›

Đồ án Khảo sát tỉ lệ phân bố và tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn staphylococcus ở một số tỉnh thuộc khu vực phía Nam

pdf 65 trang thiennha21 13/04/2022 4690
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát tỉ lệ phân bố và tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn staphylococcus ở một số tỉnh thuộc khu vực phía Nam", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_ti_le_phan_bo_va_tinh_trang_de_khang_khang_si.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát tỉ lệ phân bố và tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn staphylococcus ở một số tỉnh thuộc khu vực phía Nam

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TỈ LỆ PHÂN BỐ VÀ TÌNH TRẠNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS Ở MỘT SỐ TỈNH THUỘC KHU VỰC PHÍA NAM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC-THỰC PHẨM -MÔI TRƢỜNG Chuyên ngành: VI SINH THỰC PHẨM Giảng viên hƣớng dẫn :TH.S DIỆP THẾ TÀI Sinh viên thực hiện :NGUYỄN THỊ NGỌC HƢƠNG MSSV: 1311100988 Lớp: 13DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TỈ LỆ PHÂN BỐ VÀ TÌNH TRẠNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS Ở MỘT SỐ TỈNH THUỘC KHU VỰC PHÍA NAM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC- THỰC PHẨM -MÔI TRƢỜNG Chuyên ngành: VI SINH THỰC PHẨM Giảng viên hƣớng dẫn :TH.S DIỆP THẾ TÀI Sinh viên thực hiện :NGUYỄN THỊ NGỌC HƢƠNG MSSV: 1311100988 Lớp: 13DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và đƣợc sự hƣớng dẫn khoa học của Ths. Diệp Thế Tài. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chƣa công bố dƣới bất kỳ hình thức nào trƣớc đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đƣợc chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. TP. Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 I
  4. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, cho phép tôi đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Diệp Thế Tài ngƣời đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài của mình. Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới tất cả nhân viên thuộc phòng Vi khuẩn 1 – Vi khuẩn Đƣờng ruột, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện tốt công việc của mình trong suốt thời gian qua. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM cùng toàn thể Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học đã truyền dạy kiến thức chuyên ngành để tôi có đủ khả năng hoàn thành đề tài. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình tôi vì đã luôn luôn là hậu phƣơng vững chắc giúp đỡ và động viên tôi không từ bỏ việc học của mình. Xin cảm ơn tới tất cả các bạn học lớp 13DSH01, những ngƣời đã cùng tôi vƣợt qua thời gian học tập và sinh sống tại thành phố Hồ Chí Minh. Xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Ngọc Hƣơng II
  5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC BẢNG VII DANH MỤC BIỂU ĐỒ VIII DANH MỤC HÌNH ẢNH IX MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 3. Câu hỏi nghiên cứu 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus 5 1.1.1. Tình hình phân bố của Staphylococcus aureus 5 1.1.1.1. Trên thế giới 5 1.1.1.2 Tại Việt Nam 6 1.2 Đặc điểm và phân loại tụ cầu khuẩn (Staphylococcus aureus) 6 1.2.1 Giới thiệu 6 1.2.2 Phân loại tụ cầu vàng 7 1.2.3 Đặc điểm sinh học 7 1.2.3.1 Hình thể và tính chất bắt màu của Stphylococcus aureus 7 1.2.3.2 Nuôi cấy 9 1.2.4 Điều kiện tăng trƣởng và sự phân bố 10 1.2.5. Đặc điểm sinh hóa 11 1.2.6. Khả năng đề kháng 11 1.2.7. Tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus trên thế giới và tại Việt Nam 12 1.2.7.1. Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus trên thế giới 12 III
  6. Đồ án tốt nghiệp 1.2.7.2. Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus tại Việt Nam 13 1.2.8. Khả năng gây bệnh của S.aureus 15 1.2.9 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus 16 1.2.10. Phòng và điều trị bệnh 17 1.2.10.1. Phòng bệnh 17 1.2.10.2. Điều trị 17 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18 2.2. Vật liệu thí nghiệm 18 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 18 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 18 2.2.2.1. Dụng cụ 18 2.2.2.2. Thiết bị 18 2.2.3. Hóa chất và môi trƣờng 19 2.3. Phƣơng pháp tiến hành 19 2.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập 19 2.3.1.1. Mẫu nƣớc 19 2.3.1.2. Mẫu thực phẩm 19 2.3.1.3 Mẫu phân 20 2.3.2 Quan sát hình thái 20 2.3.3 Kỹ thuật multiplex PCR 20 2.3.4. Kỹ thuật kháng sinh đồ theo phƣơng pháp Kirby-Bauer 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, mẫu nƣớc và mẫu bệnh phẩm 27 3.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc S.aureus 27 3.1.2. Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, môi trƣờng và mẫu bệnh phẩm ở 5 tỉnh An Giang, Sóc Trăng, Bến Tre, Bình Phƣớc, TP.Hồ Chí Minh. 28 IV
  7. Đồ án tốt nghiệp 3.1.3. So sánh kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus tại 5 tỉnh thành theo từng loại mẫu 30 3.2. Kết quả định danh vi khuẩn S.aureus 30 3.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, môi trƣờng và mẫu bệnh phẩm ở 5 tỉnh An Giang, Sóc Trăng, Bến Tre, Bình Phƣớc, TP.Hồ Chí Minh. 31 3.4. Tỉ lệ S.aureus kháng Methicilline (MRSA) 35 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 4.1 Kết luận 36 4.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 V
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BHI Brain Heart Infusion BP Baird Paker Agar MH Mueller Hinton Agar LB Luria-Bertani TBE Tris-borate-EDTA VRSA Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus S.aureus Staphylococcus Aureus PCR Polymerase Chain Reaction FOX Cefoxitin CN Gentamicin CIP Cipro VA Vancomycine NA Clindamycin AZM Azithromycin DO Doxycicline VI
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR 21 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR đa mồi cơ sở phát hiện vi khuẩn S.aureus 22 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cơ sở của các mồi 22 Bảng 2.4. Bảng tiêu chuẩn đánh giá kết quả đƣờng kính vô khuẩn đối với Staphylococcus aureus theo CLSI năm 2017. 26 Bảng 3.1. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở Thành phố Hồ Chí Minh 28 Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh An Giang 28 Bảng 3.3. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Bến Tre 29 Bảng 3.4. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Bình Phƣớc 29 Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Sóc Trăng 29 Bảng 3.6. Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus tại khu vực phía Nam theo từng loại mẫu. 30 Bảng 3.7. Kết quả kháng sinh đồ của S.aureus (n = 17) 32 VII
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC SƠ ĐỒ BIỂU ĐỒ Sơ đồ 1.1. quy trình PCR 21 Sơ đồ 2.2. Quy trình thực hiện kháng sinh đồ S.aureus 24 Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ đề kháng đa kháng sinh của S.aureus (n= 15) 32 Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu bệnh phẩm (n= 6) 33 Biểu đồ 3.3. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu nƣớc 34 Biểu đồ 3.4. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu thực phẩm 34 VIII
  11. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình thái Staphylococcus aureus 8 Hình 1.2. Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dƣơng dƣới kính hiển vi 8 Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc S.aureus trên hai môi trƣờng nuôi cấy 10 Hình 2.1. Cách đọc kết quả kháng sinh đồ 25 Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn S.aureus trên môi trƣờng BP 27 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn S.aureus 27 Hình 3.3 Kết quả điện di phát hiện 31 Hình 3.4. Kết quả kháng sinh đồ từ mẫu thực phẩm (005EQA.82BR) và mẫu bệnh phẩm (GS17.018P.AG) 31 IX
  12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Vi khuẩn gây bệnh là một trong những nguyên nhân hàng đầu lấy đi sinh mạng của rất nhiều ngƣời trên thế giới. Nhƣng ngày nay, việc con ngƣời sản xuất thành công thuốc kháng sinh đƣợc xem là bƣớc tiến vĩ đại của ngành y học. Các bệnh nhiễm khuẩn trên ngƣời hiện nay đều có thể điều trị bằng kháng sinh. Ban đầu, dƣới tác dụng của một liệu trình kháng sinh, đa số vi khuẩn bị giết chết nhƣng sẽ có một số ít tồn tại và phát triển theo nguyên lý chọn lọc tự nhiên của Darwin. Vi khuẩn sẽ kháng thuốc bằng cách sản sinh ra enzyme mới phù hợp để phân huỷ kháng thể. Nếu chúng ta lạm dụng kháng sinh dùng với mục đích dự phòng hoặc dùng không đủ liều lƣợng, số ngày qui định sẽ dẫn đến vi khuẩn không bị tiêu diệt ngày càng nhiều và trở nên kháng thuốc rất nguy hiểm. Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus đã trở thành một vấn đề thời sự của y tế thế giới. Tại Việt Nam: vấn đề này cũng không ngoại lệ, các bệnh nhiễm khuẩn vẫn luôn đƣợc đặt vào mối quan tâm hàng đầu của ngành y tế và hiện nay đã có nhiều nghiên cứu khoa học cảnh báo về tình trạng này. Sở dĩ S.aureus đƣợc quan tâm nhiều nhƣ vậy bởi vì vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đứng đầu danh sách các tác nhân thƣờng gặp nhất trong các bệnh viện. Chúng gây ra nhiều ca nhiễm trùng trầm trọng cho ngƣời nhƣ: viêm da mãn tính, viêm xƣơng khớp, áp-xe ở các vị trí sâu, nhiễm trùng vết thƣơng, viêm phổi, viêm màng tim, viêm cơ tim, viêm màng não S.aureus có khả năng kháng kháng sinh rất nhanh, kéo dài thời gian nằm viện, tăng chi phí và làm tăng tỉ lệ tử vong. Với tình hình kháng kháng sinh ngày càng gia tăng nhanh thì trong tƣơng lai gần có thể dẫn đến tình trạng không còn đủ kháng sinh cho việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và loài ngƣời sẽ trở lại thời kỳ không có kháng sinh. Các nghiên cứu tại Viện Pasteur Nha Trang và Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh (TP.HCM) từ năm 2006 đến năm 2011 cũng cho thấy S.aureus ngày càng đề kháng với nhiều loại kháng sinh và tỉ lệ MRSA cũng ngày càng gia tăng. 1
  13. Đồ án tốt nghiệp Vì thế việc xác định kháng sinh đặc hiệu cho từng loại vi khuẩn là điều cần thiết để hỗ trợ cho bác sĩ trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và việc sử dụng đúng kháng sinh trong điều trị sẽ rút ngắn đƣợc thời gian điều trị, làm giảm thiểu đáng kể về chi phí, vật chất và tinh thần của ngƣời bệnh, đồng thời cũng hạn chế tỉ lệ S.aureus kháng kháng sinh trong cộng đồng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Staphylococcus và tình trạng đề kháng kháng sinh của chúng ở một số tỉnh thuộc khu vực phía nam. Kết quả nghiên cứu nhằm góp phần cung cấp cho các bác sĩ lâm sàng mức độ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Từ đó, đề ra hƣớng chuẩn đoán và điều trị thích hợp, rút ngắn thời gian điều trị và sử dụng kháng sinh đạt hiệu quả nhất. 2. Tình hình nghiên cứu Năm 1945, Alexander Fleming ngƣời tìm ra penicillin, đã cảnh báo rằng việc lạm dụng kháng sinh có thể dẫn đến tình trạng chọn lọc tự nhiên ở vi khuẩn. Năm 1946 báo cáo từ một bệnh viện có 14% chủng staphylococcus đề kháng với penicillin, đến cuối thập kỷ này tỉ lệ chủng staphylococcus kháng thuốc tăng lên đến 59% ở bệnh viện này. Vài năm sau đó, con ngƣời chống lại S. aureus đề kháng bằng cách tìm ra kháng sinh mới là nhóm methicillin. Nhƣng đến năm 1961, S.aureus lại đề kháng methicillin để đƣợc gọi tên MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus).Tuy nhiên vào năm 1961 tại Anh, và tình trạng đề kháng này bắt đầu ngày càng gia tăng, đến năm 1993 có 51 ca tử vong liên quan đến MRSA, năm 2005 có 1.629 ca tử vong, năm 2006 có 1.652 ca tử vong, tỷ lệ tử vong liên quan đến MRSA chiếm đến 50% . Khi đó, muốn chống lại MRSA phải dùng vancomycin là kháng sinh quý hiếm, dự trữ sau cùng. Đến năm 1997, tai họa lại đến là vì MRSA đề kháng đƣợc cả vancomycin VRSA(Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus). Hiện nay, tên MRSA, VRSA đƣợc xem là nỗi kinh hoàng của giới chức y tế. Chỉ riêng MRSA hằng năm gây chết khoảng 20.000 ngƣời ở Mỹ, vƣợt xa HIV/AIDS. 2
  14. Đồ án tốt nghiệp Từ tháng 8/2012- tháng 8/2013, một nghiên cứu tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh với 143 chủng S.aureus về tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong 4.299 bệnh phẩm, cho thấy: S.aureus chiếm 23,6% (n=143), đa số đƣợc phân lập từ bệnh phẩm mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nƣớc tiểu (11,9%) và phân (10,5%) (n=143). Qua kết quả từ kháng sinh đồ, tỉ lệ đề của S.aureus với các KS là 93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine, 60,8% với Kanamycine, 58% với Clindamycine. Tỉ lệ MRSA là 39,2% và MSSA là 60,8%. Với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học con ngƣời đã tao ra nhiều loại kháng sinh mới để điều trị các chủng vi khuẩn khác cùng với chủng vi khuẩn kháng thuốc. Nhƣng thời gian dùng diễn ra không dài lại xuất hiện những vi khuẩn kháng lại những kháng sinh mới sử dụng, con ngƣời đã trở nên thất thế trong việc chạy đua với sự biến đổi của vi khuẩn. Kháng kháng sinh đã thực sự trở thành mối đe dọa với con ngƣời và nó xảy ra nhƣ một hiện tƣợng tất yếu của quy luật tƣơng sinh tƣơng khắc trong tự nhiên. Thực tế ngày càng nhiều các nhiễm khuẩn bệnh viện gây ra do Tụ cầu, các nhiễm khuẩn này xảy ra ở mọi lứa tuổi, nhiều khoa phòng và đơn vị điều trị. 3. Câu hỏi nghiên cứu Tỉ lệ phân bố của S.aureus ở một số tỉnh thuộc khu vực phía nam là bao nhiêu? Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus phân lập đƣợc ở khu vực phía nam là bao nhiêu ? 4. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu tổng quát: Xác định tỉ lệ phân bố và tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong các mẫu nƣớc, thực phẩm, bệnh phẩm ở khu vực phía nam từ tháng 12/2016 đến tháng 06/2017. Mục tiêu cụ thể: Xác định tỉ lệ phân bố của S.aureus trong các mẫu môi trƣờng, thực phẩm, bệnh phẩm ở 5 tỉnh thành Bến Tre, Bình Phƣớc, Sóc Trăng, An Giang, TP.HCM. 3
  15. Đồ án tốt nghiệp Xác định tỉ lệ đề kháng 7 loại kháng sinh của S.aureus trong các loại mẫu môi trƣờng, thực phẩm, bệnh phẩm ở 5 tỉnh thành Bến Tre, Bình Phƣớc, Sóc Trăng, An Giang, TP.HCM. Xác định tỉ lệ S.aureus kháng Methicillin (MRSA) trong các loại mẫu môi trƣờng, thực phẩm, bệnh phẩm ở 5 tỉnh thành Bến Tre, Bình Phƣớc, Sóc Trăng, An Giang, TP.HCM. 4
  16. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus 1.1.1. Tình hình phân bố của Staphylococcus aureus 1.1.1.1. Trên thế giới Năm 1878, Robert Koch phát hiện Staphylococcus aureus sau khi thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt. Năm 1880 Louis Paster cũng đã thực hiên tiến hành phân lập và nghiên cứu về Staphylococcus aureus. Ngày 09/04/1880 bác sĩ ngƣời Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học, trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (staphylococcus) và trình bày tƣơng đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ lâm sàng. Đến năm 1881 Ogston đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm, đây là tiền đề cho những nghiên cứu về S.aureus sau này. Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ hơn về vi khuẩn này. Và ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là Staphylococcus aureus. Năm 1926 Julius von Daranyi là ngƣời đầu tiên phát hiện mối tƣơng quan giữa sự hiện diện hoạt động men coagulase huyết tƣơng của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948 phát hiện này mới đƣợc chấp nhận rộng rãi. Từ năm 1988 đến 1992, S. aureus gây ra 5,1% trong số các vụ ngộ độc ở Châu Âu (G.Normanno và ctv, 2005). Từ năm 1988 đén 1996, ở Đức xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu gây ra và vào năm 2000 lại xảy ra một vụ dịch làm 297 ngƣời bị ngộ độc cũng do tác nhân là tụ cầu (Viktoria Atanassovavà ctv, 2001). Từ năm 1986 đến năm1995, ở Đài Loan vi khuẩn S. aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch. Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một trƣờng trung học ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờ sau khiăn sáng (H.-L. Wei và C.-S. Chiou, 2002) . 5
  17. Đồ án tốt nghiệp Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 ngƣời bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tƣơi có nhiễm tụcầu (L. Simeaxo do Carmo và ctv, 2002). Tại Pháp, năm 1997 ngƣời ta tìm thấy S. Aureus là tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm (J.P. Rosec và O.Gigaud, 2002). Ở Nhật, từ năm 1994 đến năm 1998 số trƣờng hợp ngộ độc do tụ cầu chiếm 3,1-11,9% tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn. Ngày 17/6/1999, 21 trong số 53 công nhân sau khi ăn trƣa tại căn tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì có biểu hiện bệnh,trong đó có 8 trƣờng hợp phải nhập viện (Norinaga Miwa và ctv, 2000). 1.1.1.2 Tại Việt Nam Theo đánh giá của tổ chức ý tế thế giới, hàng năm Việt Nam có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD. Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nƣớc ta ngày càng gia tăng. Năm 2000 có 213vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 ngƣời mắc 59 ngƣời tử vong (Bùi Thế Hiền, Tô ThịThu và cộng sự, 2003). Theo số liệu từ cục Quản lý chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những vụ dịch đƣợc tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40-45% trong các loại gây ngộ độc, trong số đó có nhiều vụ đƣợc xác định tác nhân là Staphylococcus aureus. Từ năm 2002 đến 2004 theo số liệu của trung tâm y tế dự phòng đã có 77 vụ ngộ độc thực phẩm mà phần lớn nguyên nhân là do thức ăn bị nhiễm khuẩn, chiếm 66%(Nguyễn Lý Hƣơng và ctv, 2005). Từ dữ liệu của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm thì năm 2005 số vụ ngộ độc thực phẩm ở nƣớc ta là 141 vụ, làm 4291 ngƣời bị ngộ độc, trong đó có 73 vụ (51,8%) là do vi sinh vật gây ra. Từ tháng 1/2006 đến tháng 3/2006, có 18 vụ ngộ độc thực phẩm,trong đó vi sinh vật gây ra 5 vụ (27,8%). 1.2 Đặc điểm và phân loại tụ cầu khuẩn (Staphylococcus aureus) 1.2.1 Giới thiệu S.aureus (hay còn gọi là Tụ cầu vàng) có dạng hình cầu, đƣờng kính 0,5 – 1,5µm, không di động, không sinh nha bào. Trên phiến phết nhuộm Gram: vi khuẩn 6
  18. Đồ án tốt nghiệp có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, bốn con hoặc xếp thành hình chùm nho, bắt màu Gram dƣơng, nhƣng đôi khi chúng bắt màu Gram âm trong những lứa cấy già. S.aureus thuộc nhóm tụ cầu có men coagulase nên trên môi trƣờng thạch máu gây tiêu huyết, trên môi trƣờng đặc mọc khuẩn lạc màu trắng sứ hoặc trắng ngà hoặc màu vàng. S.aureus phân bố khắp nơi trong tự nhiên nhƣ đất, nƣớc, không khí. Quần thể tụ cầu khuẩn phổ biến có thể sống trên cơ thể của ngƣời. Rất nhiều ngƣời khỏe mạnh có mang S.aureus nhƣng không bị nhiễm bệnh, chúng đƣợc gọi là “tạo khóm”. Khi những vi khuẩn này gây bệnh thì ngƣời bị bệnh đƣợc gọi là “nhiễm” S.aureus. Trong đa số trƣờng hợp, S.aureus không gây ra vấn đề gì hoặc chỉ gây nhiễm khuẩn nhẹ nhƣ nổi mụn mủ hoặc bóng nƣớc. Nhƣng trong một số trƣờng hợp, S.aureus có thể gây nhiễm khuẩn trầm trọng hơn. Tỷ lệ ngƣời mang vi khuẩn tụ cầu vàng trên da hoặc niêm mạc vào khoảng từ 10 đến 90%. Các khu vực cƣ trú thƣờng gặp của tụ cầu vàng là tiền đình mũi, tóc, nách và nếp hậu môn. Đây là nguồn lây chéo trong các đơn vị hồi sức, đặc biệt là ở các bệnh nhân suy giảm miễn dịch nhƣ đái tháo đƣờng, bệnh nhân AIDS hoặc xơ gan. Chủng vi khuẩn nguy hiểm trong các khu vực này là tụ cầu vàng đề kháng với methicillin. 1.2.2 Phân loại tụ cầu vàng Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus Aureus nhƣ sau: Giới: Prokaryote Phân loại: Firmicute Lớp: Firmibacteria Họ: Micrococceae Giống: Staphylococcus 1.2.3 Đặc điểm sinh học 1.2.3.1 Hình thể và tính chất bắt màu của Stphylococcus aureus Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính chất chung của Staphylococcus.Tụ cầu vàng là những vi khuẩn hình cầu có đƣờng 7
  19. Đồ án tốt nghiệp kính 0,8 - 1μm đứng tụ lại với nhau thành từng đám nhƣ chùm nho; đôi khi có thể đứng riêng rẽ hoặc thành từng đôi hay từng chuỗi ngắn. Tụ cầu thƣờng không có vỏ, không có lông, không di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram dƣơng. Hình 1.1. Hình thái Staphylococcus aureus (Nguồn: www.impe-qn.org.vn) Hình 1.2. Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dƣơng dƣới kính hiển vi 8
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.2 Nuôi cấy Tụ cầu vàng thuộc loại vi khuẩn hô hấp hiếu khí kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Tụ cầu vàng có khả năng phát triển đƣợc ở khoảng nhiệt độ dao động từ 10 - 45 o C và môi trƣờng có nồng độ muối cao tới 10%. Trong môi trƣờng canh thang sau 5 - 6 giờ vi khuẩn đã phát triển mạnh và làm đục đều môi trƣờng, để lâu đáy có lắng cặn. Hầu hết các dòng S. aureus đều tạo sắc tố vàng, nhƣng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thƣờng thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sắc tố đƣợc tạo ra nhiều hơn trong môi trƣờng có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng (Collin C.H và cs, 1995). Trên môi trƣờng BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trƣng của S. aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đƣờng kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase) (Rosamund M B. và cs, 1995; Mary K. S. và cs, 2002). Trên môi trƣờng MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trƣờng Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc (do lên men đƣờng manitol) (Mary K. S. và cs, 2002). Một số dòng S. aureus có khả năng gây tan máu trên môi trƣờng thạch máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhƣng chúng đều có vòng tan máu hẹp hơn so với đƣờng kính khuẩn lạc. Khuẩn lạc tụ cầu vàng dạng S, kích thƣớc khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có màu vàng. Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thƣớc khoảng 1 – 2mm, có màu trắng và thƣờng không gây tan máu. 9
  21. Đồ án tốt nghiệp Môi trƣờng Bair- Paker Môi trƣờng Chapman Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc S.aureus trên hai môi trƣờng nuôi cấy 1.2.4 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố Nhu cầu dinh dƣỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi tùy thuộc vào từng dòng. S. aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7-48 o C, với nhiệt độ cực thuận là 30-45 o C; khoảng pH 4,2-9,3, với độ pH cực thuận là 7-7,5; và trong môi trƣờng chứa trên 10% NaCl. Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đƣờng cao, nhƣng bị ức chế bởi nồng độ 60%; nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu vẫn phát triển. Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm. Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S. aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu đƣợc phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của ngƣời và động vật máu nóng. S. aureus đƣợc cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ. Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nƣớc dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn. Tuy nhiên, S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 60 o C từ 2-50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật khác ức chế (Bremer P.J và cs, 2004). Có 10 - 50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S. aureus (Bremer P.J và cs, 2004). Tuy nhiên khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S. aureus cũng 10
  22. Đồ án tốt nghiệp rất lớn do chúng phân bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố. Tụ cầu nhiễm thực phẩm vào chủ yếu qua con đƣờng chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với ngƣời. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều 12 kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt. Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc, điều đó chỉ xảy ra khi S. aureus đƣợc phân lập tạo độc tố. Ngƣợc lại, chỉ với một lƣợng nhỏ S. aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc (Reginald W. B. và cs, 2001). 1.2.5. Đặc điểm sinh hóa Phát triễn tốt ở môi trƣờng tổng hợp, đặc biệt ở môi trƣờng thạch máu hoặc huyết thanh. Sinh beta hemolysis trong môi trƣờng thạch máu. Phản ứng indol, NH 3 , thủy phân gelatin, đông tụ huyết tƣơng. Trên môi trƣờng thạch khuẩn lạc có hình tròn, trơn bóng, đục mờ. Trên môi trƣờng lỏng tế bào ở dạng cặn, vòng nhãn mờ trong ống nghiệm ở trên bề mặt môi trƣờng. 1.2.6. Khả năng đề kháng Hầu hết các dòng S. aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Một vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những dòng này ngày càng tăng. Những dòng MRSA (Methicilin resistant Staphylococcus aureus) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh khác. Trong phòng thí nghiệm, ngƣời ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S. aureus , và ngƣời ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đƣờng tiêu hóa chẳng hạn. Ngoài ra, S. aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế (Kenneth Todar , 2005). Từ khi sử dụng penicillin vào những năm 1940, tính kháng thuốc đã hình thành ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn. Nhiều dòng hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thƣờng, và sắp tới sẽ kháng cả những kháng sinh mới. Thật sự là trong hai năm gần đây, việc thay thế kháng sinh cũ bằng vancomycin đã dẫn đến sự gia tăng các dòng kháng vancomycin 11
  23. Đồ án tốt nghiệp VRSA(Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus) (Kenneth Todar , 2005). Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S.aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006). 1.2.7. Tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus trên thế giới và tại Việt Nam 1.2.7.1. Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus trên thế giới Năm 1941, Penicilline bắt đầu đƣợc đƣa vào điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do Staphylococci thì đến năm 1943 đã xuất hiện chủng S.aureus kháng Penicilline [26]. Năm 1946 ở London, M.Barber và L.P.Garrod phân lập đƣợc 14% S.aureus đề kháng Penicilline do tiết ra penicillinase. Tỉ lệ này tăng lên nhanh chóng: năm 1947 là 38%, đến năm 1948 là 59%. Tại Pháp, từ năm 1948 hiện tƣợng này đƣợc Chabbert ghi nhận ở Pháp, đến năm 1962 là 17%, năm 1965 là 35%, năm 1974 là 44%. Ngày nay có đến 90% S.aureus kháng Penicilline và đang có xu hƣớng gia tăng chủng S.aureus kháng methicillin (MRSA). Các chủng MRSA đƣợc xem là kháng với các kháng sinh nhóm β-lactamins gồm Penicilline (Methicillin, Dicloxacilline, Nafcilline, Oxacilline ) và các Cephalosporine [6]. Năm 1959 Methicillin đƣợc đƣa vào sử dụng, ngay sau đó xuất hiện chủng S.aureus kháng Methicillin (MRSA). Chủng S.aureus giảm nhạy cảm với Vancomycine cũng đã đƣợc tìm thấy ở Nhật lần đầu tiên vào năm 1997 và một số nƣớc khác. Năm 1961 tại Anh, MRSA đƣợc phát hiện. Các trƣờng hợp đầu tiên đƣợc báo cáo của MRSA đã xuất hiện vào giữa những năm 1990 ở Úc, Hoa Kỳ, Anh, Pháp . Tại Anh, đến năm 1993 có 51 ca tử vong liên quan đến MRSA, năm 2005 có 1.629 ca tử vong, năm 2006 có 1.652 ca tử vong liên quan đến MRSA chiếm 50% . Từ đầu những năm 1980, Vancomycine đã đƣợc đƣa vào điều trị các nhiễm khuẩn do MRSA, đặc biệt là đối với những ca nhiễm khuẩn bệnh viện. Tuy nhiên, 12
  24. Đồ án tốt nghiệp chủng S.aureus giảm nhạy cảm với Vancomycine (VISA) đã đƣợc tìm thấy ở Nhật lần đầu tiên vào năm 1997, sau đó ở một số nƣớc khác nhƣ Úc, Đức, Gần đây hai chủng S.aureus đề kháng hoàn toàn với Vancomycin đã đƣợc tìm thấy tại Mỹ năm 2002. Một nghiên cứu mới nhất vào năm 2013 trong một bệnh viện ở Cannada, cho thấy MRSA cũng hiện diện trên bề mặt các dụng cụ y tế, trong phòng bệnh nhân và môi trƣờng chung của bệnh viện. 1.2.7.2. Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus tại Việt Nam Báo cáo “Hội nghị tổng kết công tác hội đồng thuốc và điều trị, hoạt động theo dõi sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp năm 2005”, nghiên cứu trên 5 bệnh viện cho kết quả: S.aureus (10,7%), Acinetobacter spp. (10,3%), E.coli (16,7%) . Báo cáo “Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện Thống Nhất từ 15/10/2004 đến 30/6/2005” của Vũ Thị Kim Cƣơng năm 2007 cho thấy: S.aureus (13,3%), Klebsiella (18,2%), P.aeruginosa (29,5%), E.coli (13,3%) . Báo cáo “Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn S.aureus-kết quả nghiên cứu trên 235 chủng vi khuẩn” của Phạm Hùng Vân năm 2005, các chủng vi khuẩn S.aureus từ 7 bệnh viện ở Đà Nẵng, Cần Thơ và TP. Hồ Chí Minh. Kết quả cho thấy S.aureus tỉ lệ kháng Methicilline 47%, Gentamicine 42%, Erythromycine 63%, Azithromycine 68%, Ciprofloxacine 39%, Cefuroxime 38%, Amoxicillin-clavulanic acid 30%, Cefepime 34%, Ticarcilline clavulanic acid 28%, Chloramphenicol 38%, Cotrimoxazol 25%, Levofloxacine 17% và chỉ 8% đối với Rifampicine. Nghiên cứu cho thấy vi khẩn S.aureus kháng Methicilline (MRSA) có tỉ lệ đề kháng các kháng sinh cao hơn rất rõ rệt so với vi khuẩn nhạy cảm Methicilline (MSSA). Báo cáo “Sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp tại bệnh viện Thống Nhất trong năm 2006” của Cao Minh Nga đã phân lập đƣợc 1.884 chủng vi khuẩn từ các bệnh phẩm. Trong đó, S.aureus kháng kháng sinh chiếm 7,27%. Xuất hiện chủng S.aureus kháng ở mức trung gian với Vancomycine chiếm 0,76% . 13
  25. Đồ án tốt nghiệp Báo cáo “Hoạt động theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp ở Việt Nam 6 tháng đầu năm 2006” tại 10 bệnh viện cho kết quả: S.aureus tỉ lệ đề kháng Oxacilline là 41.7%, tỉ lệ đề kháng Bactrim là 27.2%, tỉ lệ đề kháng Vancomycine là 1.8% . Báo cáo “Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp tại bệnh viện Nhi Đồng tháng 2 năm 2007” của Trần Thị Ngọc Anh năm 2008 đã phân lập đƣợc 2.738 chủng vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm. Trong đó có 311 chủng S.aureus kháng Methicillin (MRSA) chiếm 33,5%. Báo cáo “Chọn lựa kháng sinh ban đầu trong điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số bệnh viện ở Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 8/2009 đến tháng 8/2010” của Nguyễn Thanh Bảo và Cao Minh Nga năm 2011, cho thấy có 6 loại vi khuẩn thƣờng gặp nhất trong các loại nhiễm khuẩn bệnh viện. Trong đó S.aureus chiếm 7,66%. Báo cáo “Tình hình kháng kháng sinh trên những chủng vi khuẩn thƣờng gặp phân lập trên bệnh nhân nhiễm trùng tiểu tại Viện Pasteur TP.HCM năm 2010” của Nguyễn Thị Ngọc Lan và cộng sự năm 2011. Trong đó tỉ lệ kháng kháng sinh của S.aureus với Penicilline 92,9%, Erythromycine 75%, Kanamycine 75%, Gentamycine 48%, Ofloxacine 46,4%, Fusidic acid 42,9%, Oxacilline 39,3%. Tỉ lệ MRSA của Staphylococcus là 39,3% Báo cáo “Kháng thuốc và gen mã hóa độc tố ruột của S.aureus phân lập từ năm 2006-2010 tại TP.HCM, Việt Nam” của Diệp Thế Tài, Vũ Lê Ngọc Lan và cộng sự năm 2011, trong 126 chủng S.aureus có 57 chủng MRSA chiếm 45,24%. Báo cáo “Tìm hiểu tính kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus phân lập trên bệnh nhân tại Viện Pasteur Nha Trang năm 2011” của Nguyễn Văn Vinh đã phân lập đƣợc 243 chủng vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm, trong đó S.aureus chiếm 35,6% (86 chủng). Kết quả S.aureus kháng nhiều loại kháng sinh với tỉ lệ kháng Penicilline 91,9%, Erythromycine 79,0%, Kanamycine 68,6%, Gentamycine 48,8%, Oxacilline 39,5%, Ofloxacine 38,4%, Amoxicillin-clavulanic acid 32,6%, Fosfomycine 26,7%, Fusidic acid 23,3%, Pristinamycine 9,3%, Rifampicine 9,3% và Vancomycine 1,1%. Tỉ lệ MRSA chiếm 39,5%. 14
  26. Đồ án tốt nghiệp Báo cáo “Khảo sát sự kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và các chủng Staphylococcus spp. tại bệnh viện Nhân dân Gia Định từ tháng 1-6/2011” của Trần Thị Quyên năm 2012. Kết quả S.aureus kháng với Erythromycine 60,3%, Ofloxaxine 55,8%, Penicilline 52,0%, Oxacilline 40,5%, Clindamycine 39,3%, Gentamycine 38,7%, Fusidic acid 11,1%, Rifampicine 3,7% và Vancomycine 0,0%. Tỉ lệ MRSA đa kháng trên 50% và kháng kháng sinh nhiều hơn MSSA. 1.2.8. Khả năng gây bệnh của S.aureus S.aureus gây bệnh là do khả năng nhân lên rồi lan tràn vào mô, đồng thời tiết ra enzyme (catalase, coagulase, staphylokinase, proteinase, lipase, β-lactamase) và độc tố (enterotoxin A, B, C, D, E, F, Toxic shock syndrome toxin, Exfoliative toxin, α-toxin, β-toxin) [3]. Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây bệnh của S.aureus là khả năng kết hợp các chất ngoại bào và tính xâm lấn của vi khuẩn. Trong trƣờng hợp ngộ độc thức ăn, yếu tố duy nhất là độc tố có sẵn trong thức ăn. Bệnh lý Dạng nhiễm trùng ban đầu là nhọt hay những áp xe khu trú. Sự xâm nhập của S.aureus vào nang lông làm da bị hoại tử. Coagulase đƣợc tiết ra làm đông huyết tƣơng tại sang thƣơng, tạo một vách bao quanh và giới hạn quá trình tiến triển của sang thƣơng. Vách đƣợc củng cố bởi tế bào viêm và cuối cùng là mô sợi. Sau đó phân hoá lỏng do hoại tử. Nếu phá vỡ vách khi sang thƣơng chƣa hoá mủ sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn lan đi nhanh chóng, bệnh tiến triển nặng, đặc biệt là mụn nhọt ở mặt. Từ ổ nhiễm, S.aureus có thể xâm nhập vào các nơi khác qua đƣờng bạch huyết, máu và có thể gây viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận, nhiễm khuẩn máu, viêm tuỷ xƣơng [3]. Biểu hiện lâm sàng Tụ cầu có men coagulase gây nên rất nhiều bệnh lý khác nhau dựa vào khả năng xâm nhập hay sinh độc tố của tụ cầu 15
  27. Đồ án tốt nghiệp Các bệnh nhiễm trùng khu trú tại da và niêm mạc: chủ yếu ở các chân lông và tuyến mồ hôi tạo thành áp xe. Tổn thƣơng tại chỗ có thể nhẹ nhƣng nó cũng là nguy cơ phát tán vi khuẩn đến những cơ quan xa hơn. Mủ của các ổ áp xe do tụ cầu vàng thƣờng có màu vàng, đặc và không hôi. Nhiễm trùng các cơ quan sâu: nhiễm trùng các cơ quan bên trong cơ thể do vi khuẩn theo đƣờng máu và bạch huyết đến các cơ quan khác hoặc vi khuẩn đi từ môi trƣờng vào cơ thể thông qua vết rách da sau chấn thƣơng hoặc trong quá trình phẫu thuật. Các bệnh lý điển hình trong nhóm này: viêm tủy xƣơng, nhiễm trùng huyết, viêm màng tim, viêm màng não mủ Viêm da bọng nƣớc (bong da sơ sinh, hội chứng bong da do tụ cầu) thƣờng gặp ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Tác nhân gây bệnh là các chủng tụ cầu sản xuất độc tố Exofoliatine. Ngay sau triệu chứng sốt và đỏ da, bệnh có biểu hiện đặc trƣng là việc bong lớp biểu bì đồng thời hình thành bọng nƣớc trên diện rộng. Bệnh thƣờng diễn tiến lành tính. Hội chứng sốc nhiễm độc: thƣờng gặp ở phụ nữ trẻ trong kỳ kinh nguyệt dùng băng thấm hút mạnh. Khoảng 20% phụ nữ có mang tụ cầu ở đƣờng âm đạo. Triệu chứng lâm sàng của hội chứng sốc nhiễm độc gồm đột ngột sốt cao, cảm giác mệt mỏi, tiêu chảy toàn nƣớc, nhức đầu, đau cơ, nổi ban ngoài da và một hoặc nhiều dấu hiệu của sốc. Hội chứng này có tỉ lệ tử vong khá cao. Ngộ độc thực phẩm là bệnh điển hình nhất do độc tố ruột bền với nhiệt của tụ cầu. Sau khi ăn các thức ăn nguội hoặc kể cả các thức ăn nhiễm tụ cầu đã đƣợc nấu chín. 1.2.9 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở ngƣời. Thƣờng xảy ra ở những chỗ xây xƣớc trên bề mặt da nhƣ nhọt, gây ra nhiều bệnh nhiễm nghiêm trọng nhƣ viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác nhƣ viêm xƣơng tủy, viêm màng trong tim. S. aureus cũng là nguyên nhân chủ yếu của việc nhiễm trùng vết mổ và những vụ nhiễm trùng do dụng cụ y khoa. S. aureus còn gây ngộ độc thực phẩm do 16
  28. Đồ án tốt nghiệp 13 tạo độc tố ruột enterotoxin trong thực phẩm, và gây hội chứng shock độc tố do chúng tạo ra siêu kháng nguyên trong máu (Kenneth Todar, 2005). Protein bề mặt: thúc đẩy việc bám dính vào tế bào chủ. Ngoài ra, hầu hết các dòng đều tạo protein gắn kết fibronogen và fibronetin làm kích thích sự kết dính các khối máu và mô bị chấn thƣơng. Các protein gắn kết chất tạo keo cũng thƣờng gặp ở những dòng gây bệnh viêm xƣơng tủy và viêm khớp. Yếu tố xâm lấn (hemolysins, leukocidin, kinase, hyaluronidase): giúp vi khuẩn lan ra trên mô, phân hủy màng tế bào eukaryote. 1.2.10. Phòng và điều trị bệnh 1.2.10.1. Phòng bệnh Vaccin phòng bệnh tụ cầu ít có kết quả. Phƣơng pháp phòng bệnh chủ yếu là vệ sinh môi trƣờng, vệ sinh cá nhân và quần áo, vệ sinh ăn uống, đặc biệt là vệ sinh bệnh viện để tránh nhiễm khuẩn bệnh viện. Đối với các dụng cụ tiêm truyền, các dụng cụ dùng trong sản khoa, ngoại khoa phải đảm bảo vô khuẩn khi dùng cho bệnh nhân. 1.2.10.2. Điều trị Tụ cầu bị tiêu diệt bởi nhiều kháng sinh nhƣ: tetracylin, oxacillin, kanamycin, gentamycin, vancomycin Tuy nhiên, do việc dùng kháng sinh rộng rãi và tuỳ tiện nên tụ cầu đã kháng lại nhiều loại kháng sinh. Việc điều trị cần thiết phải dựa vào kháng sinh đồ để chọn thuốc thích hợp. 17
  29. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại phòng Vi khuẩn 1 (Vi khuẩn đƣờng ruột) – khoa Vi sinh miễn dịch – Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian nghiên cứu: 12/2016 đến 06/2017. 2.2. Vật liệu thí nghiệm 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Các mẫu môi trƣờng (nƣớc đá, nƣớc sông, nƣớc sinh hoạt), các mẫu thực phẩm (thịt, cá, rau, ) và các mẫu phân từ các tỉnh An Giang, Tây Ninh, Bến Tre, Bình Phƣớc và Thành phố Hồ Chí Minh gửi về phòng Vi khuẩn 1. 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 2.2.2.1. Dụng cụ Đĩa petri Que cấy tròn Ống đông Eppendoff Ống nghiệm thủy tinh Kẹp Tube Đèn cồn Micropipet, pipetman Hộp đá lạnh Đầu tube Ống falcon Bercher Đầu col pipette các loại Que cấy gòn cuvet Giấy vệ sinh Khẩu trang Găng tay Bọc nilon 2.2.2.2. Thiết bị Cân điện tử Lò viba Cân phân tích Máy Shaking Tủ an toàn sinh học cấp 2 Máy ủ nhiệt Tủ lạnh Máy spin Máy ly tâm lạnh Lò vi sóng Tủ ấm Bếp điện 18
  30. Đồ án tốt nghiệp Máy vortex Máy điện di Bể ổn nhiệt Máy PCR 2.2.3. Hóa chất và môi trường - Môi trƣờng tăng sinh vi khuẩn: BHI Broth. - Hóa chất tách chiết DNA: dung dịch TE (10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA), nƣớc cất. - Hóa chất sử dụng cho quá trình điện di: Agarose (Bio – RAD), Ethidium Bromide, dung dịch chạy điện di TBE 0,5X (Invitrogene), nƣớc cất. - Hóa chất sử dụng cho PCR: Master Mix 2X, Primer, nƣớc cất khử ion. - Môi trƣờng phân lập S.aureus: Baird parker agar (BP) - Môi trƣờng giữ chủng: LB broth +20% Glycerol. - Môi trƣờng Mueller Hinton (MH) - Nƣớc muối vô trùng (0,85% NaCl) 2.3. Phƣơng pháp tiến hành 2.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập 2.3.1.1. Mẫu nước - Tăng sinh: Lấy 100 μl mỗi mẫu nƣớc tăng sinh trong 3ml môi trƣờng BHI broth, ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát mẫu, ghi nhận kết quả. - Cấy trực tiếp: Lấy 10 μl mỗi mẫu nƣớc lên các môi trƣờng BP ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát khuẩn lạc mọc trên các môi trƣờng, ghi nhận kết quả. Nếu mẫu nào không mọc hoặc mọc khuẩn lạc không đặc trƣng thì ta tiến hành cấy 10μl mẫu nƣớc đã tăng sinh lên môi trƣờng BP, ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát khuẩn lạc, ghi nhận kết quả. Tiến hành giữ nhuộm gram các khuẩn lạc nghi ngờ. 2.3.1.2. Mẫu thực phẩm - Lấy 25 g mỗi mẫu thực phẩm tăng sinh trong 225 ml môi trƣờng BHI, ủ qua đêm ở 37oC. - Sau đó cấy 10 μl mỗi mẫu đã tăng sinh lên các môi trƣờng BP, ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát khuẩn lạc mọc trên các môi trƣờng, ghi nhận kết quả. Tiến hành giữ nhuộm gram các khuẩn lạc nghi ngờ. 19
  31. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1.3 Mẫu phân Mẫu phân đƣợc thu nhận trong ống falcon môi trƣờng Cary-Blair. - Tăng sinh: Tăng sinh trong môi trƣờng BHI broth hoặc LB broth bằng cách bỏ que gòn trong ống mẫu vào ống nghiệm môi trƣờng. Ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát mẫu, ghi nhận kết quả. - Cấy trực tiếp: Lấy que gòn mỗi mẫu phân phết lên các môi trƣờng BP ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát khuẩn lạc mọc trên các môi trƣờng, ghi nhận kết quả. Nếu mẫu nào không mọc hoặc mọc khuẩn lạc không đặc trƣng thì ta tiến hành cấy 10μl mẫu phân đã tăng sinh lên môi trƣờng BP, ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát khuẩn lạc, ghi nhận kết quả. Tiến hành giữ nhuộm gram các khuẩn lạc nghi ngờ. 2.3.2 Quan sát hình thái Tiến hành nhuộm Gram tiêu bản vi khuẩn phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc: - Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm. - Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn. - Nhuộm với crytal violet trong 1 phút. - Nhuộm với dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 30 giây. - Rửa với ethanol 95% khoảng 30 giây. - Rửa bằng nƣớc. - Nhuộm tiếp với dung dịch fuchsin trong 30 giây. - Rửa qua nƣớc. Để khô. - Quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần. 2.3.3 Kỹ thuật multiplex PCR Sau khi đã phân lập đƣợc S.aureus trên các mẫu môi trƣờng (mẫu H2O),thực phẩm. Tiến hành định danh S.aureus bằng kỹ thuật multiplex PCR. 20
  32. Đồ án tốt nghiệp Quy trình kỹ thuật chạy multiplex PCR: Mẫu đã phân lập Tách chiết DNA Chạy PCR Điện di Đọc kết quả Sơ đồ 1.1. quy trình PCR Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR Gen Vị trí Cặp mồi Trình tự mục khuếch 5’ → 3’ tiêu đại (bp) Nuc F TTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCA Nuc 132 Nuc R GCCACGTCCATATTTATCAGTTC Fem F AAAAAAGCACATAACAAGCG Fem A 279 Fem R GATAAAGAAGAAACCAGCAG 21
  33. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR đa mồi cơ sở phát hiện vi khuẩn S.aureus Thành phần Nồng độ Nồng độ cuối Thể tích/ 1 phản ứng đầu PCR Master Mix 2 X 1 X 12,5 µl Fem F 100 pmol 20 pmol 1 µl Fem R 100 pmol 20 pmol 1 µl Nuc F 100 pmol 20 pmol 0,5 µl Nuc R 100 pmol 20 pmol 0,5 µl Nƣớc cất khử ion 6,5 µl DNA mẫu 3 µl Tổng thể tích 25 µl Điện đi: - Chuẩn bị gel agarose (TBE 0.5X và agarose 2 %). - 8µl sản phẩm chạy PCR với 5µl load dye. - Nạp mẫu vào giếng. - Chạy điện di ở 100V trong 30 phút. Bảng 2.1. Chu trình nhiệt cơ sở của các mồi Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian 10 phút Biến tính 950C Biến tính 940C 30 giây Gắn mồi 55.70C 30 giây 30 chu kỳ Tổng hợp 720C 1 phút Kết thúc 720C 10 phút Giữ ổn định nhiệt 40C 22
  34. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4. Kỹ thuật kháng sinh đồ theo phƣơng pháp Kirby-Bauer Kháng sinh: có 7 loại kháng sinh đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này với hàm lƣợng nhƣ sau - Cefoxitin (FOX) 30 μg - Gentamicin (CN) 10μg - Azithromycin (AZM) 15 μg - Doxycycline (DO) 30 μg - Ciprofloxacin (CIP) 5 μg - Vancomycin (VA) 30 μg - Clinamycin ( DA) 2μg Chuẩn bị - Đĩa kháng sinh: trƣớc khi thử nghiệm kháng sinh đồ, các lọ chứa đĩa phải đƣợc lấy ra khỏi tủ lạnh 1-2 giờ trƣớc khi mở nắp. Chỉ sử dụng các đĩa còn hạn dùng, loại bỏ các đĩa kháng sinh quá hạn. - Môi trường tiêu chuẩn MH: trƣớc khi dùng, nếu mặt trên thạch quá ẩm thì nên để hộp thạch hé nắp ở tủ ấm (370C) cho đến khi khô mặt. Hộp đã đƣợc kiểm tra đảm bảo vô trùng trƣớc khi làm kháng sinh đồ. 23
  35. Đồ án tốt nghiệp Thực hiện S.aureus Cấy chuyển vào môi trƣờng không chọn lọc ủ 37±2oC/qua đêm Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nƣớc muối sinh lý (nồng độ 108 vi khuẩn/ml) Điều chỉnh độ đục vi khuẩn (nồng độ 10 8 vi khuẩn/ml) Đo mật độ quang (600 nm) Trãi đều huyền dịch vi khuẩn lên đĩa thạch MHA Đặt khoanh giấy kháng sinh o ủ 37 C/qua đêm ủ to phòng/qua đêm Đo vòng vô khuẩn Phân tích và trả lời kết quả đề kháng kháng sinh dựa vào CLSI-2017 Sơ đồ 2.2. Quy trình thực hiện kháng sinh đồ S.aureus 24
  36. Đồ án tốt nghiệp Đọc kết quả Sau khi ủ qua đêm, vi khuẩn mọc thành những khúm mịn tiếp hợp nhau tạo thành vòng tròn đồng nhất. Nếu vi khuẩn mọc đƣợc thành khúm riêng rẻ tức là mầm cấy quá loãng, phải làm lại thử nghiệm. Đo đƣờng kính vòng vô khuẩn là một vòng kể cả đƣờng kính đĩa kháng sinh, hoàn toàn không có vi khuẩn mọc nhìn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. Đơn vị đo đƣờng kính vòng vô khuẩn là milimet (mm). Dùng thƣớc kẹp đo vòng vô khuẩn ở mặt sau của hộp thạch. Sau đó ghi lại kết quả đƣờng kính vòng vô khuẩn của từng loại kháng sinh. Hình 2.1. Cách đọc kết quả kháng sinh đồ (Nguồn Wikiwand ) Dựa vào bảng tiêu chuẩn CLSI năm 2017 đánh giá kết quả đƣờng kính vô khuẩn đối với Staphylococcus aureusđể xác định 3 mức độ: nhạy cảm (S), trung gian (I) và kháng (R) đối với kháng sinh thử nghiệm. Riêng đối với thử nghiệm tìm MRSA : Kết quả S.aureus nhạy cảm, trung gian hay kháng với Cefoxitin cũng đồng nghĩa S.aureus nhạy cảm, trung gian hay kháng với Methicilline. 25
  37. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.4. Bảng tiêu chuẩn đánh giá kết quả đƣờng kính vô khuẩn đối với Staphylococcus aureus theo CLSI năm 2017. Tên kháng Hàm Đƣờng kính vòng vô Đĩa kháng sinh sinh (viết lƣợng khuẩn (mm) tắt) (μg) S I R Cefoxitin FOX 30 ≥22 - ≤21 Gentamicin CN 10 ≥15 13-14 ≤12 Azithromycin AZM 15 ≥18 14-17 ≤13 Clindamycin DA 2 ≥21 15-20 ≤14 Doxycycline DO 30 ≥16 13-15 ≤12 Ciprofloxacin CIP 5 ≥21 16-20 ≤15 Vancomycin VA 30 - - - 26
  38. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, mẫu nƣớc và mẫu bệnh phẩm 3.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc S.aureus Sau khi cấy mẫu nghiên cứu trên môi trƣờng BP đĩa, ủ ở 37oC sau 24 giờ, quan sát và chọn những khuẩn lạc điển hình có đặc điểm nhƣ hình 2.1. Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn S.aureus trên môi trƣờng BP (a): Mẫu GS17.18.P.AG; (b): Mẫu 006EQA.83BR; Khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn S.aureus có hình tròn, lồi, có tâm đen và quầng sáng xung quanh đƣờng kính từ 0,5 – 1,5 mm. Nhuộm Gram tiêu bản vi khuẩn phân lập và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy: các chủng vi khuẩn có hình dạng là cầu khuẩn, Gram dƣơng, thƣờng xếp thành từng chùm giống chùm nho. Hình 3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn S.aureus 27
  39. Đồ án tốt nghiệp 3.1.2. Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, môi trường và mẫu bệnh phẩm ở 5 tỉnh An Giang, Sóc Trăng, Bến Tre, Bình Phước, TP.Hồ Chí Minh. Kết quả xét nghiệm ở 5 tỉnh, phát hiện ở tỉnh Sóc Trăng có số mẫu dƣơng tính là 7,8% (6/77), tỉnh Bến Tre có số mẫu dƣơng tính là 6,8% (5/74), tỉnh Bình Phƣớc có số mẫu dƣơng tính là 5,1% (3/59),ở tỉnh An Giang có số mẫu dƣơng tính là 4,8% (3/62), và Thành phố Hồ Chí Minh không phát hiện dƣơng tính. Bảng 3.1. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở Thành phố Hồ Chí Minh Kết quả PCR Tỉ lệ (+) với Loại mẫu Số mẫu (+) với S.aureus S.aureus trên (mẫu) tổng số mẫu (%) Nƣớc đá 4 0 Nƣớc sinh hoạt 4 0 Nƣớc sông 4 0 0 Thực phẩm 4 0 Phân 3 0 Chú thích: (+): dƣơng tính Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh An Giang Kết quả PCR Tỉ lệ (+) với Loại mẫu Số mẫu (+) với S.aureus S.aureus trên (mẫu) tổng số mẫu (%) Nƣớc đá 9 2 Nƣớc sinh hoạt 9 0 Nƣớc sông 9 0 4,8 Thực phẩm 9 0 Phân 26 1 28
  40. Đồ án tốt nghiệp Chú thích: (+): dƣơng tính Bảng 3.3. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Bến Tre Kết quả PCR Tỉ lệ (+) với Loại mẫu Số mẫu (+) với S.aureus S.aureus trên (mẫu) tổng số mẫu (%) Nƣớc đá 7 0 Nƣớc sinh hoạt 7 0 Nƣớc sông 7 0 6,8 Thực phẩm 7 1 Phân 46 4 Chú thích: (+): dƣơng tính Bảng 3.4. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Bình Phƣớc Kết quả PCR Tỉ lệ (+) với Loại mẫu Số mẫu (+) với S.aureus S.aureus trên (mẫu) tổng số mẫu (%) Nƣớc đá 8 1 Nƣớc sinh hoạt 9 1 5,1 Nƣớc sông 9 0 Thực phẩm 9 0 Phân 24 1 Chú thích: (+): dƣơng tính Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Sóc Trăng Kết quả PCR Tỉ lệ (+) với Loại mẫu Số mẫu (+) với S.aureus S.aureus trên (mẫu) tổng số mẫu (%) Nƣớc đá 12 2 7,8 29
  41. Đồ án tốt nghiệp Nƣớc sinh hoạt 12 4 Nƣớc sông 12 0 Thực phẩm 12 0 Phân 29 0 Chú thích: (+): dƣơng tính Các mẫu dƣơng tính tồn tại ở hầu hết các loại mẫu: nƣớc đá, nƣớc sinh hoạt và phân, trừ mẫu nƣớc sông không phát hiện dƣơng tính. 3.1.3. So sánh kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus tại 5 tỉnh thành theo từng loại mẫu Bảng 3.6. Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus tại khu vực phía Nam theo từng loại mẫu. Kết quả PCR (+) với Loại mẫu Số mẫu S.aureus (mẫu) Phân 128 6 Nƣớc đá 40 5 Nƣớc sinh hoạt 41 5 Nƣớc sông 41 0 Thực phẩm 41 1 Chú thích: (+): dƣơng tính Qua kết quả bảng 2.6 cho thấy, số mẫu dƣơng tính với S.aureus trên mẫu nƣớc đá với 5/40 (12,5%), số mẫu dƣơng tính trên mẫu nƣớc sinh hoạt là 5/41(12,2%) ; số mẫu dƣơng tính trên mẫu phân là 6/128(4,7%), số mẫu dƣơng tính trên mẫu thực phẩm là 1/41 chiếm tỉ lệ 2,4 % mẫu nƣớc sông không phát hiện dƣơng tính. 3.2. Kết quả định danh vi khuẩn S.aureus Sau khi đã nuôi cấy và phân lập đƣợc S.aureus trên các mẫu thực phẩm, môi trƣờng và bệnh phẩm. Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA các mẫu có khuẩn lạc là S.aureus và thực hiện quy trình định danh S.aureus bằng kỹ thuật multiplex PCR. 30
  42. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3 Kết quả điện di phát hiện S.aureus sử dụng mồi Fem và Nuc. (L) 1: thang điện di, Giếng 2: chứng dương, Giếng 3: chứng dương I, Giếng 4: chứng âm, Giếng 5: 006EQA.83BR, Giếng 6:17.10NSH.ST, Giếng 7: 17.11NSH.ST, Giếng 8: 17.12NSH.ST, Giếng 9: 17.12NĐ.ST. 3.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, môi trƣờng và mẫu bệnh phẩm ở 5 tỉnh An Giang, Sóc Trăng, Bến Tre, Bình Phƣớc, TP.Hồ Chí Minh. Hình 3.4. Kết quả kháng sinh đồ từ mẫu thực phẩm (005EQA.82BR) và mẫu bệnh phẩm (GS17.018P.AG) 31
  43. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7. Kết quả kháng sinh đồ của S.aureus (n = 17) ký Kháng (R) Trung gian (I) Nhạy (S) Stt Kháng sinh hiệu n (%) n (%) n (%) 1 Cefoxitin FOX 15(88,2) - 2(11,8) 2 Gentamicin CN 10(52,6) 2(11,8) 5(29,4) 3 Azithromycin AZM 11(57,9) - 6(31,6) 4 Doxycycline DO 5(29,4) 1(5,8) 11(57,9) 5 Cip CIP 12(70,6) - 5(29,4) 6 Vancomycin VA 1(5,8) - 16(94,1) 7 Clindamycin DA 9(52,9) - 8(47,1) Trong số 17 chủng S.aureus đƣợc thực hiện kháng sinh đồ với 7 loại kháng sinh cho thấy: tỉ lệ S.aureus đề kháng cao nhất với kháng sinh Cefoxitin 15/17(88,2%), Cip 12/17 (70,6%), Azithromycin 11/17 (57,9%) Gentamicin 10/17 (52,6%), Clindamycine 9/17 (52,9%), Doxycycline 5/17 (29,4%). Ngoài ra, S.aureus có hiện tƣợng giảm nhạy cảm (kháng trung gian) với 2 loại kháng sinh: Gentamicin 2/17(11,8%), Doxycycline 1/17 (5,8%). S.aureus vẫn còn nhạy cảm trên 90% với: Vancomycin 16/17 (94,1%). Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ đề kháng đa kháng sinh của S.aureus (n= 15) 32
  44. Đồ án tốt nghiệp Trong tổng số 17 chủng S.aureus đƣợc thực hiện kháng sinh đồ với 7 loại kháng sinh: có 15/17 chủng S.aureus kháng từ 2 loại kháng sinh trở lên (đa kháng chiếm 89,5%). Trong số 15 chủng S.aureus đa kháng: chiếm tỉ lệ cao nhất là S.aureus kháng cùng lúc với 4 loại kháng sinh: có 6 chủng S.aureus (chiếm 40,0%); kháng 3 loại kháng sinh : có 3 chủng S.aureus (chiếm 20,0%), kháng 2 loại kháng sinh: có 3 chủng S.aureus ( chiếm 20,0%); kháng 5 loại kháng sinh: có 2 chủng S.aureus (chiếm 13,3%). Chiếm tỉ lệ thấp có 1 chủng S.aureus kháng với 6 loại kháng sinh (6,7 %). Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu bệnh phẩm (n= 6) Có 6 chủng S.aureus đƣợc phân lập từ mẫu bệnh phẩm phân. Trong 6 chủng S.aureus đƣợc thực hiện kháng sinh đồ với 7 loại kháng sinh: có 6/6 trƣờng hợp S.aureus kháng MRSA, 4/6 trƣờng hợp cùng kháng với Gentamicin và Cip,3/6 trƣờng hợp kháng với Doxycycline và Azithromycin. Vi khuẩn vẫn còn nhạy với Vancomycine (6/6 trƣờng hợp). 33
  45. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.3. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu nƣớc Có 10 chủng S.aureus đƣợc phân lập từ mẫu môi trƣờng( mẫu nƣớc). Trong 10 chủng S.aureus đƣợc thực hiện kháng sinh đồ với 7 loại kháng sinh: có 8/6 trƣờng hợp S.aureus kháng MRSA và Cip , 7/10 trƣờng hợp cùng kháng với Azithromycin, 6/10 trƣờng hợp kháng với Gentamicin và Clindamicin. Biểu đồ 3.4. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu thực phẩm 34
  46. Đồ án tốt nghiệp Có 1 chủng S.aureus đƣợc phân lập từ mẫu thực phẩm.Chủng S.aureus đƣợc thực hiện kháng sinh đồ với 7 loại kháng sinh: có 1 trƣờng hợp S.aureus kháng MRSA, Azithromycin, Doxycycline, Gentamicin. S.aureus vẫn còn nhạy với: Vancomycine và Clindamycin, Cip. 3.4. Tỉ lệ S.aureus kháng Methicilline (MRSA) Bảng 3.12. Tỉ lệ S.aureus kháng Methicilline (MRSA) trong tổng số mẫu thực hiện kháng sinh đồ (n=17). Chủng S.aureus Số lƣợng Tỉ lệ (%) MRSA 15 88,2 Tổng số 17 100,0 35
  47. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Qua nghiên cứu khảo sát tổng cộng 270 mẫu từ các mẫu các thực phẩm, mẫu môi trƣờng, mẫu phân tại 5 tỉnh/thành phố: Thành phố Hồ Chí Minh, An Giang, Bến Tre, Bình Phƣớc và Sóc Trăng. Kết quả cho thấy, vi khuẩn S.aureus phân bố: - Kết quả xét nghiệm ở 5 tỉnh, phát hiện ở tỉnh Sóc Trăng có số mẫu dƣơng tính cao nhất là 7,8% (6/77), tỉnh Bến Tre có số mẫu dƣơng tính là 6,8% (5/74), tỉnh Bình Phƣớc có số mẫu dƣơng tính là 5,1% (3/59),ở tỉnh An Giang có số mẫu dƣơng tính là 4,8% (3/62), và Thành phố Hồ Chí Minh không phát hiện dƣơng tính - Kết quả xét nghiệm ở các mẫu môi trƣờng, bệnh phẩm, thực phẩm có số mẫu dƣơng tính với S.aureus trên mẫu nƣớc đá là cao nhất với 5/40 (12,5%), số mẫu dƣơng tính trên mẫu nƣớc sinh hoạt là 5/41(12,2%) ; số mẫu dƣơng tính trên mẫu phân là 6/128(4,7%), số mẫu dƣơng tính trên mẫu thực phẩm là 1/41 chiếm tỉ lệ 2,4 % mẫu nƣớc sông không phát hiện dƣơng tính. - Trong số 17 chủng S.aureus đƣợc thực hiện kháng sinh đồ với 7 loại kháng sinh cho thấy: tỉ lệ S.aureus đề kháng cao nhất với kháng sinh MRSA là 15/17(88,2%), Cip 12/17 (70,6%), Azithromycin 11/17 (57,9%) Gentamicin 10/17 (52,6%), Clindamycine 9/17 (52,9%), Doxycycline 5/17 (29,4%). Ngoài ra, S.aureus có hiện tƣợng giảm nhạy cảm (kháng trung gian) với 2 loại kháng sinh: Gentamicin 2/17(11,8%), Doxycycline 1/17 (5,8%). S.aureus vẫn còn nhạy cảm trên 90% với: Vancomycin 16/17 (94,1%). Đã phát hiện đƣợc một chủng kháng Vancomycin đƣợc phân lập từ mẫu bệnh phẩm.  Tỉ lệ đề kháng đa kháng sinh của S.aureus (n= 15) Trong tổng số 17 chủng S.aureus đƣợc thực hiện kháng sinh đồ với 7 loại kháng sinh: có 15/17 chủng S.aureus kháng từ 2 loại kháng sinh trở lên (đa kháng chiếm 89,5%). Trong số 15 chủng S.aureus đa kháng: chiếm tỉ lệ cao nhất là S.aureus kháng cùng lúc với 4 loại kháng sinh: có 6 chủng S.aureus (chiếm 40,0%); kháng 3 loại kháng sinh : có 3 chủng S.aureus (chiếm 20,0%), kháng 2 loại kháng sinh: có 3 chủng S.aureus ( chiếm 20,0%); kháng 5 loại kháng sinh: có 2 chủng S.aureus 36
  48. Đồ án tốt nghiệp (chiếm 13,3%).Chiếm tỉ lệ thấp có 1 chủng S.aureus kháng với 6 loại kháng sinh (6,7 %).  Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu bệnh phẩm (n= 6) Trong 6 chủng S.aureus đƣợc thực hiện kháng sinh đồ với 7 loại kháng sinh: có 6/6 trƣờng hợp S.aureus kháng MRSA, 4/6 trƣờng hợp cùng kháng với Gentamicin và Cip,3/6 trƣờng hợp kháng với Doxycycline và Azithromycin. Vi khuẩn vẫn còn nhạy với Vancomycine (6/6 trƣờng hợp).  Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu nước (n= 10) Có 10 chủng S.aureus đƣợc phân lập từ mẫu môi trƣờng( mẫu nƣớc). Trong 10 chủng S.aureus đƣợc thực hiện kháng sinh đồ với 7 loại kháng sinh: có 8/6 trƣờng hợp S.aureus kháng MRSA và Cip , 7/10 trƣờng hợp cùng kháng với Azithromycin, 6/10 trƣờng hợp kháng với Gentamicin và Clindamicin.  Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu thực phẩm (n= 1) Có 1 chủng S.aureus đƣợc phân lập từ mẫu thực phẩm.Chủng S.aureus đƣợc thực hiện kháng sinh đồ với 7 loại kháng sinh: có 1 trƣờng hợp S.aureus kháng MRSA,Azithromycin, Doxycycline, Gentamicin. S.aureus vẫn còn nhạy với: Vancomycine và Clindamycin, Cip. 4.2 Kiến nghị Tiến hành khảo sát sự phân bố của vi khuẩn S.aureus tại các tỉnh khác trong khu vực phía nam. Tiến hành khảo sát khả năng sinh men ISBL và Hogtest đối với vi khuẩn gram dƣơng S.aureus. 37
  49. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Hội nghị tổng kết công tác hội đồng thuốc và điều trị: hoạt động theo dõi sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp năm 2005 (2006), Đà Nẵng. 2. Trần Thị Ngọc Anh (2008) "Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp tại bệnh viện Nhi Đồng 2 năm 2007". Tạp chí Y học TP.Hồ Chí Minh, Vol.12 - Số 4-2008 (183-191). 3. Nguyễn Thanh Bảo (2011) Vi khuẩn học, Bộ môn Vi Sinh - Khoa Y - Đại Học Y Dƣợc TP.HCM - Nhà xuất bản Y học TP.HCM. 4. Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga (2011) Chọn lựa kháng sinh ban đầu trong điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số bệnh viện tại Thành phố Hồ Chí Minh, Sở Khoa Học và Công Nghệ TP.HCM. 5. Lê Huy Chính (2001) Vi sinh y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 6. Vũ Thị Kim Cƣơng (2007) Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện Thống Nhất từ 15/10/2004 đến 30/6/2005, Luận văn Thạc sỹ Y học, Đại học Y dƣợc TP.HCM. 7. Nguyễn Hữu Đức (2012) Đề kháng kháng sinh -29876.html, cập nhật ngày 16/08/2013. 8. Nguyễn Đức Hiền, Nguyễn Thị Vinh và Cộng sự (2006) Báo cáo hoạt động theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam năm 2004 và 2005, Hội nghị tổng kết công tác hội đồng thuốc và điều trị; hoạt động theo dõi sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp (ASTS) năm 2005.Đà Nẵng, 02-2006, Tr.123-131. 9. Kingcountry (8/2013) Bệnh nhiễm khuẩn da tụ cầu, cập nhật ngày 06/08/2013. 10. Nguyễn Văn Kính (2010) "Phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt Nam". 38
  50. Đồ án tốt nghiệp 11. Cao Minh Nga (2006) Sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện Thống Nhất trong năm 2006. 12. CLSI 2012 - Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm (2012) Quy trình thao tác chuẩn về thử nghiệm tính nhậy cảm kháng sinh - Tiêu chuẩn đọc kết quả kháng sinh đồ và MIC. 13. Trần Thị Quyên (2012) Khảo sát sự kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và các chủng Staphylococcus spp. tại bệnh viện Nhân dân Gia Định, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Đại học Sƣ phạm TP.HCM. 14. ROVETCO (2012) Đại cương về thuốc kháng sinh, item_id=232&lang=vn., cập nhật ngày 14/08/2013. 15. Nguyễn Thị Ngọc Lan và cộng sự (2011) Tình hình kháng kháng sinh trên những chủng vi khuẩn thường gặp phân lập trên bệnh nhân nhiễm trùng tiểu tại Viện Pasteur TP.HCM năm 2010, Khoa xét nghiệm Sinh học Lâm sàng Viện Pasteur TP.HCM, Tạp chí Y học dự phòng, Tập XXI, số 5 (123). tr.78-85. 16. Diệp Thế Tài, Đoàn Nguyễn Khánh Trình, Vũ Lê Ngọc Lan và Cs (2011) "Kháng thuốc và gen mã hóa độc tố ruột của S.aureus phân lập từ năm 2006-2010 tại TP.HCM, Việt Nam". Khoa Vi sinh Miễn dịch - Viện Pasteur TP.HCM. 17. Nguyễn Thị Mỹ Thanh Chuẩn đoán vi sinh học bệnh nhiễm trùng, Thành phố Hồ Chí Minh. 18. Nguyễn Thanh Tùng (2013) Sự kháng thuốc của vi khuẩn đối với kháng sinh nhóm β-lactam UV-Viet Nam, cập nhật ngày 14/08/2013. 19. Nguyễn Sử Minh Tuyết, Vũ Thị Châu Hải, Trƣơng Anh Dũng, Lê Thị Tuyết Nga (2009) Khảo sát vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện nhân dân Gia Định. 39
  51. Đồ án tốt nghiệp 20. Viện Vệ sinh Dịch tể Trung Ƣơng (2013) Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán, huat-khoanh-giay-khang-sinh-khuech-tan.vhtm, cập nhật ngày 12/08/2013. 21. Phạm Hùng Vân (2000) Cẩm nang các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng dùng cho các phòng thí nghiệm tại bệnh viện, Đại Học Y Dƣợc TP.HCM. 22. Phạm Hùng Vân (2005) Tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus. Kết quả nghiên cứu đa trung tâm thực hiện trên 235 chủng vi khuẩn, Trƣờng Đại học Y dƣợc, Thành phố Hồ Chí Minh. 23. Nguyễn Văn Vinh (2011) Tìm hiểu tính kháng kháng sinh của staphylococcus aureus phân lập trên bệnh nhân tại Viện Pasteur Nha Trang năm 2011 Cập nhật ngày 17/08/2013. 24. Wikipedia (8/2013) Tụ cầu khuẩn, BA%A9n, cập nhật ngày 06/08/2013. Tài liệu tiếng Anh 25. Berger-Bachi (1999) "Genetic basis of methicillin resistant in Staphylococcus aureus". Cellular and Moclecular Life Sciences CMLS, Volume 56 26. CDC (1997) "Update: Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin - United States, 1997. MMWR 1997; 46: 813-814". 27. Gever J.Senior Editor (2011) "Germicidal Surgical Mask Approved". Senior Editor Published, April 09, 2011. 28. Association for Professionals in Infection Control and Epidemilogy (June 25, 2007) "National Prevalence Study of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in U.S". Healthcare Facilities, Archived from the original on September 7, 2007, Retrieved 2007-07-14, Volume 35 (10). 29. M. C. Faires, D. L. Pearl, O. Berke, R. J. Reid-Smith, J. S. Weese (2013) "The identification and epidemiology of meticillin-resistant Staphylococcus 40
  52. Đồ án tốt nghiệp aureus and Clostridium difficile in patient rooms and the ward environment". BMC Infect Dis, 13, 342. 30. First study finds MRSA in U.S. pigs and farmers (2008) seattlepi.com, 4 June 2008. 31. MRSA Infections (2013) "Keep Kids Healthy". 32. Jernigan JA, Arnol K, Heilpern K, Kainer M, Woods C, Hughes JM (2006) "Methicillin-resistant Staphylococcus aureus as community pathogen, Symposium on Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus". Centers for Disease Control and Prevention, Retrieved 2007-01-07. 33. Jawetz, Welnick, Adelberg’s (2007) "Medical microbiology 24th edition 2007". Tr.161-196. 34. F.D. Lowy (2003) "Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus". The Journal of Clinical Investigation. 35. M. Monaco, A. Pantosti, A. Sanchini (2007) "Mechanism of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus". Future Microbiology, Vol.2 (3). 36. CA. Muto, JA. Jernigan, BE. Ostrowsky, HM. Richet, WR. Jarvis, JM. Boyce, BM Farr (May 2003) "SHEA guideline for preveting nosocomial transmission of multidrug-resistant strains of Staphylococcus aureus and Enterococcus". Infect Control Hosp Epidemiol. 37. Fritz SA, Garbutt J, Elward A et al (2008) "Prevalence of and risk factors for community-acquired methicillin-resistant and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus colonization in children seen in a pratice-based research network". Pediatrics. 41
  53. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Bảng 1 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn S.aures tại tỉnh An Giang KẾT QUẢ KẾT QUẢ STT MÃ MẪU NUÔI CẤY PCR 1 GS17.01NSH.AG - - 2 GS17.02NSH.AG - - 3 GS17.03NSH.AG - - 4 GS17.04NSH.AG - - S5 GS17.05NSH.AG - - 6 GS17.06NSH.AG - 7 GS17.01NSO.AG - - 8 GS17.02NSO.AG - - 9 GS17.03NSO.AG - - 10 GS17.04NSO.AG - - 11 GS17.05NSO.AG - - 12 GS17.06NSO.AG - - 13 GS17.01TP.AG - - 14 GS17.02TP.AG - - 15 GS17.03TP.AG - - 16 GS17.04TP.AG - - 17 GS17.05TP.AG - - 18 GS17.06TP.AG - - 19 GS17.01P.AG - - 1
  54. Đồ án tốt nghiệp 20 GS17.02P.AG - - 21 GS17.03P.AG - - 22 GS17.04P.AG - - 23 GS17.05P.AG - - 24 GS17.06P.AG - - 25 GS17.07P.AG - - 26 GS17.08P.AG - - 27 GS17.09P.AG - - 28 GS17.10P.AG - - 29 GS17.11P.AG - - 30 GS17.07NSH.AG - - 31 GS17.08NSH.AG - - 32 GS17.07NSO.AG - - 33 GS17.08NSO.AG - - 34 GS17.07ND.AG - - 35 GS17.08ND.AG 36 GS17.07TP.AG - - 37 GS17.08TP.AG - - 38 GS17.9NSH.AG - - 39 GS17.10NSH.AG - - 40 GS17.9NSO.AG - - 41 GS17.10NSO.AG - - 42 GS17.9TP.AG - - 2
  55. Đồ án tốt nghiệp 43 GS17.10TP.AG - - 44 GS17.9ND.AG + + 45 GS17.10ND.AG + + 46 GS17.12P.AG - - 47 GS17.13P.AG - - 48 GS17.14P.AG - - 49 GS17.15P.AG - - 50 GS17.16P.AG - - 51 GS17.17P.AG - - 52 GS17.18P.AG + + 53 GS17.19P.AG - - 54 GS17.20P.AG - - 55 GS17.21P.AG - - 56 GS17.22P.AG - - 57 GS17.23P.AG - - 58 GS17.24P.AG - - 59 GS17.25P.AG - - Chú thích: +: dƣơng tính, -: âm tính Bảng 2 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn S.aures tại tỉnh Bình Phƣớc KẾT QUẢ KẾT QUẢ STT MÃ MẪU NUÔI CẤY PCR 1 GS17.01NSH.BP - - 2 GS17.02NSH.BP + + 3
  56. Đồ án tốt nghiệp 3 GS17.03NSH.BP - - 4 GS17.04NSH.BP - - 5 GS17.05NSH.BP - - 6 GS17.06NSH.BP - - 7 GS17.01NSO.BP - - 8 GS17.02NSO.BP - - 9 GS17.03NSO.BP - - 10 GS17.04NSO.BP - - 11 GS17.05NSO.BP - - 12 GS17.06NSO.BP - - 13 GS17.01TP.BP - - 14 GS17.02TP.BP - - 15 GS17.03TP.BP - - 16 GS17.04TP.BP - - 17 GS17.05TP.BP - - 18 GS17.06TP.BP - - 19 GS17.01P.BP - - 20 GS17.02P.BP - - 21 GS17.03P.BP + + 22 GS17.04P.BP - - 23 GS17.05P.BP - - 24 GS17.06P.BP - - 4
  57. Đồ án tốt nghiệp 25 GS17.07P.BP - - 26 GS17.08P.BP - - 27 GS17.09P.BP - - 28 GS17.10P.BP - - 29 GS17.11P.BP - - 30 GS17.12P.BP - - 31 GS17.13P.BP - - 32 GS17.14P.BP - - 33 GS17.15P.BP - - 34 GS17.7NÐ.BP - - 35 GS17.8NÐ.BP - - 36 GS17.9NÐ.BP - - 37 GS17.10NÐ.BP - - 38 GS17.9NSH.BP - - 39 GS17.10NSH.BP - - 40 GS17.9NSO.BP - - 41 GS17.10NSO.BP - - 42 GS17.9TP.BP - - 43 GS17.10TP.BP - - 44 GS17.16P.BP - - 45 GS17.17P.BP - - 46 GS17.18P.BP - - 47 GS17.19P.BP - - 5
  58. Đồ án tốt nghiệp 48 GS17.20P.BP - - 49 GS17.21P.BP - - 50 GS17.22P.BP - - 51 GS17.23P.BP - - 52 GS17.07NSO.BP - - 53 GS17.08NSO.BP - - 54 GS17.07NSH.BP - - 55 GS17.08NSH.BP - - 56 GS17.07TP.BP - - 57 GS17.08TP.BP - - 58 GS17.01ND.BP - - 59 GS17.02ND.BP + + 60 GS17.03ND.BP - - 61 GS17.04ND.BP - - 62 GS17.05ND.BP - - 63 GS17.06ND.BP - - 64 GS17.07ND.BP - - 65 GS17.08ND.BP - - Chú thích: +: dƣơng tính, -: âm tính Bảng 3 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn S.aures tại tỉnh Bến Tre KẾT QUẢ STT MÃ MẪU KẾT QUẢ PCR NUÔI CẤY 1 GS17.01P.BT - - 6
  59. Đồ án tốt nghiệp 2 GS17.02P.BT - - 3 GS17.03P.BT + + 4 GS17.04P.BT - - 5 GS17.05P.BT - - 6 GS17.07P.BT - - 7 GS17.08P.BT - - 8 GS17.25P.BT - - 9 GS17.26P.BT - - 10 GS17.27P.BT - - 11 GS17.01NSH.BT - - 12 GS17.02NSH.BT - - 13 GS17.01NSO.BT - - 14 GS17.02NSO.BT - - 15 GS17.01ND.BT - - 16 GS17.02ND.BT - - 17 GS17.01TP.BT - - 18 GS17.02TP.BT - - 19 GS17.06P.BT - - 20 GS17.03ND.BT - - 21 GS17.04ND.BT - - 22 GS17.03NSO.BT - - 23 GS17.04NSO.BT - - 24 GS17.03NSH.BT - - 7
  60. Đồ án tốt nghiệp 25 GS17.04NSH.BT - - 26 GS17.03TP.BT - - 27 GS17.04TP.BT - - 28 GS17.09P.BT - - 29 GS17.10P.BT - - 30 GS17.28P.BT - - 31 GS17.29P.BT - - 32 GS17.05ND.BT - - 33 GS17.06ND.BT - - 34 GS17.05NSO.BT - - 35 GS17.06NSO.BT - - 36 GS17.05NSH.BT - - 37 GS17.06NSH.BT - - 38 GS17.05TP.BT + + 39 GS17.06TP.BT - - 40 GS17.11P.BT - - 41 GS17.12P.BT - - 42 GS17.13P.BT - - 43 GS17.14P.BT - - 44 GS17.15P.BT - - 45 GS17.16P.BT + + 46 GS17.17P.BT - - 47 GS17.30P.BT - - 8
  61. Đồ án tốt nghiệp 48 GS17.31P.BT - - 49 GS17.32P.BT - - 50 GS17.33P.BT - - 51 GS17.34P.BT - - 52 GS17.35P.BT - - 53 GS17.36P.BT - - 54 GS17.18P.BT + + 55 GS17.19P.BT - - 56 GS17.37P.BT - - 57 GS17.38P.BT - - 58 GS17.39P.BT - - 59 GS17.40P.BT - - 60 GS17.7NSH.BT - - 61 GS17.8NSH.BT - - 62 GS17.7ND.BT - - 63 GS17.8ND.BT - - 64 GS17.7NSO.BT - - 65 GS17.8NSO.BT - - 66 GS17.7TP.BT - - 67 GS17.8TP.BT - - 68 GS17.9NSO.BT - - 69 GS17.10NSO.BT - - 70 GS17.9NSH.BT - - 9
  62. Đồ án tốt nghiệp 71 GS17.10NSH.BT - - 72 GS17.9ND.BT - - 73 GS17.10ND.BT - - 74 GS17.9TP.BT - - 75 GS17.10TP.BT - - Chú thích: +: dƣơng tính, -: âm tính Bảng 4 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn S.aures tại tỉnh Sóc Trăng KẾT QUẢ STT MÃ MẪU KẾT QUẢ PCR NUÔI CẤY 1 GS17.01P.ST - - 2 GS17.02P.ST - - 3 GS17.03P.ST - - 4 GS17.05P.ST - - 5 GS17.06P.ST - - 6 GS17.07P.ST - - 7 GS17.08P.ST - - 8 GS17.09P.ST - - 9 GS17.10P.ST - - 10 GS17.11P.ST - - 11 GS17.12P.ST - - 12 GS17.13P.ST - - 13 GS17.14P.ST - - 14 GS17.01NSO.ST - - 15 GS17.02NSO.ST - - 10
  63. Đồ án tốt nghiệp 16 GS17.03NSO.ST - - 17 GS17.01NSH.ST - - 18 GS17.02NSH.ST - - 19 GS17.03NSH.ST - - 20 GS17.01ND.ST - - 21 GS17.02ND.ST - - 22 GS17.03ND.ST - - 23 GS17.01TP.ST - - 24 GS17.02TP.ST - - 25 GS17.15P.ST - - 26 GS17.16P.ST - - 27 GS17.04NSH.ST - - 28 GS17.05NSH.ST + + 29 GS17.06NSH.ST - - 30 GS17.04NSO.ST - - 31 GS17.05NSO.ST - - 32 GS17.06NSO.ST - - 33 GS17.04ND.ST + + 34 GS17.05ND.ST - - 35 GS17.06ND.ST - - 36 GS17.04TP.ST - - 37 GS17.05TP.ST - - 38 GS17.06TP.ST - - 11
  64. Đồ án tốt nghiệp 39 GS17.03TP.ST - - 40 GS17.17P.ST - - 41 GS17.18P.ST - - 42 GS17.19P.ST - - 43 GS17.07NSH.ST - - 44 GS17.08NSH.ST - - 45 GS17.09NSH.ST - - 46 GS17.07NSO.ST - - 47 GS17.08NSO.ST - - 48 GS17.09NSO.ST - - 49 GS17.07ND.ST - - 50 GS17.08ND.ST - - 51 GS17.09ND.ST - - 52 GS17.07TP.ST - - 53 GS17.08TP.ST - - 54 GS17.09TP.ST - - 55 GS17.23P.ST - - 56 GS17.24P.ST - - 57 GS17.25P.ST - - 58 GS17.26P.ST - - 59 GS17.27P.ST - - 60 GS17.28P.ST - - 61 GS17.29P.ST - - 12
  65. Đồ án tốt nghiệp 62 GS17.30P.ST - - 63 GS17.31P.ST - - 64 GS17.32P.ST - - 65 GS17.33P.ST - - 66 GS17.10NSH.ST + + 67 GS17.11NSH.ST + + 68 GS17.12NSH.ST + + 69 GS17.10NSO.ST - - 70 GS17.11NSO.ST - - 71 GS17.12NSO.ST - - 72 GS17.10ND.ST - - 73 GS17.11ND.ST - - 74 GS17.12ND.ST + + 75 GS17.10TP.ST - - 76 GS17.11TP.ST - - 77 GS17.12TP.ST - - 13