Đồ án Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

242 trang thiennha21 13/04/2022 4760

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_phan_lap_va_tuyen_chon_cac_chung_bacillus_ung_dung_tro.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Quách Hồng Thúy MSSV: 1411100668 Lớp: 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2018
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên Quách Hồng Thúy 1
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp LỜI CÁM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Viện Khoa Học Ứng Dụng cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Hai, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên Quách Hồng Thúy 2
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp i
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Phương pháp nghiên cứu 1 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2 4. Ý nghĩa đề tài khoa học 2 5. Các kết quả đạt được của đề tài 3 6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp: . 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4 1.1 Tổng quan về chủng Bacillus spp . 4 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu . 4 1.1.2 Phân loại 5 1.1.3 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên . 5 1.1.4 Đặc điểm hình thái học 6 1.1.5 Đặc điểm sinh hóa 6 1.1.6 Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử 8 1.1.7 Khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng Bacillus spp 10 1.1.8 Mức độ an toàn sinh học 16 1.2 Tổng quan về các chủng nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long . 16 i
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 1.2.1 Giới thiệu về bệnh đốm trắng 16 1.2.2 Tác hại của bệnh đốm trắng: .19 1.2.3 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh 19 1.2.4 Phân loại 21 1.2.5 Đặc điểm hình thái học 22 1.2.6 Lịch sử nghiên cứu 22 1.3 Nấm gây bệnh héo vàng trên cây ớt (Fusarium sp.) 25 1.3.1 Giới thiệu về bệnh héo vàng trên cây ớt 25 1.3.2 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh chủ yếu 25 1.3.3.Lịch sử nghiên cứu . 27 1.3.4 Phân loại 27 1.3.5 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên . 27 1.3.6 Đặc điểm hình thái học 28 1.4 Giới thiệu về enzyme ngoại bào 29 1.4.1 Tổng quan về Enzyme Chitinase 29 1.4.2 Tổng quan về Enzyme Cellulase 32 1.5 Phân giải lân khó tan trong đất .35 1.5.1 Khái niệm 35 1.5.2 Sự chuyển hóa lân trong đất 36 1.5.3 Vi sinh vật phân giải lân khó tan 37 ii
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 1.6 Khả năng sinh IAA 39 1.6.1 Lịch sử nghiên cứu IAA 40 1.6.2 Khái niệm 41 1.6.3 Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR) . 42 1.6.4 Các chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR) 44 1.7 Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus spp. ứng dụng vào sản xuất nông nghiệp 45 1.7.1 Nghiên cứu nước ngoài 45 1.7.2 Nghiên cứu trong nước 46 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48 2.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 48 2.2 Vật liệu nghiên cứu 48 2.2.1 Vật liệu 48 2.2.2 Hóa chất . 48 2.2.3 Môi trường . 49 2.3.Thiết bị và dụng cụ 50 2.3.1 Thiết bị 50 2.3.2 Dụng cụ . 51 2.4 Bố trí thí nghiệm 52 2.5 Phương pháp nghiên cứu .54 iii
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 54 2.5.2 Phương pháp pha loãng . 55 2.5.3 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn 55 2.5.4 Phương pháp tăng sinh 56 2.5.5 Phương pháp quan sát hình thái tế bào 57 2.5.6 Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa 58 2.5.7 Phương pháp cấy chuyển để bảo quản giống . 65 2.5.8 Phương pháp bảo quản giống bằng giữ lạnh . 65 2.5.9 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của các chủng vi khuẩn . 66 2.5.10 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 69 2.5.11 Khả năng phân giải phosphate khó tan 75 2.5.12 Khả năng sinh IAA 77 2.5.13 Phương pháp đối kháng nấm 78 2.5.13 Đánh giá khả năng phòng trừ nấm bệnh trên trái thanh long 79 2.5.14 Đánh giá khả năng phòng trừ nấm bệnh trên cây ớt 81 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 83 3.1 Kết quả phân lập các chủng Bacillus spp. từ đất nông nghiệp . 83 3.1.1. Đặc điểm hình thái của các chủng 83 3.1.2 Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của các chủng 89 iv
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng 90 3.2.1 Khả năng sinh enzyme chitinase 90 3.2.2 Khả năng sinh enzyme cellulase 92 3.3 Khả năng đối kháng nấm của các chủng 95 3.3.1. Khả năng đối kháng nấm Fusarium sp 95 3.3.2. Khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh long 97 3.4. Khả năng phân giải lân khó tan của các chủng 100 3.5 Khả năng sinh IAA của các chủng 102 3.9 Đánh giá khả năng ức chế nấm bệnh của các chủng vi khuẩn đối với thanh long ứng dụng bảo quản sau thu hoạch 105 3.10 Kết quả hiệu quả đối kháng nấm Fusarium sp. gây chết cây ớt . 110 3.11 Định danh các chủng có triển vọng 117 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 120 4.1. Kết luận 120 4.2. Kiến nghị 120 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 122 PHỤ LỤC 1 v
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT NB: Môi trường Nutrient Broth NA: Môi trường Nutrient Agar NMSL: Nước muối sinh lý PDA: Môi trường Potato D-glucose Agar PDB: Môi trường Potato D- glucose Broth LBNT: Lây bệnh nhân tạo vi
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Đặc điểm hình thái và khuẩn lạc Bacillus spp. trên môi trường NA theo Malarkodi Chelladurai et al (2013) Hình 1.2: Triệu chứng bệnh khi xuất hiện trên thân, cành thanh long (Nguồn: Viện bảo vệ thực vật, 2014) Hình 1.3: Triệu chứng bệnh trên quả thanh long chin (Nguồn: Viện bảo vệ thực vật,2014) Hình 1.4 Hình thái nấm Scytalidium dimidiatum dưới kính hiển vi ở vật kính 40X. Hình 1.5: Đặc điểm hình thái vi nấm Fusarium oxysporum (Jeon CS et al, 2013) Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải cellulase của các chủng Bacillus spp. Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải chitinase của các chủng Bacillus spp. Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn – dựng đường chuẩn tế bào Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mật độ nấm – dựng dường chuẩn nấm Hình 3.1.: Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn. Quan sát ở 100x Hình 3.2: Kết quả nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn. Quan sát 100X Hình 3.3: Đường kính vòng phân giải chitin (cm) Hinh 3.4: Đường kính vòng phân giải CMC (cm) Hình 3.5: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Fusarium sp.của các chủng Bacillus spp. vii
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Hình 3.6: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum của các chủng Bacillus spp. Hình 3.7: Hàm lượng photphat khó tan do các chủng Bacillus sp.p. phân giải (Trong đó A: thí nghiệm; B: đối chứng) Hinh 3.8: Lượng photphat các chủng Bacillus spp. phân giải theo thời gian Hình 3.9: Khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn. (Trong đó A: Bổ sung tryptophan, B: là không bổ sung tryptophan) Hình 3.10: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus spp. Hình 3.11: Chỉ số bệnh hại trên thanh long sau 7 ngày Hình 3.13: Chiều cao cây qua các nghiệm thức Hình 3.14: Chiều dài rễ qua các nghiệm thức Hình 3.15: Số lá qua từng nghiệm thức Hình 3.16: Kết quả giải trình tự gen 16S của mẫu BPS6 Hình 3.17: Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH (NCBI) của chủng BPS6 Hình 3.18: Kết quả giải trình tự 16S của chủng BTA7 Hình 3.19: Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH (NCBI) của chủng BTA7 viii
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số thử nghiệm sinh hóa đặc trưng ở Bacillus spp. Bảng 1.2: Các chất kháng sinh được tổng hợp ở một số loài Bacillus spp. (M. Dworkin, The Prokaryotes, 2006) Bảng 3.1 : Hình dạng khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được Bảng 3.2 : Kết quả thử nghiệ sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được. Bảng 3.3: Khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng sau 24 giờ Bảng 3.4: Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập Bảng 3.5: Hiệu quả ức chế nấm Fusarium sp. của các chủng vi khuẩn Bảng 3.6: Hệu lực ức chế nấm bệnh sau 3 ngày, 5 ngày (%) Bảng 3.7: Khả năng phân giải photphate khó tan sau các khoảng thời gian (휇𝑔/ 푙) Bảng 3.8: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus spp. sau 5 ngày Bảng 3.9: Chỉ số bệnh đốm trắng trên thanh long ở các nghiệm thức Bảng 3.10: Tỷ lệ (%) nảy mầm, tỷ lệ (%) sống sót, chiều dài rễ, chiều cao cây, số lá trên cây. ix
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây, nền nông nghiệp Việt Nam ngày càng được nhiều nước trên thế giới biết đến với những mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực như: lúa, gạo, cà phê, hồ tiêu, ớt, thanh long, vú sữa Đáp ứng được những tiêu chí về chất lượng của các nước trên thế giới. Tuy nhiên, nông nghiệp ở nước ta vẫn còn dựa chủ yếu vào phân bón và thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Hệ quả, nông dân không chỉ tốn nhiều chi phí cho hóa chất mà sự đa dạng hệ vi sinh vật đất và chất lượng đất bị suy giảm nghiêm trọng. Vì vậy, biện pháp sinh học được tập trung nghiên cứu và thay thế dần các biện pháp hóa học. Các kết quả nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng với nhiều loài nấm gây bệnh có thể bảo vệ cây trồng, chống lại các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt (Dunlap et al, 2013; Jamil Shafi et al., 2017; Radhakrishnan et al., 2017). Do đó, nhiều chủng Bacillus đã được sản xuất thành chế phẩm ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo phân bón vi sinh đã được quan tâm và triển khai (Phạm Văn Toản, 2002). Tuy nhiên, việc sử dụng Bacillus để trừ bệnh hại vẫn còn khá hạn chế, chủ yếu là nhập chế phẩm từ nước ngoài. Mặt khác, hiệu lực đối kháng bệnh của các chủng Bacillus vẫn khá biến động. Xuất phát từ những lý do trên, sinh viên tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp.” 2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tổng hợp tài liệu: + Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên quan đến đề tài. + Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài. 1
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp - Phương pháp nghiên cứu: + Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào và tuyển chọn các chủng có khả năng sinh enzyme mạnh nhất từ các nguồn đất. + Thực hiện một số khảo sát về hình thái, thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho các chủng Bacillus spp. để tuyển chọn chủng mong muốn, loại các vi sinh vật có nguy cơ gây bệnh. + Bố trí các thí nghiệm khảo sát tương ứng từng thí nghiệm - Phương pháp thu thập và xử lý số liệu: + Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát. + Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS) và Microsoft Excel 2013. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: Nghiên cứu thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế nấm bệnh từ các nguồn đất khác nhau. - Phạm vi giới hạn đề tài: Vi khuẩn Bacillus spp. được phân lập từ đất. 4. Ý nghĩa đề tài khoa học - Ý nghĩa khoa học: Phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng ức chế nấm bệnh đạt hiệu quả cao, góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái tế bào và hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn nhóm Bacillus subtilis. - Ý nghĩa thực tiễn: 2
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Dựa trên kết quả thí nghiệm nghiên cứu thu được để góp phần tìm ra chủng vi khuẩn có khả năng ức chế nấm bệnh mạnh ứng dụng để tạo ra các chế phẩm bảo quản sau thu hoạch thanh long, các loại phân bón sinh học góp phần nâng cao sự phát triển ở cây trồng, thay thế dần các sản phẩm hóa học góp phần bảo vệ môi trường. 5. Các kết quả đạt được của đề tài -Phân lập được 8 chủng vi khuẩn, từ kết quả phân lập sau khi định danh sơ bộ bằng các phản ứng test sinh hóa đặc trưng của Bacillus subtilis thì trùng khớp. -Kết quả khả năng ức chế nấm bệnh được thực hiện cho các chủng vi khuẩn phân lập được làm cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học. -Bước đầu ứng dụng vi khuẩn phân lập tuyển chọn được vào quá trình bảo quản sau thu hoạch thanh long và nâng cao sự phát triển ở cây ớt 6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp: - Phần Mở đầu. - Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. -Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. -Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được. -Phần Kết luận và đề nghị: nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài. 3
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về chủng Bacillus spp. 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Từ bacillus nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được quan sát dưới kính hiển vi. Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que. Do đó, một số nơi gọi là khuẩn que hoặc trực khuẩn. Tuy nhiên, Bacillus (viết hoa và in nghiêng) là tên của một chi gồm các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí thuộc về họ Bacillaceae trong Firmicutes. Chi Bacillus được đặt tên vào năm 1835 bởi Christian Gottfried Ehrenberg, có chứa vi khuẩn hình que (trực khuẩn). Ông đã có bảy năm trước đó được đặt tên là chi Bacterium. Bacillus sau đó đã được Ferdinand Cohn sửa đổi để mô tả thêm chúng như là bào tử hình thành bào tử, vi khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc vi khuẩn kỵ khí. Giống như các chi khác liên quan đến lịch sử vi sinh vật như Pseudomonas và Vibrio, 267 loài Bacillus có mặt khắp nơi. Chi này có sự đa dạng 16S ribosome rất lớn và đa dạng về môi trường. Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường 4
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường 1.1.2 Phân loại Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus thuộc: Kingdom: Bacteria Division: Firmicutes Class: Bacilli Order: Bacillales Family: Bacillaceae Genus: Bacillus 1.1.3 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên Vi khuẩn Bacillus thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 106– 107 triệu cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi một số loài khác như Bacillus haericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB) theo Hiroshi Fujikawa và Mitsugu Matsushita (2007). 5
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 1.1.4 Đặc điểm hình thái học Hình 1.1: Đặc điểm hình thái và khuẩn lạc Bacillus spp. trên môi trường NA theo Malarkodi Chelladurai et al (2013) Bacillus spp. là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase dương tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt. Các chủng Bacillus spp. có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di chuyển nhanh chóng trong chất lỏng. Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,5-0,8µm × 1,8-3 µm. Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus spp. sẽ hình thành bào tử để vượt qua điều kiện bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus spp. sẽ nảy mầm và phát triển như một tế bào mới với chu kỳ sống mới. Bào tử Bacillus subtilis có hình bầu dục, kích thước khoảng 0,6 - 0,9 µm. Phân bố không theo quy tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm theo Hong et al (2009). 1.1.5 Đặc điểm sinh hóa Bacillus spp. có một số test sinh hóa đặc trưng sau: Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường glucose, maltose, mannitol, sucrose, xylose; Indol (-); VP (+); nitrate 6
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp (+); H2S (-); NH3 (+); catalase (+); amylase (+); casein (+); citrate (+); có khả năng di động và hiếu khí. Bảng 1.1: Một số thử nghiệm sinh hóa đặc trưng ở Bacillus spp. Phản ứng sinh hóa Kết quả Catalase + Indol - MR + VP + Citrate + Nitrate + Gelatin + Di động + Amylase + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - 7
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Maltose + (Theo Holt,1992, trích từ Lý Kim Hữu,2005) 1.1.6 Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử 1.1.6.1 Đặc điểm tế bào Tế bào Bacillus spp. thường có hình que, là tế bào gram dương, chúng có khả năng sinh ra bào tử để tồn tại qua thời điểm khó khăn, điều kiện môi trường khắc nghiệt như nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn. Thành phần hóa học chủ yếu của vách tế bào là lớp peptidoglycan dày mang điện tích dương đóng vai trò là duy trì cấu trúc của vách tế bào theo McKenney et al(2013). 1.1.6.2 Cấu tạo bào tử Bacillus spp. sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử. Bào tử là một cấu trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi trường không thuận lợi, tế bào phát triển đến một giai đoạn nhất định. Hai chủng vi khuẩn gram dương có khả năng tạo bào tử là Bacillus và Clostridium. Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp bào tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó là lớp vỏ của tế bào mẹ, ngay dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp protein mỏng và không có tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng của bào tử. Vỏ của bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu nối nội peptide và ít liên kết chéo. Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách bào tử bao bọc có cấu trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng bất hoạt theo McKenney et al (2013). 1.1.6.3 Đặc điểm của bào tử 8
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Bào tử ở Bacillus spp. không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà chúng là dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại qua giai đoạn điều kiện sống bất lợi. Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong những điều kiện khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất lâu (bào tử trong xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm hoặc trong quặng mỏ 250 triệu năm đến nay vẫn còn sống theo Hong et al (2009). Nhiệt độ 1000C, bào tử của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 - 20 giờ. Ngoài việc chịu được nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn cũng như tác động của nhiều loại hóa chất cũng như các loại tia sáng. Quá trình hình thành bào tử: các tế bào sinh bào tử trong những điều kiện thiếu thức ăn hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử. Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40% và chứa nhiều ion Ca2+. 1.1.6.4 Sự nảy mầm của bào tử Khả năng tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi (2007) thì một trong những đặc điểm quan trọng nhất của Bacillus subtilis là khả năng sinh bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay khi gặp điều kiện bất lợi. Theo Bùi Thị Phi (2007) sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn và mất đến 8 giờ để hoàn tất. Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình gồm 3 giai đoạn là: hoạt hóa, nảy mầm và sinh trưởng. Nảy mầm Protein chứa nhiều cystenin trong áo bào tử hóa xốp lên làm tăng tính thấm, xúc tiến sự hoạt động của enzyme protease. Khi đó lượng protein trong áo bào tử giảm xuống. Các cation bên ngoài có thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương lớp vỏ bào tử lên, sau đó làm tan ra và tiêu đi. Khi đó, nước bên ngoài sẽ xâm nhập vào lớp vỏ bào 9
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp tử, làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hóa, bắt đầu quá trình tổng hợp thành tế bào. Trong quá trình nảy mầm, các đặc tính chịu nhiệt, tính chiết quang, bắt đầu giảm dần, lượng dipicolinate-canxi, acid amin, polypeptide dần dần mất đi, bắt đầu việc tổng hợp DNA, RNA và protein trong vỏ bào tử. Bào tử chuyển thành tế bào sinh dưỡng. Khi nảy mầm, bào tử có thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm ngang. Lúc đó thành tế bào còn rất mỏng và chưa hoàn chỉnh, do đó nâng cao khả năng tiếp nhận thêm DNA ngoại lai để thực hiện quá trình biến nạp. Sức đề kháng của bào tử Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hóa học như: nhiệt độ, tia cực tím, áp suất và chất sát trùng. Bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố: Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ. Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2+ và acid dipicolinic, protein của bào tử kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính ổn định cao đối với nhiệt độ. Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài. Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các chất hóa học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử. 1.1.7 Khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng Bacillus spp. Bacillus spp. là một tác nhân sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh hại cây trồng. Chúng có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnh với phổ tác động rộng, 10
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp không gây hại cho con người và cây trồng. Mặt khác, có thể phân hủy các thành phần thực vật già cõi, hệ sợi nấm đã chết của các loài nấm khác nhau thành các hợp chất hữu cơ nhỏ hơn, theo thời gian tạo thành lớp mùn cho đất (Markovich và Kononova, 2003; Narasimhan và Shivakumar, 2012). Vi khuẩn Bacillus subtilis nằm trong nhóm vi khuẩn có khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh cho cây. Trong các vi sinh vật đối kháng, vi khuẩn Bacillus được chứng minh có khả năng đối kháng với nhiều loại nấm như: Rhizoctonia, Sclerotinia, Fusarium, Pythium và Phytopthora và một số vi khuẩn khác nhờ vào khả năng sinh ra các chất kháng sinh (Lê Đức Mạnh và cộng sự, 2003; Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Thu Hoa, 2005; Nguyễn Xuân Thành và cộng sự, 2003; Võ Thị Thứ, 1996). Tính đối kháng với các nấm hại này bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh. Cạnh tranh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976). Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đông”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ. Tuy nhiên trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus subtilis đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ. Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ cố gắng 11
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt. Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn Bacillus subtilis sẽ tiết ra các chất kháng sinh tiêu diệt vi khuẩn bên cạnh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004). Chủng vi sinh vật có thể tiết ra chất kháng sinh, cạnh tranh về dinh dưỡng hoặc tấn công trực tiếp lên tơ nấm gây bệnh, hay tiết ra những chất kích thích sinh trưởng giúp cho cây trồng tăng khả năng kháng bệnh. * Tiết kháng sinh: - Chi vi khuẩn Bacillus tiết các loại kháng sinh kanosamine (Milner et al., 1996), bacillomycin (Volpon et al., 1999), iturin A2 (Yoshida et al., 2002), prodigrosin và (+)- (S)- dihydroaeruginoic acid (Carmi et al., 1994; Nguyễn Thị Thu Nga, 2003). Theo Carmi et al. (1994) thì DAPG, PRN, PLT và (+)-(S) dihydroaeruginoic acid có khả năng hạn chế các nấm gây bệnh cây như Sclerotium rolfsii, Colletotrichum gloeosp.orioides và Rhizoctonia solani. Trong các loại kháng sinh trên, DAPG và PRN được phát hiện khá nhiều ở các chi vi khuẩn đối kháng. Có loại kháng sinh có phổ ức chế rộng như DAPG, nó có thể ức chế được cả nấm, vi khuẩn và tuyến trùng gây hại (Nguyễn Thị Thu Nga, 2003). Bảng 1.2: Các chất kháng sinh được tổng hợp ở một số loài Bacillus spp. (M. Dworkin, The Prokaryotes, 2006) Loài TÁC DỤNG CỦA CÁC LOẠI KHÁNG SINH Đối kháng Ức chế Kháng sinh Đối kháng Đối vi khuẩn quá trình phổ rộng nấm kháng Gram tạo sợi vi 12
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp dương khuẩn Gram âm Bacillus Subtilin Surfactin Difficidin Bacillomycin subtilis F Bacilysin Oxydifficidin Mycobacillin Bacillus Gramicidin brevis S Lincar Gramicidin Tyrocidin Bacillus Bacitracin licheniformis Surfactin Công thức cấu tạo C53H93N7O13, là chất hoạt động bề mặt rất mạnh, thường được sử dụng như một loại kháng sinh, bao gồm heptapeptides vòng (L-asparagin, acid glutamic, L-leucine, L-valine và hai D-leucines) (Marc Ongena, Guillaume Henry, Philipe Thonart, 2010, Chapter 5). Nó là một lipopeptide vòng tạo ra do các vi khuẩn hình thành nội bào tử gram dương như Bacillus subtilis. Do có hoạt tính bề mặt rất mạnh, nó có tính đối kháng mạnh với vi khuẩn, virus, kháng các tế bào ung thư, chống mycoplasma và tan huyết, tuy nhiên ít tác động đối với nấm. Một chuỗi acid béo kỵ nước dài 13-15 carbon cho phép nó xâm 13
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp nhập vào màng tế bào. Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên trong lớp màng lipid kép, đồng thời ức chế hoạt tính của enzyme cylic AMP phosphodiesterase theo Isaac S., (1992). Iturin Iturin có công thức hóa học C55H86N14O16 (Hiradate et al và Yu et al, 2002), iturin có tính đối kháng mạnh với nấm và nấm men, có khả năng làm tan huyết tuy nhiên kháng khuẩn hạn chế và không có khả năng kháng virus (Nakano, Michiko M., Zuber, Peter, 1998). Trong số các kháng sinh nhóm iturin, đại diện là iturin A, mycosubtilin và bacillomycin thường được nghiên cứu nhiều nhất cho hoạt động kiểm soát sinh học. Đây là những heptapeptides với một acid béo β-amino. Iturin A là lipopeptide chống nấm đặc trưng bởi sự hiện diện của các đồng phân fl-Aminoacid tan trong chất béo. Iturin tác động lên màng tế bào chất, làm tan màng và tạo những lỗ thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng (Marc Ongena, Guillaume Henry, Philipe Thonart, 2010, Chapter 5). Iturin A là một lipopeptide chống nấm đặc trưng bởi sự hiện diện của các đồng phân fl- Aminoacid tan trong chất béo (Pyoung Tl Kim, Jaewon Ryu, Young Hwan Kim, Youn Tae Chi, 2010). Fengycin Theo Vanittanakom et al (1986), fengycin có khả năng làm tan huyết kém hơn iturin và sucfactin, tuy nhiên tính đối kháng với nấm tốt hơn và có một số tác dụng kìm hãm đối với vi khuẩn E.coli (M. Dworkin, 2006). Fengycin được tổng hợp nhiều trong pha tăng trưởng, đạt nồng độ cực đại ở cuối pha tăng trưởng và duy trì ở nồng độ thấp với hàm lượng ổn định trong pha cân bằng (Tsuey-Pin Lin, Chyi-Liang Chen, Li-Kwan Chang, Johannes Scheng-Ming Tschen và Shih-Tung Liu, 1999). 14
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Fengycin là một lipodecapeptide vòng, chứa một acid béo β-hydroxy với chiều dài chuỗi 16-19 nguyên tử carbon. Fengycin ở dạng bột, không màu, tan trong các dung môi hữu cơ phân cực: methanol, ethanol và dimetyl formamit, ít tan trong dichloromethane và tert-butanol, không hòa tan trong nước, acetone, diethylether (Tsuey-Pin Lin, Chyi-Liang Chen, Li-Kwan Chang, Johannes Scheng-Ming Tschen và Shih-Tung Liu, 1999). Bacilysocin Bacilysocin là phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh đối với nấm, được tổng hợp khi bắt đầu pha cân bằng sau đó thì giảm dần. Bacilysocin là kháng sinh có bản chất phospholipid được phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis. Cấu trúc của bacilysocin là 1-(12-methyltetradecanoyl)-3-phosphoglyceroglycerol. Bacilysocin được tổng hợp từ tiền chất là phosphatidylglycerol, là một phospholipid chủ yếu của Bacillus subtilis. Quá trình chuyển phosphatidylglycerol thành bacilysocin được thực hiện bởi enzyme lysophospholypase được mã hóa bởi gene ytpA (Norimasa Tamehiro, Yoshiko Okamoto-Hosoya, Susumu Okamoto, Makoto Ubukata, Masa Hamada, Hiroshi Naganawa và Kozo Ochi, 2002). * Tiết ra các enzym phân huỷ vách tế bào Vách tế bào nấm gồm nhiều thành phần như glucan, chitin, protein (Phạm Văn Kim, 1999). Theo Nielsen và cộng sự năm 1997 thì vi khuẩn đối kháng có khả năng tiết ra các enzyme phân huỷ các thành phần glucan hay chitin hoặc thành phần protein của vách tế bào nấm gây bệnh. Các dòng vi khuẩn Paenibacillus polymyxa, Bacillus pumilus, Bacillus spp. có khả năng tiết enzyme thuộc nhóm glucan như cellulase, mannase và xylanase và các enzyme phân hủy protein của vách tế bào nấm Aphamyces cochlioides gây bệnh thối rễ trên cây củ cải đường. Vi khuẩn Bacillus cereus strain 65 có khả năng tạo enzyme chitinase có khối lượng phân tử 36Kda, chitinase này giúp phân giải diacetylchitodibose. Khi áp dụng Bacillus cereus strain 65 trực tiếp vào đất 15
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp thì bảo vệ cây bông vải con khỏi bệnh thối rễ do nấm Rhizoctonia solani (Pleban, 1997); Nguyễn Thị Thu Nga, 2003). 1.1.8 Mức độ an toàn sinh học Bacillus subtilis là chủng vi khuẩn probiotic thể hệ mới có tính an toàn cao đối với con người. Bacillus subtilis là loài vi khuẩn đã được sử dụng phổ biến ở Nhật Bản trong các món ăn cổ truyền từ hàng nghìn năm trước và là thực phẩm an toàn đối với con người. Hiện nay ở châu Âu và ở Mỹ, vi khuẩn này được chỉ định là đủ điều kiện về an toàn thực phẩm, tiếng Anh gọi là QPS (Qualified Presumption of Safety) hay GRAS (Generally Regarded As Safe). Bacillus subtilis đã được các nhà khoa học chứng minh là rất an toàn và không hề có tác dụng phụ với liều uống lên đến 1×1011 CFU/ngày (Hong et al, 2008). Bacillus subtilis cũng đã được nghiên cứu tính chất, sự an toàn và khả năng tồn tại và phát triển ở ruột (Hong et al, 2009). Theo hướng dẫn của Cộng đồng châu Âu và Mỹ, đề xuất bởi tổ chức Lương thực Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) (FAO/WHO, 2002), Cơ quan An toàn Thực phẩm châu Âu EFSA (European Food Safety Authority, EU) và Cục An toàn Thực phẩm và Thuốc của Mỹ FDA (Food & Drug Administration, USA), Bacillus subtilis đã được định danh tên chủng bằng công nghệ gen. 1.2 Tổng quan về các chủng nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long 1.2.1 Giới thiệu về bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng (đốm nâu) là một loại bệnh nguy hiểm trên thanh long, bệnh hại trên cành và quả gây thiệt hại kinh tế lớn cho nhiều vùng trồng thanh long của bà con. Dựa vào triệu chứng gây hại mà bà con địa phương thường có những tên gọi khác nhau 16
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp như bệnh nấm tắc kè, bệnh đốm nâu, bệnh đốm trắng (do trong quá trình phát sinh, phát triển biểu hiện của bệnh thường thay đổi liên tục theo từng giai đoạn diễn tiến của bệnh). Bệnh đốm trắng thanh long do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Loại nấm này có bào tử sinh trưởng khỏe, khả năng lây lan nhanh, chống chịu tốt với nhiều loại thuốc hóa học đặc trị nấm nói chung (có tính kháng thuốc mạnh) do đó hiện nay chưa có một loại thuốc hóa học nào có khả năng đặc trị loại bệnh này (bệnh đốm trắng; đốm nâu). Bào tử nấm gây bệnh bằng cách nảy mầm trên bề mặt thân cành, quả thanh long, sau đó xâm nhập vào trong mô gây hoại tử. Bệnh đốm trắng hiện nay được xem là vấn nạn của bà con tại các vùng trồng thanh long. Bệnh phát triển mạnh và lây lan rộng tại các tỉnh trồng thanh long (Bình Thuận – Long An - Tiền Giang – Vĩnh Long ). Hiện nay các nhóm thuốc hóa học gần như không có tác dụng triệt đề, nhiều bà con chia sẻ rằng khi phun các loại thuốc được xem là đặc trị bệnh nhưng chỉ có tác dụng “cầm bệnh” một thời gian sau đó chúng lại phát triển mạnh trở lại (tái nhiễm bệnh) (Viện bảo vệ thực vật, 2014). Triệu chứng bệnh biểu hiện trên cành: Khi bệnh mới phát sinh vết bệnh thường là những chấm nhỏ (đốm nhỏ) hình tròn màu trắng. Lúc đầu vết bệnh có biểu hiện hơi lõm xuống so với bề mặt xung quanh, gặp điều kiện thuận lợi (ẩm cao) vết bệnh phát triển to dần và có xu hướng phát triển lồi lên (giống như mụn ghẻ nhô lên) có màu vàng gỉ sắt đến nâu. Khi bệnh nặng số lượng vết bệnh tăng lên và chúng liên kết với nhau tạo thành những vết loang sần sùi nhô lên có màu nâu giống như da con tắc kè nên bà con nhiều nơi gọi là nấm tắc kè. Trong thời kỳ phát triển bệnh nếu gặp mưa ẩm vết bệnh có thể bị thối nhũn (Viện bảo vệ thực vật, 2014). 17
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Hình 1.2: Triệu chứng bệnh khi xuất hiện trên thân, cành thanh long (Nguồn: Viện bảo vệ thực vật, 2014) Triệu chứng bệnh biểu hiện trên quả: Tương như trên cành, các vết bệnh nằm rải rác trên bề mặt quả, vết bệnh là những đốm tròn lồi trên bề mặt quả ảnh hưởng đến chất lượng quả. 18
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Hình 1.3: Triệu chứng bệnh trên quả thanh long chín (Nguồn: Viện bảo vệ thực vật ,2014) 1.2.2 Tác hại của bệnh đốm trắng: Bệnh đốm trắng trên thanh long diễn biến rất phức tạp, lây lan nhanh trên diện rộng, phát triển mạnh vào mùa mưa. Ở một số vườn thanh long mới trồng, bệnh đốm trắng đã xuất hiện trên cành với tỷ lệ bệnh dao động từ 1-5%. Trên một số vườn thanh long kinh doanh, bệnh nặng hơn với tỷ lệ bệnh dao động từ 10-50%. Bệnh phát triển mạnh trên cành non và trên quả gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Nếu không bị bệnh, trọng lượng quả đạt ≥600g/quả. Nếu như quả bị bệnh, hoặc trọng lượng quả <500 g/quả, dẫn đến thua lỗ. Việc thâm canh quá mức, bón phân và sử dụng thuốc BVTV không đúng cách có thể sẽ gây ảnh hưởng đến tình hình dịch hại và ngày càng khó kiểm soát (Viện bảo vệ thực vật, 2014) 1.2.3 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh 19
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Hình 1.4 Hình thái nấm Scytalidium dimidiatum dưới kính hiển vi ở vật kính 40X. A: Tản nấm trên môi trường CMA sau 7 ngày nuôi cấy. B, C, D, E, F, G: các dạng bào tử đốt ( Nguồn: Trung tâm kiểm dịch sau nhập khẩu II, 6/2013) Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, cành bào tử, kích thước bào tử và hình thái tản nấm dựa vào khóa phân loại của Ellis (1976) đã xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên Thanh long là do nấm Scytalidium dimidiatum (B. Sutton & Dyko, 1989), hiện nay nấm còn được gọi tên là Neoscytalidium dimidiatum (Crous & Slippers, 2006). Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có thể sinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp có vách ngăn một tế bào thường có một nhân đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyển hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo 20
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục, chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào được cấu tạo bằng chitin hay glucan đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất, trong nước trên cạn, thực vật, động vật, một số loại ký sinh gây bệnh trên thực vật, động vật đơn bội chiếm ưu thế và người gây ra những thiệt hại lớn. Ascomyta sinh sản sinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đỉnh (conidia) và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+; -) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh túi đa bào sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi. Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch, giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế. Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lổ và quả thể hở. 1.2.4 Phân loại Đặc điểm phân loại của nấm N. dimidiatum (Rous & Slippers., 2006) Kingdom: Fungi Division: Ascomycota Class: Dothideomycetes Order: Botryosphaeriales Family: Botryosphaeriaceae Genus: Neoscytalidium 21
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Species: N. dimidiatum 1.2.5 Đặc điểm hình thái học Tản nấm mọc rất nhanh trên môi trường PDA, 3 ngày sau khi cấy đã mọc đầy đĩa. Tản nấm ban đầu có màu xám trắng sau 10 ngày nuôi cấy có màu xám đen đến màu đen, mặt sau tản nấm có màu đen, không có vòng đồng tâm. Sợi nấm có màu nâu đen đến màu nâu đậm, vươn cao như bông gòn trên bề mặt môi trường. Cành bào tử sinh ra trực tiếp từ bề mặt của môi trường nuôi cấy, cành bào tử đơn lẻ, thẳng hoặc hơi cong. Bào tử đốt có màu nâu nhạt đến nâu sậm, hầu hết không có vết ngăn, bào tử hình thành rất nhanh chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Bào tử dạng chuỗi hoặc đơn lẻ có nhiều hình dạng khác nhau như hình que, hình tròn, hình quả lê, hình trứng, hình trụ. Kích thước trung bình của bào tử khoảng 9.17휇 - 21.2 휇 *4.05휇 -7.75휇 . 1.2.6 Lịch sử nghiên cứu 1.2.6.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước: Thanh long là cây ăn quả phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới. Vì vậy, việc nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm đang được quan tâm, đã có rất nhiều nghiên cứu về tình hình bệnh hại trên Thanh long. Thanh long bị gây hại bởi một số bệnh như bệnh thối đầu cành (Alternaria sp.), bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp.). Tuy nhiên những năm gần đây Thanh long lại bị gây hại nặng bởi nấm Neoscytalidium dimidiatum đây là một bệnh có ảnh hưởng lớn đến năng suất chất lượng sản phẩm gây thiệt hại lớn cho người trồng Thanh long. Trước vấn đề cấp thiết trên, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu tìm hiểu về nấm Neoscytalidium dimidiatum. Theo báo cáo đầu tiên về nấm N. dimidiatum trên cây có múi tại Italya (G. Polizzi et al, 2008) vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện và chú ý ở phía Sicily, Italy trong vườn cây có múi như cam ngọt (Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. 22
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Tarocco Scires) 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh mới với triệu chứng điển hình là chồi kém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm. Theo báo cáo đầu tiên về nấm N.dimidiatum và N.novaehollandiae trên cây xoài tại Australia của ( J. D. Ray, T. Burgess và V. M. Lanoiselet. 2010), N.dimidiatum là loài nấm có phạm vi phân bố và có nhiều ký chủ: cây dương mai, hạt sung, vả, cây có múi, chuối, mận và nhiều cây trồng khác ở Mỹ (Farret al., 1980). N.dimidiatum còn gây hại trên xoài (Reckhaus 1987) và nhất là trên Thanh long (Brown 2012). N.dimidiatum gây nên các triệu chứng như héo cành, chết mầm, thối, chảy gôm và làm cây chết. Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm N.dimidiatum là độ ẩm (Punithalingam and Waterson 1970; Reckhaus 1987; Elshafie and Ba-Omar 2001). N.dimidiatum được báo cáo lần đầu tiên tại Australia liên quan đến bệnh chết mầm của xoài (2010). Tại Australia đã tiến hành khảo sát về sức khỏe cây trồng do Bộ nông nghiệp và thực phẩm Tây Australia kết hợp với kiểm dịch viên Australia thực hiện. Tháng 8 năm 2008 trong cuộc khảo sát này các nghiên cứu đã tiến hành phân lập các triệu chứng chết mầm trên cây xoài và rễ cây sung, sau khi tiến hành phân lập đã phát hiện nguyên nhân gây bệnh làm chết mầm, thối rễ, thối cây là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Neoscytalidium dimidiatum tiếp tục được phân lập và tiến hành giải trình tự một phần DNA của từng vùng ITS kết quả xác định là do Neoscytalidium gây ra. Trong cuộc khảo sát, N.dimidiatum cũng được phân lập từ các mẫu xoài lấy tại Derby, trong tháng 9 năm 2008, Broome vào tháng 9 năm 2008 và Đảo Bathurst, Northen Territory vào tháng 10 năm 2008. Sau khi phân lập, các nhà khảo sát đã tiến hành lây bệnh nhân tạo và tái phân lập theo quy tắc Kock đã thu được kết quả tốt. Tiến hành kiểm tra lại các chủng thu thập với các cuộc điều tra trước (2005) các nhà khảo sát đã phát hiện rằng N.dimidiatum đã xuất hiện và gây hại tại Australia trong thời gian dài trước đó (phân lập từ cây có múi (Torula dimidiate 1914)). Theo báo cáo này, yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển gây hại của bệnh. 23
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Trước đây N.dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau như: Fusicoccum dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea, (Crous et al, 2006). Theo nghiên cứu của Mohd et al (2013), viện nghiên cứu sở nông nghiệp, Đại học quốc gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh đốm trắng đã xuất hiện ở một số cây Thanh long tại Đài Loan. Triệu chứng của bệnh là các vết nhỏ, tròn, vết bệnh lõm, màu cam. Bệnh được xác định do nấm N.dimidiatum gây ra. 1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước: Hiện nay tại Việt Nam có rất ít thông tin về nấm gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long, chỉ có thông tin nghiên cứu của Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền nam (2011) rằng bệnh đốm trắng do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Nấm này còn có tên khác là Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea, bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh và mùa mưa, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển từ 20-300C. Ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan mạnh. Bệnh lây theo gió và nguồn nước nhiễm bệnh. Qua theo dõi thấy bệnh hại nặng ở những vùng có mực nước ngầm cao, những vườn vệ sinh kém, rậm rạp và bị che mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay phân bón phân chuồng chưa ủ hoai, vườn sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng hay vườn bón thiếu trung vi lượng đều có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi có bệnh thì khó phòng trừ hơn. Vết bệnh ban đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, hơi lõm, về sau chuyển sang màu vàng cam và khi bệnh phát triển nặng đốm bệnh trở thành vết loét có màu nâu, hơi nổi lên và gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây, năng suất và giá trị thương phẩm của quả. Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Theo Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2014) khi so sánh trình tự vùng gen ITS-RADN của mười một mẫu phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum tại Viện Nghiên Cứu CNSH và Môi Trường - trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh cho thấy các mẫu 24
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp phân lập tương đồng rất cao với trình tự của loài Neoscytalidium dimidiatum đã được định danh về hình thái. 1.3 Nấm gây bệnh héo vàng trên cây ớt (Fusarium sp.) 1.3.1 Giới thiệu về bệnh héo vàng trên cây ớt Bệnh héo vàng do nấm Fusarium sp. gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn ở nhiều nước châu Âu, châu Á, châu Mỹ và châu Đại Dương. Bệnh thường thấy nhiều ở thời vụ có thời tiết nóng, nhiệt độ trong vụ trồng cà chua trên 250C. Ở những nước có nhiệt độ mát mẻ thường thấy bệnh trong nhà kính. Theo Binder và Hutchinson (1959) cà chua bị bệnh héo vàng do nấm Fusarium sẽ chết nhanh và thiệt hại lớn khi cùng bị tuyến trùng (Meloidogine incognita) xâm nhập vì tuyến trùng làm giảm tính chống bệnh của cà chua đối với nấm Fusarium. Trên cây ớt, bệnh thường gây hại giai đoạn cây con đến ra hoa, quả. Triệu chứng điển hình là lá biến vàng và héo dần từ lá dưới gốc lên lá trên ngọn, cây sinh trưởng kém, cuối cùng toàn cây bị héo và chết. Gốc và rễ cây bệnh có vết nâu rồi khô dần, bó mạch trong thân cây hóa nâu. Phần gốc gần mặt đất teo tóp nhỏ lại và đôi khi có lớp tơ mỏng màu trắng bao phủ. Lá cây chết có màu vàng và khô. Thời gian từ khi cây có biểu hiện bệnh đến khi cây chết kéo dài hàng tháng. 1.3.2 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh chủ yếu 25
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Hình 1.5: Đặc điểm hình thái vi nấm Fusarium oxysporum (Jeon CS et al, 2013) (A): tản nấm sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA; (B) : tản nấm sau 7 ngày nuôi cấy (C): tản nấm sau 7 ngày nuôi cấy mặt dưới đĩa) (D), (E): bào tử vi nấm, (F): cuống bào tử vi nấm. Nấm Fusarium equiseti gây bệnh thối bầu bí khi quả tiếp xúc với đất (Burgess et al, 1988). Nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối nõn ngô (Nelson et al, 1988) và gây thối nõn dứa (Bolkan et al, 1974). Cũng theo Burgess et al (1998) nấm Fusarium oxysporum là tác nhân gây bệnh héo và thối rễ, thân, mầm cây. Theo Binder và Hutchison (1959) cà chua bị bệnh sẽ bị chết nhanh hơn và thiệt hại nhanh hơn khi cùng bị tuyến trùng (Meloidogin incognita) xâm nhập vì tuyến trùng đã làm giảm khả năng chống bệnh của cây gây ra bệnh thối rễ và lở cổ rễ ở cây bí ngô là do nấm. Ngoài ra, theo R.H.Stover ở vùng nhiệt đới loài nấm Fusarium oxysporum còn gây hại trên nhiều ký chủ khác nhau như thuốc lá, cà chua, khoai lang, khoai tây, cây hoa huệ, cây ớt Đây là những bệnh có tác hại kinh tế lớn trong sản xuất. 26
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 1.3.3.Lịch sử nghiên cứu Các loài nấm Fusarium sp. đã được nghiên cứu từ khoảng đầu thế kỷ XIX. Đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm Fusarium đã được công bố và có ý nghĩa lớn trong sự phát triển của khoa học kỹ thuật. Nấm Fusarium thuộc lớp Hyphomycetes., nhóm nấm bất toàn Fungi imperfecti, đây là loại nấm có thành phần rất phong phú và đa dạng, trong đó sự biến động của một số loài phụ thuộc cơ bản vào đặc điểm khí hậu ở các vùng khác nhau trên thế giới. Loài nấm này gây hại nhiều loại cây trồng trên tất cả các bộ phận đặc biệt bộ phận gốc, rễ của cây. 1.3.4 Phân loại Ngành: Ascomycota Lớp: Deuteromycetes Họ: Tuberaulariaceae Bộ: Moniliales Chi: Fusarium 1.3.5 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên Nấm Fusarium là loại nấm tồn tại chủ yếu trong đất xâm nhiễm gây bệnh bên trong bó mạch thông qua bộ rễ do rễ làm nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng. Nấm Fusarium có 2 giai đoạn tồn tại trong đất: giai đoạn sinh trưởng tích cực và giai đoạn tiềm sinh (giai đoạn ngủ nghỉ). Ở điều kiện thích hợp, môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng, nấm sẽ sinh trưởng tích cực. Ngược lại, khi gặp điều kiện bất lợi, lượng dinh dưỡng trong đất còn rất ít thì nấm sẽ chuyển sang giai đoạn tiềm sinh. Lúc này, các loài Fusarium sẽ hình thành cấu trúc tiềm sinh là bào tử hậu. Cũng trong giai đoạn này, cường độ hô hấp và nguồn dinh dưỡng dự trữ được tích lũy trong hệ sợi nấm 27
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp sẽ được các loài Fusarium sử dụng ở mức thấp nhất, nhằm đảm bảo sự tồn tại của chúng trong thời gian dài. Một số loài Fusarium không sản sinh bào tử hậu thì chúng sẽ tiếp tục tồn tại bằng cách làm chậm lại các hoạt động hoại sinh hay ký sinh trong cơ thể vật chủ. Vì thế, sau khi thu hoạch vụ mùa với các cây bị bệnh do Fusarium thì khả năng trong đất còn sót lại Fusarium là rất cao. Nấm Fusarium oxysporum có dạng bào tử lớn trong suốt, có nhiều vách ngăn, bào tử hình trăng khuyết, một đầu thắt lại hình bàn chân. Dạng bào tử nhỏ, đơn hoặc đa bào hình cầu hoặc hình bầu dục. Một số loài Fusarium oxysporum có bào tử nhỏ, bào tử hậu và quả thể hoặc không có bào tử hậu. Theo Booth (1977 -1979) đã chú ý vào bản chất tế bào phân sinh mà từ đó sinh ra bào tử nhỏ, là một trong những chỉ tiêu đầu tiên để phân loại nấm trên cơ sở đó ông cho rằng nấm Fusarium oxysporum có số lượng 90 loài. Gần đây Burgess et al (1993) đã đưa ra cơ sở phân loại nấm Fusarium oxysporum gồm các chỉ tiêu như sau: +Hình thành bào tử lớn. +Hình thành bào tử nhỏ. +Hình dạng và kiểu bào tử nhỏ. +Kích thước của bào tử nhỏ. 1.3.6 Đặc điểm hình thái học Fusarium sp. là chi lớn nhất trong Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau. Nó là nguyên nhân chính làm héo rũ cây chủ. Hệ sợi nấm lan toả khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ. Sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở quá trình chuyển vận nước làm héo cây, Fusarium sp. cũng sản xuất một số chất độc tiết vào mạch dẫn cây chủ cũng có thể gây héo rũ, nhiều loài thực vật bị Fusarium sp. tấn công. Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu 28
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Cơ thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa. Trong một tế bào có một nhân hoặc nhiều nhân. Vách tế bào bằng chitin, glucan. Nấm sống hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật, gặp phổ biến trong đất, cũng gặp trên các vật liệu cellulose. (Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương, 1982) Nấm Fusarium sp. phát triển nhanh chóng trên môi trường PDA ở nhiệt độ 250C và hình thành tản nấm có hình thể tơi xốp như bông hoặc bằng phẳng hoặc lan rộng trên môi trường nuôi cấy. Mặt trên của tản nấm có thể có màu trắng, kem, vàng, vàng cam, đỏ, tím hồng hoặc tím. Mặt dưới nó có thể không màu, vàng cam, màu đỏ, màu tía sẫm, hay màu nâu. 1.4 Giới thiệu về enzyme ngoại bào 1.4.1 Tổng quan về Enzyme Chitinase 1.4.1.1 Khái niệm Chitinase (EC 3.2.1.14), còn gọi là [poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid glucanohydrolase]) là enzyme thủy phân chitin thành các đơn phân N- acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β- 1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Enzyme này có ở nhiều loài khác nhau như thực vật, động vật không xương sống, động vật có vú, côn trùng, chân khớp, nấm, vi khuẩn và virus. Chân khớp và nấm cần chitinase trong sự phân chia tế bào để tăng trưởng. Chitinase được tạo thành trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm. Đối với nấm sợi, chitinase tham gia nhiều chức năng như phân giải thành tế bào, nảy mầm bào tử, phát triển khuẩn ty và tự phân khuẩn ty, biệt hóa bào tử, đồng hóa chitin và ký sinh. Ở vi khuẩn, chitinase được tạo ra để sử dụng chitin làm nguồn carbon. 29
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 1.4.1.2 Phân loại chitinase Dựa vào cấu trúc phân tử: Chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzyme thủy phân đường): - Họ glycohydrolase18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở nhiều loại sinh vật như vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N- acetylglucosaminidase. - Họ glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum), ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae Chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme (EC 3.2.1.17) của động vật và phage, bao gồm motif cuộn α + β và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển. Thực vật và vi sinh vật như Streptomyces tạo chitinase thuộc cả 2 họ, trong khi côn trùng và hầu hết sinh vật khác chỉ tạo chitinase thuộc họ glycohydrolase 18. • Dựa vào trình tự amino acid: Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptid nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm: - Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có vùng đầu N giàu cysteine chứa khoảng 40 acid amin (giống với vùng đầu N ở hevein và các enzyme khác có ái lực đối với chitin hay N-acetylglucosamine) nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C)(peptid nhận biết). Vùng giàu cysteine có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác. Các vùng gắn chitin này không phải luôn đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường hoạt tính xúc tác enzyme mà chúng cần để tạo các đặc tính sinh học riêng 30
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp biệt cho chitinase ở nhiều loài khác nhau. Ở nấm men, vùng gắn chitin nằm ở đầu C giúp định vị chitinase trên thành tế bào nấm men, đóng vai trò trong việc phân tách tế bào mẹ khỏi các tế bào chị em. Ở thuốc lá và nhiều loài thực vật khác, các chitinase này nằm trong không bào và được cảm ứng từ sự nhiễm nấm, vi khuẩn hay virus. Chitinase nhóm I của thuốc lá có vùng đầu C giàu cystein đóng vai trò là vùng gắn chitin. - Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác có trình tự amino acid tương tự ở chitinase nhóm I, thiếu đoạn giàu cysteine ở đầu N và peptide nhận biết ở đầu C. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn. Chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Ở thực vật, các protein nhóm II thuộc loại protein kháng bệnh và được tế bào tiết ra dưới nhiều điều kiện stress khác nhau. - Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II, nhưng rất giống về trình tự với lysozyme ở Hevea brasiliensis, vì thế chúng mang hoạt tính lysozyme. Ở thực vật, các chitinase nhóm III là các protein kháng bệnh và được tiết ra ngoại bào. - Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I và khá giống với chitinase vi khuẩn. Trong phân tử cũng có đoạn giàu cysteine nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I. - Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cysteine) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao. • Dựa vào phản ứng phân cắt: 31
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β- chitobiosidase, N- acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase. Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1=36kDa, pI1=5,3±0,2 và M2=40kDa, pI2=3,9), Gliocladium virens (M=41kDa, pI=7,8). Chitin-1,4-β-chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin (exochitinase) từ đầu không khử tạo thành các sản phẩm chính là các chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma harzianum (M=36kDa, pI=4,4±0,2). N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D- glucosamin. Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 đơn phân N-acetyl-D- glucosamin. Ngoài ra, đối với chitosan - dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, chitosanase (EC 3.2.2.132) xúc tác thủy phân chitosan tạo thành các oligosaccharide tương ứng. 1.4.2 Enzyme Cellulase 1.4.2.1 Khái niệm Enzyme cellulase là một phức hợp enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua phân cắt liên kết 1,4-D–glucoside trong cellulose tạo sản phẩm glucose cung cấp cho công nghiệp lên men. Nguồn thu cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật. Hệ cellulase gồm: + endo -(1,4)–β-D-glucanase (EC.3.2.1.4) + exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC.3.2.1.91) + β-glucosidases (EC.3.2.1.21) 32
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Hoạt động phối trộn thủy phân cellulose thành glucose. 1.4.2.2 Cơ chế tác động của enzyme Cellulase Cellulose là enzyme phức tạp xúc tác sự phân giải cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Gồm ba giai đoạn chủ yếu: Giai đoạn 1: dưới tác động của cellulose và các tác nhân của môi trường làm thay đổi tính chất lý hóa của cellulose, làm cho phân tử cellulose từ dạng tinh thể thành dạng hoạt động. Khi phân tử cellulose ở dạng hoạt động, các endocellulose dễ dàng tác động và phân giải chúng thành cellulose hòa tan (polysaccharide), cellotetrose, cellobiose, glucose, mà chủ yếu của giai đoạn này là tạo thành các cellulose hòa tan. Giai đoạn thứ 2: Cellulose biến đổi sau giai đoạn 1 bị phân giải các cellobiose (disaccharide) và cellotetrose dưới tác dụng của exocellulase. Giai đoạn cuối cùng: dưới tác dụng của cellobiose (β-1,4-glucosidase), các đoạn cellobiose bị thủy phân thành glucose, β-1,4-glucosidase là những enzyme rất đặc hiệu thủy phân cellobiose thành D-glucose. 1.4.2.3. Phân loại và đặc điểm của enzyme Cellulase Theo Wood và Mc.Cral (1979), enzyme cellulase được phân chia theo chức năng thành 3 nhóm: Exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase). Endocellulase (endoglucanase; 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase). β-glucosidase (cellbiase; β-D-glucoside glucohydrolase). Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng từ 40- 600C, pH nằm trong khoảng 4 – 7. Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng 33
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp của nó như glucose, cellobiose. Hg2+ ức chế hoàn toàn cellulose, trong khi các ion như Mn2+, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ. Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 – 15 phút ở 800C. Exocellulase được tổng hợp bởi Trichoderma reesei và đã được các nhà khoa học nghiên cứu rất kỹ. Chúng bao gồm hai loại: exocellulase kiểu I và exocellulase kiểu II. Exocellulase kiểu I chiếm 60% lượng protein có trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Chúng có phân tử lượng khoảng 66.000 Da, điểm đẳng điện là 4,4(PI = 4,4). Loại enzyme này tác dụng cả lên cellulose vô định hình và cellulose kết tinh. Nhưng chúng lại không tác đến cellulose biến tính như carboxylmethyl cellulose (CMC) hay hydroxyethycellulose, cellohexaose β-nitrophenyl, β-glucoside hay β- glucan. Exocellulase kiểu I chứa khoảng 496 amino acid. Exocellulase kiểu II có phân tử lượng 53.000 Da, PI = 5,0. Chúng cũng không tác động lên CMC, chúng có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và cả cellulose không hòa tan. Exocellulose kiểu II chưa khoảng 471 amino acid. Exocellulase của Cellulomonas fimi có một số tính chất khác biệt so với của Trichoderma reesei. Exocellulase của Cellomonas fimi có chứa 443 amino acid. Enzyme này có ba cầu nối disulfide. Hai cầu nối disulfide nằm trong trung tâm hoạt động còn một cầu nối nằm ngoài trung tâm hoạt động. Exocellulase của Clostridium thermocellum có phân tử lượng 68.000 – 75.000 Da. Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Các nhà khoa học chia chúng thành hai loại endoglucase kiểu I và endoglucanase kiểu II. Endoglucanase kiểu I chứa 459 amino acid, phân tử lượng khoảng 48.121 Da. Endoglucanase kiểu II chứa 418 amino acid, phân tử lượng 42.200 Da. Các enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao. 34
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Ngoài ra endoglucanase còn được tìm thấy ở Clostridium themocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật khác. Các endoglucanase của các vi sinh vật khác thường không khác biệt nhiều. β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động trong pH rất rộng (pH từ 4,4 – 8,4), phân tử lượng 50.000 – 98.000 Da, PI (isoeletric point) 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. β-glucosidase của Trichoderma reesei chứa đến 713 amino acid với phân tử lượng là 75.340 Da. Trong dịch chiết, chúng chiếm 1% so với tổng lượng protein thu được. β-glucosidase của Clostridium thermocellum được chia làm hai loại β-glucosidase A và β-glucosidase B. β-glucosidase A chứa khoảng 448 amino acid và có phân tử lượng 51.82 Da. Chúng hoạt động mạnh ở pH 6,0 – 6,5 và ở nhiệt độ 600C. Chúng tham gia thủy phân cellobiose nhưng không thủy phân CMC. 1.5 Phân giải lân khó tan trong đất 1.5.1 Khái niệm: Lân là chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự tăng trưởng của cây trồng, khi không cung cấp đủ lân, cây sẽ sinh trưởng, phát triển chậm, do đó giảm năng suất (Sawyer và Creswell, 2000). Lân có thể ở dạng hòa tan, có giá trị sử dụng đối với cây trồng, cây trồng có thể hấp thu để sử dụng hoặc ở dạng khó tan, cây trồng không thể hấp thu được (Lê Huy Bá, 2000). Lân hòa tan hay còn gọi là lân dễ tan sẽ nhanh chóng bị cố định thành dạng khó tan trong đất chua. Lân khó tan chiếm tới 95-99% tổng lượng lân có trong đất. Tỷ lệ lân dễ tan và lân khó tan trong đất được quyết định bởi thành phần và tính chất của đất, thành phần hữu cơ có trong đất, độ chua, độ kiềm của đất. Hoạt động của các cation kim loại (Ca, Fe, Mg, ) và các hợp chất oxide của các kim loại này trong đất cũng làm lân dễ tan bị cố định. Vì vậy, để cây trồng sử dụng lân sẵn có trong đất đạt hiệu quả vẫn là 35
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp một thách thức lớn với nền nông nghiệp. Trong đất, lân tồn tại ở hai hình thức: vô cơ và hữu cơ. Mỗi hình thức là một dãy liên tục nhiều hợp chất của lân, tồn tại ở các giai đoạn khác nhau và luôn trong trạng thái cân bằng động với nhau (Sharpley, 2006). 1.5.1.1 Lân vô cơ Lân vô cơ tồn tại ở dạng muối phosphate của những nguyên tố Ca, Fe, Al, Mg Ở đất trung tính và đất kiềm thì phosphate canxi là chủ yếu, còn ở đất chua thì phosphate sắt, nhôm là chủ yếu. Có thể phân loại lân vô cơ theo tính tan như sau: - Lân vô cơ khó tan (Ca3(PO4)2, AlPO4, FePO4, Mg3(PO4)2, ): là các muối phosphate khó tan trong nước, cây không thể hấp thu được. - Lân vô cơ dễ tan (Na2 HPO4, K2HPO4, MgHPO4, Al2(HPO4)3, CaHPO4, KH2PO4, NaH2PO4, ): cây trồng dễ dàng sử dụng các loại muối phosp.hate này. − Trong thực tế, lân dạng (H2PO4) là dạng cây trồng dễ hấp thu nhất. Phosphate canxi dễ được huy động để làm thức ăn cho cây hơn là phosphate sắt, phosphate nhôm. 1.5.1.2 Lân hữu cơ Lân hữu cơ tồn tại ở các chất có nguồn gốc động vật, thực vật. Từ xác bã của động vật, thực vật qua sự phân giải của vi sinh vật trong đất tạo thành dạng chất mùn. Lân hữu cơ trong đất chủ yếu ở trong thành phần mùn và vật liệu hữu cơ. Đất càng giàu mùn thì càng giàu lân hữu cơ (Trần Kong Tấu, 2009). 1.5.2 Sự chuyển hóa lân trong đất Trong tự nhiên, lân tham gia vào các quá trình chuyển đổi vật chất bằng cả con đường hóa học và sinh học. Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của lân trong tự nhiên diễn ra theo 3 quá trình sau: Khoáng hóa: Là quá trình chuyển hóa lân dạng hữu cơ thành lân dạng vô cơ. 36
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Cố định sinh học (Immobilization): Là quá trình tái sử dụng lân vô cơ nhờ VSV và qua đó chuyển đổi lân vô cơ thành lân hữu cơ trong protoplasm của VSV. Cố định hóa học (Fixation): Là quá trình chuyển đổi lân dạng tan sang dạng khó tan 3- dưới tác dụng của các phản ứng hóa học giữa ion (PO4) và cation kim loại. Trong đất có nhiều loại VSV khoáng hóa được lân hữu cơ. Các VSV này tiết ra các enzyme khử phosphoryl đồng thời giải phóng ion phosphate. Phản ứng enzyme nhanh khi hợp chất lân hữu cơ vừa mới bón vào đất và sau đó xảy ra chậm khi lân đã bị cải biến (tức là lân đã tạo các phức liên kết với Fe, Al, các chất hữu cơ phân tử lượng cao và bị giữ chặt trên các phần tử sét). Khi bón phân lân vào đất, trong vòng vài giờ, độ ẩm của đất sẽ bắt đầu hòa tan các − 2− hạt phân tạo thành các ion orthophosphate (H2PO4) , (HPO4) mà cây trồng có thể sử dụng được (Schulte và Kelling, 1996). 1.5.3 Vi sinh vật phân giải lân khó tan Vi sinh vật phân giải lân khó tan là những VSV (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn) trong quá trình sinh trưởng, phát triển tiết ra các hợp chất có khả năng phân giải các hợp chất phosphate vô cơ khó tan trong đất thành dạng hòa tan mà cây trồng có thể sử dụng. Có nhiều VSV trong đất có khả năng phân giải lân khó tan trong đất thành dạng dễ tan có giá trị sử dụng cho cây trồng (Antoun et al, 1998). Trong đất, các VSV là trung tâm của chu trình chuyển hóa lân và đóng vai trò trung gian quan trọng trong việc chuyển hóa lân vô cơ và hữu cơ, giải phóng lân có giá trị cung cấp cho cây trồng (McLaughlin, 1988; Oberson, 2001). Có hai loại lân được giải phóng bởi VSV: - Lân được giải phóng bởi các quá trình hòa tan (Rodríguez và Fraga, 1999). 37
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp - Lân giải phóng từ tích lũy trong sinh khối của VSV (Oehl, 2001). Trong quần thể VSV đất, các VSV phân giải lân có thành phần loài khác nhau và thay đổi tùy từng loại đất (Banik và Dey, 1982; Kucey et al, 1989). Mật độ VSV phân giải lân thay đổi khác nhau ở các loại đất của các khu vực địa lý khác nhau. Mật độ VSV hòa tan lân cũng thay đổi theo từng vùng đất, tập trung nhiều nhất ở vùng đất có rễ cây (Brown và Rovira, 1999). Các VSV có khả năng hòa tan lân có thể tồn tại cả trong đất giàu lân hoặc nghèo lân tổng số (Oehl, 2001). Các VSV phân giải lân có thể kể đến là Pseudomonas, Bacilllus, Flavobacterium, Aspergillus, Rhizobium, Fusarium, Achromobacter, Agrobacterium. Các chủng đã được dùng trong thương mại: Bacillus megaterium, Bacillus circulans, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa, Bacillus sircalmous, Pseudomonas striata, một số Penicillium sp., Aspergillus awamori (Nguyễn Thu Hà, 2013). Theo Babenko et al (1984), lượng lân hòa tan tăng tuyến tính cùng với sự tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy, lượng lân hòa tan tăng tại các điểm khác nhau trong những giai đoạn tăng trưởng (không phải trong suốt thời gian nuôi cấy). 1.5.3.1. VSV phân giải lân vô cơ Goldstein (1986) đã nghiên cứu đánh giá khả năng của các vi khuẩn khác nhau khi hòa tan các hợp chất lân vô cơ khó tan như canxi phosp.hate và quặng apatit. Các vi khuẩn Goldstein xác định có khả năng này là Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus, Aereobacter, Flavobacterium và Erwinia. Khả năng phân giải các loại lân vô cơ của các vi khuẩn khác nhau là khác nhau. Theo nhiều nghiên cứu thì có thể thấy Bacillus, Rhizobium, Pseudomonas là một trong 38
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp những vi khuẩn có khả năng phân giải lân vô cơ mạnh nhất (Arora và Gaur, 1979; Illmer và Schinner, 1992; Halder và Chakrabartty, 1993; Rodríguez và Fraga, 1999). Phân tích dịch nuôi cấy của các VSV có khả năng hòa tan lân đã cho thấy sự hiện diện của số lượng các acid hữu cơ như malic, glyoxalic, succinic, fumaric, tartaric, alpha keto butyric, oxalic, citric, acid 2-ketogluconic và gluconic (Lapeyrie et al, 1991; Cuningham và Kuaick, 1992; Illmer et al, 1995; Fasim et al, 2002; Kim et al, 1997). Trong số đó, acid gluconic có vẻ là tác nhân thường gặp nhất của quá trình hòa tan lân vô cơ. Các vi khuẩn sinh acid gluconic đã được báo cáo là Pseudomonas sp. (Illmer và Schinner, 1992), Erwinia herbicola (Liu et al, 1992), Pseudomonas cepacia (Goldstein et al, 1993). Chủng vi khuẩn Bacillus liqueniformis và Bacillus amyloliquefaciens đã được xác định là có khả năng sản xuất hỗn hợp các acid lactic, isovaleric, isobutyric,và acid acetic có vai trò tham gia vào quá trình hòa tan lân vô cơ khó tan (Rodríguez và Fraga, 1999). 1.5.3.2 VSV phân giải lân hữu cơ Sự tồn tại của các vi khuẩn sinh enzyme phosphatase khoáng hóa được lân hữu cơ trong đất đã được nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến (Greaves và Webley, 1965; Raghu và MacRae, 1966; Bishop et al, 1994; Abd-Alla, 1994). Qua nghiên cứu hoạt động phân giải lân hữu cơ của các enzyme phosphatase khác nhau ở vùng rễ ngô, lúa mạch, lúa mì, Burn (1983) đã nhận thấy hoạt tính của các phosphatase mạnh nhất ở đất chua đến trung tính. Các vi khuẩn sinh enzyme phosp.hatase có vai trò quan trọng để phân giải lân hữu cơ có thể kể đến là Rhizobium (Abd-Alla, 1994), Pseudomonas (Gügi và et al, 1991), Bacillus (Skrary và Cameron, 1998). 1.6 Khả năng sinh IAA 39
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 1.6.1 Lịch sử nghiên cứu IAA Darwin (1880) khảo sát hiện tượng quang hướng động, ông thấy ngọn diệp tiêu hướng về phía có ánh sáng và khi che ngọn lại thì không có hiện tượng này, từ đó ông cho rằng có một chất gì đó ở ngọn diệp tiêu điều khiển sự vân động này. Paal (1914- 1919) đã khảo sát ảnh hưởng tương quan giữa đỉnh diệp tiêu và thân diệp tiêu: Nếu cắt ngọn diệp tiêu thì thân diệp tiêu không kéo dài Nếu cắt ngọn diệp tiêu thì thân diệp tiêu sẽ dài ra Nếu gắn ngọn diệp tiêu lệch một bên thì bên đó sẽ kéo dài bên còn lại thì không Như vậy, có một chất gì đó ở ngọn diệp tiêu và di chuyển xuống dưới điều khiển sự kéo dài thân diệp tiêu phần bên dưới. Boysen-Jensen (1913) ngăn cách chớp diệp tiêu bằng miếng mica hoặc kim loại thì thân diệp tiêu cũng không dài ra. Nếu thay miếng mica bằng một miếng agar mỏng thì thân diệp tiêu sẽ dài ra và nếu lấy miếng agar có gắn chớp diệp tiêu đặt lên trên một diệp tiêu khác đã bị cắt chớp thì diệp tiêu sau này cũng dài ra. Ông khẳng định một lần nữa là có một chất gì đó ở ngọn diệp tiêu và di chuyển xuống dưới điều khiển sự kéo dài thân diệp tiêu phần bên dưới. Went (1926) đặt chớp diệp tiêu lên khối agar sau đó lấy khối agar đặt lại trên thân diệp tiêu thì thân cũng vươn dài. Nếu miếng agar đặt lệch thì thân diệp tiêu cũng phát triển lệch. Thí nghiệm này một lần nữa chứng minh giả thuyết trên là đúng. Went đặt tên cho chất đó là Auxin. Koll (1934) đã xác định được công thức hóa học của Auxin và gọi tên là Indole acetic acid (IAA). Auxin tồn tại trong cây bằng nhiều hình thức khác nhau như: Auxin tự do, tiền auxin và auxin liên kết (Lê Văn Bé, 2008). 40
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 1.6.2 Khái niệm: Auxin là hormone tăng trưởng thực vật hiệu quả nhất và IAA là loại auxin phố biến nhất. IAA được tổng hợp từ tiền chất L-tryptophan. Sự sinh tổng hợp IAA của hệ vi sinh vùng rễ đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển của cây. Một số loài của các giống Azospirillum, Gluconacetobacter và Pseudomonas là những vi khuẩn cố định đạm nhưng nhờ vào khả năng tổng hợp IAA của chúng cũng nên cũng được xem là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật, góp phần làm tăng sản lượng cây trồng (Kloepper et al, 1989). Auxin có tác dụng sinh lý đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt. Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt giãn theo chiều ngang của tế bào làm tế bào to về chiều ngang, vì vậy làm cho các bộ phận của cây to về bề ngang. IAA (acid indole-3- acetic), trong thực vật IAA có thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết với glucose hay peptide. IAA và các dẫn xuất của nó thường được gọi là auxin hay hormone sinh trưởng, đây là hormone thực vật được biết sớm nhất. Ở thực vật bậc cao, IAA tập trung nhiều trong các chồi, là đang sinh trưởng, trong tầng phát sinh, trong hạt đang lớn, trong phấn hoa. IAA được tổng hợp tại đỉnh sinh trưởng của thân. Trong cây IAA di chuyển từ đỉnh xuống gốc với tốc độ 10-15mm/giờ. IAA (acid indole-3- acetic) thuộc nhóm phytohormones và thường được gọi là nguồn gốc quan trọng nhất trong nhóm auxin. Nó hoạt động như một phân tử tín hiệu quan trọng trong việc điều tiết sự phát triển thực vật bao gồm cả sinh cơ quan, đáp ứng với môi trường, phản ứng của tế bào chẳng hạn như tăng kích thước của tế bào, phân chia, phân biệt và điều hòa gen (Ryu và Patten, 2008). Có rất nhiều loài vi khuẩn có khả năng tạo ra IAA - hormone thực vật nhóm auxin. Con đường sinh tổng hợp tạo ra 41
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp IAA đã được xác định lượng IAA dư thừa từ sinh tổng hợp đã tạo nên sự tương tác giữa thực vật và vi khuẩn. Tương tác giữa vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA và thực vật dẫn đến sự thay đổi về bệnh lý trong miễn dịch thực vật. Xem xét vai trò của thực vật có khả năng sinh IAA trong tương tác của chúng với thực vật cho thấy vi khuẩn sử dụng hormone thực vật này để tương tác dịch với thực vật như một phần chiến lược để xâm nhập vào bên trong tế bào thực vật của chúng như là sự khắc phục của cơ chế miễn thực vật cơ bản. Hơn nữa, vài báo cáo gần đây cho thấy IAA cũng có thể là phân tử báo hiệu trong vi khuẩn và do đó có thể ảnh hưởng trực tiếp đối với sinh lý học vi khuẩn (Spaepen et al, 2007). Có nhiều hệ vi thực vật đất có khả năng tổng hợp auxin hoàn toàn cả khi ở trong đất hay trong nuôi cấy. Tiềm năng tổng hợp auxin bởi vi khuẩn vùng rễ có thể được sử dụng như một công cụ sàng lọc có hiểu quả chủng PGPR (Khalid et al, 2004). 1.6.3 Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR) PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobactera) được gọi là những chủng vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật. Nhóm vi khuẩn tổng hợp IAA là nhóm vi khuẩn vùng rễ đang được nghiên cứu hiện này nhằm cải thiện tỷ lệ nảy mầm hạt giống, chất lượng cây trồng thông qua sự thúc đẩy nảy mầm, tăng chiều cao của cây, tăng chiều dài và diện tích bề mặt rễ, do đó cho phép các loài thực vật dễ hấp thụ chất dinh dưỡng và nước từ đất. Sự phát triển của thực vật trên nền đất nông nghiệp chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố vô sinh và hữu sinh. Khái niệm vùng rễ lần đầu tiên được giới thiệu bởi Hiltner để mô tả các vùng hẹp của đất xung quanh rễ, nơi dân số vi khuẩn được kích thích phát triển bởi sự hoạt động của rễ (Hiltner, 1904). Theo McCully (2005), vùng rễ bao gồm đất xung quanh rễ cũng như các nhân tố vật lý, hóa học, sinh học, ở trong đấy đã được thay đổi bởi hoạt động của rễ. Ngoài một số lượng các vi khuẩn còn có các vi sinh vật khác như nấm, động vật nguyên sinh và 42
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp tảo cùng tồn tại trong vùng rễ. Để hỗ trợ cho các hoạt động của những vi khuẩn có lợi cho vùng rễ của mình, thực vật sẽ giải phóng các hợp chất hữu cơ thông qua dịch tiết (Lynch, 1990) tạo ra một môi trường sống rất chọn lọc (Garcia et al, 2001). Theo Hallmann et al (1997) liên tục thấy sự tồn tại của vi khuẩn trong đất vùng rễ, bề mặt rễ và nội bào của các mô thực vật. Sự tương tác kết hợp của thực vật và vi sinh vật như một kết quả của đồng tiến hóa, việc sử dụng các nhóm vi khuẩn sau để sản xuất những chế phẩm sinh học phải được điều chỉnh trước, để nó phù hợp với một hệ thống nông nghiệp bền vững lâu dài. PGPR thường được sử dụng như những chế phẩm sinh học để cải thiện tốc độ tăng trưởng và năng suất của cây trồng nông nghiệp, chúng như một biện pháp khả thi để thay thế phân hóa học, thuốc trừ sâu, và các chất kích thích (Ashrafuzzaman et al, 2009). Việc sử dụng phân bón sinh học và chất tăng trưởng sinh học từ vi khuẩn cố định cũng như lợi ích vi sinh vật mang lại có thể làm giảm lượng sử dụng phân bón hóa học do đó chi phí sản xuất thấp hơn. Không chỉ có vậy, việc sử dụng PGPR để tăng năng suất thay thế phân bón hóa học còn giúp giảm thiểu ô nhiễm và bảo vệ môi trường, hướng đến một nền nông nghiệp sinh thái (Stefan et al, 2008). Do đó vi khuẩn vùng rễ là một tác nhân tiềm năng cho sự thúc đẩy tăng trưởng thực vật trong nông nghiệp (Chaiharn et al, 2008), được sử dụng như những chế phẩm sinh học để cải thiện tốc độ tăng trưởng và năng suất của cây trồng nông nghiệp. PGPR hoặc sự kết hợp của PGPR và AMF (Arbuscular mycorrhiza fungi-nấm vùng rễ Arbuscular) có thể nâng cao hiệu quả sử dụng chất dinh dưỡng của phân bón và cho phép áp dụng tỷ lệ giảm phân bón hóa học (Adesemoye et al, 2009). Việc sử dụng PGPR phân lập được như những chế phẩm phân bón sinh học có lợi cho canh tác lúa giúp tăng cường sự phát triển của lúa bằng cách thúc đẩy tăng trưởng những chỉ tiêu sinh lý khác. Ứng dụng sự tương tác kết hợp của PGPR như phân sinh học ảnh hưởng đến năng suất và có lợi cho tăng trưởng của đậu chickpea trong điều kiện thực nghiệm (Rokhzadi et al, 2008). 43
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Tầm quan trọng của vi khuẩn vùng rễ từ lâu đã được công nhận, tuy nhiên, vi khuẩn vùng rễ chỉ là một phần nhỏ trong tổng số 3 dạng sinh học đất. Có 1 nhóm vi khuẩn đất trong các thập niên gần đây đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu là nhóm vi khuẩn được gọi là vi khuần vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPR). Vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật là vi khuẩn cư ngụ ở rễ cây chúng có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật, làm giảm bệnh hoặc các thiệt hại do côn trùng. PGPR đã và đang được quan tâm nghiên cứu rất nhiều và nhiều sản phẩm của nó đã được thương mại hóa phục vụ cho sản xuất nông nghiệp (Antoun và Kloepper, 2001). Ví dụ, chi Rhizobium là nhóm vi khuẩn vùng rễ được biết đến rộng rãi nhất và nó đã được thương mại hóa thành công với nhiều ứng dụng thực tế trong nông nghiệp theo nguyên lý phát triển cộng sinh với thực vật (Saharan et al, 2011). 1.6.4 Các chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR) Vào đầu những thế kỷ này, mặc dù có rất nhiều loại vi khuẩn liên kết hay cộng sinh với thực vật từ đó kiểm soát sự sinh trưởng của thực vật nhưng chúng lại chưa được nghiên cứu rộng rãi cho đến khi các công bố mang tính đột phá về sự tương tác của vi khuẩn đến thực vật những nghiên cứu của Bashan và Holguin (1998), sự phát hiện vi khuẩn Pseudomonas có khả năng kiểm soát các mầm bệnh và gián tiếp điều khiển thực vật của Kloeppeer và cộng sự (1980) hay việc tìm thấy Azosprillum sp., loài vi khuẩn sống tự do tăng nhanh xung quanh vùng rễ của cây trồng nhiệt đới (Maria và cs, 2002). Một số loài vi khuẩn thuộc chi Azospirillum, Alcaligenes, Arthrobacter, Acinetobacter, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterrium, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia liên quan đến rễ cây và có gây ra các tác dụng có lợi đối với sự tăng trưởng của thực vật (Egamberdiyeva, 2005). Thành phần dịch tiết ở rễ của từng loài thực vật đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn và làm phong phú thêm các loại vi khuẩn. Vì vậy, cộng đồng vi khuẩn trong vùng rễ phát huy tùy theo 44
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp tính chất và nồng độ các hợp chất hữu cơ của dịch tiết cũng như khả năng tương ứng của vi khuẩn để sử dụng như các nguồn năng lượng đó (Curl và Truelove, 1986). 1.7 Tình hình nghiên cứu sửu dụng Bacillus spp. ứng dụng vào sản xuất nông nghiệp 1.7.1 Nghiên cứu nước ngoài Năm 2007, Edgecomb và Manker nghiên cứu thành công chế phẩm vi sinh từ Bacillus có mật độ là 1x109 CFU/ml hay CFU/g. Khi dùng sẽ được pha loãng theo khuyến cáo của nhà sản xuất, thời gian bảo quản dưới 2 năm. Chế phẩm này có thể được pha chung với thuốc trừ nấm hóa học mà vẫn giữ được hiệu quả đối kháng. Năm 2006, S.A.El-Hassan và S.R.Gowen đã nghiên cứu về thời gian bảo quản chế phẩm Bacillus subtilis với glucose, bột hoạt thạch (talc) và than bùn để trừ bệnh héo rũ trên cây đậu, kết quả sau 30 ngày bảo quản mật độ Bacillus subtilis trên glucose, bột hoạt thạch tương đối cao so với chế phẩm từ than bùn tương ứng là 10,6; 10,3 và 8,83 log10 CFU/g. Sau 240 ngày, tổng mật độ giảm xuống 9,4; 8, 9 và 5,2 log10 CFU/g và đến ngày thứ 360, mật độ bào tử chỉ còn 8,6; 7,8 và 3,5 log10 CFU /g tương ứng của chế phẩm glucose, talc và than bùn. Các kết quả cho thấy chế phẩm Bacillus Subtilis từ glucose và bột hoạt thạch có thời gian bảo quản lâu hơn chế phẩm từ than bùn khi bảo quản ở nhiệt độ phòng. Năm 2013, N. Ashwini và cộng sự đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis làm tác nhân đối kháng sinh học phòng ngừa bệnh thán thư trên ớt do chủng C.gloeosporioies OGC1 là tác nhân. Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng với nhiều tác nhân gây bệnh trong điều kiện in vitro từ 41-57%. Trong thí nghiệm xử lý hạt giống với tác nhân gây bệnh và vi khuẩn đối kháng cho hiệu quả kháng bệnh trên 87,5%, tỷ lệ nảy mầm đạt 85%, so với đối chứng không dùng vi khuẩn Bacillus subtilis thì mức độ nhiễm 45
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp bệnh trên 77,5% và chỉ 1% hạt giống nảy mầm được thành cây. Điều này cho thấy hiệu quả trong phòng ngừa bệnh thán thư của vi khuẩn Bacillus subtilis là rất khả quan. Nan Zhang và ctv (2011) đã dùng Bacillus subtilis N11 phối vào phân bón sinh học BIO2 nhằm kiểm soát nấm Fusarium gây ra bệnh héo chuối, kết quả cho thấy BIO2 làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc Fusarium gây héo so với nhóm đối chứng. Một nghiên cứu khác cũng liên quan tới bệnh héo chuối do nấm Fusarium oxysporum gây ra của Beibei Wang và ctv (2012) trong nghiên cứu này 57 chủng vi khuẩn được phân lập từ rễ cây chuối khỏe mạnh, kết quả cho thấy dòng Bacillus amyloliquefaciens W19 cho thấy có thể làm giảm đáng kể Fusarium gây héo và thúc đẩy sự phát triển của cây chuối khi kết hợp với phân hữu cơ. Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ đã sử dụng phosphobacterium trên lúa mì, đại mạch, ngô, rau quả cho thấy các cây trồng đều phản ứng tích cực với việc tẩm nhiễm VSV phân giải lân, làm tăng năng suất và khả năng sử dụng lân, đồng thời nâng cao chất lượng sản phẩm. Theo Gaur và Alagawadi (1992) nhiều kết quả khoa học đã chứng minh ở Liên Xô, năng suất cây trồng tăng 5-10% và có trường hợp đạt 30% khi sử dụng Bacillus megateirum var phosphaticum phân giải lân, hiệu quả này tương ứng ở Ấn Độ là 10- 20%. Nhưng sản phẩm này đã không đạt hiệu quả tương ứng với đất tại Hoa Kỳ (Smith và cộng sự, 1962). Chắc rằng trong trường hợp này tính chất của đất là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả của VSV phân giải lân. 1.7.2 Nghiên cứu trong nước Theo Đỗ Thị Huỳnh Mai, Nguyễn Thị Liên (2014), đã phân lập được 26 dòng vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng từ vùng đất trồng lan Ngọc điểm của 7 mẫu đất được thu tại Cần Thơ, Vĩnh Long và Bến Tre. Các dòng vi khuẩn phân lập được có hiệu lực đối kháng với 46
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp nấm gây bệnh dao động từ 62,2 – 79,2% sau 4 ngày chủng vi khuẩn. Dòng vi khuẩn đối kháng cao nhất là SH8 với hiệu lực đối kháng là 79,2%. Qua khảo sát các cơ chế đối kháng, kết quả thu được có 21/26 dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh siderophore, 25/26 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, 25/26 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải chitin, 26/26 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải protein. Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế phẩm subtin từ Bacillus subtilis để phòng trừ nấm bệnh Ostriniaa furnacalis trên bắp. Noriokimura Yokohamo (1940) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm Aspergillus Flavus, A. paraciticus. 47
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu -Thời gian: Đề tài này được thực hiện từ tháng 1/2018 đến tháng 7/2018 -Địa điểm: Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh Viện Khoa học Ứng Dụng Hutech, trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu: Nguồn mẫu 1: Mẫu đất lấy từ cây thanh long bệnh được trồng tại Xã Song Phú, Huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long. Nguồn mẫu 2: Mẫu đất lấy từ cây thanh long bệnh được trồng tại Xã Hàm Chính, Huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận. Nguồn mẫu 3: Mẫu đất lấy từ cây cà phê được trồng tại xã Xuân Bảo, Huyện Cẩm Mỹ, tỉnh Đồng Nai. Nguồn mẫu 4: Mẫu đất lấy từ cây thanh long được trồng tại huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre. - Chủng Bacilus subtilis và Lactobacilus sp. do trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao, Khu Nông nghiệp Công nghệ cao cung cấp dùng làm đối chứng dương và đối chứng âm. 2.2.2 Hóa chất NaNO3 K2HPO4 MgSO4.7H2O 48
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp FeSO4.7H2O KCl Chitin Tinh bột CMC Lugol Malachite Green 5% NaCl NaOH 1N KOH 40% Gelatin HCl 1N Glycerol 40% Cồn Nước cất Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Methylred 2.2.3 Môi trường Môi trường Nutrient Broth - NB (g/l) Meat extract 3,0 49
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Pepton 5,0 Môi trường Pikovskaya - P (g/l) Glucose 10,0 Ca3(PO4)2 5,0 (NH4)2SO4 0,5 KCl 0,2 NaCl 0,2 MgSO4.7H2O 0,1 MnSO4 0,001 FeSO4 0,001 Yeast extract 0,5 Các loại môi trường tổng hợp: Môi trường Potato Dextrose Agar – PDA Môi trường Simmon Citrate Agar - SCA (thử nghiệm biến dưỡng citrate) Môi trường Methyl Red Voges Proskauer Broth (MR-VP Broth) 2.3.Thiết bị và dụng cụ 2.3.1 Thiết bị Tủ cấy vi sinh Tủ lạnh Tủ ấm 50
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Bếp từ Máy quang phổ Nồi hấp Autoclave Bể điều nhiệt Máy lắc Máy ly tâm Kính hiển vi Cân phân tích 2.3.2 Dụng cụ Ống nghiệm Đèn cồn Đĩa petri Dụng cụ đục lỗ thạch Đũa thủy tinh Bông thấm nước Ống ly tâm Bông không thấm Giấy đo pH Cốc thủy tinh các loại Ống đong các loại 51
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Chai thủy tinh Pipette thủy tinh 1ml, 5ml, 10ml Que cấy vòng Erlen 100ml, 500ml, 1000ml Que cấy thẳng Chai đun môi trường 200ml, 500ml Que cấy trang Micropipette 100µl, 1000µl 2.4 Bố trí thí nghiệm 2.4.1 Bố trí thí nghiệm 52
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp MẪU ĐẤT PHÂN LẬP TEST SINH HÓA KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI SINH ENZYME ĐỐI KHÁNG PHÂN GIẢI LÂN SINH IAA NGOẠI BÀO NẤM Fusarium sp. CHITINASE Neoscytalidium dimidiatum CELLULASE Bảo quản sau thu Trồng hoạch thanh long ớt Đánh giá, tuyển chọn các chủng có ưu điểm vượt trội Các chủng VSV có khả năng bảo quản sau thu hoạch thanh long, phòng trừ nấm Fusarium trên cây ớt và kích thích tăng trưởng Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 53
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 2.4.2 Thuyết minh quy trình: Mẫu đất sau khi thu từ các nguồn đất nông nghiệp sẽ tiến hành phân lập trên môi trường NA. Sau 48h nuôi cấy trên môi trường NA, tiến hành quan sát những khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus, các khuẩn lạc được chọn sẽ tiến hành cấy ria nhiều lần để làm thuần và test một số thử nghiệm sinh hóa theo kháo phân loại Bergy (1974) nhằm định danh sơ bộ các chủng thuộc chi Bacillus spp. Sau khi định danh sơ bộ các chủng được lựa chọn sẽ tiến hành khảo sát các đặc điểm có lợi như: Khả năng sinh enzyme ngoại bào bao gồm enzyme chitinase và cellulase, khả năng đối kháng các loại nấm bệnh như Fusarium sp., Neoscytalidium Dimidiatum, kế tiếp là khảo sát khả năng sinh IAA và phân giải lân khó tan. Sau khi tiến hành các thí nghiệm đối kháng nấm bệnh, các chủng có ưu thế vuột trội sẽ được lựa chọn thử nghiệm in vivo. Đối với chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum, tiến hành khảo sát khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn trên trái thanh long nhằm ứng dụng bảo quản sau thu hoạch thanh long. Đối với chủng nấm Fusarium sp, khảo sát khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn thông qua thí nghiệm trồng ớt và theo dõi sự phát triển của cây ớt. 2.5 Phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu Mẫu đất được lấy tại các vùng đất nông nghiệp, mẫu đất trồng lấy ở tầng mặt, độ sâu 20-30cm Lượng mẫu khoảng 300g - 500g. Mẫu được đựng trong túi PE đã được khử trùng, dụng cụ lấy mẫu phải được làm sạch sau mỗi lần lấy để tránh tạp nhiễm giữa các mẫu với nhau. Mẫu đất sau khi thu được ghi đầy đủ các thông tin: Ngày tháng lấy mẫu, địa diểm lấy mẫu. 54
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 2.5.2 Phương pháp pha loãng Mục đích: Làm giảm mật độ vi khuẩn có mặt trong dịch tăng sinh mẫu hay dịch đồng nhất mẫu giúp cho việc phân lập riêng rẽ từng khuẩn lạc tế bào được dễ dàng hơn. Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhất trong phương pháp phân tích vi sinh nhưng rất quan trọng, việc pha loãng mẫu ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả thí nghiệm, khi mẫu được pha loãng đến nồng độ thích hợp sẽ thuận lợi cho người phân tích vi sinh đọc kết quả hay thực hiện các phân tích định lượng một cách dễ dàng nhất có thể. Phương pháp: Phương pháp này chỉ dùng trong trường hợp vi sinh vật phân bố nhiều trong mẫu và để định lượng vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm. Dung dịch pha loãng là nước muối sinh lý Chuẩn bị sẵn dung dịch nước muối sinh lý 0,9% và phối vào chính xác 9 ml vào mỗi ống nghiệm có nút đậy rồi đem hấp khử trùng. Dùng micropipette hút 1ml dung dịch cần pha loãng cho vào ống nước muối sinh lý đã chuẩn bị vô trùng để pha loãng và tiến hành thao tác pha loãng đến một dãy nồng độ nhất định thích hợp. Ống nước muối sinh lý đã hút 1ml dung dịch cần pha loãng vào sẽ là ống có nồng độ pha loãng là 10-1, pha loãng tiếp sẽ là 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 . 2.5.3 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Huyền phù mẫu: cân 5g đất cho vào ống phancon chứa 45ml nước muối sinh lý 0.9% đã được hấp khử trùng, lắc đều. 55
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Xử lý nhiệt: đặt ống phancon chứa huyền phù mẫu đất ở 800C với thời gian 20 phút trong bể điều nhiệt ủ để diệt bớt những vi khuẩn không có khả năng chịu nhiệt và các tế bào không sinh bào tử. Dùng micropipette hút 0,1ml dịch mẫu từ các ống nghiệm đã được pha loãng ở các nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, dùng que cấy trang trang đều dịch mẫu trên môi trường NA cho đến khi bề mặt môi trường thật khô, dùng paraphin quấn quanh vành đĩa để tránh tạp nhiễm. Để yên khoảng 60 phút rồi đặt úp đĩa xuống, quấn paraphin quanh đĩa để tránh nhiễm từ bên ngoài. Ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 48h, quan sát khuẩn lạc đặc trưng. Sau 2 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc. Chọn những khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng và mọc riêng lẽ để quan sát: Khuẩn lạc có màu vàng xám, dạng hình tròn, tâm sẫm màu, viền nhăn, bề mặt phẳng hoặc hơi sần sùi, khô, đường kính từ 3-7mm để cấy ria trên môi trường NA tạo dòng vi khuẩn được phân lập từ khuẩn lạc đơn. Làm thuần: Sau khi cấy ria lần thứ nhất, tiến hành chọn khuẩn lạc đơn trong đĩa cấy tiếp tục thực hiện cấy ria cho đến khi các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa cấy có cùng hình dạng và kích thước. 2.5.4 Phương pháp tăng sinh a. Mục đích: Phương pháp này nhằm giúp cho vi khuẩn hồi phục khả năng sinh trưởng để phát triển bình thường trong môi trường nuôi cấy tiếp theo giúp làm ổn định giống và nâng cao tính chính xác của các thí nghiệm. b. Phương pháp: Môi trường NB được sử dụng để làm môi trường tăng sinh. Môi trường này được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút ở 1atm. Thực hiện thao tác trong điều kiện vô 56
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp trùng, cho 1ml chủng vi khuẩn trong eppendorf hay 1ml dịch nuôi cấy trong môi trường tăng sinh trước đó hoặc dùng que cấy ria lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ cho vào chai môi trường NB, ủ và lắc ở 150 vòng/ phút trong 24 giờ trước khi đưa vào thí nghiệm chính. 2.5.5 Phương pháp quan sát hình thái tế bào 2.5.5.1 Nhuộm Gram Các chủng sau khi được làm thuần bằng phương pháp cấy ria được quan sát hình thái vi thể bằng phương pháp nhuộm gram để xác định từng chủng vi khuẩn này thuộc nhóm Gram dương hay Gram âm. Chúng được tăng sinh trong môi trường thích hợp trong 18-24 giờ, lắc 150 vòng/ phút ở điều kiện nhiệt độ phòng. Kỹ thuật nhuộm Gram: Phương pháp Hucker cải tiến theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2001. - Làm tiêu bản: dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame, hơ khô trong không khí. Vết bôi sẽ được cố định vào phiến kính bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Mục đích của việc cố định vết bôi nhằm: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào lam kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống. - Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal violet trong 30 giây. - Rửa nước - Nhuộm lugol trong 1 phút. - Rửa nước. - Tẩy cồn 96 0 trong 20-30 giây, để nghiêng tiêu bản và nhỏ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. 57
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp - Rửa nước. - Nhuộm bổ sung Fushin hoặc Safranin từ 10-30 giây. - Rửa nước. - Để khô và quan sát dưới kính hiển vi. 2.5.5.2 Nhuộm bào tử - Vi sinh vật được nhuộm bào tử để xác định khả năng sinh bào tử của chúng, nếu chúng có khả năng sinh bào tử chứng tỏ chúng có thể là Bacillus sp.p. và ngược lại thì không. Cấy ria hoặc trang vi khuẩn từ đĩa khuẩn lạc thuần nhất sang đĩa môi trường NA mới và tiến hành đem ủ ở 370C trong 7-10 ngày với mục đích cho vi khuẩn sinh bào tử. Quy trình nhuộm bào tử được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Lân Dủng và Đinh Thúy Hằng (2006). - Dùng que cấy vòng vô trùng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc riêng lẻ để làm vết bôi trên lame. - Cố định vết bôi bằng ngọn lửa đèn cồn. - Đặt một cốc nước lên bếp từ và đun từ từ đến khi đạt khoảng 800C nhằm tăng độ hấp thụ malachite Green của bào tử rồi đặt một tấm giấy lọc lên miệng cốc. Đặt lame có vết bôi lên trên tấm giấy lọc và đặt thêm 1 tấm giấy lọc nữa lên vết bôi, nhỏ từ từ malachite green 5% lên phía trên vết bôi và luôn giữ cho chúng không bị khô trong vòng 5 phút nhuộm. Rửa vết bôi bằng nước cất khoảng 30 giây. Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fushin trong khoảng 60 - 90 giây rồi rửa lại bằng nước cất. - Thấm khô và quan sát dưới vật kính 100x cùng dầu soi kính. 2.5.6 Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa 2.5.6.1 Khả năng di động 58
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp a. Mục đích: Xác định khả năng di động của VSV. b. Nguyên tắc: VSV di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiên mao (flagella) có ở nhiều vi khuẩn hình que, một số vi khuẩn hình cầu. Khả năng di động là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt VSV. Khả năng này có thể được quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di động của VSV vào bên trong môi trường thạch mềm. c. Tiến hành - Cấy đâm sâu VSV vào môi trường thạch mềm (0,5% agar). - VSV di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy. - VSV không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục. 2.5.6.2 Thử nghiệm catalase Quy trình được thực hiện theo Sharmin và Rahman (2007) a. Mục đích: Định tính khả năng sinh enzyme catalase của VSV. b. Nguyên tắc: Các VSV hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử cytochrome đều có enzyme catalase. Enzyme này là một trong những enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất có độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Các VSV này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương pháp hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyển điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2 O và O2 ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Tuy nhiên, ngoài catalase, nhiều enzyme peroxide khác trong hệ thống các enzyme bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa cũng có khả năng thủy phân hydrogen peroxide. Các enzyme này cũng hiện diện ở các tế bào, VSV hiếu khí và kị khí tùy ý có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức 59
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp hô hấp hiếu khí. Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí. c. Tiến hành: - Tạo vết bôi VSV (lấy từ môi trường nuôi cấy thạch nghiêng) trên lam kính sạch. - Nhỏ 1-2 giọt H2O2 30%. - Quan sát sau 1-2 giây. Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện. Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện. 2.5.6.3 Thử nghiệm citrate a. .Mục đích: Xác định khả năng của một số VSV sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất. b. Nguyên tắc: Sự biến dưỡng citrate bởi VSV sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate thường dùng ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải muối ammonium sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường. Tiến hành: Chuẩn bị môi trường Simmons Citrate Agar với chỉ thị là bromothymol blue. Dùng que cấy vô trùng cấy ria khuẩn lạc thuần lên bề mặt môi trường SCA trong đĩa thạch. Ủ ở 300C trong 24-48 giờ, khi cần có thể để đến 4 ngày. c. Kết quả: Phản ứng (-): môi trường giữ nguyên màu xanh lục. Phản ứng (+): môi trường chuyển sang màu xanh dương 2.5.6.4 Thử nghiệm Indole a. Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của VSV có khả năng tạo vòng indol trong môi trường canh trypton b. Cơ sở sinh hóa: 60