›

Đồ án Nghiên cứu công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp SHF (separate hydrolysis and fermentation)

pdf 85 trang thiennha21 13/04/2022 3860
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp SHF (separate hydrolysis and fermentation)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfnghien_cuu_cong_nghe_chuyen_hoa_go_tram_bong_vang_thanh_bioe.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp SHF (separate hydrolysis and fermentation)

  1. New Text Document.txt NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CHUYỂN HÓA GỖ (TRÀM BÔNG VÀNG) THÀNH BIOETHANOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SHF(SEPARATE HYDROLYSIS AND FERMENTATION) VĂN BẢO HUY NGUYỄN ĐÌNH QUÂN (giảng viên hướng dẫn) TRẦN THỊ TƯỞNG AN (giảng viên hướng dẫn) Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017 Page 1
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do bản thân thực hiện và không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào. Nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. Các số liệu trong đề tài có nguồn gốc rõ ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc. Kết quả trình bày trong đề tài được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực và chưa từng được công bố trước đây. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung khoa học đề tài nghiên cứu này. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Văn Bảo Huy
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi đến TS. Nguyễn Đình Quân, ThS. Trần Thị Tưởng An cùng anh Nguyễn Anh Duy và các bạn Nguyễn Minh Thiện, Võ Thị Thảo Trang, Trần Thị Ánh Nguyệt đang nghiên cứu và làm đồ án tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh lời cảm tạ sâu sắc vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt trong suốt thời gian qua. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy cô của trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM nói chung, quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường nói riêng đã tận tình dạy dỗ, giúp em hoàn thiện kiến thức, các kỹ năng chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã nuôi dạy con nên người. Ba mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất để con bước đi trên con đường đời khi vấp ngã luôn có ba mẹ động viên tinh thần cho con. Vì chưa có nhiều kinh nghiệm, chỉ dựa vào kiến thức hạn hẹp cùng với thời gian ngắn ngủi nên chắc chắn không tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô để kiến thức của chúng em ngày càng hoàn thiện hơn, rút ra được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình học tập, làm việc sau này. Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô của trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý của mình. Đồng kính chúc quý thầy cô, anh chị và các bạn của phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh luôn dồi dào sức khỏe và đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Văn Bảo Huy
  4. Đồ án tốt nghiệp
  5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Sơ lược về cồn sinh học 4 1.1.1. Khái niệm 4 1.1.2. Các thế hệ bioethanol 4 1.1.3. Tình hình sản xuất bioethanol thế giới và trong nước 5 1.1.4. Quy trình sản xuất bioethanol 7 1.2. Nguyên liệu lignocellulose 8 1.2.1. Khái niệm 8 1.2.2. Thành phần cấu trúc lignocellulose 9 1.3. Cây tràm bông vàng ở Việt Nam (Acacia auriculiformis) 11 1.3.1. Sơ lượt về cây tràm bông vàng 11 1.3.2. Phương pháp sản xuất bioethanol từ gỗ tràm bông vàng 13 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 23 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27 2.2. Nguyên vật liệu 27 2.2.1 Mùn cưa từ gỗ cây tràm bông vàng 27 2.2.2. Acremonium cellulase 27 2.2.3. Saccharomyces cerevisiae 28 2.2.4. Hóa chất sử dụng 28 2.3. Các thiết bị sử dụng 29 2.4. Bố trí thí nghiệm 31 i
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Sơ đồ quy trình 32 2.4.2. Trình tự và Bố trí thí nghiệm 33 2.5. Các phương pháp phân tích 41 2.5.1. Phương pháp phân tích hàm lượng ẩm 41 2.5.2. Phương pháp phân tích thành phần cellulose, lignocellulose, lignin và hàm lượng tro trong nguyên liệu biomass 42 2.5.3. Phương pháp cấy và giữ giống nấm men 46 2.5.4. Phương pháp nhân giống và hoạt hóa giống nấm men 46 2.5.5. Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 47 2.5.6. Phương pháp xác định hai loại đường và ethanol bằng máy HPLC 47 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 48 3.1. Khảo sát chủng nấm men S.cerevisiae sử dụng trong đề tài 48 3.1.1. Đặc điểm hình thái của nấm men 48 3.1.2. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae 48 3.2. Phân tích mẫu nguyên liệu ban đầu 50 3.3. Tiền xử lý 50 3.3.1. Khảo sát kích thước nguyên liệu 50 3.3.2. Chọn tác chất tiền xử lý 51 3.3.3. Thành phần mẫu sau tiền xử lý với NaOH 53 3.3.4. Thời gian tiền xử lý và tỉ lệ khối lượng mẫu/ khối lượng dung dịch 54 3.4. Quá trình thủy phân 55 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân 55 3.4.2. Khảo sát tác động của tỷ lệ enzyme bổ sung đến quá trình thủy phân 56 3.4.3. Khảo sát pH ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 58 3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân 59 3.5. Khảo sát lên men 60 3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men 60 3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đối với hiệu quả của quá trình lên men 61 ii
  7. Đồ án tốt nghiệp 3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men 63 3.5.4. Khảo sát tỷ lệ nấm men bổ sung trong quá trình lên men 63 3.5.5. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần chất dinh dưỡng bổ sung 64 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66 4.1. Kết luận 66 4.2. Đề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC iii
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT - CSL: Corn steep liquor - HPLC: High Performance Liquid Chromatography - KHV: Kính hiển vi - STT: Số thứ tự - SHF: Separate Hydrolysis and Fermentation - SSF: Simultaneous Saccharification Fermentation - SSCF: Simultaneous Saccharification and Cofermentation - UV-VIS: Ultraviolet–visible spectroscopy - VSV: Vi sinh vật iv
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tình hình một số nhà máy bioethanol tại Việt Nam 6 Bảng 1.2. Thành phần của vài loại lignocellulose .9 Bảng 1.3. Ưu, nhược điểm của một số phương pháp lên men .14 Bảng 1.4. Các phương pháp tiền xử lý hiện nay 17 Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng 28 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định kích thước hạt thích hợp 33 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm lựa chọn tác nhân tiền xử lý . 35 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian tiền xử lý 36 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ bã/dung dịch 37 Bảng 3.1. thành phần phần trăm các chất có trong mẫu mùn cưa gỗ ban đầu .50 Bảng 3.2. Thành phần phần trăm các chất có trong mẫu mùn cưa gỗ tràm bông vàng sau khi tiền xử lý với NaOH 4% 53 v
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Quy trình sản xuất bioethanol .8 Hình 1.2. Công thức hóa học của cellulose 9 Hình 1.3. Các dạng cấu trúc của hemicellulose . .10 Hình 1.4. Các đơn vị cơ bản của lignin 11 Hình 1.5. Gỗ và cây tràm bông vàng .12 Hình 1.6. Nguồn cung dăm gỗ của Việt Nam và các nước trên thế giới .13 Hình 1.7. Sơ đồ quy trình sản xuất bioethanol 16 Hình 1.8. Sơ đồ đường phân .22 Hình 1.9. Sự tạo thành ethanol từ glucose 23 Hình 2.1. Mùn cưa gỗ tràm bông vàng 27 Hình 2.2. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 30 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm . 32 Hình 3.1. Đặc điểm đại thể (a) và vi thể (b) của S.cerevisiae 48 Hình 3.2. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae theo thời gian trên môi trường SDB 49 Hình 3.3. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất tách lignin. 51 Hình 3.4. Ảnh hưởng của các tác chất tiền xử lý đối với hiệu suất lignin tách ra. . 52 Hình 3.5. Sự thay đổi của hiệu suất tách lignin theo thời gian 54 Hình 3.6. Sự phụ thuộc của lượng lignin tách ra vào tỉ lệ khối lượng mẫu/ khối lượng dung dịch .54 Hình 3.7. Nồng độ glucose và xylose được khảo sát theo thời gian 56 Hình 3.8. Hàm lượng glucose và xylose thay đổi khi khảo sát các tỷ lệ enzyme khác nhau từ 1% đến 9% 57 vi
  11. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9. Hàm lượng đường thay đổi khi khảo sát các giá trị của pH . 58 Hình 3.10. Hàm lượng glucose, xylose theo nhiệt độ thủy phân 59 Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men .60 Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu với quá trình lên men . 62 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ với quá trình lên men . .63 Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ bổ sung nấm men đến quá trình SHF 64 Hình 3.15. Hàm lượng glucose, xylose và ethanol theo chất dinh dưỡng bổ sung 65 vii
  12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay, thế giới đang đứng trước nguy cơ khủng hoảng năng lượng trầm trọng, Theo dự báo của các nhà khoa học trên thế giới, nguồn năng lượng từ các sản phẩm hoá thạch dầu mỏ sẽ bị cạn kiệt trong vòng 40 - 50 năm nữa. Để ổn định và đảm bảo an ninh năng lượng đáp ứng cho nhu cầu con người cũng như các ngành công nghiệp, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm ra những nguồn nhiên liệu mới. Trong đó, nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ sinh khối động, thực vật là một hướng đi có thể tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế phần nào nguồn nhiên liệu hoá thạch đang cạn kiệt; đảm bảo an ninh năng lượng cho từng quốc gia. Theo báo cáo của tổ chức Forest Trends, mỗi năm Việt Nam xuất khẩu dăm gỗ sang Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan để làm bột giấy lên đến gần 10 triệu tấn khô, trong đó chiếm 70 % là dăm gỗ tràm bông vàng. Từ năm 2011 đến nay, Việt Nam là quốc gia xuất khẩu dăm gỗ lớn trên thế giới và có diện tích trồng tăng từ 150.000 đến 200.000 hecta/năm. Dăm gỗ và đặc biệt là mùn cưa tràm thải ra trong quá trình sản xuất là rất lớn gần 1 triệu tấn khô tập trung dễ thu gom hơn rơm rạ và các nguyên liệu tinh bột. Vùng nguyên liệu dăm gỗ cụ thể là tràm bông vàng và keo lai (một loài tương tự như tràm bông vàng) lớn nhất tập trung tại miền Trung. Đây cũng là nơi có các nhà máy sản xuất cồn sinh học có quy mô lớn nhất cả nước như Dung Quất (Quảng Ngãi), nhưng các nhà máy này chỉ sử dụng nguồn nguyên liệu tinh bột khó thu mua. Dựa vào thành phần chủ yếu của tràm bông vàng là cellulose và hemicellulose, qua quá trình thủy phân và lên men, chuyển hoá cellulose trong gỗ thành Bioethanol. Với những ưu điểm như rẻ tiền, phổ biến, mùn cưa gỗ tràm sẽ là một nguồn nguyên liệu tiềm năng trong quá trình nghiên cứu sản xuất Bioethanol. Vậy nên chúng ta có thể kết hợp nguyên liệu ở các vùng có cơ sở sản xuất để phát triển bioethanol thế hệ thứ 2 sẽ mang đến các ý nghĩa thiết thực sau: 1
  13. Đồ án tốt nghiệp • Phù hợp với xu hướng phát triển của sản xuất bioethanol nói riêng và ngành năng lượng nói chung. • Nếu thành công thì sẽ tận dụng được nguồn mùn cưa, phế phụ phẩm lâm nghiệp khổng lồ hiện nay. • Phù hợp với an ninh lương thực thế giới thay thế nguyên liệu tinh bột và đường bằng lignocellulose trong công nghiệp sản xuất bioethanol. 2. Mục đích nghiên cứu Mục đích của đề tài là nghiên cứu khảo sát thực nghiệm hướng đến xây dựng công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp thủy phân và lên men không đồng thời (SHF) sử dụng Acremomium cellulase và Saccharomyces cerevisiae ở quy mô phòng thí nghiệm. 3. Nội dung nghiên cứu Để tối ưu khả năng chuyển hóa bioethanol từ mùn cưa tràm cần nghiên cứu:  Đối với quá trình tiền xử lý: - Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu. - Khảo sát thành phần mùn cưa gỗ ban đầu và sau tiền xử lý. - Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng NaOH và H2SO4. - Khảo sát thời gian tiền xử lý và tỉ lệ khối lượng mẫu/ khối lượng dung dịch  Đối với quá trình thủy phân và lên men không đồng thời (SHF): - Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến từng giai đoạn thủy phân và lên men. - Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hai giai đoạn thủy phân và lên men. - Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme bổ sung vào giai đoạn thủy phân. - Khảo sát ảnh hưởng của mật độ nấm men đến giai đoạn lên men. - Khảo sát ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến giai đoạn lên men. 2
  14. Đồ án tốt nghiệp 4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đồ án được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 03/04/2017 đến tháng 16/07/2017. 5. Hạn chế của đề tài Do quỹ thời gian không cho phép đồ án chỉ tiến hành các thí nghiệm tiền xử lý với NaOH và H2SO4 nhằm thu nhận được cellulose, chưa đa dạng được các phương pháp tiền xử lý ảnh hưởng trực tiếp đến các quá trình sau. 3
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về cồn sinh học 1.1.1. Khái niệm Bioethanol (ethanol sinh học) là một loại nhiên liệu sinh học dạng cồn, được sản xuất bằng con đường sinh học, chủ yếu bằng phương pháp lên men và chưng cất các loại ngũ cốc chứa tinh bột có thể chuyển hóa thành đường đơn, thường được sản xuất từ các loại cây nông nghiệp hàm lượng đường cao như bắp, lúa mì, lúa mạch, mía. Ngoài ra, bioethanol còn được sản xuất từ các loại cây có chứa hợp chất cellulose. Hiện nay, các nguồn nguyên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt, ước tính trữ lượng dầu mỏ của thế giới đến năm 2050 sẽ cạn. Trong khi đó, hoạt động sống của con người rất cần năng lượng. Mặt khác, nguồn năng lượng hóa thạch khi sử dụng đã gây ra các vấn đề nghiêm trọng về ô nhiễm môi trường, hiệu ứng nhà kính. Chính vì vậy, nhu cầu về nguồn nguyên liệu thay thế cho xăng dầu đang là vấn đề cấp thiết cho toàn thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Việc đầu tư nghiên cứu “nhiên liệu sạch”- nhiên liệu sinh học bioethanol đang trở thành đề tài được quan tâm hàng đầu trên thế giới [26]. 1.1.2. Các thế hệ bioethanol Dựa vào nguyên liệu sản xuất, bioethanol được chia làm 3 thế hệ:  Bioethanol thế hệ thứ nhất Bioethanol thế hệ thứ nhất là nguồn nguyên liệu chứa nhiều tinh bột và đường. Nói chung bioethanol có thể được tạo thành từ những nguyên liệu carbonhydrate có công thức chung là (CH2O)N và nó có thể được chia thành 3 nhóm : đường, tinh bột và sinh khối lignocellulosic.Bioethanol thế hệ thứ nhất là khái niệm đề cập tới nguồn cây trồng, đây cũng chính là nguồn dinh dưỡng cho con người và động vật như: các loại cây ngũ cốc, cây lấy đường [17].  Bioethanol thế hệ thứ hai Nguyên liệu thô sử dụng để sản xuất bioethanol thế hệ thứ 2 được đề cập ở đây là các sản phẩm không phải là nguồn thực phẩm, thường là sinh khối lignocellulosic. 4
  16. Đồ án tốt nghiệp Các nguyên liệu này đại diện cho các hình thể chứa nhiều cacbon trên trái đất như các loại phế phẩm nông nghiệp ( rơm, bã bắp (vỏ bắp, râu bắp, cùi bắp), gỗ thải, mùn cưa, phế phẩm lâm nghiệp, bã mía, các loại cỏ )[17].  Bioethanol thế hệ thứ ba Tảo biển là nguyên liệu tốt nhất trong nhóm này đòi hỏi ít đất đai canh tác và nguồn nước sạch cho trồng trọt, tiêu biểu cho nguồn sinh khối rất đáng quan tâm để sản xuất ra bioethanol [17]. 1.1.3. Tình hình sản xuất bioethanol thế giới và trong nước  Thế giới Brazil là nước đi đầu trong việc sản xuất và ứng dụng bioethanol trên thế giới. Brazil đã thành công trong việc sản xuất bioethanol theo quy mô công nghiệp từ những năm 1970 khi nước này phụ thuộc nặng nề vào dầu nhập khẩu. Ngày nay, toàn bộ xe hơi ở Brazil sử dụng xăng có pha ít nhất 25% ethanol, và 60% số xe có khả năng “linh động về nhiên liệu” (có thể sử dụng 100% ethanol làm nhiên liệu). Brazil sản xuất bioethanol hầu như chỉ từ cây mía. Trong mô hình này, mỗi tấn mía cho năng suất 72 lít ethanol. Loại ethanol này có thể được tinh lọc thêm để pha vào xăng, hoặc dùng làm ethanol nhiên liệu tinh. Rõ ràng con số này cho thấy có rất nhiều thành phần không được sử dụng trong quá trình chuyển hóa biomass thành ethanol. Hầu hết những thành phần này là hemicellulose và cellulose. Nước Mỹ đang bám theo Brazil và đầu tư mạnh vào sản xuất nhiên liệu sinh học. Hiện tại Mỹ đang sử dụng toàn bộ xăng có pha 10% ethanol, với những cải tiến nhằm tăng tỉ số này. Trong tương lai, Colombia bắt buộc những thành phố có dân số trên 500.000 dân phải bán xăng có pha 10% ethanol. Ở Venezuela, công ty dầu Quốc gia đang hỗ trợ dự án xây dựng 15 nhà máy chế cồn từ mía trong 5 năm tới khi chính phủ sắp ban hành đạo luật bắt buộc sử dụng xăng E10 (pha 10% ethanol). Ở Đông Nam Á, Thái Lan đã ban hành luật cho sử dụng xăng pha 10% ethanol bắt đầu từ 2007 [20]. 5
  17. Đồ án tốt nghiệp  Việt Nam Ở Việt Nam, công nghiệp sản xuất ethanol đã được hình thành. Phần đông các nhà máy ethanol sản xuất từ rỉ đường mía, tinh bột dùng làm ethanol cho thực phẩm và công nghiệp (bảng 1.1). Tổng cộng năng suất là 25 triệu lít/năm, trong đó có 3 nhà máy sản xuất 15000 – 30000 lít/ngày là nhà máy đường Lam Sơn, nhà máy đường Hiệp Hoà và nhà máy rượu Bình Tây và hàng trăm cơ sở sản xuất 3000 – 5000 lít/ngày. Tập Đoàn Dầu Khí Việt Nam (PetroVietNam) đã giao cho Tổng công ty Dầu Khí Việt Nam (Petrosetco), đơn vị thành viên của PetroVietnam việc phát triển năng lượng sinh học. Ngày 09/03/2007, Petrosetco ký kết với tập đoàn Itochu Nhật Bản hợp tác thành lập liên doanh xây dựng nhà máy sản xuất bioethanol đầu tiên tại Việt Nam phục vụ cho hoạt động công nghiệp và giao thông vận tải với công suất 100 triệu lít/năm. Xăng sinh học E5 do PetroVietnam pha chế chính thức có mặt trên thị trường từ ngày 01/08/2010 và được bán tại hơn 153 điểm kinh doanh xăng dầu của PetroVietnam cũng như các đại lý tại một số tỉnh, thành phố lớn trên cả nước. Bảng 1.1. Tình hình một số nhà máy bioethanol tại Việt Nam STT Tên nhà máy Công suất Địa điểm Tình trạng 1 Nhà máy ethanol nhiên 130 triệu Đại Lộc, Quảng Đang sản xuất liệu - Cty Đồng Xanh lít/năm Ngãi 2 Nhà máy sản xuất ethanol 70 triệu Đồng Nai Dừng hoạt nhiên liệu Cty Tùng Lâm lít/ năm động 3 Nhà máy sản xuất ethanol 70 triệu Lô CN5 khu CN Đang sản xuất nhiên liệu – Cty TNHH lít/ năm Tâm Thắng, Đắc Đại Việt Nông 4 Nhà máy sản xuất ethanol 100 triệu Khu CN Dung Dừng hoạt sinh học Dung Quốc (Cty lít/ năm Quốc, Quảng Ngãi động Nhiên liệu miền Trung ) Nguồn: Khoa học và công nghệ, số 9 -08/2012. 6
  18. Đồ án tốt nghiệp Ngày 20/11/2007, "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025" đã được Thủ tướng Chính phủ ký quyết định số177/2007/QĐ- TTG với mục tiêu phát triển năng lượng, một dạng năng lượng mới, tái tạo được thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần bảo đảm an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường. Nhà máy Ethanol Đại Tân có công suất 125 triệu lít/năm Ngày 05/08/2010, công ty Đồng Xanh tổ chức lễ công bố xăng sinh học sản xuất ở Việt Nam với tỷ lệ cồn lên tới 99.8%. Sản phẩm đã bán ra trên thị trường Việt Nam và sử dụng cho động cơ với tên thương mại xăng E5. Hiện nay nhà máy ethanol Đại Tân đã tạm dừng hoạt động kể từ tháng 6/2012, đến quý I/2013 nhà máy sản xuất ethanol Bình Phước có công suất 100 triệu lít/năm cũng đã phải tạm ngừng sản xuất do giá nguyên liệu đầu vào cao trong khi nhu cầu tiêu thụ ethanol nhiên liệu nội địa không đáng kể. 1.1.4. Quy trình sản xuất bioethanol Bioethanol có thể được sản xuất từ ba loại nguyên liệu: đường (từ mía đường, củ cải đường, mật đường và trái cây), tinh bột ( từ ngô, sắn, khoai tây) và cellulose (từ gỗ, phế thải nông nghiệp, chất thải từ bột giấy và giấy nhà máy) (hình 1.1). Trong số ba loại nguyên liệu chính, cellulose chứa trong sinh khối lignocellulosic là nguồn sinh khối toàn cầu phổ biến nhất có thể sử dụng cho sản xuất ethanol sinh học. Quá trình lên men sản xuất ethanol gồm các khâu: tiền xử lý nguyên liệu và 2 giai đoạn: Thủy phân nguyên liệu (đường hóa) và lên men. Thủy phân (đường hóa) là quá trình chuyển hoá nguyên liệu thành các đường đơn chủ yếu như glucose, xylose. Lên men là quá trình chuyển hoá các phân tử đường thành ethanol. Sản xuất ethanol từ mùn cưa tràm có thể thực hiện bằng phương pháp “Thủy phân và Lên men riêng biệt” (separate hydrolysis and fermentation – SHF) hoặc bằng phương pháp “Đường hóa và Lên men đồng thời” (simultaneous saccharification and fermentation - SSF) hay phương pháp đồng đường hóa và đồng lên men (SSCF) 7
  19. Đồ án tốt nghiệp đường hóa và lên men đồng thời bởi nhiều giống vi sinh vật khác nhau. Phương pháp này có nhiều đặc điểm giống SSF. Đường Lên men Tinh bột Bioethanol Chưng Thủy phân Lên men cất và đồng Cellulose sản phẩm Tiền xử lý Thủy phân Lên men Hình 1.1 Quy trình sản xuất bioethanol [4]. 1.2. Nguyên liệu lignocellulose 1.2.1. Khái niệm Lignocellulose là nguyên liệu biomass phổ biến nhất trên trái đất. Lignocellulose dùng trong sản xuất bioethanol có trong phế phẩm nông nghiệp, trong sản phẩm phụ của công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy; có trong rác thải rắn của thành phố Với thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu to lớn cho việc sản xuất bioethanol (bảng 1.2). Về cơ bản, trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như lignin. Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau bằng liên kết cộng hóa trị [8]. Gỗ tràm bông vàng là một dạng vật liệu lignocellulose. 8
  20. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2. Thành phần của vài loại lignocellulose. Chất Nguồn Cellulose Xylose Mannose Galactose Arabinose Lignin trích ly Gỗ vân 41.9 6.1 14.3 - 1.2 27.1 9.6 sam Gỗ thông 37.7 4.6 7.0 - - 27.5 10.8 Gỗ bu lô 38.2 18.5 1.2 - - 22.8 4.8 Gỗ 49.9 17.4 4.7 1.2 1.8 18.1 - dương cây bắp 36.4 18.0 0.6 1.0 3.0 16.6 7.3 lúa mì 38.2 21.2 0.3 0.7 2.5 23.4 13 Theo Hetti Palonen [8]. 1.2.2. Thành phần cấu trúc lignocellulose 1.2.2.1 Cellulose Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản. Các sợi này được gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm. Các vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của ezyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân. Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose ( hình 1.2 ), các D-glucose được liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucoside [5]. Cellulose là loại polymer phổ biến nhất trên trái đất,độ trùng hợp đạt được 3.500 – 10.000 DP [3] . Hình 1.2. Công thức hóa học của cellulose 9
  21. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.2 Hemicellulose Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 - 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường C6 gồm glucose, mannose, galactose và đường C5 gồm xylose và arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β-D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4) [5]. H nh 1.3. Các dạng cấu trúc của hemicellulose 1.2.2.3 Lignin Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở (hình 1.4). Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose, rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn [5]. 10
  22. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Các đơn vị cơ bản của lignin Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ. Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringly lignin. Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl. Nghiên cứu chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringyl lignin. Do sự liên kết chặt chẽ của lignin với mạng cellulose và hemicellulose nên yêu cầu cần một quá trình tiền xử lý nguyên liệu ban đầu để phá vỡ cấu trúc giữa lignin – cacbohydrate giải phóng cellulose, giúp cho quá trình thủy phân bằng enzyme hay acid diễn ra dễ dàng hơn. 1.3. Cây tràm bông vàng ở Việt Nam (Acacia auriculiformis) 1.3.1. Sơ lượt về cây tràm bông vàng Gỗ tràm bông vàng là một dạng nguyên liệu lignocellulose . Tràm bông vàng có danh pháp khoa học là Acacia auriculiformis là một loài cây thuộc họ Fabaceae chi Keo (Acacia). Loài này trong tiếng Việt còn có tên gọi khác là keo lưỡi liềm, tên này được sử dụng nhiều khi loài này mới nhập nội vào Việt Nam (thập kỷ 1960-1970), sau này người ta sử dụng rộng rãi tên gọi keo lá tràm. Keo lá tràm được phân bố tự nhiên ở vùng Indonesia và Papua New Guinea. Hiện tại được trồng rộng rãi tại nhiều Quốc gia ở vùng nhiệt đới trong đó có Việt Nam. 11
  23. Đồ án tốt nghiệp H nh 1.5. Gỗ và cây tràm bông vàng Tràm bông vàng được trồng rất nhiều trên khắp cả nước và là nguồn dăm gỗ, làm giấy xuất khẩu hàng đầu của Việt Nam (hình 1.5). Từ năm 2011 đến nay, Việt Nam là quốc gia xuất khẩu dăm gỗ lớn trên thế giới và có diện tích rừng trồng tăng từ 150,000 đến 200,000 hecta/năm. Hàm lượng cellulose trong tràm bông vàng cao, lên đến 42% khối lượng với sợi cellulose dài và bền, nên được sử dụng làm nguyên liệu chế biến bột giấy. Mỗi năm Việt Nam xuất khẩu dăm gỗ sang Nhật Bản, Trung Quốc và Đài Loan để làm bột giấy lên đến gần 10 triệu tấn khô (Hình 1.6), trong đó chiếm 70% là gỗ tràm bông vàng [19]. Để chế biến dăm gỗ, cây được vát bỏ cành, nhánh rồi bóc vỏ trước khi băm thành những miếng gỗ dăm domino. Phần cành, nhánh, vỏ cây là phụ phẩm của quá trình sản xuất lâm nghiệm này, ước tính chiếm 20% khối lượng tổng thể của cá thể 12
  24. Đồ án tốt nghiệp cây. Phần phụ phẩm này được băm nghiền thành mùn cưa để bán làm chất đốt với giá thành tương đối thấp nhưng vẫn còn lãng phí rất nhiều vì không sử dụng hết. Nguồn lignocellulose này chính là nguyên liệu rất tiềm năng để chuyển hóa thành cồn sinh học. Qua kết quả thống kê và thực tế, ước tính phụ phẩm mùn cưa gỗ tràm và gỗ xấu, gỗ vụn tại Việt Nam hằng năm sẽ tối thiểu 36 tấn/hecta x 50,000 hecta/năm = 1,800,000 tấn/năm. Đây là một con số rất lớn nên được tận dụng để sản xuất ethanol. Hình 1. 6. Nguồn cung dăm gỗ của Việt Nam và các nước trên thế giới. 1.3.2. Phương pháp sản xuất bioethanol từ gỗ tràm bông vàng  Một số phương pháp lên men Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử diễn ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme là quá trình oxy hóa sinh học. Có rất nhiều phương pháp lên men để tạo bioethanol, bước cuối để biến đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol là thủy phân và lên men có thể được thực hiện một cách độc lập (SHF), đồng thời (SSF) hay đồng thời kết hợp nhiều chủng vi sinh vật (SSCF). Ưu, nhược điềm của các phương pháp này được trình bày trong bảng 1.3. 13
  25. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3. Ưu, nhược điểm của một số phương pháp lên men Phương TT pháp lên Ưu điểm Nhược điểm men Cả hai quá trình Tốc độ đường hóa bị ảnh hưởng mạnh bởi đường hóa và lên sự ức chế sản phẩm cuối đối với enzyme. men được thực hiện Sự tích tụ các chất ức chế cản trở hoạt Đường hóa trong điều kiện tối ưu động của enzyme thủy phân cellulose làm và lên men 1 của mỗi quá trình. cho quá trình biến đổi kém hiệu quả và riêng rẽ gây tốn kém (phải bổ sung một lượng lớn (SHF) enzyme). Dễ nhiễm các vi sinh vật khác do thời gian ủ dài ở quá trình thủy phân. Tăng tỷ lệ thủy phân Nhiệt độ tối ưu cho enzyme thủy phân và và giảm ức chế nấm men chuyển hóa đường thành ngược khi sản phẩm ethanol hoàn toàn khác nhau. tạo thành. Cần phải lựa chọn được điều kiện nhiệt Giảm lượng enzyme độ và pH gắn với điều kiện tối ưu của mỗi Đường hóa dùng cho quá trình. quá trình riêng. và lên men Cho hiệu suất ethanol Ethanol tạo thành sẽ quay lại ức chế 2 đồng thời cao. enzyme cellulose làm cho lượng ethanol (SSF) Đòi hỏi điều kiện vô thu được không cao. trùng thấp. Cơ chế thủy phân không hoàn toàn nên Thời gian lên men lượng glucose do enzyme cellulase tạo ra ngắn. chỉ đủ để cho nấm men tăng trưởng hơn là việc lên men đường thành ethanol. 14
  26. Đồ án tốt nghiệp Cải tiến của phương Nhiệt độ của quá trình thủy phân enzyme pháp SSF. và lên men ethanol khác nhau đáng kể, Đường hóa Chi phí thấp. làm cho quá trình tối ưu hóa đồng thời hai và lên men Thời gian xử lý ngắn, hoạt động rất khó. đồng thời giảm nguy cơ ô Quá trình SSCF phải được vận hành ở hexoses và nhiễm và tác dụng ức nhiệt độ thấp hơn để phù hợp tăng trưởng pentoses chế ít. của vi khuẩn và lên men ethanol. 3 bởi nhiều Hiệu suất lên men giống vi bioethanol cao và lên sinh vật men cả đường 5 và 6 khác nhau carbon. (SSCF) [2]. Trong đề tài này sẽ sử dụng phương pháp SHF để thu bioethanol từ mùn cưa gỗ.  Phương pháp đường hóa và lên men riêng rẽ (SHF): Thuận lợi chính của SHF là cả hai quá trình đường hóa và lên men được thực hiện trong điều kiện tối ưu của mỗi quá trình. Tuy nhiên sự tích tụ các chất ức chế cản trở hoạt động của enzyme thủy phân cellulose và glucose. Điều này làm cho quá trình biến đổi kém hiệu quả và gây tốn kém (phải bổ sung một lượng lớn enzyme). Dễ nhiễm các vi sinh vật khác do thời gian ủ dài ở quá trình thủy phân. Về nguyên tắc, quá trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa cellulose cũng giống như từ tinh bột hay rỉ đường. Bao gồm các bước cơ bản (hình 1.7): - Xử lý thô bằng các phương pháp cơ học để loại bỏ bụi, đất, đá và làm giảm kích thước. 15
  27. Đồ án tốt nghiệp - Tiền xử lý. - Thủy phân cellulose (enzyme cellulase tấn công vào cellulose kết tinh để giải phóng ra glucose). - Lên men (chuyển hóa đường xylose và đường glucose thành ethanol). Nguyên liệu Tiền xử lý Thủy phân Lên men Ethanol Hình 1.7. Sơ đồ quy trình sản xuất bioethanol 1.3.2.1 Tiền xử lý Tiền xử lý để chuyển hóa các carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose thành ethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa. Tuy nhiên, bản chất 16
  28. Đồ án tốt nghiệp của cellulose lại là rất bền vững trước sự tấn công của enzyme, nên bước tiền xử lý là bắt buộc để quá trình đường hóa glucose có thể diễn ra tốt. Cellulose ban đầu có thể bị phá hủy bởi acid mà không cần được tiền xử lý. Tuy nhiên, trong đồ án này chỉ đề cập đến việc thủy phân lignocellulose bằng enzyme. Bảng 1.4. Các phương pháp tiền xử lý hiện nay Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid loãng. Trong đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất vì nó rẻ và hiệu quả. Tuy nhiên, thiết bị phải chịu được ăn mòn cao và lượng thạch cao (Na2SO4) sinh ra nhiều từ quá trình trung Tiền xử hòa acid với NaOH. lý hóa • Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan. Tuy nhiên, học nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phí hóa chất, thì vôi tôi là hóa chất thích hợp. lý • Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi ử n x n hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa ề tan lignin; xử lý bằng khí SO2, khí CO2,NH3 Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ Tiền xử năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi. Trong đó phương Các phương Các pháp ti lý cơ pháp nổ hơi là phương pháp quan trọng nhất, đã được phát học triển, áp dụng trên quy mô pilot và được sử dụng trong đề tài nghiên cứu này. Nổ hơi nước được phát triển vào năm 1925 bởi W. H. Mason Tiền xử trong sản xuất gỗ ép [25]. Tiền xử lý biomass bằng nổ hơi lý nổ nước được giới thiệu từ năm 1980. Công ty Iotech Corporation hơi đã tiến hành một vài thí nghiệm tiên phong để tìm hiểu ảnh hưởng của nổ hơi nước lên gỗ cây dương [25]. 17
  29. Đồ án tốt nghiệp Mục đích của quá trình tiền xử lý lignocellulose là để làm tăng khả năng xâm nhập của enzyme vào cấu trúc nguyên liệu lignocellulose với chi phí xử lý phù hợp. Qua quá trình tiền xử lý làm giảm hàm lượng lignin, tăng diện tích bề mặt và mức độ cấu trúc vô định hình của nguyên liệu lignocellulose, làm tăng tốc độ thủy phân của enzyme vào cấu trúc cellulose và làm tăng hàm lượng đường [10]. 1.3.2.2 Thủy phân Quá trình thủy phân Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành các đường đơn. Ở đây, ta quan tâm nhiều đến sự thủy phân cellulose, do nó là thành phần chính trong sinh khối lignocellulose. Phương trình PT1 phản ứng tổng quát : (PT1) Quá trình thủy phân cellulose được thực hiện bởi axit thủy phân hoặc enzyme thủy phân. Thủy phân bằng acid: vào cuối thế kỉ XIX và đầu thế kỉ XX, quá trình thủy phân được thực hiện bởi phản ứng giữa cellulose với acid. Acid loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt độ cao và áp suất cao, còn acid đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển. Quá trình thủy phân bằng acid loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furan và các hợp chất vô cơ [11]. Thủy phân bằng enzyme: Các mắt xích của cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose riêng lẻ bằng enzyme cellulase. Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β- 18
  30. Đồ án tốt nghiệp glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose. Nguồn thu enzyme cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật (nấm, vi khuẩn). Nhiều loài nấm như Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, và T. Emersonii có thể sản sinh ra một số lượng lớn cellulase và hemicellulase ngoại bào. Vật liệu lignocellulose bị thủy phân bằng enzyme ở điều kiện ôn hòa (50°C và pH ~ 5), cho phép phân cắt cellulose và hemicellulose một cách hiệu quả mà không hình thành nên các sản phẩm phụ có thể ức chế hoạt động của enzyme [11]. Cellulase  Khái niệm Cellulase là hệ enzyme có thể sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hay vi sinh vật đơn bào và có khả năng thủy phân cellulose và hemicellulose.  Cơ chế xúc tác enzyme Cơ chế xúc tác enzyme thường trải qua 3 giai đoạn theo phương trình PT2: E + S ES P + E (PT2) Trong đó: E là enzyme, S là cơ chất, ES là phức hợp enzyme – cơ chất, P là sản phẩm. Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp. Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng. Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng dạng tự do. Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là tương tác tĩnh điện, liên kết hydro và liên kết Van der Waals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước. 19
  31. Đồ án tốt nghiệp  Phản ứng thủy phân cellulose Cellulose là có cấu trúc rất bền vững và khó bị phá vỡ vì cellulose có độ kết tinh cao, không tan trong nước, có khả năng chống lại các quá trình đề polymer hóa. Quá trình thủy phân cellulose tạo thành glucose được thực hiện nhờ sự tác dụng cùng một lúc của 3 enzyme khác nhau: “Endo-1,4,β-D-glucanases” (EG) hay 1,2-β-D-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4), enzyme này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả tan và không tan. “Exo-1,4-β-D-glucanases” (EG) hay 1,4-β-D-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4), enzyme này có tác dụng giải phóng D – glucose từ 1,4-β-D-glucancellobiohydrolase (EC 3.2.1.91, enzyme này có giải phóng cellobiose từ 1,4-β-glucan. “β-D-glucosidase” hay còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có tác dụng tạo thành D-glucose từ celobiose là cellodextrin, cũng như các oligomer của glucose. Quá trình thủy phân nguyên liệu lignocellulose trong tự nhiên rất chậm, bởi vì cấu trúc vững chắc của cellulose. Vì vậy cần qua quá trình tiền xử lý nguyên liệu bằng phương pháp vật lý, hóa học hay sinh học để nâng cao khả năng xâm nhập của enzyme vào cấu trúc cellulose, làm tăng tốc độ thủy phân và đạt được nồng độ đường glucose và xylose cao. Quá trình thủy phân bằng enzyme được chia thành 3 giai đoạn: Enzyme endo – cellulase tấn công ngẫu nhiên vào mạch cellulose nhờ tạo liên kết bằng tương tác giữa CBD với cellulose tạo thành oligosaccharide. Enzyme exo – cellulase tấn công vào cellulose và cả oligomer từ đầu đường khử và không khử thông qua tương tác của CBD với cellulose tạo thành cellobiose và glucose. β – glucoside tấn công cellobiose và oligosaccharide tạo glucose. 20
  32. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.3 Lên men Lý thuyết quá trình lên men đã được nhiều nhà sinh học nghiên cứu từ rất lâu. Năm 1769, Lavoisier phân tích sản phẩm lên men rượu và nhận thấy khi lên men, đường không chỉ tạo thành ethanol và CO2 mà còn tạo ra acid acetic. Năm 1810, Gay-Lussac nhận thấy rằng cứ 45 phần khối lượng đường sẽ chuyển thành 23 phần ethanol và 22 phần khí carbonic. Trên cơ sở đó ông đưa ra phương trình tổng quát như phương trình 3: (PT3) Năm 1857, Louis Pasteur tiếp tục nghiên cứu và thu nhận kết quả sau: cứ 100 phần đường saccharose khi lên men sẽ tạo ra 51,1 phần ethanol, 48,4 phần CO2, 32,0 phần glycerin, 0,7 phần acid succinic và hai phần các sản phẩm khác. Từ đó suy ra cứ 45 phần khối lượng glucose khi lên men sẽ tạo ra 21,8 phần ethanol chứ không phải 23 phần như Gay-Lussac đã tính. Tuy nhiên phương trình lên men do Gay-Lussac đưa ra vẫn đúng và dùng làm cơ sở lý thuyết để tính hiệu suất thu hồi rượu theo lý thuyết. Gay-Lussac còn kết luận sự lên men là quá trình sinh học có liên hệ mật thiết đến sự hoạt động của tế bào nấm men. Vào khoảng 1871-1872 Manaxemi đem nghiền tế bào nấm men với cát thạch anh rồi mới cho vào lên men dịch đường thì hiện tượng lên men vẫn xảy ra. Năm 1879, Buchuer tiến hành nghiền nát tế bào nấm men rồi chiết lấy dịch trong không chứa xác nấm men rồi cho vào dịch đường thì thấy dịch chiết vẫn có khả năng lên men. Từ đó người ta gọi các chất trong dịch tế bào nấm men là zymase. Đây chính là hợp chất của nhiều enzyme cùng tham gia chuyển hóa đường thành ethanol và khí carbonic [25]. 21
  33. Đồ án tốt nghiệp Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử. Quá trình oxy hóa này lại xảy ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme, cho nên người ta gọi quá trình lên men là quá trình oxy hóa sinh học. Quá trình đường phân thể hiện một cách chi tiết được minh họa như hình 1.8. Hình 1.8. Sơ đồ đường phân 22
  34. Đồ án tốt nghiệp Sự tạo thành bioethanol từ glucose phải trải qua nhiều giai đoạn, sơ đồ hình thành bioethanol từ glucose thể hiện ở hình 1.9. Hình 1.9. Sự tạo thành ethanol từ glucose • Giai đoạn 1 (giai đoạn đường phân): Phân tử đường glucose trải qua một loạt phản ứng phức tạp dưới xúc tác của một loạt hệ thống enzyme, phân tử glucose ban đầu được chuyển hóa thành 2 phân tử acid pyruvic (CH3 – CO – COOH). • Giai đoạn 2: Acid pyruvic bị decacboxyl để tạo thành acetaldehyde • Giai đoạn 3: Acetaldehyde bị khử bởi NAD.H2 tạo thành ethanol. Nấm men thường được dùng là S.cerevisiae là loại vi sinh vật phổ biến được sử dụng trong quá trình lên men truyền thống ở quy mô công nghiệp để sản xuất ethanol từ đường sucrose, bột và cellulose. Nấm men S.cerevisiae được công nhận là loại nấm men an toàn và có thể lên men hiệu quả các loại đường hexose, D – glucose, D – mannose, D – galactose và các disaccharide như: sucrose và mantose và nồng độ ethanol đạt 20 % (v/v) [6]. Hơn nữa, nấm men S.cerevisiae có khả năng chịu đựng tương đối tốt dưới sự tác động của chất ức chế có nguồn gốc từ sự phân hủy các hợp chất trong lignocellulose. Điểm bất lợi chính trong việc sử dụng nấm men S.cerevisiae là không có khả năng lên men đường pentose (D – xylose và L – arabinose). 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc Tình hình trên thế giới, công nghệ sản xuất ethanol sinh học đã được nghiên cứu và ứng dụng thành công ở nhiều Quốc gia, trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, nguyên 23
  35. Đồ án tốt nghiệp liệu phục vụ cho công nghệ sản xuất ethanol sinh học chủ yếu từ các cây lương thực, rơm rạ. Đối với Việt Nam vấn đề này vẫn còn rất mới mẻ và đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Năm 1995, Sun đã nghiên cứu điều kiện tối ưu để tiền xử lý rơm lúa mì là 1,5 % NaOH, trong 144 giờ ở 20oC, kết quả thu được lượng lignin tác ra đạt 60 % và lượng hemicellulose tách ra đạt 80 % [16]. Năm 2007, Aizawa của trường Đại học Tokai Nhật Bản đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học của Nhật Bản do Tokyo Fisheries Promotion Foundation đầu tư trên tạp chí Oceans 2007. Dự án sản xuất ethanol từ rong biển Sargassum horneri là một loại rong nâu, có hàm lượng carbohydratee 5,8 %, kết quả thu được 29,6 kg ethanol hoặc 38 lít ethanol trên 1 tấn rong tươi có độ ẩm 90 % [30]. Năm 2008, Zhao và các đồng nghiệp cho thấy tính hiệu quả khi dụng NaOH là chất tiền xử lý hiệu quả đối với các nguyên liệu có hàm lượng lignin nhỏ hơn 26 % như rơm, lúa mì và gỗ cứng [14]. Năm 2009, Rishi Gupta và các cộng sự đã nghiên cứu sử dụng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipites để chuyển hóa gỗ loài Prosopis juliflora thành bioethanol bằng phương pháp SHF với thủy phân bằng H2SO4 3 %, pH tối ưu giai đoạn lên men là 5,0 cho ra hàm lượng ethanol thu được đạt 7,13 g/L [33]. Năm 2009, Sorahi Abedinifar và các cộng sự nghiên cứu dùng Mucor indicus and Rhizopus oryzae để tạo ethanol từ các nguyên liệu rơm rạ bằng phương pháp SHF, với quá trình thủy phân ở 45 °C và pH 5,0. Tỷ lệ mẫu nguyên liệu với lượng nước bổ sung ảnh hưởng tương đối tới hiệu suất len men. Tuy nhiên, R. oryzae tạo ra axit lactic là sản phẩm phụ của quá trình này [34]. Năm 2009, Parveen Kumar đã nghiên cứu tiền xử lý gỗ cứng bằng NaOH giúp tăng khả năng thủy phân từ 14 % lên 55 % bằng việc loại bỏ hàm lượng lignin từ (24 – 55) % xuống còn 20 % [13]. Nói chung, ở nồng độ NaOH cao làm tăng khả năng loại 24
  36. Đồ án tốt nghiệp bỏ lignin, mặc dù ở nồng độ NaOH (6 – 20) % (w/w) làm hòa tan cellulose và giảm khả năng loại bỏ lignin [9]. Năm 2011, Lincai Peng đã nghiên cứu công nghệ chuyển đổi bùn giấy thành ethanol bằng quá trình thủy phân và lên men riêng biệt (SHF) sử dụng Saccharomyces cerevisiae. Thời gian tối ưu của quá trình thủy phân là 82,7 giờ, tỷ lệ chuyển đổi đường thành ethanol là 34,2 % và sản lượng ethanol tạo thành là 190 g/kg bùn giấy khô, tương ứng với năng suất chuyển đổi tổng thể 56,3 % Carbohydrate ban đầu [31]. Năm 2013, Mathiyazhakan Kuttiraja chuyển hóa nguồn tre phế phẩm thành ethanol. Pha loãng mẫu trước xử lý có hiệu quả với 63.1 % cellulose thu được. Hiệu suất xử lý 43 %, khả năng tạo ra 143 lít ethanol/tấn tre[29]. Năm 2014, Raveendran Sindhu và các cộng sự đã nghiên cứu tạo bioethanol từ tre nứa Ấn Độ bằng phương pháp SHF. Đây là báo cáo đầu tiên được công bố về tạo bioethanol từ tre nứa Ấn Độ. Năng suất đường tối đa là 0.651 g/sinh khối, ethanol được tạo ra với hiệu quả lên men là 41,72 % [32]. Các nghiên cứu trong nước hiện nay cũng đã và đang quan tâm sản xuất ethanol nhiên liệu sinh học thế hệ II từ sinh khối (phế thải). Theo hướng này, đã có một số công trình, nhưng trong quá trình thực hiện đang còn gặp những khó khăn rất lớn. Về nghiên cứu sử dụng nguồn phế thải nông nghiệp thành nhiên liệu sinh học theo 2 hướng: - Sử dụng nguồn phế thải để sản xuất ethanol sinh học - Sử dụng nguồn phế thải để sản xuất diesel - sinh học. Theo hướng sử dụng nguồn phế thải nông, lâm nghiệp để sản xuất ethanol sinh học đã có một số đề tài, công trình sau: Ethanol sinh học được sản xuất bằng phương pháp lên men và chưng cất từ các loại ngũ cốc chứa tinh bột (bắp) và đường (mía). Ngoài ra, ethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose, từ những phụ phẩm có chứa hợp chất cellulose cao. Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới. Chính vì vậy, sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là lignocellulose từ phế phẩm nông nghiệp là một giải pháp thích hợp trong bối cảnh giá nhiên liệu tăng cao, ô nhiễm môi trường ngày càng trầm 25
  37. Đồ án tốt nghiệp trọng và vấn đề an ninh lượng thực lại càng được chú ý và tiếp tục nghiên cứu hoàn thiên trên thế giới [21]. “Sản xuất ethanol sinh học từ phế thải nông nghiệp”, Chủ nhiệm đề tài PGS. TS Vũ Nguyên Thành, Viện Công nghiệp thực phẩm, Bộ Bông Thương, (2009-2011). “Nghiên cứu công nghệ hiện đại để sản xuất ethanol nhiên liệu từ gỗ phế liệu nguyên liệu giấy”, Thuộc Đề án thuộc Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 của Bộ Bông Thương. Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Doãn Thái Hòa, ĐHBK Hà Nội. (2009 - 2010). Năm 2009, Trần Diệu Lý với đề tài “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ. Đã kết luận dùng enzyme để thủy phân phế thải để tạo đường tan nhìn chung đạt hiệu quả thấp, chưa tìm được enzyme thích hợp cho hiệu suất cao. Năm 2009, Nguyễn Thị Hẳng Nga với đề tài “ Nghiên cứu khả năng sản xuất ethanol từ phụ phẩm nông nghiệp ” đã kết luận: hiệu suất chuyển hóa của quá trình đường khử từ 70 - 75 % đối với dịch lên men có hàm lượng đường khử từ 3,0 - 5,0 g/L. Hàm lượng ethanol không cao từ 1,9 - 4,2 % v/v nhưng cũng chứng tỏ là than cây ngô là nguyên liệu tiềm năng sản xuất bioethanol [22]. Năm 2013, Võ Thị Thúy Huệ đã nghiên cứu “ sản xuất ethanol sinh học từ vỏ cacao”, quá trình tiền xử lý với HCL 1M ở 100 oC trong 4 giờ thu hồi được 21,93 % lượng đường khử, quá trình lên men đạt hiệu quả cao từ 28-30 oC, thời gian lên men 72 giờ [18]. Năm 2013, Võ Thị Thanh Kiều đã nghiên cứu sản xuất bioethanol từ rong biển thu được 20,92 g/L cồn, hiệu suất chuyển hóa đạt 90 % [20]. 26
  38. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đồ án được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh trong thời gian từ 03/04/2017 đến 16/07/2017. 2.2. Nguyên vật liệu 2.2.1 Mùn cưa từ gỗ cây tràm bông vàng Nguyên liệu được sử dụng trong đồ án này là loại mùn cưa gỗ của cây tràm bông vàng được lấy từ nhà máy sản xuất dăm gỗ và viên gỗ nén tỉnh Bình Dương. Đây là loại mùn cưa thương mại được nhà sản xuất dùng máy nghiền từ hỗn hợp cành, nhánh, dăm vụn để trồng nấm và làm chất đốt với giá thành rẽ từ 200.000 đồng/tấn tươi (độ ẩm 40%). Hình 2.1. Mùn cưa gỗ tràm bông vàng 2.2.2. Acremonium cellulase Acremonium cellulase được cung cấp bởi Meiji Seika Co, (Japan) với các thông số bao gồm: - Nhiệt độ hoạt động tối ưu : (45 – 50)°C - PH hoạt động tối ưu : 4,8. 27
  39. Đồ án tốt nghiệp - Là enzyme chuyên dùng để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều cellulose thuộc nhóm cellulase. 2.2.3. Saccharomyces cerevisiae - Chủng nấm men Ethanol RedTM (Dry yeast, S.cerevisiae, Ementics, France). - Mật độ tế bào nấm men 109 cfu/ml. 2.2.4. Hóa chất sử dụng Các hóa chất sử dụng được liệt kê trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng Xuất xứ Tên hóa chất Mục đích sử dụng (nguồn gốc) Tiền xử lý NaOH Trung Quốc Trung hòa Phá mẫu H2SO4 Trung Quốc Tiền xử lý Làm blank UV-Vis Sản xuất từ máy Nước đề ion Pha động HPLC Themo – Stat. Sản xuất từ máy Pha mẫu Nước cất cất nước 2 lần Tạo môi trường HCl Trung Quốc Trung hòa Peptone Việt Nam Môi trường SDB Glucose Sigma Aldrich Dựng đường chuẩn Môi trường SDA Glucose Trung Quốc Môi trường SDB Xylose Sigma Aldrich Dựng đường chuẩn Dextrose Agar Việt Nam Môi trường SDA Ethanol Sigma Aldrich Dựng đường chuẩn 28
  40. Đồ án tốt nghiệp Thành phần môi trường hoạt hóa và nhân giống nấm men Sabouraud Dextrose Broth. (SDB): o D – Glucose: 20 g o Peptone: 10 g o Nước cất: 1000 mL. Thành phần Môi trường nuôi cấy nấm men Sabouraud Dextrose Agar (SDA): o D – Glucose: 40 g o Peptone: 10 g o Agar: 20 g o Nước cất: 1000 mL 2.3. Các thiết bị sử dụng Tất cả các thiết bị sử dụng được đặt tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. • Máy lắc ngang HY-4A, Trung Quốc. • Máy đo độ pH Schott Lab850 của hảng SI Analytics, Đức. • Bếp khấy từ gia nhiệt C-MAG HS 7 của hãng IKA, Đức. • Cân điện tử TE 612 của hãng Sartorius, Đức. • Cân phân tích PA 214 của hãng Ohaus, Mỹ. • Kính hiển vi điện tử MT4200H của hãng Meiji, Nhật Bản. • Hệ thống bơm hút chân không Gast, Mỹ. • Lò nung nhiệt độ cao của hãng Nabertherm, Đức. • Tủ sấy HN101-1A, Trung Quốc. • Tủ ủ của hãng Memmert, Đức. • Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2. • Nồi hấp tiệt trùng tự động của hãng ALP, Nhật Bản. • Máy ly tâm lạnh Z32HK của hãng Hermle, Đức. 29
  41. Đồ án tốt nghiệp  Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC -Liquid Chromatography High Performance) của hãng Shimadzu, Nhật Bản. Gồm các bộ phận: - Đầu dò RID – 10A - Bơm cao áp LC – 20AD - Bộ phận tách khí DGU – 20 A3 - Bộ phận lò cột CTO – 20A - Cột sử dụng phân tích là SUGAR SH101, H312039., kích thước cột: 8mmID×300mmL. - Bộ xử lý và máy in C – R8A Hình 2.2. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).  Thiết bị máy đo quang phổ UV-VIS-NIR V770 của hãng Jasco, Nhật Bản bao gồm các bộ phận: - Hệ thống quang học đơn sắc: Hệ Czerny – Turner, 2 chùm tia sáng. - Cách tử: Halographic, 27,5x35mm, 1.200 vạch/ mm, góc tia sáng 8,6° tại bước sóng 240 mm. - Dải bước sóng: 180 – 1100 nm. - Giới hạn độ phân giải: < = 1,5 nm. - Khe sáng: 1,5 nm. 30
  42. Đồ án tốt nghiệp - Đầu dò: 02 đầu dò Silicon Photodiode. - Cuvette thạch anh 10 mm, 2 cái. - Ngõ giao tiếp với máy tính. 2.4. Bố trí thí nghiệm Trên thực tế ngày nay đã có nghiên cứu lên men và thủy phân đồng thời một số loại nguyên liệu tương tự, tuy nhiên nghiên cứu này muốn sử dụng thủy phân và lên men không đồng thời (SHF) với một nguyên liệu mới đó là tràm bông vàng. 31
  43. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Sơ đồ quy trình Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32
  44. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Trình tự và Bố trí thí nghiệm 2.4.2.1 Thí nghiệm khảo một số đặc điểm của nấm men Tiến hành giữ giống trên môi trường SDA và nhân giống trên môi trường SDB. Đánh giá kết quả đường cong tăng trưởng dựa trên mật độ nấm men. Thí nghiệm với loại nấm men là S.cerevisiae đo giá trị OD610. Tiến hành nhân giống sau đó bổ sung vào môi trường SDB. Quan sát nấm men vi thể và đại thể. Xác định mật độ tế bào nấm men theo thời gian từ 0 h đến 48 h, gồm : 0 h; 2 h; 4 h; 6 h; 8h; 10 h; 12 h; 14 h; 16 h; 18 h; 20 h; 22 h; 24 h; 26 h; 28 h; 30 h; 32 h; 34 h; 36 h; 38 h; 40 h; 42 h; 44 h; 46 h; 48 h. 2.4.2.2 Thí nghiệm khảo sát kích thước nguyên liệu Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định kích thước hạt thích hợp STT cỡ hạt (mm) Lượng mẫu Thể tích Thời gian (g) NaOH (h) 1 1.5 5 50 24 2 1 5 50 24 3 0.425 5 50 24 4 0.325 5 50 24 5 0.16 5 50 24 Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu quả của quá trình tiền xử lý Thực hiện các thí nghiệm với tác nhân cho các cỡ hạt khác nhau ở cùng nhiệt độ phòng (30 oC) và trong cùng 1 khoảng thời gian như nhau là 24 giờ. Đánh giá kết quả thí nghiệm thông qua hàm lượng lignin tách ra khỏi mẫu nguyên liệu ban đầu 33
  45. Đồ án tốt nghiệp Nội dung các thí nghiệm được trình bày trong bảng 2.2. 2.4.2.3 Thí nghiệm tiền xử lý - Mùn cưa từ tràm bông vàng được lấy từ nhà máy ở Bình Dương rây bằng rây có kích thước 1,5 mm để loại những hạt to không đồng nhất làm nguyên liệu để thực hiện tiền xử lý. Thực hiện quá trình tiền xử lý bằng cả hai phương pháp là tiền xử lý bằng acid H2SO4 và tiền xử lý bằng NaOH ở các nồng độ khác nhau để lựa chọn tác nhân tiền xử lý thích hợp. Tối ưu hóa các thông số tiền xử lý cho mẫu gỗ tràm bông vàng: - Kích thước nguyên liệu - Nồng độ tác nhân tiền xử lý - Thời gian tiền xử lý - Tỉ lệ khối lượng giữa nguyên liệu và dung dịch tác nhân tiền xử lý  Thí nghiệm lựa chọn tác nhân tiền xử lý thích hợp Mục đích là để lựa chọn ra tác nhân tiền xử lý thích hợp cho loại mùn cưa gỗ cây tràm bông vàng. Thực hiện các thí nghiệm với cả 2 tác nhân tiền xử lý là acid H2SO4 và NaOH với các nồng độ khác nhau ở cùng nhiệt độ phòng (30 oC) và trong cùng 1 khoảng thời gian như nhau là 24 giờ Đánh giá kết quả thí nghiệm thông qua các thông số sau đây: o Hàm lượng lignin tách ra khỏi mẫu nguyên liệu ban đầu o Nồng độ đường glucose trong dung dịch sau khi tiền xử lý o Nồng độ đường xylose trong dung dịch sau khi tiền xử lý Nội dung các thí nghiệm được trình bày trong bảng 2.3. 34
  46. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm lựa chọn tác nhân tiền xử lý Thể tích Khối lượng Nồng độ dd sử dụng STT mẫu (g) H2SO4 1 5 1 50 2 5 2 50 3 5 3 50 Mẫu tiền xử lý 4 5 4 50 bằng 5 5 5 50 6 5 7 50 7 5 10 50 8 5 1 50 9 5 2 50 10 5 3 50 11 5 4 50 Mẫu tiền xử lý 12 5 5 50 bằng 13 5 10 50 14 5 15 50 15 5 20 50 16 5 25 50  Thí nghiệm khảo sát thời gian tiền xử lý Xác định khoảng thời gian thích hợp cho quá trình tiền xử lý. Thực hiện các thí nghiệm với tác nhân NaOH ở nồng độ xác định 4% với các thời gian khác nhau 35
  47. Đồ án tốt nghiệp Đánh giá kết quả thí nghiệm thông qua hàm lượng lignin tách ra khỏi mẫu nguyên liệu ban đầu. Nội dung các thí nghiệm được trình bày trong bảng 2.4. Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian tiền xử lý Lượng cân Thể tích Thời gian STT mẫu NaOH 4% (h) (g) (ml) 1 5 50 0 2 5 50 1 3 5 50 2 4 5 50 3 5 5 50 6 6 5 50 12 7 5 50 18 8 5 50 24 9 5 50 36 10 5 50 48 11 5 50 72  Thí nghiệm khảo sát tỉ lệ bã rắn / dung dịch Xác định tỉ lệ khối lượng bã rắn / dung dịch thích hợp. Thực hiện các thí nghiệm với tác nhân NaOH ở nồng độ xác định ở thí nghiệm lựa chọn tác nhân tiền xử lý và thời gian xác định là 24 giờ trong khi thay đỏi tỉ khối lượng lệ bã rắn / dung dịch. Đánh giá kết quả thí nghiệm thông qua hàm lượng lignin tách ra khỏi mẫu nguyên liệu ban đầu. Nội dung các thí nghiệm được trình bày trong bảng 2.5. 36
  48. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ bã/dung dịch lượng cân Thể tích Thời gian STT mẫu NaOH 4% (h) (g) (ml) 1 5 50 24 2 5 75 24 3 5 100 24 4 5 150 24 5 5 200 24 6 5 50 36 8 5 75 36 9 5 100 36 10 5 150 36 11 5 200 36 2.4.2.4 Thí nghiệm thủy phân  Thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH, thí nghiệm được tiến hành mẫu được lấy trong khoảng thời gian từ 0-72 h, cứ 6 giờ lấy 3 mẫu ra và đem đo bằng máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành theo thời gian. Các thông số của mẫu bao gồm: • Tỉ lệ bã / dịch lên men là 1 / 10 • nồng độ enzyme 5% • 50 oC • pH 5,0 • Tốc độ lắc 120 vòng / phút. 37
  49. Đồ án tốt nghiệp  Thí nghiệm khảo sát pH thủy phân Thí nghiệm được làm trên cơ sở kết quả của khảo xác thời gian, khảo sát pH ở các mốc 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần lấy mẫu sau 24 giờ thủy phân, tiến hành đo bằng máy HPLC. Các thông số của mẫu bao gồm: - Tỉ lệ bã / dịch lên men là 1/10 - Tỉ lệ enzyme bổ sung 5 % - Thời gian thủy phân 24 giờ - Tốc độ lắc 120 vòng/ phút  Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thủy phân Thí nghiệm khảo sát ở 4 mốc nhiệt độ là 45 oC, 50 oC, 55 oC, 60 oC, các ngiệm thức lặp lại 3 lần lấy mẫu sau thủy phân 24h, đo mẫu bằng HPLC. Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ enzyme 5%, pH 5,0. Tỉ lệ bã /dịch lên men là 1/10. Mẫu lên men được đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng / phút.  Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ enzyme bổ sung Tỉ lệ enzyme bổ sung so với thể tích khảo sát ở các tỷ lệ 1%; 3%; 5%; 7%; 9%. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần lấy mẫu sau 24 giờ thủy phân, tiến hành đo bằng máy HPLC. Các thông số của mẫu bao gồm: - PH tối ưu ở thí nghiệm khảo sát pH. - Tỉ lệ bã / dịch lên men là 1/10 - Thời gian thủy phân 24 giờ - Nhiệt độ tối ưu xác định ở thí nghiệm khảo sát nhiệt độ - Tốc độ lắc 120 vòng/ phút 2.4.2.5 Thí nghiệm lên men  Thí nghiệm khảo sát thời gian lên men Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH và thủy phân ở các điều kiện tối ưu , thí nghiệm được tiến hành mẫu được lấy trong khoảng thời gian từ 0-72 h, cứ 6 38
  50. Đồ án tốt nghiệp giờ lấy 3 mẫu ra và đo bằng máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành theo thời gian. Các thông số của mẫu bao gồm: • Tỉ lệ bã / dịch lên men là 1/ 10. • Tỷ lệ enzyme bổ sung 5%. • Nhiệt độ thủy phân 50 oC. • pH 5,0. - Tốc độ lắc 120 vòng /phút. - Tỷ lệ Saccharomyces cerevisiae 5%. - CSL 1%. - Nhiệt độ lên men là 35 oC.  Thí nghiệm khảo sát pH lên men Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH và thủy phân ở các điều kiện tối ưu, thí nghiệm được tiến hành mẫu ở pH: 4,5; 5,0; 5.5; 6,0. Mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại sau đó đo bằng máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành theo thời gian. Các thông số của mẫu bao gồm: - Tỉ lệ bã / dịch lên men là 1/10. - Tỉ lệ enzyme bổ sung 5%. - Tỉ lệ nấm men bổ sung 5% mỗi loại. - Tỉ lệ chất dinh dưỡng bổ sung CSL 1%. - Thời gian lên men 48 giờ. - Tốc độ lắc 120 vòng/ phút - Nhiệt độ lên men (32,5 oC).  Thí nghiệm khảo xác nhiệt độ lên men Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH và thủy phân ở các điều kiện tối ưu, thí nghiệm được tiến hành với: - Tỷ lệ enzyme 5% - Tỷ lệ Saccharomyces cerevisiae 5% 39
  51. Đồ án tốt nghiệp - CSL 1% - pH 5,0. Các giá trị nhiệt độ khảo sát gồm 30oC; 32,5oC; 35oC; 37,5oC và 40oC. Mẫu lên men được đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút và đo sau 48 giờ bằng máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành ở những điều kiện nhiệt độ được khảo sát.  Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ Saccharomyces cerevisiae bổ sung khi lên men Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH và thủy phân ở các điều kiện tối ưu, thí nghiệm được tiến hành với: - enzyme 5%. - CSL 1%. - Nhiệt độ là 35oC. - pH là 5,0. Tỉ lệ thể tích dịch nấm men/ thể tích dung dịch được khảo sát gồm 1%; 3%; 5%; 7%; 9%. Mẫu lên men được đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng /phút và đo sau 48 giờ bằng máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành ở những nồng độ nấm men được khảo sát.  Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của CSL( bột bắp) đối với quá trình lên men Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH và thủy phân ở các điều kiện tối ưu, thí nghiệm được tiến hành với: - Tỷ lệ enzyme 5 %. - Tỷ lệ Saccharomyces cerevisiae 5 %. - Nhiệt độ 350C. - pH 5,0. Các chất dinh dưỡng bổ sung cần khảo sát gồm CSL 1 %; CSL 5 %; CSL 10 %; peptone 1 %; peptone 3 %; peptone 5 %; hỗn hợp K2HPO4 (3 g/L) và MgSO4 (2,5 g/L). Mẫu lên men được đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng /phút và đo sau 48 giờ bằng 40
  52. Đồ án tốt nghiệp máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành ở những thành phần chất dinh dưỡng khác nhau. 2.5. Các phƣơng pháp phân tích 2.5.1. Phương pháp phân tích hàm lượng ẩm Phương pháp xác định độ ẩm trong mẫu nguyên liệu là biomass dựa trên qui trình của NREL - National Renewable Energy Laboratory, phòng thí nghiệm năng lượng quốc gia Hoa Kỳ [20]. Trình tự các bước thực hiện thí nghiệm như sau: - Đặt cốc sấy trong tủ sấy đối lưu ở trong ít nhất 4 giờ. Sau đó mang cốc bỏ vào bình hút ẩm và để nguội (sử dụng găng tay hoặc kẹp để di chuyển cốc). Cân chính xác khối lượng cốc đến 0,1 mg. - Cho một lượng mẫu xác định vào trong cốc, cân và ghi lại chính xác khối lượng mẫu đến 0,1 mg sau đó dùng bút đánh dấu mẫu. Lặp lại ít nhất 2 lần đối với từng mẫu. - Đặt cốc đã chứa mẫu vào trong tủ sấy đối lưu ở ít nhất 4 giờ. Sau khi sấy xong, chuyển cốc từ tủ sấy sang bình hút ẩm và để nguội đến nhiệt độ phòng. Cân và ghi lại cốc chứa mẫu chính xác đến 0,1 mg. - Đặt cốc vào trở lại tủ sấy đối lưu ở 105 ± 3ºC và sấy đến khi khối lượng không đổi. Khối lượng cốc và mẫu được xác định là không đổi khi sự thay đổi khối lượng cốc và mẫu ít hơn 0,1 % khối lượng mẫu khô ban đầu trong vòng 1 giờ. Tính toán % ẩm: 41
  53. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Phương pháp phân tích thành phần cellulose, lignocellulose, lignin và hàm lượng tro trong nguyên liệu biomass Phương pháp xác định các thành phần carbohydrate, lignin và tro trong mẫu nguyên liệu là biomass dựa trên qui trình của NREL - National Renewable Energy Laboratory, phòng thí nghiệm năng lượng quốc gia Hoa Kỳ[1]. Trình tự các bước thực hiện thí nghiệm như sau:  Chuẩn bị mẫu phân tích - Nung cốc crucible trong lò nung ở ít nhất 4 giờ, sau đó chuyển cốc trực tiếp từ lò nung sang bình hút ẩm và để nguội trong 1 khoảng thời gian xác định (khuyến nghị là 1 giờ). Cân chính xác cốc crucible đến 0,1 mg và ghi lại giá trị ( . - Đặt lại cốc crucible vào lò nung ở và nung cốc cho đến khi khối lượng không đổi. Giá trị khối lượng được xác định là không đổi khi biến thiên khối lượng đạt giá trị dưới 0,3 mg trong một giờ. - Cân mẫu phân tích cho vào trong ống nghiệm. Ghi lại chính xác giá trị cân mẫu đến 0,1 mg sau đó đánh dấu lại mẫu. Thêm vào (hoặc ) acid sunfuric 72 % vào mỗi ống nghiệm chứa mẫu, sử dụng cá từ để khuấy cho hỗn hợp đồng đều. - Đặt các ống nghiệm chứa mẫu phân tích vào bể ổn nhiệt ở trong 1 giờ. Khấy mẫu bằng cá từ sau mỗi 5 hoặc 10 phút. - Sau khi kết thúc sự thủy phân trong 60 phút, lấy các ống nghiệm ra khỏi bể ổn nhiệt. Pha loãng nồng độ acid trong ống nghiệm xuống 4 % bằng cách cho thêm nước đề ion bằng cách sử dụng burette. - Đặt ống nghiệm vào trong nồi hấp và hấp ở121oC trong 1h, sau khi hấp xong để nồi hấp nguội từ từ về nhiệt độ phòng trước khi lấy mẫu ra khỏi nồi. 42
  54. Đồ án tốt nghiệp  Phân tích mẫu xác định hàm lượng lignin không hòa tan trong acid - Lọc chân không dung dịch thủy phân thu được sau khi hấp bằng cốc đã được chuẩn bị trước đó. - Chuyển xấp xỉ 50 mL dịch cái vào một cái bình giữ mẫu, mẫu này được dùng để xác định thành phần lignin hòa tan trong acid cũng như là thành phần carbohydrate. Lưu ý rằng thành phần lignin hòa tan trong acid phải được thực hiện trong vòng 6 giờ sau khi thủy phân. Nếu phải lưu mẫu lại thì nên để trong tủ đông trong vòng 2 tuần, - Sử dụng nước đề ion để chuyển toàn bộ lượng rắn còn lại ở ống nghiệm vào trong cốc lọc. Rửa lại phần rắn trong cốc lọc với ít nhất nước đề ion. - Đem cốc có thành phần rắn không hòa tan trong acid đi sấy ở cho đến khi khối lượng không đổi, thường ít nhất là 4 giờ. - Chuyển cốc ngay vào bình hút ẩm khi đem ra khỏi lò sấy. Cân chính xác khối lượng cốc và thành phần rắn chứa trong đó đến 0,1 mg. - Đem cốc có chứa phần rắn đi nung trong lò nung ở trong khoảng giờ. Có thể cài đặt chương trình nung như sau: . Gia nhiệt từ nhiệt độ phòng lên 105 oC. . Giữ nhiệt độ 105 oC trong 12 phút. . Gia nhiệt lên 250 oC với tốc độ 10 oC/ phút. . Giữ nhiệt độ 250 oC trong 30 phút. . Gia nhiệt lên 575 oC với tốc độ 20 oC/ phút. . Giữ nhiệt độ 575 oC trong ít nhất 180 phút. . Để lò nguội xuống còn 105 oC. . Giữ nhiệt độ lò ở 105 °C cho đến khi lấy cốc ra ngoài. 43
  55. Đồ án tốt nghiệp - Cẩn thận chuyển cốc từ lò nung vào ngay bình hút ẩm và để nguội trong một khoảng thời gian nhất định bằng với thời gian để nguội trong khi chuẩn bị cốc. Cân và ghi lại chính xác khối lượng cốc đến 0,1 mg. Đặt cốc trở lại lò nung và nung tiếp đến khối lượng không đổi.  Phân tích mẫu xác định hàm lượng lignin tan trong acid - Chạy mẫu trắng là dung dịch 4 % H2SO4 trên máy đo quang phổ UV – Vis. - Lấy dịch thủy phân được sau khi lọc qua cốc crucible đem đi đo độ hấp thu tại bước sóng thích hợp. Mẫu được pha loãng nếu cần thiết để đưa giá trị đo được của độ hấp thu về khoảng 0,7 – 1,0; ghi lại giá trị đo được và hệ số pha loãng. Mẫu phải được phân tích trong khoảng thời gian không quá 6 giờ sau khi thủy phân và thực hiện ít nhất 2 lần đối với mỗi mẫu.  Phân tích mẫu xác định thành phần cellulose và lignocellulose - Lấy khoảng 20 ml dịch thủy phân được sau khi lọc qua cốc crucible chuyển vào erlen 50 ml. - Sử dụng calcium carbonate để trung hòa mẫu đến pH 5,0 – 6,0. Sử dụng bút đo độ pH để kiểm tra pH của mẫu và tránh để cho pH của mẫu vượt quá 6,0. Khi pH đạt 4,0 cho rất từ từ calcium carbonate. Khuấy mẫu liên tục. Khi pH đạt 5,0 – 6,0 thì ngừng trung hòa và để mẫu lắng, sau khi quá trình đạt cân bằng thì pH của mẫu sẽ đạt giá trị xấp xỉ 7. Gạn lấy phần dung dịch trên bề mặt - Lọc phần dung dịch qua màng lọc rồi cho vào trong lọ đựng mẫu để chuẩn bị cho phân tích HPLC Tính toán: - Khối lượng mẫu khô ODW (oven dry weight) 44
  56. Đồ án tốt nghiệp - Thành phần rắn không hòa tan trong acid AIR (acid insoluble residue) Trong đó: : khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy : khối lượng cốc đã chuẩn bị lúc đầu - Thành phần lignin không hòa tan trong acid AIL (acid insoluble lignin) Trong đó: : khối lượng cốc và mẫu sau khi nung - Thành phần lignin hòa tan trong acid ASL (acid soluble lignin) Trong đó: là giá trị độ hấp thu trung bình mẫu đo tại 240 nm : Thể tích dung dịch sau lọc, 86,73 mL : Hệ số pha loãng mẫu ( đo ở bước sóng ) - Hàm lượng lignin chứa trong mẫu - Hàm lượng cellulose và hemicellulose: Nồng độ glucose và xylose: được phân tích bởi máy HPLC. 45
  57. Đồ án tốt nghiệp 2.5.3. Phương pháp cấy và giữ giống nấm men  Phương pháp cấy nấm men gồm các bước: - Chuẩn bị que cấy vòng hơ trên lửa đèn cồn để vô khuẩn. - Tháo nút bông trên ống canh trường giống và tại ống môi trường, hơ nóng hai ống. - Dùng que cấy lấy một phần nấm men sau đó đưa que vào đáy ống môi trường. - Kéo đầu que cấy lên mặt thạch. - Rút que cấy ra và khử trùng trên đèn cồn, đậy nút bông lại.  Giữ giống nấm men • Chuẩn bị môi trường SDA có chứa Agar, tiệt trùng, rót 10 ml dung dịch vào ống nghiệm và để nghiêng đến khi agar đông lại. • Tiến hành cấy giống nấm men từ ống nghiệm gốc sang ống môi trường thạch nghiêng đã chuẩn bị sẵn từ trước. • Công việc này tiến hành trong tủ cấy vi sinh để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng đến men giống và quá trình lên men sau này. 2.5.4. Phương pháp nhân giống và hoạt hóa giống nấm men Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, đề tài tiến hành nhân giống qua các bước: Sau khi môi trường nấm men đã phát triển tốt trên môi trường thạch nghiêng, cấy ria vào đĩa petri chứa môi trường SDA, ủ ở nhiệt độ phòng. - Nhân giống cấp 1: lấy 1 khuẩn lạc rời cấy vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường SDB, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. - Nhân giống cấp 2: chuyển ống nghiệm sang chai chứa 90 ml môi trường SDB nuôi cấy lắc ở nhiệt độ thường trong 24 giờ. 46
  58. Đồ án tốt nghiệp 2.5.5. Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc: Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, qua đó xác định được số tế bào sống. Tiến hành: - Pha loãng mẫu: pha loãng mẫu theo các dãy số thấp phân thích hợp như: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. - Trải mẫu: dùng micropipette hút 20 µl dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ thích hợp vào môi trường đĩa thạch. Sử dụng que cấy gạt bằng thủy tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. - Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đem tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 250 để tính toán. Mật độ tổng của nấm men được tính theo công thức: Trong đó: A: mật độ tế bào (CFU/ml) Ai: Số khuẩn lạc/đĩa Di: Độ pha loãng V: thể tích dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa (ml) 2.5.6. Phương pháp xác định hai loại đường và ethanol bằng máy HPLC Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử trên cột sắc ký, khi dung môi đi qua các cấu tử này sẽ lần lượt được rửa ra khỏi cột theo thứ tự tại các mốc thời gian riêng đặc trưng tùy vào bản chất từng loại. Những cấu tử cùng thuộc một chất thì sẽ có thời gian lưu như nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn nên HPLC có độ phân tách cao. Thời gian lưu peak của glucose là vào khoảng 7,558 phút, trong khi đó của xylose và cồn lần lượt là 7,993 phút và 15,556 phút. 47
  59. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát chủng nấm men S.cerevisiae sử dụng trong đề tài 3.1.1. Đặc điểm hình thái của nấm men a) Khuẩn lạc S.cerevisiae (mt SDA) b) Tế bào S.cerevisiae quan sát hiển vi Hình 3.1. Đặc điểm đại thể (a) và vi thể (b) của S.cerevisiae S.cerevisiae sau khi được hoạt hóa, nhân giống và nuôi cấy trên môi trường SDA thu được khuẩn lạc có hình dạng tròn, lồi trơn có màu trắng đường kính từ 1 - 2 mm (hình 3.1a). So với các VSV khác (vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 7 µm (hình 3.1b). Những tế bào men hình tròn đến hơi ovan. Những tế bào chết bắt màu xanh khi làm tiêu bản nhuộm với chất xanh metylen[23]. 3.1.2. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae Khảo sát đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae dựa vào phương pháp xác định mật độ tế bào gián tiếp bằng đường tương quan OD – mật độ tế bào (phụ lục B). Đồ thị biểu diễn sự sinh trưởng của VSV phụ thuộc vào logarit số tế bào với thời gian được thể hiện trong hình 3.2. 48
  60. Đồ án tốt nghiệp 9.5 9.06 8.94 9 8.53 8.5 8 7.77 7.59 7.5 log (CFU/ml) log 7 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 thời gian khảo sát (giờ) Hình 3. 1. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae theo thời gian trên môi trường SDB Khi tiếp giống vào môi trường lỏng, nồng độ giống tế bào ban đầu là 3,9x108 CFU/ml. Sau 8 giờ mật độ tế bào là 5,9 x108 CFU/ml, số lượng tế bào tăng không đáng kể vì đây là pha tiềm phát VSV chưa sinh sản, còn làm quen với môi trường, nhưng sự trao đổi chất của chúng lại xảy ra mạnh mẽ. Mật độ tế bào tăng lên 8,7x109 CFU/ml ở thời điểm 18 giờ, đây là giai đoạn phát triển của nấm men, số lượng tế bào tăng theo cấp số nhân với tốc độ sinh trưởng là cực đại. Trong pha này, chất dinh dưỡng trong môi trường cạn dần, các sản phẩm sinh ra làm cho các điều kiện mất đi sự thuận lợi cho sự sinh trưởng và quá trình chuyển sang pha ổn định kéo dài đến thời điểm 38 giờ với mật độ là 1,1x1010 CFU/ml. Trong pha này tế bào sống là ổn định và mật độ quần thể là tối đa, số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi. Ở thời điểm 48 giờ, mật độ tế bào là 3,3x109 CFU/ml. Tế bào chuyển sang giai đoạn suy vong, các tế bào sống giảm dần và tế bào chết tăng dần do tế bào chất bị phân hủy bởi các enzyme nội bào. Tế bào sống trở nên già đi và nhỏ lại. Như vậy, nấm men sinh trưởng tốt nhất để lên men trong 18 giờ với mật độ 8,7x109 CFU/ml. 49
  61. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Phân tích mẫu nguyên liệu ban đầu Các phương pháp phân tích thành phần các chất trong gỗ được trình bày mục 2.5.2. Sau khi phân tích thu được các thành phần trong gỗ được thể hiện chi tiết ở bảng 3.1. Bảng 3.1. thành phần phần trăm các chất có trong mẫu mùn cưa gỗ ban đầu Protein và các thành Thành phần Cellulose Hemicellulose Lignin Ẩm phần khác Hàm lượng 45,28 11,08 32,46 5,09 6,19 (%) Thành phần cellulose trong mẫu mùn cưa gỗ ban đầu cao (45,28 %), hàm lượng lignin cũng ở mức cao (32,46 %). Trong thành phần lignin thì phần lignin không tan trong acid lại chiếm tỉ lệ lớn (24,02 %), điều này được lý giải là do sự đồng kết tủa, ngưng đọng của các chất chiết xuất, tannin, hay các sản phẩm biến tính từ đường (furfural) tạo ra. Ngoài ra do một phần cấu trúc polysaccharide bị bao bọc bởi tannin, chất chiết xuất, protein và sản phẩm đường biến tính dẫn đến khả năng xâm nhập của acid vào cấu trúc lignin bị khó khăn dẫn đến quá trình thủy phân không hiệu quả, dẫn đến đường thủy phân không hoàn toàn [7]. 3.3. Tiền xử lý 3.3.1. Khảo sát kích thước nguyên liệu Kích thước của nguyên liệu là một trong những yếu tố quan trọng nhất mà quá trình tiền xử lý nguyên liệu cần làm rõ. 50
  62. Đồ án tốt nghiệp 9.4 9.31 9.24 9.18 9.2 9.17 9 8.8 8.6 8.53 Hiệu Hiệu lignin suất tách ra (%) 8.4 8.2 8 0.16 0.375 0.425 1 1.5 Kích thƣớc nguyên liệu (mm) H nh 3.3. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất tách lignin. Với vùng kích thước của nguyên liệu ban đầu, tác nhân NaOH có ảnh hưởng rõ rệt lên hiệu quả tách lignin. Mẫu có kích thước lớn nhất là 1,5 mm có có khả năng tách được 8,6 % lignin. Mẫu có kích thước bé nhất là 0.16 mm có khả năng tách 9,7 % lignin ( hình 3.3). Kết quả này là hợp lý vì kích thước nguyên liệu càng nhỏ, thì diện tích bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với tác nhân tiền xử lý sẽ càng lớn, quá trình sẽ diễn ra càng dễ dàng hơn. Với kích thước <1 mm thì lượng lignin tách ra được là xấp xỉ nhau nên có thể chọn kích thước nguyên liệu <1 mm là tối ưu để tiến hành tiền xử lý. 3.3.2. Chọn tác chất tiền xử lý Thí nghiệm chọn tác chất tiền xử lý nguyên liệu mùn cưa gỗ với 2 tác chất là acid và kiềm với các nồng độ khác nhau. Kết quả được trình bày trong hình 3.4. 51
  63. Đồ án tốt nghiệp 12 9.79 9.78 10 9.38 8 6.00 6 H2SO4 4 NaOH 1.63 2 0.86 Hiệu Hiệu lignin suất tách ra (%) 0 1 2 3 4 5 10 15 20 25 Nồng độ tác chất tiền xử lý (%) Hình 3.4. Ảnh hưởng của các tác chất tiền xử lý đối với hiệu suất lignin tách ra. Đối với mẫu tiền xử lý bằng dung dịch acid H2SO4, nồng độ đường glucose và xylose trong các dịch tiền xử lý là rất thấp và gần như bằng 0. Khả năng tách lignin ra khỏi mẫu của acid là yếu. Hàm lượng lignin tách ra tăng đều nhưng không đáng kể. Ứng với 1 nồng độ acid khá cao là 10 % thì lượng lignin tách được khỏi mẫu chỉ là 1,63 %. Điều này chứng tỏ rằng đối với cấu trúc bền chắc như gỗ tràm bông vàng thì khả năng xâm nhập và phá vỡ lignocellulose của acid là rất kém, cellulose và hemicellulose hầu như không bị tác động gì. Đối với mẫu tiền xử lý bằng dung dịch kiềm NaOH, nồng độ đường glucose và xylose trong phần dịch là thấp. Tuy nhiên, với dung dịch kiềm, sau quá trình tiền xử lý sẽ lọc rửa và loại bỏ phần dịch, chỉ giữ lại phần bã cho thủy phân và lên men. Vì vậy, tác nhân NaOH không gây ảnh hưởng đến cellulose và hemicellulose trong mẫu nguyên liệu. Lượng lignin tách ra đáng kể với tác nhân tiền xử lý NaOH. Khi tăng nồng độ NaOH, hàm lượng lignin tách ra được khỏi mẫu cũng tăng theo, cụ thể khi tăng nồng độ NaOH từ 1 % đến 10 % thì hàm lượng lignin cao tăng từ 6,00 % đến 9,52 %. Hàm lượng lignin tách ra bắt đầu tăng rất chậm từ NaOH 4 % (9,38 %) 52
  64. Đồ án tốt nghiệp đến NaOH 25 % (9,78 %). Tuy nồng độ NaOH 20 % cho kết quả tốt nhất hàm lượng lignin tách ra đạt 9,79 % nhưng đó là nồng độ kiềm cao gây nên sự hình thành các hợp chất ức chế như furfural hay HMF [15]. Sự hình thành hợp chất muối sau quá trình trung hòa kiềm có thể gây ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol. Do đó, để chọn nồng độ thích hợp vừa đạt được hiệu quả tách lignin tốt vừa hạn chế sự hình thành các hợp chất ức chế nên chọn dung dịch kiềm nồng độ thấp và nồng độ NaOH 4 % là thích hợp nhất. So sánh hiệu quả giữa hai phương pháp tiền xử lý bằng acid và kiềm đối với nguyên liệu gỗ tràm bông vàng, phương pháp xử lý kiềm cho ưu điểm vượt trội hơn: hàm lượng lignin tách ra tương đối cao và không làm ảnh hưởng nhiều đến cellulose và hemicellulose thuận lợi cho quá trình thủy phân và lên men. Ngoài ra do tiền xử lý bằng kiềm có thể thực hiện ở nhiệt độ và áp suất thường nên hiệu quả tiền xử lý cao so với các phương pháp tiền xử lý khác [23]. Nồng độ NaOH 4 % được chọn cho quá trình tiền xử lý. 3.3.3. Thành phần mẫu sau tiền xử lý với NaOH Bảng 3.2. Thành phần phần trăm các chất có trong mẫu mùn cưa gỗ tràm bông vàng sau khi tiền xử lý với NaOH 4 %. Protein và các thành phần Thành phần Cellulose Hemicellulose Lignin khác Hàm lượng 62,73 12,82 18,87 6,48 (%) Hàm lượng cellulose trong mẫu đã qua tiền xử lý này ở mức cao (67,73 %), hàm lượng lignin đã giảm xuống còn 18,87 % .So sánh kết quả trên với mẫu tiền xử lý ban đầu có thể đưa ra những nhận xét sau: 53
  65. Đồ án tốt nghiệp Quá trình tiền xử lý bằng NaOH với điều kiện như trên làm tăng đáng kể hàm lượng cellulose từ 45,28 % lên 62,73 % và giảm đáng kể hàm lượng lignin từ 32.46 % xuống 18,87 %. Hàm lượng cellulose sẽ tăng và hàm lượng lignin sẽ giảm khi thực hiện quá trình tiền xử lý với các nồng độ cao và thời gian tiền xử lý dài. 3.3.4. Thời gian tiền xử lý và tỉ lệ khối lượng mẫu/ khối lượng dung dịch 10 9.24 8 9.17 6 (%) 4 2.96 2 Hiệu suất lignin Hiệu lignin tách suất ra 0 0 15 30 45 60 75 Thời gian (h) Hình 3.5. Sự thay đổi của hiệu suất tách lignin theo thời gian. 35 30 25 20 15 lignin lignin ra tách (%) 10 24h 5 36h Lƣợng 0 10 15 20 30 40 Tỉ lệ khối lượng NaOH/ khối lượng mẫu H nh 3.6. Sự phụ thuộc của lượng lignin tách ra vào tỉ lệ khối lượng mẫu/ khối lượng dung dịch 54
  66. Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát thời gian tiền xử lý và Tỉ lệ khối lượng dd NaOH/ khối lượng mẫu cho ta những nhận xét sau đây: Thời gian tiền xử lý là một thông số rất quan trọng, xác định thời gian tiền xử lý thích hợp để đảm bảo rằng quá trình tiền xử lý đã đạt đến cân bằng trong thời gian ngắn nhất, và tác nhân tiền xử lý đã tách được nhiều lignin nhất có thể. Theo kết quả khảo sát thời gian tiền xử lý thì trong khoảng thời gian ngắn là 6 h đầu tiên (hình 3.5), tác nhân NaOH đã tách được phần lớn lượng lignin có thể tách ra. Tuy nhiên để tách được phần còn lại mà nó có thể tách thì vẫn cần một khoảng thời gian dài hơn nữa. Ở thời điểm , lượng lignin tách ra ngoài đã đạt gần đến giá trị lớn nhất, quá trình bắt đầu chuyển sang cân bằng, có thể chọn giá trị này làm thời gian tiền xử lý thích hợp. Ngoài ra, tỉ lệ khối lượng NaOH/ khối lượng mẫu cũng có ý nghĩa quan trong. Tỉ lệ này phải được giới hạn sao cho ta không phải dùng quá nhiều dung dịch NaOH mà vẫn tạo ra được mẫu tiền xử lý với khả năng tách lignin chấp nhận được. Biểu đồ cho thấy nếu dùng càng nhiều NaOH thì lượng lignin tách ra được cũng tăng theo. Ở giá trị 1/20 lượng lignin tách ra được đã đạt giá trị khá cao, không cần phải tăng lên (hình 3.6). 3.4. Quá trình thủy phân 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH, thí nghiệm được tiến hành mẫu được lấy trong khoảng thời gian từ 0 - 72 giờ, cứ 6 giờ lấy 3 mẫu ra và đem đo bằng máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành theo thời gian. Kết quả hiển thị dưới hình 3.7. 55
  67. Đồ án tốt nghiệp 4 3.476 3.5 3 2.5 2 1.5 Glucose Hàm Hàm lƣợng(g/L) 1 Xylose 0.5 0 0 20 40 60 80 Thời gian (giờ) Hình 3.7. Nồng độ glucose và xylose được khảo sát theo thời gian Kết quả cho thấy từ 0 giờ đến 24 giờ lượng glucose tăng nhanh từ 1,42 g/L lên 3,15 g/L. Lượng xylose cũng tăng mạnh từ 1,65 g/L lên 3,47 %. Từ 48 giờ đến 72 giờ lượng glucose giảm dần đều từ điểm cực đại đo được là 3,15g/L xuống còn 2,23 g/L. Hàm lượng đường xylose dao động giảm xuống 2,75 g/L tại 36 giờ và tăng đến 2,92 g/L tại 72 giờ. Dựa vào đồ thị theo thời gian tác động enzyme chuyển hóa thành glucose tại 24 giờ là tốt nhất do lúc này enzyme hoạt động tốt đã thích nghi, còn về xylose bản chất enzyme bổ sung vào không có khả năng cắt hay phân giải tạo ra xylose, do đó lượng xylose dao động theo thời gian là do các chất trong dịch tạo phức với nhau. Kết quả này cho thấy được mốc thời gian cần thiết thích hợp cho các thí nghiệm sau là 24 giờ [11]. 3.4.2. Khảo sát tác động của tỷ lệ enzyme bổ sung đến quá trình thủy phân Tỉ lệ enzyme bổ sung so với thể tích khảo sát ở các tỷ lệ 1 %; 3 %; 5 %; 7 %; 9 % ,mỗi nghiệm thức lấy mẫu sau 24 giờ thủy phân, tiến hành đo bằng máy HPLC. Từ hình 3.8 thể hiện các kết quả của quá trình khảo sát. 56
  68. Đồ án tốt nghiệp 6 5 4 3 Glucose 2 Xylose Hàm Hàm lƣợngg/L) 1 0 1 3 5 7 9 Tỷ lệ enzyme (%) Hình 3.8. Hàm lượng glucose và xylose thay đổi khi khảo sát các tỷ lệ enzyme khác nhau từ 1% đến 9% Enzyme ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân. Khi tăng lượng enzyme bổ sung vào thì hàm lượng glucose, xylose tăng. Đối với glucose tăng từ 1,79 g/L lên 2,96 g/L tại mốc có tỷ lệ ezyme là 5 %. Tuy nhiên khi lượng enzyme cao (7 % và 9 %) thì lượng glucose tăng chậm từ 3,14 g/L lên 3,18 g/L. Có thể giải thích rằng lượng cellulose có thể bị thủy phân gần hết nên việc dùng lượng enzyme nhiều hơn sẽ không cho hiệu quả đáng kể. Vì vậy, enzyme 5 % là tối ưu nhất và được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo. Dựa vào các số liệu đo được thì tỷ lệ enzyme là 5 % thích hợp nhất để tiến hành thủy phân vì sự chuyển hóa thành đường cao, nếu tăng tỷ lệ enzyme lên 7 % hay 9 % thì lượng đường tương đối không thay đổi nhiều kết hợp với các yếu tố kinh tế mà ở đây là giá thành enzyme cao nên không cần thiết phải dùng tỉ lệ enzyme 7 % hay 9 %. 57
  69. Đồ án tốt nghiệp 3.4.3. Khảo sát pH ảnh hưởng đến quá trình thủy phân Hàm lượng glucose và xylose có sự tương quan với nhau khi khảo sát pH quá trình thủy phân được thể hiện ở hình 3.9. 7 6 Glucose 5 Xylose 4 3 2 Hàm Hàm lƣợng(g/L) 1 0 4 4.5 5 5.5 6 pH Hình 3.9. Hàm lượng đường thay đổi khi khảo sát các giá trị của pH Hàm lượng glucose và xylose thấp nhất ở pH 6 (0,21 g/L và 2,13 g/L). Hàm lượng glucose cao nhất ở pH 5 là 3,40 g/L, lượng xylose cao nhất ở pH 5,5 là 5,97 g/L. Tại thí nghiệm này, lượng xylose không phải là yếu tố cần tối ưu. Đối với S.cerevisiae, khoảng pH 4,5-5 cũng là các giá trị pH cho phép hoạt động tốt. Chính vì vậy, dựa trên hình 3.9 có thể thấy tại pH 5 là thích hợp nhất, enzyme hoạt động có hiệu quả hơn và sinh ra nhiều glucose. Khoảng pH hoạt động của enzyme rất có ý nghĩa với sản xuất công nghiệp vì trong quy mô công nghiệp, việc giữ pH ở một giá trị không đổi là rất khó khăn. Vì vậy việc đưa ra một khoảng pH hoạt động tốt sẽ giúp quá trình lên men sau này đạt hiệu quả quá trình cao. 58
  70. Đồ án tốt nghiệp 3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân Sự biến đổi hàm lượng glucose và xylose khi khảo sát nhiệt độ quá trình thủy phân được thể hiện tại hình 3.10. 7 6 5 4 3 2 Hàm Hàm (g/L) lƣợng Glucose 1 Xylose 0 45 50 55 60 Nhiệt độ (oC) Hình 3.10. Hàm lượng glucose, xylose theo nhiệt độ thủy phân. Nhiệt độ tối ưu cho enzyme sẽ chuyển hóa thành glucose cao nhất. Ở nhiệt độ 45oC nồng độ glucose đạt 0,88 g/L và ở nhiệt độ 50oC là 3,00 g/L. Hàm lượng glucose cao tại 50oC vì thích hợp cho Acermomium cellulase hoạt động. Càng về gần khoảng nhiệt độ đó, enzyme hoạt động càng mạnh và hiệu quả thủy phân glucose càng cao.Từ 50oC đến 60oC hàm lượng glucose giảm nhanh từ 3,00 g/L xuống dao động từ 1,23 g/L. Hàm lượng xylose cao nhất tại 50oC là 6,03 g/L và thấp nhất là ở 45oC là 4,27 g/L. Nhìn chung xylose dao động liên tục nhưng luôn giữ ở mức trung bình. Dựa vào kết quả có được 50oC là nhiệt độ tối ưu nhất cho quá trình thủy phân. 59
  71. Đồ án tốt nghiệp 3.5. Khảo sát lên men 3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men Kết quả quá trình khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men được trình bày ở hình 3.11. 4.5 4 3.5 3 2.5 2 Glucose 1.5 Xylose 1 Hàm Hàm lƣợng(g/L) 0.5 Ethanol 0 0 20 40 60 80 -0.5 Thời gian (giờ) Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men. Tại thời điểm 0 h, hàm lượng glucose đạt 2,22 g/L và tăng dần đến 12 h đạt 3,02 g/L. Ở các thời gian tiếp theo, lượng glucose có sự biến thiên: giảm trong giai đoạn 12 h đến 18 h (từ 3,02 g/L xuống 2,87 g/L), rồi tăng lên đến 30 h (3,82 g/L) và tiếp tục giảm xuống tại 72 h (2,58 g/L). Tại mốc ban đầu không có ethanol chỉ bao gồm glucose và xylose do enzyme và nấm men vừa được cho vào. Trải qua các mốc thời gian đến 36 h, lượng ethanol liên tục được tạo ra và đạt giá trị cao nhất tại 48 h (1,53 g/L). Sau đó, hàm lượng ethanol có xu hướng giảm nhẹ đến 72 h (1,26 g/L). 60
  72. Đồ án tốt nghiệp Lượng xylose cao nhất ở 0h đạt 3,91 g/L. Tuy nhiên thời gian càng về sau, xylose giảm mạnh đến 40 h trở đi, hàm lượng xylose thấp đạt ngưỡng 0%. Trong giai đoạn 0 h đến 30 h, hàm lượng glucose tăng dần và đạt giá trị cực đại trong khi ethanol không ghi nhận được do quá thấp. Nồng độ glucose được quyết định bởi tốc độ phản ứng thủy phân bằng cellulase và tốc độ lên men của nấm men. Lý do ethanol giai đoạn này không có vì hoạt động của nấm men trong giai đoạn này còn yếu do sự chuyển đổi môi trường nên glucose chưa bị tiêu thụ mạnh. Do hàm lượng xylose tạo ra vẫn cao đều trong khoảng thời gian này. Từ 30 h đến 72 h, sinh khối và khả năng thích nghi của nấm men tăng lên, lượng ethanol tiếp tục được tạo ra đạt giá trị cực đại tại 48 h. Hàm lượng glucose giảm chứng minh S.cerevisiae đã tiêu thụ và sinh ra ethanol, lượng xylose giảm trong đề tài này vẫn là một vấn đề mới mà tham khảo nhiều nguồn tài liệu vẫn chưa tiềm được lời giải thích cụ thể. Sau 40 h, xylose gần như không còn. Hàm lượng glucose còn khá nhiều nhưng ethanol không được tạo ra thêm và bắt đầu giảm nhẹ, có thể giải thích rằng có thể trong thành phần của gỗ có chất ức chế quá trình lên men. Mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men vẫn duy trì ở mật độ cao (4,54 x 1010) lượng glucose vẫn còn tuy nhiên ethanol lại không thể tiếp tạo ra. Từ kết quả đã đạt được thông qua các đánh giá thì thời gian tối ưu nhất để tiến hành thực hiện quá trình lên men là 48 h. 3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đối với hiệu quả của quá trình lên men Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH và thủy phân ở các điều kiện tối ưu, thí nghiệm được tiến hành mẫu ở pH:4.5; 5 5.5; 6 tại 48h cho kết quả hình 3.12. 61
  73. Đồ án tốt nghiệp 3 2.5 ) 2 1.5 Glucose Xylose 1 Ethanol Hàm Hàm lƣợng(g/L 0.5 0 4.5 5 5.5 6 pH Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đối với quá trình lên men. Lượng glucose và ethanol thấp nhất ở pH 6 tương ứng với 2,21 g/L và 0,75 g/L. Lượng glucose cao nhất ở pH 4.5 là 2,71 g/L và ethanol cao nhất ở pH 5 là 1,44 g/L. Hàm lượng xylose cao nhất ở pH 5.5 (1,07 g/L) và thấp nhất ở pH 5 (0.25 g/L). Đối với S.cerevisiae, khoảng pH 4.5-5,0 cũng là các giá trị pH trong khoảng hoạt động tốt. Chính vì vậy, dựa trên hình 3.12 có thể thấy tại pH 4.5-5, nấm men hoạt động có hiệu quả hơn và sinh ra nhiều glucose từ đó sinh nhiều ethanol hơn. Dựa theo kết quả thí nghiệm trên, giá trị pH 5,0 được chọn là giá trị pH thích hợp nhất cho quá trình thí nghiệm này. 62
  74. Đồ án tốt nghiệp 3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men 4 3.5 3 2.5 2 Glucose 1.5 Xylose Hàm Hàm lƣợng(g/L) 1 Ethanol 0.5 0 30 32.5 35 37.5 40 Nhiệt độ (oC) Hình 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ với quá trình lên men Ở nhiệt độ (30oC) hàm lượng glucose đạt 2,38 g/L và ở nhiệt độ 37,5oC là 3,65g/L. Hàm lượng glucose tăng khi nhiệt độ cao vì nhiệt độ thích hợp cho Acermomium cellulase hoạt động là 45-50oC, càng về gần khoảng nhiệt độ đó enzyme hoạt động càng mạnh và hiệu quả thủy phân glucose càng cao. Đối với hàm lượng ethanol, tại 40oC nồng độ ethanol chỉ đạt 0.52 g/L do ở nhiệt độ quá cao, nấm men bị ức chế sinh trưởng hoặc có thể chết. Ở nhiệt độ 35oC, nồng độ ethanol sinh ra cao nhất 1.31 g/L. Nồng độ xylose biến thiên bất thường tăng cao nhất ở 32,5oC 0,54 g/L và giảm ở 35oC còn 0,12 g/L. Tại thí nghiệm này, nhiệt độ 35oC được chọn vì thích hợp để nấm men hoạt động và lên men tạo ethanol. 3.5.4. Khảo sát tỷ lệ nấm men bổ sung trong quá trình lên men Lượng nấm men bổ sung ảnh hưởng tương đối với quá trình lên men nên được tiến hành khảo sát với các kết quả được ghi nhận ở hình 3.14. 63
  75. Đồ án tốt nghiệp 4 3.5 3 2.5 2 Glucose 1.5 Xylose 1 Ethanol Hàm Hàm lƣợng(g/L) 0.5 0 1 3 5 7 9 Tỷ lệ nấm men bổ sung (%) Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ bổ sung nấm men đến quá trình SHF Nhìn chung, khi mật độ nấm men cho vào tăng, lượng ethanol tạo thành tăng vì với mật độ nấm men lớn, nấm men sẽ sử dụng đường tạo thành trong quá trình thủy phân để tăng sinh khối nên hiệu suất chuyển hóa cồn tăng [25]. Thí nghiệm cho thấy, tỉ lệ nấm men bổ sung không đóng vai trò lớn trong quá trình SHF và tỉ lệ nấm men bổ sung là 5% sẽ cho hiệu suất chuyển hóa ethanol cao nhất với hàm lượng glucose đạt 3,43 g/L và lượng ethanol 1,67 g/L. Hàm lượng glucose, xylose và ethanol thấp nhất tại tỷ lệ bổ sung nấm men là 1% ứng với các giá trị lần lượt là 1,32 g/L, 0,21 g/L và 1,21 g/L. Vì vậy, tỉ lệ nấm men bổ sung là 5 % được chọn cho những nghiên cứu tiếp theo. 3.5.5. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần chất dinh dưỡng bổ sung Hàm lượng glucose tạo ra cao nhất ở CSL 3 % (3,86 g/L) và thấp nhất ở Peptone1% (2,53 g/L). Hàm lượng xylose cao nhất ở Mg+K (1,01 g/L) và thấp nhất ở Peptone 5 % (0,82 g/L). Hàm lượng ethanol cao nhất ở CSL 1 % (1,89 g/L) và thấp nhất ở Peptone1 % (0,41 g/L) (hình 3.15). 64
  76. Đồ án tốt nghiệp 4.5 4 3.5 3 2.5 Glucose 2 Xylose 1.5 Ethanol Hàm Hàm lƣợng(g/L) 1 0.5 0 Pep1% Pep3% Pep5% CSL1% CSL3% CSL5% Mg+K Chất dinh dƣỡng bổ sung Hình 3.15. Hàm lượng glucose, xylose và ethanol theo chất dinh dưỡng bổ sung Các chất dinh dưỡng bổ sung ảnh hưởng nhiều đến quá trình lên men, Các chất dinh dưỡng bổ sung khi lên men để kích thích nấm men phát triển trong giai đoạn đầu của quá trình lên men do nấm men lúc này vừa thay đổi môi trường chưa thích ứng. Với thí nghiệm này, chất dinh dưỡng bổ sung CSL 1 % cho kết quả thích hợp nhất về hiệu suất chuyển hóa glucose thành ethanol. 65
  77. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Thông qua đồ án có một số kết luận như sau: - Xác định được thành phần nguyên liệu tràm bông vàng ban đầu gồm: 45,28 % cellulose, 11,08 % hemicellulose, 32,46 % lignin, 5,09 % ẩm và 6,19 % protein và các thành phần khác. - Xác định được thành phần nguyên liệu sau tiền xử lý gồm: 62,73 % cellulose, 12,82 % hemicellulose, 18,87 % lignin, 6,48 % protein và các thành phần khác. - Khảo sát được đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae, thời điểm thích hợp để lên men là sau 18 giờ nhân giống với mật độ tế bào đạt 8,71 108 CFU/mL. - Quá trình tiền xử lý với các thông số tốt nhất gồm: tác nhân NaOH 4 %, thời gian 24 h, tỉ lệ nguyên liệu / dung dịch là 1/20. Từ đó đạt được hàm lượng lignin hòa tan khỏi nguyên liệu là 13,54 %. - Quá trình thủy phân với các thông số tối ưu bao gồm: o Thời gian thủy phân 24 giờ. o Tỷ lệ enzyme bổ sung là 5 %. o pH của thủy phân là 5,0. o Nhiệt độ thủy phân 50oC - Quá trình lên men với các giá trị tốt nhất gồm: o Thời gian lên men là 48 giờ. o pH lên men là 5,0. o Nhiệt độ lên men 35oC. o Tỷ lệ enzyme bổ sung 5 %. o Bổ sung CSL 1 %. o Lượng ethanol thu được 1,53 g/L. Kết quả cho thấy có thể chuyển hóa nguồn mùn cưa tràm bông vàng thành bioethanol. Tuy đã có những kết quả sơ khởi nghiên cứu ethanol từ gỗ tràm bông vàng 66
  78. Đồ án tốt nghiệp nhưng kết quả chưa được khả quan và còn rất nhiều hạn chế như sự tạo ethanol thấp và chưa giải quyết được vấn đề lượng xylose sinh ra trong quá trình SHF. 4.2. Đề nghị Vì quỹ thời gian không cho phép đồ án khảo sát quy mô phòng thí nghiệm chưa thể thực hiện ở quy mô công nghiệp. Để quá trình sản xuất bioethanol từ mùn cưa gỗ tràm bông vàng và các nguồn nguyên liệu lignocellulose có hiệu quả hơn, một số đề nghị được đưa ra như sau: Quá trình tiền xử lý có thể có thử các phương pháp khác như nổ hơi, kết hợp H2SO4 và NaOH . để tìm phương pháp nào là tốt nhất đối với mùn cưa gỗ tràm bông vàng. Nghiên cứu để nâng cao hiệu quả của của quá trình tiền xử lý là điều cần thiết. Quá trình thủy phân và lên men riêng lẽ (SHF) với hiệu suất không cao, lượng glucose và ethanol sinh ra thấp, cần nghiên cứu thêm về nguyên nhân của vấn đề và có hướng khắc phục. Tiến hành các phương pháp khác tiên tiến hơn để khảo sát lại điển hình như phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF). Sử dụng thêm chủng nấm men có khả năng tận dụng cả nguồn đường 5 carbon để so sánh với cải thiện kết quả lên men. Mặc dù nghiên cứu này còn nhiều hạn chế, tuy nhiên, từ những kết quả có được đã phần nào chứng minh tính khả thi của việc lên men ethanol từ nguồn nguyên liệu lignocellulose là mùn cưa gỗ tràm bông vàng. Đây là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo với mục tiêu tận dụng nguồn nguyên liệu mùn cưa đang rất dư thừa và bỏ phí một cách đáng tiếc chuyển hóa thành bioethanol. 67
  79. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Anh: 1. A. Sluiter, B.H., D. Hyman, C. Payne, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton, and J. Wolfe, Determination of Total Solids in Biomass and Total Dissolved Solids in Liquid Process Samples. Laboratory Analytical Procedure (LAP), 2008. 2. Cadavid E. O., Lopez C. C. Tofalo R., and Paparella A. and Suzzi G., “Detecion and identification of wild yeasts in Champus, a fermented Colombian maize beverage", in Food Microbilogy. 2008. p. 771 – 777. 3. Charles E.Wyman, Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Taylor&Francis, 1996. p 119-285 4. Cheng, Hongbin and Wang, Lei (2013), "Lignocelluloses Feedstock Biorefinery as Petrorefinery Substitutes", Biomass Now-Sustainable Growth and Use, InTech. 5. E.Wyman, C., Handbook on Bioethanol: Product and Utilization. 1996. 6. F.M. Gírio , C.F., F. Carvalheiro, L.C. Duarte, S. Marques, R. Bogel-Łukasik, Hemicelluloses for fuel ethanol: A review. Bioresource Technology, 2010. 101: p. 4775–4800. 7. Fernandes, M.C., et al., Enzymatic saccharification and bioethanol production from Cynara cardunculus pretreated by steam explosion. Bioresource Technology, 2015. 186: p. 309-315. 8. Hetti Palonen, Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose, VTT Biotechnology, 2004, p 11-39. 9. Kambiz Mirahmadi, M.M.K., Azam Jeihanoiour, Alkaline pretreatment of spruce and birch to improve bioethanol and biogas production. Bioresources Technology, 2010. 10. Kim, T.H., Kim, J.S., Sunwoo, C., Lee, Y.Y. (2003), "Pretreatment of corn stover by aqueous ammonia", Bioresour. Technol, pp. 39–47. 68
  80. Đồ án tốt nghiệp 11. Kumar, P., Barrett, D.M., Delwiche, M.J., Stroeve, P., 2009, Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Industrial and Engineering Chemistry Research, 2009. 48: p. 3713– 3729. 12. Mosier N, Wyman C, Dale B, Elander R, Lee YY, Holtzapple M, Ladisch M (2005), "Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass", Bioresoure Technology. 96, pp. 673–686. 13. Parveen Kumaz, D.M.B., Michael J. Delwiche§ and Pieter Stroeve, Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production. Industrial and Engineering Chemistry Research, 2009. 48 (8): p. 3713– 3729. 14. R. Sun, J.M.L., and W. B. Banks, Influence of alkaline pre-treatments on the cell wall components of wheat straw. Industrial Crops and Products, 1995. 4(2): p. 127–145. 15. Siti Sabrina Mohd Sukri, Roshanida A. Rahman, Rosli Md Illias, Harisun Yaakob. (2013), "Optimization of Alkaline Pretreatment Conditions of Oil Palm Fronds in Improving the Lignocelluloses Contents for Reducing Sugar Production ", Romanian Biotechnological Letters. 19, No 1. 16. Yulin Zhao, Y.W., J.Y. Zhu, Art Ragauskas, Yulin Deng, Enhanced Enzymatic Hydrolysis of Spruce by Alkaline Pretreatment at Low Temperature. Biotechnology and Bioengineering, 2008. 99(6): p. 1320–1328. Tài liệu tiếng Việt: 17. Ngô Quốc Anh, 2015. “Nghiên cứu chuyển hóa rong biển, phế thải nông nghiệp chứa carbohydrate thành ethanol sử dụng xúc tác sinh học” 18. Võ Thị Thúy Huệ, 2013. Nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ võ cacao, Nghiên cứu khoa học, đại học Nông Lâm Tp.HCM. 69
  81. Đồ án tốt nghiệp 19. Trần Lê Huy and Ngô Xuân Phúc (2013), Ngành công nghiệp dăm gỗ Việt Nam: thực trạng và xu hướng phát triển trong tương lai 20. Trần Diệu Lý,2009. “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ”. Luận văn tốt nghiệp đại học, ĐH Bách Khoa Tp.HCM. 21. Hoàng Minh Nam (2009): Nghiên cứu công nghệ và thiết bị liên tục xử lý rơm rạ bằng hơi nước để lên men etanol. ĐH Bách Khoa- Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 22. Nguyễn Thị Hằng Nga, Nghiên cứu khả năng sản xuất bioethanol sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp, Luận văn thạc sĩ, ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM, Việt Nam, 2009. 23. Lương Đức Phẩm, Nấm men công nghiệp. 2009, Hà Nội. 106. 24. Võ Thị Kiều Thanh, 2013, Nghiên cứu sản xuất bioethanol từ rong biển, Nghiên cứu khoa học, Viện sinh học nhiệt đới, Tp.HCM. 25. Cao Đình Khánh Thảo, “Nghiên cứu thử nghiệm khả năng xử lý rơm rạ đểlên men ethanol”, Luận văn Đại học, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Khoa Công Nghệ Hóa Học, 01/2007 26. Trần Đình Toại, Châu Văn Minh (2004), Tiềm năng rong biển Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Tài liệu internet: 27. Tô Xuân Phúc, Xuất khẩu dăm gỗ của Việt Nam 2012-2014, 5/2017, final 28. Tin Tức Phát Triển Công Nghệ, 7/2017, lieu-sinh-hoc-tai-viet-nam-truoc-day/ 29. Mathiyazhakan Kuttiraja, Bioethanol production from bamboo (Dendrocalamus sp.) process waste, 07/2017, 70
  82. Đồ án tốt nghiệp 30. Masahito Aizawa, Seaweed Bioethanol Production in Japan – The Ocean Sunrise Project, 07/2017, 31. Lincai Peng, Conversion of paper sludge to ethanol by separate hydrolysis and fermentation (SHF) using Saccharomyces cerevisiae, 07/2017, 32. Raveendran Sindhu, Bioethanol production from dilute acid pretreated Indian bamboo variety (Dendrocalamus sp.) by separate hydrolysis and fermentation, 07/2017, 33. Rishi Gupta, Separate hydrolysis and fermentation (SHF) of Prosopis juliflora, a woody substrate, for the production of cellulosic ethanol by Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis-NCIM 3498, 07/2017, 34. Sorahi Abedinifar, Ethanol production by Mucor indicus and Rhizopus oryzae from rice straw by separate hydrolysis and fermentation, 07/2017, 71
  83. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục A o Chuẩn Glucose Nồng độ glucose pha theo các nồng độ cho trước đo bằng máy HPLC được trình bài trong hình 1. ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSE 8000000 7000000 6000000 5000000 S 4000000 3000000 2000000 y = 3E+06x + 175634 1000000 R² = 0.9972 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 C Hình 1. Phương trình đường chuẩn của glucose. o Chuẩn xylose Nồng độ xylose pha theo các nồng độ cho trước đo bằng máy HPLC được trình bài trong hình 2. ĐƯỜNG CHUẨN XYLOSE 3000000 2500000 2000000 1500000 S 1000000 y = 2E+06x + 343690 500000 R² = 0.9835 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 C Hình 2. Phương trình đường chuẩn xylose. 1
  84. Đồ án tốt nghiệp o chuẩn Ethanol ĐƯỜNG CHUẨN ETHANOL 2000000 1500000 S 1000000 y = 2E+06x + 61087 500000 R² = 0.9876 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 C Hình 3. Phương trình đường chuẩn ethanol. Phụ lục B Đồ thị tương quan giữa mật độ quang OD-mật độ tế bào Saccharomyces cerevisiae. 8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 8 y = 1.6486x + 7.5527 7.9 R² = 0.9824 log(cfu/ml) 7.8 7.7 7.6 OD 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Hình 4. Đồ thị tương quan giữa mật độ quang OD-mật độ tế bào Saccharomyces cerevisiae. 2
  85. Đồ án tốt nghiệp