Đồ án Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S - XT và H - CP16 trên sâu xanh da láng Spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng

161 trang thiennha21 12/04/2022 3990

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S - XT và H - CP16 trên sâu xanh da láng Spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_hieu_luc_diet_sau_va_kha_nang_sinh_san_cua_ha.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S - XT và H - CP16 trên sâu xanh da láng Spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HIỆU LỰC DIỆT SÂU VÀ KHẢ NĂNG SINH SẢN CỦA HAI CHỦNG TUYẾN TRÙNG S – XT VÀ H – CP16 TRÊN SÂU XANH DA LÁNG Spodoptera exigua VÀ XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH CÔN TRÙNG CỦA TUYẾN TRÙNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : LÊ QUỐC VŨ MSSV: 1151110545 Lớp: 11DSH05 TP. Hồ Chí Minh, 2015
LỜI CAM ĐOAN Là sinh viên năm năm cuối của Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, nay được vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học của mình. Tôi cam đoan đây là nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Những số liệu, hình ảnh trong bài hoàn toàn trung thực chưa từng có ai công bố. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Lê Quốc Vũ
LỜI CẢM ƠN Tận đáy lòng con xin ghi khắc công lao cha mẹ đã gian khó nuôi dạy con thành người. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất, là người nâng con dậy sau mỗi lần vấp ngã, là động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống. Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức quý giá ngay từ những ngày đầu tiên bước vào giảng đường đại học. Đặc biệt, con xin chân thành biết ơn cô Nguyễn Hoài Hương, người thầy đáng kính, luôn hết mình chỉ dạy để con có thể hoàn thành đồ án. Và hơn thế nữa là những lời khuyên, bài học cuộc sống cô dạy bảo, sẽ là hành trang quý báu cho con sau này. Con cũng xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn con về phương pháp nuôi sâu, tuyến trùng và cũng là người cho con nguồn nấm bệnh trong những thí nghiệm. Con cũng chân thành cô Đỗ Thị Tuyến đã cho con vi khuẩn chỉ thị và hoá chất để con có thể hoàn thành đồ án. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm. Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH đã luôn khích lệ và giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trường. Cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Anh Kha, anh Nguyễn Ngọc Phong, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, bạn Phan Nguyễn Hương Thảo, Phạm Hải Hậu, Đinh Thị Minh Châu, Hồ Thị Bích Phương cùng em Lê Thị Ngọc Dung 12DSH01 đã cùng đồng hành, sát cánh trong những ngày làm đồ án tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 SVTH: Lê Quốc Vũ
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1 Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) 4 1.1.1. Khái niệm EPN 4 1.1.2. Vai trò và ƣu thế của EPN 4 1.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng 5 1.2.1. Phân loại 5 1.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis 6 1.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus 7 1.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae 8 1.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus 9 1.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản 11 1.4. Tổng quan về Serratia marcescens 16 1.4.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens 16 1.4.2. Phân loại Serratia marcescens 17 1.4.3. Đặc điểm của Serratia marcescens 17 1.4.3.1. Đặc điểm sinh lý 17 1.4.3.2. Đặc điểm sinh hóa 18 1.4.3.3. Đặc điểm phân bố 20 i
Đồ án tốt nghiệp 1.4.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens 20 1.4.4.1. Sắc tố 20 1.4.4.2. Biosurfactants 21 1.4.4.3. Acid béo 22 1.4.4.4. Enzyme 22 1.4.5. Yếu tố độc lực của Serratia marcescens 22 1.5. Mối quan hệ cộng sinh 23 1.5.1. Vai trò của tuyến trùng 23 1.5.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh 24 1.5.3. Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn 24 1.5.4. Mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng EPN và Serratia sp 28 1.6. Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt 29 1.6.1. Đặc trƣng côn trùng bị EPN tiêu diệt 29 1.6.2. Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt 29 1.7. Khái quát về SXDL Spodoptera exigua 30 1.7.1. Đặc điểm hình thái 30 1.7.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái 30 1.6.2.1. Vòng đời (30 – 40 ngày) 30 1.7.2.2. Thiên địch 31 1.7.3. Một số biện pháp phòng trừ 32 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 33 2.1.1. Thời gian 33 2.1.2. Địa điểm 33 ii
Đồ án tốt nghiệp 2.2. Vật liệu – thiết bị - hoá chất 33 2.2.1. Nguồn vi sinh vật 33 2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất sử dụng 33 2.3. Bố trí thí nghiệm 36 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 38 2.4.1. Phƣơng pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm 38 2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu tuyến trùng in vivo 38 2.4.2.1 Phƣơng pháp thử nghiệm trong đĩa petri (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 38 2.4.2.2 Phƣơng pháp bẫy nƣớc thu tuyến trùng Whitetrap (White, 1927) 39 2.4.2.3. Phƣơng pháp lọc rửa tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2009) 39 2.4.2.4. Phƣơng pháp đếm tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 40 2.4.2.5. Phƣơng pháp bảo quản tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Phong, 2013) 40 2.4.2.6. Phƣơng pháp xác định hoạt động của tuyến trùng (Albrecht M. Koppenhofer, 2007) 41 2.4.2.7. Thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên đối tƣợng SXDL tuổi 41 2.4.2.8. Thí nghiệm khảo sát sự tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm - sản lƣợng IJ và chu kì kí sinh – phát tán của các chủng tuyến trùng trên vật chủ SXDL 43 2.4.2.9. Thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S – XT, H – CP16 bằng phƣơng pháp tiêm và bƣớc đầu xác định tác nhân gây chết 44 2.4.3. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn 46 2.4.3.1. Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp của Akhurst (1980) và Sun Ho Park và Yeon Su Yu (1999) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2009) 46 2.4.3.2. Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp của Lawrwnce A. Lacey (2011) 48 iii
Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.3. Phƣơng pháp chứng minh nội sinh 48 2.4.3.4. Phƣơng pháp định lƣợng vi khuẩn nội sinh 49 2.4.4. Phƣơng pháp định danh vi khuẩn phân lập 49 2.4.4.1. Phƣơng pháp kiểm tra độ thuần khiết 49 2.4.4.2. Phƣơng pháp quan sát hình thái, sinh lý 50 2.4.4.3. Thử nghiệm sinh hoá 50 E 2.4.4.4. Phƣơng pháp định danh bằng APIKIT 20 50 2.4.4.5. Giải trình tự 16S rRNA 50 2.4.5. Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học 50 2.4.5.1. Phƣơng pháp định tính enzyme 50 2.4.5.2. Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng kháng sinh 51 2.4.5.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn- phƣơng pháp cấy chéo 51 2.4.5.4. Khảo sát hoạt tính kháng nấm 53 2.4.5.5. Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phƣơng pháp tiêm 53 2.4.5.6. Khảo sát sự tính tƣơng tác tổ hợp vi khuẩn và tuyến trùng EPN 54 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 56 3.1. Kết quả đánh giá LD50 của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 56 3.1.1. Chủng S – XT 57 3.1.2. Chủng H – CP16 58 3.2. Khả năng sinh sản của tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên SXDL 60 3.2.1. Khả năng nhân của 2 chủng tuyến trùng trên SXDL tuổi 4 62 3.2.1.1. Chủng S – XT 62 3.2.1.2. Chủng H – CP16 63 3.2.2. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng IJ gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra 63 iv
Đồ án tốt nghiệp 3.2.2.1. Chủng S – XT 64 3.2.2.2. Chủng H – CP16 66 3.2.3. Chu kỳ kí sinh và phát tán của hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên SXDL 68 3.2.3.1. Chu kỳ kí sinh hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên SXDL 68 3.2.3.2. Chu kỳ phát tán của hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên SXDL 69 3.3. Xác định tác nhân gây chết sâu 72 3.4. Phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng 75 3.5. Kết quả định lƣợng tổng số vi khuẩn trong tuyến trùng (cfu/IJ) 79 3.6. Quan sát hình thái, sinh lý 80 3.7. Thử nghiệm sinh hóa 83 3.8. Kết quả định danh bằng KIT API 20E (Biomerieux) 85 3.9. Kết quả giải trình tự rRNA 16S 86 3.10. Khả năng tiết enzymme ngoại bào 88 3.11. Khả năng kháng kháng sinh 91 3.12. Hoạt tính kháng khuẩn 94 3.14.1. Đối kháng không tiếp xúc 95 3.14.2. Đối kháng tiếp xúc 96 3.13. Hoạt tính kháng nấm 98 3.14. Hiệu lực diêt sâu 101 3.17. Khảo sát sự tƣơng tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn 104 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107 v
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 109 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PTSH : P òng trừ sinh học IJ : Ấu trùng xâm nhiễm (viết tắt tên tiếng Anh: Infective juveniles). EPN : tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh: entomopathogenic nematodes). S-XT : Steinernema guangdongense XT H-CP16: Heterorhabditis indica CP16 VKCS : Vi khuẩn cộng sinh. BSL : Bƣớm sáp lớn. SB : Serratia marcescens SB HB : Serratia marcescens HB VSV : Vi sinh vật. SXDL : Sâu xanh da láng vii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng 6 Bảng 1.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus 9 Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus 11 Bảng 1.4.Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của Xenorhabdus / Photorhabdus 12 Bảng 1.5. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus 14 Bảng 1.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus 15 Bảng 1.7. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens 19 Bảng 1.8. Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh 27 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên đối tƣợng SXDL tuổi 4 42 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra đối với 2 chủng tuyến trùng 43 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S – XT, H – CP16 bằng phƣơng pháp tiêm 45 Bảng 3.1. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng S – XT 57 Bảng 3.2. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng H – CP16 59 Bảng 3.3. Khả năng sinh sản của chủng S – XT trên SXDL 61 Bảng 3.4. Khả năng sinh sản của chủng H – CP16 trên SXDL 61 Bảng 3.5. Chu kỳ kí sinh của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên SXDL 68 Bảng 3.6. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng S – XT 70 Bảng 3.7. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng H – CP16 71 Bảng 3.8 Kết quả diệt sâu ở một số nồng độ gây nhiễm của hai chủng S – XT và H – CP16 bằng phƣơng pháp tiêm 73 Bảng 3.9. Kết quả khử trùng bề mặt tuyến trùng 76 viii
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10. Bảng tóm tắt đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng phân lập 84 Bảng 3.11. Kết quả định danh bằng KIT API 20E của hai chủng SB và HB 85 Bảng 3.12. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của SB và HB 89 Bảng 3.13. Tỷ lệ đối kháng nấm của 2 chủng SB, HB 100 Bảng 3.14. LD50, LD90 của chủng SB và HB sau 48 giờ đƣợc tiêm vào sâu . 103 Bảng 3.15. Tỷ lệ chết của S – XT sau 12 ngày 104 Bảng 3.16. Tỷ lệ chết của H – CP16 sau 12 ngày 104 ix
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng 7 Hình 1.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus 10 Hình 1.3. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) 17 Hình 1.4. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở 25oC sau 48 giờ (David, 2012) 18 Hình 1.5. Vòng đời SXDL da láng 31 Hình 2.1. Quy trình khảo sát sản lƣợng, chu kì kí sinh- phát tuyến trùng trên kí chủ SXDL và phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng 36 Hình 2.2. Quy trình khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa và định danh vi khuẩn 37 Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn mới phân lập 37 Hình 2.4. Quy trình phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng EPN 47 Hình 3.1. Dấu hiệu sâu chết bởi tuyến trùng 56 Hình 3.2. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng S – XT trên SXDL tuổi 4 58 Hình 3.3. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng H – CP16 trên SXDL tuổi 4 60 Hình 3.4. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của chủng S – XT 65 Hình 3.5. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của chủng H – CP16 67 Hình 3.6. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng S – XT 70 Hình 3.7. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng H – CP16 72 Hình 3.8. Sâu chết bởi tuyến trùng bằng phƣơng pháp tiêm 74 Hình 3.9. Khuẩn lạc vi khuẩn từ huyết tƣơng sâu trên môi trƣờng NBTA 75 Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc hai chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ tuyến trùng khử trùng bề mặt trên NBTA, MacConkey, NA và PGA 78 x
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng SB 80 Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc của chủng HB 81 Hình 3.13. Kết quả nhuộm Gram của hai chủng SS1 và SH1 83 Hình 3.14. Cây phát sinh loài của SB và HB 88 Hình 3.15. Khả năng tiết enzyme ngoại bào 90 Hình 3.16. Kết quả kháng sinh đồ 92 Hình 3.17. Kết quả đối kháng không tiếp xúc 95 Hình 3.18. Kết quả đối kháng tiếp xúc (mặt trên) 96 Hình 3.19. Kết quả đối kháng tiếp xúc (mặt dƣới) 97 Hình 3.20. Kết quả đối kháng với các chủng nấm 100 Hình 3.21. Khả năng diệt sâu của SB, HB sau 48 giờ tiêm vào sâu 102 Hình 3.22. Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 giờ tiêm SB vào SXDL 102 Hình 3.23. Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 giờ tiêm HB vào SXDL 103 Hình 3.24. Tỷ lệ chết của chủng tuyến trùng S – XT 105 Hình 3.25. Tỷ lệ chết của chủng tuyến trùng H – CP16 105 xi
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay ngành nông nghiệp Việt Nam đang trên đà phát triển hết sức mạnh mẽ cả về số lƣợng và chất lƣợng, trong đó một số mặt hàng nông sản nhƣ cà phê, lúa gạo có kim nghạch xuất khẩu cao và có vị thế trên thị trƣờng quốc tế. Nhu cầu tăng sản lƣợng, rút ngắn thời gian sản xuất để nâng cao lợi nhuận đang đƣợc đặt ra, đi đôi với nó luôn đòi hỏi những kiến thức để sản xuất sản phẩm an toàn. Tuy nhiên không phải chỉ riêng Việt Nam mà hầu nhƣ tất cả các nƣớc nông nghiệp ngƣời nông dân ít đƣợc trang bị đầy đủ kiến thức về sản xuất để đảm bảo tính bền vững. Vì vậy ở không ít nơi ngƣời nông dân sử dụng ồ ạt các loại thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học vì không hiểu biết hay đã biết đƣợc tác hại nhƣng vẫn cố ý sử dụng để tăng sản lƣợng, thu lợi nhuận. Chính việc sử dụng mà không tuân thủ các quy định về liều lƣợng và cách thức đã làm dịch bệnh trở nên nhiều hơn, nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, SXDL da láng (Spodoptera exigua) là một trong những loài sâu ăn tạp khá phổ biến, phá hoại trên nhiều loại cây trồng nhƣ họ bầu bí, họ thập tự, hành, lạc, nho, có khả năng kháng thuốc hóa học rất cao nếu ngƣời dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học không đúng cách. Vì vậy xu hƣớng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đang trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, đảm bảo sức khỏe cho con ngƣời, đồng thời tính an toàn môi trƣờng cao. Trong các biện pháp sinh học đƣợc sử dụng hiện nay thì dùng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) gồm hai giống Steinernema và Heterorhabditis đang đƣợc các nƣớc trên thế giới và Việt Nam đặc biệt chú ý. Tuy nhiên, các loài tuyến trùng EPN này sẽ không thực sự phát huy hiệu quả nếu không có mặt VKCS trong ruột chúng là nguyên nhân chính gây ra cái chết của côn trùng. Hai loài VKCS phổ biến từng đƣợc nghiên cứu và biết đến nhiều nhất gồm Photorhabdus, Xenorhabdus nhƣng theo một số báo cáo gần đây thì Serratia macescens cũng có vai trò này.Với vai trò đặc biệt, VKCS trở thành mấu chốt trong mối quan hệ giữa sâu hại – tuyến 1
Đồ án tốt nghiệp trùng – vi khuẩn. Đây đƣợc coi là những loài vi khuẩn có đời sống rất đặc biệt khi cộng sinh trong một vật chủ và gây hại cho một vật chủ khác thông qua vật chủ mà nó cộng sinh. Mặt khác có thể thấy đƣợc khả năng kháng mạnh với các loài vi khuẩn có hại gây bệnh cho gia súc và các loài nấm gây hại cho nông nghiệp, điều này mở ra những ứng dụng rất lớn. Tuy nhiên ở Việt Nam hiện chỉ có một số nghiên cứu tại Hà Nội có liên quan đến VKCS trong tuyến trùng EPN, ở các tỉnh thành miền Nam chƣa có nghiên cứu về vấn đề phân lập và ứng dụng vi khuẩn cộng sinh này. Trong nghiên cứu này sử dụng hai nguồn tuyến trùng gồm Heterorhabditis indica (H – CP16) và Steinernem guangdongense (S – XT), H – CP16 và S – XT là hai chủng tuyến trùng mới chƣa có bất kỳ nghiên cứu về các chủng VKCS với nó cũng nhƣ việc đánh giá hiệu lực diệt sâu của chúng trên đối tƣợng SXDL (Spodoptera exigua) . Vì những lợi ích rất quan trọng của hai chủng tuyến trùng và VKCS ngƣời tiến hành đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là : “Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên sâu xanh da láng Spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng ” 2. Mục đích của nghiên cứu Ứng dụng khả năng phòng trừ sâu hại và nhân nuôi in vivo tuyến trùng EPN trên đối tƣợng SXDL Spodoptera exigua của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16. Xác định các chủng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh côn trùng của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 và ứng dụng chúng trong đấu tranh sinh học bảo vệ thực vật. 3. Nhiệm vụ của nghiên cứu Đánh giá hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên đối tƣợng SXDL. Phân lập các chủng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh côn trùng của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16. 2
Đồ án tốt nghiệp Khảo sát các hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập và bƣớc đầu xác định mối quan hệ giữa chúng với hai loài tuyến trùng khảo sát. 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài. Xác định đƣợc chỉ số LD50 và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng trên đối tƣợng SXDL. Phân lập đƣợc hai chủng vi khuẩn SB, HB lần lƣợt trên tuyến trùng S – XT và H – CP16. Kết quả định danh cho thấy 2 chủng SB, HB đều thuộc loài Serratia macescens. Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng kháng sinh, hoạt tính enzyme, tỉ lệ ức chế nấm bệnh gây hại cây trồng, hiệu lực diệt sâu và sự tƣơng tác với kí chủ tuyến trùng của hai chủng vi khuẩn SB, HB. 3
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) 1.1.1. Khái niệm EPN EPN viết tắt của từ Entomopathogenic Nematodes, đây là thuật ngữ dùng để chỉ các loài tuyến trùng kí sinh thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis, chúng vừa có khả năng ký sinh lại vừa có khả năng gây bệnh giết chết côn trùng. Thực chất các loài tuyến trùng kí sinh này là tổ hợp đƣợc hình thành trong tự nhiên và có sự chuyên hóa cao, trong đó các loài tuyến trùng thuộc giống Steinernema cộng sinh với vi khuẩn Xenorhabdus, còn Heterorhabditis thì cộng sinh với vi khuẩn Photorhabdus. Sở dĩ đƣợc gọi là cộng sinh vì cả vi khuẩn và tuyến trùng đều dựa vào nhau để tồn tại, phát triển, sinh sản. Đây là một hiện tƣợng cộng sinh bắt buộc, cả tuyến trùng và vi khuẩn không thể tồn tại độc lập trong tự nhiên (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). 1.1.2. Vai trò và ưu thế của EPN Vai trò của EPN đƣợc thấy trƣớc tiên nhƣ là các thiên địch tự nhiên có tác dụng điều chỉnh mật độ quần thể côn trùng, trong đó có nhiều loài sâu hại. Thực tế cho thấy, trong tự nhiên nơi đâu có sự tồn tại của EPN thì nơi đó hầu nhƣ không bùng phát dịch hại do côn trùng gây ra (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). EPN đang nhận đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng có những ƣu thế sau : a. Phƣơng pháp s đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng có những ƣu thế sau :t độ quần thể cô b. EPN có kháp s đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng có những ƣu thế sau c. Các loài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chú d. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng e. Áp dhoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng có những ƣu thế 4
Đồ án tốt nghiệp f. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng có g. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là h. Tó khoà bsâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và in vitro và in vivo. to những ƣu thế sau :t độ quần thể côn trù i. Dà bsâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và in vitro và in v 1.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng 1.2.1. Phân loại Tuyến trùng ký sinh côn trùng đã đƣợc tìm thấy trong sáu bộ tuyến trùng: - Aphelenchida - Diplogasterida - Mermithida - Oxyurid - Rhabditida - Tylenchida Trong các bộ trên thì bộ Rhabditida, Mermithida và Tylenchida là quan trọng nhất. Trong bộ Rhabditida, tuyến trùng trong hai họ sau đây đã đƣợc đề cập: - Hrong bộ Rhabditida, tuyến trùng tSteinernema và Neosteinernema - Heosteinernemaitida, tuyến trùng trong Heterorhabditis. Steinernema đã đƣợc Steiner mô tả năm 1923 với tên gọi Aplectana, vì tên này đã đƣợc sử dụng trƣớc đó, nên năm 1927, Travassos đổi tên thành Steinernema, trƣớc năm 1982 rất nhiều loài của tuyến trùng này có tên khác là Neoaplectana. Hiện nay có khoảng 56 loài đã đƣợc mô tả. Neosteinernema đƣợc Nguyễn và Smart mô tả năm 1994, tuyến trùng này chỉ có một loài và ký sinh trên mối. Heterorhabditis đƣợc Poinar mô tả năm 1976, Heterorhabditis có 12 loài. Đây đƣợc đánh giá là nhóm tuyến trùng quan trọng nhất trong bảo vệ mùa màng, vì vậy có nhiều nghiên cứu tập trung về các giống này. 5
Đồ án tốt nghiệp Vòng đời của EPN khoảng 10 - 12 ngày và trung bình từ một vật chủ cho khoảng 5×104 ấu trùng tùy thuộc vào loài và trọng lƣợng vật chủ. Bảng 1.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng Tên Phân loại Ngành Nematoda Lớp Chromadorea Phân Chromadoria lớp Bộ Rhabditida Phân Panagrolaimomorpha bộ Họ Steinernematidae Heterorhabditiae Giống Steinernema Neosteinernema Heterorhabditis 1.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis Ấu trùng tuyến trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJ) mang vi khuẩn cộng sinh trong ruột. Khi vào đến bên trong vật chủ, chúng xâm nhập vào xoang máu, tuyến trùng sẽ phóng thích các vi khuẩn cộng sinh từ ruột của chúng vào trong máu của côn trùng. Vi khuẩn sẽ phát triển nhanh nhờ huyết tƣơng của côn trùng tạo ra hiện tƣợng ngộ độc máu làm côn trùng chết trong khoảng từ 24 đến 48 giờ đồng hồ. Vi khuẩn sẽ phân hủy mô trong cơ thể côn trùng giúp ấu trùng tuyến trùng hấp thu chất dinh dƣỡng để phát triển sang tuổi 4 và thành thành trùng thế hệ 1. Phụ thuộc vào nguồn dinh dƣỡng mà tuyến trùng có cách phát triển khác nhau trong cơ thể côn trùng nhƣ hình 2.1. 6
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng a. Chu trình sinh sản tuyến trùng trong cơ thể côn trùng Khi nguồn thức ăn phong phú thì tuyến trùng sẽ sống theo vòng tròn nhƣ hình 2.1. Trứng của tuyến trùng thế hệ 1 sẽ nở ra ấu trùng tuyến trùng thế hệ 1 và chúng lại tiếp tục ăn vi khuẩn để phát triển sang ấu trùng tuổi 2, 3, 4 và thành trùng thế hệ thứ 2. Thành trùng thế hệ mới sẽ tiếp tục chu trình sống và sinh sản nhƣ ở thế hệ 1. b. Chu trình sống khi không đủ dinh dưỡng Khi không có đủ nguồn dinh dƣỡng thì tuyến trùng sẽ sống theo chu kỳ ngắn nhƣ vòng nửa vòng cung phía dƣới của hình 2.1. Trứng của thành trùng thế hệ thứ 1 sẽ nở ra ấu trùng tuổi 1, từ đây phát triển sang dạng ấu trùng tuổi 2, kế đó sẽ chuyển sang dạng trung gian giữa ký sinh và tiềm sinh, cuối cùng thành ấu trùng gây nhiễm, chờ thời cơ để xâm nhập vào vật chủ. 1.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus Photorhabdus và Xenorhabdus đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh với côn trùng cũng nhƣ cung cấp dinh dƣỡng cho tuyến trùng. Đây đƣợc đánh giá là hai chi vi khuẩn đặc biệt nhất trong giới vi sinh vật khi cộng sinh với một vật chủ là tuyến trùng và ký sinh gây hại với một vật chủ khác là côn trùng (Steven Forst và David Clarke, 2011). 7
Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đƣờng ruột). 1.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae là một họ vi khuẩn lớn, gồm trên 100 loài mang những đặc điểm cơ bản sau: a. Nơi cư trú Họ vi khuẩn đƣờng ruột gồm những vi khuẩn thƣờng trú trên cơ thể, ở ống tiêu hóa của ngƣời và động vật, có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh. b. Hình thái Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn, không sinh nha bào. Một số giống vi khuẩn thƣờng không di động (Klebsiella, Shigella), một số vi khuẩn khác di động (E. coli, Salmonella) nhờ có tiên mao ở xung quanh thân tế bào. Một số giống có vỏ nhìn thấy đƣợc nhờ kính hiển vi thƣờng nhƣ Klebsiella. c. Sinh lý Các vi khuẩn đƣờng ruột là gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, phát triển đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. d. Tính chkhuẩn đường Lên men glucose, có sinh hơi hoặc không sinh hơi, oxidase âm tính, hầu hết catalase dƣơng tính, khử nitrate thành nitrite. Lên men một số đƣờng nhƣ glucose, galactose hoặc không lên men một số đƣờng nhƣ lactose, manose, saccharose. Có thể có một số enzyme nhƣ urease, tryptophanase. Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít amin hoặc các dẫn chất có lƣu huỳnh. 8
Đồ án tốt nghiệp 1.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus Bảng 1.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus STT Phân loại 1 Giới Bacteria 2 Ngành Proteobacteria 3 Lớp Gramma proteobacteria 4 Bộ Enterobacteriales 5 Họ Enterobacteriaceae 6 Chi Photorhabdus Xenorhabdus Hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có mối quan hệ với nhau, có thể thấy mối quan hệ giữa hai chi qua hình 2.1. 9
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus 10
Đồ án tốt nghiệp 1.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản Đây là hai chi có sự tƣơng tự cả về hình thái, sinh lý và sinh hóa, tuy nhiên có thể phân biệt chúng theo một số đặc điểm cơ bản đƣợc nhắc đến trong bảng 1.3. Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus STT Đặc điểm Photorhabdus Xenorhabdus Trình tự 16S Tại vị trí 208 – 213 Tại vị trí 208 – 211 1 rRNA TGAAAG TTCG Tế bào có hình que, Tế bào có hình que Đặc điểm 2 kích thƣớc vào khoảng và kích thƣớc là (0,3 - 2 hình thái (0,5 - 2 × 1 – 10 µm) × 2 – 10 µm) Điều kiện phát triển Phát triển tối ƣu ở Điều kiện tốt nhất là 280C hoặc 3 280C, một vài chủng phát nuôi cấy nhỏ hơn, một vài chủng triển ở 37 - 380C. phát triển ở 40C. Loài vật chủ 5 Heterorhabditis Steinernema cộng sinh Ngoài ra còn có một số đặc điểm cơ bản khác về mặt sinh hóa thì tùy thuộc từng loài và chủng cụ thể. a. Đặc điểm sinh lý nổi bật Photorhabdus và Xenorhabdus là Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có cả hai quá trình lên men và hô hấp trong tế bào. Đặc điểm nổi bật nhất phải nhắc đến là hiện tƣợng biến đổi pha, đây đƣợc coi là một hiện tƣợng rất độc đáo trong hai chi vi khuẩn này. Hiện tượng biến đổi pha: Đây là thuật ngữ để chỉ giai đoạn biến đổi tự nhiên xảy ra ở một số vi khuẩn về một số điểm nhƣ hình thái, màu sắc, tính chất hóa lý trong tế bào vi khuẩn. Nguyên nhân do biến đổi trong cấu trúc DNA đã làm thay đổi cấu trúc phân tử của các 11
Đồ án tốt nghiệp protein mà chúng tổng hợp ra điều này làm thay đổi các kiểu hình và kháng nguyên ở pha thứ cấp. Đối với vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus, pha I (sơ cấp) là dạng tế bào tự nhiên có quan hệ với tuyến trùng, còn pha II (thứ cấp) có thể xuất hiện một cách tự phát khi vi khuẩn đi vào pha cân bằng không tăng trƣởng. Đặc điểm của hai pha: Đặc điểm trƣớc tiên để dễ dàng phân biệt hai pha là khả năng hấp thu màu môi trƣờng để tạo màu khuẩn lạc ở pha sơ cấp nhƣng ngƣợc lại pha thứ cấp lại không thể hấp thu màu nên không tạo màu đặc trƣng nhƣ pha I. Một đặc điểm rất quan trọng khác là khả năng sinh enzyme và chất kháng sinh mạnh ở pha I nhƣng hầu nhƣ không có ở pha II. Có thể thấy đƣợc một số các đặc điểm khác nhau cơ bản ở bảng 1.4. Bảng 1.4. Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của Xenorhabdus / Photorhabdus Đặc điểm Dạng sơ cấp Dạng thứ cấp Hình thái khuẩn lạc Tròng, lồi, dạng hạt, Phẳng, trong mờ, cạnh trên nutrient agar màu đục, cạnh không đều. đều. Hình thái khuẩn lạc Các khuẩn lạc hút Không xốp, màu đỏ, trên MacConkey nƣớc, có màu đỏ trung trung tính, trắng, vàng. tính, đỏ, đỏ hồng. Hình thái khuẩn lạc Dạng xốp, xanh Không có dạng xốp, trên NBTA dƣơng, oliu hoặc xanh lá. màu đỏ hoặc nâu sẫm. Xung quanh khuẩn lạc Không tạo thành vùng có vùng trong, một phần trong suốt bao quanh. agar bị biến màu. Sắc tố tạo thành trong Phụ thuộc chủng và Phụ thuộc chủng và môi trƣờng lỏng môi trƣờng. Ở P. môi trƣờng. Thƣờng có luminesens có màu thay màu vàng thẫm, da cam. 12
Đồ án tốt nghiệp đổi từ tím đến màu tía Màu thay đổi không khi tăng nồng độ NaOH. mạnh khi thêm NaOH do nồng độ sắc tố thấp. Hình dạng và hình Tế bào dạng que, kích Tế bào tƣơng đối dài, thái tế bào thƣớc nỏ đến trung bình kích thƣớc nhỏ đến trung (dài 3 - 5 , rộng 1,5 – bình (6-7 , rộng 1 - 2 ). Cơ thể có thể vùi 1,5 ). Cơ thể ít có thể hình oval hoặc hình vùi vuông. Phát huỳnh quang ở Dƣơng tính Âm tính Photorhabdus Hoạt tính kháng Dƣơng tính Âm tính khuẩn Sinh trƣởng của tuyến Tuyến trùng sinh Nhân giống tuyến trùng trong nhân nuôi vi trƣởng tốt, tăng nhanh trùng khó khăn, sinh khuẩn kích thƣớc, số lƣợng thế trƣởng đình trệ, chết hệ sau và khả năng sống nhiều. sót. b. Đặc điểm hình thái nổi bật Khuẩn mao: Khuẩn mao là những sợi lông rất mảnh, rất ngắn, cứng, mọc quanh bề mặt tế bào nhiều vi khuẩn Gram âm. Chúng có đƣờng kính khoảng 7 - 9 nm, rỗng ruột (đƣờng kính trong là 2 - 2,5 nm), số lƣợng khoảng 250 - 300 sợi/vi khuẩn, có một tiểu đơn vị lớn hơn 17 kDa, vai trò chính là giúp vi khuẩn bám dính. Khuẩn mao của vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus đƣợc đánh giá có vai trò trong gây độc vì bám vào tế bào, mô côn trùng tạo điều kiện cho các yếu tố gây độc khác hoạt động. 13
Đồ án tốt nghiệp Tiên mao: Tiên mao là những sợi lông dài, dƣới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy rõ khi nhuộm theo phƣơng pháp riêng, vai trò chính là giúp cho vi khuẩn vận động. Mặt khác, chúng đóng một vai trò quan trọng trong gây độc vì nó sẽ đƣa vi khuẩn đến những vị trí thích hợp để gây bệnh, né tránh những vị trí bất lợi và tìm đến các nguồn dinh dƣỡng. Trong hầu hết chủng X. nematophila đã đƣợc kiểm tra, tế bào sơ cấp đều thể hiện hai đặc tính là di động và quần tụ bầy đàn trong khi tế bào thứ cấp không có tiên mao và không thể di động. Trong một nghiên cứu để tìm ra nguyên nhân thiếu tiên mao trong tế bào thứ cấp, Givaudan và cộng sự (1996) tách dòng gen mã hóa tiên mao fliC và filD của X. nematophila cho thấy fliCD operon không bị thay đổi trong tế bào thứ cấp nhƣng không đƣợc sao chép. Sự sao chép của fliCD operon bị điều khiển bởi flhDC (đây là operon ở Enterobacteriaceae kiểm soát sự biểu hiện của hơn 50 gen mã hóa chức năng tiên mao). Việc không có tiên mao ở tế bào thứ cấp là do thiếu yếu tố sigma fliA đây là yếu tố cần cho việc sao chép của fliCD. c. Đặc điểm sinh hóa Photorhabdus: Các đặc tính sinh hóa có sự khác nhau giữa các chủng của chi Photorhabdus, hầu hết âm tính trong các mô tả của Enterobacteriaceae Bảng 1.5. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus Kết quả Tên thử nghiệm Pha I Pha II Catalase + Khử nitrate - Thủy phân gelatine + Tan huyết cừu Hầu hết + Tan máu ngựa Hầu hết + Phân giải tween 20 + 14
Đồ án tốt nghiệp Tween - 40, 60, 80 và 85 Hầu hết + Acid hóa fructose, D - mannose, Hầu hết + maltose, ribose, N – acetylglucosamine Lên men từ glycerol + yếu Nguồn cacbon và năng lƣợng từ + fumarate, glucosamine, L - glutamate, L - malate, L - proline, Succinate, L – tyrosine Phát quang + + yếu Xenorhabdus: Xenorhabdus âm tính với hầu hết thử nghiệm của Enterobacteriaceae. Bảng 1.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus Kết quả Tên thử nghiệm Pha I Pha II Catalase + Khử nitrate - Thủy phân gelatine + Tan huyết cừu Hầu hết + Tan máu ngựa Hầu hết + Phân giải tween 20 + Tween - 40, 60, 80 và Hầu hết + 85 Acid hóa glucose + Di động + + yếu Hấp thu màu môi + - trƣờng Kháng sinh + - 15
Đồ án tốt nghiệp 1.4. Tổng quan về Serratia marcescens 1.4.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, vào năm 332 trƣớc công nguyên, những ngƣời lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có “máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcescens, tuy nhiên, điều này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011). Bizio, một dƣợc sĩ ở Padua (Italya), là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serrati, tên loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn. 16
Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Phân loại Serratia marcescens Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau: - Giới: Bacteria - Ngành: Proteobacteria - Lớp: Gramma proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Chi: Serratia - Loài: Serratia marcescens 1.4.3. Đặc điểm của Serratia marcescens 1.4.3.1. Đặc điểm sinh lý Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia marcescens có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Hình 1.3. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) 17
Đồ án tốt nghiệp Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar đƣợc mô tả là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thƣờng bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Hình 1.4. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở 25oC sau 48 giờ (David, 2012) Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. 1.4.3.2. Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng có oxy hoặc trong trƣờng hợp không có oxy. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatas, peroxides, bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trƣờng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là 18
Đồ án tốt nghiệp một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.7. (Tariq và John, 2010). Bảng 1.7. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens Đặc điểm sinh STT Kết quả hóa 1 Di động + 2 Indole – 3 Methyl Red – 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase + 7 Catalase + 8 Oxidase – 9 Urease – 10 Gelatinase + 11 Chitinase + Môi trƣờng chuyển sang acid, 12 Triple sugar iron không sinh khí và không sinh H2S 13 Hydrogen sulphide – 14 Lysine decarboxylase + peoduction 15 Ornithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose + 20 Lên men xylose – 21 Lên men rhaminose – 22 Lên men lactose – 23 Lên men arabinose – 19
Đồ án tốt nghiệp 1.4.3.3. Đặc điểm phân bố Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực vật, côn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hóa của ngƣời và động vật có xƣơng sống. Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông và Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể đóng một vai trò quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng nhƣ hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964). Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế. Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae. 1.4.4. Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens 1.4.4.1. Sắc tố Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố đặc biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008). 20
Đồ án tốt nghiệp Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup A1 và A2/6, nó không đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT (Grimont, 1977). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thƣờng gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont, 1977; Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hóa sinh tổng hợp prodigiosin đã đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Các dòng đƣợc tạo thành này có khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc tổng hợp giai đoạn MAP ở bên ngoài (Francine và Patrick, 2006). Prodigiosin đƣợc biết đến là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, có thể chúng sẽ không tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997). Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự, 1988). Enzyme này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens. Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a, đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp chất thơm, để có thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006). 1.4.4.2. Biosurfactants Các chủng sinh sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất thấm này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30°C nhƣng không đƣợc sản xuất ở 37°C trong phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1 đến W3, có các hoạt động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 đƣợc xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide mà trƣớc đó đã từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng sự (1961). 21
Đồ án tốt nghiệp 1.4.4.3. Acid béo Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và octadecanoic acid. Các acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế bào, trong đó, n- tetradecanoic acid chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983). 1.4.4.4. Enzyme Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase, Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc, (Joshi và cộng sự, 1989). Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme chitinase (ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding (CBP21) (Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự, 1988; Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự, 1996; Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998), chúng có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với các hoạt động chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986). 1.4.5. Yếu tố độc lực của Serratia marcescens Yếu tố độc lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các tác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trƣởng phát triển, gây ảnh hƣởng đến vật chủ, mà phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss và Hewlett, 1986). Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã đƣợc nghiên cứu, bao gồm sự bám dính, tính kị nƣớc, mannose-resistant, mannose-sensitive, LPS, Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính. 22
Đồ án tốt nghiệp Các yếu tố bám dính của vi sinh vật đƣợc gọi là các adhesion, chúng có thể có bản chất polypeptide hoặc polysaccharide. Đối với các adhesin có bản chất polypeptide thì đƣợc chia thành hai nhóm là nhóm có fimbriae và nhóm không có fimbriae. Mà các vi khuẩn Gram âm, nhƣ là Serratia marcescens, thƣờng bám dính nhờ các fimbriae này. Các fimbriae (hay còn gọi là các pili) là những cấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng nhƣ sợi lông trên bề mặt vi khuẩn. Các fimbriae đƣợc cấu tạo bởi nhiều protein xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống nhƣ trụ xoắn ốc. Thƣờng thì chỉ có một loại protein là cấu trúc chính của một phân nhóm fimbriae tuy nhiên các protein phụ trợ khác cũng có thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc fimbriae. Đỉnh của các fimbriae có chức năng gắn với tế bào vật chủ. Bên cạnh đó, LPS hay còn đƣợc gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lƣỡng tính nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O – antigen, lõi oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là thành phần gây độc của phân tử LPS, gây bên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm. Ngoài ra, việc sản xuất các enzyme khác nhau bởi Serratia marcescens cũng đƣợc xem nhƣ một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme chitinase, lipase, chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997). 1.5. Mối quan hệ cộng sinh 1.5.1. Vai trò của tuyến trùng Tuyến trùng đóng một vai trò quan trọng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm: - Vector vùng đóng một vai tròIJ khi xâm nh đóng một vai trò quan trọng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e, chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).ide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ màng tế bào khỏi các táđây vi khuẩn sẽ sinh sôi, tạo độc tố giết chết vật chủ. 23
Đồ án tốt nghiệp - Bkhi xâm nh đóng một vai trò quan trọng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e, chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).ide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPSqua lỗ hậu môn để vi khuẩn vào xoang máu côn trùng. Tạiác chất kháng thể để chống lại vi khuẩn cộng sinh, tuyến trùng sẽ tiết ra các chất làm trung hòa và làm mất tác dụng của kháng thể này (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). 1.5.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh S.5.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e, chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).ide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPSqua lỗ hậu môn để vi khuẩn vào xoang máu Cung c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e, chloroperoxviệc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của r4 giờ - 48 giờ,ày các IJ (tu c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e, chloroperoxviệc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của r4 giờ - 48 giờ,ày các ian này phụ Hotu c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e, chloroperoxviệc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của r4 giờ - 48 giờ,ày các ian này phụ ên kế vào tổ hợp tuyến trùng, vi khuẩn và lo Ngăn c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e, chloroperoxviệc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của r4 giờ - 48 giờ,ày các ian này phụ ên kế vào tổ hợp tuyến 1.5.3. Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn Mối liên hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn có thể đƣợc khái quát hóa qua ba giai đoạn nhƣ sau: a) Giai đon hệ Tuyến trùng sẽ tồn tại ở dạng ấu trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJ) đƣợc bao bọc bởi lớp vỏ cutin của ấu trùng tuổi 2. Đây là hình thức tồn tại mà không cần đến dinh dƣỡng, chúng sẽ tồn tại bền bỉ trong đất cho đến khi tìm đƣợc vật chủ. IJ của 24
Đồ án tốt nghiệp Steinernema sẽ mang vi khuẩn ở bọng trƣớc ống ruột, trong khi đó Ciche và Ensign (2000) cho thấy Heterorhabditis mang vi khuẩn nằm rải rác giữa ruột nhƣng chủ yếu vẫn là nửa trƣớc ống ruột. IJ tìm vật chủ theo hai hình thức: * Hình tht chủ theo : Vh tht chủ tHeterorhabditis và mrorhabditi Steinernema thì có tập tính săn lùng vật chủ. Nhờ khả năng nhận biết khí CO2 mà vật chủ thải ra giúp chúng định hƣớng đƣợc mục tiêu và di chuyển nhanh đến vật chủ. * Hình thtập tính s: Vh thtập tínSteinernema thì chúng a ính chn lùng đất chờ khi vật chủ đi qua chúng sẽ tấn công. Sau khi đã tìm thấy vật chủ chúng sẽ vào cơ thể vật chủ theo hai hình thức: * Hình th đã tìm thấ: Heterorhabditis s vật chủ chúng sẽ vào cơ thể vật miệng để đâm thủng biểu bì tại nơi xung yếu nhất là ranh giới giữa các đốt trong cơ thể, sau đó đi trực tiếp vào xoang máu của vật chủ. * Hình thđi trực ti: Steinernema seinernemarực tiếp vào xoang máu của qua miệng, lỗ thở, hậu môn và sau cùng sẽ di trú vào xoang máu. b) Giai đong, lỗ thở, Đây là giai đoạn kết hợp việc phục hồi của IJ, sự phóng thích vi khuẩn vào huyết tƣơng và giết chết vật chủ côn trùng. Tuy nhiên đồng thời với việc xâm nhập của IJ là một loạt các phản ứng của cơ thể vật chủ côn trùng để chống lại cả tuyến trùng và vi khuẩn. Phản ứng của tế bào để đáp lại thông qua tế bào máu để tiêu diệt các vi sinh vật bằng cơ chế thực bào. Khi mà sinh vật xâm nhập trên diện rộng (ở đây là tuyến trùng) thì tế bào máu sẽ phối hợp với nhau tạo thành một lớp bao vây quanh sinh vật là gọi là nốt sần. Cách khác là tế bào máu hoạt hóa enzyme phenoloxidase tạo thành lớp melanin quanh vi sinh vật gây hại. Và các phản ứng miễn dịch dịch thể gồm sản xuất lyzozyme và sản xuất các pepetide kháng sinh nhƣ cecropin. * Phà một lIJ: Trong huyết tƣơng, tuyến trùng vẫn tồn tại ở dạng IJ và tiếp tục phát triển. Bƣớc phát triển này của tuyến trùng gọi là sự phục hồi. IJ của Heterorhabditis sẽ phục hồi 25
Đồ án tốt nghiệp và phát triển thành dạng lƣỡng tính, trong khi đó IJ của Steinernema phát triển thành hai dạng giới tính rõ ràng. * Gây btriể Đây là yếu tố mấu chốt của mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn, vi khuẩn sẽ sản xuất ra các yếu tố độc tố gây ra cái chết của côn trùng chuẩn bị cho các bƣớc kế tiếp. c) Giai đouẩn, vi khuẩ Trong giai đoạn này là sự phát triển mạnh của vi khẩn đạt mật độ tế bào cao nhất và quá trình biến đổi sinh học xác côn trùng thành nguồn dinh dƣỡng thích hợp cho tuyến trùng sinh sôi và phát triển. * Biong giai đoạn này là sự phát t Huyết tƣơng là một nguồn dinh dƣỡng rất phong phú cho sự phát triển của vi khuẩn. Gian đoạn này bắt đầu sau khoảng 24 giờ – 48 giờ sau khi nhiễm, côn trùng sẽ bị khống chế hoàn toàn bởi các chất gây độc của vi khuẩn sau đó bị phân hủy dần vì các enzyme ngoại bào mà vi khuẩn tiết ra. Ví dụ nhƣ trong môi trƣờng nhân tạo Photorhabdus và Xenorhabdus sản xuất ra phức hợp protease, lipase, lecithinase, chitinase trong suốt giai đoạn tăng trƣởng. Ngoài ra P. luminescens cũng tiết ra một metalloprotease trong cả điều kiện invitro và invivo. * Nâng đoiết ra một metalloprotease tron Sản xuất enzyme phân giải cơ thể côn trùng để lấy dinh dƣỡng cho tuyến trùng và chính nó: Khả năng sinh sôi của tuyến trùng phụ thuộc vào sự hiện diện của vi khuẩn trong cơ thể côn trùng. Trong trƣờng hợp của Photorhabdus – Heterorhabditis cho thấy Heterorhabditis chỉ phát triển khi có Photorhabdus, điều này cho thấy vai trò rất quan trọng trong việc chuyển hóa sinh học xác côn trùng. Ở một nghiên cứu khác, Steinernema có thể sinh sôi dù không có sự hiện diện của Xenorhabdus, nhƣng sự sinh sôi này có sự hạn chế về số lƣợng. * B nhưng sự sinh sôi này có sự hạn chế về số lượng.iệc chuyển hóa sinh học 26
Đồ án tốt nghiệp Phụ thuộc điều kiện nuôi cấy, thời gian của một thế hệ ấu trùng xâm nhiễm thoát ra ngoài là khoảng 7 – 21 ngày sau khi chúng vào côn trùng. Trong suốt thời gian này điều rất quan trọng là xác chết côn trùng phải đƣợc bảo vệ khỏi sinh vật lạ. Cả Photorhabdus và Xenorhabdus sản xuất ra kháng sinh để chống lại các loài sinh vật khác. d) Giai đot ra k Giai đoạn trƣởng thành của IJ và hình thành tập đoàn IJ mới cộng sinh với vi khuẩn. Sự trưởng thành của IJ: IJ sẽ sử dụng dinh dƣỡng đƣợc cung cấp để phát triển thành dạng thành trùng trƣởng thành. Hình thành tập đoàn IJ: Khi phát triển đến trƣởng thành trong cơ thể vật chủ, tuyến trùng tiếp tục phát triển qua một, hai hay nhiều thế hệ và tạo ra nhiều IJ sau khi kết thúc quá trình sinh sản trong vật chủ. Sau đó các IJ đồng loạt chui ra ngoài xác côn trùng và phát tán vào môi trƣờng đất xung quanh xác chết và trở thành ấu trùng xâm nhiễm. Bảng 1.8. Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh Giai đoi Vòng đoi của tuyến trùng Vòng đoi của tuyến tr Tuyg đoi của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sin Vi khuoi của tuyến I Tìm vđoi của tuyến trùn trùng – vi khuẩn cộng sin Xâm nhoi của tuyến trùng – vi khuẩn cộng Vi khum) của tuyến trùng – vi khuẩn cộng s Ph (suoi của tuyến trùng – vi II (suoi Si khum) của tuyến khuẩn cộ trùng Làm chết côn trùng. II (muết Tuy(muết côn trùng.t Vi khuết côn trùng.trùng 27
Đồ án tốt nghiệp – Si khuết côn trùng.trùng – vi khuẩn cộng sinht tán vào m Bi khđết côn trùng.trùng – Hình thành th III Tuykhđết côn trùng.trùng – hùng.trùng – vi khuẩn cộng sinht tá 1.5.4. Mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng EPN và Serratia sp. Không nhƣ mối quan hệ cộng sinh truyền thống giữa tuyến trùng EPN và hai chi VKCS Photorhabdus, Xenorhabdus đƣợc báo cáo trƣớc đây. Trong công bố của Eyualem Abebe và cộng sự, 2011 đã khẳng định mối quan hệ cộng sinh mới giữa tuyến trùng Caenorhabditis briggsae và chủng Serratia sp. SCBI khi gây nhiễm trên ấu trùng BSL. Mặc dù mối quan hệ này có nhiều nét tƣơng đồng với tổ hợp Heterohabditis – Photorhabdus nhƣ việc Serratia sp. SCBI cũng đƣợc phát hiện trong ống tiêu hóa của tuyến trùng C. briggsae, đƣợc truyền cho các thế hệ tuyến trùng thông qua cơ thể tuyến trùng cái. Tuy nhiên hầu nhƣ chỉ có tuyến trùng trƣởng thành mới mang vi khuẩn Serratia sp. SCBI (gần cơ quan sinh sản) và mối quan hệ cộng sinh này dƣờng nhƣ không bắt buộc. Vì thực tế Serratia sp. SCBI đều có khả năng giết chết sâu bằng cách nhiễm trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tuyến trùng. Đây chính là bằng chứng của việc cộng sinh không bắt buộc và Serratia sp. SCBI trong mối quan hệ này cũng không đóng vai trò là thức ăn chính của tuyến trùng C. briggsae. Trong nghiên cứu tƣơng tự của Zhang và cộng sự, năm 2009 cũng tìm thấy một chủng vi khuẩn DZ0503SBS1(T) gram âm, tạo sắc tố đỏ, có khả năng phát quan, di động trong ống tiêu hóa của tuyến trùng Heterorhabditidoides chongmingensis. 28
Đồ án tốt nghiệp Việc giải trình tự 16s rRNA, cho thấy chủng DZ0503SBS1(T) tƣơng đồng 99,8% với Serratia marcescens subsp. sakuensis JCM 11315(T), 99,5% với S. marcescens subsp. marcescens DSM 30121(T). Do vậy, tiến hành giải trình tự acid béo ở vỏ màng nhầy, kết quả thu đƣợc chủng DZ0503SBS1(T) chƣa từng tồn tại trong chi Serratia và đƣợc đặt tên là Serratia nematodiphila sp. nov. DZ0503SBS1(T). 1.6. Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt Côn trùng là nguồn cung cấp dinh dƣỡng hết sức phong phú gồm protein, lipid và một số thành phần khác, ngoài ra nó còn cung cấp chỗ trú ngụ tạm thời cho một vài thế hệ tuyến trùng. 1.6.1. Đặc trưng côn trùng bị EPN tiêu diệt N1. Đặc trSteinernema thì xác chng côn trùng bị EPN tiêu diệ Nthì xác cHeterorhabditis thì da có màu đ n trùng bị EPN Da xác ch màu đ n trùng bị EPN tiêu diệtết sức 1.6.2. Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt a) Sâu hác EPN có hiệu quả trong diệt trừ nhiều loài sâu hại nhƣ: sâu khoang (Spodopetera litura); sâu keo da láng (S. exigua); sâu keo (S. mauritia); sâu xám (Agrotis ypsilon); sâu đo xanh (Plusia sp.); sâu cuốn lá đậu tƣơng (Lamprosema indicata); SXDL bông (Helicoverpa armigera); sâu cuốn lá bông (Sylepta flava); SXDL bƣớm trắng ( Pieris rapae); sâu cuốn lá đơn (Parnara guttata); sâu tơ (Plutella xylostella). b) B. rel Sùng bọ rầy là một loài côn trùng gây hại trầm trọng cho các sân cỏ và sân golf ở nƣớc Mỹ. Hai loại tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis đã đƣợc thí nghiệm bằng cách xịt lên sân cỏ và cho thấy có thể diệt 100% côn trùng hiện diện trên sân cỏ. Các loài S. carpocapsae, S. glaseri, S. arenarium, H. bacteriophora, H. megidis. c) Côn trùng hsaeurculionidae trên cam quýt Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhà kính, ngoài đồng với các loại tuyến trùng S. carpocapsae, S. glaseri, S. riobrave và H. bacteriophora cho thấy các loại 29
Đồ án tốt nghiệp tuyến trùng này có thể diệt trừ một phần hoặc toàn bộ côn trùng gây hại cam quýt trong tiểu bang Florida. d) Dcho th Dế nhũi là một côn trùng gây hại trầm trọng cho sân cỏ, sân đánh golf. Nguyễn và Smart, 1990 đã tìm ra đƣợc một loài tuyến trùng từ Brazil và Uruguay và đƣợc đặt tên là S. scapterisci. Loài tuyến trùng này có khả năng ký sinh hầu hết các loài dế nhũi trong tiểu bang Florida và các tiểu bang Florida và các tiểu bang có khí hậu ấm ở miền nam nƣớc Mỹ. 1.7. Khái quát về SXDL Spodoptera exigua SXDL da láng là một loài sâu đa thực, ngoài cây hành chúng còn gây hại khá nhiều loại cây trồng khác thuộc họ đậu đỗ, họ bầu bí, họ thập tự, họ cà, cây bông vải, cây bắp, cây nho vì thế việc phòng trị chúng vốn đã khó (vì loài này kháng thuốc rất nhanh) lại càng khó hơn. Sâu non ăn lá, lúc nhỏ chừa lại biểu bì, sâu tuổi lớn ăn thủng lỗ trên lá, không hình dạng, mật độ sâu cao có thể làm ảnh hƣởng đến năng suất. 1.7.1. Đặc điểm hình thái Thành trùng có kích thƣớc trung bình, thân dài 18-20 mm, sải cánh rộng 30-35 mm, màu nâu xám nhạt, cuối bụng con cái có một chùm lông. Trứng đƣợc đẻ tập trung vào nửa đêm thành từng ổ, mỗi ổ có hàng trăm trứng. Trên ổ trứng có phủ một lớp lông màu trắng hoặc vàng nhạt. Sâu non có màu xanh nhạt, da bóng láng trên lƣng có năm sọc, 2 sọc ở mỗi bên hông rất to và đậm, sọc giữa lƣng có màu đen xen kẽ màu trắng. Nhộng màu nâu sẫm hay đỏ sẫm thƣờng ở trong đất. 1.7.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái 1.6.2.1. Vòng đời (30 – 40 ngày) Trứng: 2 – 5 ngày Sâu non: 15 – 20 ngày Nhộng: 7 – 10 ngày Trƣởng thành: 2 – 3 ngày 30
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Vòng đời SXDL da láng Trƣởng thành chủ yếu hoạt động vào ban đêm, nhất là những đêm có trăng. Trứng đƣợc đẻ thành ổ trên lá. Sâu non mới nở sống tập trung quanh ổ trứng, ăn chất xanh của lá để lại màng biểu bì. Sâu tuổi 3 bắt đầu phân tán ăn toàn bộ thịt lá chỉ chừa lại gân, sâu còn ăn cả ngọn, hoa và đục vào trái. Sâu non có 6 tuổi, sâu non ăn rất mạnh, cắn phá thành từng lỗ không hình dạng trên lá mật độ cao có thể làm các ruộng cây màu xơ xác. Sâu non ban ngày ẩn trong tán lá hoặc dƣới đất, phá hại mạnh vào ban đêm và những khi trời âm u, ít nắng. Sâu đẫy sức hóa nhộng trong đất, lùm cỏ hoặc dƣới lớp lá khô. 1.7.2.2. Thiên địch Nhóm ký sinh có hai loài ong kén nhỏ thuộc họ Braconidae. Loài ruồi thuộc họ Tachinidae. Nhóm vi sinh vật có vi khuẩn tấn công. 31
Đồ án tốt nghiệp 1.7.3. Một số biện pháp phòng trừ * Biện pháp canh tác: Trƣớc khi trồng cần đƣa nƣớc làm ngập ruộng để diệt nhộng. Cày ải phơi ruộng để diệt sâu và nhộng. Vệ sinh đồng ruộng hủy bỏ tàn dƣ cây trồng. Mật độ trồng thích hợp. Bón phân cân đối hợp lý cũng là biện pháp hạn chế bớt sâu bệnh phát triển. * Biện pháp cơ học: Ở những thửa ruộng nhỏ có thể ngắt bỏ ổ trứng và thu sâu non khi sâu non đang sống tập trung quanh ổ. * Biện pháp hóa học: Dùng chế phẩm NPV đặc hiệu trừ SXDL da láng có hiệu quả cao. Nên kết hợp dùng thuốc thảo mộc Rotenone hay Azadirachtin. Thuốc vi sinh nhƣ: Biocin 16WP; Olong 55WP; Biocin 8000SC; Vi-BT; Xentari 15FC; Delfin WG Ngoài ra có thể dùng các loại thuốc nhóm Pyrethroid, Abamectin lƣu ý dùng luân phiên thuốc. 32
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 25/05/2015 đến ngày 15/08/2015. 2.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu – thiết bị - hoá chất 2.2.1. Nguồn vi sinh vật Tuyến trùng Steinernema quangdongsense XT (S – XT) và Heterorhabditis indica CP 16 (H – CP16) do TS. Nguyễn Ngọc Châu, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Việt Nam cung cấp. Nguồn vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi do cô Đỗ Thị Tuyến, Phòng các hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện sinh học nhiệt đới cung cấp. Nguồn nấm Fusarium sp., Colletotrichum sp., Rhizoctonia sp., Neoscytalidium sp. do TS. Nguyễn Thị Hai phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng – Đại học Công Nghệ TP. HCM cung cấp. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng a. Môi trường (Thành phần môi trƣờng xem phụ lục 1) - Môi trƣờng MacConkey (Mac) - Môi trƣờng NBTA - Môi trƣờng Nutrient agar (NA) - Môi trƣờng Nutrient broth (NB) - Môi trƣờng Peptone glycerone agar (PGA) - Môi trƣờng Peptone glycerone broth (PG) - Môi trƣờng Triple Sugar Iron Agar (TSI) - Môi trƣờng Phenol Red Lactose Broth 33
Đồ án tốt nghiệp - Môi trƣờng Tryptone Broth - Môi trƣờng Simmon Citrate - Môi trƣờng Nitrate Broth - Môi trƣờng thạch mềm NA - Môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase - Môi trƣờng Gelatine - Môi trƣờng Casein - Môi trƣờng huyền phù chitin b. Hóa chất sử dụng - Cồn 70o, cồn 96o - NaCl - HCl, NaOH - Hóa chất nhuộm Gram - H2O2 - Thuốc thử Kovac’s - Thuốc thử Griess A và Griess B - Trichloroacetic acid (TCA) - Nƣớc muối bão hòa 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị a. Dụng cụ - Hộp nuôi sâu - Đĩa petri nhựa - Thùng nuôi bƣớm - Chổi lông bắt sâu - Giấy lọc - Ống nghiệm - Đĩa petri - Erlen 50ml, 100 ml, 250ml - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml 34
Đồ án tốt nghiệp - Pipetman 100μl, 1000μl - Đầu típ - Đũa thủy tinh - Bao hấp, giấy gói, thun - Đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng - Bông không thấm, bông thấm - Kim tiêm, que cấy b. Thiết bị - Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh - Cân phân tích - Bếp từ - Máy nƣớc cất - Autolave - Tủ hút - Máy ly tâm - Máy lắc - Bể điều nhiệt - Kính hiển vi 35
Đồ án tốt nghiệp 2.3. Bố trí thí nghiệm Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau: Nguồn tuyến trùng Xâm nhiễm trên SXDL Đánh giá hiệu lực Bảo quản trong Thu và bảo quản sâu chết bởi nƣớc cất tuyến trùng Khảo sát sản lƣợng, Nguồn tuyến trùng chu kì kí sinh-phát tán IJ mới Lựa chọn phƣơng pháp khử trùng – phân lập Chứng minh nội sinh Định lƣợng vi sinh vật Khảo sát hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng NBTA, NA, MacConkey Chủng thuần khiết Hình 2.1. Quy trình khảo sát sản lƣợng, chu kì kí sinh- phát tuyến trùng trên kí chủ SXDL và phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng 36
Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn TSI Kiểm tra tính thuần khiết Lên men Soi khuẩn lạc đƣờng Quan sát hình thái, sinh lý Nhuộm Gram OF/O–OF/F Thử nghiệm sinh hoá Catalase Định danh sinh hóa trên Indole KIT API 20E Khử nitrate Định danh bằng giải mã trình tự gene 16S rRNA Khử citrate Oxidase So sánh trình tự gene trên Blast NCBI Di động Hình 2.2. Quy trình khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa và định danh vi khuẩn Chủng vi khuẩn Tăng sinh 24 giờ khử trùng – phân lập Khảo sát hoạt tính sinh học khử trùng – phân lập Khả năng Kháng Kháng Enzyme Kháng Tƣơng tác diệt sâu nấm kháng sinh khuẩn tuyến trùng Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn mới phân lập 37
Đồ án tốt nghiệp 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 2.4.1. Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm Phòng nuôi sâu phải đảm bảo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho SXDL phát triển 27 ± 20 C, và ẩm độ 70 ± 5%. SXDL da láng Spodoptera exigua đƣợc thu mẫu từ các ruộng hành tại tỉnh Vĩnh Long. Thế hệ P đƣợc nuôi trong hộp nhựa và cho ăn bằng thức ăn tự nhiên (hành hái tại ruộng) cho tới khi hóa nhộng. Sau khi sâu hóa nh tr, lót khăn giu hóa nh trong hộp nhựa và cho ăn bằng thức ăn tự nhiên (hành hái tại ruộng) cho tới khi 5-6 ngày nhgiu hóa nh trong hộp n Sau khi vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy, thức ăn là mật ong pha loãng. Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh hàng ngày. Ổau khi vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy, thức ăn là mật ong pha loãng. Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh Sâu non F1 m u non vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong t u non vũ hóa, bƣớm t đã chu vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy, thức ăn là mật ong pha loãng. Tiến hành kiểm tra thu trứng, t30 sâu/ hu v(Ph/ hu vũ hóa, bƣớm thế hệ. C/ hu vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghé T C/ hu v F1 thC/ hu v Fhóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy, thức ăn là mật ong pha loãng. Tiến hành kiể Nhân nuôi SXDL cho đnhi Fhóa, bƣớm thế hệ P đƣợc 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu tuyến trùng in vivo 2.4.2.1 Phương pháp thử nghiệm trong đĩa petri (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) Đặt 2 giấy lọc whatman (hoặc một lớp cát) vào đĩa petri có đƣờng kính 10 cm. Đƣa số lƣợng IJ theo yếu cầu vào trên giấy lọc trong một thể tích nƣớc sao cho giấy lọc đủ ấm nhƣng không chảy nƣớc khi nghiên đĩa. Thêm số vật chủ vào trong đĩa theo yêu cầu và đậy nắp lại. Giữ ẩm bằng cách cho vào một túi nilon, có trao đổi khí với bên ngoài, ủ ít nhất trong vòng 48 giờ (lâu hơn trong điều kiện nhiệt độ lạnh). 38
Đồ án tốt nghiệp Các ký chủ không có dấu hiệu bị ký sinh do tuyến trùng mà có biểu hiện bị nhiễm bởi các vi sinh vật khác ký sinh, có mùi hôi và bị thối rửa sẽ bị loại ngay. Còn các ký chủ chết mà không có mùi hôi và có các biểu hiện là do tuyến trùng ký sinh sẽ đƣợc giữ lại và tiếp tục theo dõi cho đến khi phát tán. Ghi lại tỷ lệ tử vong và kiểm tra nhiễm tuyến trùng bằng cách giải phẫu xác chết côn trùng hoặc đếm số tuyến trùng xâm nhập vào tử thi trong vòng 48 giờ sau khi. Các số liệu sâu chết sau khi ghi nhận sẽ đƣợc đem đi xử lý bằng dùng công thức Abbott (1925) để tính hiệu lực diệt sâu nhƣ sau: H% = (1- ) x 100 Trong đó: - H: tỷ lệ sâu chết (%) - Ta: số sâu sống ở các công thức sau thí nghiệm - Ca: số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm 2.4.2.2 Phương pháp bẫy nước thu tuyến trùng Whitetrap (White, 1927) Sau khi côn trùng bị nhiễm tuyến trùng và chết thì tiến hành thu bằng bẫy nƣớc nhƣ sau. Dùng một đĩa petri thủy tinh có đƣờng kính 15 cm đổ vào khoàng 70 ml nƣớc cất. Đặt vào trong một gƣơng cầu lõm úp ngƣợc không để nƣớc lọt vào bên trong, đặt lên trên một tờ giấy lọc whatman sao cho vừa gƣơng cầu và mép gấp vừa chạm mặt nƣớc. Đặt sâu chết (sau 3-4 ngày) lên mép mặt cầu, giữ ấm trong túi nilon, quan sát đến khi phát tán IJ thì ta thu nƣớc phía dƣới, lấy tuyến trùng và thêm nƣớc vào thu đợt mới. Tuyến trùng sau khi thu đƣợc lọc rửa và bảo quản. 2.4.2.3. Phương pháp lọc rửa tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2009) Nếu dung dịch chứa tuyến trùng mang nhiều cặn bẩn có thể dùng rây lọc kích thƣớc lỗ 50 μm để lọc lấy IJ. 39
Đồ án tốt nghiệp Để cho tuyến trùng vào một cốc nƣớc cất, để lắng, gạn phần nƣớc phía trên bỏ đi và cho nƣớc cất mới vào (2-4 lần) cho đến khi dung dịch trở nên sạch. Có thể dùng formalin 0.1% để rửa tuyến trùng trong lần rửa đầu tiên nếu dung dịch có nguy cơ ôi nhiễm. Để đẩy nhanh quá trình lắng có thể li tâm dung dịach chứa tuyến trùng ở tốc độ 300 vòng/phút trong 1 phút. Sau khi dung dịch trong ta tiến đếm xác định mật độ và tiến hành bảo quản. 2.4.2.4. Phương pháp đếm tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) Có hai phƣơng pháp chính là đếm trực tiếp và pha loãng. * Đếm trực tiếp: Chỉ dùng khi lƣợng tuyến trùng ít (1- 50 IJ), đếm từng cá thể trực tiếp dƣới kính hiển vi. Với độ phóng đại 10 – 40X. * Pha loãng: Khi nồng độ tuyến trùng trong mẫu cao hơn 200 IJ/ ml thì áp dụng phƣơng pháp này. Bước 1: Chuẩn bị dịch pha loãng. Lắc nhẹ dung dịch chứa tuyến trùng cho phân bố mật độ đều, lấy 1 ml từ dịch này và thêm vào X ml nƣớc, X đƣợc ƣớc lƣợng để số lƣợng tuyến trùng vào khoảng 100 IJ/ml. Đây là l: X+1 pha loãng. Bước 2: Đếm dung dịch pha loãng: Lần lƣợt, 1 ml dung dịch sẽ đƣợc trải ra 4-5 đĩa đếm và đếm dƣới kính hiển vi. Tiến hành đếm từ 3-5 mẫu từ 2-3 dung dịch pha loãng khác nhau. Để xác định nồng độ tuyến trùng trong dung dịch ban đầu sử dụng công thức: N x x (X+1) = S Trong đó: N là số tuyến trùng trung bình trong 1 mẫu đếm, M là số ml trong 1 mẫu đếm, X+1 là số ml pha loãng, và S là nồng độ tuyến trùng trong dung dịch ban đầu. 2.4.2.5. Phương pháp bảo quản tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Phong, 2013) Tuyến trùng đƣợc bảo quản ở điều kiện lạnh 10oC. 40
Đồ án tốt nghiệp Nƣớc cất, pH 6.5. Nồng độ bảo quản: 104 IJ/ml. Thể tích bảo quản: 15 ml/lọ. 2.4.2.6. Phương pháp xác định hoạt động của tuyến trùng (Albrecht M. Koppenhofer, 2007) Để quan sát trạng thái sống – chết của tuyến trùng trong quá trình bảo quản dƣới kính hiển hiển vi ta dựa vào một số đặc điểm khác nhau của tuyến trùng sống vàđã chết. Tuyến trùng còn sống sẽ bắt đầu di chuyển sau khi đƣợc khuấy động mạnh, nhìn chung các IJ đã chết thƣờng nằm bất động với tƣ thế thẳng còn các IJ sống di chuyển hoặc thƣờng nằm với tƣ thế cong. Dƣới kính hiển vi, các IJ còn sống ngoại trừ phần đầu và đuôi thì có màu tối hơn so với các IJ đã chết. Màu tối này là bởi lƣợng lipid dự trữ bên trong tuyến trùng. Vì vậy các IJ đã chết có thân hình trong hơn do lƣợng lipid dự trữ không còn. Cuối cùng kiểm tra khả năng xâm nhiễm của tuyến trùng bằng cách thử nghiệm trên đĩa petri. 2.4.2.7. Thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên đối tƣợng SXDL tuổi 4 41
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên đối tượng SXDL tuổi 4 Nghiệm thức Nồng độ gây nhiễm Số lƣợng sâu gây nhiễm (IJ/sâu) 1 5 20 2 10 20 3 15 20 4 20 20 5 25 20 6 30 20 7 35 20 8 40 20 9 45 20 10 50 20 Đối chứng 0 20 - Điều kiện: Nhiệt độ: nhiệt độ phòng. Thời gian: 2 ngày. Độ ẩm: 70- 95%. Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp thí nghiệm trên đĩa prtei và thu hoạch bằng phƣơng pháp bẫy nƣớc Whitetrap. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 10 nghiệm thức gây nhiễm và 1 nghiệm thức đối chứng. - Chỉ tiêu theo dõi: Nồng độ (mật độ) IJ gây nhiễm lên ký chủ. Số lƣợng sâu chết. 42
Đồ án tốt nghiệp - Ghi nhận và xử lý số liệu: Ghi nhận số sâu chết, đặc điểm sâu chết do tuyến trùng. Xác định tỷ lệ sâu chết bằng dùng công thức Abbott (1925). Xác định chỉ số LD50. Vẽ biểu đồ thể hiện mối tƣơng quan giữa tỷ lệ chết và nồng độ IJ gây nhiễm. 2.4.2.8. Thí nghiệm khảo sát sự tương quan giữa số lượng gây nhiễm - sản lượng IJ và chu kì kí sinh – phát tán của các chủng tuyến trùng trên vật chủ SXDL * Thí nghiệm a: Sự tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra đối với 2 chủng tuyến trùng Nghiệm thức Nồng độ gây nhiễm Số lƣợng sâu gây nhiễm (IJ/sâu) 1 5 1 2 10 1 3 15 1 4 20 1 5 25 1 6 30 1 7 35 1 8 40 1 Đối chứng 0 1 - Điều kiện: Sâu tuổi 4. Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Độ ẩm: 70- 95% 43
Đồ án tốt nghiệp Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp thí nghiệm trên đĩa petri và thu hoạch bằng phƣơng pháp bẫy nƣớc Whitetrap. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 5 nghiệm thức gây nhiễm và 1 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. - Chỉ tiêu theo dõi: Tổng sản lƣợng IJ sinh ra ở mỗi nồng độ gây nhiễm từ đó suy ra nồng độ nhiễm tối ƣu. * Thí nghiệm b: Khảo sát chu kỳ kí sinh và phát tán của các chủng tuyến trùng - Bố trí thí nghiệm: Số lƣợng: 1 sâu/đĩa Nồng độ: chọn nồng độ tối ƣu ở thí nghiệm 1 Thí nghiệm lặp lại 3 lần - Điều kiện: Sâu tuổi 4. Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Độ ẩm: 70- 95% Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp thí nghiệm trên đĩa prtei và thu hoạch bằng phƣơng pháp bẫy nƣớc Whitetrap. - Chỉ tiêu theo dõi: Ngày bắt đầu phát tán và sản lƣợng IJ sinh ra ở mỗi ngày, từ đó xem xét độ phát tán tập trung. 2.4.2.9. Thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S – XT, H – CP16 bằng phương pháp tiêm và bước đầu xác định tác nhân gây chết 44
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S – XT, H – CP16 bằng phƣơng pháp tiêm Nghiệm thức Nồng độ gây nhiễm Số lƣợng sâu gây nhiễm (IJ/sâu) 1 5 6 2 10 6 Đối chứng 0 6 - Điều kiện: Sâu tuổi 4. Tuyến trùng đã khử trùng bề mặt. Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Thời gian: theo dõi đến khi đối chứng hoá nhộng. Độ ẩm: 70- 95% Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp tiêm, đối chứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 2 nghiệm thức gây nhiễm và 1 nghiệm thức đối chứng. Sâu ở nghiệm thức đối chứng đƣợc tiêm dung dịch tiêm (0,85% NaCl và 0,1% peptone). Tiến hành rút và ria giọt huyết tƣơng từ sâu chết do tuyến trùng sau 48 giờ trên môi trƣờng NBTA, bƣớc đầu xác định nguyên nhân gây chết sâu. - Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian và dấu hiệu sâu chết do phƣơng pháp tiêm. Sự hiện diện của vi sinh vật trên môi trƣờng NBTA. 45
Đồ án tốt nghiệp 2.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn 2.4.3.1. Phương pháp phân lập được cải tiến từ phương pháp của Akhurst (1980) và Sun Ho Park và Yeon Su Yu (1999) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2009) Tuyến trùng đƣợc trữ lạnh ở 10oC lấy ra để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tuyến trùng hoạt động trở lại. Khử trùng bề mặt IJ Rửa 2 – 3 lần bằng formalin 0,1%, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Ly tâm ở 500 vòng/phút trong 2 phút hoặc để lắng tự nhiên, thu dịch tuyến trùng. Ngâm trong dung dịch NaClO 0,5% 10 phút, lặp lại 2 lần, rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Ly tâm ở 500 vòng/phút trong 2 phút hoặc để lắng tự nhiên, thu dịch tuyến trùng. Ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 30 phút để giải phóng vi khuẩn. Cho vi khuẩn tăng sinh trên môi trƣờng NB trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng, điều kiện tối và lắc 210 vòng/phút. Sau khi tăng sinh pha loãng canh trƣờng vi khuẩn bằng nƣớc muối sinh lý 0,85%, chọn 3 độ pha loãng cấy trang trên môi trƣờng MacConkey, ủ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối 48 giờ, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau thời gian ủ, chọn khuẩn lạc đặc trƣng cấy thuần lại trên môi trƣờng MacConkey, Nutrient agar (NA) và Peptone glycerol agar (PGA) để khảo sát hình thái khuẩn lạc. 46
Đồ án tốt nghiệp Mẫu tuyến trùng EPN Rửa 2 - 3 lần với formaline 0,1 % Ngâm trong dung dịch NaClO 0,5% 15 phút Ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút Tăng sinh trên môi trƣờng NB 48 giờ, trong tối, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng Phân lập trên môi trƣờng thạch MacConkey Cấy thuần trên môi trƣờng thạch MacConkey Cấy trên môi trƣờng thạch NA và PGA chọn chủng tổng hợp sắc tố Hình 2.4. Quy trình phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng EPN 47
Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.2. Phương pháp phân lập được cải tiến từ phương pháp của Lawrwnce A. Lacey (2011) - Khử trùng bề mặt IJ: Chuyển 2 ml dung dịch tuyến trùng (400 IJ) vào ống ly tâm, tiến hành ly tâm. Loại bỏ nƣớc và thêm vào 1 ml dung dịch Javel 1%, giữ trong 1 phút. Tiến hành ly tâm 15000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dung dịch Javel và thêm vào 1 ml nƣớc cất vô trùng. Tiếp tục ly tâm 15000 vòng/phút trong 3 phút. - Lặp lại các bƣớc khử trùng 7 lần. - Bổ sung bụi thủy tinh vào nƣớc rửa của lần khử trùng cuối, ly tâm 15000 vòng/phút trong 30 phút, sử dụng đũa thủy tinh vô trùng nghiền nát tuyến trùng giải phóng vi khuẩn. - Cấy ria dịch ly tâm từ tuyến trùng lên đồng thời ba môi trƣờng (có bổ sung pyruvate) NBTA, McConkey và peptone glycerol agar (PGA). Quan sát hình thái khuẩn lạc. - Tạo chủng thuần khiết, giữ giống lạnh đông và giống trong ống thạch nghiêng. 2.4.3.3. Phương pháp chứng minh nội sinh Sau mỗi lần khử trùng bề mặt, hút 0,1 ml dịch trong từ ống ly tâm, trải đĩa trên môi trƣờng PCA. Lặp lại 3 lần ở nƣớc rửa cuối cùng trong bƣớc khử trùng bề mặt. Đối với phƣơng pháp phân lập mô tả bởi Nguyễn Hòang Anh Kha (2009), tiến hành định tính sự hiện diện của vi sinh vật trong nƣớc rửa cuối cùng trƣớc khi phá vỡ tuyến trùng. Đối với phƣơng pháp Lawrwnce A. Lacey (2011), sự hiện diện của vi sinh vật đƣợc kiểm tra qua 7 lần, mỗi lần ứng với nƣớc rửa cuối cùng của bƣớc khử trùng bề mặt. Vi khuẩn khuẩn phân lập đƣợc xem là nội sinh trong tuyến trùng khi trong nƣớc rửa cuối cùng không có sự xuất hiện của bất kì vi sinh vật nào. 48
Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.4. Phương pháp định lượng vi khuẩn nội sinh - Khử trùng bề mặt IJ: Đƣợc tiến hành tƣơng tự trong mục 2.4.3.3. Để giảm thiểu tối đa lƣợng tuyến trùng bị mất sau mỗi lần ly tâm, sau mỗi lần rửa, dịch sẽ đƣợc lọc qua tấm giấy lọc vô trùng. - Lặp lại bƣớc khử trùng 7 lần. - Chuyển toàn bộ tuyến trùng trên giấy lọc vào ống ly tâm chứa 1ml nƣớc cất vô trùng. - Ly tâm 15000 vòng/phút trong 30 phút có bổ sung bụi thủy tinh, và cuối cùng đƣợc nghiền bởi đũa thủy tinh. - Pha loãng dịch nghiền 10-1 – 10-5 trong nƣớc muối sinh lý. Ở mỗi nồng độ, tiến hành trải 3 đĩa trên môi trƣờng NBTA để định tính và định lƣợng các chủng vi khuẩn nội sinh trong tuyến trùng. - Số lƣợng vi khuẩn trong 1 IJ đƣợc tính bở công thức sau: C N =  400d(Vn1 0,1Vni ) N là số vi sinh vật trong một IJ. C là tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên tất cả các đĩa Petri đƣợc giữ lại; V là thể tích trải đĩa; n1 là số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất; ni là số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ i; d là hệ số pha loãng tƣơng ứng với độ pha loãng thứ nhất; 400 là lƣợng IJ đem phân tích. - Sự định lƣợng lặp lại 3 lần ở các mẫu ngẫu nhiên của mỗi chủng tuyến trùng. 2.4.4. Phương pháp định danh vi khuẩn phân lập 2.4.4.1. Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết Tiến hành cấy ria các chủng vi khuẩn trong ống thạch nghiêng vừa phân lập đƣợc trên môi trƣờng NBTA, MacConkey. Quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm gram, soi khuẩn lạc lạc dƣới kính hiển vi ở vật kính 4X. Quan sát màu sắc khuẩn 49
Đồ án tốt nghiệp lạc, hình dạng, bề mặt, hình dạng tế bào, loại Gram. Khuẩn lạc có màu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trƣng giống nhƣ kết quả ban đầu, không có các màu sắc và sắc tố lạ thì đƣợc coi là tinh khiết. 2.4.4.2. Phương pháp quan sát hình thái, sinh lý Gồm phƣơng pháp soi khuẩn lạc, nhuộm gram xem chi tiết tại phụ lục 1. 2.4.4.3. Thử nghiệm sinh hoá Gồm các thử nghiệm TSI, khả năng lên men lactose, khả năng lên men arabinose, catalase, oxidase, khả năng lên men - oxi hóa, khả năng sinh indole, khả năng khử nitrate, khả năng sử dụng Citrate, khả năng di động xem chi tiết tại phụ lục 1. 2.4.4.4. Phương pháp định danh bằng APIKIT 20E Sau khi kiểm tra độ thuần khiết và một số phản ứng sinh hóa đặc trƣng, tiến hành định danh chủng vi khuẩn bằng kit sinh hóa APIKIT 20E theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Biomerieux (xem phụ lục 1). Sau khi đọc kết quả test API, dò các hệ số bằng bằng phần mềm ứng dụng sẽ kết luận đƣợc các chủng vi khủng thuộc loài vi sinh vật nào. 2.4.4.5. Giải trình tự 16S rRNA Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gene rRNA 16S. RNA đƣợc trích ly từ vi khuẩn phân lập thuần khiết và gene mã hóa rRNA 16S đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp PCR sử dụng mồi phổ biến (universal primer) BAC-F-(5'-AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG-3') BAC-R (5'AAG GAG GTG (AT)TC CA(AG) CC-3'), sau đó đƣợc giải mã trình tự (do công ty NamKhoa Biotek tiến hành). Trình tự sau đó đƣợc so sánh với các chủng của GENBANK. 2.4.5. Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 2.4.5.1. Phương pháp định tính enzyme Thử nghiệm hoạt tính lipase Pha môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50 oC đổ ra các đĩa petri. Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối của hai chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm 50
Đồ án tốt nghiệp hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đo đƣờng kính vòng tủa trên bề mặt môi trƣờng. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thử nghiệm hoạt tính protease Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trong tối bằng môi trƣờng NB. Pha môi trƣờng geltatine agar và môi trƣờng casein agar, hấp 121 oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50 oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Cho 20 μl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào hai giếng thạch, giếng còn lại cho 20 μl môi trƣờng nutrient broth để làm đối chứng. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt phòng, 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm), với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thử nghiệm hoạt tính chitinase Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trong tối bằng môi trƣờng NB. Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50 oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Cho 20 μl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào hai giếng thạch, giếng còn lại cho 20 μl môi trƣờng NB để làm đối chứng. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt phòng, 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng thuốc thử lugol. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm), với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. 2.4.5.2. Phương pháp khảo sát khả năng kháng kháng sinh Sử dụng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (do công ty Nam Khoa Biotek tiến hành) theo tiêu chuẩn kháng sinh dành cho vi khuẩn đƣờng ruột. Chi tiết xem phụ lục 1. 2.4.5.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn- phương pháp cấy chéo Chuẩn bị môi trƣờng NA đƣợc vô trùng tại 1210C, 1 atm, trong 15 phút. 51
Đồ án tốt nghiệp Các chủng vi khuẩn thử nghiệm sẽ đƣợc thực hiện cấy ria từ ống nghiệm giữ giống lên đĩa petri chứa môi trƣờng NA để tạo khuẩn lạc thuần riêng rẽ. Ủ các đĩa qua đêm ở nhiệt độ phòng. Chủng vi khuẩn chỉ thị sẽ đƣợc thực hiện cấy ria từ ống nghiệm giữ giống lên đĩa petri chứa môi trƣờng nutrient agar để tạo khuẩn lạc thuần riêng rẽ. Ủ các đĩa qua đêm ở 37oC. Tiến hành đối kháng: Đối kháng không tiếp xúc: Từ đĩa petri của vi khuẩn thử nghiệm, chọn một khuẩn lạc thuần riêng rẽ rồi thực hiện cấy một đƣờng thẳng dọc xuống, ủ 24 giờ. Sau đó, từ đĩa petri của vi khuẩn chỉ thị, cũng chọn một khuẩn lạc thuần riêng rẽ rồi thực hiện cấy một đƣờng thẳng từ mép ngoài vào sát với vạch cấy vi khuẩn thử nghiệm nhƣng không đƣợc chạm nhau. Thực hiện lần lƣợt với hai chủng vi khuẩn thử nghiệm và ba chủng vi khuẩn chỉ thị, mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Sau đó, đem tất cả các đĩa petri đi ủ 24 giờ, ở nhiệt độ phòng và 37oC trong bóng tối. Đối kháng tiếp xúc: Từ đĩa petri của vi khuẩn thử nghiệm, chọn một khuẩn lạc thuần riêng rẽ rồi thực hiện cấy một đƣờng thẳng dọc xuống, sau đó, từ đĩa petri của vi khuẩn chỉ thị, cũng chọn một khuẩn lạc thuần riêng rẽ rồi thực hiện cấy một đƣờng thẳng ngang qua, sao cho hai đƣờng giao nhau tại trung tâm của đĩa petri. Thực hiện lần lƣợt với hai chủng vi khuẩn thử nghiệm và ba chủng vi khuẩn chỉ thị, mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Sau đó, đem tất cả các đĩa petri đi ủ 24 giờ, ở nhiệt độ phòng và 37oC trong bóng tối. - Đọc kết quả: Đối kháng không tiếp xúc: Dùng thƣớc hoặc compa đo khoảng cách giữa mép của vạch xạ khuẩn với vạch của vi khuẩn thử nghiệm. Khoảng cách càng lớn chứng tỏ khả năng đối kháng của vi khuẩn thử nghiệm càng mạnh. Đối kháng tiếp xúc: Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng khuẩn thì ở điểm giao nhau của hai đƣờng cấy, vi khuẩn chỉ thị không phát triển đƣợc. Nếu không có hiện tƣợng kháng khuẩn thì ở điểm giao nhau của hai đƣờng cấy, vi khuẩn chỉ thị vẫn phát triển bình thƣờng. 52
Đồ án tốt nghiệp 2.4.5.4. Khảo sát hoạt tính kháng nấm Chuẩn bị môi trƣờng NA, PDA đƣợc vô trùng tại 121oC, 1 atm, trong 15 phút. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm sẽ đƣợc thực hiện cấy ria từ ống nghiệm giữ giống lên đĩa petri chứa môi trƣờng NA để tạo khuẩn lạc thuần riêng rẽ. Ủ các đĩa qua đêm ở nhiệt độ phòng. Các chủng nấm từ ống nghiệm giữ giống sẽ đƣợc hoạt hóa bằng cách dùng dây cấy vô trùng cấy điểm sang đĩa petri chứa môi trƣờng potato dextro agar có bổ sung kháng sinh chloramphenicol 0,02% để ức chế sự phát triển của các vi khuẩn. Ủ trong 3 ngày. Tiến hành đối kháng: Trên đĩa thạch môi trƣờng PDA (giảm ½ đƣờng, thêm 1% peptone), tiến hành cấy khoanh thạch của nấm chỉ thị (đƣờng kính 5mm) từ đĩa PDA đặt ngay tâm đĩa petri, Ủ 48 giờ. Sau đó, dùng que cấy vòng cấy vạch các chủng vi khuẩn thử nghiệm cách mép ngoài đĩa 1,5 cm (2 vạch chủng vi kuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đƣờng kính). Ủ các đĩa ở 72 giờ hoặc hơn tuỳ vào khả năng tăng trƣởng của nấm, nhiệt độ phòng. Đọc kết quả: đo chiều rộng của vòng ức chế, dựa vào kích thƣớc của vòng ức chế để đánh giá hiệu lực đối kháng. 2.4.5.5. Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp tiêm - Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ: Pha môi trƣờng Peptone Glyxerol và dung dịch tiêm, dụng cụ để pha loãng; đem hấp vô trùng ở 121oC, 1 atm, trong 15 phút. Chuẩn bị lá thầu dầu để nuôi sâu, kiêm tiêm vô trùng (30G) - Chuẩn bị vi khuẩn: Mật độ tế bào vi khuẩn tƣơng ứng với từng độ pha loãng tại mỗi nghiệm thức đƣợc xác định bằng phƣơng pháp trải đĩa và đếm khuẩn lạc. Pha loãng vi khuẩn thử nghiệm: từ canh trƣờng tăng sinh của hai chủng vi khuẩn Serratia marcescens SB và Serratia marcescens HB, tiến hành pha loãng -1 nồng độ 10 bằng cách hút 1ml canh trƣờng cho vào 9 ml dung dịch pha loãng, thực -6 -7 -8 -9 -10 hiện tƣơng tự cho các nồng độ pha loãng 10 , 10 , 10 , 10 và10 . 53
Đồ án tốt nghiệp Tăng sinh vi khuẩn chỉ thị E.coli, pha loãng đến các nồng độ sao cho đạt 5 x 104, 5 x 103, 5 x 102 cfu/5μl. - Chuẩn bị sâu: Trứng SXDL da láng Spodoptera exigua đƣợc ấp nở và nuôi lớn bằng lá thầu dầu cho đến đầu tuổi 4. - Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị hộp đựng sâu thí nghiệm: các hộp nhựa thí nghiệm đƣợc rửa sạch, khử trùng bằng dung dịch clorine 5% và rửa lại bằng nƣớc sôi, sau đó để khô tự nhiên. Tiếp theo, cắt lá thầu dầu thành từng mảnh nhỏvới kích thƣớc khoảng 3 m × 3 cm, rồi cho lần lƣợt 5 mảnh vào một hộp nhựa. Mỗi hộp đối chứng âm chứa 10 SXDL và mỗi SXDL đƣợc tiêm 5μl dung dịch pha loãng. Mỗi hộp thí nghiệm chứa 10 SXDL và mỗi SXDL đƣợc tiêm 5μl dung -6 -7 -8 -9 dịch vi khuẩn ở nồng độ 10 . Thực hiện lần lƣợt cho các nồng độ 10 , 10 , 10 và 10-10. Tiến hành tƣơng tự với đối chứng E. coli tại các nồng độ đã bố trí. Tiến hành rút và ria giọt huyết tƣơng từ sâu chết trên môi trƣờng NBTA, xác nhận tác nhân gây chết sâu. - Đọc kết quả: Theo dõi số lƣợng sâu tử vong lần lƣợt sau 6 giờ để đánh giá hiệu quả diệt sâu của hai chủng vi khuẩn SB, HB và đối chứng E. coli, so sánh và mô tả hình thái sâu tử vong ở từng nghiệm thức so với đối chứng dƣơng, đồng thời tính toán LD50 và LD90 của hai chủng này. 2.4.5.6. Khảo sát sự tính tương tác tổ hợp vi khuẩn và tuyến trùng EPN Chuẩn bị môi trƣờng Lipid Agar, pipetman hấp tiệt trùng ở 121oC, 1 atm, trong 15 phút. Chủng vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trong tối bằng môi trƣờng NB. Tuyến trùng dự trữ đƣợc đƣa về nhiệt độ phòng, pha loãng đạt 5 IJ/μl. 54
Đồ án tốt nghiệp Tiến hành thí nghiệm: Dùng pipetman chuyển 800 μl canh trƣờng vi khuẩn lên bề mặt Lipid agar, xoay nhẹ đĩa để canh trƣờng trải đều. Sau đó, tiếp tục chuyển 20 μl dung dịch tuyến trùng đã pha loãng. Ủ ở nhiệt độ phòng 12 - 14 ngày. Đối chứng là các đĩa Lipid Agar chứa 20 μl dung dịch tuyến trùng đã pha loãng và 800 μl nƣớc cất. Đọc kết quả: sau mỗi 3 ngày, chuyển một lƣợng nƣớc vừa phải lên bề mặt đĩa để tráng và thu hỗn hợp tuyến trùng. Tiến hành đếm số lƣợng tuyến trùng hoạt động dƣới kính hiển vi vật kính 4X. Đọc kết quả lần cuối vào ngày thứ 12. Tính tỉ lệ chết (%) ở mỗi đĩa sau thời gian 3, 6, 9, 12 ngày. Vẽ đồ thị xử lý thống kê so sánh tỉ lệ chết giữa đối chứng và thí nghiệm. 55
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá LD50 của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 SXDL (Spodoptera exigua) là loài sâu đa thực gây hại chủ yếu trên hành và nhiều loại cây trồng khác thuộc họ thập tự, bầu bí, họ cà, nho, Tuy nhiên, từ trƣớc đến nay, vẫn chƣa có bất kì kết quả đánh giá về hiệu lực của 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên SXDL đƣợc công bố. Vì vậy, việc thí nghiệm xác định LD50 của 2 chủng tuyến trùng trên SXDL góp phần xác định thêm phổ kí chủ cho 2 chủng tuyến trùng này. Dấu hiệu nhận biết đối tƣợng kí chủ chết do tuyến trùng ký sinh Nhận biết dấu hiệu sâu chết do tác nhân tuyến trùng cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình ghi nhận và xử lý số liệu khi tiến hành thí nghiệm. Kết quả theo dõi hình thái sâu sau khi chết, kết hợp với theo dõi sự phát tán của IJ cho thấy, dấu hiệu sâu chết bởi tuyến trùng ký sinh sẽ không có mùi hôi, không nhiễm các vi sinh khác nhƣ nấm và có màu sắc, biểu hiện đặc trƣng (hình 3.1). Sâu chết do bị nhiễm tuyến trùng S – XT: màu sắc cơ thể chuyển từ hồng nhạt sang hồng đậm đến nâu đỏ phần bụng căng tròn, cứng, không mềm nhũn. Sâu chết do bị nhiễm tuyến trùng H – CP16: cơ thể ửng màu đỏ sậm, phần bụng căng tròn, cứng hơn so với sâu chết bởi tuyến trùng S – XT. A B C Hình 3.1. Dấu hiệu SXDL chết bởi tuyến trùng A. SXDL trƣớc khi nhiễm; B. SXDL chết bởi tuyến trùng S – XT; C. SXDL chết bởi tuyến trùng H – CP16 56
Đồ án tốt nghiệp 3.1.1. Chủng S – XT Thí nghiệm trên SXDL tuổi 4 đƣợc tiến hành với 10 công thức nồng độ gây nhiễm từ 5-50 IJ/sâu và 1 công thức đối chứng không gây nhiễm IJ, ở mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với tổng số là 220 sâu. Kết quả đƣợc t nh bày trong bảng sau: Bảng 3.1. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng S – XT Tỷ lệ sâu chết (%) Số lƣợng IJ/sâu Số lƣợng thí nghiệm Số sâu chết Sau 2 ngày phơi nhiễm 0 (đối chứng) 20 0 0 5 20 12 60 10 20 13 65 15 20 15 75 20 20 17 85 25 20 18 90 30 20 19 95 35 20 19 95 40 20 20 100 45 20 20 100 50 20 20 100 LD50= 4,84 ± 0.01IJ Theo dõi tỉ lệ sâu chết sau 2 ngày phơi nhiễm cho thấy: SXDL tuổi 4 có độ mẫn cảm cao với chủng S – XT. Từ những nồng độ phơi nhiễm rất nhỏ 5 IJ/sâu, tỉ lệ chết đã đạt 60%. Tỉ lệ chết tăng dần từ 65 – 75% ở các nồng độ phơi nhiễm từ 10 – 15 IJ/sâu. Ở các nghiệm thức có nồng độ phơi nhiễm từ 20 – 35 IJ/sâu thì tỉ lệ chết lên đến 85 – 95%. Với nồng độ phơi nhiễm 40 – 50 IJ/sâu thì tỉ lệ chết đạt cực đại 100%. 57
Đồ án tốt nghiệp Giá trị LD50 đối với SXDL tuổi 4 tƣơng ứng là 7,4 cho thấy chủng S – XT có độc tính rất mạnh, mặc dù SXDL cũng là đối tƣợng kháng mạnh với nhiều thuốc hóa học. 100 90 80 70 60 50 y = -0.025x2 + 2.3023x + 47.25 40 R² = 0.9886 30 Tỷ lệ lệ Tỷ(%) chết 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Nồng độ gây nhiễm (IJ/sâu) Hình 3.2. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng S – XT trên SXDL tuổi 4 Giá trị tƣơng quan R2= 0,9886 thể hiện sự tƣơng quan chặt chẽ giữa nồng độ gây nhiễm IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng S – XT trên SXDL tuổi 4. Kết quả phân tích thống kê hàm bậc 2 dựa trên số liệu thực nghiệm cho thấy với đồ thị y = -0,025x2 + 2,3023x + 47,25, tỉ lệ chết có quan hệ tuyến tính với nồng độ gây nhiễm IJ/sâu, giá trị cực trị 46 IJ/sâu ứng với tỉ lệ chết 100%. Vì đồ thị là một hàm parabol lồi nên các nồng độ gây nhiễm khác nằm ngoài đoạn [43;49] khác với giá trị cƣc đại thì ứng với tỉ lệ chết thấp hơn. Hơn thế nữa, nếu nồng độ gây nhiễm càng vƣợt trên khỏi giá trị cực trị 46 IJ/sâu thì càng không còn mối quan hệ tuyến tính giữa tỉ lệ chết và nồng độ gây nhiễm IJ/sâu. 3.1.2. Chủng H – CP16 Thí nghiệm trên SXDL tuổi 4 đƣợc tiến hành với 10 công thức nồng độ gây nhiễm từ 5 – 50 IJ/sâu và 1 công thức đối chứng không gây nhiễm IJ, ở mỗi 58
Đồ án tốt nghiệp nghiệm thức lặp lại 3 lần với tổng số là 220 sâu. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng sau: Bảng 3.2. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng H – CP16 Tỷ lệ sâu chết (%) Số lƣợng IJ/sâu Số lƣợng thí nghiệm Số sâu chết Sau 2 ngày phơi nhiễm 0 (đối chứng) 20 0 0 5 20 11 55 10 20 14 70 15 20 15 75 20 20 17 85 25 20 18 90 30 20 18 90 35 20 19 95 40 20 20 100 45 20 20 100 50 20 20 100 LD50= 4,81 ± 0,01 IJ Theo dõi tỉ lệ sâu chết sau 2 ngày phơi nhiễm cho thấy: SXDL tuổi 4 có độ mẫn cảm cao với chủng H – CP16. Từ những nồng độ phơi nhiễm rất nhỏ 5 IJ/sâu, tỉ lệ chết đã đạt 55%. Tỉ lệ chết tăng dần từ 70 – 75% ở các nồng độ phơi nhiễm từ 10 – 15 IJ/sâu. Ở các nghiệm thức có nồng độ phơi nhiễm từ 20 – 35 IJ/sâu thì tỉ lệ chết lên đến 85 – 95%. Với nồng độ phơi nhiễm 40 – 50 IJ/sâu thì tỉ lệ chết đạt cực đại 100%. Giá trị LD50 đối với SXDL tuổi 4 tƣơng ứng là 7,5 cho thấy chủng H – CP16 có độc tính rất mạnh. Kết quả này cũng phù hợp với một số công bố trƣớc đây trong việc đánh giá hiệu lực đƣơc xem là có tiềm năng của hai chủng tuyến trùng H – MP11 và H – NT3 trên SXDL tƣơng ứng lần lƣợt với LD50 = 12 và LD50 = 14 59
Đồ án tốt nghiệp (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). Điều này cho thấy hiệu quả trong việc sử dụng chủng H – CP16 trong phòng trừ SXDL là rất khả thi. 100 90 80 70 60 y = -0.025x2 + 2.3083x + 46.583 50 R² = 0.9818 40 30 Tỷ lệ lệ Tỷ(%) chết 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Nồng độ gây nhiễm (IJ/sâu) Hình 3.3. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng H – CP16 trên SXDL tuổi 4 Giá trị tƣơng quan R2= 0,9818 thể hiện sự tƣơng quan chặt chẽ giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng H – CP16 trên SXDL tuổi 4. Tƣơng tự nhƣ chủng S – XT, kết quả phân tích thống kê hàm bậc 2 dựa trên số liệu thực nghiệm của củng H – CP16 cho thấy với đồ thị y = -0,025x2 + 2,3083x + 46,583, tỉ lệ chết có quan hệ tuyến tính với nồng độ gây nhiễm IJ/sâu, giá trị cực trị 46 IJ/sâu ứng với tỉ lệ chết ≈ 100%. Vì đồ thị là một hàm parabol lồi nên các nồng độ gây nhiễm khác nằm ngoài đoạn [45;47] khác với giá trị cực đại thì ứng với tỉ lệ chết thấp hơn. Hơn thế nữa, nếu nồng độ gây nhiễm càng vƣợt trên khỏi giá trị cực trị 46 IJ/sâu thì càng không còn mối quan hệ tuyến tính giữa tỉ lệ chết và nồng độ gây nhiễm IJ/sâu. 3.2. Khả năng sinh sản của tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên SXDL Bƣớm sáp lớn (BSL) đƣợc xem là côn trùng lý tƣởng cho việc nhân sinh khối đối với hầu hết các chủng tuyến trùng EPN do BSL rất nhạy cảm với tuyến trùng và cho hệ số nhân rất lớn. Tuy nhiên việc nhân nuôi BSL gặp nhiều khó khăn trong điều 60
Đồ án tốt nghiệp kiện phòng thí nghiệm. Do vậy việc tìm ra những loài côn trùng khác nhạy cảm và có hệ số nhân cao đáp ứng cho nhân nuôi in vivo tuyến trùng EPN là điều cần thiết. SXDL (Spodoptera exigua) là đối tƣợng sâu hại phổ biến và nhân nuôi đơn giản. Thông qua thí nghiệm đánh giá hiệu lực LD50 cũng cho thấy đây là loài sâu khá mẫn cảm với 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 nên thí nghiệm nghiên cứu đánh giá tỉ lệ nhân của 2 chủng tuyến trùng trên đối tƣợng này là điều kiện cần để kết luận khả năng nhân nuôi in vivo 2 chủng tuyến trùng trên SXDL. Bảng 3.3. Khả năng sinh sản của chủng S – XT trên SXDL Nồng độ gây Chủng S - XT, Sản lƣợng IJ/sâu nhiễm (IJ/sâu) Tỷ lệ nhân Thấp nhất Cao nhất Trung bình (lần) 5 12009 12130 12053 ± 51 a 2411 10 30030 30700 30420 ± 260 b 3042 15 45907 46101 45994 ± 72 c 3066 20 45307 45973 45594 ± 253 c 2280 25 44320 44930 44645 ± 218 c 1786 30 35030 39980 38300 ± 2180 d 1277 35 25039 25482 25277 ± 1589 e 722 40 9549 9810 9658 ± 101 f 241 P - Value = 0 Bảng 3.4. Khả năng sinh sản của chủng H – CP16 trên SXDL Chủng H - CP16, Sản lƣợng IJ/sâu Nồng độ gây Tỷ lệ nhân nhiễm (IJ/sâu) Thấp nhất Cao nhất Trung bình (lần) 5 22109 22130 22120 ± 7 a 4424 10 56231 56723 56498 ± 178 b 5650 15 85937 86121 86007 ± 76 c 5734 61
Đồ án tốt nghiệp 20 85327 85983 85614 ± 246 c 4281 25 84324 86693 85651 ± 884 d 3426 30 71029 73861 72624 ± 1063 e 2421 35 50100 50488 50301 ± 134 e 1437 40 18550 18812 18662 ± 100 f 467 P - Value = 0 3.2.1. Khả năng nhân của 2 chủng tuyến trùng trên SXDL tuổi 4 3.2.1.1. Chủng S – XT Kết quả thí nghiệm tỉ lệ nhân của chủng S – XT đƣợc trình bày trong bảng 3.3 Ở những nồng độ gây nhiễm khác nhau thì tỉ lệ nhân của chủng S – XT trên SXDL cũng có sự sai khác. Tuy nhiên có thể thấy ở một vài nồng độ gây nhiễm ban đầu chủng S – XT có tỉ lệ nhân cao nhƣ ở nồng độ 10 IJ/sâu và 15 IJ/sâu có tỉ lệ nhân tƣơng ứng lên tới 3042 và 3066 lần/SXDL. Nghiên cứu tƣơng tự của Nguyễn Ngọc Phong (2013) đối với chủng S – XT trên sâu khoang cho thấy tỉ lệ nhân dao động từ 590 – 3580 lần/sâu. Nhƣng do sâu khoang là đối tƣợng lớn hơn 8 – 9 lần so với SXDL nên sự chênh lệch về tỉ lệ nhân là điều có thể xảy ra. Ngoài ra, một số nghiên cứu trên đối tƣợng có sinh khối lớn hơn là ấu trùng bƣớm sáp lớn của Nguyễn Ngọc Châu (2008) cho thấy tỉ lệ nhân của chủng S – TK10 trên BSL chỉ dao động trong khoảng 500 đến 1200 lần, trên chủng S – TX1 là 500 – 3570 lần. Nhƣ vậy, có thể thấy hệ số nhân của chủng S – XT trên SXDL là không hề thua kém so với các chủng khác thuộc giống Steinernema nhân nhiễm trên các đối tƣợng sinh khối lớn hơn. Điều này mở ra một triển vọng có thể sử dụng SXDL cho việc nhân sinh khối tuyến trùng chủng S – XT bởi đây cũng là một đối dễ nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng thức ăn nhân tạo hoặc tự nhiên nhƣ thầu dầu (M Senthamizhsel Van, 1988). Tuy nhiên để sản xuất in vivo thì cần xem xét thêm một 62
Đồ án tốt nghiệp số điều kiện nhƣ quá trình phát tán IJ, và quan trọng hơn nữa là tƣơng quan nồng độ gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra. 3.2.1.2. Chủng H – CP16 Kết quả thí nghiệm tỉ lệ nhân của chủng H – CP16 đƣợc trình bày trong bảng 3.4 Thống kê kết quả của chủng H – CP16 trên SXDL cho thấy tỉ lệ nhân có sự sai khác giữa các nghiệm thức và dao động trong khoảng 467 – 5734 lần/sâu. Số liệu tỉ lệ nhân ở những nồng độ ban đầu đạt giá trị khá cao, cao nhất đạt 5734 lần/sâu ứng với nồng độ gây nhiễm ban đầu 15 IJ/sâu. Sự dao động này phụ thuộc vào tổ hợp nhiều yếu tố nhƣ số lƣợng IJ ban đầu gây nhiễm, mỗi loại sâu và mỗi chủng tuyến trùng. Do vậy, cùng một chủng tuyến trùng H – CP16 gây nhiễm trên sâu khoang (đối tƣợng sinh khối khá lớn), tỉ lệ nhân trong nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Phong (2013) dao động từ 817 – 4413 lần/sâu khoang. Mặc dù có thể thấy đƣợc tỉ lệ nhân này là tốt hơn so với chủng S – XT và H – CP16 gây nhiễm trên sâu khoang nhƣng so với các chủng khác thuộc giống Hetrohabditis thì tƣơng đối thấp hơn. Kết quả khảo nghiệm trên 2 chủng H – MP11 và H – NT3 trên BSL có tỉ lệ nhân khá cao, cao nhất lên đến 13700 và 14000 lần/BSL ứng với H –NT3 và H – MP11 (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). Tuy nhiên để kết luận khả năng sinh sản của chủng H – CP16 trên SXDL thấp hơn so với các chủng khác thuộc giống Heterohabditis thì cần xem xét thêm nhiều yếu tố khác. 3.2.2. Mối tương quan giữa số lượng IJ gây nhiễm và sản lượng IJ sinh ra Bên cạnh yếu tố di truyền thì nồng độ IJ đối với côn trùng vật chủ cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sản lƣợng IJ sinh ra, chúng có mối liên hệ là một hàm bậc hai, nghĩa là nồng độ gây nhiễm thích hợp nhất thì sản lƣợng IJ sinh ra sẽ là cao nhất (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). Từ thí nghiệm xác định hệ số nhân của hai chủng tuyến trùng trên SXDL là khá tốt và để đánh giá toàn diện hơn về khả năng nhân nhiễm sinh khối EPN trên SXDL 63
Đồ án tốt nghiệp với mục đích tìm ra nồng độ gây nhiễm thích hơp của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 sao cho cao nhất thì việc tiến hành thí nghiệm tìm mối tƣơng quan giữa nồng độ gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra cũng là một điều kiện cần thiết yếu để để kết luận khả năng nhân nuôi in vivo 2 chủng tuyến trùng trên SXDL. 3.2.2.1. Chủng S – XT Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh sản của chủng tuyến trùng S – XT trên SXDL cho thấy kết quả nhƣ sau: Với nồng độ gây nhiễm ban đầu là 5 IJ/sâu sản lƣợng IJ sinh ra cao nhất đạt 12130 IJ/sâu, trung bình là 12130 IJ/sâu. Sản lƣợng này tăng lên 30420 IJ/sâu khi tăng nồng độ gây nhiễm ban đầu lên 10 IJ/sâu. Khi đến nồng độ gây nhiễm ban đầu là 15 IJ/sâu thì sản lƣợng tăng cao đáng kể trung bình đạt 45994 IJ/sâu, cá biệt có giá trị cao nhất lên đến 46101 IJJs/sâu. Ở các nồng độ gây nhiễm tiếp theo không tăng nữa mà có xu hƣớng giảm theo qui luật khi số lƣợng IJ sinh đã đạt giá trị cực đại của hàm bậc 2, ở nồng độ gây nhiễm từ 20 đến 40 giá trị trung bình giảm dần và về mặt số liệu nhìn thấy thì sản lƣợng thấp hơn nhiều so với sản lƣợng cao nhất đạt ở nồng độ gây nhiễm 15 IJ/sâu, thấp nhất ở nồng độ gây nhiễm cuối cùng 40IJ/sâu với sản lƣợng trung bình là 9658 IJ/sâu. Các kết quả thu đƣợc từ các nghiệm thức cũng cho thấy sự chênh lệch về số lƣợng IJ giữa những lần thấp nhất và cao nhất là khá nhỏ, thấp nhất ở nồng độ nhiễm 5 IJ/sâu với sự chênh lệch là 121 IJ và cao nhất tại nồng độ 30 IJ/sâu với sự chênh lệch 4950 IJ. Nhƣ vậy có thể nói, sản lƣơng của chủng S – XT trên kí chủ SXDL là khá ổn định và là một trong nhƣng yếu tố lí tƣởng cho việc nhân nuôi in vivo tuyến trùng. Về mặt thống kê thì P – Value = 0 < 0,05, nghĩa là có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sản lƣợng IJ sinh ra giữa các nồng độ gây nhiễm khác nhau ở mức ý nghĩa 0,05. Và từ bảng phân tích số liệu, cũng dễ dàng nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa sản lƣơng sinh ra ở nồng độ nhiễm ban đầu 15, 20, 25 IJ/sâu với các sản lƣợng IJ sinh ra ở các nồng độ khác nhau với độ tin cậy 95%. Tuy không có sự khác 64
Đồ án tốt nghiệp biệt về mặt thống kê giữa 3 nồng độ cho sản lƣợng IJ cao nhất là 15, 20, 25 IJ/sâu, nhƣng khi xét về mặt kinh tế thì có lẽ nồng độ 15 IJ/sâu là tối ƣu nhất trong các nghiệm thức với sản lƣợng IJ cao nhất cũng nhƣ cho tỉ lệ nhân cao nhất. 50000 y = -118.19x2 + 5160.3x - 9266.5 45000 R² = 0.9804 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 Sản Sản lƣợngtuyến trùng (IJ) 5000 0 0 10 20 30 40 50 Nồng độ gây nhiễm (IJ/sâu) Hình 3.4. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của chủng S – XT Kết quả phân tích thống kê hàm bậc 2 dựa trên số liệu thực nghiệm cho thấy với đồ thị y = -118,19x2 + 5160,3x – 9266,5 số lƣợng IJ thu đƣợc đạt cực đại ứng với giá trị cực trị của hàm số là 22 IJ/sâu.Vì đồ thị là một hàm parabol lồi nên các giá trị gây nhiễm khác càng ít hơn hoặc càng cao hơn so với giá trị cực trị thì tất nhiên sẽ cho sản lƣơng IJ thấp hơn. Giá trị tƣơng quan R2= 0,9804 thể hiện sự tƣơng quan chặt chẽ giữa nồng độ gây nhiễm IJ/sâu với sản lƣợng IJ sinh ra của chủng S – XT trên SXDL. So sánh với một số thí nghiệm tƣơng tự nhƣ các chủng S – TX1, S – TK10 đƣợc gây nhiễm trên BSL và H – CP16 trên sâu khoang tuổi 5 với sản lƣợng trung bình cao nhất đạt đƣợc là 55800 IJ/BSL, 34400 IJ/BSL và 143330 IJ/ sâu khoang (Nguyễn Ngọc Phong, 2013) thì sản lƣợng IJ sinh ra khi nhiễm S – XT trên SXDL ít hơn hẳn. Điều này có thể là do sinh khối của SXDL bé hơn nhiều so với sâu khoang tuổi 5 và BSL, khối lƣợng trung bình của một sâu khoang tuổi 5 có thể đạt 65