Đồ án Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia Marcescens SH1

87 trang thiennha21 12/04/2022 4520

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia Marcescens SH1", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

thiet_lap_moi_truong_dinh_duong_va_dieu_kien_nuoi_cay_de_san.pdf

Nội dung text: Đồ án Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia Marcescens SH1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP MƠI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUƠI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH1 Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HỒI HƯƠNG Sinh viên thực hiện :TRẦN LÂM TÚ QUYÊN MSSV: 1051110139 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
Đồ án tốt nghiệp LỞI CẢM ƠN Em xin được trân trọng cảm ơn quý thầy cơ khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm - Mơi trường, trường Đại học Cơng nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức nền tảng, những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình học tập và làm đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hồi Hương, người cơ đáng kính, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho em về nội dung cũng như các kỹ năng, phương pháp, cách thức tiến hành thí nghiệm để em cĩ thể hồn thành đồ án tốt nghiệp của mình. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình em thực hiện đồ án tại phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường, Trường Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cơ trong hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp của em. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luơn ủng hộ, thương yêu và dành cho con những điều tốt đẹp nhất trong suốt quá trình học tập cũng như trong cuộc sống. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 Sinh viện thực hiện
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi, các số liệu và kết quả là trung thực. Nếu phát hiện cĩ bất kỳ sự gian lận nào, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về nội dung đồ án của mình. Trường Đại học Cơng Nghệ TP. HCM khơng liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tơi gây ra trong quá trình thực hiện. TP.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện
Đồ án tốt nghiệp Mở Đầu 1. Tính cấp thiết của đề tài Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn như thực vật, vi sinh vật, động vật cĩ xương sống và khơng xương sống là những nguồn cĩ giá trị của các hợp chất hoạt tính sinh học. Một số lượng lớn các loại thuốc đã được phát triển trong ngành y từ các sản phẩm tự nhiên (Amador và cộng sự. 2003). Kể từ khi phát hiện và thành cơng trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã được sử dụng như một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học cĩ cấu trúc đa dạng. các ứng dụng điều trị của các chất chuyển hĩa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin ), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ : lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thư (ví dụ: doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin). Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên được chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ cũng như từ vi sinh vật đã được sử dụng trong việc làm thuốc đơng y, mỹ phẩm, thực phẩm , Nhưng sau đĩ, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã được nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hĩa học cũng như cách tổng hợp bằng phương pháp hĩa học, bởi người ta cho rằng chúng bền hơn, cĩ thể sản xuất trên quy mơ lớn và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ơ nhiễm mơi trường và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hĩa học đã bắt đầu được quan tâm. So với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh vật ngày càng được quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên và an tồn để sử dụng, sản xuất được quanh năm trong các điều kiện địa lý khác nhau và do sự tăng trưởng nhanh chĩng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản xuất xuống cịn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật cĩ thể dễ dàng được kiểm sốt và dự đốn sản lượng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất prodigiosin được biết đến với ý nghĩa quan trọng. 1
Đồ án tốt nghiệp Một số lồi Serratia, đặc biệt lồi Serratia marcenscens cĩ khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005). Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và cĩ hoạt tính kháng vi sinh vật đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Dựa trên cơ sở lợi ích rất quan trọng của hợp chất prodigiosin được tách từ việc nuơi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, đề tài “THIẾT LẬP MƠI TRƢỜNG DINH DƢỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUƠI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN S. MARCESCENS SH1” được tiến hành nhằm tìm ra được mơi trường và điều kiện nuơi cấy để tổng hợp ra prodigiosin cao nhất. 2. Mục tiêu của nghiên cứu Khảo sát các loại mơi trường tổng hợp prodigiosin cao nhất. Khảo sát các điều kiện nuơi cấy tổng hợp prodigiosin cao nhất. 3. Ý nghĩa khoa học Tìm ra được mơi trường nuơi cấy tốt nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất. Thiết lập được điều kiện nuơi cấy tối ưu nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất. 4. Ý nhĩa thực tiễn Prodigiosin là hợp chất thứ cấp vi sinh vật được nghiên cứu phát triển dược phẩm nên được bán trên thị trường với giá rất cao. Thành cơng của đề tài sẽ gĩp phần vào việc tìm được mơi trường tốt nhất và điều kiện nuơi cấy tối ưu để sản xuất và ứng dụng hợp chất prodigiosin. 2
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1. Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất được tạo ra từ hợp chất sơ cấp, cĩ trọng lượng phân tử nhỏ, thường được gọi là chất cĩ hoạt tính sinh học đĩng vai trị điều hịa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của mơi trường xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất được vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hĩa hợp chất sơ cấp 1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã được sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học như thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Cĩ sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành cơng nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn như hợp chất thứ cấp, được xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học như động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật được sử dụng trong ngành cơng nghiệp chế biến cá, ví dụ như để tăng màu hồng của cá hồi nuơi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên cĩ tiềm năng thương mại để sử dụng như chất chống oxy hĩa. Ngành cơng nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lượng hợp chất rất lớn như: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này cĩ tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng như cĩ thể dễ dàng tối ưu hĩa quy trình cơng nghệ (Juailova và cộng sự, 1997). Bên cạnh đĩ, một số vi sinh vật cĩ khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác như: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng cĩ khả năng sản xuất số lượng lớn hợp 3
Đồ án tốt nghiệp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đĩ kháng sinh, nhĩm hoạt chất cĩ khả năng gây chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, được một số vi sinh vật (fungi, actmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh cĩ phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tĩm tắt về một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật. Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật Hợp chất thứ Vi sinh vật Ứng dụng Kiểu tác động ức chế cấp Penicillium notatum, Ức chế tụ cầu Ức chế tạo polymer Penicillium khuẩn, nhiễm vách tế bào vi khuẩn, chrysogenum Penicillin trùng kỵ khí, ức chế hấp thu amino giang mai, hen acid và protein, ức chế suyễn. tạo enzyme Streptomyces griceus Ức chế vi khuẩn Ức chế ghép nối một Gram âm và ram số amino acid vào dương. Trị bệnh protein, tác động lên Streptomycin lao, bệnh viêm hệ enzyme của vi màng não, ho gà khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb Steptomyces Ức chế đối với Ức chế đặc hiệu sinh venezuelae bệnh lỵ, sốt cao, tổng hợp protein vi sốt phát ban khuẩn liên quan đến peptidyl transferase Chloramphenicol trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn khơng cho tạo liên kết peptide 4
Đồ án tốt nghiệp Streptomyces Ức chế phổ rộng Ức chế tổng hợp aureomycin Tetracilin vi khuẩn Gram protein âm, Gram dương Streptomyces Chữa bệnh do tụ ức chế vi khuẩn Gram erythraeus cầu khuẩn âm và Gram dương Erythromycin streptococcal gây ra Streptomyces fradiae Tác dụng vi Hơi độc Neomycin khuẩnn Gram âm và Gram dương Streptomyces Điều trị lao, ức Tác động giống như kanamycetius chế vi khuẩn streptomycin và Kanamycin Gram âm và neomycin Gram dương Streptomyces Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hợp vách Cycloserine lavendulae tế bào 1.2. Tổng quan prodigiosin 1.2.1. Khái niệm về prodigiosin Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” cĩ nguồn gốc từ “prodigious” cĩ nghĩa là một điều gì đĩ kỳ diệu. Prodigiosin được tìm thấy ở dạng túi bên ngồi tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). 5
Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin là một chất chuyển hĩa thứ cấp, được sản xuất bởi các vi khuẩn như Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các xạ khuẩn Gram dương, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc hĩa học của các hợp chất đại diện của prodigiosin. Hình 1.1. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin Mãi đến năm 1960, cơng thức hĩa học chính xác của prodigiosin được tổng hợp bởi Serrattia marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chĩng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo, mà cấu trúc của prodigiosin dần được nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000). 6
Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)- methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) cĩ cơng thức phân tử C20H25N3O và trọng lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid cĩ cấu trúc hĩa học đặc biệt, với ba vịng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đĩ hai vịng đầu liên kết trực tiếp với nhau, cịn vịng thứ ba được gắn vào thơng qua cầu nối methene (Qadri và Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin cĩ bảy liên kết đơi và được miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và khơng tan được trong nước. Prodigiosin cĩ thể tan tương đối trong alcohol và ether; bên cạnh đĩ, nĩ dễ tan trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafari và cộng sự, 2006). Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Trọng lƣơng Danh pháp Lồi Tên sắc tố phân tử và prodigiosin cơng thức 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da C20 Serratia marcescens Prodigiosin methoxy prodigiosene H25 N30 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da Serratia marcescens Norprodigiosin hydroxy-prodigiosene C10 H23N3O Nocardia 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) Nonylprodigiosin methoxyprodigiosene C23H31 N3O madurae 7
Đồ án tốt nghiệp Nocardia 2,10-Nonano-6- 265,5 Da (Actinomadura) Cyclononylprodigiosin melhoxy-prodigiosene C23H33 N3O Madurae Nocardia Methylcyclodc 2,10-Nonano-6- 391,5 Da (Actinomadura) cyl-prodigiosin Methoxy-prodigiosene C25H33N3O pellctieri Streptomyces longisporusruber và 2-Undecyl-6- 393,6 Da Nocardia Undccylprodigiosin Rnethoxyprodigiosene C25 H35 N3O (Actinomadura) pelletieri 2,4-(9-Ethylnonano) Streplonlyces 391,6 Da Metacycloprodigiosin -6- longisporusruber C25H33N3O methoxyprodigiosene 1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin 1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn Prodigiosin cĩ khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số lồi vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng tế bào và khả năng ức chế các enzyme như DNA gyrase, topoisomerase IV, dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009). Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin cĩ thể kháng một số vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, Tuy nhiên, hoạt động kháng khuẩn của prodigiosin 8
Đồ án tốt nghiệp đối với các vi khuẩn Gram dương lại cao hơn so với các vi khuẩn Gram âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). 1.2.3.2. Hoạt tính chống tế bào ung thư Prodigiosin cĩ khả năng gây độc tế bào và cĩ thể chống lại một loạt các dịng tế bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng sự,2009; Pérez-Tomás và Viđas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc này, prodigiosin hứa hẹn cĩ nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thư. Các hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh lần đầu tiên bằng những tác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7 hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999). Một mơ hình khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin cĩ khả năng ức chế sự di căn, bằng cách nĩ đã giảm sự di căn trên tế bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thư thơng qua nhiều cơ chế. Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin chủ yếu là do ảnh hưởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính. Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đường prodigiosin gây sự tự hủy của các tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011). Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin được mơ tả cụ thể như sau: 9
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự, 2011) Quá trình acid hĩa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng của quá trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004). Acid hĩa nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình tự hủy trong tế bào HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tương tự như prodigiosin gây ra sự tự hủy ở tế bào ung thư ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005). Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đường tự hủy của ty thể bằng cách điều hịa tính thấm của màng ty thể bên ngồi. Tăng tính thấm của màng ty thể bên ngồi sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c, nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy. Prodigiosin được biết là tác nhân gây ra sự kích thích quá trình tự hủy của protein BCL-2 BAX trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004). Tương tự như vậy, các nghiên cứu cũng đã chứng minh trước đĩ undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự hủy BCL-XL nhưng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và cộng sự, 2007). Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase. Survivin hoặc XIAP cao sẽ tạo ra sự đề kháng, điều này rất phổ biến trong các tế bào ung thư (Schimmer và cộng sự, 2006; Altieri, 2008). Một nghiên cứu trước đĩ của các tác giả thấy rằng 10
Đồ án tốt nghiệp cả survivin và XIAP đều được giảm đi bởi sự cĩ mặt của undecylprodigiosin trong tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007). Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thư, prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thư bằng cách gây ra quá trình ngừng chu kỳ tế bào ở nồng độ khơng gây độc cho tế bào. Để làm điều này, undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997). Tương tự như vậy, prodigiosin gây ra ngừng tăng trưởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách giảm phosphoryl hĩa Rb thơng qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2 và cyclin A-CDK2, cũng như bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003). Một nghiên cứu gần đây của Soto- Cerrato và cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào cách prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1. Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu dẫn đến sự tử vong do bệnh ung thư và làm tăng nhu cầu về thuốc chống di căn. Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã được chứng minh trong một mơ hình khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự, 2005). Cơ chế hoạt động chống di căn của prodigiosin cĩ thể là do tác dụng ức chế của nĩ trên các tế bào di căn và xâm nhập, cĩ thể thơng qua quá trình down-regulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và cộng sự, 2005). Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dịng tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, cĩ nguồn gốc từ phổi, ruột, thận, buồng trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế bào cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dịng tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). 11
Đồ án tốt nghiệp Ngồi ra, prodigiosin cũng được tìm thấy gây độc tế bào ung thư phổi và các tế bào biểu mơ kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng thuốc (Lagostera và cộng sự, 2005). 1.2.3.3. Hoạt tính ức chế miễn dịch Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mơ tả bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và metacycloprodigiosin trong canh trường nuơi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế bào lympho B (Han và cộng sự, 2001). Sau đĩ, hoạt động ức chế miễn dịch đã được chứng minh cho các chất tương tự prodigiosin khác như: undecylprodigiosin, cPrG, MAMPDM, nonylprodigiosin, Bảng 1.3. Ảnh hưởng prodigiosin đến khả năng tồn tại của các tế bào miễn dịch (Hwanmook và cộng sự, 2003) Khả năng tồn tại (%) Prodigiosin Ngay thứ (nM) Ngày thứ hai Ngày thứ ba nhất Đồi chứng 0 93 79 77 3 96 86 79 10 89 82 79 30 89 70 81 100 82 70 70 Thử nghiệm 300 68 14 18 1000 74 14 14 3000 61 9 8 10 000 32 4 4 30 000 4 4 4 12
Đồ án tốt nghiệp 1.3. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin 1.3.1. Điều kiện tổng hợp prodigiosin Helvia và cộng sự (2010), đã tối ưu hĩa quá trình sản xuất proodigiosin bởi Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nước thải từ cơng nghiệp chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l. Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hĩa sản xuất prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu cho việc sản xuất prodigiosin trong mơi trường Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và quá trình chiết xuất prodigiosin được thực hiện bằng ethanol: hydrochloric acid (9,5: 0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngồi ra, prodigiosin thu nhận được cĩ tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin cĩ khả năng kháng khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., hơn nữa, prodigiosin cĩ khả năng chống oxy hĩa ở nồng độ 22,05 μg/ml và cĩ tiềm năng nhuộm, cùng với việc khơng bị ảnh hưởng bởi acid, kiềm , chất tẩy rửa, mà cĩ thể ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành cơng nghiệp trị liệu. Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các mơi trường dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và cĩ thể sử dụng để nhuộm bơng tạo ra màu đẹp. San và cộng sự (2012), đã sử dụng chất thải chế biến thủy sản như một nguồn carbon và nitơ để sản xuất prodigiosin từ Serratia marcescens TKU011. Hơn nữa, nghiên cứu của các tác giả này cũng cho thấy prodigiosin cĩ khả năng diệt cơn trùng. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn như Alteromonas 13
Đồ án tốt nghiệp sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đĩ, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 μg/ml. 1.3.2. Cơ chế tổng hợp prodigiosin Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens, ATCC 274 (Sma 274) đã được báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Prodigiosin được hình thành qua hai giai đoạn: 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, được gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene. Cĩ rất ít thơng tin về con đường sinh tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC, ngoại trừ việc mơ tả về phân tử proline kết hợp nguyên vẹn thành một trong những nhĩm pyrrole của MBC. Quá trình tổng hợp sắc tố này cần cĩ khơng khí và phân tử oxy (Williams và Qadri, 1980). Hình 1.3. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001). Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để thực hiện thử nghiệm trong các chất chuyển hĩa của Serratia marcescens và cĩ thể hữu ích đối với việc nghiên cứu 14
Đồ án tốt nghiệp một hệ thống mơ hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hĩa thứ cấp trong vi khuẩn. Tách các phân tử tái tổ hợp mã hĩa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. Việc tách trình tự của DNA mã hĩa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống nhân bản vector ở Escherichia coli cosmid đã được báo cáo (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 được biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm), mặc dù nĩ đã khơng được biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn khác thuộc Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và cộng sự, 2000). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thơng qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã được thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000). Nhĩm sắc tố Serratia được quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và Streptomyces coelicolor và được bố trí trong pigA đến pigN, trong đĩ cĩ năm gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), được mơ tả ở hình 1.4. Bốn gene cịn lại khơng cĩ vai trị tổng hợp, tuy nhiên, cĩ một protein cịn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự gene của hai lồi Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thước và trình tự amino acid khác nhau giữa các lồi (Cerdeno và cộng sự, 2001). 1.3.3. Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin Prodigiosin là một chất chuyển hĩa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng sự, 2004). Bản chất màu đỏ tươi 15
Đồ án tốt nghiệp của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng hạn như: nhiệt độ, pH, độ oxy hịa tan, ánh sáng, phosphate vơ cơ và thành phần mơi trường ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự, 1994; Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005). Quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nhạy cảm với nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004). Hơn nữa, mơi trường thơng thường được sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi các chủng Serratia marcescens là mơi trường phức tạp và rất giàu dinh dưỡng (Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất dinh dưỡng như thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng đối với sản xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự, 1977), adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại cĩ tác dụng ức chế sản lượng prodigiosin. Hình 1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên các mơi trường khác nhau như: mơi trường hạt mè, nutrient broth và peptone glycerol broth, Các mơi trường cũng được so sánh tốc độ tăng trưởng và khả năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan 16
Đồ án tốt nghiệp sát vai trị của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong hạt cĩ thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều prodigiosin hơn. Trên mơi trường peanut broth thì prodigiosin cĩ thể tổng hợp ở nhiệt độ 37oC trong khi trên các mơi trường như nutrient broth, peptone glycerol broth cĩ hoặc khơng cĩ bổ sung đường cũng khơng thể làm được điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các loại đường metabolizable khác do sự giảm pH trong canh trường nuơi cấy Khanafari và cộng sự, 2006). Bên cạnh đĩ, cĩ thể xét đến vai trị của nguồn carbon trong quá trình sản xuất sắc tố. Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là mơi trường này khơng cĩ nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose làm tăng cường việc sản xuất sắc tố, trong trường hợp sử dụng mơi trường sesame broth thì nguồn carbon ở dạng các acid béo. Maltose và glucose được thêm vào nutrient broth làm tăng gấp đơi năng suất so với chỉ sử dụng mơi trường nutrient broth hoặc peptone glycerol broth. Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố được tăng cường trong mơi trường peptone glycerol broth ở 30oC và trong nutrient broth ở 28oC, điều này cĩ thể là do sự hiện diện của glycerol như là một nguồn carbon. Rõ ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ tăng trưởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Ngồi ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silicagel vào mơi trường lỏng của Serratia marcescens cũng dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001). Hơn nữa, prodigiosin thường nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn như SDS vào mơi trường nuơi cấy cũng cĩ thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Feng và cộng sự, 1982; Wei và Chen, 2005). 17
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các mơi trường và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009). STT Mơi trƣờng sử dụng Nhiệt độ Tác giả 280C 300C 370C 1 Mơi trường dextrose bổ sung 13,0 - - Pruss and casein Matsummura, 1996 2 Ethanol và nguồn carbon 3,0 - - Mandarville, 2001 3 Canh dinh dưỡng 0,52 0,354 0,111 Giri and cs, 2004 4 Cang pepton glycerol 0,302 0,569 0,111 Giri and cs, 2004 5 Mơi trường hạt mè 16,68 9,3 0,319 Giri and cs, 2004 6 Canh dinh dưỡng bổ sung 0,5% 1,836 0,79 0,104 Giri and cs, 2004 maltose 7 Canh dinh dưỡng bổ sung 0,5% 1,698 0,29 0,104 Giri and cs, 2004 glucose 8 Mơi trường hạt mè bổ sung 9,43 8,56 1,63 Giri and cs, 2004 0,5% maltose 9 Mơi trường hạt mè bổ sung 1,47 1,16 0,42 Giri and cs, 2004 0,5% glucose 10 Mơi trường dầu mè 0,767 1,006 0,107 Giri and cs, 2004 11 Mơi trường hạt đậu phộng 38,75 25,98 1,49 Giri and cs, 2004 12 Mơi trường dầu đậu phộng 2,89 0,559 0,111 Giri and cs, 2004 13 Mơi trường từ dừa 1,94 1,39 0,1736 Giri and cs, 2004 14 Mơi trường dầu dừa 1,42 0,05 0,117 Giri and cs, 2004 Prodigiosin được phân lập từ Serratia marcescens. Hiển thị kháng khuẩn, chống ung thư, gây độc tế bào, ức chế miễn dịch, và chống các hoạt động đào thải trong quá trình cấy ghép . Prodigiosin gây ra ức chế trong tế bào ung thư máu và các tế bào cĩ nguồn gốc từ các loại ung thư khác của con người, bao gồm cả dạ dày và đại 18
Đồ án tốt nghiệp tràng khơng cĩ độc tính đáng kể trong các dịng tế bào ác tính. Vì vậy, prodigiosin được sản xuất mang tính thương mại trên tồn thế giới, điều đĩ được thể hiện trong bảng 1.5. Bảng 1.5. Giá trị thương mại prodigiosin trên thế giới (Santa Cruz Biotechnology, Merck Millipore, Biovision incorporated) ĐỘ ST GÍA THÀNH TINH THƠNG SỐ KỸ THUẬT ỨNG DỤNG T SẢN PHẨM SẠCH Hoạt động như một mTORC1 - Độ hịa tan : DMSO hoặc 95 $/ 250 휇g và mRTOC2 Ethanol = 2000000 ức chế chất - Nhiệt độ lưu trữ: -200C VNĐ/ 250 휇g ≥ 95% phát triển phức 1 - Điều kiện vận chuyển : gĩi gel, 355 $/ 1 mg = HPLC tạp. Chỉ sử tránh khơng khí ánh sáng. 7100000 VNĐ/ dụng cho - Dạng thành phẩm: rắn màu đỏ 1mg nghiên cứu, đậm khơng sử dụng cho người - Trạng thái vật lý: rắn Hoạt động như - Cĩ nguồn gốc từ: Serratia một kháng marcescens sinh. Chỉ sử 349 $/500 휇g - Độ hịa tan: Hịa tan trong dụng cho 2 = 6980000 >95% ethanol, methanol, DMF hoặc nghiên cứu, VNĐ/ 500 휇g DMSO. Tan trong nước hạn chế khơng sử dụng - Bảo quản: ở nhiệt độ -20°C cho điều trị ở - Điểm nĩng chảy: 151-152ºC người. 3 159 GBP/200 휇g >95% - Nguồn: marcescens Serratia Một ứng dụng 19
Đồ án tốt nghiệp = 3975000 HPLC - Xuất hiện: rắn, màu đỏ đậm hợp chất tế VNĐ/ 200 휇g - Lưu trữ dài hạn: -20 ° C bào thẩm thấu - Độ hịa tan: Hịa tan trong cĩ hiển thị ức ethanol, methanol, DMF hoặc chế miễn dịch DMSO. Tan trong nước hạn chế. và chống khối - Đĩng gĩi khí trơ u đặc tính khơng phân biệt tình trạng p53 và kháng đa thuốc. 1.3.4. Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin 1.3.4.1. Thu nhận và tinh sạch Các sắc tố khơng tan trong nước mà tan trong dầu thường được chiết xuất bằng dung mơi hữu cơ pha nước như: acetone, methanol, ethanol, hoặc các hỗn hợp của các dung mơi, để giúp các dung mơi này hoạt động tốt hơn. Chiết xuất thường cĩ chứa một lượng nước đáng kể, do đĩ, cĩ thể được loại bỏ bằng cách phân lớp nhờ hexane, petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn hợp các dung mơi. Sắc ký, quang phổ hấp thụ ở vùng khả kiến là cơ sở đầu tiên dùng để xác định các chất màu. Quang phổ sẽ được thực hiện, lưu giữ và sau đĩ tiến hành so sánh với các phổ chuẩn (Amaya. 2001). Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đây được đề xuất là nên thực hiện để xác định một hợp chất chưa biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng sự, 1994). - Phổ khả kiến (휇max ). - Sắc ký lớp mỏng (Rf). - Sắc ký lỏng cao áp (thời gian lưu mẫu). - Phương pháp phổ khối (khối lượng phân tử). 20
Đồ án tốt nghiệp - NMR (chuyển hĩa về mặt hĩa học). Các nhà khoa học đã thực hiện nhiều nghiên cứu về quá trình thu nhận và tinh sạch prodigiosin như sau: - Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) được chiết xuất từ mơi trường nutrient broth nuơi cấy Serratia marcescens sau 72 giờ, với ethanol và petroleum ether, tiếp theo loại bỏ dung mơi trong một cốc nước sơi (hay trong một bể cách thủy) và hịa tan phần cịn lại vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky, 1980). - Các sắc tố từ tế bào của Serratia marcescens phân lập từ đất được chiết xuất bằng acetone, hịa với một ít ethyl acetate, và được sấy khơ bằng natri sulfat. Các chất chiết xuất được hịa tan và được thực hiện quét từ bước sĩng 200 – 700 nm. Hỗn hợp dung mơi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5: 2,5: 0,5 đã được sử dụng để tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với các sắc tố bằng sắc ký lớp mỏng. Cột silicagel cĩ kích thước từ 80 – 100 mesh đã được sử dụng để phân tách các tạp chất khơng màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết cho thấy cĩ độ hấp thụ cao duy nhất tại 535 nm trong quang phổ UV. Nĩ được tiếp tục phân tích để xác định trọng lượng phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ khối. Các sắc tố prodigiosin tinh khiết được đem phân tích quang phổ khối cho thấy chúng cĩ trọng lượng phân tử là 324 Da (Giri và cộng sự, 2004). - Prodigiosin được chiết xuất bằng cách lắc mơi trường nuơi cấy tế bào Serratia marcescens 2170 với methanol cĩ tính acid (1ml dung dịch HCl 1N: 24ml methanol) và dịch trong suốt được làm cho bay hơi trong chân khơng. Sắc ký lỏng cao áp của các chiết xuất được thực hiện trên silicagel với dung mơi chloroform và methanol. Các sắc tố thu được sẽ được rửa giải trong methanol và phân tích bởi phương pháp phổ khối (ESI-MS). Sau đĩ, các sắc tố chưa tinh khiết đã thu được sẽ tiếp tục được thực hiện phương pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil C18 (250x4 mm, 10 vm) đã được sử dụng với một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% acetonitrile). Việc 21
Đồ án tốt nghiệp rửa giải được theo dõi bằng cách sử dụng cả hai máy dị UV diode-array và ESI-MS (Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003). - Sau khi lên men Serratia marcescens phân lập từ đất, canh trường được lấy từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đĩ, 1 lít ethanol 95% (v/v) đã acid hĩa (pH 3,0) được thêm vào IAB. Các sắc tố được chiết xuất bằng cách sử dụng một vịng trịn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vịng trong 5 giờ, rồi đem cơ đặc và ly tâm. Sau đĩ, nĩ được thu bằng cách sử dụng nước và chloroform để tách pha. Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dưới của pha chloroform và được cơ đặc bằng cách cho bốc hơi. Prodigiosin được phân tách bằng sắc ký cột silicagel (2,5 × 30 cm). Nĩ được rửa với một hỗn hợp hexane: ethyl acetate (2: 1, v/v). Các sắc tố cơ đặc đã được tách ra bởi việc sử dụng hỗn hợp chloroform: methanol 95:5 (v/v) trong TLC. Sau đĩ, màu đỏ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã được thu nhận và hịa tan trong acetone. Các sắc tố chưa tinh khiết sẽ tiếp tục được thực hiên phương pháp TLC (với tỷ lệ dung mơi chloroform: methanol: diethyl ether là 6: 2: 2), và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm)). Sau đĩ, nĩ được tách rửa với hỗn hợp methanol: nước (7:3, v/v) đã được điều chỉnh pH= 3,0 bằng 0,1N HCl với tốc độ dịng chảy là 20 ml/ phút. Một lưới thép khơng gỉ lớn với kích thước lỗ 0,5 cm đã được sử dụng như sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng độ của các prodigiosin đỏ sản xuất ra được ước tính bằng cách đo độ hấp thụ ở 535 nm sử dụng chùm quang phổ tia UV khả kiến trong methanol đã được acid hĩa (0,01N HCI 4ml + 96ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối lượng phân tử của chất màu tinh khiết được xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các 1H- và 13C-NMR của các mẫu màu được ghi nhận sau khi hịa tan trong CDCl3. Các dịch chuyển hĩa đã được đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố được ghi nhận (Song và cộng sự, 2006). 1.3.4.2. Định lượng Mẫu tinh khiết của prodigiosin cho thấy nĩ cĩ độ hấp thụ cao và duy nhất tại bước sĩng 535nm trong quang phổ UV (Giri và cộng sự, 2004). Chính vì vậy, 22
Đồ án tốt nghiệp nồng độ của các prodigiosin đỏ sản xuất ra được thu nhận trong methanol đã acid hĩa (với 0,01N HCI 4ml và 96ml methanol) sẽ được ước tính bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sĩng 535 nm và sử dụng quang phổ UV khả kiến (Goldschmidt và Williams, 1968). Tổng số các sắc tố được ước tính theo cơng thức sau (Chen và cộng sự, 2006; Williams và cộng sự, 1960): 퐀퐱퐃퐱퐕 TP(µg/L)= . 퐱 ^ퟒ퐱퐕 Trong đĩ: - TP: Biểu thị tổng số sắc tố thu được (μg/L). - A: Độ hấp thụ của sắc tố được chiết xuất trong methanol ở 535 nm. - D: Hệ số pha lỗng. - V1: Thể tích methanol bổ sung vào. V2: Thể tích canh trường ban đầu. - 7.07×104: Hệ số hấp thụ của prodigiosin. 1.4. Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens Trong nhiều thập kỷ qua, prodigiosin được biết đến là một hợp chất tự nhiên cĩ thể gây độc tế bào (Furstner, 2003) và được sản xuất bởi các vi sinh vật như Vibrio psychroerythrus (D’ Aoust và Gerber, 1974), Serratia marcescens, Pseudomonas magnesiorubra và một số vi khuẩn khác (Lewis và Corpe, 1964). Đặc trưng của Serratia marcescens là sản xuất sắc tố đỏ khơng cĩ khả năng khuếch tán prodigiosin nên khuẩn lạc cĩ màu đỏ rất đẹp (Kalesperis và cộng sự, 1975; Gargallo và cộng sự, 1987; Gargallo-Viola, 1989). S. marcescens cũng là một tác nhân gây bệnh cơ hội ở người với những chủng khơng sản xuất sắc tố gây đe dọa sức khỏe cộng đồng (Gargallo-Viola, 1989). Những chủng sản xuất sắc tố phân lập từ tự nhiên ít liên quan đến nhiễm trùng và thật thú vị là những sắc tố đỏ khơng tan trong nước này lại được báo cáo là cĩ hoạt tính kháng sinh (Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji và cộng sự, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Các prodigiosin tốt nhất được biết đến là một chất màu đỏ nondiffusible gắn với lớp màng bên trong tế bào (Iranshahi và cộng sự, 2004). S. marcescens cũng 23
Đồ án tốt nghiệp sản xuất một chất hịa tan trong nước, cĩ màu đỏ hồng tím superoxidase dismutase (Hardjito và cộng sự, 2002). Ở S. marcescens khuẩn lạc rất nhỏ và ban đầu khơng cĩ màu, màu đầu tiên xuất hiện gần đường kính khuẩn lạc khoảng 1mm (Haddix và Werner, 2000). S. marcescens chỉ tổng hợp sắc tố trong một điều kiện nhất định. Bizio và Sette đã phân lập được sắc tố đỏ sản xuất bởi các chủng Serratia và cố gắng sử dụng nĩ như là một loại thuốc nhuộm cho mục đích thương mại. Tuy nhiên, ở dạng tinh khiết nĩ quá nhạy cảm với ánh sáng khi được sử dụng thực tế (Furstner, 2003). Serratia, giống các vi sinh vật họ Enterobacteriaceae khác, cĩ thể phát triển tốt trong điều kiện mơi trường kỵ khí và hiếu khí. Nĩ phát triển tốt trên các mơi trường tổng hợp, sử dụng các hợp chất khác nhau như một nguồn carbon duy nhất. Giri và cộng sự (2004) đã thực hiện thử nghiệm trên một loạt các mơi trường và phát hiện ra trên mơi trường từ hạt đậu phộng làm tăng một lượng đáng kể prodigiosin. Hơn nữa, một báo cáo chứng minh việc bổ sung silicagel vào mơi trường lỏng của S. marcescens cũng dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001). Ngồi ra, prodigiosin thường nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn như sodium dodecyl sulface (SDS) cũng cĩ thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Wei và Chen, 2005). Hardjito và cộng sự (2002) báo cáo rằng việc sản xuất sắc tố bởi chủng phi lâm sàng (non-clinical) cĩ ý nghĩa khoa học và quan trọng, cĩ một mối quan hệ giữa quá trình sản xuất sắc tố với sự vắng mặt của plasmid. Do đĩ, sản xuất sắc tố do chủng phi lâm sàng của S.marcescens đã được quan tâm nghiên cứu sâu hơn để xác định mối quan hệ của quá trình sản xuất sắc tố và khả năng gây bệnh. Đặc điểm sắc tố của S. marcescens cũng khác nhau (Hardjito và cộng sự, 2002), chịu ảnh hưởng của cả hai yếu tố di truyền và mơi trường. Sản xuất các sắc tố tan trong nước được tăng cường bằng cách bổ sung polymyxin B (Suzuki và cộng sự, 2001), gramicidin và valinomycin vào mơi trường tăng trưởng (Hardjito và cộng sự, 2002). 24
Đồ án tốt nghiệp Khơng nghi ngờ gì nữa, sản xuất sắc tố bởi S. marcescens sẽ tiếp tục hấp dẫn các nhà vi sinh vật học, bác sĩ và kỹ sư cơng nghệ sinh học. Gần đây, prodigiosin đã được xem là hiệu quả như một tác nhân kiểm sốt sinh học với tảo cĩ hại trong mơi trường biển tự nhiên, do đĩ, prodigiosin phải sản xuất với số lượng lớn để cĩ thể đáp ứng nhu cầu trong tương lai (Someya và cộng sự, 2001). 1.5. Tổng quan về Serratia marcescens 1.5.1. Phân loại Serratia marcescens Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhĩm vi khuẩn cĩ liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đĩ, lồi điển hình của chi Serratia là Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serratia marcescens được phân loại như sau: - Giới: Bacteria - Ngành: Proteobacteria - Lớp: Gramma proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Chi: Serratia - Lồi: Serratia marcescens 1.5.2. Đặc điểm của Serratia marcescens 1.5.2.1 Đặc điểm sinh lý Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia marcescens cĩ hình que, đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và cĩ thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). 25
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên mơi trường nutrient agar được mơ tả là khuẩn lạc trịn, lồi và các khuẩn lạc này cĩ màu trắng, hồng hay đỏ, đĩ cũng chính là sắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thường bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Hình 1.6. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên mơi trường nutrient agar ở 250C sau 48 giờ (David, 2012) Serratia marcescens cĩ thể bám dính với nhau trên mơi trường thạch, tạo thành nhĩm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8%); các cụm tế bào này cĩ chiều dài từ 5- 30 μl. Serratia marcescens cũng cĩ thể tạo thành một màng sinh học. 26
Đồ án tốt nghiệp 1.5.2.2 Đặc điểm sinh hĩa Serratia marcescens cĩ thể phát triển trong mơi trường cĩ oxy hoặc trong trường hợp khơng cĩ oxy. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lượng và nhờ cĩ các enzyme như superoxide dismutase, calatase, peroxidase, bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hĩa, cho phép sống trong mơi trường oxy hĩa. Serratia marcescens cĩ thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Ngồi ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào như nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đĩ, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO- NH) trong casein. Một số đặc điểm sinh hĩa của Serratia marcescens được thể hiện qua bảng 1.6 sau: Bảng 1.6. Một số đặc điểm sinh hĩa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010) STT Đặc điểm sinh hĩa Kết quả 1 Di động + 2 Indole - 3 Methyl Red - 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase + 7 Catalase + 8 Oxidase - 9 Urease - 27
Đồ án tốt nghiệp 10 Gelatinase + 11 Chitinase + 12 Triple sugar iron Mơi trường chuyển sang acid, khơng sinh khí và khơng sinh H2 S 13 Hydrogen sulphide peoduction - 14 Lysine decarboxylase + 15 Ornithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose + 20 Lên men xylose - 21 Lên men rhaminose - 22 Lên men lactose - 23 Lên men arabinose - 1.5.2.3. Đặc điểm phân bố Cĩ thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nước, trong đất, trong thực vật, cơn trùng, cũng như trong ống tiêu hĩa của người và động vật cĩ xương sống. - Trong nước và đất: đã cĩ 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sơng và Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đĩ, Serratia marcescens cĩ thể đĩng một vai trị quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thơng qua việc khống hĩa hữu cơ sắt, cũng như hịa tan vàng và đồng (Parès, 1964). - Trong cơn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các lồi cơn trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ưu thế. Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm 28
Đồ án tốt nghiệp năng đối với cơn trùng, chúng làm cơn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là mơi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, người ta cịn phát hiện sự cĩ mặt của Serratia marcescens trong các lồi Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữ Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae. 1.5.3. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của Serratia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng như ảnh hưởng của Serratia marcescens lên thúc đẩy tăng trưởng của cây thuộc chi cam chanh. Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm sốt Pyricularia oryzae gây bệnh trên cây lúa bằng cách sử dụng Serratia marcescens. Nghiên cứu của Gursharan và cộng sự (2007) đã sử dụng chitin, nấm, làm chất nên cho quá trình sản xuất enzyme chitinase bởi Serratia marcescens GG5. Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm Serratia marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria mellonella và đạt được kết quả gây chết 100% ấu trùng. 1.5.4. Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens 1.5.4.1. Sắc tố Một nhĩm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin được tổng hợp từ vi khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), được biết đến như là một yếu tố đặc biệt, nhưng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhĩm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đĩ, khả năng ức chế miễn dịch cĩ trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008). 29
Đồ án tốt nghiệp Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin được sản xuất bởi biogroup A1 và A2/6, nĩ khơng được sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT (Grimont, 1977). Bên cạnh đĩ, chủng khơng sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thường gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont, 1977; Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hĩa sinh tổng hợp prodigiosin đã được biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Các dịng được tạo thành này cĩ khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc tổng hợp giai đoạn MAP ở bên ngồi (Francine và Patrick, 2006). Prodigiosin được biết đến là cĩ khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể người, cĩ thể chúng sẽ khơng tổng hợp prodigiosin và do đĩ thốt khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997). Bên cạnh đĩ, một sắc tố vàng cĩ tên gọi là 2-hydroxy-5- carboxymethylmuconic semialdehyde acid, được sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự, 1988). Enzyme này được cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens. Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a, đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp chất thơm, để cĩ thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006). 1.5.4.2. Biosurfactants Các chủng sinh sắc tố và một số chủng khơng sinh sắc tố của Serratia marcescens đều sản xuất biosurfactants cĩ thể hoạt động như một chất thấm. Chất thấm này được sản xuất với số lượng lớn ở 30°C nhưng khơng được sản xuất ở37°C trong phase cân bằng của quá trình tăng trưởng. Ba aminolipid, từ W1 đến W3, cĩ các hoạt động thấm ướt và đã được tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đĩ, W1 được xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide mà trước đĩ đã từng được phát hiện bởi Wasserman và cộng sự (1961). 30
Đồ án tốt nghiệp 1.5.4.3. Acid béo Các acid béo chủ yếu trong tồn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và octadecanoic acid. Các acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế bào, trong đĩ, ntetradecanoic acid chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983). 1.5.4.4. Enzyme Serratia marcescens cĩ thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease, chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase, Trong đĩ, enzyme chitinase cĩ nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải cĩ chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đĩng gĩi, cũng như kiểm sốt sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước, (Joshi và cộng sự, 1989). Serratia marcescens cĩ khả năng tiết ra các loại enzyme: - Thủy phân casein khơng phải là một đặc điểm chung và do đĩ rất hữu ích trong việc phân biệt Serratia marcescens từ 438 chủng vi khuẩn đường ruột và tập hợp Pseudomonadaceae.Serratia marcescens sử dụng các enzyme ngoại bào được gọi là protease để phá vỡ các lien kết peptide (CO-NH) trong casein. - Tương tự như vậy, một loại enzyme ngoại bào được gọi là gelatinase phân hủy gelatin, một loại protein khơng đầy đủ mà thiếu trytopan. Thủy phân gelatin biến đổi protein thành các acid amin. - Enzyme Catalase. - Enzyme Esculinase. - Enzyme Dnase. 31
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm 2.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 08/04/2014 đến ngày 12/07/2014. 2.1.2. Địa điểm Phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học, Khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực phẩm- Mơi trường, Trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn vi sinh vật Nguồn vi khuẩn thử nghiệm là hai chủng Serratia marcescens do Nguyễn Hồng Anh Kha phân lập từ tuyến trùng EPN, tại phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học, khoa Cơng nghệ sinh học-Thực phẩm-Mơi trường, Đại học Cơng nghệ TP. HCM. Trong đĩ, chủng SH1 được phân lập từ Heterorhabditis indica CP 16 (H.CP 16) và chủng SS1 được phân lập từ Steinernema quangdongsense XT (S.XT). Được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử cĩ số đăng kí trên genbank là KF534508.1. 2.2.2. Mơi trường nuơi cấy và hĩa chất sử dụng 2.2.2.1. Mơi trường nuơi cấy ( thành phần mơi trường xem phụ lục) - Mơi trường Nutrient agar; - Mơi trường Nutrient broth; - Mơi trường Peptone glycerol broth; - Mơi trường Mac Conkey; 32
Đồ án tốt nghiệp - Mơi trường Triple sugar iron agar; - Mơi trường Tryptone broth; - Mơi trường Citrate broth; - Mơi trường huyền phù đậu phộng; - Mơi trường huyền phù đậu phơng gelatin; - Mơi trường huyền phù đậu phộng pepton; - Mơi trường huyền phù đậu phơng với các loại đường; - Mơi trường huyền phù đậu phộng pepton dầu hướng dương; 2.2.2.2. Hĩa chất sử dụng - KIT API 20E (Biomerieux) - Hĩa chất nhuộm Gram; - H2O2; NaCl; HCl; NaOH; - Thuốc thử Kovac’s; - Thuốc thử Griess A và Griess B; - Thuốc thử oxidase; - Nước muối sinh lý 0,85%; - Ethanol 96%; 2.2.2.3. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị Nồi tiệt trùng Autoclave, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy lắc, máy ly tâm, máy đo độ hấp thụ quang học, tủ lạnh thường, tủ cấy vơ trùng, tủ ấm, kính hiển vi 33
Đồ án tốt nghiệp Dụng cụ Cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, pipet, micropipet, ống nghiệm, đĩa petri, Eppendorf, đũa thủy tinh, que cấy,cuvet thủy tinh, 2.3. Nội dung nghiên cứu - Khẳng định các chủng vi sinh vật nghiên cứu thuộc lồi Serratia marcescens qua khảo sát đặc điểm nuơi cấy, cĩ sử dụng KIT API 20E . - Chọn chủng cĩ khả năng tổng hợp prodigiosin cao nhất. - Xác định điều kiện nhân giống. - Xác định mơi trường nuơi cấy. - Xác định điều kiện nuơi cấy 2.4. Phƣơng pháp luận Prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thường trễ hơn pha tăng trưởng tế bào. Dịch mơi trường và và điều kiện nuơi cấy quyết định nồng độ prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các báo cáo trước đĩ của các tác giả ngồi nước để xác định mơi trường dinh dưỡng và điều kiện nuơi cấy cho chủng phân lập của phịng thí nghiệm. 34
Đồ án tốt nghiệp 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Để đạt được mục tiêu của đề tài, người thực hiện tiến hành với các nội dung theo sơ đồ hình 2.1. Các cơng việc được tiến hành theo các trình tự sau: 35
Đồ án tốt nghiệp 2.5.1. Kiểm tra độ thuần khiết và khẳng định là S. marcescens Từ các chủng vi khuẩn đã được phân lập trong phịng thí nghiệm, tiến hành nhân giống cấp 1 bằng mơi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vịng/phút, ở nhiệt độ phịng. Sau đĩ, thu dịch vi khuẩn, tiến hành pha lỗng và cấy trang trên mơi trường đĩa thạch Mac Conkey và NB. Để nhiệt độ phịng trong 24 giờ, kiểm tra khuẩn lạc trên thạch đĩa (cĩ khi để thêm 24 giờ), sau đĩ tiến hành tới các kiểm tra sinh hĩa theo sơ đồ sau: Hình 2.2. Sơ đồ kiểm tra độ thuần khiết và khẳng định là S. marcescens 36
Đồ án tốt nghiệp 2.5.1.1. Tiến hành thí nghiệm kiểm tra độ thuần khiết Khả sát hình thái khuẩn lạc Cấy ria chủng vi khuẩn đã được phân lập trên mơi trường Mac, NA. Dùng dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc. Quan sát dưới kính hiển vi ở hai gĩc độ là từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính 4X và 10X. Nhuộm Gram Tăng sinh chủng vi khuẩn phân lặp được và hai chủng đối chứng là E. coli và Bacillus subtilis trong mơi trường NB 24 giờ, lắc 150 vịng/phút trong tối. Quan sát vi sinh vật dưới vật kính 100X với một giọt dầu soi kính. Vi khuẩn gram âm sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn gram dương sẽ bắt màu tím. Thử nghiệm TSI Pha các thành phần mơi trường TSI trong nước cất, trộn đều, đun nĩng và thỉnh thoảng lắc. Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối chứng E. coli vào sâu vào phần sâu của ống thạch nghiêng cách đáy ống nghiệm khoảng 1cm, sau đĩ ria trên bề mặt thạch nghiêng. Sau khi cấy giống, các ống thạch nghiêng được ủ ở 370C trong 24 giờ. Ghi nhận sự sinh khí ở phần sâu, màu ở mặt thạch nghiêng và sự tạo thành màu đen bởi FeS. Thử nghiệm khả năng sinh Indol Pha mơi trường Tryptone Broth. Dùng que cấy vịng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối chứng E. coli vào ống nghiệm mơi trường Tryptone Broth. Sau khi cấy giống, các ống nghiệm được ủ ở 370C trong 24 giờ. Trước khi bổ sung thuốc thử Kovac’s bổ sung 1 ml petroleum ether, lắc đều để tách indol trên lớp dung mơi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào ống dịch nuơi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung mơi hữu cơ. 37
Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm khả năng khử nitrat Pha mơi trường Nitrate Broth. Dùng que cấy vịng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối chứng E. coli vào ống nghiệm mơi trường Nitrate Broth. Sau khi cấy giống, các ống nghiệm được ủ ở 370C trong 24 giờ. Ta dùng phương pháp thử nghiệm trên lame, sau thời gian ủ, lấy một giọt canh trường nuơi cấy đặt lên lame sạch. Nhỏ một giọt thuốc thử Griess A và một giọt thuốc thử Griess B lên giọt canh trường. Theo dõi sự hình thành màu hồng, nếu màu hồng khơng hình thành ta cho thêm một ít bụi kẽm vào để kiểm tra nitrate. Thử nghiệm Citrate Mục đích Xác định khả năng của một số VSV sử dụng citrate như nguồn cacbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất. Nguyên tắc Sự biến dưỡng citrate bởi VSV sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hĩa mơi trường. Mặt khác mọi sinh vật cĩ khả năng sử dụng citrate thường dùng ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải muối ammonium sinh NH3 làm kiềm hĩa mơi trường. Sự gia tăng giá trị pH được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong mơi trường. Tiến hành Chuẩn bị mơi trường Simmons Citrate Agar với chỉ thị là bromothymol blue. Dùng que cấy vơ trùng cấy ria khuẩn lạc đặc trưng chủng vi sinh vật lên bề mặt mơi trường SCA trong đĩa thạch. Ủ ở 300 C trong 24-48 giờ Phản ứng (-): mơi trường giữ nguyên màu xanh lục. Phản ứng (+): mơi trường chuyển sang màu xanh dương. Khả năng di động Mục đích Xác định khả năng di động của VSV. Nguyên tắc 38
Đồ án tốt nghiệp Khả năng di động là một trong những căn cứ cĩ thể dùng để phân biệt VSV. Khả năng này cĩ thể được quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di động của VSV vào bên trong mơi trường thạch mềm. Tiến hành - Cấy đâm sâu VSV vào mơi trường thạch mềm (0,5% agar). - VSV di động sẽ làm mơi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy. - VSV khơng di động sẽ phát triển quanh đường cấy, mơi trường khơng bị đục. Thử nghiệm catalase Mục đích Định tính khả năng sinh enzyme catalase của VSV. Nguyên tắc Catalase H2O2 H2O + 1/2 O2(bọt khí). Tiến hành - Tạo vết bơi VSV để trên lam kính sạch. - Nhỏ 1-2 giọt H2O2 30%. Quan sát sau 1-2 giây. Phản ứng (+): cĩ bọt khí xuất hiện. Phản ứng (-): khơng cĩ bọt khí xuất hiện 2.5.1.2. Tiến hành thí nghiệm khẳng định là S. marcescens bằng KIT API 20E Sau khi kiểm tra sinh hĩa cho thấy độ thuần khiết và các hoạt tính của vi sinh vật vẫn cịn, tiến hành khẳng định là S. marcescens bằng KIT API 20E theo quá trình sau: Tiến hành - Pha mơi trường NB tăng sinh 2 giống vi sinh vật là SS1 và SH1. Ủ 300C lắc 150 vịng/ phút, trong 20-24 giờ sao cho khi thu canh trường OD600nm khoảng 0,582 - Pha mơi trường NA và nước muối sinh lý 0,85% để cấy trang, thu khuẩn lạc - Tiến hành làm Mc Faland theo hướng dẫn tài liệu Dung dịch BaCl2 1% (w/v) : cân 1.000g BaCl2.2H2O cho vào 50ml nước cất, khuấy đến khi tan rồi định mức 100ml. 39
Đồ án tốt nghiệp Dung dịch H2SO4 1% (v/v): hút 1ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào bình định mức 100ml, sau đĩ dùng nước cất định mức về 100ml. Bàng 2.1. Các mức Mc Faland Nồng độ 0.05 1 2 3 4 BaCl2 1% (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 H2SO4 1% (ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6 - Sau 24h, kiểm tra cĩ khuẩn lạc đặc trưng hay khơng. Nếu cĩ tiến hành test định danh API 20E - Dùng pipetman đã chuẩn bị (hấp khử trùng) hút nước cất vơ trùng vào khay nhựa để bộ KIT đạt độ ẩm nhất định - Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng cho vào nước muối sinh lý cho đến khi đạt độ đục so với Mc Faland cĩ nồng độ =3 - Dùng pipetmen hút nước muối sinh lý đã cĩ vi khuẩn vào từng phản ứng của bộ KIT như sau: Đối với ONPG, TDA, IND, GLU cho đến ARA: cho dịch vào sao cho đầy cupble. Đồi với ADH, LDC, ODC, H2S, URE: cho dịch vào khơng được đầy cupble, sao đĩ cho dầu khống vào ngập cả cupble và tube (đổ cho lồi lên). Đối với CIT, VP, GEL: cho dịch vào sao cho đầy cả cupble và tube (đổ cho lồi lên). - Ghi lại tên người thực hiện, ngày và giờ sau khi cấy xong. - Ủ bộ KIT ở nhiệt độ 370C, từ 18-24 giờ. Sau đĩ đọc kết quả. - Đọc kết quả Sau 18giờ: đọc tất cả các phản ứng và hiện tượng của các test ( trừ TDA, IND, VP), rồi sau đĩ ghi nhận lại kết quả bằng cách : dương tính (+), âm tính (-). Sau 24 giờ: đọc lại tất cả các phản ừng và hiện tượng của các test kể cả TDA, IND, VP, rồi sau đĩ ghi nhận lại kết quả bằng cách: dương tính (+), âm tính (-). Sau khi đọc kết quả test API dị các hệ số bằng phần mếm ứng dụng sẽ kết luận được hai giống SH1 Và SS1 thuộc giống vi sinh vật nào. 40
Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Đánh giá và tuyển chọn chủng vi khuẩn cĩ khả năng tổng hợp prodigiosin cao Sau khi khẳng định là S. marcescens bằng KIT API 20E, tiến hành thí nghiệm đánh giá và tuyển chọn chủng vi sinh vật cĩ khả năng tổng hợp prodigiosin cao. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau: Hình 2.3. Sơ đồ chọn chủng cĩ khả năng tổng hợp prodigiosin cao 41
Đồ án tốt nghiệp Tiến hành thí nghiệm - Bước 1 (nhân giống cấp 2): từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra độ tinh khiết cũng như khẳng định là S. macescens, tiến hành nhân giống cấp 2 trong mơi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vịng/phút, ở nhiệt độ phịng. - Bước 2: thu canh trường, pha lỗng sao cho OD600nm ≈ 0,7. Cấy giống vi khuẩn vào mơi trường NB, tỷ lệ cấy giống 1%, lắc 150 vịng/phút ủ tối trong vịng 48 giờ, ở nhiệt độ phịng. - Bước 3: thu canh trường, tiến hành trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5) theo sơ đồ sau: Hình 2.4. Sơ đồ trích ly canh trường từ mơi trường nuơi cấy thu prodigiosin - Bước 4: gom 3 dịch vừa trích ly vào bình định mức 50 (ml), định mức bằng hỗn hợp dung mơi Ethanol:HCl (95:5), lấy 1ml màu thu được vào ống nghiệm và thêm 4ml dung mơi Ethanol:HCl (95:5), quét phổ hấp thụ ở bước sĩng 400-700nm, dùng hỗn hợp Ethanol:HCl (95:5) làm mẫu trắng. Xác định OD (λmax) các mẫu vừa được quét phổ ở trên. Dựa vào đường chuẩn sắc tố (xem phụ lục B) xác định hàm lượng prodigiosin cĩ trong mẫu. 42
Đồ án tốt nghiệp 2.5.3. Xác định điều kiện nhân giống Thí nghiệm này được trình bày qua sơ đồ hình 2.4: Hình 2.5. Sơ đồ xác định điều kiện nuơi cấy tế bào trong giai đoạn nhân giống Thuyết minh sơ đồ: Nhân giống cấp 1 và cấy giống thực hiện tương tự như thí nghiệm trên (bước 1) (2.6.2). - Thí nghiệm xác định pH nhân giống Thu canh trường, giống cấp 1 pha lỗng sao cho OD600nm ≈ 0,7. Cấy giống vào mơi trường NB được điều chỉnh pH: 6,2; 7,2; 8,2, tỷ lệ cấy giống 1%, lắc 150 vịng/phút trong vịng 24 giờ, ở nhiệt độ phịng. - Thí nghiệm xác định vận tốc lắc khi nhân giống Thu canh trường, giống cấp 1 pha lỗng sao cho OD600nm ≈ 0,7. Cấy giống vi khuẩn vào mơi trường NB, tỷ lệ cấy giống 1%, lắc ở các vận tốc sau: khơng lắc, 150 vịng/phút, 180 vịng/phút, trong vịng 24 giờ, ở nhiệt độ phịng. 43
Đồ án tốt nghiệp - Sau thời gian thí nghiệm, đo OD600nm canh tường, dựa vào đường chuẩn tế bào (xem phụ lục B) tính tốn được mật độ tế bào, chọn điều kiện nào cho mật độ tế bào cao nhất. Từ đĩ xác định được những điều kiện nhân giống để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.5.4. Xác định mơi trường lên men thu prodigiosin Sau khi xác định được được các điều kiện nhân giống cho mật độ tế bào cao, tiến hành thí nghiệm xác định mơi trường lên men thu prodigiosin. Quy trình xác định mơi trường được thể hiện qua sở đồ sau: Hình 2.6. Sơ đồ xác định mơi trường lên men thu prodigiosin 44
Đồ án tốt nghiệp 2.5.4.1. Xác định mơi trường MT1 lên men thu prodigiosin Ở mơi trường cơ bản (MT0) thành phần chủ yếu là đậu phộng nguyên chất. được sơ chế bằng cách luộc chin và tiến hành theo các bước sau: cân 50g đậu phộng, luộc bỏ vỏ, bổ sung nước để đạt 250g, xay nhuyễn. - Điều chế mơi trường thí nghiệm MT1: từ mơi trường cơ bản MT0 bổ sung nước như sau: 5ml MT0 + 15ml nước (đậu phộng 5%) 10ml MT0 + 10ml nước (đậu phộng10%) 15ml MT0 + 15ml nước (đậu phộng 15%) 20ml MT0 + 0ml nước (đậu phộng 20%) Mơi trường pepton glycerol làm đồi chứng - Nhân giống và cấy giống thực hiện theo quy trình trong thí nghiệm chọn chủng cĩ khả năng tổng hợp prodigiosin cao (bước 1 ở mục 2.6.2). - Cấy giống cấp 2 vào mơi trường lên men MT1 thu prodigiosin giống như bước 2 ở thí nghiệm 2.6.3. Các điều kiện lên men thu prodigiosin giống như các điều kiện ở các thí nghiệm trên như tỉ lệ cấy giống 1%, vận tốc lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ phịng. - Sau 48 giờ, tiến hành thu mẫu và trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5) theo sơ đồ sau: Dịch 1 + Dịch 2 Hình 2.7. Sơ đồ trích ly prodigiosin từ canh trường nuơi cấy cĩ chứa đậu phộng + 45
Đồ án tốt nghiệp Sau khi trích ly, loại bỏ dịch trong, gom dịch 1 và dịch 2 vừa trích ly vào bình định mức 50 (ml) định mức về 50 ml bằng hỗn hợp dung mơi Ethanol:HCl (95:5), tiến hành đo OD (λmax) hợp chất thu được và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu. Từ đĩ, tìm ra được mơi trường cĩ hàm lượng đậu phộng khơ cho quá trình lên men thu prodigiosin cao nhất sao với các mơi trường cịn lại để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.5.4.2. Xác định nguồn nito bổ sung vào mơi trường MT1 để được MT2 Sau khi xác định hàm lượng đậu phộng khơ trong mơi trường MT1 lên men thu prodigiosin cao nhất, xác định nguồn nito bổ sung vào để được mơi trường MT2. Ở mơi trường MT2 này nguồn nito được bổ sung theo các tỉ lệ khác nhau: 0% (đối chứng), 2,5 %, 5%, 10% (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần). Tiến hành theo các bước sau: - Các bước nhân giống và cấy giống tiếp theo thực hiện quy trình giống như ở thí nghiệm chọn chủng cĩ khả năng tổng hợp prodigiosin cao (2.6.2). Nhân giống cấp 2 vào mơi trường MT2 lên men thu prodigiosin giống với thí nghiệm trên (2.6.3). Các điều kiện: tỉ lệ cấy giống 1%, vận tốc lắc là 150 vịng/phút, nhiệt độ phịng, ủ tối, điều được cố định ở các nghiệm thức. - Sau 48 giờ, tiến hành thu mẫu và trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5) giống như quy trình trích ly ở thí nghiệm điều chế mơi trường MT1. - Sau khi trích ly, tiến hành xác đo OD (λmax) hợp chất thu được và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu. - Từ đĩ, tìm ra được mơi trường cĩ bổ sung hàm lượng nitơ cho quá trình lên men thu prodigiosin cao nhất sao với các mơi trường cịn lại để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. 46
Đồ án tốt nghiệp 2.5.4.3. Xác định nguồn lipid, đánh giá và tuyển chọn các nguồn đường bổ sung vào mơi trường MT2 để được mơi trường MT3 Sau khi xác định nguồn nito bổ sung vào mơi trường MT1 để được MT2, cĩ khả năng lên men thu prodigiosin cao nhất so với các mơi trường khác, tiến hành thí nghiệm tiếp theo là xác định nguồn lipid và các nguồn đường bổ sung vào để được mơi trường MT3. Ở mơi trường MT3 này nguồn lipid được bổ sung theo các tỉ lệ khác nhau và bổ sung các nguồn đường được thể hiện qua hình 2.5. Các bước được thực hiện theo trình tự sau: - Các bước nhân giống và cấy giống tiếp theo thực hiện quy trình giống như ở thí nghiệm 2.6.2. Nhân giống cấp 2 vào mơi trường MT3 lên men thu prodigiosin giống với thí nghiệm trên (2.6.3). Các điều kiện: tỉ lệ cấy giống 1%, vận tốc lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ phịng, ủ tối, điều được cố định ở các nghiệm thức. - Sau 48 giờ, tiến hành thu mẫu và trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5) giống như quy trình trích ly ở thí nghiệm 2.6.4. - Sau khi trích ly, tiến hành xác đo OD (λmax) hợp chất thu được và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu. - Từ đĩ, tìm ra được mơi trường cĩ bổ sung hàm lượng lipid và nguồn đường cho quá trình lên men thu prodigiosin cao nhất sao với các mơi trường cịn lại để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.5.5. Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin Sau tất cả các quá trình nghiên cứu tìm ra được mơi trường để tổng hợp prodigiosin cao nhất, tiếp theo tiến hành thí nghiệm xác định điều kiện trên mơi trường mới này nhằm tìm ra điều kiện tốt nhất cho quá trình lên men tổng hợp prodigiosin. Các điều kiện được trình bày qua sở đồ sau: 47
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.8. Sơ đồ xác định điều kiện lên men trên mơi trường tổng hợp MT3 48
Đồ án tốt nghiệp 2.5.5.1. Xác định tỉ lệ cấy giống trên mơi trường tổng hợp MT3 Ở thí nghiệm này, tỉ lệ cấy giống sẽ thay đổi qua nhiều giá trị, cịn các điều kiện: vận tốc lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ phịng, ủ tối, điều được được cố định ở các nghiệm thức. Quá trình này được thể hiện qua sơ đồ sau: - Các bước nhân giống và cấy giống tiếp theo thực hiện quy trình giống như ở thí nghiệm 2.6.2. Các bước nhân giống cấp 2 lên men thu prodigiosin thực hiện như thí nghiệm trên. Các điều kiện: vận tốc lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ phịng,ủ tối, điều được cố định ở các nghiệm thức nhưng cĩ sự thay đổi về tỉ lệ cấy giống : 1%, 3%, 5%, 7% (trong đĩ tỉ lệ 1% là đối chứng, vì các thí nghiệm trên đều sử dụng tỉ lệ này). - Sau 48 giờ, tiến hành thu mẫu và trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5) giống như quy trình trích ly ở thí nghiệm 2.6.4. - Sau khi trích ly, tiến hành xác đo OD (λmax) hợp chất thu được và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu. - Từ đĩ, tìm ra được tỉ lệ cấy giống cho quá trình lên men thu prodigiosin cao nhất sao với các tỉ lệ cịn lại để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.5.5.2. Xác định vận tốc lắc cho quá trình tổng hợp prodigiosin Sau khi tìm ra tỉ lệ cấy giống, tiến hành thí nghiệm tiếp theo là xác định số vịng lắc cho quá trình tổng hợp prodigiosin. Khi chọn được số vịng lắc thích hợp sẽ kích thích quá trình tăng trưởng tế bào và đồng thời sinh tổng hợp prodigiosin. Ở thí nghiệm này: tỉ lệ cấy giống (lấy tỉ lệ tối ưu đã được xác định ở thí nghiệm trên), nhiệt độ phịng, ủ tối, điều được cố định, cịn số vịng lắc được thay đổi ở các vận tốc khác nhau đã trình này qua sơ đồ hình 2.7 Các bước nhân giống và cấy giống tiếp theo thực hiện quy trình giống như ở thí nghiệm 2.6.2. Các bước nhân giống cấp 2 lên men thu prodigiosin thực hiện như ở thí nghiệm 2.6.4. Các điều kiện: vận tốc lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ phịng,ủ tối, điều được cố định ở các nghiệm thức nhưng cĩ sự thay đổi vận tốc lắc: khơng lắc, 150 vịng/phút, 180 vịng/phút, 180/150 vịng/phút ( 24 giờ đầu lắc 180 vịng/phút, 49
Đồ án tốt nghiệp 24 giờ tiếp theo giảm cịn 150 vịng/phút), (trong đĩ sử dụng vận tốc lắc 150 vịng/phút làm đối chứng vì các thí nghiệm trước đều dung vận tốc này) Sau 48 giờ, tiến hành thu mẫu và trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5) giống như quy trình trích ly ở thí nghiệm 2.6.4. Sau khi trích ly, tiến hành xác đo OD (λmax) hợp chất thu được và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu. Từ đĩ, tìm ra được vận tốc lắc cho quá trình lên men thu prodigiosin cao nhất sao với các vận tốc cịn lại để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.5.6. Phương pháp theo dõi động học quá trình tổng hợp prodigiosin Mục đích Khi nĩi về sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn tức là đề cập tới sinh trưởng và phát triển của một số lượng lớn tế bào của một lồi Nguyên tắc Dựa vào sự thay đổi vè tốc độ sinh trưởng và khối lượng sinh khồi hình thành mà biết được quá trình động học của tế bào vi khuẩn đang trong giai đoạn nào. Tiến hành - Tăng sinh chủng vi khuẩn được chọn trong mơi trường NB 24 giờ, lắc 150 vịng/phút trong tối, ở nhiệt độ phịng. - Sử dụng mơi trường tối ưu đã được nghiên cứu ở trên để khảo sát đường cong tăng trưởng. Mỗi bình 20 ml mơi trường, mật độ cấy giống 1%, lắc 180 vịng/phút, bao tối, ủ ở nhiệt độ phịng. - Cứ 2 giờ lấy mẫu 1 lần, theo dõi liên tiếp trong 72 giờ. Theo dõi thơng số là nồng độ sắc tố tổng hợp được. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Vẽ đường cong tăng trưởng và đường cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. - Các thơng số từ đường cong tăng trưởng được tính như sau: Tốc độ tổng hợp sắc tố = (P-P0)/(t-t0) với P là nồng độ sắc tố (mg/ml). 50
Đồ án tốt nghiệp 2.6. Phƣơng pháp phân tích 2.6.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin Mục đích Xác định được lượng hợp chất prodigiosin cĩ trong mẫu từ đĩ đưa ra kết luận cho thí nghiệm. Nội dung Nồng độ hợp chất prodihiosin được xác định dựa vào đường chuẩn hợp chất và giá trị đo OD tại λmax của hợp chất prodigiosin. 2.6.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Các số liệu thơ được xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu sau đĩ được phân tích ANOVA và được trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05. Các số liệu được tính tốn và xử lý trên phần mềm Microsoft Office Excel 2007. Các biểu đồ cũng được thể hiện bằng phần mềm này. 51
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. Kết quả sau khi kiểm tra độ thuần khiết và khẳng định là S. marcescens 3.1.1. Kết quả kiểm tra độ thuần khiết của chủng vi sinh vật Hình thái khuẩn lạc Vi khuẩn được cấy trên mơi trường MacConkey cĩ hình thái khuẩn lạc trịn, màu đỏ, cĩ quần sáng bao quanh và làm đổi màu mơi trường MacConkey (Hình 3.1). Hai chủng vi khuẩn này được Nguyễn Hồnh Anh Kha (2013) phân lập từ Heterorhabditis indica CP 16 và từ Steinernema quangdongsense XT lần lược được đặt tên là SH1 và SS1. Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc hai chủng vi sinh vật được phân lập trên MacConkey A B Chủng SS1 và SH1 tạo khuẩn lạc trịn, lồi, màu đỏ, cĩ quầng sáng bao quanh và làm đổi màu mơi trường xung quanh (Hình 3.1). Cả hai chủng SS1 và SH1 đều tổng hợp sắc tố đỏ trên mơi trường NA làm cho khuẩn lạc cĩ màu đỏ (Hình 3.1) như theo mơ tả của các tài liệu về khả năng tổng hợp sắc tố của Serratia marcescens (Grimont và Grimont, 2006; Anita và cộng sự, 2006; Chidambaram và cộng sự, 2009; Antony và cộng sự, 2011). Khuẩn lạc của chủng SS1 trịn, lồi, cĩ trạng thái nhớt trên mơi trường NA và kích thước khuẩn lạc 2,5-3,0 mm. Khuẩn lạc của chủng SH1 cũng trịn, lồi, cĩ trạng thái nhớt trên mơi trường NA và PGA nhưng kích thước khuẩn lạc nhỏ hơn chủng SS1, từ 1,5-2,0 mm. Nguyên nhân của sự đổi màu mơi trường xung quanh vì hai chủng SS1 và SH1 đều khơng cĩ khả năng sử dụng đường lactose trong mơi trường nên sử 52
Đồ án tốt nghiệp dụng peptone là nguồn carbon chính, chính vì thế đã làm tăng pH của mơi trường và làm đổi màu chỉ thị neutral red từ đỏ sang vàng. SH1 SS1 Khuẩn lạc SH1 trên mơi trường NA Khuẩn lạc SS1 trên mơi trường NA Khuẩn lạc SH1 soi nghiêng trên NA Khuẩn lạc SS1 soi nghiêng trên NA Hình 3.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc chủng SS1 và SH1 trên mơi trường NA Kết quả hình thái nhuộm Gram Nhuộm Gram là hình thức quan sát vi thể hình thái tế bào vi sinh vật và là cách đơn giản nhất, nhanh nhất để phân biệt vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Sau khi tiến hành nhuộm kết quả cho thấy hai chủng phân lập được cĩ lớp peptidoglycan mỏng nên khơng giữ được phức hợp crystal violet – iodine sau khi tẩy cồn và tiếp tục bắt màu hồng với thuốc nhuộm fuchsin. Điều này cho thấy hai chủng phân lập được là Gram âm, phù hợp với những mơ tả về Serratia marcescens (Williams và Qadri, 1980; Grimont và Grimont, 2006; David R.C., 2012). Cĩ thể thấy ở bảng 3.2, tế bào SS1 và SH1 bắt màu hồng, hình que ngắn. Đối chứng E. 53
Đồ án tốt nghiệp coli là vi khuẩn gram âm hình que, đối chứng Bacillis subtilis là vi khuẩn gram dương hình que. Chủng SH1 Gram (-) Chủng SS1 Gran (-) Đồi chứng E.coli Gram (-) Đối chứng Bacillus subtilis Gram (+) Hình 3.3. Kết quả nhuộm Gram hai chủng SH1 và SS1 cùng với đối chứng E.coli và Bacillus subtilis Đặc điểm sinh hĩa của chủng SS1 và SH1 Sau khi làm thuần chủng vi sinh vật trên mơi trường MacConkey, tiến hành lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng để thực hiện các thử nghiệm sinh hĩa nhằm xác định mơt số tính chất sinh hĩa tiêu biểu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1. 54
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Các thử nghiệm sinh hĩa Chủng VSV TSI Indol Nitrat Citrat Catalase SH1 Nghiêng vàng, sâu - + + + vàng, khơng sinh hơi, khơng sinh H2S SS1 Nghiêng vàng, sâu - + + + vàng, khơng sinh hơi, khơng sinh H2S Trong mơi trường TSI cĩ hai nguồn đường, vì vậy kết quả của kiểm tra này chủ yếu xem xét vi sinh vật cĩ thể sử dụng nguồn đường nào. Từ kết quả nhận thấy rằng S. marcescens cĩ thể sử dụng cả hai loại đường trong mơi trường TSI nên làm thay đổi pH trong mơi trường dẫn đến thay đổi màu chỉ thị phenol red, tuy nhiên khơng cĩ khả năng sinh khí và khơng cĩ khả năng sinh H2S. điều này phù hợp với đặc điểm sinh hĩa của S. marcescens đã được ghi nhận trước đĩ. Với hai chủng thử nghiệm SS1 và SH1 vì khơng cĩ hệ enzyme tryptophanase nên khơng tạo ra indol, thuốc thử Kovac’s vẫn giữ nguyên màu vàng trong lớp dung mơi hữu cơ . Điều này hồn tồn phù hợp với các nghiên cứu về S. marcescens. Với mẫu SS1 và SH1 cũng thấy cĩ sự khử nitrate thành nitrite tạo ra màu hồng đậm trên giọt canh trường khi cho thuốc thử Griess A và Griess B vào. Điều này hồn tồn phù hợp với các nghiên cứu về S. marcescens. Với mẫu SS1 và SH1 cũng thấy cĩ sự biến dưỡng citrate tạo CO2 làm kềm hĩa mơi trường,vì vậy làm thay đổi màu thuốc thử chuyển từ màu xanh lục qua màu xanh dương . Điều này hồn tồn phù hợp với các nghiên cứu về S. marcescens. Cĩ hiện tượng sủi khí khi ta cho H2O2 30% vào sinh khối trên lame, sở dĩ như vậy do SH1 và SS1 là một vi sinh vật hiếu khí tùy nghi nên cĩ hệ enzyme catalase 55
Đồ án tốt nghiệp phát triển để thực hiện các phản ứng giải độc trong tế bào. Kết quả dương tính ở ESS1 và SH1 giống với các nghiên cứu trước. Tĩm lại từ các kiểm tra sinh hĩa trên phù hợp với các nghiên cứu được ghi nhận trước đĩ, là tiền đề tiến hành định danh chủng vi khuẩn SS1 và SH1 bằng KIT API 20E. 3.1.2. Kết quả định danh bằng KIT API 20E (Biomerieux) - Từ kết quả bảng 3.3., tiến hành định danh chủng vi khuẩn bằng KIT API 20E. - Sau 18 giờ ủ bộ KIT, tiến hành đem ra đọc kết quả: đọc tất cả các phản ứng và hiện tượng của các test ( trừ TDA, IND, VP). (Xem hình phụ lục A) - Sau 24 giờ, tiến hành đọc hết tất cả các phản ứng và hiện tượng của bộ KIT API 20E bằng cách so màu với các chỉ tiêu đưa ra trong phần mềm API web rồi dựa vào bảng phần trăm ( Xem phụ lục B) ghi nhận lại kết quả bằng cách: dương tính (+), âm tính (-). (Xem hình phụ lục A) - Từ kết quả ghi nhận ở các phản ứng và hiện tượng của KIT API 20E được trình bày cụ thể qua bảng 3.4. như sau: Bảng 3.2. Kết quả định danh bằng KIT API 20E của hai chủng SS1 và SH1 STT Tên phản ứng SS1 SH1 1 ONPG (+) (+) 2 ADH (-) (-) 3 LDC (+) (+) 4 ODC (+) (+) 5 CIT (+) (+) 6 H2S (-) (-) 7 URE (-) (-) 8 TDA (-) (-) 9 IND (-) (-) 56
Đồ án tốt nghiệp 10 VP (+) (+) 11 GEL (+) (+) 12 GLU (+) (+) 13 MAN (+) (+) 14 INO (+) (+) 15 SOR (+) (+) 16 RHA (-) (-) 17 SAC (+) (+) 18 MEL (-) (-) 19 AMY (+) (+) 20 ARA (-) (-) 21 OX (-) (-) 22 NO2 (+) (+) 23 N2 (-) (-) 24 McC (+) (+) - Từ bảng 3.2., tiến hành dị kết quả đối chứng với phần mềm API web ta được các thơng số quan trọng sau (xem hình phụ lục A) + Trắc đồ: 530772153 + Phân loại: Serratia marcescens + Phần trăm chứng minh: 97,4% Từ đây, khẳng định được rằng chủng SH1 và SS1 là Serratia marcescens. 3.2. Kết quả đánh giá và tuyển chọn khả năng tổng hợp prodigiosin của hai chủng SS1 và SH1 - Sau 48 giờ tăng sinh trên mơi trường NB, tiến hành trích ly canh trường bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5), thu được sắc tố màu đỏ. Sau đĩ dựa và phương pháp xác định phổ hấp thụ của sắc tố để tìm ra λmax nhằm khẳng định hợp chất sắc tố thu được là prodigiosin và từ đĩ dùng λmax đo OD, dựa vào đường chuẩn sắc tố tính ra hàm lượng prodigiosin cĩ trong mẫu. 57
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4. Sắc tố sau khi trích ly Trong dung mơi Ethanol:HCl (95:5), phổ hấp thụ λmax= 534nm và 535nm, giá trị này tương đồng với các báo cáo về λmax của prodigiosin trong dung mơi Ethanol 96%, cả hai đều hấp thụ cao nhất ở bước song 535nm (Giri và cộng sự, 2004; Krishna, 2008; Ramina và Samira, 2008; Song và cộng sự, 2006). Điều này tạo cơ sở tin tưởng hợp chất thu được là prodigiosin. Vậy chọn bước song cao nhất λmax=535nm cho các thí nghiệm tiếp theo. Phổ SS1 Phổ SH1 Hình 3.5. Kết quả quét quang phổ của hợp chất trong dung mơi Ethanol:HCl (95:5) 58
Đồ án tốt nghiệp Sau khi cĩ kết quả quét quang phổ, lấy λmax= 535nm tiến hành đo OD hợp chất prodigiosin và dựa vào đường chuẩn sắc tố (xem phụ lục B) tính hàm lượng prodigiosin cĩ trong mẫu. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp sắc tố của hai củng SS1 và SH1 được biễu diễn trong hình 3.3. 4.57a 5 4.5 4 3.14b 3.5 3 2.5 SS1 2 (mg/ml) SH1 1.5 1 Hàm lƣợng prodigiosin lƣợngHàm prodigiosin 0.5 0 SS1 SH1 Chủng vi sinh vật Hình 3.6. Khả năng tổng hợp prodigiosin của hai chủng vi sinh vật SS1 và SH1 Từ kết quả trong hình 3.3, người thực hiện nhận thấy rằng trong cùng các điều kiện nuơi cấy (mơi trường NB, tỉ lệ cấy giống 1%, lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ phịng) thì chủng SH1 cho hàm lượng prodigiosin cao hơn chủng SS1. Vì vậy, từ kết quả của thí nghiệm này, chọn chủng SH1 cho quá trình lên men thu prodigiosin ở các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Xác định điều kiện nhân giống Quá trình này được thực hiện vì các nghiên cứu trước đĩ của các bài báo nước ngồi cho nhiều kết quả khác nhau vì nhiều lý do, mà chủ yếu là các điều kiện mơi trường. Vì vậy người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này với mục đích tìm ra được điều kiện nuơi cấy phù hợp với mơi trường phịng thí nghiệm tại Việt nam. 3.3.1. Đánh giá yếu tố pH ảnh hưởng mật độ tế bào 59
Đồ án tốt nghiệp Để tiến đến mục tiêu, người thực hiện đề tài tiến hành nuơi cấy chùng vi khuẩn SH1 trên các khoảng pH 6,2; 7,2; 8,2 trong mơi trường NB. Sau 24 giờ, tiến hành đo OD600nm, dựa vào đường chuẩn tế bào tính ra mật độ tế bào trong canh trường. Phương trình đường chuẩn tế bào xem phụ lục B. kết quả được trình bày hình 3.7. 8.90 8.79a 8.75a 8.73a 8.80 8.70 8.60 8.50 8.40 8.30 8.20 Log mật độ mật Log bào tế 8.10 8.00 6,2 7,2 8,2 Giá trị pH Hình 3.7. Mật độ tế bào của chủng vi khuẩn SH1 ở các pH khác nhau Quá trình tăng trưởng của vi sinh vật rất nhạy cảm với pH, mỗi vi sinh vật thích ứng với khoảng pH khác nhau. Vì vậy, tìm ra được pH phù hợp sẽ giúp cho quá trình tăng trưởng tế bào của vi sinh vật phát triển tốt hơn Qua nghiên cứu này, người thực hiện nhận thấy rằng, pH ở giá trị 7,2 cho mật độ tế bào cao nhất là 8,79 ≈ 6,2x108 (cfu/ml). Tuy nhiên, các giá trị pH cho mật độ tế bào khơng khác nhau nhiều. Từ đĩ cho thấy, khoảng pH của vi khuẩn Serratia marcescens khá rộng nên khơng bị ảnh hưởng trong khoảng pH từ 6,2 đến 8,2. 3.3.2. Đánh giá số vịng lắc ảnh hưởng mật độ tế bào Để tiến đến mục tiêu, người thực hiện đề tài tiến hành nuơi cấy chủng vi khuẩn SH1 trong các điều kiện sau: kỵ khí khơng lắc, hiếu khí lắc 150 vịng/phút, hiếu khí lắc 180 vịng/phút trong mơi trường NB. Sau 24 giờ, tiến hành đo OD600nm, dựa vào đường chuẩn tế bào tính ra mật độ tế bào trong canh trường. Phương trình đường chuẩn tế bào xem phụ lục B. kết quả được trình bày hình 3.8 sau: 60
Đồ án tốt nghiệp 10.00 8.79a 8.63b 9.00 c 8.00 7.17 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 Log mật độ mật Log bào tế 1.00 0.00 150v/phút 180v/phút kỵ khí Vận tốc lắc ( vịng/phút ) Hình 3.8. Log mật độ tế bào qua các điều kiện nuơi cấy Mỗi VSV cần điều kiện oxi và số vịng lắc khác nhau. Cĩ loại hiếu khí, cĩ loại kị khí hoặc cũng cĩ loại hiếu khí tùy nghi. Vì vậy, tìm ra được điều kiện hơ hấp và số vịng lắc phù hợp bản chất của mỗi vi sinh vật sẽ giúp quá trình tăng trưởng vi sinh vật ổn định và tốt hơn. Theo nghiên cứu của Krishna (2008) thì tế bào sản xuất tối đa ở tốc độ lắc 150 vịng/ phút cịn ở nghiên cứu của Wei và cộng sự (2005) là 200 vịng/phút. Như vậy, trong các điều kiện ở nghiên cứu này thì điều kiện lắc 150 vịng cĩ oxi là cho log mật độ tế bào cao nhất và điều này đúng với nghiên cứu của Krishma (2008). Qua nghiên cứu này người thực hiện nhận thấy rằng điều kiện lắc 150 vịng/phút cĩ oxi cho log mật độ tế bào cao nhất là 8,79 ≈ 6,2x 108 (cfu/ml). Từ đây, chọn điều kiện lắc 150 vịng/phút cĩ oxi cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.4. Xác định mơi trƣờng lên men thu prodigiosin 3.4.1. Xác định mơi trường MT1 lên men thu prodigiosin Để thực hiện mục tiêu của đề tài thì cơng việc cần làm là lựa chọn được nồng độ huyền phù đậu phộng làm mơi trường nuơi cấy vi khuẩn Serratia marcescens sản xuất prodigiosin cho hàm lượng cao nhất. Người thực hiện đề tài tiến hành tạo mơi 61
Đồ án tốt nghiệp trường huyền phù đậu phộng là MT1, nuơi cấy chủng vi khuẩn SH1 với các điều kiện tối ưu khảo sát ở trên, sau 48 giờ thu canh trường nuơi cấy, trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5) được hợp chất prodigiosin. 1 2 3 4 5 6 Hình 3.9. Hợp chất prodigiosin sau khi trích ly từ mơi trường MT1 bằng hỗn hợp dung mơi Ethanol:HCl (95:5) Đậu phộng cĩ nguồn lipid, protein và nguồn carbon đều cao, vì vậy mơi trường đậu phộng là mơi trường lý tưởng cho sự tăng trưởng tế bào và kích thích để sinh tổng hợp prodigiosin. Theo bảng 1.4 nghiên cứu của Chidambaram và Perumalsamy (2009) về việc so sánh hàm lượng prodogiosin trong các mơi trường và nhiệt độ khác nhau, tác giả cho thấy hàm lượng prodigiosin trong mơi trường đậu phộng nguyên hạt ở nhiệt độ 280C cho hàm lượng cao nhất đạt 38,75 (mg/ml), tuy vậy tác giả khơng đề cập hoặc khơng cĩ bài báo nào nĩi về khối lượng đậu cần bổ sung là bao nhiêu nên người thực hiện đề tài tiến hành xác định mơi trường gồm đậu phộng và nước (MT1) đã nêu rõ ở phương pháp. Sau các quá trình lên men, trích ly, đo OD và xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu, kết quả được thể hiện qua bảng 3.3 và hình 3.10. 62
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Hàm lượng prodigiosin thu được từ các mơi trường cĩ hàm lượng dịch nghiền đậu phộng khác nhau Tỉ lệ đậu phộng khơ trong MT1 Hàm lượng 5% 10% 15% 20% PG prodigiosin 4,05b±0,44 9,91a±2,47 10,71a±1,64 7,45a±2,78 3,99b±0,19 (mg/ml) (Các giá trị cĩ các chữ cái giống nhau ở cùng một dịng thì khơng cĩ sự khác biệt theotrắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05) Qua bảng 3.8 cho thấy: Theo nghiên cứu Nguyễn Hồng Anh Kha (2013), mơi trường pepton glycerol cho tổng hợp prodigiosin cao nhất. Nhưng trong nghiên cứu này, ở mơi trường thí nghiệm MT1 (cách làm và nồng độ đã nêu ở phương pháp), nồng độ đậu phộng càng cao cho giá trị hàm lượng prodigiosin càng lớn nhưng khi nồng độ quá cao ở mức 20% đậu khơ vào mơi trường thì làm cản trở oxi dẫn đến giảm tốc độ tăng trưởng tế bào từ đĩ ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp prodigiosin, nhưng nhìn chung vẫn cao hơn mơi trường pepton gelycerol ( mơi trường đối chứng). 63
Đồ án tốt nghiệp 300 268.4 248.4 250 200 186.7 150 101.5 100 100 (% so so đối với (% chứng) 50 Hàm lƣợng prodigiosin lƣợngHàm prodigiosin 0 5% 10% 15% 20% PG Hàm lƣợng đậu khơ trong mơi trƣờng MT1 (%) Hình 3.10. Hàm lượng prodigiosin thu được trong mơi trường MT1 với các hàm lượng đậu phộng khác nhau - Từ kết quả bảng 3.6 và hình 3.7, nhận thấy rằng hàm lượng đậu khơ 10% và 15% cho hàm lượng prodigiosin cao nhất đạt 9,91 và 10,71 (mg/ml) và cao hơn so với đối chứng là 48,4% và 68,4%. Tuy nhiên hai giá trị này khơng khác nhau, nên ngưởi thực hiện quyết định chon hàm lượng đậu phộng khơ cho tổng hợp prodigiosin là 10% vì mang tính kinh tế. 3.4.2. Xác định nguồn nitơ bổ sung vào mơi trường cơ bản MT1 để được MT2 3.4.2.1. Bổ sung gelatin Serratia marcescens cĩ thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong học Enterobacteriaceae bởi đạc điểm tiết enzyme gelatinase (Giri và cộng sự, 2004) phân giải gelatin tạo ra các hợp chất cung cấp cho quá trình tăng trưởng tế bào, vì vậy việc bổ sung gelatin vào mơi trường đậu phộng nhằm cung cấp thêm dưỡng chất cho vi khuẩn tăng trưởng và sinh tổng hợp prodigiosin. Prodigiosin là pyrrole alkaloid. Tiền chất của vịng pyrrole là amino acid Proline. Các tác giả đã nghiên 64
Đồ án tốt nghiệp cứu cho thấy bổ sung proline làm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp. Proline cĩ nhiều trong gelatin (theo Williams và Quadri, 1980) Sau 48 giờ tăng sinh, lấy mẫu để trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5), sau đĩ đo OD535nm và dựa vào đường chuẩn sắc tố (xem ở phụ lục B) xác định hàm lượng prodigiosin cĩ trong mẫu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.11. Bảng 3.4. Hàm lượng prodigiosin trong mơi trường MT1 cĩ bổ sung gelatin Mơi trƣờng MT1 + gelatin Hàm lượng MT1 MT1 + 2,5% MT1 + 5% MT1 + 10% prodigiosin 5,36a±1,36 3,96b±0,47 2,81c±1,33 0,51d±0,21 (mg/ml) 120 100 100 80 73.9 52.4 60 40 20 9.5 (% (% đối với so chứng) lƣợngHàm prodigiosin 0 MT1 MT1 + MT1 + MT1 + 2,5% 5% 10% Hàm lƣợng gelatin bổ sung vào MT1 (%) Hình 3.11. Kết quả hàm lượng prodigiosin trong mơi trường MT1 bổ sung gelatin Kết quả trên hình 3.8 cho thấy hàm lượng prodigiosin cao ở mơi trường khơng bổ sung gelatin hoặc bổ sung hàm lượng gelatin ít, vì sau khi khuấy tan trong nước gelatin trở nên cơ đặc nên làm mơi trường trong trạng thái kết dính làm cản trở khả năng truyền khối oxi trong mơi trường, vì vậy mà hàm lượng prodigiosin giảm. 65
Đồ án tốt nghiệp Qua kết quả thí nghiệm trên, người thực hiện đề tài thấy rằng khơng nên bổ sung thêm gelatin vào mơi trường huyền phù đậu phộng, mà nếu được thì bổ sung peptone thay cho gelatin. Mẫu trước và sau khi trích ly và sau khi trích ly được thể hiện trên hình 3.12. Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Hình 3.12. Mẫu trong mơi trường MT1 (10%) bổ sung gelantin trước và sau khi trích ly thu prodigiosin 3.4.2.2. Bổ sung peptone Trong hầu hết các mơi trường dinh dưỡng đều cĩ mặt pepton, vì đây là nguồn dưỡng chất cần thiết cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Vì vậy việc bổ sung pepton vào mơi trường huyền phù đậu phộng nhằm cung cấp thêm dưỡng chất cho vi khuẩn Serratia marcescens dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất prodigiosin. Sau 48 giờ, thu mẫu tiến hành trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5), sau đĩ đo OD535nm và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu thu được.Kết quả bổ sung hàm lượng pepton vào mơi rường huyền phù đậu phộng được thể hiện trong bảng 3.5 và hình 3.13. 66
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5. Hàm lượng prodigiosin .trong mơi trường MT1 cĩ bổ sung peptone Mơi trƣờng MT1 + peptone Hàm lượng MT1 MT1 + 2,5% MT1 + 5% MT1 + 10% prodigiosin 13,31c±2,01 17,64b±0,5 20,02a±0,62 21,39a±0,48 (mg/ml) 180 160.7 150.4 160 140 132.5 120 100 100 80 60 40 (% so so đối với (% chứng) Hàm lƣợng prodigiosin lƣợngHàm prodigiosin 20 0 MT1 MT1 + 2,5% MT1 + 5% MT1 + 10% Hàm lƣợng pepton bổ sung vào MT1 (%) Hình 3.13. Hàm lượng prodigiosin khi bổ sung peptone vào mơi trường huyền phù đậu phộng. Từ kết quả ở bang 3.5 và hình 3.13, người thực hiện đề tài nhận thấy rằng việc bổ sung peptone vào mơi trường huyền phù đậu phộng làm tăng hàm lượng prodigiosin so với mơi trường khơng bổ sung là rất lớn, với việc bổ sung 5% và 10% pepton cho hàm lượng prodigiosin đạt 20,02a±0,62 và 21,39 ± 0,48 (mg/ml), tăng 50,4% và 60,7% so với đối chứng là mơi trường MT1 khơng bổ sung peptone, cao hơn tất cả mơi trường trong bảng 1.4 (chỉ trừ mơi trường hạt đậu phộng) (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Vì hàm lượng prodigiosin ở 5% và 10% pepton khơng khác nhau nhiều nên người thực hiện đề tài quyết định chọn mơi trường MT2 = MT1 (10% đậu phộng) + 5% pepton cho thí nghiệm tiếp theo. 67
Đồ án tốt nghiệp 3.4.3. Kết quả xác định nguồn lipid và các nguồn đường bổ sung vào mơi trường MT2 để được mơi trường MT3 3.4.3.1. Xác định nguồn lipid bổ sung vào mơi trường MT2: Sau 48 giờ tăng sinh, thu mẫu, tiến hành trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5), sau đĩ đo OD535nm và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu thu được.Kết quả bổ sung nguồn lipid vào mơi trường MT2 được thể hiện trong bảng 3.9 và hình 3.11. Bảng 3.6. Hàm lượng prodigiosin trong mơi trường MT2 cĩ bổ sung Lipid Mơi trƣờng MT2 + % dầu hƣớng dƣơng Hàm lượng MT2 MT2 + 1% MT2 + 2% prodigiosin (mg/ml) 6,79b±1,25 9,01a±1,03 9,81a±0,21 160 144.5 140 132.5 120 100 100 80 60 40 Phần trăm trăm Phần lƣợng hàm 20 prodigiosin cĩ trong mẫu mẫu (%) trong cĩ prodigiosin 0 MT2 MT2 + 1% MT2 + 2% Tỉ lệ dầu hƣớng dƣơng bổ sung vào mơi trƣợng MT2 (%) Hình 3.14. Hàm lượng prodigiosin khi bổ sung dầu hướng dương vào mơi trường MT2 Từ kết quả bảng 3.6 và trong hình 3.14, người thực hiện đề tài nhận thấy rằng khi bổ sung dầu hướng dương vào mơi trường huyền phù đậu phộng peptone thì hàm lượng prodigiosin tăng so với mơi trường khơng bổ sung, ở mơi trường bổ 68
Đồ án tốt nghiệp sung 1% (≈0,2ml) và 2% (≈0,4ml) hàm lượng prodigiosin đạt 9,01a±1,03 và 9,81a±0,21 ,tăng 32,5% và 44,5% so với đối chứng, tuy nhiên hai kết quả khơng sai khác nhau nên chọn tỉ lệ dầu hướng dương bổ sung là 1% vì tính kinh tế. Theo thí nghiệm Chidambaram và Perumalsamy (2009) nêu rõ vai trị của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong hạt cĩ thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều prodigiosin hơn. Vì vậy, kết quả đạt được đúng với thí nghiệm của Chidambaram và Perumalsamy (2009) cho nên người thực hiện đề tài quyết định lấy kết quả bổ sung 1% dầu hướng dương vào mơi trường đậu phộng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.4.3.2. Xác định nguồn đường bổ sung vào mơi trường MT2: Sau 48 giờ tăng sinh, thu mẫu tiến hành trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5), sau đĩ đo OD535nm và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu thu được.Kết quả bổ sung các nguồn đường vào mơi trường MT2 được thể hiện trong bảng 3.7 và hình 3.15. Bảng 3.7. Hàm lượng prodigiosin trong mơi trường MT2 cĩ bổ sung nguồn đường Mơi trƣờng cơ bản MT2 + % dầu hƣớng dƣơng MT2 + MT2 + MT2 + MT2 + MT2 + MT2 Sorbitol malnitol mantose sucrose tinh bột Hàm lượng a c b b b b prodigiosin 7,03 ± 2,12 ± 3,23 ± 2,81 ± 2,44 ± 2,68 ± (mg/ml) 1,39 0,07 0,49 1,12 0,93 0,12 69
Đồ án tốt nghiệp 120 100 100 80 60 45.9 40 34.7 38.1 (%) 40 30.2 20 0 Phần trăm trăm Phần lƣợng hàm MT2 MT2 + MT2 + MT2 + MT2 + MT2 + prodigiosin trong mơi trƣờngmơi trong prodigiosin Sor Man Mal Suc TB Mơi trƣờng MT2 và các nguồn đƣờng Hình 3.15. Kết quả hàm lượng prodigiosin trong mỗi loại đường Qua kết quả ở hình 3.15 cho thấy rằng hàm lượng prodigiosin ở mơi trường khơng thêm đường là cao nhất so với tất cả các mơi trường bổ sung đường, và ở mơi trường bổ sung Sorbitol cho hàm lượng prodigiosin thấp nhất. Theo Khanafari và cộng sự (2006), quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia macecens giảm bởi glucose và các loại đường lên men được khác do cĩ sự giảm pH trong canh trường nuơi cấy, vì vậy kết quả ở thí nghiệm này đúng với kết quả của Khanafari và cộng sự. Từ đây, người thực hiện đề tài quyết định khơng bổ sung đường vào mơi trường huyền phù đậu phộng peptone. Như vậy trong số các nguồn cacbon bổ sung, 1% dầu hướng dương làm tăng hàm lượng prodigiosin cao nhất (32,5% so với đối chứng). Do đĩ mơi trường lên men thu prodigiosin được chọn là MT3 = MT1 (10% đậu phộng) + 5% peptone + 1% dầu hướng dương. Mơi trường MT3 được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo. 70
Đồ án tốt nghiệp 3.5. Xác định điều kiện lên men tổng hợp prodigiosin 3.5.1. Xác định tỉ lệ cấy giống trên mơi trường MT3 Tỉ lệ cấy giống rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tăng trưởng tế bào vả sản xuất sắc tố. Sau 48 giờ tăng sinh, thu mẫu, tiến hành trích ly bằng dung mơi Ethanol:HCl (95:5), sau đĩ đo OD535nm và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu thu được. Kết quả tỉ lệ cấy giống ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp prodigiosin được thể hiện trong bảng 3.8 và hình 3.16. Bảng 3.8. Hảm lượng prodigiosin trong mơi trường MT3 qua các tỉ lệ cấy giống Tỉ lệ cấy giống Hàm lượng 1% 3% 5% 7% prodigiosin (mg/ml) 8,24b±0,58 9,4a± 0,12 7,03c±0,54 5,57d ± 0,52 140 120 114 100 100 85 80 68 60 40 (% so so đối với (% chứng) 20 Hàm lƣợng prodigiosin lƣợngHàm prodigiosin 0 1% 3% 5% 7% Tỉ lệ cấy giống Hình 3.16. Kết quả hàm lượng prodigiosin qua các tỉ lệ cấy giống 71
Đồ án tốt nghiệp Trong nghiên cứu này, quan sát thấy tỉ lệ cấy giống ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin của chủng SH1. Một loạt các thử nghiệm tỉ lệ cấy giống 1%, 3%, 5%, 7% cho thấy sự khác biệt về hàm lượng prodigiosin, kết quả thấy rằng ở tỉ lệ cấy giống 3% ≈ 3,84x108 (cfu/ml) cho hàm lượng prodigiosin là cao nhất đạt 9,4 ± 0,12 (mg/ml). Vì vậy, từ kết quả nghiên cứu này người thực hiện đề tài quyết định chọn tỉ lệ cấy giống 3% làm các thí nghiệm tiếp theo và là tỉ lệ cấy giống tốt nhất. 3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của vận tốc lắc đến quá trình tổng hợp prodigiosin trên mơi trường MT3 Mỗi vi sinh vật cĩ các điều kiện oxi khác nhau, cĩ chủng hiếu khí, cĩ chủng kị khí hoặc cũng cĩ chủng kỵ khí tùy nghi, vì vậy biết được điều kiện nào là cần thiết sẽ gĩp phần làm tăng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Oxy ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp prodigiosin bởi S.marcescens, đã cĩ sự ghi nhận prodigiosin sản xuất ở tốc độ lắc 150 vịng/phút (Krishna, 2008) và 200 vịng/phút (Wei và cộng sự, 2005). Từ đây, người thực hiện đề tài đã thí nghiệm các vịng lắc và cho kết quả ở bảng 3.9 và hình 3.17. Bảng 3.9. Hàm lượng prodigiosin trong mơi trường MT3 qua các vận tốc lắc Vận tốc lắc (vịng/phút) Khơng lắc 150 180 180/150 Hàm lượng prodigiosin (mg/ml) 2,75d±0,35 3,65c± 0,23 5,06b±0,31 6,11a ± 0,07 72
Đồ án tốt nghiệp 180 167 160 139 140 120 100 100 75 80 60 40 (% (% đối với so chứng) Hàm lƣợngHàm prodigiosin 20 0 khơng lắc 150 180 180->150 Vận tốc lắc (vịng/phút) Hình 3.17. Kết quả hàm lượng prodigiosin qua các vận tốc lắc Kết quả ở hình 3.17 cho thấy cĩ sự khác biệt về hàm lượng prodigiosin thu được ở các vận tốc lắc khác nhau. Khơng lắc hiển nhiên hàm lượng prodigiosin tổng hợp chỉ bằng 75% so với đối chứng 100%, giảm 25%. Ở tốc độ lắc 180 vịng/phút hàm lượng prodigiosin tăng 39% so với đối chứng 150 vịng/phút. Điều này cho thấy trong mơi trường chứa huyền phù đậu phộng độ nhớt cao hơn mơi trường lỏng thơng thường nên nhu cầu oxy cũng cao hơn. Khi giữ nguyên vận tốc lắc 180 vịng/phút trong 24 giờ đầu và giảm cịn 150 vịng/phút ở 24 giờ sau hàm lượng prodigiosin cao nhất tăng 67% so với đối chứng. Cĩ thể giải thich rằng: vì prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp xảy ra trong hai pha: pha tăng trưởng và pha tổng hợp. Trong pha tăng trưởng cần cung cấp oxy cho tế bào, mà độ nhớt trong mơi trường NB thấp trong khi đĩ độ nhớt mơi trường đậu phộng cao hơn gấp nhiều lần so với NB chình vỉ vậy để thu sinh khối tốt hơn cần tăng vận tốc lắc lên 180 vịng/phút. Ở giai đoạn sau, quá trình tổng hợp prodigiosin là cĩ sự gắn kết protein lên trên lớp màng ngồi của tế bào (Allen và cơng sự, 1983), vì vậy nếu vận tốc lắc lớn sẽ ảnh hưởng đến sự gắn kết này nên cần giảm vận tốc xuống 150 73
Đồ án tốt nghiệp vịng/phút. Kết quả này hồn tồn phù hợp với các kết quả đã được nghiên cứu trước đĩ. Vì vậy, từ kết quả nghiên cứu này người thực hiện đề tài quyết định chon điều kiện 24 giờ đầu lắc 180 vịng/phút 24 giờ sau lắc 150 vịng/phút làm thí nghiệm tiếp theo . 3.6. Động học quá trình tổng hợp prodigiosin trên mơi trƣờng MT3 Kết quả khảo sát động học tổng hợp prodigiosin của chủng vi khuẩn SH1 được thể hiện ở hình 3.18 Kết quả tính tốn được tốc độ sinh trưởng cực đại μmax = 0,157 (h-1) trong pha log từ 4 giờ đến 12 giờ. Thời gian thu prodigiosin là từ 36 giờ nhưng khơng trễ hơn 48 giờ. Trong khi đĩ sự tổng hợp prodigiosin bắt đầu tứ 10 giờ nhưng chỉ thực sự mạnh từ 36 – 48 giờ với tốc độ tổng hợp prodigiosin cực đại qpmax= 0,3 (mg/ml/h). Quá trình tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật xảy ra khơng song song với quá trình tổng hợp sinh khối, mà trễ pha. Như vậy chỉ khi tế bào đi vào pha cân bằng động quá trình tổng hợp mạnh prodigiosin mới thực sự bắt đầu. Đến 48 giờ thì quá trình tổng hợp sinh khối bắt đầu giảm mạnh trong khi đĩ quá trình tổng hợp prodigiosin vẫn cịn nằm pha cân bằng. Chỉ sau 54 giờ thì sắc tố giảm mạnh cĩ thể do pH mơi trường thay đổi làm cho cấu trúc sắc tố thay đổi. 74
Đồ án tốt nghiệp 10.5 9.00 8.00 10 7.00 9.5 6.00 9 5.00 8.5 4.00 3.00 8 2.00 Log mật độ mật Log bào tế cfu/ml) (Log 7.5 1.00 7 0.00 Hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu Hàm (mg/ml) trong lƣợngprodigiosin 0 20 40 60 80 Thời gian (giờ) Series2Log mật độ tế bào Series1Hàm lượng prodigiosin(mg/ml) Hình 3.18. Đường cong tăng trưởng tế bào và tổng hợp prodigiosin của SH1 trong mơi trường MT3 75
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Điều kiện nhân giống chủng Serratia marcescens trên mơi trường NB cĩ pH nằm trong khoảng 6,2 đến 8,2, cĩ điều kiện hiếu khí lắc 150 vịng/phút và cĩ tỉ lệ cấy giống là 1%. Trong quá trình lên men thu prodigiosin, mơi trường huyền phù đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lượng prodigiosin là 248,4% so với mơi trường peptone glycerol là 100% Bổ sung gelatin khơng làm tăng mà giảm prodigiosin tổng hợp đáng kể do tăng độ nhớt mơi trường. Bổ sung peptone 5% vào mơi trường MT1 (10%) làm tăng hàm lượng prodigiosin tổng hợp lên đến 150,4%, tăng 50,4% so với mơi trường MT (10%). Trong số các nguồn C bổ sung, đường khơng làm tăng prodigiosin tổng hợp, trong khi đĩ bổ sung dầu hướng dương 1% làm tăng prodigiosin tổng hợp lên đến 132,5%, tăng 32,5% so với mơi trường MT2 (MT1 bổ sung 5% peptone). Tỉ lệ cấy giống 3% tương đương 3,84x108 (cfu/ml) là tỉ lệ cho hàm lượng prodigiosin tăng 14% so với tỉ lệ 1% làm đối chứng. Vận tốc pha tăng trưởng (24 giờ đầu) là 180 vịng/phút và pha tổng hợp (24 giờ sau) là 150 vịng/phút làm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp lên đến 167%, tăng 67% so với vận tốc 150 vịng/phút làm đối chứng. Đường cong tăng trưởng tế bào và tổng hợp prodigiosin cho thấy cĩ thể nuơi cấy vi khuẩn thu prodigiosin trong mơi trường chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton và 1% dầu hướng dương, tỉ lệ cấy giống 3%, lắc 180 vịng phút trong 24 giờ đầu sau đĩ giảm cịn 150 vịng/phút. Thời điểm thu hồi prodigiodin cĩ thể bắt đầu từ 36 giờ và kết thúc khơng muộn hơn 48 giờ. Kết hợp tất cả yếu tố trên là điều kiện tốt nhất cho quá trình nuơi cấy chủng SH1 sản xuất prodigiosin. 76