Đồ án Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi

125 trang thiennha21 12/04/2022 4370

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_pha_vach_bao_tu_nam_linh_chi.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện: TRẦN MINH HOÀNG MSSV: 1211100082 Lớp: 12DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là hoàn toàn trung thực, chưa từng được ai sử dụng để công bố trong bất kì công trình nào khác. Các thông tin, tài liệu trích dẫn trong luận án đều đã được ghi rõ nguồn gốc. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Trần Minh Hoàng iii
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi LỜI CẢM ƠN Trong thực tế không có sự thành công nào mà không có sự giúp đỡ từ những người khác. Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, đánh dấu kết thúc quãng thời gian học tập ở Trường Đại học Công nghệ TP.HCM tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ gia đình, thầy cô, bạn bè trong suốt bốn năm qua. Trước hết xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã tạo cơ hội cho tôi được học tập tại trường. Cám ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức và tâm huyết trong quá trình giảng dạy suốt những năm qua. Xin gửi lời cám ơn đến TS. Nguyễn Thị Hai đã cung cấp chủng nấm Trichoderma harzianum T2; cô Đỗ Thị Tuyến đã cung cấp cơ chất β-glucan và enzyme cellulase C20032; Ths. Nguyễn Thị Ngọc Yến đã cung cấp bào tử nấm Linh chi. Cám ơn quý thầy cô phụ trách quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tạo điều kiện làm việc cho tôi và nhóm thực hiện đồ án. Đặc biệt xin chân thành cám ơn TS. Nguyễn Hoài Hương, người đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, nếu không có sự giúp đỡ của cô chắc chắn đồ án tốt nghiệp của tôi gặp rất nhiều thiếu sót. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã có những sự giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cám ơn! Sinh viên thực hiện Trần Minh Hoàng iv
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT x DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 3. Mục đích của đề tài 2 4. Mục tiêu của đề tài 3 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Kết quả đạt được ban đầu 3 7. Hạn chế của đề tài 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi 4 1.1.1 Phân loại 4 1.1.1.1 Phân loại theo khoa học 4 1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc 5 1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi 9 1.1.2.1 Cuống nấm 9 1.1.2.2 Mũ nấm 9 1.1.2.3 Thụ tầng 10 1.1.2.4 Bào tử nấm Linh chi 10 1.1.3 Chu kì sống của nấm Linh chi 14 1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi 15 1.1.4.1 Dinh dưỡng 15 1.1.4.2 Nhiệt độ 15 1.1.4.3 Độ ẩm 15 1.1.4.5 Không khí 15 v
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1.1.4.6 Ánh sáng 16 1.1.4.7 Trị số pH 16 1.1.5 Thành phần dược tính của nấm Linh chi 16 1.1.5.1 Thành phần dược tính tổng quát 16 1.1.5.2 Triterpenoid 17 1.1.5.3 Hợp chất saponin 21 1.1.5.4 Những thành phần khác 22 1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi 22 1.1.6.1 Phòng ngừa ung thư 22 1.1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch 23 1.1.6.3 Khả năng chống oxy hóa 24 1.1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường 24 1.1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi 24 1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma 27 1.2.1 Phân loại 27 1.2.2 Lịch sử phát triển 27 1.2.3.1 Đặc điểm hình thái 28 1.2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng 29 1.2.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma 31 1.2.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh tổng hợp 31 1.2.4.1 Hệ enzyme chitinase 31 1.2.4.2 Hệ enzyme β – glucanase 33 1.2.4.3 Hệ enzyme cellulase 34 1.2.4.4 Hệ enzyme protease 35 1.3 Giới thiệu về enzyme phá vách tế bào 36 1.3.1 . Enzyme phá vách tế bào thực vật 37 1.3.2 Enzyme Cellulase C20032 41 CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 vi
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất 44 2.1.1 Vật liệu 44 2.1.2 Nơi tiến hành 44 2.1.3 Thời gian thực hiện 44 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 44 2.1.4.1 Thiết bị 44 2.1.4.2 Dụng cụ 45 2.1.5 Hóa chất – Môi trường sử dụng 45 2.1.5.1 Hóa chất 45 2.1.5.2 Môi trường sử dụng 47 2.2 Phương pháp nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 49 2.3 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi cấy 53 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum trên môi trường thạch PDA 54 2.3.2 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường lỏng 54 2.3.3 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn 54 2.4 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và enzyme chế phẩm C20032 56 2.4.1 Dựng đường chuẩn glucosamine 56 2.4.2 Xác định hoạt độ enzyme chitinase ở pH và nhiệt độ khác nhau 56 2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme celullase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm enzyme C20032 57 2.5.1 Dựng đường chuẩn glucose 57 2.5.2 Phản ứng xác định hoạt tính cellulase 58 2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease dịch nuôi cấy và chế phầm C20032 bằng phương pháp Anson cải tiến 59 2.6.1 Dựng đường chuẩn tyrosine 59 vii
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.6.2 Phản ứng xác định hoạt tính protease 60 2.7 Phương pháp xác định hoạt tính β-glucanase trong dịch nuôi cấy và chế phầm C20032 60 2.7.1 Dựng đường chuẩn β-glucan 61 2.7.2 Phản ứng xác định hoạt tính β-glucanase 61 2.8 Phương pháp xác định protein trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phầm C20032 bằng phương pháp Bradford 62 2.8.1 Dựng đường chuẩn Albumin 62 2.8.2 Xác định hàm lượng protein trong mẫu 62 2.9 Khảo sát phá vách bào tử nấm Linh chi bằng dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và enzyme chế phẩm C20032. 64 2.9.1 Phương pháp xác định tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032 64 2.9.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. 65 2.9.3 Phương pháp xác định độ ẩm bào tử nấm Linh chi 67 2.9.4 Phương pháp thay đổi nồng độ của chế phẩm C20032 kết hợp với dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum 68 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 70 3.1 Kết quả định tính enzyme chitinase, β-glucanase, protease trong chế phẩm C20032 10% và dịch nuôi cấy 70 3.1.1 Kết quả định tính các enzyme trong chế phẩm C20032 10% 70 3.1.2 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy lỏng 71 3.1.3 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy rắn 72 3.2 Kết quả định lượng hoạt tính các enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum nuôi cấy môi trường lỏng và nuôi cấy môi trường rắn và chế phẩm C20032 10% 73 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032 75 3.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm viii
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Trichoderma harzianum ở điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau. 75 3.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm C20032 10% 76 3.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10% 77 3.5 Kết quả tỉ lệ bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum 81 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 85 4.1 Kết luận 85 4.2 Kiến nghị 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 PHỤ LỤC 1 ix
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA: Potato Dextrose Agar EC: Enzyme cellulase C20032 DNC: Dịch nuôi cấy G. lucidum: Ganoderma lucidum T.harzianum: Trichoderma harzianum T. hamatum: Trichoderma hamatum T. polysporum: Trichoderma polysporum T. viride: Trichoderma viride T. reesei: Trichoderma reeisei B.cinerea: Botrytis cinerea T. hamatum: Trichoderma hamatum T. virens: Trichoderma virens BSA: Bovine serum albumin DD: Dung dịch TCA: Trichloacetic acid FC: Folin – Ciocalteu CMC: Sodium carboxymethyl cellulose DNS: acid – 2 – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic MT: Môi trường ĐC: Đối chứng TB: Trung bình NT: nghiệm thức x
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi DANH MỤC BẢNG STT Bảng Nội dung Trang 1 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở 11 các mẫu vật khác nhau 2 1.2 So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở 25 các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2,5mg/ml) 3 1.3 Một số loại enzyme thủy phân của T. harzianum 36 4 1.4 Một số enzyme thương mại và thành phần enzyme trong 40 chế phẩm 5 1.5 Thông tin chế phẩm enzyme cellulase C20032 của 41 Novozyme 6 2.1 Bảng dựng đường chuẩn glucosamine 56 7 2.2 Lập đường chuẩn glucose 58 8 2.3 Các bước xác định hoạt tính enzyme cellulase (CMCase) 58 9 2.4 Bảng bổ sung hóa chất dựng đường chuẩn tyrosine 59 10 2.5 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease 60 11 2.6 Lập đường chuẩn β-glucan để xác định hoạt tính enzyme 61 β-glucanase 12 2.7 Các bước xác định hoạt tính enzyme β-glucanase 61 13 2.8 Dựng đường chuẩn albumin (protein theo Bradford) 62 14 2.9 Bảng bố trí sự thay đổi tỉ lệ enzyme DNC và chế phẩm 65 C20032 10% 15 2.10 Bảng bố trí sự thay đổi nồng độ enzyme C20032 68 16 3.1 Vòng phân giải các enzyme có trong chế phẩm C20032 70 10% 17 3.2 Vòng phân giải các enzyme có trong DNC T. harzianum 72 MT nuôi cấy lỏng iv
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 18 3.3 Vòng phân giải các enzyme có trong DNC T. harzianum 73 MT nuôi cấy rắn 19 3.4 Kết quả hoạt tính enzyme của DNC nấm T. harzianum và 74 chế phẩm C20032 10% 20 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase ở điều kiện 75 nhiệt độ và pH thay đổi. 21 3.6 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong 77 chế phẩm C20032 10% điều kiện pH5 22 3.7 Bảng kết quả % bào tử linh chi bị phá vỡ khi thay đổi tỉ 78 lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm C20032 10% 23 3.8 Bảng hoạt tính enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có 79 mặt trong hỗn hợp dịch thí nghiệm 24 3.9 Bảng tổng hợp tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay 81 đổi nồng độ chế phẩm C20032 25 3.10 Bảng hoạt tính enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có 82 mặt trong hỗn hợp dịch thí nghiệm có sự thay đổi nồng độ enzyme chế phẩm C20032 v
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi DANH MỤC HÌNH STT Hình Nội dung Trang 1 1.1 Xích chi Ganoderma lucidum 5 2 1.2 Thanh chi Ganoderma genus 6 3 1.3 Bạch chi Fomitopsis officinalis 6 4 1.4 Hoàng chi Laetiporus sulphureus 7 5 1.5 Hắc chi Polyporus melanopus 7 6 1.6 Tử chi Ganoderma sinense 8 7 1.7 Phân loại linh chi theo màu sắc 8 8 1.8 Hình thái giải phẫu thể quả nấm linh chi Ganoderma 13 lucidum 9 1.9 Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi 13 Ganodermataceae 10 1.10 Chu kì sống của nấm Linh chi 14 11 1.11 Cấu trúc không gian của 29 loại Triterpenoids trong bào 19 tử nấm Linh chi 12 1.12 29 Triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi 20 13 1.13 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi 28 trường thạch dịch chiết khoai tây PDA 14 1.14 Sợi nấm và cuống bào tử của T. harzianum 29 15 1.15 Cấu trúc chitin 31 16 1.16 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 32 17 1.17 Cấu tạo cellulose 34 18 1.18 Enzyme cellulolytic xâm nhập vách tế bào qua lỗ của 38 vách tế bào 19 1.19 Nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 42 Novozyme vi
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 20 1.20 pH hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme 42 21 2.1 Buồng đếm hồng cầu Neubauer 66 22 3.1 Biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy 74 T.harzianum MT nuôi cấy lỏng và MT nuôi cấy rắn 23 3.2 Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch 76 nuôi cấy nấm T. harzianum ở nhiệt độ và pH khác nhau 24 3.3 Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có trong chế 77 phẩm C20032 10% điều kiện pH5 25 3.4a Bào tử nấm Linh chi soi dưới kính hiển vi khi chưa bị 78 phá vỡ 26 3.4b Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ soi dưới kính hiển vi khi 78 thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp ở ngày thứ 4 27 3.5 Biểu đồ tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm linh chi khi thay 79 đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm C20032 10% 28 3.6 Biểu đồ tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm linh chi khi thay 82 đổi nồng độ chế phẩm C20032 29 3.7 Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi soi dưới kính hiển vi 83 ngày thứ 7 (NT1: 1DNC: 1EC10%) 30 3.8 Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi soi dưới kính hiển vi 83 ngày thứ 10 (NT1: 1DNC: 1EC10%) vii
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ STT Sơ đồ Nội dung Trang 1 2.1 Sơ đồ thực hiện thí nghiệm 50 2 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối 51 ưu của enzyme chitinase từ DNC nấm T. harzianum T2 3 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm 52 linh chi bằng enzyme DNC nấm T. harzianum T2 kết hợp chế phẩm EC 20032 4 2.4 Sơ đồ nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu 53 enzyme dịch nuôi cấy 5 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp 64 giữa DNC và chế phẩm C20032 10% 6 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi nồng độ enzyme chế 69 phẩm C20032 kết hợp với DNC nấm T. harzianum T2 7 4.1 Quy trình phá vỡ vách bào tử nấm linh chi bằng phương 86 pháp enzyme viii
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong y học cổ truyền phương Đông, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) là một loại dược phẩm quý, nó được sử dụng như một loại thượng dược trong các bài thuốc để điều trị một số căn bệnh cũng như bồi bổ sức khỏe. Tuy nhiên khi sử dụng nấm Linh chi trong việc điều trị người ta chỉ chú trọng đến việc phối hợp các vị trong bài thuốc và nấu chúng trong nhiều giờ để tách các hoạt chất mà không chú ý đến thành phần, các biện pháp tách chiết các hoạt chất sao cho tối ưu. Bên cạnh đó, Tây y hiện đại cho rằng thảo dược không được xem là một loại thuốc để chữa bệnh mà chỉ có thể được xem như một loại thực phẩm chức năng và nấm Linh chi cũng được xếp vào loại thảo dược thực phẩm chức năng. Ngày nay, nấm Linh chi được trồng khá phổ biển ở một số quốc gia như Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam cho nên việc sử dụng nấm Linh chi như một loại thực phẩm chức năng giúp hỗ trợ sức khỏe, tăng tuổi thọ, phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh ung bướu, tim mạch, huyết áp, tiểu đường Trong hai thập kỉ qua, các phương pháp phân tích khoa học hiện đại đã cho phép xác định được một số lượng lớn các hợp chất hóa học có trong quả thể, tơ và bào tử nấm Linh chi như: triterpenoid, steroid, polysaccharide, saponin, chất khoáng, vitamin, amino acid, phenol Trong đó Triterpenoid, polysaccharide được xem là thành phần chính có nhiều hoạt tính sinh học của nấm. Mặc dù có một lượng lớn các hoạt chất sinh học được tìm ra trong nấm Linh chi nhưng việc phân tích, chiết xuất các hoạt chất sinh học này đa số đuợc thực hiện trên quả thể và tơ nấm, có rất ít nghiên cứu thực hiện việc trích ly các hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi bởi bào tử được cấu tạo bởi lớp vách đôi rất bền vững nên làm giảm khả năng chiết xuất các chất. Do đó, việc nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi là giai đoạn quan trọng cho quá trình phân tích thành phần các chất có trong bào tử. Để góp phần nghiên cứu việc chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi, tôi đã tiến hành nghiên cứu phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 kết 1
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi hợp với enzyme thương mại Cellulase C20032 được trình bày trong đồ án tốt nghiệp “NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI” 2. Tình hình nghiên cứu Các công trình nghiên cứu thành phần các hợp chất có trong nấm Linh chi được thực hiện chủ yếu trên quả thể và tơ nấm. Hội nghị nấm học thế giới 7/1994 tại Vancouver (Canada) đã dành riêng một hội thảo về Linh chi, kết quả đã đi đến quyết định thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế đầu tiên về nấm Linh chi, đặt trụ sở tại New York (Hoa Kỳ). Do vậy, vào tháng 10/1994 Hội nghị Quốc tế đầu tiên về nấm Linh chi đã được tổ chức tại Bắc Kinh, Trung Quốc. Tại đây quan điểm về sự tồn tại độc lập của họ Linh chi Ganodermataceae Donk với tầm quan trọng là các nấm làm thuốc quý. Vào tháng 7/1996, Hội nghị Quốc tế về nấm học Châu á, lại dành một trong năm Hội thảo cho các báo cáo về Linh chi tại đại học Chiba, Nhật Bản. Tại mỗi Hội nghị số báo cáo rất lớn, thể hiện tầm quan trọng kinh tế và sự phong phú của nấm Linh chi. Vào thập niên 70 – 80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh chi. Chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và Việt Nam. Gần đây một số phòng thí nghiệm ở Hoa Kỳ và vùng Đông Nam á cũng bắt đầu tham gia vào tiến trình này. Năm 1988, Nhật Bản đã điều trị thành công bệnh nhược cơ bằng Linh chi theo nguyên tắc điều hoà miễn dịch. Bệnh viện Sơn Đông, Trung Quốc dùng “súp” Linh chi để giải độc và bổ gan có kết quả tốt, trong 70.000 ca trên 90% khỏi bệnh (Lui Xing Jia, 1994). Tác giả cho rằng nấm Linh chi có tác dụng tốt đối với đường tiết niệu, điều hoà rối loạn tuần hoàn não, tránh các cơn kịch phát nghẽn mạch và làm dịu thần kinh, Năm 2010, Chaiyavat Chaiyasut, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun đã công bố công trình nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi bằng quá trình lên men vi khuẩn Lactobacillus plantarum và bào tử nấm Linh chi. 3. Mục đích của đề tài Xây dựng quy trình phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi thu dịch chiết bào tử 2
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 4. Mục tiêu của đề tài Xây dựng quy trình phá vỡ vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp kết hợp enzyme chế phẩm thương mại và enzyme dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm linh chi. 5. Phương pháp nghiên cứu Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm Đề tài được xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Statisticals Analysis Systems (SAS) 6. Kết quả đạt được ban đầu Tìm ra được phương pháp phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp kết hợp chế phẩm thương mại và enzyme dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum Xác định được tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi trên một lượng nhất định. 7. Hạn chế của đề tài Tỷ lệ bào tử phá vỡ còn thấp làm hạn chế việc định lượng hoạt chất trong dịch trích ly sau phá vỡ cũng như hiệu suất trích ly hoạt chất. 3
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi Nấm Linh chi hay còn gọi là Linh chi thảo, nấm trường thọ, nấm lim, thuốc thần tiên, hạnh nhĩ Cách đây khoảng 2000 năm, nấm Linh chi đã được ghi trong sách “Thần nông bản thảo kinh”, tác phẩm chuyên tập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật từ đời Hán trở về trước . Xưa kia linh chi chỉ được khai thác trong thiên nhiên nên nó là loại thuốc quý, hiếm và rất đắt tiền. Từ đầu thế kỷ 17, nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở Trung Quốc, chính bởi chính giá trị dược liệu cao của chúng. Ngay từ thời Hoàng đế, trong các thư tịch cổ đã ghi chép về giá trị của Linh chi. Trong “Bản thảo cương mục”, các ghi chép đã chuẩn mực hơn, và nấm Linh Chi ngày càng được coi trọng. Cho nên, dễ hiểu là các nhà Đông y Việt Nam kế tục Lý Thời Trân, đã phát hiện ra Linh Chi ở nước ta và như Lê Quý Đôn đã chỉ rõ đó là “nguồn sản vật quý của đất rừng Đại Nam”. 1.1.1 Phân loại 1.1.1.1 Phân loại theo khoa học Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim (Ganodermataceae). Tên tiếng Anh là Varnished conk hay lingzhi. Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010) - Loài: Ganoderma lucidum - Chi: Ganoderma - Họ: Ganodermataceae - Bộ: Ganodermatales - Lớp phụ: Hymenomycetidae - Lớp: Hymenomycetes - Ngành phụ: Basidiomycotina - Ngành: Nấm thật – Eumycota - Giới: Nấm – Mycota hay Fungi Theo trình định danh, có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này. Kể từ lần đặt tên đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học Phần Lan xác 4
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst đã mất đến 100 năm (1881). 1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu sắc và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi. Xích chi: Còn được gọi với những cái tên khác như Linh chi đỏ hay đơn chi, hồng chi có vị đắng. Tên khoa học là Ganoderma lucidum. Xích chi giúp ích tâm khí, chủ vị, tăng trí tuệ. Sử dụng linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh các bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực. Hình 1.1 Xích chi – Ganoderma lucidum Thanh chi: Linh chi xanh hay long chi có màu xanh, vị chua. Tên khoa học là Ganoderma genus. Thanh chi giúp cho sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái. 5
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 1.2 Thanh chi Ganoderma genus Bạch chi: Linh chi trắng hay ngọc chi có màu trắng. Tên khoa học là Fomitopsis officinalis. Bạch chi có vị cay tính bình không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi. Hình 1.3 Bạch chi Fomitopsis officinalis Hoàng chi: Linh chi vàng hay kim chi, có vị ngọt, màu vàng. Tên khoa học là Laetiporus sulphureus. Linh chi vàng có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần. 6
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 1.4 Hoàng chi Laetiporus sulphureus Hắc chi: Linh chi đen hay huyền chi có màu đen và vị mặn. Tên khoa học là Polyporus melanopus. Hắc chi có tác dụng ích thận khí, khiến cho đầu óc sản khoái và tinh tường. Hình 1.5 Hắc chi Polyporus melanopus Tử chi: Linh chi tím hay Mộc chi, màu tím có vị ngọt. Tên khoa học là Ganoderma sinense. Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi đẹp. 7
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 1.6 Tử chi – Ganoderma sinense Gần đây khi đã tìm ra được phương pháp gây giống, những nhà khoa học Nhật Bản chứng minh được rằng những cây nấm có màu sắc khác nhau không phải vì khác loại mà chỉ vì môi trường và điều kiện sống khác nhau. Nếu thay đổi điều kiện người ta có thể có được sáu loại từ cùng một giống. Hình 1.7 Phân loại linh chi theo màu sắc 8
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Ngoài cách phân loại Linh chi theo màu sắc, người ta còn có thể phân loại linh chi theo các đặc điểm như:  Vị trí nấm mọc trên cơ chất chủ. - Nhóm mọc cao: tai nấm mọc từ gốc lên đến ngọn cây. - Nhóm mọc gần đất : nấm mọc từ gốc cây chủ. - Nhóm mọc từ đất : tai nấm mọc từ rễ cây hoặc xác mùn.  Nhiệt độ ra nấm. - Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 20oC – 23oC. - Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 24oC – 26oC. - Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 27oC – 30oC Do đó, có thể thấy rằng Linh chi không những đa dạng về chủng loại mà còn đa dạng về sinh thái, đây là loại nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N. 189). Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại, từ khi xác lập một chi riêng là Ganoderma Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến nhất là Ganoderma lucidum có tới 45 loại. Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công trong phòng thí nghiệm năm 1978. Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏ đặc sắc của các rừng cây Lim miền Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào nuôi trồng chủ động. 1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi Về hình thái ngoài, chúng cũng có ít nhiều sai khác 1.1.2.1 Cuống nấm Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi uốn khúc. Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen, bóng, không có lông phủ trên mặt tán nấm. 1.1.2.2 Mũ nấm Mũ nấm: khi non hình trứng, lớn dần hình quạt. Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia 9
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu đen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có đầu sợi dầy thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 - 10μm. Chính những tế bào vỏ này tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm. Lớp vỏ láng phủ suốt theo cuống. Kích thước tán biến động từ 2 – 30cm, dày 0,8 – 2,5cm, cuống dài từ 2,5 – 3,5cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2cm). phần đính cuống hoặc gồ lên hoặc lõm như lõm rốn. Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8cm màu vàng kem – nâu nhạt – trắng. Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ. Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh trong cồn. Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được mưa, nắng. Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử 1.1.2.3 Thụ tầng Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 – 1,7 cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5 ống/mm. Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, không màu, dài 16 - 22μm. Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpose) phồng căng hay lõm thụt vào mà thành. 1.1.2.4 Bào tử nấm Linh chi Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử, tức là hạt giống hữu ích cho đời sau. Bào tử đảm thường được mô tả có dạng trứng cụt. Đôi khi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn – nhọn. Thực ra đó là do chụp phủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành. Mỗi bào tử được bao phủ với hai lớp tường rất khó khăn gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999), màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kích thước bào tử rất nhỏ dao động ít nhiều khoảng từ 5-6 x 8,5 – 12 μm. Vỏ bào tử khá dày, cỡ 0,7 – 1,2 μm, có cấu trúc phức tạp. Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vỏ rất cứng, khó nảy mầm. Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi: Polysacharide, triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng, với 10
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi hàm lượng đậm đặc hơn Linh chi từ 7 – 20 lần (Nguyễn Thị Sáu, 2014). Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được phát hiện. Do những tiến bộ gần đây trong quang phổ hiện đại và kỹ thuật quang phổ, một loạt các triterpenoids được phân lập từ bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược sĩ. Từ năm 1988 các nhà khoa học đã phân lập được 29 triterpenoids bao gồm cả cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng. Bảng 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác nhau (Lê Xuân Thám, 1996) Nguồn Kích thước bào tử (µm) Vùng thu mẫu 1889 Patouuillard 10 – 12 x 6 – 8 Đông Dương 1939 Imazeki 9,5 – 11 x 5,5 – 7 Nhật Bản 1964 Teng 8,5 – 11,5 x 5 – 6,5 Trung Quốc 1972 Steyaert 8,5 – 10,8 – 13 x 5,5 – 8,5 Indonesia, Úc châu 1973Pegler et al 1976 9 – 13 x 6 – 8 Anh quốc Ryvarden 7 – 12 x 6 – 8 Bắc Âu, Phi châu 1980 Ryvarden et al 7 – 12 x 6 – 8 Đông Phi châu 1981 Kiet 7,5 – 10 x 5 – 6,5 Bắc Việt Nam 1982 Bazzalo et al 9 – 13 x 5 – 7 Argentine 1986 Melo 8,2 – 11,5 – 13,5 x 6,3 – 7,5 – 8,1 Bồ Đào Nha 1986 Gibertson et al 9 – 12 x 5,5 – 8 Bắc Mỹ 1986 Adaskaveg et al 10 – 11,8 x 6,8 – 7,8 Bắc Mỹ 1987 Petersen 7 – 8 x 6 – 7,8 Bắc Âu 1989 Zhao 9 – 11 x 6 – 7 Trung Quốc 1990 Hseu 8,5 – 11,5 x 5 – 7 Đài Loan 1994 Thu 9 – 12 x 5 – 7 Hà Bắc, Việt Nam 1994 Tham et al 8 – 10,5 x 5 – 7 Lạng Sơn Việt Nam 1996 Tham 7,5 – 11,5 x 5,5 – 7 Đà Lạt Việt Nam Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tử bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất 11
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi mịn. Tuy vậy số lượng bào tử linh chi rất ít. Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ thu được 1 kg bào tử. Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu tạo tinh vi của bào tử đảm thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt. Rõ ràng kiến tạo lỗ thủng trên bề mặt lớp vỏ ngoài là phổ biến. Lỗ nảy mầm hình tròn, khá lớn, là đặc điểm quan trọng phổ biến ở các loài Ganoderma (đường kính 3,2 – 4,2μm). Thuật ngữ “germpore” là tương đương định nghĩa “aperture” do Erdtman đưa ra (1952) – là chỉ vùng mà tại đó vỏ bào tử mỏng đi rất nhiều, nơi mầm sợi nấm nguyên thủy (hay mầm ống phấn trong trường hợp của tiểu bào tử ở thực vật) nhú ra khi nảy mầm (germination). Trên lớp vỏ ngoài thấy rõ các trụ chống – chính là khái niệm “gai chống” theo nhiều tác giả khác. Đỉnh các trụ nổi gồ thành các mụn cóc – gò hạt. Các trụ chống chính là tầng cột theo phân loại của G.Erdtman (1952) (columellae), các trụ đuợc nối với nhau bởi các vách mỏng chống từ tầng nền tới tầng phủ, chúng tạo thành các xoang rỗng của lớp ngoài, nhờ đó tạo khả năng bảo vệ cao cho vỏ bào tử. Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường cản quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học. Cấu trúc của lớp vỏ trong cho đến nay còn chưa được biết rõ. Cần lưu ý rằng: khái niệm “gai chống nhọn” từ màng trong đâm sát màng ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác. Thực chất các gai hay chính các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thành các u lồi – và chính các u lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium, exosporium hay chính là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt – mụn cóc – u nhú trên bề mặt vỏ bào tử. Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973), Mims et al (1989) đã từng phân tích và thảo luận nhiều. 12
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 1.8 Hình thái giải phẫu thể quả nấm linh chi Ganoderma lucidum Hình 1.9 Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi Ganodermataceae 1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử). 2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻ múi ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma). Bào tử nấm Linh chi chứa các vật liệu di truyền và các chất sinh học, nó có giá trị về dược phẩm lớn hơn quả thể, tuy nhiên hoạt chất trong bào tử nấm khó thu nhận, cho nên hầu hết các kết quả nghiên cứu về Linh chi được tiến hành bằng cách sử dụng quả thể. 13
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1.1.3 Chu kì sống của nấm Linh chi Hình 1.10 Chu kì sống của nấm Linh chi Bào tử đảm đơn bội, trong điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo nên hệ sợi sơ cấp (primary hyphae) - trong thực nghiệm tỷ lệ nảy mầm khá thấp ở nhiệt độ 28oC – 30oC chỉ đạt 3 – 15%. Hệ sợi sơ cấp đơn nhân, đơn bội mau chóng phát triển phối hợp với nhau tạo thành hệ sợi thứ cấp (tức hệ sợi song hạch), phát triển và phân nhánh rất mạnh tràn ngập khắp giá thể. Lúc này thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày - rất dày (gasterospores – Chlamydospores), chúng dễ dàng rụng ra và khi gặp điều kiện phù hợp sẽ nảy mầm cho ra hệ sợi song hạch tái sinh. Hệ sợi thứ cấp sẽ phát triển mạnh đạt đến giai đoạn cộng bào tức là các vách ngăn được hòa tan. Tiếp đó là giai đoạn sợi bện kết để chuẩn bị cho sự hình thành mầm móng thể quả (primordial). Đây chính là giai đoạn phân hóa hệ sợi. Từ hệ sợi nguyên thủy hình thành các sợi cứng màng dày, ít phân nhánh, bện kết lại thành các cấu trúc bó được cố kết bởi các sợi bện phân nhánh rất mạnh. Từ đó hình thành các mầm nấm màu trắng mịn vươn dài thành các trụ tròn mập. Phần đỉnh trụ bắt đầu xòe thành tán, trong lúc lớp vỏ láng đỏ cam xuất hiện. Tán lớn dần hình thành bào tầng và bắt đầu phát tán bào tử đảm liên tục cho đến khi nấm già sẫm màu, khô tóp và lụi dần trong 3 – 4 tháng. Nấm Linh Chi có thể mọc trên cây gỗ (thường là thuộc bộ đậu Fabales) sống hay đã chết. Quả thể gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5 – tháng 11), có thể trên thân cây (cuống thường ngắn), quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây (khi ấy cuống thường dài và có thể 14
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi phân nhánh). Nấm thường mọc tốt dưới bóng rợp, ánh sáng khuếch tán nhẹ. Do có lớp vỏ láng đỏ. Linh Chi có thể chịu nắng rọi – khi đó thường xuất hiện lớp phấn ánh xanh tím, có thể chịu mưa liên tục. Ở những vùng thấp rõ ràng là ưu thế của các chủng chịu nhiệt độ cao (28oC – 35oC) như ở vùng châu thổ sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long (quanh TP. Hồ Chí Minh). Ở vùng núi đồi vĩ độ cao (>1000m) thường có các chủng ôn hòa, thích hợp nhiệt độ thấp hơn (21oC – 26oC) – như vùng Đà lạt, Sapa, Tam Đảo, Tây Nguyên ở nước ta. Nếu theo các tư liệu cổ thì Linh Chi của vùng rừng sâu, núi cao được coi là linh thiêng quí giá. 1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi 1.1.4.1 Dinh dưỡng Nguồn carbon: nguồn carbon chủ yếu là đường glucose, saccharose, maltose, tinh bột, pectin, lignin, cellulose, hemicelluloses, từ đó chúng tổng hợp năng lượng và tạo thành các chất cần thiết. Nguồn nitơ hữu cơ: protein, pepton, acid amin, ngoài ra có thể hấp thu urê, muối amon, sulphate amon. Nitơ không được quá nhiều làm cho sợi nấm mọc nhiều khó hình thành quả thể. Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1. Giai đoạn hình thành thể quả, tỉ lệ là 30/1 hoặc 40/1. Nguyên tố vi lượng: Ca, P, Mg, K. nguồn vi lượng đó chỉ thêm trong quá trình nuôi cấy giống mẹ, còn khi trồng thì chúng có trong nước và nông sản phẩm. 1.1.4.2 Nhiệt độ Thích hợp nhất là 22 – 28oC. Khi nuôi cấy tầng sâu nhiệt độ thích hợp là 28oC không thấp hơn 27oC. Thông thường nhiệt độ thích hợp cho Linh chi phát triển là 24 – 28oC. Nhiệt độ không nên thay đổi lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát triển thành tán mà ở dạng sừng hươu, dạng đuôi gà. 1.1.4.3 Độ ẩm Hàm lượng nước môi trường thường là 65% là vừa, quá nhiều hoặc quá ít sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển sợi nấm. Độ ẩm không khí nên giữ ở 85 – 95%, nuôi cấy trong phòng cần giải quyết vấn đề về độ ẩm và thông thoáng gió. 1.1.4.5 Không khí 15
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Nấm Linh chi là loài hiếu khí vì vậy cần thông gió, giữ độ ẩm và nhiệt độ thích hợp. Khi nuôi cấy nấm trong tầng lỏng cần lắc 100 – 150 vòng/phút. Lắc mạnh dễ làm sợi nấm đứt đoạn. 1.1.4.6 Ánh sáng Nấm Linh chi cần ánh sáng tán xạ. Sợi nấm nuôi trong điều kiện ánh sáng từ 500 – 1200 lux. 1.1.4.7 Trị số pH pH của môi trường nuôi nấm Linh chi là 3 – 7,5, thích hợp nhất là 5 - 6. Trong môi trường lỏng là 4,5 – 5. Trong vật liệu trồng nấm điều chỉnh pH từ 5,8 – 6. 1.1.5 Thành phần dược tính của nấm Linh chi 1.1.5.1 Thành phần dược tính tổng quát Trong đề tài nghiên cứu năm 2005 của Nguyễn Minh Khang, thành phần dược tính của nấm Linh Chi được phân như sau: - Nước: 12 – 13% - Cellulose 54 – 56% - Lignin: 13 – 14% - Hợp chất nitơ 1,6 – 2,1% - Chất béo (kể cả dạng xà phòng hóa) : 1,9 – 2% - Hợp chất phenol 0,08 – 0,1% - Hợp chất Sterol toàn phần 0,11 – 0,16% - Saponin toàn phần 0,3 – 1,23% Theo Wachtel - Galor et al. (2011) trong nấm linh chi tươi, nước là thành phần chủ yếu chiếm 90% khối lượng. Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10 - 40%, chất béo chiếm từ 2 - 8%, carbonhydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lượng tro chiếm 8 - 10% cùng một số loại vitamin và khoáng chất khác như kali, can-xi, phốt pho, magne, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Borchers et al. (1999)). Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau et al. (2001) đã xác định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm linh chi gồm: tro (1,8%), 16
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 - 8%). Hàm lượng của protein trong nấm linh chi khoảng 7- 8%, thấp hơn so với nhiều loại nấm khác (Chang et al. (1996); Borchers et al. (1999)). Ngoài ra trong nấm còn chứa các glycoprotein và các polysaccharide. Bên cạnh đó, nấm linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học như các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của chúng. Hoạt tính sinh học của nấm linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide, peptidoglycan và các triterpen mang lại (Boh et al. (2007). 1.1.5.2 Triterpenoid Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có cấu trúc hóa học dựa trên cơ sở các phân tử isopren liên kết lại với nhau, công thức tổng quát (C5H8)n với n ≥ 2, tuy isopren là dẫn xuất của terpenoid nhưng pharnesyl pyrophosphate mới là chất liệu cơ bản để sinh tổng hợp terpenoid. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2010). Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lượng chất béo. Triterpene là một phân lớp của terpenoid được phân bố rộng rãi trong giới động vật, thực vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycosid. Cấu trúc hóa học của triterpen có thể là mạch hở 3, 4, hoặc 5 vòng với 33 khung sườn cacbon chính (Jose D. Connolly et al. (1991)). Khối lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato et al. (1997)); Zhou et al. (2007)). Trong nấm linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là chất tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis et al. (2002)). Trong quá trình chiết xuất triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng. Dịch chiết sau đó sẽ được phân tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường hoặc HPLC pha nghịch đảo (Chen et al. (1999); Su et al. (2001)). Những triterpene đầu tiên được Kubota phân tách từ nấm linh chi là ganoderic acid A và B (Kubota et al. (1982)). Kể từ khi đó, hơn 100 loại triterpene cùng với cấu hình của chúng đã được 17
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi tìm ra. Trong số đó, có hơn 50 loại là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong nấm linh chi. Đa số các triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có một số loại khác như là ganoderal, ganoderiol và ganodermic acid (Jiang et al. (2008)). Nấm linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần tạo nên vị đắng của nấm linh chi. Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể. Tuy nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm linh chi lại không ổn định. Chúng phụ thuộc rất nhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế biến, điều này đã được thể hiện trong một nghiên cứu của Chen và Su được tiến hành vào năm 1999 và 2001 (Chen et al. (1999); Su et al. (2001)). Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được tìm thấy từ quả thể của nấm Linh chi đại diện cho năm lớp cấu trúc chính. So với quả thể của nấm Linh chi, các nghiên cứu về bào tử của nấm Linh chi mới bắt đầu từ năm 1988 (Hou CY et al. (1988)), cho đến nay đã có 29 loại triterpenoids đã được tìm thấy trong bào tử này. Với những tiến bộ gần đây trong quang phổ và trắc phổ kỹ thuật hiện đại, một loạt các triterpenoids được phân lập từ các bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược sĩ. Tất cả các triterpenoids trong các bào tử của nấm Linh chi có quá trình tổng hợp tương tự nhau, cụ thể là con đường acid mevalonic (MVA) (Bingji Ma et al. (2011)). Các Triterpenoids này được bắt đầu từ trans - squalene và sau đó đã được thay đổi bởi quá trình oxy hóa, giảm, khử acid, tạo vòng, sắp xếp lại, tạo ra nhiều loại cấu hình triterpenoids trong bào tử của nấm Linh chi. Triterpenoids được cô lập từ bào tử Linh chi cho thấy khả năng kháng HIV-1 protease, chống khối u, và các hoạt động chống bổ sung. Triterpenoids này là thành phần hoạt chất chính của bào tử Linh chi và biểu thị cho các hoạt tính sinh học khác nhau được sử dụng trong dược liệu. 18
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 1.11 Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma et al. (2011)) 19
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 1.12 – 29 Triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma et al. (2011))  Triterpenoids được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi Năm triterpenoids đã được cô lập từ phần trong ether - tan của bào tử của nấm Linh chi và trên cơ sở tính chất hóa học và dữ liệu quang phổ, acid ganopsoreric A (1), acid ganoderic B (2), acid ganoderic C1 (3), acid ganoderic E (4) và 20
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi ganodermanontriol (5) được xác định tương ứng (Bingji Ma et al. (2011)). Thí nghiệm dược lý cho thấy acid ganopsoreric A có có hoạt tính GTP thấp đối với gan chuột bị tổn thương bởi CCl4 và GaNI (Chen RY et al. (1993)). Hai triterpenoids pentacyclic mới, có tên ganosporelactone A (6) và B (7) được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi, có thể được bắt nguồn từ khung lanostane thông qua việc hình thành liên kết C18 và C23 (Chen RY et al. (1991)). Hai triterpenes lanostane kiểu mới, lucidumol A (8) và β - acid ganoderic (9), cùng với một lucidumol B (10) và bảy triterpenoids đã biết, ganodermanondiol (11), ganoderiol F (12), acid ganoderic A (13), acid ganolucidic A (14), và 2, 3, 5. Trong số các hợp chất cô lập, các hợp chất 5, 10, 11 và 14 cho thấy khả năng kháng virus gây suy giảm miễn dịch (kháng HIV) - 1 protease hoạt động đáng kể với giá trị IC50 với giá trị 20 - 90 mM (Min BS et al. (1998)). Sáu triterpenes lanostane loại oxy hóa cao mới, được gọi là ganoderic acid γ (15), acid ganoderic δ (16), acid ganoderic ε (17), acid ganoderic ξ (18), acid ganoderic η (19), acid ganoderic θ (20), cùng với ganolucidic axit D (21) và axit ganoderic C2 (22) được phân lập từ các bào tử nấm. Các khả năng gây độc của các hợp chất 15-21 đã được thực hiện trong ống nghiệm chống Meth - A và LLC dòng tế bào ung thư (Min BS et al. (1998)). Một terpenoid C27 oxy hóa cao mới, lucidenic axit SP1 (23), được phân lập từ một phần CHCl3-tan của bào tử nấm Linh chi cùng với mười một triterpenoids, acid ganoderic C6 (24), acid ganoderic G (25), và 2, 3, 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14 1.1.5.3 Hợp chất saponin Saponin là một nhóm chất trao đổi thứ cấp quan trọng trong thế giới thực vật. Tên gọi của saponin bắt nguồn từ từ sapo trong tiếng latin, có nghĩa là xà phòng. Saponin có tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt. Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao, từ 200oC trở lên và có thể trên 300oC. Saponin bị tủa bởi chì acetate, hydroxide barium, sulphate amonium nên lợi dụng chất này để cô lập saponin. Về phương diện hóa học, saponin được xác định gồm các cấu trúc khác nhau: triterpenoids, glucosylated steroids steroidal alkaloids. 21
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Khả năng dược tính: trị long đờm, chữa ho, chất phụ gia cho một số vaccine, thông tiểu, kháng viêm, chống khối u. 1.1.5.4 Những thành phần khác Tiến hành phân tích thân nấm linh chi, người ta còn tìm thấy thành phần chất khoáng như phospho, silicon, sulfur, kali, calcium và magnesium chiếm một tỉ lệ khá cao. Bên cạnh đó còn có sắt, nhôm, kẽm, đồng, mangan và strontium với hàm lượng thấp hơn. Ngoài ra còn có một số kim loại nặng như chì, cadmium và thủy ngân (Chen et al. (1998)). Trong một nghiên cứu của Chiu được tiến hành vào năm 2000, khi phân tích nấm linh chi hoang thuộc loài Ganoderma spp, ông đã xác định được trong hàm lượng chất khoáng của loại nấm này có chứa 10,2% là kali, calcium và magnesium. Cũng trong một nghiên cứu khác thì Falandysz đã không tìm thấy cadmium và thủy ngân trong những mẫu nấm linh chi, nhưng hàm lượng selenium được xác định là 72 µg/g. Trong thành phần của nấm linh chi (Ganoderma spp) có một chất cũng nhận được rất nhiều sự quan tâm, đó là germanium. Đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5 trong các chất khoáng (489 µg/g) có trong nấm linh chi. Chất này tồn tại rất ít ở các loại thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm, lô hội và tỏi. Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu, nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch, kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến (Kolesnikova et al. (1997)). Những hợp chất khác cũng được tìm thấy trong nấm linh chi đó là các loại enzyme như metalloprotease (đây là loại enzyme có tác dụng trì hoãn quá trình đông máu). Ngoài ra, ergosterol (provitamin D2), các nucleoside và các nucleotide (như adenosine và guanosine) cũng đã được tìm thấy trong nấm linh chi, đây là những hợp chất có tác dụng ức chế thuận nghịch α-glucosidase và SKG-3. 1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi 1.1.6.1 Phòng ngừa ung thư Nấm linh chi được sử dụng phổ biến trong quá trình hỗ trợ điều trị ung thư nhằm giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho các bệnh nhân bên cạnh áp dụng những liệu pháp 22
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi chữa trị thông thường. Mặc dù hiện nay quá trình điều trị bệnh ung thư đã có những tiến bộ nhất định thông qua việc chẩn đoán bệnh sớm cũng như những phương pháp hoá trị hiện đại, tuy nhiên việc chữa dứt điểm các căn bệnh này vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn thử thách (theo WHO 2008). Trong quá trình tìm kiếm những phương pháp điều trị và những tác nhân hoá trị mới, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loài thực vật, trong đó có cả nấm linh chi, những hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặn quá trình hình thành khối u (Wasser et al. (1999); Borchers et al. (2008)). Trong nấm linh chi có một lượng lớn những hợp chất hoá học có thể được chiết xuất từ thân nấm, sợi nấm và bào tử. Trong đó, các polysaccharide và triterpene là 2 nhóm hợp chất chính trong nấm linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư và ngăn chặn quá trình hình thành khối u. Một trong những tác dụng mới được tìm thấy của dịch chiết nấm linh chi là có khả năng hỗ trợ điều trị cho các căn bệnh mãn tính, ví dụ như bệnh ung thư và bệnh liên quan đến gan (Bao X et al. (2005)). Những thí nghiệm trên động vật đã cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc ức chế sự hình thành và di căn của các tế bào ung thư. Tuy nhiên, việc tiến hành những thí nghiệm này trên cơ thể người vẫn còn hạn chế. 1.1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch Những tác nhân giúp làm tăng khả năng hoạt động của hệ miễn dịch cũng có tác dụng tăng cường sức khoẻ, qua đó giúp ngăn ngừa bệnh tật. Nhiều thành phần trong nấm linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào lympho, các bạch cầu đơn nhân, các tế bào NK (natural killer cells) (Bao et al. (2001); Cao et al. (2002)). Trong một nghiên cứu của Chang et al. (2009) được tiến hành trên chuột BALB/c cho thấy dịch chiết nấm linh chi chứa nhiều polysaccharide có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào spleno và hoạt tính của các đại thực bào và các tế bào NK. Trong một nghiên cứu khác của Wang et al. (1997), polysaccharide có trong nấm linh chi có tác dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lympho T và các đại thực bào, bằng cách làm tăng hàm lượng IL- 1β, TNF-α và IL-6. Cũng trong một nghiên cứu khác, quá trình ủ của các đại thực bào và các tế bào lympho T bằng các 23
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi polysaccharide đã cho thấy hàm lượng TNF- α và INF- γ tăng lên (Zhang et al. (1999)). 1.1.6.3 Khả năng chống oxy hóa Những hợp chất chống oxi hoá trong thực vật có tác dụng ngăn ngừa ung thư cũng như những căn bệnh nan y khác (Collins et al. (2005); Benzie et al. (2009)). Những hợp chất này có tác dụng bảo vệ các thành phần có trong màng tế bào chống lại những tổn thương do quá trình oxy hoá gây nên, qua đó giúp làm giảm những nguy cơ gây ra đột biến và ung thư cũng như góp phần bảo vệ các tế bào miễn dịch. Những hợp chất có trong nấm linh chi chủ yếu là các polysaccharide và các triterpene cũng có tác dụng chống lại quá trình oxy hoá tế bào (Lee et al. (2001); Lin et al. (2002); Shi et al. (2002); Wachtel-Galor et al. (2005)) 1.1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường Những thành phần của nấm linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường huyết đối với động vật. Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách từ thân nấm linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100 mg/kg, cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm và tác dụng hạ đường huyết vẫn tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ (Hikiko et al. (1985)). Cũng trong một thí nghiệm trên chuột, ganoderan B có tác dụng làm tăng lượng insulin, qua đó làm giảm hàm lượng glucose trong máu và điều chỉnh quá trình tổng hợp glucose dưới tác dụng của các enzyme có sẵn trong gan (Hikiko et al. (1989)). Trong một nghiên cứu khác cũng được tiến hành trên chuột, người ta đã chứng minh được rằng một polysaccharide khác có trong nấm linh chi được gọi là ganoderan C cũng có tác dụng hạ đường huyết (Hikiko et al. (1989)). 1.1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi Trong các nghiên cứu gần đây, bào tử của nấm Linh chi chứa một số hoạt chất sinh học phong phú hơn nhiều so với trong quả thể của chúng (Chaiyavat Chaiyasut et al, 2010). Tuy nhiên, với bào tử của nấm Linh chi được cấu tạo phức tạp với 2 lớp vách rất cứng và bền vững, hai lớp vách này có thành phần gồm silica (19,01%), canxi (19,01%) và chitin (52,08 - 57,64%) (Jungjing et al, 2007.) nên đã làm hạn chế rất 24
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi nhiều khả năng thu nhận các hoạt chất sinh học này. Daniel Sliva, Ph.D. et al., 2003 đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư vú trên chuột với các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi như: bào tử còn nguyên, bào tử bị phá vỡ, bột quả thể, dịch chiết của quả thể và bào tử với các nguồn cung cấp khác nhau và đã thu được kết quả như bảng 1.1.2 Bảng 1.2: So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2.5mg/mL) Tên Nguồn gốc Thành phần Khả năng ức chế tế bào ung thư a Trung Quốc Bào tử còn nguyên 89.3% Zihang b Trung Quốc Bào tử phá vỡ 71.9% Zhongke c Trung Quốc Bào tử còn nguyên 9.5% Jilin d Trung Quốc Bột quả thể 54.3% Two Urn e Đài Loan Bột quả thể 86.5% Double Crane f Mỹ Dịch chiết quả thể 99% ReishiMax và bào tử Từ những nhận định và kết quả thí nghiệm nêu trên cho ta thấy việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi nhằm tăng khả năng dược liệu của nó cần được quan tâm. Trong những năm gần đây đã có nhiều sáng chế tiết lộ phương pháp phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi. Ví dụ: patent JP52041208 tiết lộ quá trình chiết xuất các thành phần sinh học của bào tử bằng phương pháp sử dụng biện pháp cơ học, JP2240026A tiết lộ việc sử dụng các dung môi để phá vỡ, CN1165032 tiết lộ phương pháp phá vỡ bằng cách sử dụng enzyme hòa tan như lysozyme, cellulose và hemicellulase, lạnh đông và dùng sóng 25
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi siêu âm. Hay theo patent CN 101596220 A của Trung Quốc, bào tử nấm Linh chi được phá vỡ bằng một số phương pháp sinh học như: sử dụng enzyme hòa tan để thủy phân vách bào tử hay sử dụng một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lớp vách này nhằm tăng cường hiệu quả sử dụng các hoạt chất sinh học có trong bào tử mà chi phí thấp và hiệu quả tương đối cao. Cũng theo patent này ngoài biện pháp sinh học để phá hủy lớp vách của bào tử, còn có thể sử dụng một số biện pháp hóa học như dùng dung dịch có tính acid hay kiềm để làm bào mòn lớp vách, tuy nhiên, với phương pháp hóa học này sẽ làm ảnh hưởng đáng kể khả năng hoạt động của các hoạt chất sinh học có trong bào tử và dư lượng của các loại hóa chất dùng cho quá trình phá vách bào tử có thể làm ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như sức khỏe. Ngoài ra, một số biện pháp vật lý: sóng siêu âm, vi sóng, nhiệt độ thấp, lạnh đông cũng được sử dụng nhưng nhìn chung khả năng làm suy yếu lớp vách của bào tử còn thấp và chi phí đầu tư cao. Trong một nghiên cứu khác của Chaiyavat Chaiyasut, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun năm 2010 ở Thái Lan, bào tử của nấm Linh chi được phá vỡ bằng cách lên men với Lactobacillus plantarum với kỹ thuật rất đơn giản, ít chi phí. Nó có thể được sử dụng để sản xuất các loại thực phẩm lên men với các lợi ích từ bào tử nấm Linh chi và vi khuẩn lên men lactic. Trong đồ án này, tôi đã thực hiện phá vỡ bằng phương pháp lạnh đông bào tử nấm Linh chi kết hợp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 là nấm mốc kí sinh trên nấm Linh chi cùng với chế phẩm enzyme Cellulase C32002 của Novozyme để phá vách bào tử nấm Linh chi. 26
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma Trichoderma là chi nấm khá phổ biến trong tự nhiên, tuy nhiên hệ thống phân loại của chúng chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến khác nhau đưa ra khi phân loại giống nấm này. Trichoderma là một chi nấm hiện diện trong đất, chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác ), nhiều loài trong chi này có khả năng sống cộng sinh với cây. Có thể nói Trichoderma là một trong số những loài vi nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Chúng được tìm thấy ở khắp nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Nấm Trichoderma phổ biến ở những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, chúng hiện diện trên rễ cây, trong đất hay xác sinh vật đã chết, xác bã hữu cơ hay kí sinh trên các loài nấm khác. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau sẽ yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Harman, 2000). 1.2.1 Phân loại - Giới (Kingdom): Nấm (Fungi) - Ngành (Phylum): Nấm túi (Ascomycota) - Lớp (Class): Sordariomycetes - Phân lớp (Subclass): Hypocreomycetidae - Bộ (Order): Hypocreales - Họ (Family): Hypocreaceae - Chi (Genus): Trichoderma - Loài (Species) : Trichoderma spp. 1.2.2 Lịch sử phát triển Chủng nấm Trichoderma được phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794, vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài: 1- Trichoderma caesium Pers. (1794). 2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794). 3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794). Cho đến năm 1801, Persoon và Gray đã mô tả chi tiết được 7 loài nấm Trichoderma đó là: 27
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1- Trichoderma caesium Pers. (1794). 2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794). 3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794). 4- Trichoderma aureum Pers. (1796). 5- Trichoderma laeve Pers. (1796). 6- Trichoderma dubium Pers. (1801). 7- Trichoderma fuliginoides Pers. (1801). Trong suốt 2 thế kỷ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện thêm khoảng 90 loài. Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới. Cho đến năm 2013, đã có trên 150 loài nấm Trichoderma được mô tả. 1.2.3 Đặc điểm chung của Trichoderma 1.2.3.1 Đặc điểm hình thái Hình 1.13 – Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường thạch dịch chiết khoai tây (PDA) Chủng nấm Trichoderma spp. thuộc nhóm nấm bất toàn (là những nấm sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành 28
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử), có khuẩn lạc màu lục khi tăng trưởng có sự hiện diện của ánh sáng mặt trời. Sợi nấm của Trichoderma phân nhánh mạnh, thường hình thành ở dạng gần như vòng tròn đồng tâm. Các sợi nấm thường mọc tạo góc với trục chính khoảng 90 độ. Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu và liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Hình 1.14 – Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum Bào tử của nấm Trichoderma mịn, trơn láng có màu xanh lá cây hoặc màu vàng. Bào tử của hầu hết các loài có hình elip, 3-5 x 2-4 µm (L/W=1.3), bào tử hình cầu (L/W<1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài. 1.2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là monosaccharide, disaccharide, polysaccharide NH3 là nguồn đạm mà nấm Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên thường có mặt trong môi trường nuôi cấy loài nấm này, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiều dinh dưỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng 29
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi của Trichoderma. Nhưng muối NaCl sẽ làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một số loài Trichoderma, do đó trong môi trường nuôi cấy không nên có sự có mặt của NaCl. Nồng độ CO2 cũng ảnh hưởng phần nào đến sự sinh trưởng của Trichoderma. Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300C, có một vài loài Trichoderma tăng trưởng được ở 350C. Một số ít phát triển tốt ở 400C (Samuels, 2000). Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5 - 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5, phát triển tốt ở pH trung tính. Các chủng Trichoderma có tốc độ tăng trưởng nhanh, đường kính khuẩn lạc đạt trung bình 2 cm – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy (Bùi Xuân Đồng, 1982). Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau. Ví dụ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu ấm áp. Phần lớn các loài Trichoderma có tính cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện môi trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn hay bào tử xuất hiện trong điều kiện sáng. Bào tử trên môi trường thạch agar dưới ánh sáng 85 Lux trong 20 - 30 giây sẽ làm tăng hiệu quả nẩy mầm. Đối với thể bào tử phialiconidio cảm ứng với ánh sáng nhất, chúng sẽ xuất hiện nhiều dưới ánh sáng ban ngày trong khoảng 3 phút hoặc dưới tia cực tím ở 10 - 30 giây. Một số tác giả đã công bố Trichoderma hình thành bào tử nhiều nhất ở bước sóng từ 380 nm - 440 nm, và không hình thành bào tử ở bước sóng dưới 254 nm và trên 1100 nm. Các bào tử cảm quang bị hạn chế phát triển dưới sự có mặt của các hóa chất như: azaguanine, 5-fluorouracil, actiomycin D, Cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidum bromide, các hóa chất này sẽ ngăn chặn sự hình thành của các hậu mô bào tử, đây là một cấu trúc rất đặc biệt, có tiềm năng trong phòng trừ sinh học. T. hamatum, T. hazianum, T. viride và T. virens ở trong cả môi trường lỏng và rắn có acide thích hợp cho sự nảy mầm bào tử hơn là môi trường trung tính. 30
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1.2.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma Weidling là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma. Weidling và Emerson đã phân lập được chất độc kết tinh từ sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma, đó là: gliotoxin (C13H14N2S2O4). Chất độc thứ hai do Brian và Mc. Growan công bố là virindin (C9H16O6), được sản xuất từ T. viride. Dennis và Webstre ghi nhận Trichoderma spp. còn sinh tổng hợp một sản phẩm trao đổi chất khác gliotoxin và virindin, đó là kháng sinh: trichlorofore từ T. viride và T. polysporum, kháng sinh peptide từ T. harzianum. Bên cạnh sản phẩm trao đổi chất là chất độc và kháng sinh, Trichoderma còn sinh tổng hợp được một số các enzyme có hoạt tính sinh học mạnh như: exo và endoglucanase, cellobiose và chitinase. 1.2.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh tổng hợp Trichoderma spp. có thể sinh tổng hợp đuộc nhiều loại enzyme ngoại bào như chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulase, protease để phân hủy nguồn xác bã thực vật và vách tế bào nấm bệnh trong đời sống hoại sinh và ký sinh của chúng. Sau đây là một số hệ enzyme điển hình 1.2.4.1 Hệ enzyme chitinase Chitin là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết cấu trúc polymer ở nấm và côn trùng, có công thức hóa học [C8H13NO5]n Hình 1.15 – Cấu trúc chitin Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên chitin là chất hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn bộ cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật. 31
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, cồn, dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc) hoặc bằng enzyme vi sinh vật. Chitinase là enzyme thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của 2 đơn vị β – 1,4 – N – acetyl glucosamine (GlcNac). Hệ enzyme chitinase được phân làm 3 lớp (Sahai và Manocha, (1993)) 1. Chitobiosidase: enzyme này giải phóng đơn vị diacetyl chitobiose 2. Endochitinase: phân cắt liên kết bên trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kì, phóng thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacetyl chitobiose. Endochitinase có vai trò quan trọng trong quá trình ký sinh nấm. 3. β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase phân cắt chitotetraose, chitotriose, diacetylchitobiose thành GlcNac monomer Glucosamin là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có nhóm amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của nhóm amino. Hình 1.16 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 32
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Người ta đã tinh chế được rất nhiều chitinase, trong đó phổ biến nhất là endochitinase có kích thước 42 kDa, sau đó là N – acetyl – β – D – glucosaminidase có kích thước 70 – 73 kDa. Ngoài ra còn có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz et al, (1992)), chitobiosidase 40 kDa, enzyme này có thể hoạt động một mình hoặc kết hợp với enzyme endochitinase 42 kDa (Harman et al, (1993)), exochitinase 28 kDa (Deane et al,(1998)) và β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase 102 kDa có vai trò duy nhất trong việc gây biểu hiện các enzyme thủy phân chitin khác nhưng chưa tinh chế được (Harman et al, (1995)). Chitinase ở Trichoderma spp. được xem là enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh, hoạt động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzyme khác như β – glucanase, sự phối hợp giữa hai enzyme này làm tăng hiệu quả hoạt động thủy phân. Mặt khác, theo báo cáo của Lorito (1994) cho biết, có sự phối hợp tác động lên màng tế bào giữa enzyme thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như chất tổng hợp. 1.2.4.2 Hệ enzyme β – glucanase β – glucan trong vách tế bào nấm thường ở dạng β – 1,3 – glucan và nhánh là dạng β– 1,6 – glucan. β – glucanase cũng là một enzyme quan trọng của Trichoderma spp. trong đời sống hoại sinh và ký sinh nấm, gồm 2 lớp enzyme chính: β-1,3-glucanase và β-1,6-glucanase  β-1,3– glucanase: enzyme phân cắt liên kết o – glycosidic của β-1,3– glucan nhờ 2 cơ chế 1. Exo-β-1,3– glucanase phân cắt giải phóng glucose ở cuối chuỗi liên kết polymer 2. Endo-β-1,3– glucanase cắt liên kết β ở vị trí bất kì trong chuỗi polysaccharide, giải phóng oligosaccharide. Trichoderma spp. phân giải β-1,3– glucan thường kết hợp giữa 2 hoạt tính exo và endo- β-1,3– glucanase, β-1,3– glucanase có vai trò chính trong quá trình hoại sinh và ký sinh nấm, ngoài ra β-1,3– glucanase giúp thực vật chống lại mầm bệnh. Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo vách tế bào của các loài nấm khác nhau, Trichoderma spp. tiết β– glucanase ở các mức độ khác nhau. Lorito năm 1994 đã tách 33
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi chiết in vitro được một endo - β-1,3– glucanase 78 kDa có khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử B.cinerea khi phối hợp với một GlcNAcase. Ở một số chủng khác như T. harzianum T – 24, El-Katatny (2001) đã tách chiết được một endo- β-1,3– glucanase có kích thước tương tự, có khả năng ức chế sự phát triển của Sclerotium rolfsii khi kết hợp với một endochitinase 43 kDa. Lorito (1995) đã tạo dòng gen của β-1,6– endoglucanase kích thước 43 kDa, có thể ức chế sự phát triển của nhiều nấm bệnh khi phối hợp với các enzyme thủy phân khác.  β-1,6– glucanase: trong điều kiện đặc biệt, Trichoderma spp. tiết β-1,6– glucanase, enzyme này phân cắt liên kết β-1,6– glucan trong vách tế bào nấm. 1.2.4.3 Hệ enzyme cellulase Hình 1.17 Cấu tạo cellulose Cellulose là chất trùng hợp với tiểu đơn vị là D – glucose nối nhau bởi liên kết β – 1,4 – glycosidic, cellulose được sử dụng như một nguồn năng lượng carbon ở rất nhiều vi sinh vật tiết ra cellulase. Hệ enzyme cellulase ở Trichoderma spp. được phân thành 3 lớp: 1. Exo β-1,4-D-glucanase (cellobiohydrolase) hay C1 giải phóng đơn vị cellobiosyl từ chuỗi cellulose 2. Endo β-1,4-D-glucanase hay Cx phân cắt liên kết glucosidic bên trong cấu trúc cellulose. 3. β-1,4-D- glucosidase phân cắt cello – oligosaccharide thành glucose khử. Quá trình thủy phân cellulose có sự phối hợp của ít nhất là hai enzyme cellobiohydrolase, hai enzyme endoglucanase và một enzyme β-glucosidase (Hui et 34
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi al, (2001)). T reesei RUT C30 được biết là chủng có khả năng tạo nhiều cellulase, T. harzianum T3 cũng là một chủng rất hiệu quả trong việc tạo ra nhiều loại cellulase. 1.2.4.4 Hệ enzyme protease Theo Delgado và Janara (2000) khi khảo sát trên T. harzianum đã xác định nhiều loại protease khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, trong môi trường có pH thấp và bổ sung chitin, glucose, amon T. harzianum tiết protease acid làm tác nhân điều hòa, đáp ứng nhu cầu phân hủy những protein ngoại bào như chitinase, glucanase, cellulase. Ngược lại protease có tính base hoặc trung tính được T. harzianum sinh ra trong môi trường có nguồn carbon khó bị phân hủy như vách tế bào nấm. Theo Haab (1990) đã tách chiết được một protease acid 42 kDa không nhạy cảm với pepsatin có liên quan đến sự giảm sút enzyme cellulase từ T.reesei QM 9414 trong điều kiện tạo cellulase. Một nghiên cứu khác của Dunaevesky và cộng sự (2000) đã tách chiết được một protease 73 kDa thuộc nhóm protease serin khi nuôi cấy T. harzianum. Protease của Trichoderma spp. có tác dụng thủy phân protein vốn là một phần của bộ khung vách tế bào. 35
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Bảng 1.3 Một số loại enzyme thủy phân của Trichoderma harzianum Gen Hoạt tính Giống Tài liệu tham khảo Chitinase exc2 73 N- TM Haran et al (1995) excl/nagl 73 acetylglucosaminidase T25-1 Draborg et al - 64-69 T25-1, P1a (1995) - 28 T189 Peterbauer et al ech42 52 N- TM, TY (1996) chit42 42 acetylglucosaminidase IMI206040a Deane et al (1998) cht42 44 Endochitinase CECT 2413 Haran et al (1995) ThEn42 42 Endochitinase Gv2908 Carsolio et al - 42 O1a (1994) - 40 P1a Garcia et al (1994) chit36 37 CECT 2413 Back et al (1990) chit33 36 Chitobiosidase 109 Lorito et al (1998) - 33 Endochitinase TM Harman et al - 31 Endochitinase CECT 2413 (1993) - Endochitinase TM, TY Cruz et al (1992) - Endochitinase Viterbo et al (2001) Haran et al (1995) Glucanase bgn13.1 78 β-1,3-endoglucanase P1a, CECT Cruz et al (1992) - 74 2413 El Katatny et al - 36 β-1,3-endoglucanase T24 (2001) - 17 β-1,3-endoglucanase 39.1 b16-2 43 β-1,6-endoglucanase CECT 2413 Lorito et al (1998) lam1.3 110 β-1,3-exoglucanase CECT 2413 Lora et al (1995) - 75 β-1,3-exoglucanase T – Y Cohen – Kupiec et al (1999) 1.3 Giới thiệu về enzyme phá vách tế bào Enzyme là protein trong tế bào, chúng được hình thành bởi các chuỗi đặc biệt của các axit amin mà kết hợp với nhau trong hình dạng khác nhau để làm các công việc đặc biệt như phá vỡ tạo thành đường và các phân tử chất béo, giải phóng hợp chất cao 36
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi phân tử bên trong tế bào hoặc làm ra nhiều enzyme hơn. Các enzyme khác nhau có chức năng riêng, việc ứng dụng chức năng của từng loại enzyme có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học. Ngay trong các tế bào vi khuẩn nhỏ nhất có thể có khoảng 1000 loại enzyme làm việc. Việc nghiên cứu ứng dụng các enzyme này có ý nghĩa thực tiễn với sự phát triển của khoa học đời sống, ứng dụng vào nhiều mặt kinh tế xã hội. Hiện nay trên thị trường Việt Nam có nhiều loại chế phẩm enzyme thương mại ứng dụng trên nhiều lĩnh vực. Ngành công nghiệp enzyme rất cần thiết cho các ngành công nghệ thực phẩm, nước giải khát, trong phân tích y học và trong công nghiệp, ngày nay chúng được thêm vào bột giặt để tăng hiệu quả giặt tẩy Chế phẩm enzyme thương mại thường được tổng hợp bởi thực vật, động vật, vi sinh vật hoặc nuôi cấy mô động, thực vật nhưng hiện nay đa số các enzyme thường được tổng hợp nhờ quá trình lên men vi sinh vật ở quy mô công nghiệp nhờ giá thành rẻ, hoạt tính cao, chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, có thể dễ dàng điều khiển sinh tổng hợp enzyme theo chiều hướng có lợi theo nhu cầu vì vi vật có khả năng cảm ứng với môi trường nuôi cấy rất nhanh. 1.3.1 . Enzyme phá vách tế bào thực vật Vách tế bào thực vật được cấu tạo bởi vách cellulose bao phủ bề mặt màng nguyên sinh chất và không bào, bảo vệ các thành phần bên trong của tế bào. Hệ thống vách tế bào có mối tương quan sinh lý chặt chẽ tạo ra một hệ thống thẩm thấu có hiệu lực, vách tế bào dày lên đảm bảo cho sự cứng rắn, thực hiện được chức năng năng nâng đỡ. Ngoài ra vách tế bào còn giữ vai trò trong một số hoạt động hấp thu, thoát hơi nước, di chuyển và tiết. Trong quá trình hình thành vách, có nhiều thành phần hóa học khác nhau tham gia cấu tạo nên vách tế bào, những thành phần đó là cơ chất không định hình (matrix) có nhiều trong màng sơ cấp như pectin, hemicellulose làm chất xây dựng bộ khung sườn của vách, những chất này sắp xếp trong mạng tinh thể có dạng sợi. Cellulose là chất cơ sở chủ yếu để cấu trúc nên bộ khung sườn nằm trong cơ chất của vách. Vì vậy, đối với một số enzyme phá vách tế bào thực vật, cellulose đóng vai trò là cơ chất của quá trình thủy phân phá vách. 37
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Enzyme cellulolytic phân hủy cellulose, polymer cellulose chính là thành phần quan trọng của màng tế bào thực vật. Nhiều vi khuẩn sản xuất phức hợp enzyme cellulolytic gọi là cellulosomes, các enzyme cellulolytic được nấm tiết ra được gọi là cellulase. Hình 1.18 Enzyme cellulolytic xâm nhập vách tế bào qua lỗ của vách tế bào Dựa vào nghiên cứu của Ding và cộng sự (2013) sử dụng kính hiển vi nanomette vi mô cho thấy các enzyme phá vách tế bào từ nấm và vi khuẩn xâm nhập vào vách tế bào qua cấu trúc lỗ của vách, các enzyme này sử dụng cơ chất cellulose biến đổi thành đường. Nhờ các enzyme ứng dụng tiềm năng này làm cơ sở cho sản xuất các sản phẩm giá trị cao như ethanol hay axit hữu cơ từ các nguồn cellulose tái tạo rẻ tiền. Những tiến bộ nhanh chóng trong nghiên cứu cellulosomes đang cung cấp thông tin 38
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi cơ bản cho sự phát triển nghiên cứu của cả in vitro và in vivo một cách hệ thống để nghiên cứu về các phương pháp phá vách tế bào ứng dụng trong công nghiệp. Trên thị trường Việt Nam, để phá vách tế bào chỉ có các chế phẩm enzyme cellulase công nghiệp có nguồn gốc từ Aspergillus spp. hoặc từ Trichoderma spp. Ứng dụng của các chế phẩm này thường được dùng để sản xuất ethanol công nghiệp hoặc axit hữu cơ công nghiệp. Mặc dù một số lượng lớn các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase, tuy nhiên vi sinh vật của chủng Trichoderma và Aspergillus được sử dụng nhiều trong sản xuất công nghiệp bởi hoạt tính mạnh chi phí sản xuất thấp, hiệu quả thu hồi cao. Một số hãng sản xuất cũng đã ứng dụng hai chủng nấm trên để sản xuất enzyme thương mại cung cấp cho thị trường. 39
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Bảng 1.4 Một số enzyme thương mại và thành phần enzyme trong chế phẩm Tên enzyme Chủng vi sinh vật Enzyme hoạt động Hãng sản xuất Lysing Trichoderma Cellulase Sigma Poole UK Enzyme harzianum Protease Cat No L2265 Chitinase Lysing Trichoderma β-glucanase InterSpex Enzyme harzianum Cellulase Foster City USA Protease Cat No 0412 - 1 Chitinase Kitalase Rhizoctonia solani β-glucanase ICN FLOW Protease High Wycombe UK Pectinase Cat No 153527 Amylase Lysing Trichoderma Cellulase ICN FLOW Enzyme harzianum Protease High Wycombe UK Xylanase Cat No 152338 Chitinase Glucanex Trichoderma spp β-glucanase Novo Nordisk Ferment Ltd Neumatt CH Cat No 367 - 5106 Các enzyme cellulase thương mại được áp dụng để tăng chất lượng sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc. Các nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc thực vật nếu được gia công bằng chế phẩm cellulase sẽ mềm ra, làm tăng hệ số đồng hóa và chất lượng sản phẩm được tăng lên. Enzyme cellulase thương mại cũng làm tăng hiệu suất trích 40
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi ly các chất khác nhau từ nguyên liệu thực vật như trà, cà phê, đậu nành Enzyme cũng làm thủy phân các nguyên liệu gỗ, phế liệu gỗ cho công nghiệp sản xuất giấy, ethanol 1.3.2 Enzyme Cellulase C20032 Chế phẩm enzyme cellulase C20032 là sản phẩm thương mại của Novo Nordisk. Sản phẩm ngoài enzyme cellulase là chủ yếu còn có hệ enzyme chitinase, protease, β- glucanase. Hệ enzyme của C20032 được coi là phù hợp để nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi bởi hệ enzyme trong chế phẩm nhìn chung có thể đáp ứng được khả năng phá cấu trúc vách chitin đôi của bào tử đảm nấm Linh chi. Bảng 1.5 Thông tin chế phẩm enzyme cellulase C20032 của Novozyme Chế phẩm Nhiệt độ tối ưu pH tối ưu Tính năng, ưu điểm C20032 45oC – 50oC 5 – 5,5 Cải thiện quá trình thủy phân cellulose khi kết hợp với CTec2. Hỗ trợ trong trường hợp tiền xử lý acid nhẹ hoặc kiềm. Chuyển đổi hemicellulose để đường lên men Hiệu quả ở nồng độ chất rắn cao. Tương thích với nhiều nguyên liệu Nồng độ cao và ổn định Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk 41
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 1.19 Nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk Hình 1.20. pH hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk 42
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Việc sử dụng enzyme cellulase C20032 của Novozyme vào ứng dụng phá vách tế bào bào tử nấm linh chi phụ thuộc nhiều vào hệ enzyme tìm thấy trong chế phẩm. Ngoài cellulase, các enzyme trong chế phẩm nghiên cứu còn cho thấy có sự xuất hiện của β-glucanase, protease, chitinase. 43
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất 2.1.1 Vật liệu  Mẫu thí nghiệm - Bào tử nấm Linh chi được thu thập từ các trại nấm trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh được cung cấp bởi Th.S Nguyễn Thị Ngọc Yến. Rây bào tử để loại bỏ một số tạp chất. Sấy ở nhiệt độ 40oC. Bảo quản trong điều kiện khô ráo. - Giống nấm Trichoderma harzianum T2 được phân lập từ nấm Linh chi trong đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu (10DSH), nhận từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH Công Nghệ Tp. HCM, cơ sở 1, 475A Điện Biên Phủ, P. 25, Q.Bình Thạnh, Tp.HCM. 2.1.2 Nơi tiến hành Thí nghiệm được thực hiện tại trung tâm thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH Công nghệ TP. HCM, cơ sở 475A, Điện Biên Phủ, P.25, Q. Bình Thạnh, TP.HCM 2.1.3 Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ 10/03/2016 đến 15/06/2016 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 2.1.4.1 Thiết bị - Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh - Kính hiển vi quang học - Autoclave - Máy ly tâm - Máy đo pH - Cân phân tích - Cân điện tử - Bếp từ - Máy nước cất - Bể điều nhiệt 44
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi - Máy lắc - Máy đo quang phổ UV 2.1.4.2 Dụng cụ - Erlen 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml, 2000ml - Cốc thủy tinh 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml - Cốc sứ - Ống đong 50ml, 100ml - Đĩa peti - Pipette thủy tinh 5ml, 10ml - Micropipette 100µl, 1000µl – đầu tuýp tương ứng - Ống ly tâm 50ml - Ống nghiệm - Đũa thủy tinh - Bông thấm nước, bông không thấm nước - Bao nylon hấp, giấy báo, dây thun 2.1.5 Hóa chất – Môi trường sử dụng 2.1.5.1 Hóa chất - Dầu soi kính hiển vi - Tween 80 - β – glucan (30% w/w) - Thuốc thử Lugol + Iodine 1g + KI 2g + Nước cất 300 ml Hòa tan rồi giữ trong lọ tối màu - Bovine serum albumin (BSA) 0,1 mg/ml: Cân chính xác 10 mg albumin pha trong 100 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 20oC. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml. - Dung dịch thuốc thử Bradford: 45
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi +Coomassie Brilliant Blue G – 250: 0,01g + Ethanol tuyệt đối 4,7g + Acid phosphoric 85%: 8,5g Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. - HCl 0,2N - Đệm phosphate pH 7 (0,05M) - Dung dịch casein 1%: hòa tan 1g casein vào 90 ml dung dịch đệm phosphate 0,05M. Đun tan casein, sau đó điều chỉnh pH bằng HCl 1N hoặc NaOH tới pH=7. Chuyển sang bình định mức 100ml và bổ sung dung dịch đệm phosphate tới vạch - Na2CO3 6%: hòa tan 6g Na2CO3 trong nước cất, định mức tới 100ml - Dung dịch Trichloacetic acid (TCA) 5%: Hòa tan 5g TCA trong nước cất, định mức tới 100ml, lắc đều - Dung dịch tyrosine 1mM (1µmol/ml): cân 181,19 mg/ml tyrosine tinh khiết hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N và chuyển sang bình định mức 100ml, định mức tới vạch ta thu được dung dịch gốc 10mM. Khi sử dụng pha loãng dung dịch gốc 10 lần bằng HCl 0,2N được dung dịch tyrosine 1mM - Thuốc thử Folin – Ciocalteu (gọi tắt là FC): pha loãng 5 lần bằng nước cất: 1 thể tích FC gốc + 4 thể tích H2O) - Đệm Natri acetate 0,05M - Dung dịch Sodium carboxymethyl cellulose (CMC) 1% w/v CMC: cân chính xác 10g CMC, hòa tan trong đệm Natri acetate 0,05M - Dung dịch acid – 2 – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic (DNS): cân 20g DNS cho vào beaker 2000 ml, thêm khoảng 800 ml nước cất. Đặt beaker vào chậu nước 80oC khuấy đều; hòa tan 32g NaOH với 300 ml nước cất, thêm dung dịch NaOH này từ từ vào dung dịch DNS, khuấy nhiệt ở 80oC. Tiếp tục thêm 600g potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy. Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình 46
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi định mức 2000 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai tối màu. - Dung dịch lactose: hòa tan 0.12g lactose monohydrate với 80 ml nước cất, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều. - Dung dịch DNS – lactose: trộn đều 150ml DNS với 50ml dung dịch lactose. - Dịch cơ chất β – D – glucan 1%: cân chính xác 3,334g β – D – glucan hòa trong 50 ml đệm Natri acetate 0,05M pH5, chuyển vào bình định mức 100ml, bổ sung đệm đến vạch. - Dung dịch Mononatri orthophosphate 0,2M: hòa tan 27,8g NaH2PO4 và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M: hòa tan 53,05g Na2HPO4.7H2O và định mức đến 1000 ml - Dung dịch acid acetic 0,2M: hòa tan 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000 ml - Dung dịch Natri acetate 0,2M: cân 16,4g CH3COONa hòa tan bằng nước cất và định mức đến 1000 ml - Dung dịch đệm pH7: hút 39,0 ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M trộn với 61,0 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M rồi định mức đến 200ml - Dung dịch đệm pH6: hút 87,7 ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M trộn với 12,3 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M rồi định mức đến 200ml - Dung dịch đệm pH5: hút 14,8 ml dung dịch acid acetic 0,2M trộn với 35,2 ml dung dịch natri acetate 0,2M rồi định mức đến 100ml - Dung dịch đệm pH4: hút 41,0 ml dung dịch acid acetic 0,2M trộn với 9,0 ml dung dịch natri acetate 0,2M rồi định mức đến 100ml 2.1.5.2 Môi trường sử dụng  Môi trường PDA D-Glucose 4g 47
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Agar 4g Dịch chiết khoai tây 200ml Cloramphenicol 0.005g pH: 6-7 Chuẩn bị dịch chiết khoai tây: cân 200g khoai tây được cắt hạt lựu, cho vào cốc 2 lít, đong nước cất tới 1000ml rồi đun sôi hỗn hợp trên bếp từ. Đun sôi khoảng 10 phút rồi đem lọc lấy dịch trong.  Môi trường tăng sinh lỏng nấm Trichoderma harzianum - Glucose 1g - NH4NO3 0,5 g - MgSO4.7H2O 0,5 g - K2HPO4 0,7 g - KH2PO4 0,3 g - FeSO4.7H2O 0,01 g - ZnSO4 0,001 g - Cloramphenicol 0,005 g - Bổ sung dịch chitin huyền phù 1% đến 1 lít. pH: 6 – 7  Môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum - Nấm linh chi nghiền 20g - Malt 5g - Dung dịch khoáng 10ml - Cao nấm men 0,5g - Chitin huyền phù 0,25g - Nước bổ sung 40ml - Độ ẩm 70%, pH5  Pha dung dịch khoáng + NH4NO3 0,5g + KH2PO4 0,2g 48
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi + NaCl 0,1g + MgSO4.7H2O 0,1g Hòa tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml  Môi trường chitin – agar 1% Đong 100ml dịch huyền phù chitin 1% vào bình môi trường Ducan bổ sung 2g agar, sau đó hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa, mỗi đĩa khoảng 20ml môi trường.  Môi trường casein – agar 1% Đong 100ml dịch casein 1% vào bình môi trường bổ sung 2g agar, sau đó hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa, mỗi đĩa khoảng 20ml môi trường.  Môi trường β-glucan agar 1% Đong 100ml dịch β-glucan 1% vào bình môi trường bổ sung 4g agar, sau đó hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa, mỗi đĩa khoảng 20ml môi trường. 2.2 Phương pháp nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 49
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thực hiện thí nghiệm Cellulase Đo đường Chitinase Sàng Chế phẩm kính thương mại vòng lọc hoạt β-glucanase phân tính giải enzyme Protease để áp dụng phá vỡ Nuôi Cellulase vách cấy Đo chìm đường bào tử Nuôi cấy Chitinase kính nấm Trichoderma vòng harzianum β-glucanase Linh chi Nuôi phân cấy giải Protease rắn Xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme Xác định tỉ lệ phá vỡ bằng Xác định tỉ lệ phối hợp enzyme chế phẩm và dịch nuôi cấy phương nấm Trichoderma harzianum để phá vách bào tử Linh chi pháp đếm hồng cầu tế bào Xác định tỉ lệ phá vỡ bằng Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi khi thay đổi phương nồng độ của enzyme chế phẩm + dịch nuôi cấy nấm pháp đếm Trichoderma harzianum hồng cầu tế bào 50
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Sơ đồ 2.2 – Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme chitinase từ dịch nuôi cấy nấm Trichoderma hazianum T2 Enzyme 30oC 40oC 50oC 60oC 70oC pH4 pH5 pH4 pH5 pH4 pH5 pH4 pH5 pH4 pH5 pH6 pH7 pH6 pH7 pH6 pH7 pH6 pH7 pH6 pH7 Hoạt tính (U/ml) Nhiệt độ tối ưu pH tối ưu 51
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Sơ đồ 2.3 – Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi bằng enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 kết hợp chế phẩm enzyme C20032 20ml 1g bào tử nấm linh chi nước cất Lạnh đông 12 tiếng ở -4oC Rã đông ở nhiệt độ phòng Ly tâm 4000 vòng/phút/20 phút Nước Thu bào tử, phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào tử Ngâm bào tử trong DNC và EC 10% ở 50oC, pH5 theo các tỉ lệ Đếm hồng cầu tế bào 1 EC 1DNC : 1 2 DNC: 1DNC : 1 DNC ngày 10% EC 10% 1 EC10% 2 EC10% 2,3,4 Đếm hồng cầu tế bào ngày 1DNC : 1DNC : 1DNC : 1DNC : 1DNC : 4,7,10 1EC 10% 1EC 5% 1EC 1% 1EC 0.5% 1EC 0.1% 52
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.3 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi cấy Sơ đồ 2.4 – Sơ đồ nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi cấy Giống gốc Nhân giống Tăng sinh MT Tăng sinh MT Tăng sinh rắn, 3 ngày lỏng Trích ly Lắc 150 vòng/phút, Nước cất Tỉ lệ nước cất : cơ chất (lắc 150 vòng/phút, 3 ngày 10:1 24 giờ) Lọc Lọc Tơ Bã nấm Ly tâm 4000 Ly tâm 4000 vòng/ vòng/phút, 10 phút phút, 10 phút Cặn Dịch nuôi cấy Dịch nuôi cấy 53
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum trên môi trường thạch PDA Chuẩn bị môi trường PDA như mục 2.1.5.2 cho vào bình môi trường Ducan 200ml rồi đem hấp khử trùng ở 1210C/1 atm/15 phút. Hấp xong, để môi trường hạ xuống khoảng 500C rồi tiến hành đổ đĩa. Đợi thạch đông lại, tiến hành cấy điểm Trichoderma harzianum T2 từ ống giống được phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu năm 2014 trường ĐH Công nghệ TP. HCM, rồi lật úp đĩa (tránh tụ nước trên bề mặt thạch) đem ủ ở 28-320C. Sau 7 ngày nuôi nấm trên môi trường PDA chuyển sang môi trường tăng sinh khối thu dịch enzyme nuôi cấy theo sơ đồ 2.3 2.3.2 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường lỏng Chuẩn bị môi trường tăng sinh lỏng nấm Trichoderma hazianum như mục 2.1.5.2 phối vào erlen 1000ml 250 ml môi trường tăng sinh lỏng có huyền phù chitin 1%, hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút. Để nguội khoảng 300C rồi cấy bào tử nấm Trichoderma harzianum T2 đã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA. Sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày nuôi cấy, lọc bỏ tơ nấm, đem ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút thu dịch tăng sinh loại bỏ cặn là sinh khối tơ nấm còn sót lại.  Phương pháp làm huyền phù chitin 1% (De-hui Dai et al, 2010): cân chính xác 5g bột chitin vào 1 bình erlen 500 ml, thêm từ từ 100 ml HCl 11M, khuấy trong 1 tiếng, ủ qua đêm ở 4oC. Sau đó, thêm vào erlen 500 ml ethanol 96% lạnh (khoảng 4oC), khuấy đều, ủ qua đêm ở 4oC. Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút thu tủa. Rửa tủa bằng nước cất đến khi pH đạt 6. Thêm vào tủa 500 ml nước cất để được huyền phù chitin 1%. 2.3.3 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn Chuẩn bị môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma hazianum như mục 2.1.5.2 phối vào erlen 1000ml môi trường tăng sinh rắn, hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút. Để nguội khoảng 300C rồi cấy bào tử nấm Trichoderma harzianum T2 đã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA. Giữ bình ở nhiệt độ phòng đem ủ ở 28-320C trong 3 ngày. Thực hiện trích ly bằng nước cất lạnh vô trùng theo tỉ lệ nước cất/cơ chất là 10:1 có bổ sung Tween 80 1%. Đem lắc trên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ rồi lọc bỏ bã. Sau 54
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi đó đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút thu dịch tăng sinh loại bỏ cặn còn sót lại. 2.3.4 Phương pháp định tính enzyme chitinase, β-glucanase, protease có trong dịch nuôi cấy và chế phẩm enzyme C20032 10%  Định tính enzyme chitinase Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri chứa môi trường huyền phù chitin agar 1% được chuẩn bị như mục 2.1.5.2. Mỗi đĩa môi trường chitin agar đục 4 lỗ thạch đường kính 5 mm, sau đó dùng micropipette hút 100µl dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) nhỏ vào 3 lỗ thạch đã đục trong mỗi đĩa và 1 lỗ không nhỏ dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) để làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) sau 48 giờ bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân giải chitin.  Định tính enzyme β-glucanase Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri chứa môi trường β-glucan agar 1% được chuẩn bị như mục 2.1.5.2. Mỗi đĩa môi trường β-glucan agar đục 4 lỗ thạch đường kính 5 mm, sau đó dùng micropipette hút 100µl dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) nhỏ vào 3 lỗ thạch đã đục trong mỗi đĩa và 1 lỗ không nhỏ dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) để làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) sau 48 giờ bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân giải β-glucan.  Định tính enzyme protease Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri chứa môi trường casein agar 1% được chuẩn bị như mục 2.1.5.2. Mỗi đĩa môi trường casein agar đục 4 lỗ thạch đường kính 5 mm, sau đó dùng micropipette hút 100µl dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) nhỏ vào 3 lỗ thạch đã đục trong mỗi đĩa và 1 lỗ không nhỏ dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) để làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch nuôi cấy/(enzyme C20032 10%) sau 48 giờ bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân giải casein. 55
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.4 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và enzyme chế phẩm C20032 2.4.1 Dựng đường chuẩn glucosamine Bảng 2.1 Bảng dựng đường chuẩn glucosamine Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Glucosamine 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 10mg/ml (ml) Nước cất (ml) 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9 Nồng độ 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 glucosamine (mg/ml) OD540nm Từ các ống nghiệm trên lấy 1 ml cho vào 6 ống nghiệm đã được rửa và làm khô, thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử DNS. Đun 95oC cách thủy các ống thí nghiệm 10 phút (có đậy nắp). Làm lạnh đến nhiệt độ phòng rồi cho 1 ml nước cất vào ống nghiệm. Đo mật độ quang ở bước sóng 535 nm với mẫu trắng pha từ ống đối chứng. Sau khi có các giá trị OD ở các nồng độ thì tiến hành dựng đường chuẩn glusosamine với trục hoành là nồng độ (µmol/ml) glucosamine, trục tung là mật độ quang (OD). Tìm phương trình biễu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa 2 giá trị: y = ax + b và hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel. 2.4.2 Xác định hoạt độ enzyme chitinase ở pH và nhiệt độ khác nhau - Nguyên tắc: Hoạt độ chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng glucosamine sinh ra trong quá trình phân giải chitin. Lượng glucosamine tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan.  Thực hiện: Chuẩn bị các ống nghiệm đã được rửa sạch và làm khô - Ống phản ứng: • Cho vào mỗi ống nghiệm hỗn hợp phản ứng bao gồm: 3 ml huyền phù chitin 56
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1%, 3 ml dịch enzyme và 1ml đệm pH (giá trị pH 4,5,6,7) Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng 30oC, 40oC, 50oC, 60oC và 70oC trong 60 phút. • Ngưng phản ứng bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút. • Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi • Lấy 1 ml dịch nổi và 1 ml thuốc thử DNS cho vào 1 ống nghiệm sạch, lắc đều, đun 95oC cách thủy trong 10 phút, rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng. • Thêm 1 ml nước cất, lắc đều và đo OD ở bước sóng 535 nm. - Ống không phản ứng: Cho 3 ml dịch enzyme vào ống nghiệm và biến tính enzyme bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút sau đó thêm 3 ml dịch cơ chất chitin, 1ml đệm pH (4,5,6,7) rồi làm tương tự như các bước của ống phản ứng.  Cách tính hoạt tính: Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µg glucosamine từ chitin huyền phù trong 1 phút ở nhiệt độ phản ứng nhất định. Đơn vị hoạt tính: HT(U/ml) = (a×n×v)/(t×V) Với: a: hàm lượng glucosamine (µmol/ml) suy ra từ đường chuẩn. n: hệ số pha loãng. v: thể tích hỗn hợp phản ứng. t: thời gian phản ứng (phút). V: thể tích dịch enzyme cho vào phản ứng (ml) 2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme celullase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm enzyme C20032  Nguyên tắc: Dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bởi enzyme CMCase, lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy- 3,5-dinitrobenzoic (DNS), màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm 2.5.1 Dựng đường chuẩn glucose Hòa tan 100mg glucose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. 57
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Thực hiện loạt 6 sống nghiệm theo bảng 2.2 sau Bảng 2.2 Lập đường chuẩn glucose Ống số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 DD glucose 1mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 DD CMC 1% trong đệm (ml) 1 1 1 1 1 1 DD DNS Lactose (ml) 2 2 2 2 2 2 Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Lắc đều các ống nghiệm này, đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540nm (AG). Vẽ đồ thị đường chuẩn dùng phần mềm excel, xác định phương trình đường chuẩn 2 (trendline) và hệ số tương quan R dạng như sau: AG=a*G+b, G = nồng độ glucose (mg/ml) 2.5.2 Phản ứng xác định hoạt tính cellulase Bảng 2.3 Các bước xác định hoạt tính enzyme cellulase (CMCase) Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng DD enzyme (ml) 1 0 Ổn định enzyme 50oC/5 phút CMC 1% ủ 50oC/5 phút 1 1 (ml) Phản ứng enzyme 50oC/10 phút DD DNS – lactose (ml) 2 2 DD Enzyme đun sôi (ml) 0 1 Đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước mát Đo mật độ quang A450nm ATN AĐC  Tính toán kết quả: Đơn vị hoạt tính CMCase: một đơn vị CMCase là lượng enzyme 58
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi xúc tác phản ứng giải phóng 1µmol/phút glucose khi thủy phân CMC dưới điều kiện phản ứng. Hoạt tính CMCase: HT(U/ml) = G*(1000/180)*(1/10)*(1/1,0)*F Với: G: nồng độ glucose (mg/ml) tạo thành trong phản ứng enzyme 1000: chuyển mg thành µg 180: phân tử lượng glucose monohydrate, chuyển µg thành µmol 10: Thời gian phản ứng (phút) 1,0: thể tích dung dịch enzyme (ml) 2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease dịch nuôi cấy và chế phầm C20032 bằng phương pháp Anson cải tiến Nguyên tắc: Dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzyme protease có trong dịch nghiên cứu, sau đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloacetic (TCA). Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu. Dựa vào đồ thị đường chuẩn Tyrosine để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo nên. 2.6.1 Dựng đường chuẩn tyrosine Xây dựng đường chuẩn tyrosine theo bảng 2.4 Bảng 2.4 Bảng bổ sung hóa chất để dựng đường chuẩn tyrosine Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 (ĐC) DD Tyrosine chuẩn 1µmol/ml (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 DD HCl 0,2N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 DD Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử FC pha loãng (ml) 1 1 1 1 1 1 Nồng độ tyrosine (µmol/ml) Lắc đều, để yên ở 50oC/30 phút. Đo độ hấp thu dung dịch ở 750nm lấy mẫu đối chứng (ĐC) làm mẫu trắng (blank) Vẽ đồ thị đường chuẩn bằng phần mềm excel, xác định phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan R2. 59
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.6.2 Phản ứng xác định hoạt tính protease Tiến hành theo bảng 2.5 Bảng 2.5 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng DD enzyme (ml) 1 0 Ổn định nhiệt độ enzyme 50oC/5 phút Casein 1% ở 50oC (ml) 2 2 Phản ứng enzyme: ủ ở 50oC/20 phút TCA (ml) 2,5 2,5 DD enzyme (ml) 0 1 Kết tủa cơ chất còn dư: lắc đều, ủ ở 50oC/30 phút. Lọc lấy dịch loại bỏ kết tủa. Dịch lọc (ml) 1 1 Na2CO3 (ml) 5 5 FC pha loãng (ml) 1 1 Phản ứng tạo phức với FC Ủ 50oC/30 phút Đo độ hấp thu ở 750nm ATN AĐC  Tính toán kết quả Đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (50oC) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin – Ciocalteau cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 750nm tương ứng mới 1µmol tyrosine trong đường chuẩn. ∗5,5∗퐹 Hoạt tính protease HT (U/ml) = ∗20 Với: X: nồng độ tyrosine suy ra từ đường chuẩn (µmol/ml) 5,5: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng thủy phân (ml) V: thể tích dịch lọc đem phản ứng tạo màu (1ml) F: hệ số pha loãng enzyme 2.7 Phương pháp xác định hoạt tính β-glucanase trong dịch nuôi cấy và chế phầm C20032 60
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Nguyên tắc: Dựa vào sự thủy phân cơ chất β-glucan bởi enzyme β-glucanase, lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS), màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm. 2.7.1 Dựng đường chuẩn β-glucan Thực hiện theo bảng 2.6 để dựng phương trình đường chuẩn β-glucan Bảng 2.6 Lập đường chuẩn β-glucan để xác định hoạt tính β-glucanase Ống số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 DD glucose 1mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 DD β-glucan 1% trong đệm (ml) 1 1 1 1 1 1 DD DNS Lactose (ml) 2 2 2 2 2 2 Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Lắc đều các ống nghiệm này, đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540nm (AG). Vẽ đồ thị đường chuẩn dùng phần mềm excel, xác định phương trình đường chuẩn 2 (trendline) và hệ số tương quan R dạng như sau: AG=a*G+b, G = nồng độ glucose (mg/ml) 2.7.2 Phản ứng xác định hoạt tính β-glucanase Bảng 2.7 Các bước xác định hoạt tính enzyme β-glucanase Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng DD enzyme (ml) 1 0 Ổn định enzyme 50oC/5 phút β-glucan 1% ủ 50oC/5 phút (ml) 1 1 Phản ứng enzyme 50oC/30 phút DD DNS – lactose (ml) 2 2 DD Enzyme đun sôi (ml) 0 1 Đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước mát Đo mật độ quang ATN AĐC A450nm 61
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi  Tính toán kết quả Đơn vị hoạt tính : một đơn vị β-glucanase là lượng enzyme xúc tác phản ứng giải phóng 1µmol/phút glucose khi thủy phân β-glucan dưới điều kiện phản ứng. Hoạt tính β-glucanase: HT(U/ml) = G*(1000/180)*(1/30)*(1/1,0)*F Với: G: nồng độ glucose (mg/ml) tạo thành trong phản ứng enzyme 1000: chuyển mg thành µg 180: phân tử lượng glucose monohydrate, chuyển µg thành µmol 30: Thời gian phản ứng (phút) 1,0: thể tích dung dịch enzyme (ml) 2.8 Phương pháp xác định protein trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phầm C20032 bằng phương pháp Bradford 2.8.1 Dựng đường chuẩn Albumin Tiến hành theo bảng 2.8 Bảng 2.8 Dựng đường chuẩn albumin (protein theo Bradford) Ống nghiệm (ĐC) 1 2 3 4 5 Mẫu DD BSA 0,1mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 - Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 - Mẫu phân tích pha loãng - - - - - - 1 hệ số F (ml) Nồng độ BSA (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 - Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 Để yên trong 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu dung dịch ở bước sóng 595nm lấy mẫy đối chứng làm mẫu trắng (blank). Ghi lại các giá trị đo OD. Vẽ đồ thị đường chuẩn bằng phần mềm excel, xác định phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan R2. 2.8.2 Xác định hàm lượng protein trong mẫu Hút 1ml dịch enzyme cần phân tích cho vào ống nghiệm thêm 2ml thuốc thử Bradford, để yên 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595nm. Chú ý pha loãng protein để OD nằm trong đường chuẩn.  Tính toán kết quả: 62
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hàm lượng protein trong dung dịch enzyme mẫu: P (mg/ml) = (X*F) Với: X: nồng độ protein trong mẫu phân tích (mg/ml) F: hệ số pha loãng mẫu 63
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.9 Khảo sát phá vách bào tử nấm Linh chi bằng dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và enzyme chế phẩm C20032. 2.9.1 Phương pháp xác định tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032 Sơ đồ 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10% 20ml 1g bào tử nấm linh chi nước cất Lạnh đông 12 tiếng ở -4oC Rã đông ở nhiệt độ phòng Ly tâm 4000 vòng/phút/20 phút Nước Thu bào tử, phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào tử Ngâm bào tử trong DNC và EC o 10% ở 50 C, pH5 theo các tỉ lệ 2 DNC: 1 DNC 1 EC10% 1DNC : 1 1 DNC : 1EC10% 2 EC10% (1,5ml + (1,5ml + EC10% (3,0ml:1,5 (1,5ml:3,0 3,5ml 3,5ml (1,5ml:1,5ml ml +0,5ml ml +0,5ml đệm) đệm) +2ml đệm) đệm) đệm) Đếm hồng cầu tế bào ngày 2,3,4 64
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Cân 1g bào tử nấm Linh chi cho vào ống ly tâm, đong 20 ml nước cất thêm vào ống ly tâm, để vào trong tủ đá làm lạnh đông bào tử ở - 4oC trong 12 tiếng. Sau thời gian lạnh đông, đem bào tử rã đông ở nhiệt độ phòng, khi đá đã tan hết, ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút để tách nước, thu bào tử ướt. Phối vào mỗi ống nghiệm 0,1g bào tử rồi ngâm bào tử trong hỗn hợp dịch nuôi cấy nấm và enzyme chế phẩm C20032 10% với các tỉ lệ thể tích khác nhau như bảng 2.9 Bảng 2.9 Bảng bố trí thay đổi tỉ lệ enzyme dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10% Nghiệm Nghiệm Nghiệm Nghiệm Nghiệm Nghiệm thức thức 1 thức 2 thức 3 thức 4 thức 5 (NT1) (NT2) (NT3) (NT4) (NT5) Tỉ lệ 1 DNC 1 EC 10% 1DNC : 2DNC : 1DNC : 1EC 10% 1EC 10% 2EC 10% Thể tích 1,5 1,5 1,5 : 1,5 3,0 : 1,5 1,5 : 3,0 (ml) Đệm 3,5 3,5 2,0 0,5 0,5 pH5 (ml) Tổng thể 5 5 5 5 5 tích (ml) Đem ủ các ống nghiệm trên trong bể điều nhiệt ở 50oC trong 2, 3, 4 ngày. Thực hiện đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu ở ngày thứ 2, 3, 4. 2.9.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. (Trần Thanh Phong, 2004; Nguyễn Đức Lượng, 2005) 65
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 2.1 Buồng đếm hồng cầu Neubauer Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm các vi sinh vật có kích thước rất nhỏ (nấm men, bào tử nấm mốc ). Nguyên tắc: Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu đó là một phiến kính hình chữ nhật, chia thành ba khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ có kẻ một lưới đếm, gồm nhiều ô vuông nhỏ, mỗi ô có diện tích là 1/25 mm2, lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16 ô), mỗi ô có diện tích là 1/400 mm2 và chiều sâu là 0,1mm. Như vậy thể tích của mỗi ô nhỏ là 1/400x0.1=1/4000 mm3. Thực hiện: Bào tử nấm Linh chi sau khoảng thời gian ủ thích hợp, được lấy ra thực hiện đếm hồng cầu. Định mức ống nghiệm chứa bào tử nấm linh chi và hỗn hợp dịch enzyme đến 10 ml, ta được ống mẫu 100. Thực hiện pha loãng bằng cách dùng micropipette hút 1ml từ ống mẫu 100 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý ta được độ pha loãng 10-1. Lặp lại như trên cho đến khi có được các độ pha loãng 10-2, 10-3. Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer. Lắc đều mẫu pha loãng. Đậy lá kính lên lưới đếm. Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho một giọt vào mép lá kính, do sức mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lưới đếm. Chú ý không để tạo bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3-5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử. Chú ý: nồng độ dịch huyền phù mẫu pha loãng phải đảm bảo sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không được quá 10 bào tử. Cách đếm và tính: 66