›

Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây Elephantopus sp

pdf 102 trang thiennha21 12/04/2022 3850
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây Elephantopus sp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfnghien_cuu_anh_huong_cua_dung_moi_tach_chiet_den_hoat_tinh_k.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây Elephantopus sp

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI TÁCH CHIẾT ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY ELEPHANTOPUS SP. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt TS. Lương Tấn Trung Sinh viên thực hiện : Dương Minh Trí MSSV: 1151110379 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. Đồ án tốt nghiệp NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN i
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Dương Minh Trí ii
  4. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Dương Minh Trí iii
  5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG BÌA LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Phạm vi nghiên cứu 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1 Giới thiệu về Elephantopus sp. 4 1.1.1 Nguồn gốc của cây Elephantopus sp. 4 1.1.2 Phân loại 4 1.1.3 Đặc điểm thực vật học 4 1.1.4 Một số thành phần hóa học trong cây Elephantopus sp. 6 1.1.5 Tính chất dược lý 6 1.2 Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 8 1.2.1 Khái niệm và phân loại 8 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 8 1.2.3 Một số hợp chất kháng khuẩn trong thực vật 9 1.2.4 Tình hình nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật trên thế giới và tại Việt Nam 16 1.3. Phương pháp tách chiết các hợp chất kháng khuẩn 18 1.3.1 Nguyên lý của quá trình tách chiết 18 1.3.2 Cơ sở của quá trình tách chiết. 18 1.3.3 Các phương pháp tách chiết một số hợp chất kháng khuẩn 18 1.4 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh 22 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 22 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 26 1.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30 1.5.1. Khái niệm 30 1.5.2. Ý nghĩa 30 1.5.3. Cách xác định chỉ số MIC 31 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 32 2.1.1. Địa điểm 32 2.1.2. Thời gian nghiên cứu 32 2.2. Vật liệu 32 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 32 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu 32 2.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất 33 v
  7. Đồ án tốt nghiệp 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị 33 2.3. Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật 34 2.3.2. Phương pháp tăng sinh 34 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 35 2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào 36 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu 36 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 36 2.3.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 37 2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học 37 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu 38 2.4. Bố trí thí nghiệm 38 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao từ Elephantopus sp. 39 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Elephantopus sp. 43 2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Elephantopus sp. 44 2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ cây Elephantopus sp. 45 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao từ cây Elephantopus sp. 53 vi
  8. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây Elephantopus sp. 54 3.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 55 3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 56 3.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp 58 3.2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp 60 3.2.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi sinh vật còn lại 63 3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Elephantopus sp 68 3.4. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ cây Elephantopus sp 69 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1. Kết luận 70 4.2. Đề nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC vii
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl Sulfoxide MIC: Minimum Inhibitory Concentration viii
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi cao từ các loại dung môi khác nhau 53 Bảng 3.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ cây Elephantopus sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị 64 Bảng 3.3. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ dung môi ethanol 70% trên các chủng vi sinh vật đối kháng 66 Bảng 3.4 Kết quả định tính một số thành phần hóa học trong cây Elephantopus sp. . 68 ix
  11. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây Elephantopus sp. và hoa 5 Hình 1.2: Hình thái E. coli trên kính hiển vi điện tử 22 Hình 1.3: Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử 23 Hình 1.4: Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử 24 Hình 1.5: Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử 25 Hình 1.6: Hình thái Pseudomonas trên kính hiển vi điện tử 26 Hình 1.7: Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử 27 Hình 1.8: Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử 29 Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 39 Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu hồi cao 40 Hình 2.3: Dịch chiết mẫu bằng nước 41 Hình 2.4: Dịch chiết mẫu bằng ethanol 50% 42 Hình 2.5: Dịch chiết mẫu bằng ethanol 70% 42 Hình 2.6: Dịch chiết mẫu bằng ethanol 90% 43 Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát hoạt tính cao chiết 44 Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát MIC 46 Hình 2.9: Sơ đồ tiến trình định tính thành phần hóa học 47 Hình 2.10: Thử nghiệm Molisch 48 Hình 2.11: Thử nghiệm Fehling 49 Hình 2.12: Thử nghiệm Dragendroff 50 Hình 2.13: Thử nghiệm tạo bọt 50 Hình 2.14: Thử nghiệm tannin 51 Hình 2.15: Định tính thành phần steroid 52 Hình 3.1: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 56 Hình 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 56 Hình 3.3: Vòng ức chế S. dublin – cao chiết ethanol 50% và 90% 56 x
  12. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. 58 Hình 3.5: Vòng ức chế Shi. flexneri – cao chiết nước và ethanol 70% 58 Hình 3.6: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 60 Hình 3.7: Vòng ức chế V. alginolyticus – cao chiết ethanol 70% 60 Vòng ức chế V. cholere– cao chiết ethanol 70% 61 Hình 3.8: Vòng ức chế V. harveyi – cao chiết ethanol 70% 62 Vòng ức chế V. harveyi – cao chiết ethanol 90% 62 Hình 3.9: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn còn lại 63 Hình 3.10: Vòng ức chế Lis. innocua – cao chiết ethanol 70% 64 Và Pseudomonas 64 xi
  13. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nhiều thế kỉ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là nguồn carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất phụ gia thực phẩm có giá trị. Những nghiên cứu về các hợp chất có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX đến nay và đã có khoảng hơn 80.000 hợp chất khác nhau ở thực vật được công bố. Trong thiên nhiên, có rất nhiều cây cỏ có chất kháng khuẩn. Nguồn dược liệu của nước ta vô cùng phong phú, trong đó có nhiều cây thuốc kháng sinh được Y học dân tộc dùng làm thuốc từ lâu. Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm đại hành, lá Móng tay được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm phế quản và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác. Nhiều cây thuốc được nhân dân ta dùng chữa vết thương có kết quả tốt như Mỏ quạ, Nọc sởi, lá Vối, lá Bòng bong, Sắn thuyền, Lô hội, lá Trầu không, Sài đất Trong điều trị các vết thương phần mềm, nhiều tác giả trong và ngoài nước cũng đã công nhận dùng chất kháng khuẩn thực vật chữa vết thương chóng sạch, các đám hoại tử dễ bong, tổ chức hạt non phát triển mạnh, vết thương mau lành hơn chữa bằng kháng sinh tân dược vì trong nước sắc cây thuốc không phải chỉ có kháng sinh mà còn có những chất kích thích giúp vết thương chóng đầy miệng, có các loại men, vitamin và các nguyên tố vi lượng tạo điều kiện cho vết thương chóng khỏi. 1
  14. Đồ án tốt nghiệp Một trong những vấn đề nan giải đối với thuốc kháng sinh tân dược hiện nay là hiện tượng quen thuốc, kháng thuốc và loạn khuẩn do tình hình lạm dụng kháng sinh trong điều trị ngày càng phát triển ở nhiều nước trên thế giới. Elephantopus sp. hay còn gọi là Cúc chỉ thiên mềm, là một loài phân bố rộng, dễ tìm kiếm. Một số nghiên cứu cho thấy thành phần chính trong cây là phenolic: caffeic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid, 1,4-dicaffeoylquinic acid, và 3,4- dihydroxy-cinamic acid methyl ester. Theo y học cổ truyền, các bộ phận của cây Elephatopus sp. đều được sử dụng để làm thuốc trị viêm nhiễm, tiêu chảy Các hợp chất sinh học chỉ chiếm một phần nhỏ nhưng lại có vai trò quan trọng trong việc cung cấp nguồn dược liệu quý, vấn đề trích ly những hợp chất này sao cho giữ được hiệu quả của chúng cũng rất quan trọng. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây Elephantopus sp. ” 2. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây Elephatopus sp. - Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của các loại cao chiết từ cây Elephantopus sp. 3. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây Elephantopus sp. - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Elephantopus sp. đối với các chủng vi khuẩn. - Định tính thành phần hóa học của cao chiết các loại dung môi từ cây Elephantopus sp. 2
  15. Đồ án tốt nghiệp 4. Phạm vi nghiên cứu - Khảo sát trên các loại dung môi: ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90%, nước cất. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. - Chỉ tiến hành định tính một số thành phần hóa học. 3
  16. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về Elephantopus sp. 1.1.1. Nguồn gốc của cây Elephantopus sp. Elephantopus sp. hay còn gọi là Cúc chỉ thiên mềm, cúc chỉ thiên hoa trắng, chân voi nhám, cỏ lưỡi mèo là một loài thực vật có hoa trong họ Cúc. Theo những hồ sơ nghiên cứu ban đầu, Elephantopus sp. được phát hiện ở Senegal vào năm 1900 và ở Sierra Leone năm 1914 (GBIF, 2013) thuộc Tây Phi. Các mẫu vật từ cây được ghi nhận lần đầu từ Cameroon vào năm 1952, Togo vào năm 1981, Seychelles vào năm 1982, Australia vào năm 1989 và Tanzania vào năm 1991 (GBIF, 2013). Sự phát tán của loài cây này không rõ ràng; trong tự nhiên nó được coi là một loại cây dại, nhưng trong các trường hợp khác dường như nó đã được giới thiệu như một loại cây thuốc có ích. Elephantopus sp. đã trở thành loài cây quan trọng ở Cameroon và ở Đài Loan, cùng với các loài châu Á như E. scaber. 1.1.2. Phân loại Giới: Plantae Ngành: Spermatophyta Ngành phụ: Angiospermae Lớp: Dicotyledonae Bộ: Asterales Họ: Asteraceae Chi: Elephantopus 1.1.3. Đặc điểm thực vật học 1.1.3.1. Mô tả Cúc chỉ thiên mềm là loại cây thân thảo cao 0,5 - 1m, thân và lá có nhiều lông. Lá mọc dài theo thân, không cuống; phiến thon dạng bay, dài 10-15cm, gốc ôm thân, mép khía lượn, có lông mềm ngắn ở mặt dưới; các lá trên rất tiêu giảm. Cụm hoa dài theo thân, nhánh mang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung; các hoa đầu 4
  17. Đồ án tốt nghiệp phụ cao 8mm, mang 4-5 hoa trắng. Quả bế cao 3mm, có rãnh; mào lông có 5 tơ (Empinotti và Duarte, 2008). Hình 1.1 Cây Elephantopus sp. và hoa. 1.1.3.2. Sinh sản Ở Queensland (Australia), cây có thể ra hoa quanh năm nhưng thường ra hoa vào tháng 6 - 7 (Chính phủ Queensland, 2013). Tại Brazil, Ferreira và ctv (2001) báo cáo sự nảy mầm nhanh chóng của những hạt giống của Elephantopus sp Tuổi thọ của các hạt giống trong đất là khá ngắn - 90% các hạt có thể bị mất đi trong một năm và 100% trong 2 năm (North Queensland, 2009). 1.1.3.3. Phân bố Elephantopus sp. có nguồn gốc ở Trung và Nam Mỹ, từ Argentina đến Mexico, bao gồm cả vùng biển Caribbean, nhưng đã được lan truyền rất rộng rãi vào châu Phi, Đông Nam Á và Thái Bình Dương. Ở nước ta, cây mọc ở rừng thưa, rừng thông, dọc đường đi ở nhiều nơi, nhất là ở các tỉnh Tây Nguyên. 5
  18. Đồ án tốt nghiệp Elephantopus sp. sinh trưởng phù hợp với điều kiện nhiệt đới ẩm. Chúng cần ánh sáng và lượng nước đầy đủ cho sự tăng trưởng. Do đó các đồng cỏ, các đồn điền, ven rừng, ven đường và đầm lầy phù hợp cho sự phát triển của Elephantopus sp 1.1.4. Một số thành phần hóa học trong cây Elephantopus sp. Một số nghiên cứu cho thấy thành phần chính trong cây là phenolic, caffeic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid, 1,4-dicaffeoylquinic acid, và 3,4-dihydroxy-cinamic acid methyl ester. - Trong lá sấy khô có chứa molephantin (1), molephantinin (2), 2-deethoxy-2- hydroxyphantomolin (3), stigmasterol (4), acid béo α-amyrin ester (5a), và acid béo lupeol ester (5b). - Nghiên cứu thành phẩn hóa học tìm thấy 9 hợp chất: 2beta-deethoxy-2- hydroxyphantomolin (1), 2beta-methoxy-2-deethoxyphantomolin (2), 2beta- methoxy-2-deethoxy-8-O-deacylphantomolin-8-O-tigli-nate (3), molephantinin (4), betulinic acid (5), magnolol (6), honokiol (7), dibutly phthalate (8) and tricin (9). - Cao chiết methanol của cây mang lại sesquiterpene lactone mới, 2-de- ethoxy-2-hydroxyphantomolin, cùng với lupeol, lupeol acetate, epifriedelinol, molephantin, và 2-de-ethoxy-2-methoxyphantomolin (9). 1.1.5. Tính chất dược lý 1.1.5.1. Theo kinh nghiệm dân gian Theo y học cổ truyền, các bộ phận của cây Elephantopus sp. đều được sử dụng để làm thuốc. Thuốc có vị đắng, se, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi thuỷ tiêu thũng. Lá trừ giun, lợi tiểu. Thường dùng trị (1) Cảm mạo, viêm hạch hạnh nhân cấp, viêm hầu họng, viêm kết mạc; (2) Viêm gan vàng da cấp, xơ gan cổ trướng; (3) Viêm thận cấp và mạn; (4) Cước khí thuỷ thũng, lỵ, tiêu chảy; (5) Cụm nhọt, eczema, rắn cắn. Ngày dùng 15-30g, dạng thuốc sắc. Dùng ngoài giã cây lá tươi lấy nước uống, bã đắp trừ rắn cắn (dùng riêng hoặc phối hợp với Bồ cu vẽ, lá 6
  19. Đồ án tốt nghiệp Ớt). Có thể lấy lá tươi giã với mẻ và giấm đắp trị nhọt độc hoặc nấu nước rửa bệnh ngoài da. Ở Dominica, người ta dùng lá Cúc chỉ thiên mềm và lá Cỏ lào hãm uống để trị bệnh tiêu chảy (Võ Văn Chi, 2012). 1.1.5.2. Tác dụng sinh học Tại Brazil, lá cây Elephantopus sp. được sử dụng như tác nhân làm lành thương và điều trị viêm phế quản, ho và cúm trong y học dân gian (Empinotti và Duarte. 2008). Một loạt các ứng dụng truyền thống khác được liệt kê theo Lorenzi (1982). Cao chiết ethanol của Elephantopus sp. đẩy nhanh việc chữa gãy xương ở chuột thông qua tác dụng kích thích sự biệt hóa nguyên bào xương và khoáng, điều đó chứng minh cho việc sử dụng cây thuốc này đã có từ lâu tại Cameroon (Ngueguim và ctv, 2012.). Ooi và ctv (2011) đã chứng minh vai trò chính của 3,4-di-O -caffeoyl quinic acid trong khả năng chống oxy hóa của cao chiết Elephantopus sp Các hợp chất này cũng gây độc tế bào và α-glucosidase tác dụng ức chế sự chết của tế bào qua trung gian và do đó là một chất không độc hại đầy hứa hẹn để điều trị ung thư và bệnh tiểu đường loại 2. Tabopda và ctv (2008) đã xác định một sesquiterpene lactone mới trong đó Elephantopus sp. thể hiện các hoạt động gây độc tế bào quan trọng chống lại u nguyên bào thần kinh B104 ở chuột. Kết quả khác cho rằng cao chiết Elephantopus sp. làm giảm sự hình thành hắc tố, dẫn tới giảm biểu hiện của Tyr và Trp. Ngoài ra, biểu hiện của melanocortin- 1 receptor (MC1R) đã được điều chỉnh bởi cao chiết, giải mẫn cảm với α- melanocyte-stimulating hormone (α-MSH) của các tế bào được điều trị với các cao chiết (Hasegawa và ctv, 2010.). Ở Ecuador, Elephantopus sp. là một trong 10 đơn vị phân loại thường gặp nhất trong điều trị leishmaniasis (một bệnh do nhiễm ký sinh trùng Leishmania) (Gachet và ctv, 2010). 7
  20. Đồ án tốt nghiệp Elephantopus sp. được chứng minh có tác dụng bảo vệ chống lại nhiễm độc gan do β-D-galactosamine và acetaminophen, bằng cách giảm nồng độ trong huyết thanh glutamate-oxalate-transaminase [aspartate aminotransferase] và huyết thanh glutamate-pyruvate-transaminase [alanine aminotransferase]. Các tiểu thùy trung tâm bị hoại tử được cải thiện rõ bằng cách xử lý với cao chiết từ cây Elephantopus sp. (Lin và ctv, 1995). 1.2. Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 1.2.1. Khái niệm và phân loại Các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus. Các hợp chất kháng khuẩn thường có tác dụng khá đặc hiệu lên các loài vi khuẩn khác nhau ở một nồng độ thường là rất nhỏ. Những chất này có thể thuộc nhiều cấu trúc hóa học khác nhau như alkaloid, các hợp chất quinone, flavonoid, tinh dầu v.v Ngày nay người ta chia các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ra làm 2 nhóm sau: - Nhóm bay hơi: gồm những chất do thực vật tiết ra có khả năng khuếch tán vào không khí và có tác dụng ức chế sự sinh trưởng, phát triển của virus, vi khuẩn. - Nhóm không bay hơi: gồm những chất ở sâu trong các tế bào thực vật, không có khả năng khuếch tán vào không khí. Muốn sử dụng nó, phải dựa vào đặc điểm, tính chất của từng loại kháng sinh thực vật. Thường người ta hay sử dụng chúng dưới các dạng: Giã nát lấy nước cốt, ngâm, sắc hoặc chiết bằng các dung môi thích hợp. 1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình 8
  21. Đồ án tốt nghiệp tổng hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant secondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào (Radulovíc và ctv, 2013). 1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn trong thực vật 1.2.3.1. Alkaloid a. Khái niệm về alkaloid Năm 1819, Wilhelm Meissner đề nghị xếp các chất có tính kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhóm riêng và gọi tên là alkaloid. Ông là người đầu tiên đưa ra khái niệm về alkaloid: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và lấy từ thực vật. Theo Polonopski: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. b. Tính chất chung của alkaloid Đặc điểm lý học: - Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy nghĩa là trong công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường. Ví dụ: Morphine (C17H19NO3), codein (C18H21NO3), strychnin (C21H22N2O2), quinin (C20H24N2O2), reserpin (C33H40O9N2) Những alkaloid thành phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng. Ví dụ như: Coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2), spartein (C15H26N2 ). Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ trước khi chảy. Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường 9
  22. Đồ án tốt nghiệp vững bền, không bị phân hủy ở nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu. - Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như capsaixin, piperin - Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu trừ một số ít alkaloid có màu vàng như berberin, palmatin, chelidonin, - Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen trái lại các muối alkaloid thì dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực. Đặc điểm hóa học: - Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất yếu như cafein, piperin vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromin và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin. Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH khi định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp. - Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng. - Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt ) tạo ra muối phức. - Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. 10
  23. Đồ án tốt nghiệp c. Vai trò của alkaloid Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc. Tác dụng của alkaloid thường khác nhau. Nhiều alkaloid có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương gây ức chế như morphin, codein, scopolamin, reserpin hoặc gây kích thích như strychnin, cafein, lobelin. Nhiều chất tác dụng lên hệ thần kinh giao cảm gây kích thích: Ephedrin, hordenin, làm liệt giao cảm, ergotamin, yohimbin hoặc kích thích phó giao cảm: pilocarpin, eserin; có chất gây liệt phó giao cảm: hyoscyamin, atropin; có chất phong bế hạch giao cảm: nicotin, spartein, coniin. Trong số alkaloid có chất gây tê tại chỗ, có chất làm giãn cơ trơn, chống co thắt. Có alkaloid làm tăng huyết áp (ephedrin, hydrastin), có chất làm hạ huyết áp trên tim như ajmalin, quinidin và α-fagarin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim. Có alkaloid diệt ký sinh trùng: Quinin độc đối với ký sinh trùng sốt rét; emetin và conexin độc đối với amip dùng để chữa lỵ. Isopelletierin, arecolin dùng để trị sán. 1.2.3.2. Flavonoid a. Khái niệm chung về flavonoid Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu nguồn gốc thực vật. Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu trúc. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng (Flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên một số có màu xanh, tím đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon, cần chú ý để khỏi nhầm lẫn. b. Tính chất chung của flavonoid Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hoá), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm 11
  24. Đồ án tốt nghiệp đến đỏ cam. Các chất thuôc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tuỳ theo pH của môi trường. Tuy nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác. Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycoside và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là cồn nước. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước. Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7- hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng. c. Vai trò của flavonoid + Các dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO., ROO Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hoá. + Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzyme oxy hoá - khử. Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, các bệnh trong nhãn khoa. Các dẫn chất anthocyanosid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc. + Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan. Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác). Flavonoid còn có tác dụng thông tiểu, chống loét chữa đau dạ dày, chống viêm điều trị ban đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị, điều hòa nhịp tim. + Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của 12
  25. Đồ án tốt nghiệp một số dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7-O-b-D- galactopyranosid. 1.2.3.3. Tinh dầu a. Khái niệm về tinh dầu Tinh dầu là một hỗn hợp của nhiều thành phần, thường có mùi thơm, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi được ở nhiệt độ thường và có thể điều chế từ thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước. b. Tính chất chung của tinh dầu * Thể chất: Đa số là chất lỏng ở nhiệt độ thường, một số thành phần ở thể rắn: Menthol, borneol, camphor, vanilin, heliotropin. * Màu sắc: Không màu hoặc vàng nhạt. Do hiện tượng oxy hóa màu có thể sẫm lại. Một số có màu đặc biệt: Các hợp chất azulen có màu xanh mực * Mùi: Đặc biệt, đa số có mùi thơm dễ chịu, một só có mùi hắc, khó chịu (tinh dầu giun). * Vị: cay, một số có vị ngọt: Tinh dầu quế, hồi. * Bay hơi được ở nhiệt độ thường. * Tỷ trọng: Đa số nhỏ hơn 1. Một số lớn hơn 1: Quế, đinh hương, hương nhu. c. Vai trò của tinh dầu Tinh dầu đóng vai trò quyến rũ côn trùng giúp cho sự thụ phấn của hoa. Một số nghiên cứu khác cho rằng tinh dầu bài tiết ra có nhiệm vụ bảo vệ cây, chống lại sự xâm nhập của nấm và các vi sinh vật khác. Tinh dầu và các dược liệu chứa tinh dầu có một phạm vi sử dụng rất rộng lớn trong đời sống hàng ngày của con người, trong nhiều ngành khác nhau thể hiện qua những tác dụng: - Tác dụng trên đường tiêu hoá: Kích thích tiêu hoá, lợi mật, thông mật. 13
  26. Đồ án tốt nghiệp - Tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn: Tác dụng trên đường hô hấp như tinh dầu bạch đàn, bạc hà. Tác dụng trên đường tiết niệu như tinh dầu hoa cây Barosma betulina. - Một số có tác dụng kích thích thần kinh trung ương: Dược liệu chứa tinh dầu giàu anethol: Đại hồi - Một số có tác dụng diệt ký sinh trùng. - Rất nhiều tinh dầu có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương, sinh cơ v.v khi sử dụng ngoài da. 1.2.3.4. Saponin a. Khái niệm saponin Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo = xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Người ta cũng phân lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao. b. Tính chất chung của saponin - Saponin có một số tính chất đặc biệt: làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch; làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng; có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b -hydroxysteroid khác. - Saponin gây độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên. - Saponin đa số có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin. Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất. 14
  27. Đồ án tốt nghiệp c. Vai trò của saponin - Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn, Saponin làm tăng sự thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu - Một số saponin có tác dụng chống viêm. Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus. Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm. Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể). Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid. 1.2.3.5. Tannin a. Khái niệm chung về tannin Từ "Tanin" được dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt trong dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da biến thành da thuộc không thối và bền. Do đó, tanin được định nghĩa là những hợp chất polyphenol có trong thực vật có vị chát được phát hiện dương tính với "thí nghiệm thuộc da" và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn. b. Tính chất chung của tannin - Tanin có vị chát, làm săn da, tan được trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ. - Kết tủa với gelatin. Dung dịch tanin (0,5-1%) khi thêm vào dung dịch gelatin 1% có chứa 10% natrichlorid thì sẽ có tủa. Acid gallic và các pseudotanin khác cũng làm kết tủa gelatin nhưng với dung dịch tương đối đậm đặc. - Kết tủa với các alkaloid. Tanin tạo tủa với các alcaloid hoặc một số dẫn chất hữu cơ có chứa nitơ khác như hexamethylen tetramin, dibazol 15
  28. Đồ án tốt nghiệp - Kết tủa với muối kim loại. Tanin cho tủa với các các muối kim loại nặng như chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt. - Phát hiện acid chlorogenic. Dịch chiết có acid chlorogenic khi thêm dung dịch ammoniac rồi để tiếp xúc không khí dần dần sẽ có màu xanh lục. c. Vai trò của tannin Ở trong cây, tanin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy hoá khử. Là những chất đa phenol, tanin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo vệ cho cây. Dung dịch tanin kết hợp với protein, tạo thành màng trên niêm mạc nên ứng dụng làm thuốc săn da. Tanin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét, hoặc chỗ loét khi nằm lâu. Tanin có thể dùng trong để chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy. Tanin kết tủa với kim loại nặng và với alkaloid nên dùng chữa ngộ độc đường tiêu hoá. Tanin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn. 1.2.4. Tình hình nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật trên thế giới và tại Việt Nam  Tình hình nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật trên thế giới - Vào năm 2010 tại Trung Quốc, Hao Liu và ctv bằng phương pháp hóa lý và phân tích quang phổ đã phân lập được 7 flavonoid từ các bộ phận của cây Halostachyscaspica và xác định các hợp chất này có một phổ kháng khuẩn rộng hoạt động trên các vi sinh vật cũng như các khả năng chống oxy hóa. - Năm 2011, Naveed Ahmad và cộng sự đã nghiên cứu về sự chống oxi hóa và kháng khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại dung môi khác nhau. - Năm 2013 tại Hàn Quốc, Suk-Nam Kang và ctv nghiên cứu xác định hàm lượng phenolic và flavonoid, hoạt động chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn của chiết 16
  29. Đồ án tốt nghiệp xuất ethanol từ thân và lá của Impatiens balsamina L. (họ bóng nước) thu hoạch vào các thời điềm khác nhau, các chất chiết từ lá I. balsamina L. có thể ứng dụng như là một chất chống oxy hóa tự nhiên trong bảo quản thực phẩm. - Năm 2014, Andrei Mocan và ctv đánh giá các hoạt động chống oxy hóa và kháng khuẩn và hàm lượng polyphenolic của lá và quả Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. và đưa ra kết luận lá cây là một nguồn giàu flavonoid, một nguồn có giá trị của các hợp chất chống oxy hóa.  Tình hình nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam - Năm 2011, Nguyễn Thị Thúy Anh đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn sâu răng gây ra bởi vi khuẩn Streptococcus mutans của một số loài thực vật (cau, xoài, lược vàng, húng quế ) - Tại hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5 năm 2013, Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong đã công bố nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và khả năng kháng khuẩn của dịch chiết quả Nhàu (Morinda citrifolia L.) - Năm 2012, Đặng Thúy Nhung và cộng sự đã đưa ra phương pháp xử lí nước thải bằng hạt cây chùm ngây bước đầu cho kết quả khả quan về khả năng diệt vi khuẩn hiếu khí và yếm khí trong nước thải chuồng nuôi lợn. Cũng trong năm đó, Nguyễn Thị Bích Thuyền và ctv đã trình bày kết quả khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng tốt trên các vi sinh vật thử nghiệm của tinh dầu lá húng chanh. - Năm 2015, Nguyễn Thị Hoàng Lan và ctv tiến hành nghiên cứu nhằm xác định khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô đối với 8 chủng vi khuẩn gây hư hỏng và ngộ độc thực phẩm. 17
  30. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Phương pháp tách chiết các hợp chất kháng khuẩn 1.3.1. Nguyên lý của quá trình tách chiết Chiết xuất là quá trình dùng dung dịch thích hợp để hoà tạn các chất tan có trong dược liệu, chủ yếu là các chất có tác dụng điều trị, sau đó tách chúng ra khỏi phần không tan của dược liệu. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết. Các chất có tác dụng diều trị trong dược liệu (alkaloid, glycoside, vitamin, tinh dầu ) Các chất không có tác dụng điều trị, các chất gây khó khăn trong quá trình bảo quản ( đường tinh bột, pectin, chất nhầy, nhựa ) được gọi là tạp chất. 1.3.2. Cơ sở của quá trình tách chiết Quá trình chiết xuất hoạt chất trong dược liệu bằng dung môi là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng, trong đó dung môi là pha lỏng còn dược liệu là pha rắn. Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là: - Sự hòa tan của chất tan vào dung môi. - Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi. - Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật. Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu ) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất. 1.3.3. Các phương pháp tách chiết một số hợp chất kháng khuẩn Các phương pháp tách chiết gồm có ngâm và chiết kiệt. Trong phương pháp ngâm dược liệu được ngâm trong 1 lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được 18
  31. Đồ án tốt nghiệp rút hết ra và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm - chiết được lập lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu. Trong phương pháp chiết kiệt, dung mội được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với 1 tốc độ nhất định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, chiết kiệt là 1 quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn. Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại họat chất mà chọn cho thích hợp. Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, các hợp chất polyphenol ) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do ) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng. Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp, dược liệu tươi được thả từ từ trong cồn sôi vừa để diệt enzyme vừa để hòa tan hoạt chất. Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao v.v đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất. 1.3.3.1. Tách chiết hợp chất alkaloid Quá trình chiết xuất alkaloid dựa vào tính chất chung sau: - Alkaloid thường là những base yếu, tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin; nên phải tán nhỏ dược liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh. - Hầu hết các alkaloid base không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực (hydrocacbon thơm, chloroform, ether). Trái lại, các muối alkaloid thường tan trong nước, cồn và không tan trong các dung môi ít phân cực. 19
  32. Đồ án tốt nghiệp Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid như loại bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp. 1.3.3.2. Tách chiết hợp chất flavonoid Không có một phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ. Các flavonoid glycoside thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực. Thông thường để chiết các flavonoid glycoside, người ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hoặc ethanol hay hỗn hợp CHCl3 và ethanol. Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần lớn các flavonoid. Hỗn hợp CHCl3 và cồn hay dùng để chiết các dẫn chất methoxy flavonoid. Các chất anthocyanin thường kém bền vững nhất là các acyl anthocyanin được acyl hoá với các acid aliphatic do đó người ta thường chiết bằng methanol có mặt của các acid yếu như acid acetic, tartric hoặc citric thay vì HCl. Đối với những chất dễ bị biến đổi thuộc các nhóm flavan-3-ol, anthocyanin, flavanon, chalcon glycosid thì nên làm đông khô. Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì để kết tủa. Sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid thì flavonoid được giải phóng. 1.3.3.3. Tách chiết tinh dầu Có 4 phương pháp được áp dụng để tách chiết tinh dầu: 1. Phương pháp cất kéo hơi nước. 2. Phương pháp chiết xuất bằng dung môi. 3. Phương pháp ướp. 4. Phương pháp ép. Nguyên tắc của sự lựa chọn trong sản xuất là: Yêu cầu về chất lượng trong sử dụng, bản chất của dược liệu và giá thành. Phương pháp 1 được áp dụng rộng rãi nhất. 20
  33. Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc phương pháp cất kéo hơi nước: Dựa trên nguyên tắc cất một hỗn hợp 2 chất lỏng bay hơi được không trộn lẫn vào nhau (nước và tinh dầu). Khi áp suất hơi bão hoà bằng áp suất khí quyển, hỗn hợp bắt đầu sôi và hơi nước kéo theo hơi tinh dầu. Hơi nước có thể đưa từ bên ngoài do các nồi hơi cung cấp hoặc tự tạo trong nồi cất. Một số lưu ý khi chế tạo tinh dầu bằng phương pháp cất: o Độ chia nhỏ dược liệu phải phù hợp với bản chất dược liệu. Những dược liệu chứa tinh dầu nằm trong tế bào ở sâu trong các mô, cần chia nhỏ đến tỷ lệ thích hợp. o Thời gian cất tuỳ theo bản chất của dược liệu và tính chất của tinh dầu. Với tinh dầu giun cần cất nhanh, nếu không tinh dầu sẽ bị phân huỷ (30 phút). o Tinh dầu sau khi thu được cần phải loại nước triệt để bằng phương pháp ly tâm. 1.3.3.4. Tách chiết hợp chất tannin Tanin hầu như không tan trong các dung môi kém phân cực, tan được trong cồn loãng, tốt nhất là nước nóng. Hiệu suất chiết được nâng cao nếu được tác động bằng siêu âm. Sau khi chiết bằng nước, có thể tủa tanin bằng (NH4)2SO4, lọc, lấy tủa, hoà lại trong aceton nước (6:1), cất đến khô rồi rửa bằng ether. Trong quá trình chiết xuất, muốn tránh sự oxy hoá thì có thể cho thêm vào dịch chiết một ít acid ascorbic hoặc metabisulfit. Muốn tách tanin người ta thường chiết từng phân đoạn theo độ phân cực của dung môi rồi sắc ký qua gel với Sephadex hoặc sắc ký điều chế với chất hấp phụ là polyamid, triển khai bằng cồn nước với các độ cồn khác nhau, cũng có thể tách bằng sắc ký giấy. 21
  34. Đồ án tốt nghiệp 1.4. Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh 1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 1.4.1.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli a) Đặc điểm Escherichia là trực khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử. Nhiệt độ thích hợp 370C, pH 7.2 - 7.4. Sống chủ yếu hội sinh trong đường ruột của người và động vật. Chúng được biết đến như là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm trùng đường tiết niệu và các bệnh đường tiêu hóa (Trần Văn Cường, 2009). Hình 1.2. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử Đặc điểm sinh hóa của Escherichia: do chúng có phản ứng lên men đường nên dòng Escherichia cụ thể là E. coli lên men sinh hơi các loại đường lactose, fructose, glucose, levulose, galactose, xylose, manitol; lên men không chắc chắn các loại đường dulcitol, saccharose và salicin. Ngoài ra chúng còn có một số phản ứng sinh hoá khác như phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính (Trần Văn Cường, 2009). b) Khả năng gây bệnh Escherichia sản sinh nhiều loại độc tố: enterotoxin, vertoxin, neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra (Trần Văn Cường, 2009). 22
  35. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.2. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Salmonella a) Đặc điểm Salmonella là trực khuẩn Gram âm kị khí tùy nghi, hình que, có khả năng di động, kích thước 0.4 – 0.6 x 1 – 3 μm thích hợp phát triển tốt ở nhiệt độ 370C, pH 7.2-7.6 (Trần Văn Cường, 2009). Hình 1.3. Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử b) Khả năng gây bệnh Salmonella cũng có khả năng sản sinh ra độc tố enterotoxin, ngoài việc phá hủy lớp niêm mạc ruột, độc tố này cũng có tác động gây tiêu chảy, độc tố thẩm xuất chậm (DPF - Delayed Permeability Factor – độc tố không chịu nhiệt) và độc tố thẩm xuất nhanh (RPF - Rapid Permeability Factor - độc tố chịu nhiệt) (Trần Văn Cường, 2009). 1.4.1.3. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. a) Đặc điểm Vibrio là phẩy khuẩn Gram âm, hình cong, kích thước 0.3-0.5 x 1.4-2.6 μm. Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh, kỵ khí tùy nghi. Chúng phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng thường và môi trường kiềm (pH >7) Vibrio có thể sống được vài ngày đến 2-3 tuần. Dễ bị diệt bởi nhiệt độ (80°C/5 phút), bởi hoá chất thông thường và môi trường axit. 23
  36. Đồ án tốt nghiệp nhiệt độ thích hợp là 370C, có thể phát triển tốt trong môi trường kiềm (pH 8,5- 9,5), có nồng độ NaCl cao (3%) (Triệu Anh Tuấn, 2013). Hình 1.4. Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và catalase dương tính (Triệu Anh Tuấn, 2013). b) Khả năng gây bệnh Vibrio cholearae gây bệnh bằng độc tố ruột (choleragen). Đây là nội độc tố có cấu trúc gồm đơn nguyên A (trọng lượng phân tử là 27 000 dalton, mang độc tính cao) và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác dụng kích thích tăng cAMP (Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat). Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng cAMP, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl- và nước gây tiêu chảy cấp tính theo (Triệu Anh Tuấn, 2013). 1.4.1.4. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. a) Đặc điểm Shigella là trực khuẩn Gram âm mảnh dài 1-3 µm, rộng 0,5-0,6 µm, không có tiên mao, vì vậy không có khả năng di động, không có vỏ không sinh bào tử, Shigella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 370C (Chang Tran, 2014). 24
  37. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử Trong môi trường lỏng làm đục đều. Trên môi trường đặc SS (Salmonella- Shigella) sau 24h khuẩn lạc có đường kính khoảng 2mm, tròn lồi mặt nhẵn bờ đều. Shigella lên men glucose không sinh hơi, lên men manitol (trừ Shigella dysenteriae không lên men manitol), hầu hết Shigella không lên men lactose, chỉ có Shigella sonnei lên men lactose nhưng chậm, không sinh H2S, Urease âm tính, phản ứng Indol thay đổi, phản ứng đỏ metyl dương tính, phản ứng VP âm tính, phản ứng citrate âm tính (Chang Tran, 2014). b) Khả năng gây bệnh Các chủng Shigella đều có độc tố ruột (enterotoxin) là ShET-1 và ShET-2 chúng làm thay đổi sự vận chuyển điện giải ở các tế bào niêm mạc đại tràng, gây tăng tiết dịch. Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào. Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn ở người, đây là một bệnh truyền nhiễm có thể gây thành các vụ dịch địa phương. Thương tổn đặc hiệu khu trú ở ruột già, trên lâm sàng biểu hiện bằng hội chứng lỵ với các triệu chứng: đau bụng quặn, đi ngoài nhiều lần, phân có nhiều mũi nhầy và thường có máu. Shigella gây bệnh bằng cơ chế xâm nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và nhân lên với số lượng lớn trong tổ chức ruột. Các Shigella đều có nội độc tố. Riêng 25
  38. Đồ án tốt nghiệp trực khuẩn Shiga còn có thêm ngoại độc tố bản chất là protein. Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào (Chang Tran, 2014). 1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 1.4.2.1. Nhóm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa a) Đặc điểm Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Đặc điểm hình thái học chung của Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Hình 1.6. Hình thái Pseudomonas trên kính hiển vi điện tử Pseudomonas aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5 - 420C, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0. Trên môi trường đặc: khuẩn lạc thường to giống như quả trứng ốp (fried eggs), nhẵn, dẹt, trung tâm 26
  39. Đồ án tốt nghiệp lồi, có màu xanh ánh kim và có xu hướng mọc lan. Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc mọc gây tan máu hoàn toàn (β). Một số đặc điểm sinh hóa chính của Pseudomonas aeruginosa: không lên men glucose, có khả năng thủy giải gelatin, khử nitrate (+) oxidase (+), sản xuất hydrogensulphide từ thiosulphate, sản xuất 2-keto-D-gluconateacid từ D-gluconate, sử dụng glycerol, succinate, L-arabinose, formate, acetate, lactose, xylose, mannitol, rhamnose, P-arabinose, trehalose, cellobiose, inositol, sucrose (Nguyễn Thị Như Yến và ctv, 2011). b) Khả năng gây bệnh Độc tính của Pseudomonas aeruginosa chủ yếu là exotoxin của vi sinh vật bao gồm loài Pseudomonas aeruginosa đuợc biết là gây độc trên ấu trùng của loài muỗi cũng như lòai sâu bọ cánh phấn. Pseudomonas aeruginosa gây chết loài muỗi ở giai đọan ấu trùng, nhộng, và theo nghiên cứu loài này cũng gây độc tố đối với họ nhà bay. Mặc dù phuơng thức hoạt động của độc tố này chưa đuợc hiểu rõ, những loại độc tố như của P. aeruginosa đuợc hấp thụ hấp thụ qua biểu bì của loài côn trùng và họat động trên protein tan huyết. Dịch formulation (VCRC B426) từ sự trao đổi chất của P. aeruginosa tiết ra như là phuơng pháp đuợc sử dụng để chống lại loài muỗi (Nguyễn Thị Như Yến và ctv, 2011). 1.4.2.2. Nhóm vi khuẩn Enterococcus faecalis Hình 1.7. Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử 27
  40. Đồ án tốt nghiệp Enterococcus faecalis là vi khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn phát triển tốt hơn ở điều kiện khí trường có thêm 5-10% CO2 và thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C, một số phát triển được ở 10 tới 400C (Dương Văn Sĩ, 2010). Khuẩn lạc có màu hồng tới đỏ đậm khi nuôi cấy trong môi trường azide tetrazolium chứa triphenyl tetrazolium chloride (TTC), trên môi trường thạch máu thì khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khô, có màu hơi xám trong. Có phản ứng catalase và oxidase âm tính, có khả năng lên men đường glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường (Dương Văn Sĩ, 2010). b) Khả năng gây bệnh Viêm họng, viêm hạch có mủ, viêm khớp, viêm thận cấp tính, viêm các van tim. Gây đau dạ dày và mùi hôi ở cổ họng. 1.4.2.3. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus Staphylococcus là các cầu khuẩn Gram dương không tạo nha bào có đường kính khoảng 1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành cụm (tụ) trông giống như chùm nho. Staphylococcus chủ yếu phân thành 2 nhóm: Staphylococcus có enzyme coagulase: Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius và Staphylococcus không có enzyme coagulase: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri. a) Đặc điểm Staphylococcus thuộc loại vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Staphylococcus có khả năng phát triển được ở khoảng nhiệt độ dao động từ 10 tới 450C và môi trường có nồng độ muối cao tới 10%. 28
  41. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.8. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc dạng S, đường kính 1 - 2mm, sau 24 giờ khuẩn lạc có màu vàng rơm (đối với Staphylococcus aureus) hoặc có màu trắng (đối với các loại Staphylococcus khác). Trên môi trường thạch máu Staphylococcus phát triển nhanh: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có màu vàng. Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, có màu trắng và thường không gây tan máu, khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu đen bóng,lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc (Trần Quang Cảnh, 2012). b) Khả năng gây bệnh Một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide. Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào. Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc. Tụ cầu còn sản xuất một số enzyme có khả năng phá hủy mô liên kết của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong cơ thể, phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào bạch cầu hạt cũng như đại thực bào, phá hủy lớp thượng bì. Enzyme 29
  42. Đồ án tốt nghiệp này gây tổn thương da tạo các bọng nước. Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu. Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) bền với nhiệt. Các độc tố ruột này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm. Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (beta- lactamase). Enzyme này phá hủy vòng beta- lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. 1.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 1.5.1. Khái niệm Nồng độ ức chế tối thiểu Minimum inhibitory concentration (MIC) là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật sau khoảng 24 giờ nuôi cấy. 1.5.2. Ý nghĩa Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn có thể áp dụng cho các phòng thí nghiệm vi sinh trong các bệnh viện tuyến tỉnh, bệnh viện khu vực, bệnh viện tuyến trung ương, các viện vệ sinh dịch tễ và các cơ sở nghiên cứu. Phương pháp chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định nồng độ chất diệt khuẩn nhỏ nhất ức chế được sự phát triển của vi khuẩn giúp cho việc nghiên cứu lựa chọn và tính toán liều dùng khi áp dụng trên người. Phương pháp này giúp cho con người biết được nồng độ ức chế và tiêu diệt đối với từng loại vi khuẩn với nồng độ chất diệt khuẩn thích hợp để chế tạo ra sản phẩm thương mại hoặc sử dụng trong y học Chỉ số MIC có tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn chất diệt khuẩn phù hợp với từng loại vi sinh vật Việc loại trừ sạch vi khuẩn có thể dự đoán dựa vào dữ liệu MIC chọn được nồng độ tối ưu để làm chậm sự chọn lọc vi khuẩn kháng thuốc. 30
  43. Đồ án tốt nghiệp 1.5.3. Cách xác định chỉ số MIC Tùy theo phương pháp áp dụng mà có cách xác định chỉ số MIC khác nhau Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường thạch: Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc mọc. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng: Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc trong ống nghiệm có nồng độ thuốc nhỏ nhất không có vi khuẩn phát triển. Phương pháp đặt khoanh giấy: MIC được tính toán bằng cách đo các vùng ức chế 31
  44. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm Địa điểm thu mẫu: Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà (thuộc huyện Lạc Dương và Đam Rông, tỉnh Lâm Đồng). Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2015 đến tháng 8/2015. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Toàn bộ mẫu cây Elephantopus sp. gồm : lá, thân, cành, hoa. 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu Vi sinh vật chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn gây bệnh được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Y tế công cộng, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2, bao gồm: Nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm: E. coli 0208, E. coli O157:H7 và Enterotoxigenic E. coli - ETEC. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm: Shi. boydii, Shi. flexneri và Shi. sonnei. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gồm: V. cholerae, V. harveyi, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm: S. dublin, S. enteritidis, S. typhi và S. typhimurium. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm Lis. innocua và Lis. monocytogenes. Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác bao gồm : Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus feacalis. 32
  45. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất - Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). - Ethanol (Việt Nam) - DMSO (Dimethy lsulfoxide) (Trung Quốc) - Ciprofloxacin (Việt Nam) - Các loại thuốc thử : Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendroff, Hager, Wagner, Ninhydrin, NaOH, NaCl, chì acetate, acetic anhydride, gelatin, chloroform, ferric chlodride, H2SO4 đậm đặc. 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị 2.2.4.1. Dụng cụ - Đĩa petri - Bình môi trường 250 ml, 500 ml, - Ống nghiệm 1000 ml - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Đèn cồn - Ống đong 100 ml - Dụng cụ đục lỗ - Giấy lọc - Thước đo - Micropipette loại 100 µl, 1000 µl - Bông thấm và bông không thấm - Các loại đầu típ nước - Pipet 1 ml, 10 ml - Đũa thủy tinh - Ống ly tâm ependoff 2 ml - Các loại dụng cụ khác như: bao - Dây cấy ria, que cấy trang chịu nhiệt, kéo, giấy báo, kẹp gấp, muỗng, dao, thun 33
  46. Đồ án tốt nghiệp 2.2.4.2 Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan). - Tủ ấm 370C (Memmert Đức). - Máy ly tâm (Tuttligen Đức). - Máy đo UV – VIS (Hach). - Cân phân tích (Orbital Đức). - Máy cất nước 1 lần (Branstead Mỹ). - Máy lắc (IKA – Đức). 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật Mục đích: Tách chiết các hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau. Nguyên tắc: Sử dụng các loại dụng môi để tách chiết các hợp chất có trong cây thuốc nhờ lực liên kết hóa học từ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây thuốc. Mẫu tươi được rửa sạch loại bỏ bụi bẩn rồi đem đi phơi khô, sau đó xay thành dạng bột. Bột cây thuốc sẽ được ngâm để trích ly hợp chất với dung môi trong 24 giờ và lặp lại từ 3 đến 5 lần cho đến khi dịch chiết đã hoàn toàn trong suốt. Dịch chiết sẽ được loại bỏ dung môi để giữ lại phần cao chiết bằng cách cô cách thủy ở nhiệt độ 70oC. Cao chiết thu được sẽ được chia vào trong chai và bảo quản ở nhiệt độ 4oC (Atta và Mouneir, 2004). 2.3.2. Phương pháp tăng sinh Mục đích: Hoạt hóa các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bước đầu giúp thu sinh khối nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh 34
  47. Đồ án tốt nghiệp dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013). 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 - 50C) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần. Đối với các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. 35
  48. Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40 % cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức MacFahrland): 9 Mật độ = OD600nm x 1,02 x 10 (CFU/ml) 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết (Phạm Minh Nhựt, 2013). 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khà năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đường kính vòng kháng khuẩn (mm). Cách thực hiện: Hút 0.1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ thích hợp cho vào môi trường TSA và tiến hành trang đều cho tới khô. Sau đó, dùng một ống trụ kim loại có đường kính 6 mm tạo các giếng trên đĩa thạch và nhỏ 100µl dịch 36
  49. Đồ án tốt nghiệp cao chiết ở nồng độ khảo sát vào, giữ yên trong vòng 1 giờ để dịch cao chiết có thể khuếch tán vào môi trường thạch. Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả thông qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm) ( Ramakrishnan, 2011). 2.3.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường lỏng (broth dilution method) được dựa theo mô tả của Burt và ctv (2006) với một vài thay đổi. Nguyên tắc: Dựa trên sự thay đổi độ đục của dung dịch chứa dịch cao chiết và dịch vi khuẩn phụ thuộc vào sự hoạt động của vi sinh vật. Phương pháp: Chuẩn bị ống nghiệm vô trùng chứa môi trường TSB, thêm dịch cao chiết pha loãng với nồng độ khảo sát và vi khuẩn đã được tăng sinh và pha loãng (106 CFU/ml) vào. Sau đó đem các ống nghiệm ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ cho vi sinh vật chỉ thị phát triển. Cuối cùng quan sát sự thay đổi độ đục được đánh giá trực quan, bất kỳ thay đổi độ đục so với ống nghiệm đối chứng được ghi nhận là dương tính với sự hoạt động của vi sinh vật trong ống nghiệm. Nồng độ thấp nhất mà tại đó ống nghiệm không bị đục được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). 2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học Phương pháp xác định thành phần hóa học dựa theo phương pháp của Yadav và ctv (2013) Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ cây Elephantopus sp. bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hoá để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. Định tính thành phần carbohydrate bằng phản ứng với các loại thuốc thử Molisch, Fehling và Barfoed. Định tính thành phần alkaloid bằng phản ứng với các loại thuốc thử Mayer, Dragendroff , Hager và Wagner. 37
  50. Đồ án tốt nghiệp Định tính thành phần saponin bằng phản ứng tạo bọt. Định tính thành phần anthraquinone glycoside bằng phản ứng Bontrager. Định tính thành phần flavonoid bằng phản ứng alkaline, phản ứng Shinoda, phản ứng ferric chloride. Định tính thành phần phenolic bằng phản ứng với chì acetate và phản ứng với gelatin. Định tính thành phần tannin bằng phản ứng với chì acetate và phản ứng với ferric chloride. Định tính thành phần steroid bằng phản ứng Salkowski và phản ứng Libermann – Burchard. Định tính thành phần amino acid bằng phản ứng với thuốc thử Ninhydrin. 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu ghi nhận ở các thí nghiệm được thống kê và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và phần mềm Statgraphics Centurion XV. Kết quả được thể hiện bằng giá trị trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Dữ liệu được phân tích theo phương sai Oneway ANOVA (P < 0.05) có ý nghĩa thống kê. 2.4. Bố trí thí nghiệm Tiến trình thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn được trình bày ở Hình 2.1 38
  51. Đồ án tốt nghiệp Mẫu cây Elephantopus sp. Xử lý mẫu Đánh giá hiệu suất thu Tách chiết cao bằng các dung môi hồi cao khác nhau Định tính một số thành Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phần hóa học Xác định chỉ số MIC Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao từ Elephantopus sp. được tiến hành như hình 2.2 39
  52. Đồ án tốt nghiệp Mẫu cây Elephantopus sp. Xử lý mẫu Ngâm dung môi (1:20) (w/v) trong 24h Lọc tinh Bã Cô cách thủy 700C Cao chiết Đánh giá hiệu suất thu hồi Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu hồi cao Mẫu cây Elephantopus sp. tươi được rửa sạch và đem đi phơi khô. Cây khi đã khô được đem xay thành bột. Sau đó, tiến hành cân 5 g bột cây và ngâm trong 100 ml các loại dung môi khảo sát (nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90%, tỉ lệ 1 : 20 w/v) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Mẫu cây sau khi ngâm trong dung môi được đem lọc tinh qua giấy lọc bằng máy lọc chân không thu được dịch lọc và bã. Bã được ngâm lại với dung môi từ 3-5 lần cho đến khi màu sắc dịch lọc không thay đổi. 40
  53. Đồ án tốt nghiệp Tất cả các dịch lọc thu được qua các lần ngâm được hòa trộn và đem đi cô cách thủy ở 700C cho đến khi đuổi hết dung môi, ta thu được cao chiết từ các loại dung môi. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Hình 2.3. Dịch chiết mẫu bằng nước Hình 2.4. Dịch chiết mẫu bằng ethanol 50% Hình 2.5. Dịch chiết mẫu bằng ethanol 70% 41
  54. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.6. Dịch chiết mẫu bằng ethanol 90% Tiến hành đánh giá hiệu suất thu hồi cao ở mỗi nghiệm thức bằng công thức: M’ − M Hiệu suất thu hồi (%) = × 100 m Trong đó: M’: khối lượng cốc sau khi cô mẫu (g) M : khối lượng cốc ban đầu (g) m: khối lượng mẫu ban đầu (g) 42
  55. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Elephantopus sp. Sau khi thu được cao chiết từ các loại dung môi khác nhau, tiến hành quy trình khảo sát hoạt tính như hình 2.7 Vi sinh vật chỉ thị Cao chiết từ cây Elephantopus sp. Tăng sinh trong môi trường TSB Dịch cao chiết Lắc 150 vòng/phút trong 18 giờ (100 mg/ml) Đo quang phổ ở 600 nm và pha loãng VSV trong nước muối sinh lý 6 VSV đạt nồng độ 10 CFU/ml Cấy trang lên môi trường TSA Nhỏ 100 μl dịch chiết (100 mg/ml) vào các giếng trên môi trường TSA 0 Ủ 37 C trong 24 giờ Đọc kết quả Hình 2.7 : Sơ đồ khảo sát hoạt tính của cao chiết 43
  56. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai thủy tinh chứa 10 ml môi trường TSB hoặc TSB + 1,5% NaCl (đối với các chủng Vibrio spp.) Sau đó, chai được lắc ở 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng trong 18 - 24 giờ. Tiến hành đo quang phổ dịch tăng sinh ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ, sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt 106 CFU/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha loãng nhỏ lên mặt đĩa môi trường thạch TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn. Các đĩa thạch sau đó được đục 3 lỗ đường kính với mỗi lỗ là 6 mm. Cao chiết Elephantopus sp. được pha trong DMSO 1% ở nồng độ 100 mg/ml. Hút 100 μl dịch cao chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa môi trường TSA đã được đục lỗ trước đó. Để yên trong 1 giờ và đem ủ ở 370C trong vòng 24 giờ. Đối chứng âm sử dụng DMSO 1%, đối chứng dương sử dụng Ciprofoxacin ở nồng độ 500 µg/ml. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Elephantopus sp. Kết thúc thí nghiệm 2 xác định được cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất và cao chiết này được sử dụng để xác định chỉ số MIC đối với các chủng đối kháng. Tiến trình khảo sát MIC được trình bày ở Hình 2.8 44
  57. Đồ án tốt nghiệp Cao ethanol 70% VSV chỉ thị Ống nghiệm chứa Pha loãng thành dãy môi trường TSB Tăng sinh nồng độ theo cơ số 2 Đo OD 0 Ủ 37 C trong 24 giờ Pha loãng để đạt Đọc kết quả nồng độ 6 10 CFU/ml Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát MIC Thuyết minh quy trình: Cao chiết ethanol 70% được hòa tan với DMSO 1% thành dãy nồng độ theo cơ số 2 với nồng dộ thấp nhất là 12.5 mg/ml và nồng độ cao nhất là 100 mg/ml. Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai thủy tinh chứa 10 ml môi trường TSB hoặc TSB + 1,5% NaCl (đối với các chủng Vibrio spp.) Sau đó, chai được lắc ở 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng trong 18 - 24 giờ. Tiến hành đo quang phổ dịch tăng sinh ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ, sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt 106 CFU/ml. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 3ml môi trường TSB, sau đó hút 1ml dịch cao chiết các nồng độ và hút thể tích dịch vi khuẩn ở mật độ 106 CFU/ml vào các ống nghiệm. Tiến hành ủ ở 370C trong 24 giờ và quan sát kết quả. Đối chứng âm sử dụng ống nghiệm chứa môi trường TSB và dịch vi khuẩn, đối chứng dương sử dụng ống nghiệm chứa môi trường TSB và dịch cao chiết. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. 45
  58. Đồ án tốt nghiệp 2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ cây Elephantopus sp. Cao chiết của các loại dung môi thu được từ cây Elephantopus sp. được sử dụng để xác định thành phần hóa học và tiến trình được thực hình theo Hình 2.9 Cao chiết từ cây Elephantopus sp. Ngâm trong H2SO4 10% Ngâm trong DMSO 1% Lọc Lọc thử nghiệm thử nghiệm Alkaloid Carbohydrate Flavonoid Tannin Saponin Amino acid Anthraquinone Steroid Phenolic glycoside s Hình 2.9 Sơ đồ tiến trình định tính thành phần hóa học Thuyết minh quy trình: Cao chiết các loại dung môi từ cây Elephantopus sp. được chia làm 2 phần. Phần thứ nhất được ngâm trong dung dịch H2SO4 10% trong khoảng 30- 60 phút sau đó tiến hành lọc hết cặn dùng để thực hiện các thử nghiệm kiểm tra nhóm alkaloid. Phần thứ hai sẽ pha trong DMSO 1% cho tan hoàn toàn sau đó tiến hành pha loãng và lọc bỏ cặn thu dịch, dịch này đem phân tích, định tính một số thành 46
  59. Đồ án tốt nghiệp phần hóa học như carbohydrate, saponin, flavonoid, amino acid, anthraquinone glycoside, steroid, phenolic, tannin. 2.4.4.1. Định tính thành phần carbohydrate - Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vào 5-6 giọt thuốc thử Molisch, nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm và quan sát sự hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách. Hình 2.10. Thử nghiệm Molisch - Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào, đun cách thủy trong 5 phút và quan sát sự xuất hiện kết tủa màu đỏ của CuO. 47
  60. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.11. Thử nghiệm Fehling - Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed, đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và quan sát sự hình thành kết tủa màu đỏ gạch. 2.4.4.2. Định tính thành phần alkaloid - Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho vài giọt thuốc thử Mayer. Quan sát kết tủa màu đục tạo thành. - Thử nghiệm Dragendroff : Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendroff và quan sát sự hình thành kết tủa màu vàng cam. - Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Hager và quan sát hình thành kết tủa màu vàng. - Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Wagner và quan sát sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ. 48
  61. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.12. Thử nghiệm Dragendroff. 2.4.4.3. Định tính thành phần saponin Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh và quan sát sự hình thành bọt ổn định. Hình 2.13. Thử nghiệm tạo bọt 49
  62. Đồ án tốt nghiệp 2.4.4.4. Định tính thành phần anthraquinone glycoside Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi, tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc, thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene, thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. Quan sát sự xuất hiện màu đỏ. 2.4.4.5. Định tính thành phần flavonoid Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh, thêm vài giọt HCl loãng. Quan sát sự xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl. Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Cho một ít bột Mg và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm. Bổ sung 5 ml cồn 95%. Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. Thử nghiệm ferric chloride: Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử ferric chloride 10%. Quan sát sự xuất hiện màu xanh hoặc tím. 2.4.4.6. Định tính thành phần phenolic Thử nghiệm chì acetate: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho 1,5 ml chì acetate 10%. Quan sát sự xuất hiện kết tủa trắng. Thử nghiệm gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm một vài giọt gelatin 1% và quan sát sự xuất hiện kết tủa trắng. 2.4.4.7. Định tính thành phần tannin Thử nghiệm chì acetate: 2 ml dịch chiết được cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt Chì acetate. Quan sát sự xuất hiện kết tủa màu vàng. Thử nghiệm ferric chloride: 2 ml dịch chiết được cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt ferric chloride 10%. Quan sát sự xuất hiện màu xanh. 50
  63. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.14. Định tính thành phần tannin. 2.4.4.8. Định tính thành phần steroid Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp và quan sát ở mặt phân cách nếu xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới sterol, màu vàng ở lớp dưới triterpenoid. Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh, nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. Quan sát nếu xuất hiện vòng màu xanh ở mặt phân cách steroid, nếu hình thành vòng màu nâu đỏ đậm triterpenoid. 51
  64. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.15. Định tính thành phần steroid 2.4.4.9. Định tính thành phần amino acid Thử nghiệm Ninhydrin: hút 1 ml dịch cao chiết, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin. Đun sôi cách thủy trong 5 phút và quan sát sự xuất hiện màu tím. 52
  65. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao từ cây Elephantopus sp. Bột cây Elephantopus sp. sau khi ngâm trong các loại dung môi khảo sát (nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90%) được lọc, thu dịch và cô dịch lọc ở 700C. Kết thúc quá trình này thu được cao chiết từ các loại dung môi khác nhau và để có thể đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả tách chiết cao của các loại dung môi đối với mẫu cây Elephantopus sp. thì hiệu suất thu hồi là một trong những tiêu chí cần xác định. Kết quả hiệu suất thu hồi cao chiết được trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi cao từ các loại dung môi khác nhau Dung môi Hiệu suất (%) Nước 15,15b ± 0,02 Ethanol 50% 17,46c ± 0,01 Ethanol 70% 17,90c ± 0,01 Ethanol 90% 13,75a ± 0,01 Qua bảng số liệu 3.1, chúng tôi nhận thấy rằng các dung môi tách chiết khác nhau có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ cây Elephantopus sp Tuy cùng quy trình tách chiết nhưng hiệu suất thu hồi cao của các loại dung môi từ cây Elephantopus sp. không giống nhau và có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0.05). Kết quả tách chiết cao từ cây Elephantopus sp. cho thấy rằng sử dụng dung môi ethanol 70% cho hiệu suất thu hồi cao cao nhất trong số 4 loại dung môi khảo sát với hiệu suất trung bình là 17,90%. Kế đến là dung môi ethanol 50%, nước với hiệu suất trung bình lần lượt là 17,46%, 15,15%. Cuối cùng với hiệu suất thu hồi thấp nhất là 13,75% ứng với dung môi ethanol 90%. Qua kết quả trên chúng tôi có thể thấy hiệu suất thu hồi cao của dung môi ethanol 50% tương đương với hiệu suất 53
  66. Đồ án tốt nghiệp của dung môi ethanol 70%, tuy nhiên để thu hồi được lượng cao cao nhất thì dung môi ethanol 70% vẫn là tối ưu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn các dung môi tách chiết đều là dung môi phân cực vì các dung môi phân cực có thể lôi kéo tốt các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật như flavonoid, alkaloids, glycosides, saponins, tannin, (Ngô Văn Thu, 2011). Sở dĩ chọn dung môi phân cực để tách chiết vì các loại dung môi này phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, giúp tiết kiệm cũng như sẽ an toàn hơn so với các dung môi không phân cực. Theo các nghiên cứu liên quan đến việc khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây thuốc thì phần lớn các tác giả đều sử dụng dung môi ethanol 70% để tiến hành tách chiết cao vì ethanol 70% có khả năng tách chiết rất nhiều chất có hoạt tính kháng khuẩn ra khỏi thực vật (Wendakoon và ctv, 2012). Do đó, sử dụng dung môi ethanol 70% để tách chiết các hợp chất từ cây Elephantopus sp. là phù hợp nhất. Tuy nhiên, ngoài việc lựa chọn dung môi nào phù hợp để tách chiết các hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ cây Elephantopus sp. nhất, chúng tôi còn cần phải tiến hành nhiều thí nghiệm từ cao chiết các loại dung môi từ cây Elephantopus sp. để khẳng định. 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây Elephantopus sp. Sau khi đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết của các loại dung môi thu được từ cây Elephantopus sp., chúng tôi tiến hành thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kết quả được thể hiện bằng đường kính vùng ức chế (mm) đối với các nhóm vi sinh vật chỉ thị trình bày trong các hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 và 3.5. 54
  67. Đồ án tốt nghiệp 3.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 35 a E.coliE. coli O157:H7 O157:H7 30 E.coliE. coli 0208 0208 25 E. coli ETEC 20 a a a 15 a b a 10 5 Đường kính kính Đường ức vòng(mm) chế Dung môi 0 tách chiết Nước Ethanol 50% Ethanol 70% Ethanol 90% Ciprofloxacin (500 µg/ml) Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli. Dựa vào hình 3.1, chúng tôi nhận thấy rằng trong 4 loại cao chiết từ 4 loại dung môi khác nhau thì có 2 loại cao chiết từ dung môi ethanol 50% và ethanol 70% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, đường kính vòng ức chế dao động từ 12,5 – 13,5 mm. Đối với cao chiết từ dung môi ethanol 50% ức chế được 1/4 chủng vi khuẩn trong nhóm thử nghiệm đó là chủng E.coli với đường kính vòng ức chế trung bình là 12,5 mm, còn đối với cao chiết từ dung môi ethanol 70% ức chế được 2/4 chủng vi khuẩn khảo sát trong nhóm đó là chủng E.coli O157:H7 với đường kính vòng ức chế trung bình là 12,2 mm và đường kính là 13,5 mm đối với chủng E. coli. Kết quả khảo sát trên cho thấy trong 4 chủng vi sinh vật chỉ thị thì chủng E.coli khá nhạy cảm với cao chiết từ dung môi ethanol 70% so với các loại cao chiết từ dung môi khác. Đáng chú ý là hoạt tính của cao chiết ethanol 50% và ethanol 70% đối với chủng E. coli (đường kính vòng ức chế tương ứng là 12,5 mm và 13,5 mm) có giá trị tương đương với hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh 55
  68. Đồ án tốt nghiệp Ciprofloxacin (đường kính 13,2 mm) và không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). 3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 18 a 16 b 14 a S. dublin c a 12 a S. enteritidis S. typhi 10 S. typhimurium 8 6 4 Đường kính Đường kính vùng ức chế (mm) 2 Dung môi 0 tách chiết Nước Ethanol 50% Ethanol 70% Ethanol 90% Ciprofloxacin (500 µg/ml) Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. Hình 3.3. Vòng ức chế S. dublin - cao chiết ethanol 50% (trái) và cao chiết ethanol 90% (phải) 56
  69. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào hình 3.2, chúng tôi nhận thấy rằng chỉ có 2 loại cao chiết từ dung môi ethanol 50% và ethanol 90% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, đường kính vòng ức chế dao động từ 14 – 15,7 mm. Đối với cao chiết từ dung môi ethanol 50% ức chế được 1/4 chủng vi khuẩn trong nhóm thử nghiệm đó là chủng S. dublin với đường kính vòng ức chế trung bình là 14 mm, còn đối với cao chiết từ dung môi ethanol 90% ức chế được 1/4 chủng vi khuẩn khảo sát trong nhóm đó là chủng S. dublin với đường kính vòng ức chế trung bình là 15,7 mm. Kết quả trên cho thấy trong 4 chủng vi sinh vật thử nghiệm thì chỉ có duy nhất chủng S. dublin xuất hiện vòng ức chế với cao chiết từ dung môi ethanol 50% và dung môi ethanol 90%. Đặc biệt, chúng tôi thấy rằng hoạt tính của cao chiết từ dung môi ethanol 50% và ethanol 90% đối với chủng S. dublin (đường kính vòng ức chế tương ứng là 14 mm và 15,7 mm) cao hơn một cách có ý nghĩa đối với hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin (đường kính 12,2 mm) và thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê. 3.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. 57
  70. Đồ án tốt nghiệp 40 35 a 30 25 Shi. boydii 20 a Shi. flexneri b 15 c Shi. sonnei 10 Đường kính Đường kính vòngức chế (mm) 5 Dung môi 0 tách chiết Nước Ethanol 50% Ethanol 70% Ethanol 90% Ciprofloxacin (500 µg/ml) Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. Hình 3.5. Vòng ức chế Shi. flexneri - cao chiết nước (trái) và cao chiết ethanol 70% (phải) Dựa vào hình 3.5, chúng tôi nhận thấy rằng trong 4 loại cao chiết từ 4 loại dung môi khác nhau thì có 2 loại cao chiết từ dung môi nước và ethanol 70% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, đường kính vòng ức chế dao động từ 12,2 – 17,3 mm. Đối với cao chiết từ dung môi nước ức chế được 1/3 chủng vi khuẩn trong nhóm thử nghiệm đó là chủng Shi. flexneri với đường kính vòng ức chế trung bình là 12,2 58
  71. Đồ án tốt nghiệp mm, còn đối với cao chiết từ dung môi ethanol 70% ức chế được 1/3 chủng vi khuẩn khảo sát trong nhóm đó là chủng Shi. flexneri với đường kính vòng ức chế trung bình là 17,3 mm. Kết quả khảo sát trên cho thấy trong 3 chủng vi sinh vật thử nghiệm thì chỉ có duy nhất chủng Shi. flexneri xuất hiện vòng ức chế với cao chiết từ dung môi nước và dung môi ethanol 70% với đường kính tương ứng là 12,2 mm và 17,3 mm. Đặc biệt, chúng tôi thấy rằng đường kính vòng ức chế của cao chiết từ dung môi ethanol 70% đối với chủng Shi. flexneri là 17,3 mm, cao hơn một cách có ý nghĩa đối với hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin (đường kính 13,2 mm) và thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê (P < 0,05). Điều đó cho thấy chủng Shi. flexneri khá nhạy cảm với các loại dung môi khảo sát. Đây là nhóm vi khuẩn dễ kháng lại kháng sinh, bằng chứng là chủng Shi. boydii kháng lại Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và các loại cao chiết của các dung môi khác nhau cũng không kháng lại được chủng này. 3.2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 59
  72. Đồ án tốt nghiệp 20 a 18 a a b 16 V. alginolyticus 14 b a V. cholerae b c 12 b c V. harveyi 10 V. parahaemolyticus 8 6 Đường kính vòng ức chế (mm) kính Đường ức vòng(mm) chế 4 2 Dung môi 0 tách chiết Nước Ethanol 50% Ethanol 70% Ethanol 90% Ciprofloxacin (8 µg/ml) Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Hình 3.7. Vòng ức chế V. alginolyticus – cao chiết ethanol 70% (trái) V. cholerae - cao chiết ethanol 70% (phải) 60
  73. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8. Vòng ức chế V. harveyi – cao chiết ethanol 70% (trái) và cao chiết ethanol 90% (phải) Dựa vào hình 3.8, chúng tôi nhận thấy rằng trong 4 loại cao chiết từ 4 loại dung môi khác nhau thì có 3 loại cao chiết từ dung môi ethanol 50%, ethanol 70% và ethanol 90% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, đường kính vòng ức chế dao động từ 10,3 – 17,3 mm. Đối với cao chiết từ dung môi ethanol 50% ức chế được 1/4 chủng vi khuẩn trong nhóm thử nghiệm đó là chủng V. alginolyticus với đường kính vòng ức chế trung bình là 10,3 mm và đối với cao chiết từ dung môi ethanol 90% ức chế được 1/4 chủng vi khuẩn khảo sát trong nhóm đó là chủng V. harveyi với đường kính vòng ức chế trung bình là 11,7 mm. Riêng đối với cao chiết từ dung môi ethanol 70% ức chế được 4/4 chủng vi khuẩn khảo sát trong nhóm với chủng V. parahaemolyticus có đường kính vòng ức trung bình cao nhất là 17,3 mm, kế đến là chủng V. harveyi và V. alginolyticus với đường kính vòng ức chế tương ứng là 15,7 và 13,2 mm. Cuối cùng, chủng V. cholerae có đường kính vòng ức chế thấp nhất là 11,7 mm. Kết quả trên cho thấy dung môi ethanol 70% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với nhóm Vibrio spp. tốt nhất trong các loại dung môi khảo sát bằng việc ức chế được 4/4 chủng vi sinh vật. Đáng chú ý là hoạt tính của cao chiết ethanol 70% và đối với chủng V. parahaemolyticus (đường kính vòng ức chế là 17,3 mm) có giá trị cao hơn một cách có ý nghĩa đối với hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin (đường kính 11,3 mm) và có sự khác biệt về mặt thống kê (P < 0,05). 61
  74. Đồ án tốt nghiệp 3.2.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi sinh vật còn lại. 14 a a a a Pseudomonas a a a a 12 S. aureus 10 E. feacalis 8 Lis. innocua 6 Lis. monocytogenes 4 Đường kính kính Đường ức vòng(mm) chế 2 Dung môi 0 tách chiết Nước Ethanol 50% Ethanol 70% Ethanol 90% Ciprofloxacin (500 µg/ml) Hình 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi sinh vật còn lại. Hình 3.10. Vòng ức chế Lis. innocua – cao chiết ethanol 70% (trái) và Pseudomonas – cao chiết ethanol 70% (phải) Dựa vào hình 3.13, chúng tôi nhận thấy rằng trong 4 loại cao chiết từ 4 loại dung môi khác nhau thì có 2 loại cao chiết từ dung môi ethanol 50% và ethanol 62
  75. Đồ án tốt nghiệp 70% cùng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với 1/4 chủng vi khuẩn trong nhóm thử nghiệm đó là chủng Pseudomonas aeruginosa với đường kính vòng ức chế trung bình tương ứng là 11,7 mm và 11,8 mm. Kết quả trên cho thấy trong 4 chủng vi sinh vật thử nghiệm thì chỉ có duy nhất chủng Pseudomonas aeruginosa xuất hiện vòng ức chế với cao chiết từ dung môi ethanol 50% và dung môi ethanol 70%. Đặc biệt, ta thấy rằng hoạt tính của cao chiết từ dung môi ethanol 50% và ethanol 70% đối với chủng Pseudomonas aeruginosa (đường kính vòng ức chế tương ứng là 11,7 mm và 11,8 mm) có giá trị tương đương với hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin (đường kính 12,2 mm) và không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05) . Đối với nhóm Listeria spp., ta nhận thấy rằng trong các loại cao chiết từ 4 loại dung môi khác nhau thì chỉ có duy nhất 1 loại cao chiết từ dung môi ethanol 70% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với đường kính vòng ức chế trung bình là 11,8 mm. Kết quả trên cho thấy trong 2 chủng vi sinh vật chỉ thị thì chỉ có duy nhất chủng Lis. innocua thể hiện vòng ức chế đối với cao chiết từ dung môi ethanol 70% so với các loại cao chiết từ dung môi khác. Tuy nhiên, hoạt tính của cao chiết từ dung môi ethanol 70% đối với chủng Lis. innocua (đường kính vòng ức chế là 11,8 mm) có giá trị tương đương với hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin (đường kính 12 mm) và không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Từ kết quả hoạt tính kháng khuẩn có được của các loại dung môi khác nhau từ cây Elephantopus sp. trên các nhóm vi sinh vật chỉ thị, ta có được kết quả đường kính vòng ức chế trên tổng số 20 chủng vi sinh vật khảo sát trình bày ở bảng 3.2. 63
  76. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ cây Elephantopus sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị Cao chiết Cao chiết Cao chiết Cao chiết Ciprofloxacin(*) Vi sinh vật nước ethanol 50% ethanol 70% ethanol 90% E.coli O157:H7 - - 12,2b ± 0,29 - 13,2a ± 0,29 E.coli 0208 - - - - 12,3a± 0,29 E. coli - 12,5a ± 0.5 13,5a ± 1,32 - 13,2a ± 0,29 ETEC - - - - 31a ± 0,5 Lis. innocua - - 11,8a ± 0,58 - 12a ± 0,5 Lis. monocytogenes - - - - 12,2a ± 0,29 S. dublin - 14b ± 0,5 - 15,7a ± 0,58 12,2c ± 0,76 S. enteritidis - - - - 13a ± 0,5 S. typhi - - - - 12,5a ± 0,5 S. typhimurium - - - - 11a ± 0 Shi. boydii - - - - - Shi. flexneri 12,2c ± 0,29 - 17,3a ± 0,58 - 13,2b ± 0,29 Shi. sonnei - - - - 33a ± 0,5 V. alginolyticus - 10,3c ± 0,58 13,2b ± 0,29 - 16,2a ± 0,29 V. cholerae - - 11,7b ± 0,58 - 13,3a ± 0,58 V. harveyi - - 15,7b ± 0,58 11,7c ± 0,58 18a ± 0,5 V. parahaemolyticus - - 17,3a ± 0,29 - 11,3b ± 0,29 Pseudomonas - 11,7a ± 0,29 11,8a ± 1,04 - 12,2a ± 0,58 S. aureus - - - - 12,2a ± 0,29 E. feacalis - - - - 12a ± 0,5 (*): Nồng độ Ciprofloxacin tương ứng với nhóm Vibrio spp. là 8 µg/ml và đối với các vi sinh vật chỉ thị còn lại là 500 µg/ml. 64
  77. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả của bảng 3.2, ta nhận thấy rằng dung môi tách chiết có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính sinh học của cao chiết thu được. Trong 4 loại dung môi khảo sát thì khi mẫu được xử lý với ethanol 70% thì cao chiết thu được có phổ kháng khuẩn rộng nhất (kháng 9/20 chủng vi sinh vật khảo sát bao gồm 4 chủng thuộc nhóm E. coli, Lis. innocua, Shi. flexneri, 4 chủng thuộc nhóm Vibrio spp. và Pseudomonas) so với các loại cao chiết từ các dung môi còn lại. Đồng thời cao chiết từ dung môi ethanol 70% cũng có hoạt tính kháng khuẩn khá cao với đường kính vòng ức chế trung bình từ 11,7 – 17,3 mm. Trong khi đó cao chiết từ các loại dung môi khác chỉ có phổ kháng khuẩn hẹp hơn và hoạt tính cũng thấp hơn, cụ thể là cao chiết ethanol 50% kháng lại 4/20 chủng vi sinh vật với đường kính vòng ức chế trung bình từ 10,3 – 14 mm, cao chiết ethanol 90% kháng lại 2/20 chủng vi sinh vật với đường kính vòng ức chế trung bình từ 11,7 – 15,7 mm và cuối cùng là cao chiết từ dung môi nước kháng được duy nhất chủng Shi. flexneri với đường kính vòng ức chế trung bình là 12,2 mm. Theo kết quả nghiên cứu của Igbinosa (2009) đã tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ cây Jatropha curcas (cây dầu mè) trên các chủng vi sinh vật như E. coli, Pseudomonas với đường kính vòng ức chế tương ứng là 11 mm và 12 mm (đường kính lỗ d = 6 mm). Từ kết quả nghiên cứu trên, so sánh với hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ cây Elephantopus sp. ở nồng độ 100 mg/ml với chủng E. coli O157:H7 và E. coli có đường kính vòng ức chế là 12,2 mm và 13,5 mm, với chủng Pseudomonas có đường kính vòng ức chế là 11,8 mm chúng tôi nhận thấy được rằng cao chiết ethanol 70% có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn cao chiết ethanol từ cây dầu mè. Theo một nghiên cứu khác của Ahmad và ctv (2011), kết quả cho thấy cao chiết ethanol 80% từ hoa của cây Calotropis procera (cây bòng bòng) có hoạt tính kháng khuẩn với chủng E. coli và đường kính vòng ức chế là 12,3 mm, thấp hơn so với đường kính vòng ức chế của cao chiết ethanol từ cây Elephantopus sp. đối với chủng E. coli là 13,5 mm. 65
  78. Đồ án tốt nghiệp Từ những kết quả trên chứng tỏ rằng hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Elephantopus sp. từ dung môi ethanol 70% khá tốt. Kết hợp với kết quả hiệu suất thu hồi cao đã chứng minh được ethanol 70% là dung môi tách chiết cao từ cây Elephantopus sp. tốt nhất. 3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Elephantopus sp. Từ kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ các dung môi khác nhau ta nhận thấy rằng dung môi ethanol 70% có hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất trong các loại dung môi khảo sát, thể hiện ở việc cao chiết ethanol 70% có phổ kháng khuẩn rộng nhất (kháng 9/20 chủng vi sinh vật chỉ thị). Từ đó ta tiến hành xác định MIC của cao chiết ethanol 70% trên các chủng vi sinh vật đối kháng, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ dung môi ethanol 70% trên các chủng vi sinh vật đối kháng. Chủng MIC (mg/ml) E. coli O157:H7 100 E. coli 100 Lis. innocua 100 Shi. flexneri 100 V. alginolyticus 43,75 V. cholerae 50 V. harveyi 37,5 V. parahaemolyticus 50 Pseudomonas 100 Kết quả đánh giá chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70% từ cây Elephantopus sp. đối với 9 chủng vi khuẩn chỉ thị được thể hiện ở bảng 3.3. Kết quả này cho thấy rằng chỉ số MIC của cao chiết này từ 37,5 mg/ml – 50 mg/ml đối với 4 chủng trong nhóm Vibrio spp. khảo sát, nhưng giá trị MIC đối với 5 chủng khảo sát còn lại là 100 mg/ml. Kết quả này cho thấy rằng cao chiết ethanol 70% từ Elephantopus sp. 66
  79. Đồ án tốt nghiệp có hoạt tính ức chế khá tốt đối với nhóm Vibrio spp. nhưng đối với các nhóm vi khuẩn còn lại thì hoạt tính ức chế của chúng không cao. Theo nghiên cứu của Gislene (2000) về chỉ số MIC của cao chiết ethanol từ cây đinh hương đối với Shigella spp. thì giá trị này là 250 mg/ml và đối với chủng Pseudomonas là 50 mg/ml trong khi giá trị MIC của cao chiết từ cây Elephantopus sp. chỉ là 100 mg/ml. Ngoài ra theo nghiên cứu của Igbinosa (2009), cao chiết ethanol từ cây Jatropha curcas đối với chủng E .coli và Pseudomonas có giá trị MIC cùng là 5 mg/ml. Từ kết quả trên có thể thấy chỉ số MIC cuả cao chiết ethanol 70% từ cây Elephantopus sp. trên 9 chủng vi sinh vật đối kháng (37,5 – 100 mg/ml) luôn cao hơn so với các nghiên cứu khác trên cùng 1 chủng vi sinh vật chỉ thị (ngoại trừ kết quả MIC trên chủng Shigella spp. theo Gislene, 2000). Kết quả có sự chênh lệch như trên có thể do sử dụng phương pháp tách chiết khác nhau, dung môi tách chiết khác nhau hay nhiều yếu tố khách quan khác tác động nên dẫn đến giá trị MIC của cây Elephantopus sp. cao hơn các loài cây khác trên cùng 1 chủng vi sinh vật chỉ thị khác nhau. 3.4. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ cây Elephantopus sp. Sau khi thu được cao chiết các loại dung môi của cây Elephantopus sp. và thực hiện các bước chuẩn bị cũng như tiến hành quy trình định tính thành phần hóa học bằng các thử nghiệm đặc trưng, kết quả được trình bày ở bảng 3.4. 67
  80. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4 Kết quả định tính một số thành phần hóa học trong cây Elephantopus sp. Cao chiết Cao chiết Cao chiết Thành phần Cao chiết Thử nghiệm ethanol ethanol ethanol hóa học nước 50% 70% 90% Molisch + + + + Carbohydrate Fehling + + + + Benedict + + + + Mayer - - - - Dragendroff + + - - Alkaloid Hager + + - - Wagner + + - - Saponin Foam + + + + Anthraquinone Bontrager - - - - Alkaline + + + + Flavonoid Shinoda - - - - Ferric chloride + + + + Lead acetate + + + + Phenolic Gelatin - - - - Ferric chloride + + + + Tannin Lead acetate + + + + Salkowski + + + + Steroid Libermann- + + + + Burchard Amino acid Ninhydrin - - - - Dựa vào bảng 3.4 ta thấy được các thành phần hóa học cơ bản trong các thử nghiệm trên như carbohydrate, alkaloid, saponin, flavonoid, phenolic, tannin, steroid đều có trong các loại cao chiết từ cây Elephantopus sp Riêng đối với thử nghiệm định tính alkaloid, ta nhận thấy cao chiết từ dung môi ethanol 50% và dung môi ethanol 70% cho phản ứng dương tính, điều này chứng tỏ 2 loại dung môi này có khả năng tách chiết các hợp chất thuộc nhóm alkaloid. Đối với thử nghiệm phenolic cho phản ứng dương tính, tương ứng với kết quả nghiên cứu của David Wang và ctv, 2007 công bố tìm được các hợp chất acid caffeic, acid 3,5- dicaffeoylquinic, 1,4-acid dicaffeoylquinic và 3,4-dihydroxy-cinnamic acid methyl 68
  81. Đồ án tốt nghiệp ester đều thuộc nhóm phenolic. Còn đối với thử nghiệm hợp chất steroid, cao chiết chiết ethanol 50% và ethanol 70% cho kết quả là hợp chất triterpenoid, cao chiết ethanol 90% và dung môi nước cho kết quả là hợp chất sterol, đồng nghĩa với kết quả nghiên cứu của Liang N1 và ctv, 2012 công bố tìm được các hợp chất betulinic acid thuộc nhóm triterpenoid và hợp chất stigmasterol thuộc nhóm sterol. Trong 3 thử nghiệm hợp chất thuộc nhóm flavonoid có 2 thử nghiệm có kết quả dương tính có thể được giải thích như sau: flavonoid có nhiều nhóm hợp chất trong đó mỗi phản ứng định tính giúp nhận biết một nhóm chất riêng trong trường hợp này phản ứng của ferric clorid giúp nhận biết chalcon trong nhóm chất flavonoid (Đặng Thị Luyến và ctv, 2008), phản ứng alkaline giúp phân biệt nhóm flavon và flavonol (Manpreet Kaur, 2015) và phản ứng shinoda giúp phân biệt anthocyanidins trong nhóm chất flavonoid (Greg, 2014). Đối với thử nghiệm hợp chất phenolic, tất cả các loại cao chiết đều cho phản ứng dương tính với phản ứng lead acetate nên chúng tôi có thể nói rằng trong cây Elephantopus sp. chỉ chứa những dẫn chất có nhóm o. dihydroxyphenol. Từ những kết quả trên khẳng định rằng cây Elephantopus sp. chứa những hợp chất kháng khuẩn, điều đó bổ sung cho kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cũng như các nghiên cứu đã từng công bố trước đây. 69
  82. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Dung môi ethanol 70% cho hiệu suất thu hồi cao từ cây Elephantopus sp. cao nhất trong số 4 loại dung môi khảo sát với hiệu suất trung bình là 17,90%. - Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Elephantopus sp. từ dung môi ethanol 70% là tốt nhất với phổ kháng 9/20 chủng vi sinh vật chỉ thị, đường kính vòng ức chế cao nhất là 17,3 mm ứng với chủng Shi. flexneri và V. parahaemolyticus. Kết hợp với kết quả hiệu suất thu hồi cao đã chứng minh được ethanol 70% là dung môi tách chiết cao từ cây Elephantopus sp. tốt nhất. - Giá trị MIC của cao chiết ethanol 70% từ cây Elephantopus sp. trên 9 chủng vi sinh vật đối kháng (37,5 – 100 mg/ml) tương đối cao hơn so với các nghiên cứu khác trên cùng 1 chủng vi sinh vật chỉ thị với chủng V. harveyi có giá trị MIC thấp nhất là 37,5 mg/ml. - Các loại cao chiết từ cây Elephantopus sp. có phản ứng dương tính với carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, phenolic, tannin, steroid, trong đó có những hợp chất kháng khuẩn , điều đó bổ sung cho kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và phù hợp với các nghiên cứu đã từng công bố trước đây. 4.2. Kiến nghị - Tiến hành thí nghiệm hoạt tính của cao thuốc trên mô hình động vật để làm cơ sở ứng dụng điều chế thuốc trị bệnh cho người. - Từ kết quả định tính thành phần hóa học tiến hành định lượng thành phần hóa học. - Định danh loài cho cây Elephantopus sp. 70
  83. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội. Phạm Thanh Kỳ (1998), “Bài giảng dược liệu”, tập II. Trường đại học Dược Hà Nội Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐHQG TPHCM. Võ Văn Chi, 2012, Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), tập I, NXB Y học, Hà Nội. Viện Dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam”, tập I & II, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật. Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp (2007). Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật. http//vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/kythuatbaoquan visinhvat.html Nguyễn Đức Lượng. 2006. Vi sinh vật công nghiệp. Công nghệ vi sinh tập 2. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. HCM. Phạm Minh Nhựt. 2013. Thực hành vi sinh đại cương. Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Lê Thị Mỹ Hạnh (2014), Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông nghiệp huyện Gò dầu, tỉnh Tây Ninh, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Công nghệ TPHCM. Lê Ngọc Thuỳ Trang. 2013. Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM. Chang Tran (2014). Trực khuẩn lỵ (Shigella), Xetnghiemmau, 07-05-2014, xem 17- 06-2015, link: . 71