Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử Metarhizium anisopliae

pdf 72 trang thiennha21 12/04/2022 550
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử Metarhizium anisopliae", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_anh_huong_cua_cac_dieu_kien_nuoi_cay_ban_ran.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử Metarhizium anisopliae

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY BÁN RẮN LÊN SỰ HÌNH THÀNH BÀO TỬ Metarhizium anisopliae Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Người hướng dẫn : ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT KS. NGUYỄN QUỐC LINH Sinh viên thực hiện : NGUYỄN DIỄM PHÚC MSSV: 1211100159 Lớp: 12DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của ThS. Nguyễn Như Nhứt và KS. Nguyễn Quốc Linh. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kì hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kì gian lận nào Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung đồ án của mình. TP. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực tập NGUYỄN DIỄM PHÚC
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của quý thầy cô đã không quản công lao khó nhọc trang bị những kiến thức cần thiết cho chúng em, tạo điều kiện cho chúng em có cơ hội được áp dụng những kiến thức đó vào thực tiễn thông qua đợt thực tập này. Tuy thời gian thực tập ngắn ngủi nhưng đã trang bị cho em nhiều kiến thức thực tiễn bổ ích cho công việc sau này. Em xin chân thành biết ơn: - Ban giám hiệu cùng toàn thể giáo viên giảng dạy của trường Đại học Công Nghệ TP. HCM nói chung và thầy cô khoa Công nghệ sinh học nói riêng đã cho em có cơ hội được đi thực tập. - Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Như Nhứt, người đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp em hoàn thành tốt bài đồ án của mình. - Em xin cảm ơn anh Nguyễn Quốc Linh đã hướng dẫn và hỗ trợ em hoàn thành đồ án này. Em xin tri ân sự giúp đỡ tận tình của: - Các anh, chị phòng thí nghiệm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương cùng toàn thể các anh, chị các phòng ban của Công ty đã tạo mọi điều kiện hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành luận văn này. Sinh viên thực tập NGUYỄN DIỄM PHÚC
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 3. Mục đích nghiên cứu 4 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 4 5. Phương pháp nghiên cứu 5 6. Các kết quả đạt được của đề tài 5 7. Kết cấu của ĐATN 5 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1.1. Sơ lược về Metarhizium anisopliae 6 1.1.1. Phân loại 6 1.1.2. Phân bố 6 1.1.3. Đặc điểm hình thái 7 1.1.4. Đặc điểm sinh học 9 1.1.5. Khả năng gây hại và cơ chế tác động của nấm lên côn trùng 16 1.1.6. Ảnh hưởng của Metarhizium anisopliae đến con người và môi trường 20 1.1.7. Phổ ký chủ của nấm Metarhizium anisopliae 20 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 22 2.1.1. Địa điểm 22 2.1.2. Thời gian. 22 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.2. Vật liệu thí nghiệm 22 2.3. Máy móc, thiết bị 22 2.4. Môi trường nuôi cấy 22 2.5. Phương pháp 24 2.5.1. Phương pháp nghiên cứu 24 2.5.2. Bố trí thí nghiệm 27 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Khảo sát hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của 4 chủng nấm Metarhizium anisopliae trong điều kiện phòng thí nghiệm 31 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử của các chủng nấm M4 33 3.3. Ảnh hưởng của các loại khoáng bổ sung vào môi trường nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4 35 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4 37 3.5. Hoạt lực diệt sâu của các chủng nấm M4 được tăng sinh trong các điều kiện nuôi cấy thích hợp đã chọn và chọn ra nồng độ thử nghiệm thích hợp 38 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 PHỤ LỤC ii
  6. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CAM : Complete Media. CDA : Czapek – Dox. M. anisopliae : Metarhizium anisopliae. M1 : chủng nấm M1. M2 : chủng nấm M2. M3 : chủng nấm M3. M4 : chủng nấm M4. NT : nghiệm thức. NSGN : ngày sau gây nhiễm. PGA : Potato Glucose Agar. TNHH : trách nhiệm hữu hạn. SDAY1 : Sabouraud dextrose Yeast. SDAY3 : Sabouraud dextrose Yeast có thêm khoáng chất. iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các chủng Metarhizium anisopliae dùng trong nghiên cứu 22 Bảng 2.2. Thành phần môi trường dùng trong thử nghiệm khảo sát môi trường nuôi cấy Metarhizium anisopliae 23 Bảng 2.3. Thành phần khoáng chất dùng trong thử nghiệm khảo sát môi trường nuôi cấy Metarhizium anisopliae 24 Bảng 3.1. Hoạt lực (%) diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của 4 chủng nấm M. anisopliae trong điều kiện phòng thí nghiệm 31 Bảng 3.2. Mật độ bào tử của chủng nấm M4 tạo thành trên các môi trường nuôi cấy 34 Bảng 3.3. Mật độ bào tử của chủng nấm M4 trên các môi trường khoáng khác nhau 36 Bảng 3.4. Mật độ bào tử của chủng nấm M4 tạo thành ở các mốc thời gian nuôi cấy khác nhau 37 Bảng 3.5. Hoạt lực diệt sâu ăn tạp của chủng nấm M4 ở các mốc thời gian với các nồng độ 106, 107, 108 bào tử/ml 38 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Côn trùng, sâu hại bị nấm Metarhizium anisopliae kí sinh 6 Hình 1.2. Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae 7 Hình 1.3. Đặc điểm hình thái Metarhizium anisopliae 8 Hình 1.4. Hai dạng bào tử của nấm Metarhizium anisopliae 8 Hình 1.5. Cơ chế xâm nhiễm của nấm lên côn trùng bướm 17 Hình 1.6. Tiến trình lây nhiễm của nấm lên côn trùng 18 Hình 3.1. Sâu ăn tạp sau khi gây nhiễm với chủng nấm M4. 33 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của các chủng nấm M. anisopliae ở 8 NSGN 32 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4 34 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của các dung dịch khoáng lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4 36 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4 37 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài - Đặt vấn đề Hiện nay, việc nông dân sử dụng không hợp lý, lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp đã và đang gây những hậu quả nghiêm trọng trực tiếp đến môi trường và sức khỏe con người. Có thể kể đến như: gây ô nhiễm môi trường, làm nguồn nước, đất đai bị nhiễm độc ảnh hưởng đến sức khỏe con người và cây trồng, nông sản bị nhiễm độc không tiêu thụ được, gây độc cho những sinh vật có ích, tạo ra những loài sâu, bệnh, cỏ dại, chuột hại mang tính kháng thuốc cao Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng Metarhizium anisopliae của các nước trên thế giới như: Philippin nghiên cứu sử dụng nấm M. anisopliae để trừ rầy nâu hại lúa (Rombach A.C., và cộng sự 1986), Úc nghiên cứu để phòng trừ bọ hung hại mía đạt hiệu quả 68% ( Milner, 1991), Nhật Bản sử dụng nấm xanh để phòng trừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệu quả trên 70% sau 10 ngày (1988), Malaysia nghiên cứu để phòng trừ mối đất đạt hiệu quả 64,75% sau 14 ngày. Ở trong nước, M. anisopliae được nghiên cứu trong phòng trừ mối (Nguyễn Dương Khuê, 2005), trừ sâu, rầy nâu hại cây công nghiệp, cây lâm nghiệp và cây lúa (Phạm Thị Thùy và cộng sự, 2000-2004; Nguyễn Thị Lộc và cộng sự, 2002) và đã được áp dụng sản xuất ở hộ nông dân nhưng quy mô còn nhỏ, thời gian nuôi cấy còn dài, chất lượng chưa ổn định. Vì vậy, đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử Metarhizium anisopliae” được thực hiện nhằm góp phần hoàn thiện hơn nữa qui trình tạo chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp. - Ý nghĩa của đề tài • Ý nghĩa khoa học Đánh giá tiềm năng ứng dụng của những chủng M. anisopliae được nghiên cứu. 1
  11. Đồ án tốt nghiệp Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử của các chủng M. anisopliae. • Ý nghĩa thực tiễn Góp phần hoàn thiện qui trình tạo chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp từ M. anisopliae. 2. Tình hình nghiên cứu - Trên thế giới Năm 1878, nhà Bác học người Nga Metschnhikov trong khi nghiên cứu bệnh của bọ cứng hại lúa mì để tìm phương pháp phòng trừ đã phát hiện nấm Entomophthora anisopliae, nay đổi tên là M. anisopliae. Năm 1880 đến 1886, Metschnhikov cùng học trò của mình là Isac Craxinstic đã nghiên cứu hàng loạt môi trường nuôi cấy nấm M. anisopliae và đã sản xuất thử hàng nghìn kilogram nấm để tách bào tử thuần khiết. Sau đó, dùng bào tử nấm trộn với đất mịn và đem bón ra đồng ruộng. Theo các tác giả thì sau 10 - 14 ngày thí nghiệm cả sâu non và trưởng thành của bọ đầu dài hại củ cải đường chết với tỷ lệ 55 - 80%. Năm 1968, Theo báo cáo của Veen thì M. anisopliae ký sinh trên 200 loài côn trùng khác nhau. Năm 1984, Albonoz và Parada nghiên cứu khả năng phòng trừ Sogatodes oryzickola (Muir) của M. anisopliae. Kết quả cho thấy, tỷ lệ chết đạt 100 ở nồng độ 109 bào tử/ml và tỷ lệ chết chỉ đạt 50% ở nồng độ 107 bào tử/ml. Năm 1987, tại Malaysia, nấm xanh M. anisopliae đã được nghiên cứu để phòng trừ mối đất đạt hiệu quả 64,75% sau 14 ngày. Tại Philippines, đã nghiên cứu sử dụng nấm xanh để diệt rầy nâu hại lúa đạt hiệu lực 60% sau 10 ngày. Năm 1991, ở Úc Milner đã nghiên cứu nấm M. anisopliae để phòng trừ bọ hung hại mía đạt hiệu quả 68%. Năm 2004, V. Rachappa và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của gạo, bo bo, bắp, lúa mì, lúa mạch lên sự phát triển của chủng nấm M. anisopliae và kết quả cho thấy gạo là cơ chất tốt nhất cho mật độ bào tử đạt 4,03 x 109 bào tử/g. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp Năm 2008, Rajesh Anand và cộng sự đã nghiên cứu hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của 3 chủng nấm M. anisopliae, L. muscar và C. Cardinalis. Kết quả cho thấy, chủng M. anisopliae cho hoạt lực diệt sâu cao hơn hai chủng còn lại. Năm 2014, Raúl Daniel Kruger và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất bào tử trên các môi trường bán rắn như gạo trắng, gạo luộc, tấm, gạo thóc, gạo lức, vỏ trấu và lúa mì. Kết quả cho thấy, tấm cho hiệu quả hình thành bào tử cao nhất. Năm 2015, LiGao đã nghiên cứu các phương pháp để tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và bào tử Metarhizium anisopliae đối với 2 chủng Metarhizium SQZ-1-21 và M. anisopliae RS-4-1. Kết quả cho thấy, chủng Metarhizium SQZ-1-21 đạt 2,53 x 105 bào tử/ml và chủng M. anisopliae RS-4-1 đạt 2,25 x 105 bào tử/ml trong 4 ngày nuôi cấy. Trong đó, Metarhizium SQZ-1-21 được nuôi theo các điều kiện môi trường riêng biệt: -1,2 MPa, độ pH9, 12 giờ sáng, 29oC và -1,2 MPa, pH 9, ánh sáng 0 h, 29oC và M. anisopliae RS-4-1 được nuôi theo các điều kiện: -0,3 MPa, pH 8, ánh sáng 24 h, 29oC và -3,9 MPa, pH 5, ánh sáng 12 h, 26oC. - Ở Việt Nam Năm 1981, GS.TS Nguyễn Lân Dũng mô tả hình thái, phân tích cơ chế tác dụng, hướng dẫn cách phân lập, nuôi cấy và phương pháp sản xuất sinh khối Metarhizium. Năm 1992, Phạm Thị Thùy và cộng sự thuộc Viện Bảo vệ thực vật đã phân lập, nuôi cấy và thử nghiệm các chủng Metarhizium thuộc hai loài M. anisopliae và M. flavoviride để phòng trừ các loài sâu hại cây nông, lâm nghiệp bằng phương pháp phun trực tiếp bào tử Metarhizium trên đồng ruộng. Năm 1996, Tạ Kim Chỉnh đã phân lập, nuôi cấy một số chủng M. anisopliae và thử nghiệm để diệt châu chấu di cư và các loài sâu bệnh hại cây nông nghiệp. Năm 1998, Dương Ngọc Khuê và các cộng sự thuộc viện Khoa học lâm nghiệp đã nghiên cứu và tuyển chọn các chủng nấm Metarhizium để thử khả năng diệt mối Coptotemes fomosanus trong phòng thí nghiệm. Các nghiên cứu đã đưa ra 3
  13. Đồ án tốt nghiệp các chế phẩm LT50, LT100, LD50, LD100 của các chủng Metarhizium được tuyển chọn với Coptotemes fomosanus và cho biết ba chủng có hiệu lực diệt mối tốt. Năm 2000, lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thùy đã sử dụng nấm M. anisopliae để trừ bọ dừa. Kết quả ban đầu cho thấy, nấm M. anisopliae có hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre trong phòng thí nghiệm, trong nhà lưới và ngoài đồng. Năm 2009, Lê Hữu Phước đã phân lập và nghiên cứu môi trường nhân sinh khối 3 loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok (Ma), Beauveria Basiana (Bals.) Vuill (Bb) và Paecilomyces spp. (Pae) trên nhóm rau ăn lá ở đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả cho thấy, môi trường SDAY3 là môi trường cho mật độ bào tử (bào tử/ml) cao nhất trong 4 loại môi trường lỏng CDA, CAM, SDAY1 và SDAY3. 3. Mục đích nghiên cứu - Xác định chủng nấm M. anisopliae có hoạt lực diệt sâu cao trong số các chủng được nghiên cứu. - Xác định một số điều kiện nuôi cấy bán rắn chủng nấm M. anisopliae đã chọn. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của 4 chủng nấm M. anisopliae trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M. anisopliae. - Khảo sát ảnh hưởng của các loại khoáng bổ sung vào môi trường nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M. anisopliae. - Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của các chủng M. anisopliae. - Khảo sát lại hoạt tính của các chủng M. anisopliae được tăng sinh trong các điều kiện nuôi cấy đã chọn và chọn ra nồng độ xử lý thích hợp. 4
  14. Đồ án tốt nghiệp 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp cấy chuyền và giữ giống. - Phương pháp nuôi cấy bán rắn M. anisopliae. - Phương pháp xác định độ ẩm. - Phương pháp đếm mật độ bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. - Phương pháp thu thập sâu ăn tạp. - Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học. - Phương pháp xử lý số liệu: xử lý bằng phần mềm SPSS (Statistical Package for the Social Sciences). 6. Các kết quả đạt được của đề tài - Tìm được chủng M. anisopliae có hiệu lực diệt sâu cao trong số các chủng nghiên cứu. - Tìm được môi trường bán rắn và một số điều kiện tăng sinh thu nhận bào tử thích hợp cho M. anisopliae. 7. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp Gồm có 4 chương - Chương 1: Tổng quan tài liệu (Sơ lược về M. anisopliae). - Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Thời gian, địa điểm, vật liệu thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu). - Chương 3: Kết quả và thảo luận (kết quả đạt được của 5 thí nghiệm và nhận xét). - Chương 4: Kết luận và kiến nghị (kết luận và đề xuất nghiên cứu). 5
  15. Đồ án tốt nghiệp Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về Metarhizium anisopliae 1.1.1. Phân loại Xếp theo hệ thống phân loại nấm của G. C. Anisworth (1971), nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromycetes), giống Metarhizium. Một số tác giả khác lại cho rằng, nấm M. anisopliae thuộc ngành phụ nấm túi Ascomycotina và giống Metarhizium [12]. Theo Sorokin (1883) thì nấm xanh được phân loại như sau: [9] Ngành (Phylum) : Ascomycota Lớp (Class) : Sordariomycetes Bộ (Order) : Hypocreales Họ (Family) : Clavicipitaceae Chi (Genus) : Metarhizium Loài (Species) : Metarhizium anisopliae 1.1.2. Phân bố Nấm M. anisopliae được tìm thấy trên khắp các châu lục, ký sinh trên 50 họ gồm khoảng 200 loài côn trùng như rầy lá, rầy mềm, bọ xít đen và rất nhiều loài sâu hại khác. Sau khi xâm nhiễm, chúng hình thành trên bề mặt côn trùng một lớp phấn màu xanh vàng đến màu xanh đậm, trên mạng sợi nấm chằng chịt màu trắng [12]. 1 2 Hình 1.1. Côn trùng, sâu hại bị nấm Metarhizium anisopliae kí sinh. “Nguồn: hình 1_Lê Hữu Phước (2010), hình 2_Phan Công Nhật (2011)” [7],[11]. 6
  16. Đồ án tốt nghiệp Nấm M. anisopliae là nấm hại côn trùng, xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất. Người ta còn phân lập được M. anisopliae trong điều kiện thời tiết rất đặc biệt như: ở những nơi có nhiệt độ -2oC, trên những khu đất ở rừng sâu khi bị đốt cháy, cả trong những chất thải hữu cơ hoặc trong trầm tích ở sông chứa đất đầm lầy trồng những loại cây đước, hoặc trong tổ của một số loài chim và cả trong rễ của cây dâu tây cũng có thể phân lập được nấm M. anisopliae [8]. 1.1.3. Đặc điểm hình thái 1 2 3 Hình 1.2. Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae. “Nguồn: hình 1 và 2_Phan Công Nhật (2011), hình 3_Phan Trọng Nhật (2009)” [9],[10]. Nấm M. anisopliae có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang, đường kính 3 – 4 µm, cuống sinh bào tử bện chặt, mỗi cuống sinh bào tử riêng rẻ phân nhánh nhiều lần, tế bào sinh bào tử có đỉnh tròn. Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng đến xanh, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi nấm dày đặc. Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến ôliu - lục, bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường có thể thấy bào tử được tạo ra trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục. Sợi nấm khi phát triển bên trong côn trùng có chiều rộng khoảng 3 - 4 µm, dài khoảng 20 µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ [14]. 7
  17. Đồ án tốt nghiệp 1 2 Hình 1.3. Đặc điểm vi thể của Metarhizium anisopliae. “Nguồn: hình 1_Joseph F. Bischoff (2006), hình 2_Nguyễn Thúy Nhung (2016)” [10],[16]. a b Hình 1.4. Hai dạng bào tử của nấm Metarhizium anisopliae. a. Dạng bào tử hình ovale b. Dạng bào tử hình trụ “Nguồn: Huỳnh Hữu Đức (2010)” [3]. Nấm M. anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, hình thành theo dạng chuỗi, khuẩn lạc có màu xanh, thỉnh thoảng có màu tối hoặc màu hồng vỏ quế. Loài M. anisopliae có 2 dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bào tử nhỏ M. anisopliae var. major có kích thước bào tử 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5 µm, dạng bào tử lớn là M. anisopliae var. major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0 µm [8]. 8
  18. Đồ án tốt nghiệp Chúng phát triển nhanh trên môi trường Czapek - Dox khi nuôi ở nhiệt độ 28oC sau 8 - 10 ngày nuôi cấy thì khuẩn lạc có đường kính 7 - 8,5 cm [13]. 1.1.4. Đặc điểm sinh học 1.1.4.1. Khả năng sử dụng cơ chất Các loại vi nấm kí sinh côn trùng thường không đòi hỏi khắc khe đối với một loại thức ăn carbon nhất định. Chúng có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau, nhưng cũng có loại hợp chất này được đồng hóa tốt hơn loại hợp chất khác. Có rất nhiều trường hợp ở trong môi trường nuôi cấy có mặt vài nguồn carbon khác nhau, nấm sẽ phát triển mạnh hơn khi chỉ có riêng từng loài. Các công trình nghiên cứu của Hegendus và cộng sự (2010) đã xác định môi trường tốt nhất để phân lập nấm M. anisopliae là môi trường có chứa chitin làm nguồn carbon [13]. Để thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau, nấm thường có những nhu cầu về các nguồn carbon khác nhau. Theo Hegendus và cộng sự (2010) cho biết M. anisopliae khi được nuôi cấy chìm có bổ sung chitin hoặc hexosamine và glucose thì thu được lượng bào tử cao nhất. Nhờ khả năng đồng hóa nguồn carbon phức tạp này mà M. anisopliae được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu thông qua cơ chế diệt côn trùng và khẳng định quá trình xâm nhập của nấm vào cơ thể côn trùng trước hết là phân hủy lớp vỏ chitin ở lớp ngoài da. Tiếp theo là phân hủy protein ở các mô, đồng thời với protein là sự phá hủy lipid. Quá trình này được thực hiện chính là nhờ vai trò của phức hệ enzyme ngoại bào của nấm kí sinh sâu hại cây trồng [8]. Khi nuôi các chủng nấm M. anisopliae trên môi trường có nguồn carbon khác nhau người ta thấy chúng đồng hóa tốt các loại đường glucose, maltose, sacharose, nhưng lại đồng hóa đường rafinose yếu [8]. Mối quan hệ giữa nguồn thức ăn carbon với sự hình thành và phát triển của bào tử nấm M. anisopliae đã được tác giả Jenking và Prior (1993) xác định. Các tác giả cho biết tỷ lệ thích hợp giàu sacharose và peptone trong dịch nuôi cấy nấm M. anisopliae có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và hình thành bào tử nấm [13]. 9
  19. Đồ án tốt nghiệp Thành phần chitin trong môi trường nuôi cấy rất cần thiết đối với các chủng vi nấm ký sinh côn trùng vì chất chitin đã giúp cho sự sinh trưởng, phát triển và hình thành bào tử đính cũng như bào tử chồi của nấm [13]. Tuy nhiên, không phải tất cả nguồn thức ăn carbon nào cũng đều hỗ trợ cho sự sinh trưởng và phát triển cũng như sự nảy mầm và hình thành bào tử của nấm. Nghiên cứu về hiệu quả của nguồn carbon, nitơ và vitamin đối với nấm M. anisopliae được phân lập từ sâu Inoplus ruoricus, người ta nhận thấy quá trình nảy mầm, sinh trưởng và hình thành bào tử nấm M. anisopliae đã sử dụng cả nguồn nitrat và nitơ amôn. Trong nguồn nitơ đã thử, chỉ có cystein là ức chế cả sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử nấm. Những vitamin đã thử cũng không làm tăng sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử của nấm M. anisopliae [8]. Ngoài việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ, nấm còn có thể sử dụng tốt những nguồn nitơ hữu cơ như protein, peptone và các axit amin. Axit glutamic là một trong những axit amin thích hợp hơn cả cho sự phát triển của nấm M. anisopliae. Nguồn thức ăn nitơ là protein từ cơ thể côn trùng là nền cơ chất giàu dinh dưỡng nhất cho nấm gây bệnh côn trùng sinh trưởng và phát triển [8]. Theo nghiên cứu của V. Rachappa và cộng sự (2005), thì M. anisopliae có khả năng sử dụng hiệu quả các cơ chất như gạo, bo bo, bắp, lúa mì, lúa mạch [18]. Raúl Daniel Kruger và cộng sự (2014), đã nghiên cứu sản xuất bào tử trên các môi trường bán rắn như gạo trắng, cơm, tấm, gạo thóc, gạo lức, vỏ trấu và lúa mì. Kết quả cho thấy tấm là môi trường thích hợp nhất để sản xuất bào tử M. anisopliae [20]. 1.1.4.2. Nhu cầu về các chất kích thích sự sinh trưởng Vi nấm có mối quan hệ rất khác nhau đối với các loại vitamin và các chất kích thích sinh trưởng. Ngoài tác dụng kích thích nảy mầm của bào tử và sự tăng trưởng của hệ sợi nấm, cũng có loại vitamin kìm hãm hoặc hạn chế sự sinh trưởng của nấm. Trường hợp bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy người ta thấy có sự ức chế khoảng 30- 40% quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm. Các chủng nấm M. anisopliae, nếu bổ sung thêm chitin tự nhiên của châu chấu vào môi trường nuôi 10
  20. Đồ án tốt nghiệp cấy sẽ làm tăng khả năng sinh bào tử (Li và Holdom, 2002). Các nguyên tố vi lượng có tác dụng kích thích sự phát triển của vi nấm, ví dụ nếu loại ra khỏi môi trường nguyên tố vi lượng Mo, người ta nhận thấy hàm lượng nitratreductaza trong tế bào vi nấm cũng giảm đi chín lần [8]. 1.1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của M. anisopliae - Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy Nấm côn trùng có thể được nuôi cấy chìm hoặc xốp . Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy chìm thường tạo bào tử ở dạng bào tử chồi, dễ mất hoạt tính vì có cấu trúc không bền vững và thời gian sống ngắn. Vì vậy, hiện nay phương pháp nuôi cấy xốp được áp dụng rộng rãi để tạo chế phẩm nấm côn trùng. Phương pháp nuôi cấy xốp sẽ tạo ra chế phẩm ở dạng đính bào tử ổn định và bền vững hơn dạng bào tử chồi [4]. Theo các tác giả Rombach (1986), Hegedus và cộng sự (2010), Jenkins và Prior (1993), thì sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất nấm sẽ thu được kết quả tốt. Vì trong nuôi cấy chìm, người ta đã xác định được khả năng sinh bào tử chồi và lượng sinh khối Metarhizium anisopliae là rất cao. Bằng phương pháp nuôi cấy chìm (tại Trung Quốc), Li và cộng sự (1996) đã thí nghiệm tách chiết theo phương pháp bản mỏng và xác định được độc tố của nấm Metarhizium anisopliae là Destruxin A, B, C và D [3]. - Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển, khả năng tiết độc tố của nấm, nếu môi trường không phù hợp, nấm mọc yếu hay không mọc và giảm độc tố. Nấm M. anisopliae có thể phát triển trên môi trường không có chitin. Nhưng theo Phạm Thị Thùy (2010), môi trường thích hợp nhất cho nấm phát triển là môi trường có chitin làm nguồn carbon. Nếu bổ sung thêm chitin và glucose trong quá trình nuôi cấy, nấm M. anisopliae hình thành lượng bào tử cao vì chitin sẽ giúp hình thành và phát triển bào tử đính và bào tử trần. Quá trình hình thành bào tử đính được kích thích bởi một số axit amin đặc biệt là lysine, alanine, axit glutamic. 11
  21. Đồ án tốt nghiệp Nhiều tác giả cho rằng, nấm nuôi trên môi trường có thêm urê, glycine, NaNO3, NH4Cl sẽ cho độc tính cao [4]. Môi trường nuôi cấy nhân tạo có thể làm mất khả năng gây độc cho côn trùng của vi sinh vật. Vì vậy, sau một thời gian nuôi cấy trên môi trường nhân tạo, nên hoạt hóa chúng trên cơ thể của sâu ký chủ [4]. Phạm thị Thùy và cộng sự (1996) cho rằng môi trường Sabouraud bổ sung thêm khoáng chất là môi trường nhân giống nấm côn trùng tốt nhất. Nguyễn Thị Lộc (2009) cho biết môi trường PGA là môi trường thích hợp để nhân giống cấp 2 và môi trường có thành phần 300 g tấm và 150 ml nước là thích hợp nhất để nhân sinh khối [4]. Theo Mohammad Saaid Dayer và Kayhan Karvandian (2016) cho biết, khi trộn axit boric với bào tử M. anisopliae vào bả thức ăn của gián không những không gây tác dụng phụ trên M. anisopliae mà còn tăng cường tính độc hại của M. anisopliae, gây tỷ lệ chết cao ở gián 100% sau 40 ngày [19]. - Ảnh hưởng của ánh sáng Ánh sáng có vai trò quan trọng đối với hầu hết các nấm ký sinh, đặc biệt có liên quan đến sợi nấm, sự phóng thích và sự sống sót của bào tử. Ánh sáng tự nhiên có phổ 290 - 400 nm sẽ ảnh hưởng lên sự bền của nấm trên tán cây và ít ảnh hưởng hơn trên những cơ chất khác. Theo nghiên cứu của Fargues và cộng sự (1996) cho thấy nấm trắng và nấm xanh bị mẫn cảm cao đối với ánh sáng đặc biệt là thành phần tia cực tím của quang phổ (285 - 315 nm) [6]. Viện Bảo vệ Thực vật xác định, nấm Metarhizium anisopliae phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong ngày với thời gian 6 - 8 giờ cũng đủ cho nấm phát triển tốt. Nếu dưới ánh sáng trực xạ nấm Metarhizium anisopliae rất khó nẩy mầm. Vì vậy, phòng nuôi cấy nấm cần phải che ánh sáng mặt trời để hạn chế tia tử ngoại [3]. - Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển của nấm. Ở nhiệt độ dưới 10oC và trên 45oC thì M. anisopliae thường không hình thành bào tử. Nhiệt độ thích 12
  22. Đồ án tốt nghiệp hợp cho sự nảy mầm của bào tử là từ 25 - 30oC và sẽ bị chết ở 49 - 55oC, nhiệt độ cho nấm phát triển tốt nhất là 25oC [8]. Theo Vestergaard và cộng sự (1995), nhiệt độ tối hảo cho nấm bất toàn là 20 – 25oC, nhưng sự xâm nhiễm và gây bệnh từ 15 - 30oC, lớn hơn 30oC sự phát triển của nấm bị giới hạn và ngừng phát triển ở 37oC. Sợi nấm trắng và nấm xanh có thời gian chết ít hơn 15 phút ở 40oC, bào tử nghỉ của nấm có thể chịu được 80oC trong một giờ hoặc lâu hơn, dưới 4oC đa số các tế bào nấm còn sống nhưng không phát triển [28]. Nhiệt độ đất tối hảo cho sự lưu tồn của nấm phụ thuộc vào dòng nấm, loại đất, ẩm độ đất và sự đối kháng tự nhiên. Bào tử nấm xanh có thể tồn tại ít nhất 21 tháng ở 19oC. Cammon and Rath (1994) cho thấy dòng nấm xanh, M. anisopliae được lây nhiễm ở 5oC và tồn tại hai năm [17]. Sự lưu tồn của nấm trong đất bị suy thoái nhanh chóng khi nhiệt độ trên 30oC và chết ở 50oC [6]. - Ảnh hưởng của độ ẩm Ẩm độ là một trong những yếu tố quan trọng quyết định đến sự phát triển của nấm khi ký sinh trên côn trùng. Ẩm độ 80 - 85% là điều kiện thích hợp cho nấm phát triển. Nếu trên hoặc dưới ngưỡng đó nấm phát triển yếu, đặc biệt là quá cao thì bào tử hình thành không có độc tố hoặc bị biến dạng [13]. - Ảnh hưởng của độ thoáng khí Hầu hết các loại nấm ký sinh côn trùng thuộc loại hiếu khí. Khi nấm phát triển chúng đòi hỏi điều kiện có hàm lượng oxy thích hợp trong cả biên độ rộng cũng như trong dụng cụ nuôi cấy. Theo Phạm Thị Thùy và cộng sự (2010) cho biết, phạm vi thích hợp cho các loài nấm phát triển là 0,3 - 0,7 m3 môi trường/m3 không khí. Nếu sản xuất lớn, cần để độ dày bề mặt của nấm trên khay hay nia khoảng 10 - 15 cm trong phòng sản xuất có không gian thích hợp và điều kiện ẩm độ phù hợp [8]. - Ảnh hưởng của hàm lượng nước Nấm kí sinh côn trùng đòi hỏi hàm lượng nước thích hợp, nếu quá khô hoặc quá ẩm thì nấm đều phát triển không tốt. Tỷ lệ nước thích hợp trong môi trường để nấm phát triển tốt là 30 - 50% [13]. 13
  23. Đồ án tốt nghiệp - Ảnh hưởng của pH Phạm vi nấm kí sinh côn trùng sống ở pH từ 3,5 - 8,0. Tuy nhiên, nấm ưa môi trường axit và phát triển thích hợp nhất ở pH từ 5,5 - 6. Vì vậy, các tác giả khuyến cáo bổ sung vào môi trường một lượng nhỏ KH2PO4 và MgSO4 và MgSO4.7H2O, mục đích là để duy trì tính ổn định của pH trong môi trường nuôi cấy [13]. 1.1.4.4. Khả năng sinh enzyme Nấm M. anisopliae xâm nhập vào lớp chitin của côn trùng được là do sự phối hợp giữa các enzyme phân huỷ chitin và áp lực vật lý. Lúc đầu, các enzyme phân huỷ làm tiêu lớp sáp trên lớp vỏ chitin của côn trùng và tạo ra các lỗ thủng chung quanh vòi xâm nhiễm. Nhóm enzyme phân huỷ chitin gồm có subtilisin-like proteinase, trypsin metalloprotease, aminopeptidase, dipeptidyl peptidase và chitinnase. Các enzyme này xuất hiện theo trình tự như sau: các enzyme phân huỷ protein và các esterase được tạo ra đầu tiên vì các protein bao bọc các sợi chitin phải được phân huỷ trước khi men chitinase hoạt động. Enzyme phân giải protein là một endoprotease và được gọi là Pr1. Pr1 là một protein, chủ yếu được tổng hợp trong quá trình hình thành đĩa bám trên bề mặt rắn hay trên lớp chitin của côn trùng. Ngoài Pr1, còn có một số endoprotease khác hiện diện trong nước lọc môi trường nuôi cấy nấm M. anisopliae bao gồm Pr1b, Pr2, Pr3, Pr4, và metalloproteinase [8]. 1.1.4.5. Khả năng sinh độc tố Độc tố diệt côn trùng của M. anisopliae sinh ra không phải là enzyme, có trọng lượng phân tử thấp, các sản phẩm này có thể diệt côn trùng ngay cả khi hiện diện với nồng độ thấp. Các độc tố của M. anisopliae vào trong ruột giữa và gây ra một số bệnh ở tế bào ruột giữa của côn trùng. Các bệnh này thường tạo ra những thay đổi trong ty thể và lưới nội chất, làm thoái hóa nhân tế bào và làm tổn thương ống Malpigi, hemocyte nhưng không gây ra các tổn thương mô ở vị trí hệ thần kinh. Các triệu chứng của sự nhiễm độc trên ấu trùng liên quan tới tổng số bào tử mà ấu trùng ăn phải [8]. 14
  24. Đồ án tốt nghiệp Độc tố diệt sâu của nấm bao gồm nhiều độc tố có tên là dexstrucin A, B, C và D. Các ngoại độc tố đó là các sản phẩm thứ cấp vòng peptit, L - prolyn, L - leucine, anhydride, L - prolyn - L - valine anhydride và Desmethyl Destruxin B. Theo tài liệu của tác giả Lysenko và Kucera (1971) thì nấm M. anisopliae cũng sinh độc tố Destruxin A và độc tố Destruxin B. Theo Suzuki và cộng sự (1970) thì Destruxin A o có công thức nguyên là C29H47O7N5, có điểm sôi là 188 C. Destruxin B có công o thức nguyên là C30H51O7N5, có điểm sôi là 234 C. Độc tố Destruxin A có bản chất hóa học là D - 2 hydroxy - 4 - pentenoy - L - prolyl - isoleucyl - N - methyl - L valyl - N - methyl - L - alanyl - alanyl lacton. Độc tố Destruxin B có bản chất hóa học là D - α hydroxy - γ - methylvaleryl - L - prolyl - L - isoleucyl - N - methyl - L valyl - N - methyl - L - alanyl - β alanyl lacton. Lần lượt từ năm 1961 và 1962, Y. Kodaira (dẫn theo Phạm Thị Thùy, 2010) đã tách ra được độc tố Destruxin A, và Destruxin B từ dịch nuôi cấy nấm lục cương M. anisopliae. S. Tamura và cộng sự từ năm 1965 – 1970 đã tiến hành nuôi cấy nấm lục cương. Các tác giả cũng tách được những độc tố trên từ môi trường Czapek - Dox có chứa 0,5% pepton. Từ 1 lít dịch nuôi cấy người ta có thể thu nhận được 13 - 15 mg độc tố Destruxin A và B, dịch lọc được xử lý bằng than hoạt tính rồi được phản hấp phụ bằng N – butanol. Sau đó, được tách ra bằng benzene và được làm sạch trên bột nhôm oxit trung tính (dẫn theo Phạm Thị Thùy, 2010). Năm 1971, người ta đã tổng hợp nhân tạo được Destruxin B. Có khoảng 70 loài côn trùng bị tiêu diệt bởi nấm lục cương M. anisopliae [7]. Nấm Metarhizium thường tạo ra độc tố: Destruxin (A-E) tác động trên kênh Ca++ trong màng bắp thịt (A, B), ức chế miễn dịch và gây bệnh tế bào (C, E); Cytochalasins ức chế sự kéo dài của các sợi actin (protein cấu thành sợi lông); Swainsonine là Indolizidine alkaloid. Destruxin E có tác động như một chất ức chế miễn dịch, ngăn cản phản ứng phòng vệ tế bào và thể dịch của một số côn trùng, và chất độc này hiệu quả hơn destruxin A và B. Ngoài ra, Destruxin E do nấm Metarhizium tạo ra có tác dụng như một chất kháng sinh, kháng lại các loại virus đa nhân khi được chủng vào ấu trùng Galleria mellonella bị nhiễm virus ở 15
  25. Đồ án tốt nghiệp mức độ chưa gây độc. Độc chất này dường như gây cản trở tại các vị trí tổng hợp của virus mà không cản trở trên chính virus. Nấm lục cương cũng tạo ra các enzyme phân hủy protein độc và các chất ức chế phản ứng kháng men protease trong hemolymth côn trùng. Ngoài ra, nấm Metarhizium còn tạo ra chất cytochalasin có tác dụng ngăn cản sự kéo dài sợi actin (protein cấu thành sợi lông) (Boucias và Pendland, 1998) [11]. Destruxin là nhóm hợp chất có nhiều chất đồng phân. Cấu trúc cơ bản của nó gồm 5 axit amin và một α - hydroxy axit. Destruxin gây chán ăn và gây độc cho côn trùng sau khi được hấp thu vào da. Một số Destruxin làm tê liệt côn trùng và một số destruxin khác có thể ức chế miễn dịch. Tính mẫn cảm của côn trùng đối với destruxin là khác nhau và một số loài sâu thuộc bộ cánh vảy có thể mẫn cảm cao nhất. LD50 của Destruxin A và B tiêm vào ấu trùng tằm là 0,015 – 0,03 mg/g ở 24 giờ sau khi tiêm. LC50 của nấm xanh đối với ấu trùng rầy nâu, N. Lugens là 1,86 x 106 bào tử/ml ở bốn ngày chủng trong điều kiện nhiệt độ 25oC. Bào tử nấm xanh có LT50 và LD50 đối với một số loài sâu bộ cánh vảy như ấu trùng tằm, sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), sâu xanh (Heliothis armigera) là 48 giờ và 105 bào tử/ml [6]. Destruxin cũng gây độc cho động vật nhỏ có vú. LD50 của Destruxin A và sau khi tiêm vào bụng chuột là 1 - 1,35 mg/kg tương ứng với 13,2 – 16,9 mg/kg trong 1 giờ (Kodaira, 1961). Trái lại, Destruxin ít độc đối với cá và động vật lưỡng cư, không làm chết, gây quái thai hay trì hoãn sự xuất hiện phôi cá BrachydaniorerioH. B [6]. 1.1.5. Khả năng gây hại và cơ chế tác động của nấm lên côn trùng 1.1.5.1. Khả năng gây hại Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là lây từ cá thể ốm sang cá thể khỏe thông qua tiếp xúc trực tiếp với nhau, hay qua nguồn thức ăn có chứa mầm bệnh. Việc lây truyền theo con đường đẻ trứng của ký sinh hầu như không đáng kể. Bệnh vi nấm rất dễ lan truyền bằng va chạm đơn giản mà ở một số bệnh vi sinh vật khác hầu như không xảy ra. Khi lây bệnh chúng thường lây lan nhờ gió, mưa, chim, thú và các 16
  26. Đồ án tốt nghiệp bệnh do nấm tạo thành những ổ bệnh kéo dài theo chiều gió, con đường truyền bệnh thông qua các độc tố của nấm [11]. Cho đến nay, người ta đã xác định được M. anisopliae có khả năng kí sinh và gây chết đối với rất nhiều loài sâu bệnh và côn trùng. Trong số đó có tới 34 loài côn trùng cánh cứng và chỉ có 5 loại côn trùng cánh vẩy [8]. 1.1.5.2. Cơ chế tác động của nấm lên côn trùng Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua lớp da (vỏ) cơ thể. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ. Trong điều kiện đủ độ ẩm, bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể sâu, côn trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động enzyme của nấm. Nấm tiết ra loại enzyme làm mềm lớp vỏ chitin, qua lỗ thủng đó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể sâu và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc. Các enzyme đó là exoprotease, endoprotease, esterase, lipase, chitinase và chitobiase [6]. Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh được sâu, côn trùng chích hút và cả những pha phát triển của côn trùng như trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác không ký sinh được [13]. Hình 1.5. Cơ chế xâm nhiễm của nấm lên côn trùng bướm. “Nguồn: Senthil-Nathan và Sengottayan, 2015” [19]. 17
  27. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng. “Sandhu S.S và cộng sự (2012)” [14]. Trong tự nhiên, khi bào tử nấm rơi vào cơ thể côn trùng, gặp điều kiện thích hợp, chỉ sau 12 - 24 giờ thì bào tử nẩy mầm và đĩa bám, ống mầm xâm nhập vào lớp biểu bì ngoài. Khi tiến tới lớp biểu bì dưới, đỉnh của đĩa bám phình ra hình thành các phiến xâm nhiễm. Các phiến xâm nhiễm phát triển ra các sợi bên, các sợi bên lại tạo ra các thể sợi nấm xâm nhiễm. Các thể sợi nấm xâm nhiễm này tạo ra các sợi nấm xâm nhiễm thẳng đứng đâm xuyên qua lớp biểu bì dưới để xâm nhập vào bên dưới lớp da và xoang cơ thể và tiếp tục xâm nhiễm tiến tới xoang máu của côn trùng và làm côn trùng bị chết [8]. Giai đoạn phát triển của nấm từ khi xâm nhiễm vào trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết là giai đoạn sống ký sinh của nấm. Trong giai đoạn này nấm thường tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn, chúng được phân tán khắp cơ thể theo dịch máu. Trước khi nấm có thể sinh sôi nảy nở trong máu nó thường phải vượt qua phản ứng phòng vệ của côn trùng, và sự tạo độc tố của nấm có thể làm suy yếu phản ứng tự vệ của côn trùng. Côn trùng có thể phản ứng với sự xâm nhiễm của nấm bằng cách sử dụng thể dịch (như phenoloxidase, lectin, peptid và protein hoặc sử dụng cơ chế của vách tế bào như sự thực bào hoặc kết nang. Côn trùng chết có thể là kết quả 18
  28. Đồ án tốt nghiệp của sự phối hợp các hoạt động như sự làm giảm dinh dưỡng, làm tắt nghẽn cơ thể hoặc sự xâm lấn của các cơ quan và tác động của độc tố đối với côn trùng. Ví dụ, nấm trắng tạo ra phức hợp các độc tố bao gồm beauvericin, bassianolide và oosporein, nấm xanh tạo ra độc tố Destruxin làm tê liệt côn trùng hoặc gây ức chế miễn dịch [6]. Khi nấm xâm nhập vào vật chủ, chúng tiến đến lớp biểu bì và gây áp lực lên lớp này để có được chất dinh dưỡng cần cho sự tăng trưởng và sinh sản. Biểu bì vật chủ thường có 2 lớp: lớp mô ngoài và lớp chitin non. Lớp mô ngoài là một lớp mỏng rất phức tạp, thiếu chitin nhưng có lượng protein chứa phenol ổn định và được bao phủ bởi một lớp sáp có chứa axit béo và quinon tạo thành một mạng lưới phức tạp. Lượng protein trong lớp biểu bì có thể lên đến 70%. Bào tử nấm sẽ nảy mầm và hình thành giác bám trên bề mặt lớp biểu bì này. Giác bám là đầu tận cùng của ống mầm phát sinh từ bào tử. Giác bám gắn vào biểu bì côn trùng là nhờ tương tác kỵ nước giữa thành bào tử và các lipid nằm trong lớp biểu bì trên. Sau đó, ống mầm xuyên qua lớp biểu bì dưới, nội bì rồi vào xoang máu. Sau khi, xâm nhập vào cơ thể côn trùng, nấm thường tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn. Những sợi nấm này được phân tán khắp cơ thể theo dịch máu. Nấm tiêu diệt dần các tế bào bạch huyết. Tiếp đó, sợi nấm xâm nhập mô, tiêu diệt tất cả các tế bào bạch huyết rồi làm chết vật chủ. Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển, hình thành nên bào tử và phát triển sợi nấm ra toàn thân cơ thể côn trùng [21]. Thời gian sợi nấm xâm nhiễm tiến tới xoang máu khác nhau tuỳ theo loại côn trùng ký chủ. Sợi nấm Metarhizium tiến vào xoang máu của ấu trùng họ Elateridae khoảng 6 ngày sau khi chủng. Trong khi đó, sợi nấm Metarhizium tiến vào xoang máu của loài mối (Nasutitermis sp.) mất 48 giờ sau khi chủng và 72 giờ sau thì các thể sợi nấm Metarhizium bắt đầu xâm nhập vào các thể mỡ và gây ra triệu chứng chết cho loài mối này, 96 giờ sau khi chủng các thể sợi nấm phát triển dày đặc bên trong xoang cơ thể mối và bắt đầu phát triển ra bên ngoài cơ thể. Các bào tử áo có thể hình thành trong xoang cơ thể mối [11]. 19
  29. Đồ án tốt nghiệp Khi bị chết cơ thể côn trùng cứng lại, các bào tử tiếp tục phát tán trong không khí [8]. 1.1.6. Ảnh hưởng của Metarhizium anisopliae đến con người và môi trường Metarhizium không sản xuất các chất chuyển hóa và chất độc gây hại cho môi trường và sức khỏe con người. Năm 1982, Shadduck và cộng sự đã sử dụng các chủng Metarhizium spp. họ phân lập được để gây bệnh cho mèo và thỏ. Họ đã tiêm bào tử vào màng bụng và nhỏ giọt huyền phù bào tử vào mắt của chúng và theo dõi trong 2 tuần. Kết quả cho thấy, Metarhizium spp. không ảnh hưởng đến chuột và thỏ thí nghiệm. Điều này có thể giải thích do thân nhiệt bên trong động vật có vú (hơn 35oC) bằng hoặc vượt ra ngoài nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của hầu hết các chủng Metarhizium spp. Từ năm 1994 đến 1998 có hàng loạt các nghiên cứu xác định tác dụng phụ của Metarhizium spp. lên cá (Genther và cộng sự, 1998), ếch và tôm. Kết quả cho thấy, Metarhizium spp. không ảnh hưởng đến chúng. Chỉ duy nhất có một trường hợp, một bệnh nhân nhỏ tuổi bị bệnh bạch cầu cấp tính 5 năm, trong quá trình hóa trị liệu phát hiện có nấm ở một số bộ phận của cơ thể. Đứa trẻ cuối cùng đã chết, nấm được liệt kê như một tác nhân góp phần vào các chết của đứa trẻ, nhưng không được đánh giá là nguyên nhân gây ra cái chết, do đứa trẻ này đã suy giảm hệ miễn dịch do bị bệnh bạch cầu trong 5 năm [25]. 1.1.7. Phổ ký chủ của nấm Metarhizium anisopliae Danh sách tên những loài hại cây trồng và mối đất bị nấm lục cương Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviride ký sinh gồm: châu chấu sống lưng vàng Pantanga sucincta, châu chấu mía Hieroglyphus tonkinensis, châu chấu mía Hieroglyphus banian, châu chấu lúa Oxya chinensis, châu chấu lúa Oxya duminuta, châu chấu Locusta sp., bọ hại dừa Brontispa longissima, bọ hại dừa Brontispa sp., mối đất Coptotermes sp., mối đất Coptotermes squamosus, sâu kèn hại keo tai tượng Amasstisa sp., sâu đo hại quế Culculla paterianria, sâu keo da láng Spodotera exigua, sâu xanh bông Helicoverpa armigera, sâu xanh thuốc lá Helicoverpa assulta, sâu xanh bướm trắng Pieris rapae, sâu tơ Plutella xylostella, 20
  30. Đồ án tốt nghiệp sâu khoang Spodoptera litura, sâu đục quả đậu Maruca testulalis, sâu đục thân ngô Pyrausta nubilalis, sâu ăn lá đậu Etiella sp., bọ xít hôi Leptinotasa acuta, bọ xít đen Scotinophora lurida, bọ xít xanh Neraza viridulla, sâu cắn gié Leucania separate, rầy nâu Nilaparvata lugent, rầy điện quang Nephotetix bipunstatus, bọ hà khoai lang Cylas formicarius, sâu đo xanh Anomis flava, châu chấu Hypomesces squamosus, sâu xanh ăn lá bồ đề Fentonia sp., mọt gạo Sitotroga sp., sâu róm thông Dendrolimus punctatus, bọ hung đen hại mía Alissonotum impressicolle, bọ hung nâu Exolontha sp., cánh cam Anomala cupripes, sâu róm quế Malacosoma dentate, sâu đục cành quế Arbela bailbarana, xén tóc Bacchisa atritaric [7]. 21
  31. Đồ án tốt nghiệp Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 2.1.1. Địa điểm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương, kho C2 – lô D – Tổng kho Sóng Thần – KCN Sóng Thần 1 – Dĩ An – Bình Dương. 2.1.2. Thời gian Từ ngày 16/05/2016 đến ngày 07/08/2016. 2.2. Vật liệu thí nghiệm - Bốn chủng nấm Metarhizium anisopliae do Phòng thí nghiệm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương cung cấp. Bảng 2.1. Các chủng M. anisopliae dùng trong nghiên cứu STT Ký hiệu Tên chủng Nơi cung cấp 1 M1 Metarhizium anisopliae Chi nhánh Công 2 M2 Metarhizium anisopliae ty TNHH Gia 3 M3 Metarhizium anisopliae Tường tỉnh Bình Dương 4 M4 Metarhizium anisopliae - Các nguồn cơ chất như: tấm, gạo lức, chitin, nhộng và các loại khoáng. 2.3. Máy móc, thiết bị Nồi hấp khử trùng, cân điện tử, tủ lạnh, kính hiển vi, tủ sấy, buồng đếm và khăn lọc 2.4. Môi trường nuôi cấy - Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) Glucose 20 g Agar 22 g Khoai tây 200 g Nước cất 1000 ml 22
  32. Đồ án tốt nghiệp Để pha môi trường PGA ta tiến hành nấu khoai tây trong vòng 30 phút tính từ khi nước sôi để trích ly các chất trong khoai tây, tiến hành lọc nước loại bỏ bã và bổ sung nước, định mức đến 1 lít. Sau đó, bổ sung glucose và agar vào nấu đến khi agar hòa tan, phân vào các bình chứa, ống nghiệm và hấp khử trùng. - Các loại môi trường dùng trong thử nghiệm khảo sát môi trường nuôi cấy M. anisopliae (bảng 2.2). Bảng 2.2. Thành phần môi trường dùng trong thử nghiệm khảo sát môi trường nuôi cấy M. anisopliae [2],[20],[21],[24] Thành phần Môi trường Gạo lức Gạo tấm Bột nhộng Nước Chitin (g) (g) (g) (ml) (%) MT1 25 - - 15,2 - MT2 - 25 - 15,0 - MT3 25 - - 15,2 1 MT4 - 25 - 15,0 1 MT5 21 - 4 15,7 - MT6 - 21 4 15,4 - MT7 21 - 4 15,7 1 MT8 - 21 4 15,4 1 Độ ẩm môi trường 45% 23
  33. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Thành phần khoáng chất dùng trong thử nghiệm khảo sát môi trường nuôi cấy M. anisopliae [22] Thành phần MS1(g/l) MS2(g/l) MS3(g/l) Urê 0,43 - - ZnSO4.7H2O 0,05 0,05 - CuSO4.5 H2O 0,05 - - H3BO3 0,005 0,05 - MnSO4.H2O 0,01 - - NaNO3 - - 2,00 KH2PO4 - - 1,00 MgSO4.7H2O - - 0,50 2.5. Phương pháp 2.5.1. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1.1. Phương pháp cấy chuyền và giữ giống Tiến hành cấy chuyền nấm bằng cách dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống gốc, cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng PGA bằng phương pháp chấm 3 điểm. Ủ giống ở nhiệt 25 - 28oC trong 12 ngày. Giống sau khi ủ bảo quản ở nhiệt độ 4oC [1]. 2.5.1.2. Phương pháp nuôi cấy bán rắn Metarhizium anisopliae Lấy 10 ml nước muối sinh lý vô trùng để tạo huyền phù bào tử trên môi trường thạch nghiêng. Pha loãng huyền phù bào tử đạt 107 bào tử/ml. Cấy 1 ml huyền phù bào tử trên vào erlen 500 ml chứa 50 g môi trường bán rắn đã được hấp khử trùng. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 12 ngày [1]. 24
  34. Đồ án tốt nghiệp 2.5.1.3. Phương pháp xác định độ ẩm Cách tiến hành: - Sấy chén cân và nắp trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC trong 1 giờ. Sau đó, đặt chén vào bình hút ẩm, đậy nắp lại, để nguội về nhiệt độ phòng. Cân chén cân và nắp trên cân phân tích, ghi lại kết quả, khối lượng chén cân (mo). - Cân khoảng 2 - 5 g tùy vào mỗi loại mẫu bằng cân phân tích cho vào chén đã biết khối lượng, ghi lại kết quả của khối lượng chén cân có mẫu (m1). Đậy nắp chén. Đặt chén cân đã có mẫu vào tủ sấy, mở nắp chén, sấy khô mẫu ở nhiệt độ 105oC trong thời gian 3 giờ đến 4 giờ. Sau đó, đậy nắp chén lại, đặt chén vào bình hút ẩm, để nguội về nhiệt độ phòng. - Cân mẫu sau khi tiến hành sấy mẫu, ghi lại kết quả (m2). Tiếp tục, sấy mẫu lần nữa trong vòng 2 đến 3 giờ đến khi trọng lượng không đổi [1]. - Độ ẩm được tính theo công thức: W = x 100% Trong đó: W : độ ẩm (%). mo: khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g). m1: khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g). m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g). 2.5.1.4. Phương pháp đếm mật độ bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Bào tử Metarhizium anisopliae có kích thước tương đối lớn nên có thể đếm được trực tiếp dưới kính hiển vi quang học (vật kính 40X). Buồng đếm hồng cầu có 25 ô lớn mỗi ô có 16 ô nhỏ. Thể tích mỗi ô nhỏ là 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 mm3. Dịch bào tử được pha loãng trong nước muối sinh lý 0,85%, lắc đều, rồi cho mao dẫn vào buồng dếm, quan sát dưới kính hiển vi để xác định mật độ bào tử trong từng ô lớn. Chỉ đếm 5 ô lớn (4 ô ở góc và 1 ô ở giữa) [1]. Cách tính mật độ bào tử: S = 0,25 x a x L x 106 (bào tử/ml). 25
  35. Đồ án tốt nghiệp Trong đó: a: số bào tử bình quân trong 1 ô lớn (bào tử). S: mật độ bào tử trong dịcch huyền phù (bào tử/ml). L: số lần pha loãng dịch huyền phù bào tử. 2.5.1.5. Phương pháp thu thập sâu ăn tạp Nguồn sâu ăn tạp thu thập từ ngoài đồng đem về nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thu nhận những lá bị sâu phá hoại có xuất hiện các ổ trứng. Những lá này được giữ trong các hộp nhựa có lót giấy thấm để vệ sinh. Sau khi trứng đã nở, thu ấu trùng sâu non và tiếp tục nuôi bằng lá cải bẹ xanh cho đến khi ấu trùng đạt tuổi 3 thì tiến hành thí nghiệm [1]. 2.5.1.6. Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học Chuẩn bị huyền phù dịch nấm: nấm sau khi tăng sinh trong các erlen 500 ml chứa 50 g môi trường sẽ được pha loãng đến mật độ 108 bào tử/ml. Nguồn sâu ăn tạp được thu từ đồng ruộng. Chọn các cá thể sâu 3 ngày tuổi để làm thí nghiệm. Các cá thể sâu được nuôi trong các hộp nhỏ có nắp đậy. Phía dưới đáy hộp có lót giấy thấm để giữ vệ sinh. Cho thức ăn là cải bẹ xanh đã được rửa sạch và phun lên bề mặt cải đã được đặt trong mỗi hộp 1ml dung dịch huyền phù bào tử nấm, đậy nắp lại. Mẫu thử không không phun dịch huyền phù bào tử nấm mà phun nước cất vô trùng. Ghi nhận số sâu chết ở thời điểm 2, 4, 6, 8 và 10 ngày sau khi xử lý đối với cả 4 chủng nấm M. anisopliae và mẫu không. Mỗi lần lấy chỉ tiêu đều đo nhiệt độ và độ ẩm [1]. Xác định hoạt lực của nấm trong phòng thí nghiệm đối với sâu hại cây trồng theo công thức Abbott (1925). Hoạt lực (%) = (1 - ) x 100 26
  36. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Bố trí thí nghiệm 2.5.2.1. Khảo sát hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của 4 chủng nấm M. anisopliae trong điều kiện phòng thí nghiệm ❖ Nguồn nấm: sử dụng các chủng nấm trong bảng 2.1. ❖ Bố trí thí nghiệm: Các chủng nấm sau khi tăng sinh trong erlen chứa môi trường gạo lức, dịch huyền phù nấm được chuẩn bị theo mục 2.5.1.6. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức, 5 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 10 cá thể sâu đồng cỡ. Các nghiệm thức thí nghiệm gồm: - NT1 (đối chứng): phun nước cất vô trùng. - NT2: phun dịch bào tử nấm M1 ở nồng độ 108 bào tử/ml. - NT3: phun dịch bào tử nấm M2 ở nồng độ 108 bào tử/ml. - NT4: phun dịch bào tử nấm M3 ở nồng độ 108 bào tử/ml. - NT5: phun dịch bào tử nấm M4 ở nồng độ 108 bào tử/ml. ❖ Chỉ tiêu đánh giá: Xác định hoạt lực diệt sâu của các chủng M. anisopliae theo công thức Abbott theo mục 2.5.1.6 để chọn chủng M. anisopliae có hoạt lực diệt sâu mạnh trong số các chủng nghiên cứu để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.5.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M. anisopliae ❖ Nguồn nấm: sử dụng các chủng nấm M. anisopliae có hoạt lực diệt sâu mạnh đã được ghi nhận trong thử nghiệm 2.5.2.1. ❖ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 8 nghiệm thức tương ứng với 8 loại môi trường (bảng 2.2), 5 lần lặp lại. Các nghiệm thức thí nghiệm gồm: - NT1: nuôi nấm trên môi trường MT1. - NT2: nuôi nấm trên môi trường MT2. 27
  37. Đồ án tốt nghiệp - NT3: nuôi nấm trên môi trường MT3. - NT4: nuôi nấm trên môi trường MT4. - NT5: nuôi nấm trên môi trường MT5. - NT6: nuôi nấm trên môi trường MT6. - NT7: nuôi nấm trên môi trường MT7. - NT8: nuôi nấm trên môi trường MT8. ❖ Chỉ tiêu đánh giá: Sau 12 ngày nuôi cấy theo mục 2.5.1.2, tiến hành xác định mật độ bào tử M. anisopliae theo mục 2.5.1.4 để chọn ra các môi trường thích hợp cho sự phát triển bào tử của M. anisopliae. 2.5.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các loại khoáng bổ sung vào môi trường nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M. anisopliae ❖ Nguồn nấm: sử dụng các chủng nấm M. anisopliae có hoạt tính diệt sâu mạnh đã được ghi nhận trong thử nghiệm trước (2.5.2.1). ❖ Bố trí thí nghiệm: Môi trường dùng để khảo sát: sử dụng môi trường với các thành phần cơ chất mà chủng nấm M. anisopliae hình thành bào tử cao đã được ghi nhận trong thử nghiệm trước (mục 2.5.2.1) và sử dụng các dung dịch khoáng (bảng 2.3) để thay thế lượng nước sao cho môi trường đạt độ ẩm 45%. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức tương ứng với 3 loại môi trường (bảng 2.3) và mẫu không không bổ sung khoáng chỉ dùng nước, 5 lần lặp lại. Các nghiệm thức thí nghiệm gồm: - NT1 (đối chứng): nuôi nấm trên môi trường MS0. - NT2: nuôi nấm trên môi trường MS1. - NT3: nuôi nấm trên môi trường MS2. - NT4: nuôi nấm trên môi trường MS3. 28
  38. Đồ án tốt nghiệp ❖ Chỉ tiêu đánh giá: Dựa vào số lượng bào tử thu được sau khi nuôi cấy (bào tử/gram cơ chất) ở các các loại môi trường khoáng khác nhau trong 12 ngày để chọn ra môi trường khoáng thích hợp cho chủng M. anisopliae. 2.5.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của các chủng M. anisopliae ❖ Nguồn nấm: sử dụng các chủng nấm M. anisopliae có hoạt tính diệt sâu mạnh đã được ghi nhận trong thử nghiệm trước (2.5.2.1). ❖ Bố trí thí nghiệm: Môi trường dùng để khảo sát: sử dụng môi trường với thành phần cơ chất và hàm lượng khoáng theo kết quả thí nghiệm mục 2.5.2.2 và 2.5.2.3 để tăng sinh chủng M. anisopliae. Thí nghiệm được thực hiện bằng cách nuôi cấy chủng M. anisopliae (mục 2.5.1.2) trên môi trường và điều kiện thích hợp đã chọn. Tiến hành thu nhận bào tử và đếm mật độ ở các mốc thời gian 6, 8, 10, 12 ngày. ❖ Chỉ tiêu đánh giá: Dựa vào mật độ bào tử thu được ở các mốc thời gian nuôi cấy khác nhau để chọn ra thời gian nuôi cấy thích hợp nhằm thu nhận bào tử M. anisopliae bằng phương pháp nuôi cấy bán rắn. 2.5.2.5. Khảo sát lại hoạt tính của các chủng M. anisopliae được tăng sinh trong các điều kiện nuôi cấy đã chọn và chọn ra nồng độ xử lý thích hợp ❖ Nguồn nấm: sử dụng các chủng nấm M. anisopliae có hoạt tính diệt sâu mạnh đã được ghi nhận trong thử nghiệm trước (2.5.2.1). ❖ Bố trí thí nghiệm: Dịch huyền phù nấm được chuẩn bị theo mục 2.5.1.6. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức, 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 10 cá thể sâu đồng cỡ. 29
  39. Đồ án tốt nghiệp Các nghiệm thức thí nghiệm gồm: - NT1 (đối chứng): phun nước cất vô trùng. - NT2: phun dịch nuôi cấy ở nồng độ 106 bào tử/ml. - NT3: phun dịch nuôi cấy ở nồng độ 107 bào tử/ml. - NT4: phun dịch nuôi cấy ở nồng độ 108 bào tử/ml. Các nghiệm thức được lặp lại 5 lần, mỗi lần nhắc lại 10 cá thể sâu non. ❖ Chỉ tiêu đánh giá: Ghi nhận kết quả sau 2, 4, 6, 8, 10 và 12 ngày. Dựa vào hoạt lực diệt sâu của các chủng M. anisopliae được xác định theo công thức Abbott theo mục 2.5.1.6 để chọn chủng M. anisopliae có hoạt lực diệt sâu mạnh trong số các chủng nghiên cứu và chọn được mật độ bào tử thử nghiệm hoạt lực hợp lý. 2.6.2.6. Xử lý số liệu Tổng hợp số liệu và phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS (Statistical Package for the Social Sciences). 30
  40. Đồ án tốt nghiệp Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của 4 chủng nấm Metarhizium anisopliae trong điều kiện phòng thí nghiệm Các số liệu cho thấy, hoạt lực diệt sâu khoang của các chủng khác nhau sẽ khác nhau. Nhìn chung, hoạt lực diệt sâu của các chủng tăng dần từ 4 đến 6 NSGN, chậm lại sau 6 NSGN và hoạt lực diệt sâu không thay đổi từ 8 đến 10 NSGN. Ở các thời gian 4, 6, 8 và 10 NSGN hoạt lực diệt sâu của các chủng M1, M2 và M3 đạt được thấp và không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các chủng. Riêng chủng M4 ở 4 và 6 NSGN hoạt lực diệt sâu đạt 22,9% và 48,3% và có sự khác biệt về mặt thống kê so với chủng M1 và M2 nhưng không có sự khác biệt với về mặt thống kê với chủng M3 đạt 10,4% sau 4 NSGN và 26,0% sau 6 NSGN. Nhưng ở 8 và 10 NSGN hoạt lực diệt sâu của chủng M4 đạt cao nhất 52,3% và có sự khác biệt về mặt thống kê so với các chủng còn lại. Bảng 3.1 Hoạt lực (%) diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của 4 chủng nấm M. anisopliae trong điều kiện phòng thí nghiệm (Nhiệt độ: 27,2 - 31,9oC; độ ẩm: 72,1 - 85,8%) Chủng Thời gian sau gây nhiễm (ngày) nấm 2 4 6 8 10 M1 2,00 a 8,00 b 14,0 b 18,7 b 18,7 b M2 2,50 a 6,05 b 11,7 b 10,1b 11,7 b M3 0,00 a 10,4 ab 26,0 ab 28,2 b 28,2 b M4 0,00 a 22,9 a 48,3 a 52,3 a 52,3 a Trong cùng một cột, các số có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. 31
  41. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.1. Hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của các chủng nấm M. anisopliae ở 8 NSGN. Theo báo cáo của Venkata Ravi Sankar Ummidi và cộng sự (2013) thì M. anisopliae có hoạt lực sinh học trên sâu khoang từ 71,98% (M46) đến 91,4% (M20); theo Lê Hữu Phước (2009), các chủng M. anisopliae cho hiệu quả diệt sâu khoang (Spodoptera litura) đạt 75,7% (M5-AG) đến 82,5 % (M1-CT), cao hơn so với kết quả nghiên cứu này, điều này có thể là do môi trường tăng sinh SDAY lỏng tốt hơn môi trường tăng sinh gạo lức dùng trong thí nghiệm này. Kết quả đạt được cho thấy, M4 là chủng nấm có hoạt lực diệt sâu ăn tạp cao trong số các chủng nghiên cứu, đạt 52,3% khác biệt về mặt thống kê so với các chủng còn lại. Như vậy, chủng M4 sẽ được chọn để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 32
  42. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1. Sâu ăn tạp sau khi gây nhiễm với chủng nấm M4. 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4 Sau khi nuôi cấy chủng nấm M4 trên 8 loại môi trường bán rắn tương ứng với 8 nghiệm thức (mục 2.5.2.2). Kết quả thu được cho thấy, các môi trường có thành phần khác nhau sẽ cho mật độ bào tử khác nhau. 33
  43. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Mật độ bào tử của chủng nấm M4 tạo thành trên các môi trường nuôi cấy Môi trường Mật độ bào tử (x 108 bào tử/g) MT1 5,52 b MT2 2,15 de MT3 3,03 cd MT4 1,18 e MT5 6,98 a MT6 2,23 de MT7 4,13 bc MT8 3,88 c Trong cùng một cột, các số có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. MT1 (gạo lức), MT2 (gạo tấm), MT3 (gạo lức + chitin), MT4 (gạo tấm + chitin), MT5 (gạo lức + nhộng), MT6 (gạo tấm + nhộng), MT7 (gạo lức + chitin + nhộng), MT8 (gạo tấm + chitin + nhộng). Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4. Sự phối hợp giữa các cơ chất khác nhau cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành bào tử. Nhìn chung, các môi trường có chứa gạo lức riêng lẻ hay kết hợp với 34
  44. Đồ án tốt nghiệp chitin hoặc/và nhộng (MT1, MT3, MT5 và MT7) cho mật độ bào tử cao hơn các môi trường có chứa gạo tấm tương ứng (MT2, MT4, MT6 và MT8) và có sự khác biệt về mặt thống kê. Theo nghiên cứu của Raúl Daniel Kruger và cộng sự (2014) khi nghiên cứu ảnh hưởng của các loại gạo lên sự hình thành bào tử của M. anisopliae (Ma 72) cho thấy, gạo tấm là nguồn cơ chất thích hợp cho sự tăng sinh chủng Ma 72 hơn là gạo lức, sự khác biệt này có thể do sự khác biệt từ chủng giống M. anisopliae sử dụng để nghiên cứu. Với nguồn cơ chất chính là gạo lức, việc kết hợp gạo lức với nhộng (MT5) cho mật độ bào tử cao hơn môi trường kết hợp đồng thời chitin và nhộng (MT7), chitin riêng lẻ (MT3) và môi trường chỉ có gạo lức (MT1) và có khác biệt về mặt thống kê. Việc sử dụng nhộng tằm cung cấp nguồn thức ăn nitơ là protein từ cơ thể nhộng là nền cơ chất giàu dinh dưỡng nhất cho nấm gây bệnh côn trùng sinh trưởng và phát triển (Phạm Thị Thùy, 2010) [13]. Do đó, môi trường gạo lức bổ sung cơ chất cảm ứng tạo bào tử là nhộng (MT5) được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Ảnh hưởng của các loại khoáng bổ sung vào môi trường nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4 Sau khi nuôi cấy chủng nấm M4 trên môi trường bán rắn thích hợp kết hợp với các dung dịch khoáng MS1, MS2 và MS3 riêng lẻ. Kết quả thu được cho thấy, các loại khoáng bổ sung vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng khác nhau lên sự tạo bào tử của M. anisopliae. 35
  45. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Mật độ bào tử của chủng nấm M4 trên các môi trường có dung dịch khoáng khác nhau Môi trường Mật độ bào tử (x 108 bào tử/g) MS0 8,36 b MS1 11,4 a MS2 2,68 c MS3 4,31 c Trong cùng một cột, các số có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của các dung dịch khoáng lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4. Các số liệu cho thấy, khi nuôi cấy chủng nấm M4 trên môi trường có dung dịch khoáng MS0, MS1, MS2 và MS3 cho mật độ bào tử đạt lần lượt 8,36 x 108 bào tử/g, 11,4 x 108 bào tử/g, 2,68 x 108 bào tử/g và 4,31 x 108 bào tử/g. Ở môi trường khoáng MS2 và MS3 không có sự khác biệt về mặt thống kê. Môi trường có dung dịch khoáng MS1 cho mật độ bào tử đạt 11,4 x 108 bào tử/g cao hơn so với các môi trường có dịch khoáng MS0, MS2 và MS3. Môi trường MS1 giúp tăng khả năng phát triển và hình thành bảo tử của chủng nấm M4 là do trong thành phần có chứa đạm urê. Urê như là một nguồn nitơ hỗ trợ sự tăng trưởng của M. anisopliae (Feng 36
  46. Đồ án tốt nghiệp và cộng sự, 1994). Như vậy, MS1 là dung dịch khoáng thích hợp cho sự tăng sinh chủng nấm M4 khi bổ sung vào môi trường bán rắn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4 Sau khi nuôi cấy chủng nấm M4 trên môi trường MT5 (gạo lức và nhộng) có bổ sung thêm dung dịch khoáng MS1 (theo kết quả ở mục 3.3) và xác định mật độ bào tử ở các mốc thời gian 6, 8, 10 và 12 ngày. Kết quả thu được cho thấy, thời gian có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo bào tử của chủng nấm M4. Bảng 3.4. Mật độ bào tử của chủng nấm M4 tạo thành ở các mốc thời gian nuôi cấy khác nhau Thời gian (ngày) Mật độ bào tử (x 108 bào tử/g) 6 4,99 c 8 7,63 b 10 9,30 ab 12 11,4 a Trong cùng một cột, các số có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. 12 10 bàotử/g) 8 8 8 10 6 4 2 Mật độMậtbào tử (x 0 6 8 10 12 Thời gian nuôi cấy (ngày) Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4. 37
  47. Đồ án tốt nghiệp Các số liệu cho thấy, mật độ bào tử tăng nhanh từ 6 đến 8 ngày nuôi cấy với mật độ đạt lần lượt 4,99 x 108 bào tử/g và 7,63 x 108 bào tử/g và bắt đầu tăng sinh chậm lại sau 10 ngày đạt 9,3 x 108 bào tử/g và không có sự khác biệt về mặt thống kê so với 8 và 12 ngày. Theo Raúl Daniel Kruger và cộng sự (2014), Masoud Latifian và cộng sự (2014) thì thời gian nuôi cấy các chủng M. anisopliae dùng trong nghiên cứu của họ là 12 ngày dài hơn kết quả của nghiên cứu này, cho thấy việc bổ sung nhộng và khoáng cho khả năng rút ngắn thời gian nuôi cấy. Từ kết quả thu được cho thấy, thời gian tốt nhất để thu nhận bào tử khi nuôi cấy bán rắn chủng M4 là 8 đến 10 ngày. 3.5. Hoạt lực diệt sâu của chủng nấm M4 được tăng sinh trong các điều kiện nuôi cấy thích hợp đã chọn và chọn ra nồng độ thử nghiệm thích hợp Chủng nấm M4 sau khi được tăng sinh trên môi trường MT5 (gạo lức và nhộng) bổ sung dung dịch khoáng MS1 và nuôi cấy từ 8 đến 10 ngày, thu bào tử và tiến hành thử hoạt lực diệt sâu ở các mức nồng độ 106, 107 và 108 bào tử/ml. Bảng 3.5. Hoạt lực diệt sâu ăn tạp của chủng nấm M4 ở các mốc thời gian với các nồng độ 106, 107 và 108 bào tử/ml Thời gian Nồng độ bào tử (bào tử/ml) (ngày) 106 107 108 2 4,00 a 10,0 a 18,0 a 4 4,00 a 18,0 a 30,0 a b ab a 6 6,50 17,0 34,2 8 31,7 a 28,7 a 49,1 a 10 35,5 a 40,0 a 54,4 a HLBD 52,3 a Trong cùng một dòng, các số có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. HLBD (Hiệu lực ban đầu). Số liệu thu được cho thấy, ở các nồng độ bào tử khác nhau thì hoạt lực diệt sâu của chủng M4 cũng khác nhau. Nhìn chung, ở nồng độ 106, 107 và 108 bào tử/ml hoạt lực diệt sâu từ 2 đến 6 NSGN tăng chậm, tăng nhanh sau 8 NSGN và đạt cao nhất ở 10 NSGN với hoạt lực tương ứng đạt 35,5%, 40,0% và 54,4% và không có 38
  48. Đồ án tốt nghiệp sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nồng độ. So với hoạt lực diệt sâu ban đầu ở 10 NSGN (52,3%) thì kết quả này cho thấy không thay đổi đáng kể hoạt lực diệt sâu khoang của chủng nấm M4. Kết quả trên cho thấy, nồng độ thích hợp để gây nhiễm trên sâu khoang của chủng M4 khi tăng sinh trên môi trường MT5 có bổ sung dung dịch khoáng MS1 là 106 – 108 bào tử/ml. 39
  49. Đồ án tốt nghiệp Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ❖ Kết luận Từ những kết quả thu được, chúng tôi rút ra được kết luận như sau: - Cả 4 chủng nấm M. anisopliae dùng trong thí nghiệm đều có hoạt lực diệt sâu nhưng khác nhau giữa các chủng. Trong số 4 chủng nấm thì chủng nấm M4 cho hoạt lực diệt sâu ăn tạp cao hơn các chủng còn lại, đạt 52,3% sau 8 ngày gây nhiễm. - Môi trường bán rắn thích hợp để tăng sinh chủng M4 là môi trường gạo lức và nhộng bổ sung dung dịch khoáng MS1 và thời gian tăng sinh thích hợp là 8 đến 10 ngày. Sau 8 đến 10 ngày mật độ bào tử đạt lần lượt 7,63 x 108 bào tử/g và 9,3 x 108 bào tử/g. Liều thích hợp để gây nhiễm ở sâu ăn tạp (Spodoptera litura) là 106 đến 108 bào tử/ml. ❖ Kiến nghị Dựa trên những kết quả thực hiện được, nhận thấy cần tiếp tục nghiên cứu một số nội dung liên quan đến đề tài như sau: - Thử nghiệm hoạt lực diệt sâu của 4 chủng M. anisopliae dùng trong thí nghiệm trên các đối tượng côn trùng gây hại khác. - Khảo sát thêm một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng hình thành bào tử của các chủng M. anisopliae dùng trong nghiên cứu như: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng - Nghiên cứu phân lập thêm các chủng M. anisopliae mới nhằm tạo nguồn tài nguyên cho các nghiên cứu tiếp theo. 40
  50. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài iệu Tiếng Việt: [1] Trần Thị Vân Anh (2014). Nghiên cứu thu nhận bào tử Paecilomyces sp. bằng phương pháp nuôi cấy bán rắn, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Tôn Đức Thắng, thành phố Hồ Chí Minh. [2] Trần Văn Cảnh (2012). Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes để ứng dụng phòng trừ sâu khoang Spodoptera litura (Fab.) hại cây trồng, Luận văn Thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Vinh, thành phố Vinh. [3] Huỳnh Hữu Đức (2010), Khảo sát khả năng sinh bào tử trong chế phẩm nấm Metarhizium anisoplae Sorokin trên hai nền cơ chất gạo và tấm, Luận văn tốt nghiệp, Trường đại học Cần Thơ, Thành phố Cần Thơ. [4] Trần Thị Hai. Ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo về thực vật, Trường Đại học Công nghệ TP. HCM. [5] Lê Tấn Hưng (2010). Nấm côn trùng tại vườn quốc gia Cát Tiên: Nguồn tài nguyên quý cho các ứng dụng sinh học, Hội nghị khoa học Kỹ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. [6] Nguyễn Thị Lộc (2010). Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất hai chế phẩm trừ sâu sinh học Ometar và Biovip, Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ, Viện lúa đồng bằng Sông Cửu Long. [7] Ninh Thị Huyền Nga (2005). Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae trên Sùng trắng, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM, Hồ Chí Minh. [8] Phan Công Nhật (2011). Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất nấm Metarhizium spp. trừ sâu hại cây trồng, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Công nghệ TP. HCM, Hồ Chí Minh. 41
  51. Đồ án tốt nghiệp [9] Phan Trọng Nhật (2009). Đặc điểm hình thái và hoạt tính một số enzyme ngoại bào của các mẫu nấm sợi phân lập được tại Hà Nội, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 1, 10-16. [10] Nguyễn Thúy Nhung (2016). Sử dụng nấm xanh Metarhizium anisopliae trừ rầy nâu hại lúa ở tỉnh Bạc Liêu, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ Khoa Học và Công nghệ Bạc Liêu. [11] Nguyễn Xuân Niệm (2012). Tiềm năng của chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae trong phòng trừ sâu hại cây trồng ở Kiên Giang, Sở Khoa học và Công nghệ Kiên Giang. [12] Lê Hữu Phước (2009). Phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối 3 loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok (Ma), Beauveria Basiana (Bals.) Vuill (Bb) và Paecilomyces spp. (Pae) trên nhóm rau ăn lá ở đồng bằng sông Cửu Long, đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường, Trường Đại học An Giang. [13] Phạm thị Thùy (2010). Giáo trình Công nghệ sinh học trong Bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục. Tài liệu nước ngoài: [14] Rajesh Anand, Birendra Prasad and Bhupendra Nath Tiwary (2009). Relative susceptibility of Spodoptera liturapupae to selected entomopathogenic fungi, BioControl, 54, 85-92. [15] Sapna Bai, O. K. Remadevi, T. O. Sasidharan, M Balachander and Priyadarsanan Dharmarajan (2012). Cuticle Degrading enzyme production by some isolates of the Entomopahogenic Fungus, Journal of Biosciences, 20, 25- 32. [16] Joseph F. Bischoff, Stephen A. Rehner and Richard A. Humber (2009). A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage, Mycologia, 101(4), 512–530. 42
  52. Đồ án tốt nghiệp [17] Mccammon S. A. and Rath A. C. (1994). Separation of Metarhizium anisopliaes trains by temperature dependent germination rates, Mycol. Res., 98, 1253-1257. [18] Neetu K. Chauhan, Monika Sain, Banwari L. Mathuriya and Jitendra Nagar (2013). Production of biomass from various agro products using entomopathogenic fungi, International Journal of Pure & Applied Bioscience, 1 (1), 7-12. [19] Mohammad Saaid Dayer and Kayhan Karvandian (2016). Toxicity of Metarhizium anisopliae (Deuteromycota: Hyphomycetes) and boric acid against nosocomial cockroaches, Arthropods, 5(4): 114-124. [20] Raúl Daniel Kruger, Julieta B. Posadas, Maricel Angulo Lewylle, Jorge I. Mini and Roberto E. Lecuona (2014). Solid Substrate Production and Formulation of an Isolate of Metarhizium anisopliae for Biological Control of Stem Bug Tibraca limbativentris, World Applied Sciences Journal, 32 (7), 1242-1251. [21] Masoud Latifian, Bahar Rad, Majid Amani and Esmaeil Rahkhodaei (2013). Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid – solid diphasic method for date palm pest, African Journal of Biotechnology, 5 (19), 2337 – 2341. [22] LiGao (2015). A novel method to optimize culture conditions for biomass and sporulation of the nematophagous fungus Metarhizium anisopliae SQZ-1-21 and the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae RS-4-1, African Journal of Microbiology Research, 9 (38), 2079-2087. [23] Sengottayan Senthil-Nathan (2015). A Review of Biopesticides and Their Mode of Action Against Insect Pests, Springer India, 1, 49 - 63. [24] V. Rachappa, S. Lingppa , R.K. Patil and P.S. Hugar (2005). Suitability of Media and Containers for Mass Production of Metarhizium anisopliae, Karnataka Journal of Agricultural Sciences,18 (3), 680-684. 43
  53. Đồ án tốt nghiệp [25] Donal W. Roberts and Raymond J. ST. Leger (2004). Metarhizium spp., Cosmopolitan Insect-Pathogenic Fungi: Mycological Aspects, Advances in Applied Microbiology, 54, 1-70. [26] Sandhu S.S., Anil K., Sharma, Vikas Beniwal, Gunjal Goel, Priyal Batra, Anil Kuma, Sndeep Jaglan, A.K. Sharma and SonalMalhotra (2012). Myco- biocontrol of insect pests: factors involved, mechanism and regulation, Journal of Phathogens, 1-10. [27] Venkata Ravi Sankar Ummidi, Usha Josyula và Padmaja Vadlamani (2013). Germination rates of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae its possible correlation with virulence against Spodoptera litura larvae, International Journal of Advanced Research, 2 (1), 625-630. [28] Vestergaard, S., T.M. Butt, A.T.Gillespie, G. Schreiter and J. Eilenberg (1995). Pathogenicityof the hyphomycete fungi Verticillium lecanii and Metarhizium anisopliae to the western flower thrips, Frankliniella occidentalis, Biocontrol Science and Technology, 5, 185-192. [29] Jianhui Wu., Shaukat Al i., Zh en Huang, Shunxiang Ren and Shujia Cai (2010). Media Composition Influences Growth, Enzyme Activity and Virulence of the Metarhizium anisopliae Entomopathogen Metarhizium anisopliae (Hypocreales: Clavicipitaceae), Engineering Research Center of Biological Control, 42(4), 451- 459. 44
  54. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục A. Bảng độ ẩm nguyên liệu ban đầu Nguyên liệu Độ ẩm (%) Gạo lức 11,55 Tấm 12,24 Nhộng 4,99 Chitin 7,21 Phụ lục B. Bảng SPSS phân tích hoạt lực sinh học của các chủng nấm Metarhizium anisopliae trên sâu ăn tạp (Spodoptera litura) trong điều kiện phòng thí nghiệm. ❖ 2NSGN Descriptives Hoatluc 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 2.0000 4.47214 2.00000 -3.5529 7.5529 .00 10.00 2 5 2.5000 5.59017 2.50000 -4.4411 9.4411 .00 12.50 3 5 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 4 5 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 Total 20 1.1250 3.48635 .77957 -.5067 2.7567 .00 12.50 ANOVA Hoatluc Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 25.938 3 8.646 .675 .580 Within Groups 205.000 16 12.812 Total 230.938 19 1
  55. Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (J) Mean Std. (I) NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 4 2.00000 2.26385 .712 -3.8687 7.8687 sided)a 2 4 2.50000 2.26385 .566 -3.3687 8.3687 3 4 .00000 2.26385 1.000 -5.8687 5.8687 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Homogeneous Subsets Hoatluc Subset for alpha = 0.05 NT N 1 Duncana 3 5 .0000 4 5 .0000 1 5 2.0000 2 5 2.5000 Sig. .325 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. 2
  56. Đồ án tốt nghiệp ❖ 4 NSGN Descriptives Hoatluc 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 14.0000 20.73644 9.27362 -11.7477 39.7477 .00 50.00 2 5 11.7140 12.55145 5.61318 -3.8707 27.2987 .00 28.57 3 5 26.0160 17.11393 7.65358 4.7662 47.2658 .00 42.86 4 5 48.2860 15.36681 6.87225 29.2056 67.3664 30.00 71.43 Total 20 25.0040 21.36179 4.77664 15.0064 35.0016 .00 71.43 ANOVA Hoatluc Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 4203.939 3 1401.313 5.020 .012 Within Groups 4466.259 16 279.141 Total 8670.197 19 3
  57. Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (J) Mean Std. (I) NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 4 -34.28600* 10.56676 .013 -61.6787 -6.8933 sided)a 2 4 -36.57200* 10.56676 .009 -63.9647 -9.1793 3 4 -22.27000 10.56676 .124 -49.6627 5.1227 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets Hoatluc Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 Duncana 2 5 11.7140 1 5 14.0000 3 5 26.0160 26.0160 4 5 48.2860 Sig. .217 .051 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. ❖ 6 NSGN Descriptives Hoatluc 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 14.0000 20.73644 9.27362 -11.7477 39.7477 .00 50.00 2 5 11.7140 12.55145 5.61318 -3.8707 27.2987 .00 28.57 3 5 26.0160 17.11393 7.65358 4.7662 47.2658 .00 42.86 4
  58. Đồ án tốt nghiệp 4 5 48.2860 15.36681 6.87225 29.2056 67.3664 30.00 71.43 Total 20 25.0040 21.36179 4.77664 15.0064 35.0016 .00 71.43 ANOVA Hoatluc Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 4203.939 3 1401.313 5.020 .012 Within Groups 4466.259 16 279.141 Total 8670.197 19 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (I) (J) Mean Std. NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 4 -34.28600* 10.56676 .013 -61.6787 -6.8933 sided)a 2 4 -36.57200* 10.56676 .009 -63.9647 -9.1793 3 4 -22.27000 10.56676 .124 -49.6627 5.1227 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets Hoatluc Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 Duncana 2 5 11.7140 1 5 14.0000 3 5 26.0160 26.0160 4 5 48.2860 Sig. .217 .051 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. 5
  59. Đồ án tốt nghiệp ❖ 8 ngày Descriptives Hoatluc 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 18.6660 22.18553 9.92167 -8.8810 46.2130 .00 50.00 2 5 10.1140 10.14470 4.53685 -2.4823 22.7103 .00 20.57 3 5 28.2380 17.21878 7.70047 6.8581 49.6179 .00 42.86 4 5 52.2860 11.54465 5.16293 37.9514 66.6206 40.00 71.43 Total 20 27.3260 21.85469 4.8886 17.0977 37.5543 .00 71.43 ANOVA Hoatluc Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 4975.409 3 1658.470 6.473 .004 Within Groups 4099.512 16 256.220 Total 9074.922 19 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (I) (J) Mean Std. Lower Upper NT NT Difference (I-J) Error Sig. Bound Bound Dunnett t (2- 1 4 -33.62000* 10.12363 .012 -59.8639 -7.3761 sided)a 2 4 -42.17200* 10.12363 .002 -68.4159 -15.9281 3 4 -24.04800 10.12363 .076 -50.2919 2.1959 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. 6
  60. Đồ án tốt nghiệp Homogeneous Subsets Hoatluc Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 Duncana 2 5 10.1140 1 5 18.6660 3 5 28.2380 4 5 52.2860 Sig. .108 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. ❖ 10 NSGN Descriptives Hoatluc 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 18.6660 22.18553 9.92167 -8.8810 46.2130 .00 50.00 2 5 11.7140 12.55145 5.61318 -3.8707 27.2987 .00 28.57 3 5 28.2380 17.21878 7.70047 6.8581 49.6179 .00 42.86 4 5 52.2860 11.54465 5.16293 37.9514 66.6206 40.00 71.43 Total 20 27.7260 21.79766 4.87411 17.5244 37.9276 .00 71.43 ANOVA Hoatluc Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 4709.617 3 1569.872 5.817 .007 Within Groups 4318.008 16 269.876 Total 9027.626 19 7
  61. Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (I) (J) Mean Std. Lower Upper NT NT Difference (I-J) Error Sig. Bound Bound Dunnett t (2- 1 4 10.3899 -33.62000* .014 -60.5542 -6.6858 sided)a 1 2 4 10.3899 -40.57200* .003 -67.5062 -13.6378 1 3 4 10.3899 -24.04800 .085 -50.9822 2.8862 1 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets Hoatluc Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 Duncana 2 5 11.7140 1 5 18.6660 3 5 28.2380 4 5 52.2860 Sig. .150 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. 8
  62. Đồ án tốt nghiệp Phụ lục C. Bảng SPSS phân tích ảnh hưởng của 8 loại môi trường bán rắn lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4. Descriptives Matdo 95% Confidence Interval for Mean Std. Lower Minimu N Mean Std. Deviation Error Bound Upper Bound m Maximum 1 5 5.5200 1.77425 .79347 3.3170 7.7230 3.08 7.00 2 5 2.1480 .64243 .28730 1.3503 2.9457 1.08 2.81 3 5 3.0300 1.41889 .63455 1.2682 4.7918 1.10 4.49 4 5 1.1780 .12637 .05652 1.0211 1.3349 1.02 1.36 5 5 6.9840 1.40872 .63000 5.2348 8.7332 5.38 8.34 6 5 2.2340 .51481 .23023 1.5948 2.8732 1.66 2.86 7 5 4.1340 .45098 .20168 3.5740 4.6940 3.56 4.82 8 5 3.8800 1.40513 .62839 2.1353 5.6247 2.07 5.97 Total 40 3.6385 2.07761 .32850 2.9740 4.3030 1.02 8.34 ANOVA Matdo Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 128.274 7 18.325 14.635 .000 Within Groups 40.069 32 1.252 Total 168.343 39 Multiple Comparisons Dependent Variable:Matdo 95% Confidence Interval (J) Mean Std. (I) NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 8 1.64000 .70771 .130 -.3145 3.5945 sided)a 2 8 -1.73200 .70771 .100 -3.6865 .2225 3 8 -.85000 .70771 .728 -2.8045 1.1045 4 8 -2.70200* .70771 .004 -4.6565 -.7475 5 8 3.10400* .70771 .001 1.1495 5.0585 9
  63. Đồ án tốt nghiệp 6 8 -1.64600 .70771 .128 -3.6005 .3085 7 8 .25400 .70771 .999 -1.7005 2.2085 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Post Hoc Tests Homogeneous Subsets Matdo Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 3 4 5 Duncana 4 5 1.1780 2 5 2.1480 2.1480 6 5 2.2340 2.2340 3 5 3.0300 3.0300 8 5 3.8800 7 5 4.1340 4.1340 1 5 5.5200 5 5 6.9840 Sig. .168 .249 .150 .059 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. Phụ lục D. Bảng SPSS phân tích ảnh hưởng của 3 loại khoáng bổ sung lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4. Descriptives Matdo 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 8.3640 1.69537 .75819 6.2589 10.4691 5.84 10.61 2 11.420 5 2.50296 1.11936 8.3122 14.5278 8.25 14.37 0 3 5 2.6860 1.07904 .48256 1.3462 4.0258 1.45 3.83 10
  64. Đồ án tốt nghiệp 4 5 4.3180 1.10217 .49290 2.9495 5.6865 3.17 5.61 Total 20 6.6970 3.84050 .85876 4.8996 8.4944 1.45 14.37 ANOVA Matdo Mean Sum of Squares Df Square F Sig. Between Groups 234.167 3 78.056 27.107 .000 Within Groups 46.073 16 2.880 Total 280.240 19 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Matdo 95% Confidence Interval (J) Mean Std. (I) NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 4 4.04600* 1.07323 .005 1.2638 6.8282 sided)a 2 4 7.10200* 1.07323 .000 4.3198 9.8842 3 4 -1.63200 1.07323 .326 -4.4142 1.1502 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets Matdo Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 3 Duncana 3 5 2.6860 4 5 4.3180 1 5 8.3640 2 5 11.4200 Sig. .148 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. 11
  65. Đồ án tốt nghiệp Phụ lục E. Bảng SPSS phân tích ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M4. Descriptives Matdo 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 4.9900 .91392 .40872 3.8552 6.1248 3.64 5.90 2 5 7.6260 1.38846 .62094 5.9020 9.3500 5.82 9.41 3 5 9.3060 1.49984 .67075 7.4437 11.1683 7.13 10.73 4 11.420 5 2.50296 1.11936 8.3122 14.5278 8.25 14.37 0 Total 20 8.3355 2.86419 .64045 6.9950 9.6760 3.64 14.37 ANOVA Matdo Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 110.759 3 36.920 13.095 .000 Within Groups 45.110 16 2.819 Total 155.868 19 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Matdo 95% Confidence Interval (J) Mean Std. Upper (I) NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Bound Dunnett t (2-sided)a 1 4 -6.43000* 1.06195 .000 -9.1829 -3.6771 2 4 -3.79400* 1.06195 .007 -6.5469 -1.0411 3 4 -2.11400 1.06195 .152 -4.8669 .6389 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. 12
  66. Đồ án tốt nghiệp Homogeneous Subsets Matdo Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 3 Duncana 1 5 4.9900 2 5 7.6260 3 5 9.3060 9.3060 4 5 11.4200 Sig. 1.000 .133 .064 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. Phụ lục F. Bảng SPSS phân tích hoạt lực diệt sâu ăn tạp của chủng nấm M4. ❖ 2 NSGN Descriptives Hoatluc 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 4.0000 8.94427 4.00000 -7.1058 15.1058 .00 20.00 2 5 10.0000 10.00000 4.47214 -2.4166 22.4166 .00 20.00 3 5 18.0000 13.03840 5.83095 1.8107 34.1893 10.00 40.00 Total 15 10.6667 11.62919 3.00264 4.2266 17.1067 .00 40.00 ANOVA Hoatluc Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 493.333 2 246.667 2.114 .163 Within Groups 1400.000 12 116.667 Total 1893.333 14 13
  67. Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (J) Mean Std. (I) NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 3 -14.00000 6.83130 .110 -31.0945 3.0945 sided)a 2 3 -8.00000 6.83130 .422 -25.0945 9.0945 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Homogeneous Subsets Hoatluc Subset for alpha = 0.05 NT N 1 Duncana 1 5 4.0000 2 5 10.0000 3 5 18.0000 Sig. .074 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. ❖ 4NSGN Descriptives Hoatluc 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 4.0000 8.94427 4.00000 -7.1058 15.1058 .00 20.00 2 5 18.0000 14.83240 6.63325 -.4169 36.4169 .00 40.00 3 13.7840 5 30.0000 30.82207 -8.2707 68.2707 10.00 80.00 5 Total 15 17.3333 21.86539 5.64562 5.2247 29.4420 .00 80.00 14
  68. Đồ án tốt nghiệp ANOVA Hoatluc Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 1693.333 2 846.667 2.032 .174 Within Groups 5000.000 12 416.667 Total 6693.333 14 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (I) (J) Mean Std. NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 3 -26.00000 12.90994 .117 -58.3055 6.3055 sided)a 2 3 -12.00000 12.90994 .565 -44.3055 20.3055 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Homogeneous Subsets Hoatluc Subset for alpha = 0.05 NT N 1 Duncana 1 5 4.0000 2 5 18.0000 3 5 30.0000 Sig. .079 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. ❖ 6 NSGN Descriptives Hoatluc Std. Std. 95% Confidence Interval for Minimu Maximu N Mean Deviation Error Mean m m 15
  69. Đồ án tốt nghiệp Lower Upper Bound Bound 1 5 6.5000 9.28709 4.15331 -5.0314 18.0314 .00 20.00 2 5 17.0000 14.72668 6.58597 -1.2856 35.2856 .00 40.00 3 11.2198 5 34.2220 25.08837 3.0707 65.3733 11.11 75.00 6 Total 15 19.2407 20.15854 5.20491 8.0772 30.4041 .00 75.00 ANOVA Hoatluc Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 1958.928 2 979.464 3.151 .079 Within Groups 3730.206 12 310.850 Total 5689.133 14 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (I) (J) Mean Std. NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 3 -27.72200 11.15079 .051 -55.6255 .1815 sided)a 2 3 -17.22200 11.15079 .249 -45.1255 10.6815 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Homogeneous Subsets Hoatluc Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 Duncana 1 5 6.5000 2 5 17.0000 17.0000 3 5 34.2220 Sig. .365 .148 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. 16
  70. Đồ án tốt nghiệp ❖ 8 NSGN Descriptives Hoatluc 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 31.6660 15.18396 6.79048 12.8126 50.5194 10.00 50.00 2 5 28.7220 15.24726 6.81878 9.7900 47.6540 11.11 50.00 3 5 49.1120 21.07707 9.42595 22.9414 75.2826 25.00 75.00 Total 15 36.5000 18.60057 4.80265 26.1994 46.8006 10.00 75.00 ANOVA Hoatluc Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 1214.637 2 607.318 2.008 .177 Within Groups 3629.098 12 302.425 Total 4843.735 14 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (I) (J) Mean Std. NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 3 -17.44600 10.99863 .234 -44.9687 10.0767 sided)a 2 3 -20.39000 10.99863 .153 -47.9127 7.1327 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Homogeneous Subsets Hoatluc Subset for alpha = 0.05 NT N 1 Duncana 2 5 28.7220 17
  71. Đồ án tốt nghiệp 1 5 31.6660 3 5 49.1120 Sig. .102 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. ❖ 10 NSGN Descriptives Hoatluc 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu N Mean Deviation Error Bound Bound m m 1 5 35.4760 7.54990 3.37642 26.1016 44.8504 25.00 42.86 2 10.2517 5 40.0000 22.92356 11.5366 68.4634 .00 57.14 3 3 5 54.4040 19.58023 8.75654 30.0919 78.7161 33.33 71.43 Total 15 43.2933 18.59440 4.80105 32.9961 53.5906 .00 71.43 ANOVA Hoatluc Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 977.018 2 488.509 1.517 .259 Within Groups 3863.505 12 321.959 Total 4840.523 14 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (I) (J) Mean Std. NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 3 -18.92800 11.34828 .206 -47.3257 9.4697 sided)a 2 3 -14.40400 11.34828 .370 -42.8017 13.9937 18
  72. Đồ án tốt nghiệp Multiple Comparisons Dependent Variable:Hoatluc 95% Confidence Interval (I) (J) Mean Std. NT NT Difference (I-J) Error Sig. Lower Bound Upper Bound Dunnett t (2- 1 3 -18.92800 11.34828 .206 -47.3257 9.4697 sided)a 2 3 -14.40400 11.34828 .370 -42.8017 13.9937 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Homogeneous Subsets Hoatluc Subset for alpha = 0.05 NT N 1 Duncana 1 5 35.4760 2 5 40.0000 3 5 54.4040 Sig. .138 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000. 19