Đồ án Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.), xác định thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.), xác định thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU BẠCH ĐÀN TRẮNG (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.), XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS. Trịnh Thị Lan Anh Sinh viên thực hiện : Nguyễn Trịnh Nhật Vy MSSV: 1411100484 Lớp: 14DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2018
2. Đồ án tốt nghiệp CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp này là công trình khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Trịnh Thị Lan Anh. Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. TP.HCM, ngày 30 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Trịnh Nhật Vy i
3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể Quý Thầy, Cô Viện Khoa học ứng dụng Hutech, trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cơ bản, đã tạo điều kiện thuận lợi để em có cơ hội tiếp cận với môi trường làm việc thực tế qua thời gian học tập đầy ý nghĩa này. Đồng thời nhà trường đã tạo cho em có cơ hội được làm việc, cho em bước ra đời sống thực tế để áp dụng những kiến thức mà các thầy cô đã giảng dạy. Qua đề tài tốt nghiệp này em nhận ra nhiều điều mới mẻ và bổ ích để giúp ích cho công việc sau này của bản thân. Đặc biệt, em xin gởi đến cô Trịnh Thị Lan Anh, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hoàn thành đề tài đồ án tốt nghiệp này lời cảm ơn sâu sắc nhất. Em xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo, các phòng ban của Viện Khoa học ứng dụng Hutech, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được tìm hiểu thực tiễn trong suốt quá trình làm đề tài tại phòng thí nghiệm. Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, anh, chị làm việc tại khoa Công nghệ sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn, hướng dẫn cho em cách làm việc, ghi chú công việc rõ ràng cụ thể để thuận lợi cho việc làm việc nhóm và báo cáo công việc. Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình làm, hoàn thiện đề tài em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ cô cũng như thầy, cô, anh, chị. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, đã tạo điều kiện giúp em có cơ hội học tập nâng cao kĩ năng của bản thân. Chúc Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM phát triển và ngày càng trở thành nơi tin cậy của nhiều sinh viên. TP.HCM, ngày 30 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Trịnh Nhật Vy ii
4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1.1. Giới thiệu về cây Bạch đàn trắng 6 1.1.1. Vị trí phân loại thực vật 6 1.1.2. Khái quát về họ Sim 7 1.1.3. Sơ lược về chi Bạch đàn 8 1.1.4. Nguồn gốc và phân bố 10 1.1.5. Đặc điểm thực vật 10 1.1.6. Thành phần hoá học 11 1.2. Giới thiệu về tinh dầu 14 1.2.1. Khái niệm về tinh dầu 14 1.2.2. Phân bố tinh dầu trong thiên nhiên 15 1.2.3. Quá trình tích luỹ tinh dầu 15 1.2.4. Tính chất vật lý của tinh dầu 16 1.2.5. Tính chất hoá học của tinh dầu 17 1.2.6. Ảnh hưởng của những nhân tố khác nhau đến thành phần và tính chất của tinh dầu Bạch đàn trắng 17 1.2.7. Ứng dụng tinh dầu Bạch đàn 18 1.2.8. Nguyên tắc sản xuất tinh dầu từ nguyên liệu thiên nhiên 19 1.2.9. Nguyên tắc trích ly tinh dầu 19 1.2.10. Các phương pháp trích ly tinh dầu 19 1.3. Giới thiệu về phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 25 1.4. Khả năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật 26 1.4.1. Khái niệm 26 iii
5. Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Các cơ chế kháng khuẩn 27 1.4.3. Một số nhóm hợp chất ở thực vật 28 1.5. Giới thiệu về các chủng vi khuẩn gây bệnh 33 1.5.1. Staphyllococcus aureus 33 1.5.2. Escherichia coli (E.coli) 35 1.5.3. Salmonella 36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 38 2.1.1. Địa điểm tiến hành đề tài 38 2.1.2. Thời gian thực hiện 38 2.2. Vật liệu 38 2.2.1. Nguyên liệu 38 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 39 2.2.3. Hóa chất 39 2.3. Phương pháp nghiên cứu 40 2.3.1. Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 42 2.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng trong quá trình chưng cất 45 2.3.3. Xác định chỉ số vật lý, hoá học của tinh dầu Bạch đàn trắng 51 2.3.3.4. Xác định thành phần hoá học của tinh dầu 55 2.3.3.5. Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn 56 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59 3.1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu bạch đàn trắng trong quá trình chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước 59 3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (cắt nhỏ và xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 59 3.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá bánh tẻ, lá già) đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 61 iv
6. Đồ án tốt nghiệp 3.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 63 3.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 65 3.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong nước muối trước khi chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 67 3.1.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 69 3.2. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Bạch đàn trắng 71 3.2.1. Đánh giá cảm quan 71 3.2.2. Định lượng tinh dầu Bạch đàn trắng 72 3.2.3. Kết quả đo tỷ trọng tinh dầu Bạch đàn trắng 72 3.2.4. Kết quả xác định độ hòa tan của tinh dầu Bạch đàn trắng trong ethanol 73 3.2.5. Chỉ số hóa học của tinh dầu Bạch đàn trắng 74 3.3. Kết quả xác định thành phần hoá học của tinh dầu 74 3.4. Xác định hoạt lực kháng khuẩn của tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 77 3.4.1. Kết quả hoạt tính kháng Salmonella của tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 77 3.4.2. Kết quả hoạt tính kháng Staphylococcus aureaus của tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 79 3.4.3. Kết quả hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu bạch đàn trắng thư được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 81 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84 4.1. Kết luận 84 4.2. Kiến nghị 85 v
7. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 86 1. Tài liệu tiếng Việt 86 2. Tài liệu tiếng Anh 87 3. Tài liệu Internet 87 PHỤ LỤC 1 vi
8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO : Dimethyl sulfoxyde DNA : Deoxyribonucleic Acid E.Coli : Escherichia coli GC : Gas chromatography MS : Mass spectrometry NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth PABA : 4-Aminobenzoic acid RNA : Ribonucleic Acid SAS : Statistical Analysis Systems TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TCVS : Tiêu chuẩn vi sinh TSA : Trypticase Soy Agar TSB : Trypticase Soy Broth vii
9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 46 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 47 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 48 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 49 Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong nước muối trước khi chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 50 Bảng 2.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 51 Bảng 3.1. Kết quả ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 59 Bảng 3.2. Kết quả ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 61 Bảng 3.3. Kết quả ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 63 viii
10. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 65 Bảng 3.5. Kết quả ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong nước muối trước khi chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 67 Bảng 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 69 Bảng 3.7. Kết quả định lượng tinh dầu Bạch đàn trắng 72 Bảng 3.8. Kết quả xác định tỷ trọng tinh dầu Bạch đàn trắng trong ethanol 72 Bảng 3.9. Kết quả xác định chỉ số hóa học của tinh dầu Bạch đàn trắng 73 Bảng 3.10. Kết quả xác định độ hòa tan của tinh dầu Bạch đàn trắng trong ethanol 74 Bảng 3.11. Kết quả xác định thành phần hóa học và hàm lượng tương đối các hợp chất trong mẫu tinh dầu Bạch đàn trắng bằng phương pháp GC – MS 75 Bảng 3.12. Kết quả hoạt tính kháng Samonella của tinh dầu Bạch đàn trắng 77 Bảng 3.13. Kết quả hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu Bạch đàn trắng 79 Bảng 3.14. Kết quả hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu Bạch đàn trắng 81 ix
11. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.) 6 Hình 1.2. Một số loài cây thuộc chi Bạch đàn 9 Hình 1.3. Hình ảnh hai loại lá Bạch đàn trắng 11 Hình 1.4. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước 20 Hình 1.5. Máy ép tinh dầu 21 Hình 1.6. Hệ thống chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng 23 Hình 1.7. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước 26 Hình 1.8. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật 27 Hình 1.9. Cấu trúc của Morphine 28 Hình 1.10. Quinie trích ly từ cây Cinchona officinalis 29 Hình 1.11. Sơ đồ phân loại sapoin 31 Hình 1.12. Vi khuẩn Staphyllococcus aureus 34 Hình 1.13. Vi khuẩn E.coli 35 Hình 1.14. Vi khuẩn Salmonella 36 Hình 2.1. Hai loại lá Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.) 38 Hình 2.2. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu Bạch đàn trắng bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 41 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình chưng cất tinh dầu Bạch đàn trắng 42 Hình 2.4. Lá Bạch đàn trắng sau khi cắt nhỏ và chuyển vào bình cầu 43 Hình 2.5. Tinh dầu Bạch đàn trắng và nước đã tách thành 2 pha 44 Hình 2.6. Bộ dụng cụ chưng cất tinh dầu nhẹ hơn nước Clevenger 45 Hình 2.7. Kích thước nguyên liệu 46 Hình 2.8. Lá Bạch đàn trắng sau khi cắt nhỏ và chuyển vào bình cầu 47 Hình 2.9. Quy trình đánh giá hoạt lực kháng khuẩn của tinh dầu Bạch đàn trắng 55 Hình 3.1. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 60 x
12. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 62 Hình 3.3. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 64 Hình 3.4. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 66 Hình 3.5. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trước khi chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 68 Hình 3.6. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 70 Hình 3.7. Tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 71 Hình 3.8. Kết quả kháng Salmonella 78 Hình 3.9 Kết quả kháng Staphylococcus aureus 80 Hình 3.10. Kết quả kháng E.coli 82 xi
13. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài 1.1. Đặt vấn đề Từ thời cổ xưa, con người đã biết khai thác và sử dụng tinh dầu làm thuốc, gia vị, chất thơm phục vụ nhu cầu cuộc sống. Tinh dầu thiên nhiên hiện nay là một sản phẩm khá thông dụng trên thị trường. Nó được ứng dụng tương đối phổ biến trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm, y học, mỹ phẩm và một số lĩnh vực khác Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện tự nhiên rất thuận lợi. Vì thế, nguồn tài nguyên thực vật có tinh dầu ở nước ta rất phong phú và đa dạng, đây là nguồn nguyên liệu có nhiều tiềm năng, triển vọng đối với sự nghiệp phát triển kinhh tế của đất nước trong giai đoạn hiện tại cũng như trong tương lai. 1.2. Tầm quan trọng của đề tài Ở nước ta cây Bạch đàn được xem là loài cây được trồng chủ yếu để phủ xanh đất trống đồi trọc và để cung cấp nguồn nguyên liệu cho công nghiệp giấy và xây dựng, cho nên việc nghiên cứu về loài cây này phần lớn tập trung vào quá trình trồng và chăm sóc. Tuy nhiên bên cạnh giá trị về cung cấp gỗ thì tinh dầu trong lá của chúng còn có một số tính chất rất quý. Một đặc điểm quan trọng của loài Bạch đàn là nó thuộc loài cây chứa tinh dầu. Tinh dầu được chứa trong lá của rất nhiều loài thuộc chi Bạch đàn. 1,8-cineol thường là thành phần chính trong tinh dầu của nhiều loài Bạch đàn. Đây là một nguyên liệu có giá trị trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm. Tinh dầu của một số loài đã được dùng làm cao xoa, làm thuốc sát trùng. Nhiều loại tinh dầu lại được dùng làm nguyên liệu để sản xuất thuốc trừ sâu bệnh từ thiên nhiên. 1.3. Lý do chọn đề tài Hiện nay đã xuất hiện nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã bắt đầu đi sâu vào các ứng dụng của tinh dầu Bạch đàn cho công nghiệp dược phẩm, hoá mỹ phẩm và đặc biệt là công nghiệp chế biến thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc thực vật. Như vậy, tinh dầu Bạch đàn có rất nhiều các tính chất khác nhau, trong đó có các độc tính chống lại các loài sâu bệnh hại cây trồng, nhiều loài vi khuẩn, 1
14. Đồ án tốt nghiệp nấm và côn trùng. Trong y học, lá Bạch đàn được dùng để chữa ho, giúp tiêu hóa, ngoài ra còn dùng để chữa cảm sốt, Tuy nhiên, trong các nghiên cứu trước đây chưa thấy các tác giả mô tả phương pháp chưng cất và tách chiết trong khi đó yếu tố này ảnh hưởng rất lớn đến thành phần và hàm lượng các chất hóa học trong tinh dầu của lá. Tinh dầu được sản suất từ lá cây tươi bằng nhiều phương pháp: phương pháp cơ học, phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi và không bay hơi, phương pháp trích ly bằng CO2, phương pháp vi sóng, phương pháp sinh học, Ngoài ra, còn một phương pháp trích ly tinh dầu khá phổ biến là phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Ưu điểm của phương pháp này là quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị gọn, dễ chế tạo, không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ, thời gian tương đối nhanh, hiệu suất thu hồi tinh dầu tương đối cao, giữ nguyên được mùi vị thiên nhân ban đầu và thành phần trong tinh dầu ít bị biến đổi. Xuất phát từ thực tế chung đó, đề tài: “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.), xác định thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn” được thực hiện nhằm bước đầu tìm ra điều kiện tối ưu trong việc ly trích tinh dầu, xác định các thành phần hóa học và ứng dụng tính kháng khuẩn của tinh dầu bạch đàn từ đó nâng cao hiệu quả sử dụng loại cây này. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng thu nhận tinh dầu từ lá bạch đàn bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Định danh và định lượng thành phần hoá học tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS). Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Bạch đàn trắng bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Nghiên cứu cơ sở lý luận và thực tiễn của đề tài. Tiến hành thực nghiệm ly trích tinh dầu Bạch đàn trắng bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. 2
15. Đồ án tốt nghiệp Định danh và định lượng các thành phần hóa học của tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS). Thử hoạt tính sinh học về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Bạch đàn trắng thu được từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. 4. Các phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu lý thuyết: thu thập, phân tích, tổng hợp tài liệu. Thực nghiệm: Các phương pháp tách chiết tinh dầu: phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp sử dụng bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger. Phương pháp sinh hóa: thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Bạch đàn trắng trên các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, E.coli, Salmonella. Xử lý số liệu bằng phần mềm SAS 9.1 và MicroSoft Excel 2010®. 5. Đối tượng nghiên cứu Lá Bạch đàn trắng được trồng ở phường Linh Trung, quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh. 6. Tình hình nghiên cứu Các công trình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về tinh dầu lá bạch đàn, cụ thể là: Năm 2014, Bùi Văn Năng đã nghiên cứu “Đánh giá đặc tính thành phần tinh dầu một số loài Bạch đàn (Eucalyptus) trồng ở Việt Nam và mối liên hệ của nó với một số vấn đề sinh thái môi trường điển hình”. Khoa Quản lí tài nguyên rừng và môi trường – Trung tâm thí nghiệm thực hành. Năm 2014, Trương Quang Cơ đã nghiên cứu “Ly trích tinh dầu Bạch đàn chanh, ứng dụng làm nước hoa xịt phòng”. Trường Cao đẳng Công thương Thành phố Hồ Chí Minh. Năm 2016, Đoàn Ngọc Dũng đã tiến hành “Nghiên cứu chiết xsuất tinh dầu lá Bạch đàn bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước”. Chuyên ngành Hóa dầu – Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu. 7. Những đóng góp mới của đề tài So sánh hàm lượng tinh dầu qua các độ tuổi của lá: lá non, lá bánh tẻ, lá già. 3
16. Đồ án tốt nghiệp Xác định được các điều kiện trích ly tinh dầu tối ưu đối với loài Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.). Xác định thành phần hóa học của tinh dầu Bạch đàn trắng thu được từ nguồn trồng ở phường Linh Trung, quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước trực tiếp. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Bạch đàn trắng đối với các chủng vi sinh vật (Salmonella, Staphylococcus aureaus, E.coli) theo các nồng độ pha loãng tinh dầu. a) Ý nghĩa về mặt kinh tế của đề tài Tạo ra được nhiều sản phẩm có giá trị cao từ tinh dầu bạch đàn thiên nhiên. Có giá thành rẻ, mà lại có ứng dụng nhiều trong đời sống và an toàn. b) Ý nghĩa về mặt xã hội Tạo ra sản phẩm mới chứa tinh dầu bạch đàn chưa có trên thị trường. Tạo ra sản phẩm chứa tinh dầu bạch đàn có tác dụng đuổi côn trùng gây hại mà thân thiện với môi trường và người sử dụng. Tinh dầu Bạch đàn sẽ thay thế các loại hóa chất độc hại và các loại kháng sinh thương mại trên thị trường. c) Ý nghĩa về mặt sức khỏe Tác dụng của tinh dầu Bạch đàn giúp sát khuẩn đường hô hấp, chữa ho hen, xông giải cảm, giải độc, chữa mụn mẩn, làm đẹp da, làm giảm đau nhức với những người bị thấp khớp, làm ấm cơ thể, giảm mệt mỏi, thư giãn cơ thể. Có thể sử dụng tinh dầu cho việc chăm sóc tóc. d) Ý nghĩa về mặt thẩm mỹ Làm se da, sáng da, tẩy tế bào chết và kháng khuẩn, kháng nấm, giảm thâm trên da khi dùng, e) Ý nghĩa trong công nghệ thực phẩm Là hương liệu trong công nghệ sản xuất các loại bánh kẹo, thức uống. Gần đây, nhờ hoạt tính kháng vi sinh vật và khả năng chống oxi hóa ưu việt của tinh dầu bạch đàn mà nó được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và an toàn thay cho các chất bảo quản tổng hợp. 4
17. Đồ án tốt nghiệp 8. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 5
18. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Bạch đàn trắng 1.1.1. Vị trí phân loại thực vật Cây Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.) thuộc: Giới (regnum) : Plantae Ngành (division) : Angiospermae Lớp (class) : Eudicots Bộ (ordo) : Myrtales Họ (familia) : Myrtaceae Chi (genus) : Eucalyptus Loài (species) : Eucalyptus camaldulensis Tên khoa học: Eucalyptus camaldulensis Dehnh., 1832. Tên đồng nghĩa là: Eucalyptus rostrata Sch., 1847. Tên thông thường: Bạch đàn Camal, Bạch đàn Úc, Khuynh diệp đỏ, Tên nước ngoài: Red gum, Murray red gum, River red gum (Anh); Eucalypt, Eucalyptus (Pháp); Yukhalip (Thái Lan); Ampupu, Leda (Indonesia); Bagras (Philippines), Hình 1.1. Cây Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.) 6
19. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Khái quát về họ Sim Trên thế giới, họ Sim hay họ Đào kim nương, còn gọi là họ Hương đào (Myrtaceae) có ít nhất 3.000 loài, phân bố trong 130 -150 chi. Chúng phân bố rộng khắp ở vùng nhiệt đới, ôn đới ấm áp trên thế giới và rất phổ biến trong nhiều khu vực đa dạng sinh học của thế giới. Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ (2000), họ Sim gồm 13 chi, có 100 loài. Theo Nguyễn Kim Đào (2003), chia họ Sim thành 15 chi, 108 loài gồm: Acmena DC, Baeckea, Callistemon, Cleistocalyx, Decaspermum, Eucalyptus, Eugenia, Macropsidium, Melaleuca, Osbornia, Psidium, Rhodamnia, Rhodomyrtus, Syzygium, Tristania. Trong đó, chi Eucalyptus có 24 loài. Trong họ Myrtaceae, tất cả các loài đều có thân gỗ, chứa tinh dầu và hoa mọc thành cụm từ 4-5 hoa đơn. Một đặc trưng nổi bật của họ này là libe nằm ở cả hai bên của xylem (chất gỗ), chứ không ở bên ngoài như ở phần lớn các loài thực vật khác. Lá của chúng thuộc loại thường xanh, mọc so le hay mọc đối, lá đơn và thông thường có mép lá nhẵn (không khía răng cưa). Hoa thường có 5 cánh hoa, mặc dù ở một vài chi thì cánh hoa rất nhỏ hay không có. Nhị hoa thường rất dễ thấy, có màu sáng và nhiều về lượng. Các cây tiêu biểu trong họ: - Sim (Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk.): lá là thuốc cầm máu, chữa vết thương chảy máu, bị chấn thương bầm dập. Quả chín ăn được, dùng chế rượu, chữa thiếu máu lúc có mang, suy nhược khi mới ốm dậy. Rễ chữa tử cung xuất huyết cơ năng, đau xương, lưng gối yếu mỏi, viêm thấp khớp. - Ổi (Psidium guajava L.): lá thường dùng trị viêm ruột cấp và mạn, chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, trẻ em khó tiêu hóa. Quả ăn được. - Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora Hook.): lá chứa tinh dầu, tinh dầu có mùi dễ chịu và có tính kháng khuẩn mạnh nên được sử dụng nhiều trong công nghệ hóa mỹ phẩm, sản xuất xà phòng và các chất tẩy rửa, sát trùng. - Tràm lá dài (Melaleuca Leucadendra L.): lá dùng nấu nước uống thay trà, giúp tiêu hoá và làm thuốc chữa ho hoặc xông để trị cảm cúm. 7
20. Đồ án tốt nghiệp Nước sắc lá dùng đắp lên mụn nhọt, vết thương có tác dụng sát trùng và cầm máu, dùng xức các vết bỏng cho chóng lên da non. - Điều đỏ (Syzygium Malaccense): quả ăn được. Lá dùng hạ sốt. Rễ làm thuốc lợi tiểu và dùng trong các bệnh về gan với chứng phù nề. 1.1.3. Sơ lược về chi Bạch đàn Chi Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi có số lượng loài khá lớn, theo Lã Đình Mỡi (2002), ước tính có khoảng trên 500 loài, theo Dairy R.Batish và cộng sự, Eucalyptus có khoảng 700 loài khác nhau, còn theo Lê Văn Truyền và cộng sự, chi này có tới 800 loài khác nhau. Theo Phạm Hoàng Hộ (2000) và Nguyễn Kim Đào (2003), có khoảng 24 loài Bạch đàn đã được trồng ở Việt Nam trong đó Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.) được coi như loài có giá trị kinh tế cao, được trồng rộng rãi ở cả các vùng đất thấp và cao, trừ những đỉnh núi có độ cao trên 1000 mét so với mực nước biển. Theo Lã Đình Mỡi (2002), một số loài Bạch đàn đã được nhập và trồng tương đối rộng rãi ở Việt Nam như: Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh., 1832. Tên đồng nghĩa: E. rostrata Sch., 1847). Một vài địa phương khác còn gọi là Bạch đàn camal, Bạch đàn Úc, Khuynh diệp đỏ. Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora Hook., 1848. Còn có các tên đồng nghĩa khác: E. melissiodara Lindley, 1848; E. variegata E.v. Mueller, 1859; E. maculata Hook. var. citriodora (Hook.) Bailey, 1990; Corymbia citriodora (Hook.) K.D Hill & L.A.S. Johnson, 1995). Có nơi ở nước ta còn gọi là Bạch đàn đỏ. Bạch đàn timo (Eucalyptus alba Reinw. ex Blume, 1827. Tên đồng nghĩa: E. leucadedron Reinw. ex de Vriese, 1856). Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla S.T. Blake, 1977. Còn có tên đồng nghĩa: E. alba auct. non Reinw.ex Blume, E. decaisneana auct. Non Blume). Bạch đàn long duyên (Eucalyptus exserta F.v. Muell.,1859). Có nơi ở nước ta còn gọi là Bạch đàn liễu. 8
21. Đồ án tốt nghiệp Bạch đàn lá nhỏ (Eucalyptus tereticornis J.E.Smith, 1795. Tên đồng nghĩa: E. subulata Cunn. ex Schauer, 1843; E. insignis Naudin, 1891; E. umbellata (Gaertner) Domin (1928) non Desf.). Bạch đàn đỏ (Eucalyptus robusta Smith., 1793. Tên đồng nghĩa: E. multiflora, 1812). Bạch đàn vỏ dày (Eucalyptus robusta Smith, 1849. Các tên đồng nghĩa: E. multiflora Rich. ex A. Gray non Poir., 1854; E. naudiniana F.v. Mueller, 1886; E. schlechteri Diels, 1992). Bạch đàn trắng Bạch đàn chanh Bạch đàn liễu Bạch đàn timo Hình 1.2. Một số loài cây thuộc chi Bạch đàn 9
22. Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Nguồn gốc và phân bố Hầu hết số loài trong chi Eucalyptus là đặc hữu của Australia. Những nghiên cứu gần đây đã phát hiện được khoảng trên 10 loài có phân bố ở miền Nam New Guinea và Indonesia, một số nhỏ ở vùng viễn bắc Philippines và Đài Loan. Các loài bạch đàn đã được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới gồm châu Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán đảo Ấn Độ, và cả Việt Nam. Ở Việt Nam, lần đầu tiên Bạch đàn được Brochet tìm thấy ở Cốc Lếu tỉnh Lào Cai vào năm 1904 (Hoàng Hòe, 1996). Thời kỳ 1960 – 1975, một số loài Bạch đàn như Bạch đàn long duyên (E. exserta), Bạch đàn lá nhỏ (E. tereticornis), Bạch đàn đỏ (E. robusta), Bạch đàn chanh (E. citriodora) và Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) đã được nhập trồng tại nhiều khu vực miền núi và trung du phía Bắc nước ta. Hiện nay, nhiều loại Bạch đàn đã được trồng nhiều vùng ở Việt Nam: Nam Trung Bộ, Đông Nam Bộ, Tây Nam Bộ. Cây có thể sống được trên nhiều loại đất khác nhau, đặc biệt chịu được phèn nên trồng tốt ở nhiều nơi vùng đồng bằng sông Cửu Long. 1.1.5. Đặc điểm thực vật Cây Bạch đàn trắng thân gỗ sống lâu năm, cao 30 đến 50 m, đường kính có thể lên đến 1,5 m thân phẳng với những dải màu từ trắng, xám đến nâu đỏ. Vỏ cây già, mềm bong thành mảng để lộ vỏ thân màu sáng. Cây mọc thẳng trong điều kiện thích hợp, nhưng cũng có thể phân nhánh nếu khí hậu khô hơn. Cành non vuông, có 4 cạnh. Cành già tròn, không cạnh. Hai loại lá: Trên cây non hay cành non, lá mọc đối, cuống ngắn, phiến lá hình trứng hoặc giống hình trái tim, màu lục, mỏng, như phủ sáp, dài 10 – 15 cm, rộng 4 – 8 cm. Trên cành cây già, lá mọc riêng biệt, so le, cong, hình liềm, cuống dài, phiến lá hẹp dài 16 – 25 cm, rộng 2 – 5 cm. Phiến lá có túi tiết tinh dầu. Khi soi lá trước ánh sáng thấy rất nhiều túi tiết tinh dầu nhỏ li ti. Khi vò lá có mùi thơm mạnh đặc biệt, mùi dịu hơn ở loài E. camaldulensis. Từ kẽ lá có những nụ hoa hình núm oản ngửa, có 4 cạnh tương ứng với 4 lá đài. Quả hình chén, phía trên có 4 ngăn, trong chứa hạt nhỏ. 10
23. Đồ án tốt nghiệp Cành lá trên cây non Cành lá trên cây già Hình 1.3. Hình ảnh hai loại lá Bạch đàn trắng 1.1.6. Thành phần hoá học a. Nghiên cứu trên thế giới Tinh dầu của Bạch đàn đã được biết đến và sử dụng từ hàng trăm năm nay. Hiện nay trên thế giới cũng đã có một số nghiên cứu về thành phần và hoạt tính của tinh dầu Bạch đàn cũng như tác động của nó đến môi sinh. Một số tác giả khác như Duke (2004), Brooker và Kleinig (2006), Liu (2008), đã tập trung nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu một số loài Bạch đàn cùng với một số tính chất của nó. Trong các nghiên cứu đó phải kể đến công trình nghiên cứu của Daizy R. Batish và cộng sự (2008). Trong nghiên cứu này tác giả đã chỉ ra rằng tinh dầu Bạch đàn có tính chất như một loại thuốc trừ sâu tự nhiên do nó có khả năng tiêu diệt được nhiều loài sâu bệnh hại cây trồng, nhiều loài vi khuẩn và nấm, muỗi.  Các hợp chất tự nhiên Theo nghiên cứu của Brooker và Kleinig (2006), tinh dầu Bạch đàn là một hỗn hợp phức tạp của nhiều monoterpenes và sesquiterpenes khác nhau, cùng với các phenol và oxit, este, rượu, ete, andehyt và keton. Thành phần này phụ thuộc vào từng loài, khu vực trồng, khí hậu, loại đất và tuổi của lá, chế độ phân bón, đồng thời còn phụ thuộc vào phương pháp tách chiết tinh dầu. Hoạt tính trừ sâu 11
24. Đồ án tốt nghiệp hại của tinh dầu Bạch đàn do các thành phần như 1,8-cineole, citronellal, citronellol, citronellyl acetate, p - cymene, eucamalol, limonene, linalool, α - pinene, γ - terpinene, α - terpineol, alloocimene và aromadendrene (Watanable, 1993; Li, 1995, 1996; Cimanga, 2002; Deke, 2004; Batish., 2006; Liu., 2008). Các thành phần khác nhau của tinh dầu Bạch đàn có tác dụng bổ trợ cho các hoạt tính sinh học trừ sâu bệnh (Cimanga et al., 2002). Trong tổng số các thành phần khác nhau của tinh dầu Bạch đàn thì 1,8-cienole là thành phần quan trọng nhất và là một hợp chất đặc trưng cho chi Bạch đàn (Duke, 2004).  Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn Theo Fiori và cộng sự (2000), Oluma và Garba (2004), tinh dầu Bạch đàn với các thành phần chính của nó có độc tính kháng rất nhiều các loài vi khuẩn, nấm và cả mầm bệnh ủ trong đất. Chúng làm giảm sự phát triển của nấm sợi. Su và cộng sự (2006), đã chứng minh hoạt tính chống nấm của tinh dầu một số loài Bạch đàn như Eucalyptus grandis, E. camaldulensis và E. citriodora kháng lại nấm Mildew và nấm gây thối ở gỗ như Aspergillus clavatus, Aspergillus niger, Chaetomium alobosum, Penicillium citrinum, Trichoderma viride, Theo tác giả Dhaliwal (2004), chứng minh được rằng tinh dầu của loài E. camaldulensis có khả năng kháng vi khuẩn Penicilium digitatum gây thối cam quýt, Nấm ngoài da Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton mentagrophytes và Epidermophyton floccosum.  Hoạt tính xua đuổi, diệt trừ côn trùng Tinh dầu Bạch đàn có hoạt tính như một loại thuốc trừ côn trùng tự nhiên để chống lại muỗi và các loài chân đốt gây hại hoặc một vài loài động vật ăn cỏ. Vào cuối những năm 1990, một số công trình nghiên cứu công bố cho thấy các sản phẩm tinh dầu Bạch đàn chủ yếu sử dụng để xua đuổi các loài côn trùng. Sau đó vào năm 2002, Fraduin và Day cho rằng 30 % tinh dầu Bạch đàn có thể dùng trong xua đuổi muỗi trong 2 giờ, tuy nhiên tinh dầu phải có ít nhất 70 % hàm lượng cineole. Yang và cộng sự (2004) đã công bố rằng tinh dầu của loài Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) với hợp chất chính là 1,8-cineole có biểu hiện tính độc chống lại muỗi vằn trưởng thành, giết chết loài Callosobruchus, Sitophilus oryzae và Tribolium castaneum trưởng thành từ 1 – 7 ngày. 12
25. Đồ án tốt nghiệp  Hoạt tính trừ cỏ Theo Kohli và cộng sự (1998), Singh và cộng sự (2005), Batish và cộng sự (2007), Setia và cộng sự (2007) cho rằng tinh dầu của một số loài Bạch đàn có biểu hiện kháng lại các loài cỏ dại và có một tiềm năng tốt cho kiểm soát cỏ dại. Cũng theo nhóm tác giả đã chứng minh tinh dầu đã bộc lộ những độc tính rất rõ ràng đối với một số loài và ảnh hưởng của tính độc đó rõ hơn đối với sự nảy mầm của các loài cây nhỏ như A. viridis. b. Nghiên cứu ở Việt Nam Về phương diện khai thác tinh dầu người ta thường quan tâm đến 3 nhóm chính: Nhóm tinh dầu dược liệu giàu cineole: (có hàm lượng cineol trong tinh dầu > 55 %) cho tinh dầu được gọi là Oleum Eucalypti. Ðại diện cho nhóm này là Eucalyptus globulus L., với những ưu điểm nổi bật: Hàm lượng tinh dầu và hàm lượng cineole khá cao, có thể đến 80 – 85 %. Thành phần tinh dầu: Thành phần chính là cineole. Loài E. camalduleusis Dehnh. có thể đạt 60 – 70 %. Loài E. exserta F.v. Muell. thấp hơn 30 – 50 %. DÐVN IV (2009) quy đinh hàm lượng cineole (C10H18O) trong tinh dầu Bạch đàn phải có ít nhất 60%. Cũng như tinh dầu tràm, tinh dầu bạch đàn trước khi sử dụng cần được tinh chế và làm giàu cineole. Ở Việt Nam, có thể dùng lá Bạch đàn trắng (E. camalduleusis Dehnh.) hoặc Bạch đàn liễu (E. exserta F.v. Muell.) để thay thế lá Bạch đàn xanh (E. globulus) là loại đã được sử dụng rất lâu đời ở các nước châu Âu. Nhóm tinh dầu thơm giàu citronelal: cho tinh dầu Oleum Eucalipti Citriodorae. Ðại diện là E. citriodora Hook. với hàm lượng citronelal trên 70%. Lá có chứa một hàm lượng lớn tinh dầu (3,3 – 4,8 %). Thành phần chính của tinh dầu là citronelal (trên 70 %) ngoài ra, còn có citronelol (5,6 %). Nhóm tinh dầu công nghiệp giàu piperiton: Có chứa thành phần được sử dụng trong công nghệ tách đãi, phương pháp được sử dụng chính trong ngành công nghiệp khai thác mỏ để tách quặng ra khỏi các khoáng sản không cần đến. Ðại diện là E. piperita Sm. với hàm lượng piperiton 42 – 48 %. Loài Bạch đàn có tinh dầu giàu cineole được dùng trong y dược và trồng rộng rãi từ năm 1987. Lá Bạch đàn trắng trồng ở Việt Nam chứa trung bình 1,79 13
26. Đồ án tốt nghiệp ± 0,46 % tinh dầu tính theo nguyên liệu khô tuyệt đối qua 118 mẫu định lượng (Nguyễn Thị Thái Hằng, 1995). Thành phần tinh dầu gồm có: (1,8-cineole 64,79 %; α-pinene 6,91 %; p-pinene 7,67 %; camphene 0,22 %; p-myrcene 0,38 %; α- phelandren 0,17 %; p-cymene 1,20 %; γ-terpinen 4,50 %; fenchol 0,12 %; linalol 1,47 %; (Z)-p-menthen-2-ol 0,43 %; (E)-p-menthen-2-ol 0,31 %; camphor 0,09 %; borneol 0,08 %; crypton 0,27 %; terpinene-4-ol 1,67 %; α-terpineol 1,99 %; citronclol vết; nerol 0,09 %; cuminal 0,90 %; geraniol vết; alcol cinamic vết; piperiton vết; terpinyl acetat 0,83 %; aromadendren vết; γ-elemen 0,29 %; p- caryophylen 0,25 %; p-bergamoten vết; α-humulen hoặc selinen 0,13 %; elemol vết; spathulenol 0,36 %; p-caryophylen ocid 0,07 %; globulol 0,15 %; γ- eudesmol 0,35 %; p-cudesmol 0,24 %; (Z)-cadusiol 0,20 %. Ngoài ra, bạch dàn trắng còn chứa tanin với tỷ lệ ở vỏ 8 – 16 %, ở gỗ 2 – 14 %, ở cành và lá 5 – 11 %. Bạch đàn trắng còn là nguồn nguyên liệu quan trọng cung cấp gôm (The Wealth of India 3, 1952). Lá bạch đàn chứa tanin, nhựa và tinh dầu (3 – 6 % tính trên lá khô kiệt). tinh dầu bạch đàn màu vàng nhạt, rất lỏng, mùi thơm, vị lúc đầu mát sau nồng. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là 1,8-cineole hay eucalyptol (60 – 85 %), α- pinene, camphene, fenchol, các adehuyt valeric và butyric (Đỗ Tất Lợi, 2004). Trong số các hợp chất có trong tinh dầu ở 0các loài Bạch đàn thì 1,8- cineole được coi là hợp chất chủ yếu và quyết định giá trị của tinh dầu (Lã Đình Mỡi, 2002). Theo nghiên cứu gần đây, đã xác định được 5 hợp chất hóa học mới đó là: limonene (14,4 %), methyl eugenol (0,2 %), alloaromadendrene (1,3 %), γ- eudesmol (2,2 %) (Bùi Văn Năng, 2014). 1.2. Giới thiệu về tinh dầu 1.2.1. Khái niệm về tinh dầu Tinh dầu gồm nhiều hợp chất dễ bay hơi, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc cung cấp nguyên liệu tinh dầu. Phân lớn tinh dầu có nguồn gốc từ thực vật và số ít từ động vật. Hệ thực vật có tinh dầu khoảng 3000 loài, trong đó có 150 – 200 loài có ý nghĩa công nghiệp. 14
27. Đồ án tốt nghiệp Tinh dầu là hỗn hợp các chất hữu cơ tan lẫn vào nhau, có mùi đặc trưng. Ở nhiệt độ thường hầu hết tinh dầu ở thể lỏng, có khối lượng riêng bé hơn 1 (trừ một vài tinh dầu như quế, đinh hương, ), không tan trong nước hoặc tan rất ít, nhưng lại hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ như alcohol, eter, chất béo, Tinh dầu bay hơi với hơi nước, có vị cay và ngọt, nóng bỏng và có tính sát trùng mạnh (Lê Ngọc Thạch, 2003). Trong thiên nhiên tinh dầu ở trạng thái tự do, chỉ có một số ít ở trạng thái tiềm tàng, nghĩa là tinh dầu không có sẵn trong nguyên liệu mà chỉ xuất hiện trong những điều kiện gia công nhất định trước khi tiến hành ly trích hay dưới tác dụng cơ học. Còn ở trạng thái tự do, tinh dầu có sẵn trong nguyên liệu có thể thu hái ly trích trong điều kiện bình thường (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014). 1.2.2. Phân bố tinh dầu trong thiên nhiên Các loại cây có tinh dầu được phân bố rộng trong thiên nhiên. Kết quả thống kê cho thấy có khoảng 2.500 loài cây có chứa tinh dầu. Trữ lượng tinh dầu trong cây phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thỗ nhưỡng. Cây mọc ở vùng nhiệt đới có trữ lượng tinh dầu cao hơn ở vùng ôn đới. Ngay trong một cây, thành phần và lượng tinh dầu trong các bộ phận khác nhau cũng khác nhau. Ngoài ra lượng tinh dầu thu được còn phụ thuộc vào điều kiện, phương pháp thu hoạch, bảo quản, tách chiết, Hàm lượng tinh dầu trong những cây khác nhau cũng rất khác nhau: hoa hồng hàm lượng tinh dầu vào khoảng 0,25 %; bạc hà hàm lượng khoảng 1 %; quả hồi và nụ đinh hương thì hàm lượng tinh dầu tương ứng có thể đạt giá trị 5 % và 15% (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014). 1.2.3. Quá trình tích luỹ tinh dầu Trong thực vật, tinh dầu được tạo ra và tích trữ trong các mô. Hình thành các mô này thay đổi tùy theo vị trí của chúng trong cây. Những mô này có thể hiện ở tất cả mọi nơi trong cây như rễ, thân, lá, hoa và trái, dưới những tên gọi khác nhau như: Tế bào tiết: tế bào tiết ra tinh dầu rồi giữ luôn trong tế bào (mô tiết) như trong cánh hóa hồng, củ gừng, Lông tiết: cũng là tế bào tiết nhưng nằm nhô ra ngoài bề mặt thực vật, thường bắt gặp ở lá các họ Hoa môi, Cúc, Cà, 15
28. Đồ án tốt nghiệp Túi tiết: tế bào tiết ra tinh dầu nhưng không chứa lại bên trong mà dồn chung chứa vào một xoang trống, tạo ra bởi cơ chế ly bào hay tiêu bào. Túi tiết thường nằm bên dưới biểu bì. Thường có ở vỏ trái các loài Citrus, Eucalyptus, Ống tiết: cách tạo ra tinh dầu cũng như túi tiết nhưng nằm sâu bên trong phần gỗ và chạy dài theo sớ gỗ, bắt gặp trong các loài Dipterocarpi, Artmisia, Về phần phân bố lượng tinh dầu, đặc biệt có nhiều trong họ Long não, họ Hoa môi, họ Cam, họ Sim, họ Hoa tán. Tinh dầu có trong các bộ phận khác nhau của cây: như ở hoa (hồng, nhài, cam, chanh, ); ở lá (bạch đàn, bạc hà, hương nhu, tần dầy lá, ); ở vỏ cây (quế); ở thân cây (hương đàn, peru, sả, ); ở rễ (hương bài, gừng, nghệ, xuyên khung, ) (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014). 1.2.4. Tính chất vật lý của tinh dầu Ở nhiệt độ thường, tinh dầu ở thể lỏng, trừ một số trường hợp như menthol, camphor, là ở thể rắn. Tinh dầu gần như không tan trong nước và dễ bay hơi, do vậy có thể tách thu tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Tinh dầu rất ít tan trong nước, tan tốt trong cồn và các dung môi hữu cơ, các loại dầu mỡ, có thể tan một phần trong dung dịch kiềm, Đa số tinh dầu không có màu hoặc màu vàng nhạt, một số tinh dầu có màu như: tinh dầu quế có màu nâu sẫm, tinh dầu thymus màu đỏ. Tinh dầu thường có vị cay và hắc. Tỷ trọng của tinh dầu thường vào khoảng 0,85 – 0,95; có một số tinh dầu nặng hơn nước như tinh dầu đinh hương, tinh dầu quế. Tỷ trọng thay đổi theo thành phần hóa học. Nếu tinh dầu có thành phần chủ yếu là hydrocarbon terpenic thì tỷ trọng thấp, tinh dầu có hợp chất chứa oxy hoặc nhân thơm thì tỷ trọng cao hơn. Tinh dầu thường có chỉ số khúc xạ vào khoảng 1,45 – 1,56. Chỉ số khúc xạ cao hay thấp tùy theo thành phần các chất chứa trong tinh dầu là no, không no 16
29. Đồ án tốt nghiệp hoặc có nhân thơm. Nếu tinh dầu có nhiều thành phần có nhiều dây nối đôi thì có chỉ số khúc xạ cao. Vì tinh dầu là một hỗn hợp nên không có nhiệt độ sôi nhất định. Điểm sôi của tinh dầu thay đổi tùy theo thành phần hợp chất. Ví dụ, hợp chất terpen có điểm sôi là 150 – 160 oC, hợp chất sesquiterpen có điểm sôi cao hơn, khoảng 250 – 280 oC, còn các hợp chất polyterpene có điểm sôi trên 300 oC. Từ đó, ta có thể tách riêng các thành phần khác nhau trong tinh dầu bằng phương pháp chưng cất phân đoạn. Khi hạ nhiệt độ một số tinh dầu có thể kết tinh như tinh dầu hồi, tinh dầu bạc hà, tinh dầu xá xị, (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014). 1.2.5. Tính chất hoá học của tinh dầu Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng, không khí, nước tinh dầu dễ bị oxy hóa và có thể bị nhựa hóa một phần. Alcol trong tinh dầu bị oxy hóa thành aldehyde, aldehyde biến thành acid. Các hợp chất có nối đôi dễ bị oxy hóa hoặc tham gia và phản ứng cộng hợp. Các hợp chất ceton và aldehyde dễ bị aldol hóa tạo nhựa khi có sự hiện diện của kiềm. Nhiều thành phần có các nhóm chức khác nhau có thể tham gia các phản ứng hóa học, làm thay đổi tính chất của tinh dầu (Phùng Thị Ái Hữu, 2012). 1.2.6. Ảnh hưởng của những nhân tố khác nhau đến thành phần và tính chất của tinh dầu Bạch đàn trắng Tinh dầu chứa trong thực vật có thành phần không cố định mà luôn thay đổi theo hướng phát triển của cây cũng như ảnh hưởng của những yếu tố khác. a. Nguyên liệu chế biến và bộ phận dùng để chế biến Ở mỗi loại cây có chứa tinh dầu, ở mỗi bộ phận chứa tinh dầu, có thành phần nhất định trong những điều kiện nhất định, các giống khác nhau thì thành phần tinh dầu cũng khác nhau. Trong cùng một cây nhưng lượng tinh dầu ở các bộ phận khác nhau, hàm lượng và thành phần cũng khác nhau. b. Phương pháp chế biến 17
30. Đồ án tốt nghiệp Tùy thuộc vào phương pháp chế biến mà hàm lượng và thành phần cũng khác nhau. Tinh dầu nhận được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ít bị tạp hơn so với tinh dầu trích ly bằng dung môi bay hơi vì các thành phần tạp khác sẽ hòa tan vào nước. c. Hướng phát triển của cây Trong thời gian cây sinh trưởng thành phần tinh dầu chịu hàng loạt các biến đổi và những chuyển hóa này có thể xác định thời kỳ mà cây tích tụ được nhiều tinh dầu nhất và có chất lượng cao nhất để thu hoạch và chế biến. Tinh dầu tạo thành trong cây không phải có một lượng cố định mà biến đổi liên tục theo hướng phát triển của cây. Sự biến đổi này có xu hướng là càng ngày càng tích tụ nhiều những hợp chất có chứa oxy. Trong các bộ phận khác nhau của cây, tinh dầu tạo thành và tích lũy không giống nhau mà luôn luôn chuyển hóa lẫn nhau (Lê Ngọc Thạch, 2003). d. Độ tươi Nguyên liệu bị khô, dập, úng cũng ảnh hưởng đến hàm lượng và chất lượng tinh dầu. Nên tránh để dồn đống nguyên liệu đưa đến sự phát nhiệt bên trong làm thối rữa nguyên liệu. Cần phơi héo nguyên liệu thích hợp, tốt nhất phơi héo trong bóng mát vì nếu nhiệt độ lên quá 40oC một số cấu phần trong tinh dầu sẽ bay hơi. Nhưng độ héo cũng ảnh hưởng đến hàm lượng và chất lượng tinh dầu. Do đó, nếu để nguyên liệu héo trong một thời gian dài sẽ đưa đến giảm khối lượng tinh dầu chứa trong nguyên liệu. Mặt khác, việc này cũng sẽ dẫn đến một số cấu phần không bền trong tinh dầu bị phân hủy làm cho tinh dầu thu được không còn chất lượng tự nhiên. Do đó, trước khi ly trích tinh dầu, nguyên liệu cần được phơi héo, cần phải khảo sát hiệu suất và thành phần hóa học của tinh dầu theo thời gian để héo để biết cần để héo trong thời gian bao nhiêu lâu là thích hợp nhất (Phùng Thị Ái Hữu, 2012). 1.2.7. Ứng dụng tinh dầu Bạch đàn Khoa học ngày càng tiến bộ thì ứng dụng của tinh dầu ngày càng rộng rãi và chiếm một vị trí quan trọng: Trong công nghệ thực phẩm: Tinh dầu giữ vai trò quan trọng trong công nghệ sản xuất các loại bánh kẹo, thức uống. Mặc dù sử dụng với lượng vô 18
31. Đồ án tốt nghiệp cùng nhỏ và dưới những dạng khác nhau, tinh dầu đã góp phần tạo hương cho các loại thức ăn, đồ uống, làm cho chúng thêm phần hấp dẫn. Gần đây, nhờ hoạt tính kháng vi sinh vật và khả năng chống oxi hóa ưu việt của nó, trong công nghệ thực phẩm cũng đã xuất hiện xu hướng sử dụng tinh dầu như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và an toàn thay cho các chất bảo quản tổng hợp. Hóa mỹ phẩm: tinh dầu có mùi thơm tự nhiên có khả năng làm sạch không khí, diệt khuẩn, tăng sức đề kháng, giảm mệt mỏi, căng thẳng. Nên tinh dầu được ứng dụng nhiều trong: dầu thơm, nước súc miệng, sản xuất xà phòng, các chất tẩy rửa, sát trùng, nước xịt phòng, thuốc xịt côn trùng, Trong y học: tinh dầu giúp dễ tiêu hóa, giảm sốt, giải độc, diệt vi khuẩn đường hô hấp và ngoài da, kích thích dịch tiêu hóa, dịch dạ dày, dịch ruột và dịch mật nên được sử dụng làm thuốc hãm, thuốc xông, hoặc pha chế thành các dạng bào chế như thuốc viên, cao, dung dịch lỏng dùng để chữa ho, các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, xông mũi, chữa cảm cúm, chữa đau bụng, nôn mửa, xoa bóp các chỗ đau, giảm mệt mỏi và kích thích hoạt động của cơ bắp. Trong công nghiệp: sản xuất thuốc bảo vệ thực vật có giá trị. 1.2.8. Nguyên tắc sản xuất tinh dầu từ nguyên liệu thiên nhiên Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu. Quy trình khai thác phải phù hợp với nguyên liệu. Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp nhất. Đơn giản, thuận tiện và nhanh chóng (Mai Thị Anh Tú, 2009). 1.2.9. Nguyên tắc trích ly tinh dầu Nguyên tắc ly trích của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những đặc tính của tinh dầu như: Dễ bay hơi. Lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 100 oC. Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ. Dễ bị hấp thu ngay ở thể khí. 1.2.10. Các phương pháp trích ly tinh dầu 19
32. Đồ án tốt nghiệp Do những yêu cầu về nguyên tắc trích ly nên khi khai thác hợp chất thơm từ thực vật, động vật, người ta thường dùng một trong các phương pháp sau đây: a) Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Hình 1.4. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước 1. Bình cấp hơi nước 2. Bình chứa nguyên liệu chưng cất 3. Lớp tinh dầu 4. Lớp nước Hơi nước tạo ra từ nồi hơi, thường có áp suất cao hơn không khí, được đưa thẳng vào bình chưng cất. Ngày nay thường dùng phương pháp này để chung cất tinh đầu từ các nguyên liệu thực vật. Điểm ưu việt của phương pháp này là người ta có thể điều chỉnh áp suất, nhiệt độ như mong muốn để tận thu sản phẩm nhưng phải giữ nhiệt độ ở mức giới hạn để tinh dầu không bị phân hủy. Việc sử dụng phương pháp cũng lệ thuộc vào những điều kiện hạn chế, yêu cầu hơi nước không quá nóng và quá ẩm. Nếu quá nóng nó có thể phân hủy nhưng cấu phần có độ sôi thấp. Nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại sớm quá, người ta phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong một thời gian cho đến khi sự khuếch tán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới tiếp tục dùng lại hơi nước quá nhiệt. Nếu hơi nước quá ẩm sẽ dẫn đến hiện tượng hơi nước ngưng tụ, phần chất nạp phía dưới sẽ bị ướt, trong trường hợp này người ta phải tháo nước ra bằng một van xả dưới đáy nồi. Trong công nghiệp, hơi nước trước khi vào bình chưng cất phải đi ngang một bộ phận tách nước. 20
33. Đồ án tốt nghiệp Với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng, nên tốt nhất là bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết thúc. Không có một quy tắc chung nào cho mọi nguyên liệu vì mỗi chất nạp đòi hỏi một kinh nghiệm và yêu cầu khác nhau. Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ vào đặc tính của tinh dầu và cách chọn phương pháp chưng cất (Lã Đình Mỡi, 2001). Trong phòng thí nghiệm, để chưng cất hơi nước tinh dầu người ta thường dùng bộ dụng cụ thủy tinh Clevenger Ưu điểm: Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản. Thiết bị gọn, dễ chế tạo. Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ. Thời gian tương đối nhanh. Nhược điểm: Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp. Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy. Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn. Những tinh dầu có độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém. b) Phương pháp cơ học Hình 1.5. Máy ép tinh dầu 21
34. Đồ án tốt nghiệp Đây là phương pháp tương đối đơn giản dùng để tách tinh dầu ở dạng tự do bằng cách tác dụng lực cơ học lên nguyên liệu (thường là ép). Phương pháp này được dùng phổ biến đối với các loại vỏ quả họ Citrus như cam, chanh, quýt, bưởi, Vì ở những loại nguyên liệu này tinh dầu thường phân bố chủ yếu ở lớp tế bào mỏng trong biểu bì. Khi có lực tác dụng lên vỏ quả, các tế bào có chứa tinh dầu bị vỡ ra giải phóng tinh dầu. Phương pháp ép có nhiều ưu điểm như: tinh dầu giữ nguyên được mùi vị thiên nhiên ban đầu, các thành phần trong tinh dầu ít bị biến đổi. Nhược điểm của phương pháp ép tinh dầu bị lẫn nhiều tạp chất, chủ yếu là các hợp chất hữu cơ hòa tan vật liệu đem ép (Lê Ngọc Thạch, 2003). c) Phương pháp trích bằng dung môi dễ bay hơi Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng thích hợp ở nhiệt độ phòng. Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong với dung môi bên ngoài do chênh lệch nồng độ. Sau khi trích ly phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu/ Ưu điểm: sản phẩm thu được theo phương pháp này thường có mùi thơm tự nhiên. Hiệu suất sản phẩm thu được thường cao hơn các phương pháp khác. Nhược điểm: yêu cầu cao về thiết bị, thất thoát dung môi, quy trình tương đối phức tạp (Mai Thị Anh Tú, 2009). d) Trích ly bằng dung môi không bay hơi Dựa vào tính chất có thể hòa tan trong chất béo động vật và thực vật của tinh dầu, người ta ngâm nguyên liệu vào dầu động vật hoặc thực vật, tinh dầu sẽ khuếch tán qua màng tế bào, hòa tan vào dầu, sau đó tách riêng dầu để thu tinh dầu. Phương pháp ngâm bằng dung môi không bay hơi có nhiều ưu nhiều ưu điểm hơn phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi ở chỗ thu dầu được dầu nhiều tạp chất hơn. Tuy nhiên, phương pháp này rất thủ công, khó cơ giới 22
35. Đồ án tốt nghiệp hóa và có nhược điểm lớn là chất béo dùng làm dung môi rất khó bảo quản và chế biến, giá thành cao. Chính vì vậy hiện nay phương pháp này rất ít được sử dụng (Mai Thị Anh Tú, 2009). e) Phương pháp trích ly bằng CO2 Lợi dụng tính chất khí CO2 có thể hóa lỏng ở áp suất cao, dùng CO2 lỏng chiết tinh dầu ra khỏi nguyên liệu. Phương pháp trích ly dùng CO2 lỏng được sử dụng nhiều trong công nghiệp trong thời gian gần đây do có nhiều ưu điểm như: Dung môi CO2 có tính chọn lựa tốt. CO2 không có tác dụng độc hại đối với con người như các loại dung môi khác. Dễ loại và không để lại vết dung môi. Khi loại dung môi không cần sử dụng nhiệt, vì vậy giữ được mùi thơm của tinh dầu mà không sợ tinh dầu bị phân hủy. Quá trình kín ít bị hao tốn. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp chịu áp lực cao, chi phí cho CO2 còn đắt, nên chưa được phổ biến (Mai Thị Anh Tú, 2009). f) Phương pháp vi sóng Hình 1.6. Hệ thống chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng 23
36. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp vi sóng có đặc điểm: vi sóng (micro – onde, microwave) là sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng. Sóng điện từ này được đặc trưng bởi: Tần số f, tính bằng Hertz (Hz = cycles/s ), là chu kỳ của trường điện từ trong một giây, nằm giữa 300 Hz và 30 GHz Vận tốc c là 300.000 km/giây. Độ dài sóng (cm) là đoạn đường đi của vi sóng trong một chu kỳ, liên hệ với tần số theo công thức = c/f. Hầu hết các lò vi sóng gia dụng đều sử dụng tần số 2450 MHz, ở tần số này = 12,24 cm. Một số phân tử, thí dụ như nước, phân chia điện tích trong phân tử một cách bất đối xứng. Như vậy các phân tử này là những lưỡng cực có tính định hướng trong nhiều điện trường. Dưới tác dụng của điện trường một chiều, các phân tử lưỡng cực có khuynh sắp xếp theo chiều điện trường này. Nếu điện trường là một điện trường xoay chiều, sự định hướng của các lưỡng cực sẽ thay đổi theo chiều xoay đó. Cơ sơ của hiện tượng phát hiện do vi sóng là sự tương tác giữa điện trường và các phân tử phân cực bên trong vật chất. Trong điện trường xoay chiều có tần số rất cao 2,45 x 109 Hz, điện trường này sẽ gây ra một sự xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử, đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất. Với một cơ cấu có tính bất đối xứng cao, phân tử nước có độ phân cực rất lớn, do đó nước là một chất rất lý tưởng để đun nóng bằng vi sóng. Ngoài ra, các nhóm định chức phân cực như: - OH, - COOH, - NH2, trong các hợp chất hữa cơ cũng là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ. Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu xạ của vi sóng. Việc này liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó. Tóm lại, sự đun nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng (Phạm Thế Chính và cộng sự, 2009). g) Phương pháp sinh học Phương pháp này được ứng dụng cho các nguồn nguyên liệu có tinh dầu ở trạng thái kết hợp (glucosid). Để phân lập tinh dầu, người ta phải sử lí bằng cách 24
37. Đồ án tốt nghiệp lên men hoặc dùng enzyme, sau đó kết hợp với chưng cất hay trích ly để thu tinh dầu giống như các loại vật liệu chứa hợp chất thơm khác (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000 - 2001). 1.3. Giới thiệu về phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Phương pháp này dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định. Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo thì phải dùng nhiều hơi nước hơn và sự chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn. Nguyên lý hoạt động của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Phương pháp chưng cất lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nước được dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu. Khi hỗn hợp này được gia nhiệt, cả hai chất đều bay hơi. Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng với áp suất môi trường thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước. Chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp Nguyên liệu và nước được cho vào cùng một thiết bị, đun sôi, hơi nước bay ra sẽ lôi cuốn theo hơi tinh dầu, sau đó làm lạnh ngưng tụ hơi, ta sẽ thu được tinh dầu sau khi phân ly tách nước ra. Thiết bị sử dụng tương đối đơn giản, rẻ tiền, phù hợp với sản xuất nhỏ ở địa phương, nhất là ở những nơi mới bắt đầu khai thác tinh dầu, bước đầu chưa có điều kiện đầu tư vào sản xuất. Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm: Chất lương tinh dầu sản phẩm không cao. Nguyên liệu dễ bị cháy khét, do bị thiếu nước, bị dính vào thành thiết bị. Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật (nhiệt độ, áp suất), thời gian chưng cất kéo dài. Tiêu tốn nhiều năng lượng. 25
38. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước Chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp Phương pháp chưng cất gián tiếp sử dụng nồi bốc hơi nước riêng hoặc sử dụng chung hệ thống hơi nước từ một lò hơi chung cho các thiết bị khác nhau. Do bộ phận chưng cất không bị gia nhiệt trực tiếp nên phương pháp khắc phục được tình trạng nguyên liệu bị khê khét, màu sắc và phẩm chất của tinh dầu thu được tốt hơn. Do hơi nước cấp từ bên ngoài nên dễ dàng khống chế và điều chỉnh các yếu tố như lưu lượng, áp suất cho phù hợp với từng loại nguyên liệu, giúp nâng cao hiệu suất cũng như chất lượng tinh dầu thu được. 1.4. Khả năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật 1.4.1. Khái niệm Hợp chất kháng khuẩn ở thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt sự phát triển của vi sinh vật. Các hợp chất kháng khuẩn thường có khả năng tác dụng đặc hiệu lên vi sinh vật với một nồng độ rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010). Các hợp chất này thường thuộc nhiều nhóm hợp chất khác nhau như alkaloid, glucoside, phenolic và tinh dầu. 26
39. Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Các cơ chế kháng khuẩn Hình 1.8. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Silva và Fernandes, 2010) a. Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn: Gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin. Tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu. b. Ức chế chức năng của màng tế bào: Gồm colistin, polymycin, gentamicin và amphoterricin. Cơ chế sẽ làm mất chức năng của màng, làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài. c. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc các acid amin mới vào chuỗi polypeptide. Nhóm macrolide và lincoxinamide gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide. 27
40. Đồ án tốt nghiệp d. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA. Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho 2 mạch đơn DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotide. Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic (Tôn Nữ Minh Nguyệt và cộng sự, 2010). 1.4.3. Một số nhóm hợp chất ở thực vật a. Nhóm alkaloid - Morphine Morphine là alkaloid chủ yếu trong nhựa của cây anh túc còn xanh (Papaver somniferum). Morphine tinh sạch được thu được lần đầu vào năm 1806 và xác định cấu trúc hóa học vào năm 1927. Morphine có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, gây nghiện . Morphine có khả năng giảm đau, tạo cảm giác lâng lâng dễ chịu. Hiện nay rất nhiều hợp chất tổng hợp giống morphine nhưng ít độc hơn được sử dụng trong y tế như linol, lerit hay phenazone, (Nguyễn Tiến Thắng, 2012). Hình 1.9. Cấu trúc của Morphine 28
41. Đồ án tốt nghiệp - Quinine Từ rất lâu, quinine đã được sử dụng làm thuốc trị sốt rét. Quinine có trong cây Cinchona officinalis có nguồn gốc từ Peru, Bolivia. Cấu trúc hóa học của quinine được xác định vào năm 1907 và tổng hợp hóa học từ năm 1945. Quinine ức chế quá trình sao chép DNA và phiên mã tạo RNA của tác nhân gây sốt rét (Nguyễn Tiến Thắng, 2012). Hình 1.10. Quinine trích ly từ cây Cinchona officinalis - Glucoalkoloid Đại diện là latisolin hoạt chất trích ly từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) thuộc họ Amaryllidaceae. Vào năm 1986, Ghosal công bố tách được một số dẫn xuất alkaloid từ cây Trinh nữ hoàng cung có khả năng chống ung thư. Nhiều nghiên cứu về sinh học phân tử từ cây Trinh nữ hoàng cung và trong họ Amaryllidaceae đã chứng minh rằng các alkaloid trong họ này có khả năng chống ung bứu, chống vi khuẩn và kích thích miễn dịch. b. Nhóm glucoside Glycoside là một phân tử đường liên kết với một nhóm chức bằng liên kết glycosidic. Trong cơ thể sống glycoside đóng rất nhiều vai trò quan trọng như dự trữ năng lương, cấu trúc tạo hình (cellulose, ), bảo vệ (Mucopolysaccharide, ), chống tạo thể cetone gây độc cho cơ thể, đồng thời rất nhiều glycose từ thực vật được sử dụng làm thuốc (Marco, 2007). 29
42. Đồ án tốt nghiệp Glycoside thường ở dạng rắn, kết tinh một số ít ở dạng lỏng hoặc vô định hình. Các hợp chất glycoside thường không màu, tan trong nước và cồn, ít hoặc không tan trong dung môi hữu cơ như ether hoặc chloroform. Phân loại Nhóm glycoside thường được phân loại theo tính chất hóa học của aglycone bao gồm các nhóm: Nhóm alcoholic glycoside: salicin. Nhóm anthraquinone glycoside. Nhóm coumarin glycoside: apterin. Nhóm chromone glycoside: benzo- gamma-pyrone. Nhóm cyanogenic glycoside: amygdalin, dhurrin, linamarin, lotaustralin và prunasin. Nhóm flavonoid glycoside: hesperidin, naringin, rutin, quercitrin. Nhóm phenolic glycoside. Nhóm saponin. Nhóm cardiac glycoside. Nhóm steviol glycoside. Nhóm thioglycosides: sinigrin, sinalbin. Một số nhóm hợp chất glycoside ở thực vật: Tannin Tannin là một polyphenol tan trong nước có trong cây Sồi. Gồm 2 nhóm chính là tannin tan và tannin phức không tan. Tannin tan trong nước là những dẫn xuất đơn của benzoic acid như gallic acid và hexahydroxydiphenic acid liên kết với đường đơn. Tannin phức là các đại phân tử tạo thành từ một số gốc hydroxyflavanol. Tannin thường không gắn với vách tế bào như các phenol khác mà nằm ở không bào. Một trong những chức năng sinh học quan trọng nhất của tannin là làm chất xua đuồi dinh dưỡng (chất làm ngán ăn). Tannin có thể gây độc cho nấm mốc, nấm men và vi khuẩn (Nguyễn Tiến Thắng, 2012). Saponin 30
43. Đồ án tốt nghiệp Saponin là một glucoside tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật đặc biệt là nhân sâm. Saponin có một tính chất chung đó là khi bị hòa tan vào nước, saponin có khả năng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch, tạo nhiều bọt, có độc đối với động vật máu lạnh đặc biệt là đối với cá. Tạo phức với cholesterol, có vị hắc và làm hắc hơi mạnh. Một vài loài động vật cũng có saponin như hải sâm, cá sao. Ngày nay, saponin được công nhân là thành phần chính giúp tạo ra những công dụng của nhân sâm. Sâm càng nhiều saponin thì càng tốt, dựa trên tiêu chí đó để đánh giá chất lượng của các loại sâm. Saponin được chia làm 2 nhóm chính dựa trên cấu trúc phần sapogenins là saponin trung tính dẫn xuất steroid và các saponin có tính acid chứa gốc triterpenoid. Saponins Saponin triterpenoid Saponin steroid Nhóm spirostan Saponin Saponin triterpenoid Nhóm triterpenoid tetracyclic furostan pentacyclic Nhóm aminofurostan Nhóm dammaran Nhóm Nhóm Nhóm spirosolan Nhóm olean hopan lanostan Nhóm Nhóm Nhóm solanidan Nhóm ursan cucurbitan lupan Hình 1.11. Sơ đồ phân loại saponin (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013) 31
44. Đồ án tốt nghiệp Flavonoid Flavonoid là nhóm hợp chất thứ cấp gồm khoảng hơn 5000 chất có bộ khung cấu tạo C15 và thường được cải biến bằng cách gắn thêm các gốc (-OH) và (-OCH3). Thông thường flavonoid thường tồn tại ở dạng phức với glucose và acid hữu cơ. Trong số này có những nhóm chất phổ biến như flavonone và flavonol, authocyacin, roteno. Một số nhóm đại diện chính của flavonoid là isoflavone, flavanonem, flavonol và leucoanthocyanidin (Nguyễn Tiến Thắng, 2012). Flavonoid chủ yếu tập trung ở các cây ngành hạt kín, lớp 2 lá mầm. Trong thực vật bậc cao flavonoid là nhóm sắc tố phổ biến nhất tạo màu cánh hoa từ da cam, đỏ đến xanh dương. Trong lớp 1 lá mầm chỉ có khoảng 10 họ được tìm thấy có chứa flavonoid. Ngoài ra hàm lượng của flavonoid còn phụ thuộc vào nơi mọc, cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì có hàm lượng flavonoid cao hơn những nơi thiếu ánh sáng (Ngô Văn Thu, 2011). c. Nhóm tinh dầu Tinh dầu thường là một hỗn hợp gồm nhiều thành phần, có mùi thơm, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi ở nhiệt độ thường và có thể tách chiết từ thực vật bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Thông thường tinh dầu đa số là chất lỏng chỉ có một số ít ở thể rắn như: menthol, borneol, vanilin, heliotropin. Không màu hoặc màu vàng nhạt và có thể sẫm màu vì oxy hóa. Tinh dầu có mặt rộng rãi trong các họ cây như: họ Cúc (Asteraceae), họ Hoa Tán (Apiaceae), họ Hoa Môi (Lamiaceae), họ Long Nhãn (Lauraceae), họ Sim (Myrtaceae), họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae) Tinh dầu được sử dụng như một vị thuốc, trong đông y tinh dầu được sử dụng để trị sán (Thymol), diệt ký sinh trùng sốt rét (Artermisinin) ngoài ra còn chống viêm, làm lành vết thương, kháng khuẩn và diệt khuẩn, (Ngô Văn Thu, 2011). Phân loại Thành phần hóa học và cấu tạo của tinh dầu khá phức tạp nhưng có thể chia thành 4 nhóm sau: 32
45. Đồ án tốt nghiệp Nhóm dẫn xuất monoterpene. Nhóm dẫn xuất sesquiterpene. Nhóm dẫn xuất các dẫn xuất nhân thơm. Nhóm các hợp chất chứa nitrogen và lưu huỳnh. Một số nhóm hợp chất tinh dầu ở thực vật Monoterpene Monoterpene chủ yếu có mặt trong tinh dầu, có mùi thơm và thường được tách chiết bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. một vài đại diện tiêu biểu của monoterpene là menthol, geraniol và citral được sử dụng rất rộng rãi trong y học, mỹ phẩm và thực phẩm. Sesquiterpene Sesquiterpene có cấu tạo từ pharnesylpyrophosphate thường có mặt trong tinh dầu và nhựa thực vật. Một số loại serquiterpene là hormone ảnh hưởng đến quá trình lột xác của sâu bọ, chất thơm và chất gây ngán ăn ở thực vật. Farnesol, abscisic acid và phaseic acid là một số hợp chất sesquiterpene thường thấy (Nguyễn Tiến Thắng, 2012). 1.5. Giới thiệu về các chủng vi khuẩn gây bệnh Một số vi khuẩn hay gặp là Salmonella, Staphylococcus aureus, E.coli, Bacillus suptilis, 1.5.1. Staphyllococcus aureus Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878, sau khi thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt. Năm 1880, Louis Pasteur cũng đã thực hiện tiến hành phân lập và nghiên cứu về Staphylococcus aureus. Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 – 1,5 µm, có thể đứng riêng lẻ nhưng thường tạo từng chùm giống chùm nho, không di động, không sinh bào tử. Staphylococcus aureus thường cư trú trên da, niêm mạc, đường ruột các động vật máu nóng. Staphylococcus aureus là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường. Phát triển được ở nhiệt độ 10 – 45°C, mọc tốt ở 37°C, pH thích hợp là 7,0 – 7,5. 33
46. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.12. Vi khuẩn Staphyllococcus aureus Ở môi trường canh thang thì sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ thì làm đục rõ, để lâu có thể lắng cặn. Ở môi trường thạch, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, đường kính khoảng 1 – 2 mm, có thể màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng. Ở môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, làm tan máu hoàn toàn. Tụ cầu vàng tiết ra năm loại dung huyết tố (hemolysin): α, β, γ, δ, ε. Coagulase do S. aureus sinh ra có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi đã được chống đông. Đây là tiêu chuẩn quan trọng nhất để phân biệt tụ cầu vàng với các tụ cầu khác. Coagulase có ở tất cả các tụ cầu vàng. Coagulase có hai loại: một loại tiết ra môi trường (coagulase tự do), một loại bám vào vách tế bào (coagulase cố định). Staphylococcus aureus cho phản ứng catalase dương tính, lên men được nhiều loại đường như: mannitol, glucose, lactose, mannose, sucrose, levulose, manit. Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không sinh bào tử khác. Nó bị tiêu diệt ở 80°C trong 1 giờ, 100°C trong 1 – 2 phút, có thể sống ở môi trường có nồng độ NaCl cao (15%), có thể tồn tại ngoài môi trường khô ráo 4 – 5 tháng. 34
47. Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn tụ cầu vàng gây bệnh bằng cách gây tổn thương trực tiếp lên các cơ quan như: Da: nhọt da, áp xe, viêm mô tế bào. Hô hấp: viêm khí quản, viêm phổi hoại tử, áp xe phổi biến chứng tràn khí màng phổi, tràn khí trung thất, tràn khí dưới da, tràn mủ màng phổi Tim: viêm nội tâm mạc, tràn mủ màng tim. Màng não: viêm màng não mủ. Xương: cốt tủy viêm, viêm khớp Máu: nhiễm trùng máu hoặc gây bệnh bằng cách gián tiếp tiết ra các độc tố gây viêm da tróc vẫy hoặc hội chứng sốc độc tố. 1.5.2. Escherichia coli (E.coli) E. coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước 2 x 0,6µm – 3 x 0,6µm. Trong cơ thể E. coli có dạng trực khuẩn hình cầu, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn E. coli có khả năng di động do có lông xung quanh thân. Vi khuẩn không sinh nha bào,có thể có giáp mô (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). E. coli lên men sinh hơi các loại đường như fructose, glucose, lactose, levulose, galactose, xylose, ramnose, mannit, H2S âm tính (Nguyễn Như Thanh, 1997). Chúng sinh indole, methyl red dương tính, không có khả năng sử dụng citrate, khử nitrate và lên men decarboxylase với arginine, lysine (Trần Linh Thước, 2010). Hình 1.13. Vi khuẩn E.coli 35
48. Đồ án tốt nghiệp E. coli gây bệnh qua nhiều con đường khác nhau nhưng chủ yếu là đường tiêu hóa. Chúng có sẵn trong ruột động vật nhưng chỉ gây bệnh do sức đề kháng của con vật giảm sút. Bệnh do E. coli gây ra giống như một bệnh truyền nhiễm kế phát do thiếu vitamin và mắc các bệnh virus, ký sinh trùng. 1.5.3. Salmonella Năm 1874, nhà nghiên cứu bệnh học Ba Lan Tadeusz Browicz mô tả một loại vi khuẩn là nguyên nhân gây ra bệnh thương hàn. Năm 1880, Karl Joseph Eberth và Robert Koch phát hiện tác nhân gây bệnh sốt thương hàn ở người. Năm 1884, Georg Gaffky thành công trong việc cấy mầm bệnh trong môi trường nuôi cấy thuần khiết. Năm 1889, nhóm nghiên cứu dưới quyền bác sĩ thú y Daniel Elmer Salmon tìm thấy vi khuẩn gây ra bệnh "dịch tả cho heo" và tên vi khuẩn được đặt theo tên của ông. Hình 1.14. Vi khuẩn Salmonella Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi, không 36
49. Đồ án tốt nghiệp sinh bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình sợi. Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới trong cả động vật máu lạnh, động vật máu nóng và trong môi trường. Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các bệnh như thương hàn (do Salmonella typhi), phó thương hàn, nhiễm trùng máu (do Salmonella choleraesuis) và ngộ độc thực phẩm (Salmonellosis). Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 – 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu chứng thường kéo dài từ 2 – 7 ngày. Trong môi trường canh thang, mọc nhanh, sau 10 giờ và làm đục môi trường. Môi trường thạch thường, Salmonella phát triển tốt sau 24 giờ, tạo khuẩn lạc dạng s màu trắng xám. Salmonella được phân loại dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên. Hiện nay có khoảng 1.500 typ huyết thanh (còn gọi là loài) Salmonella. Đặt tên cho mỗi loài Salmonella mới tìm ra có thể lấy tên động vật mang mầm bệnh hoặc tên địa phương đã phân lập ra chúng lần đầu tiên. Sau đây là một số loài Salmonella đáng được chú ý nhất: S.typhi: chỉ gây bệnh cho người. Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu do S.typhi gây ra. S.paratyphi A: cũng chỉ gây bệnh thương hàn cho người. Ở nước ta cũng hay gặp loài này sau S.typhi. S.paratyphi В: gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi ở cả súc vật. Bệnh thường gặp ở các nước Châu Âu. S.paratyphi С: vừa có khả năng gây bệnh thương hàn, vừa có khả năng gây viêm dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết thường gặp ở các nước đông nam Châu Á. S.typhimurium và S. enteritidis gây bệnh cho người và súc vật. Hai loài này là nguyên nhân chủ yếu của nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn do Salmonella. S.choleraesuis: là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do Salmonella ở nước ta. 37
50. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 2.1.1. Địa điểm tiến hành đề tài Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Viện Khoa học ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh. Địa chỉ: Lô E1, Phân khu đào tạo E1, Khu Công Nghệ cao TP.HCM, Phường Hiệp Phú, Quận 9, TP.HCM. 2.1.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ tháng 8 năm 2017 đến tháng 7 năm 2018. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguyên liệu Lá cây Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.) thu hái ở phường Linh Trung, quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh. Kích thước: lá cành non, cuống ngắn, phiến lá hình trứng hoặc giống hình trái tim, màu lục, mỏng, như phủ sáp, dài 10 – 15 cm, rộng 4 – 8 cm. Lá trên cành cây già, cong, hình liềm, cuống dài, phiến lá hẹp dài 16 - 25cm, rộng 2 – 5 cm. Khối lượng trung bình của lá: 2,05 g Lá trên cành non Lá trên cành già Hình 2.1. Hai loại lá Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnh.) 38
51. Đồ án tốt nghiệp Các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis được cung cấp bởi Viện Sinh Học Nhiệt Đới. 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị  Thiết bị: Bộ chưng cất tinh dầu nhẹ hơn nước Clevenger Autoclave (Đức). Cân phân tích, cân kỹ thuật. Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức). Bếp điện Máy xay ướt Bể điều nhiệt  Dụng cụ: Bao PE Bông thấm nước, bông không thấm nước. Pipetman 100 µl, 1000 µl. Becher 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000ml Erlen 250 m. Đĩa Petri Que cấy trang Đèn cồn Ống đong Pipette Lọ thủy tinh Đũa thủy tinh Ống nghiệm Phễu thủy tinh Phễu chiết Giấy lọc 2.2.3. Hóa chất Các hóa chất để pha môi trường NA, NB 39
52. Đồ án tốt nghiệp Na2SO4 NaCl KOH 0,1N HCl 0,1N Nước deion Thuốc thử phenolphthalein Ethanol 90o, ethanol 80o, ethanol 70o và ethanol tuyệt đối Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: môi trường Nutrient Agar và môi trường Nutrient Broth. 2.3. Phương pháp nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm với các nội dung sau: 40
53. Đồ án tốt nghiệp Nguyên liệu lá Bạch đàn trắng Kích thước nguyên liệu Nồng độ NaCl Cắt Xay Xác định ảnh hưởng của nhỏ nhuyễn các yếu tố đến khả năng thu nhận tinh dầu Bạch Thời gian ngâm nguyên liệu trong Tuổi nguyên liệu đàn trắng bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn dung dịch NaCl Tỷ lệ hơi nước nước/nguyên liệu Thời gian chưng cất Màu sắc Đánh giá cảm quan Mùi Vị Chỉ số vật lý tinh Định lượng tinh dầu Bạch đàn trắng dầu Bạch đàn trắng Xác định chỉ tiêu hóa lý của tinh dầu Bạch đàn trắng Chỉ số hóa học tinh Tỷ trọng tinh dầu dầu Bạch đàn trắng Bạch đàn trắng Xác định thành phần hóa học tinh dầu Bạch đàn trắng bằng phương pháp GC – MS E.coli Staphylococcus Đánh giá hoạt lực kháng khuẩn aureus Salmonella Hình 2.2. Sơ đồ các bước tiến hành nguyên cứu thu nhận tinh dầu Bạch đàn trắng bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 41
54. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng Quy trình trích ly tinh dầu Bạch đàn trắng bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước: Nguyên liệu (lá Bạch đàn trắng) Xử lý nguyên liệu Ngâm trong dung dịch nước + NaCl Ly trích bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước Ngưng tụ Phân ly Nước chưng Tinh dầu thô (tinh dầu + nước) Chưng lại lần 2 Làm khan bằng Na2SO4 Tinh dầu Bạch đàn trắng Hình 2.3. Sơ đồ quy trình chưng cất và thu nhận tinh dầu Bạch đàn trắng 42
55. Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình Chuẩn bị nguyên liệu: lá Bạch đàn chọn những lá tươi đạt độ trưởng thành không bị sâu bệnh, đem đi rửa sạch rồi để ráo nước (chú ý không rửa lá quá mạnh và nhiều lần có thể làm vỡ các túi chứa tinh dầu, ảnh hưởng đến kết quả). Sau đó, cân chính xác 200 g (± 0,001 g), cắt nhỏ từng lá rộng khoảng 1 cm (quá trình cắt nhỏ giúp dễ dàng trích ly được tinh dầu trong quá trình chưng cất). Ngâm hỗn hợp: cho tỷ lệ nước/nguyên liệu là 3/1 (v/w) với nồng độ NaCl trong nước ngâm là 5%. Cho tất cả nguyên liệu đã cắt nhỏ và dung dịch nước + NaCl vào bình cầu 1000 ml. Ngâm trong 30 phút sau đó đặt vào hệ thống chưng cất. Hình 2.4. Lá Bạch đàn trắng sau khi cắt nhỏ và chuyển vào bình cầu Chưng cất: lắp đặt hệ thống chưng cất hơi nước và chưng hỗn hợp nguyên liệu đã xử lý trong khoảng từ 30 phút đến 180 phút để lấy tinh dầu bạch đàn trắng ở dạng thô. 43
56. Đồ án tốt nghiệp Ngưng tụ: hỗn hợp nước và tinh dầu thoát ra được đi vào ống sinh hàn của thiết bị chưng cất, dưới tác dụng làm lạnh của nước có trong ống sinh hàn sẽ chuyển hóa hỗn hợp trên từ dạng hơi sang dạng lỏng và sau đó chảy vào bộ phận ngưng tụ của thiết bị. Phân ly: để yên cho hỗn hợp thu được trong bộ phận ngưng tụ đến khi tách hoàn toàn thành 2 pha. Cho lớp tinh dầu trên chảy qua bình lóng (phễu chiết) để thu tinh dầu thô. Hình 2.5. Tinh dầu Bạch đàn trắng và nước đã tách thành 2 pha Làm khan: sau khi tách tinh dầu ra khỏi hỗn hợp nước chưng thì tiếp tục cho khoảng 5 g Na2SO4 khan để làm khan triệt để những hạt nước còn nằm trong lớp tinh dầu. Lấy phần nước chưng còn lẫn ít tinh dầu trữ lại và đem chưng lại để thu tinh dầu triệt để hơn. Thu tinh dầu đã được làm sạch và bảo quản. Tinh dầu bạch đàn trắng là hỗn hợp các hợp chất có chứa liên kết đôi trong phân tử nên rất dễ bị oxy hóa bởi oxy không khí. Vì vậy, quá trình bảo quản tinh dầu phải đựng trong các lọ dung tích khoảng 5 – 10 ml, sẫm màu, được bịt kín bằng nút cao su và cho tinh dầu vào lọ sao cho lượng không khí trong lọ càng ít càng tốt. Tinh dầu bạch đàn trắng được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4oC. 44
57. Đồ án tốt nghiệp Tính toán kết quả và so sánh lượng tinh dầu bạch đàn trắng. Đem tinh dầu đi bảo quản và thử hoạt tính sinh học. Các thông số đề xuất trong quy trình đã được xác định từ quá trình nghiên cứu sơ bộ và tham khảo từ đề tài của Đoàn Ngọc Dũng (2016). Hình 2.6. Bộ dụng cụ chưng cất tinh dầu nhẹ hơn nước Clevenger 2.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng trong quá trình chưng cất Tiến hành khảo sát 6 yếu tố: kích thước nguyên liệu xay nhuyễn và cắt nhỏ, độ tuổi nguyên liệu (lá non, lá bánh tẻ, lá già), thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất và nồng độ muối. Nguyên tắc: cố định 5 yếu tố và thay đổi một yếu tố để chọn được mức tối ưu cho yếu tố đó. Sau đó cố định yếu tố này và tiếp tục thay đổ một yếu tố khác, cứ tiến hành như vậy cho đến khi chọn được 6 mức tối ưu của 6 yếu tố cho quá trình ly trích. 45
58. Đồ án tốt nghiệp a. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (cắt nhỏ và xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Kích thước của nguyên liệu có ảnh hưởng lớn đến thời gian chưng cất và thể tích lượng tinh dầu thu được. Kích thước được khảo sát là lá bạch đàn cắt nhỏ và xay nhuyễn trong 1 phút để tránh thất thoát nhiều tinh dầu dễ bay hơi. Cố định 5 yếu tố: nguyên liệu mẫu: lá già, thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nồng độ muối. Sau đó tiến hành trích ly thu tinh dầu và so sánh để tìm ra được kích thước nguyên liệu tối ưu. Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Khối Thời Lượng Nồng Thời gian lượng Nguyên gian Kích thước nước độ NaCl chưng cất mẫu liệu ngâm (ml) (%) (phút) (g) (phút) 200 Xay nhuyễn Lá già 600 5 30 180 200 Cắt nhỏ Lá già 600 5 30 180 Lá xay nhuyễn Lá cắt nhỏ Hình 2.7. Kích thước nguyên liệu 46
59. Đồ án tốt nghiệp b. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá bánh tẻ, lá già) đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Thành phần và hàm lượng tinh dầu phụ thuộc rất lớn vào tuổi của lá cây. Đến độ tuổi trưởng thành, lá bắt đầu sản xuất ra lượng tinh dầu thích hợp theo từng giai đoạn phát triển. Cố định các yếu tố: thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nồng độ muối, kích thước nguyên liệu đã được xác định tối ưu ở trên và thay đổi 3 loại lá bạch đàn: lá non, lá bánh tẻ, lá già. Sau khi ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu được, từ đó chọn tuổi nguyên liệu tối ưu. Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Khối Thời Lượng Nồng Thời gian lượng Kích Nguyên gian nước độ NaCl chưng cất mẫu thước liệu ngâm (ml) (%) (phút) (g) (phút) 200 Cắt nhỏ Lá non 600 5 30 180 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 5 30 180 200 Cắt nhỏ Lá già 600 5 30 180 Lá non Lá bánh tẻ Lá già Hình 2.8. Lá Bạch đàn trắng sau khi cắt nhỏ và chuyển vào bình cầu 47
60. Đồ án tốt nghiệp c. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Xác định lượng nước bổ sung vào khi ngâm nhằm đánh giá khả năng phân li tinh dầu trong nguyên liệu, đây là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình chưng cất. Vì vậy, việc xác định lượng nước bổ sung cũng quyết định thời gian chưng cất tối ưu của sản phẩm. Lượng nước quá nhiều một số thành phần tinh dầu có tính phân cực sẽ tan vào nước. Nếu lượng nước quá ít thì không đủ hòa tan các chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu, có khi dẫn đến nguyên liệu bị cháy, khét, mất đi tính chất tự nhiên của tinh dầu. Cố định thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, nồng độ muối, nguyên liệu: lá già và cắt nhỏ đã được tối ưu, ta tiến hành thay đổi lượng nước/nguyên liệu theo các tỉ lệ: 2/1; 3/1; 4/1. Ghi lại lượng tinh dầu thu được trong mỗi trường hợp, từ đó xác định được lượng nước chưng cất tối ưu. Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Khối Thời Lượng Nồng Thời gian lượng Kích Nguyên gian nước độ NaCl chưng cất mẫu thước liệu ngâm (ml) (%) (phút) (g) (phút) 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 400 5 30 180 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 5 30 180 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 800 5 30 180 d. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước thành hệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợp chưng cất để tránh thất thoát tinh dầu dưới dạng nhũ, làm giảm độ tan của một số thành phần không phân cực có trong tinh dầu vào nước. Việc 48
61. Đồ án tốt nghiệp thêm muối NaCl vào quá trình chưng cất nhằm mục đích tăng hiệu suất ly trích do NaCl hòa tan trong nước sẽ tạo thành dung dịch điện ly dẫn đến làm tăng nhiệt độ sôi (hay làm tăng áp suất hơi) của nước, giảm sự bay hơi của nước trong hỗn hợp; do đó, tinh dầu ly trích được nhiều hơn. Lượng tinh dầu thu được có thể giảm theo sự tăng nồng độ của muối do khi ở nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngoài chứa tinh dầu co lại, ngăn cản sự thoát tinh dầu ra ngoài. Với 3 mức tối ưu của 3 yếu tố đã chọn và cố định các yếu tố: thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, ta thay đổi nồng độ muối chưng cất như sau: 0% (0 g/500 ml nước cất), 5% (1,25 g/500 ml nước cất), 10% (2,5 g/500 ml nước cất), 15% (5 g/500 ml nước cất). So sánh lượng tinh dầu thu được để tìm ra nồng độ muối tối ưu. Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Khối Thời Lượng Nồng Thời gian lượng Kích Nguyên gian nước độ NaCl chưng cất mẫu thước liệu ngâm (ml) (%) (phút) (g) (phút) 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 0 30 180 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 5 30 180 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 10 30 180 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 15 30 180 e. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong nước muối trước khi chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Thời gian ngâm là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thể tích tinh dầu thu được bởi vì sự thẩm thấu của NaCl và nước hay sự khuếch tán của các cấu tử tinh dầu ra môi trường không thể thực hiện được trong giây lát mà đòi hỏi phải trong một khoảng thời gian nhất định. 49
62. Đồ án tốt nghiệp Thời gian ngâm nguyên liệu với dung dịch NaCl trước khi chưng cất có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu được. Do có thời gian để tạo sự thẩm thấu cho tinh dầu thoát ra môi trường bên ngoài nên khi chưng cất tinh dầu thu được nhiều ngay từ đầu và thể tích tinh dầu thu được tăng đáng kể. Đồng thời muối sẽ làm tăng tỷ trọng của nước phá vỡ hệ nhũ tương tinh dầu – nước và tinh dầu bị hơi nước cuốn đi dễ dàng hơn khi chưng cất. Với các mức tối ưu đã chọn, tiếp tục cố định yếu tố còn lại và thay đổi các mức thời gian ngâm nguyên liệu: 0 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút. So sánh lượng tinh dầu thu được ở những thời gian khác nhau, từ đó chọn mức thời gian để ngâm tối ưu. Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong nước muối trước khi chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Khối Thời Lượng Nồng Thời gian lượng Kích Nguyên gian nước độ NaCl chưng cất mẫu thước liệu ngâm (ml) (%) (phút) (g) (phút) 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 10 0 180 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 10 30 180 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 10 60 180 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 10 120 180 f. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Thời gian chưng cất có vai trò quyết định lượng tinh dầu thu hồi được. Nếu chưng cất trong thời gian quá ngắn thì lượng tinh dầu trích ly chưa hết hoàn toàn hay nó vẫn còn tồn tại trong các tế bào tiết, do vậy sẽ làm giảm thể tích tinh dầu thu được. Ngược lại, khi chưng cất quá thời gian tối ưu thì vừa tốn thời gian, vừa tổn hao năng lượng và nghiêm trọng hơn là chất lượng tinh dầu thu được cũng bị giảm đi đáng kể do nguyên liệu bị cháy khét làm mất mùi thơm tự nhiên. 50
63. Đồ án tốt nghiệp Sau khi tối ưu được 5 yếu tố trên, ta tiến hành khảo sát thời gian chưng cất 30 phút, 60 phút, 120 phút, 180 phút, 240 phút. Sau khi ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu được ở những thời gian khác nhau, từ đó chọn mức thời gian để chưng cất tối ưu. Bảng 2.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Khối Nồng Thời Lượng Thời gian lượng Kích Nguyên độ gian nước chưng cất mẫu thước liệu NaCl ngâm (ml) (phút) (g) (%) (phút) 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 10 60 30 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 10 60 60 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 10 60 120 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 10 60 180 200 Cắt nhỏ Lá bánh tẻ 600 10 60 240 2.3.3. Xác định chỉ số vật lý, hoá học của tinh dầu Bạch đàn trắng 2.3.3.1. Đánh giá cảm quan Phân tích sơ bộ chất lượng của tinh dầu bằng cảm quan phương pháp thực hiện dựa theo tác giả Tôn Long Dày (2013). Nghĩa là nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài như mùi, vị, màu sắc, độ trong suốt, Qua nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài này có thể phán đoán và đánh giá sơ bộ về chất lượng của tinh dầu và mục đích sử dụng tinh dầu. Màu sắc và độ trong suốt: Xác định màu sắc và độ trong suốt của tinh dầu bằng cách cho tinh dầu vào một ống thủy tinh trong suốt không có màu có dung tích 20 ml, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cường độ của màu và độ trong suốt (ví dụ: vàng nhạt, nâu sẫm, ). Nếu tinh dầu còn vẩn đục và không trong suốt chứng tỏ còn tạp chất và nước. Mùi: 51
64. Đồ án tốt nghiệp Mùi là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại tinh dầu có một mùi đặc trưng. Dựa vào mùi có thể biết được chất lượng và mục đích sử dụng của nó. Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy lọc hoặc bôi một ít vào mu bàn tay rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20 – 30 mm, cứ 15 phút ngửi 1 lần trong 1 giờ. Ghi nhận xét về bản chất và cường độ mùi (thơm dịu, hăng, xốc, ). Vị: Vị cũng là một biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại tinh dầu có mùi vị riêng. Để xác định vị, dùng phương pháp nếm, nếm xong ghi nhận xét bản chất (ngọt, đắng, ) và cường độ của vị (dịu, thoảng, ) (Tôn Long Dày, 2013). 2.3.3.2. Xác định chỉ số vật lý a. Định lượng tinh dầu Theo (DĐVN IV) hàm lượng tinh dầu được tính theo công thức: số ml tinh dầu sau chưng cất % tinh dầu = × 100% số gam nguyên liệu tươi b. Tỷ trọng Tỷ trọng của tinh dầu tại 20oC là tỷ số khối lượng tinh dầu ở 20oC trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20oC. Tiến hành đo tỷ trọng tinh dầu theo phương pháp thủ công. Dùng một ống tiêm y tế (loại 1 ml), trên than ống tiêm được vạch một đường làm dấu. Cách xác định: Ban đầu, đem cân ống tiêm không và ghi số liệu lại (m0). Tiếp theo: Hút nước cất đến vạch (lưu ý trong ống tiêm không có bong bóng khí), đem cân và ghi lại số liệu (m1). Rồi xả bỏ nước trong ống tiêm, vẩy cho khô nước. Cuối cùng: Hút tinh dầu khan đến vạch (lưu ý không để cho có bong bóng khí trong ống tiêm) đem cân và ghi lại số liệu (m2). Tỷ trọng (d): 52
65. Đồ án tốt nghiệp Với: mo: khối lượng của ống tiêm không, tính bằng gam (g) m1: khối lượng của ống tiêm và nước cất, tính bằng gam (g) m2: khối lượng của ống tiêm và tinh dầu, tính bằng gam (g) Cứ như thế lặp lại nghiệm thức 3 lần: d(tb) = (d1 + d2 + d3)/3 (TCVN 189:1993) c. Độ hoà tan trong ethanol Pha ethanol 90o, 80o, 70o từ cồn tuyệt đối. Dùng pipette chuẩn hút 1 ml tinh bạch đàn trắng cho vào bình tam giác có nút mài. Từ buret nhỏ dần ethanol vào bình đựng tinh dầu. Sau mỗi lần nhỏ khoảng 0,2 ml vào đậy nút và lắc đều cho đến khi tan hết tinh dầu. Tiếp tục nhỏ ethanol vào và lắc cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất trong suốt, ghi lượng ethanol đã dùng. Lặp lại thao tác 3 lần (TCVN 189:1993). 2.3.3.3. Xác định chỉ số hóa học a. Chỉ số acid (Index Acid) Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hoà các acid tự do trong 1 g tinh dầu. KOH trung hoà các acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng RCOOH + KOH RCOOK + H2O Cách xác định: Cho vào erlen 100ml: 10 ml ethanol, thêm vào 5 giọt dung dịch chỉ thị phenolphthalein. Cho tiếp vào 1 g tinh dầu (chính xác đến 0,005g), lắc đều cho dầu tan hoàn toàn. Tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng dung dịch KOH 0,1 N đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây. Ta thực hiện phép đo 3 lần, ghi lại thể tích dung dịch KOH 0,1 N (VKOH) dùng chuẩn độ, lấy kết quả trung bình. Giữ erlen lại để xác định chỉ số este Chỉ số acid được tính theo công thức 5,61 ⋅ = Trong đó: VKOH: số ml dung dịch KOH 0,1 N dùng chuẩn độ. 5,61: số mg KOH có trong ethanol. 53
66. Đồ án tốt nghiệp m: số g tinh dầu dùng để chuẩn độ. (TCVN 189:1993) b. Chỉ số ester (Index Ester) Chỉ số ester hoá của tinh dầu là số mg KOH cần thiết để trung hoà lượng acid béo nằm ở dạng ester có trong 1 g tinh dầu. Cách xác định: Dùng buret cho 20 ml dung dịch KOH 0,5 N vào erlen để xà phòng hóa có chứa lượng mẫu đã xác định chỉ số acid ở trên lắp ống sinh hàn ngược vào bình đun cách thủy trong 1 giờ đến khi phản ứng xà phòng hóa kết thúc (lúc đó dung dịch trong bình màu hồng, đồng thời xuất hiện tinh thể nhỏ màu vàng nâu). Đồng thời làm một mẫu đối chứng với 20 ml dung dịch KOH 0,5 N trong ethanol và 10ml ethanol 96o, tiến hành trong cùng điều kiện như trên. Đun xong để nguội cho vào 2 erlen mỗi erlen 5 giọt chỉ thị màu phenolphetalein 2%, chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1 N. Hiệu số giữa số ml dung dịch HCl 0,1 N đã dùng trong mẫu đối chứng và số ml dung dịch HCl 0,1 N đã dùng trong mẫu thử là số ml HCl đã dùng để trung hòa lượng KOH dùng cho phản ứng este hóa. ,.( ) Chỉ số ester được tính theo công thức: = Trong đó: V0: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu trắng (ml) V1: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu tinh dầu (ml) m: số g tinh dầu bạch đàn (TCVN 189:1993) c. Chỉ số savon hoá (Index Savon) Chỉ số savon hoá là số mg KOH cần thiết để tác dụng với tất cả các acid tự do và acid kết hợp dưới dạng ester có trong 1 g tinh dầu. Quá trình savon hoá tinh dầu bao gồm: KOH trung hoà các acid tự do: KOH + RCOOH RCOOK + H2O KOH xà phòng hoá các ester: KOH + R1COOK +R2OH 54
67. Đồ án tốt nghiệp Chỉ số savon hoá của tinh dầu bằng tổng số giữa chỉ số ester hoá và chỉ số acid: IS = IE + IA Trong đó: IS: chỉ số savon hoá. IE: chỉ số ester hoá. IA: chỉ số acid hoá. (TCVN 189:1993) 2.3.3.4. Xác định thành phần hoá học của tinh dầu Thành phần hoá học của tinh dầu bạch đàn trắng được xác định bằng phương pháp sắc kí ghép khối phổ GC/MS với các điều kiện như sau: Máy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS:HP6890 Cột mao quản: dài 30 m, đường kính trong 250 m, lớp phim dày 250 m. Nhiệt độ phần bơm mẫu (injector): 250oC Tỷ lệ dòng (splitless) Đầu do khối phổ tứ cụ (MSD) Tốc độ dòng khí mang (He) 0,9 ml/phút, áp suất 6.9 psi Chương trình nhiệt phân tích: bắt đầu ở 60oC, giữ trong 4 phút. Sau đó tăng lên 100oC, với tốc độ tăng 10oC/phút. Tiếp tục tăng đến 280oC với tốc độ tăng 30oC/phút và giữ trong 15 phút (Phùng Thị Ái Hữu, 2012). Phát hiện sự có mặt của các cấu tử có trong tinh dầu Bạch đàn trắng tại Viện Công nghệ Hóa học TP. Hồ Chí Minh (số 01 Mạc Đĩnh Chi, quận 1, TP. Hồ Chí Minh) trên thiết bị sắc ký khí – ghép khối phổ. Việc định danh các thành phần trong tinh dầu được thực hiện bằng cách dùng phần mềm cài đặt sẵn trên máy để so sánh các phổ full-MS và MS/MS của từng cấu tử tách ra trên sắc ký đồ với các phổ chuẩn có trong thư viện phổ. Mức độ phù hợp giữa các chất có trong mẫu nghiên cứu và chất đề nghị được tính bằng đại lượng độ tương thích. Độ tương thích càng cao thì kết quả định danh càng chính xác. Khi phổ khối của một chất phân tích hoàn toàn giống với phổ khối của một chất chuẩn trong thư viện thì độ tương thích là được biểu 55
68. Đồ án tốt nghiệp thị là 1000. Độ tương thích đạt trên 800 được xem là cho kết quả có độ tin cậy cao. 2.3.3.5. Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn Vi khuẩn thuần Tăng sinh Pha loãng Cấy trang Đặt khoanh giấy tẩm tinh dầu và kháng sinh Ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ Đo kích thước vòng kháng khuẩn và chụp ảnh Hình 2.9. Quy trình đánh giá hoạt lực kháng khuẩn của tinh dầu Bạch đàn trắng a. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị tinh dầu nguyên chất của lá Bạch đàn trắng: tinh dầu Bạch đàn trắng. Chuẩn bị 3 loại vi khuẩn: Salmonella, Staphylococcus aureus, E.coli. Chuẩn bị mẫu thuốc kháng sinh để đối chiếu (Gentamicin 10 g). b. Chuẩn bị môi trường Thạch nền: sử dụng môi trường NA, pha NA vào nước cất sau đó hấp khử trùng 121oC, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến khoảng 50oC đến 60oC sau đó đổ vào các đĩa petri đã tiệt trùng. Để nguội sau đó úp ngược đĩa petri lại. 56
69. Đồ án tốt nghiệp Môi trường lỏng: sử dụng môi trường NB, pha 4 g NB vào 500 ml nước cất sau đó chia ra làm 5 lọ để hấp khử trùng 121oC, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng sau đó cấy E. coli vào lọ số (1), S. aureus vào lọ số (2), cấy Salmonella vào lọ số 3, còn lọ số (4) dùng để set máy. Sau đó mang đi lắc. Chuẩn bị 20 ống nước muối sinh lý 0,9% hấp khử trùng 121oC, 1 atm, 15 phút. c. Nguyên tắc Các hợp chất kháng khuẩn có trong tinh dầu sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu tinh dầu có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng đường kính vòng kháng khuẩn (mm). d. Tiến hành Lấy sinh khối vi khuẩn hòa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng (NaCl 0,9%), lắc đều. Lấy que cấy trang đã được khử trùng trang đều huyền dịch vi khuẩn được hoạt hóa và đạt mật độ 106 CFU/ml lên mặt thạch NA cho tới khi khô. Sau đó đặt 3 đĩa kháng sinh đã có tinh dầu bạch đàn trắng (đã pha loãng theo từng nồng độ) và giấy tẩm kháng sinh có đường kính 6 mm, giữ yên trong vòng 1 giờ để tinh dầu và kháng sinh Gentamicin ĐC có thể khuếch tán vào môi trường thạch. Cuối cùng, các đĩa được đem ủ trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả thông qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm). e. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu Đối với thạch: dùng thước đo vòng vô khuẩn (tính bằng mm) và chụp hình. So sánh đường kính vòng vô khuẩn của tinh dầu với kháng sinh. f. Phương pháp tính toán Kết quả đường kính vòng vô khuẩn thu được qua 3 lần thí nghiệm lặp lại tính trung bình. Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết được phân loại dựa theo đường kính vòng vô khuẩn: (Celikel và Kavas, 2008) 57
70. Đồ án tốt nghiệp Đường kính vòng vô khuẩn 20 mm: cực nhạy 2.4. Thống kê và xử lý số liệu Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Xử lý số liệu thu được, vẽ biểu đồ, đồ thị bằng phần mềm Excel 2010® và dữ liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm Statistical Analysis Systems 9.1. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. 58
71. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu ctrong quá trình chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước 3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (cắt nhỏ và xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cố định 5 yếu tố: nguyên liệu mẫu: lá già, tỉ lệ lượng nước/nguyên liệu là 3/1, nồng độ muối 5%, thời gian ngâm nguyên liệu 30 phút, thời gian chưng cất 180 phút. Sau đó tiến hành trích ly thu tinh dầu và so sánh để tìm ra được kích thước nguyên liệu tối ưu. Tiến hành khảo sát kích thước nguyên liệu ở hai kích thước cắt nhỏ và xay nhuyễn trong 1 phút, thu được kết quả như sau: Bảng 3.1. Kết quả ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Hàm lượng Thể tích tinh dầu Kích thước Chất lượng tinh dầu tinh dầu (%) thu được (ml) Trong suốt, vàng đậm, Xay nhuyễn 0,208 0,417b mùi thơm nồng Trong suốt, vàng đậm, Cắt nhỏ 0,358 0,717a mùi thơm nồng (Phụ lục 2) *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. Nhận xét và thảo luận: Sau thời gian khảo sát, trích ly tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước với kích thước nguyên liệu lá cắt nhỏ sẽ cho thể tích tinh dầu thu được là 0,717 ml và hàm lượng tinh dầu tối ưu nhất là: 0,358% cao hơn so với nguyên liệu xay nhuyễn. 59
72. Đồ án tốt nghiệp Kích thước nguyên liệu 0.400 0.358 ) % 0.350 ược ( ược 0.300 0.258 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 Hàm lượng tinh dầu thu đ dầu thu lượng tinh Hàm 0.000 Xay nhuyễn Cắt nhỏ Hình 3.1. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Khi xay nhuyễn, các tế bào chứa tinh dầu bị vỡ, nước dễ thẩm thấu vào các túi dầu, tinh dầu dễ thoát ra môi trường ngoài và hơi nước có nhiệm vụ lôi cuốn tinh dầu tự do ra bình hứng. Chất lượng tinh dầu là như nhau, tinh dầu thu được có màu vàng đậm, trong suốt, có mùi thơm nồng. Tuy nhiên, vì điều kiện phòng thí nghiệm chỉ sử dụng máy xay thông thường nên trong quá trình xay nhuyễn, máy sinh nhiệt và làm bay hơi một lượng tinh dầu đáng kể nên hàm lượng tinh dầu thu được cuối cùng còn rất ít. Hiện nay, chưa có kết quả khảo sát về kích thước nguyên liệu khi trích ly tinh dầu Bạch đàn trắng. Tuy nhiên, theo đề tài khảo sát của tác giả Đoàn Ngọc Dũng (2016) đã tiến hành Nghiên cứu chiết xuất tinh dầu lá Bạch đàn bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước tại Bà Rịa - Vũng Tàu đã sử dụng nguyên liệu cắt nhỏ cho kết quả cao. Từ đó, cho thấy việc cắt nhỏ nguyên liệu lá Bạch đàn trắng sẽ cho hàm lượng tinh dầu thu được cao hơn so với khi xay nhuyễn. 60
73. Đồ án tốt nghiệp 3.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá bánh tẻ, lá già) đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cố định các yếu tố: tỉ lệ lượng nước/nguyên liệu là 3/1, nồng độ muối 5%, thời gian ngâm nguyên liệu 30 phút, thời gian chưng cất 180 phút, kích thước nguyên liệu cắt nhỏ đã được xác định tối ưu và thay đổi 3 loại lá bạch đàn: lá non, lá bánh tẻ, lá già. Sau khi ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu được, từ đó chọn tuổi nguyên liệu tối ưu. Bảng 3.2. Kết quả ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Tuổi Hàm lượng Thể tích tinh dầu Chất lượng tinh dầu nguyên liệu tinh dầu (%) thu được (ml) Vẩn đục, vàng nhạt, mùi Lá non 0,658 1,317b hơi lạ Trong suốt, vàng sáng, Lá bánh tẻ 0,792 1,583a mùi thơm nồng Trong suốt, vàng đậm, Lá già 0,358 0,717c mùi thơm nồng (Phụ lục 2) *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. Nhận xét và thảo luận: Từ bảng kết quả 3.2., cho thấy nguyên liệu Bạch đàn trắng lá bánh tẻ thu được lượng tinh dầu cao hơn so với các loại lá khác. Lá bạch đàn bánh tẻ sau khi chưng cất tinh dầu thu được 1,583 ml (hàm lượng tinh dầu là 0,792%), tuy hàm lượng tinh dầu trong lá non (0,658%) khá cao nhưng chất lượng tinh dầu thu được không tốt, ngược lại chất lượng tinh dầu trong lá già tốt nhưng hàm lượng (0,358%) rất ít. 61