Đồ án Xây dựng quy trình nhân giống invitro cây cúc lá nhỏ PICO (Chrysanthemum sp.)

109 trang thiennha21 13/04/2022 4250

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Xây dựng quy trình nhân giống invitro cây cúc lá nhỏ PICO (Chrysanthemum sp.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_xay_dung_quy_trinh_nhan_giong_invitro_cay_cuc_la_nho_p.pdf

Nội dung text: Đồ án Xây dựng quy trình nhân giống invitro cây cúc lá nhỏ PICO (Chrysanthemum sp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY CÚC LÁ NHỎ PICO (Chrysanthemum sp.) Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : TS. Hà Thị Loan Sinh viên thực hiện : Huỳnh Thị Anh Đài MSSV : 1411100170 Lớp : 14DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi số liệu, nội dung, quy trình trong đồ án toàn bộ là của tôi đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Hà Thị Loan. Toàn bộ đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thực nghiệm cây trồng Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 12/2017-7/2018. Tất cả những nội dung, quy trình, số liệu trong đồ án chƣa đƣợc công bố trên tạp chí, hội thảo hay những diễn đàn khoa học. Đồ án đƣợc thực hiện có sự tham khảo, trích dẫn một số tài liệu và đảm bảo đúng tác quyền theo chuẩn quốc tế APA. Trong trƣờng hợp nếu có thắc mắc về nội dung, số liệu trong đồ án tôi sẵn sàng xuất trình mọi dữ liệu có liên quan đƣợc lƣu trữ tại nơi tôi thực hiện đề tài. TP. Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực hiện Huỳnh Thị Anh Đài
LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trƣờng Đại học Công Nghệ TP. HCM, đặc biệt là Quý thầy cô trong Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH. Em biết rằng đề tài đƣợc thực hiện đã phản ánh phần nào kiến thức mà thầy cô đã biên soạn và chỉ dạy cho em trong suốt 4 năm qua, những bài học, những kinh nghiệm mà thầy cô giảng dạy đã giúp em rất nhiều. Trong suốt thời gian em làm đề tài, những giá trị này đƣợc lặp lại một lần nữa, chính vì thế em đã cảm nhận rõ hơn về một hệ thống kiến thức nền tảng. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và cán bộ viên chức trong Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã tiếp nhận, tạo điều kiện để em có nơi thực hiện đề tài. Và đặc biệt em muốn gửi lời tri ân sâu sắc đến TS. Hà Thị Loan, nơi cô em hiểu thế nào là sự tận tâm hƣớng dẫn, nhƣ thế nào là nghiên cứu khoa học. Ngoài ra em khám phá ra đƣợc những lý thuyết thông qua cách cô giúp em từng bƣớc giải quyết khó khăn. Em nhận ra cô đã đồng hành cùng em nhƣ thế nào khi phân công anh kĩ sƣ Trịnh Bá Uy thƣờng trực phòng thí nghiệm để hỗ trợ em. Con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, mặc dù ba mẹ và các em đã không trực tiếp giúp con trong việc làm đề tài, nhƣng bằng cách này hay cách khác gia đình đã luôn động viên, lắng nghe con chia sẽ mỗi khi con gặp khó khăn, khích lệ con cố gắng, giúp đỡ con cả về tài chính và tinh thần, con xin mãi ghi khắc. Luận văn là thành quả khoa học đầu tiên của em, nên chắc chắc có những thiếu sót về nội dung. Rất mong đƣợc quý thầy cô và những nhà khoa học nhận xét, đóng góp ý kiến để em đƣợc học hỏi, rèn luyện và trƣởng thành hơn. Xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô và toàn thể ân nhân. Trân trọng.
MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật 4 1.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 4 1.1.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 4 1.1.3. Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam 5 1.1.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 5 1.1.4.1. Tính toàn năng của tế bào 5 1.1.4.2. Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào 6 1.1.5. Các giai đoạn nuôi cấy mô 7 1.1.5.1. Chuẩn bị cây mẹ, lựa chọn mẫu cấy: 7 1.1.5.2. Khử trùng mẫu cấy 7 1.1.5.3. Tạo thể nhân giống in vitro và tăng sinh mô 7 1.1.5.4. Ra rễ in vitro và tái sinh cây hoàn chỉnh 7 1.1.5.5. Chuyển cây con ra vƣờn ƣơm 8 1.1.5.6. Ra rễ ex vitro 8 1.1.6. Các kỹ thuật nhân giống in vitro 8 1.1.6.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và chồi bất định 8 1.1.6.2. Nuôi cấy tế bào đơn 9 1.1.6.3. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 9 1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô 10 1.1.8. Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng 11 1.1.9. Tổng quan về ánh sáng 13 1.2. Tổng quan về cây cúc 17 1.2.1. Phân loại khoa học 17 1.2.2. Nguồn gốc, lịch sử và phân bố 17 1.2.3. Đặc điểm thực vật học 19 1.2.4. Tình hình nhân giống cúc trên thế giới và Việt Nam 21 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 i
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đồ án 23 2.1.1. Địa điểm 23 2.1.2. Thời gian 23 2.2. Vật liệu 23 2.2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 23 2.2.2. Trang thiết bị 23 2.2.3. Môi trường nuôi cấy 24 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm 24 2.3. Phƣơng pháp 25 2.3.1. Pha môi trường 25 2.3.2. Hấp khử trùng 25 2.4. Bố trí thí nghiệm 25 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cúc Pico. 26 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico 27 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến khả năng nhân chồi mẫu cúc 28 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng các loại đèn chiếu sáng đến sự nhân nhanh chồi mẫu cúc 29 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc 30 2.5. Thống kê và xử lý số liệu 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico. 32 3.2. Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. 34 3.3. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. 37 3.4. Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. 40 3.5. Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. 43 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1. Kết luận 47 4.2. Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4D 2,4 – Dichlorphenoxy acetic acid BA Benzyl adenyl Cs. Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid GA3 Gibberellic acid IAA Indolylacetic acid IBA Indole -3-Butyric acid LED Light Emitting Diode MS Murashige and Skoog NAA Naphthul acetic acid RNA Ribonucleic acid TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh Vitamin B1 Thiamin Vitamin B2 Riboflavin Vitamin B6 Pyridoxin iii
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cúc Pico. 27 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả năng nhân chồi mẫu cúc 28 Bảng 2.3. Khảo sát nồng độ nƣớc dừa thích hợp đến sự tái sinh chồi mẫu cúc 29 Bảng 2.4. Khảo sát loại đèn LED thích hợp đến sự tái sinh chồi mẫu cúc 30 Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hƣởng NAA đến sự ra rễ mẫu cúc 31 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc 32 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico 35 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. 38 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. 41 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. 44 iv
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico 33 Biểu đồ 3.2: Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. 35 Biểu đồ 3.3: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. 38 Biểu đồ 3.4: Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. 41 Biểu đồ 3.5: Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. 45 v
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Phổ hấp thụ ánh sáng của thực vật 14 Hình 1.2. Chrysanthemum sp. 17 Hình 1.3. Một số hình ảnh cúc Pico 21 Hình 2.1. Chrysanthemum sp .23 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng 5% Javel đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico. 33 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico 36 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. 39 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. 42 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. 45 vi
Đồ Án Tốt Nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đời sống con ngƣời ngày nay đƣợc cải thiện kéo theo không gian sống ngày càng chất lƣợng, ngƣời ta hƣớng tới cuộc sống đầy đủ tiện nghi và phong cách. Đặc biệt là những thành phố lớn, nơi đời sống của ngƣời dân cao nhƣng lại thiếu đi vẻ đẹp hoang sơ của thiên nhiên. Chính vì thế, hoa đƣợc sử dụng nhƣ món quà tinh thần bù đắp lại thiếu sót đó. Việc trƣng bày hoa nơi công sở để bàn làm việc thêm sắc màu hay dùng hoa để thay lời nói trong những ngày lễ tết đã thu hút đam mê của nhiều ngƣời. Trong đó, hoa cúc đã chiếm một vị trí khá lớn, theo (Đặng, 2006) cho biết, với màu sắc phong phú, kích cỡ và hình dáng đa dạng, dễ điều khiển cho ra hoa tạo nguồn giống quanh năm khiến cho hoa cúc trở thành loài hoa đƣợc tiêu thụ đứng thứ hai trên thế giới chỉ sau hoa hồng. Ngày nay cúc đƣợc sử dụng rộng rãi trong cuộc sống, ngoài trang trí, cúc còn đƣợc dùng để làm cảnh, thờ cúng, dƣợc liệu, trà, Ở nhiều nơi, ngƣời ta còn tin rằng cúc là biểu tƣợng của sự sống, là niềm tin, là sự bắt đầu. Cúc đƣợc đƣa vào đời sống ngƣời dân nhƣ một món quà tinh thần không thể thiếu trong những ngày đặc biệt. Nhắc đến cúc ta không thể kể đến cúc lá nhỏ hay còn gọi là cúc Pico, tên khoa học Chrysanthemum sp., thuộc họ Asteraceae, nguồn gốc Châu Á, Châu Âu. Cúc Pico là cây thân thảo, có quả bế, mọc trong bóng râm, chiều cao trung bình 20- 50cm. Hiện nay, cúc Pico đƣợc Dalat hasfarm nhập hạt giống về trồng, và Dalat hasfarm độc quyền với loại hoa này, ngoài ra còn có một số cơ sở nhỏ lẻ trồng bằng một vài biện pháp thủ công nhƣ giâm cành. Việc làm này cho mức độ nhân giống không cao, cây con dễ nhiễm bệnh từ cây mẹ, ngoài ra nếu không có kỹ thuật tốt sẽ làm ảnh hƣởng đến cây mẹ, dễ gây thoái hóa giống. Vì thế cần chọn một biện pháp để nhân nhanh cây mà lại giúp bảo tồn giống, không làm ảnh hƣởng đến cây mẹ là một thách thức lớn hiện nay. Hơn thế nữa, mức độ tiêu thụ cúc hiện nay khá mạnh, 1
Đồ Án Tốt Nghiệp nếu cứ duy trì những biện pháp thủ công này sẽ không đủ hàng để tiêu thụ vào các dịp lễ, tết. Đứng trƣớc thực trạng đó, tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cúc lá nhỏ Pico (Chrysanthemum sp.)” vì cúc Pico hiện nay chƣa đƣợc ai nghiên cứu nhân giống in vitro, trong khi nhân giống in vitro cho hệ số nhân giống cao giúp chủ động đƣợc nguồn giống, cây con hoàn toàn sạch bệnh, không gây ảnh hƣởng đến cây mẹ, cây sinh trƣởng phát triển đồng đều, giúp ngƣời trồng hoa đạt đƣợc hiệu quả kinh tế cao. 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico. - Xác định nồng độ BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. - Xác định nồng độ nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. - Xác định đƣợc loại đèn chiếu sáng thích hợp đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. - Xác định nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc. 3. Nội dung của đề tài - Nội dung 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cúc Chrysanthemum sp. - Nội dung 2: Khảo sát nồng độ BA đến sự nhân chồi cúc Chrysanthemum sp. - Nội dung 3: Khảo sát nồng độ nƣớc dừa đến sự nhân chồi cúc Chrysanthemum sp. - Nội dung 4: Khảo sát các loại đèn chiếu sáng đến sự nhân nhanh chồi cúc Chrysanthemum sp. - Nội dung 5: Khảo sát nồng độ NAA đến sự ra rễ của cúc Chrysanthemum sp. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu - Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài đƣợc sử dụng làm tài liệu tham khảo, nghiên cứu cho sinh viên, hay đƣợc sử dụng để làm tài liệu nghiên cứu cho các cây cúc cùng họ. Ngoài ra, những kết quả trong đề tài có thể sử dụng trong các công trình nghiên cứu khoa học hay các quy trình nhân giống các cây cùng họ. 2
Đồ Án Tốt Nghiệp - Ý nghĩa thực tiễn Việc nhân giống in vitro cây cúc lá nhỏ (Pico) thành công sẽ giúp chủ động nguồn giống, làm đa dạng hơn nguồn hoa cảnh của TP.HCM, nâng cao giá trị kinh tế cho ngƣời trồng. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai, mỗi chai 10 mẫu. Các số liệu thu thập đƣợc xử lý bằng phần mềm SAS 8.2 và chƣơng trình Microsoft Excel 2010. 6. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Thí nghiệm 1: Xác định thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico. - Thí nghiệm 2: Xác định nồng độ BA đến sự nhân chồi của mẫu cúc Pico. - Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ nƣớc dừa đến sự nhân chồi của mẫu cúc Pico. - Thí nghiệm 4: Xác định đƣợc loại đèn thích hợp đến sự nhân chồi của mẫu cúc Pico. - Thí nghiệm 5: Xác định nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc Pico. 7. Kết cấu của đồ án Đồ án bao gồm các chƣơng sau: Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị 3
Đồ Án Tốt Nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay, có nhiều khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật, dƣới đây là một số khái niệm cơ bản: Nuôi cấy mô tế bào thực vật là áp dụng tất cả những kỹ thuật để nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trƣờng đã xác định thành phần (Trần, 1997). Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trƣờng đƣợc xác định rõ thành phần và đặt dƣới điều kiện kiểm soát (Nguyễn T. B., 2004). Nuôi cấy mô tế bào thực vật, vi nhân giống hay nhân giống in vitro là phạm trù cho tất cả các loại nguyên liệu từ thực vật, đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng (Trịnh A. L., 2016). 1.1.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay có nhiều tác giả khái quát về lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, gồm có các giai đoạn chính sau đây: - Những ngƣời tiên phong trong lĩnh vực nuôi cấy mô Cha đẻ của lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào Haberlandt 1 lần đầu tiên nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật trên môi trƣờng dinh dƣỡng trong điều kiện vô trùng không nhận biết rằng các tế bào quang hợp, phân sinh mô không biểu hiện một cách dễ dàng và cần các chất sinh trƣởng để hoạt hóa. Vì vậy, ông chọn các loại tế bào nhƣ tế bào mô giậu, tế bào lõi, lông của nhị hoa để nuôi cấy trên môi trƣờng hữu cơ chứa glucose trong điều kiện vô trùng, và tất cả các thí nghiệm này không thành công nhƣng tồn tại trong vài tuần. Từ đó cho biết, tế bào phân sinh mô là dị dƣỡng và cần chất điều hòa sinh trƣởng để làm mất sự chuyên hóa. - Những ngƣời đóng góp cho lĩnh vực nuôi cấy mô 1 Haberlandt (1854-1945): là nhà thực vật học ngƣời Đức, cha đẻ của lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật. 4
Đồ Án Tốt Nghiệp Từ năm 1934-1941 là những năm nghiên cứu để biết đƣợc thực vật duy trì cần đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng chứa các chất dinh dƣỡng bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng. Nhƣ Kotte và Robbins (1922) đã đặt mẫu cấy vào môi trƣờng chứa muối Pnop, glucose, và một số hỗn hợp nitrogen nhƣ asparagine, alanine và chất trích từ thịt. Năm 1934, Went và Thimann xác định IAA là chất điều hòa sinh trƣởng. Năm 1935, Snow chứng minh khi thêm IAA và vitamin B trong môi trƣờng nuôi cấy kích thích sự hoạt động của tƣợng tầng. Năm 1937, Bonner khám phá trong yeast extract là vitamin B1. Năm 1941, Van Overbech sử dụng nƣớc dừa để cấy phôi Datura. Từ năm 1950-1957: là những năm đánh dấu sự thành công trong nuôi cấy mô nhƣ vào năm 1947, Lauren cấy cây một lá mầm thành công từ phôi nhũ Bắp. Năm 1953, Muir và cs. tạo ra phƣơng pháp cấy tế bào treo trong môi trƣờng lỏng. Năm 1957, Muir phát triển kỹ thuật dùng giấy để cấy tế bào đơn. Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật (môi trƣờng MS). Năm 1964-1998: hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô nhƣ nuôi cấy tế bào trần , chứng minh đƣợc tính toàn năng của tế bào vô tính, chuyển gen, tạo cây lai từ tế bào chất bằng dung hợp tế bào trần. Và trong giai đoạn hiện nay, các nghiên cứu đƣợc ứng dụng vào đời sống để sản xuất các hợp chất thứ cấp, nghiên cứu di truyền thực vật bậc cao. 1.1.3. Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam Vào khoảng những năm 1977, Phân Viện Khoa học TP.HCM bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hiện nay, Đà Lạt là nơi tập trung nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của tƣ nhân phục vụ công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ (Nguyễn T. B., 2004). 1.1.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo (Sáng, 2017), kỹ thuật nhân giống in vitro dựa trên cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hóa và phản phân hóa 1.1.4.1. Tính toàn năng của tế bào 5
Đồ Án Tốt Nghiệp Vào năm 1902, Haberlandt đã đƣa ra quan niệm là mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Còn ngày nay, theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi một tế bào chuyên hóa đều chứa một lƣợng thông tin di truyền của một cơ thể trƣởng thành. Từ đó có thể thấy, từ xƣa đến nay tính toàn năng của tế bào đều có điểm chung là một tế bào bất kì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh trong điều kiện nhất định. Đó cũng là cơ sở khoa học của kỹ thuật nhân giống vô tính. Ngƣời ta có thể biến một tế bào (hay một mẫu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi nuôi cấy dƣới môi trƣờng thích hợp để tế bào thực hiện quá trình phân hóa và phản phân hóa. 1.1.4.2.Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào Tính phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành tế bào của mô chuyên hóa đảm nhiệm các chức năng khác nhau. Tính phản phân hóa của tế bào là các tế bào khi đã đƣợc phân hóa thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhƣng trong điều kiện nhất định chúng có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào. Sự phân hóa và phản phân hóa giữa tế bào phôi sinh và tế bào chuyên hóa đƣợc biểu diễn theo sơ đồ sau Phân hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa Về bản chất sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể thì một số gen đƣợc hoạt hóa và một số gen khác bị ức chế. Điều này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc phân tử AND. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhƣng khi đƣợc tách rời các gen đƣợc hoạt hóa dễ dàng hơn dƣới điều kiện nhất định nên chúng có khả năng mở các gen để hình thành cá thể mới. Đây là nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. 6
Đồ Án Tốt Nghiệp 1.1.5. Các giai đoạn nuôi cấy mô Theo (Trịnh A. L., 2016), có các giai đoạn sau: 1.1.5.1. Chuẩn bị cây mẹ, lựa chọn mẫu cấy: Cây mẹ đƣợc lựa chọn phải sạch bệnh, sinh trƣởng và phát triển tốt, không dị dạng. Khi lấy mô cấy cần chú ý đến tuổi sinh lý của cơ quan lấy mẫu; chất lƣợng, vị trí, kích thƣớc của cơ quan lấy mẫu. 1.1.5.2. Khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy sau khi lựa chọn đƣợc rửa sạch bằng xà phòng, sau đó khử trùng bằng các chất khử trùng hóa học nhƣ calcium hypochloride, chlorua, thủy ngân, Khử trùng bên ngoài tủ cấy. Sau đó đƣa mẫu cấy vô tủ cấy vô trùng và khử trùng bên trong tủ cấy. 1.1.5.3. Tạo thể nhân giống in vitro và tăng sinh mô - Tạo thể nhân giống Mẫu sau khi đƣợc khử trùng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp để tạo thể nhân giống. Có 2 thể nhân giống là thể chồi và thể cắt đốt. Đối với loài không có khả năng nhân giống, ngƣời ta thƣờng nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. - Tăng sinh mô: gồm có các phƣơng pháp sau đây Tạo phôi sôma Tăng cƣờng sự phát triển chồi bên Sự phát triển chồi bất định - Nhân giống in vitro Vật liệu nuôi cấy là thể chồi, môi trƣờng nuôi cấy giống môi trƣờng tạo thể chồi, nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng cần giảm thấp để quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cây trẻ hóa, quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. 1.1.5.4. Ra rễ in vitro và tái sinh cây hoàn chỉnh 7
Đồ Án Tốt Nghiệp - Ra rễ in vitro và điều kiện ra rễ Sau khi nhân giống đủ số lƣợng chồi, ta tách chồi ra nuôi cấy sang môi trƣờng ra rễ có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng, khoáng đa lƣợng, vi lƣợng, vitamin, và nuôi dƣỡng ở điều kiện thích hợp để tái sinh cây hoàn chỉnh. - Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn cây có đầy đủ thân, lá, rễ để chuyển ra vƣờn. Cây cần khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trƣờng bình thƣờng. Ở giai đoạn này, các chất có tác dụng tạo chồi loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích ra rễ. Điều kiện nuôi cấy gần giống với bên ngoài môi trƣờng. 1.1.5.5. Chuyển cây con ra vƣờn ƣơm Cây có đủ bộ phận đƣợc chuyển qua phòng huấn luyện cây con, với điều kiện, nhiệt độ gần giống với môi trƣờng tự nhiên để cây thích nghi. Sau đó, cây trong bình nuôi cấy khi lấy ra đƣợc rửa sạch agar và đặt trong rổ có lót giấy báo, phun thuốc diệt nấm, đặt nơi thoáng mát, độ ẩm cao, độ chiếu sáng thấp, Đây là giai đoạn quan trọng, vì cây chuyển từ in vitro ra vƣờn ƣơm rất dễ chết do sự khác biệt về điều kiện sống. 1.1.5.6. Ra rễ ex vitro Trong nhiều trƣờng hợp các loài đã nhân chồi thành công trong điều kiện in vitro, dễ ra rễ trong điều kiện tự nhiên thì rút ngắn các giai đoạn của vi nhân giống mà vẫn đảm bảo tỷ lệ cây con sống sót cao khi chuyển ra vƣờn ƣơm, có thể chuyển các chồi in vitro ra điều kiện ex vitro, cấy chồi vào các cơ chất ẩm nhƣ: than bùn, vỏ cây, khoáng chất, đất, cát, để giúp chồi ra rễ. 1.1.6. Các kỹ thuật nhân giống in vitro Theo (Kiên, 2003) có các kỹ thuật sau: 1.1.6.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và chồi bất định Một trong những phƣơng thức sinh trƣởng để đạt đƣợc mục tiêu trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Sau khi vô trùng, mẫu sẽ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dƣỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trƣờng khoáng có 8
Đồ Án Tốt Nghiệp bổ sung chất kích thích sinh trƣởng thích hợp Từ đỉnh sinh trƣởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vƣơn thân, ra lá và rễ để trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con đƣợc chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thƣờng. - Nuôi cấy chồi bất định Hệ thống nuôi cấy này có những yêu cầu tƣơng tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới. Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô sẹo, mà mô sẹo này hình thành trên vết cắt của mẫu vật. - Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhah khi môi trƣờng có sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trƣờng không có chất kích thích tạo mô sẹo. 1.1.6.2. Nuôi cấy tế bào đơn Khi mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng và đƣợc đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn đƣợc lọc và nuôi cấy trên môi trƣờng đặc biệt để tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trƣờng lỏng tế bào đơn đƣợc tách ra và trải trên môi trƣờng thạch. Khi môi trƣờng thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo. Khi trên môi trƣờng thạch có tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 1.1.6.3. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu của Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) trên lúa. Từ cuối những năm 1970 đã nhận đƣợc cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên 30 loại cây. Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đƣờng tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông 9
Đồ Án Tốt Nghiệp qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan. Phƣơng pháp tạo cây đơn bội kép và phƣơng pháp chọn lọc tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao. 1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô Theo (Nguyễn A. P., 2011), có các yếu tố sau: - Kiểu di truyền: Cây hai lá mầm tái sinh tốt hơn cây một lá mầm, hạt trần rất khó tái sinh. Trong một số cây hai lá mầm thì Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriacea và Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất. Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trƣờng tự nhiên thì chúng hầu nhƣ dễ tái sinh trong in vitro. Cũng có trƣờng hợp ngoại lệ nhƣ những đoạn cắt từ lá của cây Kalanchoe farinacea hầu nhƣ không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhƣng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh trƣởng có trong môi trƣờng nuôi cấy. - Tuổi của cây: Khi cây già đi, khả năng tái sinh cũng giảm theo, các mô ở cây non có khả năng tái sinh mạnh hơn. Khi mô phân sinh và chồi đỉnh đƣợc tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ đặc tính già hay non. Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già đƣợc trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào. - Tuổi của mô và cơ quan: Những mẫu non và mềm dễ nuôi cấy hơn mô cứng, nhƣng cũng có trƣờng hợp ngoại lệ. Mẫu cấy từ cuống lá non tái sinh tốt hơn mẫu cấy từ cuống lá già. Khả năng tái sinh của những loài khác nhau thì khác nhau. - Tình trạng sinh lý: Các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dƣỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó nuôi cấy in vitro hơn các chồi đã vƣợt qua giai đoạn này. - Vị trí của mẫu cấy trên cây: 10
Đồ Án Tốt Nghiệp Những chồi tách từ vị trí thấp trên cây dễ tái sinh trên môi trƣờng in vitro hơn, chồi gốc tăng trƣởng nhanh hơn chồi nách. Mô sẹo phát sinh từ những phần khác của cây đều có phản ứng in vitro giống nhau. - Kích thƣớc mẫu cấy: Tế bào, cụm tế bào, mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trƣởng hơn thân, lá, củ. Các phần tách khỏi cây tự cung cấp chất dinh dƣỡng và hormone, do đó mẫu càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Củ, thân là những nơi dự trữ nhiều chất dinh dƣỡng dễ tái sinh trên môi trƣờng in vitro hơn những mẫu có ít chất dinh dƣỡng. Ở những mẫu bị cắt, phần trăm tổn thƣơng cũng ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh. - Vết thƣơng: Bề mặt tổn thƣơng giúp hấp thu chất dinh dƣỡng và tạo ra ethylen nhiều hơn. Ngoài ra, có thể hình thành rễ bất định bằng vết thƣơng. 1.1.8. Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng Đến nay đã có hàng trăm loại môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo đã đƣợc xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trƣờng đều bao gồm những nhóm chất chính sau đây: - Các loại muối khoáng - Nguồn cacbon hữu cơ - Vitamin - Chất điều tiết sinh trƣởng - Nhóm chất tự nhiên - Chất làm đông môi trƣờng a. Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy mô, tế bào thực vật đƣợc phân chia thành hai nhóm theo hàm lƣợng sử dụng: nhóm nguyên tố đa lƣợng và nhóm nguyên tố vi lƣợng. Các nguyên tố khoáng đa lƣợng 11
Đồ Án Tốt Nghiệp Bao gồm các nguyên tố khoáng có trong thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng với nồng độ trên 30 ppm (part per million). Gồm những nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca. Các nguyên tố vi lƣợng: Bao gồm các nguyên tố có trong thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy với nồng độ thấp hơn 30ppm. Đó là các nguyên tố: Fe, B, Mn, Mo, Co, Ni b. Nguồn carbon hữu cơ: Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phƣơng thức dị dƣỡng, cũng có thể sống bán dị dƣỡng nhờ vào khả năng quang hợp trong điều kiện ánh sáng nhân tạo, nhƣng rất yếu nên không đủ nguồn carbon hữu cơ cho sự sinh trƣởng phát triển của cây. Vì vậy, trong môi trƣờng nuôi cấy cần đƣợc bổ sung nguồn carbon hữu cơ và thƣờng dùng saccaroza với liều lƣợng 2-3%. Trong một số trƣờng hợp đặc biệt nhƣ nuôi cấy bao phấn lúa, nuôi cấy tế bào trần có thể dùng glucoza, maltoza, galactoza c. Vitamin Mặc dù mô và tế bào nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp đƣợc các loại vitamin cần thiết, nhƣng thƣờng không đủ về lƣợng, do đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là vitamin thuộc nhóm B với nồng độ khoảng 1ppm. - Vitamin B1 (Thiamin HCl) - Vitamin B2 (Riboflavin - Vitamin B6 (Pyridoxin) - Mio Inositol - Pantotenic axit d. Nhóm chất tự nhiên Các nhà sáng lập ngành nuôi cấy mô trƣớc đây thƣờng sử dụng môi trƣờng dinh dƣỡng rất đơn giản chỉ bao gồm muối khoáng và đƣờng. Ngày nay ngƣời ta đã khẳng định rằng loại môi trƣờng đơn giản nhƣ vậy chƣa đủ cho tế bào sinh trƣởng tốt. Vì vậy, thành phần môi trƣờng ngày càng phong phú, đầy đủ và phức tạp hơn. 12
Đồ Án Tốt Nghiệp Ngƣời ta đã bổ sung vào môi trƣờng một số nhóm chất tự nhiên nhằm làm gia tăng thành phần dinh dƣỡng và cũng có cả các chất có hoạt tính sinh lý nên kích thích sự sinh trƣởng phát triển của cây in vitro. Nhƣ: - Nƣớc dừa: theo kết quả phân tích thành phần nƣớc dừa của Tulecke và ctv (1961) cho thấy trong nƣớc dừa có nhiều nhóm chất cần thiết cho sự sinh trƣởng của tế bào nhƣ: axit amin, axit béo, axit hữu cơ, đƣờng, ARN, AND, myo inositol, các chất có hoạt tính auxin, các glucosit của xytokinin. - Dịch chiếc nấm men: White (1934) lần đầu tiên đã nuôi cấy thành công rễ cây cà chua trong môi trƣờng có dịch chiết nấm men. Thành phần của dịch chiết nấm men gồm có: đƣờng, nucleic axit, amino axit, vitamin, auxin, khoáng. Tác dụng của dịch chiết nấm men cho sự sinh trƣởng của rễ rất tốt nhƣng với mô sẹo thì không tốt. - Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha): chứa chủ yếu một số đƣờng, vitamin và một số chất có hoạt tính điều tiết sinh trƣởng. - Dịch chiết một số loại rau, quả tƣơi (khoai tây, chuối, cà rốt ) thành phần có đƣờng, axitnucleic, axit amin, vitamin, khoáng e. Chất làm đông môi trƣờng (Agar) Agar-là một loại polysacarit của tảo (chủ yếu tảo hồng-Rodophyta). Agar khi ngâm nƣớc ở 800C sẽ chuyển sang dạng sol và 400C thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nƣớc của agar cao (6-12g/l nƣớc). Tuy ở trạng thái gel nhƣng agar vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng. Vì vậy, thuận lợi cho sự hút dinh dƣỡng của cây trong nuôi cấy mô. f. Chất điều tiết sinh trƣởng - Các chất thƣờng dùng trong nuôi cấy mô: nhóm auxin (IAA, NAA, 2,4D, ), nhóm cytokinin (BA, GA3, IBA). - Các chất ít sử dụng trong nuôi cấy mô: nhóm auxin (IBA), nhóm cytokinin (TDZ, kinetin), abscisic acid, ethylen, polyamin, jasmonic acid. 1.1.9. Tổng quan về ánh sáng 13
Đồ Án Tốt Nghiệp Ánh sáng có tác dụng vô cùng quan trọng trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây xanh. Bất cứ một loài thực vật nào cũng phải dựa vào lá để hấp thu ánh sáng, tiến hành quang hợp, tạo ra dinh dƣỡng cần thiết. Ánh sáng đầy đủ, tác dụng quang hợp mạnh, cây cảnh sẽ sinh trƣởng khỏe, mọc nhiều hoa, hoa to; ngƣợc lại, thiếu ánh sáng cây cảnh sinh trƣởng chậm. Trƣớc đây, ngƣời ta thƣờng sử dụng đèn huỳnh quang trong nuôi cấy mô, mà đèn huỳnh quang thì chủ yếu lại đƣợc sử dụng cho sinh hoạt của con ngƣời. Ánh sáng đèn huỳnh quang là sự phối trộn của nhiều vùng quang phổ từ những vùng ánh sáng có bƣớc sóng ngắn 320 nm đến bƣớc sóng dài 800 nm. Có những vùng có bƣớc sóng ngắn không có lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Hình 1.1 Phổ hấp thụ ánh sáng của thực vật (Nguồn: a. Ƣu và nhƣợc điểm của đèn LED Theo GS.TS Phan Hồng Khôi, Giám đốc điều hành dự án chiếu sáng công cộng hiệu suất cao tại Việt Nam: Đèn led là một loại đi-ốt bán dẫn đặc biệt có thể phát ra ánh sáng phổ hẹp, rời rạc khi bị kích thích. Màu sắc của ánh sáng đèn led có thể là hồng ngoại, cận cực tím hoặc ánh sáng nhìn thấy, phụ thuộc vào vật liệu bán dẫn sử dụng và điều kiện hoạt động. 14
Đồ Án Tốt Nghiệp Thông thƣờng ngƣời ta sử dụng hai chùm sáng màu đỏ (R) và màu xanh (B) có đỉnh cực đại ở độ dài sóng 662nm và 430nm. Lúc đó, quang phổ đèn led gần trùng với quang phổ hấp thụ của các diệp lục tố của cây trồng. Chiếu sáng cho cây trồng bằng đèn led còn có ƣu điểm khác nhƣ: thân thiện môi trƣờng, không chứa thủy ngân và các chất độc khác; dễ điều khiển bằng kỹ thuật số với khả năng thay đổi độ sáng 100%; chi phí bảo hành và thay thế hệ thống thấp; dễ dàng thay đổi nhiệt độ màu khi cần thiết Rào cản duy nhất của công nghệ chiếu sáng này là giá thành của led, nhƣng với tốc độ phát triển mau chóng, rào cản này sẽ đƣợc dỡ bỏ. - Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về đèn Tình hình nghiên cứu trên thế giới Nhựt và đồng tác giả (2003) đã chứng minh đƣợc cây dâu tây in vitro phát triển tốt nhất khi đƣợc nuôi cấy với nguồn chiếu sáng đèn LED (70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh) với cƣờng độ chiếu sáng là 60 µmol/m2.s. Nhut (2005) đã chứng minh đƣợc cây con Lan Ý đƣợc nuôi cấy trong hộp CPRW (Culture Pack – Rockwool), sục khí CO2 (3.000 μmol.mol-1), có hệ thống nuôi cấy sử dụng đèn LED và film thoáng khí thích hợp trong vi nhân giống cây Lan Ý và cho chất lƣợng cây tốt nhất. Tanaka và đồng tác giả (1998) đã chứng minh đƣợc sự sinh trƣởng của Cymbidium có thể đƣợc cải thiện sinh trƣởng khi đƣợc nuôi cấy bằng phƣơng pháp quang tự dƣỡng không bổ sung đƣờng dƣới sự chiếu sáng của đèn LED ( ánh sáng LED đỏ và ánh sáng LED xanh kết hợp). Wang và cộng sự (2001) đã chứng minh trong nuôi cấy lông rễ của cây Artemisia annua L cho thấy sinh khối lông rễ và hàm lƣợng artemisia dƣới ánh sáng đỏ cao hơn 17% đến 67% so với dƣới ánh sáng trắng .Linan và đồng tác giả (2002) đã nghiên cứu về sự phát sinh hình thái và sự sinh trƣởng của vảy củ Lilium với nguồn chiếu sáng đèn LED đỏ, LED xanh và LED đỏ kết hợp với LED xanh. Gần đây, trong nghiên cứu của Heo và đồng tác giả (2006) cũng cho thấy với nguồn chiếu sáng đèn LED cây nho tăng khả năng sinh trƣởng và tổng hợp carbohydrate. Trong năm 2012, Huiminli và 15
Đồ Án Tốt Nghiệp cs. cũng đã nghiên cứu về những tác động của nguồn ánh sáng khác nhau đến tốc độ tăng trƣởng và chất lƣợng của cây cải Bắp Trung Quốc (Brassica campestris L.). Tác động của các nguồn ánh sáng khác nhau (màu xanh, màu xanh kết hợp với màu đỏ, màu đỏ), đèn huỳnh quang, ánh sáng mặt trời, sự tăng trƣởng và hàm lƣợng vitamin C, protein hòa tan, sucrose, đƣờng, tinh bột và nồng độ sắc tố trong không gian của cây Bắp cải. Cho ra kết quả khối lƣợng khô của chồi và khối lƣợng khô của rễ cao nhất trong cây con trồng dƣới ánh sáng đèn LED màu đỏ với ánh sáng yếu. Khối lƣợng tƣơi của rễ có tinh bột cao nhất dƣới đèn LED màu đỏ. Hàm lƣợng chlorophyll và vitamin C cao nhất là dƣới đèn LED màu xanh. Đèn LED màu xanh cộng với màu đỏ hỗ trợ tăng trƣởng sinh sản ở cây Bắp cải Trung Quốc, nguồn ánh sáng có thể đƣợc lựa chọn để đáp ứng các yêu cầu của giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Trong năm 2014, Nguyễn Bá Nam và cs. đã nghiên cứu trong đèn LED với sự phối trộn giữa hai LED xanh và LED đỏ với các tỉ lệ lần lƣợt: 100% LED đỏ; 90% LED đỏ kết hợp với 10% LED xanh; 80% LED đỏ kết hợp với 20% LED xanh; 70% LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh; 60% LED đỏ kết hợp với 40% LED xanh; 50% LED đỏ kết hợp với 50% LED xanh đƣợc sử dụng để chiếu sáng bổ sung vào ban đêm nhằm nghiên cứu ảnh hƣởng của chúng lên sự sinh trƣởng và phát triển của ba giống Cúc (Đóa vàng, Sapphire và Kim cƣơng) đƣợc trồng trong nhà kính. Đèn compact 3U đƣợc sử dụng làm nghiệm thức đối chứng. Kết quả cho thấy, tỉ lệ 70% LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh phù hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây Cúc giống Sapphire và Kim cƣơng. Trong khi đó, tỉ lệ 60% LED đỏ kết hợp với 40% LED xanh phù hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây Cúc giống Đóa vàng. Nguyễn Thanh Phƣơng và cs. (2014) nghiên cứu về tác động của phổ ánh sáng trên các loại bình nuôi cấy đến sự sinh trƣởng, phát triển của giống cẩm chƣớng Hồng Hạc đã đƣợc tiến hành trong giai đoạn nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh. Kết quả đèn LED 13R-4B-3W cho cây sinh trƣởng chiều cao tốt, 16
Đồ Án Tốt Nghiệp tuy nhiên đèn LED 17R-3B lại có tác dụng kích thích cây tăng số lá, số chồi cao hơn và cho chất lƣợng cây giống hoàn chỉnh. Năm 2014, Nguyễn Thanh Sang và cs. cũng đã nghiên cứu về tác động của các điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự nhân chồi; sinh trƣởng, phát triển và tổng hợp chlorophyll a và b của cây cúc in vitro. Các đốt thân và các chồi đỉnh cúc đƣợc nuôi cấy dƣới các điều kiện chiếu sáng khác nhau bao gồm LED đỏ, LED xanh, LED vàng, LED xanh lá cây, LED trắng và LED đỏ kết hợp với LED xanh theo nhiều tỷ lệ khác nhau (10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 và 90:10). Kết quả thu đƣợc sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy chiều dài lá, chiều rộng lá, khối lƣợng tƣơi và khối lƣợng khô của chồi đạt tốt nhất ở 50% LED đỏ và 50% LED xanh. Sau 6 tuần nuôi cấy cho thấy khối lƣợng tƣơi, khối lƣợng khô, chiều dài lá và chiều rộng lá của cây đạt tốt nhất ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh. Bên cạnh đó, hàm lƣợng chlorophyll a và chlorophyll b của cây đạt cao nhất ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh. Nhƣ vậy, kết quả từ nghiên cứu cho thấy khả năng nhân chồi tốt nhất là các đốt thân đƣợc nuôi cấy ở 50% LED đỏ và 50% LED xanh và sự hình thành cây tốt nhất là các chồi đỉnh nuôi cấy ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh. 1.2. Tổng quan về cây cúc 1.2.1. Phân loại khoa học Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Magnoliopsida Bộ Asterales Hình 1.2 Chrysanthemum sp. Họ Asteraceae Nguồn: www.dalathasfarm.com Chi Chrysanthemum 1.2.2. Nguồn gốc, lịch sử và phân bố 17
Đồ Án Tốt Nghiệp Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum, đƣợc định nghĩa từ Chiysos (vàng) và themum (hoa) bởi Linnde năm 1973. Hoa cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và một số nƣớc châu Âu. Theo Zenhua, Shouhe hoa cúc đƣợc trồng ở Trung Quốc cách đây 3000 năm, có nguồn gốc từ một số loài hoang dại thuộc loại cúc (Dendranthema), trải qua quá trình trồng trọt, lai tạo và chọn lọc từ những biến dị để trở thành những giống cúc nhƣ ngày nay. Các nhà khảo cổ học Trung Quốc đã chứng minh rằng từ đời Khổng Tử ngƣời ta đã dùng hoa cúc trong các lễ mừng thắng lợi và cây hoa cúc đã đi vào các tác phẩm hội họa, điêu khắc từ đó. Từ những năm 1930, việc trồng hoa cúc đƣợc coi trọng, đƣợc bảo hộ và đề cao, đến những năm 1980, hoa cúc đƣợc phát triển mạnh. Năm 1982, Trung Quốc đã tổ chức triển lãm hoa cúc đầu tiên ở Thƣợng Hải với hơn một nghìn giống cúc, đánh dấu bƣớc chuyển biến quan trọng trong việc trồng hoa cúc. Các năm sau đó các nhà khoa học Trung Quốc đã thu thập mô tả chụp ảnh hàng nghìn màu giống và tiếp tục tổ chức các cuộc triển lãm hoa cúc. Ở Nhật Bản, cây hoa cúc đƣợc di thực từ Trung Quốc sang, nó đƣợc đánh giá rất cao và đƣợc mệnh danh là “Hoàng thất quốc hoa”. Năm 1889 Edsmit đã bắt đầu lai tạo thành công nhiều loại cúc và ông đặt tên cho hơn 100 giống cúc của các thế hệ sau đó, một số khác ngày nay vẫn còn duy trì và đƣợc trồng cho đến ngày nay. Năm 1843, nhà thực vật học ngƣời Anh Fortune mang từ Trung Quốc giống cúc Chusan Daisy lai tạo ra các loại hình cầu và hình tán xạ ngày nay. Năm 1789 nƣớc Pháp nhập từ Trung Quốc 3 loại cúc đại đóa, đến năm 1927 Bemct đã thành công trong việc lai tạo giống cúc mới dẫn đến một sự cải tiến rất mạnh mẽ về giống cúc ở Châu Âu. Ở Mỹ, từ đầu thế kỷ 18 hoa cúc đã đƣợc trồng nhiều, đến năm 1860 hoa cúc trở thành hàng hóa và đƣợc trồng trong nhà lƣới. Ở Việt Nam hoa cúc đƣợc nhập vào từ thế kỷ 15, ngƣời Việt Nam coi hoa cúc là biểu tƣợng của sự thanh cao, là một trong những loài hoa mộc đƣợc xếp vào hàng tứ quý “tùng, cúc, trúc, mai” hoặc “mai, lan, cúc, trúc”. 18
Đồ Án Tốt Nghiệp Hoa cúc đƣợc trồng nhiều nhất ở các nƣớc Nhật Bản, Pháp, Mỹ, Trung Quốc và đƣợc ƣa chuộng bởi sự đa dạng, phong phú về màu sắc, kiểu dáng, kích cỡ hoa, hƣơng thơm kín đáo của hoa. 1.2.3. Đặc điểm thực vật học - Rễ: Rễ của cây hoa Cúc là loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang, phân bố ở tầng mặt đất mặt từ 5-20cm. Kích thƣớc các rễ trong bộ rễ Cúc chênh lệch nhau không nhiều, số lƣợng rễ rất lớn do vậy khả năng hút nƣớc và dinh dƣỡng rất mạnh. Cúc chủ yếu trồng bằng nhân giống vô tính nên rễ không phát sinh từ mầm rễ của hạt mà từ những rễ mọc ở mấu của thân (gọi là mắt) ở những phần ngay sát mặt đất. - Thân: Cây thuộc thân thảo nhỏ, có nhiều đốt giòn dễ gãy càng lớn càng cứng, cây dạng đứng hoặc bò. Kích thƣớc thân cao hay thấp, to hay nhỏ, cứng hay mềm phụ thuộc vào từng giống và thời vụ trồng. Những giống nhập nội thân thƣờng to, mập, thẳng và giòn, ngƣợc lại những giống Cúc dại hay giống cổ truyền Việt Nam thân nhỏ mảnh và cong. Thân có ống tiết nhựa mủ trắng, mạch có bản ngăn đơn. - Lá: Thƣờng là lá đơn không có lá kèm, mọc so le nhau, bản lá xẻ thùy lông chim, phiến lá mềm, mỏng có thể to hoặc nhỏ, màu sắc xanh đậm hay nhạt phụ thuộc vào từng giống. Mặt dƣới phiến lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng. Trong một chu kì sinh trƣởng cây có từ 30-50 lá trên thân. - Hoa, quả: Hoa cúc chủ yếu có 2 dạng: Dạng lƣỡng tính: trong hoa có cả nhị đực và nhụy cái Dạng đơn tính: trong hoa chỉ có nhị đực hoặc nhụy cái, đôi khi có loại vô tính (không có cả nhụy, nhị, hoa này thƣờng ở phía ngoài đầu). Mỗi hoa gồm rất nhiều hoa nhỏ gộp lại trên một cuống hoa hình thành hoa tự đầu trạng mà mỗi 19
Đồ Án Tốt Nghiệp đầu trạng là một bông hoa. Trong thực tế tùy theo mục đích sử dụng mà ngƣời ta để một bông trên một cành hay nhiều bông trên một cành. Màu sắc của hoa cúc rất khác nhau, hầu nhƣ có tất cả các màu tự nhiên: trắng, vàng, đỏ, tím, hồng, nâu, xanh. Trong đó, trên mỗi bông hoa có thể có một màu duy nhất, có thể có vài màu riêng biệt hoặc có rất nhiều màu pha trộn, tạo nên một thế giới màu sắc vô cùng phong phú và đa dạng. Tùy theo cách sắp xếp của cánh hoa mà ngƣời ta phân ra thành nhóm hoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp trên một bông) và nhóm hoa đơn (chỉ có một vòng hoa trên bông). Những cánh hoa nằm ở phía ngoài có màu sắc đậm hơn, xếp nhiều tầng, sít nhau, chặt hay lỏng tùy từng giống, cánh hoa có nhiều hình dáng khác nhau: cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn, có loại cánh dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong. Đƣờng kính của bông hoa phụ thuộc vào giống, giống hoa to có đƣờng kính 10-12cm, loại trung bình 5-7cm và loại nhỏ 1-2cm. Hoa có 4-5 nhị đực dính vào nhau làm thành 1 ống bao xung quanh vòi nhụy, bao phấn nở phía trong theo khe nứt dọc, khi phấn nhị đực chín, bao phấn nở tung hạt phấn ra ngoài nhƣng lúc này nhụy chƣa đến tuổi trƣởng thành, chƣa có khả năng tiếp nhận hạt phấn vì vậy sự thụ phấn, thụ tinh không thành, dẫn đến quả không hạt, muốn có hạt giống phải thụ phấn nhờ sâu bọ hoặc thụ phấn nhân tạo cho hoa. Quả bế, đóng, chứa một hạt, quả có chùm lông do đài tồn tại để phát tán hạt, có phôi thẳng mà không có nội nhũ. 20
Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 1.3. Một số hình ảnh cúc Pico 1.2.4.Tình hình nhân giống cúc trên thế giới và Việt Nam Tình hình trồng hoa cúc trên thế giới Hiện nay, ngành sản xuất hoa cúc trên thế giới đang phát triển mạnh và mang tính thƣơng mại cao. Sản xuất hoa đã mang lại lợi ích kinh tế to lớn cho nền kinh tế các nƣớc trồng hoa trên thế giới nhất là đối với các nƣớc đang phát triển. Hoa cúc đƣợc trồng nhiều nhất ở các nƣớc Nhật Bản, Pháp, Mỹ, Trung Quốc và đƣợc ƣa chuộng bởi sự đa dạng, phong phú về màu sắc, kiểu dáng, kích cỡ hoa, hƣơng thơm kín đáo của hoa. Hà Lan là một trong những nƣớc lớn nhất thế giới về xuất khẩu hoa, cây cảnh nói chung và xuất khẩu cúc nói riêng. Diện tích trồng cúc của Hà Lan chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa tƣơi. Năng suất hoa tƣơi từ năm 1990–1995 tăng trung bình từ 10-15%/ha. Hàng năm Hà Lan đã sản xuất hàng trăm triệu cành hoa cắt và hoa chậu phục vụ cho thị trƣờng tiêu thụ rộng lớn gồm trên 80 nƣớc trên thếgiới. Năm 1998, Hà Lan sản xuất 866 triệu cành và năm 1999, sản xuất 1046 triệu cành hoa cúc cắt. Một trong những nguyên nhân quan trọng góp phần tạo ra sự thành công của Hà Lan là sử dụng phƣơng pháp nhân giống invitro để sản xuất cây con. Sau Hà Lan là Colombia–năm 1990 thu đƣợc 150 triệu USD từ việc xuất khẩu hoa cúc, đến năm 1992 đã lên đến 200 triệu USD. Nhật Bản có nhu cầu sử dụng hoa cúc rất lớn. Diện tích trồng hoa cúc chiếm 2/3 tổng diện tích trồng hoa. Năm 1991 diện tích trồng hoa cúc ở Nhật Bản và 614 ha ngoài trời và 1150 ha nhà kính. Tuy vậy hàng năm Nhật Bản vẫn phải nhập một lƣợng lớn hoa cúc từ Hà Lan và một số nƣớc khác trên thếgiới. Năm 1996 Nhật Bản đã chọn Việt Nam là một trong số những nƣớc sẽ xuất khẩu hoa cúc cho Nhật Bản. Một số nƣớc khác nhƣ Thái Lan, cúc đã đƣợc trồng quanh năm với số lƣợng cành cắt hàng năm là 50.841.500. Trung Quốc cũng là nơi có nguồn hoa cúc phong phú, việc xuất khẩu hoa cúc đƣợc chú trọng ở màu sắc hoa và hình dạng hoa. Đây cũng là nƣớc có kỹ thuật tiên tiến trong việc sản xuất hoa cúc khô. 21
Đồ Án Tốt Nghiệp Tình hình trồng hoa cúc ở Việt Nam Hoa cúc đƣợc du nhập vào Việt Nam từ thế kỷ15, đến đầu thế kỷ19 đã hình thành một sốvùng chuyên nhỏ cung cấp cho nhân dân. Một phần để chơi, một phần phục vụ việc cúng lễ và một phần dùng làm dƣợc liệu. Nếu xét về cơ cấu chủng loại tất cả các loại hoa thì trƣớc những năm 1997 diện tích hoa hồng nhiều nhất chiếm 31% nhƣng từ 1998 trở lại đây diện tích hoa cúc đã vƣợt lên chiếm 42%, trong đó hoa hồng chỉ còn 29,4%. Riêng ở Hà Nội tổng sản lƣợng hoa cúc năm 1999 đạt 41,3 tỷ đồng, xuất khẩu sang Trung Quốc 3,6 tỷ đồng, tốc độ tăng hàng năm khoảng 10%. Hiện nay hoa cúc đƣợc trồng khắp nƣớc ta, nó có mặt ở mọi nơi từ núi cao đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành thị nhƣng chủ yếu tập trung ở các vùng hoa truyền thống của thành phố, khu công nghiệp, khu du lịch, nghỉ mát nhƣ Ngọc Hà, Quảng An, Nhật Tân (Hà Nội), Đằng Hải, Đằng Lâm (Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ Long (Quảng Ninh), Triệu Sơn, thành phố Thanh Hoá (Thanh Hoá), Gò Vấp, Hóc Môn (thành phố Hồ Chí Minh), thành phố Đà Lạt (Lâm Đồng) với tổng diện tích trồng hoa khoảng 2000 ha. Riêng Hà Nội và Đà Lạt là những nơi lý tƣởng cho việc sinh trƣởng và phát triển của hầu hết các giống cúc đƣợc nhập từ nƣớc ngoài vào. 22
Đồ Án Tốt Nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đồ án 2.1.1.Địa điểm Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Thực nghiệm Cây trồng Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. Địa chỉ: 2734 Quốc lộ 1A, Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP.HCM 2.1.2.Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 1 năm 2018 đến tháng 7 năm 2018. 2.2. Vật liệu 2.2.1.Đối tượng và vật liệu nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: cây cúc Pico đƣợc mua tại Dalat hasfarm. Hình 2.1 Chrysanthemum sp. Nguồn: www.dalathasfarm.com - Vật liệu nghiên cứu: thân cúc Pico 2.2.2.Trang thiết bị a. Hóa chất thực hiện - Cồn 96%, 70% - Agar - Đƣờng - Nƣớc cất, nƣớc dừa - Các Stock đa lƣợng, vi lƣợng, vitamin, - Javel, xà phòng - Các chất điều hòa sinh trƣởng BA, NAA, - HCl, NaOH 23
Đồ Án Tốt Nghiệp b. Thiết bị-dụng cụ - Dao cấy, kẹp cấy - Ống nghiệm, chai thủy tinh 500ml - Pipet 1ml, 2ml, 5ml - Micro pipet 1000 l, 500 l - Bóp cao su - Ống đong 500ml, 1000ml - Bông gòn, đèn cồn, giấy cấy - Máy đo pH - Becher - Máy phối môi trƣờng - Tủ sấy - Tủ cấy vô trùng - Nồi hấp khử trùng - Cân điện tử - Máy nƣớc cất 2 lần - Đèn LED, đèn neon 2.2.3.Môi trường nuôi cấy Môi trƣờng khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung thêm 30 g/l sucrose, 8,5 g/l agar, pH= 5,8 và chất điều hòa sinh trƣởng gồm 2 nhóm auxin và cytokinin, nƣớc dừa tuỳ theo từng thí nghiệm. 2.2.4.Điều kiện thí nghiệm Để đảm bảo cây sinh trƣởng và phát triển tốt trong điều kiện phòng nuôi, cần có các điều kiện nuôi cấy sau đây: - Nhiệt độ: 25±20C - Độ ẩm trung bình: 50-60% - Cƣờng độ chiếu sáng: 500-2500 lux (tùy theo từng thí nghiệm) - Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày 24
Đồ Án Tốt Nghiệp Thời gian chiếu sáng và độ ẩm có thể khác nhau tùy thuộc vào mục đích và điều kiện thí nghiệm 2.3. Phƣơng pháp 2.3.1.Pha môi trường a. Chuẩn bị dung dịch mẹ Để thao tác đƣợc thuận tiện trong việc pha môi trƣờng, ta cân hóa chất, pha thành dung dịch mẹ, sau đó khi nào sử dụng chỉ việc pha loãng. Hóa chất pha xong có thể bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh. b. Cách pha môi trƣờng cấy - Bƣớc 1: cân các chất nhƣ đƣờng, agar, hút dung dịch mẹ, khoáng đa lƣợng, khóa vi lƣợng, FE-EDTA và vitamin hòa vào nƣớc. - Bƣớc 2: cân các chất điều hòa sinh trƣởng phù hợp với từng thí nghiệm cho vào dung dịch trên. Đo pH từ 5,7-5,8 (điều chỉnh bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N). - Bƣớc 3: cho agar vào và khuấy đều - Bƣớc 4: phối môi trƣờng vào ống nghiệm hay vào các chai 500ml tùy theo thí nghiệm - Bƣớc 5: đóng nút, ghi rõ ngày tháng, tên môi trƣờng để tránh nhầm lẫn với nhau. 2.3.2.Hấp khử trùng a. Hấp khử trùng môi trƣờng Môi trƣờng sau khi chuẩn bị xong sẽ đƣợc đem hấp vô trùng trong nồi autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1atm trong 20 phút. b. Hấp khử trùng dụng cụ cấy Tất cả các dụng cụ nhƣ giao, kẹp, giấy cấy, erlen, đƣợc gói cẩn thận bằng giấy rồi cho vào bao PP chịu nhiệt. Sau đó tiến hành hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 20 phút. Sau khi hấp, nếu chƣa sử dụng liền thì cất dụng cụ vào tủ sấy ở 800C. 2.4. Bố trí thí nghiệm 25
Đồ Án Tốt Nghiệp 2.4.1.Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cúc Pico. - Mục tiêu của thí nghiệm: xác định đƣợc thời gian khử trùng thích hợp ở nồng độ 5% Javel cho quá trình vô mẫu thân cúc. - Tạo vật liệu vô trùng: trong nội dung này sử dụng những cây cúc Pico không sâu bệnh, không dị dạng, sinh trƣởng và phát triển tốt làm vật liệu tiến hành thí nghiệm. - Cách tiến hành: Khử trùng sơ bộ: các thân thu đƣợc sẽ đƣợc rửa qua nƣớc xà phòng pha loãng trong 5 phút, sau đó rửa lại với nƣớc, lặp lại thao tác 3 lần. Ngâm thân trong dung dịch Javel pha loãng 5% trong 5 phút để loại bỏ bớt nấm và vi khuẩn. Tiếp theo để những mẫu thân này dƣới vòi nƣớc chảy trong 30 phút. Đổ hết nƣớc, cho những mẫu thân này vào erlen vô trùng và đƣa vào tủ cấy. Khử trùng trong tủ cấy: mẫu đƣa vào đƣợc rửa nhanh qua nƣớc cất vô trùng 3 lần. Sau đó ngâm trong cồn 700 trong 30 giây, rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần cho sạch cồn. Tiếp theo cho Javel với các nồng độ bố trí nhƣ bảng dƣới vào và lắc đều trong 5 phút. Sau đó rửa lại 5-6 lần với nƣớc cất, mỗi lần 5 phút cho thật sạch. Cấy mẫu: các mẫu sau khi đƣợc khử trùng sạch đƣợc đặt trên giấy cấy, cắt bỏ những phần bị tổn thƣơng và cấy vào ống nghiệm chứa môi trƣờng MS bổ sung 30g/l đƣờng, 8,5g/l agar, pH=5,8 và nồng độ BA đƣợc bố trí trong bảng 2.1 - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai, mỗi chai 10 mẫu. 26
Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cúc Pico. Nghiệm thức Nồng độ Javel (%) Thời gian (phút) A1 5 5 A2 5 10 A3 5 15 - Chỉ tiêu theo dõi sau 7 ngày, 14 ngày nuôi cấy: Tỷ lệ mẫu vô trùng (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)  Mẫu thân cúc sau 2 tuần nuôi cấy còn sống, không nhiễm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu. 2.4.2.Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả năng nhân chồi mẫu cúc - Mục tiêu thí nghiệm: Xác định đƣợc nồng độ BA thích hợp đến khả năng nhân chồi mẫu cúc. - Cách tiến hành: các cây cúc sống, sinh trƣởng và phát triển khỏe, không bị dị dạng đƣợc chọn làm vật liệu thí nghiệm. Các cây cúc đƣợc cắt đốt 1-1,5cm đƣợc cấy vào môi trƣờng MS bổ sung 30g/l đƣờng, 8,5g/l agar, pH=8,5 và bổ sung BA với nồng độ nhƣ bảng 2.2. - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm có 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai, mỗi chai 10 mẫu. 27
Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả năng nhân chồi mẫu cúc Nghiệm thức BA(mg/l) B1 0,5 B2 1 B3 1,5 B4 2 B5 2,5 B6 3 - Chỉ tiêu theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy: Tỷ lệ tái sinh chồi (%). Số chồi/mẫu. Chiều cao chồi. 2.4.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến khả năng nhân chồi mẫu cúc - Mục tiêu của thí nghiệm: xác định đƣợc nồng độ nƣớc dừa thích hợp đến khả năng nhân chồi mẫu cúc. - Cách tiến hành: các cây cúc sống, sinh trƣởng và phát triển khỏe, không bị dị dạng đƣợc chọn làm vật liệu thí nghiệm. Các cây cúc đƣợc cắt đốt 1-1,5cm đƣợc cấy vào môi trƣờng MS bổ sung 30g/l đƣờng, 8,5g/l agar, pH=8,5 và bổ sung nƣớc dừa với nồng độ nhƣ bảng 2.3 - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm có 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai, mỗi chai 10 mẫu. 28
Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 2.3. Khảo sát nồng độ nƣớc dừa thích hợp đến sự tái sinh chồi mẫu cúc Nghiệm thức Nƣớc dừa (%) C1 0 C2 5 C3 10 C4 15 - Chỉ tiêu theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy: Tỷ lệ tái sinh chồi (%). Số chồi/mẫu. Chiều cao chồi 2.4.4.Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng các loại đèn chiếu sáng đến sự nhân nhanh chồi mẫu cúc - Mục tiêu thí nghiệm: xác định đƣợc loại đèn chiếu sáng thích hợp đến khả năng nhân chồi mẫu cúc - Cách tiến hành: các cây cúc sống, sinh trƣởng và phát triển khỏe, không bị dị dạng đƣợc chọn làm vật liệu thí nghiệm. Các cây cúc đƣợc cắt đốt 1-1,5cm đƣợc cấy vào môi trƣờng MS bổ sung 30g/l đƣờng, 8,5g/l agar, pH=8,5, BA=1,5 sau khi cấy nuôi cấy dƣới các loại đèn chiếu sáng với các màu bố trí dƣới bảng 2.4. 29
Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 2.4. Khảo sát loại đèn chiếu sáng thích hợp đến sự tái sinh chồi mẫu cúc Nghiệm thức Đèn chiếu sáng D1 Neon D2 Đỏ D3 Xanh D4 Trắng D5 60% đỏ-40% xanh - Chỉ tiêu theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy: Tỷ lệ tái sinh chồi (%) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi 2.4.5.Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc - Mục tiêu thí nghiệm: xác định đƣợc nồng độ NAA thích hợp đến sự ra rễ của mẫu cúc. - Cách tiến hành: các cây cúc sống, sinh trƣởng và phát triển khỏe, không bị dị dạng đƣợc chọn làm vật liệu thí nghiệm. Các cây cúc đƣợc cắt đốt 1-1,5cm đƣợc cấy vào môi trƣờng MS bổ sung 30g/l đƣờng, 8,5g/l agar, pH=8,5, nồng độ NAA đƣợc bố trí nhƣ bảng 2.5 30
Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hƣởng NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Nghiệm thức NAA(g/l) E1 0,5 E2 1 E3 1,5 E4 2 E5 2,5 - Chỉ tiêu theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy: Số rễ/cây Chiều dài rễ Số chồi/cây Chiều cao cây 2.5. Thống kê và xử lý số liệu Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Các số liệu thu thập đƣợc đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.2 và MicroSoft Excel 2010®. 31
Đồ Án Tốt Nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico. Việc tìm ra nồng độ chất khử trùng và thời gian tạo mẫu cấy vô trùng là giai đoạn quan trọng. Vì đây là giai đoạn quyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy, mẫu không nhiễm nấm, khuẩn, sinh trƣởng và phát triển khỏe mạnh, giúp tạo vật liệu cho các giai đoạn tạo cây con sau. Mục đích của giai đoạn này là giúp tạo mẫu cấy vô trùng. Tùy vào vị trí lấy mẫu, mẫu non hay mẫu già mà thời gian và nồng độ sử dụng khác nhau. Mẫu già sẽ sinh trƣởng và phát triển khỏe hơn mẫu non, nhƣng dễ nhiễm hơn. Kết quả của thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.1, biểu đồ 3.1 và hình 3.1. Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Chỉ tiêu theo dõi Thời gian xử lý (phút) 7 ngày 14 ngày Tỷ lệ mẫu sống vô trùng Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) (%) 5 100a 86,7a 10 100a 91,1a 15 80b 68,9b CV(%) 8,2 7,6 Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,01. 32
Đồ Án Tốt Nghiệp 120 100 100 100 86.7 91.1 80 tỷ lệ mẫu sống vô 80 68.9 trùng sau 7 ngày 60 nuôi cấy (%) 40 tỷ lệ mẫu sống vô trùng sau 14 ngày 20 0 0 nuôi cấy (%) 0 5 phút 10 phút 15 phút Biểu đồ 3.1: Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico. a. b. Hình a. Mẫu in vitro sạch khỏe Hình b. Mẫu in vitro nhiễm nấm Hình 3.1: Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng 5% Javel đến sự vô trùng mẫu Từ kết quả thu đƣợc ở bảng 3.1, biểu đồ 3.1 và hình 3.1 cho thấy sau 7 ngày nuôi cấy có sự khác biệt giữa các nghiệm thức thí nghiệm, ở nghiệm thức xử lý Javel (5%) trong thời gian 5 phút và 10 phút cho tỷ lệ sống vô trùng cao nhất (100%), còn nghiệm thức 15 phút cho tỷ lệ nhiễm cao nhất (20%). Tƣơng tự nhƣ 33
Đồ Án Tốt Nghiệp vậy, tiếp tục theo dõi đến ngày thứ 14 sau khử trùng, ở nghiệm thức xử lý Javel (5%) trong thời gian 5 phút và 10 phút cho tỷ lệ sống vô trùng cao, đặc biệt là ở thời gian 10 phút, tỷ lệ sống vô trùng đạt cao nhất (91,1%), kế đến là thời gian xử lý 5 phút tỷ lệ mẫu sống vô trùng đạt (86,7%). Thấp nhất là ở mức xử lý 15 phút, tỷ lệ sống vô trùng còn (68,9%). Ở nghiệm thức này một số mẫu bị hoại tử và chết do thời gian khử trùng. Nguyên nhân có sự giảm tỷ lệ mẫu sống vô trùng sau 14 ngày là do dƣới tác động của chất khử trùng, một số mẫu quan sát thấy không có biểu hiện bị nhiễm nấm bệnh nhƣng thực sự chƣa hoàn toàn sạch nấm, khuẩn. Do đó sau 14 ngày xử lý Javel tỷ lệ sống vô trùng ở các nghiệm thức tiếp tục giảm. Một số nghiên cứu sử dụng Javel thƣơng mại từ 5-10% để vô trùng mẫu phục vụ công tác nuôi cấy mô. Theo (Truyền, 2017) đã sử dụng Javel thƣơng mại 10%, trong thời gian 10 phút cho 74 % đoạn thân Dƣơng xỉ lá nhún sống, sạch nấm, khuẩn. Tóm lại:Từ kết quả của thí nghiệm chung tôi chọn thời gian xử lý Javel 5% trong thời gian 10 phút cho kết quả tốt nhất với tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao nhất (91,1%). 3.2.Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. Cytokinin có tác dụng mạnh mẽ trong sự phân chia tế bào, kích thích chồi nách, ức chế lão hóa, hình thành sẹo, sự có mặt của BA trong môi trƣờng nuôi cấy kích thích sự nhân chồi, đối với một số loài thực vật khi BA kết hợp với NAA giúp nhân chồi cao. Khi cấy các đốt thân, chồi non vào môi trƣờng chỉ có BA riêng lẻ đều phát triển thành cụm. (Nguyễn Thị Quý Cơ, 2014). Vật liệu nuôi cấy sử dụng trong thí nghiệm là các chồi cúc Pico in vitro đƣợc chọn cắt thành các đốt có kích thƣớc 1-1,5cm đƣợc cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung BA với các nồng độ đƣợc bố trí nhƣ bảng 3.2, biểu đồ 3.2 và hình 3.2 sau 6 tuần nuôi cấy. 34
Đồ Án Tốt Nghiệp Chỉ tiêu theo dõi Nghiệm thức BA (mg/l) Chiều cao chồi Số chồi (chồi) (cm) 0 1,3e 5,2a 0,5 9,4cd 3,5b 1 12,7b 2,6cd 1,5 16,5a 2,7c 2 10,1c 2,2de 2,5 8,0d 1,9e CV% 8,8 8,1 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,01 18 16.5 16 14 12.7 12 10.1 9.4 10 nghiệm thức 8 8 số chồi (cm) 6 5.2 chiều cao (cm) 3.5 4 2.6 2.7 2.2 2.5 1.5 2 1.9 2 1.3 1 0 0.5 0 1 2 3 4 5 6 Biểu đồ 3.2: Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. 35
Đồ Án Tốt Nghiệp 0,5mg/l 0mg/l 1mg/l 1,5mg/l 2mg/l 2,5mg/l Hình 3.2: Ảnh hƣởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico Sau 6 tuần nuôi cấy chồi cúc Pico trên môi trƣờng MS có bổ sung BA từ 0- 2,5mg/l cho thấy, tất cả các nghiệm thức đều nhân chồi và tỷ lệ chồi tạo đƣợc đều cao hơn so với đối chứng. Ở nghiệm thức bổ sung 1,5mg/l BA đạt số chồi cao nhất là 16,5 chồi, cao gấp 12,7 lần so với nghiệm thức đối chứng 1,3 chồi (đây cũng là nghiệm thức có số lƣợng chồi ít nhất), kế đến là nghiệm thức bổ sung BA 1mg/l (12,7 chồi). Đới với nghiệm thức có nồng độ BA là 2mg/l và 2,5mg/l cho số lƣợng chồi thấp hơn nghiệm thức 1,5mg/l BA là 1,6 và 2,1 lần, tƣơng ứng với số chồi là 10,1 và 8,0 chồi. Từ kết quả thí nghiệm cho thấy: sự hiện diện của BA trong môi trƣờng nuôi cấy đã cảm ứng hình thành chồi, nhƣng ức chế sự tăng trƣởng chồi. Khi không bổ sung BA trong môi trƣờng nuôi cấy tỉ lệ chồi thấp (1,3 chồi), khi nồng độ BA tăng thì khả năng tạo chồi và nhân nhanh chồi tăng, nhƣng nếu nồng độ BA cao vƣợt ngƣỡng 1,5mg/l ức chế sự tạo chồi. Kết quả này phù hợp với báo cáo của Phan 36
Đồ Án Tốt Nghiệp Xuân Huyên và cộng sự (2015) khi tiến hành nuôi cấy in vitro cây lan Miltonia sp. Tuy nhiên, theo nghiên cứu Phạm Định Dũng và cộng sự (2014) khi tiến hành nuôi cấy in vitro cây địa lan hƣơng cát cát, sử dụng môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BA cho số chồi/cụm chồi cao nhất là 6,4 chồi/cụm, thì kết quả nghiên cứu của chúng tôi đƣa ra không giống với kết quả của nhóm nghiên cứu này. Nguyên nhân do nguồn mẫu sử dụng trong thí nghiệm khác nhau, một số yếu tố không hoàn toàn đồng nhất. Ở nghiệm thức không bổ sung BA chiều cao chồi cao nhất (5,2cm). Khi bổ sung BA có sự kích thích nhân chồi nhƣng chiều cao chồi giảm. Nhƣ vậy BA ức chế sự phát triển chiều cao đối với cây cúc Pico. Tuy nhiên ở sự sinh trƣởng chồi, theo báo cáo của Phan Xuân Huyên và cộng sự (2005) khi tiến hành nuôi cấy in vitro cây lan Miltonia sp., sử dụng môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l BA cho chiều cao chồi tốt nhất (1,85cm). Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn khác với chúng tôi, khi nhìn qua biểu đồ ta thấy, nghiệm thức không bổ sung BA cho số chồi thấp nhất nhƣng chiều cao lại phát triển vƣợt trội so với các nghiệm thức còn lại (5,2cm). Khi tăng nồng độ BA từ 0,5-2,5mg/l thì sự tăng trƣởng chồi giảm. Từ kết quả của thí nghiệm chúng tôi chọn BA nồng độ 1,5mg/l là môi trƣờng thích hợp để tái sinh chồi mẫu cúc Pico. 3.3.Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. Trong nƣớc dừa có các amino acid, acid hữu cơ, đƣờng sucrose, glucose, fructose, và các chất có hoạt tính auxin, cytokinin, glycoside với hàm lƣợng cân đối. Phù hợp cho sự tạo chồi và sinh trƣởng của nhiều loại cây. Những hoạt chất này trong nƣớc dừa non cao hơn so với dừa già. Vì vậy trong nhiều nghiên cứu, đặc biệt là những nghiên cứu trên lan, ngƣời ta bổ sung nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy thu đƣợc hiệu quả khả quan, điển hình nhƣ nghiên cứu của (Trịnh Thị Lan Anh, 2011). Vật liệu nuôi cấy sử dụng trong thí nghiệm là các chồi cúc Pico in vitro đƣợc chọn cắt thành các đốt có kích thƣớc 1-1,5cm đƣợc cấy vào môi trƣờng MS có bổ 37
Đồ Án Tốt Nghiệp sung nƣớc dừa với các nồng độ đƣợc bố trí nhƣ bảng 3.3, biểu đồ 3.3 và hình 3.3 sau 6 tuần nuôi cấy. Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. Chỉ tiêu theo dõi Nƣớc dừa (%) Số chồi (chồi/cụm Chiều cao (cm) chồi) 0 1,35b 5,19b 5 1,75ab 5,35b 10 2,12a 6,45a 15 1,78ab 6,62a 20 1,83ab 6,42a CV% 20,07 4,3 Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,01 25 20 15 nghiệm thức số chồi (chồi/cụm chồi) 10 chiều cao (cm) 5 0 1 2 3 4 5 Biểu đồ 3.3: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. 38
Đồ Án Tốt Nghiệp 0% 5% 10% 15% 20% Hình 3.3: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. Khác với thí nghiệm 3.2, sử dụng BA trong nhân chồi thu đƣợc kết quả khá khả quan, số chồi hình thành nhiều, chiều cao chồi hạn chế thì ngƣợc lại, ở thí nghiệm này chúng tôi nhận thấy, số chồi hình thành khá thấp, chiều cao chồi tăng qua từng nghiệm thức. Ở nghiệm thức bổ sung 10% nƣớc dừa cho tỷ lệ chồi đạt cao nhất là 2,12 chồi, ít hơn so với nghiệm thức bổ sung 1,5mg/l BA là 7,78 lần. Thí nghiệm đạt kết quả thấp nhất là không bổ sung nƣớc dừa với số chồi đạt đƣợc là 1,35 chồi. Thế nhƣng chiều cao chồi lại có kết quả vƣợt bật, ở nồng độ không bổ sung nƣớc dừa cây đạt 5,19cm, nhƣng khi nồng độ nƣớc dừa tăng lên 15% chiều cao chồi tăng đến 6,62cm, cao hơn gấp 1,89 lần so với bổ sung 0,5mg/l BA. Khi tiếp tục tăng nồng độ nƣớc dừa lên 20%, chiều cao lại giảm nhƣng không đáng kể (6,42cm). Từ kết quả đó cho thấy, nƣớc dừa không có tác dụng trong sự nhân chồi cúc Pico, mà giúp kéo dài lóng thân, làm phát triển chiều cao cây. Nồng độ nƣớc dừa tăng càng cao kéo theo chiều cao cây tăng, nhƣng tăng không đáng kể. Điển hình nhƣ trong nghiên cứu này, khi chúng tôi tăng nồng độ nƣớc dừa từ 5%-15% chiều cao cây tăng từ 5,35 lên 6,62. Nhƣng khi tiếp tục tăng nồng độ nƣớc dừa lên 20% chiều cao giảm, nhƣng không giảm nhiều, từ 6,62 giảm xuống còn 6,42. Theo báo cáo của Phan Xuân Huyên và cộng sự (2015), nƣớc dừa có tác dụng tốt lên quá trình hình thành chồi và sinh trƣởng của chồi cây, nồng độ nƣớc dừa càng cao tỷ lệ tạo chồi và chiều cao chồi càng tốt. Nƣớc dừa ở nồng độ 15% là tốt nhất cho kết 39
Đồ Án Tốt Nghiệp quả chiều cao đạt 1,45cm, số chồi đạt 6,5. Báo cáo này không phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi. Tóm lại, bổ sung nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy chồi cúc Pico không phù hợp để tái sinh chồi, nhƣng có tác dụng tốt trong việc kéo dài lóng thân, giúp cây cao lớn. 3.4.Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. Ánh sáng cung cấp năng lƣợng cho quang hợp và điều hòa nhân tố cần thiết cho sự phát triển của thực vật (Hoàng Minh Tấn và cs. 2006), cây đƣợc chiếu sáng với bƣớc sóng phù hợp sẽ tái sinh mạnh, hình thành chồi bất định và tạo cây con in vitro. Ánh sáng đỏ đƣợc cảm ứng bằng cách phân hóa lục lạp, kéo dài thân, ánh sáng xanh sẽ đƣợc cảm ứng sinh tổng hợp các sắc tố, tuy nhiên lại ức chế phát triển chiều cao (Trần Ngọc Truồi và cs., 2017) Mục đích của thí nghiệm này là tìm ra loại đèn thích hợp đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico. Vật liệu nuôi cấy sử dụng trong thí nghiệm là các chồi cúc Pico in vitro đƣợc chọn cắt thành các đốt có kích thƣớc 1-1,5cm đƣợc cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung BA 1,5mg/l, sau khi cấy, đặt các chai vừa cấy dƣới các loại đèn đƣợc bố trí dƣới bảng 3.4, biểu đồ 3.4 và hình 3.4. 40
Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. Chỉ tiêu theo dõi Đèn chiếu sáng Số chồi (chồi/cụm chồi) Chiều cao (cm) ab Neon 16,47ab 2,73 b LED đỏ 17,35a 2,48 a LED xanh 13,24bc 3,02 a LED trắng 11,9cd 3,01 c LED phối hợp 9,47d 1,56 CV% 13,54 7,16 Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,01. 20 17.35 18 16.47 16 14 13.24 11.9 12 9.47 10 số chồi (chồi/cụm chồi) 8 6 chiều cao (cm) 4 2.73 2.48 3.02 3.01 1.56 2 0 Neon LED đỏ LED xanh LED trắng 60% đỏ- 40% xanh Biểu đồ 3.4: Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. 41
Đồ Án Tốt Nghiệp NEON LED đỏ LED XANH LED TRẮNG 60%-40% Hình 3.4: Ảnh hƣởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico. Từ kết quả của bảng 3.4, biểu đồ 3.4 và hình 3.4 cho thấy chất lƣợng ánh sáng có ảnh hƣởng đáng kể đến sự nhân chồi và sinh trƣởng chồi cúc Pico. Cụ thể ở công thức LED đỏ cho số chồi đạt cao nhất (17,35 chồi/cụm chồi), chiều cao đạt 2,48cm, chồi phát triển mập mạp, đồng đều, lá dày, xanh đậm, không bị biến dạng do bƣớc sóng của ánh đèn này kích thích sắc tố diệp lục khiến chồi có màu xanh tốt hơn. Kế đến là công thức NEON cho số chồi đạt 16,47 chồi/cụm chồi, chiều cao trung bình 2,73cm, ở nghiệm thức này cũng cho chồi mập mạp, đồng đều, lá dày, xanh đậm. Điều này cho thấy NEON không phải là loại đèn tối ƣu nhất cho sự tái sinh chồi cúc Pico, mặc dù ngày nay nó đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. Tiếp theo ở nghiệm thức LED xanh, số chồi ở nghiệm thức này giảm so với LED đỏ và NEON (13,24 chồi/cụm chồi), tuy nhiên, chiều cao chồi lại tăng rõ rệt (3,02cm), chồi phát triển mập mạp, đồng đều, lá nhỏ, và màu xanh nhạt hơn so với 2 nghiệm thức trên. Cuối cùng là ở nghiệm thức LED trắng và 60% đỏ-40% xanh cho tỷ lệ chồi tạo thành thấp nhất (11,9 chồi/cụm chồi và 9,47 chồi/cụm chồi), thế nhƣng chiều cao chồi của 42
Đồ Án Tốt Nghiệp LED trắng cao hơn và cao xấp xỉ nghiệm thức LED xanh (3,01cm), nghiệm thức 60% đỏ-40% xanh không thích hợp để tái sinh, và ức chế sự sinh trƣởng chồi. Kết quả của thí nghiệm phù hợp với báo cáo của Nguyễn Bá Nam và cộng sự 2012 khi nuôi cấy cúc in vitro, ở nghiệm thức sử dụng 100% LED đỏ cho số chồi/mẫu cao nhất (7,4 chồi) và chiều cao đạt 1,02cm. Từ đó có thể kết luận, ánh sáng đỏ phù hợp cho sự nhân chồi cúc Pico. 3.5.Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. Cây nuôi cấy mô trƣớc khi đƣa ra trồng ngoài vƣờn ƣơm cần phát triển hoàn chỉnh, việc tạo rễ cho cây giúp cây hút nƣớc và muối khoáng để tồn tại ngoài tự nhiên. Nếu rễ kém phát triển sẽ làm cây sinh trƣởng chậm, thậm chí là chết, nhƣng nếu rễ phát triển quá mạnh cũng làm ảnh hƣởng đến các bộ phận khác của cây. Việc tìm ra chất kích thích với nồng độ phù hợp thật sự cần thiết cho cây. Các auxin nhƣ IAA, NAA đƣợc nghiên cứu và ứng dụng nhiều hiện nay vì nó đóng vai trò nhƣ chất thúc đẩy sự tăng trƣởng và giãn nở của tế bào, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính (Trịnh A. L., 2016). Vật liệu nuôi cấy sử dụng trong thí nghiệm là các chồi cúc Pico in vitro đƣợc chọn cắt thành các đốt có kích thƣớc 1-1,5cm đƣợc cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung NAA với các nồng độ đƣợc bố trí nhƣ bảng 3.5, biểu đồ 3.5 và hình 3.5 sau 6 tuần nuôi cấy. 43
Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. Chỉ tiêu theo dõi Nghiệm thức Chiều dài rễ Chiều cao NAA (mg/l) Số rễ Số chồi (cm) cây (cm) bc 0,5 7,7d 4,47abc 3,4c 3,7 a 1 9,6ab 5,18a 2,4d 6,0 ab 1,5 9,1bc 4,06bc 4,3b 4,6 a 2 10,7a 4,72ab 2,3d 5,8 c 2,5 8,4cd 3,82c 5,2a 2,9 CV% 6,95 10,12 7,59 16,81 Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,01. 44
Đồ Án Tốt Nghiệp 12 10.7 10 9.6 9.1 8.4 8 7.7 nghiệm thức 6 5.8 số rễ 6 5.18 5.2 chiều dài rễ (cm) 4.47 4.6 4.72 4.064.3 số chồi 3.7 3.82 4 3.4 2.9 chiều cao cây (cm) 2.4 2.3 2.5 2 2 1.5 1 0.5 0 1 2 3 4 5 Biểu đồ 3.5: Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. 2mg/l 0,5mg/l 1mg/l 1,5mg/l 2,5mg/l Hình 3.5: Ảnh hƣởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. Qua kết quả ở bảng 3.5, biểu đồ 3.5 và hình 3.5 cho thấy, khi bổ sung NAA vào môi trƣờng nuôi cấy tất cả các nghiệm thức có ảnh hƣởng đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. Sau khi nuôi cấy đƣợc 1 tuần, qua sự theo dõi chúng tôi thấy mẫu bắt đầu tạo sẹo, sau đó vừa tái sinh chồi và vừa hình thành rễ. Từ đó cho thấy NAA không chỉ giúp cây hình thành rễ mà còn có tác dụng trong việc hình thành mô sẹo. Ở nghiệm thức bổ sung 2mg/l NAA cho số rễ nhiều nhất (10,7 rễ), tuy nhiên ở nghiệm thức bổ 45
Đồ Án Tốt Nghiệp sung 1mg/l NAA cho 9,6 rễ, giữa hai nghiệm thức này không có sự khác biệt về mặt thống kê. Ở hai nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l và 2,5mg/l cho số rễ thấp nhất lần lƣợt là 7,7 rễ và 8,4 rễ, tƣơng tự chiều dài rễ cũng thấp nhất ở hai nghiệm thức này. Từ đó cho thấy, khi bổ sung NAA với nồng độ quá thấp hay quá cao (0,5mg/l hay 2,5 mg/l) sẽ ức chế hình thành rễ và chiều dài rễ. Khi bổ sung đầy đủ sẽ kích thích cây ra rễ và đạt chiều dài tốt nhất. Kết quả của nghiên cứu phù hợp một phần với báo cáo của Nguyễn Thị Hồng Dƣ, 2017 trên cây Sâm cau, ở nghiệm thức 1mg/l NAA cho kết quả rễ và chiều dài rễ đạt cao nhất (3,42 rễ, 4,10cm). Tóm lại ở nghiệm thức 1mg/l và 2mg/l NAA cho số rễ và chiều dài rễ tốt nhất. Tuy nhiên chọn nghiệm thức 1mg/l NAA để tạo rễ để tiết kiệm chi phí. 46
Đồ Án Tốt Nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận Qua quá trình thực hiện các thí nghiệm trên cây cúc Pico (Chrysanthemum sp.), đã xây dựng đƣợc quy trình nhân giống cúc Pico và kết quả nhƣ sau: Giai đoạn 1: (tạo nguồn vật liệu ban đầu): quy trình khử trùng mẫu sử dụng nồng độ Javel 5% xử lý mẫu trong thời gian 10 phút (nghiệm thức A2) cho hiệu quả khử trùng tốt nhất. Giai đoạn 2: (nhân chồi): nghiệm thức tạo chồi tốt nhất trên môi trƣờng MS có bổ sung 1,5 mg/l BA, 100% LED đỏ (nghiệm thức B4 và nghiệm thức D2). Giai đoạn 3 (tạo cây hoàn chỉnh): cây cúc tạo rễ tốt nhất trên môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l NAA (nghiệm thức E2). 4.2.Kiến nghị Do thời gian thực hiện đồ án có hạn nên tôi đƣa ra một vài kiến nghị nhƣ sau: - Khảo sát thêm một số loại môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để tạo sẹo cúc Pico. - Khảo sát thêm một số loại môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để nhân chồi cúc Pico ví dụ BA kết hợp NAA, - Khảo sát thêm một số kỹ thuật nuôi cấy cúc Pico, ví dụ nhƣ: nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng-lắc, nuôi cấy trên hộp TIS, - Khảo sát cách trồng cúc ngoài vƣờn ƣơm. 47
Đồ Án Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ảnh hƣởng của ánh sáng đơn sắc đến quá trình phát sinh hình thái của một số loại cây trồng nuôi cấy in vitro. Đƣợc truy lục từ qua-trinh-phat-sinh-hinh-thai-cua-mot-so-loai-cay-trong-nuoi-cay-in-vitro.htm 2. Ánh sáng có tác dụng gì trong sự sinh trƣởng phát triển của cây cảnh. (2014). Đƣợc truy lục từ sang-co-tac-dung-gi-trong-su-sinh-truong-phat 303 3. Cây phát triển nhanh, sạch nhờ đèn LED. Đƣợc truy lục từ 4. CHƢƠNG II. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT - NHÂN GIỐNG IN VITRO. (2011). Đƣợc truy lục từ nghe-nuoi-cay-mo-va-te-bao-thuc-vat-nhan-giong-in-vitro-573760.html 5. Đặc điểm thực vật học của cây hoa cúc. Đƣợc truy lục từ 6. Đặng, C. N. (2006). Nghiên cứu xác định một số biện pháp kỹ thuật tăng năng suất, chất lƣợng của một số giống cúc chi nhập nội. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam. 7. Jiang , H. Q. (2004). Hỏi đáp về kỹ thuật nuôi trồng hoa và cây cảnh (Tập 1). (M. V. GS. Trần, Dịch giả) Nhà xuất bản Nông nghiệp. 8. Kiên, D. C. (2003). Nuôi cấy mô thực vật. TP.HCM: Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP.HCM. Truy lục ngày 10 15, 2003 9. Nguyễn , A. P. (2011, 04 27). Giáo trình Nhân giống in vitro. Truy lục ngày 07 20, 2018 10. Nguyễn, C. Q., Trần, T. V., Võ , M. B., Trần, T. T., & Nguyễn , S. H. (2014). Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo và chồi của cây Long Não (Cinnamomum camphora (L.) Sieb.) nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học và Phát triển 2014, trang 1034-1041. 48
Đồ Án Tốt Nghiệp 11. Nguyễn, D. H. (2017). Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sâm cau (Curculigo orchioides gaertn). Hồ Chí Minh. 12. Nguyễn, N. T., Nguyễn, V. T., Nguyễn, N. P., & Huỳnh, P. T. (2016). Nghiên cứu ảnh hƣởng của ánh sáng đơn sắc (đèn LED) đến hiệu quả nhân giống in vitro cây Lan Gấm . Đà Nẵng: Hội Động vật học Frankfurt tại Việt Nam và Khoa Sinh - Môi trƣờng. 13. Nguyễn, T. B. (2004). Giáo trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cần Thơ: Đại học Cần Thơ. 14. Phạm, Q. M., & Khúc, A. T. (2011). Vi nhân giống cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) tại trƣờng đại học Nha Trang. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thuỷ sản, 53-58. 15. Phạm, T. T. (2014). Xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun - 3) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Khoá luận tốt nghiệp đại học, Hà Nội. 16. Phan, H. X., Hoàng, C. V., & Nguyễn, H. P. (2015). Nghiên cứu nhân giống in vitro cây hoa lan Miltonia sp. Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015, 13(7), 1128- 1135. 17. Sai lầm cần tránh khi dùng đèn LED trong nông nghiệp. (2017). Đƣợc truy lục từ nong-nghiep-116-153-9177.aspx 18. Sáng, V. Q. (2017). Giáo trình Sinh lý Thực vật Ứng dụng. Đại học Nông nghiệp I Hà Nội. 19. Trần Ngọc Truồi và cs. (2017). NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA HỆ THỐNG CHIẾU SÁNG ĐƠN SẮC ĐẾN QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HOA CHUÔNG (Sinningia speciosa). Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp, 1(1), 195-201. 20. Trần, M. V. (1997). Giáo trình Nuôi cấy mô tế bào thực vật. 21. Trịnh , A. L. (2016). Giáo trình Công nghệ Sinh học Thực vật. Thành phố Hồ Chí Minh. 22. Trịnh, A. T., & Dƣơng, N. T. (2011). Ảnh hƣởng của nƣớc dừa già tới quá trình phát sinh hình thái của phôi vô tính Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis Amabilis). Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trƣờng và Công nghệ sinh học năm 2011, trang 138-142. 49
Đồ Án Tốt Nghiệp 23. Truyền, P. T. (2017). Bƣớc đầu nghiên cứu nhân giống in vitro cây dƣơng xỉ lá nhún (Polystichum sp.). TP.HCM. 50
Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC - XỬ LÝ SỐ LIỆU TỶ LỆ MẪU SỐNG KHÔNG NHIỄM SAU 7 NGÀY XỬ LÝ MẪU. The SAS System 11:16 Friday, July 23, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values SOPHUT 3 10 15 5 TYLESONGKHONGNHIEM 4 66.67 80 93.33 100 Number of observations 9 1
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 11:16 Friday, July 23, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLESONGKHONGNHIEM Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 800.000000 400.000000 6.75 0.0291 Error 6 355.377800 59.229633 Corrected Total 8 1155.377800 R-Square Coeff Var Root MSE TYLESONGKHONGNHIEM Mean 0.692414 8.245799 7.696079 93.33333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F SOPHUT 2 800.0000000 400.0000000 6.75 0.0291 2
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 11:16 Friday, July 23, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TYLESONGKHONGNHIEM NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 59.22963 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 15.376 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SOPHUT A 100.000 3 10 A A 100.000 3 5 B 80.000 3 15 3
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 11:16 Friday, July 23, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLESONGKHONGNHIEM NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 59.22963 Number of Means 2 3 Critical Range 15.38 15.94 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N SOPHUT A 100.000 3 10 A A 100.000 3 5 B 80.000 3 15 4
Đồ Án Tốt Nghiệp - XỬ LÝ SỐ LIỆU TỶ LỆ MẪU SỐNG KHÔNG NHIỄM SAU 14 NGÀY XỬ LÝ MẪU. The SAS System 11:21 Friday, July 23, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values SOPHUT 3 10 15 5 TYLESONGKHONGNHIEM 6 66.7 73.3 80 86.7 93.3 100 Number of observations 9 5
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 11:21 Friday, July 23, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLESONGKHONGNHIEM Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 829.926667 414.963333 10.58 0.0108 Error 6 235.413333 39.235556 Corrected Total 8 1065.340000 R-Square Coeff Var Root MSE TYLESONGKHONGNHIEM Mean 0.779025 7.617141 6.263829 82.23333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F SOPHUT 2 829.9266667 414.9633333 10.58 0.0108 6
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 11:21 Friday, July 23, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TYLESONGKHONGNHIEM NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 39.23556 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 12.514 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SOPHUT A 91.133 3 10 A A 86.667 3 5 B 68.900 3 15 7
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 11:21 Friday, July 23, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLESONGKHONGNHIEM NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 39.23556 Number of Means 2 3 Critical Range 12.51 12.97 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N SOPHUT A 91.133 3 10 A A 86.667 3 5 B 68.900 3 15 8
Đồ Án Tốt Nghiệp - XỬ LÝ SỐ LIỆU CHIỀU CAO CHỒI THÍ NGHIỆM 2 The SAS System 10:24 Sunday, July 25, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values BA 6 0 0.5 1 1.5 2 2.5 CHIEUCAO 16 1.82 1.87 1.89 2.13 2.26 2.29 2.34 2.63 2.92 2.98 3.35 3.49 3.61 4.85 5.34 5.37 Number of observations 18 9
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 10:24 Sunday, July 25, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUCAO Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 21.32222778 4.26444556 71.03 F BA 5 21.32222778 4.26444556 71.03 <.0001 10
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 10:24 Sunday, July 25, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUCAO NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.060039 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.4359 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N BA A 5.1867 3 0 B 3.4833 3 0.5 C 2.7300 3 1.5 C D C 2.6133 3 1 D D E 2.2433 3 2 E E 1.8600 3 2.5 11
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 10:24 Sunday, July 25, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for CHIEUCAO NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.060039 Number of Means 2 3 4 5 6 Critical Range .4359 .4563 .4686 .4768 .4824 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N BA A 5.1867 3 0 B 3.4833 3 0.5 C 2.7300 3 1.5 C D C 2.6133 3 1 D 12
Đồ Án Tốt Nghiệp D E 2.2433 3 2 E E 1.8600 3 2.5 - XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI THÍ NGHIỆM 2 The SAS System 10:21 Sunday, July 25, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values BA 6 0 0.5 1 1.5 2 2.5 SOCHOI 17 1.3 1.37 7.87 7.9 8.27 8.3 9.03 9.5 9.7 10.37 11.47 11.7 12.53 13.83 15.73 16.67 17 Number of observations 18 13
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 10:21 Sunday, July 25, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 382.5761167 76.5152233 105.57 F BA 5 382.5761167 76.5152233 105.57 <.0001 14
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 10:21 Sunday, July 25, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.724778 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 1.5145 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N BA A 16.4667 3 1.5 B 12.6867 3 1 C 10.0667 3 2 C D C 9.3800 3 0.5 D D 8.0233 3 2.5 E 1.3467 3 0 15
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 10:21 Sunday, July 25, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.724778 Number of Means 2 3 4 5 6 Critical Range 1.515 1.585 1.628 1.657 1.676 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N BA A 16.4667 3 1.5 B 12.6867 3 1 C 10.0667 3 2 C D C 9.3800 3 0.5 D 16
Đồ Án Tốt Nghiệp D 8.0233 3 2.5 E 1.3467 3 0 - XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI THÍ NGHIỆM 3 The SAS System 20:34 Friday, July 16, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NUOCDUA 5 0 10 15 20 5 SOCHOI 14 1.3 1.37 1.38 1.43 1.5 1.53 1.63 1.77 1.87 1.93 2.1 2.3 2.37 2.5 Number of observations 15 17
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:34 Friday, July 16, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 0.91662667 0.22915667 1.82 0.2013 Error 10 1.25786667 0.12578667 Corrected Total 14 2.17449333 R-Square Coeff Var Root MSE SOCHOI Mean 0.421536 20.06776 0.354664 1.767333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NUOCDUA 4 0.91662667 0.22915667 1.82 0.2013 18
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:34 Friday, July 16, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.125787 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.6452 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NUOCDUA A 2.1233 3 10 A B A 1.8333 3 20 B A B A 1.7767 3 15 B A B A 1.7533 3 5 B B 1.3500 3 0 19
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:34 Friday, July 16, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.125787 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range .6452 .6743 .6913 .7023 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NUOCDUA A 2.1233 3 10 A B A 1.8333 3 20 B A B A 1.7767 3 15 B A B A 1.7533 3 5 B B 1.3500 3 0 20
Đồ Án Tốt Nghiệp - XỬ LÝ SỐ LIỆU CHIỀU CAO CHỒI THÍ NGHIỆM 3 The SAS System 20:44 Friday, July 16, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NUOCDUA 5 0 10 15 20 5 CHIEUCAO 14 4.85 5.02 5.34 5.37 5.5 5.52 6.24 6.29 6.33 6.4 6.43 6.44 6.77 6.82 Number of observations 15 21
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:44 Friday, July 16, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUCAO Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 5.57529333 1.39382333 20.89 F NUOCDUA 4 5.57529333 1.39382333 20.89 <.0001 22
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:44 Friday, July 16, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUCAO NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.066727 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.4699 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NUOCDUA A 6.6233 3 15 A A 6.4500 3 10 A A 6.4233 3 20 B 5.3467 3 5 B B 5.1867 3 0 23
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:44 Friday, July 16, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for CHIEUCAO NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.066727 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range .4699 .4911 .5035 .5115 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NUOCDUA A 6.6233 3 15 A A 6.4500 3 10 A A 6.4233 3 20 B 5.3467 3 5 B B 5.1867 3 0 24
Đồ Án Tốt Nghiệp - XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI THÍ NGHIỆM 4 The SAS System 12:19 Monday, July 26, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values LED 5 0 1 2 3 4 SOCHOI 14 8.3 10 10.1 11.3 11.8 12.2 12.6 12.7 14 15.47 15.73 16.67 17 20.7 Number of observations 15 25
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 12:19 Monday, July 26, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 112.6789650 28.1697413 8.54 0.0029 Error 10 32.9758083 3.2975808 Corrected Total 14 145.6547733 R-Square Coeff Var Root MSE SOCHOI Mean 0.773603 13.54022 1.815924 13.41133 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F LED 4 112.6789650 28.1697413 8.54 0.0029 26
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 12:19 Monday, July 26, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 3.297581 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 3.3852 Harmonic Mean of Cell Sizes 2.857143 NOTE: Cell sizes are not equal. Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N LED A 17.350 2 1 A B A 16.467 3 0 B B C 13.243 4 2 C D C 11.900 3 3 D 27
Đồ Án Tốt Nghiệp D 9.467 3 4 28
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 12:19 Monday, July 26, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 3.297581 Harmonic Mean of Cell Sizes 2.857143 NOTE: Cell sizes are not equal. Number of Means 2 3 4 5 Critical Range 3.385 3.538 3.627 3.685 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N LED A 17.350 2 1 A B A 16.467 3 0 B B C 13.243 4 2 C 29
Đồ Án Tốt Nghiệp D C 11.900 3 3 D D 9.467 3 4 - XỬ LÝ SỐ LIỆU CHIỀU CAO CHỒI THÍ NGHIỆM 4 The SAS System 12:09 Monday, July 26, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values LED 5 0 1 2 3 4 CHIEUCAO 14 1.55 1.56 1.57 2.29 2.47 2.48 2.87 2.92 2.97 2.98 3 3.02 3.08 3.14 Number of observations 15 30
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 12:09 Monday, July 26, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUCAO Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 4.34064000 1.08516000 32.34 F LED 4 4.34064000 1.08516000 32.34 <.0001 31
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 12:09 Monday, July 26, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUCAO NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.033553 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.3332 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N LED A 3.0167 3 2 A A 3.0100 3 3 A B A 2.7300 3 0 B B 2.4767 3 1 C 1.5600 3 4 32
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 12:09 Monday, July 26, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for CHIEUCAO NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.033553 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range .3332 .3482 .3571 .3627 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N LED A 3.0167 3 2 A A 3.0100 3 3 A B A 2.7300 3 0 B B 2.4767 3 1 C 1.5600 3 4 33
Đồ Án Tốt Nghiệp - XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ RỄ THÍ NGHIỆM 5 The SAS System 19:49 Friday, July 16, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NAA 5 0.5 1 1.5 2 2.5 SORE 15 7.2 7.57 7.87 7.9 8.3 8.9 8.93 9.23 9.33 9.5 9.53 9.58 9.84 10.9 11.6 Number of observations 15 34
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 19:49 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SORE Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 16.30044000 4.07511000 10.22 0.0015 Error 10 3.98813333 0.39881333 Corrected Total 14 20.28857333 R-Square Coeff Var Root MSE SORE Mean 0.803430 6.956051 0.631517 9.078667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NAA 4 16.30044000 4.07511000 10.22 0.0015 35
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 19:49 Friday, July 16, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SORE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.398813 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.1489 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NAA A 10.6933 3 2 A B A 9.6233 3 1 B B C 9.0533 3 1.5 C D C 8.3667 3 2.5 D D 7.6567 3 0.5 36
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 19:49 Friday, July 16, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for SORE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.398813 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range 1.149 1.201 1.231 1.250 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NAA A 10.6933 3 2 A B A 9.6233 3 1 B B C 9.0533 3 1.5 C D C 8.3667 3 2.5 D D 7.6567 3 0.5 37
Đồ Án Tốt Nghiệp - XỬ LÝ SỐ LIỆU CHIỀU DÀI RỄ THÍ NGHIỆM 5 The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NAA 5 0.5 1 1.5 2 2.5 CHIEUDAIRE 14 3.34 3.7 3.85 3.91 4.15 4.16 4.4 4.44 4.68 4.71 4.76 4.85 5.42 5.67 Number of observations 15 38
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUDAIRE Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 3.45344000 0.86336000 4.26 0.0288 Error 10 2.02820000 0.20282000 Corrected Total 14 5.48164000 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUDAIRE Mean 0.630001 10.12490 0.450355 4.448000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NAA 4 3.45344000 0.86336000 4.26 0.0288 39
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUDAIRE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.20282 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.8193 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NAA A 5.1767 3 1 A B A 4.7167 3 2 B A B A C 4.4700 3 0.5 B C B C 4.0567 3 1.5 C C 3.8200 3 2.5 40
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for CHIEUDAIRE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.20282 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range .8193 .8562 .8779 .8918 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NAA A 5.1767 3 1 A B A 4.7167 3 2 B A B A C 4.4700 3 0.5 B C B C 4.0567 3 1.5 C C 3.8200 3 2.5 41
Đồ Án Tốt Nghiệp - XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI THÍ NGHIỆM 5 The SAS System 20:17 Friday, July 16, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NAA 5 0.5 1 1.5 2 2.5 SOCHOI 13 2.1 2.27 2.37 2.5 2.83 3 3.53 4.13 4.3 4.47 5.07 5.13 5.47 Number of observations 15 42
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:17 Friday, July 16, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 18.67180000 4.66795000 65.45 F NAA 4 18.67180000 4.66795000 65.45 <.0001 43
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:17 Friday, July 16, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.07132 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.4859 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NAA A 5.2233 3 2.5 B 4.3000 3 1.5 C 3.3533 3 0.5 D 2.4000 3 1 D D 2.3233 3 2 44
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:17 Friday, July 16, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.07132 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range .4858 .5077 .5206 .5288 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NAA A 5.2233 3 2.5 B 4.3000 3 1.5 C 3.3533 3 0.5 D 2.4000 3 1 D D 2.3233 3 2 45
Đồ Án Tốt Nghiệp - XỬ LÝ SỐ LIỆU CHIỀU CAO CÂY THÍ NGHIỆM 5 The SAS System 22:36 Monday, July 26, 2018 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NAA 5 0.5 1 1.5 2 2.5 CHIEUCAOCAY 13 2.18 3.12 3.28 3.3 3.47 3.78 3.97 5.39 5.52 5.6 5.67 6.27 6.92 Number of observations 15 46
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 22:36 Monday, July 26, 2018 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUCAOCAY Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 20.83133333 5.20783333 8.64 0.0028 Error 10 6.02480000 0.60248000 Corrected Total 14 26.85613333 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUCAOCAY Mean 0.775664 16.81291 0.776196 4.616667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NAA 4 20.83133333 5.20783333 8.64 0.0028 47
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 22:36 Monday, July 26, 2018 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUCAOCAY NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.60248 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.4121 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NAA A 6.0133 3 1 A A 5.7767 3 2 A B A 4.6333 3 1.5 B B C 3.7400 3 0.5 C C 2.9200 3 2.5 48
Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 22:36 Monday, July 26, 2018 4 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for CHIEUCAOCAY NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.60248 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range 1.412 1.476 1.513 1.537 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NAA A 6.0133 3 1 A A 5.7767 3 2 A B A 4.6333 3 1.5 B B C 3.7400 3 0.5 C C 2.9200 3 2.5 49
Đồ Án Tốt Nghiệp 50