›

Đồ án Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh

pdf 72 trang thiennha21 13/04/2022 4400
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_phan_lap_tuyen_chon_cac_chung_vi_khuan_co_hoat_tinh_ke.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KEO TỤ SINH HỌC TỪ CÁC AO NUÔI TÔM TẠI TỈNH TRÀ VINH Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực hiện : VÕ LAN HƯƠNG MSSV : 1411100330 Lớp : 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2018
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình. Trường đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có) Sinh viên Võ Lan Hương
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành báo cáo này, trước tiên em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học và Ban Chủ nhiệm Viện Khoa học ứng dụng HUTECH lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự hào vì đã được học tập tại Trường trong những năm qua. Bên cạnh đó, để hoàn thành được bài báo cáo này, em xin chân thành cảm ơn ThS. Phạm Minh Nhựt đã luôn bên cạnh em, cảm ơn thầy đã tận tình chỉ dạy em, cho em thêm động lực và niềm tin để phấn đấu hoàn thành tốt nhất đề tài của mình. Em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm công tác nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH đã giúp đỡ em nhiệt tình trong suốt quá trình thực tập tại trung tâm. Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn bè em, đã quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn trong quá trình thực tập và hoàn thành báo cáo thật tốt. Trong quá trình hoàn thiện báo cáo không tránh khỏi những thiếu xót nhất định mà em chưa thể khắc phục nên em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để đề tài này được hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm ơn. Sinh viên Võ Lan Hương
  4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BÀNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1 Giới thiệu về ngành nuôi trồng thủy sản 3 1.2 Khó khăn của ngành nuôi trồng thủy sản 4 1.2.1 Ảnh hưởng của dịch bệnh 4 1.2.1.1 Bệnh do virus 4 1.2.1.2 Bệnh do vi khuẩn 7 1.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nước 8 1.2.2.1 Ô nhiễm từ nguồn nitơ 8 1.2.2.2 Ô nhiễm từ lớp bùn hình thành 9 1.2.2.3 Ô nhiễm từ môi trường tự nhiên 9 1.2.2.4 Một số nguyên nhân khác 9 1.3 Vai trò của chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản 9 1.3.1 Khái niệm 9 1.3.2 Thành phần 10 1.3.2.1 Vi khuẩn Gram dương 10 1.3.2.2 Vi khuẩn Gram âm 10 1.3.2.3 Nấm men 10 1.3.3 Vai trò 10 1.3.3.1 Cạnh tranh vị trí gắn kết 10 1.3.3.2 Sản xuất các chất ức chế 10 1.3.3.3 Cạnh tranh các nguồn năng lượng 11 1.3.3.4 Tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng 11 1.3.3.5 Ảnh hưởng đến hệ thống nước xanh 11 1.3.3.6 Nâng cao đáp ứng miễn dịch 11 i
  5. 1.3.4 Ứng dụng chế phẩm vi sinh trong sử lý nước 12 1.4 Vi khuẩn keo tụ sinh hoạt và vai trò trong nuôi trồng thủy sản 12 1.4.1 Khái niệm keo tụ sinh hoạt 12 1.4.2 Giai đoạn hình thành 12 1.4.3 Vi khuẩn sản xuất keo tụ sinh học 12 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14 2.1.1 Thời gian 14 2.1.2 Địa điểm thu mẫu 14 2.1.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 14 2.2 Vật liệu 14 2.2.1 Mẫu 14 2.2.2 Hoá chất và môi trường 14 2.2.2.1 Hóa chất 14 2.2.2.2 Môi trường 15 2.3 Dụng cụ và thiết bị 15 2.3.1 Dụng cụ 15 2.3.2 Thiết bị 15 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 16 2.4.2 Phương pháp phân lập 16 2.4.3 Phương pháp nhuộm Gram 18 2.4.4 Phương pháp nhuộm bào tử 18 2.4.5 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 20 2.4.5.1 Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật 20 2.4.5.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 20 2.4.6 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật 20 2.4.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính keo tụ sinh học 21 2.4.8 Phương pháp định danh 21 ii
  6. 2.4.8.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa 21 2.4.8.2 Định danh bằng sinh học phân tử 31 2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 31 2.5 Bố trí thí nghiệm 31 2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm 31 2.5.2 Quy trình phân lập 31 2.5.3 Sàn lọc hoạt tính keo tụ sinh học các chủng sau định danh sơ bộ 32 2.5.4 Định danh các chủng vi khuẩn sau sàng lọc 32 2.5.4.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa 32 2.5.4.2 Định danh bằng sinh học phân tử 33 2.5.5 Bước đầu khảo sát quy trình thu hồi hợp chất keo tụ sinh học từ vi khuẩn 34 2.5.5.1 Sơ đồ quy trình thu hồi 34 2.5.5.2 Thuyết minh quy trình 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước ao nuôi 36 3.2 Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính keo tụ sinh học 43 3.3 Kết quả định danh chủng 9.4 45 3.3.1 Định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa 45 3.3.2 Kết quả định danh chủng 9.4 bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S . 46 3.4 Kết quả bước đầu tách triết hoạt tính keo tụ sinh học từ chủng 9.4 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 4.1 Kết luận 50 4.2 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 53 iii
  7. PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ TỈ LỆ HOẠT TÍNH KEO TỤ XỬ LÝ BẰNG CHƯƠNG TRÌNH SAS 9.0 55 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỪ GENE 61 iv
  8. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TSA : Tryptic Soya Agar TSB : Trypto-casein soy broth COD : Chemical Oxygen Demand DO : Dessolved Oxygen BOD : Biochemical oxygen Demand TSS : Turbidity & suspendid solids DNA : Deoxyribonucleic acid PCR : Polymerase Chain Reaction NCBI : National Center for Biotechnology Information SAS : Statistical Analysis Systems RNA : Ribonucleic acid v
  9. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước ao nuôi 46 Bảng 3.4: Kết quả định danh sinh hóa của chủng vi khuẩn 9.4 55 vi
  10. DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mẫu lấy từ ao nuôi tôm ở tỉnh Trà Vinh 26 Hình 2.2: Mẫu để lắng trong bình chiết quả lê 27 Hình 2.3: Thử nghiệm Catalase 31 Hình 2.4: Thử nghiệm Voges Proskauer 32 Hình 2.5: Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột 33 Hình 2.6: Thử nghiệm TSI 35 Hình 2.7: Thử nghiệm Citrate 36 Hình 2.8: Thử nghiệm thủy phân Casein 37 Hình 2.9: Thử nghiệm Nitrate 39 Hình 2.10: Môi trường TSB có bổ sung NaCl 40 Hình 2.11: Môi trường TSB ở 500C và 600C 40 Hình 2.12: Quy trình tinh sạch chất kết tụ sinh học 44 Hình 3.1: Hoạt tính keo tụ sinh học của 22 chủng vi khuẩn phân lập 28 Hình 3.2: Kết quả định danh chủng 9.4 bằng phương pháp giải trình tự rDNA 31 Hình 3.3: Kết quả tách chiết hoạt tính keo tụ sinh học từ chủng 9.4 32 vii
  11. MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Qua nhiều năm, ngành nuôi tôm ở Việt Nam đã có những bước phát triển đáng kể đóng góp một phần không nhỏ trong việc phát triển kinh tế của đất nước. Tuy giá trị kinh tế của ngành nuôi trồng thủy sản mang lại khá lớn nhưng để phát triển lớn mạnh hơn nữa, ngành nuôi trồng thủy sản phải vượt qua không ít thách thức do thực tế với quy mô nuôi nhỏ lẻ, ít được đầu tư đồng bộ về cơ sở hạ tầng, kỹ thuật dẫn đến việc kiểm soát môi trường và dịch bệnh trong toàn vùng nuôi gặp nhiều khó khăn. Hơn nữa, những hiện tượng thời tiết cực đoan như nắng nóng kéo dài, mưa lớn, hạn hán, thay đổi cường độ và tần suất của bão do tác động của biến đổi khí hậu xuất hiện ngày càng nhiều ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường nước nuôi tôm dẫn đến sản lượng và chất lượng tôm nuôi giảm. Để khắc phục hiện tượng trên nhiều nghiên cứu đã được thực hiện như xử lý nước thải nuôi trong thủy sản bằng cụm vi tảo, ứng dụng men vi sinh, loại bỏ chất hữu cơ khỏi các vùng nước ven biển bị ô nhiễm bằng thực vật xử lý môi trường, Trong đó công nghệ biofloc được ứng dụng rộng rãi hơn cả. Công nghệ biofloc được Giáo sư Yoram Avnimelech khởi xướng ở Israel và do Robins McIntosh thực hiện đầu tiên trong nuôi tôm thương phẩm ở Belize. Công nghệ này thích hợp trong việc sản xuất thủy hải sản do trong nước ao nuôi có chứa nhiều cacbon, nitơ, photpho và các chất dinh dưỡng khác, cũng như có các đặc điểm riêng như ít kim loại nặng, nồng độ nitơ, photpho, SS và nhu cầu oxy hóa học thấp hơn (COD) thích hợp cho vi khuẩn keo tụ sinh học phát triển. Vì vậy hướng sử dụng vi khuẩn keo tụ để chúng có thể chuyển cơ chất (các chất thải hữu cơ) trực tiếp thành sinh khối vi khuẩn được xem là giải pháp hiệu quả, yêu cầu đầu tiên đặt ra khi ứng dụng các vi khuẩn có khả năng sản xuất keo tụ sinh học là phải có được nguồn chủng vi khuẩn thích hợp với điều kiện địa phương, và điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển cũng như hoạt tính của các chủng vi khuẩn này. Tuy nhiên, hiện nay các nghiên cứu trong nước về vấn đề này chưa được thực hiện nhiều. 1
  12. Chính vì vậy, đề tài “Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh” được thực hiện để giải quyết các vấn đề trên, tìm kiếm, phân lập, sàng lọc các chủng vi khuẩn bản địa có hoạt tính tạo keo tụ sinh học cao, có khả năng ứng dụng trong điều kiện Việt Nam. 2. Mục tiêu Phân lập và tuyển chọn các chủng có hoạt tính tạo keo tụ sinh học cao. Chủng vi khuẩn phải có tính an toàn và không gây bệnh. Có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường và chịu được các điều kiện khắc nghiệt, thích hợp với điều kiện địa phương và điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển cũng như hoạt tính tạo keo tụ của các chủng vi khuẩn này. 3. Nội dung nghiên cứu Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh. Xác định hoạt tính keo tụ sinh học. Sàng lọc hoạt tính keo tụ sinh học của các chủng. Định danh. Tinh sạch chất kết tụ sinh học. 4. Phạm vi nghiên cứu Các ao nuôi tôm ở Hòa Minh, xã Long Hưng 1, huyện Châu Thành, thành phố Trà Vinh. 2
  13. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về ngành nuôi trồng thủy sản Trà Vinh là tỉnh ven biển thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với tổng diện tích tự nhiên là 2.288,09 km2, dân số (năm 2010) là 1.005.856 người, mật độ dân số 440 người/km2. Ở vị trí nằm kẹp giữa 2 con sông lớn là sông Cổ Chiên và sông Hậu, một mặt giáp biển Đông (dài 65 km), có 2 cửa sông quan trọng là Cung Hầu và Định An, hệ thống sông, kênh, rạch chằng chịt với tổng chiều dài 578 km diện tích lưu vực tự nhiên là 21.265 ha và khoảng 98.597 ha ngập nước (từ 3-5 tháng/năm), có luồng cho tàu biển trọng tải lớn vào sông Hậu qua địa bàn huyện Duyên Hải đã được Thủ tướng phê duyệt. Vùng biển Trà Vinh rộng 45.536 hải lý vuông, nguồn lợi thủy sản rất phong phú với nhiều loài có giá trị kinh tế cao; trữ lượng (vùng cửa sông ven biển) trên 72.000 tấn, cho phép khai thác 50%, trữ lượng trong nội đồng từ 3.000-4.000 tấn, cho phép khai thác từ 2.000-2.500 tấn, Là tỉnh có vị trí quan trọng đối với nghề tôm cá đồng bằng sông Cửu Long, ngành nuôi trồng thủy sản ở Trà Vinh là một ngành kinh tế thủy sản tổng hợp cả trong đất liền, ven biển và trên biển về các mặt khai thác, nuôi trồng, chế biến và hậu cần dịch vụ Nghề cá. Trong thời gian qua, thủy sản đạt được sự tăng trưởng đáng khích lệ và có đóng góp quan trọng vào sự phát triển kinh tế - xã hội chung của địa phương. Tốc độ tăng trưởng bình quân giai đoạn 2006-2010 đạt 4,5%/năm về sản lượng thủy sản (trong đó khai thác đạt 7,4%/năm); đạt 3,5%/năm về giá trị sản xuất; đạt 16,8%/năm về kim ngạch xuất khẩu. Tính đến năm 2010, tổng sản lượng thủy sản của tỉnh đạt 160.053 tấn (trong đó khai thác 77.276 tấn); tổng giá trị sản xuất đạt 2.931 tỷ đồng; kim ngạch xuất khẩu đạt 77,2 triệu USD. Hơn nữa, phát triển thủy sản còn tạo ra nhiều việc làm cho lao động địa phương, góp phần nâng cao thu nhập, cải thiện mức sống và giải quyết nhiều vấn đề xã hội bức xúc khác của địa phương. Tuy nhiên, sự phát triển ngành thủy sản của tỉnh trong thời gian qua chủ yếu vẫn dựa trên những tiềm năng, thế mạnh sẵn có do còn gặp phải nhiều khó khăn như ô nhiễm môi trường, dịch bệnh, thời tiết là những yếu tố ngăn cản sự phát triển của ngành thủy sản trong thời kỳ tới. 3
  14. 1.2 Khó khăn của ngành nuôi trồng thủy sản Cũng như các ngành kinh tế khác ngành nuôi trồng thủy sản Trà Vinh đang gặp không ít những khó khăn như ảnh hưởng thời tiết và biến đổi khí hậu, mưa đến sớm nên độ mặn thấp, môi trường nuôi bị ô nhiễm nên dịch bệnh dễ xảy ra và khó khống chế làm ảnh hưởng đến sản lượng và chất lượng tôm. 1.2.1 Ảnh hưởng của dịch bệnh Trong năm 2017, tình hình dịch bệnh trên thủy sản nuôi cũng khá phức tạp, khoảng 190 ha nuôi tôm bị bệnh. Dịch bệnh trên tôm nuôi vẫn chưa được khống chế triệt để, tình hình dịch bệnh xảy ra rải rác suốt vụ nuôi, ở hầu hết vùng nuôi, gây thiệt hại lớn cho người nuôi, chủ yếu các bệnh do virus gây ra như: WSSV, MBV, YHV, TSV hay bệnh do vi khuẩn: bệnh phát sáng, bệnh gan thận mủ 1.2.1.1 Bệnh do virus a. Whiter Spot Syndrome Virus - WSSV Nguyên nhân: Do virus gây hội chứng đốm trắng (Whiter Spot Syndrome Virus) gây ra Cách thức: Virus gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ phận của tôm như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, virus này tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và năng lượng của tế bào. Thông qua quá trình này, số lượng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào. Khi quan sát dưới kính hiển vi các tế bào bị nhiễm virus thường có nhân phình to. Virus phát triển đến giai đoạn phá vỡ nhân và giết chết tế bào, virus lan truyền ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác và lại tiếp tục xâm nhập, tấn công. (Trần Thị Việt Ngân, 2002 ) Tác hại: Tôm bị bệnh đốm trắng dễ dàng phát hiện ở tôm nhỏ và sắp trường thành, thường xuất hiện ở tầng mặt và dạt vào bờ, bỏ ăn, hoạt động kém, các phần phụ bị tổn thương, nắp mang phồng lên và vỏ có nhiều sinh vật bám. Khi tôm bị bệnh có dấu hiệu sức khỏe yếu đồng thời các đốm trắng xuất hiện, tỷ lệ tôm phát bệnh trong vòng 3 – 10 ngày lên đến 100% và tôm chết hầu hết ở ao nuôi. 4
  15. b. Monodon Baculovirus MBV Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là virus type A Monodon Baculovirus Cách thức: Vào giai đoạn đầu, sau khi tế bào vật chủ nhiễm MBV nhân tế bào vẫn bình thường, chỉ có biến đổi nhỏ ở tế bào chất. Sau đó nhân tế bào sưng lên, xuất hiện thể ẩn trong nhân. Tế bào chất mất dần chức năng và hình thành giọt mỡ. Cuối cùng, nhân tế bệnh tăng gấp 2 lần đường kính bình thường và tăng 6 lần về thể tích, bên trong có 1 đến nhiều thể ẩn. Virus hủy hoại tế bào và bong tróc vào trong ống gan tụy kèm theo hội nhiễm vi khuẩn. Phá hủy mô gan tụy và màng ống tiêu hóa. Tác hại: Tôm chậm phát triển, ăn ít, có thể chuyển sang màu xanh xám, chết lên đến 100% sau 2 tuần khi có biểu hiện lâm sàng. Chủ yếu gây chết ở giai đoạn ấu trùng zoea, mysis và tôm giống nhỏ. Nhiễm tỷ lệ cao ở tôm nuôi ấu niên và trưởng thành nhưng rất ít gây chết. c. Yellow Head Virus - YHV Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là Yellow Head Virus. Cách thức: YHV thường nhiễm bệnh ở các cơ quan bạch huyết, các mô liên kết, tuyến sinh dục, buồng trứng, tế bào biểu bì ruột Bệnh YHV lây lan cả theo chiều ngang và chiều dọc. Lây lan theo chiều ngang khi tôm khỏe ăn thịt tôm nhiễm YHV, tôm nhiễm bệnh bài tiết ra môi trường nước hoặc một số tôm tự nhiên cũng sẽ nhiễm bệnh sẽ lây truyền cho các tôm trong ao nuôi. Khả năng lây lan theo chiều dọc từ bố mẹ sang con thông qua trứng bị nhiễm bệnh Tác hại: Khi tôm bị nhiễm bệnh thì biểu hiện đầu tiên là tăng đột ngột lượng thức ăn trong một vài ngày sau đó giảm ăn, và đa phần tôm dừng hẳn sau đó vài ngày. Giai đoạn đầu tiên thấy xuất hiện nhiều cá thể bơi lờ đờ trên mặt nước sát bờ ao, những cá thể này thường xuất hiện màu vàng nhạt trên giáp đầu ngực, mang có màu trắng nhợt hoặc có những sọc vàng đến nâu. Sau đó vài ngày (2-3 ngày) số lượng cá thể tăng nhanh chóng, cuối cùng tôm dừng ăn hẳn và có dấu hiệu chết trong ao. Đối với bệnh YHV tôm có thể chết tích luỹ đến 100% trong 7-10 ngày. d. Taura Syndrome Virus TSV 5
  16. Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là Taura Syndrome Virus Cách thức: Tôm bị hội chứng Taura thường diễn biến qua 3 thời kỳ của bệnh Thời kỳ cấp tính: Tôm postlarvae hay tôm lớn của loài P.vannamei khi bị bệnhcho thấy sự chuyển màu đỏ nhợt, đặc biệt là đuôi và các chân bơi, nên người nông dân Ecuador đã đặt tên cho bệnh này, khi xảy ra lần đầu, là bệnh đỏ đuôi - Tail Red Diseasse. Sự thay đổi màu là do sự phình to của sắc tố đỏ trong biểu mô vỏ. Sự dày mọng của các mép chân bơi, chân bò và đuôi tôm, là dấu hiệu đầu tiên của sự hoại tử cục bộ. Tôm bệnh còn có một số dấu hiệu khác như: mềm vỏ, ruột rỗng và thường chết khi lột xác. Khi dịch bệnh xảy ra, một số loài chim biển sẽ tấn công ao có tôm bệnh. Ở tôm he chân trắng (P.vannamei), giai đoạn cấp tính có tỷ lệ chết cao (40 – 90%). Trong khi đó loài P. stylirostris đã có sức đề kháng, chống lại sự cảm nhiễm của loại virus này. Thời kỳ chuyển tiếp: Dù giai đoạn chuyển tiếp của Taura Syndrome chỉ diễn ra trong trong thời gian ngắn, nhưng cũng thể hiện một số dấu hiệu: Có nhiều điểm bị thương tổn mầu nâu, đen trên vỏ kitin, màu đen là của sắc tố melanin, là sản phẩm cuối cùng của cơ chế hoạt động miễn dịch tự nhiên ở tôm. Ở thời kỳ này tôm bệnh có thể có, hay không có hiện tượng mềm vỏ và đổi màu đỏ của các phần phụ. Tôm bệnh ở thời kỳ này vẫn có thể bắt mồi bình thường. Thời kỳ mãn tính: Những con tôm bị bệnh do cảm nhiễm Taura Syndrome nhưng sống sót qua thời kỳ cấp tính và thời kỳ chuyển tiếp, thì sẽ bước sang thời kỳ mãn tính. Thời kỳ này có thể kéo dài cho đến cuối đời của những con tôm bị bệnh. Tôm bị bệnh ở thời kỳ mãn tính, sau vài lần lột xác, cơ thể trở lại bình thường, các dấu hiệu bệnh lý ở các thời kỳ trước biến mất, nhưng trong cơ thể tôm vẫn mang virus gây bệnh cho đến hết cuộc đời. Tuy nhiên, không có các dấu hiệu đặc thù để có thể dùng làm cơ sở sàng lọc những cá thể mang virus. Nếu các con tôm mang mầm bệnh thành thục, khi tham gia sinh sản có thể truyền virus gây bệnh Taura cho đàn ấu trùng. 6
  17. Tác hại: Bệnh TSV thường xảy ra ở giai đoạn ấu niên, từ 14-40 ngày tuổi. Tôm lớn cũng có thể xuất hiện bệnh này nếu giai đoạn ấu niên chưa bị bệnh. Bệnh này có thể gây chết từ 40-90% tùy theo kích cỡ tôm bị bệnh. Bệnh TSV có thể lây nhiễm theo 2 trục ngang và dọc. Đặc biệt sự lây nhiễm theo trục dọc rất phổ biến, do những con tôm bị bệnh ở thời kỳ mãn tính, sau vài lần lột xác, những dấu hiệu của bệnh TSV biến mất, nhưng trong cơ thể vẫn mang mầm bệnh. Tôm he chân trắng lại có thể thành thục trong ao, nên rất khó tránh nguy cơ đưa những con tôm mang mầm bệnh vào tham gia sinh sản, chúng sẽ sản sinh ra các đàn tôm giống mang mầm bệnh. Nguồn nước chứa các chất thải từ tôm bệnh và những con chim ăn tôm chết đã trở thành nguồn lây bệnh từ nơi này tới nơi khác. 1.2.1.2 Bệnh do vi khuẩn a. Bệnh phát sáng Nguyên nhân: Nhiễm vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio sp. chủ yếu và gây nguy hiểm nhất là Vibrio harveyi. Vibrio harveyi là vi khuẩn Gram âm, phát triển nhanh ở độ mặn 10-40ppt (mạnh nhất ở độ mặn 20-30 ppt). Các vi khuẩn này có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh. Bệnh có thể nhiễm từ các trại giống, ao ương sang ao thịt. Trong sản xuất giống, mầm bệnh được lây lan chủ yếu bằng đường ruột từ tôm mẹ sang ấu trùng trong giai đoạn sinh sản. Triệu chứng: Tôm yếu, bơi không định hướng, tấp mé bờ, phản ứng chậm chạp. Mang và thân tôm có màu sẫm, bẩn, thịt đục màu. Gan viêm và teo nhỏ, mất chức năng tiêu hóa cho tôm. Ăn giảm, không có thức ăn và phân trong ruột, phân tôm trong nhá ít. Đầu, thân tôm phát sáng màu trắng - xanh lục trong bóng tối. Quan sát bằng kính hiển vi thấy vi khuẩn phát sáng di chuyển trong cơ, máu tôm. Có đốm sáng rất nhỏ và nhiều trên phần cơ thịt của tôm. Tôm chậm lớn, có thể bị đóng rong ở mang và vỏ. Tôm chết đáy rải rác tuỳ vào mức độ nặng nhẹ của bệnh. Nếu nhiễm bệnh 100% đàn tôm trong giai đoạn 45 ngày nuôi đầu, có thể chết hàng loạt. Tôm ấu trùng nhiễm bệnh có màu trắng đục, nhiễm bệnh nạng thì lắng dưới đáy bể ương và chết hàng loạt. b. Hoại tử gan tụy 7
  18. Nguyên nhân: Bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy Necrotizing Hepatopancreatitis Peru - NHP gây ra bởi loài vi khuẩn gây bệnh, cơ thể loại Rickettsia, kích thước tương đối nhỏ, đa hình thể, gam âm nội bào bắt buộc Phương thức lan truyền bệnh theo phương ngang qua nguồn nước ao bị ô nhiễm (trong phân) và hoặc cảm nhiễm qua đường miệng (ăn thịt đồng loại). Triệu chứng: Các dấu hiệu lâm sàng về tổng quan có thể cho biết tôm nuôi nhiễm bệnh NHP: tuyến tiêu hóa (gan tụy) bị suy yếu từ nhợt nhạt đến trắng, quan sát có các dấu hiệu: lờ đờ, giảm hấp thụ thức ăn, hệ số chuyển đổi thức ăn cao, bỏ ăn, giảm tăng trưởng rõ, tỉ lệ trọng lượng chiều dài kém (“đuôi mỏng”), gầy mòn, vỏ mềm, thân nhũn, mang sậm hoặc đen, teo gan tụy. Kiểm tra ở mép ao, tôm bị nhiễm rỗng ruột và bề mặt nặng mùi do ngoại ký sinh gia tăng và các bệnh viêm nhiễm cơ hội khác (nghĩa là đốm đen). Bệnh do vi khuẩn liên quan đến vỏ bao gồm tổn thương loét biểu bì hoặc mòn phần phụ bị đen, và tế bào sắc tố phát triển dẫn đến xuất hiện rìa đen ở chân đuôi và chân bụng. Gan tụy bị teo và có một số đặc điểm sau: mềm và ướt, giữa đầy dịch, xanh xám và sọc đen (tế bào ống bị đen). Tỉ lệ chết tăng dần hơn 90% có thể xảy ra trong vòng 30 ngày khi bắt đầu có dấu hiệu lâm sàng nếu không được điều trị. c. Bệnh vi khuẩn dạng sợi Nguyên nhân: Do vi khuẩn dạng sợi là Leucothrix mucor, Thiothrix sp., Cytophaga sp., Flovobacterium sp. Triệu trứng: Tôm bệnh thường ở các giai đoạn Mysis và post larva. Bệnh nặng tôm đổi màu sang màu vàng, nâu, xanh lá cây. Tôm bơi lờ đờ, khó lột xác và chết hàng loạt. 1.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nước Những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường nước trong nuôi trồng tôm như: nguồn đạm từ thức ăn thừa, phân tôm, xác tảo chết tôm chết, các hóa chất tích tụ ở đáy ao nuôi tạo thành một lớp bùn hoặc do ô nhiễm nước mưa, lũ lụt cuốn theo các chất thải hữu cơ từ chăn nuôi, sinh hoạt cùng một số nguyên nhân khác. 8
  19. 1.2.2.1 Ô nhiễm từ nguồn Nitơ Khi nuôi trồng người ta thường sử dụng 2 dạng thức ăn chính sau: thức ăn xanh và thức ăn tinh tuy nhiên kết quả quan sát đã cho thấy rằng trong hệ thống thâm canh tôm thì chỉ có 15 – 20% thức ăn được dùng vào phát triển mô động vật, có tới 15% tổng lượng thức ăn hao hụt do không ăn hết và thất thoát. Dẫn đến phần dư thừa bị lắng đọng và bị phân hủy bởi các vi sinh vật yếm khí tạo ra các chất độc hại như CH4, NO2, NH3 , làm giảm lượng oxy hòa tan. Ô nhiễm nitơ chính là nguyên tố chủ yếu chiếm tỷ lệ lớn (30 – 40%) hình thành từ thức ăn thừa. Nitơ dưới dạng protein được tôm hấp thu và bài tiết dưới dạng NH3. NH3 sẽ được nhóm vi khuẩn Nitrosomonas sp. và Nitrosococcus sp. - - chuyển hóa thành NO2 . Trong quy trình nuôi tôm, hàm lượng NH3 và NO2 luôn có xu hướng tăng rất nhanh và gây độc làm tôm chậm lớn, dễ nhiễm bệnh, chết. - Ngoài ra NH3 và NO2 sẽ làm tảo trong ao nuôi phát triển đột biến, nhất là các loại tảo xấu, gây ra việc thiếu oxy trong nước ao nuôi trầm trọng vào ban đêm. Đặc biệt có thể làm sụp tảo nhanh chóng gây ra các ảnh hưởng nghiêm trọng cho tôm. 1.2.2.2 Ô nhiễm từ lớp bùn hình thành Hầu hết các chất trong nước nuôi tôm lắng đọng dưới đáy tạo thành một lớp bùn ô nhiễm. Thành phần lớp bùn chủ yếu là các chất hữu cơ như protein, lipid, các chất khoáng và vitamin, vỏ tôm lột xác, Lớp bùn này luôn ở trong tình trạng ngập nước yếm khí làm các vi sinh vật yếm khí phát triển mạnh, phân hủy các hợp chất trên tạo thành các sản phẩm như H2S, NH3, CH4 ảnh hưởng đến độ pH của nước và kìm hãm sự phát triển của tôm. Hơn nữa tôm luôn có xu hướng tránh khỏi vùng này và tập trung vào những khu vực sạch sẽ hơn. Do việc tập trung vào một vùng sẽ làm giảm bớt diện tích cho ăn, cũng như tăng tính cạnh tranh trong khi ăn. Nếu như toàn bộ đáy ao bị dơ bẩn thì con tôm bị bắt buộc phải sống trong môi trường ô nhiễm. Lớp bùn dơ bẩn còn tác động lên nước trong ao nuôi làm giảm chất lượng nước. 1.2.2.3 Ô nhiễm từ môi trường tự nhiên 9
  20. Khi mưa xuống nước chảy qua mặt đất đồng thời với dòng chảy đã hòa tan và cuốn theo nó các chất gây ô nhiễm nhu chất rắn, kim loại nặng, dầu mỡ, phân bón, thuốc trừ sâu, cùng với nước thải sinh hoạt từ các hộ dân cư, bệnh viện hay do các sản phẩm của hoạt động sống của sinh vật và kể cả xác chết của chúng đã gây ảnh hưởng xấu đến chất lượn nước nuôi thủy sản và sức khỏe của vật nuôi. 1.2.2.4 Một số nguyên nhân khác Dư lượng của các chất kháng sinh, dược phẩm, thuốc trị liệu và kích thích tố hay vật chất lơ lửng trong ao nuôi nhuyễn thể hay từ lồng bè, kim loại nặng, hóa chất từ các vùng công nghiệp, cũng là các nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn nước. 1.3 Vai trò của chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản. 1.3.1 Khái niệm Chế phẩm vi sinh hay probiotics là hỗn hợp vi sinh vật có lợi cho tôm bằng cách biến đổi hệ vi sinh vật xung quanh hoặc liên quan đến vật chủ, bằng cách nâng cao khả năng sử dụng thức ăn hay nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn, nâng cao đáp ứng của vật nuôi với mầm bệnh hay cải thiện chất lượng môi trường xung quanh thông qua quá trình phân hủy các chất hữu cơ trong nước nhan hơn (Moriaty, 1999; Tinh et al, 2007). 1.3.2 Thành phần 1.3.2.1 Vi khuẩn Gram dương Các vi sinh vật Gram dương, hiếu khí và sinh bào tử được sử dụng nhằm mục đích nâng cao chất lượng nước ao nuôi do ức chế hệ vi sinh vật gây hại trong nước và làm giảm số mầm bệnh. Một lợi ích trực tiếp trong việc sử dụng trực khuẩn này là làm giảm việc sử dụng kháng sinh, hóa chất trong việc nuôi trồng thủy sản và nâng cao tỷ lệ sống của các loài nuôi trồng thủy sản ( Irianto và Austin, 2002 ). 1.3.2.2 Vi khuẩn Gram âm Có khả năng ức chế Saprolenia và A. Salmocinida trên các loài cá có vây và ngăn chặn các mầm bệnh trên tôm từ Vibrio spp, đồng thời có tác dụng làm giảm tỷ lệ chết trên cá hồi ( Irianto và Austin, 2002 ), cải thiện chất lượng của ấu trùng cua, hàu và cá bơn, cải thiện quá trình tiêu hóa protein ở cá bơn khi được cung cấp qua 10
  21. con đường cho ăn, làm tăng tỷ lệ sống của ấu trùng Pacific oyster ( Irianto và Austin, 2002 ). 1.3.2.3 Nấm men Nấm men được ứng dụng phổ biến nhất với sự hiện diện của nấm men, nó sẽ bám dính vào ruột, làm nâng cao sự tiết enzyme amylase và kích thích các enzyme màng ở ấu trùng sau 27 ngày tuổi ( Irianto và Austin, 2002 ). 1.3.3 Vai trò 1.3.3.1 Cạnh tranh vị trí gắn kết Một trong những cơ chế ngăn ngừa sự hình thành tập đoàn vi khuẩn gây bệnh là sự cạnh tranh vị trí gắn kết trên ruột hay trên bề mặt các mô khác ( Verschuere et al, 2000; Gullian et al, 2003; Tinh et al, 2007 ). Nên nhớ rằng khả năng gắn kết trên ruột và bề mặt thành ruột là một quá trình rất cần thiết cho vi khuẩn cư trú trên ruột và chính là giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn khác ( Verschuere et al, 2000 ). Do đó, việc cạnh tranh vị trí gắn kết có thể được xem như là một hàng rào đầu tiên của hệ thống phòng chống lại sự xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh ( Tinh et al, 2007 ). 1.3.3.2 Sản xuất các chất ức chế Một quần thể vi sinh vật đều có thể tạo ra cơ chế hóa học có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế các quần thể vi sinh vật khác. Chính sự hiện diện của các vi khuẩn có khả năng sản xuất ra các chất ức chế trong ruột của vật chủ tạo nên một hàng rào bảo vệ chống lại các bệnh cơ hội ( Verschuere et al, 2000; Tinh et al, 2007 ). Các nhân tố ức chế được các vi khuẩn probiotic sản xuất ra bao gồm: kháng sinh, bacteriocin, siderophone, lysozyme, protease, hydroperoxide, thay đổi giá trị pH bằng cách tạo ra các acid hữu cơ ( Verschuere et al, 2000 ). 1.3.3.3 Cạnh tranh các nguồn năng lượng Sự cạnh tranh diễn ra giữa vi sinh vật probiotic và các vi khuẫn gây bệnh chủ yếu là sự cạnh tranh các ion sắt vì hầu như tất cả các vi sinh vật đều cần sắt để phát triển ( Verschuere et al, 2000 ). Siderophore là một tác nhân giữ ion sắt chuyên biệt có trọng lượng phân tử thấp có khả năng phân hủy sắt kết tủa và biến nó thành sắt 11
  22. mà vi sinh vật có thể sử dụng được. Do đó, các chũng vi khuẩn vô hại có thể sản xuất siderophore được sử dụng như probiotic cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh có thể sản xuất siderophore đồng thời cạnh tranh các ion sắt trong môi trường ion sắt hiện diện hạn chế ( Verschuere et al, 2000; Tinh et al, 2007 ). Hiệu quả của các vi sinh vật probiotic này làm tăng tính kháng Vibrio đã được kiểm chứng trên ấu trùng cá bơn ( Verschuere et al, 2000 ) 1.3.3.4 Tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng Hệ vi sinh vật đường ruột đóng vai trò rất quan trọng đối với khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ. Do đó, để tăng cường khả năng hấp thu chất dinh dưỡng ở vật chủ đòi hỏi hệ vi sinh vật đường ruột phải hoạt dộng tích cực. Trong một số nghiên cứu về tác dụng tăng cường hấp thu chất dinh dưỡng của vi sinh vật probiotic trong ruột của vật chủ, nấm men nâng cao sự ổn định của hệ vi sinh vật đường ruột vì chúng hoạt động như một nhà sản xuất polyamine (Tinh et al, 2007 ). 1.3.3.5 Ảnh hưởng đến hệ thống nước xanh Sự bổ sung chế phẩm probiotic trong đó có sự hiện diện của vi nấm, như bổ sung vi nấm Isochrysis galbana vào môi trường nước trong quá trình nuôi cá chẽm có thể làm giảm tỷ lệ chết của ấu trùng cá chẽm. Ở ấu trùng của tôm, vi nấm có khả năng kháng khuẩn nhất là hoạt tính chống lại các chủng Vibrio spp gây bệnh trên tôm 1.3.3.6 Nâng cao đáp ứng miễn dịch Các chất kích thích miễn dịch là các hợp chất hóa học hoạt hóa hệ thống miễn dịch của vật nuôi để chống lại sự xâm nhiễm của virus, vi khuẩn, nấm và can thiệp vào hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh và nâng cao chất lượng nước ao nuôi. 1.3.4 Ứng dụng chế phẩm vi sinh trong ổn định xử lý nước Có khả năng tiêu diệt vi trùng gây bệnh làm cho vi trùng gây bệnh không tồn tại lâu dài và phát triển trong môi trường nước. Giúp giảm các chỉ tiêu như: COD, BOD, TSS, NH4, NH3, NO2 12
  23. Làm tăng khả năng sự tạo bông và kết lắng của bùn hoạt tính, tăng mật độ vi sinh vật hữu ích trên các màng đệm sinh học giúp tăng cường hiệu quả trong các hệ thống xử lý nước thải, giúp quá trình làm sạch được ổn định và đạt chỉ tiêu xả thải, phân hủy các mùn bã hữu cơ, xử lý khí độc trong ao nuôi tôm và làm sạch môi trường, tăng hệ men vi sinh có lợi trong đường ruột của tôm, cá nuôi giúp tiêu hóa thức ăn tốt hơn. Cuối cùng là tác dụng chữa trị và phòng một số bệnh phổ biến trên thủy sản. 1.4 Vi khuẩn keo tụ sinh học và vai trò trong nuôi trồng thủy sản 1.4.1 Khái niệm keo tụ sinh học Keo tụ sinh học (Bioflocculant) là sản phẩm được hình thành trong quá trình phát triển của vi khuẩn, nấm, tảo (Desouky và cộng sự, 2008). Protein, polysaccharide, glycoprotein, nucleic acid và một vài đại phân tử khác là thành phần chính của chất keo tụ sinh học (Lin J và Harichund C, 2012). 1.4.2 Giai đoạn hình thành Sự keo tụ bao gồm 2 giai đoạn: Keo tụ ẩn: bằng mắt thường quan sát vẻ bên ngoài ta không thể nhận biết bất cứ một biến đổi nào, mặc dù trong thực tế các hạt keo đã chập lại với nhau tập hợp thành các hạt lớn hơn. Keo tụ rõ: là giai đoạn thấy rõ sự biến đổi về màu sắc, ánh quang rồi chuyển đổi đến trạng thái đục mờ và cuối cùng tạo ra kết tủa. 1.4.1 Vi khuẩn sản xuất keo tụ sinh học Vi khuẩn sản xuất chất keo tụ sinh học là những loài vi khuẩn có thể sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường để tổng hợp các hợp chất đa phân tử trong tế bào dưới sự hoạt động của các enzyme đặc biệt, sau đó chúng có thể được bài tiết ra ngoài và tồn tại trong môi trường hoặc trên bề mặt vỏ tế bào vi khuẩn, các hợp chất này có khả năng tạo sự kết tụ với các chất khác nhau và tạo thành một khối nhầy lắng xuống dưới đáy Gần đây, chất keo tụ sinh học được ứng dụng nhiều trong việc loại bỏ chất rắn lơ lửng ở các ngành công nghiệp, sinh hoạt, vật liệu xây dựng, xử lý nước thải 13
  24. chăn nuôi vì hiệu quả cao, ít tốn kém, không độc hại với con người và môi trường. Sự kết tụ các vật chất này giúp làm giảm các chỉ tiêu như COD và một phần độ đục của nước thải trước khi nước thải được xử lý bằng các phương pháp khác. 14
  25. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Thời gian Từ ngày 1 tháng 4 năm 2018 đến ngày 29 tháng 7 năm 2018 2.1.2 Địa điểm thu mẫu Mẫu được thu ở Hòa Minh, xã Long Hưng 1, huyện Châu Thành, thành phố Trà Vinh 2.1.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu Phòng Thí nghiệm Viện Khoa học Ứng dụng Hutech, Trung tâm Đào tạo nhân lực chất lượng cao Hutech, Khu Công Nghệ cao TP.HCM, Phường Hiệp Phú, Quận 9, TP.HCM. 2.2 Vật liệu 2.2.1 Mẫu Mẫu được thu ở Hòa Minh, xã Long Hưng 1, huyện Châu Thành, Thành phố Trà Vinh. Số lượng mẫu: 13 mẫu, trong đó 4 mẫu được lấy từ các ao đang trong quá trình nuôi, 9 mẫu lấy từ các ao đang trong giai đoạn nghỉ 2 tuần. 2.2.2 Hóa chất và môi trường 2.2.2.1 Hóa chất NaCl (Trung Quốc) NaOH 2N (Trung Quốc) HCl 2N (Trung Quốc) Kaolin (Trung Quốc) CaCl2 (Trung Quốc) Glycerol (Trung Quốc) Peptone (Trung Quốc) Yeast extract (Himedia, Ấn Độ) Meat extract (Himedia, Ấn Độ) 15
  26. Urea (Trung Quốc) D-Glucose (Trung Quốc) Cồn 70o, cồn 96o (NH4)2SO4 (Trung Quốc) KH2PO4 (Trung Quốc) K2HPO4.3H2O (Trung Quốc) MgSO4.7H2O (Trung Quốc) 2.2.2.1 Môi trường TSB (Himedia-Ấn Độ) TSA (Himedia-Ấn Độ) 2.3 Dụng cụ và thiết bị 2.3.1 Dụng cụ Cốc 250ml Erlen 250ml Pipetman 100µl, 1000µl Pipet 5ml, 20ml Bóp cao su Đầu típ Đũa thủy tinh Bao hấp, giấy gói, thun Đèn cồn Bông không thấm, bông thấm 2.3.2 Thiết bị Que cấy vòng Bình chiết quả lê Máy lắc tròn SK-O330-Pro Cân phân tích A&D HR – 200 (Nhật) Nồi hấp khử trùng Autoclave ES – 315, Tomy (Nhật) 16
  27. Tủ ủ Sanyo MIR – 162, Sanyo (Nhật) Máy cô quay LABOROTA 4001– efficient, Heidolph (Đức) Que cấy vòng Bình chiết quả lê Máy lắc tròn SK-O330-Pro Cân phân tích A&D HR – 200 (Nhật) Máy quang phổ kế JASCO 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu Các mẫu được thu ở vị trí gần đáy ao bằng cách sử dụng gàu, mẫu nước sẽ bao gồm các phần nước và bùn. Sau khi thu, mẫu sẽ được chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản ở 40C. Các mẫu nước được cho vào phễu chiết quả lê và phần lắng sẽ được thu bằng erlen đã được hấp vô trùng. Hình 2.1: Mẫu lấy từ ao nuôi tôm ở Hình 2.2: Mẫu để lắng trong bình chiết tỉnh Trà Vinh quả lê 2.3.2 Phương pháp phân lập Mẫu nước ao nuôi được để lắng trong phễu chiết quả lê trong vòng 48 giờ. Sau đó thu phần mẫu lắng. Tiến hành pha loãng và cấy trải mẫu ở các nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 trải trên môi trường nuôi cấy. Ủ ở 300C trong 72h, chọn khuẩn lạc đặc trưng và tiến hành làm thuần bằng cách cấy ria trên môi trường nuôi cấy. 17
  28. 2.3.3 Phương pháp nhuộm Gram Làm tiêu bản Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên lame Dùng que cấy lấy một chút sinh khối Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn Nhuộm tiêu bản Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh trong 1 phút Rửa nước Nhuộm lugol trong 1 phút Rửa nước Tẩy cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu Rửa nước Nhuộm bổ sung fuchsin hoặc safranin từ 10 – 30 giây Rửa nước Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu 2.3.4 Phương pháp nhuộm bào tử Dùng dây cấy vòng vô trùng lấy sinh khối vi khuẩn cần xác định làm vết bôi trên lame Đặt một cốc nước trên bếp từ và đun sôi. Sau đó đặt lên trên miệng cốc một miếng giấy lọc Cho dung dịch Malachite Green 5% vào vết bôi và đặt lame có sinh khối của vi khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong thời gian 5 phút Sau đó rửa vết bôi bằng nước cất trong khoảng thời gian 30 giây Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fuchsin trong khoảng 60-90 giây Rửa lại bằng nước rồi thấm khô Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X 18
  29. 2.3.5 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.5.1 Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, dễ thực hiện, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điểu kiện môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (từ 30C-50C) để bảo quản. Quá rình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, nhằm đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền 1 lẩn. Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ ở nhiệt độ 40C. Sau 1 đến 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng mới đem đi ủ, thời gian ủ từ 48-72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. (Nguyễn Văn Dũng và Dương Văn Hợp, 2007) 2.3.5.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mãy bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khác phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và tan nhanh như glycerol. Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C. (Nguyễn Văn Dũng và Dương Văn Hợp, 2007) 2.3.6 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật Mục đích: nhằm hoạt hóa các vi khuẩn được giữ giống phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản 19
  30. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo đầy đù các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa sinh vật và môi trường. Cách tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay glycerol 40%, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB trong điều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy ( Lê Ngọc Thùy Trang, 2013 ). Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ ở bước sóng 600 nm. Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (Công thức McFahrland) 9 Mật độ =OD600 nm x 1,02 x10 (cfu/ml) 2.3.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính keo tụ sinh học Kiểm tra khả năng kết tụ của các dòng vi khuẩn bằng hỗn hợp gồm 93 ml dung dịch Kaolin (5 g/l); 5 ml dung dịch CaCl2 1%, pH =7; 2 ml dịch vi khuẩn. Hỗn hợp được lắc trên máy lắc xoay vòng ở tốc độ 180 vòng/phút trong 1,5 phút rồi 80 vòng/phút trong 3 phút , để lắng 10 phút, sau đó lấy phần trong ở trên đem đo OD ở bước sóng 550 nm. Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng thay chủng vi khuẩn bằng nước cất vô trùng. Tỷ lệ kết tụ được tính theo công thức: OD đối chứng−OD mẫu Tỷ lệ keo tụ (%) = x 100% OD đối chứng 2.3.8 Phương pháp định danh 2.3.8.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa a) Thử nghiệm Catalase Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong vi sinh vật 20
  31. Cơ sở sinh hóa Enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí có hệ thống cytochrome và những vi sinh vật không có hệ thống cytochrome thì cũng không có catalase nên không có khả năng phân hủy hydroperoxide (H2O2). Catalase là một homoprotein gồm 4 cấu tử protein và một nhân Fe2+ có khả năng hân hủy hydroperoxide là một phân tử có độc tính cao trong tế bào, thành H2O và để giải độc cho tế bào. Trong phản ứng này, một phân tử hydroperoxide đóng vai trò là một chất cho điện tử và một phân tử hydroperoxide khác đóng vai trò là một chất nhận điện tử. Phân tử H+ từ chất cho điện tử sẽ khử cơ chất tạo nước và oxy phân tử. Cách tiến hành Hóa chất sử dụng là hydroperoxide 30% được giũ lạnh trong chai màu, tránh ánh sáng, dung dịch đệm phosphate pH 7,4. Có thể thực hiện phản ứng catalase theo các cách: Thử trên lame: dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối đặt trên lame. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật. Ghi nhận lại sự sủi bọt nếu có. Thử trong ống nghiệm thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp 1 ml H2O2 30% lên sinh khối của vi sinh vật. Ghi nhận lại sự sủi bọt. Đọc kết quả Thử nghiệm (+): có hiện tượng sủi bọt khí Thử nghiệm (-): không có hiện tượng sủi bọt khí Hình 2.3: Thử nghiệm Catalase b) Thử nghiệm Voges Proskauer (VP) Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetylmethylcarbimol (acetoin) trong quá trình lên men glucose. 21
  32. Cơ sở sinh hóa Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Ở tế bào vi sinh vật, sự phân hủy glucose tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đó có thể chia vi sinh vật thành 2 nhóm theo 2 con đường chuyển hóa pyruvic khác nhau nhu sau: nhóm trao đổi không tạo thành 2,3-butanediol như E.Coli là nhóm VP (-) và nhóm trao đổi tạo thành 2,3-butanediol, như Klebsiella là nhóm VP (+). Tuy nhiên, phản ứng VP nhắm mục dích phát hiện acetoin là một tiền chất của 2,3-butanediol. Vì acetoin là tiền chất của 2,3-butanediol nên trong quá trình nuôi cấy tích lũy rất ít. Để dễ dàng cho quá trình phát hiện, vi dinh vật phải được nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí. Để phát hiện acetoin trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, α-naphtol được sử dụng như một thuốc thử hát hiện môi trường kiềm mạnh được tạo ra KOH 40% được cho vào môi trường thử nghiệm. Cách tiến hành Cấy vi sinh vật vào môi trường glucose phosphate (MR-VP broth), ủ ở nhiệt độ 300C trong 2-5 ngày. Thêm vào canh khuẩn dịch thuốc thử α-naphtol 5% trong cồn và dung dịch KOH 40% với tỷ lệ 3:1. Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút. Đọc kết quả Thử nghiệm (+): xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu Hình 2.4: Thử nghiệm Voges Proskauer 22
  33. c) Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột Nguyên tắc: Nhằm xác định xem vi sinh vật có khả năng sản sinh hệ enzyme amylase thủy phân tinh bột thành glucose hay không. Cơ sở sinh hóa Tinh bột là một đại phân tử có cấu trúc từ các đơn phân là glucose gồm có hai dạng amylose và amylopectin. Amylose là phân tử tinh bột dạng thẳng không phân nhánh, cấu tạo từ 200-300 đơn vị, trong khi đó amylopectin là phân tử nhánh. Tinh bột dễ dàng bị thủy phân bởi các vi sinh vật có khả năng sản sinh enzyme amylase để tạo thành dextrin, maltose và glucose. Để phát hiện khả năng thủy phân tinh bột, sử dụng thuốc thử lugol là chất chỉ thị. Khi có sự hiện diện của tinh bột, iodine tạo phức màu nâu. Khi tinh bột bị thủy phân, lugol không tạo phức nên màu nâu biến mất. Cách tiến hành Trong thử nghiệm này sử dụng môi trường Starch Agar với phương pháp cấy điểm (agar spot). Sau đó tiến hành ủ ở 300C trong 24 giờ rồi đổ dung dịch lugol vào. Nếu xung quanh cấy điểm không hình thành màu nâu thì kết quả đó dương tính và ngược lại. Đọc kết quả Thử nghiệm (+): không xuất hiện màu nâu xung quanh điểm cấy Thử nghiệm (-): toàn bộ đĩa xuất hiện màu nâu phức hợp của iodine và tinh bột Hình 2.5: Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột 23
  34. d) Thử nghiệm trên môi trường TSI Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn cacbonhydrate có mặt trong môi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas trong môi trường Cơ sở sinh hóa Môi trường TSI là môi trường rắn sử dụng trong thử nghiệm sinh hóa. Môi trường TSI có các nguồn carbohydrate: lactose 1%, glucose 0,1% và sucrose 1%. Có 3 trường hợp xảy ra khi nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường TSI: chỉ lên men glucose, lên men cả glucose lẫn lactose và không lên men được cả 2 nguồn cacbonhydrate này Nếu vi sinh vật lên men được glucose sau 18-24 giờ nuôi cấy: phần nghiêng của môi trường pH có kiềm và phần sâu có pH acid. Hiện tượng này được quan sát khi có chất chỉ thị pH trong môi trường và chất chỉ thị pH thường được sử dụng là phenol red. Điều này có nghĩa là trên phần nghiêng, một lượng nhỏ glucose được sử dụng hết hoàn toàn, sau đó chúng sử dụng đến pepton làm giải phóng NH3→pH kiềm→phần nghiêng có màu đỏ. Trong khi đó, ở phần sâu có sự lên men kỵ khí glucose→các acid hữu cơ→pH acid→phần sâu có màu vàng. Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả hai nguồn carbohydrate: cà phần sâu lẫn phần nghiêng đều có tính acid sau 18-24 giờ nuôi cấy→cả phần nghiêng lẫn phần sâu đề có màu vàng vì lượng đường lactose đủ để vi sinh vật sử dụng trong thời gian này. Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả 2 nguồn cabonhydrate trên: khi đó nguồn peptone trở thành nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật→làm môi trường có màu đỏ. Trong môi trường nếu có tạo thành H2S sẽ làm đen môi trường nuôi cấy. Còn trường hợp có sinh gas thì sẽ tích tụ trong môi trường và có thể làm vỡ thạch hay tạo thành các bọt khí bên trong. 24
  35. Cách tiến hành Môi trường TSI được chuẩn bị trong các ống nghiệm với phần nghiêng cách nắp ống khoảng 2,5 cm, phần sâu có chiều cao khoảng 2,5 cm. Dùng que cấy thẳng đưa vi sinh vật vào phần sâu của ống nhưng không đụng đáy ống, sau đó cấy ria lên phần nghiêng. Ủ các ống nghiệm đã cấy ở 300C trong 18-24 giờ. Ghi lại các biểu hiện ở phần sâu, phần nghiêng, sinh H2S và sinh gas. Hình 2.6: Thử nghiệm TSI e) Thử nghiệm Citrate Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất hay không. Cơ sở sinh hóa Sự biến dưỡng citrate thường thông qua sự kết hợp với acetylCoA thành oxaloacetate để vào chu trình Krebs. Sản phẩm biến dưỡng citrate thay đổi tùy pH của môi trường. Khi pH tăng môi trường chuyển sang kiềm, lượng formate và acetate tăng trong khi lactate và CO2 giảm. Ở pH trung tính, sản phẩm chủ yếu là CO2 và acetate, còn ở pH acid, sản phẩm tạo ra chủ yếu là acetoin và lactate. Như vậy, sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. 25
  36. Mặt khác, các vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate như là carbon duy nhất có khả năng sử dụng muối ammonium như làm nguồn nitơ duy nhất→sinh ra NH3 làm kiềm hóa môi trường. Như vậy, trong môi trường thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất có chứa đạm ở dạng muối ammonium sẽ làm tăng pH của môi trường thể hiện qua sự đổi màu chỉ thị pH trong môi trường. Cách tiến hành Môi trường sử dụng trong thử nghiệm này là môi trường Simmon citrate agar hay môi trường lỏng Koser. Cấy vi sinh vật lên môi trường thạch nghiêng SCA, ủ 300C trong 24 giờ rồi đọc kết quả. Đọc kết quả Thử nghiệm (+): môi trường chuyển sang màu xanh dương Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu Hình 2.7: Thử nghiệm Citrate f) Thử nghiệm thủy phân casein Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định xem vi sinh vật có khả năng thấm qua màng nguyên sinh chất của vi khuẩn. Do đó, trước khi casein vi khuẩn sử 26
  37. dụng, nó phải được bẻ gãy thành các amino acid. Vi khuẩn thực hiện điều này bằng cách sản xuất enzyme thủy phân protein (caseinase) để thủy phân protein thành amino acid giúp vi khuẩn hấp thụ. Cách tiến hành: Sử dụng môi trường Skim Milk Agar và phương pháp cấy điểm. Nếu vi sinh vật phân giải được casein sẽ hình thành vòng trong suốt xung quanh điểm cấy vi khuẩn. Đọc kết quả Thử nghiệm (+): hình thành vòng phân giải trong suốt. Thử nghiệm (-): không hình thành vòng phân giải. Hình 2.8: Thử nghiệm thủy phân Casein g) Thử nghiệm nitratase Nguyên tắc: Nhằm thử nghiệm khả năng vi sinh vật khử nitrate thành nitrite hoặc nitơ tự do. Tất cả các quá trình diễn ra trong tế bào vi sinh vật dưới sự xúc tác của enzyme nitratase. Cơ sở sinh hóa Sự khử natrate thành nitrite hay nitơ tự do thường diễn ra trong điều kiện kỵ khí. Oxy từ nitrate được coi là chất nhận điện tử và proton cuối cùng. Hầu hết các vi sinh vật hiếu khí khử được nitrate là các vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, chỉ thực hiện quá trình khử nitrate trong điều kiện không có oxy phân tử. 27
  38. Sản phẩm cuối cùng của sự khử này là: nitrite, ammonia, nitơ phân tử, hydroxylamine hay nitric oxide. Sự hình thành sản phẩm cuối cùng phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật và điều kiện môi trường. Cách tiến hành và đọc kết quả Có thể thực hiện bằng các cách sau: Cách 1: cấy vi sinh vật vào môi trường nitrate broth và ủ qua đêm Cách 2: khuếch tán dày đặc vi sinh vật thử nghiệm vào trong dung dịch đệm sodium nitrate 0,01M trong dung dịch đệm phosphate pH 7,0 và ủ ở 300C trong 24 giờ. Cách 3: nhỏ vài giọt dung dịch sodium nitrate 1% vào môi trường canh khuẩn dày đã được nuôi cấy trước đó. Ủ 300C trong 4 giờ. Acid hóa các dung dịch thử nghiệm bằng vài giọt HCl 1N, thêm vào mỗi thử nghiệm 0,5 ml dung dịch sulphanilamide 0,2% và 0,5 ml N-napthylethylenediamine hydrochloride, tất cả các thuốc thử này đều phải bảo quản trong tủ lạnh. Nếu có xuất hiện màu hồng là dấu hiệu nitratase dương tính. Nếu không có xuất hiện màu hồng có thể có một trong 2 trường hợp như sau: Không có nitratse trong môi trường, nitrate vẫn còn tồn tại: Thêm vào đó một lượng rất nhỏ bụi kẽm (Zn) vào các thử nghiệm để chuyển nitrate thành nitrite, khi đó màu hồng sẽ xuất hiện. Nitrate không còn trong môi trường: thêm bụi Zn vào môi trường vẫn không xuất hiện màu hồng. Hình 2.9: Thử nghiệm Nitrate 28
  39. h) Phương pháp đánh giá khả năng chịu mặn Mục đích của thử nghiệm: Thử nghiệm mục đích khảo sát sự chịu mặn của vi khuẩn trên môi trường TSB có bổ sung thêm NaCl ở các nồng độ khác nhau. Cách thực hiện thử nghiệm: Chủng vi khuẩn được tăng sinh trong môi o trường TSB ở 37 C trong 24 giờ. Sau đó đo OD600nm để xác định mật độ và pha loãng về mật độ 108 cfu/ml. Tiến hành đánh giá khả năng chịu mặn trong môi trường có bổ sung NaCl với các nồng độ 7%. Sau khi cấy vi khuẩn vào các môi trường khảo sát nuôi cấy lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 37oC. Hình 2.10: Môi trường TSB có bổ sung NaCl. i) Phương pháp đánh giá khả nặng chịu nhiệt Mục đích của thử nghiệm: Thử nghiệm mục đích khảo sát sự chịu nhiệt của vi khuẩn ở các mức nhiệt độ khác nhau trên môi trường TSB có bổ sung thêm NaCl 1,5%. Cách thực hiện thử nghiệm: Chủng vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường TSB + NaCl ở 37oC trong 24 8 giờ. Sau đó đo OD600nm để xác định mật độ và pha loãng về mật độ 10 cfu/ml. Tiến hành đánh giá khả năng chịu nhiệt ở 500C và 650C. 29
  40. Hình 2.11: Môi trường TSB ở 500C và 600C 2.3.8.2 Định danh bằng sinh học phân tử Định danh bằng giải trình tự rDNA 16S tại công ty Nam Khoa Biotek. 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu Phần mềm xử lý thống kê SAS 9.1 kết hợp với Microsoft Excel 2010. 2.4 Bố trí thí nghiệm 2.4.1 Sơ đồ thí nghiệm Nguồn mẫu nước ao nuôi tôm tỉnh Trà Vinh Xử lý mẫu Pha loãng và phân lập Sàng lọc các chủng có hoạt tính keo tụ sinh học Định danh Tinh sạch 2.4.2 Quy trình phân lập Mẫu được để lắng trong phễu chiết quả lê trong vòng 48 giờ. Sau đó thu phần cặn. Mẫu cặn sau đó được pha loãng ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, ở mỗi nồng 30
  41. độ pha loãng hút 0,1 ml cho vào môi trường nuôi cấy. Ủ 300C trong 72h và tiến hành chọn các khuẩn lạc trên môi trường dựa vào các đặc điểm về hình dạng, hình chiếu, rìa và màu sắc. Sau đó tiến hành cấy thuần trên môi trường nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập được tiến hành nhuộm Gram và nhuộm bào tử để chọn những chủng vi khuẩn Gram (+) và sinh bào tử. Sau đó, các chủng này được bảo quản trong glycerol 20% để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.4.3 Sàng lọc hoạt tính keo tụ sinh học các chủng sau định danh sơ bộ Sau khi đã định danh sơ bộ tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học keo tụ của các chủng bằng cách khảo sát khả năng keo tụ của các chủng vi khuẩn bằng hỗn hợp gồm 93 ml dung dịch kaolin (5 g/l); 5 ml dung dịch CaCl2 1%, pH 7,0; 2 ml dịch vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml. Hỗn hợp được lắc trên máy lắc xoay vòng ở tốc độ 180 vòng/phút trong 1,5 phút rồi 80 vòng/phút trong 3 phút, để lắng 10 phút, sau đó hút dịch trong đo OD ở bước sóng 550 nm. Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng thay chủng vi khuẩn bằng nước cất vô trùng. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Tỷ lệ kết tụ được tính theo công thức: OD đối chứng−OD mẫu Tỷ lệ keo tụ (%) = x 100% OD đối chứng Từ các kết quả thu được chọn ra chủng có hoạt tính keo tụ sinh học mạnh nhất. 2.4.4 Định danh các chủng vi khuẩn sau khi sàng lọc Sau khi tiến hành sàng lọc thu được chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học mạnh nhất, chúng tôi tiến hành định danh để xác định đó là chủng vi khuẩn nào. Tiến hành định danh bằng 2 phương pháp, đó là định danh bằng các thử nghiệm sinh hoá và giải trình tự rDNA 16S 2.4.4.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa Vi khuẩn được tiến hành tăng sinh trong môi trường TSB + NaCl 1,5% trong thời gian 24 – 48h, sau đó tiến hành các thử nghiệm sinh hoá được trình bày ở Bảng 2.1. 31
  42. Bảng 2.1 : Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa STT Thử nghiệm 1 Nhuộm Gram 2 Khả năng sinh bào tử 3 Thử nghiệm Catalase 4 Thử nghiệm Voges Proskauer 5 Khảo sát sự tăng trưởng ở 500C 6 Khảo sát sự tăng trưởng ở 650C 7 Tăng trưởng trong môi trường 7% NaCl 8 Khả năng sinh acid và sinh gas 9 Thử nghiệm Nitrate 10 Thử nghiệm Citrate 11 Khả năng thủy phân tinh bột 12 Khả năng thủy phân casein 2.4.4.2. Định danh bằng sinh học phân tử Chủng vi khuẩn có hoạt tính tốt sau khi được định danh sinh hoá sẽ được định danh bằng giải trình tự rDNA 16S tại Công ty Nam Khoa Biotek. 32
  43. 2.4.5 Bước đầu khảo sát quy trình thu hồi hợp chất keo tụ sinh học từ vi khuẩn 2.4.5.1 Sơ đồ quy trình tinh sạch Vi khuẩn khảo sát Tăng sinh Môi trường lên men tối ưu sau 5 ngày ủ ở 300C Nước cất Ly tâm 0 vô trùng 1ml (6000v/phút x 30 phút, 4 C) Dịch sau ly tâm Bỏ cặn Ly tâm (6000v/phút x 15 phút, 40C) Ethanol tuyệt Thu dịch nổi Bỏ đối lạnh 2ml cặn Để yên ở 40C, 12 giờ Thu tủa Cô cạn ở 400C-450C Chất keo tụ sinh học dạng thô Hình 2.12: Quy trình thu hồi hợp chất keo tụ sinh học 2.4.5.2 Thuyết minh quy trình Vi khuẩn sau khi được tăng sinh trong môi trường TSB + NaCl 1,5% sẽ được cấy vào môi trường lên men tối ưu ở mật độ 108 cfu/ml. Sau khi ủ 5 ngày đem đi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 40C để loại bỏ tế bào và thu 33
  44. dịch. Sau khi thu dịch, tiến hành bổ sung nước cất vô trùng vào dịch mẫu với tỷ lệ 1:1 (v/v) rồi ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Sau khi ly tâm, loại bỏ cặn và thu dịch, đồng thời bổ sung 2 ml ethanol tuyệt đối lạnh và để yên ở nhiệt độ 40C trong 12 giờ. Sau đó, hỗn hợp mẫu được mang đi cô cạn để đuổi dung môi ethanol ở nhiệt độ từ 400C-450C đến khối lượng không đổi. Phần cặn thu được sau quá trình cô cạn sẽ được đem đi cân để xác định khối lượng. 34
  45. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước ao nuôi Từ 13 mẫu nước ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh trong đó, có 4 ao đang trong quá trình nuôi, 9 ao đang trong quá trình nghỉ 2 tuần, chúng tôi đã phân lập được các chủng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 3.1: Bảng 3.1 : Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước ao nuôi Mã số Hình thái khuẩn lạc Gram Hình nhuộm Gram MS 1.1 Tròn, lồi, trong suốt, rìa đều, + bóng, đường kính 0,5mm Hình cầu, không có sinh bào tử MS 1.4 Tròn, lồi, bóng, vàng, rìa đều, + đường kính ≥ 0,5 mm Hình que, có sinh bào tử 35
  46. MS 1.5 Tròn, dẹt, rìa phân thùy, trắng + đục, đường kính ≥ 0,5 mm Hình que, không có sinh bào tử MS 1.6 Tròn, lồi bóng, trong trắng, rìa + đều, đường kính > 0,5mm Hình cầu, không có sinh bào tử MS 1.7 Tròn, lồi, bóng, rìa phân thùy, + trắng trong, tâm trắng đục, đường kính ≈ 0,5mm Hình que, không có sinh bào tử MẪU MS 2.1 Tròn, dẹt, trắng đục, rìa đều, + NƯỚC tâm vàng nhạt, đường kính ≥ AO 2mm NUÔI Hình que, có sinh bào tử SỐ 2 MS 2.2 Tròn, lồi, bóng, trắng trong, rìa + đều, đường kính ≤ 0,5mm Hình cầu, có sinh bào tử MẪU MS 3.2 Tròn, dẹt, trắng đục, rìa đều, + NƯỚC đường kính ≈ 2mm AO Hình cầu, không có sinh bào tử NUÔI 36
  47. SỐ 3 MS 3.3 Tròn, lồi, bóng, rìa đều, trong + suốt, đường kính ≤ 0,5mm Hình cầu, không có sinh bào tử MS 3.4 Tròn, lồi bóng, trắng sữa, rìa + đều, đường kính 0,5mm Hình que, có sinh bào tử MẪU MS 4.2 Tròn, lồi, bóng, trắng trong, rìa + NƯỚC đều, đường kính > 0,5mm AO Hình que, có sinh bào tử NUÔI SỐ 4 MS 4.3 Tròn, rìa phân thùy, dẹt, trắng + đục, đường kính > 2mm Hình que, có sinh bào tử MS 5.1 Tròn, rìa đều, trắng đục, lồi, + đường kính ≈ 0,5mm MẪU Hình que, có sinh bào tử NƯỚC AO MS 5.3 Tròn, dẹt, trắng trong, tâm + NUÔI trắng đục, rìa răng cưa, đường SỐ 5 kính > 0,5mm Hình que, không có sinh bào tử 37
  48. MS 5.4 Tròn, dẹt, đen, rìa răng cưa, + trắng đục, đường kính > 0,5mm Hình cầu, có sinh bào tử MS 5.5 Tròn, lồi, bóng, rìa đều, vàng, + đường kính > 0,5 mm Hình que, không có sinh bào tử MS 5.6 Tròn, dẹt, trắng đục, rìa răng + cưa, đường kính ≥ 2mm Hình cầu, không có sinh bào tử MS 6.1 Tròn, lồi, bóng, rìa răng cưa, + trắng sữa, đường kính > 2mm MẪU Hình que, có sinh bào tử NƯỚC AO MS 6.2 Tròn, lồi, bóng, rìa đều, trắng + NUÔI trong, tâm hồng, đường kính > SỐ 6 0,5 mm Hình que, có sinh bào tử MS 7.1 Tròn, lồi, bóng, trắng đục, tâm + màu da, rìa đều, đường kính > MẪU 0,5mm NƯỚC Hình que, có sinh bào tử AO NUÔI MS 7.2 Tròn, dẹt, trắng đục, rìa phân + SỐ 7 thùy, đường kính > 2mm Hình que, có sinh bào tử 38
  49. MS 8.2 Tròn, dẹt, không bóng, trắng + trong, rìa răng cưa, đường kính MẪU ≈ 0,5mm NƯỚC Hình que, có sinh bào tử AO MS 8.3 Tròn, dẹt, trắng đục, rìa đều, + NUÔI tâm lõm, đường kính > 2mm SỐ 8 Hình que, không có sinh bào tử MS 9.1 Tròn, lồi, bóng, trắng trong, rìa + phân thùy, đường kính ≈ 2mm Hình que, không có sinh bào tử MẪU NƯỚC MS 9.2 Tròn, dẹt, rìa răng cưa, trắng + AO trong, nhám có tâm trắng hồng, NUÔI đường kính> 0mm SỐ 9 Hình que, có sinh bào tử MS 9.4 Tròn, rìa đều, trắng trong, lồi, + tâm trắng đục, đường kính≈ 5mm Hình que, có sinh bào tử MS 10.1 Tròn, lồi, màu trắng đục, rìa + đều, có tâm , đường kính ≈ MẪU 5mm NƯỚC Hình cầu, có sinh bào tử AO MS 10.2 Tròn, lồi, bóng, rìa đều, màu + NUÔI vàng, đường kính ≈ 2mm SỐ 10 Hình que, không có sinh bào tử 39
  50. MẪU MS 11.1 Tròn, nhám, dẹt, rìa răng cưa, + NƯỚC tâm lồi, trắng đục, đường kính AO ≈ 5mm NUÔI Hình que, có sinh bào tử SỐ 11 MS 11.2 Tròn, lồi, bóng, vàng, rìa đều, + đường kính ≈ 5mm Hình cầu, không có sinh bào tử MS 12.1 Tròn, dẹt, rìa răng cưa, trắng + đục, rìa đều màu trắng trong, đường kính ≥ 2mm MẪU Hình cầu, không có sinh bào tử NƯỚC MS 12.2 Tròn, dẹt, rìa răng cưa, trắng + AO đục, nhám, đường kính ≈ 5mm NUÔI Hình que, có sinh bào tử SỐ 12 MS 12.3 Tròn, rìa đều, trắng trong, + bóng, tâm lồi, đường kính ≈ 2mm Hình que, không có sinh bào tử MẪU MS 13.1 Tròn, dẹt, tâm lồi trắng đục, rìa + NƯỚC phân thùy, đường kính > 2mm AO SỐ Hình que, có sinh bào tử 13 40
  51. MS 13.2 Tròn, trắng đục, có rìa phân + thùy lồi bóng, đường kính > 5mm Hình que, có sinh bào tử MS 13.3 Tròn, lồi, rìa đều, bóng , vàng, + đường kính ≥ 2mm Hình que, không có sinh bào tử Từ 13 mẫu nước ao nuôi tôm sau khi phân lập trên môi trường TSA có bổ sung NaCl 1,5% và dựa vào các đặc điểm hình dạng, hình chiếu, rìa và màu sắc khuẩn lạc đã phân lập được 57 chủng trong đó có 18 chủng phân lập được từ 4 ao đang trong quá trình nuôi (32%) và 39 chủng phân lập được từ 9 ao đang trong quá trình nghỉ 2 tuần (68%). Về hình dạng khuẩn lạc, tất cả các chủng phân lập có hình tròn (100%), hình chiếu có 34 chủng dạng lồi (60%), dạng dẹt 23 chủng (40%). Rìa khuẩn lạc có 24 chủng rìa đều (42%), rìa răng cưa có 19 chủng (33%), rìa phân thùy có 14 chủng (25%). Về màu sắc có 8 chủng màu vàng (14%), trắng trong có 26 chủng (46%), trắng đục có 23 chủng (40%). Với mục tiêu chọn vi khuẩn thuộc nhóm Gram dương, có khả năng sinh bào tử nhằm ứng dụng vào thực tế, do đó chúng tôi tiến hành nhuộm Gram, nhuộm bào tử. Kết quả nhuộm Gram chúng tôi nhận thấy rằng trong 57 chủng có 39 chủng Gram dương (68%) và 18 chủng Gram âm (32%). Tiến hành lọai bỏ các chủng vi khuẩn Gram âm và nhuộm bào tử 39 chủng vi khuẩn Gram dương, kết quả cho thấy rằng có 22 chủng vi khuẩn Gram dương có khả năng sinh bào tử (56%) và 17 chủng không sinh bào tử (44%). Các chủng vi khuẩn Gram dương không sinh bào tử bị loại bỏ, 22 chủng vi khuẩn Gram dương sinh bào tử trong đó có 18 chủng thuộc nhóm trực khuẩn (82%) và 4 chủng thuộc nhóm cầu khuẩn (18%). Các chủng này được cấy thuần và giữ giống cho các thí nghiệm tiếp theo. 41
  52. 3.2 Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính keo tụ sinh học Dựa vào kết quả sàng lọc hoạt tính keo tụ sàng lọc của 22 chủng vi khuẩn Gram dương sinh bào tử đã phân lập được trên Bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả 22 chủng vi khuẩn này đều có hoạt tính keo tụ sinh học nhưng hoạt tính keo tụ sinh học không đồng đều và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05). 22 chủng vi khuẩn khảo sát thuộc 2 nhóm mẫu. Nhóm 1 gồm có 4 chủng được phân lập từ 4 ao đang trong quá trình nuôi có tỷ lệ keo tụ sinh học từ 42,43% đến 69,15%, và tỷ lệ keo tụ cao nhất thuộc về chủng 2.2. Nhóm 2 gồm có 18 chủng được phân lập từ 9 ao đang trong quá trình nghỉ 2 có tỷ lệ keo tụ từ 23,67% đến 75,82% và tỷ lệ keo tụ cao nhất thuộc về chủng 9.4. Kết quả này cho thấy rằng các chủng vi khuẩn thuộc nhóm 2 có tỷ lệ keo tụ cao hơn so với nhóm 1. Về hình dạng tế bào vi khuẩn 4 chủng vi khuẩn hình cầu có tỷ lệ keo tụ từ 45,61% đến 69,15% (tỷ lệ keo tụ cao nhất thuộc về chủng 2.2 ) trong khi đó 18 chủng vi khuẩn hình que có tỷ lệ keo tụ sinh học từ 28,33% đến 75,82% (tỷ lệ keo tụ cao nhất thuộc về chủng 9.4). Như vậy, từ kết quả khảo sát hoạt tính keo tụ sinh học của 22 chủng vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử chúng tôi nhận thấy rằng chủng 9.4 cho tỷ lệ keo tụ cao nhất là 75,82%. Chủng 9.4 có những đặc điểm khuẩn lạc như sau: tròn, rìa đều, trắng trong tâm trắng đục, có đường kính xấp xỉ 5mm thuộc nhóm trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử và được phân lập từ ao nuôi đang trong giai đoạn nghỉ. Theo kết quả nghiên cứu của Luo và cộng sự (2016) có 48 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ mẫu nước ao nuôi cá chép tại tỉnh Hắc Long Giang, Trung Quốc, trong đó chủng SP1 cho tỷ lệ keo tụ sinh học cao nhất trong số 48 chủng khảo sát là 91%. SP1 có các đặc điểm như sau: tròn, trắng trong, bóng, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương có hình que. So với kết quả nghiên cứu mà chùng tôi thu được dù chủng 9.4 có những đặc điểm tương đống so với chủng SP1 nhưng tỷ lệ keo tụ lại thấp hơn. 42
  53. 100% 90% 80% a abc abcde abcd abcdef 70% defghijk defghijkl efghijk fghijk fghijk 60% fghijk fghijk ghijkl ghijkl fghijk ghijkl fghijkl fghijkl ghijkl ghijkl ijkl lk 50% hijkl jkl 40% Tỷ lệ keo keo Tỷ tụ lệ (%) nm 30% 20% 10% 0% 1.1 1.2 1.4 2.1 2.2 4.1 4.2 4.3 5.1 5.4 5.7 5.8 5.9 6.1 6.2 7.1 7.2 8.2 9.2 9.4 10.1 11.1 12.2 13.1 13.2 Chủng vi khuẩn Hình 3.1: Hoạt tính keo tụ sinh học của 22 chủng vi khuẩn phân lập 43
  54. Nguyên nhân cho sự khác biệt về tỷ lệ keo tụ trên khác nhau có thể là do chất lượng nước ao nuôi, tùy vào từng điều kiện môi trường, khí hậu, nhiệt độ mà người ta sẽ chọn cách thức nuôi, cách thức trồng, thức ăn, sao cho phù hợp từ đó dẫn đến các chủng vi khuẩn cũng sẽ cho hoạt tính keo tụ không giống nhau. Ngoài ra, trong quá trình nuôi người dân cũng sẽ bổ sung một số chế phẩm vi sinh để gia tăng chất lượng sản lượng và điều đó có thể làm ảnh hưởng đến khả năng gắn kết của vi khuẩn. Với kết quả thí nghiệm sàng lọc này, chúng tôi chọn chủng vi khuẩn 9.4 để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 3.3 Kết quả định danh chủng 9.4 3.3.1 Định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa Chủng vi khuẩn 9.4 sau khi sàng lọc sẽ được tiến hành các thử nghiệm sinh hóa để định danh sơ bộ. Kết quả định danh sinh hóa được trình bày ở Bảng 3.4: Bảng 3.4: Kết quả định danh sinh hóa của chủng vi khuẩn 9.4 Vi khuẩn Bacillus subtilis Chủng NTH 9.4 Thử nghiệm Hình thái khuẩn lạc Tròn, nhăn, trắng đục Tròn, nhăn, trắng đục Nhuộm Gram + + Sinh bào tử + + Catalase + + VP + + Tăng trưởng ở 500C + + Tăng trưởng ở 650C - - Tăng trưởng trong môi + + trường 7% NaCl Sinh Acid và hơi trong môi - - trường glucose Nitrate + + Citrate + + Phân hủy tinh bột + + Phân hủy Casein + + (+):dương tính (-): âm tính Kết quả định danh sinh hóa của chủng NTH 9.4 cho thấy rằng chủng này có khả năng là chủng Bacillus subtilis. Theo kết quả định danh trong The Prokaryote (Vol.3), 44
  55. B. subtilis thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử, có hình dạng khuẩn lạc tròn, nhăn, trắng đục được nuôi cấy trong môi trường TSA (hoặc NA), có khả năng sinh enzyme catalase, tạo ra acetoin trong môi trường glucose – phosphate (thử nghiệm Voges – Proskauer), tăng trưởng tốt ở nhiệt độ 500C nhưng lại bị kìm hãm ở 650C. B.subtilis chịu được nồng độ muối 7%, nhưng không sinh hơi và acid trong môi trường glucose. Có thể cho nitrate và citrate dương đồng thời có khả năng phân hủy casein và tinh bột. Thông qua các thử nghiệm sinh hóa này, chủng vi khuẩn 9.4 có các kết quả sinh hóa tương đồng với B. subtilis (theo The Prokaryote). Để kiểm chứng kết quả định danh sinh hóa, chúng tôi tiến hành giữ chủng vi khuẩn 9.4, định danh bằng phương pháp giải trình tự DNA 16s tại công ty Nam Khoa Biotek. 3.3.2 Kết quả định danh chủng 9.4 bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S Kết quả định danh chủng 9.4 bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S được trình bày ở Hình 3.2. Kết quả này cho thấy rằng chủng 9.4 là vi khuẩn Bacillus subtlis với độ tương đồng là 100%. Kết hợp với kết quả định danh về mặt sinh hoá, chúng tôi đi đến kết luận chủng 9.4 là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. 45
  56. Hình 3.2: Kết quả định danh chủng 9.4 bằng phương pháp giải trình tự rDNA 46
  57. 3.4 Kết quả bước đầu tách chiết hoạt tính keo tụ sinh học từ chủng 9.4 Từ thể tích 200 ml dịch lên men tối ưu sau khi cô cạn đã thu được khối lượng là 0,176g (hiệu suất 0,088%). Sau đó chúng tôi tiến hành đánh giá sơ bộ hoạt tính keo tụ sinh học của hợp chất này ở các nồng độ 5mg/ml, 10mg/ml, 15mg/ml, 20mg/ml. Kết quả hoạt tính keo tụ sinh học sau khi thu hồi được trình bày ở Hình 3.3 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% Tỷ lệ keo keo Tỷ tụ lệ (%) 30% 20% 10% 0% Sinh khối 5 mg/ml 10 mg/ml 15 mg/ml 20 mg/ml Hình 3.3: Kết quả tách chiết hoạt tính keo tụ sinh học từ Bacillus subtilis NTH 9.4 Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính keo tụ sinh học của hợp chất sau khi tinh sạch ở các nồng độ 5mg/ml, 10mg/ml, 15mg/ml, 20mg/ml và sinh khối của vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng tất cả các nghiệm thức khảo sát đều thể hiện hoạt tính keo tụ với tỷ lệ rất cao (cao hơn 75%), trong đó hợp chất keo tụ ở nồng độ 20 mg/ml đạt tỷ lệ 83,56%, cao hơn so với vi khuẩn. Tóm lại: Với mục tiêu đặt ra là phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh, chúng tôi thu được các kết quả sau: Từ 13 mẫu nước ao nuôi tôm gồm 4 mẫu được lấy từ các ao đang trong quá trình nuôi, 9 mẫu lấy từ các ao đang trong giai đoạn nghỉ 2 tuần chúng tôi đã phân lập 47
  58. được 57 chủng vi khuẩn. Trong 57 chủng vi khuẩn thì có 39 chủng vi khuẩn Gram dương và 18 chủng vi khuẩn Gram âm và từ 39 chủng vi khuẩn Gram dương 22 chủng vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử sẽ được chọn để khảo sát hoạt tính keo tụ sinh học nhằm mục đích chọn ra chủng có hoạt tính keo tụ sinh học cao nhất. Sau khi sàng lọc các chủng vi khuẩn phân lập thì chủng 9.4 cho tỷ lệ keo tụ tốt nhất (75,83%) đồng thời qua các bước định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa và bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S, chúng tôi xác định được chủng 9.4 là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. Với các kết quả đạt được chủng vi khuẩn 9.4 hứa hẹn sẽ mở ra một hướng đi mới không những giải quyết khó khăn mà ngành nuôi trồng thủy sản nước ta còn gặp phải mà còn thúc đẩy phát triển kinh tế ngành nuôi trồng thủy sản tại Trà Vinh nói riêng và Việt Nam nói chung. 48
  59. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.1 Kết luận Từ 13 mẫu nước ao ở Hòa Minh, xã Long Hưng 1, huyện Châu Thành, thành phố Trà Vinh chúng tôi đã thu được các kết quả như sau: Phân lập được 57 chủng vi khuẩn trong đó có 22 chủng vi khuẩn Gram dương có sinh bào tử, 17 chủng vi khuẩn Gram dương không sinh bào tử và 18 chủng vi khuẩn Gram âm. Tiến hành khảo sát hoạt tính keo tụ sinh học của 22 chủng vi khuẩn Gram dương, có khả năng sinh bào tử với cơ chất là dịch kaolin cho thấy rằng chủng MS 9.4 có tỷ lệ keo tụ cao nhất (75,83%). Định danh sơ bộ và định danh sinh học phân tử xác định được đây là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. Bước đầu thu hồi hợp chất keo tụ sinh học từ Bacillus subtilis đạt tỷ lệ 0,088% với tỷ lệ cao tụ đạt 83,56% ở nồng độ 20 mg/ml. 4.2 Kiến nghị Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis. Thiết lập các thông số cho quy trình thu hồi hợp chất keo tụ vào thực tế. Ứng dụng trong quá trình nuôi tôm quy mô nhỏ. 49
  60. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Desouky, A.M., Abd El-Haleem, Roda, F.A., Thourya, A., Sidra, A. and Fatima, H., (2008): Isolation and characterization of extracellular bioflocculant produced by bacteria isolated from Qatari Ecosystems. Polish J. Microbiol. 57(3): 231-239. 2. Irianto A and Austin ., 2002. Probiotics in aquaculture. Journal of Fish Diseases 25 : 633 -642. 3. Liang Luo, Zhigang Zhao, Xiaoli Huang, Xue Du, Chang’an Wang, Jinnan Li, Liansheng Wang, and Qiyou Xu, 2016. Isolation, Identification, and Optimization of Culture Conditions of a Bioflocculant-Producing Bacterium Bacillus megaterium SP1 and Its Application in Aquaculture Wastewater Treatment. 4. Moriaty D. J. W., 1999. Disease Control in Shrim Aquaculture with prioviotics bacteria. Microbial Interactions in Aquaculture 5. Rajkumar, M., Pandey, P.K., Aravind, R., Venilla, A., Bharti, V., and Purushothaman, C.S. (2015) Effect of different biofloc system on water quality, biofloc composition and growth performance in Litopenaeus vannamei. Aqua. Res.1-13. 6. Tinh N. T. N., Dierckens K., Sogerloos P. and Bossier P., 2007. A review of the fuctionality of probitics in the laeviculture food chain. Marine Biotechnology 10: 1 – 12. 7. Tinh N. T. N., Gunasekara A., Boon N., Dierckens K., Sogerloos P. and Bossier P., 2007. N – acyl homoserine lactone-def grading microbial enrichment cultures isolated from Penaeus vannamei shrimp gut and their probiotic properties in Brachionus plicatilis culture. FEMS Microbiol Ecol 62: 45 – 53 8. Viraj Krishan Mishra, Geeta Sharma, 2010. Effect of Factors on Activity of Bioflocculant Produced by Bacterial Strain Isolated from Waste Water Sample 9. Venkat H. K., Sahu N. P. and Jain K. K., 2004. Effect of feeding Lactobacillus – based probiotics on the gut microflora, groeth and survival of postlarvae of Macrobrachium rosenbergii ( de Man ). Aquaculture Research 35 : 501 – 507. 50
  61. 10. Verschuere L., Rombaut G., Sogerloos P. and Verstraete W., 2000. Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture. Microbiology and Molecu;ar Biology Reviews 64: 655 – 671. 51
  62. PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 1.1 Thành phần môi trường Tryptone Soya Agar (g/l) TSA (g/l) Tryptone 15 Soy peptone 5 Sodium Chloride 5 Agar 15 1.2 Thành phần môi trường Tryptone Soya Broth (g/l) TSB (g/l) Tryptone 17 Soya peptone 3 Glucose 2.5 Dipotassium phosphate 2.5 1.3 Thành phần môi trường nuôi cấy (theo Deng và cộng sự, 2004) Môi trường nuôi cấy (g/l) Beef extract 3 Peptone 10 NaCl 5 Agar 18% 52
  63. 1.4 Thành phần môi trường lên men (theo Deng và cộng sự, 2004) Môi trường lên men (g/l) Glucose 20 KH2PO4 2 K2HPO4⋅3H20 5 MgSO4⋅7H2O 0.5 (NH4)2SO4 0.2 NaCl 0.1 Urea 0.5 Yeast extract 0.5 53
  64. PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ TỶ LỆ HOẠT TÍNH KEO TỤ XỬ LÝ BẰNG CHƯƠNG TRÌNH SAS 9.0 1. Kết quả xử lý thống kê SAS 9.1 TY LE KEO TU 21:03 Wednesday, May 26, 2018 11 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MS 42 MS1.1 MS1.2 MS1.3 MS1.4 MS1.5 MS1.6 MS1.7 MS10.1 MS10.2 MS11.1 MS11.2 MS12.1 MS12.2 MS12.3 MS13.1 MS13.2 MS13.3 MS2.1 MS2.2 MS3.2 MS3.3 MS3.4 MS4.1 MS4.2 MS4.3 MS5.1 MS5.3 MS5.4 MS5.5 MS5.6 MS5.7 MS5.8 MS5.9 MS6.1 MS6.2 MS7.1 MS7.2 MS8.2 MS8.3 MS9.1 MS9.2 MS9.4 Number of Observations 126 TY LE KEO TU 21:03 Wednesday, May 26, 2018 11 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TyLeKeoTu Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr>F Model 43 14388.67610 334.62037 8.77 F MS 41 14137.01809 344.80532 9.04 <.0001 TY LE KEO TU 21:03 Wednesday, May 26, 2018 11 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for kq NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 82 Error Mean Square 38.14734 Critical Value of t 2.63712 Least Significant Difference 13.299 54
  65. Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N MS A 75.826 3 MS9.4 A A 75.018 3 MS3.2 A B A 70.244 3 MS1.3 B A B A C 69.171 3 MS2.2 B A C B D A C 67.969 3 MS5.9 B D A C E B D A C 67.451 3 MS12.2 E B D A C E B D A C F 63.130 3 MS2.1 E B D F E B D G C F 59.029 3 MS5.6 E B D G C F E B D G H C F 57.906 3 MS1.5 E D G H C F E I D G H C F 56.378 3 MS5.3 E I D G H C F E I D J G H C F 56.138 3 MS5.5 E I D J G H F E I D J G H K F 55.035 3 MS11.1 E I D J G H K F E I D J G H K F 54.874 3 MS8.2 E I J G H K F E I J G H K F 54.563 3 MS1.4 I J G H K F I J G H K F 53.864 3 MS6.1 I J G H K F I J G H K F 53.738 3 MS4.1 I J G H K F I J G H K F 53.453 3 MS5.4 I J G H K F I J G H K F 52.284 3 MS4.3 I J G H K F I J G H K F 50.754 3 MS1.1 I J G H K F I L J G H K F 50.653 3 MS8.3 I L J G H K F I L J G H K F 50.606 3 MS5.8 I L J G H K F I L J G H K F 50.297 3 MS1.7 I L J G H K I L J G H K 49.816 3 MS11.2 I L J G H K I L J G H K 49.805 3 MS7.2 I L J G H K I L J G H K 49.451 3 MS3.4 I L J G H K I L J G H K 49.313 3 MS6.2 I L J G H K 55
  66. I L J G H K 49.096 3 MS13.3 I L J G H K I L J G H K 48.716 3 MS3.3 I L J G H K I L J G H K 48.647 3 MS5.1 I L J G H K I L J G H K 47.092 3 MS1.2 I L J G H K I L J G H K 46.563 3 MS7.1 I L J G H K I L J G H K 46.249 3 MS12.3 I L J H K I L J H K 45.497 3 MS10.1 I L J H K I L J H K 45.094 3 MS1.6 I L J K I L J K 44.345 3 MS5.7 I L J K I L J K 43.246 3 MS10.2 L J K L J K 43.075 3 MS13.2 L K L K L K 42.059 3 MS13.1 L L M 37.415 3 MS9.1 M N M 28.404 3 MS9.2 N N 23.684 3 MS12.1 56
  67. PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GENE 57
  68. PHỤ LỤC 4: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ PHÂN LẬP 60