Đồ án Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng xử lý nitrate trong nước thải công nghiệp

pdf 63 trang thiennha21 12/04/2022 90
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng xử lý nitrate trong nước thải công nghiệp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_phan_lap_chung_vi_khuan_co_kha_nang_xu_ly_nitrate_tron.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng xử lý nitrate trong nước thải công nghiệp

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN CĨ KHẢ NĂNG XỬ LÝ NITRATE TRONG NƯỚC THẢI CƠNG NGHIỆP Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC . Giáo viên hướng dẫn : Th.S Phạm Minh Nhựt. Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Trang MSSV: Lớp: 08DSH4 TP. Hồ Chí Minh, 2012
  2. MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 9 1. Đặt vấn đề 9 2. Mục tiêu nghiên cứu 10 3. Nội dung nghiên cứu 10 4. Tính cấp thiết nghiên cứu 10 5. Phạm vi nghiên cứu 11 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 12 1.1.Tổng quan về nitrate trong nƣớc thải và ảnh hƣởng của chúng 12 1.1.1.Qúa trình hình thành nitrate tổng quá [4] 12 1.1.1.1 Chu trình nitơ trong ao hồ 13 1.1.1.2 Quá trình amon hĩa 13 1.1.1.3 Quá trình nitrate hĩa 14 1.1.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nitrate hĩa[24] 15 1.1.2.1 Nhiệt độ 15 1.1.2.2 pH 15 1.1.1.3 Vi sinh vật 16 1.1.3.Ảnh hƣởng của nitrate đến sức khỏe con ngƣời[] 16 1.1.4. Ảnh hƣởng của nitrate đến các sinh vật thủy sinh[24] 17 i
  3. 1.1.5. Nguyên nhân cĩ mặt nitrate trong nguồn nƣớc ngầm, nƣớc mặt, nƣớc cấp[2] 19 1.2. Các phƣơng pháp loại bỏ nitrate trong mơi trƣờng 19 1.2.1 Phƣơng pháp trao đổi ion 19 1.2.2 Lọc thẩm thấu ngƣợc 20 1.2.3 Phƣơng pháp sinh học 21 1.3 Vai trị của các chủng vi khuẩn trong quá trình xử lý nitrate 21 1.4 Tổng quan về vi khuẩn 23 1.4.1 Thiobacillus denitrificans[11] 23 1.4.1.1 Phân loại. 23 1.4.1.2 Đặc điểm. 24 1.4.1.3 Cơ chế loại bỏ nitrate của T.denitrificans 25 1.4.1.4 Ứng dụng. 26 1.4.2 Pseudomonas stutzeri 26 1.4.2.1 Nguồn gốc[19] 26 1.4.2.2 Phân loại 27 1.4.2.3 Đặc điểm sinh lý và điều kiện sống[12] 27 1.4.2.4 Đặc điểm chung[22,23] 28 1.4.2.5 Đặc điểm hình thái và cấu trúc khuẩn lạc.[14] 29 1.4.2.6 Hoạt tính sinh học 31 1.4.2.7 Cơ chế khử của P. Stutzeri[18] 32 1.4.2.8 Ứng dụng2[1, 2] 33 1.4.3 Paracoccus denitrificans 33 1.4.3.1 Nguồn gốc[5] 33 ii
  4. 1.4.3.2 Phân loại 33 1.4.3.3 Đặc điểm sinh học. 34 1.4.3.4 Ứng dụng. 35 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Thời gian và địa điểm 37 2.1.1 Thời gian 37 2.1.2 Địa điểm 37 2.1.2.1 Địa điểm lấy mẫu 37 2.1.2.2 Địa điểm thực hiện thí nghiệm 37 2.2 Dụng cụ và hĩa chất 37 2.2.1 Dụng cụ 37 2.2.2 Hĩa chất 37 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 38 2.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 38 2.3.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nitrate trong mẫu 38 2.3.3. Phƣơng pháp xác định hàm nitrite trong mẫu 39 2.3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 40 2.4. Bố trí thí nghiệm 40 2.4.1. Phân lập vi khuẩn cĩ khả năng xử lý nitrate 40 2.4.1.1 Quy trình phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân hủy nitrate 40 2.4.1.2 Sàng lọc khả năng loại bỏ nitrate đối với các chủng vi khuẩn 41 2.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình xử lý nitrate của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc. 41 iii
  5. 2.4.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình loại bỏ nitrate 42 2.4.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ nitrate đến quá trình loại bỏ nitrate 42 2.4.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng loại bỏ nitrate 42 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 44 3.1.Kết quả phân lập vi khuẩn cĩ khả năng phân hủy nitrate 44 3.1.1. Kết quả định tính các mẫu chứa vi khuẩn xử lý nitrate trên mơi trƣờng Giltay 44 3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn xử lý nitrate từ mẫu đất 45 3.2 Kết quả xác định đặc điểm hình thái 45 3.3. Kết quả sàng lọc khả năng phản nitrate, và khả năng sinh nitrite của các chủng vi khuẩn 47 3.3.1. Kết quả xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn sau 168 giờ 47 3.3.2. Tốc độ xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát 48 3.3.3. Kết quả sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn sau 168h 49 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình loại bỏ nitrate và khả năng sinh nitrite (Foglar và ctv, 2004) 50 3.4.1. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình xử lý nitrate 50 3.4.2. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến sự sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate 51 3.5.Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ nitrate đến quá trình loại bỏ nitrate (Foglar và ctv, 2004; Reazee và ctv, 2010; Liang và ctv, 2011) 52 iv
  6. 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng loại bỏ nitrate (Rwazee và ctv, 2010; Liang và ctv, 2011). 53 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 4.1. Kết luận 56 4.2. Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 60 v
  7. DANH MỤC HÌNH Hình1.1: Chu trình nitơ trong hồ 11 Hình1.2: Các con sơng bị phú dƣỡng hĩa, nhiễm nitrate 16 Hình 1.3: Khuẩn lạc P. stutzeri cĩ nếp nhăn, màu hơi đỏ nâu, khơ và dính chặt với nhau .21 Hình 1.4: Tế bào vi khuẩn T.denitrificans cĩ dạng hình que ngắn 22 Hình 3.1: Kết quả xử lý nitrate sau 168 giờ của 5 chủng vi khuẩn 301, 302, 303, 303, 304, 305 . 38 Hình 3.2 : Tốc độ xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát 39 Hình 3.3: Kết quả sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn sau 168h 40 Hình 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến sự sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate 41 Hình 3.5: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến sự sinh nitrite quá trình xử lý nitrate 43 Hình 3.6: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ nitrate 200mg/l, 400mg/l, 600mg/l, 800mg/l lên quá trình loại bỏ nitrate . .44 Hình 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng loại bỏ nitrate . 45 vi
  8. DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Kết quả định tính các mẫu chứa vi khuẩn xử lý nitrate trên mơi trƣờng Giltay 43 Bảng 3.2: kết quả hình thái khuẩn lạc của 5 chủng phân lập trên mơi trƣờng DM .44 Bảng 3.3: Bảng kết quả sát định đặc điểm của 5 chủng vi khuẩn 301, 302, 303, 304, 305 .45 vii
  9. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DM : Denitrification medium LB : Lysogeny broth PDA : Diphenyl sulfur acid ETDA : Ethylenediaminetetraacetic acid viii
  10. MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Căn cứ vào Luật Mơi Trƣờng do Quốc hội khĩa IX kỳ họp thứ tƣ (từ ngày 6 đến ngày 30 tháng 12 năm 1993) thơng qua thì “ Mơi trƣờng bao gồm các yếu tố tự nhiên và yếu tố vật chất nhân tạo quan hệ mật thiết với nhau bao quanh con ngƣời, cĩ ảnh hƣởng tới dời sống, sản xuất, sự tồn tại, phát triển của con ngƣời và thiên nhiên”. Bảo vệ mơi trƣờng đƣợc quy định là “ Những hoạt động giữ cho mơi trƣờng trong lành, sạch đẹp, cải thiện mơi trƣờng, đảm bảo cân bằng sinh thái, ngăn chặn, khắc phục các hậu quả xấu do con ngƣời và thiên nhiên gây ra cho mơi trƣờng, khai thác, sử dụng hợp lý và tiết kiệm tài nguyên thiên nhiên”. Một số nƣớc nhƣ Trung Quốc gọi mơi trƣờng là hồn cảnh sống, đĩ là từ chính xác để chỉ điều kiện sống của cá thể hoặc quần thể vi sinh vật Sinh vật và con ngƣời khơng thể sống tách rời khỏi mơi trƣờng của mình cho nên cũng cĩ thể nĩi mơi trƣờng tự nhiên là cái nơi sinh thành của con ngƣời. Trong các loại mơi trƣờng từ mơi trƣờng nƣớc, mơi trƣờng khơng khí và mơi trƣờng đất là những mơi trƣờng rất quan trọng trong cuộc sống của mỗi lồi sinh vật sống trên Trái Đất. Và mơi trƣờng chúng tơi quan tâm ở đây là mơi trƣờng nƣớc. Ở nƣớc ta, ơ nhiễm nguồn nƣớc chủ yếu ở các khu vực đơ thị, các khu cơng nghiệp và các bến cảng lớn. Theo các số liệu đã phân tích trên đây, chúng ta thấy cĩ thể nêu lên một số nhận xét chung về tình hình ơ nhiễm mơi trƣờng nƣớc của chúng ta nhƣ sau: Đất nƣớc sau giải phĩng: nƣớc ta đã giành khá nhiều tập trung cho việc hàn gắn những vết thƣơng chiến tranh, tốc độ phát triển cơng nghiệp chƣa cao. Vì vậy, tổng lƣợng chất thải độc hại dƣới dạng rắn, lỏng chƣa phải đã nhiều so với các nƣớc đang phát triển, tuy cĩ nơi cĩ lúc cũng đã thể hiện mức độ nghiêm trọng của nĩ. Nguyên nhân dẫn đến ơ nhiễm phần lớn các nhà máy xí nghiệp chƣa cĩ hệ thống xử lý trƣớc khi đổ vào hệ thống nƣớc thải của thành phố. Nếu cĩ hệ thống xử lý nƣớc thải đi chăng nữa cũng chỉ mới bƣớc đầu nghiên cứu, thử nghiệm nên hiệu quả chƣa 9
  11. cao. Hoặc cĩ nơi tuy đã trang bị những hệ thống xử lý nƣớc thải nhƣng khơng chịu vận hành vì sợ tốn kém Hiện nay, Việt Nam đang trong cơng cuộc xây dựng kiến thiết đất nƣớc theo hƣớng cơng nghiệp hĩa, hiện đại hĩa với sự phát triển dân số và tốc độ đơ thị hĩa cao. Xử lý sinh học bằng các chủng vi sinh vật với ƣu điểm là phù hợp điều kiện tự nhiên, giảm chi phí năng lƣợng, hĩa chất, đơn giản, cĩ khả năng tận dụng các sản phẩm phụ sau xử lý đang là phƣơng pháp cĩ tiềm năng. Trong đĩ hoạt động của các vi sinh vật giữ vai trị rất quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả xử lý của tồn bộ hệ thống.Trong nƣớc thải cơng nghiệp cĩ chứa hàm lƣợng nitrate cao cĩ chứa các vi sinh vật cĩ khả năng phân hủy nitrate. Các chủng vi sinh vật này cĩ nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn này đƣợc chúng tơi tiến hành trong đề tài: “ Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cĩ khả năng xử lý nitrate trong nƣớc thải cơng nghiệp”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn và đánh giá khả năng xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn cĩ khả năng phân hủy nitrate. 3. Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn và phân lập các chủng vi khuẩn cĩ khả năng phân giải nitrate, nitrite của các chủng vi khuẩn. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc. 4. Tính cấp thiết nghiên cứu Hiện nay, việc loại bỏ các chất đạm từ cơng nghiệp và chất thải trong nƣớc đã đƣợc nhận nhiều sự quan tâm do cĩ nhiều hiện tƣợng phú dƣỡng hĩa từ trong nƣớc. Đã cĩ nhiều phƣơng pháp xử lý để loại bỏ nitơ đƣợc xử dụng bằng phƣơng pháp sinh học, hĩa học, các yếu tố vật lý. Gần đây nitơ đƣợc loại bỏ bằng phƣơng pháp sinh học đã đƣợc tìm thấy và áp dụng rộng rãi, do cách tiếp cận xử lý nƣớc thải từ các vi sinh vật trở nên dễ dàng và dễ thực hiện, sử dụng hiệu quả, chi phí tiết kiệm. 10
  12. Các quá trình sinh học phổ biến nhất bao gồm nitrate hĩa, oxi hĩa ammonium, nitrite thành nitrate. Sinh vật tự dƣỡng trong điều kiện hiếu khí, kỵ khí và khử nitơ chuyển đổi nitrite và nitrate thành nitơ . Vì vậy nĩ bao gồm các bƣớc chuyển hĩa khá đặc biệt, bao gồm hiếu khí và kỵ khí đƣợc chuẩn bị. Trong những năm qua, một số nhĩm di dƣỡng nitrate các vi khuẩn nhƣ Paracoccus,Thiosphaera pantotropha,Cammamonas sp. và Alcaligences faecalis đƣợc báo cáo là cĩ quá trình nitrate hĩa dị dƣỡng và khả năng khử nitơ hiếu khí. Nhƣ vậy chúng cĩ thể đƣợc xử dụng để khắc phục các vấn đề khĩ khăn trong hệ thống nƣớc thải nhƣ làm giảm các chi phí cĩ liên quan với tình trạng thiếu oxi trong các bể chứa hoặc làm giảm kích thƣớc của bể chứa khi cần thiết. Khả năng khử yếm khí trong điều kiện bầu khơng khí cĩ oxi cao đã đƣợc chứng minh. Vì thế em thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn xử lý nitrate từ nước thải và xác định khả năng loại bỏ nitrate của chúng trong điều kiện hiếu khí”. 5. Phạm vi nghiên cứu Thời gian nghiên cứu hạn chế nên chỉ cĩ thể phân lập đƣợc các chủng vi khuẩn cĩ khả năng xử lý nitrate, nitrite tốt. Đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng phân hủy một cách tốt hơn. 11
  13. CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan về nitrate trong nƣớc thải và ảnh hƣởng của chúng - Nitrate (NO3 ) đƣợc tạo thành tự nhiên từ nitơ trong lịng đất. Nitơ là một loại khí chiếm tới gần 80% bầu khí quyển và rất cần thiết cho sự sống. Rễ cây hấp thụ càng nhiều nitơ thì năng suất của mùa màng càng cao. Quá trình hình thành nitrate là một giai đoạn khơng thể thiếu trong vịng tuần hồn của nitơ trong tự nhiên. Thực phẩm và đồ uống cĩ chứa một hàm lƣợng nitrate thấp thì khơng cĩ hại cho sức khỏe. Cây cối hấp thụ nitrate trong đất để lấy dƣỡng chất và cĩ thể sẽ tạo một dƣ lƣợng nhỏ trong lá và quả. Do tính cơ động cao, nitrate dễ dàng thấm vào nguồn nƣớc ngầm. Nếu con ngƣời và súc vật uống phải nƣớc cĩ nhiều nitrate sẽ dễ bị mắc các chứng bệnh về máu, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ. Nitrate hình thành khi vi sinh vật chuyển hĩa phân bĩn, phân hủy xác động thực vật. Nếu cây cối khơng kịp hấp thụ hết lƣợng nitrate này thì nƣớc mƣa và nƣớc tƣới sẽ làm cho nĩ ngấm vào lịng đất, làm ơ nhiễm nguồn nƣớc ngầm. Rất tiếc là con ngƣời lại chính là thủ phạm tạo ra nguồn ơ nhiễm nitrate lớn nhất thơng qua các hoạt động nơng nghiệp.[1,3] 1.1.1.Qúa trình hình thành nitrate tổng quá [4] 12
  14. Hình 1.1 : Chu trình nitơ trong ao hồ 1.1.1.1 Chu trình nitơ trong ao hồ Chu trình nitơ là một trong những mơ hình tuần hồn vơ hình và quan trọng nhất đối với mơi trƣờng thủy sinh. Tơm cá và các động vật thủy sinh trong quá trình sinh sống chúng bài tiết ra NH3, nếu ở nồng độ cao NH3 sẽ gây độc. Chu trình nitơ, trong đĩ cĩ quá trình amơn hĩa và quá trình nitrate hĩa diễn ra nhờ vào hoạt động của các vi khuẩn cĩ ích giúp chuyển hĩa các chất độc thành những chất cĩ ích cho đời sống của thực vật thủy sinh và giúp các động vật thủy sinh khơng bị độc từ chất thải do chúng bài tiết ra. 1.1.1.2 Quá trình amon hĩa Amơn hĩa là quá trình phân hủy và chuyển hố các hợp chất hữu cơ phức tạp thành NH3 dƣới tác dụng cuả vi sinh vật. Dƣới tác dụng của enzyme phân hủy protein (enzyme proteolytic, thƣờng gọi là enzym protease) làm chất xúc tác sẽ 13
  15. phân hủy protein thành các chất đơn giản hơn, các chất này tiếp tục đƣợc phân giải thành acid amin nhờ tác dụng của enzyme peptidase ngoại bào. Một phần nhỏ acid amin sẽ đƣợc vi sinh vật sử dụng để tổng hợp thành protein của chúng (protein xây dựng cấu trúc cơ thể của vi sinh vật), phần cịn lại đƣợc tiếp tục phân giải tạo ra 2- NH3, CO2, SO4 (nếu các acid amin cĩ chứa S) và các sản phẩm trung gian khác. + Trong nƣớc, NH3 sẽ đƣợc chuyển hĩa thành NH4 theo phản ứng sau: + - NH3 + H2O NH4 + OH (1) 1.1.1.3 Quá trình nitrate hĩa + Dƣới tác dụng của một số vi sinh sinh thì NH4 đƣợc hình thành từ quá trình - - amơn hĩa sẽ đƣợc tiếp tục chuyển hĩa thành NO2 (nitrite) rồi thành NO3 (nitrate). + - Trƣớc hết NH4 đƣợc chuyển hĩa thành NO2 bởi vi khuẩn Nitrosomonas, sau đĩ vi - - khuẩn Nitrobacter sử dụng men nitrite oxidase để chuyển hĩa NO2 thành NO3 . - NO3 cĩ thể đƣợc các thực vật thủy sinh sử dụng nhƣ là một nguồn dinh dƣỡng hoặc cĩ thể bị chuyển hĩa tiếp thành khí nitơ (N2) qua hoạt động của các vi khuẩn yếm + khí nhƣ Pseudomonas. Các quá trình chuyển hĩa NH4 đều cần sự tham gia của oxy và độ kiềm của nƣớc. Quá trình nitrate hĩa gồm 2 giai đoạn đƣợc thực hiện bởi hai nhĩm vi khuẩn nối tiếp nhau. Hai giống vi khuẩn này cĩ mối quan hệ mật thiết với nhau. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên; mơi trƣờng đất, nƣớc. Mơi trƣờng thích hợp cho cả 2 loại này phải cĩ pH>6 (tối ƣu ở pH=7-8). + - Giai đoạn nitrit hĩa :Chuyển hĩa NH4 thành NO2 (2) bởi nhĩm vi khuẩn nitrite hĩa. + + NH4 + 1,5 O2 NO2+ 2H + H2O (2) Vi khuẩn tham gia mạnh nhất trong quá trình nitrite hĩa là vi khuẩn hĩa vơ cơ tự + - dƣỡng, là lồi vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Khi chúng chuyển hĩa NH4 thành NO2 sẽ sinh ra năng lƣợng, năng lƣợng này sẽ đƣợc các vi khuẩn nitrite hĩa sử dụng cho hoạt động sống của mình. Sự cĩ mặt của các nhĩm vi khuẩn nitrite hĩa giúp loại bỏ + + đƣợc NH4 , khi hàm lƣợng NH4 trong nƣớc giảm phƣơng trình phản ứng (1) sẽ dịch chuyển theo chiều thuận dẫn đến làm giảm hàm lƣợng NH3 trong nƣớc, làm giảm khả năng gây độc của NH3 đối với tơm cá. 14
  16. Trong tự nhiên vi khuẩn nitrite hĩa hiện diện rất nhiều: Nitrosococcuseanus, Nitrosococcus (thuộc phân lớp γ- proteobacteria), Nitrosomonas sp và Nitrosopira sp (thuộc phân lớp β- proteobacteria), Nitrosocystis, Nitrosolobus. Tất cả các vi sinh vật này đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hố nhƣng khác nhau khác nhau về đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào. Tất cả đều thuộc loại tự dƣỡng bắt buộc, khơng cĩ khả năng sống trên mơi trƣờng thạch. - - Giai đoạn nitrat hĩa : Chuyển NO2 thành NO3 (3) bởi nhĩm vi khuẩn nitrate hĩa. NO2 + 0,5 O2 > NO3 (3) Sau quá trình nitrite hĩa thì các vi khuẩn thuộc nhĩm nitrate hĩa sẽ thực hiện giai - - đoạn tiếp theo, chuyển hố NO2 thành NO3 (là sản phẩm cuối cuả quá trình nitrat hĩa). Các vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hĩa cũng là vi khuẩn hĩa vơ cơ tự dƣỡng, vi khuẩn nitrate hĩa thƣờng gặp (gồm cĩ 3 chi khác nhau): Nitrobacter vinogradskii, Nitrobacter agilis ( thuộc phân lớp α-Proteobacteria), Nitrospina gracili , Nitrococcus mobilis (thuộc phân lớp β–Proteobacteria). Quá trình nitrate hĩa chỉ xảy ra trong điều kiện trong nƣớc cĩ đầy đủ oxy lúc đĩ - thì nồng độ của NO2 khơng vƣợt quá 0,5 mg/L, nhƣng khi trong nƣớc thiếu oxy thì - NO2 sẽ tồn tại nhiều và gây độc cho tơm. Trong một số nghiên cứu thì quá trình nitrate hĩa trong hồ các ao hồ nuơi thủy sản xảy ra khơng mạnh do vi sinh vật phát triển chậm, khả năng nitrate hĩa khoảng 25–50g/m3/ngày. 1.1.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hĩa[24] 1.1.2.1 Nhiệt độ Nhiệt độ cũng cĩ ảnh hƣởng lớn đến hoạt động của nhĩm vi sinh vật nitrate hĩa này. Ở nhiệt độ thấp hơn 5 °C và cao hơn 40 °C vi khuẩn hoạt động rất chậm nên sự chuyển biến đạm NH4 thành đạm NO3 cũng rất chậm. Nhiệt độ tối hảo cho hoạt động của nhĩm vi khuẩn này nằm trong khoảng 30 °C. Điều này giải thích đƣợc hiện tƣợng nitrate hĩa xảy ra rất kém vào mùa đơng và mùa hè, và xảy ra rất mạnh vào mùa xuân và mùa thu ở vùng ơn đới. 1.1.2.2 pH 15
  17. Yếu tố quan trọng nữa cĩ ảnh hƣởng đến hoạt động của vi khuẩn nitrite hĩa và nitrate hĩa là pH của đất. pH thích hợp cho hoạt động của vi khuẩn này thƣờng trên 6. Sự thích hợp với các mức độ pH khác nhau cịn tùy thuộc vào lồi và chủng vi khuẩn. Ở một số nơi, mức độ nitrate hĩa giảm đi khi pH thấp hơn 6, rất thấp ở pH=5, và ngừng hẳn ở pH=4 hoặc thấp hơn. Ở cuộc đất khác, nitrate hĩa xảy ra đƣợc ở pH=4,5, nhƣng ở nơi khác nữa vi khuẩn khơng hoạt động đƣợc ở pH này. Các vi khuẩn nitrate hĩa sống trong đất chua, cĩ mức pH tối ƣu 6,5, cịn vi khuẩn ở nơi đất kiềm tính cĩ mức pH tối hảo ở 7,8. Ngồi ảnh hƣởng hoạt động của vi khuẩn, pH cịn ảnh hƣởng đến mật số các vi khuẩn này. Mật số vi khuẩn nitrate hĩa tăng dần theo mức độ tăng pH từ chua sang kiềm tính. Do ảnh hƣởng này, việc bĩn vơi cho đất chua sẽ làm gia tăng tốc độ nitrate hĩa các đạm ammonium trong đất. 1.1.1.3 Vi sinh vật Cĩ 2 nhĩm vi sinh vật tham gia 2 giai đoạn của quá trình này. Trong đĩ cĩ 7 nhĩm vi khuẩn tự dƣỡng: + - Nhĩm vi khuẩn ơxít hố NH4 thành NO2 : nhĩm này do 5 chi vi khuẩn đảm nhiệm: Vi khuẩn hình (que) bầu dục: Nitrosomonas. Vi khuẩn hình cầu: Nitrosococcus. Vi khuẩn xoắn: Nitrosospira. Vi khuẩn cĩ khuẩn lạc nhầy nhụa (zoogloae) và cĩ nang (cyst): Nitrosococystis. Vi khẩn cĩ khuẩn lạc nhầy nhụa, khơng cĩ nang: Nitrosogcola. Nhĩm vi khuẩn ơxít hố nitrite thành nitrate Vi khuẩn khơng cĩ zoogloea: Nitrobacter. Vi khuẩn cĩ zoogloea: Nitrocystis. Trong bảy chi vi khuẩn trên đây, Nitrosomonas và Nitrobacter là thƣờng gặp nhất. Ngồi các vi khuẩn trên, các vi sinh vật dị dƣỡng nhƣ Streptomyces, Pseudomonas, Aspergillus,Paracoccus, Thiosphaera pantotropha,Commamonas sp. và Alcaligences faecalis cũng cĩ tham gia quá trình chuyển hĩa N này. 1.1.3.Ảnh hưởng của nitrate đến sức khỏe con người[] 16
  18. Hàm lƣợng nitrate trong nƣớc cao cĩ thể gây ra các bệnh về hồng cầu, dễ thấy nhất là bênh xanh da ở trẻ nhỏ. Dịch axid trong dạ dày trẻ nhỏ khơng đủ mạnh nhƣ của ngƣời trƣởng thành. Do đĩ, các loại khuẩn đƣờng ruột dễ dàng chuyển hĩa - nitrate thành nitrite (NO2 ). Tuyệt đối khơng cho trẻ nhỏ uống nƣớc hoặc ăn các loại - thực phẩm cĩ lƣợng nitrate vƣợt quá 10 mg/l NO3 -N. Khi Nitrite hấp thụ vào máu, các hemoglobin (phƣơng tiện chuyên chở ơ xy trong máu) sẽ bị biến thành methemoglobin. Methemoglobin sẽ mất hoặc suy giảm chức năng vận chuyển ơ xy, gây ra hiện tƣợng các tế bào (nhất là ở não) khơng đủ ơ xy để hoạt động. Khác với ngƣời lớn, trong cơ thể trẻ em, Methemoglobin khơng thể chuyển hĩa ngƣợc thành hemoglobin, khi não khơng đủ ơxy rất dễ dẫn đến tử vong. Một ngƣời trƣởng thành khỏe mạnh cĩ thể chịu đƣợc một lƣợng Nitrate tƣơng đối lớn mà khơng bị ảnh hƣởng đến sức khỏe. Trên thực tế, phần lớn lƣợng nitrate xâm nhập cơ thể qua thực phẩm, cụ thể là các loại rau củ. Tuy nhiên, lƣợng nitrate này sẽ bị thải theo nƣớc tiểu. Thế nhƣng, nếu liên tục phải hấp thụ nitrate cĩ thể sẽ dẫn đến mắc phải một số bệnh do sự hình thành của các nitrosamines. N- nitrosamine là những tác nhân gây ung thƣ khi thí nghiệm trên động vật. Hiện chƣa cĩ các thí nghiệm trên cơ thể ngƣời để chứng tỏ nitrate cĩ thể gây ung thƣ hay khơng. 1.1.4. Ảnh hưởng của nitrate đến các sinh vật thủy sinh[24] Khơng giống nhƣ nhiệt độ và oxy hịa tan, sự hiện diện của nitrat thƣờng khơng cĩ ảnh hƣởng trực tiếp cơn trùng thủy sinh hoặc cá. Tuy nhiên, mức độ dƣ thừa nitrat trong nƣớc cĩ thể tạo ra các điều kiện mà làm cho nĩ khĩ khăn cho cơn trùng thủy sinh hoặc cá để tồn tại. Tảo và thực vật khác sử dụng nitrat nhƣ là một nguồn thực phẩm. Nếu tảo cĩ một nguồn khơng giới hạn của nitrate, tăng trƣởng của chúng là vơ hạn. 17
  19. Hình 1.2: Các con sơng bị phú dƣỡng hĩa, và nhiễm nitrate Các sơng bên phải là màu xanh nhƣ súp đậu, một kết quả của nồng độ cao của tảo.Một lƣợng lớn tảo cĩ thể gây ra biến động cực đoan trong oxy hịa tan. Quang hợp của tảo và thực vật khác cĩ thể tạo ra oxy trong ngày. Tuy nhiên, vào ban đêm, oxy hịa tan cĩ thể làm giảm đến mức rất thấp nhƣ là một kết quả của số lƣợng lớn các vi khuẩn oxy tiêu thụ ăn tảo chết hoặc đang phân hủy và thực vật khác. Trong hệ thống nƣớc ngọt hoặc cửa sơng, nitrate cĩ thể đạt đến mức độ cao cĩ khả năng cĩ thể gây ra cái chết của cá. Trong khi nitrate là ít độc hại hơn so với ammonia, nitrite, mức độ trên 30 ppm nitrate cĩ thể ức chế sự phát triển, làm giảm hệ thống miễn dịch và gây ra căng thẳng ở một số lồi thủy sản. Tuy nhiên, thí nghiệm độc tính cấp tính nitrate, mức độ nhiễm độc nitrat là chủ đề của cuộc tranh luận gần đây. Trong hầu hết các trƣờng hợp nồng độ nitrate dƣ thừa trong hệ thống thuỷ sản, các nguồn chính là bề mặt dịng chảy từ khu vực nơng nghiệp,đã nhận đƣợc phân bĩn lƣợng nitrate vƣợt quá. Điều này đƣợc gọi là hiện tƣợng phú dƣỡng và cĩ thể dẫn đến tảo nở hoa. Cũng nhƣ dẫn đến nƣớcbị ơ nhiễm trầm trọng và trở thànhvùng chết , những bơng hoa này cĩ thể gây ra những thay đổi khác để chức năng hệ sinh thái, gây ra mất cân bằng hệ sinh thái. Kết quả là, nhƣ nitrate tạo thành một thành phần của tổng chất rắn hịa tan , chúng đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ là một chỉ số về chất lƣợng nƣớc . 18
  20. 1.1.5. Nguyên nhân cĩ mặt nitrate trong nguồn nước ngầm, nước mặt, nước cấp[2] Nguyên nhân chủ yếu là do sử dụng phân bĩn đặc biệt là phân đạm, lƣợng nƣớc thải chứa hàm lƣợng chất hữu cơ cao từ nhà máy chế biến thực phẩm. Nhƣng nitrate trong nƣớc từ sản xuất nơng nghiệp chiếm tỷ lệ lớn nhất. Nguồn nƣớc này thấm vào sâu trong lịng đất, nồng độ nitrate trong nguồn nƣớc ngầm tăng đều và rõ ở những đất canh tác. Nƣớc mặt bị nhiễm nirate là do quá trình rửa trơi bề mặt hay từ lớp đất đá mà nƣớc chảy qua hay ơ nhiễm nguồn nƣớc ngầm trong mùa khơ (nƣớc ngầm cung cấp nƣớc cho sơng hồ vào mùa khơ ). Nƣớc cấp đƣợc lấy từ sơng hồ rồi mới đem xử lý. Dù hạn chế đến mức tối đa nồng độ nitrate nhƣng cũng khơng tránh khỏi cịn một lƣợng nhỏ. 1.2. Các phƣơng pháp loại bỏ nitrate trong mơi trƣờng Nitrate/nitrite trong nguồn nƣớc cĩ thể bị loại bỏ bằng nhiều phƣơng pháp, tùy theo hàm lƣợng, ứng dụng và quy mơ: chƣng cất, trao đổi ion, lọc thẩm thấu ngƣợc, phƣơng pháp sinh học. 1.2.1 Phương pháp trao đổi ion Trao đổi ion là quá trình hấp thụ các ion trong dung dịch lên lớp vật liệu trao đổi và thay thế bằng những ion của lớp vật liệu trao đổi hịa tan vào dung dịch ấy. Để khử ion nitrat trong nƣớc, khi sử dụng phƣơng pháp trao đổi ion chất lƣợng nƣớc sau xử lý sẽ đạt đƣợc độ an tồn cao. Ion nitrat sẽ đƣợc trao đổi với một ion của nhựa trao đổi ion với một lƣu lƣợng dịng chảy đƣợc lựa chọn. Trong phƣơng pháp xử lý nƣớc ngầm nhiễm nitrat, loại nhựa anionit cĩ tính kiềm mạnh rất thích hợp và thơng dụng. Loại nhựa này cĩ độ bền khá cao, hiệu quả trao đổi tốt, chất lƣợng trao đổi lớn. Nhựa trao đổi anionit thƣờng cĩ dạng tổng quát là R - Cl. Quá trình khử nitrat bằng phƣơng pháp trao đổi ion dựa theo phản ứng sau: - - R - Cl + NO3 → R - NO3 + Cl 19
  21. - - NO3 đƣợc hấp phụ kết nối trên nhựa trao đổi ion tạo thành R -NO3, cịn ion Cl ở trong hạt nhựa sẽ hịa tan trong nƣớc. - R - NO3 cĩ thể đƣợc tái sinh lại dạng ban đầu R - Cl bằng cách hồn nguyên nhựa trao đổi bởi dung dịch NaCl hay dung dịch NaOH theo phản ứng sau hĩa học sau: - R - NO3 + NaCl → RCl + NO3 Hoặc R - NO3 + NaOH → ROH + Tuy nhiên loại nhựa kiềm mạnh cũng khử các anion khác cĩ trong nƣớc. Tùy 2- thuộc vào lƣợng SO4 trong nƣớc nhiễm nitrate mà ảnh hƣởng đến dung lƣợng trao đổi nitrate của nhựa. Tùy theo yêu cầu chất lƣợng nƣớc và từng điều kiện cụ thể cĩ thể chọn phƣơng pháp khử nitrate thích hợp, thơng thƣờng ngƣời ta thƣờng dùng phƣơng pháp trao đổi ion. Điều kiện áp dụng phƣơng pháp trao đổi ion đạt hiệu quả cao: Nƣớc cĩ hàm lƣợng cặn < 1 g/l. Tổng hàm lƣợng ion nitrate, sulfat và clor cĩ trong nƣớc nguồn muốn xử lý phải nhỏ hơn 250 mg/l (vì hàm lƣợng clo lớn nhất cho phép trong nƣớc ăn uống là 250 mg/l). 1.2.2 Lọc thẩm thấu ngược Khử nitrate bằng phƣơng pháp lọc qua màng cĩ hiệu quả cao với thẩm thấu ngƣợc (RO) và siêu lọc UF. Tuy nhiên hiệu quả chỉ khoảng 60 - 65% hàm lƣợng nitrate đƣợc loại trừ. Để khử nitrate triệt để, phƣơng pháp RO thƣờng đƣợc đƣa vào dây chuyền cơng nghệ vận hành trƣớc cột trao đổi ion. Phƣơng pháp thẩm thấu ngƣợc dùng màng bán thấm RO rất tốn kém chỉ dùng để khử nƣớc cĩ tổng lƣợng khống (TDS) cao, nƣớc nhiễm mặn hoặc cĩ nguồn gốc nƣớc ven biển, nƣớc biển. Chọn phƣơng pháp khử nitrat cần phải dựa vào chất lƣợng nƣớc yêu cầu sau xử lý, thành phần muối hịa tan trong nƣớc nguồn: - Khi tổng hàm lƣợng muối trong nƣớc nguồn thấp: nitrate vƣợt quá tiêu chuẩn, lƣợng ion Cl- trong nƣớc thấp dùng phƣơng pháp trao đổi ion phù hợp. 20
  22. 2- - Khi tổng hàm lƣợng muối trong nƣớc nguồn cao: , SO4 , cao ứng dụng phƣơng pháp trao đổi ion khơng hiệu quả kinh tế, nên dùng phƣơng pháp phối hợp với phƣơng pháp thẩm thấu ngƣợc dùng màng bán thấm RO. 1.2.3 Phương pháp sinh học Lọc nƣớc đã đƣợc khử hết sắt và cặn bẩn qua bể lọc chậm hoặc bể lọc nhanh, thổi khí lien tục từ dƣới lên. Do quá trình hoạt động vi khuẩn Nitrosomonas oxi hĩa + - - - NH4 thành NO2 và vi khuẩn Nitrobacter oxy hĩa NO2 thành NO3 . Quá trình diễn ra theo phƣơng trình: + - + NH4 + 2O2 → NO3 + 2H + H2O + - - 1.02NH4 + 1.89O2 + 2.02HCO3 → 0.21C5H7O2N + 1.0NO3 + 1.92 H2CO3 + 1.06H2O - Khử Nitrate NO3 Để khử nitrate dùng lọc thẩm thấu ngƣợc RO, điện phân, trao đổi ion trong các bể lọc ionit. Điều kiện áp dụng phƣơng pháp trao đổi ion Nƣớc cĩ hàm lƣợng cặn < 1mg/l. - 2- - Tổng hàm lƣợng ion NO3 và SO4 và Cl cĩ sẵn trong nƣớc phải nhỏ hơn 250 mg/l là hàm lƣợng ion Cl- lớn nhất cho phép cĩ trong nƣớc ăn uống. Vì khi lọc qua 2- - - bể lọc anionit các ion SO4 , NO3 đƣợc giữ lại, thay bằng ion Cl khi hồn nguyên bể lọc anionit bằng dung dịch muối ăn. 1.3 Vai trị của các chủng vi khuẩn trong quá trình xử lý nitrate[6] Vi khuẩn xử lý nitrate cĩ quá trình khử nitơ là một phần của chu kỳ nitơ , mục đích chính của chúng là để chuyển hĩa đạmhợp chất , với sự hỗ trợ của các enzymenitrate reductase , biến oxit trở lại khí nitơ oxit nitơ cho thế hệ năng lƣợng . Quá trình này chỉ diễn ra trong sự vắng mặt của oxy , nhƣ hầu hết các vi khuẩn xử lý nitrate là hiếu khí tùy ý thích sử dụng oxy là chất nhận điện tử cuối cùng, tuy nhiên chúng cũng cĩ thể sử dụng nitrate thay cho oxy. Vì vậy, quá trình khử nitơ chỉ cĩ thể đƣợc thực hiện theo điều kiện kỵ khí. Đây là lý do chính lý do tại sao quá 21
  23. trình khử nitơ chủ yếu xảy ra sâu trong lịng đất , hoặc trong các khu vực nƣớc tù đọng . Các quá trình của quá trình khử nitơ làm giảm độ phì nhiêu của đất và do đĩ ít phổ biến hơn tại các khu vực nơi cĩ đất là khá tốt canh tác . Nhƣng sự mất mát này của nitơ trong khí quyển cuối cùng cĩ thể đƣợc lấy lại qua thực phẩm và nƣớc, nhƣ là một phần của chu kỳ nitơ. Quá trình khử nitơ phổ biến nhất là cơ bản đƣợc trình bày dƣới đây, với nitơ oxit đƣợc chuyển đổi trở lại khí nitơ (nhƣ trái ngƣợc với các vi khuẩn nitrat): - - + 2 NO 3 + 10 e + 12 H → N 2 + 6 H 2 O Nhƣ cĩ thể thấy, kết quả là một phân tử nitơ (bao gồm hai nguyên tử) và sáu phân tử nƣớc. Vi khuẩn nitrat cĩ các chi (Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrobacter, Nitrococcus) vi khuẩn phát triển bởi các hợp chất nitơ vơ cơ tiêu thụ. Nhiều lồi vi khuẩn nitrat cĩ hệ thống màng phức tạp nội bộ cĩ vị trí cho các enzyme quan trọng trong quá trình nitrat hĩa: ammonia monooxygenase oxy hĩa ammonia hydroxylamine, và Oxidoreductase nitrite, oxy hĩa nitrite thành Một nhĩm các vi khuẩn làm giảm nitrate, nitrit để thành khí nitơ. Ví dụ các vi khuẩn tiềm năng bao gồm Thiobacillus, Micrococcus,Paracoccus và Pseudomonas . Điều này là quan trọng vì nĩ cho phép nitơ đƣợc tái trở lại vào bầu khí quyển . Những vi khuẩn này cũng đã đƣợc liên quan đến sự suy giảm độ màu mỡ của đất, và do đĩ năng suất nơng nghiệp cĩ thể cung cấp cho việc cấy ghép tốt nhất nĩ cĩ thể cung cấp cho. Vi khuẩn nitrate đƣợc phổ biến rộng rãi trong đất và nƣớc, và đƣợc tìm thấy ở cao nhất số lƣợng đáng kể của amoniac cĩ mặt (khu vực mở rộng phân hủy protein, và các nhà máy xử lý nƣớc thải). Vi khuẩn nitrate phát triển mạnh trong các hồ và suối với đầu vào cao của nƣớc thải và nƣớc thải vì hàm lƣợng amoniac cao. Vi khuẩn nitrate cĩ thể oxy hĩa ammonium thành nitrite ( )và sau đĩ là nitrate ( ). Nitrite là độc hại đối với cá và các lồi thủy sản khác, nhƣng nĩ thƣờng khơng tích lũy trong mơi trƣờng bởi vì nĩ đƣợc nhanh chĩng chuyển thành 22
  24. nitrate trong một mơi trƣờng hiếu khí. Ngồi ra, nitrit và nitrat cĩ thể trải qua vi khuẩn khử nitơ trong một mơi trƣờng thiếu ơxy. Trong quá trình khử nitơ, nitrat đƣợc chuyển thành nitrite, và sau đĩ tiếp tục chuyển đổi sang các hình thức nitơ khí của nguyên tố nitơ (N2), nitơ oxit (N2O), nitric oxide (NO), hoặc oxit nitơ (NOx) các hợp chất. nitrate hĩa xảy ra dễ dàng trong mơi trƣờng hiếu khí nhận đƣợc dịng suối và đất khơ trong khi quá trình khử nitơ cĩ thể là đáng kể ở các vùng nƣớc phía dƣới thiếu ơxy và đất bão hịa. 1.4 Tổng quan về vi khuẩ[n23] Hiện nay vi khuẩn nitrate hĩa đƣợc sử dụng rộng rãi trong xử lý nƣớc (nƣớc thải cơng nghiệp, nƣớc thải sinh hoạt và nƣớc thải từ nuơi trồng thủy sản). Trong nuơi trồng thủy sản, nhĩm vi khuẩn nitrate hĩa đƣợc sử dụng rất phổ biến trong lãnh vực sản xuất giống thủy sản và nuơi thủy sản thâm canh. Quy trình sản xuất đƣợc thực hiện thơng qua hệ thống lọc sinh học tuần hồn, nƣớc thải từ các bể ƣơng nuơi tơm cá chứa hàm lƣợng NH3 (do tơm cá bài tiết ra) đƣợc đƣa vào bể lọc sinh học để xử + - lý. Trong bể lọc sinh học, vi khuẩn Nitrosomonas sẽ chuyển hĩa NH4 thành NO2 - - (giai đoạn nitrite hĩa), kế đến vi khuẩn Nitrobacter chuyển hĩa NO2 thành NO3 (giai đoạn nitrate hĩa). Nƣớc sau khi xử lý qua bể lọc sinh học hồn tồn khơng độc cho tơm cá và đƣợc đƣợc tái sử dụng để ƣơng nuơi tơm cá (đƣa trở lại bể ƣơng nuơi). Trong suốt quá trình nuơi, nƣớc sẽ tuần hồn trong một hệ thống kín và hồn tồn khơng thay nƣớc, chỉ cĩ một lƣợng nhỏ nƣớc mới đƣợc cấp thêm vào hệ thống đề bù đắp cho lƣợng nƣớc hao hụt do bốc hơi. Giới thiệu một số chủng xử lý nitrate 1.4.1 Thiobacillus denitrificans[11] 1.4.1.1 Phân loại. Giới: Bacteria. Ngành: Proteobacteria. Lớp: Betaproteobacteria Bộ: Hydrogenophilales Họ: Hydrogenophilaceae 23
  25. Giống: Thiobacillus Lồi: Thiobacillus denitrificans 1.4.1.2 Đặc điểm.[17] Thiobacillus denitrificans là vi khuẩn kích thƣớc nhỏ, hình que (0,5 x 1,0 – 3,0µm), gram âm, roi cĩ cực, dạng vi khuẩn tự dƣỡng hĩa năng bắt buộc và là 1 chi của lớp vi khuẩn phân giải protein dạng beta. Khác với vi khuẩn di dƣỡng hĩa năng oxy hĩa lƣu huỳnh nhƣ Acidithiobacillus ferrooxidans, hiếu khí. T. denitrificans là vi khuẩn hĩa năng kỵ khí tùy nghi, sự kết hợp của quá trình oxy hĩa hợp chất vơ cơ lƣu huỳnh đến giảm hợp chất oxy hĩa nito nhƣ nitrate, nitrite, dinitrogen. Những điều kiện tối ƣu cho quá trình khử nitơ: pH=6.85, ở nhiệt độ 32,80C. Điều kiện tối ƣu cho sự tăng trƣởng là pH=6,9, nhiệt độ là 29,50C. Chúng đƣợc tìm thấy trong đất, bùn, nƣớc ngọt và biển trầm tích, nƣớc thải và ao xử lý chất thải cơng nghiệp trong điều kiện thiếu oxy. Trong mơi trƣờng nhân tạo mơi trƣờng nuơi cấy đầu tiên đƣợc phát hiện bởi Beijerinck (Beijerinck, 1904). cĩ Hình 1.3: tế bào vi khuẩn T.denitrificans cĩ dạng hình que ngắn Tế bào T.denitrificans bắt màu với DAPI (xanh). Những tế bào này cĩ thể di động đƣợc nhờ một roi cĩ cực. khuẩn lạc thuần khiết màu trắng sữa sẽ đƣợc quan sát thấy trên mơi trƣờng yếm khí thiosufate hoặc nitrate agar, cĩ thể chuyển thành 24
  26. màu trắng khi tác dụng với lƣu huỳnh sau một thời gian. Khí nitơ sẽ đƣợc sản xuất ra trong mơi trƣờng yếm khí, kết quả là mơi trƣờng agar bị nứt. T. denitrificans phát triển chậm và khơng cĩ pha ổn định rõ ràng. Tốc độ tăng trƣởng tối đa là 2,245 mg/(Lh) ở giai đoạn phase tăng trƣởng (lũy thừa). Trong quá trình phát triển pH của mơi trƣờng giảm đáng kể. Một vài nghiên cứu cho rằng mơi trƣờng cĩ nồng độ muối cao hạn chế hoạt động khử nito của T.denitrificans. Kết quả của một số nghiên cứu đã chứng minh T.denitrificans khơng cĩ độc tố. T. denitrificans giúp loại bỏ nitrate dƣ thừa từ nguồn nƣớc ngầm tự nhiên và hệ thống xử lý nƣớc. Chúng là vi khuẩn đầu tiên và duy nhất để oxy hĩa hợp chất oxit của uranium hĩa trị IV thành hợp chất khống oxit của uranium hĩa tri VI trong điều kiện kỵ khí, hợp chất này cĩ tác dụng tích cực trong việc trung hịa uranium từ nguồn nƣớc ngầm bị nhiểm uranium bằng cách giảm pha tĩnh ở dạng U(IV) nhờ một số vi sinh vật, chẳng hạn nhƣ Geobacter sp. 1.4.1.3 Cơ chế loại bỏ nitrate của T.denitrificans T.denitrificans tăng trƣởng trên mơi trƣờng thiosulfate, tetrathionate, thionate hiếu khí và cả trên mơi trƣờng thiosulfate, tetrathionate, thionate, sulfide hoặc sulfur nguyên tố. Trƣớc đây, hĩa học lƣợng pháp đƣợc miêu tả là một trong những phản ứng điển hình mơ tả sự tăng trƣởng của T.denitrificans trên mơi trƣờng sulfide và sử dụng sulfide nhƣ là nguồn năng lƣợng và nitrate là chất nhận điện tử cuối cùng dƣới điều kiện yếm khí. Muối amoni và nitrate đƣợc sử dụng nhƣ là nguồn nitơ tốt. Quá trình này xảy ra theo hai giai đoạn: Khử nitrate (NO3) thành nitrite (NO2); khử (NO2) thành nitric oxide (NO), rồi nitrous oxide (N2O) rồi đến N và sau cùng là N2. Trong điều kiện thiếu oxy xảy ra quá trình oxy hĩa amonium ky khí. Ở T.denitrificans, sulfide bị oxy hĩa bởi 1 loạt các phản ứng xúc tác nhờ enzyme sulfide hoặc sulfite oxidoreductase đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn phân hủy sulfate và quá trình oxy hĩa lƣu huỳnh nguyên tố bởi T.denitrificans theo thứ tự ban đầu làm giảm sulfide (hợp chất lƣu huỳnh với một nguyên tố khác), sau đĩ quá trình oxy hĩa lam giảm sulfite (muối của acid sulfuro). 25
  27. Ngồi ra, T.denitrificans cĩ thể sử dụng giảm lƣợng sắt và lƣu huỳnh trong hợp chất khống ít tan (hợp chất này đƣợc xem là chất nhƣờng điện tử). Các nghiên cứu về việc cố định carbon dioxide của T.denitrificans cho thấy rằng nĩ cĩ khả năng tổng hợp hexose phosphate từ carbon dioxide bởi một cơ chế tuần hồn cũng tƣơng tự nhƣ cơ chế đƣợc tìm thấy trong cây xanh. ở cấp độ gene T.denitrificans biểu hiện ở dạng I RubisCO dƣới điều kiện hiếu khí và dạng II RubisCO dƣới điều kiện yếm khí. Phát hiện này khơng chỉ cho thấy các cơ chế khác nhau cĩ ảnh hƣởng đến hiệu suất cố định CO2 của T.denitrificans và cũng cung cấp một số hiểu biết về khả năng oxy hĩa hợp chất lƣu huỳnh trong diều kiện hiếu khí và khử nitơ. 1.4.1.4 Ứng dụng. T. denitrificans là sinh vật chiếm ƣu thế trong mơi trƣờng sống giàu nitrate. Cĩ một điều đáng quan tâm với T. denitrificans trong xử lý mơi trƣờng, đặc biệt để loại bỏ nitrate. Hàm lƣợng nito vƣợt quá giới hạn cĩ thể gây ra những vấn đề nhƣ gây ra hiện tƣợng phú dƣỡng và hội chứng methemoglobin làm mất khả năng vận hành oxy, cĩ thể dẫn đến tử vong và nguyên nhân là do xả nƣớc thải, sử dụng quá mức phân bĩn. T. denitrificans là vi khuẩn khử nitơ, khơng cần nguồn cacbon nào khác thêm vào quá trình này. Chúng đƣợc xem là một giải pháp khả thi để loại bỏ nitrate từ nƣớc ngầm và nƣớc mặt đã bi ơ nhiễm, cũng nhƣ xử lý nƣớc thải với nơng độ nitrate cao nhƣ nƣớc rĩ rác. Chúng cĩ hiệu quả trong việc loại bỏ nitrate trong thời gian dài, ngồi ra khả năng loại bỏ nitrite cũng rất tốt. T. denitrificans cũng đƣợc xem xét để loại bỏ sulfite, nguồn chất thải giàu sulfide nhƣ: khí chua và nƣớc, chất ăn mịn. Hợp chất lƣu huỳnh trong mơi trƣờng cĩ độc tính cao, mùi khĩ chịu, tinh chất ăn mịn và nhu cầu oxy cao. Quá trình oxy hĩa sulfide hiếu khí là phƣơng pháp ƣa thích để loại bỏ sulfide trong nƣớc thải cơng nghiệp. 1.4.2 Pseudomonas stutzeri 1.4.2.1 Nguồn gốc[19] Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri đƣợc phân lập đầu tiên bởi Burri và Stutzer vào năm 1895 (Burri và Stutzer, 1895) và đƣợc xem nhƣ là Bacillus denitrificans II, 26
  28. sau đĩ Van Niel và Allen đặt tên là Pseudomonas stutzeri (Van Niel và Allen, 1952). Các đặc điểm kiểu hình và chức năng của nĩ đƣợc mơ tả chính xác bởi Lehman và Neumann vào năm 1927 (Lehman, K. B và Neumann, 1896-1927) 1.4.2.2 Phân loại[19] Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales. Họ: Pseudomonadaceae Lồi: Pseudomonas stutzeri Các nghiên cứu về trình tự 16S rRNA cho thấy chúng tƣơng đồng với các lồi nhƣ P.mendocinia, P.alcaligenes, P.pseudoalcaligenes và P.balearica (Obradors và ctv, 1991). Năm 1952, C.B. van Neil và M. B. Allen đã cơng khai trong nhật ký của họ về lịch sử của P. stutzeri: “Trong hai thập kỉ một số chủng vi khuẩn cĩ khả năng khử nitơ đã đƣợc phân lập và mơ tả đặc điểm. Một nghiên cứu trong các tài liệu này cho thấy Burri và Stutzer (1895) là những ngƣời đầu tiên mơ tả chi tiết các đặc điểm để nhận ra các sinh vật này. Đặc điểm đăc biệt này là của Bacillus denitrificans II, một sinh vật phân bố rộng rãi và cĩ những đăc trƣng riêng, chúng đƣợc phân lập từ rơm, phân xanh, nƣớc kênh và quá trình khử nitơ của nĩ thì rất phổ biến và dễ nhận biết”. Các tên gọi khác nhau về vi khuẩn khử nitơ này đã đƣợc đặt kể từ khi chúng đƣợc khám phá trong tài liệu của van Neil và Allen 1952 (C.B. van Neil và M. B. Allen, 1952). Các tên gọi bao gồm: Bacterium stutzeri, Bacillus nitrogenes, Bacillus stutzeri, Achromobacter sewerinii, Pseudomonas stutzeri và Achromobacter stutzeri. 1.4.2.3 Đặc điểm sinh lý và điều kiện sống[12] P. stutzeri là một lồi vi khuẩn cĩ mặt ở nhiều nơi trên trái đất, nĩ cĩ khả năng thúc đẩy quá trình nitrite hĩa và khử đạm (Zumft, 1992), đặc biệt nĩ cĩ mặt ở những nơi cĩ nhiều nitrogen nhƣ nguồn nƣớc bị ơ nhiễm ammonia từ ao cá, tơm và trại chăn nuơi (Lee và ctv, 2002). 27
  29. Chi Pseudomonas là một trong những chi đa dạng và cĩ ý nghĩa sinh thái nhất trên trái đấtvà giữ vai trị quan trọng trong chu trình carbon và nitrogen P. stutzeri là lồi cĩ ý nghĩa nhất trong chi này bởi vì chúng cĩ thể biến dƣỡng nhiều nguồn carbon khác nhau, đặc biệt chúng cĩ thể khống hĩa nhiều chất ơ nhiễm nguồn gốc hữu cơ và vơ cơ trong điều khiện hiếu khí lẫn kỵ khí và chúng xuất hiện trong nhiều mơi trƣờng khác nhau (ơ nhiễm dầu thơ, bệnh viện). Nhiều chủng P. stutzeri cĩ khả năng phân hủy đƣợc các dung mơi hữu hay polyethylene glycols, đặc biệt lồi vi khuẩn này cĩ khả năng loại bỏ nitrogen trong mơi trƣờng nƣớc rất tốt vì chúng cĩ đủ các gen nir, nos, nor, nhất là oxy hĩa ammonia rất nhanh (Zumft, 1997). Chủng P. stutzeri cĩ thể phát triển trong mơi trƣờng chỉ cĩ một lƣợng nhỏ ammonium hoặc nitrate và một phân tử hữu cơ nhƣ là một nguồn carbon duy nhất vàlà nguồn năng lƣợng cho sự phát triển của chúng. Khơng cần thêm các yếu tố tăng trƣởng khác. Chúng khơng phát triển ở mơi trƣờng acid. P. stutzeri cĩ sự trao đổi chất qua đƣờng hơ hấp và oxy là chất nhận điện tử cuối cùng. Tuy nhiên, chúng cĩ thể sử dụng nitrate để làm chất nhận điện tử thay thế và cĩ thể thực hiện quá trình khử oxy. Quá trình khử này cĩ thể bị cản trở hoặc chỉ cĩ thể xuất hiện sau khi chuyển nitrate vào mơi trƣờng dƣới điều kiện kỵ khí. Sự phân hủy oxy của các hợp chất thơm liên quan đến sự tham gia của các mono- và dioxygenase. Thơng thƣờng, catechol hoặc protocatechuate là trung tâm trung gian trong phản ứng này.( Obradors và Aguilar, 1991) đã chứng minh rằng polyethylene glycol đƣợc phân hủy thành ethylene glycol, một loại cơ chất đƣợc sử dụng bởi P. stutzeri (Obrador và ctv, 1991). Tất cả các chủng P. stutzeri cho kết quả âm tính với phản ứng “dihydrolase”. Chúng khơng sử dụng glycogen và cũng khơng làm tan gelatin. 1.4.2.4 Đặc điểm chung[22,23] Tế bào cĩ hình que, dài 1 đến 3μm, rộng 0.5 μm. Khuẩn lạc cĩ hình dạng khơng kiên định khi đƣợc phân lập trực tiếp, khuẩn lạc cĩ dạng sần, khơ, bám chặc với nhau. P. stutzeri cĩ gram âm, hình que, di chuyển bằng một cực của tiên mao. - Nĩ khơng cĩ sắc tố và cĩ khả năng loại nitơ từ NO3 giải phĩng N2. P.stutzeri cĩ thể 28
  30. tăng trƣởng trong mơi trƣờng amylase, maltose và tinh bột nhƣng khơng phát triển trong gelatinase. Vi khuẩn P.stutzeri hiếu khí, phân bố rộng rãi trong các vùng địa lý nhƣng đƣợc tìm thấy chủ yếu trong đất và nƣớc. Nhiều dịng đƣợc phân lập từ các mẫu bệnh lý. Chúng cĩ khả năng chuyển hĩa, làm giảm các chất độc cho mơi trƣờng và các hợp chất cĩ trọng lƣợng phân tử cao nhƣ polyethylene glycols (Obradors và ctv., 1991). Pseudomonas stutzeri là loại vi khuẩn khử nitrate, khơng phát quỳnh quang. 1.4.2.5 Đặc điểm hình thái và cấu trúc khuẩn lạc.[14] Tế bào thuộc loại di động và phần lớn là một lơng roi. Một số chủng cĩ roi ngắn ở phía bên.Những roi ngắn ở bên cĩ thể dễ dàng bị gãy trong quá trình thao tác nhuộm lơng roi (Palleroni và ctv, 1970). Những roi này tham gia chung với những lơng roi chính và giúp cho quá trình di chuyển trên bề mặt rắn của vi khuẩn (Shinoda và ctv, 1977). Theo thống kê số lƣợng tế bào lơng roi cĩ thể đạt rất cao ở giai đoạn đầu của pha tăng trƣởng (Lautrop và ctv, 1964). Cả roi và tiên mao rất quan trọng cho các khuẩn lạc sống trên bề mặt sinh học và phi sinh học, đặc biệt là trong việc hình thành ban đầu của các khuẩn lạc nhỏ. P. stutzeri sở hữu cả roi và tiêm mao nhƣng chúng khơng đƣợc xem là thành viên của các vi khuẩn cĩ màng sinh học tự nhiên. Về hình thái khuẩn lạc cĩ thể đƣợc phân biệt bởi hình dạng và tính thống nhất bất thƣờng của chúng. 29
  31. Hình 1.4: Khuẩn lạc P. stutzeri cĩ nếp nhăn, màu hơi đỏ nâu, khơ và dính chặt với nhau. Khuẩn lạc đƣợc phân lập thì kết dính và cĩ nếp nhăn, cĩ màu đỏ nâu, khơng cĩ màu vàng. Chúng thƣờng cứng, khơ và dính chặt với nhau. Chúng di chuyển dễ dàng trên bề mặt rắn. Khuẩn lạc cĩ hình dạng nhƣ miệng núi lửa với đỉnh cao, thƣờng cĩ nhánh và đồng nhất và chúng cĩ kết cấu rất chặt đƣợc so sánh với cấu trúc của san hơ. Cĩ thể cĩ lớp nhày phồng lên ở ngồi rìa so với các khu vực khác. Thƣờng cĩ cấu trúc đa giác khơng đều hoặc các khu vực đồng tâm. Cấu trúc khuẩn lạc khơng đồng nhất chúng thay đổi theo thời gian. Sau nhiều lần cấy chuyển trên mơi trƣờng nhân tạo ở phịng thí nghiệm, khuẩn lạc cĩ thể trở nên nhẵn hơn và màu nhạt hơn. Khuẩn lạc lúc này sắp tách rời ra. Thuộc tính này thì hiếm và thƣờng giới hạn ở các vi khuẩn ở biển. (Sorokin và ctv,1999) đã diễn tả rất chi tiết hình thái của khuẩn lạc, sự khác nhau giữa khuẩn lạc type-R và type-S. Khuẩn lạc type-R thì 30
  32. khơng cĩ khả năng di động, nhƣng khuẩn lạc type-S thì sản sinh cả 2 loại khuẩn lạc dƣới điều kiện thích hợp. Khuẩn lạc nhẵn phát triển trên đĩa ở 300C và ủ ở 40C trong 24 giờ thì thƣờng xuất hiện các nếp nhăn (Lalucat và ctv, 2006). P. stutzeri là lồi thuộc nhĩm khơng chứa sắc tố của chi, mặc dù khuẩn lạc của một số chủng trở thành màu nâu sẫm. Điều này là do nồng độ cytochrome c cao trong tế bào. Khơng khuếch tán sắc tố trên đĩa thạch (Lalucat và ctv, 2006). 1.4.2.6 Hoạt tính sinh học.[22] Chúng cĩ khả năng chuyển hĩa, làm giảm các chất độc cho mơi trƣờng và các hợp chất cĩ trọng lƣợng phân tử cao nhƣ polyethylene glycols (Obradors và ctv., 1991). Gần đây nhiều nhà khoa học đang chú ý đến khả năng chuyển hĩa chuyên biệt của nĩ: Một vài dịng cĩ thể chuyển hĩa các hợp chất thơm nhƣ naphthalene và mathylnapthalenes Hai hợp chất thơm này hiện diện nhiều trong dầu thơ, là chất cĩ tiềm năng gây độc (Cerniglia, 1984). P.stutzeri đƣợc đề cập nhƣ một hệ thống khử nitrate vì nĩ cĩ khả năng là giảm nitrate chuyển khí N2 (Cuypers và Zumft, 1992). Một số lồi cĩ khả năng biến đổi tự nhiên, là đối tƣợng thích hợp cho các nghiên cứu về sự biến đổi gen trong mơi trƣờng. P.stutzeri đƣợc phân lập từ động vật, mơi trƣờng bệnh viện và các mẫu bệnh ở ngƣời (Balows và ctv, 1991). Ớ Việt Nam ta, các chủng vi khuẩn địa phƣơng khử đạm mạnh, phù hợp với điều kiện sinh thái địa phƣơng cĩ thể ứng dụng vào xử lý mơi trƣờng nƣớc đã đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu, đặc biệt gần đây nhất là đề tài phân lập vi khuẩn Pseudomomas stutzeri cĩ khả năng khử đạm mạnh trong nƣớc thải ao cá tra ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long và ứng dụng nĩ vào xử lý nƣớc thải (Cao Ngọc Điệp và ctv, 2009). 31
  33. 1.4.2.7 Cơ chế khử của P. Stutzeri[18, 19] Theo kết quả phân tích mẫu nƣớc thu đƣợc từ các ao cá cho thấy hàm lƣợng đạm và lân tổng số khá cao, tổng chất rắn lơ lửng cao trong khi vi khuẩn colifrom vẫn cịn trong giới hạn cho phép theo qui dịnh số 02/2006 của Bộ Thủy Sản. Cĩ 15 dịng vi khuẩn đƣợc phân lập từ chất thải ao nuơi cá tra dọc theo sơng Tiền và sơng Hậu bằng mơi trƣờng SW – LB (mơi trƣờng nƣớc biển nhân tạo Luria – Britani) bổ sung với 10 mM và . 11 dịng xác định là vi khuẩn Pseudomomas stutzeri dựa trên mức độ tƣơng đồng PCR – 16S rRNA dùng các primers phổ biến và chuyên dụng. Cĩ 4 dịng là cĩ hiệu quả trong việc làm giảm các mức N hịa tan (NH4, NO2 and NO3) trong nƣớc ao cá từ mức ban đầu là 10mg/L xuống gần bằng 0 sau 4 ngày xử lý. Các thí nghiệm khác đang đƣợc tiến hành để xác định phƣơng thức mà N bị mất từ dung dịch và nồng độ ammonia bị oxy hĩa, và nồng độ của nitrite và nitrate bị khử bị khử bởi dịng Pseudomomas stutzeri (Cao Văn Phụng, 2007) Quá trình khử đạm đƣợc coi nhƣ là một tiến trình then chốt trong chu trình nitơ. Quá trình này hầu nhƣ là sự tập hợp của sự hơ hấp nitrate, nitrite, kết hợp với sự khủ oxit và hơ hấp nitơ oxit Nitrate Nitrite Nitrite oxit Dinitơ oxit Khí nitơ - - (NO3 ) (NO2 ) (NO) (N2O) (N2)↑ Dạng oxy hĩa khử: - + 2NO3 + 10e + 12H N2↑ + 6H2O Các lồi vi khuẩn tham gia là Paracoccus denitrificans, Thiobaccillus denitrificans, và những lồi Pseudomonas, Clostridium. Dƣới tác dụng của các lồi vi sinh vật: HNO3→ HNO2→HNO →NO2→N2 + H NH4Cl + HNO2→HCl + H2O + N2 R-NH2 + HNO2→R-OH + H2O + N2 R-CH(NH2)COOH + HNO2 →R-CHOHCOOH + H2O + N2 R-CO-NH2 + HNO2→ R-COOH + H2O + N2(Lee et al., 2002). 32
  34. 1.4.2.8 Ứng dụng2[1, 2] Hiện nay phƣơng pháp xử lý vi sinh đang đƣợc các nhà khoa học trong nƣớc ta đặc biệt chú ý vì cĩ nhiều ƣu điểm xử lý hiệu quả của nĩ. Những nghiên cứu này đã chứng minh cho ta thấy đƣợc chất lƣợng nƣớc kênh rạch đã đƣợc cải thiện khi nƣớc thải và bùn đáy ao đƣợc xử lý bằng cách dùng cho ruộng sản xuất lúa. Điều này sẽ cung cấp bằng chứng rõ là chiến lƣợc xử lý hiện hữu và làm căn bản cho việc thực hiện trên diện rộng của phƣơng pháp xử lý này ở vùng Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Định hƣớng về kinh tế để nơng dân chấp nhận để sử dụng nƣớc và bùn đáy ao cho canh tác lúa tiết kiệm đƣợc từ 33 – 67% chi phí dành cho phân bĩn cĩ đƣợc bằng cách thay thế một phần chất thải ao nuơi bĩn cho ruộng lúa (Thơng tin kinh tế xã hội tỉnh Tiền Giang, 2009). Theo một số bằng chứng từ dự án: “Xử lý và tái chế nƣớc và chất rắn từ ao nuơi cá vùng đồng bằng sơng Cửu Long để cải thiện đời sống và giảm ơ nhiễm nƣớc” thì vấn đề cải tạo mơi trƣờng nƣớc làm giảm nhẹ gánh nặng tác động của kinh tế lên mơi trƣờng, mà điển hình là vi khuẩn Pseudomonas stutzeri cĩ khả năng làm giảm hàm lƣợng nitrogen, amoni, trong nƣớc ở những nuơi cá tra, basa, tăng hiệu quả kinh tế, cải thiện cuộc sống cho ngƣời dân (Cao Văn Phụng, 2010). Tuy nhiên ở nƣớc ta vấn đề nghiên cứu này đã và đang đƣợc nghiên cứu ứng dụng vào quy trình nhiều hạn hẹp và chƣa đƣợc ứng dụng rộng rải. 1.4.3 Paracoccus denitrificans 1.4.3.1 Nguồn gốc[5] Trƣớc đây chúng đƣợc biết đến với tên là Micrococcus denitrificans, nĩ đƣợc phân lập đầu tiên vào năm 1910 bởi Martinus Beijerinck một nhà vi sinh vật học ở Hà Lan. Vi khuẩn P. denitrificans đƣợc phân loại vào năm 1969 bởi D. H. Davis (Davis và ctv, 1969). 1.4.3.2 Phân loại[5] Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: α Proteobacteria 33
  35. Bộ: Rhodobacterales Họ: Rhodobacteraceae Giống: Paracoccus Lồi: Paracoccus denitrificans Tên khoa học: Paracoccus denitrificans (Davis, 1969) 1.4.3.3 Đặc điểm sinh học.[8] Hình 1.5: tế bào vi khuẩn Paracoccus denitrificans P. denitrificans là vi khuẩn Gram âm, khơng di động, vi khuẩn khử nitơ (giảm nitrate). Nĩ là vi khuẩn hình que nhƣng nĩ cĩ thể giả hình cầu trong giai đoạn ổn định (Copeland A, 2006). Giống nhƣ tất cả các vi khuẩn gram âm, tế bào cĩ màng đơi với vách tế bào. Sự trao đổi chất của P. denitrificans rất linh hoạt và đƣợc giử lại trong đất cả mơi trƣờng hiếu khí lẫn kỵ khí. Vi khuẩn này cĩ khả năng sống trong nhiều loại mơi trƣờng khác nhau. Chúng cĩ thể cĩ đƣợc năng lƣợng từ các hợp chất hữu cơ nhƣ methanol, methylamine và từ các hợp chất vơ cơ nhƣ hydrogen và sulfur. Nhờ khả năng chuyển hĩa các hợp chất của hydro và sulfur nhƣ thiosulfate nên các vi khuẩn này đƣợc xem nhƣ một mơ hình để nghiên cứu việc biến đổi các hợp chất lƣu huỳnh chƣa đƣợc biết đến. Đặc tính khử nitơ của P. denitrificans là nguyên nhân quan trọng làm mất mát nitơ trong đất nơng nghiệp. Điều này cĩ thể là do quá trình hĩa học gọi là “khử 34
  36. nitơ” trong đĩ nitơ đƣợc chuyển đổi thành dinitrogen để sản xuất oxit nitric và oxit nito gây nên sự mất nito của khí quyển. Một số chủng P. denitrificans cĩ thể đƣợc phân lập và phát triển trên mơi trƣờng nhân tạo sử dụng carbon disulfide và carbonyl sulfide làm nguồn năng lƣợng. Chúng khơng gây hại cho con ngƣời. Paracoccus là một chi cĩ nhiều tác dụng về mặt hĩa sinh, sở hữu một loạt các chuyển hĩa thơng qua sự phân hủy hàng loạt các hợp chất. Do đĩ, nĩ cĩ khả năng đƣợc ứng dụng trong xử lý sinh học (Copeland A, 2006). Đặc tính phân hủy nitơ của P. denitrificans đƣợc sử dụng để tạo ra các phản ứng sinh học. Trong trƣờng họp này, một gel hình ống chứa 2 vi khuẩn, để loại bỏ nito khỏi nƣớc thải. P. denitrificans làm giảm nitrite để tạo khí nito trong khi Nitrosomonas europaea làm giảm amonia thành nitrite. Hệ thống này đơn giản hĩa quá trình loại bỏ nito khỏi nƣớc thải (Uemoto và Saiki, 1996).[16] Một số chủng của P. denitrificans cĩ thể sử dụng thiocyanate nhƣ nguồn năng lƣợng, nên chúng cĩ khả năng đƣợc sử dụng để làm sạch nƣớc thải bị ơ nhiễm thiocyanate từ các nhà máy luyện than cốc. Một số chủng khác cĩ khả năng làm giảm halobenzoates trong điều kiện kỵ khí và cĩ thể phân hủy sulfonate dƣới điều kiện phát triển kỵ khí (Copeland A, 2006).[15] Chủng P. denitrificans đƣợc phân lập từ nƣớc thải đã qua xử lý để làm giảm methylate amine trong cả 2 điều kiện kỵ khí và hiếu khí (Copeland A, 2006). Sự tích lũy polyphosphate bởi P. denitrificans đƣợc thực hiện dƣới điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Quá trình tổng hợp polyphotphate này diễn ra với oxy hoặc nitrate là chất nhận điện tử và cĩ sự hiện diện của nguồn carbon từ bên ngồi. Các sinh vật cĩ khả năng tích lũy polyphophate thì cĩ khả năng phân hủy photphate trong nƣớc thải, trong các sinh vật này cĩ P. denitrificans cĩ khả năng phân hủy vừa photphate vừa nitrate mà khơng cần phải xen kẻ điều kiện hiếu khí/kỵ khí hoặc kỵ khí/hiếu khí (Marshall K. C và ctv, 1990). [16] 1.4.3.4 Ứng dụng.[4] 35
  37. Hiện nay vi khuẩn nitrate hĩa đƣợc sử dụng rộng rãi trong xử lý nƣớc (nƣớc thải cơng nghiệp, nƣớc thải sinh hoạt và nƣớc thải từ nuơi trồng thủy sản). Trong nuơi trồng thủy sản, nhĩm vi khuẩn nitrate hĩa đƣợc sử dụng rất phổ biến trong lãnh vực sản xuất giống thủy sản và nuơi thủy sản thâm canh. Quy trình sản xuất đƣợc thực hiện thơng qua hệ thống lọc sinh học tuần hồn, nƣớc thải từ các bể ƣơng nuơi tơm cá chứa hàm lƣợng NH3 (do tơm cá bài tiết ra) đƣợc đƣa vào bể lọc sinh học để xử + - lý. Trong bể lọc sinh học, vi khuẩn Nitrosomonas sẽ chuyển hĩa NH4 thành NO2 - - (giai đoạn nitrite hĩa), kế đến vi khuẩn Nitrobacterchuyển hĩa NO2 thành NO3 (giai đoạn nitrate hĩa). Nƣớc sau khi xử lý qua bể lọc sinh học hồn tồn khơng độc cho tơm cá và đƣợc đƣợc tái sử dụng để ƣơng nuơi tơm cá (đƣa trở lại bể ƣơng nuơi). Trong suốt quá trình nuơi, nƣớc sẽ tuần hồn trong một hệ thống kín và hồn tồn khơng thay nƣớc, chỉ cĩ một lƣợng nhỏ nƣớc mới đƣợc cấp thêm vào hệ thống đề bù đắp cho lƣợng nƣớc hao hụt do bốc hơi. Hiện nay, các nƣớc phát triển đã ứng dụng rất thành cơng quy trình lọc sinh học tuần hồn trong sản xuất thâm canh cá trê phi, cá chình, cá hồi và cá bơn và cả cá rơ phi. Năng suất nuơi cá trê phi cĩ thể đạt 500kg/m3/vụ, cá chình khoảng 600 tấn/m3/vụ và cá rơ phi là 140 kg/m3/vụ. Ở Việt Nam, quy trình lọc sinh học tuần hồn đƣợc áp dụng phổ biến trong các trại sản xuất giống tơm. 36
  38. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm 2.1.1 Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 12/2011 đến 7/2012 2.1.2 Địa điểm 2.1.2.1 Địa điểm lấy mẫu Mẫu đất: Mẫu đƣợc thu tại KCN Việt Nam – Singapore, Bình Dƣơng. Tiến hành lấy mẫu đất cách mặt đất khoảng 2 cm. Lấy một lƣợng vừa phải. Mẫu nƣớc thải: mẫu nƣớc thải giàu nitrate đƣợc thu tại KCN Long Hậu. Mẫu bùn hoạt tính: mẫu bùn đƣợc thu tại KCN Long Hậu 2.1.2.2 Địa điểm thực hiện thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại Phịng Thí nghiệm Khoa Mơi Trƣờng và Cơng Nghệ Sinh Học,Trƣờng Đại Học Kỹ Thuật Cơng Nghệ TP.HCM. 2.2 Dụng cụ và hĩa chất 2.2.1 Dụng cụ - Ống nghiệm - Đĩa petri - Autoclave - Pipet, micro pipet - Bếp đun - Cốc thủy tinh - Máy đo pH - Máy đo OD 2.2.2 Hĩa chất - Mơi trƣờng phân lập Mơi trƣờng DM - Mơi trƣờng sàng lọc 37
  39. Mơi trƣờng Giltay - Mơi trƣờng tăng sinh Mơi trƣờng LB - NaOH - PDA - Acid sulfanilic - EDTA - Acetate - Naphthylamine 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu . 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu - Đối với mẫu đất: mẫu đất đƣợc thu từ các vùng đất canh tác nơng nghiệp. Tiến hành lấy mẫu đất cách lớp đất mặt 2 – 3 cm. Dùng dụng cụ thu mẫu lấy khoảng 100 g đất cho vào bịch nylon vơ trùng và cột chặt miệng bao đồng thời vận chuyển về phịng thí nghiệm. - Đối với mẫu nƣớc thải và bùn hoạt tính: Mẫu nƣớc thải và bùn hoạt tính đƣợc lấy tại khu cơng nghiệp Long Hậu. Mẫu nƣớc thải lấy từ nguồn nƣớc thải đầu vào giàu nitrate, cịn đối với mẫu bùn hoạt tính lấy trong các bể aerotank. Mẫu đƣợc cho vào các chai nhựa vơ trùng và vận chuyển về phịng thí nghiệm để tiến hành phân lập. 2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong mẫu Nếu mẫu cĩ cặn và màu, thêm 2 ml Al(OH)3 vào 100ml mẫu, để lắng vài phút, lọc bỏ lớp nƣớc qua lọc đầu tiên. Chuẩn bị mẫu và dung dịch chuẩn nhƣ sau: Hĩa chất Các bình định mức số Thể tích nitrate chuẩn 0 5 10 15 20 25 Cơ cạn mẫu đến khơ trên nồi cách thủy 38
  40. Thể tích dung dịch PDA 1 1 1 1 1 Thể tích nƣớc cất(ml) 25 25 25 25 25 25 Trung hịa acid dƣ bằng NaOH 10% đến pH trung tính Chuyển vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch, đo độ hấp thụ các mẫu ở bƣớc sĩng 410nm Đo độ hấp thu D Phƣơng pháp này sử dụng đƣợc khi hệ số tƣơng quan R≥ 0.99 xác định phƣơng trình đƣờng chuẩn dạng Y = ax + b, trong đĩ Y là nồng độ µg/ml, x là độ hấp thu mật độ quang. Lấy 10ml dịch nuơi cấy sẽ đƣợc lọc qua giấy lọc đƣờng kính Ø= 11 để loại bỏ tế bào vi khuẩn, tráng rữa lọc nhiều lần bằng nƣớc cất, dịch sau lọc đƣợc làm khan bằng cách đun cách thủy trong các cốc thủy tinh đến khi khơ ( khơng để khét). Bổ sung 1ml dung dịch PDA và 25ml nƣớc cất, trung hịa bằng NaOH 10% đến trung tính, định mức 100ml tới vạch, đo bƣớc sĩng 410nm ghi nhận mật độ quang, thay vào giá trị x phƣơng trình trên xác định nồng độ nitrate. Chú ý: - Trong trƣờng hợp mẫu cĩ NO2 > 0.2mg/l sẽ ảnh hƣởng đến kết quả - phân tích, do cĩ thể bị oxy hĩa thành NO3 . Để loại bỏ thêm 5ml ure-acetic hoặc 2ml dung dịch acid sulfanilic 2% vào 50ml mẫu. Trƣờng hợp mẫu nhiễm clorua gây sai số, để xử lý thêm vào tể tích xác định vừa đủ dung dịch Ag2SO4 để kết tủa hết ion Clo. Độ màu: nếu mẫu nƣớc cĩ độ màu >10 đơn vị, cần loại bỏ bằng cách thêm 2ml dung dịch huyền phù Al(OH)3 vào 100ml mẫu ban đầu 2.3.3. Phương pháp xác định hàm nitrite trong mẫu Nếu mẫu cĩ cặn và màu, thêm 2 ml Al(OH)3 vào 100ml mẫu, để lắng vài phút, lọc bỏ lớp nƣớc qua lọc đầu tiên. Chuẩn bị mẫu và dung dịch chuẩn nhƣ sau: 39
  41. STT 0 1 2 3 4 5 6 Vdd N-NO2 chuẩn, ml 0 2.5 5 7.5 10 12.5 0 V nƣớc cất, ml 25 22.5 20 17.5 15 10 V dd EDTA, ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Vdd acicsulfanilic, ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Đợi 10 phút Vdd Naphthylamine, 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 ml Vdd acetate, ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Đợi 20 phút C (mg/l) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 OD Tiến hành thêm mẫu theo đúng trình tự và thời gian theo bảng trên, đo độ hấp thu mẫu ở bƣớc sĩng 520nm. 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu trong thí nghiệm đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel 2007 và xử lý thống kê bằng phần mêm Statgraphics Centuriin XV với trắc nghiệm Tukey. 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.1. Phân lập vi khuẩn cĩ khả năng xử lý nitrate 2.4.1.1 Quy trình phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân hủy nitrate Các mẫu sau khi đem về phịng thí nghiệm, tiến hành cân vơ trùng 10 g mẫu đối với mẫu rắn và hút 10 ml mẫu đối với mẫu lỏng cho vào 90 ml nƣớc muối sinh lý rồi đồng nhất mẫu. Sau đĩ hút 1 ml mẫu cấy sang ống nghiệm chứa 10 ml mơi trƣờng Giltay cĩ chứa ống Durnham.Tiến hành ủ ở nhiệt độ 300C trong 3 ngày. Sau 3 ngày tiến hành quan sát sự sinh khí trong các ống Durnham. Các mẫu nào sinh khí trong ống Durnham đƣợc sử dụng để định tính khả năng loại bỏ nitrate của các chủng vi khuẩn này bằng thuốc thử Griess A và Griess B. Nhỏ vài giọt thuốc thử Griess A và Griess B vào mơi trƣờng Giltay và quan sát màu sắc tạo thành. Những mẫu nào tạo thành màu đỏ thì loại vì trong trƣờng hợp này nitrate chuyển 40
  42. thành nitrite. Những mẫu nào khơng cĩ màu đỏ tạo thành thì cho một vài tinh thể Zn vào. Nếu mơi trƣờng chuyển sang màu đỏ thì khơng cĩ quá trình phản nitrate xảy ra, cịn nếu khơng cĩ màu đỏ tạo thành thì đây chính là các chủng vi khuẩn cĩ khả năng xử lý nitrate tốt. Từ các mẫu cho kết quả thích hợp trên mơi trƣờng Giltay, tiến hành pha lỗng mẫu ở các nồng độ từ 10-1 đến 10-6. Chọn 3 độ pha lỗng cuối cùng và ở mỗi độ pha lỗng, hút 100 μl dịch mẫu cấy trang trên mơi trƣờng DM. Mỗi độ pha lỗng thực hiện trên 2 đĩa. Ủ ở 300C trong 48 giờ. Sau khi ủ, tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trên đĩa ở các độ pha lỗng dựa vào hình dạng, màu sắc khuẩn lạc. Các khuẩn lạc này sau khi đƣợc xác định, tiến hành cấy chuyển sang mơi trƣờng LB agar để làm thuần và sau đĩ bảo quản 2.4.1.2 Sàng lọc khả năng loại bỏ nitrate đối với các chủng vi khuẩn Mơi trƣờng DM broth (chứa KNO3 2.5g/l) đƣợc sử dụng để sàng lọc các chủng vi khuẩn loại bỏ. Quy trình thực hiện nhƣ sau: - Các chủng vi khuẩn đƣợc tăng sinh trong erlen chứa 10ml mơi trƣờng LB broth trong thời gian 24 giờ trong điều kiện lắc 120v/p ở nhiệt độ phịng và sau đĩ tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 600 nm để xác định mật độ vi khuẩn trong erlen. Tiến hành pha lỗng để cĩ đƣợc mật độ vi khuẩn là 108 cfu/ml. - Sử dụng 1 ml dịch vi khuẩn đã nuơi cấy (mật độ 108 cfu/ml) đƣợc cho vào trong 100ml mơi trƣờng nitrate trong các erlen đƣợc đậy bằng bơng khơng thấm nƣớc, đậy bằng giấy bạc và sau đĩ đƣợc ủ ở nhiệt độ phịng trong 8 ngày khơng cần lắc. Đối chứng sử dụng cùng mơi trƣờng DM nhƣng khơng bổ sung vi khuẩn - Tại các thời điểm thu mẫu (0giờ, 3giờ, 6giờ, 12giờ, 24giờ, 48giờ, 72giờ, 96giờ, 120giờ, 144giờ, 168giờ), tiến hành thu 35 ml mỗi dịch nuơi cấy, ly tâm và tiến hành xác định hàm lƣợng NO3 cịn lại trong mẫu bằng phƣơng pháp PDA và xác định hàm lƣợng NO2 trong mẫu. 2.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý nitrate của chủng vi khuẩn phân lập được. 41
  43. Sau khi tiến hành chọn ra chủng vi khuẩn cĩ khả năng loại bỏ nitrate cao thời gian ngắn đồng thời hàm lƣợng nitrite tạo thành ít. Chủng này tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình loại bỏ nitrate (Foglar và ctv, 2004) Mật độ vi khuẩn khảo sát 105, 106, 107, 108 cfu/ml. Mơi trƣờng sử dụng DM broth với nồng độ nitrate là 200mg/l ở pH 6.8. Thời gian khảo sát : 0, 3, 6, 12, 24, 48 giờ. Sau khi ủ ở nhiệt độ phịng, tại mọi thời điểm, tiến hành thu 35ml mẫu. Tại mỗi thời điểm, tiến hành thu mẫu và đem đi ly tâm 4000 v/p trong 20 phút. Tách riêng phần cặn và phần dịch nổi. Đối với phần cặn, ta đem loại bỏ. Đối với phần dịch, tiến hành đo hàm lƣợng nitrate, nitrite tạo thành. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 2.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nitrate đến quá trình loại bỏ nitrate (Foglar và ctv, 2004; Reazee và ctv, 2010; Liang và ctv, 2011) Mật độ vi khuẩn sử dụng ban đầu là 108 là kết quả tốt nhất trong thí nghiệm 3.7.1. Mơi trƣờng sử dụng là DM broth các nồng độ nitrate là 200, 400, 600, 800 mg/l ở pH 6.8. Thời gian khảo sát : 0, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 h. Sau khi ủ ở nhiệt độ phịng, tại mọi thời điểm, tiến hành thu 35ml mẫu. Tại mỗi thời điểm, tiến hành thu mẫu và đem đi ly tâm 4000 v/p trong 20 phút. Tách riêng phần cặn và phần dịch nổi. Đối với phần cặn, ta đem loại bỏ. Đối với phần dịch, tiến hành đo hàm lƣợng nitrate, nitrite tạo thành. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 2.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng loại bỏ nitrate (Rwazee và ctv, 2010; Liang và ctv, 2011) Mật độ vi khuẩn ban đầu là 108 là mật độ khảo sát tốt nhất. Mơi trƣờng DM broth với nồng độ nitrate là 200mg/l ở pH là 6.8. Thời gian khảo sát: 0, 3, 6, 12, 24, 48 giờ. Nguồn C sử dụng là methanol, etanol, và succinate. Sau khi ủ ở nhiệt độ phịng, tại mọi thời điểm, tiến hành thu mẫu. Tại mỗi thời điểm, tiến hành thu mẫu và đem đi ly tâm 4000 v/p trong 20 phút. Tách riêng phần 42
  44. cặn và phần dịch nổi. Đối với phần cặn, ta đem loại bỏ. Đối với phần dịch, tiến hành đo hàm lƣợng nitrate, nitrite tạo thành. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 43
  45. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1.Kết quả phân lập vi khuẩn cĩ khả năng phân hủy nitrate 3.1.1. Kết quả định tính các mẫu chứa vi khuẩn xử lý nitrate trên mơi trường Giltay Bảng 3.1: Kết quả định tính các mẫu chứa vi khuẩn xử lý nitrate trên mơi trƣờng Giltay Mẫu Griess A + Griess B Zn Kết luận Đất (khơng màu) Khơng màu Khơng Dƣơng tính ( cĩ màu xảy ra phản ứng khử nitrate) Nƣớc thải (khơng Khơng màu Đỏ Âm tính (khơng màu) xảy ra phản ứng khử nitrate) Bùn (khơng màu) Khơng màu Đỏ Âm tính (khơng xảy ra phản ứng khử nitrate) Dựa vào kết quả định tính đƣợc trình bày ở bảng 3.1 chúng tơi nhận thấy rằng hệ vi sinh vật trong mẫu đất khi cấy vào mơi trƣờng Giltay cĩ khả năng loại bỏ nitrate với bằng chứng là khi cho thuốc thử Griess A và Griess B ta thấy cĩ xuất hiện màu đỏ trong mẫu. Theo Trần Phƣớc Linh (2007), trong thử nghiệm nitratase thì vi khuẩn sau khi ủ, cho thuốc thử Griess A và Griess B vào nếu khơng xuất hiện màu đỏ chứng tỏ khơng cĩ sự hình thành nitrite và khi cho bột kẽm vào cũng khơng xuất hiện màu đỏ, điều đĩ chứng tỏ rằng nitrate trong mẫu khơng tạo sản phẩm cĩ sự hiện diện của nitrite. Điều này chứng tỏ hệ vi sinh vật trong đất cĩ khả năng loại bỏ đƣợc nitrate trong mẫu và khơng sinh nitrite trong mơi trƣờng. Trong khi đĩ, hệ vi sinh vật trong mẫu nƣớc thải và bùn hoạt tính thu đƣợc từ khu cơng nghiệp Long Hậu lại khơng cĩ khả năng loại bỏ đƣợc nitrate. Trên cơ sở đĩ chúng tơi tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn cĩ khả năng loại bỏ đƣợc nitrate từ mẫu đất. 44
  46. 3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn xử lý nitrate từ mẫu đất Từ mẫu đất tại khu cơng nghiệp Việt Nam + Singapore, Bình Dƣơng ta tine61 hành phân lập các chủng xử lý nitrate trên mơi trƣờng DM chuyên biệt cho vi khuẩn xử lý nitrate, ở nhiệt độ phịng, trong điều kiện hiếu khí. Vì mơi trƣờng DM là mơi trƣờng đặc trƣng chỉ chứa KNO3 là nguồn năng lƣợng năng lƣợng duy nhất chỉ những vi sinh vật cĩ hệ enzyme nitratase cĩ khả năng phân hủy nitrate mới cĩ thể phát triển trên mơi trƣờng này. Mẫu đƣợc cấy trên mơi trƣờng DM agar bằng phƣơng pháp cấ trang. Tiến hành phân lập mà sau đây là bảng 3.2 thể hiện hình thái, màu sắc và kích thƣớc khuẩn lạc. Bảng 3.2: Kết quả hình thái 5 khuẩn lạc trên mơi trƣờng DM Chủng Đặc điểm 301 Trịn, lồi, trong suốt, cĩ tâm vàng, đƣờng kính >2mm 302 Trịn, lồi, trong suốt, cĩ tâm trắng đục, đƣờng kính >2mm 303 Phân thùy, quan sát dƣới ánh sáng cĩ màu xanh da trơn, d<1mm 304 Phân thùy, quan sát dƣới ánh sáng cĩ màu xanh da trơn, d<1mm Trịn, lồi, trong suốt, cĩ màu hơi vàng và chuyển sang cam khi già, 305 đƣờng kính <0.5mm Sau thời gian tuyển chọn chúng tơi phân lập đƣợc 5 khuẩn lạc riêng lẽ cấy chuyển nhiều lần trên mơi trƣờng DM agar để thu đƣợc giống thuần sau đĩ bảo quản ở âm 4 sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo. Căn cứ vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc, đã chọ lựa đƣợc 5 chủng cĩ khả năng phát triển trên mơi trƣờng chứa nitrate là nguồn năng lƣợng chính và duy nhất. Hầu hết các khuẩn lạc đều cĩ hình dạng và kích thƣớc khác nhau. Để cĩ cơ sở tuyển chọn chúng tơi tiến hành xác định các đặc điểm hình thái của chúng. 3.2 Kết quả xác định đặc điểm hình thái 45
  47. Bảng 3.3: Bảng kết quả sát định đặc điểm của 5 chủng vi khuẩn 301, 302, 303, 304, 305 Hình thái Kết quả Chủng 301: hình que ngắn, màu hồng Chủng 302: Hình cầu màu hồng Chủng 303: hình que ngắn màu hồng Chủng 304: hình cầu, màu tím Chủng 305: hình que màu hồng 46
  48. Do các chủng vi khuẩn mà chúng tơi đặc biệt quan tâm là chủng vi khuẩn cĩ khả năng xử lý nitrate và sống đƣợc trong điều kiện hiếu khí mà hầu hết trong những chủng cĩ khả năng phân hủy nitrate điều cĩ hình dạng hình que và Gram âm. Điều đĩ chứng minh đƣợc qua quá trình nhuộm Gram thì các chúng ta cĩ thể quan tâm nhiều hơn là chủng 301, 303, 305. 3.3. Kết quả sàng lọc khả năng phản nitrate, và khả năng sinh nitrite của các chủng vi khuẩn 3.3.1. Kết quả xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn sau 168 giờ 512512 256256 128128 64 64 301301 3232 1616 302302 8 8 303303 4 4 304 2 2 304 1 1 305305 0.50.5 0h0h 3h3h 6h6h 12h12h 24h24h 48h48h 72h72h 96h96h 120h120h144h144h168h168h đcđc 0.250.25 0.1250.125 0.06250.0625 0.031250.03125 Hình 3.1: Kết quả xử lý nitrate sau 168 giờ của 5 chủng vi khuẩn 301, 302, 303, 303, 304, 305. Dựa vào hình 3.1, chúng tơi nhận thấy các chủng vi khuẩn đều cĩ khả năng xử lý nitrate mạnh. Quá trình loại bỏ nitrate bắt đầu từ thời điểm 3 giờ, tuy nhiên, thời điểm này, các chủng vi khuẩn phân hủy nitrate tƣơng đối chậm vì chúng đang ở giai đoạn thích nghi với điều kiện mơi trƣờng. Đến thời điểm 12 giờ, hàm lƣợng nitrate trong mẫu bắt đầu giảm xuống nhanh hơn, chứng tỏ các chủng vi khuẩn bắt đầu thích nghi với mơi trƣờng. Đến thời điểm 24 giờ, quá trình loại bỏ nitrate xảy ra rất - mạnh ở tất cả các chủng, cụ thể là đối với chủng 301 giảm từ 250mg/l NO3 cịn 4.5 - - ± 1.08 mg/l NO3 , chủng 302 giảm từ 250mg/l giảm xuống cịn 5.32±1.91 mg/l NO3 - , chủng 303 xử lý nguồn nitrate 250mg/l giảm xuống cịn 3.49 ± 0.31 mg/l NO3 , - chủng 304 xử lý nitrate giảm từ 250 mg/l giảm xuống cịn 3.29 ± 0.43 mg/l NO3 và 47
  49. đặc biệt là chủng 305 giảm nguồn từ 250 mg/l cịn 2.7 ± 0.45 mg/l. Các chủng vi - khuẩn điều cĩ khả năng xử lý NO3 cao giảm nguồn nitrate ban đầu xuống thấp hơn 10 mg/l nitrate cho phép trong khoảng thời gian 24 giờ. Thời gian khảo sát càng kéo dài thì nồng độ nitrate trong mẫu càng giảm tuy nhiên tốc độ nitrate giảm khơng nhiều do tại các thời điểm lúc sau thì nồng độ nitrate trong mẫu giảm xuống thấp đồng thời mật độ vi khuẩn trong mẫu khá lớn nên ảnh hƣởng đến khả năng loại bỏ nitrate. 3.3.2. Tốc độ xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát Tốc độ loại bỏ nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát đƣợc trình bày ở Hình 3.2. 120.00% 100.00% 80.00% D301 D302 60.00% D303 D304 40.00% D305 20.00% 0.00% 3h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h Hình 3.2 : Tốc độ xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát Dựa vào hình 3.2, chúng tơi nhận thấy rằng tốc độ xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát tăng dần theo thời gian khảo sát. Tại thời điểm 3 giờ, tốc độ xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn này khá chậm do quá trình thích nghi và tăng dần vào thời điểm 6 giờ vả 12 giờ. Tuy nhiên, đến thời điểm 24 giờ tốc độ loại bỏ nitrate của các chủng vi khuẩn này tăng đột biến và đạt trên 98 % ở tất cả các chủng, riêng đối với chủng D305 thì vƣợt qua mức 99 %. Điều này chứng tỏ cả 5 chủng vi khuẩn 48
  50. đều cĩ khả năng xử lý nitrate rất tốt. Tuy nhiên, để cĩ thể chọn lựa đƣợc các chủng vi khuẩn này cho các thí nghiệm tiếp theo, chúng tơi phải tiến hành khảo sát hàm lƣợng nitrite tạo thành vì nitrite là một thành phần cĩ độc tính khá cao nên nếu chúng hiện diện trong mẫu với nồng độ cao sẽ gây nguy hiểm cho ngƣời và động vật. 3.3.3. Kết quả sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn sau 168h 0.35 0.3 0.25 301 302 0.2 303 0.15 304 0.1 305 đc 0.05 0 0h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h Hình 3.3: Kết quả sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn sau 168h Dựa vào hình 3.3, chúng tơi nhận thấy rằng khả năng sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn biến động khá lớn theo thời gian. Nhìn chung, quá trình hình thành nitrite tăng dần ở thời gian đầu và đạt cực đại ở thời điểm 48 giờ ở hầu hết các chủng. Nhƣng sau thời điểm 48 giờ thì hàm lƣợng nitrite bắt đầu giảm xuống khá nhanh. Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn này cũng cĩ khả năng loại bỏ nitrite và đến thời điểm khảo sát cuối cùng (168 giờ). Mặc dù hàm lƣợng nitrite tạo thành tại thời điểm 168 giờ của chủng D304 là thấp nhất nhƣng trong quá trình hoạt động xử lý nitrate của chủng này thì lƣợng nitrite luơn hình thành khá cao nên cĩ khả năng gây ảnh hƣởng đến chất lƣợng nguồn nƣớc. Trong 49
  51. khi đĩ, chủng D305 thực hiện quá trình loại bỏ nitrate thì lƣợng nitrite tạo thành cao hơn so với chủng D304 nhƣng trong các thời điểm trƣớc đĩ thì hàm lƣợng nitrite tạo ra khá thấp (hàm lƣợng nitrite tạo thành cao nhất là 0,1568 mg/l tại thời điểm 72 giờ). Điều này đã chứng tỏ rằng, chủng vi khuẩn D305 cĩ khả năng chuyển hĩa nitrate và sau đĩ xử lý luơn nitrite mới tạo thành. Sau khi thực hiện thí nghiệm sàng lọc chúng tơi chọn chủng 305 tiến hành các thí nghiệm tiếp theo vì nĩ cĩ khả năng sử lý đƣợc nitrate mạnh và sinh ra nitrite thấp phù hợp với yêu cầu trong xử lý mơi trƣờng. 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình loại bỏ nitrate và khả năng sinh nitrite (Foglar và ctv, 2004) 3.4.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình xử lý nitrate 250 200 10^5 150 10^6 100 10^7 10^8 50 0 0h 3h 6h 12h 24h 48h Hình 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình xử lý nitrate Dựa vào hình 3.4, chúng tơi nhận thấy rằng khả năng loại bỏ nitrate của chủng vi khuẩn D305 cĩ sự khác biệt ở mật độ vi khuẩn ban đầu. Mật độ vi khuẩn đàu vào càng cao thì khả năng loại bỏ xảy ra càng nhanh. Sự khác biệt ở khả năng xử lý nitrate của chủng vi khuẩn D305 theo mật độ khơng cĩ sự biến đổi lớn trong khoảng 3 giờ đầu, vì lúc này chúng đang trong giai đoạn thích nghi với mơi trƣờng. Tuy nhiên, ta vẫn thấy rõ do khác nhau về mặt mật độ nên khả năng xử lý cũng khác nhau. Vào lúc khoảng 6 giờ là các khả năng xử lý nirate đạ cĩ sự khác biệt một 50
  52. cách rõ rệt. Đối với mật độ 105 thì khả năng xử lý nitrate từ 200 mg/l giảm xuống cịn 134.16±2.98 mg/l, mật độ vi khuẩn 106 thì khả năng xử lý nitrate trong mơi trƣờng từ 200 mg/l giảm cịn 65.13±10.01 mg/l, đối với mật độ là 107 thì khả năng tiêu thụ nitrate từ 200 mg/l giảm cịn 59.76±16.79 mg/l, đối với mật độ vi khuẩn 305 cấy là 108 thì khả năng xử lý nitrate từ 200 mg/l giảm xuống cịn 20.04±34.52 mg/ l. Điều này chứng tỏ rằng ở mật độ vi khuẩn quá thấp điển hình nhƣ mật độ 105 thì mật độ vi khuẩn quá thấp trong mơi trƣờng dẫn đến khả năng xử lý thấp, hàm lƣợng nitrate quá cao so với mật độ sẽ gây ức chết ngƣợc lại đối với vi khuẩn, làm vi khuẩn cĩ khả năng chết và khơng xử lý tốt, dẫn đến mất thời gian trong quá trình xử lý nƣớc thải. Dựa vào hình 3.4 thì ta thấy ở mật độ là 108 là xử lý tốt nhất. Ở thời điểm khảo sát 48 giờ hàm lƣợng nitrate cịn 15.81±5.47 mg/ l gần tiến đến hàm lƣợng cho phép 10mg/l, nên cĩ thể nĩi 108 là mật độ tối ƣu khi tiến hành cấy vi khuẩn xử lý nƣớc thải. Ở mật độ 106, 107 tuy cĩ xử lý nhƣng vẫn cịn khá cao so với hàm lƣợng nitrate của mật độ 108 là 46,87± 22,94 mg/l và 36,93 ± 13.41 mg/l. Tuy nhiên mật độ vi khuẩn trong mơi trƣờng quá cao sẽ gây cạnh tranh về nguồn dinh dƣỡng, tế bào vi khuẩn bị tồn thƣơng và chết gây ơ nhiễm, khĩ khảo sát nguồn nitrate cịn lại, gây tốn chi phí khi sử dụng nguồn giống xử lý. 3.4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến sự sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate 0.6 0.5 0.4 10^5 0.3 10^6 10^7 0.2 10^8 0.1 0 0h 3h 6h 12h 24h 48h 51
  53. Hình 3.5: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến sự sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate Dựa vào hình 3.4 cĩ sự biến động sinh nitrite cĩ mối liên hệ theo mật độ qua các thời gian khảo sát. Nhìn chung thì quá trình hình thành nitrite cũng tăng nhƣng nĩ phụ thuộc vào mật độ rất lớn. Mật độ càng cao thì khả năng sinh nitrite càng cao ở thời điểm rõ nhất là vào 12 giờ, sau khi vi khuẩn đã thích nghi và bắt đầu tổng hợp năng lƣợng sống. Ở mật độ 105 thì líc 12 giờ sinh nitrite thấp nhất với hàm lƣợng khảo sát là 0.04 ± 0.005 mg/l, mật độ 106 cũng sinh nitrite thấp với hàm lƣợng 0.05 ±0.012 mg/l, và 107 thì hàm lƣợng sinh nitrate tăng lên 0.25 ± 0.002 mg/l, và cao nhất là 108 hàm lƣợng nitrite cao nhất là 0.51 ± 0.12 mg/l. Điều này chứng tỏ mật độ càng cao thì hoạt động xử lý càng mạnh và sinh nitrite nhiều. Tuy nhiên ở khoảng thời gian là 48 giờ thì lƣợng nitrite sinh ra ở mật độ 108 giảm mạnh cịn 0.2 mg/l. Cịn các mật độ cịn lại thì khả năng sinh nitrite ngày càng tăng cao với hàm lƣợng nitrite ở mật độ 105 là 0.05 ± 0.001,mật độ 106 cĩ hàm lƣợng nitrite là 0.82 mg, và ở mật độ 107 thì hàm lƣợng nitrite là 0.5 gây ảnh hƣởng đến chất lƣợng nƣớc khi xử lý. Vì vậy mật độ 108 là mật độ tốt nhất trong thí nghiệm . 3.5.Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ nitrate đến quá trình loại bỏ nitrate (Foglar và ctv, 2004; Reazee và ctv, 2010; Liang và ctv, 2011) 900 800 700 600 200mg/l 500 400mg/l 400 600mg/l 300 800mg/l 200 100 0 0h 3h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h 52
  54. Hình 3.6: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ nitrate 200mg/l, 400mg/l, 600mg/l, 800mg/l lên quá trình loại bỏ nitrate. Dựa vào hình 3.6 thấy hàm lƣợng nitrate giảm theo thời gian. Ở các nồng độ nitrate ban đầu là 200mg/l, 400mg/l, 600mg/ l, 800 mg/l gây ảnh hƣởng đến khả năng xử lý nitrate rất nhiều của vi khuẩn khi ở mật độ cố định là 108cfu/ml. Trong khoảng 6 giờ đầu là nitrate cĩ giảm nhƣng khơng nhiều, bắt đầu xử lý ở thời gian 24 giờ thì ta thấy chủng vi khuẩn 305 cĩ khả năng phân giải nitrate ở hàm lƣợng cao 800mg/ l. Khả năng xử lý nitrate ở 24 giờ đối với hàm lƣợng 200mg/l giảm cịn 33.83 ± 14.89 mg/ l với hiệu suất đạt đƣợc 83.5%, đối với hàm lƣợng là 400 mg/l thì giảm cịn 126.83 mg/l với hiệu suất đạt đƣợc trong quá trình xử lý 68.5%, đối với hàm lƣợng 600 mg/l vi khuẩn xử lý cịn lại là 214,97 ± 87.75 mg/l với hiệu suất làm việc 64.3%, và 800mg/l giảm cịn 684.59 ± 37 mg/l hiệu suất xử lý là 14.5 %. Điều này chứng tỏ với hàm lƣợng nitrate 200mg/l sẽ là hàm lƣợng thích hợp mà vi khuẩn cĩ khả năng xử lý với hiệu suất cao. Mắc khác thì với hàm lƣợng 400mg/l, 600mg/l cũng cho hiệu suất xử lý tƣơng đối cĩ thể chấp nhận đƣợc khi xử lý. Ở hàm lƣợng vi khuẩn 800mg/ l thì hiệu suất làm việc rất thấp. Điều này chứng tỏ hàm lƣợng nồng độ nitrate ban đầu rất quan trọng đối với quá trình xử lý nitrate của vi khuẩn. Nếu hàm lƣợng nirate quá cao sẽ ức chết hoạt động của tế bào vi khuẩn, làm tăng áp suất thẩm thấu qua màng tế bào, làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của tế bào vi khuẩn, làm tế bào mau chĩng chết đi. Nếu quá thấp sẽ khơng đủ dinh - dƣỡng cho quá trình xử dụng NO3 nhƣ là chất nhận điện tử cuối cùng và là nguồn năng lƣợng cho chúng phát triển. 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng loại bỏ nitrate (Rwazee và ctv, 2010; Liang và ctv, 2011). 53
  55. 250 200 150 DM + 1%metanol DM + 1%etanol 100 DM + 1%succinate 50 0 0h 3h 6h 12h 24h 48h Hình 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng loại bỏ nitrate Dựa vào hình 3.7 chúng tơi nhận thấy vi khuẩn vẫn cĩ khả năng xử lý đƣợc nitrate khi ta cho thêm các nguồn carbon khác nhau. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đƣợc xác định và sự phân hủy và chuyển đổi carbon. Trong khoảng thời gian 3 giờ đầu tiên thì khả năng xử lý kém do tế bào vi khuẩn chƣa thích nghi với mơi trƣờng. khi đến 24 giờ tiếp theo thì hàm lƣợng nitrate giảm mạnh đối với các nguồn carbon. Hàm lƣợng nitrate xử lý đƣợc đối với mơi trƣờng cĩ bổ sung metanol từ 200 mg/l giảm cịn 47.32 ± 6.66 mg/l, cịn đối với mơi trƣờng chứa etanol thì lƣợng nitrate 200mg/ l giảm xuống cịn 29 ± 3.84 mg/l, đối nguồn carbon là succinate thì từ 200 mg/l giảm xuống cịn 26.86±5.3 mg/l. Điều đĩ chứng tỏ là với nguồn carbon là succinate thì tạo điều kiện tốt hơn cho vi khuẩn khuẩn xử lý nhanh hơn so với hai nguồn carbon cịn lại. Tuy nhiên chúng tơi nhận thấy là đối tài liệu của Shu-Cheng Liang (2011) thì vi khuẩn khơng cĩ khả năng xử lý đƣợc metanol là chất rất độc. Theo hình 3.6 thì chủng vi khuẩn 305 cĩ thể sử dụng cả metanol và etanol làm nguồn carbon để xử dụng và nguồn nitơ làm năng lƣợng chính. Và nguồn carbon vi khuẩn sử dụng tốt nhất trong thí nghiệm và succinate. Vì nĩ đƣợc chọn nhƣ nguồn 54
  56. carbon duy nhất trong quá trình thích nghi, và trong chu trình acid citric succinate cĩ thể liên quan đến quá trình sinh tổng hợp trực tiếp. Và việc sử dụng nguồn carbon bổ sung vơ mơi trƣờng nuơi cấy để ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn, và kéo dài khả năng xử lý nitrate hơn. Theo bài báo khoa học của Shu-Cheng Liang (2011) thì việc xử dụng nguồn carbon phù hợp và tối ƣu hĩa chúng sẽ đẩy mạnh việc xử lý nitrate cao.Ảnh hƣởng của nguồn carbon cĩ ý nghĩa rất quan trọng trong việc khử nitrate. Vì vậy chúng tơi tiến hành thực hiện thí nghiệm cho 3 nguồn carbon là metanol, etanol, succinate bổ sung trong mơi trƣờng nuơi cấy. Nhất là đối với metanol và etanol là hai nguồn carbon độc hại trong mơi trƣờng nếu vi khuẩn cĩ khả năng sử dụng thì sẽ làm giảm rất nhiều chi phí khi xử lý các nguồn nƣớc thải ngồi nitrate cịn chứa cả etanol, metanol. Đây cũng là một thành cơng trong thí nghiệm. 55
  57. CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Từ mẫu đất chúng tơi đã phân lập đƣợc 5 chủng vi khuẩn cĩ khả năng xử lý nitrate và sinh nitrite khơng đáng kể. Và chủng vi khuẩn 305 đƣợc chọn là chủng tốt nhất vì khả năng xử lý nitrate nhanh và tạo nitrite thấp. Sau đĩ chúng tơi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng xử lý nitrate của chủng 305. Đối với thí nghiệm khảo sát thì nồng độ nitrate 200 mg/l là chủng xử lý tốt nhất ở 24 giờ, giúp tiết kiệm đƣợc thời gian lẫn chi phí sản xuất khi vận hành hệ thống xử lý nƣớc thải trong cơng nghiệp. Thí nghiệm khảo sát mật độ vi khuẩn đến quá trình loại bỏ nitrate thì với mật độ 108 thì kết quả xử lý hiệu quả nhất sau 6 giờ khảo sát nồng độ nitrate giảm. Thí nghiệm khảo sát khả năng phát triển và xử lý nitrate khi ta thêm 1% hàm lƣợng 3 nguồn carbon là etanol, metanol, succinate, và thu đƣợc kết quả tốt nhất là succinate. 4.2. Kiến nghị Do thời gian làm đề tài cĩ giới hạn nên chúng tơi khơng thể định danh chủng vi khuẩn. cần làm một số thử nghiệm sinh hĩa. - Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân giải nitrate - Khảo sát chế độ lắc đến khả năng xử lý nitrate của chủng vi khuẩn. - Khảo sát của tỷ lệ C/N đến khả năng loại bỏ nitrate. 56
  58. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ (1976). Giáo trình vi sinh vật học, tập 2. NXB: Giáo dục [2]. Cao Ngọc Điệp, Phan Trƣờng Khanh, Nguyễn Thị Xuân Mỵ (2008). Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sơng Cửu Long. Viện nghiên cứu và phát triển sinh học, Đại học CầnThơ. [3]. Cao Văn Phụng (2009). Xử lý và tái chế nước và chất thải rắn từ ao nuơi cá vùng đồng bằng sơng Cửu Long để cải thiện đời sống và giảm ơ nhiễm nước, Minisstry of Agriculture và Rural Development. [4]. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2010). Ứng dụng vi khuẩn nitrate hĩa trong nuơi trồng thủy sản. Viện nuơi trồng thủy sản [5]. A. TillBrian, AlvaresJ. J. Lenly J Weathers and Prdro (1998). Fe(0)- Supported Autotrophic Denitrification. [6]. A. Copeland, S. Lucas, A. Lapidus, K. Barry, J. C. Detter, T. Glavina del Rio, N. Hammon, S. Israni, E. Dalin, H. Tice, S. Pitluck, A. C. Munk, T. Brettin, D. Bruce, C. Han (2006).Complete sequence of plasmid 1 of Paracoccusdenitrificans PD1222, Submitted (DEC – 2006) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. [7]. C. B Van Neil and M. B. Allen (1952). A note on Pseudomonas stutzeri. J. Bacteriol, 64 (3): 413. [8]. Diana H. Davis, Michael Doudoroff, Roger Y. Stanier (1969). Proposal to reject the genus hydrogenomonas taxonomic implications, University of California and University of Texas, California 94720; Texas 77025. [9]. E. Gorbikova, N.Belevich, M. Wikstrưm, M. Verkhovsky (2007). Protolytic reactions on reduction of cytochrome oxidase studied by ATR-FTIR spectroscopy, Biochemistry. 46.13 (2007), 4177 – 4183. [10]. Hiroaki Uemotovà Hiroshi Saiki (1996). Nitrogen removal by tubular gel containing Nitrosomonaseuropaea and Paracoccusdenitrifficans. Applied and Environmental Microbiology, Nov, 1996, p. 4224 – 4228. 58
  59. [11]. Igor Kucera (2006). Interference of chlorate and chlorite with nitrate reduction in resting cells of Paracoccusdenitrificans. [12]. Jaap van Rijn, Yossi Tal, Harold J. Schreier (2005). Denitrification in recirculating systems: Theory and applications. [13]. Johannes Sikorski, Martin Mohle and WilfriedWackernagel (2002). Indentification of complex composition, strong strain diversity and directional selection in local Pseudomonas stutzeri populations from marine sediment and soil, Environmental Microbiology, 4 (8), 465 – 476. [14]. Johannes Sikorski, Ramon Rosello-Mora and Michael. G. Lorenz (1999).Analysis of genotypic diversity and relationships among Pseudomonas stutzeri strains by PCR – based genomic fingerprinting and multilocus enzyme electrophoresis, System. Appl. Microbiol. 22, 393 – 402. [15]. Jorge Lalucat, AntoniBennasar, Rafael Bosch, Elena García-Valdés and Norberto J. Palleroni, 2006. Biology of Pseudomonas stutzeri. Microbiology and Molecular Biology Reviews, p. 510 – 547. [16]. J. Reimann, U. Flock, H. Lepp, A. Honigmann, P. Adelroth (2007). A pathway for protons in nitric oxide reductase from Paracoccusdenitrificans. Elsevier 1767.5 (2007), 362 – 373. [17]. K. C. Marshall, D. F. Toerien, A. Gerber, L. H. Lotter, T. E. Cloete (1990).Enhanced biological phosphorus removal in activated sludge systems. in Advances in microbial ecology, edMarshallK. C. (Plenum Press, New York, N.Y), 11:173–219. [18]. M. W. Beijerinck, D. C. J. Minkman (1910). Bildung und Verbrauch von StickoxyduldurchBakterien, ZentralblattfürBakteriologie, Parasitenkunde und Infektionskrankheiten und Hygiene, AbteilungII25: 30–63. [19]. SrinuNaik. S and Y. PydiSetty (2012). Biological denitrification of wastewater with immobilized cells of Pseudomonas stutzeri attached to polypropylene and polyoxymethylene. International Journal of Biological, Ecoloical and Environmental Sciences (IJBEES) vol. 1, No. 2, 2277 – 4394. 59
  60. [20]. S.Lyubenova, M. Siddiqui, M. Vries, B. Ludwig, T. Prisner (2007). Protein-protein interactions studied by EPR relaxation measurements: cytochrome c and cytochrome c oxidase. J. Phys. Chem. B. 111.14 (2007), 3839 – 3846. [21]. Tracy E. Letain, Staci R. Kane, Tina C. Legler, Edmund P. Salazar, Peter G. Agron and Harry R. Beller (2007). Development of a Genetic System for the Chemolithoautotrophic Bacterium Thiobacillusdenitrificans. [22]. W. Visniac, M. Santer (1975). The thiobacilli,Bacteriol. Rev. 21:195–213. [23]. Yu Yang, HuiguangZuhu, Vicki L. Colvin and Pedro J. Alvarrez (2011). Cellular and transcriptional response of Pseudomonas stutzeri to quantum dots under aerobic and denitrifying condition, Environ. Sci. Technol. 2011, 45, 4988 – 4994. [24]. ZhenyaZhanga, Zhongfang Lei, XiaoyanHea, Zhiyin Zhang, YingnanYanga, Norio Sugiuraa (2009). Nitrate removal by Thiobacillusdenitrificans immobilized on poly(vinyl alcohol) carriers. [25]. [26]. 60