›

Đồ án Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzyme amylase

pdf 56 trang thiennha21 12/04/2022 3980
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzyme amylase", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_ung_dung_nam_moc_tu_banh_men_de_thu_nhan_en.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzyme amylase

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NẤM MỐC TỪ BÁNH MEN ĐỂ THU NHẬN ENZYME AMYLASE Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện: ĐỒNG THỊ MINH THANH Lớp: 11HSH02 MSSV: 1191111040 TP. Hồ Chí Minh, 2013
  2. Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase LỜI CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp “Nghiên cứu tìm hiểu về enzym amylase, amylase nấm mốc và vi khuẩn” là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thị Hoài Hương. Người thực hiện đề tài xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. TP.HCM, ngày tháng 9 năm 2013 Người thực hiện đề tài Đồng Thị Minh Thanh
  3. LỜI CẢM ƠN Để thực hiện đề tài này, người thực hiện đề tài xin dành lời cảm ơn chân thành nhất gởi đến TS. Nguyễn Thị Hoài Hương, đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Người thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa KhoaCông Nghệ Sinh Học – Môi Trường Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh cùng các quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy người thực hiện đề tài trong suốt khóa học. - Lãnh đạo Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư đã tạo điều kiện giúp đỡ người thực hiện đề tài hoàn thành tốt trong suốt chương trình học và quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Cuối cùng, người thực hiện đề tài xin cảm ơn đến gia đình, các anh chị em trong bộ phận xét nghiệm Trung tâm Khuyến Nông Khuyến Ngư đã động viên và giúp đỡ người thực hiện đề tài trong suốt quá trình học tập và làm đề tài tốt nghiệp. Người thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn Hội đồng chấm luận án đã phản biện, đánh giá, góp ý, giúp đỡ người thực hiện đề tài hoàn thiện luận văn tốt nghiệp này. Chân thành cảm ơn! ii
  4. Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH v PHẦN MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Giới thiệu về enzym amylase nấm mốc 4 1.1.1. Khái niệm về enzyme amylase 4 1.1.2. Phân loại 5 1.2. enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn 5 1.3. Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc: 9 1.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng 9 1.3.2. Độ ẩm 12 1.3.3. Nhiệt độ 12 1.3.4. pH 13 1.4. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase 13 1.4.1. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt 13 1.4.2. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp nuôi cấy chìm. 15 1.5. Ứng dụng của enzyme amylase 16 1.5.1. Amylase trong công nghiệp rượu – bia 16 1.5.2. Trong sản xuất bánh mì 17 1.5.3. Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco 17 1.5.4. Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác 18 1.5.5. Trong các ngành công nghiệp dệt, giấy 18 1.5.6. Trong chăn nuôi 19 1.5.7. Trong y học 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 i
  5. 2.1. Vật liệu 20 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2. Vật liệu và hóa chất 20 2.2. Phương pháp 22 2.2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 22 2.3. Qui trình lên men bề mặt tạo Enzym Amylase 28 2.3.1. Qui trình công nghệ lên men bề mặt 28 2.3.2. Xác định hoạt tính enzyme amylase theo Wohlgemuth 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 31 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có trong bánh men cơm rượu 31 3.2. Kết quả quan sát hình thái nấm mốc 32 3.3. Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc và chọn lọc chủng sản xuất enzyme amylase 34 3.4 Kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy chìm 36 3.4.1. Điều kiện nuôi cấy 36 3.4.2. Xác định hoạt tính của enzyme Amylase 37 3.4.3. Kết quả xác định hoạt tính của enzyme Amylase 37 3.5. Kết quả lên men bề mặt thu enzyme amylase 38 3.6. Kết quả xác định hoạt tính enzyme amylase sau kết tủa 42 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1. Kết luận 47 4.2. Kiến nghị 47 ii
  6. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên Ghi chú MT Môi trường PGA Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) CĐ Chợ Động – Phan Rang– Ninh Thuận Nơi lấy mẫu CL Chợ Lớn – Đường Thống Nhất – TP. Phan Rang Nơi lấy mẫu NS Chợ Ninh Sơn– Ninh Thuận Nơi lấy mẫu KB Chợ Kim Biên – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu LB Chợ Long Bình – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu NH Chợ Ninh Hải – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu TN Chợ Thuận Nam – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu NP Chợ Ninh Phước – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu M1 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Động M2 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Động M3 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Lớn M4 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Lớn M5 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Sơn M6 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Sơn M7 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Kim Biên M8 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Long Bình M9 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Hải M10 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Thuận Nam M11 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Phước Dd Dung dịch iii
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các mẫu bánh men cơm rượu 20 Bảng 2.2: Thuốc thử Lugolc 21 Bảng 2.3: Dung dịch đệm axetat pH 4,7 21 Bảng 2.4: Dung dịch tinh bột 1% 21 Bảng 2.5: Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) 21 Bảng 2.6: Môi trường thạch – tinh bột . 22 Bảng 3.1: Các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu 31 Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc đã phân lập từ bánh men cơm rượu .32 Bảng 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu 34 Bảng 3.4: Bảng kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme 38 Bảng 3.5: Xác định hoạt tính enzyme amylase thu được trong thời gian 2, 3, 4 ngày lên men thể rắn 43 Bảng 3.6: Thí nghiệm thủy phân tinh bột . 44 iv
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Môi trường PGA sau khi hấp 23 Hình 2.2: Đổ đĩa peptri .24 Hình 2.3: Môi trường nuôi cấy sau 48h 24 Hình 2.4:Môi trường sau làm thuần 24 Hinh 2.5. Cấy giữ giống 25 Hình 2.6: Quy trình thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc 27 Hình 2.7 : Quy trình công nghệ lên men bề mặt 28 Hình 3.1: Khuẩn lạc của các chủng nấm mốc M2, M4, M7, M10 32 Hình 3.2: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M3, M4, M9, M11 35 Hình 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M6, M7 36 Hình 3.4: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme .38 Hình 3.5: Môi trường nuôi cấy sau khi hấp 39 Hình 3.6: Cấy giống vào môi trường nuôi cấy 39 Hình 3.8: Thu dịch nuôi cấy .40 Hình 3.9: Lọc dịch chiết 41 Hình 3.10: Chế phẩm enzyme amylase được tủa bằng cồn 960 lạnh 41 Hình 3.11: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 2 ngày nuôi cấy 42 Hình 3.12: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 3 ngày nuôi cấy 42 Hình 3.13: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 4 ngày nuôi cấy 43 Hình 3.14: Kết thúc thủy phân tinh bột gạo hồ hóa .45 v
  9. PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết và lý do hình thành đề tài. Ngày nay, Amylase là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, đem lại những lợi ích kinh tế, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước ép trái cây, bánh kẹo, bánh mì Sản xuất enzyme Amylase từ bánh mem (cơm rượu) là một trong những đề tài mang tính cấp thiết, bởi vì bánh men có chứa rất nhiều chủng có khả năng tạo ra enzyme amylase như nấm men, nấm mốc đây là nguồn nguyên liệu dễ tìm và rẻ tiền, là nguyên liệu truyền thống sản xuất rượu trắng đảm bảo sự an toàn cho người tiêu dùng và enzyme amylase thu được từ nấm mốc có trong bánh men có những ưu điểm ưu việt, vì vậy trong nội dung đồ án tốt nghiệp người thực hiện đề tài đã chọn đề “Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase” 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau. Đặc điểm này có liên quan đến cơ thể đơn bào. Cơ thể đơn bào phải thực hiện tất cả chức năng của sự sống, do đó chúng phải tạo ra nhiều loại enzyme khác nhau để đảm bảo sự sống phát triển tốt. Nhiều vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme amylase như: nấm mốc, vi khuẩn, nấm men, xạ khuẩn Trong đó nấm mốc có khả năng tạo ra enzym amylase nhiều hơn cả. Nấm mốc còn được gọi là nấm sợi, tức là tất cả các mốc mọc trên thực phẩm, trên chiếu, trên quần áo, trên sách vở Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ẩm. Nấm mốc là vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp vì quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài, nguồn nguyên liệu làm môi trường nuôi cấy nấm mốc rẻ tiền và dễ kiếm, tốc độ sinh sản của nấm mốc phát triển vật rất nhanh, Enzyme thu nhận từ nấm mốc có hoạt tính rất cao, đồng thời trong một khoảng thời gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn về enzyme nội bào mà còn 1
  10. thu được một lượng đáng kể enzyme ngoại bào do nấm mốc tiết ra môi trường. Vì thế, giá thành sản phẩm sẽ giảm và có thể sản xuất ở mọi nơi trên thế giới, mang lại hiệu suất kinh tế cao. 3. Mục tiêu nghiên cứu, đối tượng: Phân lập vi nấm enzyme amylase từ bánh men rượu và thử nghiệm các quy trình lên men thu enzyme amylase, cụ thể: + Thu thập nguồn bánh men từ các vùng khác nhau, sau đó phân lập các chủng nấm mốc từ các mẫu bánh men cơm rượu, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột, lấy chủng đó lên men thu enzym bằng phương pháp lên men chìm, lên men bán rắn, lên men công nghiệp và ứng dụng chúng để thu nhận enzyme amylase. + Xác định hoạt tính của enzyme amylase thu được và thử nghiệm khả năng phân giải tinh bột của enzyme amylase nhằm góp phần tạo ra nguồn enzyme có giá trị từ vi sinh vật. + Phạm vi và giới hạn của đề tài Trong giới hạn của đề tài, người thực hiện đề tài chỉ tập chung tìm hiểu về nguồn nấm mốc có trong bánh men để thu nhận enzyme trong quy mô phòng thí nghiệm. Do trang thiết bị máy móc tại phòng thí nghiệm không đầy đủ, chưa hiện đại nên đồ án còn nhiều hạn chế, chỉ dừng lại ở bước thu sản phẩm bán tinh khiết. 4. Kết quả đạt được: Đã Phân lập được 11 chủng nấm mốc từ bánh men cơm rượu ở 8 địa điểm khác nhau, trong đó có 9 chủng nấm mốc đều có khả năng phân giải tinh bột bao gồm các chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 và 2 chủng không có khả năng phân giải tinh bột là chủng M2, M6. Như vậy, 9 chủng nấm mốc có khả năng tạo enzyme amylase, 2 chủng nấm mốc không có khả năng tạo enzyme amylase. - Đã tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán tinh khiết theo phương pháp nuôi cấy chìm. 2
  11. - Từ 1 lít môi trường nuôi chủng M4 thu được 1,23 g chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết. - Đã tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán tinh khiết theo phương pháp lên men công nghiệp. - Xác định enzym amylase có hoạt tính cao nhất thu được trong thời gian nuôi cấy ở 3 ngày. Xác định khả năng phân giải tinh bột gạo của enzyme amylase từ đó tính được nồng độ enzyme amylase cần để thủy phân hết 1g tinh bột gạo. 5. Cấu trúc đồ án: Đồ án gồm các chương sau đây: CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tìm hiểu về enzym amylase nấm mốc, enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn, các phương pháp thu nhận enzyme amylase và ứng dụng của enzyme amylase CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các vật dụng và hóa chất để tiến hành thí nghiệm. Xác định đối tượng nghiên cứu, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Mô tả phương pháp và qui trình lên men , xác định hoạt tính enzym amylase CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Các kết quả sau khi thực nghiệm như: kết quả quả phân lập các chủng nấm mốc có trong bánh men cơm rượu, kết quả quan sát hình thái nấm mốc, kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc và chọn lọc chủng sản xuất enzyme amylase, kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy chìm, kết quả lên men bề mặt thu enzyme amylase, kết quả xác định hoạt tính enzym amylase sau kết tủa CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Các kết luận và kiến nghị của đồ án. 3
  12. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về enzyme amylase nấm mốc 1.1.1. Khái niệm về enzyme amylase Enzyme amylase là một trong số các enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga,Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor đã tách được chất phân giải tinh bột đó là từ đại mạch nảy mầm. Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dung dịch chiết malt và thu được enzyme ở dạng bột, đồng thời đặc tên là diaslase. Sau này theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột gọi là amylase. Các enzyme amylase có trong nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn, nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm. Bây giờ, người ta thu chúng chủ yếu từ canh trường nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men. Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các Enzyme này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước. Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế. Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Đối với enzyme amylase có trong nấm mốc, khi nuôi nấm mốc tạo enzyme amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tạo ra enzyme amylase trong tế bào hay ngoài môi trường. Ở một số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase xảy ra song song với quá trình sinh trưởng, sự tạo ra enzyme amylase phụ thuộc 4
  13. tuyến tính vào sự tăng sinh khối. Sự tạo thành enzyme amylase cực đại xảy ra sau khi quần thể tế bào vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng. 1.1.2. Phân loại Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã hồ hóa. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase ra các loại sau: α-amylase, β-amylase, Glucoamylase Tốc độ phản ứng của Enzyme Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa của cơ chất. Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau. 1.2. Enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn Trong thiên nhiên, enzyme amylase có ở hầu hết mọi vi sinh vật, thực vật và động vật. Song chỉ có một số loài vi sinh vật và một số hạt thực vật mới là đối tượng dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase, do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định. Ngày nay do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo. Người ta đã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme amylase. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều enzyme amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên, bởi các loài khác nhau và các chủng vi sinh vật khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều enzyme khác nhau. Vi sinh vật tạo enzyme amylase được dùng nhiền hơn cả là nấm mốc, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. - Để thu enzyme amylase người ta thường dùng các giống nấm mốc Aspergillus, Rhizopus và một số loài của giống Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ α- amylase và glucoamylase. Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces, Endomycopis, Endomyces cũng tạo enzyme amylase. - Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn enzyme amylase như Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas saccharophila, Bacillus circulans 5
  14. - Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo enzyme amylase rất mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số tạo enzyme như xạ khuẩn ưa nhiệt. Các enzyme amylase có trong nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn, nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm. Bây giờ, người ta thu chúng chủ yếu từ canh trường nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men. Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã hồ hóa. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase ra các loại sau: α-amylase, β-amylase, glucoamylase Các enzyme amylase từ các nguồn khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân. α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4 glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất: tinh bột, glycogen và polyose đồng loại một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. Vì thế người ta gọi nó là enzyme amylase nội phân. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn. Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ 1 số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh sang giai đoạn thứ hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới di và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylase bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose. Sau đó các polyglucose này lại bị phân cách tiếp tục nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose, và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylase chứa 13% glucose và 87% maltose. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α- 6
  15. amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose. α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globulin. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2-5,7. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc Bacilus subtilis của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của enzyme. Canxi còn có tác dụng bảo đảm cho α-amylase có độ bền cực lớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein.α- amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. α-amylase bị kìm hãm bởi kim loại nặng. α-amylase của nấm mốc chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tích, còn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân hủy cả các hạt tinh bột nguyên vẹn lẫn hồ tinh bột. Ở giai đoạn thủy phân cuối, tác dụng của α-amylase từ nấm mốc khác tác dụng của α-amylase từ vi khuẩn. Dextrin do amylase vi khuẩn tạo ra có mạch dài hơn dextrin do α-amylase của malt và nấm mốc tạo ra một số lần. Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5-4,8, của đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5,3 và của vi khuẩn là 5,8-6,0. Độ bền đối với tác dụng của axit cũng khác nhau.α-amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae bền vững đối với axit tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bacilus subtilis. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúa tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm mốc rất nhạy đối với tác động của nhiệt.Nhiệt độ tối thích của nó là 500C.Amylase của thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58-600C. Amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn cả. Nhiệt độ tối thích của nó là 70-750C . Amylase của nấm mốc bị vô hoạt ở 700C, trong khi đó amylase vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 920C. Những khác biệt về nhiệt độ và pH tối thích, mức độ thủy phân và đặc tính thủy phân của α- amylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng to lớn trong việc ứng 7
  16. dụng chúng một cách thích hợp và đầy hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của quá trình sản xuất. β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch. Maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế amylase này được gọi là β-amylase. Theo đặc tính tác dụng lên tinh bột, β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột.β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58% amylopectin thành maltose. Quá trình thủy phân amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng. Khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì β-amylase ngừng tác dụng. Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α- 1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin, α-dextrin cho màu tím đỏ của iodine. Độ nhớt của dung dịch giảm chậm. Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong polysaccharide, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân đã liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan. Glucoamylase là enzym ngoại phân, nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose.Khi thủy phân tinh bột cùng với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside. Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose. Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “axit” . Thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5-5,5. So với α-amylase, glucoamylase bền đối với axit hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton không được bảo vệ bằng Ca2+. Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. Đa số các chế phẩm glucoamylase của nấm mốc, vi khuẩn, nấm men và của mô động vật đều có pH hoạt động tối thích ở vùng axit trừ glucoamylase của 8
  17. Saccharomyces italicus và một số mô động vật có pH hoạt động tối thích ở vùng trung tính. Glucoamylase axit có pH hoạt động tối thích là 4,0-5,0; glucoamylase trung tính pH tối thích là 6,0-7,5. Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đã đặt nền móng cho việc sản xuất các chế phẩm enzyme amylase để sử dụng trong sản xuất và đời sống. Những nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của enzyme amylase ngày càng được phát triển mạnh mẽ hơn và đang mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn hơn đối với việc ứng dụng enzyme amylase rộng rãi trong các ngành công nghiệp. 1.3. Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc: 1.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng Nấm mốc là sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ. Chúng chỉ có khả năng thu nhận năng lượng từ môi trường bên ngoài nhờ quá trình oxy hóa hiếu khí hoặc quá trình lên men kỵ khí các chất hữu cơ ngoại bào. Kiểu dinh dưỡng carbon hữu cơ này được gọi là kiểu dinh dưỡng carbon dị dưỡng. mốc là những loài nấm có kiểu carbon dị dưỡng thuộc loại hoại sinh, sử dụng các hợp chất hữu cơ để làm chất dinh dưỡng. a. Nguồn carbon: Nấm mốc có thể sử dụng nguồn carbon rất khác nhau. Các loại thức ăn carbon có thể dùng làm nguồn năng lượng và nguồn vật liệu xây dựng tế bào đối với nấm mốc có thể kể đến các loại hydradecarbon (monosaccharide, oligosaccharide, polysaccharide), các dẫn xuất của hydradecarbon, các loại rượu, các loại axit hữu cơ, các loại axit amin, protein, lipid Trong nhiều trường hợp nếu có mặt trong môi trường vài nguồn carbon khác nhau, nấm mốc sẽ phát triển mạnh mẽ hơn so với khi chỉ có riêng biệt từng loại một. Đối với các nguồn carbon phức tạp (tinh bột, cenlulose, ) trước hết nấm mốc phải sinh ra các enzyme để phân hủy các hợp chất này thành các hợp chất đơn phân tử sau đó mới đồng hóa được chúng. b. Nguồn Nitơ: Các loại nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với các nguồn nitơ.Nấm mốc thường có khả năng sử dụng cả các nguồn nitơ hữu cơ lẫn các nguồn 9
  18. nitơ vô cơ. Nhiều loại nấm mốc có khả năng đồng hóa cả muối amon lẫn nitrat. Đôi khi có những loại nấm mốc không phát triển được trên các môi trường chứa nguồn + nitơ là muối amon nhưng nguyên nhân không phải ở bản thân gốc NH4 mà ở độ + chua sinh lý do các muối amon tạo ra. Sau khi nấm mốc đồng hóa gốc NH4 trong 2- 2- - môi trường sẽ tích lũy các anion vô cơ ( SO4 , HPO4 , Cl ) và làm hạ độ pH của môi trường xuống. Ngược lại với các muối amon, nitrat là những muối có tính kiềm - sinh lý. Sau khi nấm đồng hóa gốc NO3 trong môi trường sẽ tích lũy lại các cation (Na+ , K+ ) và làm tăng rõ rệt độ pH của môi trường. Khả năng đồng hóa amon sunfat của nấm mốc sẽ tăng cường rõ rệt khi bổ sung vào môi trường một ít axit hữu cơ ( acid lactic, acid malic ). Ngoài các nguồn nitơ vô cơ, nhiều loài nấm mốc có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ (protein, peptid, acid amin, ). c. Các nguyên tố khoáng: Nấm mốc cần các nguyên tố đa lượng như: S, P, K, Ca, Mg và Fe. Các nguyên tố được nấm mốc đòi hỏi với những số lượng rất nhỏ được gọi là các nguyên tố vi lượng như: Mn, Zn, Cu, Co, Ni, Lượng chứa từng nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc không những thay đổi tùy thuộc vào từng loài nấm mốc mà còn phụ thuộc cả vào điều kiện nuôi cấy chúng. Sau đây là vai trò các chất khoáng trong tế bào nấm mốc: - Phospho: thường chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của nấm mốc. Phospho tham gia vào cấu tạo của nhiều chất hữu cơ rất quan trọng trong tế bào nấm mốc như: nucleoprotein, nucleotid, phosphoprotein, phosphatid ). - Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần của một số acid amin: cystin, cystein, metionin. Lưu huỳnh cũng có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như acid lipoic, biotin, coenzyme A - Kali: có lượng khá lớn trong các tế bào nấm mốc, chúng tham gia vào quá trình trao đổi glucid và có ảnh hưởng đến nhiều quá trình trao đổi chất khác của các tế bào này. 10
  19. - Magnesium: tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng 80 enzyme trong tế bào. Có nghiên cứu cho biết việc thiếu Mg2+ dẫn đến việc ức chế quá trình hình thành bào tử ở một số loài nấm mốc. - Canxi: không tham gia các thành phần các chất hữu cơ trong tế bào nhưng chúng rất cần thiết vì đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng trong tế bào (giữa các nucleotid, giữa protein và acid nucleic). Canxi còn có ảnh hưởng đến sự hình thành các cấu trúc không gian ổn định của ribosome, nhân - Sắt: tham gia vào kết cấu porphirin sắt của các hệ thống enzyme chuyển vận electron. Sắt còn tham gia vào cấu trúc của các enzyme catalase, peroxidase. d. Các chất sinh trưởng: Cũng giống như đối với các loại vi sinh vật khác, nấm mốc có những quan hệ rất khác nhau đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng khác. Việc một loài nấm mốc không đòi hỏi một loại chất sinh trưởng nào đấy có thể do hoặc là chúng tự tổng hợp ra được chất sinh trưởng này hoặc là trong quá trình trao đổi chất chúng không cần tới loại coenzyme có chứa chất sinh trường này. Người ta chia nấm mốc thành hai nhóm căn cứ vào mối quan hệ của chúng đối với các chất sinh trưởng : - Nhóm tự dưỡng chất sinh trưởng: có thể tự tổng hợp tất cả các chất sinh trưởng cần thiết đối với hoạt động sống của chúng. - Nhóm dị dưỡng chất sinh trưởng: cần phải được cung cấp một vài hoặc nhiều chất sinh trưởng ở dạng có sẵn Nhu cầu về chất sinh trưởng của một loài nấm mốc có thể thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy, tùy theo tuổi giống. Phần lớn các vitamin nhóm B được các loài nấm mốc sử dụng để tạo ra các enzyme cần thiết đối với hoạt động sống của chúng. Nhiều loại vitamin tan trong lipid (A, D, E, K) được tìm thấy trong các lớp màng sinh học, sự tồn tại và số lượng của các loại vitamin này trong môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đối với cấu trúc và đối với sự hoạt động của các lớp màng này. 11
  20. 1.3.2. Độ ẩm Ngoài các chất dinh dưỡng nấm mốc cũng như tất cả sinh vật khác còn có nhu cầu về nước cho các hoạt động sinh lý, sinh hóa của tế bào. Liên quan đến lượng nước này là độ ẩm, bao gồm : hàm lượng nước của sản phẩm, độ ẩm tương đối của không khí. Giữa hàm lượng nước của sản phẩm và độ ẩm của không khí ở môi trường ngoài có mối liên quan (trao đổi qua lại).Chính mối liên quan dinh dưỡng này không những ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm, mà còn ảnh hưởng đến khả năng sử dụng nước của tế bào nấm mốc cho các quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng. a. Hàm lượng nước của sản phẩm: Nước trong các sản phẩm như: lương thực, thực phẩm, thuốc men, dược liệu gồm phần nước liên kết và phần nước không liên kết. Nấm mốc cũng như các vi sinh vật khác chỉ sử dụng được phần nước tự do có trong sản phẩm, và cũng chỉ phần nước này thực hiện sự trao đổi qua lại với nước có trong không khí. b. Độ ẩm tương đối của không khí: Mỗi loại nấm mốc thích ứng với một khoảng giá trị độ ẩm tương đối.Việc giảm độ ẩm tương đối sẽ làm ngừng hoặc kéo dài thời gian nảy chồi của bào tử nấm mốc.Nấm mốc sống trong môi trường có độ ẩm tương đối thấp, chúng có khả năng thích nghi dần để có thể tiếp tục sinh trưởng, phát triển bình thường hoặc ở trạng thái sống nghỉ. Ở độ ẩm tương đối thấp cùng với hàm lượng nước thấp trong sản phẩm, tế bào nấm mốc đầu tiên mất nước tự do, sau mất nước liên kết. Tùy theo lượng nước mất đi, nấm mốc chuyển sang trạng thái sống nghỉ hoặc bị chết. Phần lớn nấm mốc không sinh trưởng, phát triển trong điều kiện độ ẩm tương đối của không khí môi trường dưới 60%. 1.3.3. Nhiệt độ Mỗi loài nấm mốc cũng có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển, sinh trưởng.Phần lớn nấm mốc sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ 15-300C và cũng thường có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu trong khoảng 20-250C tùy từng loài.Một số rất nhỏ các loài nấm mốc có thể tăng trưởng ở các kho lạnh ở nhiệt độ -60C, thậm 12
  21. chí ở -200C và một số ít loài khác có nhiệt độ tăng trưởng đến 500C. Căn cứ vào nhiệt độ tăng trưởng, các loài nấm mốc được chia thành 5 nhóm: nhóm ưa nóng, nhóm chịu nóng, nhóm ưa nhiệt trung bình, nhóm chịu lạnh, nhóm ưa lạnh. 1.3.4. pH Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm mốc đó là pH. Nấm mốc nảy mầm và sau đó tăng trưởng bình thường ở pH 7. Ở môi trường kiềm hoặc axít, nấm mốc không hoặc tăng trưởng rất yếu. 1.4. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase 1.4.1. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt Trong quá trình phát triển của vi sinh vật, enzyme luôn được tổng hợp để tham gia vào quá trình đồng hóa và quá trình dị hóa. Trong thí nghiệm này chủ yếu là thu nhận các chế phẩm enzyme thủy phân. Phần lớn các enzyme thủy phân là enzyme cảm ứng. Do hoạt tính enzyme không chỉ biểu hiện ở khả năng thủy phân của enzyme mà còn biểu hiện ở khả năng mà vi sinh vật tổng hợp ra nó trong những điều kiện nuôi cấy nhất định. Trong quá trình phát triển, vi sinh vật sẽ tạo ra nhiều loại enzyme khác nhau. Các enzyme được tạo ra trong tế bào vi sinh vật và thoát ra khỏi tế bào để thực hiện các phản ứng thủy phân ngoài tế bào được gọi là enzyme ngoại bào. Các enzyme được tổng hợp trong tế bào vi sinh vật và thực hiện các phản ứng trong tế bào được gọi là enzyme nội bào. Thành phần chính của môi trường vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt là cám mì, cám gạo. Đó là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là thành phần duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật mà không cần phải bổ sung thêm các chất khác nữa. Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của các enzyme amylase.Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%, nên dùng cám tốt, cám mới không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độ không quá 0,05% Thành phần bổ sung được đưa vào môi trường có thể là chất làm xốp môi trường hoặc làm giàu thêm chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng mà ở cám 13
  22. không có đủ. Thành phần này thường là mầm mạch, trấu, mùn cưa Cám và các chất phụ gia chứa nhiều vi sinh vật khác cần phải thanh trùng để đảm bảo môi trường không có vi sinh vật ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 – 1,5 atm trong vòng 4 - 6 giờ. Độ ẩm tối thích của môi trường: trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường đối với Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae là 58 – 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như tạo enzyme amylase. Chế độ thông khí có thể liên tục, gián đoạn tùy thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dãy khay. Ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4 – 5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong một giờ, ở giai đoạn thứ hai là 30 – 60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi trong 1 giờ, giai đoạn ba giảm đi chỉ còn 10 – 12 thể tích không khí. Nhiệt độ nuôi: Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám chia làm ba thời kỳ: - Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10 – 11 giờ đầu tiên, vi khuẩn 3 – 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23 – 300C đối với nấm mốc.Độ ẩm tương đối của không khí là 96 – 100%. - Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi kéo dài trong 4 – 18 giờ. Ở giai đoạn này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý lớn.Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ phòng nuôi khoảng 28 – 290C. - Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ kéo dài từ 10 – 20 giờ. Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh.Các enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3 – 40C so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28 – 300C. 14
  23. Thời gian nuôi để có lượng enzyme amylase cực lớn: Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme amylase mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực enzyme.Đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo enzym amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử. 1.4.2. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp nuôi cấy chìm. Phương pháp nuôi cấy chìm là phương pháp vi sinh vật phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong lòng môi trường. Môi trường dùng trong nuôi cấy chìm là môi trường lỏng. Trong quá trình phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong lòng môi trường lỏng, vi sinh vật sẽ tổng hợp ra các enzyme thủy phân. Các enzyme thủy phân là các enzyme hòa tan trong nước. Do đó việc thu nhận enzyme trong trường hợp này là thu nhận dịch nuôi cấy. ( sau khi đã tách sinh khối và những thành phần không hòa tan của môi trường). Chế phẩm enzyme thô trong nuôi cấy chìm ở đây bao gồm enzyme đã hòa tan trong nước, nước và các sản phẩm trao đổi chất hòa tan khác. Môi trường dinh dưỡng: môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase là có chất cảm ứng là tinh bột, dextrin hay maltose. Để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển tốt và sinh nhiều enzyme amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại nước chiết như nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành Độ axit của môi trường được xác định bởi thành phần và tính chất của các muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi vi sinh vật, pH của môi trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ . Nếu thêm vào môi trường các muối ammonium thì khi vi sinh vật tiêu thụ ion ammonium, các anion được giải phóng ra sẽ axit hóa môi trường. Vì thế cần phải thêm CaCO3 vào để trung hòa hoặc duy trì giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp enzyme amylase. 15
  24. Nhiệt độ nuôi: là một yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và sự tạo thành enzyme amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm mốc thuộc giống Aspergillus là 30 – 320C, Bacillus subtilis là 370C. Sục khí và khuấy trộn. Phần lớn vi sinh vật tạo enzyme amylase là những vi sinh vật hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng, vi sinh vật sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Vì thế việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase của vi sinh vật. Chế độ sục khí đối với nấm mốc là 10 – 12m3 không khí vô trùng trên 1 m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi khoảng 68 – 72 giờ. 1.5. Ứng dụng của enzyme amylase Chế phẩm enzyme amylase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp - đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm, sau đây là một số ứng dụng quan trọng của enzyme amylase: 1.5.1. Amylase trong công nghiệp rượu – bia Chế phẩm enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus usamii, Aspergillus niger, Rhizopus delemar hoặc từ Endomycopsis bispora, từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus được thay thế malt làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu,bia từ nguyên liệu có bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất. Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và đóng vai trò quyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường lên men, do vậy cần chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh nhiều glucoamylase. Trong sản xuất rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt hay bề sâu của các nấm mốc. Ở Việt Nam chúng ta dùng canh trường bề mặt của nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii, Aspergillus awamori và Rhizopus delemar để đường 16
  25. hóa. Ở một số nước, ngoài enzyme amylase nấm mốc người ta còn sử dụng enzyme amylase từ vi khuẩn, nấm men cũng cho kết quả đường hóa khá cao. Chế phẩm enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus chịu nhiệt độ cao, dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột lúc đầu, trước khi đường hóa rất tốt. Ở nhiệt độ 80-900C trong 10-15 phút α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt một phần rất nhỏ. Trong sản xuất bia, thường dùng Aspergillus oryzae và Bacillus subtilis để đường hóa thay malt, là nguyên liệu khá đắt tiền và cần thiết trong sản xuất bia. Dùng chế phẩm enzyme này người ta có thể thay từ 50 - 100% malt bằng đại mạch không nảy mầm, thay thế 50 - 60% malt thì chất lượng bia tốt hơn. Khi dùng chế phẩm enzyme vi sinh vật thay malt, cần bổ sung nguồn nguyên liệu có bột như các loại ngũ cốc như: bắp, khôi, sắn, gạo, đại mạch không nảy mầm, tiểu mạch. Biện pháp thay thế malt bằng chế phẩm enzyme như trên có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc giảm giá đáng kể giá thành của sản phẩm, mà chất lượng bia vẫn bảo đảm. 1.5.2. Trong sản xuất bánh mì Trong sản xuất bánh mì người ta thường sử dụng chế phẩm enzyme amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, hay của vi khuẩn, nhưng chế phẩm từ nấm mốc áp dụng có hiệu quả và rộng rãi hơn. Dùng với lượng 0,002 - 0,05% chế phẩm enzyme amylase so với bột nhão sẽ tăng cường quá trình lên men bột, rút ngắn thời gian lên men xuống 20 - 30%, tăng độ xốp 5 - 8%, tăng thể tích bánh lên men 15 - 25% màu sắc vỏ bánh đẹp hơn, ruột bánh xốp và sáng màu hơn tăng hương vị thơm ngon của bánh. Khi làm bánh mì ngọt, nếu thêm chế phẩm enzyme amylase vào bột, sẽ xảy ra quá trình thủy phân bột thành đường, do đó giảm lượng đường tiêu tốn cho sản xuất. 1.5.3. Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco Từ lâu các sản phẩm mật tinh bột như: mật gluco, mật malto được sản xuất bằng phương pháp thủy phân tinh bột bằng axit hay bằng malt. Ngày nay người ta 17
  26. sử dụng rộng rãi chế phẩm enzyme amylase vi sinh vật trong sản xuất mật tinh bột, gluco, malto từ nguyên liệu tinh bột. Ở các nước tiên tiến khác, phương pháp dùng enzyme từ vi sinh vật trong lĩnh vực này cũng đã được áp dụng có hiệu quả và phổ biến, hay phối hợp phương pháp axit và enzyme. Trong sản xuất mật tinh bột, gluco, hai enzyme chủ yếu là amylase và glucoamylase từ nấm mốc và vi khuẩn. Enzyme α-amylase để dịch hóa tinh bột và tạo malto, còn glucoamylase dùng để đường hóa tạo gluco, chế phẩm amylase cho sản xuất gluco được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus sublitis, Bacillus mesentericus. Chế phẩm glucoamylase thường sản xuất từ nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Rhizopus delamar, Mucor hay từ một số nấm men Saccharomyces, Endomycopsis 1.5.4. Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác như bánh kẹo, nước giải khát, đồ hộp, nước ép trái cây, tương Chế phẩm enzyme amylase giúp cho quá trình thủy phân tinh bột thành đường, làm trong các thành phần dạng lỏng, dễ cô đặc, tăng lượng đường trong sản phẩm, giảm lượng đường tiêu tốn, tăng lượng đường đơn giản dễ hấp thu cho người, đặc biệt là thức ăn cho trẻ em, giảm thời gian nấu, chế biến Hiện nay người ta dùng hỗn hợp các enzyme: protease, amylase, pectinase trong sản xuất các sản phẩm trên, tạo sản phẩm dễ tan, dễ tiêu hóa màu sắc đẹp, dễ lọc, dễ cô đặc, rút ngắn thời gian sản xuất, giảm giá thành sản phẩm 1.5.5. Trong các ngành công nghiệp dệt, giấy Trong công nghiệp dệt, chế phẩm enzyme amylase của vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus diastaticus, Bacillus amylosolvens có tính ưu việt chịu nhiệt cao, dùng trong rũ hồ vải, tạo điều kiện tốt dễ dàng khi nhuộm, tẩy vải sau này. Ngoài ra người ta còn dùng chế phẩm enzyme amylase trong sản xuất keo tinh bột cho công nghiệp giấy. 18
  27. 1.5.6. Trong chăn nuôi Chế phẩm enzyme amylase được sử dụng riêng rẽ hay phối hợp với các enzyme khác như: protease, cenlulase, pectinase để sản xuất các loại thức ăn dễ tiêu hóa, hấp thu trong chăn nuôi gia súc, gia cầm. Sử dụng thức ăn có chế phẩm enzyme amylase sẽ làm tăng khả năng hấp thu, tiêu hóa do đó giảm lượng thức ăn, tăng trọng nhanh, tăng khả năng sinh sản, chống bệnh tật 1.5.7. Trong y học Enzyme amylase cùng các enzyme khác, được dùng cho chữa bệnh do thiếu enzyme, kém khả năng chuyển hóa chất, bệnh về tiêu hóa, tim, thần kinh Ngoài ra chế phẩm enzyme amylase dùng để điều chế môi trường nuôi vi sinh vật phục vụ cho nghiên cứu khoa học, chuẩn trị bệnh. 19
  28. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các chủng nấm mốc phân lập từ các mẫu bánh men cơm rượu ở các địa điểm khác nhau theo bảng 2.1: Bảng 2.1: Các mẫu bánh men cơm rượu STT Kí hiệu mẫu Nơi lấy mẫu 1 CĐ Chợ Động – Phan Rang– Ninh Thuận 2 CL Chợ Lớn – Đường Thống Nhất – TP. Phan Rang 3 NS Chợ Ninh Sơn– Ninh Thuận 4 KB Chợ Kim Biên – Ninh Thuận 5 LB Chợ Long Bình – Ninh Thuận 6 NH Chợ Ninh Hải – Ninh Thuận 7 Chợ Thuận Nam – Ninh Thuận TN 8 Chợ Ninh Phước – Ninh Thuận NP 2.1.2. Vật liệu và hóa chất 2.1.2.1 Dụng cụ và thiết bị Các dụng cụ thí nghiệm phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh như: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, erlen ,tủ cấy,tủ ấm , nồi hấp, máy ly tâm Centrifuge 5430, máy sấy, máy lắc điều nhiệt. 2.1.2.2. Hóa chất a. Thuốc thử Lugol 20
  29. Bảng 2.2: Thuốc thử Lugol Thành phần Số lượng I2 1 g KI 2 g Nước cất 300 ml b. Dung dịch đệm axetat pH 4,7: Bảng 2.3: Dung dịch đệm axetat pH 4,7 Thành phần Số lượng Axetat 82 g Axit CH3COOH 32,3 ml Nước cất 100 ml c. Dung dịch tinh bột 1%: Bảng 2.4: Dung dịch tinh bột 1% Thành phần Số lượng Tinh bột 1 g Dung dịch đệm axetat 10ml Nước cất 100 ml 2.1.2.3. Môi trường a. Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) Bảng 2.5: Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) Thành phần Số lượng Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 20g Nước cất 1000ml Ph 6.5 b. Môi trường thạch – tinh bột 21
  30. Bảng 2.6: Môi trường thạch – tinh bột Thành phần Số lượng KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 0.2g (NH4)2SO4 0.2g Tinh bột tan 10g Agar 20g Nước cất 1000ml 2.2. Phương pháp 2.2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiện tại phòng xét nghiệm bệnh tôm Ninh Thuận Thời gian thực hiện: từ tháng 06/2013 – 09/2013. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1. Phương pháp phân lập Môi trường phân lập nấm mốc được sử dụng là môi trường PGA. Các chủng nấm mốc được phân lập từ các mẫu bánh men cơm rượu. Bánh men được bẻ làm đôi, lấy một ít bánh men ở giữa rải đều lên bề mặt đĩa petri chứa môi trường PGA, sau đó đem để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ. Sau khi nấm mốc mọc trên bề mặt môi trường của đĩa petri. Dùng que cấy chuyển nấm mốc qua đĩa petri có chứa môi trường PGA mới để làm thuần. Nấm mốc sau khi làm thuần được cấy vào ống nghiệm và được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Chuẩn bị môi trường phân lập: PGA - Cho 200g khoai tây cắt lát mỏng + 1000ml nước cất dun sôi trong thời gian từ 20 đên 25 phút sau đó lọc thu dịch chiết khoai tây, tiếp tục + 20g agar + 20g Glucose dun thêm 10 dến 15 phut cho đến khi agar tan hoàn toàn. - Đổ vào mỗi erlen 200ml dịch môi trường sau đó đem đi hấp môi trường. 22
  31. Hình 2.1: Môi trường PGA sau khi hấp - Đổ đĩa peptri: được thực hiện trong điều kiện vô trùng với đèn cồn, đĩa sau khi khô để ở nhiệt độ phòng 1 ngày sau đó kiểm tra chất lượng đĩa( đảm bảo không bị nhiễm khuẩn). Hình 2.2: Đổ đĩa peptri 23
  32. - Bánh men được bẻ làm đôi, lấy một ít bánh men ở giữa rải đều lên bề mặt đĩa petri chứa môi trường PGA. - Để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ. Hình 2.3: Môi trường nuôi cấy sau 48 h Hình 2.4: Môi trường sau làm thuần 24
  33. - Cấy giữ giống vào ống nghiệm và bảo quản trong tủ lạnh ở 40C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Hinh 2.5. Cấy giữ giống 2.2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái nấm mốc: a. Quan sát khuẩn lạc nấm mốc: Cấy chủng nấm mốc lên môi trường PGA, để ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sau đó quan sát và ghi nhận hình thái khuẩn lạc nấm mốc trên đĩa như: màu sắc, hình dạng sợi nấm và đo kích thước khuẩn lạc. b. Quan sát tế bào nấm mốc dưới kính hiển vi: Làm tiêu bản tế bào nấm mốc trong xanh methylen, quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học. 2.2.2.3. Phương pháp xác định khả năng phân giải tinh bột: Môi trường sử dụng để xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc là môi trường thạch – tinh bột. Cấy chủng nấm mốc lên môi trường thạch - tinh bột, để ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ. Sau đó, đổ dung dịch Lugol lên môi trường thạch - tinh bột. Nếu có vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc thì chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột, nếu không có vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc thì chủng nấm mốc không có khả năng phân giải tinh bột, dùng thước đo vòng phân giải tinh bột và ghi nhận kết quả. 25
  34. 2.2.2.4. Phương pháp thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc Sử dụng môi trường PGA không cho agar để nuôi cấy nấm mốc. Thu nhận chế phẩm enzyme amylase theo phương pháp nuôi cấy chìm, như Hình 2.1. Chuẩn bị 100ml môi trường trong erlen 250ml. Đem tiệt trùng ở 1210C trong 30 phút và để nguội. Cho 10ml nước cất đã vô trùng vào trong ống nghiệm giống nấm mốc, khuấy nhẹ để các bào tử hòa trong nước. Đổ toàn bộ 10ml dịch trong ống nghiệm này vào trong erlen 250ml có 100ml môi trường. Tất cả thao tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Đặt các erlen này vào máy lắc có tốc độ 200 v/p nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, đem ly tâm, thu lấy dịch. Dịch nuôi cấy này có chứa enzyme hòa tan. Bảo quản dịch nuôi cấy này trong tủ lạnh 40C. Dùng 200ml cồn 960 lạnh đổ từ từ vào 100ml dịch lọc enzyme đã làm lạnh, khuấy rất nhẹ để cồn hòa đều với dịch enzyme. Sau đó, để hỗn hợp này vào tủ lạnh.Sau 24 giờ, hỗn hợp sẽ phân thành hai lớp. Đem ly tâm để thu enzyme dạng tủa. Enzyme dạng tủa này còn chứa nhiều nước. Nước tồn tại trong đó sẽ làm giảm hoạt tính enzyme. Do đó, cần phải loại nước bằng cách sấy ở nhiệt độ <400C, ta có chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết. 26
  35. 100 ml MT PGA lỏng Giống nấm mốc Lắc 200v/p trong 48 giờ ở t0 phòng Ly tâm 6000v/p trong 5 phút Thu dịch lỏng, bỏ cặn Tủa bằng cồn 960 lạnh Giữ lạnh ở 40C trong 24 giờ Ly tâm ở 6000v/p trong 20 phút Thu cặn, bỏ dịch Sấy dưới 400C Enzyme bán tinh khiết Hình 2.6: Quy trình thu nhận enzym amylase từ nấm mốc 27
  36. 2.3. Qui trình lên men bề mặt tạo Enzym Amylase 2.3.1. Qui trình công nghệ lên men bề mặt Hình 2.7: Qui trình công nghệ lên men bề mặt Thuyết minh quy trình: Bước 1: Chuẩn bị 10 g cám gạo và 16 ml dung dịch muối khoáng trung bình MSM là dung dịch muối khoáng trong bài: ZnSO4x7H2O (6,2 mg), FeSO4x7H2O (6,8mg), CuSO4 x 7H2O (0,8 mg) pha trong 1 lít nước cất điều chỉnh pH về 4,5. Bước 2: Cho vào bình 250 ml sau đó điều chỉnh độ ẩm độ ẩm 55%. Thêm 5 g trấu, trộn đều. Đậy nút bông, Hấp tiệt trùng 1210 C (1 atm), 15 phút. Bước 3: Cấy vào bình đã nguội 1ml huyền phù bào tử nấm, thực hiện lên men trong vòng 4 ngày (96 h) ở nhiệt độ trong phòng nuôi cấy từ 23oC đến 30oC. Giống có thể chuẩn bị trong ống thạch nghiêng, dùng 5 ml nước muối sinh lý có 0,1% Tween 80 để tạo huyển phù bào tử trong ống thạch nghiêng. 28
  37. Bước 4: Sau 96 h lên men (thật ra phải làm mẫu để ở 48 h, 72 h và 96 h mỗi chủng cho enzyme cực đại ở thời gian khác nhau. Thu nhận enzym, Thêm lượng nước cất gấp 4 lần lượng mẫu trong bình tam giác trộn đều, lắc trong 60 phút. Bước 5: Hỗn hợp này được lọc qua vải. Bước 6: Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng, thu dịch nổi Bước 7: Lấy dịch nổi lọc qua giấy lọc ta thu được enzym là dịch trong. - Sau đó xác định hoạt tính enzyme trong dịch trong và hàm lương protein theo Wolhgemuth. - Sau đó tủa enzyme bằng cồn lạnh (thể tích enzyme : thể tích cồn = 1:3), để lạnh qua đêm, bỏ dịch trong phía trên, phần còn lại thu tủa bằng ly tâm 5000, 15 phút, thu tủa. - Hòa tan kết tủa enzyme vào dung dịch đệm. Thử hoạt tính và protein, 2.3.2. Xác định hoạt tính enzym amylase theo Wohlgemuth Ta thu được 3 mẫu enzym ( ở 48h,72h, 96h): lần lượt xác định hoạt tính enzym của từng mẫu. 2.3.2.1. Dụng cụ và hoá chất Dụng cụ và hoá chất cụ thể như sau: 11 ống nghiệm, Pipet 1ml (4 cái), tủ ấm, NaCl 0.5%, tinh bột 0.5%, H2SO4 10%, Iod trong KI 3% 2.3.2.2. Tiến hành Mẫu enzym thu được, lần lượt cho vào mỗi mẫu 2 ml nước cất hòa tan. Tiến hành khảo sát hoạt tính amylase. - Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Sau đó. Hút vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch NaCl 0.5% . - Trong ống nghiệm số 1, cho vào 1ml dung dịch amylase và lắc kỹ . Sau đó , lấy 1ml từ ống nghiệm số 1 cho vào ống nghiệm số 2 , lắc kỹ và lặp lại cho tới ống nghiệm số 10 thì hút 1ml và bỏ đi. - Trong mỗi ống nghiệm cho vào 1ml dung dịch hồ tinh bột 0.5% lắc đều , để vào tủ điều nhiệt ở 37ºC. 29
  38. - Sau 30 phút lấy ra , thêm vào mỗi ống 1ml H2SO4 10% và 2 giọt Iod trong KI 3% lắc đều. - Sau đó ghi kết quả vào bảng. - Lấy 1 ống nghiệm khác (ống số 11) cho vào 3ml nước cất , 2 giọt thuốc thử Iod và so sánh với màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzyme amylase thấp nhất thuỷ phân hoàn toàn tinh bột. 2.3.3. Thí nghiệm khả năng thủy phân bột gạo của enzym amylase Pha 1 ml enzyme + 3 ml nước cất = 4 ml enzyme. Chuẩn bị dung dịch tinh bột 10%: Cho 2 g bột gạo +16 ml H2O + 2 ml NaCl 0,5%, hồ hóa để nguội 40oC, chia thàng 4 ống: Ống 1: 2 ml enzyme, ống 2: 1 ml enzyme + 1ml H2O, ống 3: 0,5 ml enzyme + 1,5 ml H2O, ống 4: 2ml H2O, đo pH ủ 40oC Sau 30 phút hoặc 60 phút, thử màu bằng dung dịch iod, bằng cách nhỏ giọt ra miếng sứ trắng, đối chứng, nhỏ giọt iod với nước cất. Theo dõi đến khi nào kết thúc thủy phân. 30
  39. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có trong bánh men cơm rượu Trong đồ án tốt nghiệp người thực hiện đề tài đã sử dụng bánh men rượu làm nguồn phân lập là do: enzyme amylase thu được từ nấm mốc có trong bánh men có hoạt lực phân hủy tinh bột có thể cao, đồng thời bánh men được sử dụng từ lâu đời trong sản xuất rượu gạo truyền thống, an toàn sinh học. Từ 8 mẫu bánh men lấy ở những địa điểm khác nhau, đã thực hiện phân lập được 11 chủng nấm mốc theo Bảng 3.1: Bảng 3.1: Các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu STT Chủng Mẫu 1 M1 CĐ 2 M2 CĐ 3 M3 CL 4 M4 CL 5 M5 NS 6 M6 NS 7 M7 NH 8 M8 NP 9 M9 LB 10 M10 KL 11 M11 TN Qua bảng trên thấy rằng từ các mẫu bánh men CĐ, CL và NS mỗi mẫu đã phân lập được 2 chủng nấm mốc, riêng các mẫu bánh men NH, NP, KL, TN, LB mỗi mẫu chỉ phân lập được 1 chủng nấm mốc. Dưới đây là một số hình ảnh khuẩn lạc nấm mốc đã phân lập được: 31
  40. a. Chủng M2 b. Chủng M4 c. Chủng M7 d. Chủng M10 Hình 3.1: Khuẩn lạc của các chủng nấm mốc M2, M4, M7, M10 3.2. Kết quả quan sát hình thái nấm mốc Sau khi quan sát khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập được từ các mẫu bánh men, đã ghi nhận một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc như ở Bảng 3.2. Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc đã phân lập từ bánh men cơm rượu 32
  41. Kích Tốc độ Hình dạng sợi STT Chủng thước (2 phát Màu sắc nấm ngày) triển 1 M1 7.7 cm Nhanh Trắng Dạng bông 2 M2 6 cm Nhanh Màu xám, viền trắng Dạng bông 3 M3 8.8 cm Nhanh Trắng Dạng bông Dạng bông, dày 4 M4 3.9 cm Vừa phải Trắng xám, nhạt đặc 5 M5 7.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 6 M6 6 cm Nhanh Màu xám, viền trắng Dạng bông 7 M7 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 8 M8 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 9 M9 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 10 M10 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông 11 M11 9.5 cm Nhanh Trắng Dạng bông Qua bảng trên cho thấy rằng, về đặc điểm hình dạng sợi nấm: đa số các chủng nấm mốc phân lập được đều có dạng bông, riêng chủng nấm mốc M4 có dạng bông dày đặc. - Về màu sắc khuẩn lạc: các chủng nấm mốc M1, M3, M5, M7, M8, M9, M10, M11 phân lập từ bánh men đều có màu trắng. Các chủng nấm mốc có màu xám, viền trắng là M2 và M6.Riêng chủng nấm mốc M4 thì có màu trắng, xám nhạt. - Về kích thước khuẩn lạc nấm mốc trong 2 ngày sau khi cấy, có kích thước từ 3,9 – 9, 5 cm. - Tốc độ phát triển của các chủng nấm mốc phân lập được đều nhanh. 33
  42. 3.3. Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc và chọn lọc chủng sản xuất enzyme amylase Kết quả thí nghiệm xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc cho thấy 9 chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 có khả năng tạo vòng phân giải tinh bột và 2 chủng: M2, M6 không có khả năng tạo vòng phân giải tinh bột. Các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột do đó chúng có khả năng tạo ra enzyme amylase. Nấm mốc tạo ra enzyme amylase phân giải liên kết 1,4 – glycoside ở giữa chuỗi tạo thành dextrin phân tử thấp. Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột trong môi trường nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu với dung dịch iodine. Như vậy, 9 chủng nấm mốc: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 có khả năng tạo enzyme amylase và 2 chủng nấm mốc: M2, M6 không có khả năng tạo enzyme amylase. Kết quả đo vòng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc theo Bảng 3.3: Bảng 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu STT Chủng Đường kính phân giải tinh bột (cm) 1 M1 1,85 2 M2 - 3 M3 2,25 4 M4 3,1 5 M5 1,55 6 M6 - 7 M7 1,25 8 M8 2,6 9 M9 2,75 10 M10 2,1 11 M11 2,23 34
  43. Qua kết quả thí nghiệm khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc đã cho thấy các chủng nấm mốc phân lập được từ bánh men có đường kính phân giải từ 1,25 – 3,1 cm. Trong đó có 2 chủng nấm mốc không có khả năng phân giải tinh bột là chủng M2 và M6. Khả năng phân giải tinh bột của chủng M4 là lớn nhất có vòng phân giải là 3, 1 cm, trong khi đó chủng M7 có khả năng phân giải tinh bột nhỏ nhất, vòng phân giải tinh bột là 1,25 cm. Chủng M4 được chọn lọc để sản xuất enzyme amylase. a. Chủng M4 b. Chủng M3 c. Chủng M9 d. Chủng M11 Hình 3.2: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M3, M4, M9, M11 35
  44. e. Chủng M6 f. Chủng M7 Hình 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M6, M7 3.4 Kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy chìm 3.4.1. Điều kiện nuôi cấy Quá trình nuôi cấy chìm phải đảm bảo ở nhiệt độ từ 23 đến 320 tốt nhất là 300 c ở nhiệt độ phòng, pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy là pH=7. Trong quá trình cấy giống cần lưu ý là mọi thao tác đều phải tiến hành trong tủ cấy và cạnh đèn cồn. Chuẩn bị 100ml môi trường trong erlen 250ml. Đem tiệt trùng ở 1210C trong 30 phút và để nguội. Cho 10ml nước cất đã vô trùng vào trong ống nghiệm giống nấm mốc, khuấy nhẹ để các bào tử hòa trong nước. Đổ toàn bộ 10ml dịch trong ống nghiệm này vào trong erlen 250ml có 100ml môi trường. Đặt các erlen này vào máy lắc có tốc độ 200 v/p nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, đem ly tâm, thu lấy dịch. Dịch nuôi cấy này có chứa enzyme hòa tan. Bảo quản dịch nuôi cấy này trong tủ lạnh 40C. Dùng 200ml cồn 960 lạnh đổ từ từ vào 100ml dịch lọc enzyme đã làm lạnh, khuấy rất nhẹ để cồn hòa đều với dịch 36
  45. enzyme. Sau đó, để hỗn hợp này vào tủ lạnh.Sau 24 giờ, hỗn hợp sẽ phân thành hai lớp. Đem ly tâm để thu enzyme dạng tủa. Enzyme dạng tủa này còn chứa nhiều nước. Nước tồn tại trong đó sẽ làm giảm hoạt tính enzyme. Do đó, cần phải loại nước bằng cách sấy ở nhiệt độ <400C, ta có chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết. 3.4.2. Xác định hoạt tính của enzyme Amylase Mẫu enzym thu được, cho vào mỗi mẫu 2 ml nước cất hòa tan. Tiến hành khảo sát hoạt tính amylase. - Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Sau đó, Hút vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch NaCl 0.5% . - Trong ống nghiệm số 1, cho vào 1ml dung dịch amylase và lắc kỹ . Sau đó , lấy 1ml từ ống nghiệm số 1 cho vào ống nghiệm số 2 , lắc kỹ và lặp lại cho tới ống nghiệm số 10 thì hút 1ml và bỏ đi. - Trong mỗi ống nghiệm cho vào 1ml dung dịch hồ tinh bột 0.5% lắc đều , để vào tủ điều nhiệt ở 37ºC. - Sau 30 phút lấy ra, thêm vào mỗi ống 1ml H2SO4 10% và 2 giọt Iod trong KI 3% lắc đều. - Sau đó ghi kết quả vào bảng. - Lấy 1 ống nghiệm khác (ống số 11) cho vào 3ml nước cất, 2 giọt thuốc thử Iod và so sánh với màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzyme amylase thấp nhất thuỷ phân hoàn toàn tinh bột. 3.4.3. Kết quả xác định hoạt tính của enzyme Amylase Theo định nghĩa đơn vị hoạt tính theo Wohlgemuth là số lần pha loãng cực đại enzyme để thủy phân hoàn toàn 1 ml tinh bột 0,5% trong thời gian 30 phút trong điều kiện thí nghiệm là nhiệt độ = 370C, pH = 6. Vì enzyme kết tủa được hòa tan trong nước cất, sau đó ½ lượng enzyme này mới được đưa vào xác định hoạt tính và thể tích enzyme là 1 ml nên hoạt tính amylase (đơn vị Wohlgemuth) là : 37
  46. A = 2n * 2 đơn vị/ml (Trong đó n là số thứ tự ống nghiệm có nồng độ enzym thấp nhất hay độ pha loãng cao nhất để thủy phân hoàn toàn tinh bột trong điều kiện thí nghiệm). Hình 3.4: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme Bảng 3.4: Bảng kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 nghiệm Độ pha 21 =2 22= 23=8 16 32 64 128 256 512 1024 loãng 4 Màu vàng Nâu Nâu Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh nhạt đậm Hoạt tính enzyme amylase thu được: A = 21 x 2 = 4 đơn vị/ml dịch enzyme kết tủa. 3.5. Kết quả lên men bề mặt thu enzyme amylase Dưới đây là một số hình ảnh trong quá trình lên men bề mặt thu nhận enzyme amylase bán tinh khiết từ chủng nấm mốc. 38
  47. Hình 3.5: Môi trường nuôi cấy sau khi hấp Hình 3.6: Cấy giống vào môi trường nuôi cấy 39
  48. Hình 3.7: Môi trường sau nuôi cấy Hình 3.8: Thu dịch nuôi cấy 40
  49. Hình 3.9: Lọc dịch chiết Hình 3.10: Chế phẩm enzyme amylase được tủa bằng cồn 960 lạnh 41
  50. 3.6. Kết quả xác định hoạt tính enzym amylase sau kết tủa Sau khi ly tâm bỏ dịch, kết tủa được hòa tan trong nước cất và sau đó xác định hoạt tính bằng phương pháp Wohlgemuth để xác định thời gian thu enzyme cực đại trong quá trình lên men thể rắn Xác định hoạt tính enzyme amylase thu được trong thời gian nuôi cấy 2, 3, 4 ngày. Hình 3.11, 3.12, 3.13: Biểu diễn kết quả thử hoạt tính enzyme thu được bằng nuôi cấy bề mặt sau 2, 3, 4 ngày. Hình 3.11: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 2 ngày nuôi cấy Hình 3.12: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 3 ngày nuôi cấy 42
  51. Hình 3.13: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 4 ngày nuôi cấy Theo định nghĩa đơn vị hoạt tính theo Wohlgemuth là số lần pha loãng cực đại enzyme để thủy phân hoàn toàn 1 ml tinh bột 0,5% trong thời gian 30 phút trong điều kiện thí nghiệm là nhiệt độ = 370C, pH = 6. Vì enzyme kết tủa được hòa tan trong đệm, sau đó ½ lượng enzyme này mới được đưa vào xác định hoạt tính và thể tích enzyme là 1 ml nên hoạt tính amylase (đơn vị Wohlgemuth) là : A = 2n * 2 đơn vị/ml (Trong đó n là số thứ tự ống nghiệm có nồng độ enzym thấp nhất hay độ pha loãng cao nhất để thủy phân hoàn toàn tinh bột trong điều kiện thí nghiệm), ta có quả trong Bảng 3.5. Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Độ pha loãng 21 = 2 22 = 4 23=8 24=16 25=32 64 128 256 512 1024 Enzyme thu được sau 2 ngày lên men = hoạt tính = 0 Màu Tím Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh xanh Enzyme thu được sau 3 ngày lên men = 22 x 2 = 8 đơn vị/ml dịch enzyme kết tủa Màu vàng vàng nâu Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Enzyme thu được sau 4 ngày lên men = 21 x 2 = 4/ml dịch enzyme kết tủa Màu vàng Nâu Nâu Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh đậm Bảng 3.5: Xác định hoạt tính enzyme amylase thu được trong thời gian 2, 3, 4 ngày lên men thể rắn 43
  52. Vậy qua thí nghiệm trên ta thấy enzym thu được ở ngày thứ 3 có hoạt tính mạnh nhất đạt 8 đơn vị/ ml enzyme kết tủa. So sánh lên men chìm và lên men bề mặt Chỉ tiêu so sánh Lên men chìm Lên men bề mặt Môi trường PGA lỏng( khoai tây, Cám gạo, trấu, nước, muối gluco, nước cất) trung tính Mật độ giống 10 ml dịch bào tử nấm 1ml dich bào tử nấm mốc Nhiệt độ 300c 300c pH 6,5 6,2 Oxy Thời gian 48h 72h Giá thành môi trường, 4000 vnd 2000 vnd Giá thành giống bào tử 1000 vnd 1000 vnd Giá thành năng lượng lên 4000 vnd 2000 vnd men (tính cho tiệt trùng và khuấy nếu cần) Giá thành cồn kết tủa 6000 vnd 10000 vnd Giá thành năng lượng sấy 2000 vnd 0 vnd Tổng chi phí 17000 vnd 6000 vnd Hoạt tính (đơn vi W/ml) 4 8 Thể tích enzymne kết tủa 200ml 500ml (ml) Hoạt tính tổng (đơn vị W) 4 đơn vị W/ ml x 2 ml 8 đơn vị W/ml x 2 ml Giá thành enzyme 8/17000 16/6000 Năng suất enzyme (đơn vị 4 / 2 ngày 8/3 ngày W/ml/ngày) Từ bảng trên ta thấy sự khác biệt giữa 2 phương pháp lên men chìm và lên men bán rắn: Lên men bán rắn phương pháp có nhiều ưu điểm hơn vì công nghệ 44
  53. đơn giản, nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền và đặc biệt hơn cả là lượng enzyme thu được nhiều hơn, chi phí thấp hơn so với phương pháp lên men chìm. 3.7. Kết quả thí nghiệm về khả năng phân giải bột gạo của enzym amylase Bố trí thí nghiệm thủy phân tính bột từ enzyme kết tủa còn lại với nồng độ dung dịch tinh bột. Xác định khả năng thủy phân tinh bột của enzyme amylase, ta có kết quả như Bảng 3.6: Bảng 3.6: Thí nghiệm thủy phân tinh bột Ống nghiệm 1 2 3 4 Đối chứng Dd tinh bột (ml) 4 4 4 4 0 Lượng tinh bột trong 2g/20 ml 0,4 g 0,4 g 0,4 g 0,4 g mẫu thủy phân x4 =0,4 g Dd Enzyme(ml) 2 1 0,5 0 0 Nước cất (ml) 0 1 1,5 2 2 Hoạt tính enzyme 8 đơn 2 đơn vị 1 đơn 0 0 vị/ml/4 ml vị x 2ml = 4 đv Tỉ lệ enzyme/cơ chất 4 đơn vị/ 2 đơn vị 2,5 0,4 g = 10 /0,4 = 5 đơn đơn vị/g đơn vị/g vị/g Dd Lugol (giọt) 2 giọt 2 giọt 2 giọt 2 giọt 2 giọt Màu vàng vàng Nâu Xanh Xanh Tiến hành đo pH ở 4 ống ta đươc pH=6. Sau 30 phút hoặc 60 phút, thử màu bằng dd iod (bằng cách nhỏ giọt ra miếng sứ trắng, đối chứng, nhỏ giọt iod với nước cất. Theo dõi đến khi nào kết thúc thủy phân. 45
  54. Ống 1 Ống 2 Ống 3 ống 4 Hình 3.14: Kết thúc thủy phân tinh bột gạo hồ hóa Kết quả ta thấy ống 1 và ống 2 có màu vàng nhạt giống với màu của ống đối chứng , điều đó cho thấy ống 1 và 2 thủy phân được hoàn toàn tinh bột. Theo dõi thời gian kết thúc thủy phân ở phản ứng trên, như vậy với tỉ lệ enzyme cơ chất là 10 đơn vị Wohlgemuth/g cơ chất, thời gian thủy phân hoàn toàn ở nhiệt độ = 370 C, pH = 6 là 30 phút. 46
  55. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau một thời gian tiến hành nghiên cứu và thực nghiệm, người thực hiện đề tài đã: - Phân lập được 11 chủng nấm mốc từ bánh men cơm rượu ở 8 địa điểm khác nhau. - Trong đó có 9 chủng nấm mốc đều có khả năng phân giải tinh bột bao gồm các chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 và 2 chủng không có khả năng phân giải tinh bột là chủng M2, M6. Như vậy, 9 chủng nấm mốc có khả năng tạo enzyme amylase, 2 chủng nấm mốc không có khả năng tạo enzyme amylase. - Tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán tinh khiết theo phương pháp nuôi cấy chìm. - Từ 1 lít môi trường nuôi chủng M4 thu được 1,23 g chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết. - Tiến hành nuôi cấy chủng M4 bằng phương pháp lên men, sau 3 ngày nuôi cấy hoạt tính enzyme thu được là cực đại. Chế phẩm enzyme kết tủa có hoạt tính 8 đơn vị/ ml. Sử dụng enzyme trên thủy phân dung dịch tinh bột 10% với tỉ lệ enzyme cơ chất là 10 đơn vị/g thời gian thủy phân hoàn toàn là 30 phút. 4.2. Kiến nghị Do thời gian có hạn và điều kiện máy móc thiết bị còn hạn chế, người thực hiện đề tài không thể tiến hành các nghiên cứu sâu hơn. Với những kết quả đạt được, người thực hiện đề tài đề nghị: - Tiến hành định danh các chủng đến loài. - Nghiên cứu tối ưu quá trình sản xuất enzyme amylase để thu được lượng enzyme tối đa, chất lượng với chi phí thấp. - Nghiên cứu sản xuất enzyme amylase từ các chủng khác có khả năng phân giải tinh bột ngoài chủng M4. 47
  56. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Văn Bá – Cao Ngọc Điệp – Nguyễn Văn Thành, Giáo trình môn Nấm học, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học – Trường ĐH Cần Thơ, 2005. [2] Nguyễn Lân Dũng, Vi sinh học học, NXB Giáo Dục, số 04 – 2009/CXB/301 – 2117/GD. [3] Bùi Xuân Đồng, Nguyên lý phòng chống nấm mốc và mycotoxin, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 2003 [4] Nguyễn Thị Hiền (Chủ Biên), Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền, NXB Khoa học và Kỹ thuật – ĐH Bách Khoa Hà Nội, 2006. [5] Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên), Cao Cường – Nguyễn Ánh Tuyết – Lê Thị Thủy Tiên – Tạ Thu Hằng – Huỳnh Ngọc Oanh – Nguyễn Thúy Hương – Phan Thị Huyền, Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh Trường ĐH Bách Khoa, 2004. [6]Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên) – Phan Thị Huyền – Nguyễn Ánh Tuyết, Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB ĐH Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2006. [7] Nguyễn Văn Mùi, Thực hành Hóa sinh học, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2000. [8] Đồng Thị Thanh Thu, Sinh hóa ứng dụng (Trong công nghiệp thực phẩm và một số lĩnh vực khác), NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, 2003. [9]. fungus _PHIL_3960_lores.jpg [10]. &Itemid=431 [11]. 48