Đồ án Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thụ CO₂ và định hướng làm giảm hiệu ứng nhà kính

Nội dung text: Đồ án Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thụ CO₂ và định hướng làm giảm hiệu ứng nhà kính

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, CHỌN LỌC VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN QUANG HỢP CÓ KHẢ NĂNG HẤP THỤ CO2 VÀ ĐỊNH HƯỚNG LÀM GIẢM HIỆU ỨNG NHÀ KÍNH Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH HVCH NGÔ ĐỨC DUY Sinh viên thực hiện : CHÂU TUẤN VĂN MSSV: 1411100262 Lớp: 14DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2018
2. LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn thầy Ngô Đức Duy, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới. Những số liệu và kết quả phân tích trong đề tài này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kì nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được công bố công khai trên các bài báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án. Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo này, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Viện Khoa học ứng dụng Hutech và trước ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực hiện Châu Tuấn Văn
3. LỜI CÁM ƠN Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy cô, các anh chị và các bạn , em đã hoàn thành tốt báo cáo này. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: TS. Hoàng Quốc Khánh, Trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài. Thầy Ngô Đức Duy, TS. Nguyễn Hoàng Dũng và chị Loan phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp. Các bạn lớp 14DSH01 đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng, chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho con ăn học thành người có ích cho xã hội.
4. Đồ Án Tốt Nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH ẢNH ii DANH MỤC BẢNG iii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2 3. Mục tiêu đề tài 3 4. Nội dung nghiên cứu 3 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Các kết quả đạt được của đề tài 4 7. Kết cấu của đề tài 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Tổng quan về khí CO2 (Carbon dioxide) 5 1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc khí CO2 5 1.1.2 Lợi ích của khí CO2 5 1.1.3 Tác hại của khí CO2 6 1.1.4 Tình hình phát thải khí CO2 trên thế giới và Việt Nam 8 1.1.5 Các biện pháp giảm thiểu khí thải CO2 10 1.2 Tổng quan về vi khuẩn quang hợp 12 1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp 12 1.2.2 Nguyên lý chung quá trình quang hợp và khả năng cố định CO2 14 1.2.3 Ảnh hưởng các nhân tố hóa lý đến sinh trưởng vi khuẩn quang hợp 16 1.2.4 Ứng dụng của vi khuẩn quang hợp 16 1.3 Phương pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử .18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 19 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 19 2.1.3 Đối tưởng nghiên cứu 19
5. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.1.4 Nguồn mẫu 19 2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 20 2.2.1 Hóa chất 20 2.2.2 Dụng cụ 21 2.2.3 Thiết bị 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 21 2.3.2 Quy trình phân lập và định danh 23 2.3.3 Phương pháp tăng sinh mẫu 23 2.3.4 Phương pháp phân lập mẫu 23 2.3.5 Phương pháp, kỹ thuật nhuộm Gram 23 2.3.6 Phương pháp khảo sát sự tăng trưởng vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau 24 2.3.7 Phương pháp khảo sát sự tăng trưởng và sử dụng nguồn CO2 của vi khuẩn quang hợp .24 2.3.8 Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn .25 2.3.9 Khuyếch tán DNA bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) 26 2.3.10 Gỉai trình tự DNA và định danh . .27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .28 3.1 Kết quả thu mẫu . .33 3.2 Kết quả tăng sinh mẫu 33 3.3 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái 36 3.4 Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn 38 3.5 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn 41 3.6 Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ CO2 46 3.7 Định danh 49 3.7.1 Ly trích, thu nhận DNA 49 3.7.2 Kết quả PCR 49 3.8 kết quả định danh .50 3.8.1 Trình tự vung gene của 4 chủng RL1, CM23, CM24, CM34.3 . 50
6. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.8.2 Thiết lập cây phát sinh loài . .52 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1 Kết luận 53 4.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 56
7. Đồ Án Tốt Nghiệp
8. Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BIM : Basic Isolation Media LHQ : Liên Hợp Quốc NCBI : National Center for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Reaction rDNA : Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid i
9. Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ về chu trình Calvin 15 Hình 2.1 Mô phỏng vị trí lấy mẫu tại Đức Hòa (A) và Ngọc Hiển (B) 19 Hình 2.2 Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp 22 Hình 2.3 Mô hình thí nghiệm thổi khí vào môi trường lỏng .25 Hình 2.4 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 27 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập và làm thuần trên môi trường BIM agar 38 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn được quan sát dưới ống kính hiển vi với vật kính 100X 40 Hình 3.3 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 5‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 41 Hình 3.4 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 10‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 42 Hình 3.5 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 15‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 42 Hình 3.6 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 20‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 43 Hình 3.7 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 25‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 43 Hình 3.8 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 30‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 44 Hình 3.9 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 35‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 44 Hình 3.10 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 40‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày.45 Hình 3.11 Kết quả ly trích DNA của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1, RL8 trên gel agarose 1% 49 Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 trên gel agarose 1% 49 Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng bộ kit của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 trên gel agarose 1% 50 Hình 3.14 Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene . 52 ii
10. Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Khí thải CO2 toàn cầu, giai đoạn 2000 – 2017 . 9 Bảng 1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn tía lưu huỳnh và không lưu huỳnh .13 Bảng 2.1 Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy .21 Bảng 3.1 Danh sách các nguồn mẫu từ Long An và Cà Mau . 29 Bảng 3.2 Danh sách mẫu tăng sinh từ các nguồn mẫu Long An và Cà Mau .33 Bảng 3.3 Hình ảnh một số ống mẫu tăng sinh có sự thay đổi màu rõ rệt 34 Bảng 3.4 Danh sách các chủng đã được phân lập từ 38 ống mẫu tăng sinh . 36 Bảng 3.5 Kết quả đặc điểm hình thái vi khuẩn 38 Bảng 3.6 Giá trị OD660nm của các chủng cao hơn 0,3 ở nồng độ 4% sau 7 ngày . 46 Bảng 3.7 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 1 46 Bảng 3.8 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 3 47 Bảng 3.9 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 5 48 iii
11. Đồ Án Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Sự nóng lên toàn cầu (Global Warming) đã và đang là một trong những vấn đề nguy hại có tầm ảnh hưởng to lớn trên toàn thế giới. Nóng lên toàn cầu là hiện tượng nhiệt độ trung bình của bề mặt Trái đất tăng lên, dẫn đến tình trạng biến đổi khí hậu. Những nhân tố có thể làm cho sự biến đổi khí hậu xuất hiện là thay đổi bức xạ khí quyển, bao gồm các quá trình như biến đổi bức xạ mặt trời, độ lệch quỹ đạo của Trái Đất, quá trình kiến tạo núi, kiến tạo trôi dạt lục địa và sự thay đổi nồng độ khí nhà kính. Khí thải CO2 có lẽ là một trong những nhân tố chính dẫn đến hiện tượng trên là do sự phát thải đáng kể của khí thải này từ các hoạt động đốt cháy nhiên liệu hóa thạch cùng các loại khí thải khác, khiến lượng nhiệt bị giữ lại trong bầu khí quyển, do đó dẫn đến nhiệt độ Trái đất tăng lên. Biến đổi khí hậu không còn là một thuật ngữ, giả thuyết mơ hồ được nghiên cứu bởi những nhà khí tượng học đưa ra, hiện tượng này dần trở thành một mối đe dọa hàng đầu đối với nhân loại và sự sống trên trái đất. Việt Nam được đánh giá là một trong những quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề của biến đổi khí hậu do có bờ biển dài. Cụ thể là, thời tiết ở Việt Nam những năm gần đây ngày càng bất thường có thể kể đến như hạn hán, ngập lụt, sạt lở, giông tố, bão lũ có diễn biến phức tạp, ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế phụ thuộc nhiều vào sản xuất nông nghiệp của nước ta. Trước sự thách thức trên, Công ước Khung của Liên Hợp Quốc về biến đổi khí hậu (United Nations Framework Convention on Climate Change) được thành lập cùng với sự tham gia của 155 quốc gia trong đó có Việt Nam nhằm chung tay góp sức cải thiện môi trường bằng cách hạn chế sự phát thải tối đa và duy trì sự ổn định khí nhà kính trong khí quyển ở mức có thể ngăn ngừa sự can thiệp nguy hiểm của con người đối với hệ thống khí hậu. Những biện pháp để giảm thiểu khí thải CO2 hiệu quả thông qua những hành động hằng ngày như là: chuyển dần sang đi bộ, đạp xe đạp,chạy xe điện, hạn chế sự dụng xe máy, ô tô; hạn chế sự dụng nguồn năng lượng từ củi ,than đốt hay gas, thay thế bằng năng lượng mặt trời; tích cực trồng cây, Ngoài ra, rất nhiều giải pháp công nghệ, hóa học, sinh học được đề xuất trong và ngoài nước để có thể cứu vác kịp thời sự hiểm họa này. Trong đó con đường sinh học hiện đại được xem là 1
12. Đồ Án Tốt Nghiệp có triển vọng, những công nghệ, chế phẩm bắt nguồn từ vi sinh vật được sử dụng trong xử lý môi trường có hiệu quả suốt thập kỷ qua. Cho nên con đường tìm kiếm vi sinh vật cụ thể là các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng cố định CO2 là một bước đi mới nhằm giải quyết vấn đề cấp bách trên. Các chủng vi khuẩn quang hợp, đặc biệt là quang dị dưỡng có khả năng sử dụng CO2 là nguồn carbon để duy trì sự sống thông qua nhiều con đường cố định carbon khác nhau. Trong đó có thể kể đến chu trình Calvin là chu trình quan trong nhất trong quá trình cố định CO2 . Việt Nam là một đất nước được đánh giá cao về tính đa dạng sinh học, có triển vọng tốt cho việc nghiên cứu và phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng trên, đóng vai trò quan trọng trong việc giải quyết khí thải nói riêng và sự nóng lên toàn cầu nó chung, là bước đệm để triển khai cho những đề tài nghiên cứu mới về sau. Chính vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu Carbon dioxide và định hướng làm giảm hiệu ứng nhà kính” 2. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước • Nghiên cứu trong nước − Nghiên cứu nhân nuôi và sử dụng vi khuẩn Rhodobacter để sử lý chất hữu cơ và Sulfide trong nước nuôi trồng thủy hải sản của Thạc sĩ Mỵ Trần Hương Trà được công bố vào năm 2015. Khả năng xử lý chất hữu cơ trong môi trường nước thải nuôi trồng thủy hải sản giả định của chủng vi sinh vật này khá cao, với hiệu suất xử lý từ 58 – 87%. Hiệu suất xử lý Sulfide trong môi trường nước thải nuôi trồng thủy sản giả định của chủng vi sinh vật này sau 7 là từ 86.7-100%, gần như loại bỏ hoàn toàn Sulfide [1]. − Phân lập, đánh giá các đặc điểm sinh học và định danh phân tử các chủng vi khuẩn quang hợp tía phục vụ chế tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu của Nguyễn Thị Hương Giang được công bố vào năm 2012. Đề tài nghiên cứu đặc điểm và khả năng tăng trưởng từ những môi trường nước khác nhau, từ đó tiến hành thu nhận sinh khối, ứng dụng và sản xuất chế phẩm vi sinh hữu hiệu trong xử lý nước thải môi trường [2]. 2
13. Đồ Án Tốt Nghiệp • Nghiên cứu ngoài nước − Phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp sản xuất coenzyme Q10 của Fang LC, Huang XF, Du ZH, Yuan J, Wei H, Cheng HH, Liu Y được công bố vào năm 2005. Trong đề tài này, 13 chủng vi khuẩn quang hợp tía được phân lập và xác định hàm lượng sản sinh coenzyme Q10 cao nhất, định hướng và ứng dụng trong y học và sức khỏe [3]. − Phân lập, định danh và tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng vi khuẩn quang hợp từ hải sản nhằm muc đích xử lý nước thải của Prasertsan P, Choorit W, Suwanno S. Đuọc công bố vào năm 1993. Đề tài chủ yếu nghiên cứu điều kiện tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn quang hợp tía, khả năng sản sinh sinh khối trong các yếu tố khác nhau, định hướng xử lý nước thải môi trường, [4] 3. Mục tiêu đề tài Xây dựng bộ sưu tập vi khuẩn quang hợp và định danh tới mức các loài vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thụ CO2. 4. Nội dung nghiên cứu − Phân lập vi khuẩn quang hợp, gram âm, hiếu hoặc kị khí, hóa tự dưỡng hoặc dị dưỡng từ nguồn nước trồng lúa thuộc các tỉnh Long An, Cà Mau. − Kiểm tra hình thái , các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được − Chọn lọc các dòng vi khuẩn có khả năng cố đinh CO2 bằng cách khảo sát sự tăng trưởng của chúng trong điều kiện dinh dưỡng có sục khí CO2. − Định danh đến loài các chủng bằng phương pháp giải trình tự DNA mã hóa cho ribosome 16S. − Bảo quản giống bằng phương pháp lạnh sâu có bổ sung 15% glycerol − Ly trích DNA và khuyếch đại đoạn gene các chủng mong muốn bằng phương pháp PCR. Định danh tới loài bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S, phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh loài. 5. Phương pháp nghiên cứu − Phương pháp phân lập, làm thuần và tăng sinh vi khuẩn quang hợp. − Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng kỹ thuật nhuộm Gram. 3
14. Đồ Án Tốt Nghiệp − Phương pháp khảo sát khả năng chịu mặn của vi khuẩn bằng phương pháp đo OD660. − Phương pháp khảo sát khả năng hấp thu CO2. − Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA. − Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi 27F và 1492R. − Phương pháp sinh tin học dựa trên các phần mềm (ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0). 6. Các kết quả đạt được của đề tài − Kết quả phân lập và làm thuần đuọc các chủng vi khuẩn quang hợp chịu mặn cao và có khả năng hấp thu CO2. − Kết quả thu nhận được bộ gene DNA. − Kết quả khuyếch đại đoạn gene bằng phương pháp PCR. 6. Kết cấu của đề tài Đề tài bao gồm 4 chương Chương 1: tổng quan tài liệu Chương 2: vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: kết quả và biện luận Chương 4: kết luận và kiến nghị 4
15. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về khí CO2 (Carbon dioxide) 1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc khí CO2 Carbon dioxide, có công thức hóa học là CO2, hay còn đuọc biết đến tên gọi khác là Carbonic anhydride, carbonic acid. Carbon dioxide là một loại khí không màu nặng hơn hơn không khí. Carbon dioxide không cháy. Ở nồng độ thấp, khí carbon dioxide không có mùi. Ở nồng độ cao, nó có độ sắc nét, có tính axit mùi. Ở nhiệt độ bình thường, carbon dioxide không phản ứng với nhiều vật liệu khác . Carbon dioxide hòa tan trong nước để tạo thành cacbonic axit. Nó có thể dễ dàng và an toàn hóa lỏng, kiên cố hóa, xử lý và lưu trữ.[5] Carbon dioxide thu được từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm cả khí thoát ra từ các núi lửa, sản phẩm cháy của các hợp chất hữu cơ và hoạt động hô hấp của các sinh vật sống hiếu khí. Nó cũng được một số vi sinh vật sản xuất từ sự lên men và sự hô hấp của tế bào. Khí carbon dioxide thải vào khí quyển do việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch "chiếm 99,4% lượng khí thải CO2 trong năm 2013" [6]. Carbon dioxide là khí nhà kính lâu đời quan trọng nhất trong khí quyển Trái đất. Kể từ khi cuộc cách mạng công nghiệp phát thải nhân loại - chủ yếu từ việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch và phá rừng - đã nhanh chóng tăng nồng độ của nó trong khí quyển, dẫn đến sự nóng lên toàn cầu. Carbon dioxide cũng gây ra acid hóa đại dương bởi vì nó hòa tan trong nước để tạo thành carbonic acid. [7] 1.1.2 Lợi ích của khí CO2 Ngày nay, tác hại khí thải CO2 là một trong những đề tài xôn xao và nhức nhối trong xã hội hiện nay. Nhưng chúng ta không thể phủ nhận rằng, ngay từ đầu khí thải nhà kính này là một nhân tố vô cùng quan trọng và ý nghĩa cho sự sống muôn loài trên trái đất. Đã có một khoảng thời gian dài hành tinh xanh này bị nhấn chìm và phủ đầy bởi các dải băng lục địa, có nghĩa rằng sự biến đổi khí hậu xảy ra khi nhiệt độ giảm xuống lâu dài, đó chính là thời kỳ Kỷ băng hà. Nhưng nhờ có hoạt động núi lửa giải phóng CO2 và chính nhờ nó đã làm bầu khí quyển ấm hơn và hình thành sự sống đa dạng, phức tạp như bây giờ. 5
16. Đồ Án Tốt Nghiệp Trong cái nhìn thực tế hơn, khí CO2 giúp ích cho cây cối phát triển và hữu dụng trong nền Công nghiệp, thực phẩm,y học và các hoạt động đời sống thường ngày. Cụ thể là, Trong công nghệ thực phẩm, CO2 được sử dụng để tạo gas cho nhiều thức uống, lưu trữu và vận chuyển thực phẩm đông lạnh, Trong công nghiệp, khí CO2 được dùng để vận hành các hệ thống khí nén trong nhà máy, làm giảm độ ẩm trong hệ thống giúp kéo dài tuổi thọ, và ít tốn chi phí bảo trì. Không những thế, CO2 còn là khí bơm và lựa chọn trong phẫu thuật nội sôi vì chúng không màu, không dễ cháy. Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, mặc dù CO2 là khí thải độc hại, nhưng xét về kinh tế, hóa chất này vẫn có thể biến thành nguyên liệu thân thiện với môi trường trong ngành công nghiệp hóa chất. Chúng ta hiện đang sản xuất nhiều loại hóa chất cần thiết từ CO2 như thuốc bảo vệ thực vật, nhựa, thuốc trừ sâu, phân bón, salicylic acid, nhiên liệu và các nguyên liệu khác. 1.1.3 Tác hại của khí CO2 Khi trái đất ấm lên nhờ có khí thải CO2 từ thiên nhiên để cân bằng sự sống, thấy được lợi ích từ khí thải này, con người đã lạm dụng chúng quá mức thông qua những hoạt động trực tiếp và gián tiếp, sự biến đổi khí hậu một lần nữa đã và đang thay đổi khiến cho trái đất nóng dần lên, thuật ngữ “Sự Nóng lên toàn cầu” bắt đầu được đề cập tới để miêu tả vấn đề trên. Lượng khí CO2 tồn tại trong bầu khí quyển vẫn đang ngày một tăng lên mức báo động. Những tác hại có thể được kể đến như: ô nhiễm môi trường ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống và sức khỏe con người và sinh vật khác; khởi tạo ra các thiên tai như hạn hán, ngập lụt, sạt lở, giông tố, bão lũ; làm băng tan chảy nước biển dâng cao; phá hủy hệ sinh thái; gây ra hiệu ứng nhà kính, biến đổi khí hậu, Trái đất đang ngày càng nóng lên và con người nhận ra những tác hại rõ ràng từ sự nóng lên toàn cầu này: nền nông nghiệp rối loạn, cơ sở hạ tầng xuống cấp cùng với nguồn năng lượng dần cạn kiệt 5 tác hại kinh hoàng của sự nóng lên toàn cầu có thể được đề cập đến là: 1. Thiếu lương thực, thực phẩm Chỉ theo tính toán riêng ở Mỹ, năng suất cây trồng của ngô, lúa mì hay bông ở vùng thung lũng trung tâm California sẽ giảm đến 30% trong vài thập kỉ tới. 6
17. Đồ Án Tốt Nghiệp Nguyên nhân được cho là do sự tăng lượng carbon trong không khí, sự sụt giảm về số lượng loài ong dẫn đến quá trình thụ phấn bất thành Ngoài ra, biến đổi khí hậu cũng sẽ ảnh hưởng đến giá thành chế biến, lưu trữ và vận chuyển lương thực, đẩy giá lương thực tăng cao do tăng nhu cầu về nguồn nước và năng lượng. Điều này gây ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế cũng như người tiêu dùng.[8] 2. Khủng hoảng năng lượng Nhu cầu năng lượng ngày càng tăng tạo nên một vòng luẩn quẩn của biến đổi khí hậu. Từ năm 1970, nhu cầu sưởi ấm của toàn cầu đã giảm trong khi nhu cầu làm mát tăng vọt. Nhiệt độ sẽ ngày càng tăng lên trong các thập kỉ tới, sự gia tăng nhanh chóng của dân số toàn cầu cũng kéo theo nhu cầu sử dụng năng lượng ngày một tăng. Điều này góp phần thúc đẩy sự phát triển trong việc xây dựng các nhà máy – nguyên nhân gây ra biến đổi khí hậu. Trong khi đó, lượng mưa được dự báo sẽ giảm đến 40% ở một số nơi, làm giảm lượng nước – một thành phần quan trọng trong sản xuất thủy điện. Do đó, khủng hoảng năng lượng sẽ là một cơn ác mộng thực sự.[8] 3. Phá hỏng cơ sở hạ tầng Cơ sở hạ tầng giao thông vận tải đã “lão hóa” sẽ không thể chống chọi tốt trước khí hậu khắc nghiệt. Càng ngày, thiên nhiên càng trở nên hung dữ và đáng sợ hơn với những cơn bão hàng năm được nhận xét là vô cùng mạnh. Theo thống kê, siêu bão Sandy tàn phá nước Mỹ năm ngoái đã cướp đi hơn 90 mạng người và gây thiệt hại gần 50 tỷ USD (hơn 1 triệu tỷ VNĐ) đối với nền kinh tế hàng đầu thế giới này. Chính sự xuống cấp, “lão hóa” của cơ sở vật chất theo năm tháng cũng như trải qua các thiên tai sẽ là một bất lợi lớn khi cần vận chuyển các mặt hàng thiết yếu như thực phẩm, nhiên liệu, nước đến nơi cần trợ giúp.[8] 4. Gây hạn hán Nhiệt độ Trái đất tăng kéo theo sự gia tăng của nạn hạn hán ở khắp nơi. Lưu lượng nước chỉ là hữu hạn nhưng nhu cầu sử dụng vẫn tăng nhanh, đặc biệt ở một số nước đang phát triển. 7
18. Đồ Án Tốt Nghiệp Nạn hạn hán hoành hành ở nhiều nơi và ngày càng tồi tệ hơn. Nguy cơ hạn hán kéo dài rất dễ xảy ra, điều này gây nguy hiểm đến sự phát triển của nền nông nghiệp cũng như các ngành công nghiệp phụ thuộc vào nước.[8] 5. Không khí ngày càng bị ô nhiễm nặng Sự ấm lên của Trái đất cũng kéo theo tình trạng ô nhiễm không khí. Tình trạng ô nhiễm khói bụi dài hạn cũng ảnh hưởng tới quá trình hình thành mây và lượng mưa, khiến các điều kiện thời tiết khắc nghiệt trầm trọng thêm. Sự gia tăng lượng ozon trong khí quyển dẫn đến việc nhiều người mắc bệnh về phổi và theo tính toán, số lượng bệnh nhân hen suyễn dự kiến sẽ tăng đến 10% tại các đô thị lớn. Các nhà khoa học cho rằng, lượng khí carbon ngày một dày đặc sẽ gây ảnh hưởng lớn đến các bệnh nhân bị dị ứng.[8] 1.1.4 Tình hình phát thải khí CO2 trên thế giới và Việt Nam Khí thải CO2 liên quan đến năng lượng toàn cầu đã tăng 1,4% trong năm 2017, tăng 460 triệu tấn (Mt), và đạt mức cao lịch sử 32,5 Gt. Sự tăng trưởng của năm ngoái là sau ba năm phát thải bằng phẳng và tương phản với mức giảm mạnh cần thiết để đáp ứng các mục tiêu của Hiệp định Paris về biến đổi khí hậu. Sự gia tăng lượng khí thải carbon, tương đương với lượng phát thải 170 triệu xe, là kết quả của tăng trưởng kinh tế toàn cầu mạnh mẽ 3,7%, giá nhiên liệu hóa thạch thấp hơn và nỗ lực tiết kiệm năng lượng yếu hơn. Ba yếu tố này đã góp phần thúc đẩy nhu cầu năng lượng toàn cầu tăng 2,1% vào năm 2017. Tuy nhiên, xu hướng phát triển khí thải ngày càng không phổ biến. Trong khi hầu hết các nền kinh tế lớn nhìn thấy sự gia tăng phát thải carbon, một số nền kinh tế khác lại suy giảm, chẳng hạn như Hoa Kỳ, Anh, Mexico và Nhật Bản. Sự suy giảm lớn nhất đến từ Hoa Kỳ, nơi mà lượng khí thải giảm 0,5%, hoặc 25 Mt, xuống còn 4810 Mt CO2, đánh dấu năm thứ ba liên tiếp suy giảm. Trong khi chuyển đổi từ than sang khí đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm phát thải trong những năm trước, năm ngoái, sự suy giảm là kết quả của việc sản xuất điện dựa trên năng lượng tái tạo cao hơn và sự suy giảm nhu cầu điện. Tỷ trọng tái tạo trong sản xuất điện đạt mức kỷ lục 17%, trong khi tỷ trọng điện hạt nhân giữ ổn định ở mức 20%.[9] 8
19. Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 1.1 Khí thải CO2 toàn cầu, giai đoạn 2000 - 2017 (Nguồn trích từ International Energy Agency, 2017) Trên lộ trình phấn đầu thành một nước công nghiệp, những năm qua, Việt Nam đã đạt được những bước tiến đáng kể trong công tác giảm nghèo và nâng cao phúc lợi xã hội. Tuy nhiên, chính sự phát triển này cũng là một trong những nguyên nhân làm tăng nhanh lượng phát thải khí CO2. Mặc dù chưa có nghĩa vụ phải cắt giảm phát thải khí nhà kính nhưng lượng khí nhà kính của Việt Nam rất đáng báo động, đặc biệt mức phát thải đang liên tục tăng, từ mức trên 21 triệu tấn CO2 trong năm 1990 lên 150 triệu tấn năm 2000. Dự tính lượng CO2 này sẽ tăng lên 300 triệu tấn vào năm 2020. Trong đó lĩnh vực năng lượng phát thải khí nhà kính nhiều nhất với 141.171 triệu tấn chiếm 53,1% tổng phát thải, tiếp theo là lĩnh vực nông nghiệp với 88.355 triệu tấn chiếm 33,2% tổng phát thải. [10] Sự tăng nhanh về phát thải khí nhà kính đã góp phần không nhỏ đến việc làm trầm trọng hơn thời tiết cực đoan của Việt Nam. Thống kê cho thấy, trong vòng 10 năm trở lại đây, các loại thiên tai như: Bão, lũ, lụt, lũ quét, sạt lở đất, úng, hạn hán, xâm nhập mặn và các thiên tai khác đã làm chết và mất tích hơn 9.000 người, giá trị thiệt hại về tài sản ước chiếm khoảng 1,5% GDP/năm. Ðiều đáng lo ngại, những biến động bất thường của thời tiết, khí hậu đã đe dọa nghiêm trọng đến an ninh lương thực và phát triển nông nghiệp do bị thu hẹp diện tích đất nông nghiệp, cũng như tác động lớn đến sinh trưởng, năng suất cây trồng, thời vụ gieo trồng.[10] 9
20. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.1.5 Các biện pháp giảm thiểu khí thải CO2 Song song với thực trạng hiện nay, các phương pháp giảm thiểu khí thải CO2 là một trong những vấn đề nhức nhói. Những biện pháp đề xuất phải phù hợp với ngân sách và đồng thời hiệu quả cao. Một số các biện pháp hóa học, vật lý để giảm thiểu khi nhà kính có thể kể đến như: − Phương pháp xử lý khí CO2 Hấp thụ bằng dung dịch etanolamin − Phương pháp xử lý khí CO2 Hấp thụ bằng dung dịch amoniac − Các phương pháp xử lý khí CO2 Hấp thụ bằng nước − Hấp thụ CO2 bằng huyền phù CaCO3 − Hấp phụ vật lý của các phương pháp xử lý khí CO2 − Hấp phụ vật lý của các phương pháp xử lý khí CO2 Một số biện pháp thông thường mà hằng ngày chúng ta có thể lam được như: Tái sử dụng và tái chế Góp phần giảm thiểu chất thải bằng cách chọn các sản phẩm tái sử dụng thay vì dùng một lần. Mua sản phẩm với bao bì tối thiểu sẽ giúp giảm chất thải. Bạn có thể tái chế giấy, nhựa, báo, thủy tinh và lon nhôm bất cứ lúc nào. Bằng cách tái chế một nửa số rác thải sinh hoạt của bạn, bạn có thể giảm khoảng 1,2 tấn khí CO2 mỗi năm.[10] Hạn chế sử dụng lò sưởi và điều hòa nhiệt độ Hãy làm cho ngôi nhà, căn phòng của bạn được kín kẽ bằng cách sử dụng các loại cửa cách âm, cách nhiệ có thể làm giảm chi phí sưởi ấm, làm mát của bạn hơn 25%. Bạn chỉ cần cài đặt nhiệt lớn cao 2 độ vào mua đông và thấp hơn 2 độ vào mùa hè có thể tiết kiệm khoảng 2 tấn CO2 mỗi năm.[10] Lái xe thông minh và hạn chế sử dụng xe cá nhân Ít xe cá nhân có nghĩa là lượng khí thải ít hơn. Đi bộ và đi xe đạp để tiêt kiệm năng lượng và là hình thức tuyệt vời để tập thể dục, khám phá hệ thống giao thông cộng đồng của bạn. hoặc bạn có thể đi chung xe làm hoặc đi học. Khi bạn lái xe, để đảm bảo xe của bạn chạy một cách hiệu quả. Hãy giữ lốp xe luôn căng, như vậy có thể cải thiện hơn 3% lượng xăng của bạn, không chỉ giúp bạn tiết kiệm ngân sách mà còn giúp giảm 20 kg CO2 trong khí quyển. [10] 10
21. Đồ Án Tốt Nghiệp Mua những sản phầm tiết kiệm năng lượng hiệu quả Hãy mua một chiếc xe tiết kiệm nhiên liệu tốt. Thiết bị gia dụng hiện nay có một loạt các sản phẩm tiết kiệm năng lượng, và bóng đèn huỳnh quang nhỏ gọn được thiết kế để cung cấp ánh sáng trông tự nhiên hơn trong khi sử dụng ít năng lượng hơn so với bóng đèn sợi đốt. Tránh các sản phẩm đi kèm như bao bì dư thừa , đặc biệt là các bao bì mà không thể tái chế được. Nếu bạn giảm rác thải hộ gia đình của bạn bằng 10 phần trăm, bạn có thể tiết kiệm 500 tấn CO2 mỗi năm. [10] Sử dụng ít nước nóng. Đặt bình đun nước nóng ở nhiệt độ vùa phải, và bọc nó trong một tấm chăn cách nhiệt nếu nếu đã sử dụng được 5 năm. Mua vòi hoa sen chảy chậm để tiết kiệm nước nóng và giảm khoảng 350 kg CO2 mỗi năm. Giặt quần áo và rửa mọi thứ bằng nước lạnh, sự thay đổi đó của một mình bạn có thể tiết kiệm ít nhất 500 kg CO2 mỗi năm. [10] Tiết kiện điện. Tiết kiệm điện và giảm sự nóng lên toàn cầu bằng cách tắt đèn khi ra khỏi phòng. Và hãy nhớ tắt ti vi và máy tính của bạn khi bạn không sử dụng chúng . Tắt nước khi bạn không sử dụng nó. Trong khi đánh răng hay rửa xe, tắt nước cho đến khi bạn thực sự cần nó để rửa. Bạn sẽ làm giảm hóa đơn tiền nước của bạn và giúp bảo tồn một nguồn tài nguyên quan trọng.[10] Trồng một cây Nếu bạn có điều kiện thì hãy bắt đầu, trong quá trình quang hợp, cây cối và các loài thực vật khác hấp thụ CO2 và tạo ra 02. Họ là một phần không thể thiếu của chu kỳ trao đổi không khí tự nhiên trên trái đất, nhưng có quá ít để đối phó sự gia tăng lượng khí carbon dioxide gây ra bởi phương tiện giao thông, sản xuất và các hoạt động khác của con người. Một cây sẽ hấp thụ khoảng một tấn carbon dioxide trong suốt cuộc đời của nó. [10] 11
22. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.2 Tổng quan về vi khuẩn quang hợp 1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp (VKQH) Nhóm vi khuẩn quang hợp nhờ có sắc tố diệp lục. Chất diệp lục vi khuẩn khác với chất diệp lục của thực vật và không tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi. Chúng sử dụng nguồn hidro là sunfit thiosunfat, hidro tự do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sản phẩm phụ dạng oxi hóa. Bao gồm: vi khuẩn lưu huỳnh lục,vi khuẩn không lưu huỳnh lục, vi khuẩn tía lưu huỳnh và vi khuẩn tía không lưu huỳnh.[1] • Vi khuẩn lưu huỳnh lục Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kị khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a cùng với b, c hoặc e, chứa carotene nhóm 5, hệ thống quang hợp liên quan đến các lục thể (chlorosom) và độc lập với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H2, H2S hay S. Hạt lưu huỳnh tíchc lũy bên ngoài tế bào, không có khả năng di động, một số loài có túi khí; tỷ lệ G+C là 48-58%.Gồm có các chi: Chlorodium, Prosthecochloris, Pelodictyon, Ancalichliris, Chloroherpeton.[12] • Vi khuẩn không lưu huỳnh lục Thuộc nhóm này là vi khuẩn đa bào, dạng sợi, thường kỵ khí không bắt buộc, thường là quang dị dưỡng (photoheterotrop), có loài quang tự dưỡng hoặc hóa dị dưỡng. Tế bào có chứa chlorophyll a và c, trong điều kiện kỵ khí thấy có chlorosom. Dùng để làm nguồn điện tử (electron donors) trong quang dị dưỡng là glucose, amino acid, acid hữu cơ, trong quang tự dưỡng là H2, H2S. Di động bằng phương thức trường (gliding), tỷ lệ G + C là 53-55%. Chi điển hình là Chloroflexux, Chloronema.[12] • Vi khuẩn quang hợp tía Vi khuẩn quang hợp tía là các tế bào gram âm, đơn bào, có các dạng cầu xoắn, hình que ngắn, hình phẩy đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi. Các loài vi khuẩn quang hợp tía đều sinh sản bằng cách nhân đôi, một số loài sinh sản bằng cách nảy chồi. Chúng có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học bởi quá trình quang hợp kỵ khí. VKQH tía thường có màu hồng đến màu đỏ tía, sắc tố quang hợp chính là bacteriocholorophyll a hoặc b. Cơ quan quang hợp là màng quang hợp được gắn với tế bào. [1] 12
23. Đồ Án Tốt Nghiệp Vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a hoặc b , hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H2, H2S hay S . Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, có loài chu mao, tỷ lệ G+C là 45- 70%.[13] Vi khuẩn quan hợp tía không lưu huỳnh. Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi khuẩn quang dị dưỡng hữu cơ (photoorganoheterotrophs) thường kỵ khí bắt buộc, một số loài là quang tự dưỡng vô cơ không bắt buộc (trong tối là hoá dị dưỡng hữu cơ- chemoorganoheterotrophs). Tế bào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng chất hữu cơ, đôi khi sử dụng hợp chất lưu huỳnh dạng khử hoặc H2. Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, hoặc không di động, một số loài có túi khí (gas vesicles), tỷ lệ G+C là 61-72%.[13] Bảng 1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn tía lưu huỳnh và không lưu huỳnh Đặc điểm Ví dụ Nhóm/loài Vi khuẩn tía lưu huỳnh (grammaproteobacteria) Vi khuẩn tía không lưu huỳnh (alpha- hoặc betaproteobacteria) Một số loài chính Vi khuẩn tía lưu huỳnh: Allochromatium vinosum, Thiocapsa roseopersicina. Vi khuẩn tía không lưu huỳnh: Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Rhodopseudomonas palustris Sắc tố/ màu sắc của huyền phù tế bào BChl a hoặc b, carotenoid chính, spirilloxanthin, speherodene, lycopene, 13
24. Đồ Án Tốt Nghiệp rhodopsin và dẫn xuất của chúng Màu sắc huyền phù tế bào: tía, đỏ tía, đỏ, tía- tím, cam, nâu, vàng-nâu (với những loài chứa BChl a), xanh hoặc vàng (với những loài chứa BChl b) Vị trí sắc tố trong tế bào Nằm trong lớp màng sinh chất, được sắp xếp thành dạng ống, dạng màng, dạng túi hoặc dạng phiến lamellae. Phổ hấp thụ cực đại của tế bào sống Những loài chứa BChl a gần 800nm và những vùng có bước sống từ 815-960nm Với những loài chứa BChl b: 835-850 nm và 1010-1040 nm 0 2- 2+ Chất cho electron/ giọt lưu huỳnh Sulfide, S , 푆2 3 , H2, Fe Nếu S0 được hình thành từ quá trình oxi hóa sulfide thì S0 được tích lũy trong tế bào, và điều này chỉ xảy ra ở vi khuẩn tía có lưu huỳnh Quang tự dưỡng/ hô hấp tối Vi khuẩn tía lưu huỳnh bị hạn chế về số lượng Vi khuẩn tía không lưu huỳnh đa dạng về số lượng (Nguồn trích từ Mỵ Trần Hương Trà, 2015) 1.2.2 Nguyên lý chung quá trình quang hợp và khả năng cố định CO2 ở vi khuẩn Tất cả vi khuẩn quang hợp đều chứa sắc tố quang hợp. Sắc tố quang hợp ở vi khuẩn được gọi là bacteriochlorophyll, chlorophyll và bacteriochlorophyll còn được gọi là chất dệp lục và chất khuẩn lục. Chất diệp lục, khuẩn lục và huyết sắc có cấu trúc tương tự nhau, đó là một vòng pocphiril do 4 nhân pirol liên kết với nhau. Lõi của chất diệp lục và chất khuẩn lục là Mg, còn lõi của của huyết sắc tố là Fe, chất diệp lục a khác với chất khuẩn lục a, b, c, d, e ở gốc 7 gốc R (từ R1 đến R7).[14] Chúng thuộc loại tự dưỡng quang năng, có thể sử dụng CO2 làm nguồn carbon tổng hợp nên chất hữu cơ của cơ thể, dưới tác động của năng lượng ánh sáng mặt trời. Phương trình có thể biểu diễn như sau: 14
25. Đồ Án Tốt Nghiệp 2CO2 + H2S + 2H2O (CH2O) + H2SO4 Trong quá trình oxy hóa H2S, lưu huỳnh được tích lũy. Sau đó S được chuyển hóa thành SO4 và dần dần ra ngoài. Vi khuẩn cũng có thể dung đồng thời H2S nhu chất cho H trong cả quá trình quang hợp.[14] Khi quang hợp, chu trình calvin, hệ thống cố định notơ, hệ thống DMSO/DMSOR được tế bào sử dụng để duy trì thế oxy hóa khử. Các phản ứng của chu trình calvin cho phép CO2 có chức năng thu nhận các lực khử dư thừa do trao đổi chất các chất hữu cơ nhu malate, succinate. Do đó, vai trò của chu trình calvin trong suốt quá trình sinh trưởng quang dị dưỡng là giữ thế cân bằng oxy hóa khử trong tế bào. Khi tế bào sinh trưởng trong điều kiện quang tự dưỡng thì vai trò chủ yếu của chu trình calvin là cố định CO2 để tổng hợp vật liệu tế bào. Chính nhời tính lưỡng cực này mà chu trình calvin có vai trò điều khiển giữa hai quá trình quang tự dưỡng và quang dị dưỡng. [1] (Nguồn trích từ Mike Jones, 2010) Hình 1.1 Sơ đồ về chu trình Calvin 15
26. Đồ Án Tốt Nghiệp 1.2.3 Ảnh hưởng các nhân tố hóa lý đến sinh trưởng vi khuẩn quang hợp tía 1. Độ pH Quang hợp của vi khuẩn quang hợp tía có thể xảy ra trong môi trường có pH 3-11. Vi khuẩn tía sinh trưởng và phát triển ở pH tối ưu khoảng 6-7.[15] 2. Cường độ ánh sáng Vi khuẩn quan hợp tía sử dụng ánh sáng để quang hợp, phát triển mạnh ở môi trường có ánh sáng đỏ, ngoài ra chúng có thể phát triển quang dưỡng và trong bóng tối.[15] 3. Nhiệt độ Quang hợp của vi khuẩn có thể xảy ra ở nhiệt độ lên tới 570C và xuống tới 00C. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ở 300C. [16] 4. Các yếu tố khác Nhiều loài vi khuẩn tía có thể sinh trưởng quang dưỡng với sulfide như là chất cho điện tử với nồng độ nhỏ hơn 2 mM. Nếu trong môi trường sống có nồng độ sulfide quá cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của chúng .Ngoài ra nồng độ NaCl trong môi trường cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn tía. Có loài sống được trong môi trường nước biển có độ mặn từ 8-11%NaCl. [17] 1.2.4 Ứng dụng của vi khuẩn quang hợp Vi khuẩn quang hợp dần trở nên phổ biến hơn khi những mặt lợi ích của chúng được thể hiện rõ qua thời gian. Chúng được sử dụng trong xử lý nhiều loại nước thải có nguồn gốc nông nghiệp, chăn nuôi, chế biến nông sản, nuôi trồng thủy hải sản, thậm chí cả công nghiệp khai thác dầu khí. Sinh khối của nhóm vi khuẩn này còn rất giàu dinh dưỡng nên có thể sử dụng như một nguồn thức ăn tươi sống trong nuôi giống thủy hải sản. Làm thuốc làm sạch chất nước của nước nuôi trồng Trong quá trình nuôi hải sản, định kỳ cho một lượng vi khuẩn quang hợp thích hợp vào nước nuôi, có thể làm mất ion N trong nước và các vật sinh ra do phân giải vật hữu cơ khác từ đó đạt tới việc không thay nước mà vẫn có thể giữ được môi trường nước tốt. Ðiều đó chủ yếu là do vi khuẩn quang hợp ở trong nước có thể lợi dụng vật hữu cơ làm vật cung ứng H để tiến hành tác dụng quang hợp, đồng thời với việc loại 16
27. Đồ Án Tốt Nghiệp bỏ vật ô nhiễm, bản thân vi khuẩn quang hợp cũng sinh sôi tăng trưởng, đạt tới tác dụng tuần hoàn ưu việt.[18] Dự phòng và điều trị bệnh Do sự sinh sôi nhanh chóng của vi khuẩn quang hợp, mà hạn chế sự sinh sôi của khuẩn khác gây bệnh. Theo thông báo, vi khuẩn quang hợp có tác dụng rõ rệt đối với bệnh đỏ vỏ tôm, bệnh đen mang, bệnh khuẩn dạng sợi. Và khuẩn quang hợp trong quá trình chuyển hoá có thể sinh ra loại men chống độc tố bệnh (men phân giải trypsin, có tác dụng dự phòng và chữa trị bệnh tôm cá). Theo thông báo, vi khuẩn quang hợp có thể điều trị bệnh loét mang của cá chép do vi khuẩn dính gây nên. Theo thông báo khác, dùng vi khuẩn quang hợp ít hơn 10 lần, đối với cá chép bị bệnh có lỗ, cá chình bị bệnh mốc nước và đỏ vây, bệnh cảm nhiễm do bị sát thương của cá trác đen, tắm thuốc từ 10 -15 phút, sau lại đem nuôi trong nước có thả một lượng thích hợp vi khuẩn quang hợp, độ nửa tháng có thể chữa khỏi. Sử dụng lâu dài trong ao nuôi cua, có thể tránh xảy ra bệnh thiếu máu.[18] Làm thức ăn cho ấu thể tôm cá Vi khuẩn quang hợp có giá trị dinh dưỡng rất cao hàm lượng prôtêin đạt trên 60%, đồng thời còn chứa vitamin nhóm B phong phú và folacin, sinh vật tố và chất thúc lớn sinh vật chưa biết, chấy lượng của nó thì men không có cách gì so sánh được. Còn khuẩn thể của vi khuẩn quang hợp rất nhỏ (chỉ là 1/20 của tảo tiểu cầu), do đó, còn là thức ăn vừa miệng nhất của ấu thể cá, tôm, nhuyễn thể có vỏ. Trong quá trình nuôi ấu thể cá, tôm, nhuyễn thể có vỏ ứng dụng vi khuẩn quang hợp có thể nâng cao tỷ lệ sống, tăng nhanh sự sinh trưởng, giảm bớt lượng nước thay. Cuối cùng nguyên nhân của nó, một là làm sạch nước, cải thiện môi trường nước, hai là làm thức ăn cho ấu thể, ba là vi khuẩn quang hợp sau khi trở thành loài ưu thế của khối nước, vật chất sinh trưởng do nó giải phóng ra có thể làm cho một số nguyên nhân bệnh khó tồn tại, có thể giảm bớt bệnh của ấu thể, từ đó nâng cao tỷ lệ sống của ấu thể.[18] Làm chất phụ gia cho thức ăn có chất lượng Vi khuẩn quang hợp gồm vật chất sống có nhiều loại công năng thúc đẩy sinh trưởng và vật hoá hợp chất béo (nhân tố sinh trưởng) v.v Do đó, nó có thể trực tiếp làm chất phụ gia cho thức ăn. nếu trong thức ăn cho thêm vi khuẩn quang hợp thì không cần phải thêm chất phụ gia vào thức ăn nữa. Vì giá thành không cao, thông 17
28. Đồ Án Tốt Nghiệp thường trong thức ăn tăng 0,5 -1% là có thể tăng rõ rệt hiệu quả thức ăn và tỷ lệ tăng trọng. Căn cứ kết quả thí nghiệm cho biết, vi khuẩn quang hợp dùng cho nuôi cá chình Nhật Bản tỷ lệ tăng trọng có thể cao tới 10%, dùng để nuôi tôm he dưới 8 mm, mỗi mẫu có thể tăng sản lượng 12% dùng để nuôi cá nước ngọt, mỗi mẫu có thể tăng sản lượng 25%.[18] 1.3 Phương pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào vật liệu di truyền là một phương pháp tin cậy, có độ chính xác cao, tiến hành trong thời gian ngắn, không cần nuôi cấy, khắc phục được một nhược điểm lớn của phương pháp định danh truyền thống là phải nuôi cấy, tiến hành nhiều phản ứng sinh hóa phức tạp, tuy nhiên đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại, cơ sở dữ liệu, thông tin về đặc điểm di truyền của đối tượng cần nghiên cứu đầy đủ. Trình tự gen 16S rDNA với chiều dài khoảng 1500 bp mã hóa cho cấu trúc phân tử 16S ribosome thể hiện sự tiến hóa của hệ thống vi sinh và là một công cụ tuyệt vời để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh loài. Lý do để sử dụng những trình tự này làm chỉ thị phân tử đó là cấu trúc phân tử rRNA là yếu tố cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp protein ở tất cả các hệ thống tế bào. Do đó gen mã hóa cấu trúc 16S rDNA có tính bảo tồn cao, chứa những vùng tương đồng giữa các loài. Nếu giữa các loài có mối quan hệ họ hàng thì độ tương đồng càng cao [19]. Để thể hiện lịch sử tiến hóa của một nh1om các loài có mối quan hệ với nhau, các phương pháp giải trình tự đoạn gene 16S rDNA và việc xây dựng cây phát sinh loài hiện nay đã trở nên khá phổ biến và được xây dựng trên cơ sở dữ liệu của sinh học và tin học (sinh tin học). Những trình tự mới này sẽ được so sánh với những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gene bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần mềm sinh tin học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp những thông tin có liên quan đến tiến hóa. 18
29. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu Làm việc tại Phòng Vi sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới 9/621 Xa lộ Hà Nội, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 03/2018 – 07/2018 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn quang hợp, có khả năng cố định CO2 từ các nguồn nước từ ruộng lúa 2.1.4 Nguồn mẫu Nguồn mẫu phân lập được thu tại rừng ngập mặn huyện Ngọc Hiển thuộc tỉnh Cà Mau nằm ở vị trí 8066’65’’ vĩ độ Bắc, 105000’28’’ Kinh độ Đông và Đức Hòa thuộc tỉnh Long An nằm ở vị trí 100 90’23’’ vĩ độ Bắc, 106041’85’’ Kinh độ Đông A B Hình 2.1 Mô phỏng vị trí lấy mẫu tại Đức Hòa (A) và Ngọc Hiển (B) 19
30. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.1 Hóa chất Hóa chất sửng dụng để nhuộm Gram vi khuẩn − Dung dịch Iodine − Dung dịch Crystal Vilolet − Dung dịch Safranin − Dung dịch Methanol Hóa chất sử dụng ly trích trong DNA − Agarose − Đệm CTAB − Chloroform Isoamyl alchol − Isopropanol, Etanol − TAE 1X − Loading dye Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR − Nước khử ion − Thang DNA 1kb − MyTaq Mix DNA Polymerase − Cặp primer: 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ 20
31. Đồ Án Tốt Nghiệp Hóa chất sử dụng tron tinh sạch DNA − Nước khử ion − Buffer PB − Buffer PE Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn BIM (Basic Isolation Media) Bảng 2.1 Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy Nước cất 1 L (NH4)2SO4 1 g KH2PO4 0.5 g MgSO4 0.2 g NaCl 2 g NaHCO3 5 g Yeast extract 1.5 g Glycerol 1.5 g pH 7 (Nguồn trích từ Brown, 2012) Thêm 2,5% Agar để được môi trường thạch. Môi trường được hấp khử trùng ở 121℃ trong vòng 15 phút 2.2.2 Dụng cụ Ống nghiệm, erlen, đĩa petri, que cấy, ống đong, ống nhỏ giọt, lam kính, bao tay, 2.2.3 Thiết bị Pipepette, micropipepette, microwave, cân phân tích, kính hiển vi, pH kế, tủ sấy, nồi hấp autoclave, tủ cấy, tủ lạnh, máy ly tâm, bình khí CO2, máy PCR, máy điện di, 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu Vi khuẩn quang hợp phân bố rộng rãi trong tự nhiên như ở các vùng ao, hồ, đặc biệt là các vùng ao lúa có ánh nắng chiếu rọi cao . Các mẫu thu thập được kiểm tra pH trước khi thu. Dụng cụ thu mẫu bao gồm túi nilon dày, ly nhựa. Ta sử dụng ly nhựa để múc nước ao ruộng cùng với vớt 1 lớp đất trồng dày khoảng 2-3 cm phân phối vào trong bịch nilon. Lưu ý rằng mỗi vùng thu mẫu tương ứng với mỗi ly nhựa khác nhau, tránh sự lây nhiễm từ ao này sang ao khác. Sau đó bịch mẫu được cột chặt bằng dây thun, ký hiệu tên mẫu, địa điểm thu mẫu và vận chuyển về địa điểm nghiên cứu để tiến hành phân lập. 21
32. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.3.2 Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp cố định CO2 Mẫu Tăng sinh 10 ngày Pha loãng mẫu đến 10-3 Phân lập Ủ 3 -4 ngày ở nhiệt độ phòng, nơi có ánh nắng chiếu rọi Làm thuần Cấy ria làm thuần mẫu 2 lần Kiểm tra hình thái khuẩn lạc Nhuộm gram và soi kính Khảo sát sự tăng trưởng ở các nồng độ muối khác nhau Kiểm tra khả năng cố định CO2 Bảo quản giống Định danh Hình 2.2 Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp 22
33. Đồ Án Tốt Nghiệp 2.3.3 Phương pháp tăng sinh mẫu Môi trường lỏng cơ bản BIM được sử dụng để tăng sinh các nguồn mẫu. Môi trường lỏng được chuẩn bị và phân phối vào ống nghiệm với thể tích 10 ml, sau đó mẫu nước được đổ vào ống môi trường sao cho mẫu gần ngập đầy miệng ống nghiệm để tránh sự sinh trưởng của tảo. Tất cả mọi thao tác đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng, các ống sau đó được đặt ở vị trí có sự tiếp xúc của ánh nắng mặt trời và quan sát sự thay đổi màu sắc trong vòng 10 ngày. 2.3.4 Phương pháp phân lập mẫu Đối với nguồn mẫu phân lập trực tiếp, tiến hành pha loãng mẫu nước ở các nồng độ khác nhau từ 10-1, 10-2, 10-3 nhằm thu được các khuẩn lạc riêng rẽ khi ta trải đĩa, mỗi nồng độ pha loãng tương ứng với 1 ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Ta hút 1 ml từ nguồn mẫu cho vào ống thứ nhất để được nồng độ 10-1, tiếp theo ta hút 1 ml từ ống có nồng độ 10-1 cho vào ống thứ 2 để đạt nồng độ 10-2, và làm tương tự đối với ống thứ 3 để đạt nồng độ 10-3 Ta phân lập bằng cách cấy trải 0,1 ml dịch nuôi cấy ở mỗi nồng độ pha loãng lên môi trường thạch BIM, ủ ỏ nhiệt độ phòng trong 2 – 3 ngày. Sau khi khuẩn lạc hình thành trên bề mặt đĩa môi trường, ta tiến hành chọn những khuẩn lạc có hình dạng và màu sắc khác nhau và cấy chuyền 2 -3 lần để sang đĩa thạch khác để thu được khuẩn lạc đồng nhất Đối với mẫu tăng sinh, tiến hành pha loãng ống tăng sinh đến nồng độ 10-3, cấy trải trên bề mặt đĩa thạch BIM với thể tích 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng như trên Sau khi các chủng vi khuẩn đã được làm thuần sẽ được đem đi nhuộm Gram để quan sát đặc điểm hình thái và màu sắc 2.3.5 Phương pháp, kỹ thuật nhuộm Gram Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Các hóa chất được sử dụng trong kỹ thuật này bao gồm: Crystal Violet, Lugol, Safranin và cồn 960 Cách tiến hành: 1. Sử dụng que cấy vòng vô trùng lấy một ít khuẩn lạc thuần mà ta mong muốn trên đĩa thạch trải và hòa vào 1 – 2 giọt nước cất được nhỏ trên giữa phiến kính Lamen. 23
34. Đồ Án Tốt Nghiệp Để cố định tế bào, ta sử dụng kẹp thủy tinh để gắp phiến kính và hơ lửa trên ngọn đèn cồn cho đến khi bề mặt kính khô. 2. Tiếp đến ta nhỏ 1 – 2 giọt thuốc nhuộm Crystal Violet trên vị trí mà ta cố định khuẩn lạc trước đó và để yên trong vòng 50 – 60 giây. Sau đó ta rửa sạch thuốc nhuộm bằng bình tia có chứa nước cất và thấm khô. 3. Tiếp theo, ta nhỏ 1 -2 giọt thuốc nhuộc Lugol ở vị trí có định khuẩn lạc trong vòng 50 – 60 giây. Sau đó ta rửa nước và thấm khô. 4. Sau khi nhỏ Lugol, ta nhỏ vài giọt cồn 960 trên phiến kính trong vòng 10 – 15 giây để tẩy màu, rửa nước và thắm khô 5. Cuối cùng, nhuộm bằng dung dịch Safranin bằng cách nhỏ 1 – 2 giọt trong vòng 50 – 60 giây, rửa nước thấm khô. Các mẫu trên sau đó được đem đi quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học, quan sát ở vật kính 100X và chụp ảnh bằng màn hình LCD được kết nối với thiết bị 2.3.6 Phương pháp khảo sát sự tăng trưởng của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau Các chủng vi khuẩn sau khi quan sát hình thái được khảo sát khả năng tăng trưởng qua các nồng độ muối khác nhau trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung NaCl nồng độ 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 phần nghìn. Ta tiến hành dung que cấy chuyển khuẩn lạc thuần chủng cho vào môi trường lỏng có các nồng độ muối khác nhau. Thời gian theo dõi trong vòng 7 ngày liên tục Khả năng tăng trưởng được theo dõi thông qua dịch huyền phù của tế bào thông qua máy đo OD tự động Bio - Rad ở bước song 660. 2.3.7 Phương pháp khảo sát khả năng tăng trưởng và sử dụng nguồn CO2 của vi khuẩn quang hợp Sau khi khảo sát sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau. Ta tiến hành kiểm tra sự hấp thụ CO2 của các chủng Ta sử dụng que cấy chuyển khuẩn lạc thuần chủng và hòa tan vào nước cất vô trùng, tiến hành đo OD đạt giá trị khoảng 0,1 nhằm có lượng tế bào đầu vào cân bằng giữa các chủng khảo sát, ly âm và thu hồi tế bào và cho môi trường BIM lỏng và bổ sung hỗn hợp khí H2: O2: CO2 theo thời gian 8 phút: 1 phút: 2 phút thông qua bình nén khí có đưởng ống kết nối với một kim tiêm vô trùng, đâm xuyên qua ống nấp nhựa ống 24
35. Đồ Án Tốt Nghiệp nghiệm, thổi khí trực tiếp vào môi trường lỏng. Qua đó, một đầu ống tiêm khác cũng được bố trí như trên, nhưng không tiếp xúc với môi trường và không kết nối với bình khí, đầu kim tiêm này nhằm mục đích dẫn các thành phần khí không cần thiết có trong ống nghiệm ra bên ngoài. Lô đối chứng không bổ sung hỗn hợp khí như trên. Các thành phần khí không Ống dẫn kết nối cần thiết với bình khí Kim tiêm Môi trường lỏng BIM Hình 2.3 Mô hình thí nghiệm thổi khí vào môi trường lỏng Khả năng tăng trưởng được theo dõi thông qua quan sát sự gia tăng liên tục độ đục của môi trường. 2.3.8 Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn DNA có kích thước lớn, mọi việc chiết tách cần phải tránh mọi tác nhân cơ học, hoá học tới phân tử DNA này.Việc tách DNA từ tế bào vi khuẩn được chia làm bốn bước cơ bản: 1. Nuôi cấy và thu sinh khối Tùy từng loại vi khuẩn mà người nghiên cứu chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau như nhiệt độ, độ pH, và điều kiện dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn.Tách tế bào ra khỏi dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm và làm sạch tế bào. Thông thường khoảng 1.000ml dịch nuôi cấy li tâm và thu lấy khoảng 10ml cặn vi khuẩn. 2. Phá vỡ màng tế bào và giải phóng các thành phần bên trong Acid nucleic được giải phóng ra khỏi màng tế bào bằng phương pháp hóa học và sinh học để thu dịch chiết tế bào.Enzyme lysozyme là một enzyme có trong lòng trắng trứng hoặc phage T4, có khả năng phá vỡ thành phần trùng hợp của thành tế bào. EDTA (TrilonB) tạo phức với 25
36. Đồ Án Tốt Nghiệp Mg+2 dạng hòa tan và làm vỡ thành tế bào. Đồng thời EDTA ngăn không cho enzyme trong tế bào phân hủy DNA. Người ta còn có thể phá vỡ màng tế bào và giải phóng DNA ra khỏi liên kết histon bằng chất tẩy rửa SDS (Sodium Derecyl Sylfat) hoặc enzyme protease. Các chất phá vỡ màng này làm li giải màng, tách rời các phần tử lipit và gây ra sự gẫy màng tế bào. 3. Làm sạch DNA từ dịch chiết tế bào Loại bỏ các thành phần không mong muốn như protein, lipit và các thành phần khác bằng kế ttủa phân đoạn. Mẫu được lắc mạnh trong hệ dung môi phenol- chloroform để biến tính, kết tủa protein và giải phóng acid nucleic vào dung dịch lỏng. Protein bị biến tính sẽ tách ra khỏi pha nước có chứa DNA sẽ được tách ra nhờ ly tâm. Dịch nổi gồm acid nucleic và nước được hút ra và tiếp tục phân hủy RNA bằng enzyme RNase. Sau đó, tách DNA và nước để thực hiện bước phân tích tiếp theo. 4. Thu hồi DNA dạng đặc Mục đích của bước này là thu DNA dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của enzyme. Có 2 phương pháp kết tủa: Kết tủa DNA trong etanol với sự có mặt Na+nồng độ cao, nhiệt độ thấp, tỷ lệ giữa etanol và mẫuphân tích là 3:1.- Kết tủa trong izopropanol, tỷ lệ giữa rượu và mẫu là 1:1. Với phương pháp này không cần sự cómặt của muối và loại được DNA có phân tử lượng thấp. Ly tâm cao tốc và thu nhận DNA dạng cô đặc.Trong cả hai phương pháp, DNA thu được sẽ rửa trong etanol-70% để loại izopropanol và muối để thu được DNA tinh khiết. 2.3.9 Khuếch tán DNA bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR là 27F (5’- AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3’) và 1492R (5’- GGTTACCTTGTTACG ACTT-3’), cặp mồi phổ rộng đặc trưng cho vi khuẩn. Thành phần phản ứng PCR 16S rRNA gồm có: 1 μl 27F và 1 μl 1492R (pmol/μl), 12.5 μl nước sinh học phân tử, 9.5 μl master mix (Bioline, Anh) và 1 μl mẫu DNA. Tổng thể tích phản ứng là 25 μl. Thông số của chu trình phản ứng PCR 16S rRNA được thể hiện như trong hình 26
37. Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 2.4 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA Sau phản ứng PCR, ta tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm ly trích DNA, sản phẩm PCR trên gel 1% agarose 1 gram bột agarose hòa vào 100ml dung dịch đệm Tris – acetate – EDTA (TAE), gia nhiệt để agarose tan hoàn toàn. Sau khi nhiệt độ gel xuống còn 50 – 55oC thì tiến hành đổ gel và lắp lược 8 giếng vào khuôn điện di. Khi miếng gel đặc lại hoàn toàn thì cho vào buồng điện di chứa đệm TAE sao cho dung dịch cao hơn mặt gel 3 – 5 mm. Tiến hành trộn sản phẩm ly trích DNA/PCR vào dịch Loading dye (6X) theo tỷ lệ 5:1 (v/v, μl). Nạp hỗn hợp vào trong các giếng. Tiến hành điện di mẫu với điện thế 90V trong khoảng 20 – 30 phút. Sau khi điện di, miếng gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide trong 15 phút, rửa lại bằng nước trong 2 phút. Cuối cùng quan sát vệt DNA xuất hiện trên gel dưới ánh sáng UV. 2.3.10 Giải trình tự DNA và định danh Mẫu sản phẩm PCR kèm theo mồi xuôi 27F được gửi tới công ty Nam Khoa Biotek để thực hiện giải trình tự một chiều. Kết quả gửi về công ty sẽ được đọc bằng phần mềm MEGA5 ( Chọn vùng trình tự ổn định và so sánh với ngân hàng BLAST của NCBI ( để tìm ra các chủng tương đồng. Kết quả chấp nhận khi mức tương đồng trình tự đạt trên 98%. Dựa vào cây phát sinh loài kết hợp hình thái, khả năng sinh hóa của các chủng để định danh ở mức cấp loài. 27
38. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Từ 63 mẫu nước ban đầu thu thập từ Long An và Cà Mau, tiến hành phân lập được 44 chủng vi khuẩn trên trường thạch BIM. Kết quả thu nhận được là, 12 chủng vi khuẩn được phân lập và làm thuần từ 22 mẫu nước ao ruộng từ Long An; 32 chủng vi khuẩn được phân lập và làm thuần từ 41 mẫu nước từ rừng ngập mặn Cà Mau. Từ 44 chủng tiếp tục tiến hành sàng lọc sơ bộ các chủng không thuộc nhóm vi khuẩn quang hợp thông qua quan sát đặc điểm hình thái bằng kỹ thuật nhuộm Gram so sánh với đặc điểm hình thái của vi khuẩn quang hợp, hầu hết các vi khuẩn quang hợp đều bắt Gram (+) và có hình thái đa dạng như hình cầu, oval, trứng, que, Sau khi chọn lọc các chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái thích hợp, tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng thông qua các nồng độ muối khác nhau và khả năng cố định CO2 để lựa chọn những chủng vi khuẩn tốt nhất đáp ứng cả 2 thí nghiệm trên. Sau hai thí nghiệm trên đã chọn ra 5 chủng đại diện trên tổng số 44 chủng ban đầu, 5 chủng vi khuẩn này được tiến hành ly trích DNA và khuyếch đại đoạn gene bằng kỹ thuật PCR và tinh sạch bằng bộ kit The QIAquick PCR Purification (QIAGEN). Sản phẩm PCR được giải trình tự. 5 chủng vi khuẩn được chọn lọc để định danh bao gồm : RL1.2, CM23.1, CM24.1, CM34.3 3.1 Kết quả thu mẫu Các mẫu nước được thu nhận từ các ao ruộng ở huyện Đức Hòa, thuộc tỉnh Long An và rừng ngập mặn huyện Ngọc Hiển thuộc tỉnh Cà Mau thu nhận được 22 mẫu nước ruộng ở Đức Hòa, 41 mẫu nước từ rừng ngập mặn ở Ngọc Hiển. Các mẫu nước từ ao ruộng thuộc huyện Đức Hòa nằm ở vi trí 100 90’23’’ vĩ độ Bắc, 106041’85’’ Kinh độ Đông, khu vực lấy mẫu chủ yếu ở Ấp 2 và Ấp 4, xã Hữu Thạnh . Các mẫu nước từ rừng ngọc mặn thuộc huyện Ngọc Hiển nằm ở vị trí 8066’65’’ vĩ độ Bắc, 105000’28’’ Kinh độ Đông, khu vực lấy mẫu chủ yếu ở Liên tiểu khu 104 – Xã Viên An Đông, rừng phòng hộ Nhưng Miên. 28
39. Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 3.1 Danh sách các nguồn mẫu từ Long An và Cà Mau Hình ảnh một số mẫu được thu thập từ Long An Tên pH Mẫu Tên pH Mẫu Địa điểm thu mẫu mẫu ban mẫu ban đầu đầu RL1 3.7 RL2 4.17 ấp 2 – xã Nhị Thành, huyện Thủ Thừa, Long An RL3 4.3 RL4 3.12 ấp 2- xã Hựu Thạnh, huyện Đức Hòa, Long An RL5 3.8 RL6 4.8 ấp 2 – xã Hựu Thạnh, huyện Đức Hòa, Long An 29
40. Đồ Án Tốt Nghiệp RL7 3.78 RL8 5.17 ấp 2 – xã Hựu Thạnh, huyện Đức Hòa, Long An RL9 5.23 RL10 6.94 ấp 4 – xã Hựu Thạnh, huyện Đức Hòa, Long An 30
41. Đồ Án Tốt Nghiệp Hình ảnh một số mẫu được thu thập từ Cà Mau CM1 6.3 CM2 6.07 Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau CM3 6.4 CM4 6.24 Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau CM5 6.23 CM6 6.53 Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau CM7 6.4 CM8 6.33 Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau 31
42. Đồ Án Tốt Nghiệp CM9 6.43 CM10 6.32 Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau CM11 6.43 CM12 6.32 Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau Từ 22 mẫu nước từ ao ruộng huyện Đức Hòa, thuộc tỉnh Long An, nhìn chung giá trị pH được đo ban đầu trước khi thu mẫu nằm trong ngưỡng từ 3.12 cho đến dưới 6,94 điều này cho ta thấy rằng môi trường nguồn mẫu ta thu được có tính acid cao. So sánh với 41 nguồn mẫu tại Cà Mau, các mẫu nước từ rừng ngập mặn này có giá trị pH cao hơn hẳn so với nguồn mẫu tại Long An, giá trị pH các mẫu nằm trong ngưỡng từ 6,03 đến 6,88, điều này cho thấy rằng môi trường tại nguồn mẫu thu được mang tính kiềm và thích hợp cho sự phát triển nhóm vi khuẩn quang dưỡng. Theo Hunter và cộng sự, năm 2009, vi khuẩn quang hợp phát triển tối ưu ở điều kiện pH= 6 – 7 [15], cho nên nhiều khả năng cho thấy rằng nguồn mẫu từ Cà Mau là nguồn mẫu tốt khi phân lập số lượng vi khuẩn quang hợp sẽ nhiều hơn so với các mẫu thu được tại Long An. 32
43. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.2 Kết quả tăng sinh mẫu Tiến hành tăng sinh các mẫu nước bằng cách đổ gần ngập đến miệng ống nghiệm có chứa 10 lít môi trường lỏng BIM, khóa chặt ống bằng nắp vặn nhựa và đem mẫu tăng dưới ánh sáng tự nhiên trong một khoảng thời gian 10 ngày. Những ống nghiệm tăng sinh thành công sẽ có màu đỏ nâu cho đến đỏ tía được đem đi phân lập. Bảng 3.2 Danh sách mẫu tăng sinh thành công từ các nguồn mẫu Long An và Cà Mau STT Chủng pH STT Chủng pH 1 RL1 3.70 20 CM18 6.66 2 RL6 5.87 21 CM19 5.43 3 RL7 3.78 22 CM22 6.62 4 RL8 5.17 23 CM23 6.50 5 RL10 6.94 24 CM24 6.60 6 RL13 4.27 25 CM25 6.47 7 RL22 4.05 26 CM26 6.48 8 CM2 6.07 27 CM27 6.47 9 CM4 6.24 28 CM29 6.53 10 CM6 6.53 29 CM30 6.88 11 CM7 6.46 30 CM31 6.50 12 CM8 6.33 31 CM32 6.65 13 CM9 6.43 32 CM33 6.51 14 CM10 6.32 33 CM34 6.61 15 CM11 6.43 34 CM35 6.67 16 CM12 6.34 35 CM37 6.53 17 CM13 6.52 36 CM38 6.43 18 CM14 6.37 37 CM39 6.63 19 CM17 6.36 38 CM40 6.44 33
44. Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 3.3 Hình ảnh một số ống mẫu tăng sinh có sự thay đổi màu rõ rệt STT Thời gian Mẫu tăng sinh thanh công Mẫu tăng sinh không thanh công 1 10 ngày tăng sinh 2 10 ngày tăng sinh 3 10 ngày tăng sinh 4 10 ngày tăng sinh 34
45. Đồ Án Tốt Nghiệp 5 10 ngày tăng sinh Từ kết quả bảng 3.2 cho thấy, nguồn mẫu tăng sinh thành công từ Cà Mau cao hơn so với nguồn mẫu Long An. Từ 22 mẫu được thu thập tại Long An, trong đó có 7 mẫu tăng sinh chuyển dần sang đỏ sau 10 ngày, chiếm tỉ lệ 31.8% . Từ 41 mẫu được thu thập tại Cà Mau, trong đó có 31 mẫu tăng sinh chuyển dần sang đỏ sau 10 ngày, chiếm tỉ lệ 75.6% . Tỉ lệ các nguồn mẫu tại Cà Mau cao gấp gần 2,5 lần nguồn mẫu tại Long An. Bên cạnh đó, dựa vào kết quả lập luận tại mục 3.1 kết quả thu mẫu, các nguồn mẫu tại Cà Mau cho kết quả tốt hơn do sự ảnh hưởng của pH, khi giá trị pH của các mẫu từ rừng ngập mặn có ngưỡng giá trị phù hợp với ngưỡng giá trị phát triển tối ưu mà ta đã đề cập phía trên, pH = 6 -7. 35
46. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.3 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái Từ 38 ống tăng sinh thành công có màu nâu đỏ sang đỏ tía từ các nguồn mẫu Long An và Cà Mau, tiến hành phân lập và làm thuần thu được 44 chủng. Các chủng được mô tả hình thái khuẩn lạc theo bảng 3.4 Bảng 3.4 Danh sách các chủng đã được phân lập từ 38 ống mẫu tăng sinh STT Ký hiệu Nguồn Mô tả khuẩn lạc chủng phân lập 1 RL1.2 RL1 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 2 RL1.4 RL1 Tròn, bóng, lồi, màu cam, rìa trơn 3 RL3.1 RL3 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 4 RL4.1 RL4 Tròn, trắng ngà, lồi, rìa trơn 5 RL5.1 RL5 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 6 RL5.2 RL5 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 7 RL8.1 RL8 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 8 RL11.1 RL11 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 9 RL10.1 RL10 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 10 RL14.1 RL14 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 11 RL14.2 RL14 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 12 RL19.1 RL19 Tròn, nhẵn, lồi, trắng đục, rìa trơn 13 RL20.1 RL20 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 14 CM6.1 CM6 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 15 CM7.1 CM7 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 16 CM11.1 CM11 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 17 CM12.1b CM12 Tròn, bóng, lồi, ngả vàng, rìa trơn 18 CM12.2 CM12 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 19 CM20.1b CM20b Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 20 CM20.2b CM20b Tròn, bóng, lồi, vàng, rìa trơn 21 CM23.1 CM23 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 22 CM24.1 CM24 Tròn, bóng, lồi, đỏ, rìa trơn 23 CM27.1 CM27 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 36
47. Đồ Án Tốt Nghiệp 24 CM28.1 CM28 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 25 CM30.1 CM30 Tròn, bóng, lồi, hồng nhạt, rìa trơn 26 CM19.1 CM19 Tròn, lồi, vàng, rìa trơn 27 CM19.2 CM19 Tròn, lồi, trắng đục, rìa trơn 28 CM19.3 CM19 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 29 CM34.1 CM34 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 30 CM34.2 CM34 Tròn, bóng, lồi, ngả vàng, rìa trơn 31 CM34.3 CM34 Tròn, bóng, lồi, đỏ, rìa trơn 32 CM35.1 CM35 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 33 CM37.1 CM37 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 34 CM40.1 CM40 Tròn, bóng, lồi, vàng cam, rìa trơn 35 CM40.2 CM40 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 36 CM9.1 CM9 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 37 CM10.1 CM10 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 38 CM25.1 CM25 Tròn, bóng, lồi, vàng, rìa trơn 39 CM39.1 CM39 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 40 CM31.1 CM31 Tròn, bóng, lồi, vàng, rìa trơn 41 CM31.2 CM31 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 42 CM18.1 CM18 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 43 CM33.1 CM33 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 44 CM13.1 CM13 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 37
48. Đồ Án Tốt Nghiệp RL1 RL8 RL34.3 RL23 RL24 RL10 O Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập và làm thuần trên môi trường BIM agar Tiến hành nhuộm Gram để quan sát đặc điểm vi thể, cũng như xác định được nhóm vi khuẩn thuộc Gram âm hay Gram dương 3.4 Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang. Kết quả của 43 chủng được thể hiện qua bảng 3.4 bên dưới Bảng 3.5 Kết quả đặc điểm hình thái vi khuẩn STT Ký hiệu Hình dạng Gram Ký hiệu Hình dạng Gram chủng STT chủng 1 RL1.2 Oval - 23 CM27.1 Oval - 2 RL1.4 Que, phẩy + 24 CM28.1 Que ngắn, cong - 3 RL3.1 Oval - 25 CM30.1 Oval - 4 RL4.1 Cầu - 26 CM19.1 Que - 5 RL5.1 Oval + 27 CM19.2 Oval - 6 RL5.2 Oval + 28 CM19.3 Que + 7 RL8.1 Cầu - 29 CM34.1 Que - 38
49. Đồ Án Tốt Nghiệp 8 RL10.1 Oval - 30 CM34.2 Oval - 9 RL11 Oval + 31 CM34.3 Oval - 10 RL14.1 Cầu + 32 CM35.1 Que ngắn - 11 RL14.2 Oval + 33 CM37.1 Que dài, cong - 12 RL19.1 Cầu + 34 CM40.1 Oval - 13 RL20.1 Oval + 35 CM40.2 Que ngắn, cong - 14 CM6.1 Que, cong - 36 CM9.1 Que, ngắn - 15 CM7.1 Oval - 37 CM10.1 Oval - 16 CM11.1 Que, cong - 38 CM25.1 Que - 17 CM12.1b Que ngắn, cong - 39 CM39.1 Oval + 18 CM12.2 Que dài, cong - 40 CM31.1 Oval - 19 CM20.1b Que ngắn, cong - 41 CM31.2 Cầu - 20 CM20.2b Oval - 42 CM18.1 Oval + 21 CM23.1 Oval - 43 CM33.1 Que + 22 CM24.1 Oval - 44 CM13.1 Que, cong - Tất cả vi khuẩn quang hợp đều bắt màu tím Gram (+), cho nên qua kỹ thuật nhuộm Gram, ta có thể loại suy ra những chủng vi khuẩn không nằm trong nhóm các chủng bắt Gram (+). Từ bảng kết quả 3.4 được đề cập phía trên, 44 chủng vi khuẩn ban đầu, có đến 33 chủng bắt màu hồng Gram (-), tức có khoảng 11 chủng vi khuẩn bắt màu tím Gram (+) chiếm 25% trên tổng số chủng ban đầu. Từ 12 chủng phân lập có nguồn mẫu từ Long An, có đến 8 chủng vi khuẩn bắt Gram (+), chỉ có 4 chủng bắt Gram (-). Qua đó, số lượng chủng vi khuẩn bắt Gram (-) từ 32 chủng phân lập tại Cà Mau lại chiếm tỉ lệ cao hơn so với những chủng bắt Gram (+), chỉ có 3 chủng bắt Gram (+). Qua đó cho ta thấy rằng, môi trường từ khu vực lấy mẫu ở Cà Mau có thể có số lượng vi khuẩn quang hợp khả nghi sinh sống cao hơn môi trường từ khu vưc lấy mẫu ở Long An 39
50. Đồ Án Tốt Nghiệp Sau khi chọn lọc những chủng vi khuẩn Gram (-), ta tiếp tục tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng quan tâm trong môi trường có bổ sung các nồng độ muối khác nhau, nhằm xem khả năng chịu mặn của chúng và tiến hành sàng lọc. RL1 RL8 RL34.3 RL23 RL24 RL10 O Hình 3.2 Đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn được quan sát dưới ống kính hiển vi với vật kính 100X 40
51. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.5 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn Để tiếp tục chọn lọc và loại suy để chọn ra vi khuẩn quang hợp. Ta tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng của chúng ở các nồng độ muối khác nhau, cụ thể là môi trường lỏng BIM có bổ sung NaCl lần lượt: 5‰, 10‰, 15‰, 20‰, 25‰, 30‰, 35‰, 40‰. Thời gian theo đõi là 7 ngày, sự tăng trưởng vi khuẩn được đo bằng máy đo độ đục tự động ở bước sóng 660. Vi khuẩn quang hợp có khả năng thích nghi với nồng độ muối cao, điều nay giúp ta có thể loại ra những chủng vi khuẩn không thích nghi với nồng độ muối khắc nghiệt. Dưới đây là những số liệu đuọc thống kê theo dạng biểu đồ cột, biểu đồ miêu tả sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn ở các nồng độ muối thấp tới cao với giá trị OD đo được la trục tung, thời gian theo dõi từng ngày là trục hoành. 1 NaCl 5‰ RL1 RL8 0.8 RL4 RL10 0.6 RL3 CM39.1 CM24.1 CM31.1 OD 0.4 CM19.2 CM19.1 0.2 CM40.1 CM31.2 0 CM25.1 CM10.1 CM23.1 CM34.3 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 1 NaCl 5‰ CM34.2 CM34.1 0.8 CM37.1 CM28.1 0.6 CM27.1 CM30.1 CM12.1 CM7.1 OD 0.4 CM11.1 CM20.1 0.2 CM6.1 CM40.2 0 CM35.1 CM13.1 CM12.1 CM9.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Hình 3.3 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 5‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày Ở nồng độ muối 5‰, đa số các chủng vi khuẩn đều thích nghi ở điều kiện muối này. Có một số chủng phát triển tốt có thể nói đến như: CM24.1 và 28.1 có giá trị OD tăng liên tục đạt trên 0,8 và không có dấu hiệu sụt giảm cho tới ngay khảo sát thứ 7. Một số chủng sau từ ngày khảo sát thứ 1 đến ngày khảo sát thứ 7 phát triển không có sự gia tăng đáng kể như là: RL1, RL8, 19.1, CM40.2 khi giá trị OD dưới 0,2. 41
52. Đồ Án Tốt Nghiệp 1 NaCl 10‰ RL1 RL8 0.8 RL4 RL10 RL3 CM39.1 0.6 CM24.1 CM31.1 OD 0.4 CM19.2 CM19.1 0.2 CM40.1 CM31.2 CM25.1 CM10.1 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 CM23.1 CM34.3 1 CM34.2 CM34.1 0.8 NaCl 10‰ CM37.1 CM28.1 0.6 CM27.1 CM30.1 CM12.1 CM7.1 OD 0.4 CM11.1 CM20.1 0.2 CM6.1 CM40.2 0 CM35.1 CM13.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 CM12.1 CM9.1 Hình 3.4 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 10‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày Ở nồng độ muối 10‰, khả năng thích nghi của những chủng vi khuẩn này cao hơn so với nồng độ muối 5‰. Điển hình có nhiều hơn hai chủng có giá trị OD cao hơn ngưỡng 0,8 như: RL8, CM24.1, CM28.1 ở ngày khảo sát thứ 7 và CM35.1 ở ngày khảo sát thứ 5. 0.8 RL1 RL8 NaCl 15‰ RL4 RL10 0.6 RL3 CM39.1 0.4 CM24.1 CM31.1 OD CM19.2 CM19.1 0.2 CM40.1 CM31.2 0 CM25.1 CM10.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 CM23.1 CM34.3 1.2 NaCl 15‰ CM34.2 CM34.1 1 CM37.1 CM28.1 0.8 CM27.1 CM30.1 0.6 CM12.1 CM7.1 OD 0.4 CM11.1 CM20.1 CM6.1 CM40.2 0.2 0 CM35.1 CM13.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 CM12.1 CM9.1 Hình 3.5 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 15‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày Ở nồng độ muối cao hơn, sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn cải thiện hơn khi có nhiều chủng đạt giá trị OD cao hơn 0,4 sau 7 ngày khảo sát. Trong đó có 2 chủng đạt 42
53. Đồ Án Tốt Nghiệp giá trị OD gần bằng 1 và 1 chủng có giá trị OD vượt qua 0,8 lần lượt là CM35.1, CM20.1 và CM28.1. 1 RL1 RL8 0.8 NaCl 20‰ RL4 RL10 0.6 RL3 CM39.1 CM24.1 CM31.1 OD 0.4 CM19.2 CM19.1 0.2 CM40.1 CM31.2 0 CM25.1 CM10.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 CM23.1 CM34.3 1 NaCl 20‰ CM34.2 CM34.1 0.8 CM37.1 CM28.1 0.6 CM27.1 CM30.1 CM12.1 CM7.1 OD 0.4 CM11.1 CM20.1 0.2 CM6.1 CM40.2 0 CM35.1 CM13.1 CM12.1 CM9.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Hình 3.6 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 20‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày Chúng ta có thể thấy rằng, ở nồng độ muối 20‰, các chủng vi khuẩn sinh trưởng ổn định so với 3 nồng độ muối trước đó. Tỷ lệ những chủng sinh trưởng kém dưới 0,2 chiếm 0% vào ngày thứ 7 khảo sát. Bên cạnh đó, tỷ lệ chủng chủng phát triển tốt đạt giá trị OD vượt mức 0,8 lại không cao khi chỉ có chủng là: CM11.1 và RL10. 0.8 NaCl 25‰ RL1 RL8 0.6 RL4 RL10 RL3 CM39.1 0.4 CM24.1 CM31.1 OD CM19.2 CM19.1 0.2 CM40.1 CM31.2 0 CM25.1 CM10.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 CM23.1 CM34.3 1 NaCl 25‰ CM34.2 CM34.1 0.8 CM37.1 CM28.1 0.6 CM27.1 CM30.1 CM12.1 CM7.1 OD 0.4 CM11.1 CM20.1 0.2 CM6.1 CM40.2 CM35.1 CM13.1 0 CM12.1 CM9.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Hình 3.7 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 25‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 43
54. Đồ Án Tốt Nghiệp Nồng độ muối cang cao, thì sự phát triển ổn định cũng cao. Sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn có chiều hướng đi lên trong 7 ngày khảo sát nhưng không chênh lệnh quá cao 0.8 NaCl 30‰ RL1 RL8 0.6 RL4 RL10 RL3 CM39.1 0.4 CM24.1 CM31.1 OD CM19.2 CM19.1 0.2 CM40.1 CM31.2 0 CM25.1 CM10.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 CM23.1 CM34.3 1.2 NaCl 30‰ CM34.2 CM34.1 1 CM37.1 CM28.1 0.8 CM27.1 CM30.1 0.6 CM12.1 CM7.1 OD 0.4 CM11.1 CM20.1 0.2 CM6.1 CM40.2 0 CM35.1 CM13.1 CM12.1 CM9.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Hình 3.8 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 30‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày Ở nồng độ muối cận kề độ mặn nước biển. Các chủng vi khuẩn có sự sụt giảm rõ rệt trong 7 ngày khảo sát, số lượng các chủng phát triển kém lên tới 6 chủng đó là: RL1, RL8, RL4, RL10, CM12.1, CM13.1. Điều đáng lưu ý rằng, không có chủng nào đạt giá trị OD cao hơn 0,8 ở ngày khảo sát cuối cùng. 0.6 RL1 RL8 NaCl 35‰ RL4 RL10 0.4 RL3 CM39.1 CM24.1 CM31.1 OD 0.2 CM19.2 CM19.1 CM40.1 CM31.2 0 CM25.1 CM10.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 CM23.1 CM34.3 1.2 CM34.2 CM34.1 1 NaCl 35‰ CM37.1 CM28.1 0.8 CM27.1 CM30.1 0.6 CM12.1 CM7.1 OD 0.4 CM11.1 CM20.1 0.2 CM6.1 CM40.2 CM35.1 CM13.1 0 CM12.1 CM9.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Hình 3.9 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 35‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 44
55. Đồ Án Tốt Nghiệp Ở nồng độ muối ngang với độ mặn nước biển, nhiều chủng phát triển không tốt, số lớn các chủng nằm trong ngưỡng dưới 0,4. Một số chủng phát triển trên ngưỡng 0,6 vào ngày khảo sát cuối cùng. Chỉ có 1 chủng đạt giá trị OD cao hơn 1 vào ngày thứ 5 là CM12.1, nhưng sau đó mau chóng tụt giảm trong ngày thứ 7, và ở mức dưới 0,4. 0.5 NaCl 40‰ RL1 RL8 0.4 RL4 RL10 0.3 RL3 CM39.1 CM24.1 CM31.1 OD 0.2 CM19.2 CM19.1 0.1 CM40.1 CM31.2 0 CM25.1 CM10.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 CM23.1 CM34.3 0.8 NaCl 40‰ CM34.2 CM34.1 0.6 CM37.1 CM28.1 CM27.1 CM30.1 0.4 CM12.1 CM7.1 OD CM11.1 CM20.1 0.2 CM6.1 CM40.2 CM35.1 CM13.1 0 CM12.1 CM9.1 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Hình 3.10 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 40‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày Ở nồng độ muối cao hơn nước biển, sự tăng trưởng các chủng tại ngày khảo sát thứ 7 khả quan hơn so với nồng độ muối 35‰ trước đó, chỉ có 2 chủng có giá trị OD thấp hơn 0,2 đo là RL4, CM40.2, chiếm 6,2% tổng thể. Còn lại tất cả các chủng phát triển tống ở giá trong OD trong ngưỡng từ 0,2 đến 0,6. Không có chủng nào phát triển vượt mức giá trị 0,8. Kết quả cho thấy, tất cả các chủng vi khuẩn đều thích nghi với các nồng độ muối khác nhau, và sinh trưởng tốt trong khoảng 0.5% đến 2.5%. Qua đó càng về sau, nồng độ muối càng cao, khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn cũng giảm dần, cụ thể là trong khoảng 3% đến 4%. Việc loại suy sẽ chọn lọc ra những chủng có khả năng sinh trưởng tốt ở nồng độ 4% ở ngay khảo sát thứ 7, giá trị OD nằm trong khoảng 0,21 – 0,571, cho nên ta sẽ lấy giá trị trung bình OD là 0,3 làm móc để tuyển chọn vi khuẩn. Nhóm thực hiện đề tài đã chọn ra 14 chủng được thể hiện ở bảng dưởi. 45
56. Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 3.6 Giá trị OD660nm của các chủng cao hơn 0,3 ở nồng độ 4% sau 7 ngày STT Ký hiệu chủng OD660nm STT Ký hiệu chủng OD660nm 1 RL1.2 0,342 8 CM23 0.385 2 RL8 0,328 9 CM34.3 0.429 3 RL10 0,393 10 CM28.1 0.435 4 CM34.2 0.354 11 CM27.1 0.549 5 CM40.1 0,373 12 CM30.1 0.571 6 CM24.1 0.378 13 CM12.1 0.327 7 CM31.2 0.311 14 CM11.1 0.336 Ta có 14 chủng có khả năng chịu mặn cao. Tuy nhiên, trong tự nhiên có một số chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn cao hơn vi khuẩn quang hợp. Cho nên khảo sát khả năng hấp thụ CO2 là bước đi tiếp theo để loại bỏ những chủng vi khuẩn không có khả năng hay có khả năng hấp thụ CO2 kém, qua đó tuyển chọn những chủng vi khuẩn có khả năng hấp thụ CO2 cao. 3.6 Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ CO2 Sau khi tuyển chọn những chủng vi khuẩn chịu mặn cao, ta tiến hành khảo xác khả năng hấp thụ CO2 của các chủng này. Ta bổ sung hỗn hợp khí H2: O2: CO2 theo thời gian 8 phút: 1 phút: 2 phút vào môi trường lỏng BIM có bổ sung vi khuẩn. Khả năng tăng trưởng được theo dõi thông qua độ đục của môi trường. Lô đối chứng không sục hỗn hợp khí trên và bổ sung vi khuẩn. Kết quả hấp thụ CO2 được thể hiện ở các bảng bên dưới. Bảng 3.7 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 1 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 OD ị Đối chứng 0.2 0.15 Hấp thu CO2 tr Gía 0.1 0.05 0 RL1 RL8 34.2 11.1 40.1 24.1 31.2 23.0 34.3 28.1 27.1 30.1 12.1 RL10 46
57. Đồ Án Tốt Nghiệp Các chủng vi khuẩn ở lô đối chứng không có bổ sung khí CO2 có sự tăng trưởng không cao, có giá trị OD chỉ ở mức 0,15 trở xuống. Bên cạnh đó, khi có bổ sung nguồn CO2, sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn cao hơn rõ ràng so với lô đối chứng. Điển hình một số chủng có giá trị OD cao như: CM34.2, CM24.1, CM23.1, CM34.3, CM28.1, RL1, RL8 những chủng này đạt ở ngưỡng trên 0,3. Một số chủng còn lại nằm trong khoảng từ 0,15 cho tới dưới 0,3. Bảng 3.8 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 3 1.2 1 0.8 OD 0.6 Đối chứng ị 0.4 Hấp thu CO2 tr Gía 0.2 0 Bước sang ngày thứ 3, các chủng được bổ sung CO2 tăng lên đáng kể, đồng thời lô đối chứng cũng tăng theo. Các chủng vi khuẩn đạt giá trị OD trên 0,3 được mô tả ở bảng 3.7 ngày nay đã tăng vọt lên trên ngưỡng 0,6 đó là các chủng CM40.1, CM24.1, CM23.1, CM34.3, CM28.1, CM27.1, CM30.1, RL1, RL8, RL10; trong đó 2 chủng đạt giá trị OD vượt mức 0,8 và 1 chủng vượt mức 1 lần lượt là CM24.1, CM28.1, CM34.3 va RL1. Ở lô đối chứng, đa số các chủng chạm ở mức giá trị OD dưới 0,4, một số chủng phát triển kém hơn 0,2. 47
58. Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 3.9 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 5 OD ị Gía tr Gía Ở lần khảo sát cuối cùng, chiều hướng tăng trưởng của các chủng vi khuẩn ngày càng đi lên, lô đối chứng tăng trưởng không đáng kể và đạt giá trị OD dưới 0,4. Qua đó có 2 chủng vi khuẩn sinh trưởng kém nhất trong số 14 chủng khảo sát là CM34.2, CM11.1. Các chủng phát triển ở mức khá như: CM40.1, CM31.2, CM28.1, CM27.1, CM30.1, CM12.1 nằm trong ngưỡng giá trị OD từ 0,4 đến dưới 0,8. Đặc biệc có đến 6 chủng vi khuẩn đạt giá trị OD cao nhất vượt mức 0,8 là CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1, RL8, RL10. Trong đó có 2 chủng vi khuẩn đạt giá trị OD xấp xỉ 1,4 là CM24.1, RL1. Gía trị OD được biểu diễn trên biểu đồ cột cho ta thấy rằng khi bổ sung khí CO2, lượng sinh khối sinh ra sẽ nhiều hơn lô đối chứng (không bổ sung CO2). Ngoài ra, sau 3 lần khảo sát, ta thấy rằng chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 phát triển đồng đều và tốt nhất, nhu cầu CO2 đối với chúng cực kì cao Cho nên 4 chủng vi khuẩn này sẽ được lựa chọn để tiến hành ly trích DNA, tiến gần hơn với giai đoạn định danh. 48
59. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.7 Định danh 3.7.1 Ly trích, thu nhận DNA CM24 CM23 CM34 RL1 .1 .1.1 .4.1 Hình 3.11 Kết quả ly trích DNA của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1, RL8 trên gel agarose 1% Từ hình 3.8, cho thấy kết quả ly trích bộ gen của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1, RL8 đều tốt. Từ đó, tiếp tục sử dụng sản phẩm ly trích dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA 3.7.2 Kết quả PCR Sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gene 16S DNA với cặp mồi 27F và 1492R cho kết quả trên gel agarose 1%, kích thước gene khoảng từ 1500bp khi so sáng với thang DNA có kích thước 10000bp. DNA ladder RL1 CM34 CM23 CM24 .4.1 .4.1 .1 1500bp Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 trên gel agarose 1% 49
60. Đồ Án Tốt Nghiệp Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR, sản phẩm sản phẩm được tinh sạch bằng bộ kit The QIAquick PCR Purification. DNA ladder RL1 CM34 CM23 CM24 .4.1 .4.1 .1 Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng bộ kit của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 trên gel agarose 1% 3.8 Kết quả định danh Sau khi gửi sản phẩm PCR để giải trình tự tại công ty Nam Khoa thì kết quả được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng: ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và ngân hàng gene, dựng cây phát sinh loài. 3.8.1 Trình tự vùng gene của 4 chủng RL1, CM23, CM24, CM34.3 RL1:GCTAGTTGTATACCGTGCAGTCGAGCGAGTCTTCGAGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGA ACGTGCCATTTGCTTCGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCGAATGTGCCCTATGGGGGAAAGATTT ATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAG CTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG GAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGATCGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGA TCTTTCAGGTGGGAAGATAATGACGGTACCACCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATACGGAGGGGGCTAGCGTTATTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGTCAGAGG TGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGAAACTCCC CM24:AAGTCGAAGTCTTCGGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTGCCCTTTGCTTCGGAA TAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCGAATGTGCCCTATGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCG CGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCA GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGCGC AAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGATCGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGATCTTTCAGGTGGGAAGATAA TGACGGTACCACCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTT ATTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACC CTGGAACTGCCTTTGAAACTCCCGATCTTGAGGTCGAGAGAGGTG CM34.3:GGACACATAACAGAGAGCGTCTGAATCGTCGCTTCTGGATGAGCCTGGCGGACGGGTGAATAACACT TGGACGCGGTGCCGTTTGGTGGCATAACTCATGGAAACTTGGGCTCATACGGTATGTGCCCTTGTGGGGAAGG ATTATCGGCATTGGAGGGGCCGTCGTCTGATGTTCTACTTGGGTAGGTAAAGGCGTCCGAAGGCGACGATCAA 50
61. Đồ Án Tốt Nghiệp TATCTGGTCTGAGAGGATGATGCCCGCGTTTGCGACGGACACAGGGCCCACACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG GGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAA ATTCTTTCACCGGGGACGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGCGGACATTTAAGTCAGG GGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTTGATACTGGG CM23:ATAATCCCACCGATGGTCGGCTGCCTCCTCTTGCGAGGTTGGCGCACCGCCTTCGGGTAGAACCAATTC CCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGTCATGCTGTTACGCGATTACTAG CGATTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACAGCTTTTTGGGATTAACCCATTGT CACTGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAACCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCACACCTTCCTCC GGCTTATCACCGGCAGTTTCCCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGACGTGGGTTGCGCTCGTTGC CGGACTTAACCGAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTGCGATCCAGCCGAACT GAAGGAACCATCTCTGGAACCGCGATCGCCATGTCAAGGGTTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAA CCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT 51
62. Đồ Án Tốt Nghiệp 3.8.2 Thiết lập cây phát sinh loài RL1 Rhodobacter sp. JA487 38 Rhodobacter johrii Rhodobacter sphaeroides Rhodobacter sp. KCI-b Rhodobacter sp. UTW6 -29 CM23 CM24 CM23 CM24 CM34.3 68 Hình 3.14 Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene Chủng RL1 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodobacter sp. JA487 và Rhodobacter sphaeroides có mức độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gene và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng RL1 là loài Rhodobacter sphaeroides Chủng CM23 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodobacter sphaeroides và Rhodobacter sp. UTW6-29 có mức độ tương đồng lần lượt là 100% và 99%. Dựa vào kết qủa so sánh trình tự gene và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng CM23 là loài Rhodobacter sphaeroides Chủng CM24 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter johrii và Rhodobacter sp. JA487 có mức tương đồng lần lượt là 100%, 99%, 99%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gene và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng CM2 là loài Rhodobacter sphaeroides Chủng CM34.3 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodobacter KCI-b, Rhodobacter johrii và Rhodobacter sp. UTW6-29 có mức tương đồng lần lượt là 99%, 100%, 99%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gene và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng CM34.3 là loài Rhodobacter johrii 52
63. Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận Từ 22 mẫu nước thu thập từ ao ruộng Long An và 41 mẫu nước từ rừng Ngọc Hiển, Cà Mau, phân lập tổng cộng được 44 chủng vi khuẩn. Sau đó tiến hành kiểm tra hình thái khuẩn lạc thông qua kỹ thuật nhuộm Gram, kết quả chọn lọc được 33 chủng vi khuẩn bắt Gram(-) Những chủng vi khuẩn này tiếp tục được khảo sát khả năng chịu mặn, kết quả cho thấy ở nồng độ muối 40‰, chỉ có 14 chủng vi khuẩn phát triển tốt và ổn định. Từ 14 chủng vi khuẩn này, tiến hành khảo sát khả năng hấp thu CO2 và chọn lọc được 4 chủng có khả năng tăng trưởng cao nhất đó là RL1, CM23, CM24, CM34.3. Kết quả hình thái học của khuẩn lạc, khuẩn ty cho thấy rằng chủng RL1, CM23, CM24 có khả năng thuộc loài Rhodobacter sphaeroides. Còn chủng CM34.3 có khả năng thuộc loài Rhodobacter johrii. Các chủng đều cho kết quả tương đồng 100% khi so sánh các dữ liệu gene của các chủng trên ngân hàng NCBI. 2. Kiến nghị Do lượng thời gian có giới hạn nên quá trình nghiên cứu vẫn còn một số vấn đề chưa được thực hiện. Cần thực hiện thêm một số khảo sát: • Tối ưu hóa điều kiện tăng trưởng các chủng vi khuẩn quang hợp • Khảo sát các đặc điểm sinh hóa đối với các chủng đã phân lập • Khảo sát sự hấp thụ CO2 qua các tỉ lệ thời gian khác nhau. Qua đó xác định khả năng hấp thụ tối ưu và lượng CO2 mất đi thông qua các phương pháp phân tích, cụ thể là phương pháp sắc kí khí 53
64. Đồ Án Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Mỵ Trần Hương Trà. 2015. Nghiên cứu nhân nuôi và sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lý chất hữu cơ và Sulfide trong nước [2] Nguyễn Thị Hương. 2012. Phân lập, đánh giá các đặc điểm sinh học và định danh phân tử các chủng vi khuẩn quang hợp tía phục vụ chế tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu. [3] Fang LC, Huang XF, Du ZH, Yuan J, Wei H, Cheng HH, Liu Y. 2005. Isolation and identification of a photosynthetic bacteria producing coenzyme Q10 [4] Prasertsan P, Choorit W, Suwanno S. 1993. Isolation, identification and growth conditions of photosynthetic bacteria found in seafood processing wastewater. [5] Michael Knaggs. 2012. Air Products and Chemicals, Inc.: Demonstration of CO2 Capture and Sequestration of Steam Methane Reforming Process Gas Used for Large- Scale Hydrogen Production [6] Maha Harbaoui Zrelli. 2016. Renewable energy, non-renewable energy, carbon dioxide emissions and economic growth in selected Mediterranean countries [7] Washington, DC: The National Academies Press. 2010. Ocean Acidification: A National Strategy to Meet the Challenges of a Changing Ocean [8] Viện Khoa Học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam. 2013. Tác hại kinh hoàng của khí hậu tới con người [9] International Energy Agency. 2017. Global Energy & CO2 Status Report [10] Duy Hữu. 2015. Việt Nam đứng trong Top các quốc gia phát thải nhiều khí nhà kính [11] Thân Mạnh. 2014. 10 điều bạn có thể làm để giảm sự nóng lên của trái đất [12] Nguyen Uyen. 2011. Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Green sulfure bacteria) [13] Nguyễn Lân Dũng. 2005. Các nhóm vi khuẩn chủ yếu [14] Nguyễn Như Khanh. 2016. Qúa trình quang hợp ở vi khuẩn [15] Hunter, N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., Beatty, J.Th. (Eds.). 2009. The Purple Phototrophic Bacteria [16]. Beverly K. Pierson and Richard W. Castenholz. 1974 .A Phototrophic Gliding Filamentous Bacterium of Hot Springs, Chloroflexus aurantiacus, gen. and sp. nov 54
65. Đồ Án Tốt Nghiệp [17] Mack et al. 1993. Rhodospirillum sodomense,sp.nov., a Dead Sea Rhodospirillum species. [18] Hà Trang. 2002. Tổng thuật theo Châu Giang Thuỷ sản, [19] Janda JM, Abbott SL. 2007. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls 55
66. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC A: Kết quả phân lập các mẫu từ tỉnh Long An và tỉnh Cà Mau. 56
67. Đồ Án Tốt Nghiệp 57
68. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC B: Hình ảnh lấy mẫu thực tế tại Long An và Cà Mau 58
69. Đồ Án Tốt Nghiệp 59
70. Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC C: Kết quả vùng gene bảo tồn các chủng định danh Chủng CM23 60
71. Đồ Án Tốt Nghiệp RL1 61
72. Đồ Án Tốt Nghiệp CM24 62
73. Đồ Án Tốt Nghiệp CM34.3 63
74. Đồ Án Tốt Nghiệp 64
75. Đồ Án Tốt Nghiệp 65