tiêu 22 1.4.1.1 Bệnh chết nhanh 23 i
1.4.1.2 Bệnh chết chậm 24 1.4.1.3 Bệnh virus hại hồ tiêu 25 1.4.2 Biện pháp phòng trừ 25 1.4.2.1 Biện pháp canh tác 25 1.4.2.2 Biện pháp hóa học 26 1.4.2.3 Biện Pháp sinh học 26 1.4.2.4 Biện pháp quản lý cây trồng tổng hợp (ICM) 26 1. 5 Một số nấm bệnh hại trong đất 27 1.5.1 Phytophthora 27 1.5.1.1 Vị trí và phân loại 27 1.5.1.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc 28 1.5.1.3 Nấm Phytophthora gây bệnh cây trồng 30 1.5.2 Fusarium sp 32 1.5.2.1 Vị trí phân loại 32 1.5.2.2 Đặc điểm hình thái , cấu trúc của Fusarium 33 1.5.2.3 Nấm Fusarium gây bệnh cho cây trồng ở việt nam 34 1.5.3 Rhizoctonia solani 35 1.5.3.1 Vị trí và phân loại 35 1.5.3.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc 36 1.5.3.3 Nấm Rhizoctonia gây hại cho cây trồng 36 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 ii
2.1 Thời gian và địa điểm 39 2.2 Thiết bị dụng cụ vật liệu 39 2.3 Vật liệu 40 2.3.1 Vi sinh vật nghiên cứu 40 2.3.2 Môi trường 41 2.4 Phương pháp nghiên cứu 42 2.4.1 Phân lập nấm Trichoderma trên đất hồ tiêu 43 2.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000). 43 2.4.1.2 Phương pháp pha loãng mẫu 43 2.4.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm 43 2.4.2.1 Quan sát đại thể nấm 43 2.4.2.2 Quan sát vi thể nấm 44 2.4.3 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase). (Tô Duy Khương, 2007) 45 2.4.4 Đánh giá tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma với chủng nấm bệnh (Fokkema, 1976) 46 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê. 47 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Kết quả phân lập nấm Trichoderma từ đất hồ tiêu. 48 3.2 Đặc điểm của các chủng nấm Trichoderma phân lập được trên đất hồ tiêu 48 3.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của 8 iii
chủng nấm Trichoderma phân lập được trên đất hồ tiêu bị bệnh. 53 3.4 Đánh giá khả năng đối kháng với các chủng nấm bệnh trong đất và đất hồ tiêu của các chủng Trichoderma phân lập được. 56 3.4.1 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp1. 57 3.4.2 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp2 61 3.4.3 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani 65 3.4.4 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp. 69 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 74 4.1 Kết luận 74 4.2 Kiến Nghị: 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC 1 iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải Chitin của 8 chủng nấm Trichoderma sau hai ngày nuôi cấy. (đơn vị: cm) 53 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải Cellulose chủa 8 chủng nấm Trichoderma sau hai ngày nuôi cấy. (đơn vị: cm) 55 Bảng 3.3 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp1 của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. 57 Bảng 3.4 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp2 của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. 61 Bảng 3.5 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. 65 Bảng 3.6 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. 69 v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cuống bào tử trần ở nấm T.hazrianum (trái) và T.aggresivum (phải). 5 Hình 1.2: Trichoderma atroviride. 5 Hình 1.3: Trichoderma hazianum. 6 Hình 1.4: Trichoderma koningii. 7 Hình 1.5: Trichoderma hamatum 7 Hình 1.6: Trichoderma viride . 8 Hình 1.7: Nấm Trichoderma atroviride đối kháng với nấm gỗ Polyporus 11 Hình 1.8: Trichoderma tiết enzyme chitinase phá hủy vách tế bào 12 Hình 1.9: Nấm Trichoderma sinh trưởng trong nấm bệnh. 13 Hình 1.10: Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma hazianum 15 Hình 1.11: Nấm Trichoderma cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống với các nấm bệnh khác. 17 Hình 1.12: Cây hồ tiêu với trái chưa chín ( ồ_tiêu) 19 Hình 1.13: Hình ảnh chu kỳ sống của Phytophthora 29 Hình 1.14: Bệnh Héo Fusarium trên cây chuối do Fusarium oxysporum f.cubensesp 34 Hình 1.15: Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra 38 Hình 3.1: Hình thái mặt trước và mặt sau theo thứ tự của nấm TT1, TT2, TT5, TT6, TT7, TT8 sau 3 và 5 ngày. 49 vi
Hình 3.2: Hình ảnh sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT1, TT2, TT5, TT6, TT7, T2. 51 Hình 3.3: Hình thái mặt trước và mặt sau theo thứ tự của nấm TT3, TT4 sau 3 và 5 ngày. 52 Hình 3.4: Sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT3 52 Hình 3.5: Sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT4 53 Hình 3.6: Hình ảnh vòng phân giải Chitin của các chủng nấm Trichoderma sp phân lập được 55 Hình 3.7: Hình ảnh vòng phân giải CMC của các chủng nấm Trichoderma sp phân lập được 56 Hình 3.8: Hình ảnh đối kháng với Phytophthora sp của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. 61 Hình 3.9: Hình ảnh đối kháng với Phytophthora sp2 của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. 65 Hình 3.10: Hình ảnh đối kháng với Rhizoctonia solani của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. 69 Hình 3.11: Hình ảnh đối kháng với Rhizoctonia sp của 8 chủng nấm Trichoderma sp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. 73 vii
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Việt Nam hiện nay là một trong những nước đứng đầu về xuất khẩu hồ tiêu trên thế giới . Các vùng trồng hồ tiêu chủ yếu ở nước ta tập trung từ Quảng Trị đến các vùng đất đỏ cao nguyên Trung bộ, Đông Nam bộ và Đảo Phú Quốc. Từ năm 1995 trở lại đây, cây hồ tiêu được phát triển với qui mô và tốc độ khá lớn, điển hình là các tỉnh Đắc Lắc, Đắc Nông, Gia Lai, Bình Dương, Bình Phước, Quảng Trị, Phú Quốc và Đồng Nai. Chỉ tính riêng hai tỉnh Đắc Lắc và Đắc Nông thì từ năm 1995 cho đến nay, diện tích hồ tiêu mới phát triển lên tới gần 10000 ha. Định hướng của ngành sản xuất hồ tiêu đến năm 2010 - 2020 giữ diện tích khoảng 50 000 ha, giá trị xuất khẩu đạt trên 240 triệu USD/ năm. Tuy nhiên nhiều năm trở lại đây, dịch hại trên hồ tiêu phát sinh sinh và gây hại đáng kể cho nhiều vùng sản xuất hồ tiêu tập trung (Báo nông nghiệp Việt Nam số ra ngày 9/2 và 10/4/2007). Thống kê của Cục BVTV cho thấy, tính tới cuối năm 2014, tổng diện tích hồ tiêu nhiễm bệnh chết nhanh đã lên tới trên 2.000 ha, chiếm 2,5% tổng diện tích gieo trồng; diện tích nhiễm bệnh chết chậm gần 3.300 ha, chiếm 4% tổng diện tích gieo trồng. Bệnh chết nhanh đã xảy ra ở hầu hết các tỉnh trồng hồ tiêu, trong khi bệnh chết chậm chủ yếu ở các tỉnh Tây Nguyên và Đông Nam bộ (Cục Bảo vệ Thực vật, 2007). Một trong những vi sinh vật quan trọng sống trong đất gây hại cho cây tiêu đó là nấm Phytophthora sp. Nấm gây hiện tượng chết nhanh và phân bố rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là vùng Đông Nam Á, Châu Á, Úc. Ngoài ra còn có các loài nấm khác gây chết cây như Fusarium sp , Rhizoctonia solani (Barbara, 2001). Theo Kularatne (2002), các bệnh quan trọng nhất trên cây tiêu gồm bệnh chết nhanh do Phytophthora sp, bệnh chết chậm do Fusarium sp. Đối với bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora sp. là tác nhân gây bệnh chính (Kularatne, 2002). 1
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Để kiểm soát được dịch bệnh này thì phương pháp hóa học không còn là một biện pháp được tin dùng. Thay vào đó việc nghiên cứu để tìm ra những tác nhân sinh học mang lại hiệu quả cao và thân thiện với môi trường đang là giải pháp được hướng đến. Một trong số các tác nhân được đánh giá là có nhiều hứa hẹn đó là nấm Trichoderma. Nhiều kết quả nghiên cứu về Trichoderma đã được thực hiện và đã đc thương mại hóa. Tuy nhiên, hiệu quả của chế phẩm Trichoderma vẫn còn khá bấp bênh. Các tác giả trong và ngoài nước đều thống nhất rằng, sự phân bố và điều kiện môi trường sống của nấm Trichoderma có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh enzyme, tiết kháng sinh và đối kháng nấm bệnh của chúng. Các chủng nấm có nguồn gốc bản địa sẽ cho hiệu quả phòng trừ tốt hơn so với các chủng nhập cư. Xuất phát từ nhận định này, sinh vien tiến hành đề tài PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA SPP TỪ ĐẤT HỒ TIÊU Ở ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHÚNG VỚI CÁC NẤM GÂY BỆNH TRONG ĐẤT, nhằm tìm ra các chủng có triển vọng để phòng trừ các loài bệnh hại có trong đất ở vùng nghiên cứu. Mục đích đề tài ➢ Tìm ra được chủng nấm Trichoderma trong đất hồ tiêu ở Đồng Nai có khả năng đối kháng với tác nhân gây bệnh trong đất. ➢ Bổ sung thêm các chủng nấm Trichoderma có nguồn gốc ở vùng sinh thái mới vào bộ sưu tập của phòng thí nghiệm trường Hutech. Nội dung nghiên cứu ➢ Phân lập các chủng nấm Trichoderma từ đất cây hồ tiêu ở Đồng Nai. ➢ Đánh giá các đặc điểm sinh học của các chủng nấm Trichoderma phân lập được. ➢ Đánh giá khả năng đối kháng với các bệnh trong đất hồ tiêu của các chủng Trichoderma phân lập được. 2
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1 Giới thiệu chung về nấm Trichoderma Trichoderma là loại nấm có mặt nhiều trong đất, các rễ cây, chúng có khả năng phân hủy gỗ, các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật (Howell và cộng sự, 2003). Các chủng Trichoderma là thành phần chính trong hệ VSV của đất, đó có thể là do khả năng trao đổi chất phong phú và cạnh tranh tích cực của chúng. Trichoderma được cho là ít liên quan đến dịch bệnh ở thực vật sống, mặc dù một nhóm của Trichoderma harzianum gây bệnh trên nấm thương mại. Năm 1996 thì Samuels đã đưa ra đánh giá toàn diện về đặc tính sinh học của Trichoderma, kỹ thuật thu nhận được enzyme tiết ra từ Trichoderma và khả năng kiểm soát sinh học của chúng (Tran Nguyen Ha, 2010). Nấm Trichoderma sp. thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm bất toàn (imperfect fungi) Deuteromycetes, bộ nấm bông Moniliales, học Moniliaceae, chi Trichoderma (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Nấm Trichoderma phát triển nhanh và sinh nhiều bảo tử màu xanh lá cây (Huỳnh Văn Phục, 2006). 1. 1.1. Vị trí phân loại Trichoderma Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho công tác phân loại do còn nhiều đặc điểm chưa được biết đầy đủ. Persoon ex Gay ( 1801 ) phân loại Trichoderma như sau. Giới Fungi Ngành Ascomycota Lớp Euascomycetes Bộ Hypocreales Họ Hypocreaceae 3
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Chi Trichoderma Ainsworth và Sussman (1968) lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae. Theo nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da silva (1997), Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes, các loài Trichoderma được chia thành 5 nhóm: Trichoderma, longibrachiatum, Saturisporum, pachybasium và Hypocreanum . Theo GS Nguyễn Lân Dũng và một số tác giả khác, chi Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales họ Moniliaceae 1. 1.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc Trichoderma Hầu hết chi Trichoderma không có giai đoạn sinh sản hữu tính. Chúng sinh sản bằng bào tử đính từ khuẩn ti khí sinh. Khuẩn ti khí sinh không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, phát triển nhanh trong MT nuôi cấy ở 25-30oC, thường không phát triển ở 35oC. Khuẩn lạc không màu trong MT thạch đường bột bắp hay trên MT giàu chất dinh dưỡng như PDA. BT hình thành trong vòng 1 tuần thành khối lỏng lẻo hoặc rắn chắc có màu xanh, màu vàng và ít khi có màu trắng. Chất tạo màu vàng thường chìm trong khối agar, đặc biệt trong môi trường PDA. Cuống sinh BT phân nhánh cao (khó để xác định hoặc đo đếm) kết thành bụi chặt hay lỏng, thường tạo nên những vòng đồng tâm đặc trưng hoặc hướng theo khuẩn ty khí sinh. Những nhánh chính của cuống sinh BT tạo ra các nhánh bên có thể kết cặp hoặc không, nhánh dài nhất xa phần đỉnh, thể bình phát sinh trực tiếp từ thân chính gần đỉnh. Các nhánh có thể tái phân nhánh, với những nhánh thứ cấp thường kết cặp. 4
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.1 Cuống bào tử trần ở nấm T.hazrianum (trái) và T.aggresivum (phải) ( 1. 1.3. Đặc điểm một số chủng Trichoderma ở Việt Nam • Trichoderma atroviride Đặc điểm: Khuẩn lạc phát triển nhanh, đạt 8-9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở 20 0C, sợi nấm trong suốt, vách dày, trơn láng rộng 2- 14µm. Bào tử màu xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục đường kính từ 4-12µm, khi nấm già thường mất màu hay màu vàng nhạt hoặc xám, bào tử già phát ra mùi hương dừa (Kubicek và Harman,1998) . Hình 1.2 Trichoderma atroviride ( 5
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP • Trichoderma hazianum Đặc điểm: Môi trường có nhiệt độ từ 15-350C, pH: 3,7-4,7 rất thích hợp cho sự phát triển của nấm (Dosmch và Gams, 1980). Khuẩn lạc phát triển nhanh, đường kính khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C. Bào tử đính có hình cầu méo đến bầu dục ngắn, màu xanh lục, vách trơn láng, kích thước (2,7- 3,2)x(2,5-2,8)µm. Hình 1.3 Trichoderma hazianum ( • Trichoderma koningii Đặc điểm: Khuẩn lạc có đường kính 3-5cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C, bào tử có hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3,0-4,8)x(1,9-2,8)µm. Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp đất mặt, nhưng ở độ sâu 120cm vẫn có sự hiện diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 260C trở lên tùy theo nguồn gốc của loài, pH: 3,7-6,0 (Huỳnh Văn Phục, 2006). 6
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.4 Trichoderma koningii ( • Trichoderma hamatum Đặc điểm: Đường kính khuẩn lạc đạt 7cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 200C. Bào tử màu xanh lục, trơn, dạng elip, có kích thước khác nhau tùy theo chủng (Domsch và Gams,1980). Sinh hóa: Nhiệt độ 240C và pH: 3,7-4,7 là những điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của Trichoderma hamatum và chúng phát triển chậm lại ở 00C (Domsch và Gams,1980). Hình 1.5 Trichoderma hamatum ( 7
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP • Trichoderma viride Đặc điểm: Bào tử màu xanh lục, vách xù xì, dạng hình cầu, kích thước (4-5)x(2,5-3)µm. (cook và baker, 1983). Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai nguồn nitrogen đơn giản và phức tạp. Khi Trichoderma tăng trưởng trên nguồn cacbonhydrate như là nguồn cacbon cho dinh dưỡng thì ammonium được sử dụng tốt hơn là nitrate (Danielson và Davey, 1973). Hình 1.6 Trichoderma viride ( 1. 1.4. Vai trò tiêu diệt các loài nấm gây bệnh trên thực vật 1.1.4.1 Nguyên tắc chung Nghiên cứu về cơ chế đối kháng có ý nghĩa quan trọng bởi lẽ muốn sử dụng hiệu quả nhất những tác nhân kiểm soát bệnh thực vật, chúng ta phải hiểu những tác nhân đó làm việc như thế nào và giới hạn của chúng là gì. Trên cơ sở đó, tác động có hiệu quả tới các khâu nuôi dưỡng, bảo quản và cuối cùng sử dụng những tác nhân kiểm soát sinh học sao cho có thể khai thác tốt nhất khả năng kiểm soát bệnh của chúng. Nhiều nghiên cứu từ trước tới nay đã chỉ ra rằng, Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế khác nhau trong phòng trừ và tiêu diệt nấm bệnh như: hiện tượng kí sinh nấm, sự sản sinh kháng sinh, sự tiết những enzyme phá huỷ thành tế bào nấm bệnh, khả nămg cạnh tranh mạnh 8
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP chất dinh dưỡng và không gian sống. Những cơ chế này không tách biệt nhau, và để đối kháng với các chủng nấm bệnh thì chúng có thể kết hợp hai hay nhiều cơ chế trong suốt quá trình ký sinh và tiêu diệt. Ví dụ, sự kiểm soát botrytis trên nho bởi Trichoderma bao gồm cả sự cạnh tranh dinh dưỡng và sự ký sinh lên hạch nấm, cả hai cơ chế đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh (Huỳnh Văn Hiếu, 2009). Cả cơ chế tạo ra chất kháng nấm và cơ chế ký sinh đều có thể liên quan đến sự cạnh tranh dinh dưỡng, và sự sản xuất ra các chất độc được biết có ảnh hưởng đến tình trạng dinh dưỡng của môi trường. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các chất kháng sinh và các enzyme thủy phân không chỉ được tạo ra đồng thời mà còn hỗ trợ nhau trong cơ chế đối kháng ký sinh (Huỳnh Văn Hiếu, 2009). Theo Kredics (2003), quá trình đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh chủ yếu bằng 2 cơ chế: Thứ nhất: Nấm Trichoderma bao quanh và cuộn lấy nấm bệnh. Thứ hai: Nấm Trichoderma tiết ra các loại enzyme thủy phân. Klein và Eveleigh (1998), thì cho rằng nấm Trichoderma tấn công trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzyme phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây trồng kháng lại bệnh (Huỳnh Văn Phục, 2006). 1.1.4.2 Cơ chế đối kháng Nấm Trichoderma phát triển nhanh trong đất, nên chúng tăng nhanh về số lượng so với các loài nấm khác (Saksena,1960). Chúng sẽ chiếm chỗ trước khi các loại nấm gây bệnh xâm nhiễm vào mô cây trồng. Cơ chế ký sinh, đối kháng của các loài nấm đối kháng thể hiện. Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” ở vùng tiếp xúc giữa nấm đối kháng với nấm gây bệnh xuất hiện sự quấn chặt của sợi nấm đối kháng quanh sợi nấm gây bệnh, sau đó xả ra hiện tượng thủy phân thành vách sợi nấm bệnh, nhờ đó mà nấm đối kháng xâm nhập 9
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP vào bên trong sợi nấm, phá vỡ tế bào sợi nấm và tiêu diệt nấm gây bệnh. Cơ chế tác động của các loài nấm đối kháng dựa trên cơ sở các loài nấm đối kháng có khả năng sản sinh ra một số chất kháng sinh (thực chất là chất độc tố do nấm đối kháng sản sinh ra nhưng không làm tổn hại đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng và không ảnh hưởng đến hệ VSV đối kháng ở trong đất và ở vùng rễ cây trồng): Gliotoxin, Trichoderma viridin, Dermadin, Cyclosporin, Alamethicin, vv Chất kháng sinh do nấm đối kháng sản sinh ra có khả năng kìm hãm, ức chế quá trình sinh trưởng của sợi nấm, đến quá trình xâm nhiễm ký sinh của nấm gây bệnh và có thể tiêu diệt nấm gây bệnh (Huỳnh Văn Phục, 2006). • Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế. Weidling (1932) đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó là “giao thoa sợ nấm”. Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” là hiện tượng tấn công trực tiếp của nấm này lên một nấm khác. Nó là một quá trình rất phức tạp bao gồm các bước chính sau: đầu tiên là sự nhận biết sự có mặt của nấm bệnh, sau đó là quá trình tấn công, xuyên qua thành tế bào và cuối cùng giết chết nấm bệnh. Một số chi tiết của cơ chế này ở Trichoderma đã được nghiên cứu và làm sáng tỏ (Vũ Nguyên Thành, 2009). Để giải thích rõ hiện tượng “giao thoa sợi nấm” chúng ta có thể chia quá trình tấn công của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh làm 3 giai đoạn. Giai đoạn 1: Bước đầu tấn công nấm bệnh Quan sát giai đoạn đầu tấn công chủng nấm bệnh. Trong giai đoạn đầu này có thể chia làm 4 bước: Bước 1: Nấm Trichoderma phát hiện nấm bệnh . 10
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hướng hóa chất, nó ký sinh phân nhánh hướng về nấm bệnh đã được định trước (do những nấm này tiết ra hóa chất). Ngoài ra, chúng có thể nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể do tự nhiên hay hóa học (qua trung gian là pectin trên bề mặt tế bào của nấm bệnh) (Trần Thị Thanh Thuần, 2009). Bước 2: Sợi nấm bám sát vào nấm bệnh Sau khi phát hiện nấm bệnh, chúng nhanh chóng phát triển về hướng nấm bệnh và phân nhánh để tăng diện tích diện tích tiếp xúc với nấm bệnh (Mark Schubert and Siegfried Fink, 2008). Bước 3: Phát triển cuống bào tử và bào tử đính Sau khi đã tiếp xúc được với nấm bệnh, chúng bắt đầu tăng sinh cuống bào tử đính và hình thành các bào tử đính. Bước 4: Tạo các giác bám trên bề mặt nấm bệnh Hình 1.7 Nấm Trichoderma atroviride đối kháng với nấm gỗ Polyporus (Mark Schubert and Siegfried Fink, 2008). Kết thúc giai đoạn đầu, nấm Trichoderma tạo các giác bám trên bề mặt nấm bệnh và chẩn bị bước qua giai đoạn 2 là tiết enzyme. 11
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Giai đoạn 2: Giai đoạn tiết enzyme phá hủy vách tế bào Trichoderma sản sinh ra một số enzyme phá huỷ thành tế bào nấm bệnh và cũng có thể sinh những kháng sinh peptaibol. Hình 1.8 Trichoderma tiết enzyme chitinase phá hủy vách tế bào (Susanne Zeilinger và cộng sự, 2003) Kết quả của những hoạt động phối hợp nhiều nhân tố này đã tạo thành những lỗ thủng tại vị trí giác bám trên sợi nấm bệnh. Giai đoạn 3: Tấn công vào tế bào chất và tiêu diệt nấm bệnh Các sợi nấm Trichoderma xuyên qua lỗ thủng vào khoang trong của nấm bệnh, phá huỷ chất nguyên sinh nấm chủ và sinh trưởng trong đó (Vũ Nguyên Thành, 2009).Sự phá hủy các chất nguyên sinh của nấm bệnh làm cho chúng bị teo lại và chết đi (Hứa Võ Thành Long, 2010). 12
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.9 Nấm Trichoderma sinh trưởng trong nấm bệnh ( • Cơ chế tiết kháng sinh Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và ký sinh đã làm cho nấm bệnh chết. Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh (Hứa Võ Thành Long, 2010). Howell (1987), thấy rằng những chủng Trichoderma virens đột biến mất khả năng ký sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm bệnh R. solani tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh kháng sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nó là một trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này có thể ức chế mạnh sự sinh trưởng của những VSV khác. Khả năng sinh kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau, chúng gồm: Gliotoxin: chất kháng sinh này được R. Weindling và O. Emerson mô tả năm 1936 do nấm Trichoderma lignorum sinh ra. Gần 13
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP đây được xác định lại là do nấm Trichoderma virens sinh ra. Chất gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều VSV: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia ) (Vũ Nguyên Thành, 2009). Steroids (viridin): Đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm Trichoderma tạo thành trong hoạt động của chúng. Chất kháng sinh này được phát hiện năm 1945. Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và là một độc tố thực vật, có hiệu lực như một loại thuốc diệt cỏ, giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm. Được sản xuất từ Trichoderma virens (Trần Thị Thanh Thuần, 2009). Ở Nhật Bản năm 1975, Atsushi, Shunsuke đã phát hiện được hai chất kháng sinh Trichodermin và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài Trichoderma koningii và Trichoderma aureoviride. Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides, isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do Trichoderma harzianum sinh ra; các kháng sinh gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do Trichoderma virens sinh ra (Vũ Nguyên Thành, 2009). Các chất trao trao đổi thứ cấp được sản sinh từ Trichoderma là bao gồm một loạt các hợp chất hóa học. Theo Ghisalberti và Sivasitham param (1991), chúng có thể được phân loại như sau: (i) các chất kháng sinh dễ bay hơi như 6-pentyl- α –pyrone (6PP), (ii) các hợp chất hòa tan trong nước như heptelidic acid hoặc koningic acid, (iii) peptaibol. Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22 aminoacid có chứa nhiều α -aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus và chứa một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus [11] do Trichoderma polysporum, hazianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh, và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh (Trần Thị Thanh Thuần, 2009). 14
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.10 Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma hazianum (Mark Schubert and Siegfried Fink, 2008). Francesco Vinale và các cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng của Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm bệnh. Ông sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma hazianum bổ sung vào môi trường nuôi cấy của chủng Pythium ultimum. Kết quả ông thu được là: ở đĩa (1) môi trường có chứa kháng sinh 6PP được tiết ra từ chủng Trichoderma hazianum, ức chế sự phát triển của chủng Pythium ultimum. Ở đĩa (2) môi trường không chứa kháng sinh 6PP, không thấy sự ức chế chủng Pythium ultimum. • Cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống Không chỉ có cơ chế kí sinh, sự sinh kháng sinh hay tiết enzyme là hiệu quả trong điều khiển sinh học mà cơ chế cạnh tranh cũng được coi là cơ chế có ý nghĩa hết sức quan trọng vì sự thiếu dinh dưỡng là nguyên nhân gây chết phổ biến đối với vi sinh vật. Cơ chế này cũng được ứng dụng nhiều và hiệu quả trong kiểm soát sinh học điều khiển 15
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP các bệnh do nấm. Nấm Trichoderma có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nấm bệnh về dinh dưỡng, nơi cư trú. Nấm Trichoderma thường định cư trước so với các nấm bệnh. Do đó, chúng chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nấm bệnh (Green et al., 1996; Martin et al., 1985). Trichoderma có khả năng cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis sp. và Sclerotina sp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử dụng những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis sp. và Sclerotina sp (Trần Thị Thanh Thuần, 2009). Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Phytium sp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Phytium sp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Phytium sp. bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Phytium sp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Trần Thị Thanh Thuần, 2009). Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn cacbon, nitơ và yếu tố tăng trưởng khác với nấm bệnh. Trichoderma hazianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại những vùng bị nhiễm (Gullino, 1992). Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T. hazianum sử dụng đế kiểm soát nấm bệnh F. oxysporum. Trichoderma có thể hòa tan tốt các chất dinh dưỡng vô cơ trong môi trường rễ cây như: đồng, photpho, sắt, mangan, kẽm và natri giúp cho cây hấp thu tốt các nguồn dinh dưỡng này. Ngoài ra, Trichoderma còn có khả năng làm giảm mức oxy hóa của các kim loại để tăng độ hòa tan của những kim loại này, và cũng có 16
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP thể sản xuất ra các thể mang sắt (siderophores) để vận chuyển các nguyên tố vi lượng như sắt. Nhờ vào khả năng sinh ra siderophores hiệu quả cao do đó cạnh tranh mạnh mẽ với khả năng hấp thu sắt của nấm khác đặc biệt là nấm bệnh. Bị thiếu sắt các đỉnh sinh trưởng mới của nấm bệnh không được hình thành (Vũ Nguyên Thành, 2009). Bên cạnh đó, Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ như loại bỏ mầm bệnh, làm tăng sự sinh trưởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm mà Trichoderma tác động đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzym bảo vệ và các hợp chất kháng sinh nhờ đó giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh (Trần Thị Thanh Thuần, 2009). Hình 1.11 Nấm Trichoderma cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống với các nấm bệnh khác. ( 17
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP 1. 2 Hiệu quả phòng trừ nấm gây hại của nấm Trichoderma Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra Trichoderma có thể ký sinh trên các loại nấm bệnh và khả năng tiết kháng sinh. Năm 1932 Weinding và các cộng sự đã mô tả chi tiết quá trình ký sinh lên nấm bệnh Rhizoctonia solani của Trichoderma, từ việc cuộn xung quanh các sợi nấm bệnh, thâm nhập và sau đó phá hủy tế bào của nấm chủ. Ông cũng đã mô tả khả năng tiết kháng sinh để tiêu diệt hai chủng Rhizotonia và Sclerotinia và đặt tên nó là gliotoxin. Trong những năm nghiên cứu này, thì nhiều kết quả tương tự khác cũng đã được báo cáo bởi các nhà bệnh lý học thực vật. Ví dụ: chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma virens thể hiện sự ức chế mạnh mẽ đối với Pythium ultinum và Phytothora (Howell và Stipanovic,1995). Sử dụng chế phẩm Trichoderma để kiểm soát hiệu quả các bệnh gây ra trên cây trồng đã và đang được quan tâm rất lớn, một số sản phẩm thương mại của nấm Trichoderma được sản xuất ở các thị trường Châu Á, Châu Âu, và Hoa Kỳ để sử dụng trên một loạt các loại cây trồng. Các dạng được sử dụng hiệu quả như bào tử, sợi nấm và bào tử vách dày (bào tử hậu) được sản xuất dưới một trong hai trạng thái rắn hoặc chất lỏng lên men.(Harman và các cộng sự, 2004). Thật vậy, nhiều nghiên cứu ở nước ta đã phần nào khẳng định vai trò quan trọng của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây hại như: Nghiên cứu về khả năng đối kháng của Trichoderma nội địa với nấm Phytophthora gây bệnh trên cây sầu riêng (Dương Minh, 2006), Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng Sông Cửu long và Đông nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani. 18
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP 1. 3 Giới thiệu về cây hồ tiêu Hình 1.12 Cây hồ tiêu với trái chưa chín ( ồ_tiêu) 1.3.1 Nguồn gốc cây tiêu Tiêu có nguồn gốc từ vùng Ghat miền tây Ấn Độ, ở đây có nhiều giống tiêu hoang dai, mọc rất lâu đời. Sau đó, tiêu được người Hindu mang tới Java (Indonesia) vào khoảng 600 năm sau công nguyên. Cuối thế kỷ 12, tiêu được trồng ở Mã Lai. Đến thế kỷ 18, tiêu được trồng ở Srilanka và Campuchia. Vào đầu thế kỷ 20 thì tiêu được trồng nhiều ở các nước nhiệt đới như Châu Phi với Mandagasca, Nigieria, và Châu Mỹ với Brazil, Mexico, Tiêu được du nhập vào đông dương từ thế kỷ 17 nhưng mãi đến thế kỷ 18 mới bắt đầu phát triển mạnh khi một số người Trung Hoa di dân vào Campuchia ở vùng dọc bờ biển vịnh Thái Lan như Konpong, Trach, kep, kampot và tiêu vào Đồng Bằng Sông Cửu Long qua ngõ Hà Tiên của tỉnh Kiên Giang, rồi sau đó lan dần đến các tỉnh khác ở miền Trung-Tây Nguyên như Thừa Thiên Huế, Quảng Trị, Đăk Lăk, Gia Lai, Đăk Nông, 1.3.2 Công dụng của cây tiêu Tiêu là loại cây trồng có thể sống lâu năm và có giá trị kinh tế cao. Tiêu được sử dụng làm gia vị, trong y dược, trong công nghiệp hương liệu và làm chất trừ côn trùng. 19
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Chất gia vị: Hạt tiêu có vị nóng, cay, có mùi thơm hấp dẫn nên rất thích hợp cho việc chế biến các món ăn. Vì vậy mà tiêu đã trở thành gia vị được dùng rất phổ biến trên thế giới. Trong y dược: Do có sự hiện diện của chất piperin, tinh dầu và nhựa có mùi thơm, cay, nóng đặc biệt, tiêu có tác dụng kích thích tiêu hóa, làm cho ăn ngon miệng. Ngoài ra, tiêu còn có tác dụng làm ấm bụng, thường dùng chung với gừng để chữa chứng tiêu chảy, ói mửa khi ăn nhằm món lạ, dùng chung với hành lá trong tô cháo giải cảm Tuy nhiên, khi dùng quá nhiều tiêu có thể gây táo bón, kích thích niêm mạc dạ dày, gây sốt, viêm đường tiểu và có khi gây tiểu ra máu. Trong công nghiệp hương liệu: Chất piperin trong hạt tiêu được thủy phân thành piperidin và acid piperic. Oxy hóa acid piperic bằng permanganate kali (KMnO4), thu được piperonal (helotropin nhân tạo) có mùi hương tự nhiên như heliotropin và coumarin, dùng để thay thế các hương liệu này trong kỹ nghệ làm nước hoa. Tinh dầu tiêu với mùi thơm đặc biệt được sử dụng trong công nghiệp hương liệu và hóa dược. Trừ côn trùng: Trước kia, Người ta dùng dung dịch chiết xuất từ hạt tiêu xay tẩm vào da trong khi thuộc để ngừa côn trùng phá hoại, nhưng từ khi xuất hiện các loại thuốc hóa học công dụng và rẻ tiền hơn thì tiêu không còn dược sử dụng trong lĩnh vực này nữa (Phạm Văn Biên, 1989). 1.3.3 Đặc điểm hình thái của cây tiêu (Phạm Văn Biên và cộng sự, 1990. Rễ cọc: Chỉ có những cây tiêu trồng bằng hạt mới có rễ cọc. Rễ này đâm sâu xuống mặt đất đến độ sâu 2.5 m, làm nhiệm vụ chính là hút nước. Rễ cái: Các rễ này cũng làm nhiệm vụ chính là hút nước. đối với cây tiêu trồng bằng giâm cành, sau khi trồng ra ngoài được một năm, các rễ cái này có thể ăn sâu đến 2m. 20
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Rễ phụ: Các rễ phụ mọc thành từng chum, phát triển theo chiều ngang, rất dày đặc, phân bố ở độ sâu 15-40 cm, làm nhiệm vụ hút nước và hút dinh dưỡng trong đất để nuôi cây. Rễ cây tiêu thuộc loại háo khí, không chịu được ngập úng, do đó để tạo cho rễ cái ăn sâu, cây chịu hạn tốt và rễ phụ phát triển tốt hút được nhiều chất dinh dưỡng thì phải thường xuyên cải tạo và làm cho đất dược tơi xốp, tăng hàm lượng mùn. Chỉ cần úng nước từ 12-24 giờ thì bộ rễ cây tiêu đã bị tổn thương đáng kể và có thể dẫn tới việc hư thối và dây tiêu có thể bị chết dần. Rễ bám: mọc ra từ các đốt trên thân ở trên không, làm nhiệm vụ chính là giúp cây tiêu bám vào choái, vách tường để vươn cao. Khả năng hút nước và hút chất dinh dưỡng của rễ bám rất hạn chế, gần như không đáng kể. Thân, Cành , Lá: Tiêu thuộc loại thân thảo mềm dẻo được phân thành nhiều đốt, tại mỗi đốt có một lá đơn, hình trái tim, mọc cách. ở nách lá có các mầm ngủ có thể phát sinh thành các cành tược, cành lươn, cành có trái tùy thuộc theo từng giai đoạn phát triển của cây tiêu. Cành tược (cành vượt): Thường phát sinh từ mầm nách của những cây tiêu nhỏ hơn 1 tuổi. Đối với cây trưởng thành, cành tược phát sinh từ các mầm nách trên khung cành thân chính phía dưới thấp của trụ tiêu, và thường là cành cấp 1. Đặc điểm của cành tược là góc độ phân cành nhỏ, dưới 450, cành mọc tuong đối thẳng. Cành tược có sức sinh trưởng mạnh, khỏe, thường được dùng để giâm cành thân giống. Cành lươn: cành phát sinh từ mầm nách gần sát gốc của bộ khung thân chính của cây tiêu trưởng thành. Đặc trưng của cành lươn là có dạng bò sát đất là có lóng rất dài. Cành lươn cũng được dùng để nhân giống, tuy vậy, và cây thường ra hoa, trái chậm hơn so với cành tược nhưng tuổi thọ lại dài và năng suất cao. 21
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Cành cho trái (còn gọi là cành ác hay cành ngang): Đó là cành mang trái, thường phát sinh từ mầm nách trên cây tiêu lớn hơn một năm tuổi. Đặc trưng của cành ác là góc độ phân cành lớn, mọc ngang, độ dài của ngành ngắn hơn 1 m, cành khúc khuỷu và lóng rất ngắn, cành cho trái trên bộ khung cây tiêu đa số là cành cấp hai trở lên. Cành cho trái nếu đem giâm cành cũng ra rễ, cho trái rất sớm. Tuy vậy, cây phát triển chậm, không leo mà mọc thành bụi vì lóng đốt không có rễ bám hoặc rất ít. Cây mau cỗi và năng suất thường thấp. Hoa, quả: Cây tiêu ra hoa dưới dạng hoa tự hình gié, treo lủng lẳng, dài 7-12 cm tùy giống tiêu và tùy điều kiện chăm sóc. Trên gié hoa có bình quân 20-60 hoa xếp thành hình soắn ốc, hoa tiêu lưỡng tính hay đơn tính. Trái tiêu thuộc loại trái hạch, không có cuống, mang một hạt hình cầu. Từ khi hoa xuất hiện đầy đủ cho đến khi trái chín kéo dài từ 7-10 tháng chia làm các giai đoạn sau: Hoa tự xuất hiện đầy đủ đến khi hoa nở thụ phấn: 1-1,5 tháng. Thụ phấn, phát triển trái (4-5,5 tháng): Giai đoạn này tiêu lớn nhanh về kích thước và đạt độ lớn tối đa của trái, đây là giai đoạn tiêu cần nước và dinh dưỡng nhất. Trái chín (2-3 tháng): Trong giai đoạn này hạt bắt đầu phát triển, đạt đường kính tối đa. Trái tiêu thường chín tập trung vào các tháng 1-2 trong năm, đôi khi kéo dài đến các tháng 4-5 do các lứa hoa ra trễ và cũng tùy theo giống. 1. 4 Bệnh hại trên cây hồ tiêu và biện pháp phòng trừ 1.4.1 Bệnh hại chính trên hồ tiêu Theo Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam, căn cứ vào các kết quả điều tra nghiên cứu trong và ngoài nước, người ta đã xác định trên cây hồ tiêu có trên 40 loại sâu, bệnh gây hại trên cây hồ tiêu và cây trồng, vật liệu được sử dụng làm “ choái” cho cây tiêu. Tuy nhiên trên những vùng trồng hồ tiêu chính ở nước ta theo các tác giả: Theo Ngô Vĩnh Viễn (2007), trên hồ tiêu có ba nhóm dịch hại có ý nghĩa kinh tế 22
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP và cần được quan tâm nghiên cứu giải quyết là: Bệnh chết nhanh, bệnh chết chậm và bệnh do virus. 1.4.1.1 Bệnh chết nhanh Triệu chứng bệnh chết nhanh: Bệnh gây hại trên tất cả các vùng trồng hồ tiêu ở nước ta. Triệu chứng bệnh thường quan sát rõ nét nhất và điển hình nhất vào cuối mùa mưa và đầu mùa khô. Ban đầu các đầu chóp rễ làm rễ biến màu và có mầu nâu nhạt hay mầu nâu thấm nước, sau chuyển sang màu nâu đen, rễ bị thối và không cung cấp đủ nước và dinh dưỡng cho cây và cây bị héo nhanh, mép lá hơi co lại và trở nên vàng trước khi rụng, sau khi lá rụng quả bắt đầu bị nhăn nheo và khô. Trên thân cây bị bệnh thường quan sát thấy mạch dẫn trong thân bị đen. Bệnh có thể quan sát thấy trong mùa mưa từng nhánh cây bị héo xanh vào mùa mưa và có thể chết từng phần trên “nọc tiêu”. Nhiều khi trong mùa mưa bệnh cũng gây thối chùm hoa và chùm quả (Đoàn Nhân Ái, 2007). Bệnh chết nhanh là nguyên nhân gây suy thoái vườn tiêu ở nhiều địa phương như: Cam Lộ- Quảng Trị, Chư Sê - Gia Lai, Xuân Lộc - Đồng Nai, Phú Quốc - Kiên Giang Các vùng tiêu từ Đà Nẵng trở vào thường biểu hiện chết nhanh rõ nhất vào cuối tháng 12 đầu tháng giêng ( lúc kết thúc mùa mưa chuyển sang mùa khô), các tỉnh từ đèo Hải Vân trở ra biểu hiện của bệnh lại rõ hơn ở cuối tháng tháng 4 đầu tháng năm - khi gió mùa đông bắc không còn gây mưa ở vùng này (Cục Bảo vệ Thực vật, 2007). Nguyên nhân gây bệnh chết nhanh. Có nhiều công trình nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh chết nhanh và đi đến thống nhất bệnh do nấm Phytophthora gây ra. Những nghiên cứu mới nhất của trường Đại học tổng hợp Sydney trong khuôn khổ của dự án ACIAR đã cho thấy có 23
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP tới 3 loài nấm Phytophthora tham gia gây triệu chứng chết nhanh: Phytophthora capsici, P. nicotianae, P.cinnamomi, trong đó loài nấm Phytophthora capsici là phổ biến hơn ở tất cả các vùng trồng tiêu. Điều tra nghiên cứu tại Đắc Nông thì Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam cũng thu được kết quả tương tự. Bằng phương pháp bẫy du động bào tử bằng cánh hoa hồng ( hoặc một số hoa có cánh hoa có mầu ) đã phát hiện còn có sự tham gia của nấm Pythium - một loại nấm cùng họ với nấm Phytophthora (Đoàn Nhân Ái, 2007) Nguyễn Tăng Tôn (2005) cho rằng bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora capsici là bệnh quan trọng nhất hiện nay trên cây tiêu ở Việt Nam. Ngoài ra một số nấm gây bệnh khác như Fusarium sp., Pythium sp., Rhizoctonia solani cũng là các tác nhân quan trọng góp phần gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu. 1.4.1.2 Bệnh chết chậm Triệu chứng bệnh chết chậm Bệnh chết chậm thường có triệu chứng vàng lá từ từ, nhiều khi cây hồ tiêu bị bệnh 2 - 3 năm sau mới chết. Cây bị bệnh kém phát triển, năng suất thấp. Bộ rễ cây thường bị hủy hoại. Tùy thuộc vào từng vùng mà trên rễ có biểu hiện thâm đen, khó khăn trong việc cung cấp nước và dinh dưỡng. Quan sát thấy trên rễ có nhiều mụn u sưng, vết thâm đen trên rễ do tập đoàn tuyến trùng gây ra. Gốc thân, cổ rễ bị thâm đen, thối khô. Các bó mạch trong thân bị chuyển mầu thâm đen. Trong điều kiện mùa khô rệp sáp gây hại trên rễ cũng gây triệu chứng héo vàng. Nhiều địa phương mối cũng tham gia gây hại. Triệu chứng chết chậm biểu hiện rõ ràng cả trong mùa khô và trong mùa mưa. Rõ ràng bệnh chết chậm hay hiện tượng vàng lá chết dây từ từ là một hội chứng rất phức tạp. Đây là hội chứng phức hợp do nhiều nguyên nhân gây ra (Đoàn Nhân Ái, 2007). 24
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Tác nhân gây bệnh chết chậm Thu thập mẫu bệnh ở nhiều địa phương khác nhau mà chủ yếu tại Quảng Trị, Đắc Nông thì Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam ghi nhận có nhiều tác nhân tham gia: Tuyến trùng vùng rễ, rệp sáp, mối, nấm Fusarium sp.Nhiều mẫu bệnh thu thập tại các tỉnh trồng tiêu còn có sự hiện diện của cả nấm Phytophthora và Pythium. Phân tích bộ rễ cây sau khi trồng còn ghi nhận sự hiện diện của tập đoàn tuyến trùng tuyến trùng mà đặc biệt là tuyến trùng u sưng (Ngô Thị Xuyên, 2002). 1.4.1.3 Bệnh virus hại hồ tiêu Bệnh vi rút trên hồ tiêu được biết đến với tên gọi “ tiêu điên”. Cây mới bị bệnh trên lá có triệu chứng khảm hay còn gọi là hoa lá, lá nhỏ lại và cây phát triển còi cọc. Giai đoạn cuối, các đốt thân sưng lên và các đốt xít gần nhau, nhiều khi gây hiện tượng “nổ đốt - tháo đốt” . Bệnh gây hại làm cho vườn tiêu phát triển chậm, dần dần tàn lụi và giảm năng suất rõ rệt (Cục Bảo vệ Thực vật, 2007). 1.4.2 Biện pháp phòng trừ 1.4.2.1 Biện pháp canh tác Làm đất: Đất là nơi lưu tồn của nhiều mầm bệnh khác nhau, do đó đất trở thành nguồn dự trữ, tích lũy và lây lan mầm bệnh. Khi cày bừa đất chúng ta đã thay đổi lý tính, cấu trúc, nhiệt độ và ẩm độ trong đất từ đó thay đổi môi trường sống của các tác nhân bệnh. Ngoài ra việc cày đất còn giúp vùi các tác nhân gây bệnh xuống dưới sâu làm chúng khó hoặc không thể phát triển bình thường. Luân canh: Luân canh giúp chúng ta cắt đứt nguồn lương thực của một số tác nhân gây bệnh chuyên tính, nhờ đó giảm bớt mật số mầm bệnh. Luân canh còn giúp những cây trồng lạ tiết ra những chất ức chế mầm bệnh của cây trồng trước đó, ngoài ra các chất từ rễ cũng giúp kích thích các vi sinh vất đối kháng (Phạm Văn Kim và 25
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP ctv, 2000). Xen canh: Việc trồng xen canh dẫn đến giảm mật độ ký chủ trên đơn vị diện tích, giảm thiểu sự tiếp xúc giữa các rễ cùng loại cây với nhau, từ đó hạn chế các mẩm bệnh lây lan qua rễ cũng như đất, thường phân bố không đều và ở dạng lưu tồn, khi chúng chuyển sang dạng hoạt động và gây hại do sự tiếp xúc của cây ký chủ, hoặc do các chất kích thích tiết ra từ rễ cây ký chủ. Do đó việc xen canh làm giảm đáng kể tình trạng kích thích này, mầm bệnh dưới dạng tồn lưu chứ không gây hại (Phạm Văn Kim và ctv, 2000). Sử dụng giống kháng Nghiên cứu chọn tạo ra các giống tiêu có khả năng chịu tốt với các tác nhân bệnh. 1.4.2.2 Biện pháp hóa học Có thể phòng trị bệnh vùng rễ bằng thuốc hóa học như khử đất bằng Kitazin 10H. khi có bệnh mới xuất hiện có thể xịt một số loại thuốc thường dùng sau: Copper B, Kitazin 50ND hoặc Validacin. Tuy nhiên việc xử lý đất bằng phương pháp hóa học thường rất tốn kém và lâu dài sẽ ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái (Phạm Văn Biên, 1989). 1.4.2.3 Biện Pháp sinh học Trong đất, nấm gây bệnh thường được khống chế bởi một số vi sinh vật đối kháng như Trichoderma sp, Gliocladium sp, vi khuẩn Pseudomonas sp, Bacillus sp. Do đó việc tao môi trường đất cân đối bằng kỹ thuật nông học đam bảo cho sự tồn tại và khống chế lẫn nhau của các vi sinh vật đối kháng và vi sinh vật gây bệnh, tránh sự bộc phát bệnh là hướng nghiên cứu mang nhiều kết quả tốt đẹp (Phạm Văn Biên, 1989). 1.4.2.4 Biện pháp quản lý cây trồng tổng hợp (ICM) 26
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Biện pháp ICM cho cây tiêu bao gồm việc sử sụng giống ít bị nhiễm bệnh, hom giống tốt, phát hiện và phòng trừ dịch hại kịp thời, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật thân thiện với môi trường và áp dụng đúng kỹ thuật, khuyến cáo sản xuất nông nghiệp tốt (GAP) như bồi dưỡng đất, dùng cây họ đậu làm cây che phủ nhằm tạo môi trường đất tốt và cây tiêu khỏe, giúp cây chống chịu với dịch hại và điều kiện bất lợi từ môi trường (Tôn Nữ Tuấn Nam, 2007). 1. 5 Một số nấm bệnh hại trong đất 1.5.1 Phytophthora 1.5.1.1 Vị trí và phân loại Tên của giống nấm bệnh Phytophthora có nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp (Phyto có nghĩa là thực vật; phthora có nghĩa là vật phá hoại ). Phytophthora infestans còn được biết như loài nấm gây nên nạn mất mùa khoai tây ở Ailen. Nó đã phá hoại trên diện rộng những vụ mùa chính của khoai tây trong suốt hai năm 1845 và 1846. Căn bệnh này đã gây nên tác hại nghiêm trọng về kinh tế và xã hội cho đất nước này, đó là nạn đói và sự ra đi của hai triệu cư dân. Sau đó vài thập kỷ nó lại gây nên một cuộc tranh cải lớn về bệnh tàn lụi muộn, Anton de Bary cũng như Rev. Miles Joseph Berkeley trước đó đã khẳng định: giống nấm này có thể là nguyên nhân chính gây nên bệnh tàn lụi muộn. Và cho đến năm 1876 nó có tên là Phytophthora infestans (Bary). Bệnh Phytophthora đã được nghiên cứu sâu ở châu Âu. Tuy nhiên đây lại là bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều bệnh nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng ở những vùng này: như bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái (Ngô Vĩnh Viễn, 2003). Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn thuộc lớp Oomycetes, có mặt khắp mọi nơi trên thế giới và có hơn 1.000 cây kí chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch hại (Gregory, 1983). Trong khi Phytophthora cinnamomi được tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì Phytophthora palmivora, Phytophthora. parasitica và Phytophthora 27
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP citrophthora là đặc trưng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; Phytophthora infestans, Phytophthora syringae và Phytophthora fragariae xuất hiện phổ biến ở vùng ôn đới. ➢ Ngành : Chromista ➢ Lớp : Oomycetes ➢ Bộ : Peronosporales ➢ Họ: Pythiaceae ➢ Giống: Phytophthora 1.5.1.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc Ta có thể xác định một số loài Phytophthora thông qua một số đặc điểm hình thái sau (A. Drenth và B. Sendall, 2004): Túi bào tử • Hình thái túi bào tử (hình dạng, kích thước, chiều dài, chiều rộng, ), hệ gai của túi, tính rụng sớm của chúng. • Chiều dài của cuống trên túi bào tử. • Sự tăng sinh của túi bào tử. • Nhánh của cuống túi bào tử mà trên đó túi bào tử sinh ra. Một số loài Phytophthora tạo ra bào tử ngay trên môi trường Agar, trong khi nhiều loài khác cần dược nuôi cấy trong nước, dung dịch muối khoáng và dịch trích từ đất pha loãng trước khi chúng tạo ra bào tử. Điều quan trọng hơn là sự tạo ra bào tử trên Phytophthora phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng. 28
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.13 Hình ảnh chu kỳ sống của Phytophthora Khi Phytophthora được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, khuẩn ty (Mycelium) của nó phát triển rất nhanh. Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo ra những bào tử vô tính được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặc túi bào tử động (Zoosporangia). Túi bào tử này nảy mầm trong môi trường nước hoặc khi nhiệt độ môi trường giảm. Chúng phóng thích ra những bào tử động (Zoospores) với hệ lông roi không đều nhau (Heterokont flagella). Những bào tử động sau khi được phóng thích sẽ bơi lội hàng giờ liền và cuối cùng ngừng bơi lội để cuộn tròn hay kết kén. Sau một thời gian chúng hình thành vách tế bào. Ở giai đoạn này, bào tử được gọi là kén hay nang (Cyst). Bào tử vách dày (Chlamydospore) ở dạng hình cầu hay oval, là một cấu trúc nghỉ vô tính. Cấu trúc hữu tính bao gồm túi giao tử đực (Antheridium - bộ phận sinh sản đực) và túi noãn ( Oogonium - bộ phận sinh sản cái). Quá trình giảm phân hình thành nên túi giao tử đực và túi noãn. Đây chỉ là giai đoạn đơn bội trong vòng đời của Phytophthora. Giai đoạn lưỡng bội đóng vai trò quyết định trong suốt chu kì sống của chúng. Các vòi thụ tinh từ túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử đực vào noãn. Hợp tử sau khi được thụ tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp tùy thuộc vào sự kết hợp của trứng với một hay nhiều ống giao tử đực. Giống Phytophthora bao gồm một số loài nấm dị tản 29
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP (Heterothallic) chẳng hạn như P.infestans. Số còn lại là những loài nấm đồng tản (Homothallic) bao gồm cả P. sojae hoặc P. porri (Nguyễn Thân, 2004). 1.5.1.3 Nấm Phytophthora gây bệnh cây trồng Theo Kularatne (2002), các bệnh quan trọng nhất trên cây tiêu gồm bệnh chết nhanh do Phytophthora. Đối với bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora sp. là tác nhân gây bệnh chính. Bệnh chết nhanh trước tiên được ghi nhận là do nấm Phytophthora palmivora, nhưng sau đó nấm được đặt lại tên Phytophthora palmivora MF4 (Tsao et al., 1985). Tên nấm bệnh được Alizadeh and Tsao (1985) đã xác định lại chủng Phytophthora palmivora MF4 phân lập từ cây ca cao và hồ tiêu với tên Phytophthora capsici, theo nghĩa rộng, và cuối cùng là Phytophthora capsici sensu lato (Tsao and Alizadeh, 1988). Việc làm cỏ trong vườn tiêu bị bệnh sẽ làm phát tán bệnh nhanh hơn (Manohara và cộng sự, 2002), và nấm gây bệnh có thể tồn tại 20 tuần trong đất ở độ thủy dung 100%. Bệnh thối rễ chết nhanh do P. capsici gây thất thoát sản lượng từ 5– 10 % hàng năm ở Mã Lai. Ngoài ra Ở Việt Nam tình hình bệnh do phyhtopthora diễn biến rất phức tạp trên những loại cây trồng khác. Bệnh tàn lụi lá trên cây cà chua và khoai tây Được nghiên cứu ở vùng đồng bằng sông Hồng trong những năm 1960. Tác nhân gây bệnh là Phytophthora infestans. Bệnh xuất hiện hàng năm từ tháng 12 đến tháng 3 khi điều kiện khí hậu lạnh và ẩm; gây mất mùa 30 – 70%, trong trường hợp xấu bệnh gây mất mùa toàn bộ (Vũ, 1973). Ở Khoai sọ bệnh tàn lụi lá gây ra bởi Phytophthora colocasiae được xem là bệnh chính trên khoai sọ ở Bắc Việt Nam. Bệnh thối nõn ở dứa là một trong những bệnh chính gây mất năng suất dứa. 30
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Bệnh được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng dứa trên khắp đất nước gồm Thừa Thiên Huế, Nghệ An, Hà Tây, Bắc Giang, Thanh Hóa và Ninh Bình. Tác nhân gây bệnh là Phytophthora cinnamomi và Phytophthora nicotianae, điều này được chứng minh bởi các thí nghiệm trong nhà kính được kiểm soát tại Viện BVTV quốc gia ở Hà Nội năm 2001. Phytophthora citrophthora được báo cáo đầu tiên trên cam ở đồng bằng sông Cửu Long trong những năm 1950 và không được theo dõi mãi đến những năm 1970, khi bệnh có mặt ở tất cả các vùng trồng cam quýt, như vùng Thanh Trà ở Thừa Thiên Huế, Ninh Bình ở Tiền Giang. Phytophthora citrophthora tấn công thân và quả, với các biểu hiện triệu chứng, làm chảy nhựa và thối quả. Phytophthora palmivora là tác nhân gây bệnh ở sầu riêng, bao gồm thối rễ, loét thân, thối trái và rụng lá. Nó được tìm thấy trong tất cả các vùng trồng sầu riêng ở những vùng cả miền Nam và miền Trung Việt Nam. Bệnh đốm đen trên cây mận đã làm giảm lượng thu hoạch một cách đáng kể ở tỉnh Bắc Hà và Mộc Châu. Phytophthora cactorum được nhận biết là tác nhân gây bệnh. Trong những năm 1960, bắt đầu có những nghiên cứu quan tâm đến bệnh trên cao su ở Việt Nam. 19 bệnh ảnh hưởng đến cao su ở Việt Nam, rụng lá, sọc đen và loét thân gây ra bởi các loài Phytophthora. Phytophthora palmivora được phân lập từ khoảng 70% cây cao su bị bệnh sọc đen, trong khi Phytophthora botryosa được tìm thấy trên 75 – 80% từ lá và trái của những cây cao su bị rụng lá. Cả hai loài Phytophthora palmivora và Phytophthora botryosa được biết là tác nhân gây bệnh trên cao su ở tất cả các vùng trồng trên đất nước (Đang Vu Thi Thanh và cộng sự, 2004). 31
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5.2 Fusarium sp 1.5.2.1 Vị trí phân loại Chi Fusarium là một chi nấm có số lượng loài đã được mô tả đặc biệt lớn, trên một nghìn loài, nhưng cũng là một chi nấm mà số lượng loài đến nay còn được chấp hận so với số lượng loài đã được mô tả nói trên chiếm một tỉ lệ rất nhỏ: trên dưới 1% hoặc 3-4% tùy các tác giả khác nhau. Nguyên nhân do khả năng biến dị rất cao của các chủng thuộc chi Fusarium trên các cơ chất tự nhiên. Những nghiên cứu về phân loại học chi Fusarium từ đầu thế kỷ này, đặc biệt từ những năm 1950 trở lại đây đã có những đổi mới như kỹ thuật nuôi cấy đơn BT, các kỹ thuật hiển vi khác được cải tiến, trước hết là các đặc điểm phân loại của mỗi loài đã được nghiên cứu có hệ thống và do đó đã có những giới hạn cho những đặc điểm đó khá rõ rệt (Lại Văn Ê, 2003). Theo Nguyễn Lân Dũng ( 1979) phân loại Fusarium như sau: Giới: Mycetae (fungi) Ngành: Eumycota Ngành phụ: Deuteromycotina (The imperfect fungi) Lớp: Hyphomycetes Bộ: Hyphales (Moniliales) Họ: Hypocreaceae Chi: Fusarium 1955: Bilai đề nghị một hệ thống gồm 26 loài tập hợp trong 9 nhóm loài. 1977: Bilai bổ sung vào chi này thêm 5 loài nữa. 1971: Booth bổ sung thêm các đặc điểm của bộ máy mang bào tử trần của nhiều loài và căn cứ vào đặc điểm này cùng với các đặc điểm hình thái và nuôi cấy khác, đã đề nghị 12 nhóm loài với 44 loài và được chấp nhận hoặc mô tả mới của chi 32
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Fusarium. Về chi Fusarium ở 3 nước Đông Dương, Bugnicourt (1939) đã phát hiện và mô tả 29 loài và thứ ký sinh trên 112 loài cây Hạt kín và 3 loài côn trùng. Các loài và thứ này đã được kiểm tra lại và đựợc xác định là thuộc 11 loài và thứ còn giá trị, 18 nhóm phân loại khác đã trở thành các tên đồng nghĩa (Bùi Xuân Đồng, 1986). Sau Burnicourt, một số loài và thứ khác thuộc chi Fusarium đã được phát hiện và mô tả. 1.5.2.2 Đặc điểm hình thái , cấu trúc của Fusarium Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Ở nấm Fusarium lỗ ở chính giữa vách ngăn lớn hơn so với các lỗ khác.Thường sinh trưởng rất nhanh, có màu trắng, hồng vàng, tím và thỉnh thoảng xuất hiện màu lục. Fusarium sinh sản vô tính trung bình giữa 3 kiểu bào tử vô tính là bào tử đính lớn (Macroconidia), bào tử đính nhỏ (Microconidia) và BT vách dày (hậu BT - Chlamydospores). BT đính lớn, thường nhiều nhân, hình liềm hoặc thân cong sinh ra từ cuống BT. Đầu và cuối BT lớn thuôn nhọn. Một vài loài BT lớn tách rời và không gắn trên cuống BT, những tế bào sinh BT lớn gọi là thể bình (phialide). Tiểu BT đính thường đơn nhân đôi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng được sinh ra từ một thể bình hay những cuống BT phân nhánh hoặc không phân nhánh. BT đính nhỏ thường được giữ trong một nhóm nhỏ và tiểu BT đính của Fusarium rất giống BT của Cephalosporium vì thế giai đoạn này thường được qui vào nấm Cephalosporium (Đỗ Tấn Dũng, 1996). BT vách dày hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận cùng hoặc chen giữa các sợi nấm giả. Chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, chúng tách ra và mọc các ống mầm nếu BT gặp điều kiện thuận lợi. Hậu BT hay BT vách dày rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài (Trương Duy Lâm, 2006). 33
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5.2.3 Nấm Fusarium gây bệnh cho cây trồng ở việt nam Nấm Fusarium là một trong những loài nấm gây thiệt hại về kinh tế quan trọng nhất.Fusarium gồm nhiều loài khác nhau có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau. Nhiều loài sản sinh ra độc tố có độc tính cao, có ảnh hưởng đến động vật hoang dã, thú nuôi và con người. Tuy nhiên có nhiều loài nấm Fusarium là nấm hoại sinh phổ biến trong đất.Nấm này phân bố khắp các nơi trên thế giới, một vài loài có xu hướng xuất hiện khắp nơi trong khi một số loài chủ yếu xuất hiện ở nhiệt đới, bán nhiệt đới, ôn đới . Thối bắp ngô, chủ yếu do Fusarium graminearum và Fusarium verticillioides gây ra, ngày càng trở nên nghiêm trọng ở Việt Nam. Cả hai loài đều sản sinh độc tố nấm tồn tại trong hạt Hình 1.14 Bệnh Héo Fusarium trên cây chuối do Fusarium oxysporum f.cubensesp. (Burgess LW và cộng sự, 2008) (a) các triệu chứng héo trầm trọng, (b) triệu trứng nứt thân, (c) hóa nâu mạch dẫn. Héo Fusarium trên cẩm chướng do F.oxysporum f.callistephisp. (d) héo trầm trọng gây chết cây, (e) thân héo với nhiều khối bào tử phân sinh màu trắng trên bề mặt. 34
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Bệnh héo vàng là một trong những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại cho cây trồng ở nước ta, bệnh phổ biến ở hầu hết các vùng trồng cây khoai tây, cà chua, đậu đỗ. Hầu hết các loài gây héo nằm trong nhóm Fusarium oxysporum complex. Nhóm Fusarium oxysporum complex có rất nhiều dạng chuyên hóa khác nhau, mỗi nhóm gây hại trên một nhóm kí chủ nhất định. Một số dạng Fusarium solani gây thối cổ rễ cây con họ đậu như đậu Hà Lan, đậu cô ve, và thối rễ ở các cây trưởng thành. Các dạng khác có thể gây hại ở khu vực gốc thân cây lớn, như cây vải, bị yếu đi do yếu tố môi trường làm stress và do các bệnh khác. Fusarium decemcellulare đã được phân lập từ cành nhãn bị thối ở miền bắc Việt Nam (L. Burgess, thông tin chưa xuất bản) và từ cà phê ở Tỉnh Đắc Lắc (TS. Trần Kim Loang, giao tiếp riêng). Danh mục này chưa phải là đầy đủ và còn nhiều loài khác có thể có mặt ở Việt Nam 1.5.3 Rhizoctonia solani 1.5.3.1 Vị trí và phân loại Nấm Rhizoctonia là một nhóm nấm lớn, đa dạng và phức tạp, phân bố khá rộng và được chia thành nhiều nhóm nấm khác nhau. Giai đoạn hữu tính liên quan đến 3 giống: Thanatephorus (giai đoạn vô tính là Rhizoctonia solani Kuhn), Ceratobasidium (giai đoạn vô tính là loài Rhizoctonia hai nhân), và Waitea (giai đoạn vô tính là loài R. zeae Voorhees, R. oryzae Ryker và Gooch và những loài khác) (Carling và Sumner, 1992). Rhizoctonia solani thuộc bộ nấm trơ Mycelia sterilia, lớp nấm bất toàn Fungi imperfecti. Giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk, thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, là nấm kí sinh không chuyên tính, có phổ kí chủ rộng. 35
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5.3.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khi còn non không màu, khi già chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa bào, có đường kính từ 8 - 13µm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chỗ phân nhánh hơi thắt lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Rhizoctonia solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm phân nhánh (lobate hyphae), và các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo Phan Minh Sang, 2003). Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch. Đặc điểm của hạch rất thay đổi. Hạch nấm khi còn non có màu trắng nhưng khi về già có thể có màu nâu, nâu đen, nâu xám, trên vỏ có lông. Hạch nấm có hình dạng phức tạp, ít khi hình cầu, đáy phẳng, bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đường Hồng Dật, 1976). Đường kính hạch nấm từ 1- 6 mm. Từng hạch nấm có thể liên kết lại với nhau tạo thành hạch nấm to (Ou, 1983). Hạch nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi già nổi lên do tế bào phía ngoài hạch trở nên rỗng (dẫn theo Phạm Minh Sang, 2003). Bào tử hậu ít gặp, chỉ phát sinh khi có ẩm độ rất cao. Sinh sản hữu tính tạo đảm đơn bào, không màu, hình bầu dục, có từ 2 - 4 bào tử đảm, hình trứng hoặc hình bầu dục dẹt. Ở nước ta chưa thấy dạng sinh sản hữu tính (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Bào tử đảm không có khả năng tồn tại lâu nhưng có vai trò lớn trong sự biến đổi di truyền của nấm (dẫn theo Hồ Viết Thế, 2005). 1.5.3.3 Nấm Rhizoctonia gây hại cho cây trồng Nấm Rhizoctonia solani phổ biến ở nhiều nơi và có thể gây bệnh cho trên 180 loại cây thuộc 60 họ thực vật khác nhau (Đường Hồng Dật, 1976). Quốc gia nào cũng có bệnh do nấm này gây ra. Ngoài cây lúa, nấm còn gây bệnh trên lúa miến, bắp, mía, đậu nành, đậu xanh. Nấm còn gây bệnh lở cổ rễ trên cà phê, trà, héo rũ 36
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP dưa chuột và bầu bí, gây lở cổ rễ hại bông, héo vàng trên khoai tây (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001). Bệnh héo rủ cây con, thối rễ, thối thân hay loét thân ở giai đoạn cây con hoặc trưởng thành. Ngoài ra, nấm Rhizoctonia solani còn là nguyên nhân gây bệnh trên một số cơ quan khác của cây như thối trái cà chua, khô lá hoặc những đốm đặc biệt trên lá ở gần mặt đất (Agrios, 1997). Haque (1975) đã phát hiện ra đậu phộng (Arachis hypoaea), ớt (Capcicum annum), cà rốt (Daucus carota), đậu nành (Glycine max), bông vải (Gossypium sp.), đại mạch (Hordeum vulgar), xà lách (Lactuca savita), lúa (Oryzae sativa), bắp (Zea mays), cà chua (Lycopersicum esculentum) đều nhiễm R. solani (dẫn theo Hồ Viết Thế, 2005). Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm Rhizoctonia solani là loại nấm bán ký sinh, có tính chuyên hóa rộng, phạm vi ký chủ bao gồm trên 180 loài cây trồng khác nhau. Ở Việt Nam, đậu nành, bắp, lúa miến (Shorgum vulgare), mía, và 27 loài cỏ dại khác ở đồng bằng sông Cửu Long đều là ký chủ của nấm Rhizoctonia solani. Trong khi đó ở Mỹ, có khoảng 550 loài ký chủ của nấm Rhizoctonia solani đã được ghi nhận (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001). 37
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.15 Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra (a) triệu chứng nhọn như đầu mác ở rễ bệnh, (b) bệnh khô vằn trên lúa, (c) hạch nấm trên bắp cải bị bệnh, (d) bệnh trên vỏ ngô (Burgess LW và cộng sự, 2008). 38
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm Thời gian thực hiện đề tài: 03/03 đến 21/07/2015. Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môi trường thuộc trường Đại học Công nghệ Tp.HCM. 2.2 Thiết bị dụng cụ vật liệu Thiết bị và dụng cụ Thiết bị - Máy đo quang phổ UV-Vis 2550 - Máy ly tâm Universal 320 - Nồi hấp khử trùng (Autoclave) - Máy lắc - Kính hiển vi quang học - Cân phân tích - Tủ lạnh Toshiba Dụng cụ - Erlen 250 ml - Đĩa petri - Ống nghiệm - Cốc thủy tinh 50ml, 100ml, 600ml, 1000ml. - Ống đong 50ml, 100ml, - Falcon - Eppendorf - Que cấy - Đũa thủy tinh - Bông thấm nước, bông không thấm nước (Bạch tuyến, Bảo thạch) 39
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP - Bao nhựa, dây thun, giấy báo - Micropipet 1000µl, 100µl và đầu tuýp. - Đèn cồn. Hóa chất: - D-Glucose - CMC - Chitin huyền phù - NaNO3 - K2HPO4 - MgSO4 - MgSO4.7H2O - NH4NO3 - MnSO4 - ZnSO4 - KCl - FeSO4 - Agar - Nước cất - Cồn 700, 960 2.3 Vật liệu 2.3.1 Vi sinh vật nghiên cứu Các chủng Trichoderma được phân lập từ đất vườn hồ tiêu lấy ở xã Xuân Đường, huyện Cẩm Mỹ tỉnh Đồng Nai Các chủng nấm bệnh Rhizoctonia solani, Fusarium sp gây bệnh héo trên cây bắp và hai chủng Phytophthora spp (Phytophthora sp1 gây bệnh trên cây hồ tiêu và Phytophthora sp2 gây bệnh trên cây ca cao) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công 40
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Nghệ Sinh Học trường Hutech. 2.3.2 Môi trường • Môi trường WA Agar: 20g Nước cất: 1000ml • Môi trường ½ Potato D-glucose agar ( ½ PDA) Nước chiết khoai tây : 100ml Glucose : 10 g Agar : 20 g Nước cất : 1000ml PH = 5,5-6,0. khử trùng 1atm/15 phút • Môi trường Potato D-glucose agar ( PDA) Nước chiết khoai tây : 200ml Glucose : 20 g Agar : 20 g Nước cất : 1000ml PH = 5,5-6,0. khử trùng 1atm/15 phút • Môi trường xác định hoạt tính chitinase 41
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP NH4NO3 0,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g K2HPO4 0,7 g KH2PO4 0,3 g FeSO4.7H2O 0,01 g ZnSO4 0,001 g Cloramphenicol 0,005 g Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít. pH: 6-7 • Môi trường xác định hoạt tính cellulase NH4NO3 0,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g K2HPO4 0,7 g KH2PO4 0,3 g FeSO4.7H2O 0,01 g ZnSO4 0,001 g Cloramphenicol 0,005 g CMC 1% Nước cất định mức đến 1000ml pH: 6-7 2.4 Phương pháp nghiên cứu 42
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.1 Phân lập nấm Trichoderma trên đất hồ tiêu 2.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000). Phân lập các chủng nấm ở Đồng Nai từ các mẫu đất. Đối vối mẫu đất thì dùng dao vô trùng gạt bỏ lớp đất mặt và lấy mẫu đất ở độ sâu từ 5- 10cm. Các mẫu sau khi lấy xong thì được phân lập ngay trong vòng 24 giờ 2.4.1.2 phương pháp pha loãng mẫu Cân 10 g mẫu đất,( đã nghiền nhỏ ) cho vào bình tam giác, cho thêm vào bình 90 ml nước muối sinh lý vô trùng và cho vào máy lắc 200 vòng / phút lắc 20 phút, thu lấy dịch lọc ta có độ pha loãng 10 -1 . Lắc đều rồi hút 1ml dịch 10-1 cho vào ống nghiệm đựng 9 ml nước muối sinh lý vô trùng ta được dung dịch pha loảng 10-2 . Tiếp tục pha loãng như thế cho đến nồng độ 10-3 , 10-4, 10-5 , 10-6 Dùng pipet hút 0,1 ml dịch lọc ở các nồng độ 10-3 , 10-4, 10-5 , 10-6 nhỏ lên đĩa petri có chứa môi trường PDA. Dùng que cấy trang dàn đều khắp bề mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục trang lên đĩa 2 và 3. Lật ngược đĩa lại rồi gói bằng giấy báo và nuôi ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Tách các khuẩn lạc riêng rẽ, cấy chuyền cho đến khi đạt độ thuần khiết thì cấy chuyền sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm tiếp theo. 2.4.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm 2.4.2.1 Quan sát đại thể nấm Quan sát đại thể nấm bằng cách tạo khuẩn lạc khổng lồ, cách tiến hành như sau: - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước cất vô trùng 43
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP - Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ các ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm đựng 5 ml nước cất vô trùng , lắc đều tạo dung dịch huyền phù - Dùng que cấy móc nhúng vào dịch huyền phu rồi nhanh chóng chấm một điểm vào giữa đĩa petri có chứa môi trường PDA . - Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-7 ngày để tạo khuẩn lạc khổng lồ, hàng ngày lấy ra quan sát và mô tả các điểm sau: + Tốc độ phát triển của khuẩn lạc (đo đường kính của khuẩn lạc). + Hình dạng, kích thước + Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc (cả mặt trái và mặt phải). + Giọt tiết, sắc tố tiết vào môi trường (Nguyễn Thành Đạt và cộng sự, 2000). 2.4.2.2 Quan sát vi thể nấm ❖ Phương pháp phòng ẩm Chuẩn bị các đĩa petri có chứa môi trường PDA thật mỏng ( khoảng 1mm ) Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có đường kính 8 mm Đặt một miếng thạch mỏng có kích thước 8 mm lên một miếng lam vô trùng. Cấy nấm vào xung quanh của miếng thạch, đậy lamen lên. Cho miếng lam vào giữa đĩa petri có sẵn một miếng giấy lọc hoặc bông đã được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Đậy nắp đĩa petri lại và ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày. Sau 2 - 3 ngày, lấy lam kính ra, khẽ gỡ lá kính, nhỏ vào một giọt lactophenol và quan sát hình thái nấm bằng kính hiển vi ở vật kính 40 và 100 về các đặc điểm như – Khuẩn ty: hình dáng, màu sắc, vách ngăn, sự phân nhánh. – Đặc điểm cơ quan sinh bào tử: cuống sinh bào tử, thể bình và bào tử. ❖ Phương pháp lamen nghiêng 44
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Cấy các chủng nấm váo các đĩa petri có chứa môi trường PDA sau đó, lấy một tấm lamen vô trùng đặt nghiêng một góc 30 – 45oC so với bề mặt thạch, nuôi ở nhiệt độ phòng 2- 3 ngày. Sau 2-3 ngày lấy lá kính ra nhỏ vào một giọt lactophenol và quan sát hình thái nấm sợi bằng kính hiển vi ở vật kính x40 và x100 về các đặc điểm như trên. (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1978). 2.4.3 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase). (Tô Duy Khương, 2007) ❖ Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự phân giải cơ chất chitin và cellulose bởi enzyme chitinase và cellulase. Cơ chất bị phân giải tạo ra các đường khử. Các đường này không cho phản ứng màu với lugol. Vì vậy có thể khảo sát khả năng sinh enzyme Cellulase và Chitinase của các chủng nấm khi nuôi cấy chúng trên môi trường có nguồn cơ chất cacbon duy nhất lần lượt là CMC và huyền phù chitin. Khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase của các chủng nấm được đánh giá dựa vào đường kính vòng phân giải chitin và cellulose sau khi nhuộm màu với thuốc thử lugol. ❖ Tiến hành: – Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm: Cấy điểm các chủng nấm thí nghiệm lên môi trường PDA và ủ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày. – Chuẩn bị môi trường: Pha nấu môi trường sinh cảm ứng rồi hấp khả trùng và đổ đĩa, để nguội để tiến hành cấy nấm Dùng khoan thạch hình trụ đục một miếng thạch (từ đĩa môi trường PGA đã nuôi cấy nấm thí nghiệm) đặt lên tâm đĩa môi trường khảo sát hoạt tính có chứa 1% cơ chất (CMC, huyền phù chitin) và ủ trong thời gian 2 ngày. 45
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Sau 2 ngày, nhuộm màu môi trường bằng cách đổ dung dịch lugol vào đĩa thí nghiệm để yên 5 phút, rửa lại bằng nước cất và tiến hành đo đường kính vòng phân giải. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri. 2.4.4 Đánh giá tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma với chủng nấm bệnh (Fokkema, 1976). ❖ Chuẩn bị nguồn nấm Đĩa nấm Trichoderma gốc: Cấy điểm các chủng Trichoderma cần khảo sát vào giữa đĩa thạch PGA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn đối kháng nấm bệnh. Đĩa nấm bệnh gốc: Cấy điểm các chủng nấm bệnh cần khảo sát vào giữa đĩa thạch PGA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn thử khả năng bị ức chế bởi nấm Trichoderma ❖ Thí nghiệm đối kháng trực tiếp Đĩa đối kháng: Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch có chứa nấm bệnh từ đĩa nuôi cấy nấm bệnh gốc, đặt khoanh thạch cách mép đĩa môi trường PGA là 1cm. Sau 2 ngày cấy nấm bệnh. Tiến hành tương tự khoan lấy 1 khoanh thạch có chứa nấm Trichoderma trên đĩa Trichoderma gốc, đặt vào đĩa có chứa nấm bệnh, cách mép đĩa petri 1cm nhưng ở phía đối xứng với nấm bệnh qua tâm đĩa thạch. Đĩa đối chứng: Lấy khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm đặt tương tự trên đĩa môi trường PGA cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma sp. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát ghi nhận kết quả sau 3, 5, 7 ngày nuôi cấy. Tính tóa khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh cây trồng Phần trăm ức chế nấm bệnh được tính theo công thức: 46
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP PIMG = (R1 – R2)/ R1 x 100 (%) R2 T R1 Đĩa đối chứng Đĩa đối kháng Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp: R1: tản nấm bệnh trên đĩa đối chứng; R2: tản nấm bệnh trên đĩa đối kháng cấy chung với nấm Trichoderma; T: tản nấm Trichoderma trên đĩa đối kháng R1: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng khi không có cấy Trichoderma (mm). R2: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối kháng khi có cấy Trichoderma (mm). 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê. -Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý số liệu. 47
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập nấm Trichoderma từ đất hồ tiêu. Từ các mẫu đất hồ tiêu bị bệnh sinh viên đã phân lập được 8 mẫu nấm (TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8) thuộc chi Trichoderma bằng phương pháp cấy trang và cấy ria mẫu đất tiêu bị bệnh. Hình thái được xác định đến chi dựa trên khóa phân loại của các tác giả Robert A. Samson, Allen S.Heekstra, Jens C.Frisvad ( 2004) và Bùi Xuân Đồng (2000). Đặc điểm hình thái của các chủng nấm này được mô tả như sau: 3.2 Đặc điểm của các chủng nấm Trichoderma phân lập được trên đất hồ tiêu Dựa vào đặc điểm hình thái của các chủng nấm, sinh viên tạm chia chúng thành 2 nhóm. Nhóm 1 gồm các chủng TT1, TT2, TT5, TT6, TT7, TT8. ❖ Đặc điểm của các mẫu nấm Trichoderma thuộc nhóm 1 Đại thể: Tơ nấm dạng bông, màu trắng, đan xen nhau dày đặc hướng dạng tia từ tâm ra ngoài mép đĩa. Bào tử màu xanh xuất hiện đan xen trong lớp tơ dày và đường kính đạt từ 60 đến 80 mm vào ngày thứ 2. Đường kính tản nấm sau 3 ngày đạt 90 mm TT1 TT2 48
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT5 TT6 TT7 TT8 Hình 3.1 Hình thái mặt trước và mặt sau theo thứ tự của nấm TT1, TT2, TT5, TT6, TT7, TT8 sau 3 và 5 ngày. Đặc điểm vi thể: Sợi nấm có vách ngăn. Cành bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính có hình cầu, vách trơn láng. 49
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT1 TT1 TT2 TT2 TT5 TT5 TT6 TT6 50
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT7 TT7 TT8 TT8 Hình 3.2 Hình ảnh sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT1, TT2, TT5, TT6, TT7, T2. ❖ Đặc điểm của các mẫu nấm Trichoderma thuộc nhóm 2 Đại thể: Bào tử màu xanh lục, mặt sau không màu, mép khuẩn lạc mịn có màu trắng do tơ nấm phân bố nhiều ở phần này. Bào tử xanh nhạt xuất hiện, lan rộng và đường kính đạt 60 đến 80 mm vào ngày thứ 2. Đến ngày thứ 3 tơ nấm lan rộng kín đĩa petri đường kính 90mm. 51
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT3 TT4 Hình 3.3 Hình thái mặt trước và mặt sau theo thứ tự của nấm TT3, TT4 sau 3 và 5 ngày. Vi thể: Sợi nấm có vách ngăn. Cành bào tử không phân nhánh. Bào tử đính có hình cầu, màu xanh nhạt và mọc dày đặc thành khối cầu lớn trên cành bào tử, vách trơn láng. TT3 TT3 Hình 3.4 Sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT3 52
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT4 TT4 Hình 3.5 Sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT4 3.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của 8 chủng nấm Trichoderma phân lập được trên đất hồ tiêu bị bệnh. 3.3.1 Khả năng sinh enzyme chitinase Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào chitinase của 8 chủng Trichoderma trên môi trường khảo sát hoạt tính enzyme có bổ sung 1% chitin. Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải Chitin của 8 chủng nấm Trichoderma spp sau hai ngày nuôi cấy. (đơn vị: cm) Đường kính vòng phân giải CHỦNG Chitin (cm) sau 2 ngày nuôi cấy TT1 3,07b ±0,11 TT2 3,33ab ± 0,42 TT3 3,26ab ± 0,11 TT4 3,20ab ± 0,20 53
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT5 3,33ab ± 0,23 TT6 3,60a ± 0,20 TT7 3,33ab ± 0,42 TT8 3,53ab ± 0,12 Kết quả ở bảng trên cho thấy, cả 8 chủng nấm Trichoderma sp đều có khả năng sinh enzyme chitinase ngoại bào tạo vòng phân giải. Theo Gary J. Samuels (2004) đây là các enzyme phân giải vách tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với nấm Trichoderma. Vòng phân giải biến động không nhiều, trong khoảng 3,07 đến 3,6 trong đó chủng TT6 lớn nhất và nhỏ nhất là TT1. Bên cạnh đó đường kính vòng phân giải Chitin khá lớn của các chủng nấm Trichoderma cũng cho thấy triển vọng trong phòng trừ nấm bệnh gây hại cây trồng. Do đó, sinh viên tiếp tục sử dụng 8 chủng nấm Trichoderma sp để nghiên cứu khảo sát khả năng đối kháng với một số nấm bệnh gây hại cây trồng. TT1 TT2 TT3 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 54
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.6 Hình ảnh vòng phân giải Chitin của các chủng nấm Trichoderma sp phân lập được. 3.3.2 Khả năng sinh enzyme Cellulase Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào cellulase của 8 chủng Trichoderma trên môi trường khảo sát hoạt tính enzyme có bổ sung 1% CMC. Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải Cellulose chủa 8 chủng nấm Trichoderma sau hai ngày nuôi cấy. (đơn vị: cm) Đường kính vòng phân giải CHỦNG CMC (cm) sau 2 ngày nuôi cấy TT1 4,53b ± 0,23 TT2 4,53b ± 0,12 TT3 3,93c ± 0,12 TT4 5,13a ± 0,23 TT5 4,93ab ± 0,31 TT6 4,53b ± 0,31 TT7 4,47b ± 0,5 TT8 3,53c ± 0,31 Kết quả ở bảng trên cho thấy, cả 8 chủng nấm Trichoderma sp đều có khả năng sinh enzyme Cellulase ngoại bào mạnh tạo vòng phân giải lớn, biến động trong khoảng 55
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP 3,53 đến 5,13cm, vòng phân giải CMC mạnh nhất thuộc về chủng TT4 và thấp nhất là chủng TT3. Kích thước vòng phân giải CMC sau 2 ngày nuôi cấy cho thấy khả năng sinh cellulase của các chủng nấm Trichoderma spp khá tốt cho thấy tiềm năng ứng dụng trong phòng trừ nấm Phytophthora là rất cao. Do Phytophthora có một lớp vách được cấu tạo chủ yếu bằng cellulose (Sophien kamoun và cộng sự, 1998). TT1 TT2 TT3 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 2 Hình 3.7 Hình ảnh vòng phân giải CMC của các chủng nấm Trichoderma sp phân lập được. 3.4 Đánh giá khả năng đối kháng với các chủng nấm bệnh trong đất và đất hồ tiêu của các chủng Trichoderma phân lập được. Thí nghiệm đối kháng trực tiếp 8 chủng Trichoderma phân lập được với các chủng nấm bệnh trong đất được cung cấp bởi phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trường Hutech là: Chủng nấm Phytophthora sp1 gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu, 56
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Phytophthora sp2 gây bệnh trên cây ca cao, nấm Fusarium sp. gây bệnh trên cây bắp và Rhizoctonia solani. Các thí nghiệm được bố trí trên môi trường PDA, kết quả được trình bày như sau: 3.4.1 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp1. Bảng 3.3 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp1 của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. CHỦNG Tỉ lệ đối kháng (%) với Phytophthora sp1 của các chủng Trichoderma spp ở các ngày sau cấy. NGÀY 3 NGÀY 5 NGÀY 7 TT1 35,00NS ± 0,00 85,09NS ± 25,83 89,58ab ± 18,04 TT2 31,19NS ± 7,84 68,20NS ± 16,54 100,00a ± 0,00a TT3 29,52NS ± 5,07 64,74NS ± 7,75 78,92ab ± 18,26 TT4 31,11NS ± 5,36 76,01NS ± 21,07 100,00a ± 0,00 TT5 29,44NS ± 4,19 83,09NS ± 24,49 100,00a ± 0,00 TT6 32,86NS ± 3,71 85,09NS ± 25,83 88,19ab ± 20,45 TT7 31,03NS ± 6,61 89,75NS ± 13,10 93,33a ± 11,55 TT8 37,70NS ± 2,52 63,77NS ± 2,84 69.83b ± 1,88 57
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Đặc điểm nấm bệnh Phytophthora sp1 bị ức chế theo thời gian 3, 5 và 7 ngày. Số liệu ở Bảng 3.3 cho thấy, cả 8 chủng nấm Trichoderma spp khảo sát đều có khả năng kháng nấm Phytophthora sp1 gây chết nhanh cây hồ tiêu. Các tỉ lệ đối kháng ở các chủng không khác nhau ở thời điểm 3 và 5 ngày nuôi cấy. Sợi nấm Trichoderma phát triển nhanh, tiếp xúc với sợi nấm bệnh và ngăn nấm bệnh phát triển sang vùng chúng đã mọc và tỉ lệ đối kháng chỉ khoảng 29,51 đến 37,7 % ở ngày thứ ba sau nuôi cấy. Sau đó tăng lên 63,77 đến 89,75% vào ngày thứ 5 sau nuôi cấy, ở thời điểm này các nấm Trichoderma spp đã mọc kín các vùng thạch còn trống, một số đã mọc đè lên tảng nấm bệnh. Ngày thứ 7 sau nuôi cấy tỉ, lệ đối kháng các chủng đã đạt đến 69- 100%, và có sự khác biệt rõ giữa các chủng khảo sát. Ba chủng TT4, TT5 và TT7 thể hiện khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp1 rất tốt và có thể ức chế từ 93-100% loài nấm hại này. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào được trình bày ở các phần trên. Vì các chủng này vừa có khả năng sinh enzyme cellulose cao nhưng cũng có khả năng sinh Chitinase tốt. 58
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT1 TT2 TT3 TT4 ĐC 59
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT5 TT6 TT7 TT8 ĐC 60
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.8 Hình ảnh đối kháng với Phytophthora sp của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. 3.4.2 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp2 Bảng 3.4 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp2 của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. Tỉ lệ đối kháng (%) với Phytophthora sp2 của các chủng Trichoderma spp CHỦNG NGÀY 3 NGÀY 5 NGÀY 7 TT1 33,33NS ± 5,77 85,34 NS ± 9,71 93,33 ab ± 11,55 TT2 35 NS 73,71NS ± 13,16 100 a ± 13,16 TT3 29,44 NS ± 419 64,34 NS ± 3,53 78,28bc ± 9,54 TT4 30,11 NS ± 5 79,17 NS ± 19,09 100 a TT5 30NS ± 5 87,25 NS ± 17,35 100 a TT6 35,48 NS ± 242 84,75 NS ±21,63 86,84abc ± 22,79 TT7 31,67 NS ± 7,64 85,37 NS ± 9,71 94,29ab ± 9,1 TT8 37,07 NS ± 1,79 64,43 NS ± 1,72 72,5c ± 6,5 Đặc điểm nấm bệnh Phytophthora sp2 bị ức chế theo thời gian 3, 5 và 7 ngày. Tương tự như khả năng đối kháng nấm aPhytophthora sp1, các chủng khảo sát đều kháng tốt với nấm Phytophthora sp2 gây thối quả ca cao. 61
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Ở các ngày đầu (3 đến 5 ngày sau cấy) các chủng đã tiêu diệt được 30 đến 87% nấm Phytophthora sp2 nhưng chưa có sự khác biệt rõ về khả năng đối kháng của các chủng. Tỉ lệ đối kháng đạt trên 90% ở các chủng TT1, TT2, TT4, TT5 và TT7 vào ngày thứ 7. Các chủng Trichoderma spp đã đối kháng, làm cho nấm bệnh tàn lụi gần như hoàn toàn. 62
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT1 TT2 TT3 TT4 ĐC 63
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT5 TT6 TT7 TT8 ĐC 64
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.9 Hình ảnh đối kháng với Phytophthora sp2 của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. 3.4.3 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani Bảng 3.5 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. Tỉ lệ đối kháng (%) với Rhizoctonia solani của các chủng Trichoderma spp CHỦNG NGÀY 3 NGÀY 5 NGÀY 7 TT1 91,11 a ± 15,40 91,95ab ± 13,94 93,33ab ± 11,55 TT2 86,67 a ± 23,10 91,67ab ± 14,43 93,33ab ± 11,55 TT3 100,00 a ± 0,00 100,00 a ± 0,00 100,00 a ± 0,00 TT4 41,11b ± 8,39 79,21b ± 4,17 82,86b ± 2,86 TT5 100,00 a ± 0,00 92,22ab ± 13,47 93,33ab ± 11,46 TT6 78,47 a ± 18,67 89,81ab ± 9,04 100,00 a ± 0,00 TT7 100,00 a ± 0,00 94,25ab ± 9,95 95,24ab ± 8,25 TT8 78,47 a ± 18,67 88,49ab ± 9,99 90,47ab ± 8,25 Đặc điểm nấm bệnh Rhizoctonia solani bị ức chế theo thời gian 3, 5 và 7 ngày Các chủng nấm khảo sát đều có khả năng đối kháng rất tốt với nấm Rhizoctonia solani. Chỉ sau ba ngày nuôi cấy các chủng nấm Trichoderma spp (trừ chủng TT4 chỉ 65
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP đối kháng 41,11% nấm Rhizoctonia solani) đã tiêu diệt từ 78 đến 100% nấm Rhizoctonia solani. Có thể thấy tơ nấm Trichoderma mọc nhanh và lan sang phần tơ nấm bệnh ức chế sự phát triển của nấm bệnh. Đến bảy ngày sau cấy, các chủng này đã kìm hãm >90% nấm Rhizoctonia solani, riêng chủng TT4 tuy hiệu lực chậm nhưng đến bảy ngày sau cấy cũng kìm hãm đến 82,86% nấm Rhizoctonia solani. Ở thời điểm này nấm bệnh đã ngừng phát triển và bị lụi tàn gần như hoàn toàn. Như vậy, các chủng nấm Trichoderma spp đều đối kháng tốt với nấm Rhizoctonia solani. (Tỉ lệ đối kháng lớn hơn 82,86%) 66
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT1 TT2 TT3 TT4 ĐC 67
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT5 TT6 TT7 TT8 ĐC 68
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.10 Hình ảnh đối kháng với Rhizoctonia solani của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. 3.4.4 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp. Bảng 3.6 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. Tỉ lệ đối kháng (%) với Fusarium sp của các chủng Trichoderma spp CHỦNG NGÀY 3 NGÀY 5 NGÀY 7 TT1 35,91ab ± 4,99 81,92ab ± 16,03 100a TT2 21,69b ± 17,81 66,72bc ± 6,22 92,91 a ± 12,29 TT3 32,10ab ± 4,67 67,55bc ± 0,88 71,44bc ± 6,31 TT4 25,98ab ± 3,06 63,02c ± 2,46 62,03c ± 5,44 TT5 37,74ab ± 11,42 85,53 a ± 12,99 87,95ab ± 11,83 TT6 31,86ab ± 5,94 81,97ab ± 7,81 100a TT7 37,99ab ± 2,97 68,55abc ± 4,77 84,57ab ± 13,49 TT8 39,70a ± 12,74 82,27ab ± 16,14 90 a ± 17,32 69
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Đặc điểm nấm bệnh Fusarium sp. bị ức chế theo thời gian 3, 5 và 7 ngày. Số liệu ở Bảng 3.6 cho thấy, cũng như đối kháng với các loài nấm bệnh khác, các chủng nấm Trichoderma spp khảo sát đều đối kháng tốt với nấm Fusarium sp. Ở 3 ngảy sau nhiễm, các chủng nấm có thể ức chế từ 21 đến 39,7% nấm Fusarium sp, tơ nấm Trichoderma phát triển nhanh tiếp xúc đồng thời ngăn không cho nấm bệnh phát triển sang vùng chúng đã mọc và đến 5 ngày tỉ lệ ức chế lên đến khoảng 63 đến 82%. Bảy ngày sau cấy, TT1, TT2, TT6 và TT8 ức chế >90% nấm bệnh. Chủng TT7 và TT5 ức chế 84,57 đến 87,95% nấm Fusarium và thấp nhất là chủng TT4, chỉ ức chế 62,03% nấm Fusarium sp. 70
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT1 TT2 TT3 TT4 ĐC 71
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TT5 TT6 TT7 TT8 TT1 72
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.11 Hình ảnh đối kháng với Rhizoctonia sp của 8 chủng nấm Trichoderma sp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. Khảo sát đều đối kháng tốt với nấm Rhizoctonia solani. Các chủng TT1, TT2, TT6, TT8 đối kháng rất Fusarium sp. Điều này mở ra triển vọng cho việc nghiên cứu nhân nuôi các chủng nấm này, bổ sung vào đất để quản lý các chủng na6m1ga6y bệnh côn trùng. Các chủng Trichoderma spp khảo sát đều có khả năng ức chế tốt với các loài nấm bệnh trong đất như Phytophthora sp1 gây hại cây hồ tiêu, Phytopthora sp2 gây thối quả ca cao, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia sp gây bệnh héo trên cây bắp. Với nhóm nấm Phytophthora sp1 và Phytophthora sp2, các chủng TT2, TT4, TT5, TT7 có khả năng đối kháng tốt nhất 73
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận – Đã phân lập được 8 chủng nấm Trichoderma spp từ đất hồ tiêu tại Đồng Nai có khả năng sinh trưởng mạnh. – Các chủng Trichoerma spp phân lập từ đất hồ tiêu có khả năng sinh enzyme Chitinase và Cellulase khá tốt. – Các chủng nấm Trichoderma spp phân lập có khả năng đối kháng với các bệnh có trong đất như Phytophthora spp, Rhizoctonia solani, Fusarium sp. – Các chủng TT2, TT4, TT5, TT7 đối đối kháng rất tốt nấm Phytophthora spp – Tất cả các chủng đều đối kháng rất tốt nấm Rhizoctonia solani. – Các chủng TT1, TT2, TT6, TT8 đối kháng tốt với nấm Fusarium sp. 4.2 Kiến Nghị: – Tiếp tục khảo sát khả năng đối kháng của các chủng có triển vọng với các loài nấm bệnh trong điều kiện invivo. – Định danh các loài nấm Trichoderma spp phân lập được. – Nghiên cứu khả năng nhân nuôi tạo chế phẩm từ các chùng nấm để trừ bệnh hại trong đất. 74
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 1. Đoàn Nhân Ái (2007). Một số nguyên tắc phòng trừ bệnh chết nhanh trên cây tiêu, Diễn Đàn khuyến nông @ công nghệ lần thứ 5, chuyên đề các giải pháp kỹ thuật nâng cao năng suất, chất lượng và giá trị hồ tiêu. 2. Phạm Văn Biên (1989). Phòng trừ sâu bệnh hại tiêu, Nhà xuất bản nông nghiệp, 72 trang. 3. Phạm Văn Biên, Nguyễn Văn Tá, Mai Thị Vinh, Trần Minh Tú, Nghiêm Bảo Tuấn (1990). Kết quả nghiên cứu sâu bệnh hại tiêu (Piper nigrum), Tạp chí nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, số 339, tr 544-548. 4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000). Vi sinh vật học (tập 1,2), NXB Đại học và Trung học Chuyên nghiệp, Hà Nội. 5. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1978). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập3), NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học ( tập 2 & 3), NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 7. Đỗ Tấn Dũng (1996). Kết quả nghiên cứu phạm vi ký chủ của nấm Fusarium sp hại trên một số giống cây trồng, cây cảnh và cỏ dại vùng Hà Nội năm 1996, Kết quả nghiên cứu khoa học Khoa Trồng trọt, đại học nông nghiệp I. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 8. Nguyễn Văn Đĩnh, Đỗ Tấn Dũng và Hà Quang Hùng (2004). Giáo trình biện pháp sinh học trong bảo vệ thực vật, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. 75
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP 9. Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000). Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục. 10. Lại Văn Ê (2003). Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ sinh học nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani Kühn gây bệnh chết cây con trên bông vải (Gossypium hirsutum L.), Luận văn thạc sĩ, khoa Nông Nghiệp, Đại Học Cần Thơ. 11. Huỳnh Văn Hiếu (2009). Nghiên cứu sử dụng nấm sợi Aspergillus sp. và Trichoderma sp. xử lý bã khoai mì để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh, Đại Học Bách Khoa TpHCM: TpHCM. 12. Trần Nguyên Ha (2010). Using Trichoderma species for biologycal control of plans pathogens in Viet Nam, Issaas. 13. Phạm Văn Kim (2000). Các nguyên lý bệnh hại cây trồng, Tài liệu học tập ngành Nông Học và Trồng Trọt. 14. Trương Duy Lâm (2006). Như những đóa hồng. Tạp chí hoa cảnh số 10/ 2006. 15. Hứa Võ Thành Long (2010). Sản xuất bào tử nấm Trichoderma. sp làm thuốc trừ nấm bệnh cây trồng, Đại Học Công Nghệ Tp.HCM. 16. Tôn Nữ Tuấn Nam (2007). Một số giải pháp kỹ thuật để phát triển sản xuất hồ tiêu bền vững vùng Tây Nguyên, Diễn Đàn khuyến nông @ công nghệ lần thứ 5, chyên đề các giải pháp kỹ thuật nâng cao năng suất, chất lượng và giá trị hồ tiêu. 17. Huỳnh Văn Phục (2006). Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúc và bắp, Đại học Nông Lâm Tp.HCM: Tp.HCM. 18. Tôn Nữ Tuấn Nam (2007). Một số giải pháp kỹ thuật để phát triển sản xuất hồ tiêu bền vững vùng Tây Nguyên, Diễn Đàn khuyến nông @ công nghệ lần thứ 5, chyên đề các giải pháp kỹ thuật nâng cao năng suất, chất lượng và giá trị hồ tiêu. 76
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP 19. Huỳnh Văn Phục (2006). Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúc và bắp, Đại học Nông Lâm Tp.HCM: Tp.HCM. 20. Nguyễn Phạm Phương Thảo (2009). Vi nấm Trichoderma-giải pháp bảo vệ thực vật bằng đấu tranh sinh học, Đại Học Sư Phạm Huế: Tp Huế. 21. Nguyễn Văn Tuất (2004). Nghiên cứu sản xuất xử dụng thuốc trừ sâu sinh học đa chức năng cho một số loại cây trồng bằng kỹ thuật công nghệ sinh học, Bộ khoa học và công nghệ Hà Nội. 22. Trần Thị Thanh Thuần (2009). Nghiên cứu xử lý vỏ cà phê bằng Trichoderma viride và Aspergillus niger để sản xuất phân bón hữu cơ bán tổng hợp, Bách khoa TPHCM. 23. Vũ Nguyên Thành (2009). Nghiên cứu khả năng đối kháng và tiềm năng ứng dụng của một số chủng Trichoderma phân lập từ RNM trên một số nấm bệnh thực vật, Đại Học Sư Phạm Hà Nội. 24. Nguyễn Thân (2004). Tuyển chọn một số dòng nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu và bệnh xì mủ cây sầu riêng, Luận án thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông lâm, TP. Hồ Chí Minh. 25. Ngô Vĩnh Viễn, Bùi Văn Tuấn, Mai Thị Liên, Đặng Lưu Hoa, F. Benyon, và A. Denth (2003). Kết quả điều tra bệnh thối nõn dứa do nấm Phytophthora gây ra, Hội thảo quốc gia bệnh cây và sinh học phân tử, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội. 26.Cục Bảo vệ Thực vật (2007). Báo cáo tình hình sản xuất hồ tiêu và ảnh hưởng của các loại dịch hại quan trọng tới sản xuất tại Việt Nam, Hội thảo sâu bệnh hại tiêu và biện pháp phòng trừ Đắc Nông. 27.Ngô Thị Xuyên (2002). Kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne bằng phương pháp sinh học. Hội thảo bệnh cây và sinh học phân tử, lần thứ nhất, Đại học Nông lâm TP. Hồ 77
ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP Chí Minh, Nhà xuất bản Nông nghiệp. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 28. Chacón Mariola R. (2007). Microscopic and transcriptome analyses of early colonization of tomato roots by Trichoderma harzianum, international microbiology. 29. Francesco Vinale (2008). Trichoderma–plant–pathogen interactions, Soil Biology & Biochemistry. 30. Fokkema N. J. (1993). Oppurtunities and problems of control of foliar pathogens with microorganisms, Pestic Sci, 37, 411-416. 31. Harman G. E., et al (2004) Trichoderma species opportunistic, avirulent plant symbionts, Nat Rev Microbiol. 32. Kularatne (2002). Pests and diseases of black pepper (Piper nigrum L.), in Sri Lanka, Paper presented at the Symposium on Pests and Diseases on Pepper, Sarawak, Malaysia. 33. Mark Schubert and Siegfried Fink (2008) In vitro screening of an antagonistic Trichoderma strain against wood decay fungi. Arboricultural. 34. Sophien kamoun, et al (1998). Resistance of Nicotiana benthamiana to Phytophthora infestans is Mediated by the Recognition of the Elicitor Protein INF1, American Soclety of Plant Physlologlsts. TÀI LIỆU INTERNET 35. 36. ồ_tiêu 78
PHỤ LỤC PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU Kết quả xử lý vòng phân giải Chitin Summary Statistics for chitin Standard Coeff. of Minimu Maximu Rang Stnd. CHUNG Count Average deviation variation m m e skewness C1 3 3.06667 0.11547 3.76533% 3.0 3.2 0.2 1.22474 C2 3 3.33333 0.416333 12.49% 3.0 3.8 0.8 0.914531 C3 3 3.26667 0.11547 3.5348% 3.2 3.4 0.2 1.22474 C4 3 3.2 0.2 6.25% 3.0 3.4 0.4 0.0 C5 3 3.33333 0.23094 6.9282% 3.2 3.6 0.4 1.22474 C6 3 3.6 0.2 5.55556% 3.4 3.8 0.4 0.0 C7 3 3.33333 0.416333 12.49% 3.0 3.8 0.8 0.914531 TR2 3 3.53333 0.11547 3.26802% 3.4 3.6 0.2 -1.22474 Total 24 3.33333 0.268112 8.04336% 3.0 3.8 0.8 0.875023 ANOVA Table for chitin by CHUNG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.613333 7 0.087619 1.35 0.2918 Within groups 1.04 16 0.065 Total (Corr.) 1.65333 23 Multiple Range Tests for chitin by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG Count Mean Homogeneous Groups C1 3 3.06667 X C4 3 3.2 XX C3 3 3.26667 XX C7 3 3.33333 XX C5 3 3.33333 XX C2 3 3.33333 XX TR2 3 3.53333 X C6 3 3.6 X Kết quả xử lý vòng phân giải CMC Summary Statistics for CMC CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness C1 3 4.53333 0.23094 5.09427% 4.4 4.8 0.4 1.22474 C2 3 4.53333 0.11547 2.54713% 4.4 4.6 0.2 -1.22474 C3 3 3.93333 0.11547 2.93568% 3.8 4.0 0.2 -1.22474 C4 3 5.13333 0.23094 4.49883% 5.0 5.4 0.4 1.22474 C5 3 4.93333 0.305505 6.19267% 4.6 5.2 0.6 -0.6613 C6 3 4.53333 0.305505 6.73908% 4.2 4.8 0.6 -0.6613 C7 3 4.46667 0.503322 11.2684% 4.0 5.0 1.0 0.41407 TR2 3 3.53333 0.305505 8.64637% 3.2 3.8 0.6 -0.6613 Total 24 4.45 0.544538 12.2368% 3.2 5.4 2.2 -0.800171 1
ANOVA Table for CMC by CHUNG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5.48667 7 0.78381 9.41 0.0001 Within groups 1.33333 16 0.0833333 Total (Corr.) 6.82 23 Multiple Range Tests for CMC by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG Count Mean Homogeneous Groups TR2 3 3.53333 X C3 3 3.93333 X C7 3 4.46667 X C6 3 4.53333 X C2 3 4.53333 X C1 3 4.53333 X C5 3 4.93333 XX C4 3 5.13333 X Đối kháng với Phytophthora sp1 • Ba ngày Summary Statistics for DKPHYTOPH3 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness C1 3 35.0 0.0 0.0% 35.0 35.0 0.0 C2 3 31.19 7.83571 25.1225% 25.0 40.0 15.0 0.944998 C3 3 29.5233 5.0677 17.1651% 25.0 35.0 10.0 0.577409 C4 3 31.11 5.35689 17.2192% 25.0 35.0 10.0 -1.0922 C5 3 29.4433 4.19281 14.2403% 25.0 33.33 8.33 -0.415015 C6 3 32.8567 3.71236 11.2987% 28.57 35.0 6.43 -1.22474 C7 3 31.0333 6.61085 21.3024% 25.0 38.1 13.1 0.485219 TR2 3 37.7 2.52389 6.69466% 35.0 40.0 5.0 -0.491632 Total 24 32.2321 4.95615 15.3765% 25.0 40.0 15.0 -0.426266 ANOVA Table for DKPHYTOPH3 by CHUNG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 170.538 7 24.3626 0.99 0.4734 Within groups 394.422 16 24.6514 Total (Corr.) 564.96 23 Multiple Range Tests for DKPHYTOPH3 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG Count Mean Homogeneous Groups C5 3 29.4433 X C3 3 29.5233 X C7 3 31.0333 X C4 3 31.11 X C2 3 31.19 X C6 3 32.8567 X C1 3 35.0 X TR2 3 37.7 X 2
• Năm ngày Summary Statistics for DKPHYTOPH5 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness C1 3 85.0867 25.8307 30.358% 55.26 100.0 44.74 -1.22474 C2 3 68.2 16.5436 24.2575% 55.26 86.84 31.58 0.966185 C3 3 64.7367 7.74969 11.9711% 60.0 73.68 13.68 1.2183 C4 3 76.01 21.0662 27.7151% 60.53 100.0 39.47 1.07564 C5 3 83.0867 24.4925 29.4783% 55.0 100.0 45.0 -1.1495 C6 3 85.0867 25.8307 30.358% 55.26 100.0 44.74 -1.22474 C7 3 89.7533 13.0951 14.5901% 75.0 100.0 25.0 -0.965375 TR2 3 63.7733 2.83645 4.4477% 60.53 65.79 5.26 -1.11873 Total 24 76.9667 18.6331 24.2094% 55.0 100.0 45.0 0.444709 ANOVA Table for DKPHYTOPH5 by CHUNG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2202.69 7 314.669 0.87 0.5496 Within groups 5782.78 16 361.424 Total (Corr.) 7985.47 23 Multiple Range Tests for DKPHYTOPH5 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG Count Mean Homogeneous Groups TR2 3 63.7733 X C3 3 64.7367 X C2 3 68.2 X C4 3 76.01 X C5 3 83.0867 X C6 3 85.0867 X C1 3 85.0867 X C7 3 89.7533 X • Bảy ngày Summary Statistics for DKPHYTOPH7 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness C1 3 89.5833 18.0422 20.1401% 68.75 100.0 31.25 -1.22474 C2 3 100.0 0.0 0.0% 100.0 100.0 0.0 C3 3 78.9167 18.2626 23.1416% 68.0 100.0 32.0 1.22242 C4 3 100.0 0.0 0.0% 100.0 100.0 0.0 C5 3 100.0 0.0 0.0% 100.0 100.0 0.0 C6 3 88.1933 20.4497 23.1874% 64.58 100.0 35.42 -1.22474 C7 3 93.3333 11.547 12.3718% 80.0 100.0 20.0 -1.22474 TR2 3 69.8333 1.87639 2.68695% 68.75 72.0 3.25 1.22474 Total 24 89.9825 14.6857 16.3206% 64.58 100.0 35.42 -1.67808 ANOVA Table for DKPHYTOPH7 by CHUNG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2532.24 7 361.749 2.38 0.0712 Within groups 2428.18 16 151.761 Total (Corr.) 4960.42 23 Multiple Range Tests for DKPHYTOPH7 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG Count Mean Homogeneous Groups 3
TR2 3 69.8333 X C3 3 78.9167 XX C6 3 88.1933 XX C1 3 89.5833 XX C7 3 93.3333 X C5 3 100.0 X C4 3 100.0 X C2 3 100.0 X Đối kháng với Phytophthora sp2 • Ba ngày Summary Statistics for DKPHYTOPH3 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness C1 3 33.3333 5.7735 17.3205% 30.0 40.0 10.0 1.22474 C2 3 35.0 0.0 0.0% 35.0 35.0 0.0 C3 3 29.4433 4.19281 14.2403% 25.0 33.33 8.33 -0.415015 C4 3 30.11 5.00363 16.6178% 25.0 35.0 10.0 -0.139635 C5 3 30.0 5.0 16.6667% 25.0 35.0 10.0 0.0 C6 3 35.4767 2.42046 6.82269% 33.33 38.1 4.77 0.602332 C7 3 31.6667 7.63763 24.1188% 25.0 40.0 15.0 0.6613 TR2 3 37.0667 1.78979 4.82856% 35.0 38.1 3.1 -1.22474 Total 24 32.7621 4.71362 14.3874% 25.0 40.0 15.0 -0.631288 ANOVA Table for DKPHYTOPH3 by CHUNG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 174.329 7 24.9042 1.18 0.3654 Within groups 336.689 16 21.0431 Total (Corr.) 511.018 23 Multiple Range Tests for DKPHYTOPH3 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG Count Mean Homogeneous Groups C3 3 29.4433 X C5 3 30.0 X C4 3 30.11 X C7 3 31.6667 X C1 3 33.3333 X C2 3 35.0 X C6 3 35.4767 X TR2 3 37.0667 X • Năm ngày Summary Statistics for DKPHYTOPH5 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness C1 3 85.3667 9.71416 11.3793% 75.0 94.26 19.26 -0.471505 C2 3 73.71 13.1551 17.8471% 60.53 86.84 26.31 -0.0120939 4
C3 3 64.3433 3.5311 5.4879% 60.53 67.5 6.97 -0.571278 C4 3 79.1667 19.0941 24.1188% 62.5 100.0 37.5 0.6613 C5 3 87.2533 17.346 19.88% 67.5 100.0 32.5 -1.0756 C6 3 84.7533 21.6283 25.5191% 60.0 100.0 40.0 -1.12841 C7 3 85.3667 9.71416 11.3793% 75.0 94.26 19.26 -0.471505 TR2 3 64.43 1.71747 2.66564% 62.5 65.79 3.29 -0.939727 Total 24 78.0487 14.613 18.7229% 60.0 100.0 40.0 0.543057 ANOVA Table for DKPHYTOPH5 by CHUNG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1890.49 7 270.07 1.43 0.2605 Within groups 3020.91 16 188.807 Total (Corr.) 4911.39 23 Multiple Range Tests for DKPHYTOPH5 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG Count Mean Homogeneous Groups C3 3 64.3433 X TR2 3 64.43 X C2 3 73.71 X C4 3 79.1667 X C6 3 84.7533 X C7 3 85.3667 X C1 3 85.3667 X C5 3 87.2533 X • Bảy ngày Summary Statistics for DKPHYTOPH7 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness C1 3 93.3333 11.547 12.3718% 80.0 100.0 20.0 -1.22474 C2 3 100.0 0.0 0.0% 100.0 100.0 0.0 C3 3 78.28 9.53704 12.1832% 68.0 86.84 18.84 -0.555203 C4 3 100.0 0.0 0.0% 100.0 100.0 0.0 C5 3 100.0 0.0 0.0% 100.0 100.0 0.0 C6 3 86.8433 22.788 26.2404% 60.53 100.0 39.47 -1.22474 C7 3 94.2867 9.89578 10.4954% 82.86 100.0 17.14 -1.22474 TR2 3 72.5 6.49519 8.95888% 68.75 80.0 11.25 1.22474 Total 24 90.6554 13.3616 14.7389% 60.53 100.0 39.47 -2.06425 ANOVA Table for DKPHYTOPH7 by CHUNG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2338.87 7 334.124 3.02 0.0316 Within groups 1767.39 16 110.462 Total (Corr.) 4106.26 23 Multiple Range Tests for DKPHYTOPH7 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG Count Mean Homogeneous Groups TR2 3 72.5 X C3 3 78.28 XX C6 3 86.8433 XXX C1 3 93.3333 XX 5