›

Đồ án Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phương pháp SSF

pdf 102 trang thiennha21 12/04/2022 2830
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phương pháp SSF", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_nang_cao_hieu_qua_qua_trinh_len_men_bioethano.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phương pháp SSF

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT NÂNG CAO HIỆU QUẢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN BIOETHANOL TỪ VỎ CACAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SSF Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S Trần Thị Tưởng An Sinh viên thực hiện : Hồ Thùy Bảo Trân MSSV: 1151110531 Lớp: 11DSH05 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, đồ án tốt nghiệp “Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên menbioethanol từ vỏ cacao bằng phương pháp SSF” là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tôi, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức và dựa trên sự hướng dẫn của Th.S Trần Thị Tưởng An. Các số liệu sử dụng trong đồ án là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng. Nội dung đồ án có tham khảo và sử dụng một số nhận xét, đánh giá từ các tài liệu thông tin được đăng tải trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án.
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đồ án tốt nghiệp là một cột mốc quan trọng trong cuộc đời sinh viên, nó đánh dấu toàn bộ quá trình học tập và nghiên cứu ở giảng đường đại học. Để có được điều kiện thực hiện đồ án tốt nghiệp cũng như hoàn thành chương trình học 4 năm tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM em đã nhận được những sự chỉ dạy tận tình với những kinh nghiệm quý báu từ quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm- Môi trường của trường Đại học Công Nghệ TP.HCM. Lời đầu tiên em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cũng như tập thể các thầy cô đã giúp đỡ vàt ạo điều kiện cho em được thực hiện đồ án này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Trần Thị Tưởng An, trường Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh. Cô là người đã giúp em đến với hướng nghiên cứu này, đồng thời cũng là người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt các kiến thức, kinh nghiệm chuyên môn, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đồ án và động viên em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh, các chị và các bạn làm việc trong phòng thí nghiệm đã nhiệt tình hỗ trợ em trong suốt thời gian làm việc ở đây. Cuối cùng, xin cảm ơn sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của toàn thể gia đình trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp, cũng như trong suốt quá trình học tập vừa qua. Mặc dù đã cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất. Song do buổi đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực nghiệm và máy móc hiện đại cũng như hạn chế về kiến thức, kinh nghiệm nên không tránh khỏi những thiếu xót. Em rất mong được sự góp ý của quý thầyvà cô các bạn để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn. Sinh viên thực hiện Hồ Thùy Bảo Trân
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề. 1 2. Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol từ vỏ trái cacao. 2 3. Mục tiêu đề tài 3 4. Nội dung nghiên cứu 3 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Các kết quả đạt được của đề tài 4 7. Kết cấu của đồ án 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Giới thiệu về Bioethanol 5 1.1.1. Khái niệm 5 1.1.2. Các thế hệ bioethanol 5 1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bioethanol trên thế giới và Việt Nam 6 1.1.4. Lợi ích, hạn chế và ứng dụng của bioethanol 11 1.1.5. Nguồn nguyên liệu lignocellulose 12 1.2. Quá trình biến đổi bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose. 13 1.2.1. Quá trình tiền xử lý 14 1.2.2. Quá trình thủy phân. 17 1.2.3. Quá trình lên men 17 1.3. Giới thiệu về cây Cacao 22 1.3.1. Tên khoa học của cây cacao 22 1.3.2. Thành phần và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái cacao 22 1.3.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cacao ở nước ta. 23 1.4. Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới 24 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.5. Giới thiệu về nấm men Saccharomyces cerevisiae 26 1.5.1. Phân loại khoa học 26 1.5.2. Đặc điểm hình thái 26 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27 2.2. Đối tượng nghiên cứu 27 2.3. Vật liệu nghiên cứu 27 2.3.1. Vật liệu 27 2.3.2. Dụng cụ và thiết bị 28 2.4. Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 29 2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 29 2.5. Các phương pháp phân tích. 34 2.5.1. Phương pháp vi sinh. 34 2.5.2. Phương pháp hóa lý 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1. Khảo sát giống nấm men 42 3.1.1. Quan sát hình thái nấm men 42 3.1.2. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae. 42 3.2. Khảo sát thành phần hóa học của vỏ cacao khô. 43 3.3. Khảo sát tiền xử lý với acid oxalic. 44 3.4. Thủy phân vỏ cacao bằng enzyme Viscozym 45 3.5. Khảo sát thời gian lên men sau khi thủy phân (SHF). 47 3.6. Khảo sát thủy phân và lên men đồng thời (SSF). 49 3.6.1. Khảo sát thời gian SSF. 50 3.6.2. Khảo sát nhiệt độ lên men SSF 54 3.6.3. Khảo sát tỉ lệ giống bổ sung 56 3.6.4. Khảo sát tỉ lệ enzyme bổ sung. 59 3.6.5. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy lắc 61 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.7. Khảo sát thành phần dinh dưỡng bổ sung trong lên men SSF 63 3.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ peptone đến quá trình lên men SSF 63 3.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose đến quá trình SSF 65 3.7.3. Khảo sát ảnh hưởng của K2HPO4 đến quá trình lên men SSF 67 3.7.4. Khảo sát ảnh hưởng của MnSO4 đến quá trình lên men SSF 68 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 4.1. Kết luận. 71 4.2. Kiến nghị . 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 73 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Cfu Colony forming unit Cty Công ty DNS Acid 3,5- dinitrosalicylic đv Đơn vị EtOH Ethanol EU European Union h Giờ HPLC High-performance liquid chromatography KH và CN Khoa học và Công nghệ MeOH Methanol PL Phụ lục. PNV Petro Vietnam. S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SDA Sabouraud’s Dextrose Agar SDB Sabouraud’s Dextrose Broth SHF Separate hydrolysis and fermentation SSCF Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation SSF Simultaneous Saccharification and Fermention TXL Tiền xử lý iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các thế hệ bioethanol 6 Bảng 1.2. Tổng sản lượng bioethanol hàng năm trên thế giới 7 Bảng 1.3. Danh sách nhà máy bioethanol sinh học đang sản xuất 10 Bảng 1.4. Các phương pháp tiền xử lý hóa học 16 Bảng 1.5. Những thuận lợi và bất lợi của phướng pháp tiền xử lý bằng acid 16 Bảng 1.6. Các phương pháp tiền xử lý sinh học 17 Bảng 1.7. Các quá trình lên men 20 Bảng 1.8. Thành phần vỏ cacao khô 22 Bảng 1.9. Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới 25 Bảng 2.1. Bảng thực hiện thí nghiệm lên men SSF 33 Bảng 3.1. Thành phần hóa học của vỏ cacao khô. 44 Bảng 3.2. Thành phần hóa học của vỏ cacao khô sau khi tiền xử lí 45 Bảng 3.3. Kết quả thủy phân theo thời gian. 46 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Thị phần sản xuất bioethanol sinh học trên thế giới. 8 Hình 1.2. Thành phần của lignocelluloses. 13 Hình 1.3. Sơ đồ chuyển đổi sinh khối lignocelluolose thành bioethanol. 14 Hình 1.4. Nấm men Saccharomyces cerevisiae 26 Hình 2.1. Sơ đồ quá trình thực hiện thí nghiệm 29 Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của Saccharomyces cerevisiae 42 Hình 3.2. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae 42 Hình 3.3. Vỏ cacao khô 43 Hình 3.4. Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên lên men SHF. 48 Hình 3.5. Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên men SSF 51 Hình 3.6. Sự thay đổi các thành phần theo nhiệt độ trong quá trình lên men SSF 55 Hình 3.7. Sự thay đổi các thành phần theo tỉ lệ cấy giống trong lên men SSF 57 Hình 3.8. Sự thay đổi các thành phần theo tỉ lệ enzyme bổ sung trong quá trình lên men SSF 60 Hình 3.9. Sự thay đổi các thành phần theo tốc độ khuấy trong quá trình lên men SSF 62 Hình 3.10. Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ pepton bổ sung trong quá trình lên men SSF 64 Hình3 .11. Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ glucose bổ sung trong quá trình lên men SSF. 66 Hình3 .12. Sự thay đổi các thành phần theonồng độ K2HPO4 trong quá trình lên men SSF. 68 Hình 3.13. Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ MnSO4 bổ sung trong quá trình lên men SSF 70 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề. Bioethanol (Ethanol sinh học) là một loại nhiên liệu sinh học mới đầy hứa hẹn sẽ thay thế cho nguồn năng lượng từ các sản phẩm hoá thạch dầu mỏ mà mọi người đang hướng tới nhằm khắc phục cơn khát năng lượng toàn cầu. Nó có thể được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu và chất thải sinh học khác nhau. Nguyên liệu được sử dụng trong sản xuất bioethanol sinh học như đậu tương, cọ, hạt cải, hạt cải dầu, mỡ động vật, dầu thực vật, tinh bột và đường được coi là nguyên liệu thế hệ đầu tiên. Những bất lợi của các nguyên liệu thế hệ đầu tiên là chúng có thể được sử dụng theo cách khácể đ làm thức ăn cho con người do đó sẽ gây ra sự lo lắng về vấn đề an ninh lương thực - sự cạnh tranh giữa cây trồng làm nhiên liệu và cây lương thực. Chính vì vậy, thế giới đang đi theo hướng sản xuất bioethanol từ các nguyên liệu phi thực phẩm có chứa hợp chất cellulose - sinh khối lignocellulose. Sử dụng nguyên liệu giàu cellulose hoặc nguyên liệu rẻ tiền chứa nhiều carbohydrate là một giải pháp đang được hướng đến để tránh việc cạnh tranh với nguồn lương thực của con người. Việt Nam là một quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các loài cây trồng, đặc biệt là các loại cây nông nghiệp có giá trị như cacao. Hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vỏcacao để làm thức ăn chăn nuôi mang lại hiệu quả cao. Bên cạnh đó, vỏcacao đã được nghiên cứu trong lĩnh vực sản xuất bioethanol sinh học. Dựa vào thành phần hóa học của vỏ cacao chủ yếu là cellulose, hemicellulose và lignin qua quá trình thủy phân và lên men nhờ vi sinh vật chuyển hoá cellulose trong vỏ cacao thành Bioethanol sinh học. Vỏ trái cacao là nguồn phế phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose nên có thể sử dụng để lên men tạo bioethanol rất hiệu quả, tận dụng được nguồn vỏ phế phẩm với lượng thải bỏ hằng năm rất lớn. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu để tìm ra phương pháp lên men tốt nhất cho nguồn nguyên liệu này là vấn đề quan trọng hàng đầu để có thể ứng dụng vào sản xuất bioethanol đại trà. Với những ưu điểm như rẻ tiền, phổ 1
  11. Đồ án tốt nghiệp biến, vỏcacao sẽ là một nguồn nguyên liệu tiềm năng trong quá trình nghiên cứu sản xuất bioethanol sinh học. Do những vấn đề nêu trên, nên đây là một loại nguyên liệu có tiềm năng rất lớn trong việc sản xuất bioethanol ở Việt Nam. Nghiên cứu “Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phương pháp SSF” được đặt ra nhằm mục đích sử dụng phương pháp SSF để lên men nguồn phế phẩm vỏ cacao để thu bioethanol có hiệu quả cao. 2. Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol từ vỏ trái cacao. Hiện nay đã có khá nhiều nghiên cứu lên men bioethanol được tiến hành trên các nguồn nguyên liệu giàu cellulose như rơm rạ, bã mía, vỏ trấu, tiêu biểu là nghiên cứu “Sản xuất bioethanol nhiên liệu từ rơm rạ” (Trần Diệu Lý, 2008), nghiên cứu dựa trên cơ sở sử dụng các phương pháp vật lý và hóa học để xử lý nguyên liệu thô giàu cellulose. Việc định hướng nguyên liệu là cellulose gặp khó khăn về vấn đề kinh tế và kỹ thuật. Nguồn nguyên liệu là rơm rạ hay bã mía hiện đang được tận dụng khá triệt để trong nông nghiệp và trong các nhà máy sản xuất điện nên việc sản xuất bioethanol từ các loại nguyên liệu kể trên có vẻ như chưa khả thi lắm. Vấn đề tìm nguồn nguyên liệu thay thế khác lại được đặt ra và vỏ trái cacao (chứa đến 43,9 – 45,2% carbohydrate) (Samah et al., 2011) đã được xem sét. Vỏcacao đã được sử dụng trước đó nhưng chủ yếu là làm phân bón hữu cơ và thức ăn cho gia xúc. Theo báo cáo của Bùi Thanh Bình (2009) thì vỏ cacao có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho việc sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, việc phối hợp vỏcacao với phân hữu cơ mang lại hiệu quả vượt bậc. Và gần đây nhất là đề tài “Nghiên cứu khả năng thủy phân vỏ trái cacao ứng dụng trong sản xuất bioethanol sinh học” của Phạm Thiếu Quân, Huỳnh Xuân Phong và Ngô Thị Phương Dung (2013) trường ĐH Cần Thơ đã tìm thấy tiềm năng sản xuất bioethanol sinh học từ nguồn phế phẩm nông nghiệp là vỏ trái cacao. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp 3. Mục tiêu đề tài Khảo sát một số điều kiện trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời để tìm ra các thông số cho quá trình lên men bioethanol đạt hiệu quả cao. 4. Nội dung nghiên cứu Khảo sát giống nấm men. Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏcacao. Khảo sát điều kiện tiền xử lý cho vỏ cacao bằng acid oxalic. Khảo sátthời gian cho quá trình lên men SHF (làm đối chứng cho quá trình SSF). Khảo sát một số điều kiện cho quá trình lên men SSF, sử dụng Saccharomyces cerevisiae 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp bố trí thí nghiệm. Phương pháp phân tích Phương pháp phân tích sinh hóa. Xác ịđ nh độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. Xác định hàm lượng tro tổng bằng phương pháp nung ở nhiệt độ cao. Định lượng đường khử bằng phương pháp Miller. Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher-Hofft. Định lượng hàm lượng lignin theo phương pháp Klasm. Trích ly pectin bằng nước nóng. Xác định nồng độcồn bằng sắc ký cột lỏng cao áp - HPLC. Phương pháp xác định mật độ vi sinh. Phương pháp đếm khuẩn lạc và sử dụng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị đo OD với mật độ tế bào vi sinh. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả nhận được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel. Các số liệu được xử lý bằng chương trình Statgraphics Centurion XV. 3
  13. Đồ án tốt nghiệp 6. Các kết quả đạt được của đề tài Trong suốt quá trình thí nghiệm đã thu thập được kết quả sau: Việc sử dụng acid oxalic 5 % khi tiến hành tiền xử lý vỏcacao trong thời gian 2 ngày thu được hàm lượng đường trong dịch đạt 14,67 mg/g Tiến hành thủy phân bằng cellulase 0,5 % và lên men riêng lẻ SHF thu được nồn độ cồn cao 4,64 % sau 30 giờ lên men ở điều kiện nhiệt độ phòng. Tiếp tục lên men theo phương pháp thủy phân và lên men đồng thời SSF thu được hàm lượng cồn là 5,47 % sau 45 giờ lên men. Khi bổ sung các chất dinh dưỡng như peptone, glucose, K2HPO4 và MnSO4 trong quá trình lên men nồng độ cồn có sự thay đổi. 7. Kết cấu của đồ án Đồ án gồm 4 chương. . Chương 1: Tổng quan tài liệu Giới thiệu về bioethanol cũng như ưu và nhược điểm của các thế hệ hệ bioethanol hiện nay, các quá trình biến đổi nguồn nguyên liệu lignocellulose để lên men bioethanol từ nguồn vỏ cacao. Một số công trình nghiên cứu liên quan về quá trình lên men SHF và SSF. . Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Trình bày nội dung, sơ đồ hóa các bước thí nghiệm, cách bố trí thí nghiệm và các phương pháp tiến hành liên quan đến từng nội dung thí nghiệm. . Chương 3: Kết quả và bàn luận. Trình bày các kết quả đạt được trong suốt quá trình nghiên cứu. . Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về Bioethanol 1.1.1. Khái niệm . Ethanol Ethanol, hay còn gọi được gọi bằng các tên khác như rượu Etylic, cồn, Ethyl alcohol, Ethyl hydrate, Hydroxyethanol, là một chất hữu cơ thuộc dãy đồng đẳng của rượu no đơn chức, có công thức phân tử: C2H5OH hay C2H6O và có công thức cấu tạo: Ethanol có thể được sản xuất bằng các phương pháp tổng hợp hóa học và phương pháp sinh học. Ethanol được sản xuất theo phương pháp sinh học, được gọi là bioethanol. . Bioethanol Bioethanol hoặc đơn giản là “Ethanol sinh học” là một nguồn năng lượng tái tạo được tạo ra bằng cách lên men các thành phần đường có trong các phụ phẩm nông nghiệp thông qua hoạt động của nấm men hay các vật liệu có thể chuyển đổi thành đường như tinh bột hoặc cellulose từ thực vật nhờ tác dụng của enzyme, mà không tổng hợp bằng con đường hóa học. Quá trình lên men đường tạo thành bioethanol và carbon dioxide C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 Trong quá trình sản xuất bioethanol sinh học có thể phân thành 2 công đoạn là công đoạn lên men nhằm sản xuất bioethanol có nồng độ thấp và công đoạn làm khan để sản xuất bioethanol có nồng độ cao để phối trộn vào xăng. 1.1.2. Các thế hệ bioethanol Hiện nay dựa trên nguồn nguyên liệu sản xuất mà người ta chia bioethanol thành các thế hệ khác nhau và được trình bày trong bảng 1.1. 5
  15. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Các thế hệ bioethanol Tài liệu Đặc điểm Ưu điểm Nhược điểm tham khảo Được sản xuất Bioethanol Khủng hoảng từ cây trồng có thế hệ thứ Quá trình sản lương thực và hàm lượng [1] nhất xuất đơn giản. mất cẩn bằng đường và tinh lương thực bột cao. Nhiên liệu bền Chứa lignin là Bioethanol Sản xuất từ vững, chi phí một chất khó thế hệ thứ sinh khối thấp. phân hủy gây cản [1], [30] hai lignocellulose Thân thiện với trở quá trình sản của thực vật môi trường. xuất bioethanol Không chứa lignin Bioethanol Hàm lượng thế hệ thứ Sản xuất từ carbohydrate cao Khí thải CO [1] ba các loài tảo 2 ( 50% so với tổng khối lượng chất khô) 1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bioethanol trên thế giới và Việt Nam 1.1.3.1. Thế giới Bioethanol nhiên liệu được sản xuất tại 34 quốc gia trên 5 châu lục. Sản xuất chính được tập trung ở Mỹ (54 %) và Brazil (34 %). Mỹ sản xuất chủ yếu là từ ngô, Mỹ cũng đang đầu tư nhiều cho việc tăng sản lượng bioethanol, hiện chiếm 5 % khối lượng nhiên liệu bán ra ở Mỹ. Đồng thời dự kiến trong năm 2020 nước này sẽ cung cấp trên 28tỷ lít bioethanol và biodesel, chiếm 3,5 % lượng xăng dầu sử dụng [25]. Brazil sản xuất bioethanol từ mía đường, nước này có diện tích đất canh tác trồng mía cho sản xuất bioethanol lên đến gần 8 triệu ha, 450 nhà máy đường ở Brazil hầu hết đều sản xuất bioethanol. Ngành công nghiệp bioethanol ở Brazil nhận được nguồn lực tài chính khổng lồ và những chính sách công phù hợp, ưu đãi khiến cho sản phẩm xăng sinh học ở đây có sức cạnh tranh lớn nhất thế giới [25]. Phần còn lại được sản xuất tại các nước châu Âu, Australia, New Zealand và Đông Nam Á, đặc biệt là Trung Quốc, Thái Lan và Ấn Độ. 6
  16. Đồ án tốt nghiệp EU xếp vị trí thứ 3 về sản lượng bioethanol nhiên liệu sau Hoa Kỳ và Brazil. Nổi lên trong khu vực châu Á, Trung Quốc đang dần khẳng định và trở thành nước sản xuất bioethanol lớn trên thế giới với khoảng 2,1 tỷ lít đã được sản xuất vào năm 2012 (90 % từ ngô), có mục tiêu tăng trưởng đầy tham vọng trong tương lai cho bioethanol từ thế hệ thứ hai. Theo báo cáo từ Lux Research thì Chính phủ Trung Quốc đang hỗ trợ rất nhiều cho ngành công nghiệp nhiên liệu sinh học. Với bioethanol cao cấp (hay còn gọi là bioethanol cellulosic) hiện đang nhận mức trợ cấp lớn nhất là 1,400 RMB/tấn. Dự kiến năm 2020, Trung Quốc sẽ sản xuất thêm nhiên liệu sinh học tổng hợp (E10). Từ năm 2010 đã có 3 nhà máyở Nhật Bản sản xuất bioethanol (từ thân mía và rơm rạ lúa mì) và cả nước có trên 2,000 trạm bán xăng sinh học. Trộn 43 % cồn sinh học với 57 % khí thiên nhiên để tạo thành ethyl tert-butyl ether (ETBE), lại trộn với 90 % xăng để tạo thành xăng sinh học. Nhờ đó mà CO2 thải ra rất ít, có lợi lớn cho môi trường. Tại Ấn Độ một chương trình bioethanol dã kêu gọi người dân sử dụng xăng E5 trên cả nước, tiến tới sử dụng xăng E10 và E20. Trong khu vực Đông Nam Á, Thái Lan làqu ốc gia phát triển rất nhanh về sản xuất và sử dụng xăng pha cồn sản xuất từ phế phẩm của sắn, hạt ngô, cây ngô, đường, bã mía. Xăng E10 đã bán tại các trạm xăng ở Thái Lan từ năm 2003. Năm 2004, Thái Lan đã sản xuất trên 280.000 m3 cồn, đầu tư thêm 20 nhà máy để năm 2015 có trên 2,5 tỷ lít cồn dùng làm nhiên liệu. Bảng 1.2. Tổng sản lượng bioethanol hàng năm trên thế giới (đv triệu Gallon Mỹ) Quốc gia 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 USA 6,521 9,309 10,938 13,298 13,948 13,300 13,300 14,300 Brazil 5,019 6,472 6,578 6,922 5,573 5,577 6,267 6,190 Europe 570 734 1,040 1,209 1,168 1,179 1,371 1,445 China 486 502 542 542 555 555 696 635 Canada 211 238 291 357 462 449 523 510 Các nước 315 389 914 985 698 752 1,272 1,490 khác Thế giới 13,123 17,644 20,303 23,311 22,404 21,812 23,429 24,570 “Nguồn: F.O. Licht, cited in Renewable Fuels Association,Bioethanol Industry Outlook 2008-2014” 7
  17. Đồ án tốt nghiệp Theo tổ chức FAO cho biết đến năm 2022, sản lượng bioethanol thế giới dự báo tăng khoảng 70 % so với mức trung bình của giai đoạn 2010 - 2012 và tăng khoảng 4 % /năm đạt mức 168 tỷ lít. Ba quốc gia sản xuất bioethanol chính vẫn là Hoa Kỳ, Brazil và Châu Âu. Tính đến năm 2022, nguyên liệu đầu vào để sản xuất nhiên liệu sinh học dự kiến tăng như sau: mía đường – 29 %, dầu thực vật – 15 % và ngũ cốc thô – 12 %. Tại Hoa Kỳ, tổng sản lượng nhiên liệu sinh học theo yêu cầu của chính phủ sẽ được duy trì lên tục trong suốt kỳ dự báo, theo đó 40 % tổng sản lượng ngô sẽ được sử dụng để sản xuấtbioethanol . Lượng xe hơi lưu hành tại Brazil gia tăng đồng nghĩa với nhu cầu sử dụng nhiên liệu tăng, trong đó có bioethanol. Dự báo đến năm 2022, sản lượng bioethanol sinh học của các nước đang phát triển tăng khoảng 2/3, tróng đó Brazil chiếm 80 % và 20 % còn lại thuộc về Ấn Độ và Trung Quốc. Gần 50 % lượng bioethanol do Ấn Độ và Trung Quốc sản xuất sẽ được tiêu thụ tại thị trường trong nước. Sản lượng bioethanol của Ấn Độ đến năm 2022 dự kiến sẽ tăng gấp đôi, với nguyên liệu chính từ mật đường. Bioethanol tại Trung Quốc chủ yếu được sản xuất từ sắn và lúa miến trong khi ngô bị hạn chế sử dụng cho mục đích công nghiệp vì vấn đề an ninh lương thực (xem hình 1.1). Hình 1.1. Thị phần sản xuất bioethanol sinh học trên thế giới. Sản lượng tính theo giá trị % của các nước trong năm 2022 [31]. 8
  18. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.2. Việt Nam Nhiên liệu sinh học đã được các nhà khoa học chú ý đến từ những năm cuối của thế kỷ 20 và cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu điều chế bioethanol sinh học, một số ít được ứng dụng trong thực tiễn còn lại vẫn chưa được áp dụng nhiều. Một số nghiên cứu còn bỏ ngỏ, chỉ là việc làm tự phát và kết quả chỉ mang tinh định hướng hoặc học thuật. Từ sau năm 2000 đã có một số xí nghiệp, công ty, đơn vị nghiên cứu tổ chức sản xuất nhiên liệu sinh học dưới dạng pilot như công ty Minh Tú (Cần Thơ), ĐH Bách khoa TP Hồ Chí Minh, Viện Hóa Công Nghiệp Hà Nội, Viện khoa học Vật liệu Ứng dụng TPHCM được dư luận quan tâm. Từ đó các khái niệm sản xuất nhiên liệu sinh học, bioethanol cũng dần rõ ràng và cụ thể hơn. Ngày 20/11/2007, "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025" đã được Thủ tướng Chính phủ ký quyết định số177/2007/QĐ- TTG với mục tiêu phát triển năng lượng, một dạng năng lượng mới, tái tạo được thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần bảo đảm an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường. Đến năm 2015, sản lượng bioethanol sinh học và dầu thực vật đạt 250 nghìn tấn, đáp ứng 1 % nhu cầu xăng dầu của cả nước. Và tầm nhìn đến năm 2025, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học ở nước ta đạt trình độ tiên tiến trên thế giới. Sản lượng bioethanol và dầu thực vật đạt 1,8 triệu tấn, đáp ứng khoảng 5 % nhu cầu xăng dầu của cả nước [28]. Để thực hiện chiến lược này, PetroVietNam dự kiến từ 2011 đến 2015 sẽ đưa 3 nhà máy bioethanol sinh học ở Quảng Ngãi, Phú Thọ, Bình Phước vào hoạt động với tổng công suất 230,000 tấn/năm và từ sản phẩm này sẽ pha thành nhiên liệu E5 - E10, đápứ ng khoảng 20 % tổng nhu cầu tiêu thụ xăng sinh học cả nước. Theo TS. Nguyễn Phú Cường, Phó Vụ trưởng Vụ KH&CN Bộ Công Thương cho biết tính đến tháng 3/2012, cả nước có 5 nhà máy sản xuất bioethanol nhiên liệu đi vào hoạt động ổn định với công suất thiết kế đạt khoảng 435,000 triệu lít bioethanol/năm (bảng 1.3). Trong số 4 nhà máy đang hoạt động mới chỉ có 03 nhà máy của Công ty CP Đồng Xanh, Cty TNHH Tùng Lâm và Công ty CP Nhiên liệu 9
  19. Đồ án tốt nghiệp sinh học miền Trung là sản xuất được bioethanol nồng độ 99,5 % đạt tiêu chuẩn để pha xăng sinh học. Sản phẩm được tiêu thụ trong nước khoảng 20 % để phối trộn xăng E5 và bán theo hệ thống phân phối của Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam (PVN). Phần còn lại khoảng 80 % sản lượng sản xuất trong năm 2011 được xuất khẩu cho các nước như Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippine ở dạng 99,5 % và 96 % bioethanol. Sản xuất nhiên liệu sinh học bioethanol ở Việt Nam cũng được nhiều đối tác nước ngoài rất quan tâm. Đáng chú ý trong số này là các Dự án JICA - Nhật Bản hỗ trợ Việt Nam nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học sử dụng các loại phế phẩm bã mía, rơm rạ, dự án do Chính phủ Hà Lan tài trợ sử dụng trấu, vỏ cà phê, trái điều, vỏ điều, rong biển; chương trình tổng thể về nghiên cứu và phát triển nhiên liệu sinh học ở Việt Nam của Hàn Quốc sản xuất diesel sinh học và các hóa chất tinh khiết thân thiện với môi trường từ dầu thực vật. Bảng 1.3. Danh sách nhà máy bioethanol sinh học đang sản xuất Công suất Tình trạng TT Tên nhà máy Địa điểm thiết kế hoạt động Nhà máy sản xuất 130 triệu Đại lộc, 1 Bioethanol nhiên liệu – Đang sản xuất lít/năm Quãng Nam Cty CP Đồng Xanh Nhà máy sản xuất 70 triệu Đồng Nai 2 Bioethanol nhiên liệu – Đang sản xuất lít/ năm Cty TNHH Tùng Lâm Lô CN5 khu Nhà máy sản xuất 70 triệu CN Tâm 3 Bioethanol – Cty TNHH Đang sản xuất lít/ năm Thắng, Đăk Đại Việt Nông. Nhà máy sản xuất 65 triệu 4 Bioethanol Đăk Tô – Kon Kon Tum Đang sản xuất lít/ năm Tum Nhà máy sản xuất Khu kinh tế Bắt đầu sản bioethanol sinh học Dung 100 triệu Dung Quốc, xuất vào tháng 5 Quất ( Cty CP Nhiên liệu lít/năm Bình Sơn, 2/2012 sinh học miền Trung) Quãng Ngãi. “Nguồn: Khoa học và công nghệ, số– 9 08/2012” 10
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Lợi ích, hạn chế và ứng dụng của Bioethanol Bioethanol có một vài lợi ích và hạn chế như: 1.1.4.1. Lợi ích . Về môi trường Bioethanol có nguồn gốc từ thực vật không đóng góp vào quá trình phát thải CO2 - khí nhà kính. Hàm lượng các khí thải độc hại khác như CO, SOx, hydrocarbon đều giảm đi đáng kể khi sử dụng năng lượng sinh học. . Nguồn nhiên liệu tái sinh Các nhiên liệu này lấy từ hoạt động sản xuất nông nghiệp và có thể tái sinh. Tránh sự lệ thuộc vào nguồn tài nguyên nhiên liệu không tái sinh truyền thống. . Tăng hiệu suất cho xăng và chống cháy nổ. Bioethanol có chỉ số octan là 113, cao hơn so với xăng khoảng 83 -95 lần. Chỉ số này cao đồng nghĩa việc hạn chế được hiện tượng tự phát nổ, xảy ra trước khi đánh lửa, sẽ làm hại động cơ. Mặt khác, nó không chứa các chất khác độc hại như chì. . Phát triển kinh tế nông nghiệp. Việc tận dụng các nguồn phế phẩm, phụ phẩm trong nông nghiệp làm tăng giá trị của nông sản. . Bảo đảm an ninh năng lượng Sử dụng bioethanol làm nhiên liệu thay thế nhiên liệu truyền thống giúp các quốc gia chủ động về nguồn năng lượng hơn so với nguồn nhiên liệu hoá thạch đang dần cạn kiệt. 1.1.4.2. Hạn chế của Bioethanol Hạn chế chủ yếu của bioethanol khi làm nhiên liệu là tính hút ẩm. Bioethanol có khả năng hút ẩm và hòa tan vô hạn trong nước cao nên cần phải được tồn trữ và bảo quản đặc biệt. . Về mặt kỹ thuật Do nhiệt trị của bioethanol (PCIbioethanol = 26,8 MJ/kg) và các loại ancol khác đều thấp hơn so với xăng (PCIxăng = 42,5 MJ/kg) nên khi dùngbioethanol để pha trộn 11
  21. Đồ án tốt nghiệp vào xăng sẽ làm giảm công suất động cơ so với khi dùng xăng. Tuy nhiên sự giảm công suất này là không đáng kể nếu ta pha với số lượng ít. Mặt khác, để sử dụng được xăng có nồng độ ethanol cao, một số xe cần phải cải biến. . Khả năng phát triển Tại thời điểm hiện tại, công nghệ sản xuất cồn sinh học từ các nguồn biomass như lignocellulose chưa đạt được hiệu suất tốt và giá thành còn cao. 1.1.4.3. Ứng dụng Bioethanol chủ yếu được ứng dụng trong pha chế xăng sinh học, có thể được sử dụng dưới dạng nguyên chất (E100) hoặc pha với xăng có nguồn gốc dầu mỏ ở bất kì tỷ lệ nào để chạy động cơ xăng. Nếu tỷ lệ pha trộn dưới 10 % bioethanol thì không cần thay đổi các động cơ xe thông thường. Bioethanol là nhiên liệu có chỉ số octan cao và đã thay thế chì như một chất tăng chỉ số octan trong xăng dầu. Bằng cách pha trộn bioethanol với xăng, đốt cháy hoàn toàn hơn và giảm lượng khí thải gây ô nhiễm. 1.1.5. Nguồn nguyên liệu lignocellulose Sinh khối lignocellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, bao gồm các polysaccharide chủ yếu là cellulose, hemicellulose (xylan) và lignin, trong đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 35 % đến 50 % khối lượng khô thực vật, còn hai hợp chất, hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20 – 30 % và 5 - 20 % khối lượng khô của cơ thể thực vật (xem hình 1.2). Trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như lignin. Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hóa trị với nhau. Cellulose là một chuỗi polysaccharide dài gồm các đơn vị D-glucose, liên kết bằng β-1,4 glycoside, cấu trúc của nó có phần tinh thể và những phần vô định hình. Hemicellulose là một mạng lưới polyme phức tạp, phân nhánh và không đồng nhất, có chứa đường 5 carbon như xylose và arabinose, 6 carbon như glucose, mannose và galactose. Nó có trọng lượng phân tử thấp hơn cellulose và vai trò của nó là để kết nối các sợi lignin và cellulose. 12
  22. Đồ án tốt nghiệp Lignin là một polymer vô định hình do các hợp chất phenolic khác nhau tạo thành và là thành phần chính của thành tế bào thực vật. Nó giữ cho sợi cellulose và hemicellulose liên kết với nhau, tăng độ cứng vững và chống thấm cho tế bào. Hình 1.2. Thành phần của lignocelluloses. 1.2. Quá trình biến đổi bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose. Quá trình biến đổi bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose được trình bày tóm lược trong hình 1.3. Về nguyên tắc, quá trình lên men bioethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa cellulose cũng giống như từ tinh bột hay rỉ đường. Bao gồm bốn bước cơ bản: . Tiền xử lý nguyên liệu. . Thủy phân nguyên liệu. . Lên men bioethanol. Tinh chế sản phẩm (chưng cất, tách nước, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy vào nồng độ cồn mà có phương pháp tinh chế khác nhau. Chủ yếu dựa vào kỹ thuật công nghệ hóa học nên trong giới hạn của đề tài xin được không trình bày phần này. 13
  23. Đồ án tốt nghiệp Lignin Cellulos e Hemicellulos e Tiền xử lý Lignin Cellulases Hemicellulases Thủy phân SSF Đường 5C và 6C Lên men Chưng cất Bioethanol Hình 1.3. Sơ đồ chuyển đổi sinh khối lignocelluolose thành bioethanol. 1.2.1. Quá trình tiền xử lý Thành phần của nguyên liệu lignocellulose chứa chủ yếu là cellulose, lignin và hemicellulose. Để chuyển hóa các chất carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose thành bioethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa nên bước tiền xử lý là bắt buộc. Tiền xử lý sẽ thay đổi cấu trúc và kích thước của sinh khối, cũng như thành phần hóa học của nó, sao cho quá trình thủy phân các hydrocarbon thành các loại đường đơn diễn ra nhanh chóng và đạt hiệu quả cao. Mục đích: - Loại bỏ lignin và hemicellulose, giảm kích thước vi sợi cellulose - Tăng vùng vô định hình của cellulose 14
  24. Đồ án tốt nghiệp - Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi biomass - Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose đối với cellulose. Các phương pháp tiền xử lý : . Các phương pháp tiền xử lý cơ ọh c. Các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lý. Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi . Trong đó phương pháp nổ hơi là phương pháp đã được phát triển, áp dụng trên quy mô pilot. . Các phương pháp tiền xử lý hóa học. Sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình tiền xử lý. Một số phương pháp tiền xử lý bằng hóa chất được trình bày trong bảng 1.4. Có khá nhiều phương pháp tiền xử lý, thường dùng nhất là phương pháp hóa học sử dụng base, acid vô cơ, đôi khi kết hợp phương pháp hóa học với phương pháp vật lý: Sử dụng acid kết hợp với nhiệt độ, Phương pháp hiệu quả trên một lượng cơ chất lớn, đáp ứng khá đầy đủ các yêu cầu như tăng độ xốp, giảm kết tinh, giảm độ trùng hợp, hòa tan lignin và đường hóa hemicelluloses. Tuy nhiên, phương pháp này cũng để lộ khá nhiều nhược điểm (bảng 1.5) cần được trung hòa và loại độc dịch trước khi lên men. 15
  25. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4.Các phương pháp tiền xử lýhóa học Phương pháp Đặc điểm Ưu điểm Nhược điểm tiền xử lý Hơi nước bão hòa áp suất cao và giảm Bằng hơi (có Hiệu quả đối với áp 160-2600C Phân hủy Xylan H SO , SO , nguyên liệu thân 2 4 2 (0,7- 4,8Mpa). Ức chế vi sinh vật CO ) gỗ cứng 2 - Thời gian < 10 phút Năng suất cao đối H SO , HCl, Sử 2 4 với xylan thành Ăn mòn thiết bị. dụng acid loãng xylose. Độc tố Với Acid hoặc nồng độ thấp Hòa tan tốt lignin. Khó thu hồi acid Điều kiện trung Không tạo ra các Khá đắt bình. chất ức chế. Thủy phân tốt liên NaOH, Ca(OH) , kết giữa lignin và Khó thu hồi kiềm Với Kiềm 2 NH3, hemicellulose/cellu Độc hại lose Etylen glycol, Khó thu hồi dung Dung môi hữu MeOH, EtOH, Năng suất xylose môi. cơ aceton với HCl cao. Khá đắt hoặc H2SO4, Chất lỏng họ Hòa tan cellulose Chất lỏng ion Khá đắt Imidazolium, Tái sử dụng “Nguồn: Alessandra Verardi, 2012” Bảng 1.5. Những thuận lợi và bất lợi của phướng pháp tiền xử lý bằng acid vô cơ Tài liệu tham Thuận lợi Bất lợi khảo Hoạt động ở Sử dụng nhiều acid Acid nhiệt độ thấp. Ăn mòn thiết bị đặc Năng suất đường Tốn kém cho việc thu hồi acid. cao Thời gian phản ứng dài Taherzadeh và Hoạt động ở nhiệt độ cao. Karimi ( 2007) Sử dụng ít acid Hiệu suất đường thấp Acid Thời gian phản Ăn mòn thiết bị loãng ứng ngắn Hình thành các sản phẩm không mong muốn. 16
  26. Đồ án tốt nghiệp . Pháp tiền xử lý sinh học Bảng 1.6. Các phương pháp tiền xử lý sinh học Phương pháp Đặc điểm Ưu điểm Nhược điểm tiền xử lý Phân hủy lignin Ức chế vi sinh Nấm nâu, nấm hiệu quả vật Sinh học mục trắng, Yêu cầu năng Mất cellulose và lượng thấp năng suất thấp 1.2.2. Quá trình thủy phân. Ở quá trình thủy phân, đường đơn sẽ được tạo ra bằng việc phân cắt các mắc xích của cellulose, trước khi chúng được lên men sản xuất rượu. Các phương pháp thủy phân: . Thủy phân bằng acid ( acid đặc hoặc acid loãng) Quá trình thủy phân theo các bước sau: Bước 1: Acid xâm nhập vào mạng lưới các vi sợi biomass. Bước 2: Xúc tác quá trình thủy phân. Bước 3: Giới hạn quá trình thủy phân. . Thủy phân bằng enzyme Các giai đoạn enzyme tác dụng lên cellulose: Bước 1: Hấp phụ enzyme lên bề mặt cellulose. Bước 2: Enzyme thủy phân cellulose giải phóng glucose. 1.2.3. Quá trình lên men 1.2.3.1. Các phương pháp lên men Trong quá trình lên men, các sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm đường hexose (glucose, mannose và galactose) và pentose (xylose và arabinose) sẽ được lên men thành bioethanol nhờ nấm men S. cerevisiae , tổ hợp nhiều loại nấm men hoặc vi khuẩn (Zymomonas mobilis). Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử diễn ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme. Cho nên, người ta gọi quá trình lên men là quá trình oxy hóa sinh học. 17
  27. Đồ án tốt nghiệp Bước cuối để biến đổi sinh khối lignocellulose thành bioethanol có thể được thực hiện một cách độc lập (SHF) hoặc đồng thời (SSF) (Xem bảng 1.7)  Phương pháp thủy phân và lên men riêng lẻ (SHF). Các sản phẩm thủy phân sẽ được lên men để sản xuất bioethanol trong một quá trình riêng. Ưu điểm: - Hai quá trình thủy phân và lên men tách biệt nhau nên có thể được tối ưu hóa riêng, không phụ thuộc vào nhau. Nhược điểm: - Sự tích tụ các chất ức chế cản trở hoạt động của enzyme thủy phân cellulose và glucose. Điều này làm cho quá trình biến đổi kém hiệu quả, và gây tốn kém (phải bổ sung thêm một lượng lớn enzyme). - Dễ nhiễm các vi sinh vật khác do thời gian ủ dài ở quá trình thủy phân.  Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF) Các sản phẩm cuối của quá trình thủy phân sẽ được trực tiếp chuyển đổi thành bioethanol ngay nhờ vi sinh vật. Ưu điểm: - Tăng tỉ lệ thủy phân và giảm sự ức chế ngược khi sản phẩm tạo thành. - Giảm lượng enzyme dùng cho quá trình. - Cho hiệu suất bioethanol cao. - Đòi hỏi điều kiện vô trùng thấp. - Thời gian ngắn. Nhược điểm: - Cần phải chọn được điều kiện nhiệt độ và pH gần với điều kiện tối ưu của mỗi quá trình riêng. - Bioethanol tạo thành sẽ quay lại ức chế cellulase làm cho lượng bioethanol thu được không cao. - Cơ chất thủy phân không hoàn toàn nên lượng đường do cellulase tạo ra chỉ đủ để cho nấm men tăng trưởng hơn là việc lên men đường sinh bioethanol. 18
  28. Đồ án tốt nghiệp  Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời sử dụng kết hợp nhiều chủng vi sinh vât (SSCF) Nói chung, việc sản xuất bioethanol từ nguồn cellulose bao gồm ba bước như đường hóa các thành phần của cellulose, lên men hexose, và lên men pentose. Các quá trình này được kết hợp với nhau để đơn giản hóa các bước và tăng cường sản lượng bioethanol. SSF là quá trình đồng thời đường hóa các thành phần của cellulose và lên men hexose nhưng không diễn ra quá trình lên men pentose. CF là đồng lên men của hexose và pentose. Như vậy SSCF là quá trình cùng lúc đường hóa các thành phần của cellulose và lên men đường 5 carbon và 6 carbon nhờ nhiều chủng vi sinh vật. Các vi sinh vật thường được áp dụng để sản xuất bioethanol sinh học không thể sử dụng tất cả các nguồn đường có nguồn gốc từ quá trình thủy phân. Ví dụ S. cerevisiae không thể sử dụng pentose, và điều này sẽ làm lãng phí sinh khối và làm giảm sản lượng bioethanol sinh học. Do đó trong SSCF sẽ sử dụng kết hợp các chủng vi sinh có khả năng sử dụng đường5 carbon và chủng có khả năng sử dụng đường 6 carbon. Ưu điểm: - Cải tiến của phương pháp SSF. - Chi phí thấp, thời gian xử lý ngắn, giảm nguy cơ ô nhiễm và tác dụng ức chế ít - Hiệu suất lên menbioethanol cao và lên men được cả đường5 carbon và 6 carbon. Nhược điểm: - Nhiệt độ cho quá trình thủy phân enzyme và lên men bioethanol khác nhau đáng kể, làm cho việc tối ưu hóa đồng thời hai hoạt động rất khó. - Quá trình SSCF phải được vận hành ở nhiệt độ thấp hơn để phù hợp tăng trưởng của vi khuẩn và lên men bioethanol. 19
  29. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.7. Các quá trình lên men Quá trình Đặc điểm Ưu điểm Nhược điểm Thủy phân và lên men Tác dụng ức chế Thủy phân và lên SHF diễn ra ở điều kiện tối men riêng lẻ Dễ nhiễm vi sinh vật ưu khác Sử dụng ít enzyme. Hoặc là thủy phân hoặc lên men có thể Sản lượng bioethanol Thủy phân và lên được thực hiện trong SSF cao. men đồng thời điều kiện tối ưu. Ít tác dụng ức chế. Khó khăn trong việc Chi phí thấp hơn. kiểm soát quá trình. Kết hợp những ưu điểm của SHF và Sản lượng bioethanol Sử dụng enzyme SSCF sinh học cao. nhiều SHCF Thủy phân riêng lẻ Thủy phân và lên men Gia tăng nguy cơ ô và lên men kết hợp diễn ra ở điều kiện tối nhiễm. nhiều chủng nấm ưu Tác dụng ức chế. men. Thời gian quá trình Sử dụng enzyme Thủy phân và lên ngắn hơn nhiều men đồng thời kết Sản lượng bioethanol SSCF Hoặc là thủy phân hợp nhiều chủng sinh học cao hoặc lên men có thể nấm men Nguy cơ ô nhiễm ít được thực hiện trong hơn điều kiện tối ưu 1.2.3.2. Các giống vi sinh vật trong lên men bioethanol. Nấm men là đối tượng chủ yếu trong lên men rượu nói chung. Tế bào nấm men có dạng hình ovan, sinh sản bằng cách nảy chồi hay tạo bào tử, sống kị khí không bắt buộc, có khả năng lên men các loại đường khác nhau. Trong điều kiện hiếu khí, nấm men oxy hóa hoàn toàn đường thành CO2 và H2O, gia tăng sinh khối, ngược lại trong điều kiện kị khí, nấm men sẽ không tăng sinh khối vì không tổng hợp được sterol cần cho cấu trúc tế bào, nấm men tiến hành lên men đường để thu năng lượng. Không giống như đường và nguyên liệu tinh bột thông thường, khi thủy phân sinh khối lignocellulose sẽ cho số lượng đáng kể các loại đường pentose như xylose và arabinose, ngoài ra còn có đường hexose như glucose, mannose và galactose. 20
  30. Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, nhiều loại nấm men như Saccharomyces cerevisiae không thể lên men các loại đường pentose thành bioethanol hiệu quả. Nếu chỉ đường hexose từ sinh khối lignocellulose được lên men, với các loại đường pentose bỏ lại phía sau, thì việc tiêu thụ nguyên liệu cho sản xuất bioethanol sinh học sẽ bị hạn chế, cho hiệu suất thấp và gây lãng phí nguồn nguyên liệu.  Nấm men và vi khuẩn sừ dụng đường 6 carbon để lên men. Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mì. Đây là một loại vi sinh vật thuộc chi Saccharomyces, lớp nấm nang (Ascomycetes), ngành nấm. Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay. Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu và bia. Trong quá trình thủy phân cellulose có tạo ra đường 5 carbon - xylose thì chủng men Saccharomyces cerevisiae không thể sử dụng để lên men tạo bioethanol nên hiệu suất tạo bioethanol không cao. Vi khuẩn Zymomonas mobilis là vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi có thể lên men glucose thành bioethanol và CO2. Ngoài ra, Z. mobilis có thể chịu được nồng độ cao như 120 g/L bioethanol, cao hơn nhiều so với các vi khuẩn khác, và sinh khối của nó thường được công nhận là an toàn (GRAS) cho thức ăn gia súc, làm cho loài này thích hợp cho kỹ thuật chuyển hóa với khả năng lên men pentose.  Nấm men và vi khuẩn sừ dụng đường 5 carbon để lên men. Nấm menPichia amomala thuộc họ nấm menvà có khả năng sử dụng glucose và xylose để chuyển hóa thành bioethanol tăng hiệu suất cho quá trình lên men. 21
  31. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Giới thiệu về cây Cacao 1.3.1. Tên khoa học của cây cacao Theo phân loại của hệ thống APG II thì cây cacao thuộc phân họByttnerioidea e của họ Cẩm quỳ (Malvaceae). Giới (regnum): Plantae Bộ (ordo): Malvales Họ (familia): Malvaceae Phân họ (subfamilia): Byttnerioideae Chi (genus): Theobroma Loài (species): T. cacao Danh pháp hai phần: Theobroma cacao L. 1.3.2. Thành phần và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái cacao Những nghiên cứu khoa học đã và đang được thực hiện đều hướng đến sự phát triển bền vững của xã hội. Một trong những sự phát triển bền vững đó là sử dụng nguồn cung cấp đường từ vỏ cacao chuyển hóa vi sinh để tạo ra bioethanol sinh học. Điều đó sẽ giải quyết các vấn đề về ô nhiễm môi trường và chất thải nông nghiệp. Bảng 1.8. Thành phần vỏ cacao khô Thành phần Trung bình (% trọng lượng khô) Celluloses 35,4 ± 0,33 Hemicelluloses 37,0 ± 0,50 Lignin 14,7 ± 0,35 Tro 12,3 ± 0,23 “Nguồn:Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2013”. 22
  32. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cacao ở nước ta. Cây cacao đã du nhập vào Việt Nam từ lâu và được trồng rải rác ở nhiều vùng địa lý khác nhau từ đồng bằng sông Cửu Long đến cao nguyên Nam Trung bộ. Vì nhiều lý do khác nhau, trước đây cacao ở Việt Nam chưa bao giờ được trồng đến quy mô lớn. Vào thập niên 80, với sự khuyến khích của Nhà Nước, cacao được trồng rộng rãi ở các tỉnh miền Trung và miền Nam. Tuy nhiên vào thời điểm đó, các doanh nghiệp Nhà Nước hỗ trợ cho chương trình này không xây dựng được một kênh thu mua và thị trường cho sản phẩm nên toàn bộ ngành sản xuất cacao đã sụp đổ. Năm 2005, Ban Điều phối Phát triển Cacao Quốc gia được Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành lập nhằm giúp Bộ định hướng phát triển cho ngành cacaoViệt Nam. Cũng trong năm 2005, Bộ KH và CN cũng đã ban hành Tiêu chuẩn hạt cacao Việt Nam nhằm giúp người sản xuất có cơ sở để sản xuất hạt cacao chất lượng cao. Năm 2006, lần đầu tiên 8 dòng cacao thương mại trong bộ giống do Trường Đại học Nông lâm TP.HCM khảo nghiệm được Bộ NN và PTNT công nhận và cho phép trồng rộng rãi trên toàn quốc. Đây là 2 sự kiện có ý nghĩa về mặt pháp lý để cacao trở thành cây trồng chính trong hệ thống canh tác ở Việt Nam. Việt Nam có hơn 20500 ha cacao, trong đó gần 7000 ha thu hoạch, sản lượng trên 4800 tấn/năm. Có 15 tỉnh trồng Cacao, chủ yếu là vùng đồng bằng sông Cửu Long (Bến Tre, Tiền Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Cần Thơ), Đông Nam Bộ (Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình phước, Bình Thuận), Tây Nguyên ( Đắc Lắc, Đắc Nông, Lâm Đồng, Gia Lai) và một số tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ. Trong đó, Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích cây Cacao lớn nhất (khoảng 12,100 ha), Tây Nguyên (4,500ha), Đông Nam bộ (3,400 ha). Cacao Việt Nam cho năng suất hơn 7 tạ hạt/ha, mỗi vụ cho sản lượng khoảng 4,900 tấn/ha. Gần đây, đầu ra của hạt cacao Việt Nam rất thuận lợi, có hàng chục doanh nghiệp trong và ngoài nước chuyên thu mua với giá trên 50 nghìn đồng/kg. Đặc biệt, cả nước có hơn 600 hộ dân trồng 541 ha cây cacao đạt tiêu chuẩn UTZ (tiêu chuẩn Quốc tế chứng 23
  33. Đồ án tốt nghiệp nhận sản xuất tốt). Trong năm 2011, cả nước đã xuất khẩu được 240 tấn hạt cacao, đạt kim ngạch xuất khẩu 520 nghìn USD. So với nhiều loại cây ăn quả khác, cacao dễ trồng, thích nghi với nhiều loại đất khác nhau, thường thì sau 18 tháng trồng cây cacao bắt đầu cho trái. Tiền Giang có 5 huyện là: Chợ Gạo, Gò Công Tây, Tân Phú Đông, Châu Thành và thành phố Mỹ Tho đã trồng loại cây này và đang phát huy hiệu quả. Giữa tháng 11/2011, 147 ha cây cacao của các nhà vườn tại huyện Chợ Gạo được tổ chức HELVETAS (Thụy sĩ) cấp giấy chứng nhận UTZ. Theo kế hoạch phát triển cacao thì đến năm 2015 diện tích cacao của cả nước sẽ là 60,000 ha với sản lượng hạt khô khoảng 52,000 tấn và đến năm 2020 diện tích sẽ đạt 80,000 ha, sản lượng 108,000 tấn. Tuy nhiên, tính đến tháng 11/2009, cả nước mới chỉ trồng được 12,207.6 ha cacao tại 17 tỉnh ở Miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên với sản lượng hàng năm khoảng 1,000 tấn. Các tỉnh trồng nhiều cacao hiện nay là Bến Tre 4,900 ha, Đăk Lăk 1,483 ha, Bình Phước 1,360 ha, Tiền Giang 1,335.7 ha Hiện nay, lượng vỏ trái cacao sau khi thu hoạch hạt một phần được nông dân làm thức ăn cho gia súc, phơi khô để đốt, một phần được bón lại trực tiếp cho cây cacao còn phần lớn được thải bỏ ra ngoài sông, là nguồn gây ô nhiễm môi trường rất lớn. Với khối lượng vỏ chiếm khoảng 60 % khối lượng trái cacao, thì đây là một lượng nguyên liệu rất lớn nếu ta biết tận dụng để sản xuất các sản phẩm như thức ăn gia súc, phân bón hữu cơ hay sử dụng vỏ cacao để chuyển hóa thành rượu bioethanol sử dụng làm nhiên liệu sinh học là tiềm năng tương lai cho ngành năng lượng xanh ở nước ta khi bước tới trở thành một nước phát triển. 1.4. Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới Tình hình nghiên cứu về biothenol từ các nguồn nguyên liệu khác nhau trên thế giới được trình bày trong bảng 1.9 24
  34. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.9. Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới Tài PP liệu Năm Tác giả Đối tượng lên Kết quả tham men khảo Bioethanol theo SHF: Pilanee SHF 21,21 % trọng lượng 2011 Vaithanomsat Vỏ dừa và khô. [18] và cộng sự SSF Bioethanol theo SSF: 20,67 %. G.Lalitha, Vỏ trái cây 2011 Rajeshwari SHF 330 mg/L [10] hỗn hợp Sivaraj Bioethanol đạt Dứa 1,87 Jayant % (v/v) Vỏcam, 2012 Mishra và SSF Cam 1,32 % (v/v) [13] chanh, dứa cộng sự Chanh 1,46 % (v/v) Rakesh 2013 Koppram và Lõi ngô SSCF 4% (w/v) bioethanol [19] cộng sự J. Itelima và Bioethanol đạt 7,45 % 2013 Vỏ chuối SSF [12] cộng sự (v/v) Ibrahim Vỏ cây Nasser Melaleuca Nồng độ bioethanol từ 2013 SSF [11] Ahmed và leucadendr 43,7 – 63,2 g/l cộng sự on Manas Ranjan 2013 Swain, Jyoti Bột khoai Bioethanol thu được 172 SSF [15] Mishra and tây g / kg chất khô. Hrudayanath Thatoi Alessia Bioethanol đạt 3,9 % 2014 Tropea và Vỏ dứa SSF [ 8 ] (v/v) cộng sự Shubhra Quả hồng Bioethanol đạt 9,4% 2014 Tiwari và SSF [21] xiêm (v/v) cộng sự Masahide Hiệu suất bioethanol là 2014 Yasuda và Cỏ Napie SSCF [16] 74% cộng sự 25
  35. Đồ án tốt nghiệp 1.5. Giới thiệu về nấm men Saccharomyces cerevisiae 1.5.1. Phân loại khoa học Giới: Fungi. Ngành: Ascomycota Phân ngành: Saccharomycotina Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Giống: Saccharomyces Loài: S.cerevisiae Danh pháp hai phần: Saccharomyces cerevisiae 1.5.2. Đặc điểm hình thái Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thuớc từ 5 - 6 µm đến 10-14 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử. Nguồn dinh dưỡng carbon chủ yếu của chúng là đường glucose, galactose, saccharose, maltose. Chúng sử dụng acid amin và muối amon như nguồn nitơ chính. Saccharomyces cerevisiae có đặc điểm: Nấm men chỉ phát triển trong môi trường lên men, cường lực lên men rất nhanh và mãnh liệt. Đặc điểm nổi bậc của nấm men này là sinh ra nhiều khí CO2, một số giống Saccharomyces có chứa enzyme α - galactosidase nên lên men hoàn toàn đường rafinose, còn đối với một số khác thì một số ít chủng có khả năng chuyển hóa đường rafinose thành CO2 và H2O và chỉ chuyển hóa được 1/3 đường rafinose. Hình 1.4. Nấm men Saccharomyces cerevisiae 26
  36. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện đề tài: từ 25/5/2015 đến ngày 15/8/2015. Địa điểm: Phòng thí nghiệm nhiên liệu sinh học và Biomass, trường ĐH Bách Khoa TP.HCM. 2.2. Đối tượng nghiên cứu Các nghiên cứu được thực hiện trên nguyên liệu vỏ cacao, được cung cấp bởi Hợp tác xã cacao Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang. Cacao được chọn là trái đã chín, vỏ cacao tươi được sấy khô rồi nghiền nhỏ, sàng thu dạng bột để tiến hành lên men tạo bioethanol. 2.3. Vật liệu nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu  Vi sinh: Saccharomyces cerevisiae trong bộ sưu tập ATCC của Hoa Kỳ.  Enzyme: Viscozym cassava của công ty BrennTag cung cấp.  Hóa chất: - H2SO4 - Acid oxalic - Sodium Hydroxide NaOH - D-glucose - Thuốc thử DNS - Peptone - Thuốc thử Anthrone - Agar - Cồn  Môi trường hoạt hóa và nhân giống nấm men Sabouraud’s Dextrose Broth (SDB): - D-glucose: 40g - Peptone: 10g - Nước cất: 1000 mL  Môi trường nuôi cấy nấm men Sabouraud’s Dextrose Agar (SDA) - D-glucose: 40g - Argar: 22g - Peptone: 10g - Nước cất: 1000 mL. 27
  37. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Dụng cụ và thiết bị Thiết bị dùng trong nghiên cứu: - Nồi hấp tiệt trùng Autoclave - Nồi đun - Tủ sấy - Máy xay cầm tay - Tủ lạnh - Brix kế - Máy đo quang phổ UV-vis - Cồn kế - Cân kỹ thuật - Máy sắc kí cột lỏng HPLC - Máy khuấy - Bếp khuấy từ. Dụng cụ dùng trong nghiên cứu: - Bình định mức 50 mL. - Ống đong 25 mL. - Bình định mức 100 mL. - Pipet 20 mL. - Bình định mức 500 mL. - Pipet 10 mL. - Bình định mức 1000mL. - Pipet 1 mL. - Erlen 100 mL. - Pipet bầu 3mL. - Erlen 250 mL. - Micropipet 1000µL, 100µL. - Becher 100 mL. - Cuvet. - Becher 250 mL. - Chai thủy tinh. - Becher 500 mL. - Đũa thủy tinh. - Ống đong 250 mL. - Phễu nhựa. 2.4. Phương pháp nghiên cứu Đề tài được bố trí thực hiện các thí nghiệm theo sơ đồ hình 2.1. 28
  38. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Sơ đồ quá trình lên men thu nhận bioethanol từ vỏ cacao gồm các bước được trình bày ở hình 2.1. Độ ẩm (%) + Tro tổng Hàm lượng lignin NGUYÊN LIỆU Đường khử Hàm lượng cellulose TIỀN XỬ LÝ Acid oxalic Hàm lượng pectin thô 5% Enzym THỦY PHÂN Enzym e THỦY PHÂN VÀ e LÊN MEN Giống Giống LÊN MEN VSV VSV − Vi thể Chất dinh − Đại thể dưỡng − Đường cong tăng trưởng BIOETHANOL Hình 2.1. Sơ đồ quá trình thực hiện thí nghiệm. 2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm Dựa vào sơ đồ bố trí thí nghiệm hình 2.1 tiến hành các thí nghiệm sau. 2.4.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát giống nấm men. Nội dung 1: Quan sát đại thể giống nấm men. Giống nấm men sau khi được hoạt hóa được pha loãng đến nồng độ thích hợp và cấy trãi vào các đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy SDA, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2-3 ngày. Quan sát hình dạng khuẩn lạc của nấm men. Nội dung 2: Quan sát vi thể giống nấm men. Tế bào nấm men được nhuộm với thuốc thử xanh Methylen và cố định trên lame, sau đó quan sát hình dạng, đặc điểm vi thể nấm men bằng kính hiển vi. 29
  39. Đồ án tốt nghiệp Nội dung 3: Xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và độ hấp thu OD. Nguyên tắc: Dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử không tan lơ lững trong pha lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do sự hiện diện của các phần tử lơ lững làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cản ánh sáng làm phân tán chùm sáng tới đồng thời làm môi trường đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ tế bào. Do vậy, có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sóng 610nm. Cách tiến hành: Pha loãng môi trường SDB đã nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae cần kiểm nghiệm có mật độ tế bào bất kì thành các dịch huyền phù có độ đục đo OD ở bước sóng 610nm đạt các giá trị lân cận 0,1 – 0,2 – 0,3 – 0,4 và ghi nhận các thông số vừa đo. Dùng phương pháp cấy trãi trên đĩa petri đã có môi trường SDA, đếm số khuẩn lạc phát triển trong đĩa từ đó ta có được số tế bào nấm men sống. Tínhgiátrị log(cfu/mL) cho mỗi giá trị mật độ cfu/mL tương ứng với độ đục trên. Vẽ được đường tương quan tuyến tính của log(cfu/mL) tương ứng các giá trị độ đục đo được theo OD ở 610nm với trục tung là log(cfu/mL) và trục hoành là cácgiá trị độ đục của dịch môi trường đo ở OD ở 610nm. Xác định mật độ tế bào theo trị số OD 610nm của các mẫu có tế bào vi sinh vật tương ứng cần đo được, kết hợp đồ thị vừa lập cho phép xác định nồng độ tế bào trong dịch huyền phù nuôi. Nội dung 4: Xây dựng đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae. Sau khi xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD của S.cervisiae xong ta suy ra được phương trình đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD của S.cerevisiae. Chuẩn bị khảo sát tại 25 mốc thời gian từ 0 giờ đến 72 giờ, mỗi mốc thời gian tiến hành lặp lại 3 lần với 3 bình nuôi cấy, mỗi bình chứa 20ml môi trường SDB đã được hấp tiệt trùng. Cứ mỗi 3 giờ lấy 3 bình khảo sát độ hấp thụ OD. 30
  40. Đồ án tốt nghiệp Từ giá trị OD đo được và phương trình đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD của S.cervisiae tính được mật độ tế bào trung bình tại mỗi mốc thời gian từ đó vẽ được đường cong sinh trưởng của S.cervisiae. 2.4.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ cacao khô. Nội dung 1: Độ ẩm xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. Nội dung 2: Độ tro tổng xác định bằng phương pháp nung ở nhiệt độ cao. Nội dung 3: Đường khử được xác ịđ nh bằng phương pháp Miller. Nội dung 4: Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher - Hofft. Nội dung 5: Định lượng hàm lượng lignin theo phương pháp Klasm. Nội dung 6: Pectin thô được xác định theo phương pháp trích ly bằng nước nóng. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo. 2.4.2.3. Thí nghiệm 3: Tiền xử lý nguyên liệu với acid oxalic. Tiền xử lý giúp loại bỏ lignin, đường hóa một phần hemicellulose, giải phóng cellulose. Trên cơ sở những nghiên cứu trước của Lê Thị Kim Anh (2014), tiến hành tiền xử lý nguyên liệu với acid hữu cơ đem lại hiệu quả cho quá trình lên men. Nên chọn acid oxalic 5% là một acid yếu để làm tác nhân tiền xử lý trong đề tài này. Bên cạnh đó tỉ lệ nguyên liệu hợp lí bao giờ cũng là điều kiện thích hợp cho tất cả các quá trình, theo các nghiên cứu trước khi tiến hành tiền xử lý bằng NaOH với tỉ lệ 1:10 [6] thu được hàm lượng đường khử cao tuy nhiên ở vỏ cacao khi tiền xử lý bằng acid oxalic, dung dịch rất đặc và nhớt do trong vỏ cacao có chứa nhiều pectin không thể khuấy trộn đều được, ảnh hưởng đến các quá trình lên men tiếp theo. Do đó phải tăng thể tích dung môi lên là 1:20. Nội dung: Tiền xử lý bằng acid oxalic 5 %, tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:20 Điều kiện Tác chất Nồng độ sử dụng Thời gian (ngày) Nhiệt độ Phòng + khuấy Acid oxalic 5% (v/v) 2 150 vòng/phút Nguyên liệu sau khi tiền xử lý thì tiến hành xác định hàm lượng đường khử (mg/g hoặc mg/mL), cellulose (mg/g hoặc mg/mL), hàm lượng lignin (%). 31
  41. Đồ án tốt nghiệp Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo. 2.4.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát quá trình thủy phân nguyên liệu. Nguyên liệu sau khi tiền xử lý sẽ được đem đi chỉnh pH và tiến hành thủy phân. Nội dung: Đề tài này chỉ tập trung vào quá trình lên men SSF nên không khảo sát lại các thông số trong quá trình thủy phân, mà chỉ kiểm tra lại khả năng thủy phân của cellulase trên cơ chất là vỏ cacao. Vì vậy chọn điều kiện thủy phân tiến hành ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ enzyme cellulase : dịch thủy phân 0,5 % (v/v), pH= 5 – 5,5, trong 48 giờ, tỉ lệ cơ chất 5% (w/v). 2.4.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian lên men ảnh hưởng đến quá trình SHF Nguyên liệu sau khi thủy phân bằng enzyme được mang đi hấp khử trùng (1210C, 1 atm, 10 phút) để bức hoạt enzyme cũng như tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên men. Nội dung: Khảo sát thời gian lên men thích hợp, tiến hành lên men trong 48 giờ giờ, mỗi nghiệm thức cách nhau 5 giờ. Cố định ban đầu các yếu tố khác như sau: Nhiệt độ phòng Dịch nấm men 5% (v/v). Cellulase 0,5% (v/v) Khuấy 150 vòng/phút. pH~ 5 Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo. 2.4.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình SSF. Lên men sau thủy phân hay còn gọi là quá trình lên men và thủy phân riêng rẻ được khảo sát lại các yếu tố cơ bản dựa theo các nghiên cứu trước nhằm so sánh, đánh giá hiệu quả lên men so với quá trình lên men và thủy phân đồng thời. Theo đó, mẫu sau tiền xử lý được khử trùng trong autoclave ở 1210C trong 20 phút, sau đó bổ sung nấm men có mật độ 108cfu/mL và enzyme cellulase 0,5 % cho lên men ở nhiệt độ phòng, pH ~ 5,0 và kiểm tra nồng độ cồn ở những khoảng thời gian khác nhau. Thí nghiệm được tiến hành theo bảng 2.1. 32
  42. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1. Bảng thực hiện thí nghiệm lên men SSF Tỉ lệ Tốc độ Thành phần giống Tỉ lệ Nghiệm Thời gian Nhiệt lắc chất dinh nấm enzyme thức (giờ) độ (0C) (vòng/ dưỡng bổ men (%) phút sung (%) (%) Nhiệt độ – 1 16 0, 5,10, 72 5 0,5 150 phòng . Phòng Thời gian . 300C 17 20 0 5 0,5 150 – tối ưu (topt) . 35 C . 400C . 3 % Thời gian Nhiệt độ . 5 % 21 24 tối ưu tối ưu 0,5 150 – . 7 % (T ) (t0 opt opt) . 9 % Tỉ lệ . 0,3 % Thời gian Nhiệt độ nấm . 0,5 % 25 28 tối ưu tối ưu 150 – men tối . 0,7 % (T ) (t0 opt opt) ưu . 0,9 % Tỉ lệ . 50 Thời gian Nhiệt độ Tỉ lệ nấm . 100 29 32 tối ưu tối ưu enzyme – men tối . 150 (T ) (t0 tối ưu opt opt) ưu . 200 Tỉ lệ Tốc độ . Pepton 1 Thời gian Nhiệt độ Tỉ lệ nấm vòng . Pepton 2 33 36 tối ưu tối ưu enzyme men tối thích . Pepton 3 (T ) (t0 tối ưu opt opt) ưu hợp . Pepton 4 Tỉ lệ Tốc độ . Glucose 1 Thời gian Nhiệt độ Tỉ lệ nấm vòng . Glucose 2 37 40 tối ưu tối ưu enzyme men tối thích . Glucose 3 (T ) (t0 tối ưu opt opt) ưu hợp . Glucose 4 Tỉ lệ Tốc độ Thời gian Nhiệt độ Tỉ lệ . K2HPO4 0,1 nấm vòng . K HPO 0,2 41 44 tối ưu tối ưu enzyme 2 4 0 men tối thích . K2HPO4 0,3 (Topt) (t opt) tối ưu ưu hợp . K2HPO4 0,4 Tỉ lệ Tốc độ . MnSO4 0,01 Thời gian Nhiệt độ Tỉ lệ . MnSO 0,02 nấm vòng 4 45 48 tối ưu tối ưu enzyme . MnSO4 0,03 0 men tối thích (Topt) (t opt) tối ưu . MnSO4 0,04 ưu hợp 33
  43. Đồ án tốt nghiệp 2.5. Các phương pháp phân tích. 2.5.1. Phương pháp vi sinh. 2.5.1.1. Phương pháp giữ giống. Chuẩn bị môi trường SDA có chứa agar. Rót dung dịch vào ống nghiệm và hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 20 phút. Sau đó để nghiêng ống nghiệm cho đến khi agar đông lại. Tiến hành cấy giống nấm men từ ống giống gốc sang môi trường thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn từ trước. Công việc này được tiến hành trong tủ cấy vi sinh tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lêmen sau này. 2.5.1.2. Phương pháp hoạt hóa và nhân giống giống nấm men Giống nấm men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống trước khi đưa vào lên men. Ở quy mô phòng thí nghiệm, đề tài tiến hành nhân giống qua các bước: • Giai đoạn 1: Sau khi nấm men đã phát triển tốt trên môi trường thạch nghiêng, tiến hành cấy ria sang đĩa petri chứa môi trường SDA, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng. • Giai đoạn 2: Nhân giống cấp 1: Nấm men sau khi được tăng sinh trên môi trường SDA thì sẽ hình thành các khuẩn lạc riêng lẻ, lấy 1 khuẩn lạc rời cấy vào ống nghiệm chứa 10mL môi trường SDB đã được hấp tiệt trùng. Nuôi ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. • Giai đoạn 3: Nhân giống cấp 2: Chuyển ông nghiệm nhân giống cấp một vào 90 mL môi trường SDB nuôi ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Giống nấm men sau khi nhân giống cấp 2 đạt đủ sinh khối sẽ được dùng để lên men bioethanol. Trước khi giống này được sử dụng cho đợt lên men sau thì cần hoạt hóa trươc 18 - 24 giờ trong môi mới để nấm men phát triển sinh khối và có hoạt lực trở lại. 34
  44. Đồ án tốt nghiệp 2.5.1.3. Phương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc: Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, qua đó xác định được số tế bào sống. Tiến hành: Pha loãng mẫu: Pha loãng mẫu theo các dãy số thập phân thích hợp như: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 , chọn ba nồng độ pha loãng thích hợp nhất. Cấy mẫu: Dùng micropipet hút 0,1mL dịch mẫu đã pha loãng cho vào mỗi đĩa thạch. Khi tất cả các thể tích 0,1 mL dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau đều đã được chuyển lên bề mặt thạch của đĩa Petri, sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch. Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 350C và ủ trong 48 giờ. Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 1mL mẫu theo công thức. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc đếm được từ 25 – 250 để tính toán. Mật độ tổng của nấm men. N cfu A = ( ) n1.V.f1+⋯+ni.V.fi mL Trong đó: A: Số tế bào (cfu) nấm men trong 1mL mẫu. N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn. ni: Số lượng đĩa cấy tại mỗi độ pha loãng thứ i. V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa. fi: Độ pha loãng tương ứng. Đặc biệt: • Nếu ở độ pha loãng cao nhất trong dãy các ống nghiệm nói trên, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa > 250 thì kết quả ghi là > 2,5.107 cfu/mL. • Nếu độ pha loãng thấp nhất trong dãy các ống nghiệm nói trên, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, kết quả ghi là < 2,5.103 cfu/mL. 35
  45. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Phương pháp hóa lý 2.5.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm Nguyên tắc: Dùng nhiệt nóng của tủ sấy làm bay hết nước trong mẫu. Tiến hành: • Lấy một cốc sứ đem đi sấy đến khối lượng không đổi • Cân a (g) mẫu (m1) • Cho mẫu vừa cân vào cốc sứ đã sấy đến khối lượng không đổi, cân khối lượng cốc chứa mẫu (m2). • Mang cốc chứa mẫu đi sấy khô ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi. Cân chính xác khối lượng cốc chứa mẫu sau khi sấy (m3). Tính toán: m −m Cách tính hàm ẩm: W = 2 3 x 100%. m1 2.5.2.2. Xác định hàm lượng tro toàn phần. Nguyên tắc: Dùng sức nóng (500 – 6500C) của tủ nung để nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro có trong vỏ. Tiến hành: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 500 – 6500C đến trọng lượng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm, cân phân tích chính xác đến 0,0001 g. Cho vào chén 5 g mẫu. Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác như trên. Cho vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ lên đến 550 – 6000C, nung cho đến tro trắng (khoảng 6 – 7 giờ). Trường hợp tro còn đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung cho đến tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác như trên. Tính kết quả: Hàm lượng tro toàn phần theo phần trăm (X) tính bằng công thức: 퐆 −퐆 X = x 100% 퐆 −퐆 36
  46. Đồ án tốt nghiệp Trong đó: G1: Trọng lượng của chén (g). G2: Trọng lượng của chén và trọng lượng mẫu thử (g). G3: Trọng lượng của chén và tro trắng sau khi nung đến khối lượng không đổi (g). 2.5.2.3. Phương pháp xác định đường khử bằng phương pháp Miller. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3, 5 -dinitrosalycylic acid (DNS). DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3 - amino - nitrosalycylic có màu đỏ cam khi đun nóng hỗn hợp phản ứng. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy quang phổ so màu UV-Vis. Dựa theo đồ thị chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất trong khoảng bước sóng 540 nm. Tiến hành: . Chiết xuất đường trong vỏ cacao (xác định đường khử trong vỏ tươi, khô). - 5g mẫu cacao khô đã nghiền nhỏ cho vào becher 100mL + 30mL cồn 960 → đun cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phần trong). - Cho tiếp 10 mL cồn 80o vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi đun cách thủy → để nguội → lọc (lặp lại 2 lần). - Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (80o) - Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ. Sau khi cho bay hơi rượu, mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm. - Cặn khô trong cốc được pha loãng thành thể tích V = 50mL với nước cất ta được dung dịch đường gốc. Pha loãng dung dịch đường gốc với một hệ số pha loãng n thích hợp. 37
  47. Đồ án tốt nghiệp . Chuẩn bị dung dịch đo quang phổ. - Cho 3mL dung dịch mẫu (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm, thêm 1mL thuốc thử DNS. - Đun cách thủy hỗn hợp trong 15-20 phút. Làm lạnh nhanh về nhiệt độ phòng rồi đo OD ở bước sóng 540nm. - Từ giá trị OD đo được, dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose suy ra hàm lượng đường khử trong mẫu. Tính toán kết quả: X × n × V D = (mg/g) m Trong đó: X (mg/mL) đường khử trong dung dịch đường pha loãng. n: hệ số pha loãng V: Thể tích dịch đường gốc (mL) m: Khối lượng mẫu cân (g). 2.5.2.4. Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher-Hofft Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa cellulose với thuốc thử anthrone có màu vàng trong dung dịch acid H2SO4 đặc sẽ tạo màu xanh từ nhạt đến đậm đến nâu khi đun nóng hỗn hợp phản ứng. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ cellulose trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy quang phổ so màu UV-Vis. Dựa theo đồ thị chuẩn cellulose với thuốc thử, sẽ tính được hàm lượng cellulose của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 630 nm. Tiến hành: Cho 1mL dịch mẫu (pha loãng đến nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm, thêm 10 mL thuốc thử Anthrone. 38
  48. Đồ án tốt nghiệp Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 - 7 phút. Làm lạnh nhanh về nhiệt độ phòng rồi đo OD ở bước sóng 630nm. Từ giá trị OD thu được, dựa vào đồ thị đường chuẩn cellulose suy ra hàm lượng cellulose trong mẫu. 2.5.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng Lignin  Chuẩn bị mẫu. Cân chính xác 0,3 g ± 0,01 g mẫu bỏ vào chai 100mL có nắp vặn, thêm 3mL 0 0 ± 0,01mL acid H2SO4 72 %. Đặt chai nắp vặn vào bể ổn nhiệt ở 30 C ± 3 C trong 60 ± 5 phút. Dung dịch phản ứng luôn luôn phải được khuấy từ. Sau 60 phút thủy phân, pha loãng acid tới nồng độ 4 % bằng cách thêm 84mL ± 0,04mL nước cất. Trộn mẫu bằng cách đảo ngược chai nhiều lần để loại bỏ sự tách pha giữa các lớp acid nồng độ cao và thấp. Hấp khử trùng ở 1210C trong 60 phút.  Phân tích lignin không hòa tan trong acid: - Nung crucible (cốc lọc chân không) ở 6000C trong ít nhất 4 tiếng, sau đó bỏ vào hộp hút ẩm để nguội trong 2 tiếng rồi đem cân trọng lượng, ghi trọng lượng tới 0,1mg. - Lọc mẫu bằng phương pháp lọc chân không, chuyển 50mL dịch lọc vào bình bảo quản mẫu, dịch này sẽ dùng để đo lignin hòa tan. Dịch này phải được đo trong vòng 6 tiếng sau thủy phân, nếu không phải được bảo quản trong tủ lạnh tối đa là 2 tuần. - Rửa phần rắn còn lại bằng ít nhất 50mL nước cất, chia làm 3 lần rửa. - Đem phần rắn sấy ở 1050C trong hơn 4 tiếng, sau đó bỏ vào hộp hút ẩm để nguội 1 tiếng, cân và ghi lại khối lượng mẫu. - Sau đó đem crucible nung ở 6000C qua đêm, đem cân xác định hàm lượng tro.  Phân tích lignin hòa tan trong acid: - Sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis, chạy mẫu trắng là acid H2SO4 4 %. 39
  49. Đồ án tốt nghiệp - Sử dụng dịch thủy phân thu được (pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng H2SO4 4%) đo ở bước sóng 240nm và 320nm. - Tính hàm lượng lignin bằng đường chuẩn. 2.5.2.6. Phương pháp xác định hàm lượng pectin thô. Nguyên tắc: Dùng nước nóng để tách pectin ở nhiệt độ cao bằng cách nung cách thủy hỗn hợp nguyên liệu và nước. Tiến hành: - Cân 3g nguyên liệu cho vào 60 mL nước cất, điều chỉnh pH bằng HCl 0,5 N. - Cho cốc lên nồi đun cách thủy và khuấy đều. - Lọc thu dịch lọc và bổ sung thêm nước cất đến thể tích 100mL. - Thêm tiếp 200 mL cồn 960 để tủa pectin. Lọc thu tủa (dùng giấy lọc) - Rửa tủa 2 lần với ethanol 700. - Sấy khô tủa pectin ở 700C đến khối lượng không đổi thu được pectin thô. Tính hàm lượng pectin: Khố i lượ ng pectin thô (g) % Pectin = x 100 Khố i lượ ng vỏ cacao khô (g) 2.5.2.7. Phương pháp xác định pH Nguyên tắc: Dùng pH kế điện tử. 2.5.2.8. Phương pháp xác định nồng độ cồn. Nồng độ cồn đo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nguyên lý: Ethanol được đo nồng độ bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng pha động là acid sulfuric 0,005N. Mẫu và chuẩn được chạy ở chế độ:  Nhiệt độ cột 500C  Tốc độ pha động 1mL/phút. Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử khác nhau trên cột, khi dung môi rửa giải đi qua, các cấu tử sẽ lần lượt được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự 40
  50. Đồ án tốt nghiệp tùy thuộc vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau ( thuộc cùng một chất) sẽ có thời gian lưu như nhau, nhờ vào đó máy HPLC có thể tách hỗn hợp nhiều chất ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC có độ phân tách khá cao.  Chuẩn bị pha động. - Hóa chất gồm acid H2SO4 tinh khiết 96 %: 267µL . Nước khử ion 1000 mL - Bình chứa pha động phải được rửa nhiều lần bằng nước cất và tráng lại bằng nước khừ ion. - Cho 1lít nước khử ion vào bình chứa, thêm vào 267µl H2SO4 tinh khiết 96% vào và khuấy kĩ. - Lọc nước bằng màng lọc vi sinh, kích thước lỗ là 0,22µm. - Loại khí trong pha động bằng cách hút chân không bình chứa pha động, vừa hút vừa khuấy trộn kĩ. - Đánh siêu âm bình chứa pha động từ 10 - 20 phút để loại bỏ hết bọt khí trong bình. - Tiến hành chạy HPLC.  Tính kết quả cồn. Mẫu được lọc qua màng lọc vi sinh kích thước lỗ 0,22 µm và đo bằng HPLC. Từ diện tích peak thu được trên sắc kí đồ, tính được nồng độ cồn theo phương trình: y = 5,031.10-7x – 0,002. 41
  51. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát giống nấm men 3.1.1. Quan sát hình thái nấm men a. Khuẩn lạc b. Tế bào Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của Saccharomyces cerevisiae Các khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae có màu trắng ở ngày thứ nhất, màu trắng ngà ở ngày thứ hai và chuyển sang màu ngà ở ngày nuôi cấy thứ 3 kể từ lúc cấy trãi. Khuẩn lạc có bề mặt bóng mịn, rìa tròn, lồi lên, đường kính khoảng 1 - 2 mm vào ngày thứ ba (hình 3.1a). Khi quan sát dưới kính hiển vi, tế bào S.cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, sinh sản bằng cách tạo chồi vào tạo bào tử, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi hoặc một chuỗi (hình 3.1b). 3.1.2. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae 9 8 7 6 tb/ml)(số log 5 4 3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 thời gian(h) Hình 3.2. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae 42
  52. Đồ án tốt nghiệp Nhận xét: Môi trường nhân giống và môi trường lên men là giống nhau. Điều kiện lên men không khác nhiều so với khi nhân giống: thể tích lên men ít nên không bị ảnh hưởng bởi áp lực nước, nhiệt độ, Nhìn vào đồ thị ta thấy đường cong sinh trưởng chia làm 4 giai đoạn: . Giai đoạn thích nghi: 0 – 6 h . Giai đoạn tăng trưởng: 6 – 39 h . Giai đoạn ổn định: từ 39 – 51 h, mật độ tế bào theo log(cfu/mL) trong khoảng từ 7,75 đến 8,19. Trong giai đoạn này có sự cân bằng giữa tế bào sinh ra và tế bào mất đi. . Giai đoạn suy vong: từ 51 – 72 h Trong giai đoạn này, chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, không đủ cung cấp cho hoạt động sinh trưởng, phát triển của nấm men.Tế bào già và chết đi. 3.2. Khảo sát thành phần hóa học của vỏ cacao khô Kết quả khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ cacao khô được trình bày trong bảng 3.1. Hình 3.3. Vỏ cacao khô 43
  53. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Thành phần hóa học của vỏ cacao khô. Chỉ tiêu Giá trị Độ ẩm (%) 12,867 ± 0,115 Tro tổng (%) 9,1 ± 0,26 Lignin (%) 22,27 ± 2,73 Pectin (%) 2,767 ± 0,011 Đường khử (mg/g) 43,155 ± 4,02 Cellulose (mg/g) 210,12 ± 4,5 Dựa vào bảng 3.1, thấy rằng vỏ cacao sau khi sấy khô đến độ ẩm 12,867 ± 0,764 % là độ ẩm thích hợp cho việc bảo quản và ngăn cản hoạt động của nấm dại, hàm lượng cellulose lúc này chiếm 210,12 ± 4,5 mg/g (khoảng 20 %) thành phần chất khô. Khi so sánh với các nguồn nguyên liệu lignocellulose khác để sản xuất bioethanol như vỏ dừa (39,31 %), rơm rạ (34 - 38 %), bã mía (50 %) .có thể thấy vỏ cacao khô tuy có hàm lượng cellulose thấp hơn những vẫn là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc sản xuấtbioethanol . Trong đó hàm lượng tro chiếm 9,1 ± 0,26 % cao hơn so với hàm lượng tro có trong gỗ (0,5 - 0,6 %), đây là một nguồn cung cấp chất khoángvà tạo môi trường dinh dưỡngcho nấm men phát triển. Bên cạnh đó hàm lượng lignin chiếm 22,27 ± 2,73 % trong vỏ cacao khô sẽ gây khó khăn trong việc giải phóng cellulose nên cần phải có một bước tiền xử lý thích hợp. 3.3. Khảo sát tiền xử lý với acid oxalic Bước tiền xử lý là một bước khá quan trọng trong quá trình lên men vì vậy đề tài đã chọn acid oxalic làm tác nhân tiền xử lý.Dựa theo các kết quả nghiên cứu trước của Lê Thị Kim Anh (2014) thì nồng độ acid oxalic là 5 % cho khả năng tiền xử lý vỏcacao tốt với tỉ lệ nguyên liệu : tác chất là 1:20. Kết quả khi tiền xử lý vỏcacao bằng acid oxalic trong thời gian 2 ngày được trình bày trong bảng 3.2. 44
  54. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Thành phần hóa học của vỏ cacao khô sau khi tiền xử lí với acid oxalic 5%. Thời Đường khử Đường khử Cellulose Cellulose Lignin gian trong dịch trong bã trong dịch trong bã (%) (ngày) (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) 1 12,1a ± 0,41 53,08b ± 1,15 49,46e ± 2,47 83,89f ± 1,91 – 2 14,67a ± 1,57 46,98c ± 1,64 52,14e ± 1,9 85,57f ± 2,68 10,12 ± 0,19 Ghi chú: Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, trong cùng một cột, các giá trị có cùngchữthể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mứcđộ tin cậy 95%. Khi tiền xử lý với acid oxalic 5% thì hàm lượng đường khử trong dịch là 14,67 ± 1,57 mg/g và hàm lượng celluloses là 52,14 ± 1,9 mg/g sau 2 ngày tiền xử lý cao hơn so với tiền xử lý 1 ngày, sự khác biệt về hàm lượng đường khử và cellulose trong dịch sau tiền xử lý không có ý nghĩa về mặt thống kê(P-Value = 0,0520). Dựa vào bảng 3.2, thấy rằng acid oxalic tạo ra lượng đường ít nhưng lượng cellulose tạo ra lại cao hơn. Hàm lượng đường khử và cellulose trong bã đã giảm sau hai ngày tiền xử lý do tác động của acid oxalic tấn công các liên kết lignin bao bọc bên ngoài nguyên liệu, giải phóng lignin và cellulose có trong bã. Như vậy với việc làm giảm hàm lượng lignin có trong nguyên liệu xuống mức thấp tạo điều kiện cho các quá trình tiếp theo được diễn ra thuận lợi. 3.4. Thủy phân vỏ cacao bằng enzyme Viscozym Để chuyển hóa cellulose trong vỏ cacao sau quá trình tiền xử lý thành các phân tử đường đơn cần phải dùng các tác chất chẳng hạn như acid hay enzyme. Tuy nhiên theo các khảo sát trước đây việc thủy phân bằng H2SO4 1,5 % (hàm lượng glucose đạt 4,15 ± 0,09 mg/mL) không đạt hiệu quả cao như khi sử dụng enzyme (hàm lượng glucose 16,35 ± 1,5 mg/mL) (Nguyễn Lê Minh Thông, 2013). Do nguyên liệu bị phá vỡ lớp lignin dày bao bọc bên ngoài các bó mạch cellulose nên enzyme dễ dàng tấn công cellulose và thủy phân thành đường glucose. Vì vậy đề tài 45
  55. Đồ án tốt nghiệp chọn tác nhân sử dụng để tiến hành thủy phân nguyên liệu vỏ cacao đã tiền xử lý là enzyme. Ngoài ra, thủy phân bằng enzyme là phương pháp thân thiện với môi trường. Vì đề tài tập trung vào quá trình lên men SSF nên không khảo sát lại các thông số của quá trình thủy phân, chỉ tiến hành để kiểm tra lại khả năng thủy phân của enzyme trên cơ chất là vỏ cacao. Do đó quá trình thủy phân sẽ tiến hành ở các điều kiện: nhiệt độ phòng, tỉ lệ cơ chất là 5 % w/v, pH ~ 5, bổ sung enzyme với tỉ lệ 0,5 % v/v, khuấy 150 vòng/ phút. Bảng 3.3. Kết quả thủy phân theo thời gian. Thời Đường khử Đường khử Cellulose Cellulose gian trong dịch trong bã trong dịch trong bã (ngày) (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) 1 58,87a ± 1,34 37,89c ± 3,06 47,87d ± 1,64 38,25f ± 1,79 2 65,62b ± 1,28 34,62c ± 1,48 40,22e ± 1,67 35,35f ± 1,21 Ghi chú: Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, trong cùng một cột, các giá trị có cùngchữthể hiệnsự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy95 %. Kết quả xử lý số liệu với ANOVA cho thấy sự sai khác về lượng đường khử trong dịch tạo thành sau quá trình thủy phân theo thời gian là có ý nghĩa (P-value = 0,0033). Như vậy khi sử dụng enzyme cellulase thủy phân vỏ cacao sẽ thu được lượng khử cao hơn ở ngày thứ hai. Do nguyên liệu bị phá vỡ lớp lignin dày bao bọc bên ngoài các bó mạch cellulose nên enzyme dễ dàng tấn công cellulose và thủy phân thành đường, do đó hàm lượng đường trong dịch sẽ tăng cao (65,62 ± 1,28) trong giai đoạn này, còn trong bã thì lượng đường sẽ giảm xuống (34,62 ± 1,48). 46
  56. Đồ án tốt nghiệp 3.5. Khảo sát thời gian lên men sau khi thủy phân (SHF) Sau quá trình thủy phân của enzyme tiến hành lên men SHF theo thời gian với các điều kiện lên men như sau: Nhiệt độ phòng. Tỉ lệ nấm men 5 %. pH ~ 5 - 5,5. Tốc độkhuấy là 150 vòng/phút Nồng độ enzyme 0,5 % Thời gian lên men là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men bioethanol. Thời gian của quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ lên men, nồng độ đường trong dịch lên men, tỉ lệ nấm men Nếu thời gian lên men quá ngắn, quá trình lên men chưa xảy ra hoàn toàn, đường sót sẽ còn nhiều trong dịch lên men và độ cồn tạo ra thấp. Nếu thời gian lên men quá dài, môi trường lên men sẽ dễ bị nhiễm các loại vi sinh vật không mong muốn, đồng thời nếu có sự hiện diện của oxy thì rượu sẽ bị oxy hóa thành acid acetic, làm giảm độ cồn và gây hư hỏng rượu Thông thường, người ta xác định thời điểm kết thúc lên men khi tổng số các chất rắn hòa tan không đổi ít nhất sau 6 giờ liên tiếp. Khi đó nấm men không còn chuyển hóa đường thành cồn nữa, do độ cồn tạo thành đã đủ gây ức chế quá trình lên men rượu của nấm men. Do đó, việc chọn thời gian lên men phù hợp có ý nghĩa rất quan trọng, chọn thời gian lên men sao cho nồng độ cồn thu được cao nhất. 12 10 (mg/mL) 8 khử khử 6 ng đườ 4 ng ng lượ 2 m Hà 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Thời gian (giờ) Hình 3.4a. Hàm lượng đường theo thời gian lên men SHF 47
  57. Đồ án tốt nghiệp 5 4,64 4,5 4 3,5 3 (%) ra sinh n 2,5 2 cồ độ ng ng 1,5 Nồ 1 0,5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Thời gian (giờ) Hình 3.4b. Hàm lượng cồn theo thời gian lên men SHF Hình 3.4. Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên lên men SHF. Dịch lên men sau khi thủy phân có hàm lượng đường là 65,62 ± 1,28 mg/g, là môi trường thuận lợi cho nấm men hoạt động. Từ kếtquả khảo sát (bảng 1- PLB) cho thấy hàm lượng đường giảm nhanh trong 10 giờ đầu, lúc này nấm men chỉ sử dụng đường để cung cấp cho việc phục hồi và phát triển sinh khối khi mới được đưa vào bình lên men, tuy có tạo ra cồn nhưng rất thấp từ 0,25 % - 2,11 %. Đối với nguyên liệu được xử lý bằng acid hữu cơ và thủy phân bằng enzyme thì lượng cồn bắt đầu tăng đến 1,98 % trong 5 giờ đầu lên men. Vì trong thời gian đầu nấm men có thời gian để thích nghi với môi trường lên men, hô hấp hiếu khí để tăng sinh khối. Tuy nhiên, thời gian để nấm men tăng sinh khối không nhiều vì nấm men đã được nuôi trong môi trường SDB đã đủ hoạt lực để sử dụng đường có trong dịch nguyên liệu để bắt đầu lên men tạo cồn. Ngoài ra, nguyên liệu đã được tiền xử lý trước để thủy phân cellulose thành đường. Do đó, nấm men có thể sử dụng đường có sẵn trong môi trường lên men để thực hiện chuyển hóa bioethanol khi oxy trong bình lên men hết hẳn. Khi sử dụng hết oxy trong bình lên men. Nấm men chuyển sang quá trình lên men kị khí ểđ sinh bioethanol. Quá trình lên men tiếp tục xảy ra nhanh ở giai đoạn từ sau 10 giờ cho đến khi đạtn ồng độcồn cao nhất là4,64 % ở 30 giờ. Từ 30 giờ trở về 48
  58. Đồ án tốt nghiệp sau thì nồng độcồn bắt đầu giảm, hàm lượng đường lúc này đã được sử dụng chỉ còn 3,36 ± 0,29 mg/mL sau 50 giờ lên men. Như vậy thời gian ảnh hưởng đến mức độ lượng bioethanol sinh ra, hệ lên men trong thí nghiệm này là hệ kín và môi trường lên men ở dạng lỏng, điều đó có nghĩa là có sự tồn tại của pha sinh trưởng và pha ổn đĩnh theo thứ tự trước-sau tương ứng. Trong pha sinh trưởng, lượng dinh dưỡng bị tiêu hao nhằm phục vụ cho sinh sản và phát triển tăng sinh khối, lúc này, bioethanol sinh ra chưa nhiều. Trong pha ổn định diễn ra sau đó, nguồn carbon được chuyển hướng sang phục vụ quá trình sản sinh bioethanol. Dựa vào hình 3.4b, có thể thấy sau 10 giờ, nấm men vẫn đang ở giai đoạn sinh trưởng (bioethanol đạt chỉ 2,11 %). Sau 15 giờ chúng đã bước sang pha ổn định và lượng bioethanol được ghi nhận đạt 2,76 – 4,64 %. Tuy nhiên sau 30 giờ, quá trình lên men bước vào giai đoạn kết thúc, lượng bioethanol thu được có chiều hướng giảm mặc dù glucose vẫn tiếp tục được tiêu thụ (hình 3.4a). Điều này được giải thích là do sự phát triển của một số vi khuẩn acid lactic sử dụng phần đường còn sót lại để tạo thành acid lactic, ức chế sự phát triển của nấm men, đồng thời một số vi khuẩn cũng có khả năng phân giải bioethanol trong quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng. Tóm lại sau 30 giờ lên men SHF thu được cồn có nồng độ 4,64 %, như vậy thấy rằng nguyên liệu vỏ cacao cũng là một lựa chọn tiềm năng để sản xuất bioethanol. 3.6. Khảo sát thủy phân và lên men đồng thời (SSF) Sau khi tiền xử lý nguyên liệu với acid oxalic 5% trong 2 ngày, tiến hành xác định các thông số cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời như: thời gian, nhiệt độ, tỉ lệ cấy giống, tỉ lệ enzyme, thành phần dinh dưỡng và tốc độ khuấy đảo. Mỗi thông số của qua trình được xác định luân phiên, khi xác định thông số nào đó thì các thông số khác được giữ ở một giá trị cố định như sau: nhiệt độ phòng. pH ~ 5 – 5,5. Tỉ lệ nấm men 5 % (v/v). Tỉ lệ enzyme 0,5 % (v/v). Tốc độkhuấy là 150 vòng/phút 49
  59. Đồ án tốt nghiệp 3.6.1. Khảo sát thời gian SSF Xét về nhân tố thời gian, nhìn chung tất cả các nghiệm thức đều cho kết quả nồng độ cồn sinh ra tăng lên sau 45 giờ lên men và giảm nhẹ trong những giờ sau đó và kết quả thống kê theo nhân tố này cũng thể hiện điều tương tự (bảng 2- PLB). 8 7,5 7 6,5 (cfu/mL)log theo o 6 5,5 độ tế bà độ tế t Mậ 5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Thời gian lên men (giờ) Hình 3.5a. Mật độ tế bào theo thời gian lên men SSF 60 50 40 30 20 m lương cellulose (mg/mL) celluloselương m 10 Hà 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Thời gian lên men (giờ) Hình 3.5b. Hàm lượng cellulose theo thời gian lên men SSF 50
  60. Đồ án tốt nghiệp 9 8 7 6 ng (mg/mL) ng 5 đườ 4 ng ng 3 lượ 2 m m Hà 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Thời gian lên men ( giờ) Hình 3.5c. Hàm lượng đường theo thời gian lên men SSF. 6 5,47 5 4 n (%) n 3 độ cồ độ ng ng 2 Nồ 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Thời gian lên men ( giờ) Hình 3.5d. Nồng độ cồn theo thời gian lên men SSF. Hình 3.5. Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên men SSF Dựa vào hình 3.5b cho thấy trong khoảng thời gian đầu hàm lượng cellulose đã giảm khá nhanh từ 47,20 ± 2,19 mg/mL tại thời điểm 0 giờ xuống 18,98 ± 2,68 mg/mL tại 35 giờ lên men. Thời gian còn lại thì hàm lượng cellulose tuy có giảm nhưng tốc độ giảm là tương đối chậm. Sau 72 giờ lên men hàm lượng cellulose còn lại là 5,77 ± 0,08 mg/mL. Như vậy khi vừa bổ sung enzyme vào dịch lên men thì hoạt 51
  61. Đồ án tốt nghiệp lực của enzyme còn mạnh và nó sẽ tấn công vào những cấu trúc cellulose dễ bị thủy phân hơn như phần cellulose xốp, vô định hình làm cho lượng cellulose giảm nhanh và giải phóng đường do đó trong giai đoạn này hàm lượng đường trong dịch lên men sẽ tăng nhanh. Từ sau 35 giờ trở đi thì hoạt lực của enzyme yếu dần cũng như những phần dễ bị thủy phân trong cellulose không còn nữa nên tốc độ thủy phân sẽ chậm dần. Trong quá trình lên men SSF, hàm lượng cellulose và hàm lượng glucose trong dung dịch phụ thuộc vào hoạt độ của cellulase và tốc độ lên men của nấm men. Khi hàm lượng cellulose giảm dần thì hàm lượng glucose cũng tăng dần (hình 3.5b và 3.5c ). Sau đó, trong môi trường lên men có nồng độ cồn cao gây ức hoạt động lên men của nấm men nên hàm lượng đường không thay đổi nhiều, quá trình lên men kết thúc. Từ hình 3.5c cho thấy hàm lượng đường glucose tăng nhanh từ thời điểm 5 giờ đến 15 giờ đầu (từ 5,54 ± 0,5 mg/mL lên 6.32 ± 0,18 mg/mL) và tăng đến cực đại ở 35 giờ lên men. Tuy nhiên sau thời điểm 35 giờ thì lượng đường đã giảm dần và chỉ còn 3,73 ± 0,38 mg/mL lúc 72 giờ. Điều này được giải thích là do trong khoảng 35 giờ đầu, dưới tác dụng của cellulase các phân tử cellulose bị phân cắt mạnh giải phóng glucose nhưng hàm lượng đường lúc này chưa chưa đủ lớn để ức chế ngược lại cellulase và trong lúc này nấm men chưa tăng sinh đủ cũng như chưa thích nghi hoàn toàn với môi trường lên men nên lượng đường do enzyme thủy phân ra nhiều hơn lượng đường mà nấm men sử dụng. Trong giai đoạn sau (từ 35 giờ đến 72 giờ), lượng đường vẫn tiếp tục được được enzyme tạo ra tuy nhiên tại thời điểm này nấm men đã thích nghi với môi trường lên men cũng như tăng sinh đầy đủ nên bắt đầu sử dụng đường hiều hơn để thực hiện việc chuyển đổi năng lượng trong chu trình sinh hóa thành sản phẩm cuối cùng là bioethanol , do đó lượng glucose cũng giảm dần theo mức độ tăng của cồn. Như vậy trong khoảng 25 giờ đầu của quá trình, mật độ tế bào nấm men trong dịch lên men tăng dần (hình 3.5a) và đạt số lượng nhiều nhất là 29,6 triệu cfu/mL ở thời điểm 25 giờ. Đây là giai đoạn giai đoạn tiềm phát và lũy thừa, nấm men sẽ thích 52
  62. Đồ án tốt nghiệp nghi với môi trường lên men, chủ yếu sử dụng lượng O2 còn lại trong bình và đường có được do hoạt động của cellulase để tăng sinh khối. Cũng trong giai đoạn này, theo hình 3.5d, ở 25 giờn ồng độcồn cũng tăng lên 3,87 % (g/g), quá trình lên men đã xảy ra nhưng lượng cồn thu được chưa được nhiều, hàm lượng đường tăng dần và hàm lượng cellulose giảm dần. Trong khoảng 20 giờ tiếp theo (từ 25 giờ – 45 giờ), quá trình lên men diễn ra mạnh mẽ nhất, lúc này nấm men đã hoàn toàn thích nghi với môi trường lên men, lượng cồn không ngừng tăng lên và đến 5,47 % ở 45 giờ lên men(hình 3.5d), mật độ tế bào nấm men cũng đạt cực đại sau 25 giờ lên men và được duy trì sau đó tuy nhiên có sự suy giảm dần mật độ theo thời gian (hình 3.5a). Trong giai đoạn này lượng glucose vẫn tiếp tục được cellulase tạo ra và được nấm men sử dụng nhều hơn để lên men tạo bioethanol do đó lượng glucose cũng giảm dần theo mức độ tăng của cồn. Từ50 giờ trở đi, mật độ nấm men giảm dần, sau thời gian sinh trưởng và phát triển, nấm men đã bước vào giai đoạn suy vong. Nồng độ cồn sau khi đạt giá trị cực đại ở 45 giờ cũng bắt đầu giảm xuống. Như vậy so sánh với thời gian lên men SHF, thời gian để lên men SSF đạt nồng độ cồn cực đại lâu hơn nhưng nồng độ cồn thu được lại cao hơn. Lượng đường trong quá trình lên men SHF được nấm men sử dụng triệt để hơn do đó sau 48 giờ lên men lượng đường giảm từ 9,79 ± 0,21 mg/mL xuống 3,36 ± 0,29 mg/mL, còn trong SSF phải mất hơn 72 giờ lên men thì lượng đường mới giảm xuống 3,73 ± 0,38 mg/mL vẫn còn khá cao so với SHF. Điều này được giải thích là do thời gian lên men SSF kéo dài sẽ làm cho môi trường lên men có thể bị nhiễm các vi sinh vật tạp khác, những vi sinh vật này sử dụng đường làm cơ chất cho sự phát triển của mình, trong quá trình phát triển chúng tạo ra các hợp chức ức chế hoạt động của nấm men như các loại acid hữu cơ, . một mặt khác vì SSF là lên men liên tục nên lượng đường tạo ra không quá cao, không đủ ức chế cellulase nên đường vẫn tiếp tục được tạo ra và nấm men chỉ có thể sử dụng ở một mức độ nào đó thì bước vào giai đoạn suy vong nên môi trường vẫn còn tích lũy một nồng độ đường nhất định. 53
  63. Đồ án tốt nghiệp 3.6.2. Khảo sát nhiệt độ lên men SSF Tiến hành khảo sát nhiệt độ đối với quá trình lên men SSF được khảo sát ở điều kiện Nhiệt độ phòng, 300C, 350C, 400C. pH ~ 5 - 5,5. Tỷ lệ nấm men 5 % (108 cfu/mL). Tỷ lệ enzyme : dịch lên men là 0,5 %. Đo mẫu ở 45 giờ lên men. 7,45 7,4 7,35 o theo log log theo o 7,3 (cfu/mL) 7,25 độ tế bà tế độ t 7,2 Mậ 7,15 7,1 room 30 35 40 Nhiệt độ( 0C) Hình 3.6a. Mật độ tế bào theo nhiệt độ. 18 16 14 12 10 mg/mL ng 8 lượ 6 m m 4 Hà 2 0 room 30 35 40 0 Đường khử Cellulose Nhiệt độ( C) Hình 3.6b. Hàm lượng đường khử và cellulose thay đổi theo nhiệt độ 54
  64. Đồ án tốt nghiệp 6,1 6 5,9 5,8 5,7 n sinh ra nra sinh (%) 5,6 5,5 độ cồ độ ng 5,4 Nồ 5,3 5,2 room 30 35 40 0 Nhiệt độ C Hình 3.6c. Nồng độ cồn ở các nhiệt độ khác nhau Hình 3.6. Sự thay đổi các thành phần theo nhiệt độ trong quá trình lên men SSF Dựa theo kết quả hình 3.6c cho thấy trong 4 mốc nhiệt độ được khảo sát, sự khác nhau về nồng độcồn thu được không có ý nghĩa về mặt thống kê. Khả năng lên men cồn đạt cao nhất ở 350C (5,83 ± 0,15 %), cao hơn 0,2 % so với bioethanol ở nhiệt độ phòng. Ở 400C khả năng lên men cồn đạt kém nhất, thấp hơn 1,05 lần so với mức cao nhất đã nêu. Điều này được giải thích là do nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme và nấm men trong quá trình lên men. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm men là 28 - 320C, của cellulase là 500C do đó ở nhiệt độ 350C - 370C là nhiệt độ thích hợp cho cả hoạt động của enzyme và hoạt động của nấm men. Ở nhiệt độ này hàm lượng cellulose thấp hơn do nhiệt độ thủy phân thích hợp, đường tạo ra đã được nấm men sử dụng 1 phần tạo bioethanol nên lúc này hàm lượng glucose không cao. Ởnhiệt độ phòng, nấm men phát triển tốt nhưng lại thấp cho enzyme hoạt động nên cellulose còn lại trong dịch vẫn còn nhiều (14,12 ± 0,36 mg/mL), cellulase hoạt động khá yếu, tốc độ thủy phân cellulose thành đường cũng bị ảnh hưởng. Nhiệt độ 300C là nhiệt độ tối ưu cho nấm men phát triển nhưng vẫn còn khá thấp cho enzyme hoạt động mạnh. Tuy hàm lượng cellulose bị giải phóng ra đường có giảm nhưng lúc này nấm men sử dụng đường này để phục vụ cho việc tăng sinh khối mà không sinh ra cồn nhiều. 55
  65. Đồ án tốt nghiệp Ở nhiệt độ 400C, tuy nồng độ cellulose còn lại rất thấp và lượng đường tạo ra nhiều nhưng nấm men không hoạt động tốt ở nhiệt độ này. Tại nhiệt độ này, lượng ethanol tích lũy nội bào trong tế bào nấm men tăng cao làm quá trình trao đổi chất bị đình trệ, làm bất hoạt hoặc thậm chí biến tính của ít nhất một enzyme chủ chốt nào đó do nấm men sản sinh ra. Bên cạnh đó khi tiến hành lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ làm tổn thất lượng cồn sinh ra. Từ những kết quả trên rút ra nhiệt độ 350C là nhiệt độ thích hợp cho các khảo sát tiếp theo. 3.6.3. Khảo sát tỉ lệ giống bổ sung Thí nghiệm tiến hành khảo sát ảnh hưởng của mật độ giống nấm men trong quá trình lên men SSF với 4 tỉ lệ giống bổ sung lần lượt là 3 %, 5 %, 7 %, 9 %. Tiến hành ở nhiệt độ 350C, trong 45 giờ, pH ~ 5 - 5,5, tỉ lệ enzyme 0,5 %. 7,46 7,44 7,42 7,4 7,38 7,36 o theo log(cfu/ml) theo o 7,34 7,32 độ tế bà tế độ t t 7,3 Mậ 7,28 7,26 3 5 7 9 Tỉ lệ giống bổ sung (%) Hình 3.7a. Mật độ tế bào theo tỉ lệ giống bổ sung 56
  66. Đồ án tốt nghiệp 16 14 12 10 8 ng (mg/ml) ng lượ 6 m m 4 Hà 2 0 3% 5% 7% 9% Tỉ lệ giống (%) Đường khử Cellulose Hình 3.7b. Hàm lượng đường khử và cellulose theo tỉ lệ giống 6,2 6,033333333 6 (%) n 5,8 độ cồ độ 5,6 5,45 ng 5,4 Nồ 5,2 5 Giống 3% Giống 5 % Giống 7 % Giống 9 % Tỉ lệ cấy giống Hình 3.7c. Nồng độ cồn theo tỉ lệ giống. Hình 3.7. Sự thay đổi các thành phần theo tỉ lệ cấy giống trong quá trình lên men SSF Kết quả thống kê theo từng nhân tố cho thấy mật độ tế bào nấm men bổ sung ban đầu có ảnh hưởng đến lượng ethanol sinh ra. Khi tăng tỉ lệ nấm men từ 3% đến 9%, nồng độ ethanol sinh ra cũng tăng (hình 3.7c). Khi tỉ lệ cấy giống nấm men đạt 9%, lượng ethanol sinh ra cao nhất6,03± 0,153 %. Trong khi đó các nghiệm thức lên men có tỉ lệ cấy giống thấp hơn thì cho kết quả thấp hơn (5,45 – 5,83 %). Điều này được giải thích là do hệ lên men là hệ kín nên mật độ giống càng thấp thì nấm men 57
  67. Đồ án tốt nghiệp càng dành nhiều thời gian và dinh dưỡng cho pha sinh trưởng, do đó việc tạo cồn thấp. Đối với tỉ lệ cấy giống 3 % là một lượng giống nhỏ, thì cần thời gian dài để thực hiện chuyển hóa glucose thành ethanol vì thế lượng ethanol sinh ra không cao. Còn đối với tỉ lệ giống 5 % thì hàm lượng cồn sinh ra tuy có cao hơn một chút, và về mặt thống kê gần như không khác biệt nhiều với tỉ lệ 7 %. Có thể nói đây là một tỉ lệ giống vừa đủ để có thể tạo ra lượng ethanol cao trong quá trình lên men. Tuy nhiên qua quá trình lên men kéo dài thì sẽ có sự biến động về số lượng. Khi hàm lượng đường do enzyme thủy phân quá nhiều mà nấm men không đủ, thì đường này sẽ ức chế lại nấm men do đó hàm lượng cồn cũng sẽ bị thất thoát. Ở hai tỉ lệ cấy giống cho nồng độ cồn cao là ở 7 % và 9 % lại không có khác biệt về mặt thống kê, nấm men tuy nhiều hơn nhưng cũng chỉ chủ yếu tăng sinh khối hơn chứ không tăng chuyển hóa cồn. Từ đó có thể thấy rằng mật độ nấm men tăng lên, ethanol cũng tạo ra nhiều hơn nhưng chỉ trong một khoảng nhất định, khi vượt khỏi khoảng này thì nấm men không làm tăng thêm cồn nữa cho dù hàm lượng đường vẫn tiếp tục giảm trong suốt quá trình. Lý do là khi mật độ tế bào nấm men tăng lên thì tốc độ lên men trong giai đoạn đầu càng nhanh và có thể cản trở quá trình lên men tiếp theo. Như vậy chọn 7% là tỉ lệ giống thích hợp cho quá trình lên men SSF từ vỏ cacao. Ở tỉ lệ này số lượng nấm men sẽ nhiều hơn nên việc các tế bào chết đi trong lúc lên men sẽ không ảnh hưởng nhiều cho quá trình, việc chuyển hóa gucose thành ethanol sẽ hiệu quả hơn, bên cạnh đó trong lên men SSF quá trình thủy phân liên tục xảy ra nên cần một số lượng nấm men nhiều để nhanh chóng sử dụng lượng đường này tạo ethanol. 58
  68. Đồ án tốt nghiệp 3.6.4. Khảo sát tỉ lệ enzyme bổ sung. Ảnh hưởng của tỉ lệ cellulase đối với quá trình lên men SSF được khảo sát ở 4 mức độ khác nhau, nhiệt độ 350C, giống nấm men 7 %, đo mẫu ở 45 giờ. 7,32 7,315 7,31 7,305 o ltheo log(cfu/ml) 7,3 7,295 độbà tế t t Mậ 7,29 7,285 0,3 % 0,5 % 0,7 % 0,9 % Tỉ lệ enzyme (%) Hình 3.8a. Mật độ tế bào theo tỉ lệ enzyme. 16 14 12 10 ng mg/mL ng 8 lượ m m 6 Hà 4 2 0 0,3 % 0,5 % 0,7 % 0,9 % Tỉ lệ enzyme (%) Đường khử Cellulose Hình 3.8b. Hàm lượng đường khử và cellulose theo tỉ lệ enzyme 59
  69. Đồ án tốt nghiệp 6,2 6 5,8 n % n 5,6 độ cồ độ 5,4 ng ng Nồ 5,2 5 4,8 0,3 % 0,5 % 0,7 % 0,9 % Nồng đô % Hình 3.8d. Nồng độ cồn theo tỉ lệ enzyme. Hình 3.8. Sự thay đổi các thành phần theo tỉ lệ enzyme bổ sung trong quá trình lên men SSF Kết quả cho thấy khi lượng enzyme cho vào tăng lên, thì nồng độ cồn cũng tăng. Khi tăng nồng độ enzymetừ 0,3 đến 0,5 % thì nồng độ cồn tăng đáng kể từ5,53 ± 0,06 đến 5,9 ± 0,1 %, nhưng khi nồng độ enzyme tăng lên 0,9 % thì nồng độ cồn giảm, mặc dù hàm lượng đường và cellulose vẫn tiếp tục giảm. Với một lượng cơ chất nhất định tương ứngvới lượng cellulose nhất định, không phải tất cảcác cellulose đều có thể bị tấn công bởi enzyme, khi enzyme tấn công thì những vùng cellulose dễ bị tấn công như cấu trúc cellulose vô định hình sẽ bị tấn công trước còn lại những phần cellulose khó bị thủy phân. Khi đó tốc độ thủy phân của enzyme cũng giảm dần, khả năng tấn công sẽ trở nên rất khó khăn. Vì vậy, nếu lượng enzyme có được tăng lên thì cũng không cải thiện tốc độ phản ứng cũng như không thể tạo thành nhiều glucose hơn cho nấm men sử dụng. Do đó, với mỗi nồng độ cơ chất nhất định, chỉ cần một lượng enzyme nhất định, nhiều hơn cũng không tăng được thêm nồng độ cồn. Nồng độ cồn tăng, lượng đường sau lên men cũng tăng theo do lượng enzyme lớn sẽ tạo ra lượng đường lớn, mà lượng nấm men là như nhau vì vậy lượng đường tạo thành nhờ enzyme nhiều hơn nhu cầu sử dụng của nấm men. 60