›

Đồ án Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum

pdf 77 trang thiennha21 12/04/2022 4030
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_so_bo_thanh_phan_hoa_hoc_va_danh_gia_mot_so_h.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TƠ NẤM LINH CHI ĐEN AMAURODERMA SUBRESINOSUM Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG Sinh viên thực hiện : TRẦN LÊ VIỆT HÀ MSSV: 1151110113 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TƠ NẤM LINH CHI ĐEN AMAURODERMA SUBRESINOSUM Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG Sinh viên thực hiện : TRẦN LÊ VIỆT HÀ MSSV: 1151110113 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện dựa trên cơ sở thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh. Các số liệu, kết quả trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố ở bất kỳ công trình nào khác. TP. HCM, ngày 20 tháng 8, năm 2015 Trần Lê Việt Hà
  4. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được cuốn đồ án một cách tốt đẹp, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ quý thầy cô, gia đình cũng như bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn và lời chúc sức khỏe đến ban lãnh đạo trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã truyền đạt cho em những kiến thức về chuyên ngành trong suốt quá trình học tập tại trường, giúp cho em nắm vững lý thuyết cũng như thực hành. Em xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Hoàng Dũng đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án cũng như lúc viết bài báo cáo, để hôm nay em có thể hoàn thành bài báo cáo tốt nhất của mình. Và em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn cùng làm việc tại phòng Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành công việc một cách tốt nhất. Con vô cùng cảm ơn ba mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên con trong suốt quá trình học tập. Cám ơn bạn bè, tập thể lớp 11DSH04 đã hỗ trợ, chia sẻ việc học tập trong thời gian 4 năm Đại học.
  5. MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 1 3. Mục đích nghiên cứu 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Các kết quả đạt được của đề tài 3 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp 4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Nấm linh chi 5 1.1.1 Khái quát chung 5 1.1.2 Đặc điểm sinh học 6 1.1.3 Điều kiện sống của nấm linh chi 8 1.1.4 Sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi 8 1.1.5 Tác dụng trị liệu của nấm Linh chi 13 1.2 Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 16 1.2.1 Vị trí phân loại 16 1.2.2 Đặc điểm hình thái 17 1.2.3 Các nghiên cứu về nấm Linh chi đen 19 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20 i
  6. 2.2 Đối tượng nghiên cứu 20 2.3 Vật liệu nghiên cứu 20 2.3.1 Thiết bị 20 2.3.2 Hóa chất 20 2.3.3 Môi trường sử dụng 21 2.4 Phương phápnghiên cứu 21 2.4.1 Theo dõi sự tăng sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng. 21 2.4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi đen A. subresinosum 21 2.4.3 Khảo sát hoạt tính của tơ nấm linh chi khi chiết với các phân đoạn dung môi khác nhau. 25 2.4.4 Xác định thành phần có trong các phân đoạn dịch chiết thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 29 2.5 Phương pháp ửx lý số liệu 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN 31 3.1 Thu nhận sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng 31 3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi A. subresinosum 33 3.2.1 Định tính anthraglycosid 33 3.2.2 Định tính flavonoid 33 3.2.3 Định tính acid béo 34 3.2.4 Định tính alkaloid 35 3.2.5 Định tính tinh dầu 36 3.2.6 Định tính carotenoid 36 3.2.7 Định tính phytosterol 36 3.2.8 Định tính steroid 37 3.2.9 Định tính tanin 38 3.2.10 Định tính đường khử 38 3.2.11 Định tính antocyanosid 39 3.2.12 Định tính saponin 40 ii
  7. 3.2.13 Định tính acid uronic 41 3.2.14 Định tính acid hữu cơ 41 3.3 Khảo sát hoạt tính cao chiết Methanol tổng của tơ nấm Linh chi đen 44 3.3.1 Khả năng kháng khuẩn của tơ nấm linh chi trong cao Methanol 44 3.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Methanol tổng 45 3.4 Khảo sát hoạt tính các phân ạđo n cao của tơ nấm Linh chi A.subresinosum 47 3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm linh chi 47 3.4.2 Khả năng kháng oxy hóa của các loại cao chiết 49 3.5 Kết quả phân tích thành phần có trong cao chiết tơ nấm A. subresinosum bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 55 Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC iii
  8. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DMSO : Dimethylsunfoxide DPPH : 2,2 diphenyl-1-pycryl-hydrazyl HPLC : High-performance liquid chromatography IC50 : The half maximal Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế 50%) LB : Luria Bertani MeOH : Methanol OD : Optical Density PDA : Potato Dextrose Agar PD-broth : Potato Dextrose Broth UV : Ultra Violet iv
  9. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi 8 Bảng 1.2 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi 10 Bảng 1.3 Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590) 13 Bảng 3.1 Khả năng tích lũy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng của nấm linh chi đen. 31 Bảng 3.2 Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết 42 Bảng 3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong các loại tơ nấm Linh chi 43 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao MeOH thu được trên 44 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao MeOH thu được 46 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn cao thu được trên đĩa thạch 47 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Hexane thu được 50 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Chloroform thu được 51 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Ethyl acetate thu được 52 Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Nước thu được 53 v
  10. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu tạo nấm Linh chi 7 Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi 7 Hình 1.3 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum. (Corner, 1993) 17 Hình 1.4 Quả thể của A.subresinosum 19 Hình 2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết tơ nấm để phân tích thành phần hóa hoc 22 Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao chiết chứa hoạt chất từ tơ nấm Linh chi đen 26 Hình 2.3 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 28 Hình 2.4 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Hexane và Chloroform. 30 Hình 2.5 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Ethyl acetate và Nước. 30 Hình 3.1 Khả năng tích lũy sinh khối của sợi nấm Amauroderma subresinosum trong môi trường lỏng 32 Hình 3.2 Định tính anthraglycosid 33 Hình 3.3 Định tính flavonoid 33 Hình 3.4 Định tính acid béo 34 Hình 3.5 Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer 35 Hình 3.6 Định tính alkaloid với thuốc thử Bouchardat 35 Hình 3.7 Định tính carotenoid 36 Hình 3.8 Định tính phytosterol 36 Hình 3.9 Định tính steroid 37 Hình 3.10 Định tính tanin 38 Hình 3.11 Định tính đường khử trước khi đun 38 Hình 3.12 Định tính đường khử sau khi đun 39 Hình 3.13 Định tính antocyanosid 39 Hình 3.14 Định tính saponin 40 Hình 3.15 Định tính acid uronic 41 Hình 3.16 Định tính acid hữu cơ 41 Hình 3.17 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao MeOH 45 Hình 3.18 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao MeOH thu được. 46 vi
  11. Hình 3.19 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Hexane 48 Hình 3.20 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Chloroform 48 Hình 3.21 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Ethyl acetate 49 Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Hexane thu được. 50 Hình 3.23 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Chloroform thu được. 51 Hình 3.24 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Ethyl acetate thu được. 52 Hình 3.25 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao nước thu được. 53 Hình 3.26 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết 54 Hình 3.27 Sắc ký đồ của dung dịch cao Hexane đo ở bước sóng 254 nm 55 Hình 3.28 Sắc ký đồ của dung dịch cao Chloroform đo ở bước sóng 254 nm 56 Hình 3.29 Sắc ký đồ của dung dịch cao Ethyl acetate đo ở bước sóng 254 nm 57 Hình 3.30 Sắc ký đồ của dung dịch cao Nước đo ở bước sóng 254 nm 58 vii
  12. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc. Các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhân Linh chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Sách “Thần nông bản thảo” đã nói: “Linh chi là thuốc kết tinh được cái quý của mây mưa trên núi cao, cái tinh của ngũ hành trong ngày đêm mà khoe năm sắc nên có thể giữ sức khỏe cho các bậc đế vương”. Đến đời Minh (năm 1590) trong sách “Bản thảo cương mục”, tác giả Lý Thời Trân đã phân nấm Linh chi thành “Lục bảo Linh chi” theo sáu màu sắc xanh, trắng, đỏ, vàng, đen, tím và khái quát tác dụng trị liệu của Linh chi theo từng màu. Nhưng nói chung các loại Linh chi đều có tính bình, không độc, có tác dụng chữa trị tốt đối với những bệnh về tim mạch, phổi, gan Đến nay với sự phát triển Khoa học – kỹ thuật, nấm Linh chi còn được chứng minh tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi Chính vì thế, việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng nấm Linh chi vẫn đang được chú trọng. Việc nuôi trồng cũng như thu hoạch quả thể nấm Linh chi tốn khá nhiều thời gian. Amauroderma subresinosum là một loại nấm Linh chi đen thường thấy ở các rừng quốc gia Việt Nam. Đây là một loại nấm hiếm trong họ Ganodermataceae, hoạt tính của A. subresinosum hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu thấu đáo. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum” để nâng cao hiệu quả sản xuất hoạt tính cần thiết của nấm Linh chi mà không cần chờ thời gian ra quả thể, đáp ứng nhanh nhu cầu sử dụng của con người. 2. Tình hình nghiên cứu ❖ Ngoài nước Trên thế giới, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm Linh chi cũng như những ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau. 1
  13. Trong một nghiên cứu của Mekkaway, Min và cộng sự (1998) cho biết Ganoderiol F, ganodermanontriol, acid ganoderic beta, ganodermanondiol, ganoderma nontriol, acid ganolucidic A, gucidumol B có trong dịch chiết nước của Linh chi có tác dụng chống HIV và còn nhiều ứng dụng có lợi khác của nấm Linh chi. Năm 2014, Huey Jen Lin và cộng sự, nghiên cứu một loại protein điều hòa miễn dịch từ nấm Linh Chi Ganoderma lucidum có khả năng chữa lành nhanh vết thương sau khi phẫu thuật điện ở mô gan chuột. ❖ Trong nước Những năm gần đây, tại Việt Nam, trên thị trường thuốc y học cổ truyền dân tộc cả nước, đặc biệt tại TP.HCM, xuất hiện nhiều loại thuốc mới mang tên Linh chi với giá bán rất đắt (mắc hơn nhân sâm). Hiện nay, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh trong nước và xuất khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành chế biến nuôi trồng, nghiên cứu thăm dò những dược chất có trong nấm Linh chi. Một số công trình nghiên cứu khoa học đã công bố như: “Bước đầu nghiên cứu tác dụng nấm linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ số lipid máu ở chuột cống” [15],“Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) trên chuột gây suy gan thực nghiệm” (Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) đối với cấu trúc mô tinh hoàn chuột nhắt trắng dòng SWISS khi bị chiếu xạ liều cao” (Đoàn Suy Nghĩ) [4], “Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan – Việt Nam” (Nguyễn Minh Khang) [13]. 3. Mục đích nghiên cứu Nuôi cấy thu nhận sinh khối hệ sợi nấm linh chi đen Amauroderma subresinosum và khảo sát một số hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm cũng như các phân đoạn cao chiết. 2
  14. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Thu nhận sinh khối của tơ nấm Linh chi Amauroderma subresinosum. - Định tính sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi A.subresinosum. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn và khả năng bắt các gốc tự do có trong tơ nấm Linh chi A.subresinosum. 5. Phương pháp nghiên cứu - Tăng sinh tơ nấm Linh chi trong môi trường lỏng để thu nhận sinh khối. - Thu dịch chiết tơ nấm để khảo sát sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi. - Dùng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch để khảo sát khả năng kháng khuẩn của tơ nấm với các phân đoạn dung môi khác nhau. - Dùng phương pháp thử nghiệm DPPH để khảo sát khả năng chống oxy hóa của tơ nấm Linh chi A.subresinosum. - Ghi chép và xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, Statgraphics centurion. 6. Các kết quả đạt được của đề tài - Thời gian nuôi cấy thích hợp để thu nhận sinh khối tơ nấm linh chi là 18 ngày trong điều kiện nhiệt độ 30oC và đặt nơi tránh ánh sáng. - Trong thành phần tơ nấm linh chi, được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 30oC thì có các hoạt chất: antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol, tanin, đường khử, saponin, acid uronic, acid hữu cơ, - Trong các phân đoạn chiết của tơ nấm, cao Methanol được đánh giá có khả năng kháng khuẩn tốt nhất với các loại vi khuẩn S.aureus, B.subtilis, E.coli, P.aeruginosa ở nồng độ 20 mg/ml cũng như khả năng bắt gốc tự do IC50 là 1,094 mg/ml. - Các phân đoạn cao chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước của tơ nấm có khả năng kháng khuẩn yếu hơn cao tổng Methanol, khả năng kháng oxy hóa 3
  15. của cao Chloroform và cao Ethyl acetate thì tốt hơn cao tổng, cao Hexane thì tương đương, còn cao nước thì khả năng kháng oxy hóa yếu nhất. - Phân tích các phân đoạn chiết, thu được trong cao Hexane có 3 hợp chất, cao Chloroform có 1 chất, cao Ethyl acetate có 2 chất và cao nước thì chưa xác định được. 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp Đồ án gồm có 4 chương: • Chương 1: Tổng quan tài liệu • Chương 2: Vật liệu và phương pháp • Chương 3: Kết quả và thảo luận • Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
  16. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm linh chi 1.1.1 Khái quát chung Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganodermataceae, người miền Bắc xưa còn gọi là nấm lim. Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung [8]. Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ. Hình thái quả thể nấm Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt hoặc thận. Mặt trên mũ có vân đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ đậm hoặc nâu đen. Mặt dưới phẳng, có nhiều lỗ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử. Cuống nấm đặc và cứng, sậm màu và bóng loáng [12]. Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm. Trong sách “Thần nông bản thảo“ cách đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi” thời nhà Minh với các khái quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590). Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau: ▪ Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi) ▪ Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi) ▪ Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi) ▪ Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi) ▪ Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi) ▪ Tử chi (Linh chi tím) Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại, trong đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm Chúng đã được sử dụng là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, 5
  17. đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm lượng rất thấp [17]. Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan , việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời nghiên cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng. Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác (1720- 1791) cũng thấy đề cập đến Linh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” [2], giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dược. 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganodermataceae) Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài [6]. Quả thể nấm Linh chi gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối diện với mũ nấm). Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3 cm. Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm. Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt. Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng như láng vecni. Mũ nấm có đường kính 2 – 15 cm, dày 0,8 – 1,2 cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm. Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm. 6
  18. Hình 1.1 Cấu tạo nấm Linh chi 1.1.2.2 Chu trình sống của nấm Linh chi Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm. Bào tử nấm thường có dạng hình trứng cụt đầu màu rỉ sắt. Cấu tạo vỏ ngoài bào tử gồm hai lớp, có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Lớp ngoài nhẵn, lớp trong có nhiều gai nhỏ, nối liền hai lớp vỏ. Bào tử nấm Linh chi có kích thước trung bình 4,5 – 6,5 x 8,5 – 11,5 µm. Khi nuôi cấy tơ nấm lúc đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, sợi nấm ngăn thành nhiều phần và hình thành các bào tử vô tính. Chu kỳ sống của nấm Linh chi giống như hầu hết các loại nấm khác, nghĩa là cũng bắt đầu từ các bào tử, bào tử nảy mầm phát triển thành hệ mạng sợi tơ nấm. Gặp điều kiện thuận lợi sợi nấm sẽ kết thành nụ nấm, nụ phát triển thành chồi, rồi tán và thành tai trưởng thành. Trên tai nấm sinh ra các bào tử, bào tử phóng thích ra ngoài và chu trình lại tiếp tục. [1] Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi 7
  19. 1.1.3 Điều kiện sống của nấm linh chi Linh chi phân bố khắp nơi trên thế giới, ký sinh và hoại sinh rộng khắp ở các loài cây lá rộng đến lá kim, thậm chí ở các tre trúc, dừa, cau, cọ dừa và nho. Nấm Linh chi tiết ra các men phân giải màng tế bào endopolygalacturonase (endo – PG) và endopectin methyl – translinase (endo – PMTE) có tác dụng làm nhũn tế bào thực vật rất mạnh gây nên tình trạng các loại gỗ và rễ cây bị mùn ra [9]. Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi [1] Yếu tố Nuôi tơ Ra quả thể Nhiệt độ 20 – 35oC 25 – 30oC Ẩm độ 55 – 60% 90 – 95% pH 4,5 – 6 4,5 – 6 Ánh sáng Không cần Cần ánh sáng tán xạ từ mọi phía 1.1.4 Sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi Nấm Linh chi có lịch sử lâu đời trong nền y học cổ truyền các nước phương Đông. Nhiều thành phần có hoạt tính sinh học đã được xác định trong quả thể, tơ nấm, bào tử và trong cả môi trường nuôi cấy. Polysaccharide và triterpenes là hai hoạt chất sinh học chính trong số đó. Polysaccharide từ Ganoderma lucidum được tìm thấy trước tiên trong phòng thí nghiệm có tác dụng chống lại ung thư theo con đường điều biến miễn dịch. hoạt chất sinh học chống lại sự oxy hóa, cân bằng lượng cholesterol, chống tăng huyết áp, bảo vệ gan, tổng hợp cholesterol [25] Nghiên cứu mới nhất của Viện Nghiên cứu Linh chi hoang dại của Trung Quốc cho thấy, Linh chi có lượng germanium (một chất giúp khí huyết lưu thông, thúc đẩy sự hấp thụ ôxy của tế bào) cao hơn nhân sâm 8 lần. Lượng polysaccaride cao trong Linh chi giúp tăng cường miễn dịch, làm mạnh gan, cô lập và diệt các tế bào ung thư. Các hoạt chất của Linh chi còn có tác dụng chống dị ứng, chống viêm, chữa trị các 8
  20. bệnh liên quan đến tim và huyết áp, làm mạnh thận, bổ phổi, mạnh gân xương, tăng trí nhớ, chống lão hóa [6] 1.1.4.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs) Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi. Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng. Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị. Một trong 4 loại polysaccharide có đặc tính chống khối u mạnh nhất là beta – D glucan, trọng lượng phân tử 3,12 * 105 hoặc 1,56 * 106, có tác dụng chống ung thu và tăng tính miễn dịch cho cơ thể. [24, 25] Vai trò dược học của polysaccharide: ▪ Kích thích hệ miễn dịch cơ thể ▪ Gia tăng khả năng dung nạp oxygen ▪ Giảm gốc tự do hydroxyl ▪ Ức chế khối u phát triển ▪ Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ ▪ Tăng chức năng gan ▪ Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường ▪ Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein 1.1.4.2 Ganoderic Acid Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganoderma. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng G.acid cao thì có nhiều vị đắng. 9
  21. Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexane, eter ethyl, chloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [14, 16]. Bảng 1.2 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi [8] Hoạt chất Hoạt tính Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp Ganodermaldiol Hạ huyết áp Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy rằng Ganoderic acid còn có tác dụng: ▪ Giảm đau ▪ Bảo vệ gan ▪ Chống khối u 1.1.4.3 Ganoderma Adenosine Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh. Chức năng của adenosine: ▪ Giảm độ nhớt máu ▪ Ức chế kết dính tiểu cầu ▪ Ngăn chặn hình thành cục nghẽn 10
  22. ▪ Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin ▪ Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lưu lượng máu cung cấp cho não ▪ Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể 1.1.4.4 Alkaloid ❖ Định nghĩa Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Tuy nhiên cũng có một số alkaloid không có nhân dị vòng với nitơ và một số alkaloid không có phản ứng kiềm. Một số alcacoid còn có thể có phản ứng acid yếu do có nhóm chức acid trong phân tử. [16] ❖ Tính chất Đa số alkaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn. Một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài akcaloid ở dạng lỏng và có màu. Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt nguyên tử nitơ. Tính base của các alkaloid khác nhau tùy theo nhóm thế (R-) gắn trên nguyên tử nitơ. Các alkaloid tính base yếu thì phải cần môi trường acid mạnh để tạo thành muối, tan trong nước. Các alkaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan trong dung môi hữu cơ: chloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: chloroform, eter, benzen. Chính vì thế, tính hòa tan của các alkaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích alkaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống [14]. ❖ Công dụng Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược và nhiều chất rất độc. Các alkaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alkaloid. ▪ Tác dụng lên hệ thần kinh ▪ Tác dụng lên huyết áp 11
  23. ▪ Tác dụng trị ung thư 1.1.4.5 Hợp chất Saponin ❖ Khái niệm chung về Saponin Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi là aglycon. Saponin có tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu. Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao từ 200oC trở lên và có thể trên 300oC. Saponin bị tủa bởi chì acetate, hidroxid barium, sulfat amonium nên lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. - Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm: o Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan. Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean. o Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan. - Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan. ❖ Công dụng [6] ▪ Trị long đờm, chữa ho ▪ Là chất phụ gia trong một số vắc xin ▪ Tác dụng thông tiểu ▪ Tác dụng kháng viêm, chống khối u 1.1.4.6 Germanium hữu cơ Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm 1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của 12
  24. oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa. Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển [21]. Chức năng của Germanium: ▪ Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư ▪ Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ ▪ Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ 1.1.5 Tác dụng trị liệu của nấm Linh chi Ở các nước Đông Nam Á, (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan ) việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng dược lý và phương cách điều trị lâm sàng. Giá trị dược lý của Linh chi càng được khẳng định khi Hội nghị Nấm học thế giới thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế tại New York. Bảng 1.3 Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590) Tên gọi Màu sắc Đặc tính dược lý Thanh chi (long Chi) Xanh Vị chua, tính bình, không độc chữa trị sáng mắt, bổ gan khí, an thần, tăng trí nhớ. Hồng chi (xích chi) Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng tim, bổ trung, trị tức ngực. Hoàng chi (kim chi) Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần, ích tì khí 13
  25. Bạch chi (ngọc chi) Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi, an thần, chữa ho nghịch. Hắc chi (huyền chi) Đen Vị ngọt, tính bình, không độc, trị bí tiểu, ích thận khí. Tứ chi Tím Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức xương khớp, gân cốt. Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng cụ thể của nấm Linh chi được tập hợp vào những mặt tác dụng lớn như sau: [3, 9, 10] ✓ Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn). ✓ Bảo can (bảo vệ gan). ✓ Cường tâm (thêm sức cho tim). ✓ Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hóa). ✓ Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp). ✓ Giải độc (giải toả trạng thái nhiễm độc). ✓ Giải cảm (giải toả trạng thái bị cảm). ✓ Trường sinh (sống lâu, tăng tuổi thọ). Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh: Đối với bệnh về hệ tim mạch: nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp. Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng nhiều thì huyết áp ổn định. Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh dưỡng [6, 8]. Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch dùng nấm Linh chi có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỉ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim. 14
  26. Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn [9]. Khả năng miễn dịch: nấm Linh chi có chứa một lượng lớn Germanium hữu cơ, Polysaccharides và Triterpenes. Những thành phần này đã được chứng minh là tốt hơn cho hệ miễn dịch và cải thiện hệ miễn dịch của chúng ta [10]. Chữa bệnh gan: ở Trung Quốc, Linh chi thường được kê vào đơn thuốc cho những bệnh nhân bị viêm gan mãn tính. Trong điều trị lâu dài từ 2 – 15 tuần thì tỉ lệ chữa hiệu quả là từ 70,7 – 98 %. Ở Nhật, phần chiết nấm Linh chi đã được báo cáo là có hiệu quả đối với những bệnh nhân suy gan. Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm. Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn [7]. Khả năng kháng HIV: để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm kháng virus HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sự nhân lên của virus được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV – 1. Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virus này (Gau J.P, 1990; Kim, 1996). Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt. Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001). o Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1. Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV– 1. 15
  27. o Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma). o Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (- OH) ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột. [8, 25] Khả năng antioxidant: nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponin và triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985). Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi. Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh chi Việt Nam nói riêng [8]. - Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm xạ. Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơ thể [1, 6]. Để sử dụng nấm Linh chi chữa bệnh, người ta thường dùng một số cách như sau: [29] ▪ Ngâm rượu: nấm Linh chi thái mỏng, ngâm trong rượu mạnh 40o – 45oC, sau 20 ngày có thể sử dụng (ngày uống 2 lần, mỗi lần một chén con). ▪ Sắc nước uống: lấy một khối lượng Linh chi khoảng 3 – 16 gam cho 1 lần sắc (đổ 3 bát nước đun sôi cô đặc để lấy một bát, làm 3 lần như vậy). Sau đó đổ trộn lẫn với nhau để uống. ▪ Uống dạng trà: sấy nấm Linh chi, nghiền nát thành bột, mỗi lần uống 3 – 7 gam (cho vào 200 ml nước sôi) hãm lại sau 10 phút rồi uống. ▪ Bào chế ở dạng chè, thuốc viên 1.2 Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 1.2.1 Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại nấm linh chi: [27] - Giới: Mycota 16
  28. - Ngành: Basidiomycota - Lớp: Agaricomycetes - Bộ: Polyporales - Họ: Ganodermataceae - Chi: Amauroderma - Loài: Amauroderma subresinosum 1.2.2 Đặc điểm hình thái Các nhóm nấm dược quý cổ truyền ngày nay xác định là thuộc họ Ganodermataceace, bao gồm 150 – 200 loài: trong đó nổi bật là Ganoderma (trên 100 loài) và chi Amauroderma (trên 30 loài) [6]. Nấm Linh chi được xem là nấm nhiều lỗ (polypore) sống bám trên thân cây gỗ. Chúng thường sống đa niên, hoá gỗ cứng, phân tầng, có cuống hoặc không. Khi theo dõi quá trình phát sinh hình thái ở các loài Amauroderma, tán nấm hình thành, liền tán và tạo kiểu đính tâm rất tương đồng với các loài Ganoderma mọc tự do dưới đất. Cho nên có thể xem chi Amauroderma đã phát sinh trực tiếp từ Ganoderma và đây là nhánh phân hoá lớn nhất trong họ Ganodermataceae [6]. Hình 1.3 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum. (Corner, 1993) a: Hệ sợi sinh dưỡng; b: Hệ sợi cứng trong hịt nấm c: Hệ sợi bên trong thịt nấm; d: Bào tử đảm 17
  29. Bào tử kích thước khá lớn, hình elip, bề mặt bào tử gần như nhẵn dưới kính hiển vi quang học, kích thước bào tử 9 – 10 µm x 4 – 5 µm [7]. Corner dựa vào kích thước, hình dạng bào tử nấm và khẳng định chi Amauroderma thuộc họ Ganodermataceae. [23]. Nấm Linh chi là dạng thể quả. Thể quả có cuống dài hoặc ngắn, thường đính bên, đôi khi đính tâm. Cuống nấm thường hình trụ hoặc thanh mảnh (cỡ 0,3 – 0,8 cm đường kính), hoặc mập khỏe (2 – 3,5 cm đường kính), ít khi phân nhánh, dài từ 2,7 – 22 cm, đôi khi có uốn khúc cong quẹo. Lớp vỏ cuống láng đỏ – nâu đỏ – nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên bề mặt tán nấm. Quả thể nấm A. subresinosum có dạng hình quạt. Ở giai đoạn mầm nấm có dạng hình tròn, màu trắng. Sau khoảng 20 - 25 ngày, mầm nấm hình tròn chuyển sang hình quạt và lớp sắc tố nâu - đen bắt đầu hình thành xung quanh cuống nấm. Phía ngoài cùng rìa của quả thể nấm có màu trắng đục, dày và sau khoảng 30 – 40 ngày tiếp theo thì lớp rìa trắng chuyển sang màu đen - quế, lúc này quả thể đã già. Trên mặt mũ nấm có vân gợn đồng tâm và những rãnh nhỏ lồi lõm nhấp nhô không đồng nhất. Mũ nấm rộng 6 – 12 cm, dày 1 – 2 cm, đôi khi có vài mũ nhỏ phát triển từ 1 gốc chung. Mép mũ thường dày, uốn lượn cong vào có các nếp gấp và các khía răng cưa. Mặt dưới quả thể nấm là lớp bào tầng chứa rất nhiều lỗ nhỏ, màu trắng đục và dày cỡ 4 – 6 ống/mm. Chính những lỗ nhỏ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành [26]. Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có dạng thận, gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc có hình dạng khác thường. Trên mặt nấm có vân gợn đồng tâm và có chia rãnh phóng xạ, màu sắc đỏ nâu, nâu tím, nâu đen, nhẵn bóng, láng như veni, thường sẫm màu dần khi già. Kích thước tán biến động lớn từ 2 – 36 cm, dày 0,8 – 3,3 cm. Phần đính cuống gồ lên hay lõm. Phần thịt nấm màu vàng kem – nâu nhợt, phân chia theo kiểu lớp trên và lớp dưới. 18
  30. Hình 1.4 Quả thể của A.subresinosum 1.2.3 Các nghiên cứu về nấm Linh chi đen - Năm 2006, Lê Xuân Thám và công sư đã phát hiện và định danh loài Linh chi đen Amauroderma subresinosum đầu tiên của Việt Nam ở Vườn Quốc gia Cát Tiên - Năm 2010, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã nghiên cứu hoạt chất kháng tế bào ung thư từ ba loài nấm Linh chi đen, Linh chi đỏ và Linh chi vàng từ vườn Quốc gia Cát Tiên, Lâm Đồng. Kết quả tác giả đã tinh sạch được 12 hợp chất ergosterol peroxide có khả năng kháng 4 dòng tế bào ung thư biểu mô, gan, phổi và vú. - Năm 2011, Đăng Ngọc Quang và các cộng sự tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Linh chi đen Việt Nam A.subresinosum. Kết quả xác định được 14 loại acid béo thiết yếu từ nấm Linh chi đen. - Năm 2013, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa của các Polysaccharides thô chiết xuất từ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum. 19
  31. Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 4/5/2015 đến 16/8/2015, tại phòng Vi sinh thuộc Viện sinh học nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh. 2.2 Đối tượng nghiên cứu Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) được thu hái tại vùng núi Chứa Chan tỉnh Đồng Nai và giữ giống tại Viện sinh học Nhiệt đới TP.HCM. 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1 Thiết bị - Cân phân tích A&D, EK-300i - Cân kỹ thuật A&D, HR-200 - Bếp điện từ - Nồi hấp Autoclave TOMY, ES-315 - Tủ cấy vô trùng Sanyo MCV-710ATS, Japan - Tủ sấy Sanyo-MIR-162 - Máy cô quay Heidolph. - Máy đo OD, Elisa 96 giếng - Máy Votex Disruptor genie, USA - Bể điều nhiệt Cole-parmer, BT-15 - Máy HPLC Waters 2695 Separations Module - Cột HPLC Silica Chrom_Silicycle (Canada). Kích thước 4,6 × 250 mm, 5µm 2.3.2 Hóa chất - Hóa chất vô cơ: H2SO4, HCl, NH4OH, KOH, Mg, CHCl3, (CH3CO)2O, Na, FeCl3, Na2CO3, HgCl2, KI, I2, Bi(NO3)3, CuSO4, NaOH. - Hóa chất hữu cơ: methanol, hexane, chloroform, ethyl acetate, diethyl ether, CH3COOH, DMSO 10%. 20
  32. 2.3.3 Môi trường sử dụng 2.3.3.1 Môi trường nhân giống ▪ Môi trường PDA Nước cất: 1000 ml Khoai tây: 200 g D-glucose: 20 g Agar: 20 g 2.3.3.2 Môi trường tăng sinh ▪ Môi trường PD-broth Nước cất: 1000 ml Khoai tây: 200 g D-glucose: 20 g 2.4 Phương phápnghiên cứu 2.4.1 Theo dõi sự tăng sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng. Theo dõi khoảng thời gian tơ nấm Linh chi tăng trọng khi nuôi trồng trong môi trường lỏng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 3, 6, 9, 12, 15, 18 mỗi lần thu 5 chai, mẫu thu được đem đi sấy ở 55oC đến khối lượng không đổi và cân trọng lượng khô. Cách tiến hành: đổ 80 ml môi trường lỏng vào chai thủy tinh. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào. Giống lấy từ tơ nấm nuôi cấy trên môi trường agar, mỗi lần cấy cắt một miếng nhỏ (1,5 x 1,5 cm) nhẹ nhàng cho vào chai (tránh để mẫu chìm xuống nếu không tơ nấm sẽ rất khó phát triển). Chai đã cấy được ủ ở nhiệt độ 30oC và đặt ở nơi tránh ánh sáng. 2.4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi đen A. subresinosum ❖ Nguyên tắc Nguyên tắc căn bản của phương pháp này là tách các hợp chất hữu cơ thành các nhóm khác nhau dựa vào độ hòa tan khác nhau của các hợp chất này trong các dung 21
  33. môi hữu cơ có tính phân cực khác nhau, sau đó mỗi nhóm được phát hiện bằng các thuốc thử đặc trưng. ❖ Phương pháp chiết [11] Mẫu khô Dietyl eter Dịch chiết Eter Bã Ethanol Dịch chiết cồn Bã Nước 70oC/cách thủy Dịch chiết nước Bã Hình 2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết tơ nấm để phân tích thành phần hóa hoc ➢ Chiết với dietyl eter Trong một erlen 100 ml, cho vào 5g mẫu khô và 30ml dietyl eter, khuấy trộn đều trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lọc ngang qua giấy lọc. Lặp lại sự chiết với dietyl eter vài lần cho đến khi dung dịch chiết cuối nhạt màu. Cho dịch chiết dietyl eter vào bình lóng, chiết 3 × 20 ml dung dịch nước KOH 10%: trong bình lóng có hai lớp là lớp nước kiềm và lớp dietyl eter. Lấy lớp nước kiềm: cho vào becher, trung hòa bằng dung dịch HCl 25% cho đến khi trung tính. Lọc bằng phễu để lấy tủa. Hòa tủa này vào 5ml ethanol 90o và chia dung dịch này vào đều trong 3 ống nghiệm ▪ Ống 1: nhỏ vài giọt KOH 10%, nếu thấy có màu đỏ, có thể có antraglycosid. 22
  34. ▪ Ống 2: Acid hóa với HCl đậm đặc, sau đó cho một vài hột Mg kim loại, nếu thấy có màu đỏ, có thể có flavonoid. ▪ Ống 3: Nhỏ một vài giọt dung dịch lên tờ giấy lọc, nếu thấy trên tờ giấy lọc có vết mờ, có thể có acid béo. Lấy lớp dietyl eter: cho vào bình lóng, rửa dung dịch eter này với nước cất (3 x 20 ml), tiếp theo chiết với dung dịch H2SO4 2% (3 x 5 ml) sẽ có hai lớp: lớp etyl eter và lớp nước của acid. ▪ Lớp nước acid được gom chung lại, định tính với các thuốc thử alkaloid. Thuốc thử Mayer cho tủa màu vàng nhạt; thuốc thử Bouchardat cho tủa màu nâu; ▪ Lớp ethyl eter được chia đều vào ba chén sứ và cho bốc hơi đến khô: * Chén 1: nếu có mùi thơm có thể có tinh dầu. * Chén 2: nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu có màu xanh có thể có carotenoid. * Chén 3: Sử dụng thuốc thử Lieberman (Ac2O/H2SO4): nhỏ 10 giọt anhidrid acetic vào chén để hòa tan cắn, rồi rót hết dung dịch này vào một ống nghiệm. Nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu thấy mặt phân cách giữa hai dung dịch trong ống nghiệm có màu vàng lục hoặc lục đỏ, có thể có phytosterol (steroid thực vật). ➢ Chiết với ethanol 90o Bã cao sau khi chiết với ethyl eter được chiết với ethenol (3 x 30ml). Sau mỗi lần chiết, lọc qua ngang qua một tờ giấy lọc, gộp ba lần chiết lại để có dung dịch alcol. Dung dịch được chia làm 6 phần, mỗi phần khoảng 15 ml dung dịch. Phần 1: Pha loãng dung dịch alcol với 4 lần thể tích nước cất. Kiềm hóa bằng dung dịch NH4OH đậm đặc, sẽ có tủa. Lọc để có phần tủa và phần dung dịch qua lọc. • Phần tủa được hòa với 1 ml chloroform, cho vào ống nghiệm. Thêm vào thuốc thử Lieberman gồm 1 ml anhidrid acetic và nhỏ chầm chậm vào dọc 23
  35. theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch có màu xanh dương lục, có thể có steroid. • Phần dịch lọc được acid hóa bằng HCl, sẽ có tủa. Lọc lấy tủa và hòa tủa với 3 – 4 ml etanol 90o và chia đều vào hai ống nghiệm * Ống 1: cho và giọt KOH 10%, nếu có màu đỏ, có thể có antraglycosid. * Ống 2: cho vào một ít bột Mg kim loại và vài giọt HCl đậm đặc, nếu có màu đỏ, có thể có flavonoid. Phần 2: Pha loãng dung dịch alcol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào hay ống nghiệm. * Ống 1: Trung hòa bằng acetate natri , sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu có màu xanh đen, có thể có tanin. * Ống 2: Cho vào vài tinh thể Na2CO3, nếu có sủi bọt, có thể có acid hữu cơ. Phần 3: Dung dịch alcol được cô cách thủy đến cạn. Hòa cặn này với 3 – 4 ml H2SO4 2%. Dung dịch này được thử với 2 loại thuốc thử alkaloid: Mayer, Bouchardat. Nếu dương tính với tất cả 2 loại thuốc thử, có thể có alkaloid. Phần 4: Dung dịch alcol được cô cách thủy đến cạn. Hòa cặn này với 3 – 4 ml nước cất, đun nóng và lọc. Cho vào dung dịch lọc 4 -5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 -5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường khử. Phần 5: Pha loãng dung dịch alcol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào 2 ống nghiệm. Ống 1: acid hóa, nếu có màu đỏ. Ống 2: kiềm hóa nếu có màu lục. Nếu cả hai ống nghiệm đều có màu như nêu trên, có thể có antocyanosid. Phần 6: Chia dung dịch alcol đều vào 2 ống nghiệm và cho bốc hơi đến cạn. * Ống 1: Cho vào 5 ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin. * Ống 2: Cho vào 0,5 ml chloroform và 0,5 ml anhidrid acetic. Nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu ở mặt phân 24
  36. cách xuất hiện màu tím, có thể có saponin triterpen; nếu có mặt phân cách xuất hiện màu xanh dương lục, có thể có saponin steroid. ➢ Chiết với dung dịch nước H2SO4 1% Phần bả còn lại được chiết với dung dịch nước H2SO4 1% (3 x 20 ml). Lọc và chia dịch chiết vào 5 ống nghiệm. Phần 1: Lắc mạnh theo chiều dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin. Phần 2: Kiềm hóa với dung dịch NH4OH 10%, chiết với diethyl eter (3 x 5 ml). Lóng lấy lớp dietyl eter. Lại chiết lớp dietyl eter này với dung dịch H2SO4 1%. Lóng lấy lớp nước, để định tính với 2 loại thuốc thử Mayer, Bouchardat. Nếu dương tính với tất cả 2 loại thuốc thử, có thể có alkaloid. Phần 3: Cho vào dung dịh lọc 4 -5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 -5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường khử. Phần 4: Trung hòa bằng acetate natri , sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu có màu xanh đen, có thể có tanin. Phần 5: Pha loãng với 2 lần thể tích etanol cao độ, nếu có tủa nhiều, có thể có hợp chất đường loại acid uronic. 2.4.3 Khảo sát hoạt tính của tơ nấm linh chi khi chiết với các phân đoạn dung môi khác nhau. ❖ Quy trình tách chiết: Từ 30g sinh khối tơ nấm được sấy khô, ly trích được 5,7 g cao Methanol thô. Hòa tan cao này vào nước, rồi lần lượt trích lỏng – lỏng với hexane, chloroform, ethyl acetate thu được tương ứng 1,7 g cao Hexane, 0,3 g cao Chloroform, 0,23g cao Ethyl acetate, 2,8 g cao nước. 25
  37. Sinh khối nấm Sấy khô - Chiết với MeOH - Cô quay Cao MeOH - Hòa tan với nước - Chiết với Hexane - Cô quay Cao Hexane Dịch nước - Chiết với chloroform - Cô quay Cao Chloroform Dịch nước - Chiết với ethyl acetate - Cô quay Cao Ethyl acetate Cao nước Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao chiết chứa hoạt chất từ tơ nấm Linh chi đen 26
  38. 2.4.3.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm Linh chi ❖ Nguyên tắc: Dịch chiết nấm linh chi sẽ khuếch tán trong môi trường thạch và tác động lên vi khuẩn được kiểm tra. Nếu dịch chiết kháng được vi khuẩn kiểm tra thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Độ lớn của vòng kháng khuẩn sẽ tỷ lệ thuận với độ nhạy cảm của vi khuẩn so với dịch chiết. ❖ Mục đích: Đánh giá sơ bộ khả năng kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm Linh chi thu được. ❖ Tiến hành: - Các chủng vi khuẩn được khảo sát là: S.aureus, B.subtilis, E.coli và P.aeruginosa. Tất cả các chủng trên sẽ được nuôi cấy lắc trong môi trường LB lỏng, ở 37oC trong 24 giờ. - Mẫu dịch chiết thô được hòa tan trong DMSO 10%, votex kỹ, để đạt được nồng độ 20 mg/ml. - Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường thạch LB đã được hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. Tiến hành đục giếng thạch: đục bốn giếng đường kính 5 mm gồm một giếng chứa đối chứng âm và ba giếng chứa dịch chiết nấm. - Hút 100 µl dịch nuôi cấy của từng loại vi khuẩn lần lượt cho vào các đĩa thạch, rồi dùng que cấy trải đều dịch vi khuẩn trên bề mặt thạch. - Hút 60 µl nước cất vô trùng cho vào giếng đối chứng âm và hút 60 µl dịch chiết thô lần lượt cho vào các giếng còn lại. - Ủ đĩa ở 37 oC trong 24 giờ. - Quan sát và đo vòng kháng khuẩn và so sánh khả năng kháng khuẩn của các loại cao thu được. 2.4.3.2 Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tơ nấm Linh chi. ❖ Nguyên tắc: DPPH (2,2 diphenyl-1-pycryl-hydrazyl; C18H12N5O6, M = 394.33) là một gốc tự do, trong dung dịch ethanol tuyệt đối sẽ có màu tím và độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm [18]. Khi phản ứng với các chất có tính kháng oxi hóa, electron 27
  39. thừa của nguyên tử nitơ trong DPPH sẽ kết hợp với nguyên tử hydro từ chất có tính kháng oxi hóa để tạo thành dạng hydrazine tương ứng (Diphenylpicrylhydrazine) không có gốc tự do. Kết quả làm mất màu tím của DPPH ban đầu và dung dịch dần chuyển sang màu vàng. Hình 2.3 Phản ứng trung hòa gốc DPPH ❖ Tiến hành: - Hòa tan DPPH (dạng bột) vào ethanol để đạt nồng độ 1,2 mg/ml. - Hòa tan vitamin C (dạng bột) – đối chứng dương, vào nước cất sau đó votex để đạt nồng độ 2 mg/ml. Pha loãng dung dịch xuống các nồng độ 0,2 mg/ml. - Các mẫu dịch chiết được hòa tan trong ethanol, votex để đạt nồng độ 4 mg/ml. Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ tương ứng: 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125 mg/ml. - Hút lần lượt 100 µl các mẫu dịch chiết tơ nấm ở các nồng độ tương ứng 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125 mg/ml cho vào các giếng 1, 2, 3 của các hàng I, II, III, IV, V, VI - Hút 100 µl ethanol tuyệt đối – đối chứng âm cho vào giếng. - Hút 100 µl Vitamin C – đối chứng dương ở nồng độ 0,2 mg/ml cho vào giếng 1, 2, 3. - Thêm 100 µl dung dịch DPPH vào tất cả các giếng, trộn đều hỗn hợp. - Bao đĩa bằng giấy bạc và ủ ở 37oC trong 30 phút. - Đo độ hấp thu (OD) ở bước sóng 517 nm. 28
  40. Khả năng kháng oxy hóa hay bắt các gốc tự do DPPH của các mẫu dịch chiết nấm sẽ được tính theo công thức sau: % Hoạt tính chống oxy hóa = (1-ODmẫu/ODđối chứng )×100 2.4.4 Xác định thành phần có trong các phân đoạn dịch chiết thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ❖ Nguyên tắc: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là một kỹ thuật sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp trong lĩnh vực hóa phân tích và sinh hóa với mục đích xác định, định lượng và tinh khiết từng thành phân riêng lẻ của hợp chất. HPLC dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một chất dung môi lỏng để tải một chất hỗn hợp đơn giản (pha động) vào cột hóa học chứa các hạt (pha tĩnh), qua đó quá trình phân tách xảy ra dựa vào sự tương tác khác nhau của từng chất trong pha động với các hạt ở pha tĩnh, mà thời gian ra khỏi cột của từng chất là khác nhau. Đồng thời dầu dò có thể là UV – VIS, quỳnh quang, khối phổ sẽ phát hiện chất phân tích khi chúng đi qua cột và ghi lại những đỉnh peak, một đỉnh peak tương ứng với một chất có trong mẫu cần phân tích [20]. ❖ Tiến hành • Chuẩn bị mẫu: Mẫu được hòa tan trong methanol để đạt được nồng độ mẫu là 5 mg/ml, sau đó được lọc qua màn lọc Nitrocellulose 0,22 µm nhằm loại bỏ tạp chất ảnh hưởng đến quá trình phân tách trong cột. • Quy trình phân tích - Hệ dung môi methanol và nước cất hai lần phải được đuổi khí để sử dụng làm pha động trong quá trình chạy HPLC. - Cột HPLC được rửa bằng methanol trong 60 phút. - Sau đó phân tích mẫu cao chiết Hexane, Chloroform bằng HPLC theo gradient nồng độ trong thời gian 50 phút theo quy trình hình 2.4 29
  41. 120 100 80 60 % % Methanol 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Thời gian (t) Hình 2.4 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Hexane và Chloroform. - Mẫu cao chiết Ethyl acetate và nước được phân tích bằng HPLC trong thời gian 50 phút theo chương trình hình 2.5 35 30 25 20 15 % % Methanol 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Thời gian (t) Hình 2.5 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Ethyl acetate và Nước. - Tốc độ pha động: 1 ml/phút - Đầu dò: UV 254 nm. 2.5 Phương pháp ửx lý số liệu Số liệu được ghi chép và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statgraphics centurion. 30
  42. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN 3.1 Thu nhận sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng Trong thí nghiệm này, tiến hành nuôi cấy thu nhận sinh khối trong trong những chai 80 ml trong vòng 18 ngày, thời gian lấy mẫu cách nhau 3 ngày. Mẫu được sấy khô ở 55oC đến khối lượng không đổi sau đó đem đi cân và ghi nhận số liệu. Số liệu được ghi nhận ở Bảng 3.1 và Hình 3.1. Bảng 3.1 Khả năng tích lũy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng của nấm linh chi đen. Thời gian (ngày) Sinh khối (gam) 3 0,276 ± 0,01a 6 0,652 ± 0,019b 9 1,803 ± 0,102c 12 1,904 ± 0,05c 15 2,11 ± 0,065d 18 2,15 ± 0,055d (Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng kí tự a, b, c, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê và chỉ sự khác nhau ở mức ý nghĩa 0,05) 31
  43. 2.5 2.0 1.5 1.0 Sinh khối (gam) Sinhkhối (gam) 0.5 0.0 0 5 10 15 20 Thời gian nuôi cấy (ngày ) Hình 3.1 Khả năng tích lũy sinh khối của sợi nấm Amauroderma subresinosum trong môi trường lỏng Nhận xét - Trong 6 ngày đầu, tơ nấm thích nghi với môi trường, sinh khối tăng lên rất ít. - Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9, sinh khối phát triển rất nhanh. - Đến ngày thứ 12 sinh khối phát triển nhưng không nhanh, quanh mẫu cấy xuất hiện sắc tố đỏ nâu, vòng sắc tố lan dần và đậm dần theo thời gian. - Từ ngày 15 trở đi sinh khối tăng chậm dần đến ngày thứ 18 thì hầu như không đổi. Để tiết kiệm thời gian nuôi cấy và cũng một phần phụ thuộc vào thời gian để sinh hoạt chất của tơ nấm Linh chi, chúng tôi quyết định thu nhận sinh khối ở ngày thứ 18 để tiến hành sấy khô và khảo sát một số hoạt tính hóa học. 32
  44. 3.2 Phân tích sơ ộb thành phần hóa học nấm Linh chi A. subresinosum 3.2.1 Định tính anthraglycosid Hình 3.2 Định tính anthraglycosid Ống 1: Nước cất + KOH 10% Ống 2: Dịch chiết diethyl ether + KOH 10% Ống 3: Dịch chiết ethanol + KOH 10% Nhỏ vài giọt KOH 10% vào dịch chiết nấm linh chi, mẫu thử ống 2 và 3 cho kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ. Quan sát màu sắc sơ bộ ở Hình 3.2 có thể kết luận sự có mặt anthraglycosid trong dịch chiết etanol nhiều hơn đối với dịch chiết diethyl eter. 3.2.2 Định tính flavonoid Hình 3.3 Định tính flavonoid Ống 1: Nước cất + HClđđ + Mg Ống 2: Dịch chiết với diethyl eter + HClđđ + Mg Ống 3: Dịch chiết với ethanol + HClđđ + Mg 33
  45. Thêm vài giọt HCl đậm đặc vào mẫu thử sau đó cho một ít bột Mg kim loại vào, theo quan sát như Hình 3.3 thì không thấy sự chuyển sang màu đỏ của các loại dịch chiết, có thể kết luận sơ bộ là trong dịch chiết tơ nấm linh chi không có sự xuất hiện của flavonoid. 3.2.3 Định tính acid béo Hình 3.4 Định tính acid béo Nhỏ 1 giọt dịch chiết tơ nấm lên giấy lọc, hơ khô, quan sát vết mờ để lại trên giấy lọc, mẫu đối chứng là nước cất không để lại vết mờ, còn với dịch chiết nấm thì có (Hình 3.4). Ta có thể kết luận được sự có mặt của acid béo trong dịch chiết tơ nấm linh chi với diethyl eter. 34
  46. 3.2.4 Định tính alkaloid Hình 3.5 Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer Ống 1: Nước cất + TT Mayer Ống 2: Dịch chiết với diethyl eter + TT Mayer Ống 3: Dịch chiết với ethanol + TT Mayer Ống 4: Dịch chiết nước + TT Mayer Hình 3.6 Định tính alkaloid với thuốc thử Bouchardat Ống 1: Nước cất + TT Bouchardat Ống 2: Dịch chiết với diethyl eter + TT Bouchardat Ống 3: Dịch chiết với ethanol + TT Bouchardat Ống 4: Dịch chiết nước + TT Bouchardat Cho dịch chiết bột tơ nấm Linh chi đen tác dụng với thuốc thử Mayer không phát hiện có tủa màu vàng nhạt (Hình 3.5), tác dụng với thuốc thử Bouchardat cũng không xảy ra hiện kết tủa màu nâu (Hình 3.6). Có thể là do trong tơ nấm linh chi không có mặt alkaloid. 35
  47. 3.2.5 Định tính tinh dầu Cho dịch chiết tơ nấm linh chi đen với diethyl eter vào chén sứ và bốc hơi đến khô, ngửi thấy có mùi thơm, có thể kết luận được trong dịch chiết có thể có tinh dầu. 3.2.6 Định tính carotenoid Hình 3.7 Định tính carotenoid Cho dịch chiết tơ nấm linh chi đen với diethyl eter vào chén sứ và bốc hơi đến khô, nhỏ vài giọt H2SO4 đđ vào, không thấy xuất hiện màu xanh nên có thể kết luận không có mặt carotenoid trong tơ nấm. (Hình 3.7) 3.2.7 Định tính phytosterol Hình 3.8 Định tính phytosterol 36
  48. Cho dịch chiết tơ nấm linh chi đen với diethyl eter vào chén sứ và bốc hơi đến khô, sử dụng thuốc thử Lieberman: nhỏ vài giọt anhidrid acetic vào chén để hòa tan cắn, nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành chén, thấy mặt phân cách giữa hai dung dịch có màu vàng lục (Hình 3.8). Ta kết sơ bộ luận trong dịch chiết tơ nấm linh chi đen có thể có phytosterol. 3.2.8 Định tính steroid Hình 3.9 Định tính steroid Ống 1: Mẫu nước cất Ống 2: Mẫu dịch chiết tơ nấm với ethanol. Hòa mẫu thử với 1 ml chloroform, cho vào ống nghiệm. Thêm vào thuốc thử Lieberman gồm 1 ml anhidrid acetic và nhỏ chầm chậm vào doc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đđ, không thấy xuất hiện màu xanh dương lục (Hình 3.9). Kết luận sơ bộ là không có steroid trong dịch chiết tơ nấm Linh chi đen. 37
  49. 3.2.9 Định tính tanin Hình 3.10 Định tính tanin Ống 1: Nước cất + acetate natri + FeCl3 5% Ống 2: Dịch chiết tơ nấm với ethanol + acetate natri + FeCl3 5% Ống 3: Dịch chiết tơ nấm với nước + acetate natri + FeCl3 5% Trung hòa mẫu thử bằng acetate natri, sau đó thêm dịch FeCl3 5%, quan sát Hình 3.10 nhận thấy rằng ống 3 có phản ứng tạo màu xanh đen. Ta có thể kết luận sơ bộ được là trong dịch chiết tơ nấm linh chi với nước, có thể có tanin. 3.2.10 Định tính đường khử Hình 3.11 Định tính đường khử trước khi đun 38
  50. Hình 3.12 Định tính đường khử sau khi đun Ống 1: Nước cất + TT Fehling A, B Ống 2: Dịch chiết tơ nấm với ethanol + TT Fehling A, B Ống 3: Dịch chiết tơ nấm với nước + TT Fehling A, B Cho vào dung dịch lọc 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, ta thấy được ống nghiệm 2 và 3 có xuất hiện kết tủa đỏ gạch, là có thể có đường khử, theo quan sát màu và lượng kết tủa trong Hình 3.12 thì thấy được đường khử có trong dich chiết với nước nhiều hơn dịch chiết với ethanol. 3.2.11 Định tính antocyanosid Pha loãng dịch chiết tơ nấm linh chi trong ethanol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào 2 ống nghiệm. Hình 3.13 Định tính antocyanosid Ống 1: Dịch chiết tơ nấm trong ethanol + HClđđ Ống 2: Dịch chiết tơ nấm trong ethanol + NaOH 39
  51. Ống 1 sau khi acid hóa, quan sát không thấy có sự chuyển sang màu đỏ. Ống 2 cũng âm tính với thử nghiệm kiềm hóa khi không có sự chuyển sang màu lục (Hình 3.13). Có thể kết luận sơ bộ trong tơ nấm linh chi không có sự hiện diện của antocyanosid. 3.2.12 Định tính saponin Hình 3.14 Định tính saponin Ống 1: Dịch chiết tơ nấm linh chi trong ethanol Ống 2: Dịch chiết tơ nấm linh chi trong nước Cho vào 5ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dài của ống, nhận thấy được cả 2 ống đều tạo bọt, theo độ bền thì hợp chất saponin ở tơ nấm linh chi được chiết với nước nhiều hơn so với ethanol (Hình 3.14). 40
  52. 3.2.13 Định tính acid uronic Hình 3.15 Định tính acid uronic Ống 1: Nước cất + ethanol 96o Ống 2: Dịch chiết tơ nấm trong nước + ethanol 96o Pha loãng mẫu thử với 2 lần thể tích ethanol 96o, thấy trong dịch chiết tơ nấm có xuất hiện nhiều kết tủa (Hình 3.15), kết luận sơ bộ rằng trong tơ nấm linh chi có thể có hợp chất đường loại acid uronic. 3.2.14 Định tính acid hữu cơ Cho vài tinh thể Na2CO3 vào mẫu thử, có hiện tượng sủi bọt xảy ra, nên có thể có sự xuất hiện của acid hữu cơ trong tơ nấm linh chi (Hình 3.16) Hình 3.16 Định tính acid hữu cơ 41
  53. Kết quả định tính sơ bộ được tóm tắt trong Bảng 3.2. Kết quả cho thấy trong hệ sợi nấm Linh chi có sự xuất hiện của antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol, tanin, đường khử, saponin, acid urunic và acid hữu cơ. Bảng 3.2 Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết Loại dung dịch chiết Hợp chất Diethyl Thuốc thử Kết quả Ethanol Nước tự nhiên eter + ++ KOH 10% Màu đỏ nhạt Antraglycosid - - Mg/HCl đđ Có vòng màu đỏ Flavonoid Nhỏ dịch trên + Để lại vết ố Acid béo giấy lọc Mayer, - - - Có tủa màu Alkaloid Bouchardat Bốc hơi còn + Có mùi thơm Tinh dầu lại cắn - H2SO4 đđ Màu xanh Carotenoid + Lieberman Màu vàng lục Phytosterol Màu xanh dương - Ac O, H SO Steroid 2 2 4 lục - + FeCl3 Màu lục đen Tanin + + Fehling A, B Tủa màu đỏ gạch Đường khử - HCl/ KOH Màu đỏ/màu lục Antocyanosid Lắc mạnh + ++ Có bọt bền Saponin dung dịch Pha loãng với + Có tủa nhiều Acid uronic ethanol 90o + Na2CO3 Sủi bọt Acid hữu cơ Ghi chú: (-): âm tính (+): dương tính (++): thể hiện nồng độ cao hơn 42
  54. Khi so sánh thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi đen (A. subresinosum) với tơ nấm Ganoderma lucidum và tơ nấm Hoàng chi G.colossum đã được nghiên cứu trước đây [5], kết quả cho thấy trong tơ nấm Linh chi A. subresinosum có nhiều hoạt chất hóa học hơn G. lucidum và G.colossum, cụ thể như antraglycosid, acid béo, tinh dầu, acid hữu cơ (Bảng 3.3). Bảng 3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong các loại tơ nấm Linh chi Hợp chất Kết quả định tính thành phần hóa học trong tơ nấm tự nhiên G.lucidum G.colossum A.subresinosum Antraglycosid - - + Flavonoid - - - Acid béo - - + Alkaloid - - - Tinh dầu - - + Carotenoid + + - Phytosterol + + + Steroid - - - Tanin + - + Đường khử + + + Antocyanosid - - - Saponin + + + Acid uronic + + + Acid hữu cơ - - + 43
  55. 3.3 Khảo sát hoạt tính cao chiết Methanol tổng của tơ nấm Linh chi đen 3.3.1 Khả năng kháng khuẩn của tơ nấm linh chi trong cao Methanol Để khảo sát hoạt tính kháng lại một số chủng vi khuẩn: S.aureus, B.subtilis, E.coli và P.aeruginosa bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, các loại cao chiết được chuẩn bị ở nồng độ 20 mg/ml, sau đó được bơm vào các giếng đã đánh dấu và được ủ ở 37 0C, trong 24 giờ. Quan sát và đo vòng kháng khuẩn (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao MeOH thu được trên đĩa thạch Đường kính vòng STT Chủng vi khuẩn kháng khuẩn (mm) 1 Bacillus subtilis 17,8 ± 0,82a 2 Staphylococcus aureus 17 ± 1,41a 3 Pseudomonas aeruginosa 19,7 ± 0,47b 4 Escherichia coli 20,3 ± 0,47b (Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng kí tự a, b, c, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê và chỉ sự khác nhau ở mức ý nghĩa 0,05) Kết quả thu được cho thấy cao MeOH có khả năng kháng lại cả 4 loại vi khuẩn với đường kính từ 17 – 20 mm sau 24 giờ ủ ở 37oC. Trong đó khả năng kháng lại P.aeruginosa và E.coli (đường kính 19 – 20 mm) cao hơn so với 2 chủng còn lại. 44
  56. Hình 3.17 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao MeOH 3.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Methanol tổng Khả năng kháng oxy hóa của các phân đoạn được tiến hành khảo sát bằng phản ứng DPPH (2,2 diphenyl-1-picryl-hydrazyl) trên đĩa 96 giếng, ủ ở 37 0C, trong 30 phút và đo OD517nm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.18. 45
  57. Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao MeOH thu được Nồng độ Trung % bắt gốc mẫu OD 1 OD 2 OD 3 % sai số bình tự do (mg/ml) 4 0,12 0,13 0,12 0,12 81,21 1,153 2 0,17 0,206 0,26 0,23 64,71 7,943 1 0,28 0,29 0,34 0,30 53,82 4,872 0,5 0,49 0,46 0,49 0,48 26,78 2,562 0,25 0,54 0,57 0,605 0,56 14,92 2,02 0,125 0,61 0,59 0,57 0,59 10,39 3,132 Hình 3.18 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao MeOH thu được. Kết quả cho thấy cao MeOH thu được có khả năng bắt các gốc tự do DPPH theo nồng độ tăng dần từ 10,39 % ở nồng độ 0,125 mg/ml đến 81,21 % ở nồng độ 4 mg/ml. Nồng độ cao MeOH ức chế các gốc tự do DPPH ở 50% (IC50) là 1,094 mg/ml. 46
  58. 3.4 Khảo sát hoạt tính các phân ạđo n cao của tơ nấm Linh chi A.subresinosum 3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm linh chi Để khảo sát hoạt tính kháng lại một số chủng vi khuẩn: S.aureus, B.subtilis, E.coli và P.aeruginosa bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, các loại cao chiết được chuẩn bị ở nồng độ 20 mg/ml, sau đó được bơm vào các giếng đã đánh dấu và được ủ ở 37 0C, trong 24 giờ. Quan sát và đo vòng kháng khuẩn. Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn cao thu được trên đĩa thạch Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Dịch chiết Ethyl Hexane Chloroform Nước Chủng VK acetate Bacillus subtilis 10 ± 0,30 16 ± 0,36 10 ± 0,30 0 Staphylococcus aureus 10 ± 0,20 15 ± 0,58 10 ± 0,45 0 Pseudomonas 0 0 0 0 aeruginosa Escherichia coli 0 0 0 0 Theo kết quả bảng 3.6, bước đầu cho thấy được rằng dịch chiết tơ nấm trong các phân đoạn có khả năng kháng lại các vi khuẩn gram dương tốt hơn so với gram âm. Trong 4 phân đoạn thu nhận được, thì khả năng kháng khuẩn của phân đoạn Chloroform là tốt nhất so với phân đoạn Hexane và Ethyl acetate. Trong cao nước thì hầu như không có khả năng kháng khuẩn. So với cao tổng Methanol thì Methanol kháng được 4 chủng vi khuẩn, các phân đoạn sau chỉ kháng được B.subtilis, S.aureus vì hợp chất kháng khuẩn trong các loại cao có thể bị mất khi thực hiện các giai đoạn tách chiết, nên khả năng kháng khuẩn của phân đoạn cũng giảm so với cao ban đầu. 47
  59. Hình 3.19 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Hexane Hình 3.20 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Chloroform 48
  60. Hình 3.21 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Ethyl acetate 3.4.2 Khả năng kháng oxy hóa của các loại cao chiết Khả năng kháng oxy hóa của các phân đoạn được tiến hành khảo sát bằng phản ứng DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) trên đĩa 96 giếng, ủ ở 37 0C, trong 30 phút và đo OD517nm. Kết quả được thể hiện ở các hình 3.22, 3.23, 3.24, 3.25 tương ứng cho các phân đoạn chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate và nước. 49
  61. Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Hexane thu được Nồng độ Trung % bắt gốc tự mẫu OD 1 OD 2 OD 3 % sai số bình do (mg/ml) 4 0,095 0,104 0,108 0,102 85,95 0,914 2 0,174 0,153 0,244 0,190 73,86 6,542 1 0,349 0,372 0,391 0,371 49,10 2,888 0.5 0,575 0,550 0,602 0,576 20,96 3,571 0.25 0,542 0,642 0,605 0,596 18,12 6,942 0.125 0,634 0,703 0,710 0,682 6,316 5,767 Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Hexane thu được. 50
  62. Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Chloroform thu được Nồng độ Trung % bắt gốc tự mẫu OD 1 OD 2 OD 3 % sai số bình do (mg/ml) 4 0,136 0,148 0,152 0,145 80,04 1,143 2 0,112 0,118 0,115 0,115 84,21 0,412 1 0,170 0,176 0,181 0,176 75,88 0,756 0.5 0,331 0,320 0,319 0,323 55,6 0,914 0.25 0,433 0,443 0,428 0,435 40,32 1,049 0.125 0,499 0,506 0,506 0,504 30,84 0,555 Hình 3.23 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Chloroform thu được. 51
  63. Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Ethyl acetate thu được Nồng độ Trung % bắt gốc tự mẫu OD 1 OD 2 OD 3 % sai số bình do (mg/ml) 4 0,125 0,107 0,109 0,114 84,39 1,35 2 0,119 0,097 0,098 0,105 85,62 1,706 1 0,252 0,237 0,231 0,240 67,04 1,485 0.5 0,409 0,397 0,396 0,401 44,98 0,993 0.25 0,400 0,501 0,486 0,509 30,11 3,827 0.125 0,555 0,562 0,555 0,557 23,48 0,555 Hình 3.24 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Ethyl acetate thu được. 52
  64. Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Nước thu được Nồng độ Trung % bắt gốc tự mẫu OD 1 OD 2 OD 3 % sai số bình do (mg/ml) 4 0,155 0,112 0,107 0,108 85,17 0,495 2 0,269 0,211 0,203 0,228 68,74 4,945 1 0,433 0,430 0,404 0,422 42,01 2,190 0.5 0,584 0,567 0,571 0,574 21,19 1,220 0.25 0,681 0,555 0,551 0,596 18,21 10,150 0.125 0,612 0,609 0,614 0,612 16,02 0,346 Hình 3.25 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao nước thu được. Kết quả cho thấy được rằng những phân đoạn thu được đều có khả năng bắt các gốc tự do DPPH theo nồng độ tăng dần. Và nồng độ ức chế 50% của các phân đoạn lần lượt là 1,115; 0,336; 0.521; 1,218 mg/ml cho các cao Hexan, Chloroform, Ethyl acetate và nước. 53
  65. Qua các giá trị IC50 của các phân đoạn và IC50 của cao tổng MeOH cho thấy được phân đoạn chiết với Chloroform, Ethyl acetate có khả năng bắt các gốc tự do tốt hơn cao tổng với các giá trị IC50 lần lượt là 0,336 và 0,521 mg/ml. Phân đoạn Hexane có giá trị tương đương với phân đoạn cao tổng Methanol trong khi đó phân đoạn nước có giá trị IC50 cao nhất. 1.4 1.2 1 0.8 0.6 IC (mg/ml) IC 50 0.4 0.2 0 MeOH Hexan Cloroform Ethyl acetate H2O Các phân đoạn Hình 3.26 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết 54
  66. 3.5 Kết quả phân tích thành phần có trong cao chiết tơ nấm A. subresinosum bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Để xác định thành phần hoạt chất chính có trong các phân đoạn cao, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao được thực hiện. Sắc ký đồ của cao Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước lần lượt được thề hiện ở các hình 3.27, 3.28, 3.29 và 3.30. Hình 3.27 Sắc ký đồ của dung dịch cao Hexane đo ở bước sóng 254 nm Theo quan sát sắc ký đồ thu được, có 3 peak đặc trưng, tương ứng với các chất có trong cao Hexane. Peak đầu tiên thời gian lưu là 24 phút, peak kế tiếp vào khoảng phút 31. Peak thứ 3 thời gian lưu là 35 phút. 55
  67. Hình 3.28 Sắc ký đồ của dung dịch cao Chloroform đo ở bước sóng 254 nm Trong cao Chloroform, phân tích được một chất đặc trưng, thời gian lưu của chất ở phút thứ 24. 56
  68. Hình 3.29 Sắc ký đồ của dung dịch cao Ethyl acetate đo ở bước sóng 254 nm Quan sát sắc ký đồ của cao Ethyl acetate, có 2 peak đồng nghĩa với việc có chất đặc trưng và một vài tạp chất khác. Thời gian lưu của 2 chất lần lượt là 14 và 21 phút. 57
  69. Hình 3.30 Sắc ký đồ của dung dịch cao Nước đo ở bước sóng 254 nm Đối với phân đoạn cao nước, các chất có thời gian gian lưu rất ngắn khi phân tách bằng cột C18 nên việc phân tách bằng cột C18 không hiệu quả. Các chất này có thể là đường khử, polysaccharide, Phân đoạn đang được tiến hành phân tách bằng các hệ thống sắc ký khác như sử dụng cột carbohydrate, cột amine. 58
  70. Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Thời gian nuôi cấy thích hợp để thu nhận sinh khối tơ nấm linh chi là 18 ngày trong điều kiện nhiệt độ 30oC. Trong thành phần tơ nấm linh chi, được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 30oC thì có các hoạt chất: antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol, tanin, đường khử, saponin, acid uronic, acid hữu cơ, Cao Methanol được đánh giá có khả năng kháng khuẩn tốt nhất với các loại vi khuẩn S.aureus, B.subtilis, E.coli, P.aeruginosa ở nồng độ 20 mg/ml. Đồng thời cao Methanol cũng có khả năng kháng oxy hóa tốt với IC50 là 1,094 mg/ml. Các phân đoạn cao chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước của tơ nấm có khả năng kháng khuẩn yếu hơn cao tổng Methanol, khả năng kháng oxy hóa của cao Chloroform và cao Ethyl acetate thì tốt hơn cao tổng, cao Hexane thì tương đương, còn cao nước thì khả năng kháng oxy hóa yếu nhất. Phân tích các phân đoạn chiết, thu được trong cao Hexane có 3 hợp chất, cao Chloroform có 1 chất, cao Ethyl acetate có 2 chất và cao nước thì chưa xác định được. 4.2 Kiến nghị Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao Methanol đối với các chủng vi khuẩn. Dùng các hệ thống sắc ký khác để xác định thành phần phân đoạn của cao nước. Thu nhận và xác định các hoạt chất chính có trong các phân đoạn cao được phân tách được bằng HPLC. 59
  71. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Arichi D.S. and Hagashi D.T. (2003). Linh chi nguyên chất và bệnh thời nay (Đoàn Sáng dịch). Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, Việt Nam. 2. Đỗ Tất Lợi (2006). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội. 3. Đoàn Sáng (2003). Linh chi nguyên chất và bệnh thời nay. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, Việt Nam. 4. Đoàn Suy Nghĩ (2008), Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) đối với cấu trúc mô tinh hoàn chuột nhắt trắng dòng SWISS khi bị chiếu xạ liều cao. Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 49. 5. Lê Quỳnh Loan (2014), Thử nghiệm nuôi cấy và khảo sát thành phần hoạt chất chính của một số chủng nấm họ Linh chi Ganodermataceae thu nhận tự nhiên, Luận văn Thạc sĩ, ĐH KHTN TP.HCM, Tp. Hồ Chí Minh. 6. Lê Xuân Thám (1996). Nấm Linh chi – tài nguyên dược liệu quí ở Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 7. Lê Xuân Thám (2013). Phát triển sản xuất nấm trên cơ sở điều tra xây dựng bảo tàng nấm ở Vườn quốc gia Cát Tiên. Báo cáo Khoa Học – Sở Khoa học và Công nghệ Đồng Nai. 8. Lê Xuân Thám (1996). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điển hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst. Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Việt Nam. 9. Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh (2000). Nấm ăn nấm dược liệu - công dụng và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Hà Nội, Hà Nội. 10. Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn và Zani Federico (2002). Cơ sở khoa học và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 60
  72. 11. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, ĐH Quốc gia TP.HCM, Thành phố Hồ Chí Minh. 12. Nguyễn Lân Dũng (2001). Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1 và 2. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 13. Nguyễn Minh Khang (2005), Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan – Việt Nam, Luận văn kỹ sư, ĐH Nông Lâm TP.HCM, Tp. Hồ Chí Minh. 14. Nguyễn Phước Nhuận (2001). Giáo trình sinh hoá học, phần 1, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TPHCM, T.p Hồ Chí Minh. 15. Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan, Phạm Thị Vân Anh (2005), Bước đầu nghiên cứu tác dụng nấm linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ số lipid máu ở chuột cống. Tạp chí nghiên cứu Y Học 38 (5). 16. Trần Hùng (2004). Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược TP.HCM. 17. Trần Văn Mão (2004). Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. 18. Viện Dược liệu – Bộ Y Tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ Dược thảo, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội , tr. 28-35, 279-292, 367. Tài liệu Tiếng Anh 19. Chairul, T.T., Hayashi, Y., Nishizawa, M., Tokuda, H., Chairul, S.M., Hayashi, Y.(1991). Applanoxidic acids A, B, C and D, biologically active tetracyclic triterpenes from Ganoderma applanatum. Phytochemistry 30, 4105–4109. 20. Hamide Ceniuva and tuncel Ozden (2002). Simultaneous High Performance Liquid Chromatographic Determination of paracetamol, phenylephrin HCl and chlorpheniramine maleate in pharmaceutical dosage forms. Journal of Chrmatografic Sience, ISSN 0021-9665 Volume 40, Number 2, pp. 97-100. 61
  73. 21. Masao Hattori (2006), Protective effects of an acidic polysaccharide isolated from fruiting bodies of Ganoderma lucidum against murine hepatic injury induced by Propionibacterium acnes and lipopolysaccharide, J. Nat. Med. 22. Shwu-Bin Lin, Chyi-Hann Li, Shiuh-Sheng Lee, Lou-Sing Kan (2003). Triterpene-enriched extracts from ganoderma lucidum inhibit growth of hepatoma cells via suppressing protein kinase c, activatin mitogen-activated protein kinases and g2-phase cell cycle arrest. Life Sciences 72 (2003) 2381 – 2390. 23. Steyaert R.L (1972). Species of Ganoderma and related genera mainly of the boyor and leiden herbaria. National de Beigique, Burxelle. 24. Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou (2001). Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature. Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Auckland. 25. YihuaiGao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of Ganoderma polysaccharides. Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,00-00. 26. Zhaoji – Ding (1980). The Ganodermataceae in chine. Berlin Shiffigart. Tài liệu từ Internet 27. 28. InformationGanoHIV.mht 29. 62
  74. PHỤ LỤC Phụ lục A: Hình ảnh thí nghiệm Tơ nấm Linh chi đen nuôi trên môi trường PDA Sinh khối nấm Linh chi đen trong môi trường lỏng sau 15 ngày nuôi cấy 1
  75. Thực hiện phản ứng DPPH trên đĩa 96 giếng (I) 4 mg/ml ; (II) 2 mg/ml; (III) 1mg/ml; (IV) 0,5 mg/ml; (V) 0,25 mg/ml; (VI) 0,125 mg/ml Máy HPLC 2
  76. Phụ lục B: Các bảng phân tích ANOVA 1. Theo dõi sự tăng sinh khối của tơ nấm Linh chi đen trong môi trường lỏng Summary Statistics Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness N3 3 0.276333 0.0100664 3.64286% 0.267 0.287 0.02 0.41407 N6 3 0.651667 0.019218 2.94906% 0.631 0.669 0.038 -0.535305 N9 3 1.80267 0.101589 5.63549% 1.713 1.913 0.2 0.620533 N12 3 1.904 0.0504777 2.65114% 1.87 1.962 0.092 1.17089 N15 3 2.11 0.0655744 3.10779% 2.05 2.18 0.13 0.473963 N18 3 2.15533 0.055003 2.55195% 2.1 2.21 0.11 -0.0385617 Total 18 1.48333 0.761445 51.3334% 0.267 2.21 1.943 -1.29252 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 9.81524 5 1.96305 569.98 0.0000 Within groups 0.0413287 12 0.00344406 Total (Corr.) 9.85657 17 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups N3 3 0.276333 X N6 3 0.651667 X N9 3 1.80267 X N12 3 1.904 X N15 3 2.11 X N18 3 2.15533 X 2. Khả năng kháng khuẩn của tơ nấm linh chi trong cao Methanol khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Summary Statistics Count Average Standard Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. deviation skewness B subtilis 3 17.0 1.0 5.88235% 16.0 18.0 2.0 0.0 E coli 3 20.3333 0.57735 2.83943% 20.0 21.0 1.0 1.22474 P aeruginosa 3 19.6667 0.57735 2.93568% 19.0 20.0 1.0 -1.22474 S aureus 3 17.0 1.73205 10.1885% 16.0 19.0 3.0 1.22474 Total 12 18.5 1.83402 9.91363% 16.0 21.0 5.0 -0.525181 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 27.6667 3 9.22222 7.90 0.0089 Within groups 9.33333 8 1.16667 Total (Corr.) 37.0 11 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups B subtilis 3 17.0 X S aureus 3 17.0 X P aeruginosa 3 19.6667 X E coli 3 20.3333 X 3
  77. Phụ lục C: Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn ▪ Môi trường tăng sinh vi khuẩn: LB Nước cất : 100 ml Pepton : 1 g NaCl : 1 g Yeast extract : 0,5 g ▪ Môi trường đĩa thạch kháng khuẩn: LB-agar Nước cất : 100 ml Pepton : 1 g NaCl : 1 g Yeast extract : 0,5 g Agar : 2 g 4