Đồ án Phân lập và khảo sát hiệu quả của nấm Mycorrhiza đến sinh trưởng và phát triển của cây ngô

88 trang thiennha21 12/04/2022 5890

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập và khảo sát hiệu quả của nấm Mycorrhiza đến sinh trưởng và phát triển của cây ngô", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_phan_lap_va_khao_sat_hieu_qua_cua_nam_mycorrhiza_den_s.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập và khảo sát hiệu quả của nấm Mycorrhiza đến sinh trưởng và phát triển của cây ngô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CỦA NẤM Mycorrhiza ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY NGÔ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Nguyễn Ngọc Như MSSV: 1051110216 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2014
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai. Các số liệu, trích dẫn trong đồ án này hoàn toàn trung thực và chƣa từng đƣợc công bố dƣới bất cứ hình thức nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Sinh viên Nguyễn Ngọc Nhƣ i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Qua khoảng thời gian học tập tại trƣờng Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh, tôi muốn gừi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu trƣờng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trƣờng đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giảng dạy cho tôi những kiến thức chuyên môn, giúp tôi có kiến thức chuyên sâu về lĩnh vực mà tôi đang học, đồng thời giúp tôi có đƣợc những kiến thức cần thiết để hoàn thành cuốn luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Hai đã nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Huỳnh Văn Thành phụ trách phòng thí công Công nghệ sinh học – Môi trƣờng đã giúp đỡ tôi tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn gia đình tôi đã luốn bên cạnh quan tâm, giúp đỡ, động viên những lúc tôi khó khăn nhất. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến những ngƣời bạn thân yêu đã luôn chia sẻ và động viên tôi trong những lúc khó khan để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này. TpHCM, ngày 17 tháng 7 năm 2014 ii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix MỞ ĐẦU x CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1 Kết quả nghiên cứu về nấm Mycorrhiza trên thế giới 1 1.1.1 Giới thiệu về nấm Mycorrhiza 1 1.1.2 Đặc tính sinh thái học của nấm rễ Mycorrhiza 5 1.1.3 Sự hình thành nấm rễ nội cộng sinh 6 1.1.4 Sự hình thành nấm rễ ngoại cộng sinh 7 1.1.5 Ảnh hƣởng của các yếu tố dinh dƣỡng đối với nấm Mycorrhiza 7 1.1.6 Vai trò cuả Mycorrhiza 9 1.1.7 Phƣơng thức sử dụng nấm rễ cộng sinh 11 1.1.8 Ứng dụng của Mycorrhiza 12 1.2 Các chế phẩm nấm Mycorrhiza 13 1.3 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 14 1.4 Sơ lƣợc về cây ngô 16 1.5 Các bệnh thƣờng gặp ở ngô 17 1.5.1 Bệnh khô vằn 17 1.5.2 Bệnh mốc hồng hại ngô 17 CHƢƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nội dung nghiên cứu 19 2.1.1 Nội dung 1 19 2.1.2 Nội dung 2 19 2.1.3 Nội dung 3 19 iii
Đồ án tốt nghiệp 2.1.4 Nội dung 4 19 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 19 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Nguyên liệu 19 2.3.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 19 2.3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 Tính toán và xử lý số liệu 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Phân lập, quan sát bào tử nấm, xác định dạng xâm nhiễm và lƣu giữ bảo quản nấm 26 3.1.1 Hình dạng bào tử nấm [4], [5] 26 3.1.2 Dạng xâm nhiễm của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 [6] 27 3.2 Ảnh hƣởng của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1, Mycorrhiza sp2 đến sinh trƣởng, phát triển của cây ngô 29 3.2.1 Chiều cao thân cây 29 3.2.2 Khối lƣợng thân cây 33 3.2.3 Chiều dài rễ 35 3.2.4 Khối lƣợng rễ 36 3.2.5 Đƣờng kính rễ 38 3.3 Hiệu quả mang lại của 2 chế phẩm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 sau khi đƣợc nhân giống 39 3.3.1 Chiều cao thân ngô 40 3.3.2 Khối lƣợng thân, chiều dài rễ, khối lƣợng rễ ngô 41 3.4 Ảnh hƣởng của 4 mức phân P đến khả năng cộng sinh của nấm Mycorrhiza 43 3.4.1 Đối với nấm Mycorrhiza sp1 43 3.4.2 Đối với nấm Mycorrhiza sp2 45 iv
Đồ án tốt nghiệp 3.5 Đánh giá khả năng kháng nấm Rhizoctonia solani và Fusarium sp của nấm Mycorrhiza 47 3.5.1 Khả năng đối kháng của nấm Mycorrhiza sp1 48 3.5.2 Khả năng đối kháng của nấm Mycorrhiza sp2 51 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1 Kết luận 53 4.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 1 v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VAM - Vesicular Arbuscular Mycorrhiza AM - Arbuscular Mycorrhiza V - Vesicular A - Arbuscular CT - Công thức vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU OC - độ C g - gam cm - centimet kg - kilogam vii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Các chế phẩm nấm Mycorrhiza 13 Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện sự phát triển chiều cao cây ngô ở các giai đoạn 10,16,22,28 ngày sau mọc giữa các công thức 30 Hình 3.2 Chiều cao cây ngô sau 28 ngày theo dõi 32 Hình 3.3 Biểu đồ so sánh khối lƣợng trung bình thân ngô giữa các công thức 33 Hình 3.4 Cây ngô sau 28 ngày theo dõi 34 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh chiều dài trung bình rễ ngô giữa các công thức 36 Hình 3.6 Biểu đồ so sánh khối lƣợng trung bình rễ ngô giữa các công thức 37 Hình 3.7 Biểu đồ so sánh đƣờng kính trung bình rễ ngô giữa các công thức 38 Hình 3.8 Bộ rễ ngô sau 28 ngày 39 Hình 3.9 Cây ngô sau 30 ngày theo dõi 42 Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hƣởng của 4 mức phân lân đến chiều cao ngô 44 Hình 3.11 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hƣởng của 4 mức phân lân đến chiều cao ngô 46 Hình 3.12 Hạt nảy mầm sau 5 ngày theo dõi 49 Hình 3.13 Đặc điểm cây ngô bị nấm R.solani tấn công 50 Hình 3.14 Cây ngô bị bệnh lỡ cổ rễ 52 viii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Hình dạng bào tử nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 26 Bảng 3.2 Dạng xâm nhiễm của nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 28 Bảng 3.3 Chiều cao cây ngô ở các ngày sau mọc 30 Bảng 3.4 Khối lƣợng thân cây ngô sau 28 ngày sau mọc 33 Bảng 3.5. Chiều dài rễ ngô sau 28 ngày theo dõi 35 Bảng 3.6 Khối lƣợng rễ ngô sau 28 ngày theo dõi 37 Bảng 3.7 Đƣờng kính rễ ngô sau 28 ngày theo dõi 38 Bảng 3.8 Chiều cao thân cây ngô 40 Bảng 3.9 Khối lƣợng thân, chiều dài rễ, khối lƣợng rễ ngô 41 Bảng 3.10 Kết quả chiều cao cây phát triển ở giai đoạn 12,16,20 ngày sau mọc của các công thức 43 Bảng 3.11 Kết quả chiều cao cây phát triển ở giai đoạn 12,16,20 ngày sau mọc của các công thức 45 Bảng 3.12 Tỷ lệ (%) hạt nảy mầm giữa các công thức 48 Bảng 3.13 % tỷ lệ cây bệnh do nấm R.solani gây ra 50 Bảng 3.14 Tỷ lệ (%) hạt nảy mầm giữa các công thức 51 Bảng 3.15. Tỷ lệ (%) cây bệnh do nấm R.solani gây ra 51 ix
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Địa hình ở nƣớc ta chủ yếu là vùng đồi núi, lƣợng mƣa lớn, tập trung, sự phân hoá giữa hai mùa khô và mƣa rõ rệt nên đất dễ bị xói mòn, rửa trôi và bị thoái hoá, tạo nên tầng kết cứng két von và đá ong làm giảm tiềm năng sản xuất của đất (Đỗ Đình Sâm et al, 2006). Đặc biệt ở những vùng đất miền Trung và miền bắc, các vùng đất thuộc các cao nguyên, nơi trồng các cây công nghiệp có giá trị và cây ngô, quá trình này diễn ra càng nặng nề hơn. Để khắc phục, hằng năm, một lƣợng lớn phân bón hóa học đã phải bổ sung để duy trì năng suất cây trồng, tuy nhiên, hiệu quả không cao. Mặt khác, phân hóa học còn làm chua hóa đất và càng làm đất bị chai cứng. Do vậy, viêc duy trì và quản lý độ phì đất đang là một vấn đề rất quan trọng và bức thiết hiện nay (Đỗ Đình Sâm et al, 2006). Trong đất tồn tại nhiều nhóm sinh vật khác nhau bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật. Các nhóm sinh vật này sống trong đất, tƣơng tác lẫn nhau trong các mối quan hệ: cộng sinh, hổ sinh, ký sinh, đối kháng. Cộng sinh là hiện tƣợng mà cả 2 loài cùng hợp tác và hổ trợ nhau phát triển. Trong đó điển hình là hiện tƣợng cộng sinh giữa nấm rễ Mycorrhiza và rễ cây. Nấm Mycorrhiza có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các chất đơn giản để cung cấp cho cây nguồn dinh dƣỡng để cây phát triển. Ngoài ra, nấm Mycorrhiza trong quá trình phát triểncòn giúp cho đất trở nên tƣơi xốp và tăng cƣờng giữ ẩm cho đất trong mùa khô. Việc ứng dụng nấm rễ cộng sinh Mycorrhiza đã đem lại hiệu quả về nhiều mặt trong phát triển nông, lâm nghiệp và bảo vệ môi trƣờng ở nhiều nƣớc trên thế giới (Nguyễn Văn Sức, 2008). Những nƣớc đi tiên phong nhƣ: Mỹ, Tây Ban Nha, Ấn Độ và một số nƣớc châu Á nhƣ :Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái lan, Phillipin, Đài Loan, Malaysia còn có cả trung tâm tuyển chọn nấm nội cộng sinh (ví dụ nhƣ Arbuscular mycorrhizal fungal Collection center in Taiwan – ACT) Tuy nhiên, ở Việt Nam, việc nghiên cứu nấm Mycorhiza ở Việt Nam vẫn còn khá khiêm tốn và chƣa có ứng dụng nào về Mycorhiza trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp đƣợc công bố. x
Đồ án tốt nghiệp Xuất phát từ những lý do trên sinh viên thực hiện đề tài” phân lập và khảo sát hiệu quả của nấm Mycorhiza đến sinh trƣởng, phát triển của cây ngô” làm cơ sở cho những nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo về nhóm nấm này. Mục đích nghiên cứu - Phân lập đƣợc 2 chủng nấm Mycorrhiza từ 2 chế phẩm. - Đánh giá đƣợc hiệu quả mang lại của 2 chủng nấm Mycorrhiza đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của cây ngô. Mục tiêu nghiên cứu: - Phân lập, quan sát đƣợc hình dạng bào tử, dạng xâm nhiễm của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2. - Đánh giá hiệu quả mang lại của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 đến sự phát triển của cây ngô. - Xác định đƣợc mức P2O5 phù hợp, nâng cao khả năng cộng sinh của 2 chủng nấm Mycorrhyza sp1 và Mycorrhiza sp2 đối với cây ngô. - Đánh giá hiệu quả kháng lại 2 loại nấm bệnh Rhizoctonia solani và Fusarium sp của 2 chủng nấm Mycorrhyza sp1 và Mycorrhiza sp2. xi
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kết quả nghiên cứu về nấm Mycorrhiza trên thế giới 1.1.1 Giới thiệu về nấm Mycorrhiza 1.1.1.1 Khái niệm Mycorrhiza Cộng sinh là quan hệ hỗ trợ cần thiết và chặt chẽ giữa hai hay nhiều loài trong đó các loài đều có lợi. Đa số các loại thực vật có thể khai thác đƣợc các chất dinh dƣỡng từ đất là nhờ vào các vi sinh vật có lợi trong đất cộng sinh với chúng, các vi sinh vật đó cộng sinh ở vùng rễ của thực vật và có các nhánh sợi phân chia len lỏi vào trong các hạt đất nên đƣợc gọi là nấm vùng rễ hay còn gọi là nấm rễ Mycorrhiza. Mycorrhiza là quan hệ cộng sinh giữa nấm và rễ thực vật. Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp Mykes (nấm) và Rhiza (rễ). Đây là một hiện tƣợng phổ biến trong tự nhiên. Chúng có tác dụng hỗ trợ nhau cùng phát triển. Nấm không có rễ thì không thể phát triển đƣợc, cây không có nấm thì sinh trƣởng yếu vàng. Năm 1885, Frank – nhà bệnh cây lâm nghiệp ngƣời Đức – đƣa ra khái niệm “mycorhiza” để chỉ sự cộng sinh đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh. Đồng thời Frank (Năm 1887) đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nội cộng sinh, sự khác biệt này dùng để chỉ nấm cộng sinh với Ericaceous và Orchid . Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi loại hình cộng sinh này. Năm 1897, Janse đã gọi cấu trúc intramatrical của bào tử là “vesicules” (gọi là thể V). Năm 1905 Gallaud (1905) gọi những cấu trúc khác trong tế bào thƣờng đƣợc quan sát thấy là “arbuscular” (gọi là thể A). Vì vậy tên gọi “vesicular – arbuscular mycorrhiza” đƣợc hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây. Vesicular – arbuscular mycorrhiza thƣờng đƣợc viết tắt là VAM. Ngoài ra, trong một số bài báo, công trình khoa học còn sử dụng tên gọi “vesicular – arbuscular mycorrhiza fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này. Sau này, các nhà khoa học nhận ra không phải tất cả các nấm đều hình thành vesicules (thể V) nhƣng thể A là đặc điểm chung nhất của các chi. Vấn đề này đặt ra yêu cầu loại hình cộng sinh này phải đƣợc đổi lại tên là “arbuscular 1
Đồ án tốt nghiệp mycorrhiza”. Những tranh luận xung quanh tên gọi của loại hình cộng sinh này vẫn tiếp diễn. Năm 2005 một hội nghị về nấm nội cộng sinh tổ chức tại Lisboa tại Portugal tên gọi “arbuscular mycorrhiza fungi” (AMF) đƣợc sử dụng để chỉ loại hình cộng sinh này. Hiện nay, trong các tài liệu mới đƣợc công bố, thuật ngữ “arbuscular mycorrhiza fungi”(AMF) đƣợc các nhà khoa học thống nhất sử dụng song song và tiến tới thay thế cho thuật ngữ “vesicular – arbuscular mycorrhiza”(VAM). Vào giữa thế kỷ 20, việc nghiên cứu về nấm rễ cộng sinh đã đƣợctìm hiểu rộng rãi và sâu sắc hơn.Theo các nhà khoa học dự đoán, trên thế giới có 1000 chi thuộc 200 họ nấm rễ. Theo thống kê của Trappe (1962) cho biết,có 535 loài nấm thuộc 81 chi, 30 họ và 10 bộ nấm có thể cộng sinh với trên 1500 loài cây gỗ khác nhau. 1.1.1.2 Phân loại và đặc điểm cấu trúc của nấm Mycorrhiza Hiện nay, việc phân loại nấm nội cộng sinh có rất nhiều hạn chế. Nguyên nhân là do tất cả các loài đều là vô tính, khó tồn tại trong môi trƣờng nhân tạo, nhiều đặc điểm loài chồng chéo lên nhau, việc xác định đặc điểm thuộc sợi nấm và bào tử, thiếu khoá phân loại đầy đủ về loài và chi.Cho đến nay việc phân loại dựa vào một số phƣơng pháp : Phân loại theo đặc điểm hình thái, cấu trúc của nấm, màu sắc biến đổi của bào tử dựa trên bảng màu của Morton (1992) để phân loại. Các tiêu chí dùng để phân loại bào tử gồm: sự sắp xếp bào tử, hình dạng bào tử, kích thƣớc bào tử, mầu sắc của bào tử (phát hiện qua bảng màu chuẩn), sự phát triển của bào tử, cầu trúc bề mặt bào tử (thông qua phản ứng nhuộm Melzer) Phƣơng pháp huỳnh quang: năm 1993 Simon đƣa ra phƣơng pháp huỳnh quang, phƣơng pháp này có thể dùng để xác định sự xâm nhiễm của nấm rễ nội cộng sinh trong rễ, xác định đƣợc số lƣợng nấm Mycorrhiza với cây chủ đặc trƣng. Phƣơng pháp phân loại dựa trên cơ sở huyết thanh học (Aldwell và Hall 1987), điện di gen (Hepper, 1987) và mức độ thay đổi axit béo (Bentivenga và Morton, 1994). Ngày nay phƣơng pháp AND đƣợc các nhà khoa học đánh giá rất 2
Đồ án tốt nghiệp cao (Cummings, 1990; Davidson và Geringer, 1990; Simon và cộng sự, 1990, 1992, 1993; Redecker 2000). Năm 2001, Schubler sử dụng dữ liệu phân tử chứng minh mối liên hệ giữa nấm nội cộng sinh và nấm khác. Thông thƣờng việc phân loại nấm nội cộng sinh sẽ vẫn dựa chủ yếu vào các đặc điểm cấu trúc. Phƣơng pháp giải phẫu sẽ đƣợc dùng để đánh giá quan hệ ở mức cao hơn. Các hệ thống phân loại ngày nay đƣợc sử dụng đều dựa trên cơ sở hệ thống phân loại của Morton và Benny xây dựng năm 1990. Thông thƣờng, căn cứ vào hình thái giải phẫu thì rễ nấm đƣợc chia ra làm 3 loại chính: a. Rễ nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza) sợi nấm bao quanh rễ dinh dƣỡng chƣa hóa gỗ, không xuyên qua mô tế bào mà chỉ kéo dài giữa các vách tế bào. Đặc trƣng cơ bản của loài này là: trên bề mặt rễ dinh dƣỡng hình thành một màng nấm (mantle) do các sợi nấm đan chéo nhau. Giữa các tế bào tầng vỏ rễ hình thành một mạng lƣới do thể sợi nấm sinh trƣởng mà thành và đƣợc gọi là lƣới Hartig (Hartig net), do tác dụng của nấm rễ, bộ rễ ngắn,to, tròn và có màu sắc khác nhau, tán rễ và biểu bì không có lông hút, bề mặt màng có nhiều sợi nấm kéo dài ra. Trong đó nấm tạo thành một lớp áo xung quanh rễ và một mạng lƣới Hartig giữa các tế bào rễ mà không xâm nhập vào nội bì. Sau đó mạng lƣới này sẽ lan khắp các hệ thống rễ. Nấm rễ ngoại cộng sinh không có hình dạng và màu sắc nhất định rất dễ nhận biết bằng mắt thƣờng Tính đa dạng thể hiện trên loài cây chủ và nấm rễ khác nhau. Nấm rễ ngoại cộng sinh đƣợc hình thành do nấm thuộc Basidiomycota, Ascomycota, và Zygomycota sống cộng sinh với rễ của khoảng 10% các loài thực vật, chủ yếu là cây thân gỗ gồm có bạch dƣơng, bạch đàn, thông, sồi, và các loài hoa hồng. b. Rễ nấm nội cộng sinh (Endomycorrhiza): có quan hệ cộng sinh với trên 80% thực vật, đặc biệt là cây thân thảo, cây nông nghiêp. Nấm rễ nội cộng sinh là thể nấm có thể xuyên qua tế bào và rễ cây chủ, không biến đổi hình thái, bề mặt rễ không hình thành màng nấm chỉ có các sợi lƣa thƣa, lông hút vẫn giữ 3
Đồ án tốt nghiệp nguyên. Tuy nhiên thể sợi nấm vẫn kéo dài giữa gian bào nhƣng không hình thành mạng lƣới Hartig (Hartig net). Sợi nấm xuyên qua vách tế bào vào trong hình thành vòi hút. Những loại này thƣờng khó nhìn thấy bằng mắt thƣờng. Căn cứ vào kết cấu của sợi nấm có vách ngăn, ngƣời ta chia ra làm hai loại: không có vách ngăn (Aseptate – endotrophic Mycorrhizal) và loại có vách ngăn (Septate – endotrophic Mycorrhizal).  Loại có vách ngăn: lại căn cứ vào cây chủ và hình dạng sợi nấm trong tế bào mà chia ra: rễ nấm loại Đỗ Quyên (Ericaceous Mycorrhizal) sợi nấm trong tế bào xoắn vòng (Coil), rễ nấm họ lan (Orchidaceous Mycorrhizal), sợi nấm trong tế bào dạng kết thắt (Knot) hoặc cục (Peloton). Một số loài cây phổ biến cộng sinh với nấm này là các loại cây thân thảo, hoa lan và một số loại cây khác.  Loại không có vách ngăn: thƣờng có dạng túi bóng (Vesicular) và dạng chùm (Arbuscular), gọi là rễ nấm dạng túi chùm (Vesicula – Arbuscular Mycorrhizal) gọi tắt là VA hoặc VAM.  Cấu trúc của túi bóng (Vesicular) Túi bóng phát triển để tích luỹ các sản phẩm dự trữ trong nhiều quần hợp VAM. Vesicular đƣợc hình thành ngay sau khi có arbuscule đầu tiên, nhƣng tiếp tục phát triển khi các arbuscule trở nên già. Vesicular là sợi nấm sƣng phồng lên trong vỏ rễ có chứa chất béo và tế bào chất. Vesicular có thể phát triển các thành dày trong rễ già hơn và có thể có chức năng nhƣ chồi (Biermann and Linderman, 1983). Cấu trúc của dạng chùm (Arbuscular): Đây là những giác mút nhánh phức tạp đƣợc hình thành trong tế bào vỏ rễ. Nó đƣợc đặt tên bởi Gallaud (1905), bởi vì chúng trông giống nhƣ bụi nhỏ. Arbuscular đƣợc hình thành do sự phân nhánh lặp đi lặp lại và sự giảm chiều rộng sợi nấm, bắt đầu từ thân sợi nấm ban đầu (đƣờng kính 5 – 10µm) và kết thúc bằng sự gia tăng của các nhánh sợi nấm nhỏ (đƣờng kính < 1µm). Arbuscular bắt đầu hình thành khoảng 2 ngày sau khi xâm nhập vào rễ (Brundrett et al., 1985). Chúng phát triển bên trong các tế bào riêng lẻ của vỏ rễ, 4
Đồ án tốt nghiệp Arbuscular đƣợc coi là nơi trao đổi dinh dƣỡng chính giữa nấm và cây chủ. Giả thiết này đƣợc dựa trên diện tích lớn của bề mặt Arbuscular nhƣng đã không đƣợc xác nhận (Smith, 1995). Arbuscular hình thành sau sự tăng trƣởng của sợi nấm, lan ra phía ngoài từ các điểm ban đầu. Arbuscular tồn tại trong thời gian ngắn và bắt đầu hỏng sau một vài ngày, nhƣng sợi nấm và các túi có thể vẫn còn trong rễ trong nhiều tháng hoặc năm. c. Rễ nấm nội ngoại cộng sinh (Ectendomycorrhiza) Đây là loại nấm rễ có cả của cả hai loại trên. Chúng thƣờng có ở rễ cây thông (Pinacea), cáng lò (Betulaceae), Đỗ quyên quả mọng (Arbutus) và cây thuốc thuộc họ lan thủy (Monotropaceae). 1.1.2 Đặc tính sinh thái học của nấm rễ Mycorrhiza Những nghiên cứu về sinh thái học của Mycorrhiza cho thấy, sự cộng sinh của VAM tại một vùng có thể chỉ ra mức độ đặc trƣng riêng của hệ sinh thái vùng đó. Sự phát triển mạnh của nấm nội cộng sinh phụ thuộc vào nhiệt độ (McGonigle và Fitter năm 1990). Số lƣợng bào tử thay đổi theo các mùa trong năm, số lƣợng bào tử nhiều vào cuối mùa hè hoặc mùa thu và sẽ giảm vào mùa động, mùa xuân và mùa hè (Sutton & Barron, 1972; Khan, 1974). Khi nghiên cứu về nấm nội cộng sinh trong các khu rừng nhiệt đới, Jha.D.K, G.D Sharma và R.R Mishra nhận thấy, nấm nội cộng sinh ở đây có ƣu thế hơn so với vùng rừng cận nhiệt đới. Số lƣợng bào tử và sự phát triển của nấm nội cộng sinh tƣơng quan nghịch với độ ẩm đất. Loài cây chủ cũng đƣợc xác định có liên quan đến số lƣợng bào tử nấm nội cộng sinh trong đất. Thí nghiệm nhân nuôi bào tử nấm nội cộng sinh trong chậu vại cho thấy cây ngô có khả năng tạo ra số lƣợng bào tử nhiều hơn so với cây đỗ tƣơng. Một yếu tố khác ảnh hƣởng tới số lƣợng bào tử là độ sâu tầng đất. Năm 1972, Sutton & Barron trong nghiên cứu của mình đã cho nhận xét: số lƣợng nấm nội cộng sinh trong đất canh tác nông nghiệp giảm theo độ sâu tầng đất mặt. Đối với dạng lập địa là cồn cát, sự xâm nhiếm của nấm nội cộng sinh cũng giảm dần theo độ sâu tầng đất. Mohankumar.V và A.Mahadevan cũng có những kết luận tƣơng tự 5
Đồ án tốt nghiệp về rừng nhiệt đới ở Ấn Độ, đồng thời cho nhận xét về tỷ lệ nhiễm nấm rễ cộng sinh trong mùa khô cao hơn mùa mƣa. Nghiên cứu về số lƣợng VAM (Vesicular-Arbuscular-Mycorrhiza) trong đất, Schenck và cộng sự đã nhận thấy rằng: ở các loại đất nghiên cứu khác nhau thì số lƣợng bào tử của nấm rễ cộng sinh cũng khác nhau, nhƣng đặc điểm chung là ở trong đất đƣợc trồng trọt thƣờng xuyên (đất trồng lúa nƣớc, trồng đậu, trồng lúa mỳ và đất trồng nhiều loại cây) luôn có số lƣợng nhiều hơn trong đất tự nhiên. Tuy nhiên, thành phần loài của nấm rễ cộng sinh trong đất tự nhiên lại đa dạng hơn so với đất trồng trọt. 1.1.3 Sự hình thành nấm rễ nội cộng sinh Nấm rễ nội cộng sinh thuộc ngành phụ nấm tiếp hợp (Zygomycotina), lớp nấm tiếp hợp (Zygomycetes). So với nấm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội sinh có rất ít loài. Năm 1989 mới chỉ phát hiện 133 loài nấm rễ nội cộng sinh. Trong đất tồn tại các bào tử nấm rễ nội cộng sinh. Sự phát triển của bào tử nấm, lại bị hấp dẫn bởi các hợp chất tiết ra từ rễ cây. Đầu tiên, các hợp chất tiết ra từ rễ sẽ kích thích sự phát triển ống mầm của nấm. Sau đó, ống mầm phân ra nhiều nhánh và hƣớng tới những vị trí nhất định khác nhau trên vỏ rễ. Khi nhận diện đƣợc cây kí chủ, thì nấm rễ sẽ hình thành vòi bám, xâm nhập vào trong vỏ rễ. Lúc này, nấm cộng sinh sẽ phát tín hiệu cho cây, để cây sản sinh ra các hợp chất nuôi Mycorrhiza phát triển đến một giai đoạn nhất định.(Ende 1978) Khả năng xâm nhập của nấm rễ phụ thuộc rất lớn vào mức độ già, non của lông hút và loài cây chủ. Rễ cỏ 3 lá (Trifolim repens) thƣờng phải sau 3 tuần, bạch đàn và cam quýt thƣờng phải sau 1 tháng mới bắt đầu xâm nhiễm. Về tỷ lệ xâm nhiễm ngƣời ta thƣờng lấy ngô làm đối chứng, sau 2 tuần tỷ lệ xâm nhiễm là 23 – 27%. Thể sợi nấm sau khi xâm nhập vào rễ có thể sinh trƣởng nhanh len lỏi giữa các tế bào rồi mới vào trong tế bào, cũng có thể phát triển giữa các tế bào, nhƣng không hình thành lƣới Hartig nhƣ nấm ngoại cộng sinh. 6
Đồ án tốt nghiệp Sợi nấm sau khi vào trong tế bào liền bao lấy nguyên sinh chất, phân nhánh hình thành vòi hút. Cuộc sống sợi nấm trong tế bào rất ngắn chỉ mấy ngày đến mƣời mấy ngày là bị phân giải, nhƣng tế bào bị nhiễm vẫn sống và bị nhánh sợi nấm khác tạo ra nhánh sợi mới. Cho nên trong tế bào ta phát hiện cả sợi nhánh, các xác sợi nấm. Khi xâm nhập vào tế bào rễ, chúng chỉ phân nhánh ở tầng giữa và tầng trong của vỏ cây. Nhánh sợi nấm trong tế bào rất nhỏ chỉ 0,5 – 1,0µm. Chỗ phân nhánh là nơi trao đổi dinh dƣỡng giữa nấm và rễ, bởi vì ở gốc nhánh sợi nấm ngƣời ta phát hiện nhiều hạt đƣờng và giọt dầu, và trong dịch bào phát hiện có hạt muối photphorat và một số hợp chất hòa tan. Nhánh phân ra bị phân giải lại cung cấp cho rễ cây sử dụng. 1.1.4 Sự hình thành nấm rễ ngoại cộng sinh Quá trình hình thành nấm ngoại cộng sinh cũng nhƣ quá trình xâm nhiễm, chia ra tiếp xúc, xâm nhập, ủ bệnh hay phát triển và xuất hiện. Trong đất hình thành nhiều bào tử nấm, sợi nấm, xâm nhiễm vào bộ rễ, làm cho rễ cây ngừng tăng trƣởng, phình lên và hình thành bao nấm, sau đó sợi nấm phân nhánh thành bao và rễ cây phân nhánh rất khác nhau. Sợi nấm xâm nhiễm vào tầng vỏ của rễ dinh dƣỡng, giữa tế bào hình thành mạng lƣới gọi là lƣới Hartig. Phần lớn nấm rễ chỉ hình thành rễ nấm với rễ dinh dƣỡng, bởi vì chỉ có nấm lấy dinh dƣỡng từ rễ dinh dƣỡng và trong điều kiện tự nhiên bộ rễ hình thành nấm rễ thƣờng rất non cây con sinh trƣởng nhờ dinh dƣỡng đƣợc cung cấp từ hạt, còn sau đó cây cần dinh dƣỡng trong đất. Giai đoạn này nếu bộ rễ tiếp xúc với nấm rễ, thì sự hình thành rễ nấm rất nhanh và rất có lợi. Cho nên mấy năm nay, nhiều ngƣời dùng phƣơng pháp cấy nấm vào lúc cây con mới nẩy mầm để làm tăng nhanh quá trình nấm tiếp xúc với rễ để cung cấp chất dinh dƣỡng cho cây phát triển. 1.1.5 Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đối với nấm Mycorrhiza Khác rất nhiều với các nhóm vi sinh vật nấm rễ Mycorhiza không thể thực hiện quá trình nhân sinh khối trên môi trƣờng nuôi cấy nhân tạo mà phải thông qua cây kí chủ hoặc qua nuôi cấy cơ quan của rễ . 7
Đồ án tốt nghiệp Nguồn Carbon Đối với Mycorrhiza, hợp chất carbon là yếu tố cần thiết trong quá trình hình thành tế bào và quá trình trao đổi chất. Nguồn carbon chủ yếu là lignin và cellulose. Những loài nấm khác nhau nhu cầu carbon không nhƣ nhau. Phần lớn nấm ngoại cộng sinh cần đƣờng đơn nhƣ glucose, fructose, một số loài cần đƣờng đôi nhƣ saccharose, maltose, một số ít cần đa đƣờng nhƣ cồn, tinh bột. Nấm ngoại cộng sinh nhờ dinh dƣỡng carbon của bộ rễ cung cấp, một số loài tiết ra enzyme để phân giải đƣờng. Cho nên hợp chất carbon trong rễ có hay không, nhiều hay ít cũng quan hệ đến sinh trƣởng phát triển của nấm rễ Khác với nấm ngoại cộng sinh, nấm nội cộng sinh cần dinh dƣỡng từ ngoài vào do không thể tiết ra enzyme phân giải đƣờng. Thông qua nguyên tử đánh dấu C14 các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc, nấm lấy hợp chất carbon do quang hợp của cây. Ở giai đoạn đầu, bộ rễ non của cây chủ cũng rất cần chất dinh dƣỡng để phát triển chứ không riêng gì nấm Mycorrhiza Do vậy, nồng độ hợp chất cacbon hòa tan trong rễ cây chủ thay đổi khi nấm rễ hình thành và cộng sinh. Thời kỳ đầu này, rễ cây và nấm tranh giành nhau hợp chất cacbon. Mức cacbon trong rễ giảm trong suốt 10 ngày đầu sau khi có sự cộng sinh giữa nấm và cây chủ. Lúc này, nấm rễ sẽ tạm thời ngƣng phát triển để nhƣờng cho cây. Sau một thời gian thì hiện tƣợng tranh giành này sẽ đƣợc xóa bỏ vì sự tích lũy cacbon trong cây tăng lên giúp cho cả hai cùng sinh trƣởng tốt hơn. Nguồn Photpho Trong dinh dƣỡng, khoáng P là thành phần quan trọng nhất đối với cả nấm ngoại cộng sinh lẫn nội cộng sinh. Trong đó, nucleotide và nucleoside phosphoride là thành phần quan trọng không thể thiếu đƣợc. Nhu cầu về P quan trọng hơn cả các chất khác. Phần lớn P hữu cơ trong đất là nguồn dinh dƣỡng P cho nấm rễ, còn nguồn P vô cơ đƣợc tổng hợp từ KH2PO4, K2HPO4 . Một số loài nấm do giai đoạn sinh trƣởng khác nhau nên nhu cầu về P cũng khác nhau. Phần lớn các loài nấm ngoại cộng sinh hấp thu P tích lại trong bao màng nấm. Jenning (1964) cho rằng P 8
Đồ án tốt nghiệp vô cơ hay hữu cơ đƣợc tích lại trong dịch bào của sợi nấm và trao đổi với tế bào chất, chỉ có một số ít tích lũy vào trong tế bào chất. Có điều lạ là khi P di chuyển vào dịch bào thì lƣợng P trong tế bào chất của bộ rễ cây giảm xuống, thể sợi nấm tiếp tục hấp thu P, khi P trong rễ cây phong phú thì sự hấp thu của nấm lại bị ngừng lại. Năm 1978, trong một công trình công bố trên tạp chí New Phytologist, Schuybert và Hayman chỉ ra rằng khả năng xâm nhiễm của Mycorhiza vào rễ cây chủ tăng khi đất thiếu photpho và giảm khi đất giầu phôtpho. Tuy nhiên không phải cứ giảm lƣợng photpho trong đất thì khả năng xâm nhiễm của Mycorhiza tăng theo. Theo Koide (1991) cho biết khi lƣợng phôtpho trong đất ở mức quá thấp thì hầu nhƣ không xuất hiện của Mycorrhiza. Nguồn Nitơ Nói chung nấm rễ không sử dụng nitơ vô cơ. Nhƣng trong một số trƣờng hợp có thể sử dụng nitơ vô cơ để tổng hợp thành chất hữu cơ. Nấm rễ ngoại sinh về cơ bản cũng nhƣ vậy. Phần lớn nấm rễ cộng sinh và ngoại cộng sinh hấp thu đạm amon dễ hơn đạm nitrat. Guo Xiuzhen (1989) thí nghiệm 14 loài nấm cộng sinh cho rằng nấm sử dụng bột nấm men, cao thịt bò và pepton dễ hơn, sợi nấm sinh trƣởng rất tốt, nhƣng đối với đạm urê thì không sử dụng. Các chất sinh trƣởng Trong quá trình sinh trƣởng phát triển nấm rễ cần các chất sinh trƣởng nhƣ vitamin, chất kích thích và nhân tố sinh trƣởng khác. Các chất đó nhận đƣợc từ môi trƣờng mà nấm không tổng hợp đƣợc. Vitamin B1 là nhân tố sinh trƣởng cần thiết cho nấm rễ, các vitamin PP, B2, B6 đều cần cho nấm nẩy mầm và hình thành quả thể. Vitamin B2, B6 rất cần cho sợi nấm sinh trƣởng và phát triển[9]. 1.1.6 Vai trò cuả Mycorrhiza Giúp cây tăng khả năng hấp thu lân trong đất. Những gốc phốt-phat khó di động trong đất thƣờng kết hợp với các ion Na+, Ca2+, Al3+ bị cố định tạo thành dạng 9
Đồ án tốt nghiệp lân khó tan, cây trồng khó hấp thu. Theo Smith và Read (2002), lƣợng lân trong đất bị cố định có thể lên tới 95-99%, chỉ một lƣợng nhỏ lân dễ tiêu đƣợc cây hấp thu, bên cạnh đó còn có các nguồn lân hữu cơ làm tăng thêm lƣợng lân khó tiêu trong đất. Nấm rễ nhờ có ái lực với lân cao hơn lông hút của rễ, cùng hệ sợi nấm có đƣờng kính nhỏ hơn lông hút của rễ có khả năng len lỏi vào các hạt đất, kể cả các lỗ hổng rất nhỏ của đất mà rễ không qua đƣợc để lấy các nguồn lân dễ tiêu,hơn nữa tốc độ hút P của sợi nấm cao hơn gấp 6 lần lông hút của rễ (Sander,1923). Ngoài ra nấm rễ cộng sinh có hoạt tính enzyme phosphorase cao ( Allen,1981), chuyển P không tan thành P hòa tan. tất cả các yếu tố đó giúp cho cây tăng khả năng tiếp xúc với nguồn lân và sử dụng đƣợc chúng. Cung cấp đạm cho cây trồng: theo Smith và Read (2002), nấm rễ có ảnh hƣởng đến sự cố định đạm. Nấm rễ Mycorrhiza có khả năng cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm, làm tăng tốc độ cố định đạm dẫn đến làm tăng một phần đạm hấp thu. Thƣờng thì hàm lƣợng đạm trong đất phụ thuộc vào hoạt tính vi sinh vật, trong quá trình khoáng hóa đạm từ nguồn hữu cơ. Trong tự nhiên, đạm dễ tiêu trong đất là + + NH4 và Mycorrhiza có khả năng vận chuyển NH4 cho cây. Nguồn nƣớc và dinh dƣỡng khác: Theo Sieverding và Toro (1988), trong đất thiếu K và đƣợc cải thiện bằng sự vận chuyển K+ của sợi nấm. Bên cạnh đó, dƣới tác động của hệ sợi nấm, khả năng hấp thu đồng, kẽm (Lambert et al, 1979), niken (Killham & Firestone, 1983), clo và sunphat (Bwalda et al, 1983) của cây tăng lên rõ rệt. Theo nghiên cứu của Li & cộng sự (1991), Burkert & cộng sự (1994), George & công sự (1995), Kothari & cộng sự (1996) cho biết, khi cộng sinh nấm Mycorrhiza vận chuyển đƣợc 25% N, 80%P, 10% K, 60% Cu, 12% Si, 25% Zn đến cây chủ. Ngoài ra, hệ sợi nấm phát triển chằng chịt bao quanh rễ cây làm tăng thêm bề mặt tiếp xúc của bộ rễ. Nhờ vậy hệ thống rễ của cây hút nƣớc và chất dinh dƣỡng thuận lợi hơn (Mosse, 1957; Abbot và Robson, 1984). Theo (David M. Sylvia, 1998) nấm cộng sinh Mycorrhiza có quan hệ rộng rãi với các loại VSV khác ở vùng rễ, quan hệ tích cực, trung lập, và tiêu cực. Quan hệ giữa Rhizobia và cộng sinh Arbuscular Mycorrhiza là quan hệ dƣơng vì yêu cầu photpho cho hoạt động cố 10
Đồ án tốt nghiệp định đạm. Cây cộng sinh Mycorrhiza và Rhizobia kết quả là hàm lƣợng N và P tăng so với chỉ nuôi cấy không trong điều kiện cộng sinh Mycorrhiza. Nấm cộng sinh Mycorrhiza xâm nhập rễ cây và có tác động ức chế và kháng lại các bệnh do các nấm Phytophthora cinnamomi, Rythium, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani gây ra (Wingfield 1968, Marx 1973, Mark và Krupa 1973). Trong hệ sinh thái tự nhiên nấm cộng sinh Mycorrhiza ngăn chặn các bệnh rễ đƣợc giải thích theo cơ chế: ngăn chặn cơ học sự xâm nhập của nguồn bệnh bằng cấu trúc sợi nấm đan xen trong rễ cây, Mycorrhiza sản sinh ra các hợp chất kháng sinh nhƣ antibiotic (Zar 1964, Mark 1972), ngoài ra trong quá trình sinh trƣởng phát triển số lƣợng bào tử nấm tăng mạnh trong đất dẫn đến việc cạnh tranh dinh dƣỡng với VSV gây bệnh và làm tăng tính bảo vệ cho cây chủ. Hơn thế nữa, theo Schonbeck (1979) và Dehne (1982), rễ có Mycorrhiza cộng sinh thì hàm lƣợng hợp chất phenol cao, kháng lại các nấm gây bệnh, làm giảm 40% các tác nhân gây bệnh ở rễ thƣờng gặp. 1.1.7 Phương thức sử dụng nấm rễ cộng sinh Các bào tử nấm rễ nội sinh có một đặc điểm rất khác so với các loài nấm cũng nhƣ nhóm vi sinh vật thông dụng khác đó là chúng khó có thể nuôi cấy trực tiếp trên môi trƣờng nhân tạo đƣợc (Gianinazzi P., Gianinazzi S., 1983; Ted, 2000; Koide, Mosse 2001). Muốn tạo ra đƣợc bào tử nấm nội sinh hay muốn tạo chế phẩm thƣơng mại ngƣời ta thƣờng phải nuôi qua hệ thống cây ký chủ trực tiếp (Bakshi, 1974; Bainbridge 1995) hoặc gián tiếp (Brundrett Mark, 1996). Khi nuôi qua hệ thống cây ký chủ, cách thức đơn giản nhất là trồng cây ký chủ trong các hệ thống hộp có chứa đất và cát (tỷ lệ thông thƣờng là 1 đất: 3 cát). Cách phức tạp hơn nhƣng đạt hiệu quả cao hơn là nuôi cấy hệ thống rễ trên thạch đĩa Petri có kết hợp các bào tử nấm (Grace, 2003; Fortin, 2002). Bên cạnh đó, hàm lƣợng P2O5 trong đất cũng ảnh hƣởng đến khả năng cộng sinh của nấm rễ . Vấn đề này hiện nay đã đƣợc giải quyết bằng cách nuôi cây trong môi trƣờng đệm và nhiễm nấm từ giai đoạn cây con. Nhiễm nấm nội cộng sinh làm tăng tỷ lệ sống của thực vật trong nhân giống vi mô. Việc nhiễm nấm phải đƣợc thực hiện trƣớc khi đƣa cây ra khỏi ống công. Những cây đƣợc nuôi trong môi 11
Đồ án tốt nghiệp trƣờng đệm và nhiễm nấm, hạt đƣợc thu hái và gieo trồng từ những cây này sẽ sinh trƣởng tốt hơn, cho sản lƣợng cao hơn và có khả năng kháng bệnh cao hơn. Nhƣ vậy, từ khi nấm nội cộng sinh đƣợc biết đến, phƣơng thức sử dụng nấm nội cộng sinh đầu tiên là sử dụng tầng đất mặt có nấm nội cộng sinh nhƣ một phƣơng thức lây nhiễm. Tiếp theo là phƣơng pháp chủ động tạo nguồn lây nhiễm bằng cách nhân nuôi bào tử nấm nội cộng sinh thuần khiết trong chậu cùng với cây chủ. Không chỉ dừng lại ở việc nhân nuôi bào tử nấm nội cộng sinh trong môi trƣờng có cây chủ, khoa học ngày nay còn có thể nhân nuôi nấm nội cộng sinh trong môi trƣờng in-vitro. Tại Ấn Độ, các nhà khoa học đã nghiên cứu chuyển ADN nấm nội cộng sinh vào rễ cây chủ và nhân nuôi trong môi trƣờng đặc biệt. Kết quả của nghiên cứu này đã tạo ra những sản phẩm nấm nấm nội cộng sinh từ môi trƣờng in- vitro. 1.1.8 Ứng dụng của Mycorrhiza Nghiên cứu và ứng dụng Mycorrhiza đã trở thành một trong những lĩnh vực quan trọng trong ngành khoa học môi trƣờng hiện đại, từ những khía cạnh cơ bản để ứng dụng trong nông nghiệp và trong việc phục hồi các hệ sinh thái. Arbuscular mycorrhizal là phổ biến nhất dựa trên sự cộng sinh. Trong các vấn đề về sinh thái và nông nghiệp sự cộng sinh giữa thực vật và nấm rễ là quan trọng, cây lấy phospho chủ yếu từ các loại nấm rễ. Arbuscular đƣợc coi là mạng lƣới của trao đổi phospho. Theo AFP cho biết, các nhà khoa học của Đại học Lausanne, Thụy Sĩ, phát hiện tác dụng của nấm Mycorrhiza sau 4 năm tiến hành thử công đối với 20 mẫu bào tử khác nhau có khả năng làm cho lúa tăng trƣởng nhanh gấp 5 lần. Ở giai đoạn cuối những năm 1980, việc áp dụng nấm rễ Mycorrhiza đã có hiệu quả tích cực trong việc phục hồi những cánh rừng bị tàn phá ở Indonesia (Jeffries and Dodd,1991; Setiadi, 1998), nấm rễ cộng sinh kích thích sự tăng trƣởng và phát triển cây con (Setiadi, 1996), ngoài ra các nhà khoa học ở Indonesia nhận thấy, khi Mycorrhiza liên kết với rễ nó làm gia tăng sự sinh trƣởng và phát triển ở rễ, khả năng hấp thu dinh dƣỡng cho năng suất cây trồng cao, loại nấm này làm giảm lƣợng phân hóa học, duy trì độ phì nhiêu của đất, tăng khả năng chịu hạn, 12
Đồ án tốt nghiệp mặn và kim loại nặng, kháng các bệnh ở rễ. Kết quả là sau 5 năm, ở những khu vực bị suy thoái đã hình thành cây con, giảm đáng kể rừng bị suy thoái (Setiadi, 1996). Năm 1988, Bali đã chứng minh hiệu quả của nấm nội cộng sinh có khả năng làm giảm bệnh héo bông do nấm Fusarium gây ra. 1.2 Các chế phẩm nấm Mycorrhiza Hiện nay ở các nƣớc phát triển, các chế phẩm Mycorrhiza đƣợc thƣơng mại hóa trên thế giới. Một số chế phẩm tiêu biểu nhƣ: Endoroot, Rootgrowplus ,Soil Most của Mỹ, Symbion của Hoa Kỳ. Hình 1.1. Các chế phẩm nấm Mycorrhiza 13
Đồ án tốt nghiệp 1.3 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Nấm rễ cộng sinh là hiện tƣợng rất phổ biến trong tự nhiên, có khoảng 60- 80% các loại thực vật trên thế giới có mối quan hệ với nấm rễ cộng sinh. Nhiều công trình khoa học đã chứng minh vai trò của nấm Mycorrhiza mang lại những lợi ích to lớn, thiết thực đối với quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây trong điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Hình thức cộng sinh đã và đang đƣợc nghiên cứu về phân loại, sự đa dạng, phân bố ảnh hƣởng của chúng đối với thực vật và ứng dụng vào thực tiễn sản xuất nông – lâm nghiệp ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tuy nhiên ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng phát triển nấm Mycorrhiza còn rất hạn chế. Nghiên cứu về nấm cộng sinh ở Việt Nam bắt đầu từ những năm 60 của thế kỷ 20. Mặc dù đã đạt đƣợc một số kết quả nhƣng phạm vi nghiên cứu khi đó chỉ bao gồm nấm ngoại cộng sinh. Nghiên cứu đầu tiên về nấm cộng sinh trong lâm nghiệp là việc sử dụng đất tầng mặt rừng thông để gieo ƣơm cây con đƣợc coi nhƣ nhiễm nấm tự nhiên của Lâm Công Định. Sau đó là các kết quả nghiên cúu của Nguyễn Sỹ Giao vào những năm 1976 - 1988 trên tập san Lâm nghiệp về sự có mặt của nấm ngoại cộng sinh với rễ cây thông. Nghiên cứu sử dụng nấm cộng sinh thuần chủng để tạo rễ nấm cho cây thông con, bằng phƣơng pháp sử dụng tầng đất mặt lấy từ rừng thông để tạo hỗn hợp túi bầu khi gieo ƣơm cây thông con đã đƣợc sử dụng nhƣ một biệp pháp lâm sinh trong một thời gian khá dài. Kết quả nghiên cứu cho thấy, có sự vƣợt trội về đƣờng kính và chiều cao của những cây đƣợc nhiễm nấm so với công thức đối chứng từ 20-30% Bên cạnh việc sử dụng nấm nội cộng sinh thúc đẩy sinh trƣởng của cây con Nguyễn Sỹ Giao còn nghiên cứu sử dụng nấm nội cộng sinh phòng bệnh vàng còi ở thông con và cũng đã đạt đƣợc kết quả nhất định. Từ đầu những năm 1970 đến những năm 1980, Viện Nghiên cứu Lâm nghiệp nay là Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hành phân lập nấm và nuôi cấy 14
Đồ án tốt nghiệp thuần chủng nấm cộng sinh. Một vài thí nghiệm đã đƣợc tiến hành trên đất cằn với cây chủ là một số loài thông nhập nội Một nghiên cứu do PGS.TS Phạm Quang Thu (Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam) và tác giả Đặng Nhƣ Quỳnh (Trƣờng ĐH Lâm nghiệp) thực hiện nghiên cứu sinh trƣởng hệ sợi của một số loài nấm cộng sinh với bạch đàn trong nuôi cấy thuần khiết, nghiên cứu đặc điểm hình thành rễ nấm cộng sinh với cây chủ bạch đàn trong nuôi cấy invitro. Qua đó đã cho thấy bạch đàn là loài cây có nhiều nấm ngoại cộng sinh (khoảng hơn 400 loài có thể cộng sinh đƣợc với bạch đàn). Đây là những lợi thế đối với loài cây này vì chúng đƣợc trồng khá phổ biến trên những lập địa thoái hóa, nghèo dinh dƣỡng.(theo Nguyễn Văn Sức 2007) Nghiên cứu nâng cao khả năng hấp thu kim loại nặng của thực vật thông qua hoạt động của nấm cộng sinh Arbuscular mycorrhizal: tuyển chọn đƣợc một số chủng nấm Arbuscular mycorrhizal (AM) làm tăng khả năng hấp thu kim loại nặng ở thực vật; có đƣợc mô hình công nghệ sử dụng nấm cộng sinh Arbuscular mycorrhizal với thực vật để xử lý đất bị ô nhiễm kim loại nặng ở quy mô pilot. Năm 2009, nghiên cứu các yếu tố làm tăng cƣờng khả năng xâm nhiễm của nấm AM và đã tuyển chọn đƣợc vào rễ cây chủ để giúp cho cây chủ có thể sinh trƣởng tốt hơn và tăng khả năng hấp thu kim loại nặng, bố trí thực nghiệm nghiên cứu và xây dựng quy trình công nghệ sử dụng Arbuscular mycorrhizal cộng sinh với cây để xử lý đất ô nhiễm kim loại nặng, đã tuyển chọn đƣợc các chủng nấm Arbuscular mycorrhiza để xử lý đất ô nhiễm kim loại nặng (Chì, Asen) trên cây chủ (ngô, cỏ vetiver) ở qui mô phòng thí nghiệm. Nghiên cứu đầu tiên về nấm nội cộng sinh ở Việt Nam là nghiên cứu thu thập mẫu bào tử cộng sinh trong vùng rễ quyển, cây dƣợc liệu của Nguyễn Hồng Hà năm 2003. Gần đây, viện nông hóa đã có đề tài cấp nhà nƣớc về phân lập, tuyển chọn các chủng nấm Mycorrhiza kết quả đã phân lập và tuyển chọn đƣợc 3 chủng nấm rễ SHM 04 – DH 16 ; SHM 04 – DH 47; SHM 04 – TC 139 có khả năng giúp cây kí chủ kháng bệnh tốt nhất chống lại đƣợc sự xâm nhiễm của 3 loài nấm bệnh 15
Đồ án tốt nghiệp Fusarium monilifonme, Fusarium oxysporum và Rhizoctinia solani. Ngoài ra, các kết quả đánh giá cho thấy 3 chủng nấm rễ có khả năng huy động và làm tăng năng suất ngô trên đất bạc màu (Sóc Sơn-Hà Nội), tăng khả năng chống bệnh của chè Thái Nguyên, kích thích sự tăng trƣởng của giống bƣởi Đoan Hùng, giảm tỷ lệ bệnh đối với cây cà phê vối.(Nguyễn Văn Sức,2007) Năm 2007, Nguyễn Văn Sức đã xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Mycorrhiza thử công trong phòng thí nghiệm. Với những hiệu quả mà nấm Mycorrhiza mang lại cho cây trồng, nên việc nghiên cứu cũng nhƣ là phân lập nấm Mycorrhiza đƣợc phổ biến hơn. Năm 2012, Trần Thị Dạ Thảo đã phân lập đƣợc 4 chủng nấm Mycorrhiza tại Bình Phƣớc và Bà Rịa-Vũng Tàu . Theo Trần Thị Dạ Thảo, nấm Mycorrhiza giúp làm tăng khả năng hấp thu lân, thúc đẩy sinh trƣởng và năng suất ngô trồng trên các loại đất phèn, đất nghèo lân dễ tiêu. Bổ sung nấm Mycorrhiza đều làm tăng năng suất ngô so với không bổ sung nấm và có thể góp phần làm giảm lƣợng phân lân bón trên 50%. Cũng theo Trần Thị Dạ Thảo, tỷ lệ rễ cộng sinh với nấm Mycorrhiza của các giống ngô thay đổi theo địa điểm trồng và có xu hƣớng tăng theo mật độ trồng cũng nhƣ khi luân canh với cây họ đậu, nhƣng giảm khi mức lân bón vƣợt quá 80 kg P2O5/ha. Tuy nhiên, những nghiên cứu mang tính ứng dụng Mycorrhiza phục vụ rộng rãi trong nông nghiệp và bảo vệ môi trƣờng ở Việt Nam còn là vấn đề cần phải đƣợc đầu tƣ nghiên cứu. 1.4 Sơ lƣợc về cây ngô Ngô (Zea mays L.) là cây nông nghiệp một lá mầm thuộc chi Zea, họ hòa thảo (Poaceae hay còn gọi là Gramineae). Các giống ngô ở Việt Nam có những đặc điểm nhƣ chiều cao cây, thời gian sinh trƣởng, chống chịu sâu bệnh và thích ứng với điều kiện ngoại cảnh khác nhau. Song cây ngô đều có những đặc điểm chung về hình thái, giải phẫu. Các bộ phận của cây ngô bao gồm: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt. Ngô là cây lƣơng thực quan trọng, đứng thứ 2 sau lúa, trong ngô chứa nhiều các chất dinh dƣỡng. Ngô đƣợc gieo trồng nhiều nhất tại châu Mỹ (chỉ riêng tại Hoa 16
Đồ án tốt nghiệp Kỳ thì sản lƣợng đã là khoảng 270 triệu tấn mỗi năm).Hàng năm, trên toàn thế giới sản xuất khoảng 696.2-723.3 triệu tấn(2005-2007).Trong đó, nƣớc Mỹ sản xuất đƣợc 40.62% tổng sản lƣợng ngô. Sản lƣợng hạt ngô xuất khẩu trên thế giới trung bình hằng năm 82.6-86.7 triệu tấn. Trong đó, nƣớc Mỹ xuất khẩu 64.41% tổng sản lƣợng hạt bắp xuất khẩu[6]. Ngô thích nghi với khoảng khí hậu rộng từ vùng vĩ độ 55o Nam đến 30o Bắc. Có thể trồng ngô trên nhiều loại đất khác nhau tuy nhiên tốt nhất vẫn là đất bazan và phù sa ẩm, do có hàm lƣợng mùn và chất dinh dƣỡng cao, tơi xốp, ít chua. 1.5 Các bệnh thƣờng gặp ở ngô 1.5.1 Bệnh khô vằn Bệnh khô vằn là bệnh nấm quan trọng nhất trên các giống ngô mới hiện nay đang trồng rộng rãi ở khắp các miền trồng ngô nƣớc ta. Tuỳ theo mức độ bị bệnh năng suất ngô trung bình bị giảm từ 20 - 40%. Bệnh do nấm R.solani gây hại trên cây ngô vào giai đoạn ngô mọc cây con khoàng 20 ngày tuổi, giai đoạn này là lúc nấm xâm nhập và phát hiện rõ nhất, bệnh thƣờng xuất hiện ở rễ cây. Đặc điểm của bệnh là xuất hiện trên các bộ phận phiến lá, bẹ lá, thân và bắp ngô tạo ra các vết bệnh lớn màu xám tro, loang lổ đốm vằn da hổ, hình dạng bất định nhƣ dạng đám mây. Vết bệnh lan từ các bộ phận phía gốc cây lên tới áo bắp và bắp ngô, bông cờ làm cây, lá úa vàng tàn lụi, khô chết bắp thối khô, gây tổn thất lớn cho các giống ngô mới.(theo Bệnh Cây Nông Nghiệp,1998) Ngoài ra, ở giai đoạn cây con nấm R.solani có thể gây ra bệnh lỡ cổ rễ đối với ngô. Vết bệnh ở cây non thƣờng có màu nâu, thối nhũng và teo thắt lại ở phần thân sát mặt đất, dẩn tới hiện tƣợng cây bị đỗ rạp trên đất. 1.5.2 Bệnh mốc hồng hại ngô Bệnh mốc hồng hại ngô là một trong những bệnh có ý nghĩa kinh tế biểu hiện trên hạt sau thu hoạch, bệnh phổ biến ở tất cả các vùng trồng ngô của Việt Nam và nhiều nƣớc trên thế giới. Bệnh mốc hồng hại ngô do nấm Fusarium moniliforme Sheld. gây ra có triệu chứng đặc trƣng là trên bắp ngô có từng chòm hạt ngô mất sắc bóng, màu nâu nhạt, 17
Đồ án tốt nghiệp trên đó bao phủ một lớp nấm xốp, mịn màu hồng nhạt. Hạt bệnh không chắc mẩy, dễ vỡ và dễ long ra khỏi lõi khi va đập mạnh, hạt bị bệnh mốc hỏng, mất sức nảy mầm hoặc nảy mầm rất yếu, mầm mọc ra bị chết ở trong đất khi gieo. 18
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Nội dung 1 Phân lập, quan sát bào tử nấm, xác định dạng xâm nhiễm của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2. 2.1.2 Nội dung 2 Đánh giá ảnh hƣởng của các chủng nấm đến sinh trƣởng, phát triển của cây ngô. 2.1.3 Nội dung 3 Đánh giá ảnh hƣởng của các 4 mức phân P đến khả năng cộng sinh của 2 chủng nấm Mycorrhyza sp1 và Mycorrhiza sp2. 2.1.4 Nội dung 4 Đánh giá khả năng kháng lại 2 loại nấm bệnh Rhizoctonia solani và Fusarium sp của 2 chủng nấm Mycorrhyza sp1 và Mycorrhiza sp2. 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí Công Khoa Học Công nghệ Sinh học, Thực phẩm và Môi trƣờng, Trƣờng Đại Học Công nghệ Tp.HCM. 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2014 đến 7/2014 2.3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Nguyên liệu Chế phẩm nấm Mycorhiza thu nhận từ Malaysia và Indonesia, đƣợc ký hiệu là Mycorrhiza sp1 (M1) và Mycorrhiza sp2 (M2) Nguồn nấm bệnh Rhizoctonia solani, Fusrium sp đƣợc cung cấp từ cục BVTV. Hạt bắp chƣa xử lý thuốc trừ bệnh. 2.3.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 19
Đồ án tốt nghiệp - Chậu - Máy lắc - Thùng vòi tƣới - Máy ly tâm - Cân phân tích - Nồi hấp - Cốc thủy tinh - Hóa chất: - Kéo - KOH 10% - Kính hiển vi - Mực in - Kính lúp - CH3COOH - Bình erlen - Sucrose 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.3.1 Phân lập nấm Mycorrhiza sp1, Mycorrhiza sp2 từ chế phẩm để xác định hình dạng bào tử nấm cộng sinh [4], [5] - Phƣơng pháp phân lập nấm cộng sinh bằng kỹ thuật sàn ƣớt để xác định bào tử nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 - Cân lần lƣợt 10g mẫu vào cốc, hòa tan mẫu vào 200ml nƣớc, ngâm khoảng 30-60 phút, để giải phóng các bào tử trong chế phẩm. Sau đó, cho mẫu vào erlen và thêm 300 ml nƣớc cất vào và lắc đều trong 1h để giải phóng hoàn toàn các bào tử trong mẫu. - Quan sát bào tử nấm dƣới kính hiển vi - Xác định hình dạng bào tử nấm theo Morton (1988) 2.3.3.2 Phương pháp nhân sinh khối nấm Mycorrhiza sp [7] - Hạt giống ngô (cây ngắn ngày, dễ trồng, dễ quan sát) - Ngâm vào dung dịch có chứa bào tử nấm đã đƣợc phân lập (ngâm khoảng 24h) - Cho hạt giống vào túi nilon có lớp giấy ẩm để kích thích để hạt nảy mầm - Chuẩn bị 2kg đất cho vào chậu (đất sạch Saigon biotech) - Sau đó chuyển ngô đã kích thích tạo rễ ở trên vào chậu, rồi chăm sóc, tƣới cây đều đặn. Thu phần rễ cây sau 3- 4 tuần 20
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.3 Phương pháp nhuộm rễ xác định dạng xâm nhiễm (Vierheilig et al. 1998, 2005) [6] - Thu nhận rễ cây kí chủ đã nhiễm nấm (20 -30 ngày). - Cắt rễ thành các đoạn nhỏ 2-4cm. - Rửa sạch các đoạn rễ bằng nƣớc. - Cho rễ vào dung dịch KOH 10% - Đem hỗn hợp dung dịch KOH và rễ đi hấp ở nhiệt độ 121oC trong vòng 15 phút. - Rửa sạch KOH 10% bằng nƣớc cất. - Đặt rễ lên lame rồi cho hỗn hợp thuốc nhuộm Inkblue 5% với acid acetic 5% và quan sát dƣới kính hiển vi. 2.3.3.4 Phương pháp nghiên cứu vai trò ảnh hưởng của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 đến sinh trưởng, phát triển của cây ngô Cây kí chủ đƣợc lựa chọn dùng trong thí nghiệm này là cây ngô đƣợc cung cấp từ cục trồng trọt.  Bố trí thí nghiệm - CT1: Ngô + tƣới nƣớc - CT2: Ngô + tƣới nấm Mycorrhiza sp1 - CT3: Ngô + tƣới nấm Mycorrhiza sp2  Phƣơng pháp tiến hành - Hạt đƣợc ngâm qua đêm trong nƣớc ấm khoảng 40oC với (3 sôi: 2 lạnh) và đem giao vào đất ở độ sâu 2m. - Số cây theo dõi là 6 cây/ công thức. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. - Sau khi cây mọc 5 ngày, tiến hành tƣới 1 lần nấm Mycorrhiza vào đất với nồng độ 109 bào tử / cây, và tƣới vào gốc cây.  Chỉ tiêu theo dõi - Kích thƣớc cây - Khối lƣợng rễ - Chiều dài rễ 21
Đồ án tốt nghiệp - Đƣờng kính vùng rễ 2.3.3.5 Phương pháp đánh giá hiệu quả của 2 chế phẩm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 sau khi đã tái nhiễm Cây kí chủ đƣợc lựa chọn dung trong thí nghiệm này là cây ngô đƣợc cung cấp từ cục trồng trọt.  Bố trí thí nghiệm - CT1:ngô + đất sạch - CT2: ngô + nấm M1 trƣớc nhiễm - CT3: ngô + M1 sau nhiễm trong rễ ngô - CT4: ngô + nấm M2 trƣớc nhiễm - CT5: ngô + M2 sau nhiễm trong rễ ngô  Phƣơng pháp thí nghiệm - Rễ cây ngô sau khi nhiễm nấm M1 và M2 đƣợc thu nhận, phơi khô ở nhiệt độ phòng, cắt nhỏ, đếm mật độ bào tử và cho vào đất. - Ngâm hạt bằng nƣớc ấm khoảng 40oC ( 3 sôi: 2 lạnh) qua đêm sau đó đem gieo vào chậu ở độ sâu 5cm. - Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong chậu nhựa (20 x 25cm), bổ sung 2kg đất khô vào từng chậu, mỗi công thức gồm 2 chậu, số cây theo dõi 4 cây/ chậu . Số bào tử nấm Mycorrhiza nhiễm cho 1 chậu là 3g/ chậu. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi ngày tƣới nƣớc 2 lần sáng, chiều. Số bào tử nấm Mycorrhiza nhiễm vào là 109 bào tử/ 1 chậu.  Chỉ tiêu theo dõi - Chiều cao cây - Khối lƣợng thân - Chiều dài rễ - Khối lƣợng rễ 22
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.6 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các mức phân P2O5 đến khả năng cộng sinh của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 thông qua sự phát triển và sinh trưởng của cây ngô Cây kí chủ đƣợc lựa chọn dung trong thí nghiệm này là cây ngô đƣợc cung cấp từ cục trồng trọt.  Bố trí thí nghiệm  Đối với chủng nấm Mycorrhiza sp1 - CT1: Ngô + P205 mức 0.03 % (đất có chứa P2O5 với mức 0.03%) - CT2: Ngô + Mycorrhiza sp1 + P2O5 mức 0.03% - CT3: Ngô + Mycorrhiza sp1 + P2O5mức 0.06% - CT4: Ngô + Mycorrhiza sp1 + P2O5 mức 0.09% - CT5: Ngô + Mycorrhiza sp1 + P2O5 mức 1.2% - Đối với chủng nấm Mycorrhiza sp2 - CT1: Ngô + P205 mức 0.03 % (đất có chứa P2O5 với mức 0.03%) - CT2: Ngô + Mycorrhiza sp2 + P2O5mức 0.03% - CT3: Ngô + Mycorrhiza sp2 + P2O5 mức 0.06% - CT4: Ngô + Mycorrhiza sp2 + P2O5 mức 0.09% - CT5: Ngô + Mycorrhiza sp2 + P2O5 mức 1.2%  Phƣơng pháp thí nghiệm - Cho 2kg đất sạch vào chậu. - Ngâm hạt bằng nƣớc ấm khoảng 40oC ( 3 sôi: 2 lạnh) qua đêm sau đó đem giao vào chậu ở độ sâu 5cm. - Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong chậu nhựa (20 x 25cm), nhắc lại 4 chậu/ công thức, với 2kg đất khô/ chậu, số cây theo dõi là 1 cây/ chậu. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, lƣợng bào tử nhiễm vào là 10^9 bào tử nấm Mycorrhiza/ chậu. - Tƣới chế phẩm nấm Mycorrhiza sp1, Mycorrhiza sp2 sau 3 ngày hạt nảy mầm. - Tƣới các mức phân P2O5 sau 4 ngày hạt nảy mầm. 23
Đồ án tốt nghiệp  Chỉ tiêu theo dõi - Chiều cao cây. 2.3.3.7 Phương pháp nghiên cứu khả năng đối kháng 2 chủng nấm bệnh Rhizoctonia solani và Fusarium sp Cây kí chủ đƣợc lựa chọn dùng trong thí nghiệm này là cây ngô có nguồn gốc nhập nội đƣợc cung cấp từ cục trồng trọt. Chủng nấm gây bệnh chuẩn: Fusarium sp; Rhizoctonia solani đƣợc cung cấp từ cục BVTV.  Bố trí thí nghiệm  Đối với chủng nấm Mycorrhiza sp1 - CT 01: Đất sạch - CT 02: Ngô+ Nấm bệnh Rhizoctonia solani - CT 03: Ngô+ Nấm bệnh Fusarium sp - CT 04: Ngô+ Mycorrhiza sp1 - CT 07: Ngô+ Mycorrhiza sp1 + Fusarium sp - CT 08: Ngô+Mycorrhiza sp1+ Rhizoctonia solani  Đối với chủng nấm Mycorrhiza sp2: - CT 01: Ngô + đất sạch - CT 02: Ngô + nấm bệnh Rhizoctonoa solani - CT 03: Ngô + nấm bệnh Fusarium sp - CT 05: Ngô + Mycorrhiza sp2 - CT 06: Ngô + Mycorrhiza sp2 + Rhizoctonia solani - CT 09: Ngô + Mycorrhiza sp2 + Fusarium sp  Phƣơng pháp thí nghiệm - Phối trộn nấm bệnh và chế phẩm Mycorrhiza theo các công thức vào 2kg đất rồi cho vào chậu. - Ngâm hạt qua đêm rồi đem gieo ở độ sâu 5 cm. - Thí nghiệm tiến hành trong chậu nhựa (20 x 25cm), nhắc lại 3 chậu/công thức. Số cây theo dõi 3 cây/ chậu. Số bào tử nấm Mycorrhiza nhiễm cho 24
Đồ án tốt nghiệp 1 chậu là 10^9 bào tử nấm Mycorrhiza. Bào tử nấm bệnh là 10^6 bào tử/2kg đất. - Tỷ lệ cây bị bệnh đƣợc xác định theo phƣơng pháp chuẩn về điều tra bệnh hại thực vật do Viện Bảo vệ Thực vật ban hành. - Các kết quả điều tra đƣợc thực hiện sau khi cây gieo đƣợc 2 tuần tuổi.  Chỉ tiêu theo dõi - Tỷ lệ hạt nảy mầm(%) - Tỷ lệ cây bị bệnh (%)  Tính toán và xử lý số liệu  Tỷ lệ hạt nảy mầm: TLHNM(%) = Trong đó A: số hạt nảy mầm B: tổng số hạt gieo  Tỷ lệ bệnh cây: TLB(%) = Trong đó D: số cây bị bệnh do nhiễm nấm R.solani và Fusarium E: tổng số cây điều tra Tính toán sử dụng phần mềm xử lý Excel 2010 Kết quả thí nghiệm đƣợc tiến hành bằng các thủ tục phân tích thống kê với ỏ = 0,05 trên phần mềm statgraphics. 25
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập, quan sát bào tử nấm, xác định dạng xâm nhiễm và lƣu giữ bảo quản nấm 3.1.1 Hình dạng bào tử nấm [4], [5] Việc phân lập nấm rễ cộng sinh từ 2 chế phẩm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 đƣợc tiến hành dựa vào phƣơng pháp phân lập nấm Mycorrhiza của Mark Brundrett (1995). Kết quả cho thấy, cả 2 mẫu chế phẩm đều có chứa bào tử nấm Mycorrhiza. Tuy nhiên hình dạng của 2 loại bào tử có nhiều điểm khác nhau . Ở chế phẩm nấm Mycorrhiza sp1, bào tử đƣợc xác định có hình dạng giống nhƣ quá trứng, có màu nâu đậm. Dựa vào khóa phân loại của Morton (1988) có thể xác định chủng nấm này thuộc chi Glomus (bảng 3.1). Ở chế phẩm nấm Mycorrhiza sp2, bào tử đƣợc xác định có hình dạng gần giống nhƣ quả bóng, có cuống, trong suốt không màu. Dựa vào khóa phân loại của Morton (1988) có thể xác định chủng nấm này thuộc chi Scherocytis (hình 3.1). Bảng 3.1 Hình dạng bào tử nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 Bào Tử Hình quan sát đƣợc qua thí nghiệm, soi Hình Nguồn (Morton, 1992) dƣới kính hiển vi (vật kính × 100) Bào tử nấm Mycorrhiza sp1 26
Đồ án tốt nghiệp Bào tử nấm Mycorrhiza sp2 3.1.2 Dạng xâm nhiễm của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 [6] Để khẳng định sự cộng sinh giữa nấm và rễ cây, cần thiết phải quan sát đƣợc sự xâm nhiễm của nấm vào trong rễ. Hai chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 đƣợc chủng vào rễ cây ngô trong điều kiện Invitro và quan sát dạng xâm nhiễm bằng kỹ thuật nhuộm Ink blue với giấm (Vierheilig et al. 1998, 2005). Kết quả cho thấy: - Ở chế phẩm nấm Mycorrhiza sp1, sợi nấm đâm thẳng vào trong vách tế bào vỏ rễ, hình thành vòi hút. Sợi nấm phân thành nhiều nhánh và kéo dài giữa gian bào tế bào rễ. Trong tế bào vỏ rễ, nấm hình thành các búi Arbuscular, đó là do trong quá trình phân nhánh lặp đi lặp của sợi nấm tạo thành. Các búi Arbuscular là nơi xảy ra trao đổi chất dinh dƣỡng giữa nấm và cây chủ. Dạng xâm nhiễm của Mycorrhiza sp1 thuộc về nấm nội cộng sinh, và theo thiếu khóa phân loại của Morton và Benny 1990, các loài thuộc chi Glomus là nấm nội cộng sinh. Nhƣ vậy, về mặt hình thái, phân lập nấm Mycorrhiza sp1 có đặc điểm của chi Glomus nhƣ đã trình bày ở phần 3.1.1 cộng với đặc điểm dạng xâm nhiễm đâm thẳng vào bên trong tế bào rễ, có thể khẳng định đây là chủng nấm rễ nội cộng sinh. - Đối với chế phẩm nấm Mycorrhiza sp2 có dạng xâm nhiễm khác hẳn so với chế phẩm Mycorrhiza sp1. Ở chế phẩm Mycorrhiza sp2, các sợi nấm không đâm 27
Đồ án tốt nghiệp thẳng vào trong tế bào rễ, mà chỉ hình thành mạng lƣới Hatig đi len lõi giữa các tế bào rễ và đi khắp tế bào rễ. Ở bên ngoài vỏ rễ các hệ sợi nấm bao quanh lấy rễ hình thành lớp áo bảo vệ vỏ rễ. Dạng xâm nhiễm của Mycorrhiza sp2 thuộc về nấm ngoại cộng sinh, và theo thiếu khóa phân loại của Morton và Benny 1990, các loài thuộc chi Scherocytis là nấm ngoại cộng sinh. Nhƣ vậy, về mặt hình thái, phân lập nấm Mycorrhiza sp2 có đặc điểm của chi Scherocytis nhƣ đã trình bày ở phần 3.1.1 cộng với đặc điểm dạng xâm nhiễm không đâm thẳng vào bên trong tế bào rễ mà chỉ đi len lõi giữa các tế bào, có thể khẳng định đây là chủng nấm rễ ngoại cộng sinh. Bảng 3.2 Dạng xâm nhiễm của nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 Dạng xâm Hình quan sát đƣợc qua thí nhiễm nghiệm,soi dƣới kính hiển vi (vật Hình nguồn thu thập kính × 40) Dạng xâm nhiễm nấm Mycorrhiza sp1 28
Đồ án tốt nghiệp Dạng xâm nhiễm nấm Mycorrhiza sp2 3.2 Ảnh hƣởng của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1, Mycorrhiza sp2 đến sinh trƣởng, phát triển của cây ngô Phần lớn nấm Mycorrhiza khó có thể phát triển trong môi trƣờng tự nhiên, do nấm không có khả năng tổng hợp đƣợc nguồn Carbon, để hình thành nên cấu trúc tế bào. Bên cạnh đó nấm cũng không có khả năng cạnh tranh các nguồn dinh dƣỡng với các vi sinh vật hoại sinh có trong đất. Nấm chỉ có thể sống và phát triển khi có sự cộng sinh với cây. Khi hiện tƣợng cộng sinh xảy ra, nấm lấy nguồn Carbon từ quá trình quang hợp của cây để phát triển, ngƣợc lại nấm giúp cây tăng khả năng hấp thu các chất dinh dƣỡng từ đất, làm tăng năng suất cây trồng [9]. Thí nghiệm đƣợc thực hiện nhằm đánh giá khả năng cộng sinh và những hiệu quả mang lại từ 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 đến sự phát triển cây ngô, thông qua các yếu tố chiều cao cây, khối lƣợng thân, chiều dài rễ, khối lƣợng rễ, đƣờng kính rễ. 3.2.1 Chiều cao thân cây Chiều cao thân cây là chỉ tiêu theo dõi khả năng sinh trƣởng của cây ở các giai đoạn khác nhau. Nguồn dinh dƣỡng dồi dao giúp cây sinh trƣởng phát triển tốt. Ngƣợc lại, các yếu tố dinh dƣỡng không đủ cung cấp cho cây, làm cây giảm khả năng sinh trƣởng và cho năng suất thấp. 29
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3 Chiều cao cây ngô ở các ngày sau mọc Chiều cao cây ở các ngày sau mọc Công thức 10 16 22 28 Bón nấm Mycorrhiza sp1 9.89a ± 1.62 32.41a ± 0.38 62.09a ± 1.45 93.52a ± 1.07 Bón nấmMycorrhiza sp2 9.51a ± 0.79 32.22a ± 1.60 60.65a ± 0.99 90.08b ± 1.89 Đối chứng 10.42a ± 0.46 26.33b ± 0.42 41.1b ± 0.68 57.43c ± 0.22 (Ghi chú: cây được trồng trên đất) cm 100 90 80 70 60 Doi chung 50 Mycorrhyza sp1 40 Mycorrhyza sp2 Chiều Chiều cao cây 30 20 10 0 10 16 22 28 Ngày Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện sự phát triển chiều cao cây ngô ở các giai đoạn 10,16,22,28 ngày sau mọc giữa các công thức Nhìn vào bảng 3.3 và hình 3.1, ta thấy rõ đƣợc sự tăng trƣởng về chiều cao cây ở các công thức qua các giai đoạn 10, 16, 22, 28 ngày sau mọc. Ở ngày thứ 10 sau mọc giữa ba công thức không có sự khác biệt, cả ba đều có giá trị chiều cao cây nhƣ nhau. Do trong quá trình phát triển ban đầu nấm rễ cần hợp chất carbon để sinh trƣởng và phát triển, trong khi đó bộ rễ non cũng cần chất dinh dƣỡng để phát triển. Vì thế ở thời kì đầu xâm nhiễm nấm Mycorrhiza sp và cây tranh giành nhau hợp chất carbon, do không đủ dinh dƣỡng nên nấm tạm thời ngừng lại (Guo 1989), và nấm không giúp cây hấp thu chất dinh dƣỡng nên không có sự khác nhau về sinh 30
Đồ án tốt nghiệp trƣởng giữa các công thức cây phát triển bình thƣờng giống nhƣ công thức đối chứng và có giá trị thấp hơn công thức đối chứng. Ở giai đoạn ngày thứ 16 sau mọc, chiều cao cây đã có sự khác biệt rõ giữa các công thức tƣới nấm và công thức đối chứng, chiều cao cây ở công thức đối chứng chỉ có 26cm, trong khi đó chiều cao cây ở 2 công thức tƣới nấm là 32cm. Ở giai đoạn này nguồn cacbon trong cây đã đƣợc tích trữ, nấm và cây không còn tranh giành nguồn carbon và lúc này nấm sử dụng nguồn carbon của cây để phát triển, song song đó nấm cũng cung cấp nguồn dinh dƣỡng cho cây trồng phát triển (Guo 1989). Nấm Mycorrhiza có cấu trúc sợi nấm rất nhỏ, có thể len lõi vào sâu trong đất để hút các chất dinh dƣỡng cho cây hấp thu. Bên cạnh đó, nấm rễ còn có hệ enzyme phospharase phân giải các hợp chất lân khó tan trong đất để cung cấp cho cây, vì thế cây sinh trƣởng và phát triển tốt. Đến giai đoạn ngày thứ 22 sau mọc, chiều cao cây ở công thức đối chứng là 41.1cm, còn ở công thức bón nấm Mycorrhiza sp1 là 62.09cm, và Mycorrhiza sp2 là 60.65cm. Chiều cao cây ở công thức đối chứng tăng 15 cm qua 6 ngày, trong khi đó thì chiều cao cây ở 2 công thức sử dụng nấm Mycorrhiza sp tăng gấp đôi qua 6 ngày. Điều này cho thấy việc sử dụng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 có tác dụng thúc đẩy sự sinh trƣởng, phát triển của cây ngô. Tuy nhiên vẫn không có sự khác nhau giữa chủng M1 và M2 . Đến ngày thứ 28 sau mọc chiều cao của cây ở công thức đối chứng là 57.43cm chỉ tăng 16cm qua 6 ngày. Trong khi đó, chiều cao của cây ở các công thức sử dụng chế phẩm nấm Mycorrhiza sp1, Mycorrhiza sp2 lần lƣợt là 93cm và 90.08cm tăng gần 32cm qua 6 ngày, tăng gấp đôi so với công thức đối chứng. Và ở giai đoạn 28 ngày sau mọc này, thì giá trị chiều cao của cây khi sử dụng sản phẩm Mycorrhiza sp1 cao hơn so với cây khi sử dụng nấm Mycorrhiza sp2 và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê, với mức ý nghĩa alpha là 0.05. Sỡ dĩ nấm chế phẩm nấm Mycorrhiza sp1 cho hiệu quả tốt hơn chế phẩm nấm Mycorrhiza sp2, là do Mycorrhiza sp1 là nấm rễ nội cộng sinh, loài nấm này cộng sinh chủ yếu với các cây thân thảo nên cho hiệu quả cao. Tuy nấm Mycorrhiza sp2 là nấm ngoại cộng 31
Đồ án tốt nghiệp sinh, phần lớn chỉ cộng sinh với các cây thân gỗ, nhƣng nấm cũng có thể cộng sinh với các cây thân thảo và cung cấp các chất dinh dƣỡng để cây phát triển. A B C Hình 3.2 Chiều cao cây ngô sau 28 ngày theo dõi A: Tƣới nấm Mycorrhiza sp1 32
Đồ án tốt nghiệp B: Tƣới nấm Mycorrhiza sp2 C: Đối chứng 3.2.2 Khối lượng thân cây Khối lƣợng thân là chỉ tiêu theo dõi khả năng hấp thu dinh dƣỡng của cây. Thân to, chắc khỏe thể hiện lƣợng dinh dƣỡng cây hấp thu tốt. Để đánh giá sinh khối cây ngô giữa 3 công thức thí nghiệm. Sinh viên tiến hành cân khối lƣợng thân cây vào giai đoạn 28 ngày tuổi. Bảng 3.4 Khối lƣợng thân cây ngô sau 28 ngày sau mọc Công thức Khối lƣợng thân (cm) Bón nấm Mycorrhiza sp1 156.8a ± 3.29 Bón nấm Mycorrhiza sp2 131.1b ± 5.08 Đối chứng 85.02c ± 3.38 gam 180 156 160 140 131 120 100 85 80 60 Khối Khối lƣợng thân 40 20 0 Đối chứng Mycorrhyza sp1 Mycorrhyza sp2 Công thức Hình 3.3 Biểu đồ so sánh khối lƣợng trung bình thân ngô giữa các công thức Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.4 và bảng 3.3 cho thấy sinh khối cây ở 2 công thức có bón nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 cao hơn hẳn so với công 33
Đồ án tốt nghiệp thức đối chứng. Khối lƣợng thân cây ngô ở công thức đƣợc bón nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 cao hơn công thức đối chứng tƣơng ứng là 1.84, và 1.54 lần. Nhƣ vậy, việc bón nấm Mycorrhiza sp đã giúp cây sinh trƣởng và phát triển tốt hơn so với không bón. Điều này cho thấy nấm Mycorrhiza giúp cây hấp thụ đƣợc lƣợng dinh dƣỡng nhiều hơn, do nấm Mycorrhiza khi cộng sinh sẽ hình thành mạng lƣới dày đặc trong đất, cùng với các hệ sợi nấm tƣơng đối nhỏ có khả năng len lõi vào sâu trong lòng đất để hút các chất dinh dƣỡng vận chuyển cho cây, mặc khác nấm Mycorrhiza có khả năng phân giải các hợp chất lân khó tiêu trong đất thành các lân dễ tiêu giúp cây dễ dàng hấp thu, nâng cao nguồn dinh dƣỡng cung cấp cho cây trồng cây trồng [10]. Hình 3.4 Cây ngô sau 28 ngày theo dõi 34
Đồ án tốt nghiệp Ghi chú: Mycorrhiza đen là Mycorrhiza sp1, Mycorrhiza trắng là Mycorrhiza sp2 3.2.3 Chiều dài rễ Đặc điểm nổi bật của nấm Mycorrhiza là kích thích sự phát triển hệ rễ của cây trồng, rễ cây hút nƣớc, hấp thụ các chất dinh dƣỡng, khoáng cung cấp cho cây trồng, tăng khả năng chống chịu hạn hán và nhiệt độ cao. Chính vì vậy, chiều dài rễ và khối lƣợng rễ cũng nói lên đƣợc vai trò của nấm Mycorrhiza đối với cây trồng. Sự phân bố của bộ rễ trong lòng đất có 3 đặc điểm chính là sâu, rộng, và nhiều. độ sâu của bộ rễ đƣợc thể hiện qua chiều dài rễ, chiều dài rễ càng dài thì càng đâm sâu vào lòng đất và hút đƣợc nhiều chất dinh dƣỡng hơn và đặc biệt là hút đƣợc nhiều nƣớc để cung cấp cho cây, bộ rễ càng dài còn giúp cây bám chặt vào lòng đất, chống đỗ vỡ. Bảng 3.5. Chiều dài rễ ngô sau 28 ngày theo dõi Công thức Chiều dài rễ (cm) Bón nấm Mycorrhiza sp1 21.16a ± 0.72 Bón nấm Mycorrhiza sp2 20.09b ± 0.3 Đối chứng 16.52c ± 0.045 35
Đồ án tốt nghiệp cm 25 21.16 20.09 20 16.5 15 10 Chiều Chiều dài rễ 5 0 Đối chứng Mycorrhyza sp1 Mycorrhyza sp2 Công thức Hình 3.5 Biểu đồ so sánh chiều dài trung bình rễ ngô giữa các công thức Số liệu ở bảng 3.5 và hình 3.5 cho thấy rõ sự khác nhau về chiều dài rễ ngô giữa các công thức. Ở công thức đối chứng chiều dài rễ ngô là 16.5cm, công thức bón nấm Mycorrhiza sp1 có chiều dài rễ là 21cm, công thức bón nấm Mycorrhiza sp2 có chiều dài rễ là 2cm, cả 2 công thức đều có chiều dài rễ dài hơn công thức đối chứng lần lƣợt là 4.6cm, 3.5cm. Và ở công thức bón nầm Mycorrhiza sp1 lại có chiều dài rễ dài hơn công thức bón nấm Mycorrhiza sp2 là 1cm, nhƣng sai khác không có ý nghĩa thống kê. Việc bón nấm Mycorrhiza sp có sự khác biệt so với bình thƣờng, nó giúp cho rễ cây ngô dài hơn, do trong quá trình cộng sinh bào tử nấm gia tăng số lƣợng trong đất, chúng tạo thành các sợi nấm len lõi sâu trong lòng đất hút chất dinh dƣỡng, kích thích sự phát rễ của cây để hấp thu và dự trữ chất dinh dƣỡng từ nấm cung cấp[10]. 3.2.4 Khối lượng rễ Rễ là bộ phận quan trọng của cây, rễ có nhiệm vụ quan trọng hút nƣớc và chất dinh dƣỡng có trong lòng đất để cung cấp cho cây duy trì sự sống, rễ càng nhiều cây càng nhận đƣợc nhiều chất dinh dƣỡng, phát triển tốt và tăng trƣởng nhanh. 36
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6 Khối lƣợng rễ ngô sau 28 ngày theo dõi Công thức Khối lƣợng rễ (gam) Bón nấm Mycorrhiza sp1 61.11a ± 1.35 Bón nấm Mycorrhiza sp2 42.11b ± 0.67 Đối chứng 15.99c ± 1.34 gam 70 61 60 50 42 40 30 Khối Khối lƣợng rễ 20 16 10 0 Đối chứng Mycorrhyza sp1 Mycorrhyza sp2 Công thức Hình 3.6 Biểu đồ so sánh khối lƣợng trung bình rễ ngô giữa các công thức Số liệu ở bảng 3.6 và hình 3.6 cho thấy, công thức bón nấm Mycorrhiza sp1 có khối lƣợng rễ cao nhất, với khối lƣợng là 61g, tiếp đến là công thức bón nấm Mycorrhiza sp2 có khối lƣợng là 42g thấp hơn 19g so với khối lƣợng rễ của công thức bón nấm Mycorrhiza sp1, và cuối cùng là công thức đối chứng (không bón nấm Mycorrhiza) có khối lƣợng rễ trung bình xấp xỉ 16g thấp hơn rất nhiều so với 2 công thức bón nấm Mycorrhiza. Điều này cho thấy nấm Mycorrhiza đã kích thích sự phát triển mạnh của rễ, làm cho rễ sinh ra nhiều hơn. Khối lƣợng rễ càng cao chứng tỏ số lƣợng rễ nhiều, rễ càng nhiều thì khả năng hấp thu chất dinh dƣỡng của cây tăng, phát triển tốt cho năng suất cao. 37
Đồ án tốt nghiệp 3.2.5 Đường kính rễ Bảng 3.7 Đƣờng kính rễ ngô sau 28 ngày theo dõi Công thức Đƣờng kính rễ (cm) Bón nấm Mycorrhiza sp1 12.24a ± 0.14 Bón nấm Mycorrhiza sp2 12.37a ± 0.11 Đối chứng 6.52b ± 0.17 gam 14 12.2 12.3 12 10 8 6.5 6 Đƣờng kính kính rễ Đƣờng 4 2 0 Đối chứng Mycorrhyza sp1 Mycorhyza sp2 Công thức Hình 3.7 Biểu đồ so sánh đƣờng kính trung bình rễ ngô giữa các công thức Đƣờng kính rễ là yếu tố thể hiện khả năng phân tán các nhánh rễ xung quanh cây trồng. Đƣờng kính càng lớn thì các nhánh rễ càng nhiều, cây càng có nhiều chất dinh dƣỡng. Nhìn vào bảng 3.7 và hình 3.7 cho thấy đƣờng kính rễ giữa ở 2 công thức đƣợc bón nấm Mycorrhiza và công thức đối chứng có sự chênh lệch nhau rất lớn, ta thấy ở công thức đối chứng đƣờng kính rễ thấp chỉ có 6.5cm trong khi đó ở 2 công thức sử dụng chế phẩm Mycorrhiza có đƣờng kính rễ trung bình cao gấp đôi công thức đối chứng. Do trong quá trình cộng sinh, nấm Mycorrhiza gia tăng số lƣợng bào tử trong đất, hình thành mạng lƣới sợi nấm dài và rộng, phân tán xung quanh cây chủ, phân giải và vận chuyển chất dinh dƣỡng, điều đó kích thích 38
Đồ án tốt nghiệp sự phát triển của rễ để hấp thu và dự trữ nguồn dinh dƣỡng để cung cấp cho cây phát triển. Ở chỉ tiêu theo dõi sự khác biệt về đƣờng kính rễ ngô giữa công thức bón nấm Mycorrhiza sp1 và công thức bón nấm Mycorrhiza sp2 này không có sự khác biệt. Vì cả 2 chế phẩm đều cho kết quả tƣơng đƣơng nhau. Hình 3.8 Bộ rễ ngô sau 28 ngày 3.3 Hiệu quả mang lại của 2 chế phẩm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 sau khi đƣợc nhân giống Các bào tử nấm rễ nội sinh có một đặc điểm rất khác so với các loài nấm cũng nhƣ nhóm vi sinh vật thông dụng khác đó là chúng không thể nuôi cấy trực tiếp trên môi trƣờng nhân tạo đƣợc (Gianinazzi P., Gianinazzi S., 1983; Ted, 2000; Koide, Mosse 2001). Muốn tạo ra đƣợc bào tử nấm nội sinh hay muốn tạo chế phẩm thƣơng mại ngƣời ta thƣờng phải nuôi qua hệ thống cây ký chủ trực tiếp (Bakshi, 1974; Bainbridge 1995) hoặc gián tiếp (Brundrett Mark, 1996). Các nghiên cứu cho rằng trên 80% các loài thực vật có khả năng cộng sinh với nấm Mycorrhiza, đặc biệt là cây thân thảo trong đó có cây ngô. Vì vậy, ngô là một trong những cây thân thảo đƣợc sử dụng để nhân nuôi nấm Mycorrhiza. Câu hỏi đặc ra là nấm Mycorrhiza sau khi đƣợc nhân lên trong rễ ngô có giữ đƣợc hoạt 39
Đồ án tốt nghiệp tính so với ban đầu hay không. Để trả lời câu hỏi này, sinh viên tiến hành đánh giá hiệu quả của nguồn nấm sau khi nhiễm và nhân trên rễ ngô so với nguồn nấm ban đầu. Kết quả đƣợc trình bày thông qua việc theo dõi sự phát triển thân, rễ cây ngô ở các công thức thí nghiệm. 3.3.1 Chiều cao thân ngô Bảng 3.8 Chiều cao thân cây ngô Công Thức 8 NSM 10 NSM 12 NSM 14 NSM Nhiễm nấm Mycorrhiza sp1 9.53a ± 0.34 15.41a ± 0.72 22.37a±1.26 29.85a±1.31 Nhiễm nấm Mycorrhiza sp2 9.10ab ± 0.30 15.38a ± 0.84 22.3a±0.42 30.18a±0.24 Nhiễm nấm Mycorrhiza sp1 8.78b ± 0.16 15.31a ± 0.53 22.39a±0.72 29.84a±0.84 đã nhân giống Nhiễm nấm Mycorrhiza sp2 8.77b ± 0.59 14.7a ± 0.86 22a±0.79 30.19a±0.66 đã nhân giống Đối chứng 7.18c ± 0.39 9.67b ± 0.76 13.96b±0.40 18.2b±0.28 (Ghi chú: thí nghiệm được thực hiện trong chậu) Số liệu ở bảng 3.8 cho thấy, ở các công thức bón nấm Mycorrhiza gốc ban đầu và bón nguồn nấm Mycorrhiza đƣợc nhân lại trong rễ ngô đều cho chiều cao cây cao hơn so với công thức đối chứng không đƣợc bón nấm. So sánh chiều cao cây ngô ở các công thức có bón nấm, số liệu ở bảng cũng cho thấy: Ở giai đoạn đầu, vào thời điểm 8 ngày sau mọc, các công thức bón nấm Mycorrhiza gốc có chiều cao thân cây phát triển cao hơn so với công thức bón nấm qua lây nhiễm trên rễ ngô. Tuy nhiên, từ 10 ngày sau mọc trở đi, chiều cao cây không có sự sai khác giữa bón nấm gốc và bón nấm sau khi nhân trên rễ cây ngô. Có lẽ ở giai đoạn đầu, do các công thức bón nấm nhân lên trên rễ ngô thực ra là đƣa vào đƣa vào đất bào tử nằm trong rễ ngô nên sự phát tán và xâm nhập khó hơn so với dạng bào tử đã đƣợc trích ly ở các công thức nấm gốc. Chính vì vậy mà tác động của chúng chậm hơn so với bào tử nấm gốc. 40
Đồ án tốt nghiệp Nhƣ vậy, nấm Myorrhiza khi nhân trên rễ ngô vẫn cho hiệu quả tốt. Khả năng thúc đẩy sự sinh trƣởng và phát triển của cây ngô ở nấm nhân trên rễ ngô tƣơng đƣơng với khả năng thúc đẩy sinh trƣởng và phát triển của cây ngô của nấm gốc. 3.3.2 Khối lượng thân, chiều dài rễ, khối lượng rễ ngô Bảng 3.9 Khối lƣợng thân, chiều dài rễ, khối lƣợng rễ ngô Khối lƣợng Chiều dài rễ Khối lƣợng Công thức thân (gam) (cm) rễ (gam) Nhiễm nấm Mycorrhiza sp1 2.25a ± 0.21 17.4a ± 0.63 1.52a ± 0.16 Nhiễm nấm Mycorrhiza sp1 đã 2.14a ± 0.03 16.27a ± 0.26 1.49a ± 0.03 nhân giống Nhiễm nấm Mycorrhiza sp2 2.40a ± 0.08 17.12a ± 0.98 1.61a ± 0.3 Nhiễm nấm Mycorrhiza sp2 đã 2.12a ± 0.19 16.07a ± 1.99 1.47a ± 0.15 nhân giống Đối chứng 1.57b ± 0.44 13.7b ± 0.49 1.12a ± 0.13 (Ghi chú: cây được trồng trong chậu) Nhìn vào bảng 3.9 cho thấy, các yếu tố theo dõi khối lƣợng thân, chiều dài rễ, khối lƣợng rễ ngô của các công thức có bón Mycorrhiza đều cao hơn so với công thức đối chứng. Do trong quá trình gieo trồng khi nhận đƣợc tín hiệu phát ra từ rễ, thì các bào tử nấm tiến lại gần và cộng sinh với rễ, chỉ cần phát hiện đúng cây chủ thì chúng hình thành vòi bám và quá trình cộng sinh bắt đầu (Ende, 1978). Khi cộng sinh nấm Mycorrhiza gia tăng bào tử, số lƣợng các sợi nấm cũng tăng theo, các sợi nấm len lõi sâu vào lòng đất hút các chất dinh dƣỡng cung cấp cho cây,cây hấp thu đƣợc hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, khả năng tăng trƣởng mạnh. Mặt khác, với hệ sợi nấm phát triển thành mạng lƣới dài rộng, còn kích thích cây gia tăng số lƣợng rễ để hấp thu, dự trữ các chất dinh dƣỡng do nấm cung cấp, vì thế khối lƣợng rễ và chiều dài rễ cây khi có nấm Mycorrhiza cộng sinh gia tăng về số lƣợng. Ngoài ra, số liệu ở bảng 3.9 còn cho thấy, không có sự sai khác về khối lƣợng thân, chiều dài rễ, khối 41
Đồ án tốt nghiệp lƣợng rễ giữa các công thức đƣợc nhiễm nấm từ nguồn ban đầu và nguồn nhiễm lại trên rễ ngô. Nhƣ vậy, có thể dùng cây ngô nhƣ là ký chủ để nhân nuôi 2 chủng nấm cộng sinh Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2. A B C D Hình 3.9 Cây ngô sau 30 ngày theo dõi A.Sử dụng chế phẩm Mycorrhiza sp1; B. Sử dụng Mycorrhiza sp1 sau khi nhân giống C.Sử dụng chế phẩm Mycorrhiza sp2; D.Sử dụng Mycorrhiza sp2 sau khi nhân giống 42
Đồ án tốt nghiệp 3.4 Ảnh hƣởng của 4 mức phân P đến khả năng cộng sinh của nấm Mycorrhiza Khác rất nhiều với các nhóm vi sinh vật nấm rễ Mycorhiza không thể thực hiện quá trình nhân sinh khối trên môi trƣờng nuôi cấy nhân tạo mà phải thông qua cây kí chủ hoặc qua nuôi cấy cơ quan của rễ. Hiện nay trên thế giới 80% lƣợng bào tử cuả nấm Mycorrhiza nhân ra phục vụ cho công tác nghiên cứu và sản xuất thƣơng mại là nhờ cây kí chủ. Việc xác định ảnh hƣởng của hàm lƣợng phôtpho đến lƣợng bào tử sinh ra khi nuôi cấy kết hợp cây kí chủ là rất quan trọng nhằm tối ƣu hoá đƣợc quá trình nhân giống bào tử nấm rễ (Nguyễn Văn Sức, 2007). Mặc khác, lân cũng là nguồn dinh dƣỡng cần thiết cho sự phát triển của các cây trồng, lân tham gia vào quá trình hình thành nên các hợp chất protid quan trọng của cây, quá trình trao đổi và chuyển hóa mạnh mẽ. Hợp chất lân có trong tất cả các tế bào. Vì thế thí nghiệm đƣợc thực hiện nhằm xác định đƣợc mức phân lân phù hợp để cây và nấm có thể sử dụng và phát triển mang lại hiệu quả cao. 3.4.1 Đối với nấm Mycorrhiza sp1 Bảng 3.10 Kết quả chiều cao cây phát triển ở giai đoạn 12,16,20 ngày sau mọc của các công thức Chiều cao cây ở các ngày sau mọc (cm) Công thức 12 16 20 Ngô+Mycorrhiza sp1+ P2O5 mức 16.5a ± 0.54 36.1a ± 6.75 66.9a ± 0.45 0.06% Ngô+Mycorrhiza sp1+ P2O5 mức 16.8a ± 0.20 31.3a ± 0.73 48.1b ± 0.48 0.03% Ngô+Mycorrhiza sp1+ P2O5 mức 12.8b ± 0.19 18.7b ± 0.57 26.3c ± 0.18 0.09% Ngô+Mycorrhiza sp1 + P2O5 mức 10.1c ± 0.47 13.7b ± 0.29 16.2d ± 0.45 1.2% 43
Đồ án tốt nghiệp c b d Ngô+ P2O5 mức 0.03% (ĐC) 10.7 ± 0.60 13.6 ± 0.29 16.7±0.46 (Ghi chú: cây được trồng trong chậu) 80 cm 70 Công thức 60 Ngô+P2O5 muc 0.03%(ĐC) 50 Ngô+Mycorrhiza sp1+P2O5 mức 0.03% 40 Ngô+Mycorrhiza sp1+P2O5 mức 0.06% 30 Chiều cây Chiều cao Ngô+Mycorrhiza sp1+P2O5 mức 20 0.09% Ngô+Mycorrhiza sp1 +P205 mức 10 0.12% 0 12 16 20 Ngày sau mọc Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hƣởng của 4 mức phân lân đến chiều cao ngô Số liệu bảng 3.10 và hình 3.10 cho thấy, ở giai đoạn 12 ngày mọc sau gieo sự phát triển của cây ngô có sự phân hóa rõ rệt giữa các công thức, việc bổ sung phân lân kết hợp với nấm Mycorrhiza sp1 cho hiệu quả cây phát triển tốt hơn so với đối chứng không đƣợc nhiễm nấm Mycorrhiza sp1. Ở mức P2O5 0.03% là mức phân có sẵn trong đất cây phát triển kém hơn nhiều so với công thức có cùng mức phân, nhƣng đƣợc bổ sung chế phẩm Mycorrhiza sp1. Khi cộng sinh nấm cộng sinh Mycorrhiza sp1 có khả năng phân giải và vận chuyển các lân khó tiêu trong đất, giúp cây hấp thu dễ dàng hơn (Allen, 1981) và nhờ vậy cây phát triển tốt hơn. Tuy nhiên, việc kết hợp các mức phân P2O5 khác nhau sẽ cho hiệu quả khác nhau. Ở công thức có bổ sung mức phân P2O5 0.12% cho hiệu quả kém và không có sự khác biệt so với công thức đối chứng, nhƣng ở công thức đƣợc bổ sung mức phân P2O5 0.06% và 003% thì cây trồng phát triển tốt. Từ mức bổ sung phân P2O5 0.09% trở lên, hiệu quả mang lại cho sự phát triển của cây giảm dần. Ở giai đoạn 16 ngày mọc 44
Đồ án tốt nghiệp sau gieo, đã có sự khác biệt rõ về chiều cao cây ở các công thức, chiều cao cây ở các mức phân P2O5 0.06% và P2O5 0.03 % tƣơng đƣơng nhau và cao hơn so với bổ sung ở mức 0.09% và 0.12% P2O5. Nhƣ vậy, việc bổ sung P2O5 ở mức 0.03% và 0.06% không làm ảnh hƣởng xấu đến nấm Mycorrhiza, nhƣng việc bổ sung hàm lƣợng lân cao, lớn hơn hoặc bằng 0.09% sẽ làm ảnh hƣởng đến sự hoạt động của nấm rễ, vì theo Schuybert & Hayman khả năng cộng sinh với cây chủ tăng khi hàm lƣợng P2O5 thấp và giảm khi hàm lƣợng P2O5 cao. Tuy nhiên không phải cứ giảm lƣợng P2O5 thì khả năng xâm nhiễm của Mycorrhiza tăng theo (Koide, 1991). Vì thế cần có một lƣợng P2O5 thích hợp để thúc đẩy quá trình cộng sinh của nấm diễn ra nhanh hơn và nâng cao năng suất của cây trồng. 3.4.2 Đối với nấm Mycorrhiza sp2 Bảng 3.11 Kết quả chiều cao cây phát triển ở giai đoạn 12,16,20 ngày sau mọc của các công thức Chiều cao cây ở các ngày sau mọc (cm) Công thức 12 16 20 Ngô+Mycorrhiza sp2+ P2O5 mức 17.5a ± 0.97 34.4a ± 0.79 54.1a ± 0.65 0.06% Ngô+Mycorrhiza sp2+ P2O5 mức 17.2a ± 0.38 32.5b ± 0.74 48.8b ± 0.71 0.03% Ngô+Mycorrhiza sp2+ P2O5 mức 11.3b ± 0.49 15.15c ± 0.07 18.8c ± 1.21 0.09% Ngô+Mycorrhiza sp2 + P2O5 mức 10.5b ± 0.46 14.2cd ± 0.28 16.8d ± 0.33 0.12% b d d Ngô+ P2O5 mức 0.03% 10.7 ± 0.60 13.6 ± 0.29 16.7 ± 0.46 (Ghi chú: cây được trồng trong chậu) 45
Đồ án tốt nghiệp 60 cm 50 Công thức Ngô+P2O5 mức 0.03% 40 Ngô+Mycorrhiza sp2+P2O5 mức 0.03% 30 Ngô+Mycorrhiza sp2+P2O5 mức 0.06% Chiều Chiều cao cây 20 Ngô+Mycorrhiza sp2+P2O5 mức 0.09% Ngô+Mycorrhiza sp2 +P205 mức 10 0.12% 0 12 16 20 Ngày sau mọc Hình 3.11 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hƣởng của 4 mức phân lân đến chiều cao ngô Số liệu bảng 3.11 và hình 3.11 cho thấy, nhìn chung thì sự phát triển cây giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt. Ở công thức đối chứng là hàm lƣợng phân P2O5 có sẵn trong đất, với lƣợng P2O5 0.03% quá thấp, không đủ dinh dƣỡng để cung cấp cho cây phát triển, kết quả là sau 20 ngày cây chỉ tăng trƣởng đƣợc 16.7 cm. Với hàm lƣợng P2O5 là 0.03% nhƣng đƣợc bón nấm Mycorrhiza sp2 thì lại cho hiệu quả hơn nhiều so với công thức đối chứng, chiều cao cây tăng đều qua các giai đoạn, sau 20 ngày chiều cao cây đạt 49cm. Ở hàm lƣợng phân P2O5 ở mức 0.06% và đƣợc bổ sung chế phẩm cây vẫn tăng đều qua 20 ngày và chiều cao cây qua 20 ngày đạt 54cm. Tuy nhiên, không phải khi tăng hàm lƣợng P2O5 lên thì năng suất cây sẽ tăng, nhìn vào biểu đồ cho thấy ở công thức bổ sung nấm Mycorrhiza sp2 và các mức phân P2O5 lần lƣợt là 0.09% và 0.12% thì sự phát triển của cây đột ngột giảm xuống, chiều cao cây phát triển thấp sau 20 ngày. Sau 20 ngày theo dõi, chiều cao cây ở 2 mức phân P2O5 0.09% và 0.12% lần lƣợt là 18cm, 17cm. Tuy đƣợc bổ sung hàm lƣợng P2O5 cao và bón nấm rễ đầy đủ nhƣng sự phát triển của 46
Đồ án tốt nghiệp cây ở 2 công thức này không khác biệt gì so với công thức đối chứng (P>0.05). Theo kết quả thí nghiệm của Nguyễn Văn Sức 2007, số lƣợng bào tử và tỷ số xâm nhiễm nấm rễ tỷ lệ nghịch với hàm lƣợng P2O5 tổng số ,số bào tử và tỷ số xâm nhiễm cao nhất ở công thức có hàm lƣợng P2O5 tổng số thấp (0,05%), giảm dần khi tăng lƣợng P2O5 và hầu nhƣ không xuất hiện ở mức giầu phôtpho (0,2% P2O5 tổng số ). Tuy hàm lƣợng P2O5 bổ sung vào các công thức do sinh viên nghiên cứu, có khác so với hàm lƣợng P2O5 bổ sung vào thí nghiệm nghiên cứu của Nguyễn Văn Sức, nhƣng cả 2 nghiên cứu đều cho kết quả là ở các mức phân P2O5 đƣợc bổ sung cao đều cho hiệu quả thấp, và ngƣợc lại ở các mức phân thấp và vừa phải thì cho hiệu quả cao.Điều này cho thấy khả năng cộng sinh của nấm tùy thuộc vào hàm lƣợng P2O5 tổng số đƣợc bổ sung [3]. Tóm lại, việc bổ sung cả 2 yếu tố, mức phân P2O5 kết hợp với nấm Mycorrhiza sp bón cho cây trồng sẽ mang lại hiệu quả kinh tế, tuy nhiên ở mỗi mức phân sẽ cho hiệu quả khác nhau. Khi hàm lƣợng phân lân trong đất quá thấp không đủ điều kiện để nấm phát triển, nấm sẽ ký sinh trên cây để lấy chất dinh dƣỡng và có thể gây hại cây, mặt khác khi hàm lƣợng phân lân dễ tiêu bón vào trong đất lớn cây không cần sự cộng sinh của nấm vì đã có đủ chất dinh dƣỡng để cây phát triển, tuy nhiên khi trong đất chỉ có một lƣợng phân vừa và đủ sẽ là điều kiện để cả 2 nấm và cây cộng sinh với nhau để duy trì khả năng sống sót [7]. 3.5 Đánh giá khả năng kháng nấm Rhizoctonia solani và Fusarium sp của nấm Mycorrhiza Nƣớc ta thuộc kiểu khí hậu nhiệt đới gió mùa, quanh năm ẩm ƣớt. Đây là kiểu khí hậu thích hợp cho sự hình thành và sinh trƣởng của các loài nấm bệnh. Khi cây trồng nhiễm các bệnh do nấm gây ra, cây dần mất sức sống, sinh trƣởng kém và dẫn đến chết cây. Để làm giảm các nguy cơ tấn công từ nấm bệnh, giải pháp đặt ra hàng đầu của ngƣời dân là sử dụng các thuốc trừ sâu hóa học, tuy nhiên việc sử dụng hàm lƣợng thuốc trừ sâu hóa học quá lớn sẽ dẫn đến ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng sức khỏe con ngƣời. Các kết quả nghiên cứu của (Wingfield 1968, Marx 1973, Mark và Krupa 1973) cho biết, nhiều loài nấm Mycorrhiza ngoài việc kích 47
Đồ án tốt nghiệp thích sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng, chúng còn có khả năng tiêu diệt, đối kháng với một số loài nấm bệnh gây hại cây trồng. Rhizoctonia solani, Fusarium sp là 2 loại nấm bệnh có trong đất thƣờng gây hại làm chết cây ngay từ giai đoạn cây con và kéo dài đến khi cây lớn. Liệu nấm Mycorrhiza khi bón vào đất có khống chế đƣợc các loài này không.Vì thế ,thí nghiệm đƣợc thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả đối kháng của chủng nấm rễ Mycorrhiza và cũng là tiền để để sản xuất thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học, thân thiện với môi trƣờng. Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng của 2 chủng nấm Mycorrhiza với 2 loài nấm bệnh đƣợc trình bày tuần tự nhƣ sau: 3.5.1 Khả năng đối kháng của nấm Mycorrhiza sp1 3.5.1.1 Tỷ lệ hạt nảy mầm Bảng 3.12 Tỷ lệ (%) hạt nảy mầm giữa các công thức Tỷ lệ hạt nảy mầm Công thức (%) Nhiễm nấm Mycorrhiza sp1 96.27a ± 6.46 Đối chứng 92.53ab ± 6.46 Mycorrhiza sp1+R.solani 85.1b ± 6.40 Mycorrhiza sp1+Fusarium sp 85.1b ± 6.40 Nhiễm nấm R.solani 70.3c ± 6.40 Nhiễm nấm Fusarium sp 66.6c ± 0 (Ghi chú: Hạt được gieo trong chậu) Nhìn vào bảng số liệu 3.12 cho thấy tỷ lệ cây mọc của các công thức đƣợc nhiễm nấm Mycorrhiza sp1 đều đạt trên 80%. Trong đó ở 2 công thức nhiễm nấm bệnh Rhizoctonia solani va Fusarium sp đƣợc bổ sung nấm Mycorrhiza sp1 có tỷ lệ % hạt nảy mầm vƣợt trội so với 2 công thức không đƣợc nhiễm nấm Mycorrhiza sp1.Có lẽ do mầm bệnh ở 2 công thức nhiễm nấm Fusarium và Rhizoctonia khá cao, nên đã tác động xấu đến sự phát triển của hạt, nấm Fusarium sp làm hạt ngô không chắc mẩy, dễ vỡ, hạt bị bệnh mốc hồng, mất sức nảy mầm, mầm mọc ra chết 48
Đồ án tốt nghiệp ở trong đất khi gieo. Việc bón chế phẩm Mycorrhiza sp1 vào các công thức chứa nấm bệnh, thúc đẩy sự phát triển của hạt ngô cao hơn so với các công thức không đƣợc lây nhiễm nấm Mycorrhiza sp1. Mặt khác nấm Mycorrhiza cộng sinh, cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng với nấm gây bệnh (David M. Sylvia, 1998). Điều đó làm giảm sức sống của nấm bệnh, nên mầm hạt không bị tấn công và phát triển bình thƣờng. A B C Hình 3.12 Hạt nảy mầm sau 5 ngày theo dõi 49
Đồ án tốt nghiệp 3.5.1.2 Tỷ lệ cây bệnh do nấm Rhizoctonia solani Nấm Rhizoctonia solani thƣờng gây bệnh ở rễ, phần thân sát mặt đất ở cây non, và trên bắp, thân, lá ở cây trƣởng thành. Bảng 3.13 Tỷ lệ (%) cây bệnh do nấm R.solani gây ra Công thức Tỷ lệ cây bệnh (%) Nhiễm nấm R.solani 69.04a ± 13.26 Nấm Mycorrhiza sp1+nhiễm nấm R.solani 17.26b ± 6.76 Đối chứng 0c (Ghi chú: cây được trồng trong chậu) Nhìn vào bảng 3.13 cho ta thấy, tỷ lệ bệnh cây do nhiễm nấm R.solani gây ra lên đến 69%, ở công thức đƣợc bổ sung chế phẩm Mycorrhiza sp1 tỷ lệ nhiễm bệnh là 17%. Việc bổ sung chế phẩm Mycorrhiza sp1, có khả năng làm giảm sự gây hại của nấm R.solani, do trong quá trình phát triển, nấm Mycorrhiza gia tăng số lƣợng cạnh tranh các nguồn dinh dƣỡng với R.solani. Hơn nữa, hệ sợi nấm Mycorrhiza phát triển chằng chịt xung quanh bảo vệ rễ cây chủ nên khả năng tấn công của nấm R.solani giảm xuống. .(theo David M. Sylvia, 1998) Hình 3.13 Đặc điểm cây ngô bị nấm R.solani tấn công 50
Đồ án tốt nghiệp 3.5.2 Khả năng đối kháng của nấm Mycorrhiza sp2 3.5.2.1 Tỷ lệ hạt nảy mầm Bảng 3.14 Tỷ lệ (%) hạt nảy mầm giữa các công thức Công thức Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) Nhiễm nấm Mycorrhiza sp2 92.53a ± 6.46 Đối chứng 92.53a ± 6.46 Mycorrhiza sp2+Fusarium sp 85.1ab ± 6.40 Mycorrhiza sp2+R.solani 81.4b ± 6.40 Nhiễm nấm R.solani 70.3c ± 6.40 Nhiễm nấm Fusarium sp 66.6c ± 0 (Ghi chú: cây được trồng trong chậu) Số liệu ở bảng 3.8 cho thấy, do nấm Fusarium sp và Rhizpctonia solani có trong đất gây ảnh hƣởng đến tỷ lệ nẩy mầm của hạt ngô và làm giảm > 20% khả năng nẩy mầm của hạt. Việc bón nấm cộng sinh vào trong rễ có chiều hƣớng làm giảm tác động xấu của nấm bệnh và giúp tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt. Theo các nghiên cứu, trong đất, nấm cộng sinh ngoài việc cung cấp dinh dwoxng cho cây còn có khả năng cạnh tranh dinh dƣỡng với các loài nấm bệnh khác và nhờ vậy mà làm tăng kahr năng nầy mầm của hạt so với không bón nấm cộng sinh 3.5.2.2 Tỷ lệ cây bệnh do nấm Rhizoctonia solani gây ra Bảng 3.15. Tỷ lệ (%) cây bệnh do nấm R.solani gây ra Công thức Tỷ lệ bệnh(%) Nhiễm nấm R.solani 69.05a ± 13.26 Nấm Mycorrhiza sp2+nhiễm nấm R.solani 13.69b ± 1.03 Đối chứng 0c (Ghi chú: cây được trồng trong chậu) Nhìn vào bảng 3.15 ta thấy, việc sử dụng nấm Mycorrhiza sp2 làm giảm khả năng gây bệnh của nấm R.solani, ở công thức có bổ sung chế phẩm nấm Mycorrhiza sp2 phần trăm cây bị bệnh là 13% trong khi đó ở công thức nhiễm R.solani phần trăm cây bị bệnh lên đến 69%, cao gấp 5 lần so với công thức đƣợc nhiễm chế phẩm 51
Đồ án tốt nghiệp nấm Mycorrhiza, điều đó cho thấy chế phẩm nấm Mycorrhiza sp2, có khả năng ngăn chặn sự phát triển bệnh. Theo Schonbeck (1979) và Dehne (1982), rễ có sự cộng sinh của nấm Mycorrhiza thƣờng có khả năng kháng nấm. Vì nấm rễ Mycorrhiza có thể kích thích sự nảy mầm của bào tử nấm bệnh để cho trƣớc khi tiếp xúc với cây chủ, nấm gây bệnh sẽ bị mất hết dinh dƣỡng và mất sức sống, từ đó làm giảm mật độ nấm bệnh. Hình 3.14 Cây ngô bị bệnh lỡ cổ rễ 52
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã phân lập và xác định hình dạng bào tử và dạng xâm nhiễm vào rễ cây kí chủ của 2 chủng nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 - Việc bổ sung chế phẩm Mycorrhiza vào đất thúc đẩy quá trình tăng trƣởng và phát triển của cây ngô - Bón nấm Mycorrhiza sp1 và Mycorrhiza sp2 làm cho bộ rễ phát triển mạnh cả về chiều dài, chiều rộng và về số lƣợng và giúp cây ngô tăng nhanh về chiều cao và sinh khối. - Hiệu quả thúc đẩy tăng trƣởng cây ngô của nấm Mycorrhiza sau khi lây nhiễm trên rễ ngô không sai khác so với nguồn ban đầu nên có thể sử dụng cây ngô nhƣ là ký chủ để nhân sinh khối 2 chủng nấm Mycorrhiza. - Nguồn P2O5 bổ sung có ảnh hƣởng đến sự cộng sinh của nấm Mycorriza. Bổ sung P2O5 mức 0.06% và P2O5 mức 0.03% sẽ giúp cây sinh trƣởng và phát triển tốt, cho năng suất cao. - Ngoài việc cung cấp hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng cho cây, nấm Mycorrhiza còn có khả năng kháng lại các chủng nấm gây bệnh nhƣ Rhizoctonia solani và Fusarium sp gây hại trên ngô. 4.2 Kiến nghị Khuyến cáo nghiên cứu và sản xuất ra phân bón sinh học từ chế phẩm Mycorrhiza để làm tăng năng suất và giảm tác hại ô nhiễm môi trƣờng do các loại phân và thuốc trừ sâu hóa học gây ra. 53
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng việt [1] Nguyễn Thị Hai (2012), Bài giảng: “Ứng dụng CNSH trong BVTV”, Trƣờng Đại Học Công Nghệ Tp.HCM. [2] Trần Thị Dạ Thảo (2012), Luận án tiến sĩ nông nghiệp: “Nghiên cứu sự cộng sinh của nấm Mycorrhizal trên cây ngô ( Zea mays L.) vùng Đông Nam Bộ”, Bộ GD&ĐT Đại học Nông Lâm. [3] Nguyễn Văn Sức (2007), Đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ: “Nghiên cứu, áp dụng kỹ thuật phát triển cộng sinh Mycorrhiza cho một số cây trồng chính tại một số vùng sinh thái phục vụ cho sản xuất nông nghiệp bền vững (2004-2007)”, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.  Tài liệu tiếng nƣớc ngoài [4] Brundrett, Mark et al (1996), “Working with Mycorrhiza in Forestry and Agriculture, Canberra, Australia 1996” [5] Morton J.B, 1998, Taxonomy of Mycorrhizal fungi: “ Classificationbnonmen cloture and identification. Mycotaxon” [6] “Development and standardization of production Technology for VA Mycorrhiza Inocula”. BAIF Development research foundation, Oct 16 1996. [7] “Manual on Arbuscular Mycorrhizal Fungus production and Inoculation Techniques”. Soil and Crop Management, July 2003. [8] FAO (1990). “Situation and Outlook of the Forestry Sector in Indonesia”. Directorate General of Forest Utilization. Ministry of Frestry, Jakarta, Indonesia, 165 pp. [9] Dr. Uthaiwan Sangwanit (2009), “ Department of Forest Biology Facuulty of forestry Kasetsart” [10] “Mycorrhizae Your Silent Partner”, Lead Article, Vol 24 (4),Winter 1998 54
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. Chiều cao trung bình của cây ngô giai đoạn 10 ngày mọc sau gieo Summary Statistics for chieu cao cong thuc Count Average Standard Coeff. of Minimum Maximum Range Stnd. deviation variation skewness Doi chung 3 10.42 0.458258 4.39787% 9.92 10.82 0.9 -0.6613 Mycorrhi 3 9.88667 1.6184 16.3696% 8.45 11.64 3.19 0.598769 za sp1 Mycorrhi 3 9.51333 0.794754 8.3541% 8.8 10.37 1.57 0.555203 za sp2 Total 9 9.94 1.01042 10.1652% 8.45 11.64 3.19 0.160992 ANOVA Table for chieu cao by cong thuc Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 1.24587 2 0.622933 0.54 0.6086 groups Within 6.92173 6 1.15362 groups Total (Corr.) 8.1676 8 Multiple Range Tests for chieu cao by cong thuc cong thuc Coun Mean Homogeneous t Groups Mycorrhiza sp2 3 9.51333 X Mycorrhiza sp1 3 9.88667 X Đối chứng 3 10.42 X PHỤ LỤC 2. Chiều cao trung bình của cây ngô giai đoạn 16 ngày mọc sau gieo Summary Statistics for chieu cao cong thuc Coun Average Standard Coeff. of Minimum Maximu Range Stnd. t deviation variation m skewness Đối chứng 3 26.3267 0.42395 1.61034% 25.94 26.78 0.84 0.487998 Mycorrhiza 3 32.4067 0.380044 1.17273% 32.13 32.84 0.71 1.08881 sp1 Mycorrhiza 3 32.2233 1.60238 4.97274% 31.2 34.07 2.87 1.20332 sp2 Total 9 30.3189 3.11356 10.2694% 25.94 34.07 8.13 - 0.725528 1
Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for chieu cao by cong thuc Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 71.7707 2 35.8853 37.23 0.0004 groups Within 5.7836 6 0.963933 groups Total (Corr.) 77.5543 8 Multiple Range Tests for chieu cao by cong thuc Method: 95.0 percent LSD cong thuc Cou Mean Homogeneous nt Groups Đối chứng 3 26.32 X 67 Mycorrhiz 3 32.22 X a sp2 33 Mycorrhiz 3 32.40 X a sp1 67 PHỤ LỤC 3. Chiều cao trung bình của cây ngô giai đoạn 22 ngày mọc sau gieo Summary Statistics for chieu cao cong thuc Co Average Standard Coeff. of Minimu Maximu Rang Stnd. unt deviation variation m m e skewness Đối chứng 3 41.1 0.679117 1.65235% 40.64 41.88 1.24 1.16645 Mycorrhiz 3 62.09 1.45248 2.33931% 60.73 63.62 2.89 0.367321 a sp1 Mycorrhiz 3 60.65 0.9992 1.64749% 59.53 61.45 1.92 -0.914531 a sp2 Total 9 54.6133 10.198 18.6731% 40.64 63.62 22.9 -1.00131 8 ANOVA Table for chieu cao by cong thuc Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 824.856 2 412.428 346.65 0.0000 groups Within 7.1386 6 1.18977 groups Total (Corr.) 831.995 8 2
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for chieu cao by cong thuc Method: 95.0 percent LSD cong thuc Cou Mean Homogeneous nt Groups Đối chứng 3 41.1 X Mycorrhiz 3 60.65 X a sp2 Mycorrhiz 3 62.09 X a sp1 PHỤ LỤC 4. Chiều cao trung bình của cây ngô giai đoạn 28 ngày mọc sau gieo Summary Statistics for chieu cao cong thuc Con Average Standar Coeff. of Mini Maximum Rang Stnd. t d variation mum e skewness deviatio n Đối chứng 3 57.4333 0.21571 0.375593% 57.28 57.68 0.4 1.11901 6 Mycorrhiza sp1 3 93.5167 1.07435 1.14884% 92.28 94.22 1.94 -1.19034 Mycorrhiza sp2 3 90.08 1.89011 2.09825% 87.93 91.48 3.55 -1.06382 Total 9 80.3433 17.2814 21.5094% 57.28 94.22 36.94 -0.997761 ANOVA Table for chieu cao by cong thuc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2379.62 2 1189.81 747.80 0.0000 Within groups 9.54653 6 1.59109 Total (Corr.) 2389.17 8 Multiple Range Tests for chieu cao by cong thuc Method: 95.0 percent LSD cong thuc Count Mean Homogeneous Groups Đối chứng 3 57.4333 X Mycorrhiza sp2 3 90.08 X Mycorrhiza sp1 3 93.5167 X 3
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 5. Khối lƣợng thân trung bình của cây ngô sau thời gian thí nghiệm 28 ngày Summary Statistics for khoi luong than cong thuc Cou Average Standard Coeff. of Minim Maxim Rang Stnd. nt deviation variation um um e skewness Doi chung 3 85.0233 3.38077 3.97629% 81.47 88.2 6.73 -0.350118 Mycorrhiza sp1 3 156.817 3.28477 2.09466% 154.37 160.55 6.18 1.05516 Mycorrhiza sp2 3 131.133 5.0819 3.87537% 126.98 136.8 9.82 0.86353 Total 9 124.324 31.6941 25.4931% 81.47 160.55 79.08 -0.480137 ANOVA Table for khoi luong than by cong thuc Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 7940.05 2 3970.02 247.89 0.0000 groups Within 96.0902 6 16.015 groups Total (Corr.) 8036.14 8 Multiple Range Tests for khoi luong than by cong thuc Method: 95.0 percent LSD cong thuc Count Mean Homogeneous Groups Doi chung 3 85.023 a 3 Mycorrhiza 3 131.13 b sp2 3 Mycorrhiza 3 156.81 c sp1 7 PHỤ LỤC 6. Chiều dài trung bình rễ của cây ngô sau thời gian thí nghiệm 28 ngày Summary Statistics for chieu dai re cong thuc Cou Average Standard Coeff. of Minimu Maximu Rang Stnd. nt deviation variation m m e skewness Doi chung 3 16.5233 0.0450925 0.272902 16.48 16.57 0.09 0.233933 % Mycorrhiza sp1 3 21.1567 0.728446 3.4431% 20.32 21.65 1.33 -1.16658 Mycorrhiza sp2 3 20.09 0.301164 1.49908% 19.83 20.42 0.59 0.699636 Total 9 19.2567 2.13815 11.1034% 16.48 21.65 5.17 -0.662248 4
Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for chieu dai re by cong thuc Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 35.3267 2 17.6633 85.01 0.0000 Within groups 1.24673 6 0.207789 Total (Corr.) 36.5734 8 Multiple Range Tests for chieu dai re by cong thuc Method: 95.0 percent LSD cong thuc Count Mean Homogeneous Groups Doi chung 3 16.523 X 3 Mycorrhiza 3 20.09 X sp2 Mycorrhiza 3 21.156 X sp1 7 PHỤ LỤC 7. Khối lƣợng rễ trung bình của cây ngô sau thời gian thí nghiệm 28 ngày Summary Statistics for khoi luong re cong thuc Coun Averag Standard Coeff. of Minimu Maximu Range Stnd. t e deviation variatio m m skewness n Doi chung 3 15.993 1.34857 8.43206 15.18 17.55 2.37 1.22103 3 % Mycorrhiza sp1 3 61.11 1.351 2.21077 60.33 62.67 2.34 1.22474 % Mycorrhiza sp2 3 42.11 0.674389 1.60149 41.53 42.85 1.32 0.712437 % Total 9 39.737 19.643 49.4316 15.18 62.67 47.49 -0.281704 8 % ANOVA Table for khoi luong re by cong thuc Source Sum of Squares Df Mean F-Ratio P-Value Square Between groups 3078.59 2 1539.3 1126.69 0.0000 Within groups 8.19727 6 1.36621 Total (Corr.) 3086.79 8 5
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for khoi luong re by cong thuc Method: 95.0 percent LSD Cong thuc Count Mean Homogeneous Groups Doi chung 3 15.993 X 3 Mycorrhiza 3 42.11 X sp2 Mycorrhiza 3 61.11 X sp1 PHỤ LỤC 8. Đƣờng kính rễ trung bình của cây ngô sau thời gian thí nghiệm 28 ngày Summary Statistics for duong kinh cong thuc Coun Averag Standard Coeff. of Minimu Maximu Rang Stnd. t e deviation variation m m e skewness Doi chung 3 6.5233 0.174738 2.67866% 6.33 6.67 0.34 -0.789189 3 Mycorrhiza 3 12.246 0.144338 1.17859% 12.08 12.33 0.25 -1.22474 sp1 7 Mycorrhiza 3 12.376 0.107858 0.871462% 12.3 12.5 0.2 1.11901 sp2 7 Total 9 10.382 2.89743 27.9076% 6.33 12.5 6.17 -1.04781 2 ANOVA Table for duong kinh by cong thuc Source Sum of Squares Df Mean Square F- P-Value Ratio Between groups 67.035 2 33.5175 1596.0 0.0000 7 Within groups 0.126 6 0.021 Total (Corr.) 67.161 8 Multiple Range Tests for duong kinh by cong thuc Method: 95.0 percent LSD cong thuc Count Mean Homogeneous Groups Doi chung 3 6.5233 X 3 Mycorrhiza 3 12.246 X sp1 7 Mycorrhiza 3 12.376 X sp2 7 6
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 9. Chiều cao trung bình của cây ngô sau 8 ngày theo dõi Summary Statistics for Chieu cao cây 8 ngay Cong thuc Count Averag Standard Coeff. of Minimu Maximu Rang e deviation variation m m e Doi chung 3 7.18 0.385746 5.37251% 6.74 7.46 0.72 Nhiem nam Mycorrhiza 3 9.5333 0.338575 3.55149% 9.17 9.84 0.67 sp1 3 Nhiem nam Mycorrhiza 3 9.1033 0.300222 3.29794% 8.81 9.41 0.6 sp2 3 Nhiễm Mycorrhiza sp1 3 8.7833 0.160416 1.82637% 8.63 8.95 0.32 sau khi đã nhân giống 3 Nhiễm Mycorrhiza sp2 3 8.77 0.585577 6.67704% 8.2 9.37 1.17 sau khi đã nhân giống Total 15 8.674 0.885291 10.2063% 6.74 9.84 3.1 ANOVA Table for Chieu cao by Cong thuc Source Sum of Squares Df Mean F-Ratio P-Value Square Between 9.52796 4 2.38199 16.49 0.0002 groups Within groups 1.4444 10 0.14444 Total (Corr.) 10.9724 14 Multiple Range Tests for Chieu cao by Cong thuc Method: 95.0 percent LSD Cong thuc Count Mean Homogeneous Groups Doi chung 3 7.18 X Nhiễm Mycorrhiza sp2 sau khi đã 3 8.77 X nhân giống Nhiễm Mycorrhiza sp1 sau khi đã 3 8.78333 X nhân giống Nhiem nam Mycorrhiza sp2 3 9.10333 XX Nhiem nam Mycorrhiza sp1 3 9.53333 X 7
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 10 Chiều cao trung bình của cây ngô sau 10 ngày theo dõi Summary Statistics for chieu cao cay 10 ngay Cong thuc Coun Average Standard Coeff. of Minimu Maximum Rang t deviation variation m e Doi chung 3 9.66667 0.765659 7.92061% 9.07 10.53 1.46 Nhiem nam Mycorrhiza 3 15.41 0.717147 4.65378% 14.9 16.23 1.33 sp1 Nhiem nam Mycorrhiza 3 15.38 0.835943 5.43526% 14.44 16.04 1.6 sp2 Nhiễm Mycorrhiza sp1 3 15.31 0.52915 3.45624% 14.71 15.71 1.0 sau khi đã nhân giống Nhiễm Mycorrhiza sp2 3 14.71 0.860174 5.84755% 13.86 15.58 1.72 sau khi đã nhân giống Total 15 14.0953 2.39305 16.9776% 9.07 16.23 7.16 ANOVA Table for Chieu cao by Cong thuc Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 74.5351 4 18.6338 33.05 0.0000 Within groups 5.63847 10 0.563847 Total (Corr.) 80.1736 14 Multiple Range Tests for Chieu cao by Cong thuc Method: 95.0 percent LSD Cong thuc Count Mean Homogeneous Groups Doi chung 3 9.66667 X Nhiem Mycorrhiza sp2 sau khi đã nhân 3 14.71 X giống NhiễmMycorrhiza sp1sau khi đã nhân 3 15.31 X giống Nhiem nam Mycorrhiza sp2 3 15.38 X Nhiem nam Mycorrhiza sp1 3 15.41 X 8
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 11 Chiều cao trung bình của cây ngô sau 12 ngày theo dõi Summary Statistics for chieu cao cay 12 ngay Cong thuc Coun Average Standard Coeff. of Minimum Maximum Range t deviation variation Doi chung 3 13.9633 0.402658 2.88368 13.59 14.39 0.8 % Nhiem nam Mycorrhiza 3 22.3767 1.25532 5.60996 21.31 23.76 2.45 sp1 % Nhiem nam Mycorrhiza 3 22.3333 0.42336 1.89564 21.87 22.7 0.83 sp2 % NhiễmMycorrhiza sp1 3 22.3967 0.725971 3.24142 21.65 23.1 1.45 sau khi đã nhân giống % Nhiễm Mycorrhiza sp2 3 22.0 0.793221 3.60555 21.34 22.88 1.54 sau khi đã nhân giống % Total 15 20.614 3.50843 17.0196 13.59 23.76 10.17 % ANOVA Table for Chieu cao by Cong thuc Source Sum of Squares Df Mean F-Ratio P-Value Square Between groups 166.18 4 41.545 67.59 0.0000 Within groups 6.14687 10 0.614687 Total (Corr.) 172.327 14 Multiple Range Tests for Chieu cao by Cong thuc Method: 95.0 percent LSD Cong thuc Count Mean Homogeneous Groups Doi chung 3 13.963 X 3 Nhiễm Mycorrhiza sp2 sau 3 22.0 X khi đã nhân giống Nhiễm nấm Mycorrhiza 3 22.333 X sp2 3 Nhiễm nấm Mycorrhiza 3 22.376 X sp1 7 Nhiễm Mycorrhiza sp1 sau 3 22.396 X khi đã nhân giống 7 9
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 12 Chiều cao trung bình của cây ngô sau 14 ngày theo dõi Summary Statistics for chieu cao cay 14 ngay Cong thuc Coun Averag Standard Coeff. of Minimu Maximu Rang t e deviation variation m m e Doi chung 3 18.2 0.278747 1.53158% 17.88 18.39 0.51 Nhiễm nấm Mycorrhiza sp1 3 29.853 1.31592 4.40793% 28.51 31.14 2.63 3 Nhiem nấm Mycorrhiza sp2 3 30.183 0.235867 0.781448% 29.96 30.43 0.47 3 NhiễmMycorrhiza sp1 sau 3 29.836 0.84002 2.81539% 29.0 30.68 1.68 khi đã nhân giống 7 Nhiễm Mycorrhiza sp2 sau 3 30.193 0.660328 2.187% 29.63 30.92 1.29 khi đã nhân giống 3 Total 15 27.653 4.93883 17.8598% 17.88 31.14 13.26 3 ANOVA Table for Chieu cao by Cong thuc Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 335.475 4 83.8687 139.47 0.0000 Within groups 6.01327 10 0.601327 Total (Corr.) 341.488 14 Multiple Range Tests for Chieu cao by Cong thuc Method: 95.0 percent LSD Cong thuc Count Mean Homogeneous Groups Doi chung 3 18.2 X Nhiễm Mycorrhiza sp1 sau 3 29.8367 X khi đã nhân giống Nhiễm nấm Mycorrhiza sp1 3 29.8533 X Nhiễm nấm Mycorrhiza sp2 3 30.1833 X Nhiễm Mycorrhiza sp2 sau 3 30.1933 X khi đã nhân giống 10
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 13 Khối lƣợng thân trung bình của cây ngô sau 14 ngày theo dõi Summary Statistics for Khoi luong than ngo sau 14 ngay Cong thuc Coun Average Standard Coeff. of Minimu Maximu Rang t deviation variation m m e Doi chung 3 1.57 0.441928 28.1483 1.18 2.05 0.87 % Nhiem nam Mycorrhiza 3 2.25333 0.210792 9.35468 2.01 2.38 0.37 sp1 % Nhiem nam Mycorrhiza 3 2.40333 0.0814453 3.38885 2.31 2.46 0.15 sp2 % NhiễmMycorrhiza sp1 3 2.12 0.186815 8.81205 1.92 2.29 0.37 sau khi đã nhân giống % Nhiễm Mycorrhiza sp2 3 2.14333 0.0321455 1.49979 2.12 2.18 0.06 sau khi đã nhân giống % Total 15 2.098 0.354627 16.9031 1.18 2.46 1.28 % ANOVA Table for Khoi luong than by Cong thuc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.19604 4 0.29901 5.30 0.0149 Within groups 0.5646 10 0.05646 Total (Corr.) 1.76064 14 Multiple Range Tests for Khoi luong than by Cong thuc Method: 95.0 percent LSD Cong thuc Coun Mean Homogeneous t Groups Doi chung 3 1.57 X Nhiễm Mycorrhiza sp1 sau khi đã 3 2.12 X nhân giống Nhiễm Mycorrhiza sp2 sau khi đã 3 2.14333 X nhân giống Nhiễm nấm Mycorrhiza sp1 3 2.25333 X Nhiễm nấm Mycorrhiza sp2 3 2.40333 X 11