›

Đồ án Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyển (Anoectochilus Setaceus) in Vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc

pdf 78 trang thiennha21 13/04/2022 5090
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyển (Anoectochilus Setaceus) in Vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_nhan_nhanh_choi_lan_kim_tuyen_anoectochilus.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyển (Anoectochilus Setaceus) in Vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc

  1. tên đề tài.txt Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyển (Anoectochilus Setaceus) in Vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc Giảng viên hướng dẫn: TS. Hà Thị Loan SV: Nguyễn Thị Kim Ngân Lớp: 13DSH01 MSSV: 1311101018 Page 1
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của Tiến sĩ Hà Thị Loan. Các số liệu sử dụng phân tích trong đồ án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây, nếu phát hiện có bất kỳ gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2017 Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Kim Ngân
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bài luận văn này, em luôn nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp Lãnh đạo, các tập thể và cá nhân. Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn bổ ích trong suốt bốn năm học vừa qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn và sự tri ân sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về kinh phí và trang thiết bị để em thực hiện đề tài này. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Tiến sĩ Hà Thị Loan cùng với những Anh (Chị) cán bộ làm việc tại phòng Thực nghiệm cây trồng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được học hỏi, tiếp cận những kiến thức thực tế, tích lũy nhiều kinh nghiệm về thao tác trong phòng thí nghiệm. Đồng thời các Anh (Chị) đã góp ý, bổ sung và chỉnh sửa những kiến thức thiếu sót để em có thể hoàn thành tốt đề tài này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình những người đã luôn bên cạnh em, cổ vũ tinh thần và đã ủng hộ em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2017 Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Kim Ngân
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật 4 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật 4 1.1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 5 1.1.3. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật 12 1.1.4. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật 13 1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 14 1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 14 1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo 14 1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn 15 1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần 15 1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn 16 1.2.6. Nuôi cấy protoplast 16 1.3. Chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 16 1.3.1. Đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ 16 1.3.2. Vai trò, chức năng của oncogen rol (root inducing locus) 19 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3. Tình hình nghiên cứu rễ tóc trên một số loài dược liệu và cây trồng 21 1.4. Tổng quan về cây lan kim tuyến 22 1.4.1. Nguồn gốc và phân bố 22 1.4.2. Phân loại. 23 1.4.3. Đặc điểm hình thái 23 1.4.4. Điều kiện sinh sống của lan kim tuyến 25 1.4.5. Giá trị dược liệu của lan kim tuyến 25 1.4.6. Nhân giống cây lan kim tuyến 26 1.4.7. Tình hình nghiên cứu cây lan kim tuyến 27 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29 2.2. Vật liệu nghiên cứu 29 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 29 2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất 29 2.2.3. Môi trường nuôi cấy 31 2.2.4. Điều kiện nuôi cấy 31 2.3. Phương pháp 31 2.3.1. Pha môi trường 31 2.3.2. Các thao tác trong phòng cấy 32 2.4. Nội dung nghiên cứu 33 2.5. Bố trí thí nghiệm 33 2.5.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy chồi lan kim tuyến 33 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến. 34 2.5.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined. 3.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến 38 3.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến. 43 3.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 48 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 4.1. Kết luận. 54 4.2. Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CNSH Công Nghệ Sinh Học TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh MS Murashige – Skoog BA Benzyl Adenin NAA Napthalene Acetic Acid BAP 6-Benzyl Amino Purine 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid IBA 3-Indole butyric acid IAA 3-Indole acetic acid NT Nghiệm thức ĐC Đối chứng Cs Cộng sự YMB Yeast mannitol broth B5 Gamborg’s iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (Street, 1974) 6 Bảng 2.1. Khảo sát nồng độ BA và NAA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến 34 Bảng 2.2. Khảo sát nồng độ BA và NAA dùng để nhân nhanh chồi lan kim tuyến . 35 Bảng 2.3. Các cơ quan của lan kim tuyến được chuyển gen 37 Bảng 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến sau 8 tuần theo dõi. 39 Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến sau 8 tuần theo dõi. 44 Bảng 3.3. Khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chủng 15834 và chủng TR7 sau 4 tuần nuôi cấy. 48 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. 40 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến tỷ lệ tái sinh chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. 41 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. 46 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 19 Hình 1.2. Lan kim tuyến ở ngoài vườn ươm 23 Hình 2.1. Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên 29 Hình 3.1. Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến. 38 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự nhân nhanh chồi lan kim tuyến 44 Hình 3.3. Ảnh hưởng của việc chuyển gen chứa vi khuẩn Agobacterium rhizogenes chủng Tr7 và chủng 15834 vào các cơ quan của lan kim tuyến sau 4 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, NT4. 51 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề Từ xưa đến nay, lan được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa dành cho bậc vương giả. Lan là một loài hoa được trồng rất phổ biến ở Việt Nam nói riêng và ở các nước trên thế giới nói chung. Lan ở việt nam tượng trưng cho một vẻ đẹp thuần khiết, thanh cao và mang nhiều ý nghĩa. Cùng với sự phát triển của ngành trồng lan trong thời gian qua, loài hoa quý này không chỉ hấp dẫn mọi du khách do sự đa dạng về hình dáng và màu sắc mà còn mang lại giá trị hiệu quả kinh tế cao. Họ Lan Orchidaceae là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường Lan được sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài Lan còn được sử dụng làm thuốc (Nguyễn Tiến Bân, 2005). Chi Lan kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài Lan kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, Lan kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và trong Sách Đỏ Việt Nam (2007), phân hạng EN A1a,c,d (Sách Đỏ Việt Nam, 2007). Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào trần đã được công bố trên nhiều loài cây dược liệu, đáng chú ý là sản xuất và thương mại hóa shikonin, berberine and ginseng ở Nhật Bản. Tuy nhiên sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào vẫn còn một số tồn tại như dòng tế bào không ổn định, năng suất thấp và khi nuôi cấy quy mô lớn gặp khó khăn như dễ bị lây nhiễm, việc điều chỉnh nguồn khí oxy, (Rao and Ravishankar, 2002). Hướng mới để sản xuất các hợp chất thứ cấp là nuôi cấy rễ chuyển gen (rễ tóc). Nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình 1
  12. Đồ án tốt nghiệp thành do sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật bị tổn thương từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như phân tích chức năng của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ cấp hay biến đổi thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật (Lê Thu Ngọc và cs, 2013). Công nghệ chuyển gen tạo rễ tóc cho phép nhanh chóng thu được sinh khối lớn trong thời gian ngắn đã thành công trên một số loài thực vật, điển hình là sâm ngọc linh đem lại hiệu quả cao. Trên thế giới cũng như trong nước đã có một số đề tài nghiên cứu về lan kim tuyến: Nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus (Chow và cs, 1982). Nhân nhanh chồi in vitro loài lan kim tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. (Phùng Văn Phê và cs, 2010) Lan kim tuyến được xem như là loài dược liệu quý cho sức khỏe con người nên hiện nay loài thực vật này đang có nguy cơ bị người dân khai thác cạn kiệt để bán cho các thương nhân nước ngoài bởi giá trị kinh tế cao với mức giá dao động từ 1,2 – 1,6 triệu đồng / 1 kg lá tươi. Mặt khác khả năng tái sinh của cây lan kim tuyến trong tự nhiên thấp, đặc biệt là những nơi môi trường sinh thái bị tàn phá. Loài thực vật này chủ yếu mọc trong rừng già trên vùng núi cao, nơi có ẩm độ cao và nhiệt độ thấp, ở những nơi đất tốt và tơi xốp, không có ánh sáng trực tiếp của mặt trời (Dương Đức Chiến, 2014). Chính vì môi trường sống ngoài tự nhiên khá khó khăn cũng như loài dược liệu quý này có giá trị kinh tế cao nên việc ứng dụng công nghệ nuôi rễ tóc thu sinh khối là cần thiết. Xuất phát từ những cơ sở đó, người thực hiện đề tài đã tiến hành: “Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc”. II. Mục đích, nhiệm vụ và phương pháp nghiên cứu 1. Mục đích Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anotoecchilus setaceus Blume), chi Lan kim tuyến. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp Tạo nguồn vật liệu in vitro làm vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tóc. 2. Nhiệm vụ Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến. Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. 3. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm SAS và Microsoft Excel 2010. III. Các kết quả đạt được và kết cấu của đồ án. 1. Các kết quả đạt được của đề tài Xác định nồng độ NAA và BA tối ưu lên sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi lan kim tuyến. Xác định nguồn mẫu (các mô hay cơ quan của lan kim tuyến) phù hợp cho hiệu suất chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. 2. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Đồ án gồm 4 chương - Chương 1: Tổng quan tài liệu. - Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận. - Chương 4: Kết luận và kiến ghị. 3
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật Theo Dương Công Kiên (2002), những mốc chính trong lịch sử phát triển của công nghệ tế bào thực vật: Năm 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào. Năm 1838: Mattias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. Năm 1902: Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công. Năm 1904: Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải Crucifers. Năm 1922: Knudson và Bot. Gaz. Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro. Năm 1924: Blumenthal và cộng sự nuôi cấy hình thành callus từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic. Năm 1929: Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hòa hợp khi lai ở Linum spp. Năm 1934: White đã thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài. Năm 1934: Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 phytohormone thực vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1936: LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau. Năm 1939: Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy, mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá. 4
  15. Đồ án tốt nghiệp Năm 1941: Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cà rốt. Năm 1942: Gautheret lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy mô sẹo thực vật. Năm 1950: Morel lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước dừa. Từ năm 1950 – 1960: Hàng loạt thành công tiếp theo trong nuôi cấy mô như nuôi cấy cây 1 lá mầm, nuôi cấy noãn, nuôi cấy phát sinh cơ quan, nuôi cấy câh sạch virus, vi ghép, nuôi cấy đơn bội, tái sinh phôi soma, sản xuất sinh khối thực vật, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Năm 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật- môi trường MS. Từ năm 1964 – 1998: hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gene để lai tạo giống mới thương mại hóa sản phẩm nuôi cấy mô. Giai đoạn hiện nay, ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào sản xuất các hợp chất thứ cấp, nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. 1.1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.2.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật a. Điều kiện vô trùng Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối thiểu cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy. Vì thế, nuôi cấy in vitro luôn được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng, mô nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, chết (Dương Công Kiên, 2002). Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao. 5
  16. Đồ án tốt nghiệp  Các bước để xử lý khử trùng bề mặt mẫu vật - Chọn lựa mẫu cấy tốt nhất, rửa kỹ mẫu bằng nước máy (trong dòng chảy) cho sạch bụi bẩn. - Ngâm rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng trong 3 phút (lắc nhẹ liên tục trong quá trình ngâm). - Rửa sạch xà phòng bằng nước máy (trong dòng chảy). Chuyển vào tủ đã được xử lý, vô trùng mẫu từ trước, mọi thao tác từ đây đều phải áp dụng các biện pháp vô trùng. - Dùng kẹp vô trùng gắp chuyển mẫu sang dung dịch khử trùng (kẹp này không dùng lại nữa nếu không khử trùng lại), ngâm (lắc nhẹ) mẫu trong dung dịch khử trùng trong thời gian ấn định. - Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần. Nếu rửa không sạch, chất khử trùng có thể làm chết mẫu. - Nhập mẫu sau khi khử trùng chuyển mẫu ra giấy thấm đặt trên đĩa petri vô trùng. Tiến hành cắt tỉa tách mẫu, tỉa bỏ các phần dập nát, hư hỏng và cấy chuyền ngay vào môi trường đã chuẩn bị trước. Bảng 1.1. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (Street, 1974) Tác nhân vô trùng Nồng độ Thời gian xử lý Hiệu quả (%) (phút) Calcium hypochorite 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Natri hypochlorite 2 5 – 30 Rất tốt Hydro peroxide 10 – 12 5 – 15 Tốt Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt 6
  17. Đồ án tốt nghiệp b, Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy.  Ánh sáng Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: cường độ chiếu sáng, thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng phù hợp nằm trong khoảng 2000 – 2500 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao hơn để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng, có khả năng quang hợp. Trong giai đoạn này, cường độ ánh sáng được Murashige (1974) đề nghị là 3.000 – 10.000 lux và nhiều phòng thí nghiệm cho rằng con số 40 – 75 µmol/m2/s (tương đương 3.300 – 6.200 lux) là thích hợp (Edwin, 1993).  Nhiệt độ Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng ở nhiều loài cây là 250C (Nguyễn Văn Uyển, 1993). 1.1.2.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002). Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy thực vật khác nhau. Trong đó, có một số môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm lượng khoáng 7
  18. Đồ án tốt nghiệp đa lượng cao. Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau: - Các muối khoáng đa lượng và vi lượng. - Nguồn cacbon. - Các vitamin. - Các chất điều hòa sinh trưởng. - Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây a. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg (Trần Văn Minh, 2010). Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kĩ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta không nghĩ tới việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I, (Trần Văn Minh, 2010). b. Nguồn cacbon Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là saccharose, d-glucose, d-fructose. Saccharose là nguồn các cacbon được sử dụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ saccharose thay đổi từ 2 – 3% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Dodds và Roberts, 1985). c. Các vitamin Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của 8
  19. Đồ án tốt nghiệp chúng. Trong nuôi cấy in vitro thì một số vitamin được bổ sung vào môi trường và trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng như: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol (Trần Văn Minh, 2010). Thiamine là một vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Vitamin C đôi khi được sử dụng ở nồng độ cao như là một chất chống oxi hóa. Myo- inositol có vai trò quan trọng cho sự phân chia tế bào vì thúc đẩy sự hình thành thành tế bào. Thường sử dụng ở nồng độ cao 50 – 100 ppm (Trần Văn Minh,2010). d. Chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (plant growth regulator), có tên khoa học là phytohormon, là chất hữu cơ có mặt trong cây với hàm lượng rất nhỏ nhằm tham gia vào điều khiển quá trình trao đổi chất và các quá trình hình thành mới các cơ quan ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây. Cho đến nay người ta đã tìm được rất nhiều chất tự nhiên hoặc nhân tạo ảnh hưởng rất mạnh đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Người ta chia các phytohormon ra làm 5 nhóm chính: Auxin, Gibberrellin, Cytokinin, Abcisic acid và Ethylene (Nguyễn Văn Uyển, 1993). Trong đó, auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.  Nhóm các auxin Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin. Các auxin sử dụng có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm (IAA, NAA, 2,4-D, IBA) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ nhưng nếu sử dụng liều lượng quá cao dễ tạo ra các đột biến (Hoàng Minh Tấn và CS, 1993). Vai trò sinh lý của Auxin - Kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào. 9
  20. Đồ án tốt nghiệp - IAA kích thích chồi bên sản sinh ra ethylene làm ức chế sinh trưởng chồi đỉnh. - Kích thích hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính. - 2,4-D sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo. - Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus). - Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp.  Nhóm các cytokinin Trong nuôi cấy mô thực vật, cytokinin dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ Auxin/Cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ, nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi, ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo. Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin, TDZ. - Kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi. - Zeatin thực chất là một dẫn xuất của adenine có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng. - BAP có hoạt tính cao hơn kinetin và bền nhiệt với độ cao hơn zeatin. Vai trò sinh lý của nhóm Cytokinin - Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng chồi in vitro. - Kìm hãm sự già hóa và kéo dài tuổi thọ của cây. - Ức chế sự hình thành rễ. - Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ. - Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh. e. Các chất hữu cơ bổ sung 10
  21. Đồ án tốt nghiệp  Nước dừa Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 – 20% thể tích môi trường (George, 1993; George, 1996).  Dịch chiết nấm men Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp (Trần Văn Minh, 2010).  Dịch chiếc khoai tây Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin B, C và các yếu tố khoáng như kali, sắt, magie rất tốt cho sự sinh trưởng và phát triển của mô, tế bào. Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môi trường nuôi cấy lan, bao phấn lúa và một số cây ngũ cốc khác (Trần Văn Minh, 2010).  Than hoạt tính Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng và làm đen môi trường. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy.  Độ pH và agar Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Độ pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động từ 5,5 - 6,0. Nếu pH thấp thì agar sẽ không đông sau khi hấp khử trùng (Trần Văn Minh, 2010). 11
  22. Đồ án tốt nghiệp Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn môi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 – 1%, đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu oxi nếu môi tường lỏng và tĩnh (Trần Văn Minh, 2010). 1.1.3. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật 1.1.3.1. Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt trong môi trường nuôi cấy. Để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, clorua thủy ngân, (Dương Công Kiên, 2003). 1.1.3.2. Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác (Dương Công Kiên, 2003). 1.1.3.3. Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài (Dương Công Kiên, 2003). 12
  23. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.4. Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro (Dương Công Kiên, 2003). 1.1.3.5. Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườn ươm Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu, luống ươm có cơ chất dễ thoát hơi nước, tơi xốp, nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp, Trong những ngày đầu, cần phủ nilon để tránh sự thoát hơi nước ở lá. Rễ cây trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ. Đây là giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro (Dương Công Kiên, 2003). 1.1.4. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật Về mặt lý luận và thực tiễn, nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô có những ưu điểm sau: - Hệ số nhân giống cao. - Các cây đồng nhất về mặt di truyền. - Tất cả các bộ phận của cây đều có thể làm vật liệu nhân giống. - Có thể nhân giống quanh năm. - Khắc phục được đặc tính khó nhân giống và bất thụ ở một số cây trồng. - Chất lượng giống cao, tạo nguồn giống sạch bệnh cho sản xuất. - Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm. 13
  24. Đồ án tốt nghiệp - Dễ dàng tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen. Bên cạnh những ưu điểm thuận lợi cho nuôi cấy mô tế bào thực vật, phương pháp vi nhân giống còn có nhiều nhược điểm cần khắc phục: - Đầu tư trang thiết bị tốn kém, đòi hỏi trình độ chuyên môn kỹ thuật cao nên dẫn đến giá thành cây con sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống khá cao. - Cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình. - Có thể xảy ra đột biến do các chất điều hòa tăng trưởng bổ sung vào môi trường - Sự nhiễm mẫu và hoại mẫu. - Hiện tượng thủy tinh thể: là hiện tượng thân lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi ra ngoài môi trường do mất nước rất mạnh. 1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Phương pháp thuận lợi có thể đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên). Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Môi trường thích hợp thay đổi theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cây, nhưng cơ bản môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng và bổ sung chất kích thích sinh trưởng là thích hợp nhất. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường khác (Ngô Xuân Bình, 2015). 1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu trắng. Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng nhân giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với các loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành 14
  25. Đồ án tốt nghiệp chồi. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo (Ngô Xuân Bình, 2015). 1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt lên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống như hệ thống nuôi cấy vi sinh. Với các cơ chất phù hợp được bổ sung môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid ). Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế bào mô sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp. Sử dụng các tế bào đơn để xử lý đột biến bằng tia phóng xạ, hóa chất, có ý nghĩa lớn trong chọn tạo giống cây trồng (Ngô Xuân Bình, 2015). 1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần Tế bào trần thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Tế bào trần có thể tách trực tiếp từ các bộ phận của thực vật (lá, rễ) bằng cơ học (nghiền mẫu + enzym) trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào trần có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn năng di truyền). Khi mất thành tế bào, hai tế bào trần có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện cây trồng. Quá trình dung hợp tế bào trần có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hoặc khác loài (khoai tây, cà chua). Ở trạng thái không có màng tế bào bao bọc, tế bào trần dễ dàng hấp thu các AND ngoại lai mang các đặc điểm di truyền khác nhau: cải thiện đặc tính kháng bệnh, năng suất và chất lượng cây trồng. Hiện nay kỹ 15
  26. Đồ án tốt nghiệp thuật tách và nuôi cấy tế bào trần đang được nghiên cứu và hoàn thiện (Ngô Xuân Bình, 2015). 1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Bao phấn chứa các bào tử hoặc hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường dinh dưỡng xác định nhằm mục đích tạo cây đơn bội. Sau đó dùng colchicin lưỡng bội hóa tạo thành cây lưỡng bội. Nuôi cấy bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo ra các dòng, giống thuần ở các cây tự thụ phấn vì đã rút ngắn được thời gian tạo ra giống mới. Nuôi cấy bao phấn tạo giống mới được ứng dụng thành công ở một số loài cây như: lúa mì, lúa nước, thuốc lá, ngô, (Ngô Xuân Bình, 2015). 1.2.6. Nuôi cấy protoplast Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào trong môi trường lỏng. Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra nhiều triển vọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống cây mới ở thực vật bậc cao nói chung. Phương pháp này được ứng dụng thành công trên nhiều đối tượng khác nhau. Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị bội từ tế bào trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây Thuốc lá đơn bội từ tế bào trần đơn bội. Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá mầm cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng cũng như trong công tác giống cây trồng (Ngô Xuân Bình, 2015). 1.3. Chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium đã cho thấy có một số ưu điểm vượt trội và đạt hiệu suất cao hơn các phương pháp khác. 1.3.1. Đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ  Đặc điểm 16
  27. Đồ án tốt nghiệp Agrobacterium là vi khuẩn đất, nhuộm gram âm, háo khí, thuộc họ Rhizobiacea (Kerters và De Ley, 1984). Nhiều nghiên cứu đã khẳng định Agrobacterium có xu hướng chuyển gen vào những vùng mô đang phân sinh mạnh. Đây là lợi thế lớn nhất của phương pháp này vì mô phân sinh là nơi mà chồi con hay rễ (đã “bị” thay đổi thông tin di truyền) có thể dễ dàng được tạo thành. Vi khuẩn A. tumefaciens (chứa plasmide pTi – tumor inducing) có thể gây khối u dễ dàng cho cả cây khỏa tử và cây hai lá mầm nhưng lại khó khăn hơn trong việc gây khối u cho cây một lá mầm (Smith và Townsend, 1907). Lý do là cây một lá mầm thuộc nhóm thực vật tiến hóa hơn (tiến hóa nhất trong giới thực vật), nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn các cây hai lá mầm như vách cellulose tẩm silic làm tăng độ bền của thành tế bào, hoặc khi bị thương, phần mô tại điểm đó có xu hướng hóa gỗ để bảo vệ, chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiết hợp chất phenol như cây hai lá mầm. Nhưng hiện nay người ta đã tìm được nhiều chủng Agrobacterium có khả năng chuyển gen cho một số cây một lá mầm như bắp, lúa, cỏ, mía, lan, ứng dụng chuyển gen tạo ra gạo vàng, phong lan phát sáng, Còn vi khuẩn A. rhizogenes (chứa plasmide pRi – root inducing) là tác nhân gây bệnh tạo rễ tóc (hairy root) cho thực vật. Nó cảm ứng kích thích tạo rễ khi xâm nhiễm vào tế bào thực vật tại điểm bị thương (Riker và cs., 1930) tạo nên bộ rễ gồm những rễ chuyển và những rễ không chuyển gen.  Cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ Đầu tiên vi khuẩn xâm nhiễm qua vết thương của mô, của cây. Sau khi di chuyển đến vết thương, Agrobacterium gắn chặt vào bề mặt tế bào thực vật. Việc các vi khuẩn gắn vào bề mặt tế bào còn được xem như phản ứng trả lời của các vi khuẩn với các hợp chất phenolic như acetosyringon và hydroxyl acetosyringon mà tế bào thực vật tiết ra. Các chất này được tiết ra khi cây bị thương và có tác động tạo vùng tế bào phân chia mạnh nhằm chữa lành vết thương, các chất phenolic sẽ hàn gắn vết thương và polymer hóa tạo lignin. Các phân tử phenolic này có tác động cảm ứng các 17
  28. Đồ án tốt nghiệp gen vir nằm trên Ti (đối với A. tumefaciens) hoặc Ri plasmide (đối với A. rhizogenes) của vi khuẩn (Birot và cs, 1987). Các gen vir định vị trên một vùng có kích thước 35kb nằm ngoài vùng T– DNA. Ở đây có 25 gen virsắp xếp trong 7 operon. Các sản phẩm của gen vir có tác dụng chuyển và gắn T–DNA vào genome của tế bào thực vật (Chilton và cs, 1982). Quá trình chuyển T–DNA cũng tương tự như quá trình chuyển plasmide từ tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tương tác với nhau. T–DNA được chuyển ở dạng phân tử sợi đơn từ plasmide vào tế bào thực vật và được tổ hợp vào DNA nhiễm sắc thể. Đầu 5’ của sợi đơn T–DNA xuất phát từ bờ phải và đầu cuối 3’ ở vị trí bờ trái. Sự hình thành sợi đơn DNA được tiến hành nhờ sự cắt đặc hiệu hai vùng bờ phải và bờ trái, sự tổ hợp T–DNA vào genome tế bào chủ phụ thuộc vào một trình tự đặc hiệu định vị ở bờ phải của T–DNA, vùng bờ phải và bờ trái đều có 25 cặp base tương tự nhau, tuy nhiên việc loại bỏ bờ trái không gây ảnh hưởng đến sự gắn T–DNA vào nhiễm sắc thể tế bào chủ (Meyer và cs, 2000). Trong quá trình cài T–DNA vào nhiễm sắc thể thực vật có sự loại bỏ một đoạn giữa DNA của nhiễm sắc thể ở điểm gắn. Ngoài ra sự cài T–DNA vào DNA thực vật xảy ra ở những vị trí ngẫu nhiên, bờ T–DNA vi khuẩn phải có được một số điểm tương đồng với DNA thực vật ở vùng cài vào. Hầu hết các gen định vị trong vùng T–DNA chỉ được thể hiện sau khi T–DNA được cài vào genome thực vật (Meyer và cs, 2000). 18
  29. Đồ án tốt nghiệp Trong vùng T–DNA của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có các gen iaaM và iaaH mã hóa cho các enzyme tổng hợp auxin (IAA). Vùng này còn chứa gen tmr còn gọi là ipt mã hóa cho các enzyme tạo ra cytokinin. Auxin và cytokinin sẽ điều khiển hình thành khối u (đối với vi khuẩn A. tumefaciens). Vùng T–DNA của vi khuẩn A. rhizogenes mang các oncogen rol A, B, C hoặc D (Jouanin và cs, 1987). Hình 1.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium (nguồn:www.slideshare.net) 1.3.2. Vai trò, chức năng của oncogen rol (root inducing locus) Nguyên nhân của sự hình thành rễ tơ được xác định có liên quan đến vùng T-DNA nằm trên plasmid Ri của các chủng A. rhizogenes, T–DNA của A. rhizogenes chứa các oncogen mã hóa cho tổng hợp các phytohocmon (auxin và cytokinin). Mặt khác, T-DNA chứa các oncogen rol A, B, C hoặc D (còn gọi là gen rol) đã được định danh và phân lập bởi Schmulling và cộng sự. (1998), là tác nhân làm tăng tính mẫn cảm của tế bào đối với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Những gen rol chịu trách nhiệm tạo nên rễ tóc ở tế bào thực vật (Cardarelli và 19
  30. Đồ án tốt nghiệp cs, 1987a, b): rễ phân nhánh mạnh, không hướng đất. Sự biểu hiện của gen rol (A, B và C) tạo cho tế bào chuyển gen có tính mẫn cảm mạnh đối với auxin nội sinh (Maurel và cs, 1991) gây ra sự tạo rễ. Sự kiện này được chứng minh bởi các cây trồng chuyển gen bằng một gen rol độc lập hoặc nhiều gen rol liên kết đã gây ra sự biến đổi về sinh trưởng (Nilsson và cs, 1993a, b; Martin-Tanguy và cs, 1996) cũng như nhiều biến đổi về mặt hình thái. Tuy nhiên, hiện nay vai trò và chức năng của gen rol D vẫn còn chưa có nhiều tài liệu công bố. Phương thức điều hoà sự phiên mã của gen rol đã mang đến những thông tin quan trọng cần thiết để tế bào cảm ứng tạo “hairy root”. Người ta đã nghiên cứu cơ chế điều hoà biểu hiện gen rol bằng việc dung hợp promotor với một gen chỉ thị GUS và phân tích hoạt động của gen GUS trong những cây đã bị chuyển gen theo hệ thống này. Cũng tương tự, gen rol B và C biểu hiện ở những mô đặc biệt, chủ yếu ở vùng libe và trong mô phân sinh của rễ. Gen rol B biểu hiện ở tế bào mô mềm tự do (Altamura và cs, 1991). Hoạt động của phiên mã của gen C là những tế bào mang libe rễ (Guiva’h và cs, 1996). Gen rol B và C biểu hiện trong tế bào trụ bì của những rễ được hình thành đầu tiên của cây dương (Nilsson và cs, 1997). Nilsson và Olsson (1997) cũng chứng minh sự chuyển hoá của gen rol B đóng vai trò trung tâm trong cảm ứng tế bào rễ tóc. Gen rol B điều hoà tổng hợp auxin (Maurel và cs, 1994) và gen rol C điều hòa tổng hợp saccharose (Yokoyama và cs, 1994). Những gen này có thể biểu hiện độc lập và làm tăng hàm lượng hoạt chất thứ cấp cho tế bào ở vùng libe. Nhưng để cảm ứng tạo rễ, nhờ gen rol tế bào sẽ tăng độ mẫn cảm với tỷ lệ auxin lên nhiều lần. Điều này có thể do chức năng của tyrosine phosphate mã hóa bởi gen rol B, là nguồn gốc của việc tạo mô phân sinh vùng rễ. Khi lây nhiễm bởi vi khuẩn A. rhizogenes, những tế bào mục tiêu sẽ là những tế bào ở vùng libe. Sự thể hiện ở mô đặc biệt này được điều hòa bởi 2 tác nhân nội sinh là auxin và saccharose như đã nêu ở trên. Như Nilsson và Olsson (1997) đã chứng minh rằng những chất này là cần thiết để cảm ứng cho rễ bất định và có mặt với một lượng quan trọng trong tế bào vùng libe. 20
  31. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3. Tình hình nghiên cứu rễ tóc trên một số loài dược liệu và cây trồng Chuyển gen rol tạo rễ tóc trên cây dược liệu đã được rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới quan tâm đặc biệt là để nhân sinh khối và sản xuất hoạt chất thứ cấp có giá trị kinh tế cao (Bulgakov, 2008). Đến năm 1990 đã có 116 loài cây trồng đã được chuyển gen nhằm tạo rễ tóc (Tepfer, 1990). Đối với nhân sâm đã có nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tóc nhờ A. rhizogenes trên sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm Mỹ (P. quinquefolium), sâm lai (P. ginseng x P. quinquefolium), sâm Ngọc linh (Panax vietnamensis) (Washida và cs, 1998 ; Yang và Choi, 2000 ; Kochan và cs, 2012; Hà Thị Loan và cs, 2014). Nguyễn Như Nhứt và Bùi Văn Lệ (2016) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự cảm ứng rễ tơ cây dừa cạn (catharanthus roseus) của chủng Agrobacterium rhizogenes C26. Kết quả nghiên cứu này cho thấy sự cảm ứng tạo rễ tơ từ giống dừa cạn VIN077 bằng chủng A. rhizogenes C26 chịu ảnh hưởng của yếu tố mật độ tế bào trong huyền phù vi khuẩn (OD600 nm), thời gian gây nhiễm, thời gian ủ cảm ứng, chế độ chiếu sáng và môi trường nuôi cấy. Điều kiện gây nhiễm thích hợp để thu nhận rễ tơ từ giống dừa cạn VIN077 bằng chủng A. rhizogenes C26 là OD600 = 0,2 với thời gian ngâm mẫu là 10 phút. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ đạt cao nhất khi mẫu được ủ cảm ứng 6 ngày trong tối và loại nhiễm vi khuẩn ở điều kiện chiếu sáng 1000 lux trên môi trường White bán đậm đặc. Ninh Thị Thảo và cs (2015) đã tiến hành nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ tơ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 và bước đầu khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối rễ tơ. Trong ba loại vật liệu lây nhiễm với vi khuẩn (lá, cuống lá và đoạn thân), mô lá là vật liệu thích hợp nhất để cảm ứng rễ tơ đan sâm. Mật độ vi khuẩn cho tỷ lệ mô lá cảm ứng tạo rễ đạt cao nhất (53,85%) tương ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2. Bùi Đình Thạch (2016) tiến hành nghiên cứu tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) từ chủng vi khuẩn A.rhizogens ATCC 11325 đã tạo được 4 21
  32. Đồ án tốt nghiệp dòng rễ tơ mang gen rolB, trong đó chỉ có 1 dòng mang cả 2 gen rolB và rolC. Qua mô hình thuật toán điều kiện acetosyringone 134,09 µM và 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,025%). Phan Trung Hải và cs (2015) đã tiến hành nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ tơ cây hoa móng tay (impatiens balsamina) từ mười bốn chủng Agrobacterium rhizogenes và kết quả là ba chủng vi khuẩn (C02, C18 và C26) cho tỷ lệ cảm ứng hình thành rễ tơ cao trên cây Hoa Móng tay và khảo sát được một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng tạo rễ tơ từ các chủng chọn lọc. Trong đó mô lá là vật liệu thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ trên cây Hoa Móng tay khi xâm nhiễm với mật độ khuẩn tương ứng với giá trị OD600 = 1,0 với thời gian gây nhiễm là 5 đến 15 phút và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ. Dòng rễ tơ được cảm ứng từ chủng C02 cho khả năng sinh trưởng nhanh nhất. Lê Xuân Thao (2014) tiến hành thực hiện tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen mang gen cry3 thông qua chủng Agrobacterium rhizogens ATCC15834/PTN289 và Chủng Agrobacterium rhizogenes pIBT/cry3 đã xác định được điều kiện thích hợp cho quá trình chuyển gen tạo rễ tơ vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A. rhizogens sử dụng vector chuyển gen pPTN289 mang gen chỉ thị gus. Bước đầu đã thu nhận được một dòng khoai lang KB1 mang gen cry3 kháng bọ hà. 1.4. Tổng quan về cây lan kim tuyến 1.4.1. Nguồn gốc và phân bố Chi lan kim tuyến (Anoectochilus) được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở việt nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc (Sách đỏ Việt Nam, 2007). Các loài lan kim tuyến sinh sống trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dưới các tán cây to trong rừng ẩm ở độ cao 500 – 1600m. cây ưa độ ẩm cao và ưa bóng râm, kỵ ánh sáng, yêu cầu đất nhiều mùn, tơi xốp, thoáng khí. Trên thế giới, lan 22
  33. Đồ án tốt nghiệp kim tuyến có mặt ở Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Indonexia, Riêng ở Việt Nam, nó phân bố ở Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô, Đắc Uy), Gia Lai (Kbang, Kon Hà Nừng) (Phùng Văn Phê và cs, 2010). 1.4.2. Phân loại. Bộ: Asparagales Họ: Orchidaceae Phân họ: Orchidoidea Chi: Anoectochilus Loài: A.setaceus Tên khoa học: Anoectochilus setaceus Hình 1.2. Lan kim tuyến ở ngoài vườn ươm (nguồn: skhcn.daknong.gov.vn) 1.4.3. Đặc điểm hình thái 23
  34. Đồ án tốt nghiệp Cây lan kim tuyến hay còn gọi là cây kim cương, lan gấm, mộc sơn thạch tùng, là cây thân thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất.  Rễ Rễ được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mẫu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3 - 10. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 - 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07 cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm.  Thân Thân rễ: nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5 - 12 cm. Đường kính thân rễ từ 3 - 4 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3 - 7 lóng. Chiều dài của lóng từ 1 - 6 cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông. Thân khí sinh: thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4 - 8 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3 - 5 mm. Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2 - 4 lóng. Chiều dài mỗi lóng từ 1- 4 cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông, thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt.  Lá Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 5 cm và rộng từ 2 - 4 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ. 24
  35. Đồ án tốt nghiệp Cuống lá dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 – 6 lá, thông thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi. Các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt.  Hoa, quả Cụm hoa dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 – 10 mm, màu hồng. Cây ra hoa 1 lần vào tháng 10 - 12. Mùa quả chín từ tháng 12 tới tháng 3 năm sau. 1.4.4. Điều kiện sinh sống của lan kim tuyến Lan kim tuyến sinh sống trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dưới các tán cây to trong rừng ẩm ở độ cao 500 – 1600 m. Cây ưa độ ẩm cao và ưa bóng râm, kỵ ánh sáng, yêu cầu đất nhiều mùn, tơi xốp, thoáng khí (Liu, Su, 1978 và Teuscher, 1978). Chúng thường mọc rải rác hoặc thành các đám nhỏ lẫn trong lớp thảm mục hoặc ở hốc đá, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm. Cây sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, chịu được thời tiết có sương mù dài ngày. Khí hậu nơi loài lan kim tuyến phân bố thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm. Lượng mưa trung bình năm là 1,826 mm. Độ ẩm không khí trung bình 85%. Nhiệt độ trung bình năm từ dưới 200C đến 220C - 230C. 1.4.5. Giá trị dược liệu của lan kim tuyến Lan kim tuyến không chỉ đơn thuần là loài hoa đẹp làm cảnh mà người ta còn sử dụng lan kim tuyến để chế tạo thảo dược, làm thuốc chữa bệnh. Lan kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh. Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyền). 25
  36. Đồ án tốt nghiệp Trước đó, lan kim tuyến là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958). Trung y sư Thái Cát Hùng, Chủ tịch Hội đồng quản trị của Hội nghiên cứu cây thuốc thực vật thành phố Gia Nghĩa tuyên bố: Kim tuyến liên là một vị thuốc hết sức quý giá trong tiệm thuốc bắc Đài Loan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, giải trừ u uất, tiêu đờm, giải độc, hạ huyết áp, trợ tim, lợi tiểu, trị bệnh đái tháo đường, chữa viêm gan, trị mụn dùng cây tươi sắc uống. Nghiên cứu của Đại học Y Tapei (Đài Loan) chứng minh dịch chiết từ lan kim tuyến có khả năng làm ngưng sự phát triển của tế bào ung thư. Chính vì lan kim tuyến có nhiều công dụng chữa các loại bệnh khác nhau như vậy nên trở thành thảo dược quý hiếm cần được bảo tồn. 1.4.6. Nhân giống cây lan kim tuyến  Nhân giống bằng hạt Nhân giống bằng hạt hay còn gọi là nhân giống vô tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan là do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loài hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus. Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cở sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa (Phí Thị Cẩm Miện, 2012). Ở vườn trồng lan, để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo, có thể cùng cây hoặc khác cây. Phương pháp này có nhiều ưu điểm, dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khỏe, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm của thụ phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên trong thực tế hạt lan kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỷ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt (Phí Thị Cẩm Miện, 2012). 26
  37. Đồ án tốt nghiệp  Nhân giống bằng cây con Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3 – 5 lá, cây cứng cáp có thể tách để trồng riêng. Đây là cách nhân giống đơn giản, dễ làm.  Phương pháp giâm cây Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các đoạn này vào nơi ẩm, chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới. Phương pháp này cổ điển, dễ làm, quen với tập tính, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số trở ngại: chậm (tăng khoảng 2 – 4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hóa, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Phí Thị Cẩm Miện, 2012).  Nhân giống in vitro Để nâng cao tỷ lệ nảy mầm của hạt lan kim tuyến, hiện nay người ta dùng nấm Rhizoctonia cộng sinh với hạt, đã làm tăng tỷ lệ nảy mầm lên 80% trong môi trường OMA, gồm bột yến mạch, dịch chiết nấm men và agar (Ling-Chin Chou and Doris Chi-Ning Chang, 2003). 1.4.7. Tình hình nghiên cứu cây lan kim tuyến  Tình hình nghiên cứu trên thế giới Chi lan kim tuyến (Anoectochilus) đã nghiên cứu chủ yếu ở Trung Quốc một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005). Chow và cs (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng. Năm 1987, Liu và cs đã chọn chồi đỉnh để nuôi cấy mô. Cũng năm 1987, Ho và cs, năm 1992, Lee và cs đã sử dụng phôi hạt để làm vật liệu nuôi cấy. 27
  38. Đồ án tốt nghiệp Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu- Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2 MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Môi trường được sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2 MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA. Năm 2002, Tsay và CS đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 2% than hoạt tính.  Tình hình nghiên cứu trong nước Những năm gần đây, nước ta đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan kim tuyến như: Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1 g/l + 20N-20P-20K 1 g/l) + 2 g/l peptone. Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1 mg/l BAP (hoặc 1 - 2 mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính. Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành, đã đạt những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro loài lan kim tuyến – Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Năm 2010, Phan Ngọc Khoa, trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan kim tuyến. 28
  39. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: Đề tài thực hiện từ tháng 2/2017 đến cuối tháng 6/2017. - Địa điểm: Phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, số 2374, Quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Hình 2.1. Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên (nguồn: www.botanyvn.com) Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) của Trunng tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM. 2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất  Trang thiết bị - dụng cụ - Tủ cấy vô trùng 29
  40. Đồ án tốt nghiệp - Tủ lạnh - Máy đo pH - Bếp từ - Cân điện tử - Dao cấy, kẹp cấy. - Ống đong 100mL, ống đong 100mL, pipet 10mL. - Chai thủy tinh 500mL. - Đèn cồn, đĩa cấy, bông thấm. - Máy đo pH, cân điện tử. - Máy nước cất 2 lần. - Tủ sấy. - Nồi hấp tiệt trùng. - Đĩa petri. - Ống kim tiêm (18G). - Que cấy vòng.  Hóa chất - Cồn 96o, 70o - Môi trường MS cơ bản - Môi trường YMB - Saccharose - Agar - Các chất kích thích sinh trưởng: NAA, BA. 30
  41. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3. Môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm sử dụng môi trường MS, bổ sung thêm đường sucrose, agar, và chất điều hòa sinh trưởng gồm 2 nhóm auxine và cytokine tuỳ theo từng thí nghiệm. 2.2.4. Điều kiện nuôi cấy - Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 1210C. - pH của môi trường là: 5.6 – 5.8 - Nhiệt độ phòng nuôi: 250C ± 2 - Cường độ ánh sáng: 2000 lux. - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/ngày. - Độ ẩm: 50%. 2.3. Phương pháp 2.3.1. Pha môi trường  Chuẩn bị dung dịch mẹ Môi trường nuôi cấy mô thực vật là loại môi trường nuôi cấy phức tạp với nhiều thành phần khác nhau có hàm lượng rất nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy người ta hạn chế việc cân nhiều loại hóa chất thay vào đó là việc chuẩn bị trước các dung dịch mẹ (dung dịch Stock) với độ đậm đặc từ X10 – X200. Khi sử dụng chỉ cần pha với nước cất 2 lần hay nước vô khoáng theo tỉ lệ thích hợp. Dung dịch Stock được pha và bảo quản dài ngày trong tủ lạnh.  Pha môi trường nuôi cấy - Cho nước cất vào ống đong, sau đó từ các chai dung dịch mẹ đã pha sẵn lần lượt lấy ra đúng số lượng qui định, khuấy đều. - Bổ sung NAA và BA (khảo sát sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi). - Chỉnh pH 5,6 – 5,8 với NaOH 1N hoặc HCl 1N. - Thêm nước cất vào ống đong đúng với thể tích cần pha và bổ sung 8 g agar. 31
  42. Đồ án tốt nghiệp - Khuấy đều và phân phối vào bình thủy tinh với thể tích cần thiết cho mỗi thí nghiệm. - Ghi rõ ngày tháng và tên (ký hiệu) môi trường để tránh nhầm lẫn. - Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy ở 121oC trong 20 phút, áp suất 1 atm. - Sau khi hấp xong lấy môi trường ra, chuyển môi trường đã hấp khử trùng vào phòng bảo quản môi trường. Môi trường dùng trong nuôi cấy mô thực vật đa số ở dạng thạch để thuận tiện cho việc nuôi cấy, tuy nhiên quá trình tạo đông môi trường thường dễ bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như pH, nồng độ chất tạo đông, nhiệt độ, nên trong quá trình pha cần chú ý điều chỉnh các thông số của môi trường nuôi cấy cho phù hợp với sự sinh trưởng và phát triển của từng loại cây, đồng thời chọn chất tạo đông phù hợp để hạn chế việc gây hỏng môi trường nuôi cấy. 2.3.2. Các thao tác trong phòng cấy - Rửa tay kỹ bằng xà phòng, mặc áo blouse, đeo khẩu trang trước khi vào phòng cấy. - Dùng khăn lau tủ cấy bằng cồn 70o. - Bật đèn UV để khử trùng tủ cấy trong 30phút. Sau khi bật UV xong bật quạt khoảng 15 phút và lau tủ cấy lại bằng cồn 70o. - Dụng cụ, ống nghiệm, đĩa cấy, bình môi trường và bình mẫu cấy được xử lý bằng cồn 70° rồi đưa vào trong tủ. Phân phối cồn 96° vào ống nghiệm và đèn cồn. - Hơ miệng chai cấy thật kỹ trên ngọn lửa đèn cồn trước và sau khi cấy. - Dụng cụ sau mỗi lần cấy phải được đốt lại bằng cồn 96o. - Dùng giấy ghi tên môi trường tên mẫu cấy, ngày cấy chuyền, người cấy và cột thêm 1 lớp ở miệng chai để tiện theo dõi kết quả và tránh sự nhầm lẫn. 32
  43. Đồ án tốt nghiệp - Đem vào nuôi trong phòng tăng trưởng với những điều kiện thích hợp giúp mẫu cấy phát triển. - Sau khi cấy xong, lau tủ cấy bằng cồn, dọn dẹp sạch sẽ nơi làm việc, giữ nguyên vị trí các dụng cụ có trong tủ cấy từ trước. Tắt đèn, quạt trong tủ cấy. 2.4. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến. - Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến. - Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. 2.5. Bố trí thí nghiệm 2.5.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến Mẫu cấy: Đốt thân cây lan kim tuyến in vitro. Các bước tiến hành: - Chọn những mẫu lan kim tuyến in vitro sinh trưởng khỏe mạnh. - Sử dụng dao và kẹp đã khử trùng tiến hành cắt từng đốt thân (ở mỗi bình thí nghiệm chứa 5 đốt thân ở các vị trí đốt ở phía dưới, đốt giữa thân, đốt gần phần ngọn của 2 cây lan kim tuyến), đồng thời bỏ các lá, rễ và những phần dập nát. Cấy mẫu sang môi trường nuôi cấy. Môi trường: Môi trường MS + 30 g/l Saccharose + 8,0 g/l Agar, nồng độ BA và NAA được bổ sung tùy theo nghiệm thức thí nghiệm, pH = 5.6 - 5.8. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại, ô thí nghiệm 3 bình thủy tinh mỗi bình chứa 50 ml môi 33
  44. Đồ án tốt nghiệp trường và cấy 5 đốt thân lan kim tuyến vào. Mẫu cấy được nuôi ở điều kiện nhiệt độ phòng 22 – 240C, cường độ ánh sáng 2200 – 2500 lux. Bảng 2.1. Khảo sát nồng độ BA và NAA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến. Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) A1 (ĐC) 0,0 0,0 A2 1,0 0,5 A3 2,0 0,5 Chỉ tiêu theo dõi: Ʃ Số mẫu tạo chồi - Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = x 100 Ʃ Số mẫu cấy ban đầu - Số chồi - Chiều cao chồi. - Chất lượng chồi. Theo dõi thí nghiệm và thu thập số liệu sau 8 tuần nuôi cấy. 2.5.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến. Mẫu cấy: Các chồi in vitro được tạo ra từ thí nghiệm 1. Các bước tiến hành: - Sử dụng dao đã khử trùng tách chồi đã tái sinh để tiến hành nhân nhanh sang môi trường cụm. 34
  45. Đồ án tốt nghiệp - Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt, dùng kẹp đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi trường nhân nhanh chồi đã chuẩn bị trước. - Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi. Môi trường: Môi trường MS + 30 g/l Saccharose + 8,0 g/l Agar, nồng độ BA và NAA được bổ sung tùy theo nghiệm thức thí nghiệm, pH = 5.6 – 5.8. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại, ô thí nghiệm 3 bình thủy tinh mỗi bình chứa 50 ml môi trường và cấy 3 chồi lan kim tuyến vào. Mẫu cấy được nuôi ở điều kiện nhiệt độ phòng 22 – 240C, cường độ ánh sáng 2200 – 2500 lux. Bảng 2.2. Khảo sát nồng độ BA và NAA dùng để nhân nhanh chồi lan kim tuyến. Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) B1 (ĐC) 0,0 0,0 B2 0,1 0,1 B3 0,5 0,1 B4 1,0 0,1 Chỉ tiêu theo dõi: - Số chồi - Số lá (lá/chồi). 35
  46. Đồ án tốt nghiệp - Chất lượng chồi. Theo dõi thí nghiệm và thu thập số liệu sau 8 tuần nuôi cấy. 2.5.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Mẫu cấy: Thử nghiệm ở các cơ quan của lan kim tuyến: lá, trên thân, đoạn thân. Các bước tiến hành: - Nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn lấy ra từ tủ lạnh sâu – 80C được cấy trên môi trường YMB thạch rắn hai lần trong 4 ngày, sau đó lấy dịch vi khuẩn Agobacterium rhizogenes đem đi lây nhiễm. Vi khuẩn được đem đi lây nhiễm là A. rhizogenes chủng Tr7 và A. rhizogenes chủng 15834 được Trung tâm công nghệ sinh học mua từ đại học Mỹ mang về và 2 chủng vi khuẩn này không mang đoạn gen để chuyển gen mà tấn công trực tiếp vào cơ quan lan kim tuyến để hình thành rễ tóc. - Sử dụng dao và kẹp đã khử trùng cắt các cơ quan của lan kim tuyến riêng biệt để tiến hành chuyển gen. - Sử dụng ống kim tiêm (18G) tạo vết thương lần lượt lên các cơ quan vừa mới cắt, và vẫn sử dụng ống kim tiêm đó dùng đầu kim chấm lấy dịch vi khuẩn Agobacterium rhizogenes rồi chấm lên bề mặt vết thương của cơ quan. - Cấy các cơ quan của lan kim tuyến vừa mới chuyển gen trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, nuôi trong 7 ngày điều kiện tối. - Kết thúc giai đoạn đồng nuôi cấy, mẫu cấy được chuyển sang môi trường diệt khuẩn và tái sinh là môi trường MS + 30 g/l sucrose + 400 mg/l cefotaxim trong điều kiện tối. - Mẫu đối chứng là những cơ quan của lan kim tuyến được nuôi cấy không lây nhiễm với vi khuẩn cũng được nuôi cấy trên các môi trường tương tự. 36
  47. Đồ án tốt nghiệp Môi trường: Môi trường MS + 30 g/l Saccharose + 8,0 g/l Agar, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, pH = 5.6 – 5.8. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 5 lần lặp lại, ô thí nghiệm 5 bình thủy tinh mỗi bình chứa 25 ml môi trường và cấy riêng biệt các cơ quan lan kim tuyến vào. Mẫu cấy được nuôi ở điều kiện nhiệt độ phòng 22 – 240C. Bảng 2.3. Các cơ quan của lan kim tuyến được chuyển gen Nghiệm thức Cơ quan chuyển gen Lá, đoạn thân và thân cây không NT1 (ĐC) lây nhiễm vi khuẩn. NT2 Lá lây nhiễm với vi khuẩn. NT3 Đoạn thân lây nhiễm với vi khuẩn. NT4 Thân cây lây nhiễm với vi khuẩn. Chỉ tiêu theo dõi: Ʃ Số mẫu tạo rễ tóc - Tỷ lệ mẫu tạo rễ tóc (%) = x 100 Ʃ Số mẫu cấy ban đầu - Chiều dài của rễ tóc. - Số rễ tóc/cơ quan. Theo dõi khả năng ra rễ sau 4 tuần lây nhiễm.  Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm SAS và Microsoft Excel 2010. 37
  48. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của sự phối hợp BA và NAA cho sự tái sinh chồi ở vị trí các đốt thân cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus ) được cấy trực tiếp vào môi trường thạch MS. Sự cảm ứng của mẫu cấy là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung nồng độ NAA và BA khác nhau. Kết quả thống kê sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy có sự khác nhau về giá trị của các chỉ tiêu theo dõi. Quan sát sau 1 tuần nuôi cấy, mẫu cấy không có sự khác biệt về mặt hình thái. Sau 2 tuần nuôi cấy ở các đốt thân ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt với sự thay đổi của nồng độ NAA và BA so với đối chứng. Theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy đã có sự khác biệt rõ ràng hơn giữa các nồng độ, ở các đốt thân của mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nổi bật số chồi, chiều cao chồi, tỷ lệ tái sinh chồi, hình thái chồi. Đến tuần thứ 8, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Người thực hiện đề tài tiến hành thu kết quả, xử lý số liệu và trình bày ở bảng 3.1, hình 3.1, biểu đồ 3.1 và biểu đồ 3.2. A1 A2 A3 Hình 3.1. Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến. 38
  49. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến sau 8 tuần theo dõi. Tỷ lệ tái sinh Số chồi Chiều cao NT Đặc điểm chồi chồi (%) (chồi/mẫu) chồi (cm) Chồi phát triển A1 (MS) 93,05ab 2,38c 1,41b chậm, ít lá. A2 (NAA = Chồi cao, thân 0,5 mg/l; 98,79a 3,83a 2,03a mập, xanh BA = 1,0 đậm, nhiều lá. mg/l) A3 (NAA = Chồi phát triển 0,5 mg/l; 86,42b 2,99b 1,65ab bình thường, BA = 2,0 đốt ngắn. mg/l) * Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p < 0,01 39
  50. Đồ án tốt nghiệp 4 3.5 3 2.5 Số chồi 2 Chiều cao chồi 1.5 1 0.5 0 A1 A2 A3 Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. 40
  51. Đồ án tốt nghiệp 100 90 80 70 60 Nồng độ BA 50 Tỷ lệ tái sinh chồi (%) 40 30 20 10 0 A1 A2 A3 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến tỷ lệ tái sinh chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy.  Nhận xét Từ kết quả bảng 3.1, hình 3.1, và biểu đồ 3.1, 3.2 cho thấy bổ sung nồng độ BA kết hợp với NAA hợp lý vào môi trường nuôi cấy là rất hiệu quả cho sự tái sinh chồi ở vị trí các đốt thân lan kim tuyến. Tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tạo chồi, số chồi/mẫu và chiều cao chồi thu được trên môi trường chứa BA và NAA cao hơn so với công thức đối chứng. Tuy nhiên, ở mỗi tổ hợp nồng độ BA và NAA khác nhau thì tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đều có sự khác biệt. Các mẫu cấy nuôi trên môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA (A2) có tỷ lệ tái sinh chồi (98,79%), số chồi/mẫu (3,83 chồi/mẫu) và chiều cao chồi (2,03 cm) cao nhất so với nghiệm thức đối chứng (A1) và nghiệm thức 2 (A2). Việc bổ sung tăng dần nồng độ BA (0; 1; 2 mg/l) thì hình thái chồi cũng khác nhau, cụ thể là: 41
  52. Đồ án tốt nghiệp Ở nghiệm thức 1 (A1): không bổ sung BA và NAA thì chồi vẫn phát triển bình thường nhưng không đều giữa các mẫu, số lượng chồi ra ít, ít lá. Ở nghiệm thức 2 (A2): môi trường bổ sung BA với nồng độ 1,0 mg/l và NAA với nồng độ 0,5 mg/l thì số lượng chồi tăng lên sau tuần thứ 3, chiều cao chồi cũng tăng lên tỷ lệ thuận với thời gian theo dõi, lá nhiều và to. Chồi tăng trưởng nhanh và ổn định trong suốt 8 tuần nuôi cấy. Ở nghiệm thức 3 (A3): khi tăng nồng độ BA lên 2,0 mg/l và vẫn giữ nguyên nồng độ NAA là 0,5 mg/l thì tỷ lệ tái sinh chồi thấp nhất so với A1 và A2. Chồi phát triển chậm từ tuần thứ 5 trở đi, đốt thân ngắn, lá nhiều và to. Ở nghiệm thức A3 khi tăng nồng độ BA lên 2,0 mg/l thì chồi sinh trưởng chậm, số chồi (2,99 chồi/mẫu) và chiều cao chồi (1,65 cm) thấp hơn so với nghiệm thức A2 sử dụng nồng độ BA là 1,0 mg/l. Kết quả này cũng tương tự như kết quả của Salez và cs (1994) khi nghiên cứu cây Thymus piperella cho thấy BA có khả năng kích thích tạo chồi ở các nồng độ BA thấp (0,0 – 0,5 mg/l) thì số lượng chồi và chiều cao chồi tăng nhưng khi tăng BA đến 2,0 mg/l thì số lượng chồi và chiều cao chồi giảm dần. Theo Hahn và Kiệt (2004), với nồng độ BA thấp có thể làm chồi sinh trưởng yếu và làm giảm sự tăng sinh số chồi bên. Khi ở một nồng độ thích hợp, BA kích thích chồi phát sinh đồng đều, hình thái phát triển bình thường, không có hiện tượng biến dị. Tuy nhiên khi nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng BA vượt quá ngưỡng tối ưu thì lại ức chế quá trình phát sinh của chồi, làm giảm số lượng cũng như chất lượng chồi hình thành và khi nồng độ BA cao các chồi thu được thường có màu xanh nhạt và lá tương đối khỏe. Phí Thị Cẩm Miện (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) và kết quả sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy mắt đốt ngang thân là cơ quan tái sinh và phát triển tốt nhất với tỷ lệ tạo mẫu là 100%, hệ số nhân 4,56 lần, chồi dài 3,2 cm. Sự kết hợp auxin và cytokinin với một tỷ lệ nhất định đôi khi không những cải thiện được khả năng tái sinh mà còn làm tăng sự sinh trưởng của chồi. Do vậy, 42
  53. Đồ án tốt nghiệp nghiên cứu này tiến hành thử nghiệm các công thức tạo sự phát sinh hình thái với các tổ hợp của BA và NAA ở các nồng độ khác nhau. Qua các kết quả trên cho thấy sự quan trọng của các chất điều hòa sinh trưởng trong quá trình nuôi cấy in vitro. BA là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trò kích thích tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp ở thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. BA ngoài tác dụng hoạt hóa sự phân chia tế bào, còn kích thích sự sinh trưởng các chồi bên. Khi nồng độ tăng cao, BA có tác dụng điều tiết quá trình sinh tổng hợp trong tế bào, ảnh hưởng lên một số khâu trong cơ chế điều hòa sinh tổng hợp protein trong tế bào và ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme cần thiết cho sự phân chia và sinh trưởng của tế bào. NAA là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin làm giảm pH, pH thấp hoạt hóa các enzyme tác động nới lỏng vách tế bào và enzyme tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình dãn nở tế bào. Tóm lại, nồng độ BA không nên quá thấp sẽ cho kết quả không cao, cũng không nên quá cao sẽ tạo ra các biến dị làm chồi sinh trưởng không bình thường. Khi có sự kết hợp giữa BA và NAA với nồng độ phù hợp (như ở nghiệm thức A2) thì sẽ đạt kết quả cao như mong muốn. 3.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến. Từ những cụm chồi được tái sinh từ thí nghiệm 1 được cấy trực tiếp vào môi trường MS. Sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung nồng độ NAA và BA khác nhau. Kết quả thống kê sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy có sự khác nhau về giá trị của các chỉ tiêu theo dõi. 43
  54. Đồ án tốt nghiệp B1 B2 B3 B4 (sau 8 tuần) B4 (sau 12 tuần) Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự nhân nhanh chồi lan kim tuyến Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến sau 8 tuần theo dõi. NT Số chồi (chồi/mẫu) Số lá (lá/mẫu) Đặc điểm chồi B1 (MS) 4,93c 5,99c Chồi ít và ít lá. B2 (NAA = Chồi phát triển 0,1 mg/l; BA 6,61b 8,46b không đều, lá bé. = 0,1mg/l) 44
  55. Đồ án tốt nghiệp B3 (NAA = Chồi phát triển bình 0,1 mg/l; BA 6,76b 8,50b thường, lá to. = 0,5 mg/l) B4 (NAA = Nhiều chồi, chồi 0,1 mg/l; BA 8,04a 10,78a khỏe, lá nhiều. = 1,0 mg/l) * Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p < 0,0,1 12 10 8 Số chồi 6 Số lá 4 2 0 B1 B2 B3 B4 45
  56. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy.  Nhận xét: Sau 2 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy bắt đầu phát triển. Sau 3 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy. Sự khác biệt hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 5 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, lá. Đến tuần nuôi cấy thứ 8, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt nhất. Người thực hiện đề tài tiến hành thu thập số liệu. Từ kết quả bảng 3.2, hình 3.2, và biểu đồ 3.3 cho thấy bổ sung nồng độ BA kết hợp với NAA hợp lý vào môi trường nuôi cấy là rất hiệu quả cho sự nhân nhanh chồi lan kim tuyến. Số lá, số chồi thu được trên môi trường chứa BA và NAA tăng dần theo nghiệm thức và cao hơn so với công thức đối chứng. Tuy nhiên, ở mỗi tổ hợp nồng độ BA và NAA khác nhau thì chỉ tiêu theo dõi đều có sự khác biệt. Các mẫu cấy nuôi trên môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA (B4) có số chồi và số lá cao nhất (8,04 chồi/mẫu và 10,78 lá/mẫu). Ở các mẫu nuôi cấy trên môi trường có nồng độ NAA và BA khác thì thấp hơn, số chồi khi sử dụng ở các nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 mg/l BA kết hợp nồng độ NAA không đổi là 0,1 mg/l lần lượt là 6,61; 6,76; 8,04 chồi/mẫu và mẫu đối chứng là 4,93 chồi/mẫu, số lá khi sử 46
  57. Đồ án tốt nghiệp dụng ở các nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 mg/l BA kết hợp nồng độ NAA không đổi là 0,1 mg/l lần lượt là 8,46; 8,50; 10,78 lá/mẫu và mẫu đối chứng là 5,99 lá/mẫu. Việc bổ sung tăng dần nồng độ BA (0,1; 0,5; 1 mg/l) kết hợp nồng độ NAA không đổi là 0,1 mg/l thì hình thái chồi cũng khác nhau, cụ thể là: Ở nghiệm thức 1 (B1): không bổ sung BA và NAA thì chồi vẫn phát triển bình thường nhưng số lượng chồi ra ít, ít lá. Ở nghiệm thức 2 (B2): môi trường bổ sung BA với nồng độ 0,1 mg/l và NAA với nồng độ 0,1 mg/l thì số lượng chồi tăng lên sau tuần thứ 3, tuy nhiên chồi phát triển không đều, lá bé. Ở nghiệm thức 3 (B3): khi tăng nồng độ BA lên 0,5 mg/l và vẫn giữ nguyên nồng độ NAA là 0,5 mg/l thì số lượng chồi tăng so với nghiệm thức B1, chồi phát triển tốt, thân mập, lá to và xanh. Ở nghiệm thức 4 (B4): việc tiếp tục tăng nồng độ BA lên 1,0 mg/l và vẫn giữ nguyên nồng độ NAA là 0,5 mg/l thì số lượng chồi nhân nhanh hơn hẳn so với 3 nghiệm thức đầu, lá nhiều. Chồi tăng trưởng nhanh và ổn định trong suốt 8 tuần nuôi cấy. Kết quả cho thấy môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA cho số chồi, số lá nhiều, chồi phát triển đồng đều và khỏe mạnh. BA là chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trò quan trọng trong phân chia tế bào và kích thích sự hình thành chồi. Bởi vậy, trong nuôi cấy mô tế bào thực vật BA thường được sử dụng trong giai đoạn nhân nhanh. Nồng độ của BA được sử dụng trong nhân giống in vitro ở những loại cây khác nhau là khác nhau, có loại cây thích hợp ở nồng độ thấp, có loại cây thích hợp ở nồng độ cao.Theo nguyên lý chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi sử dụng phối hợp cytokinin và auxin với nồng độ và tỷ lệ thích hợp không những nâng cao hệ số nhân chồi mà còn có tác dụng tốt đến chất lượng của chồi in vitro. Nhiều kết quả nghiên cứu cũng đã khẳng định hiệu quả phối hợp của auxin và cytokinin đến hệ số nhân nhanh chồi trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau. 47
  58. Đồ án tốt nghiệp Phí Thị Cẩm Miện (2010) đã tiến hành “nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý” với thí nghiệm ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân của lan kim tuyến thu được sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy công thức Knud + 0,5 mg/l BA + 0,3 kinetin + 0,3 mg/l NAA + 20 g/l sucrose + 20 g/l ND + 5% than hoạt tính + 7 g/l agar cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,55 chồi/mẫu, chất lượng chồi thu được rất đẹp, màu sắc lá xanh đậm, thân mập, to và khỏe. Nguyễn Thị Lệ Hà và cs (2015) tiến hành “nghiên cứu kỹ thuật vi nhân giống lan kim tuyến (Anoectochilus sp.)” đã khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp nồng độ NAA và BA lên sự kéo dài chồi Lan kim tuyến in vitro và kết quả sau 3 tuần nuôi cấy đã kết luận rằng nghiệm thức có bổ sung 0,3 mg/l BA và 0,3 mg/l NAA là một sự lựa chọn tốt cho sự kéo dài chồi Lan kim tuyến với giá trị trung bình đạt 3,9 cm/chồi, chồi phát triển tốt, số đốt dài, lá có màu xanh đậm. Còn ở thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng BA lên sự nhân chồi của Lan kim tuyến in vitro, sau 8 tuần nuôi cấy đã kết luận rằng môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA cho kết quả cao nhất với 23,9 chồi/mẫu; 1,1 cm/chồi. Đồng thời, chất lượng chồi cũng cho là tốt nhất, có màu xanh đậm và lá rất khỏe. 3.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Từ các cơ quan (lá, đoạn thân, thân cây) của lan kim tuyến tiến hành lây nhiễm vi khuẩn Agobacterium rhizogenes chủng TR7 và chủng 15834. Các cơ quan sau khi lây nhiễm được cấy riêng biệt vào môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Kết quả theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy được thu nhận ở bảng 3.3 và hình 3.3. Bảng 3.3. Khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chủng 15834 và chủng TR7 sau 4 tuần nuôi cấy. 48
  59. Đồ án tốt nghiệp Cơ quan không lây Số lượng Xuất hiện rễ Vị trí xuất hiện rễ nhiễm vi khuẩn Lá 20 0 Đoạn thân 30 0 Thân cây 22 0 Cơ quan lây nhiễm vi khuẩn chủng 15834 Lá 50 0 Đoạn thân 75 0 Chỗ không lây nhiễm vi Thân cây 55 12 khuẩn (đốt thân) Cơ quan lây nhiễm vi khuẩn chủng TR7 Lá 50 0 Đoạn thân 75 0 Chỗ không lây nhiễm vi Thân cây 55 15 khuẩn (đốt thân) 49
  60. Đồ án tốt nghiệp NT1 NT2 a b NT3 a b 50
  61. Đồ án tốt nghiệp NT4 a b Hình 3.3. Ảnh hưởng của việc chuyển gen chứa vi khuẩn Agobacterium rhizogenes chủng Tr7 và chủng 15834 vào các cơ quan của lan kim tuyến sau 4 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, NT4. Hình a: chuyển gen vi khuẩn A. rhizogenes chủng 15834 vào các cơ quan của lan kim tuyến. Hình b: chuyển gen vi khuẩn A. rhizogenes chủng Tr7 vào các cơ quan của lan kim tuyến.  Nhận xét: Sau 2 tuần nuôi cấy các cơ quan của lan kim tuyến đã có sự thay đổi nhưng chưa thực sự rõ rệt, mẫu cấy được tiến hành chuyển sang môi trường diệt khuẩn và tái sinh là môi trường MS + 30 g/l sucrose + 400 mg/l cefotaxim trong điều kiện tối. Sự khác biệt hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 4 trở đi được trình bày ở hình 3.3 và bảng 3.3. Ở nghiệm thức đối chứng (NT1), mẫu lá không có hiện tượng gì thay đổi so với lúc bắt đầu cấy, đoạn thân và thân cây thì tái sinh chồi, có lá và có lông tơ, không xuất hiện rễ. Ở nghiệm thức NT2, mẫu lá được chuyển gen vi khuẩn A. rhizogenes chủng TR7 và chủng 15834 đều cảm ứng với vi khuẩn tại vị trí tạo vết thương nhưng vẫn không có gì khác so với đối chứng, một số mẫu lá bị già, héo hoặc bị nhiễm khuẩn từ lá ra môi trường. Ở nghiệm thức NT3, các đoạn thân được chuyển gen vi khuẩn A. rhizogenes chủng Tr7 và chủng 15834 đều cảm ứng với 51
  62. Đồ án tốt nghiệp vi khuẩn tại vị trí tạo vết thương (2 đầu của đoạn thân), tuy nhiên tất cả các mẫu đều có hiện tượng tái sinh chồi, có lá và có lông tơ, một số đoạn thân bị chết và không có hiện tượng gì. Ở nghiệm thức NT4, các thân cây được chuyển gen vi khuẩn A. rhizogenes chủng TR7 và chủng 15834 thì không cảm ứng được với vi khuẩn tại vị trí tạo vết thương mà tạo rễ ở các đốt thân của mẫu (vị trí không chuyển gen). Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nguồn vật liệu dùng cho lây nhiễm với vi khuẩn có khả năng cảm ứng chuyển gen khác nhau. Hao và cs (2012) ghi nhận tỷ lệ mẫu lá đan sâm Salvia miltiorrhiza Bunge tạo rễ tơ (73%) cao hơn so với đoạn thân khi lây nhiễm hai loại vật liệu này với chủng vi khuẩn A. rhizogenes ACCC 10066. Gupta và cs (2011) sử dụng mô lá làm vật liệu lây nhiễm để cảm ứng tạo rễ tơ đan sâm với hiệu quả chuyển gen đạt 75-80%. Theo Pavar và Maheshvari (2004), có sự khác nhau về tỷ lệ các vật liệu cảm ứng tạo rễ tơ là do phản ứng của các mô thực vật khác nhau với sự xâm nhiễm của vi khuẩn A. rhizogenes là khác nhau và phụ thuộc rất lớn vào trạng thái sinh lý của mô. Hà Thị Loan và cs (2013) đã sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 15834 được dùng cho việc chuyển gen vào phiến lá và cuống lá cây con in vitro sâm ngọc linh theo quy trình của Bulgakov et al. (1998). Kết quả cho thấy, các mẫu mô khác nhau được lây nhiễm với vi khuẩn sau 5, 6 tuần nuôi cấy đều cảm ứng ra rễ tóc nhưng với tỷ lệ khác nhau. Tỷ lệ cảm ứng tạo rễ tóc và số rễ từ phiến lá lần lượt là 3,3% và 1,6 rễ cao hơn so với mẫu cuống lá tỷ lệ này tăng lên là 14,8% và 2,8 rễ, đối với các mẫu đối chứng đều không hình thành rễ. Kim et al. (2008) đã chứng minh rằng chủng A. rhizogenes 15834 cho tỷ lệ phần trăm số mẫu cảm ứng tạo rễ tóc trên lá đậu phộng là 36,8% và số rễ tóc tạo ra từ vị trí bị thương là 2,3 rễ. Còn trên mẫu từ trụ hạ diệp thì tỷ lệ cảm ứng tạo rễ tóc là 75,9% và 6,7 rễ. Shi & Kintzios (2003) cũng ghi nhận đối với cây Pueraria phaseoloides có sự cảm ứng tạo rễ tóc từ mẫu cuống lá cao hơn từ mẫu lá và lá mầm. 52
  63. Đồ án tốt nghiệp Tóm lại, theo kết quả ghi nhận được ở hình 3.3 và bảng 3.3 thì bước đầu lây nhiễm vi khuẩn Agobacterium rhizogenes chủng TR7 và chủng 15834 vào các cơ quan của lan kim tuyến để tạo rễ tóc đã không thành công. Nhìn chung, giữa các mẫu được chuyển gen và không chuyển gen không có sự khác biệt nhiều. Các mẫu lá được chuyển gen hay không đều không có hiện tượng gì cả, các đoạn thân được chuyển gen và không được chuyển gen đều có hiện tượng tái sinh chồi, có lá và có lông tơ, không xuất hiện rễ. Các mẫu thân cây không chuyển gen thì tại đốt thân xuất hiện chồi, có lông tơ, còn mẫu thân cây được chuyển gen thì không xuất hiện chồi nhưng lại xuất hiện rễ ở những vị trí không chuyển gen (các đốt thân). 53
  64. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận. Dựa vào kết quả thu được từ các thí nghiệm người thực hiện đề tài đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng lên sự tạo chồi và nhân nhanh chồi lan kim tuyến. Môi trường tái sinh chồi ở các vị trí đốt thân lan kim tuyến phù hợp nhất: môi trường MS có bổ sung agar (8 g/l), sucrose (30 g/l) và nồng độ NAA (0,5 mg/l) kết hợp nồng độ BA (1,0 mg/l). Môi trường nhân nhanh chồi lan kim tuyến phù hợp nhất: môi trường MS có bổ sung agar (8 g/l), sucrose (30 g/l) và nồng độ NAA (0,1 mg/l) kết hợp nồng độ BA (1,0 mg/l). Bước đầu lây nhiễm vi khuẩn Agobacterium rhizogenes chủng TR7 và chủng 15834 vào các cơ quan của lan kim tuyến để tạo rễ tóc đã không thành công. 4.2. Kiến nghị Do thời gian tiến hành đồ án có hạn, người thực hiện đề tài chưa thể thực hiện nhiều nghiên cứu sâu hơn về lan kim tuyến. Tuy nhiên, qua thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn Agobacterium rhizogenes chủng TR7 và chủng 15834 vào các cơ quan của lan kim tuyến để tạo rễ tóc chưa có kết quả sau 4 tuần nuôi cấy, người thực hiện đề tài kiến nghị nên tiếp tục theo dõi và tiến hành làm đề tài này nhiều hơn với việc sử dụng những chủng vi khuẩn Agobacterium rhizogenes khác và lây nhiễm vào những cơ quan khác trên lan kim tuyến. 54
  65. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Bộ Khoa học và Công nghệ, Sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật). Nxb. Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội, 2007. 2. Bùi đình thạch (2016), “Nghiên cứu tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (plumbago zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo plumbagin trong nuôi cấy in vitro, Luận văn tiến sĩ , Học viện khoa học và công nghệ Hà Nội. 3. Dương công kiên (2002). Nuôi cấy mô thực vật (tập 1,2,3). NXB ĐHQG TP.HCM. 4. Dương Đức Chiến. Báo người lao động. “Giá tăng bạc triệu, dân đổ vào rừng vét cỏ quý”. Qúy 13/01/2014. 5. Hà Thị Loan, Dương Hoa Xô, Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Hoàng Quân, Vũ Thị Đào, “Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm ngọc linh panax vietnamenis bằng phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”, tạp chí sinh học 2014, 36 (1se): 293-300, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM. 6. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (1993), Chất điều hòa sinh trưởng đối với cây trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 7. Lê Thu Ngọc, Trần Thu Trang, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Dương Tấn Nhựt, “Nghiên cứu tạo vector chuyển gen mang các cấu trúc gen rol tăng cường cảm ứng tạo rễ tơ ở thực vật chuyển gen”, Tạp chí sinh học 2013, 35(4): 494-503, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam. 8. Lê Xuân Thao (2014), “Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cr3 kháng sâu non bọ hà”, Luận văn Thạc sĩ.,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. 9. Ngô Xuân Bình (chủ biên), Nuôi cấy mô tế bào thực vật , NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 2015. 10. Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ tế bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP.HCM. 55
  66. Đồ án tốt nghiệp 11. Nguyễn Thị Lệ Hà , Phạm Thị Mận , Cao Minh Thủy Nguyên, Phạm Thụy Nhật Truyền, Nguyễn Xuân Cường, Nguyễn Văn Thiết, (2015) “Nghiên cứu kỹ thuật vi nhân giống lan kim tuyến (Anoectochilus sp.)” Trung tâm Ứng dụng Khoa học Kỹ thuật Lâm nghiệp Nam Bộ, Viện NCKH Lâm nghiệp Nam Bộ. 12. Nguyễn Như Nhựt, Bùi Văn Lệ (2001), “Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự cảm ứng rễ tơ cây dừa cạn (Catharanthus roseus) của chủng Agrobacterium rhizogenes C26”, Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 44 (2016): 96-103. 13. Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập III, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội, 2005. 14. Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp. 15. Ninh Thị Thảo, Lê Tiến Vinh, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Phương (2015), “Nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ tơ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 13, số 2: 251-258. 16. Phan Trung Hải, Quách Ngô Diễm Phương, Nguyễn Như Nhứt (2015), “Nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ tơ cây hoa móng tay (Impatiens balsamina) từ mười bốn chủng Agrobacterium rhizogenes”, Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016, Trường đại học Khoa học tự nhiên ĐHQG TP.HCM. 17. Phú Thị Cẩm Miện (2010), “Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học KHXH&NV (ĐHQG Hà Nội), Hà Nội. 18. Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng, “Đặc điểm hình thái, phân bố của loài Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(2), 104-109, 2010. 56
  67. Đồ án tốt nghiệp 19. Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành, Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lind. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(4), 248-253, 2010. 20. Trần văn Minh (2010), Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia,. Tài liệu nước ngoài. 21. Altamura, 2004. Agrobacterium rhizogenes rolB and rolD genes: regulation and involvement in plant development. Plant Cell Tissue Org. Cult., 77: 89-101. 22. Birot, Bouchez, Casse-Delbart, Durand-Tardif, Jouanin, Pautot, Robaglia, Tepfer, Tepfer, Tourneur, 1987. Studies and uses of the rRi plasmids of Agrobacterium rhizogenes. Plant Physiol. Biochem., 25: 323-335. 23. Cardarelli, Spanò, 1987. The role of auxin in hairy root induction. Mol. Gen. Genet., 208(3): 457-463. 24. Chilton, Tepfer, 1982. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature, 295: 432-434. 25. Chow, Hsieh, Chang, 1982. In vitro propagation of Anoectochilus formosanus. J. Sci. Eng. 19: 155- 165. (in Chinese). 26. Christophe Maurel, Helene Barbier-Brygoo, Angelo Spena, Jacques Tempe, and Jean Guern, 1991. Single rol Genes from the Agrobacterium rhizogenes TL-DNA Alter Some of the Cellular Responses to Auxin in Nicotiana tabacum. 97: 212-216. 27. Dodds, Roberts, 1985. Experiments in Plant Tissue Culture. 2nd Ed. Cambridge University Press, Cambridge. 28. Edwin 1993, Plant Propagation by Tissue Culture, Exegetics Limited, Part 2. 29. Gupta, Liu, Liaw, Chan , Tsay, 2011. Enhanced tanshinone production in hairy roots of ‘Salvia miltiorrhiza Bunge’ under the influence of plant growth regulators in liquid culture. Botanical Studies, 52: 435-443. 57
  68. Đồ án tốt nghiệp 30. Hahn và Van Kiet Nguyen, 2004. Effect of Environmental Conditions on in vitro and ex vitro growth of Jewel Orchid Anoectochilus formosanus Hayata, Thesis for the Degree of Doctor of Philosophy in Agriculture, The Graduate School of Chungbuk National University. 31. Hao, Ji, Li, Shi R, Wang, Feng, Huang, 2012. Exogenous ABA and polyamines enhanced salvianolic acids contents in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza Bge f.alba. Plant Omics Journal, 5(5): 446-452. 32. Kim, Lee, Park, 2008. Resveratrol production in hairy root of peanut, Arachis hypogaea L. transformed with defferent Agrobacterium rhizogenes strains. Afr. J. Biotechnol., 7: 3788-3790. 33. Jouanin, Guerche, Pamboukdjian, Tourneur, Casse-Delbart, Tourneur, 1987. Structure of T-DNA in plants regenerated from roots transformed by Agrobacterium rhizogenes strain A4. Mol. Gen. Genet., 206: 387-392. 34. Meyer, Tempe, Costantino, 2000, Hairy root; a molecular overview. Functional analysis of Agrobacterium rhizogenes T-DNA genes. In: Stacey G, Keen NT, eds. Plant Microbe Interactions. St. Paul: APS Press: 93-139. 35. Narayaswamy, 1994 .Plant cell and tissue culture. Tata McGraw-Hill Education. 36. Nilsson, Olsson, 1997. Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots. Physiol. Plant, 100: 463- 473. 37. Ramachandra Rao, Ravishankar. 2002. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnol. Adv. 20: 101-153. 38. Riker et al. 1930, Rhizobium rhizogenes, Young et al. 2001. 39. Salez, Sánchez, Piqueras, 1994, Micropagation of Thymus piperella, Plant Cell Tiss, 39:269–272 58
  69. Đồ án tốt nghiệp 40. Shi, Kintzios, 2003. Genetic transformation of Pueraria phaseoloides with Agrobacterium rhizogenes and peurarin production in hairy root. Plant Cell Rep, 21: 1103-1107. 41. Smith, Townsend 1907. "A Plant-Tumor of Bacterial Origin". Science. 25 (643): 671–673. Tài liệu từ internet 42. 43. 44. 59
  70. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục A: Thành phần môi trường Bảng 1. Thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần mg/1 NH4NO3 1650 KNO3 1900 Mg SO .7H O 370 Khoáng đa lượng 2 4 2 CaCl2.2H2O 440 KH9PO4 170 MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.7H2O 8,6 CUSO4.5H2O 0,025 KI 0,83 Khoáng vi lượng COC12.6H2O 0,025 H3PO3 6,2 Na2MoO4.2H2O 0,025 Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Các vitamin và các Pyridoxine HC1 0,5 chất hữu cơ khác Thiamine HC1 0,1 Glycine 2 1
  71. Đồ án tốt nghiệp 2
  72. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2. Thành phần môi trường YMB Thành phần mg/l Yeast extract 0,4 K2HPO4.3H2O 0,5 Manitol 10 MgSO4.7H2O 2 NaCl 0,1 Phụ lục B: Bảng số liệu được xử lý bằng phần mềm SAS Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến. The ANOVA procedure Dependent variable: TYLETAISINHCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 230.0480889 115.0240444 13.98 0.0055 Error 6 49.3660667 8.2276778 Corrected Total 8 279.4141556 R-Square Coeff Var Root MSE TYLETAISINHCHOI Mean 0.823323 3.092533 2.868393 92.75222 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 2 230.0480889 115.0240444 13.98 0.0055 3
  73. Đồ án tốt nghiệp The ANOVA procedure Test (LSD) for TYLETAISINHCHOI Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 8.227678 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 8.6829 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NTHUC A 98.790 3 NT2 A B A 93.050 3 NT1 B B 86.417 3 NT3 The ANOVA procedure Dependent variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 3.19395556 1.59697778 43.30 0.0003 Error 6 0.22126667 0.03687778 Corrected Total 8 3.41522222 R-Square Coeff Var Root MSE SOCHOI Mean 0.935212 6.264309 0.192036 3.065556 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 2 3.19395556 1.59697778 43.30 0.0003 4
  74. Đồ án tốt nghiệp The ANOVA procedure Test (LSD) for SOCHOI Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.036878 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 0.5813 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NTHUC A 3.8300 3 NT2 B 2.9900 3 NT3 C 2.3767 3 NT1 The ANOVA procedure Dependent variable: CHIEUCAOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 0.59982222 0.29991111 11.84 0.0083 Error 6 0.15200000 0.02533333 Corrected Total 8 0.75182222 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUCAOCHOI Mean 0.797825 9.387158 0.159164 1.695556 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 2 0.59982222 0.29991111 11.84 0.0083 5
  75. Đồ án tốt nghiệp The ANOVA procedure Test (LSD) for CHIEUCAOCHOI 0.01 Alpha Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.025333 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 0.4818 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NTHUC A 2.0333 3 NT2 A B A 1.6467 3 NT3 B B 1.4067 3 NT1 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến. The ANOVA procedure - Dependent variable: SOCHOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 14.69502500 4.89834167 28.32 0.0001 Error 8 1.38386667 0.17298333 Corrected Total 11 16.07889167 R-Square Coeff Var Root MSE HESONHANCHOI Mean 0.913933 6.316861 0.415913 6.584167 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 3 14.69502500 4.89834167 28.32 0.0001 6
  76. Đồ án tốt nghiệp The ANOVA procedure Test (LSD) for SOCHOI Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.172983 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 1.1395 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NTHUC A 8.0400 3 NT4 B 6.7600 3 NT3 B B 6.6100 3 NT2 C 4.9267 3 NT1 The ANOVA procedure - Dependent variable: SOLA Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 34.39680000 11.46560000 20.70 0.0004 Error 8 4.43046667 0.55380833 Corrected Total 11 38.82726667 R-Square Coeff Var Root MSE SOLA Mean 0.885893 8.824304 0.744183 8.433333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 3 34.39680000 11.46560000 20.70 0.0004 7
  77. Đồ án tốt nghiệp The ANOVA procedure Test (LSD) for SOLA Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.553808 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 2.0388 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NTHUC A 10.7800 3 NT4 B 8.5000 3 NT3 B B 8.4600 3 NT2 C 5.9933 3 NT1 8
  78. Đồ án tốt nghiệp 9