›

Đồ án Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel từ nấm mốc Trichoderma spp

pdf 86 trang thiennha21 12/04/2022 4850
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel từ nấm mốc Trichoderma spp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_mot_so_yeu_to_anh_huong_den_qua_trinh_sinh_to.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel từ nấm mốc Trichoderma spp

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐĐỒỒ ÁÁNN TTỐỐTT NNGGHHIIỆỆPP KKHHẢẢOO SSÁÁTT KKHHẢẢ NNĂĂNNGG SSIINNHH TTỔỔNNGG HHỢỢPP EENNZZYYMMEE XXYYLLAANNAASSEE VVÀÀ TTIINNHH SSẠẠCCHH BBẰẰNNGG SSẮẮCC KKÝÝ LLỌỌCC GGEELL TTỪỪ CCHHỦỦNNGG NNẤẤMM MMỐỐCC TTRRIICCHHOODDEE RRMMAA SSPPPP Ngành: MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : KS. ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực hiện : LÊ NGỌC MỸ MSSV: 1191111028 Lớp: 11HSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2013
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi là sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không sao chép đồ án/khóa luận tốt nghiệp của người khác dưới mọi hình thức nào. Đây là nghiên cứu hoàn toàn của riêng tôi, những số liệu trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực và chưa được công bố bởi tác giả nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan trên.
  3. LỜI CÁM ƠN Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp em đã được áp dụng những lý thuyết đã học vào thực tế và thêm được những kinh nghiệm bổ ích cho công việc sau này. Em xin chân thành cảm ơn : Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM đã cho phép em làm đồ án tốt nghiệp tại Viện, cung cấp những thiết bị, máy móc hiện đại giúp ích rất nhiều cho việc thực hiện đồ án. Ks. Đỗ Thị Tuyến đã hướng dẫn, giúp đỡ cho em rất tận tình, giải thích những thắc mắc trong khi thực hiện đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ các tài liệu để em hoàn thành đồ án một cách tốt nhất. Các thầy cô trong khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ Thuật Công nghệ TP.HCM đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em trong những năm học vừa qua. Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn đồng hành, chia sẽ, động viên. Các bạn trên Viện và bạn Nguyễn Thị Hoài An đã giúp đỡ em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp.
  4. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐĐỒỒ ÁÁNN TTỐỐTT NNGGHHIIỆỆPP KKHHẢẢOO SSÁÁTT KKHHẢẢ NNĂĂNNGG SSIINNHH TTỔỔNNGG HHỢỢPP EENNZZYYMMEE XXYYLLAANNAASSEE VVÀÀ TTIINNHH SSẠẠCCHH BBẰẰNNGG SSẮẮCC KKÝÝ LLỌỌCC GGEELL TTỪỪ CCHHỦỦNNGG NNẤẤMM MMỐỐCC TTRRIICCHHOODDEE RRMMAA SSPPPP Ngành: MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : KS. ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực hiện : LÊ NGỌC MỸ MSSV: 1191111028 Lớp: 11HSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2013
  5. LỜI CAM ĐOAN Tôi là sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không sao chép đồ án/khóa luận tốt nghiệp của người khác dưới mọi hình thức nào. Đây là nghiên cứu hoàn toàn của riêng tôi, những số liệu trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực và chưa được công bố bởi tác giả nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan trên.
  6. LỜI CÁM ƠN Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp em đã được áp dụng những lý thuyết đã học vào thực tế và thêm được những kinh nghiệm bổ ích cho công việc sau này. Em xin chân thành cảm ơn : Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM đã cho phép em làm đồ án tốt nghiệp tại Viện, cung cấp những thiết bị, máy móc hiện đại giúp ích rất nhiều cho việc thực hiện đồ án. Ks. Đỗ Thị Tuyến đã hướng dẫn, giúp đỡ cho em rất tận tình, giải thích những thắc mắc trong khi thực hiện đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ các tài liệu để em hoàn thành đồ án một cách tốt nhất. Các thầy cô trong khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ Thuật Công nghệ TP.HCM đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em trong những năm học vừa qua. Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn đồng hành, chia sẽ, động viên. Các bạn trên Viện và bạn Nguyễn Thị Hoài An đã giúp đỡ em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp.
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ viii LỜI MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích nghiên cứu 3 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3 5. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu chung về cơ chất xylan, enzyme xylanase 4 1.1.1. Cơ chất xylan 4 1.1.2. Hệ enzyme xylanase 5 1.1.3. Hệ xylanase của Trichoderma spp. 5 1.1.4. Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan 6 1.2. Giới thiệu chung về nấm sợi Trichoderma spp. 6 1.2.1. Phân loại Trichoderma spp 6 1.2.2. Đặc điểm sinh học của Trichoderma spp. 7 1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma spp. 7 1.2.4. Một số ứng dụng của Trichoderma 8 1.3. Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzyme 9 1.4. Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme 10 i
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 1.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase 11 1.5.1. Bã mía 11 1.5.2. Cám mì 11 1.6. Phƣơng pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme và các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase trong điều kiện nuôi cấy bán rắn 12 1.6.1. Độ ẩm của môi trường nuôi cấy 12 1.6.2. Sự thông khí 13 1.6.3. Nguồn carbon 13 1.6.4. Nguồn nitrogen 13 1.6.5. pH 14 1.6.6. Các nguyên tố khoáng 14 1.7. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch chế phẩm enzyme 15 1.8. Sợ lƣợc về sắc ký lọc gel 16 1.8.1. Bản chất của phương pháp 16 1.8.2. Đặc tính của gel 17 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 2.1. Nguyên liệu 18 2.2. Hóa chất và thiết bị 18 2.2.1. Hóa chất 18 2.2.2. Thiết bị 18 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase từ nấm mốc Trichoderma spp. 19 2.3.1. Phương pháp mô tả hình thái Trichoderma 19 2.3.2. Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu 19 2.3.3. Phương pháp đo đường vành khuyên phân giải 20 ii
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 2.3.4. Quy trình khảo sát một số yếu tố 21 2.3.5. Thuyết minh quy trình 22 2.4. Bố trí thí nghiệm 24 2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase 24 2.4.2. Khảo sát các tác nhân tủa enzyme xylanase 26 2.4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase 30 2.5. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu và xử lí kết quả 34 2.5.1. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu 34 2.5.2. Xử lý số liệu 37 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 38 3.1. Quan sát hình thái Trichoderma spp. trên môi trƣờng PGA 38 3.1.1. Quan sát đại thể 38 3.1.2. Quan sát vi thể 39 3.2. Định tính enzyme xylanase của Trichoderma spp. 40 3.3. Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp. 41 3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase của Trichoderma spp. 41 3.5.1. Khảo sát dung môi và tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase 51 3.5.2. Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme xylanase từ dịch chiết bằng phương pháp kết tủa 53 3.5.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme xylanase 58 3.6. Tinh sạch enzyme xyalanse bằng phƣơng pháp chạy sắc ký lọc gel 60 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 4.1. Kết luận 62 iii
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 4.2. Đề nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC A 1 PHỤ LỤC B 2 PHỤ LỤC C 4 iv
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BM Bã mía CM Cám mì DNS Acid 2-hydroxyl-3,5-dinitrobenzoic DC Dịch chiết HT Hoạt tính HL Hàm lƣợng HTR Hoạt tính riêng IU (UI) Unit Internation, đơn vị quốc tế v
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 DANH MỤC BẢNG STT Bảng Nội dung Trang 1 1.1 Thành phần hóa học của bã mía 11 2 1.2 Thành phần hóa học của cám mì 11 Nồng độ chất khoáng cần thiết cho sinh trƣởng nấm 3 1.3 14 mốc và xạ khuẩn 4 2.1 Bảng số liệu dựng đƣờng chuẩn Bradford 35 5 2.2 Tỷ lệ pha loãng dung dịch Xylose chuẩn 36 Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 6 3.1 42 Trichoderma spp. với tỷ lệ cơ chất khác nhau Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 7 3.2 44 Trichoderma spp. có độ ẩm môi turờng khác nhau Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 8 3.3 45 Trichoderma spp. có pH khác nhau Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 9 3.4 47 Trichoderma spp. có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 10 3.5 48 Trichoderma spp. có thời gian nuôi cấy khác nhau Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 11 3.6 50 Trichoderma spp. có tỷ lệ giống khác nhau Kết quả khảo sát các dung môi để tách chiết enzyme 12 3.7 51 xylanase 13 3.8 Kết quả tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase 52 Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzyme 14 3.9 53 xylanase Kết quả khảo sát tỷ lệ acetone dùng để tủa enzyme 15 3.10 55 xylanase 16 3.11 Kết quả khảo sát tỷ lệ nồng độ muối dùng để tủa 56 vi
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 enzyme xylanase 17 3.12 So sánh kết quả tủa enzyme xylanase 57 Kết quả ảnh hƣởng của pH đến chế phẩm enzyme 18 3.13 58 xylanase Kết quả ảnh hƣởng của nhiệt độ đến chế phẩm 19 3.14 59 enzyme xylanase 20 3.15 Hiệu suất tinh sạch 61 vii
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ DANH MỤC HÌNH STT Hình Nội dung Trang 1 1.1 Sơ đồ cấu trúc cách tế bào thực vật 4 2 1.2 Trichoderma spp. 6 3 3.1 Hình thái đại thể của Trichoderma spp. 38 4 3.2 Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 24h 39 5 3.3 Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 36h 39 6 3.4 Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 48h 39 7 3.5 Kết quả vành phân giải Xylanase của Trichoderma spp. 40 DANH MỤC ĐỒ THỊ STT Đồ thị Nội dung Trang Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính 1 3.1 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có 42 tỷ lệ cơ chất khác nhau Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính 2 3.2 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có 44 độ ẩm khác nhau Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính 3 3.3 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có 46 độ ẩm khác nhau Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính 4 3.4 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có 47 độ ẩm khác nhau Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính 5 3.5 49 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có viii
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 độ ẩm khác nhau Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính 6 3.6 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có 50 độ ẩm khác nhau Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 7 3.7 51 các dung môi tách chiết enzyme xylanase 8 3.8 Biểu diễn tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase 52 Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme 9 3.9 54 xylanase từ các phân đoạn tủa bằng cồn Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme 10 3.10 55 xylanase từ các phân đoạn tủa bằng acetone Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme 11 3.11 56 xylanase từ các phân đoạn tủa bằng muối Biểu diễn kết quả so sánh tủa enzyme xylanase từ các 12 3.12 57 tác nhân tủa Biểu diễn hoạt tính xylanase theo pH của chế 13 3.13 58 phẩm enzyme xylanase Biểu diễn hoạt tính xylanase theo nhiệt độ của 14 3.14 59 chế phẩm enzyme xylanase 15 3.15 Sắc ký đồ trên excel khi chạy sắc ký enzyme xylanase 60 ix
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay, công nghệ vi sinh – hóa sinh phát triển nhanh chóng tạo điều kiện cho nghiên cứu phát triển, giúp ứng dụng vào thực tế nông nghiệp cũng nhƣ công nghiệp thực phẩm rất có hiệu quả. Việc sử dụng các chế phẩm enzyme trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm đƣợc sử dụng nhiều trong thực tế sản xuất nhằm nâng cao chất lƣợng cũng nhƣ năng suất của sản phẩm, đồng thời tiết kiệm chi phí sản xuất. Vì vậy, việc nghiên cứu và sản xuất ra enzyme và các chế phẩm enzyme ngày càng đƣợc quan tâm nhiều hơn. Việt Nam là một nƣớc nhiệt đới có nền nông nghiệp khá phát triển, phong phú và đa dạng trên đà phát triển mạnh. Lƣợng phế phẩm và phụ phẩm của nông nghiệp, công nghiệp cũng rất dồi dào nhƣng lại không đƣợc xử lý đúng mức. Theo đó các chất thải hữu cơ cũng gia tăng lên không ngừng. Trong đó phụ liệu của nhà máy mía đƣờng là một ví dụ điển hình và chiếm khoảng 20% mía nguyên liệu. Theo đánh giá của ngành mía đƣờng, nếu công suất nhà máy là 1000 tấn/ngày thì mỗi ngày nhà máy thải ra môi trƣờng khoảng 25 tấn bã mía gây ô nhiễm nghiêm trọng. Chính vì thế, đang có nhiều hƣớng giải quyết lƣợng bã mía sau sản xuất trên một số nhà máy sử dụng bã mía làm nhiên liệu đốt lò hơi, cách này rất lãng phí mà lại ô nhiễm môi trƣờng sống. Còn các nhà máy khác lại cố gắng tận dụng bã mía vào các mục đích tốt hơn nhƣ làm ván ép, thức ăn gia súc Nhƣng những biện pháp trên chƣa khả thi vì thành phần ván ép từ bã mía chƣa tốt và chắc bền nhƣ ván ép từ gỗ, còn thức ăn gia súc không thực sự đảm bảo nguồn dinh dƣỡng cho vật nuôi cũng nhƣ tốn nhiều chi phí cho sản xuất. Nếu để lâu bã mía sẽ bị vi sinh vật mùn hóa, lúc này có thể làm phân bón cho cây trồng nhƣng phải mất một thời gian rất lâu để vi sinh vật phân hủy vì thế không có khả năng giải quyết đƣợc thực trạng lƣợng bã mía tồn đọng ngày càng nhiều, hao tốn diện tích. Enzyme là một protein đặc biệt đƣợc sinh vật tổng hợp và tham gia các phản ứng sinh hóa, là thành phần không thể thiếu trong mọi tế bào sinh vật. Chúng đóng vai trò quyết định mối quan hệ giữa cơ thể sống và môi trƣờng. 1
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Cuối thế kỷ 19 và suốt thế kỷ 20, ngành công nghệ enzyme rất phát triển và phát triển thành ngành công nghiệp sản xuất enzyme dựa vào hoạt động sống của vi sinh vật. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những thuận lợi to lớn cho nhiều nƣớc. Từ lâu, xylanase đã đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm nhƣ: làm bánh mỳ, nƣớc hoa quả, rƣợu vang, bia, thu nhận đƣờng xylose. Xylanase đã, đang và ngày càng đƣợc bổ sung nhiều hơn vào thức ăn chăn nuôi. Kết quả cho thấy, bổ sung xylanase một cách độc lập hay kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn làm tăng đáng kể khối lƣợng và giảm thiểu bệnh tật ở vật nuôi. Xylanase có tác dụng phân giải xylan, một thành phần quan trọng của hemicellulose có nhiều trong thức ăn của vật nuôi, giải phóng đƣờng xylose và xylooligosaccharide dẫn đến làm giảm độ nhớt của thức ăn, giúp cho vật nuôi tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dƣỡng tốt hơn, cải thiện hệ vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi. Ở Việt Nam, nguồn vi sinh vật sinh enzyme trong đó có Xylanase khá phong phú, phần lớn có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn. Đây là một thuận lợi lớn cho sự phát triển lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất Xylanase từ vi sinh vật. Mặt khác, nƣớc ta là một nƣớc nông nghiệp nên hàng năm các phế phụ phẩm nông nghiệp nhƣ rơm, lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ lạc rất lớn, đây là nguồn cung cấp chất lên men rẻ tiền và dễ kiếm. Muốn thu đƣợc enzyme có hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và chọn giống vi sinh vật để chọn những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trƣờng tối ƣu cũng nhƣ tiêu chuẩn hóa điều kiện nuôi cấy. Ở Việt Nam hiện nay, công nghệ enzyme vẫn chƣa phát triển, nguồn enzyme còn hạn chế phụ thuộc vào enzyme nhập khẩu từ nƣớc ngoài. Vì vậy, việc nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme để ứng dụng vào công nghiệp, đời sống là rất cần thiết. 2
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Từ những lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài: “Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel từ nấm mốc Trichoderma spp.”. 2. Mục đích nghiên cứu Tìm ra môi trƣờng tốt nhất để chủng nấm mốc Trichoderma spp. thực hiện tối ƣu hóa môi trƣờng Tinh sạch enzyme xylanase đƣợc thu nhận từ nấm mốc Trichoderma spp. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát thành phần môi trƣờng cảm ứng để chủng nấm mốc Trichoderma spp. cho hoạt lực enzyme cao nhất. Các thành phần của môi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt lực enzyme bao gồm: tỷ lệ cám mì : bã mía, độ ẩm, nồng độ dinh dƣỡng, pH, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống. Tách chiết và tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp Bradford dùng để xác định hàm lƣợng protein. Phƣơng pháp Xylose dùng để xác định hoạt tính enzyme xylanase. Phƣơng pháp tủa enzyme bằng các tác nhân khác nhau. Phƣơng pháp tinh sạch enzyme xylanase bằng sắc ký lọc gel. 5. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp Chƣơng 3: Kết quả và biện luận Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị 3
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cơ chất xylan, enzyme xylanase 1.1.1. Cơ chất xylan Xylan là thành phần chính của hemicelluloses thực vật, đứng thứ hai sau cellulose và chiếm khoảng một phần ba nguồn carbon hữu cơ có thể phục hồi trên trái đất (Prade, 1995). Trong đó, hemicelluloses là phức hợp polysaccharide gồm xylan, xyloglucan, glucomannan và arabinogalactan (Shallom, D và Shoham, Y , 2003). Phức hợp này cùng với cellulose, pectin và một lƣợng nhỏ glycoprotein và các hợp chất phenolic hình thành vách tế bào sơ cấp. Sau đó, vách tế bào sơ cấp đƣợc phát triển thành vách thứ cấp. Ngoài thành phần chính là cellulose và hemicelluloses, trong vách thứ cấp còn có thêm lignin – đƣợc hình thành bởi quá trình đồng hóa các dẫn xuất phenylpropan nhƣ cumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol tạo nên thành phần polymer của vách tế bào thực vật (Kulkarni, N et al, 1999). Ba thành phần chính trong cấu trúc vách tế bào thực vật kết hợp với nhau nhờ các liên kết cộng hóa trị và không cộng hóa trị. Xylan đƣợc tìm thấy ở điểm giao giữa lignin và cellulose, đây là giao điểm quan trọng của sự gắn kết và toàn vẹn của vách tế bào thực vật (Beg, Q.K., et al. 2001). Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc vách tế bào thực vật 4
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Xylan đƣợc tìm thấy trong một lƣợng lớn trong gỗ cứng của thực vật hạt kín (15 – 30%) và gỗ mềm của thực vật hạt trần (7 – 10%), cũng nhƣ trong cây hàng năm (< 30%) (Singh, S, et al., 2003). Xylan là polysaccharide phức, có cấu trúc thay đổi giữa các loài thực vật khác nhau. Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylose đƣợc nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside, tảo biển tổng hợp xylan với cấu trúc khác là D-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,3-glucoside. Nhìn chung, xylan là polysaccharide có cấu trúc gồm các đơn vị xylose liên kết với liên kết β- 1,4-glucoside (Whistler và Richards, 1970). Phần lớn xylan là heteropolysacharide, có các nhóm thế khác nhau trong khung sƣờn và chuỗi bên (Biely, 1995). Các nhóm thế phổ biến trên khung sƣờn xylan là acetyl, arabinofuranosyl và glucuronysyl (Whitsler và Richards, 1970). Với các nhóm thế khác nhau nhƣ vậy, xylan đƣợc phân loại thành homoxylan thẳng, arabinoxylan, acetyxylan, glucuronoxylan và glucu-arabinoxylan. 1.1.2. Hệ enzyme xylanase Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 trong khung sƣờn xylan. Xylanase đƣợc biết thuộc họ 10 và 11 (hơn 300 trình tự gen đã đƣợc biết) và khoảng hơn 20 gen xylanase đƣợc xếp vào họ 5, 8, 43 (Shallom, Shoham, 2003). Cho đến nay, đã có 87 xylanase đƣợc xác định cấu trúc lập thể. Hầu hết xylanase của vi sinh vật là protein đơn phân tử. Ngày nay, xylanase đa phân tử ngày càng đƣợc miêu tả nhiều hơn. Những enzyme này chứa những cấu trúc đƣợc coi là vùng xúc tác (catalytic domain) hoặc một số vị trí gắn với carbohydrate. Những enzyme xylanase chứa CBDs có hiệu quả thủy phân cao trên cơ chất kết tinh và nồng độ cao trên bề mặt cơ chất lỏng. 1.1.3. Hệ xylanase của Trichoderma spp. Vi sinh vật sinh ra nhiều loại endoxylanase với các đặc tính lý hóa, cấu trúc, hoạt tính và hiệu suất rất đa dạng và phức tạp. Các chủng Trichoderma sản xuất ra tất cả các enzyme thủy phân xylan. Nhiều loài đã đƣợc phân tách và giải trình tự. 5
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Hệ enzyme thủy phân xylan đƣợc sản xuất bởi chủng Trichoderma, chủ yếu là T.reesei, là những enzyme đƣợc xác định rõ trong nhóm thủy phân vách tế bào. 1.1.4. Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan Xylanase là enzyme cảm ứng đƣợc vi sinh vật tiết vào môi trƣờng nuôi cấy có mặt xylan hoặc cơ chất giàu xylan (Balakrishnan và cộng sự, 1997). Xylan là polymer cao phân tử không thể xâm nhập vào tế bào. Do vậy, sự sinh tổng hợp xylanase đƣợc cảm ứng chủ yếu bởi các phân đoạn của xylan nhƣ xylose, xylobiose, xylooligosacharide của xylose, có trọng lƣợng phân tử thấp đƣợc tạo ra trong môi trƣờng nhờ một lƣợng nhỏ enzyme xúc tác (Bastawde 1992, Kulkarni và cộng sự, 1999). Nhiều nghiên cứu cho rằng, ligocellulose có trong cám mì, trấu, bã mía là yếu tố cảm ứng vi sinh vật sinh xylanase (Beg và cộng sƣ, 1998, Puchart và cộng sự, 1999). Các loại nấm sợi sử dụng xylan nhƣ nguồn carbon để cảm ứng sinh tổng hợp xylanase. 1.2. Giới thiệu chung về nấm sợi Trichoderma spp. 1.2.1. Phân loại Trichoderma spp Lớp: Euascomycetes Bộ: Hypoceales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Hình 1.2. Trichoderma spp. Có 5 loài chính: Trichoderma Harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma viride. 6
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 1.2.2. Đặc điểm sinh học của Trichoderma spp. Trichoderma là nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng cách đính bào tử từ khuẩn ty. Khuẩn lạc có màu trắng hoặc từ lúc trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Khuẩn ty không màu, cuống sinh bào tử phân nhiều nhánh, ở cuối nhánh phát triển thành khối tròn mang các bào tử không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn, có thành trơn hoặc nhám. Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, đƣờng kính khuẩn lạc lớn hơn 9cm sau 5 ngày trên môi trƣờng thạch đĩa OA (oatmeal agaro) ở 20ºC. 1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma spp. Trichoderma phân bố chủ yếu ở trong đất và phân hủy gỗ, xác thực vật. Các loài Trichoderma là thành phần chiếm ƣu thế trong hệ vi sinh vật đất với môi trƣờng sống biến đổi đa dạng. Trichoderma rất khó tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh thực vật (Gary J Samuels, 2000). Các chủng Trichoderma spp. đƣợc tìm thấy rất nhiều trong môi trƣờng tự nhiên, đặc biệt trong môi trƣờng đất, chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác, ), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%) và sống đƣợc ở đất acid và base (pH 3 – 8). Hầu hết các loài Trichoderma sống hoại sinh, thƣờng gặp trên xác bã thực vật, ở những nơi ẩm ƣớt Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ carbonhydrate, amino acid đến ammonia. Theo Garrett (1956), khả năng cạnh tranh dinh dƣỡng cao của Trichoderma spp. Do các đặc tính sau: - Sinh trƣởng mạnh và bào tử nảy mầm rất nhanh. - Có khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân cao. - Có khả năng tạo chất kháng sinh. - Chịu đƣợc chất kháng sinh. 7
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Các loài Trichoderma spp. khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau. Chẳng hạn nhƣ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi trƣờng có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum phân bố ở vùng có khí hậu ấm áp. 1.2.4. Một số ứng dụng của Trichoderma 1.2.4.1. Bảo vệ thực vật Trichoderma đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học. Chúng có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm gây bệnh thực vật, đồng thời kích thích sự tăng trƣởng của cây trồng. Quá trình kiểm soát sinh học bởi Trichoderma theo các cơ chế sau: Sự kí sinh nấm: Trichoderma có khả năng cảm ứng tiết ra một lƣợng lớn các enzyme chitinase, glucanase, cellulose, protease thủy phân vách tế bào sợi nấm gây bệnh làm cho chúng không phát triển đƣợc và bị tiêu diệt. Khả năng tiết kháng sinh: Trichoderma còn có khả năng tiết một số chất kháng sinh dễ bay hơi hoặc không bay hơi và một số hợp chất ức chế tăng trƣởng. Ngoài ra, Trichoderma có khả năng cạnh tranh chất dinh dƣỡng và không gian, làm bất hoạt hệ enzyme ở nấm gây bệnh. 1.2.4.2. Cải thiện năng suất cây trồng Ngày nay, các nƣớc có nền công nghiệp phát triển có xu hƣớng sử dụng phân bón hữu cơ sinh học thế hệ mới, thực chất là sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học để khắc phục những hạn chế khi sử dụng phân bón hóa học, thuốc trừ sâu mà vẫn cho năng xuất cây trồng. Khi khảo sát các loài Trichoderma ở các lớp đất sâu, ngƣời ta thấy rằng Trichoderma làm tăng số lƣợng các rễ nằm sâu trong đất, điều này góp phần giúp các cây lƣơng thực nhƣ ngô có khả năng chống chịu hạn tốt. Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa. Đã có nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Trichoderma harzianum và 8
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Trichoderma koningii kích thích sự nẩy mầm và tăng trƣởng của cây. Đối với các hoa đƣợc trồng trong nhà kính, Trichoderma harzianum đẩy mạnh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lƣợng hoa. 1.2.4.3. Xử lý ô nhiễm môi trường Trichoderma harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất tự do 2, 4, 6-trichlorophenol; 4,5-dichloroguaiacol và alcohol oxidase trong môi trƣờng chứa muối khoáng. Trichoderma harzianum CCT – 4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24 giờ, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong đất và trong đầm lầy. Trichoderma reesei Rut-30 có thể xử lý chất thải sinh hoạt đô thị, hứa hẹn một nguồn sản xuất enzyme cellulose rẻ tiền, đồng thời giảm lƣợng rác thải. 1.2.4.4. Các lĩnh vực khác Các enzyme ngoại bào đƣợc tổng hợp từ Trichoderma bao gồm cellulase, hemicellulase, đƣợc ứng dụng rỗng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: sản xuất thức ăn gia súc, sản phẩm thực phẩm và đồ uống, công nghiệp dệt và sản xuất giấy 1.3. Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzyme Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đóng vai trò quyết định: - Giống vi sinh vật quyết định đến năng suất của enzyme. - Giống vi sinh vật ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính enzyme). - Giống vi sinh vật quyết định vốn đầu tƣ cho sản xuất. - Giống vi sinh vật quyết định giá thành cho sản phẩm. Nhƣ vậy giống vi sinh vật có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật. 9
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 1.4. Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và đƣợc sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ enzyme cần có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là: Giống vi sinh vật phải tạo ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có số lƣợng và chất lƣợng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì vậy trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lƣợng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp nhiều chất và tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau. Chính vì thế giống vi sinh vật dùng cho sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lƣợng và chất lƣợng. Cho năng suất sinh học cao. Có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp. Có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phƣơng nơi nhà máy hoạt động. Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh. Có tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo ra sản phẩm mong muốn, dễ tách sản phẩm ra khỏi tạp chất. Ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản. Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên men công nghiệp ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết. 10
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 1.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase 1.5.1. Bã mía Thành phần hóa học của bã mía Bã mía (sản phẩm của quá trình ép mía) là phế liệu chiếm nhiều nhất trong sản xuất đƣờng. Từ 100 tấn mía cây đƣa vào nhà máy, ta có 10 – 12 tấn đƣờng, 23 – 28 tấn bã mía, 3 – 4 tấn mất rỉ, 1,5 – 3 tấn bùn lọc. Bã mía sau khi ép thƣờng ngậm 45 – 50 % nƣớc. Ngoài nƣớc bã mía còn chứa thành phần chất xơ chủ yếu là cellolose. Các chất hòa tan trong nƣớc (nƣớc này là nƣớc thẩm thấu và nƣớc mía nguyên chất) gồm đƣờng và các chất tạp khác, các chất hòa tan chiếm số lƣợng nhỏ từ 2 đến 4%. Bã mía (toàn Thành phần Xơ bã mía (%) Tủy mía (%) bộ) Cellulose 46,00 56,50 55,40 Hemicelluloses 24,50 26,11 29,30 Lipid và sáp 3,45 2,25 3,55 Chất khoáng 2,40 1,30 3,02 Lignin 19,95 19,15 22,30 Silic 2,22 0,46 2,42 Bảng 1.1. Thành phần hóa học của bã mía (A.G.Keller, 1964). 1.5.2. Cám mì Cám mì là sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến bột mì. Thành phần Cám mì Protein thô 14 – 15,5% Chất xơ thô 8 – 10% Chất béo thô 4,5 – 6% Độ ẩm 11 – 14% Bảng 1.2. Thành phần hóa học của cám mì 11
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Cám mì là loại thức ăn tốt cho gia súc. So với cám gạo, cám mì có hàm lƣợng protein cao hơn (bình quân 15,5%), ít hơn dầu (bình quân 4%), 8 – 10% xơ thô với độ ẩm 11 – 14%, năng lƣợng trao đổi là 2420 Kcal/g. Cám mì thƣờng có hai loại: loại có màu vàng nâu nhạt, hoàn toàn là cám; loại màu ngà trắng, ngoài vỏ cám còn lẫn cả tinh bột. 1.6. Phƣơng pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme và các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase trong điều kiện nuôi cấy bán rắn Ngày nay, nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng bán rắn đƣợc quan tâm và sử dụng rộng rãi nhằm tăng giá trị cho các sản phẩm từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, các phế liệu nông nghiệp và chất thải công nghiệp. Canh trƣờng bán rắn sau khi ngừng nuôi cấy có thể đem nghiền nhỏ, sấy khô, đông khô đến độ ẩm 8 – 12% để sử dụng nhƣ chế phẩm enzyme thô. Lên men bán rắn là sự sinh trƣởng của vi sinh vật trên cơ chất ẩm. Ở đây, vi sinh vật phát triển và bao phủ bề mặt môi trƣờng rắn, các nguồn dinh dƣỡng (cám mì, bã mía ) đƣợc làm ẩm và dùng làm môi trƣờng. Vi sinh vật sử dụng chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng và oxy trong không khí để tạo hệ sợi nấm phát triển, sự tổng hợp enzyme sẽ hoàn thành say khoảng 36 – 40 giờ, có khi lâu hơn tùy chủng. Để tăng sự tổng hợp một số enzyme ngƣời ta thêm vào canh trƣờng một số chất cảm ứng cần thiết. Ngoài ra, để cấu trúc đƣợc thoáng, ngƣời ta bổ sung thêm trấu, mùn cƣa Song, nếu thêm nhiều hơn 15 – 20%, chúng sẽ làm nghèo dinh dƣỡng của môi trƣờng. Vậy cần bổ sung nguồn nitrogen vô cơ, phosphor 1.6.1. Độ ẩm của môi trường nuôi cấy Độ ẩm không những ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và trao đổi chất của vi sinh vật mà còn ảnh hƣởng đáng kể đến đặc tính lý hóa của cơ chất. Độ ẩm trong môi trƣờng lên men bán rắn đƣợc thể hiện qua hàm lƣợng nƣớc của cơ chất rắn, ảnh hƣởng đến áp suất thẩm thấu do các chất tan trong cơ chất. 12
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nƣớc khác nhau. Do đó, quá trình lên men bán rắn đƣợc thực hiện với hàm lƣợng nƣớc trong cơ chất khác nhau từ 30 – 80%. Độ ẩm thích hợp để thu canh trƣờng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao là 53 – 70% tùy thuộc đặc điểm sinh lý của chủng giống, thành phần, cấu trúc cơ học của môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy. Trong nuôi cấy bán rắn, độ ẩm quá cao cản trở sự thoáng khí, làm giảm hoạt động sống của vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nấm mốc và xạ khuẩn đều phát triển tốt trong môi trƣờng xốp có độ ẩm từ 60 – 65%. 1.6.2. Sự thông khí Vi sinh vật tổng hợp xylanase thƣờng hiếu khí, do đó độ thông khí của môi trƣờng ảnh hƣởng lớn đến quá trình tổng hợp enzyme của chúng. Trong nuôi cấy bán rắn, việc cung cấp oxy thƣờng rất thuận lợi, phụ thuộc độ xốp của cơ chất, độ dày của môi trƣờng, nhiệt độ và độ thoáng khí của phòng nuôi cấy. Trong các yếu tố trên, độ xốp của cơ chất và độ dày của lớp môi trƣờng là chủ yếu quan trọng hơn cả. 1.6.3. Nguồn carbon Nguồn carbon là thành phần dinh dƣỡng cơ bản đối với sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật. Khi nuôi cấy bán rắn theo hƣớng tận dụng phế phụ liệu thì nên lựa chọn cơ chất vừa là nguồn carbon vừa là cơ chất cảm ứng. 1.6.4. Nguồn nitrogen Nguồn nitrogen cũng là một trong những nguồn dinh dƣỡng cơ bản, thiết yếu đối với vi sinh vật và ảnh hƣởng rất rõ đến sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Nitrogen vô cơ có thể ở dạng các muối nitrat và amonium. Đối với nấm sợi, muối nitrat là nguồn nitrogen thích hợp để sinh tổng hợp enzyme. Muối này làm kiềm hóa môi trƣờng, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành enzyme. Muối amonium, khi đƣợc đồng hóa tạo nên các aniom vô cơ làm thấp pH của môi trƣờng. Điều này không những ức chế vi sinh vật mà còn làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành. 13
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Nguồn nitrogen hữu cơ có thể là các hợp chất hữu cơ phức tạp nhƣ dịch nấm men, nƣớc chiết đậu nành 1.6.5. pH pH của môi trƣờng cũng có ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp xylanase của vi sinh vật, đối với những loài vi sinh vật khác nhau có sự ảnh hƣởng khác nhau. Sự sinh trƣởng của vi sinh vật có thể làm thay đổi đáng kể pH trong cơ chất. Sự thay đổi này phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật và khả năng đệm của cơ chất rắn. Tuy nhiên, pH rất khó kiểm soát trong môi trƣờng lên men bán rắn. Ngƣỡng pH thích hợp cho các loại nấm mốc từ 3 – 8. 1.6.6. Các nguyên tố khoáng Nhu cầu chất khoáng ở vi sinh vật là rất ít, nhƣng không thể thiếu. Nhu cầu này không giống nhau đối với từng loài, từng giai đoạn phát triển của vi sinh vật. theo nghiên cứu, Nguyễn Lân Dũng, 2007 nhận thấy nồng độ cần thiết về chất khoáng đối với vi nấm thƣờng thay đổi trong phạm vi nhƣ ở bảng 1.3. Chất khoáng Nồng độ cần thiết (g/l) 1 – 2 K2HPO4 1 – 2 KH2PO4 0,2 – 0,5 MgSO4.7H2O 0,02 – 0,1 MnSO4.4H2O 0,02 – 0,05 FeSO4.7H2O 0,01 – 0,02 Na2MoO4 0,02 – 0,1 ZnSO4.7H2O < 0,06 CoCl2 0,02 – 0,1 CaCl2 0,01 – 0,05 CaSO4.5H2O Bảng 1.3. Nồng độ chất khoáng cần thiết cho sinh trƣởng nấm mốc và xạ khuẩn. 14
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 1.7. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch chế phẩm enzyme Trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào chất của tế bào. Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào. Do đó để có thể chiết rút enzyme nội bào trƣớc hết cần phá vỡ cấu trúc của tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng biện pháp cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoặc đồng hóa bằng các thiết bị đồng hóa) bằng tác dụng của các dung môi hữu cơ (rƣợu butylic, aceton, glycerin ) của sóng siêu âm. Việc tách enzyme ra khỏi tế bào gặp nhiều khó khăn, do đó khi tách chúng phải hết sức lƣu ý: - Enzyme có trong tế bào vi sinh vật với lƣợng không lớn so với các thành phần khác. Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất khó khăn. Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi chịu các tác động bên ngoài. - Enzyme là protein mà protein enzyme luôn đi cùng với những loại protein không phải enzyme nhƣng lại có tính chất lý hóa rất giống nhau. Do đó việc tách protein enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt đƣợc kết quả tốt và không phải gặp những khó khăn nhất định. - Đa số các ngành sản xuất thực phẩm cũng nhƣ công nghiệp nhẹ thì lại đòi hỏi phải dùng enzyme sạch. Để tách chiết enzyme từ môi trƣờng rắn ngƣời ta thƣờng dùng nƣớc, các dung môi trung tính và các dung dịch đệm thích hơp. Trong đó, nƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi và cho kết quả tốt nhất. Các enzyme đƣợc chuyển từ tế bào vào nƣớc do sự chênh lệch nồng độ. Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzyme đƣợc cô đặc dƣới áp suất thấp sao cho hàm lƣợng chất khô không nhỏ hơn 50 – 55%. Theo phƣơng pháp khuếch tán bằng nƣớc, có thể chiết đƣợc lƣợng enzyme trên 90 – 95% và trong dịch chiết không chứa các tạp chất không tan. Nƣớc thƣờng dùng để chiết có nhiệt độ 25 – 28oC. Dịch chiết thu đƣợc có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và đƣợc làm lạnh kịp thời xuống còn 10 – 15
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 12oC. Trong dịch chiết ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ chúng cần thực hiện nhiều phƣơng pháp khác nhau. Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lƣợng thấp ngƣời ta thƣờng dùng biện pháp thẩm tích đối với nƣớc hay các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel. Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lƣợng cao khác, thƣờng dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau. Phƣơng pháp biến tính chọn lọc nhờ các tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trƣờng, phƣơng pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phƣơng pháp sắc ký, điện di, phƣơng pháp lọc gel. 1.8. Sợ lƣợc về sắc ký lọc gel 1.8.1. Bản chất của phương pháp Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lƣợng phân tử và phân tích tƣơng tác phân tử. Một số thông số vật lý của phƣơng pháp - Giới hạn tách (exclution limit): là trọng lƣợng phân tử (MW) của phân tử nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel. Ví dụ: giới hạn tách của G – 50 có FR từ 1.500 – 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn đều không chui vào hạt gel. - Phạm vi tách (Fructionation range): ví dụ: sephadex G – 50 có FR từ 1.500 – 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ đƣợc tách dễ dàng bởi G – 50. - Độ ngậm nƣớc (water regain): là trong lƣợng nƣớc mà 1 gam bột gel khô hút nƣớc. Ví dụ: G – 50 có WR là 0,5 ± 0,3g. Giá trị này chƣa tính đến lƣợng nƣớc bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột. - Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu khi trƣơng nở trong nƣớc. G – 50 có thể tích nền 9 – 11ml/g gel khô. 16
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 - Hạt gel (gel particle): hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thƣớc hạt xác định bằng mesh hoặc đƣờng kính hạt (bead diameter) tính theo µm. Hạt có kích thƣớc lớn (50 – 100 mesh, 100 – 300 µm) cho tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhƣng kết quả tách thấp. Ngƣợc lại những hạt mịn (400 mesh, 10 – 40 µm) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thƣờng ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100 – 200 mesh, 50 - 150 µm. - Thể tích trống (void volume): là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Daltons. - Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách ra khỏi cột. 1.8.2. Đặc tính của gel Có 4 loại gel thƣờng đƣợc sử dụng. - Dextran có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB (Thụy Điển) cung cấp với tên thƣơng mại là Sephadex. Giới hạn tách của gel dextran là 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang nên khó giữ nguyên vẹn hạt nếu kích thƣớc lỗ to hơn. Tuy nhiên nếu dextran đƣợc bổ sung thêm các liên kết ngang bởi N,N’ – methylene bisacrylamide thì dextran có giới hạn tách gia tăng. - Gel polyacrylamide: tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và N,N’ – methylene bisacrylamide (Bio – Rad cung cấp – Biogel – P là tên thƣơng mại). - Gel agarose: là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ galactose và anhydrogalactose. Mạng gel đƣợc ổn định nhờ liên kết hydro nhiều hơn 1 do các liên kết ngang. Hãng Bio – Rad cung cấp agarose với tên thƣơng mại là Bio – gel A, còn Pharmacia – cung cấp tên thƣơng mại là sepharose và seperose. - Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thƣơng mại là ultragel, nó cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng. 17
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu - Lúa - Cám mì - Bã mía - Giống mốc Trichoderma 2.2. Hóa chất và thiết bị 2.2.1. Hóa chất - Thuốc thử Coomassie - Thuốc thử DNS - Thuốc thử lugol - Dung dịch đệm Citrate - Acetone, acetate pH5, NaCl 2.2.2. Thiết bị Tủ hút Kính hiển vi Máy đo quang phổ Máy vortex Microwave Tủ ủ Autoclave Cân phân tích Buồng đếm hồng cầu Máy khuấy Đo pH Máy ly tâm 18
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase từ nấm mốc Trichoderma spp. 2.3.1. Phương pháp mô tả hình thái Trichoderma 2.3.1.1. Quan sát đại thể - Dùng que cấy móc vô trùng gạt nhẹ lên bào tử đính của sợi nấm, chuyển sang đĩa petri chứ môi trƣờng PGA, cắm đầu móc xuống giữa mặt thạch. - Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 – 3 ngày. - Quan sát hình dạng và màu sắc khuẩn lạc của sợi nấm ở mặt trên và mặt dƣới của khuẩn lạc. 2.3.1.2. Quan sát vi thể - Lót giấy thấm ở mặt đáy đĩa petri, đặt vào một miếng lame, gói giấy và đem khử trùng. - Nhỏ 3 giọt môi trƣờng PGA vào lame và chờ đông lại, cấy 1 điểm vào giữa môi trƣờng PGA rồi đậy miếng lamen lên. - Làm ẩm 4 góc giấy bằng nƣớc cất vô trùng. - Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng. - Sau 2, 3 ngày lấy miếng lame ra khỏi đĩa petri, nhỏ vài giọt cồn thấm bằng giấy sau đó nhỏ tiếp NaOH 10% thấm khô. - Quan sát kính hiển vi với độ phóng đại x40. 2.3.2. Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu  Cách tiến hành Cân 1g giống bào tử  ống nghiệm chứa 9ml nƣớc cất bổ sung Tween 80 0,1%  vortex  độ pha loãng 10-1  tiếp tục pha loãng cho đến 10-4  cho vào buồng đếm hồng cầu  quan sát X40 và đếm bào tử.  Công thức tính số bào tử trong 1g cơ chất 19
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Trong đó : - N: số lƣợng bào tử trong 1ml dịch huyền phù - a: số lƣợng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con) - b: số ô con trong 5 ô lớn (16 x 5 = 80) - 103: số chuyển mm3 thành ml (1000 mm3 = 1ml) - n: độ pha loãng của mẫu 2.3.3. Phương pháp đo đường vành khuyên phân giải  Nguyên tắc Khi cho enzyme tác dụng với cơ chất trong môi trƣờng thạch, các hợp chất này đƣợc phân giải thành các hợp chất đơn giản hơn. Có thể định tính và định lƣợng sơ bộ hoạt tính xylanase dựa vào vòng phân giải xylan do các hợp chất không phản ứng màu với thuốc thử.  Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ - Môi trƣờng định tính hoạt tính xylanase của dịch enzyme theo phƣơng pháp cấy điểm: PGA bổ sung xylan. - Thuốc thử glugol. - Đĩa petri hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, 15 phút.  Cách tiến hành Đổ đĩa môi trƣờng định tính hoạt tính xylanase  dùng que cấy điểm Trichoderma vào giữa môi trƣờng  cho thuốc thử glugol vào sau khi khảo sát ở 8h ; 16h ; 24h ; 32h ; 40h ; 48h ; 56h ; 64h ; 72h  đo vòng phân giải. 20
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 2.3.4. Quy trình khảo sát một số yếu tố Giống Trichoderma Cấy chuyền (môi trƣờng thạch nghiêng PGA) Cất giữ giống (môi trƣờng lúa) Khảo sát sinh tổng hợp enzyme (môi trƣờng bán rắn) Khảo sát tỷ lệ Khảo sát độ ẩm cơ chất môi trƣờng Khảo sát thời Khảo sát pH gian nuôi cấy Khảo sát nồng Khảo sát tỷ lệ độ dinh dƣỡng giống 21
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 2.3.5. Thuyết minh quy trình 2.3.5.1. Giống mốc Trichoderma Viện Sinh học Nhiệt Đới cung cấp đƣợc nuôi trong môi trƣờng PGA thạch nghiêng ở nhiệt độ thƣờng trong thời gian là 36h, khi bào tử đƣợc hình thành đem bảo quản ở nhiệt độ lạnh. 2.3.5.2. Cấy chuyền  Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ - Môi trƣờng PGA: khoai tây 200g, agar 20g, glucose 20g, nƣớc cất 1000ml, hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, 15 phút. - Que cấy mốc, ống nghiệm.  Cách tiến hành - Cho môi trƣờng vào 1/3 ống nghiệm hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, 15 phút, lấy ra và để nghiêng sao cho thạch không bị dính lên trên nút bông, chờ cho thạch đông lại. - Dùng que cấy đã hấp khử trùng cấy ria trên bề mặt thạch - Giống sau khi cấy nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. 2.3.5.3. Cất giữ giống  Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ - Môi trƣờng lúa bổ sung (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, UREA, pepton, hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, 15 phút. - Pipetman, đầu típ, đũa thủy tinh, que cấy vòng tất cả đều đƣợc thanh trùng.  Cách tiến hành - Cho 1ml nƣớc cất vào trong ống giống, dùng que cấy mài nhẹ trên bề mặt thạch để tách bào tử, cho chúng hoàn toàn nằm trong pha nƣớc nhƣ các dịch huyền phù. - Sau đó đổ toàn bộ nƣớc chứa bào tử vào trong môi trƣờng nhân giống và trộn kỹ. 22
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 2.3.5.4. Khảo sát sinh tổng hợp enzyme xylanase từ Trichoderma spp.  Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ - Môi trƣờng khoáng Czapeck: KNO3, KH2PO4, MgSO4, FeSO4, KCl - Môi trƣờng bán rắn: 20g cám mì – bã mía bổ sung khoáng Czapeck. - Thuốc thử Coomassie - Thuốc thử DNS - Pipetman, đầu típ, đũa thủy tinh, nƣớc tinh khiết, bình định mức 50ml, tất cả đều đƣợc thanh trùng.  Cách tiến hành - Cho vào môi trƣờng lúa nhân giống 20ml nƣớc tinh khiết, dùng đũa thủy tinh khuấy để bào tử hòa lẫn vào nƣớc. - Dùng pipetman hút 2 ml cho vào môi trƣờng bán rắn. - Sau khi cấy, nuôi ở nhiệt độ phòng ở 48h. - Đo hàm lƣợng protein: sử dụng thuốc thử Coomassie và đo ở bƣớc sóng 595 nm. - Đo hoạt tính enzyme: sử dụng thuốc thử DNS, cơ chất xylan và đo ở bƣớc sóng 540 nm. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỷ lệ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase ở tỷ lệ cám mì – bã mía Tỷ lệ 4:6 6:4 5:5 3:7 7:3 Thí nghiệm 2: Khảo sát độ ẩm môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase Độ ẩm 45 50 55 60 65 70 (%) Thí nghiệm 3: Khảo sát pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase pH 4,5 5 5,5 6 6,5 23
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase Thời 8h 16h 24h 32h 40h 48h 56h 64h 72h 80h gian Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ dinh dƣỡng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase Nồng độ x1 x2 x3 x4 x5 Thí nghiệm 6: Khảo sát tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase Tỷ lệ 1.12×1011 2.24×1011 3.36×1011 4.48×1011 5.6×1011 giống 2.4. Bố trí thí nghiệm Sau khi thu nhận kết quả khảo sát sinh tổng hợp enzyme xylanase ta tiến hành thu chế phẩm enzyme nhằm phục vụ cho các thí nghiệm khảo sát enzyme về sau. Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát từng thông số kỹ thuật ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase và quá trình tách chiết, tinh sạch sơ bộ enzyme. 2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase Mục đích nhằm chọn tỷ lệ dung dịch đệm tối ƣu để tách chiết enzyme cho các thí nghiệm sau. Chọn ra tỷ lệ dung môi tốt nhất để thu nhận dịch chiết enzyme xylanase. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi để tách chiết enzyme  Chuẩn bị: Chế phẩm enzyme, các dung môi (nƣớc cất, đệm Citrate, đệm Acetate, muối sinh lý NaCl). 24
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013  Cách tiến hành Cân chế phẩm enzyme Bổ sung dung môi (tỷ lệ chế phẩm : dung môi là 1:8) Khuấy trong 30 phút Lọc Dịch chiết Đo hàm lƣợng Protein và Hoạt tính enzyme Thí nghiệm 2: Khảo sát các tỷ lệ của dung môi tốt nhất để tách chiết thu nhận enzyme.  Chuẩn bị: Chế phẩm enzyme, dung môi tốt nhất (kết quả của thí nghiệm 1). 25
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013  Cách tiến hành Cân chế phẩm enzyme Tỷ lệ 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10 Chế phẩm 3 3 3 3 3 3 3 3 enzyme (g) Dung môi 9 12 15 18 21 24 27 30 (ml) Khuấy trong 30 phút Lọc Dịch chiết Đo hàm lƣợng protein và Hoạt tính enzyme 2.4.2. Khảo sát các tác nhân tủa enzyme xylanase Mục đích khảo sát: Khảo sát các tỷ lệ các tác nhân với dịch chiết để chọn tỷ lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất. 26
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Dịch chiết protein Cồn 960 (NH4)2SO4 Acetone 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 3 50% 55% 60% 65% 70% 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 3 Xác định hoạt tính và hàm luợng Chọn lấy tỷ lệ, nồng độ tốt nhất Thí nghiệm 3. Khảo sát tủa bằng cồn 96o  Chuẩn bị: Dịch chiết protein, cồn 96o.  Cách tiến hành: Để tránh làm biến tính protein, cồn 960 phải đƣợc làm lạnh trƣớc khi tiến hành tủa. Thể tích dịch chiết protein và thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh ở 4oC trong 1 giờ. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong thời gian là 5 phút. Thu tủa rồi đem đi xác định hoạt tính và hàm lƣợng. Chọn tỷ lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất. 27
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Dịch chiết protein 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 3 Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng Chọn lấy tỷ lệ tốt nhất Thí nghiệm 4. Khảo sát tủa bằng muối (NH4)2SO4  Chỉ tiêu khảo sát: Khảo sát các nồng độ muối (NH4)2SO4 với dịch chiết để chọn nồng độ cho hoạt tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất.  Vật liệu: Dịch chiết protein, dung dịch muối (NH4)2SO4 (50%, 55%, 60%, 65%, 70%).  Cách tiến hành Để tránh làm biến tính protein, dịch chiết protein thô đƣợc cho vào ống ly tâm 5ml đặt trong chậu nhỏ chứa đá lạnh vụn xung quanh. Thể tích dịch chiết protein và muối tƣơng ứng với các nồng độ 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. Khuấy hỗn hợp bảo quản lạnh ở 40C trong 30 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong thời gian là 5 phút. Thu tủa rồi đem đi xác định hoạt tính và hàm lƣợng. Chọn nồng độ cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất. 28
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Dịch chiết protein 50% 55% 60% 65 % 70% 3 Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng Chọn lấy nồng độ tốt nhất. Thí nghiệm 5. Khảo sát tủa bằng Acetone  Chỉ tiêu khảo sát: Khảo sát các tỷ lệ cồn với dịch chiết để chọn tỷ lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất.  Chuẩn bị: Dịch chiết protein, dung dịch Acetone.  Cách tiến hành: Để tránh làm biến tính protein, Acetone phải đƣợc làm lạnh trƣớc khi tiến hành tủa. Thể tích dịch chiết protein và thể tích dung dịch Acetone tƣơng ứng với các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh ở 40C trong 30 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong thời gian là 5 phút. Thu tủa rồi đem đi xác định hoạt tính và hàm lƣợng. Chọn tỷ lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất. 29
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Dịch chiết protein 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 3 Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng Chọn lấy tỷ lệ tốt nhất Sau khi khảo sát các tác nhân tủa giữa dịch chiết với từng chất ta so sánh xem tỷ lệ và nồng độ nào cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất thì chọn 2.4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase Mục đích: Khảo sát nhiệt độ và pH cho hoạt tính enzyme tốt nhất. Thí nghiệm 6. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính enzyme trong dịch chiết  Vật liệu: Dịch tủa enzyme, các dụng cụ - thiết bị để chạy sắc ký. 30
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013  Cách tiến hành Dịch tủa protein pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 3 Xác định hoạt tính Chọn lấy pH tốt nhất. Sau khi khảo sát pH, ta có hoạt tính và hàm lƣợng protein ứng với từng pH. Ta chọn pH cho kết quả hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất để thu nhận dịch tủa. Thí nghiệm 7. Khảo sát ảnh hƣởng theo nhiệt độ  Chuẩn bị: Dịch tủa enzyme.  Cách tiến hành Dịch tủa enzyme 30oC 40oC 50oC 60oC 70oC 3 Xác định hoạt tính Chọn lấy nhiệt độ tốt nhất. 31
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Sau khi khảo sát nhiệt độ, ta có hoạt tính và hàm lƣợng protein ứng với từng nhiệt độ. Ta chọn nhiệt độ cho kết quả hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất. 2.4.4. Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký lọc gel - Chuẩn bị cột sắc ký: sử dụng cột sắc ký Bio – Rad. - Tốc độ dòng chảy: 1 ml/phút. - Cột 50 x 1.5 cm. - Phân đoạn: 2 ml. - Thể tích: 2 ml.  Cách tiến hành Bƣớc 1: Chuẩn bị gel Cho 10 g bột gel Biogel P – 100 từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0.1 N, pH 7 đựng trong cốc, không khuấy, để yên trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng cho quá trình trƣơng nở xảy ra hoàn toàn tạo thể huyền phù đồng nhất của các hạt, sau khi quá trình trƣơng nở xảy ra hoàn toàn gạn lớp nổi trên bề mặt bỏ đi, đổ thêm đệm cho ngập phần gel và đuổi bọt khí bằng máy đuổi khí. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel. Bƣớc 2: Nhồi cột Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều, vừa rót vừa khuấy nhẹ để gel hấp phụ lắng từ từ theo trọng trƣờng. Tránh không cho tạo thành bọt khí, phải rót liên tục. Dịch đệm thừa cho chảy qua van dƣới cột. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột đƣợc nạp đầy gel. Khi cột đã đƣợc nạp đầy gel, đặt một đĩa giấy lọc hoặc ít bông thủy tinh lên trên bề mặt nền cột để bảo vệ mặt cột khi cho mẫu vào hoặc khi thay đổi dịch rửa trôi, khóa đầu ra của cột và gắn adaptor vào. 32
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Cho chạy máy sắc ký để ổn định cột bằng đệm phosphate pH 7 với lƣợng đệm chạy bằng 2 – 3 lần thể tích cột. Sau khi cột đã ổn định đóng đầu ra của cột và điều chỉnh adaptor xuống sát lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền gel qua adaptor. Bƣớc 3: Nạp mẫu vào cột Chuẩn bị mẫu: Mẫu chạy bằng sắc ký phải sạch, hòa tan mẫu trong NaOH 0.1 N. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0.45 micrometre) để làm gia tăng độ bền và thời gian sử dụng cột. Dùng xi lanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký. Bƣớc 4: Thêm dung dịch đệm rửa Sau khi mẫu thấm hết vào cột, bổ sung ngay vài ml dung dịch đệm rửa, để cho mẫu còn đọng lại thấm hết vào nền cột. Mẫu và dung dịch đệm di chuyển qua cột. Các phân tử di chuyển vào và ra ngoài lỗ hạt gel. Sau đó nối cột với bình chứa dịch cột thổi. Bƣớc 5: Thổi cột Dịch thổi cột đƣợc giữ ổn định ở tốc độ thích hợp. Điều này rất quan trọng vì tốc độ cột thổi cao cho kết quả tách mẫu thấp, ngƣợc lại nếu tốc độ thổi cột thấp kéo dài thời gian tách mẫu, các peak bị loãng ra cho kết quả thấp. Thổi cột liên tục bằng dung dịch đệm phosphate. Bƣớc 6: Thu mẫu và xác định mẫu tách đƣợc Dịch ra khỏi cột đƣợc đo hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm bằng detector trong hệ thống sắc ký và đƣợc thể hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP – Data View trên máy tính. Dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu mẫu (collector). Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các peak sẽ đƣợc phân tích hàm lƣợng protein sau sắc ký theo phƣơng pháp Bradford. + Hiệu suất tinh sạch protein Xác định hiệu suất quá trình tinh sạch bằng hệ thống sắc ký lọc gel ượ Hiệu suất tinh sạch = x 100%. ượ ư + Hiệu suất về hoạt tính enzyme: 33
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Hiệu suất về hoạt tính enzyme = ư + Hoạt tính riêng của enzyme: HTR của enzyme = + Độ tinh sạch enzyme Độ tinh sạch enzyme = ư 2.5. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu và xử lí kết quả 2.5.1. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu 2.5.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm Trong đó: - A: cơ chất nuôi cấy (g) - B: độ ẩm muốn bổ sung vào môi trƣờng (%) - C: độ ẩm trong cơ chất A (%) - 100: độ ẩm 100% - F: lƣợng nƣớc cần bổ sung vào môi trƣờng để đạt độ ẩm thích hợp (ml) 2.5.1.2. Phương pháp Bradford xác định hàm lượng protein  Nguyên tắc Phƣơng pháp này dựa trên những bƣớc sóng hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595nm. Độ hấp thu trực tiếp có liên hệ trực tiếp với nồng độ protein.  Chuẩn bị hóa chất - Thuốc thử Bradford 34
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 - Albumin: cân chính xác 10mg albumin, thêm 50 – 60 ml nƣớc cất khuấy tan albumin  cho vào bình định mức 100ml, dẫn nƣớc cho đến vạch  dung dịch albumin chuẩn có nồng độ 0,1 mg/ml  Cách tiến hành Chuẩn bị 10 ống nghiệm đánh số 0  9, tiến hành thí nghiệm theo bảng sau: Ống số 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nồng độ albumin 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (µg/ml) Albumin 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 (0,1mg/ml) Nƣớc cất 10 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Thuốc thử Bradford 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 (ml) Bảng 3.1. Bảng số liệu dựng đƣờng chuẩn Bradford  Tính toán kết quả Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn và mật độ quang của mẫu khảo sát ta suy ra đƣợc nồng độ protein của mẫu là X (µg/ml) có trong mg nguyên liệu. Vậy hàm lƣợng protein có trong 1g nguyên liệu là: HL (mg/ml) Trong đó: - X (µg/ml): nồng độ protein trong mẫu khảo sát dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn - n: hệ số pha loãng mẫu từ 1g chế phẩm protein thô ban đầu 2.5.1.3. Xây dựng đường chuẩn xylose 35
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013  Chuẩn bị dung dịch xylose nồng độ 10mM: hòa tan 150mg xylose trong đệm Na-citrate 0,05M pH 5,3 chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm đến vạch. Dung dịch này tiếp tục đƣợc pha loãng với dung dịch đệm Na-citrate 0,05M pH 5,3 theo bảng sau: Độ pha loãng Xylose (µMol/ml) BXU 1:1 (0,15g/100ml) 10,0 33,3 1:2 (25ml/50ml) 5,0 16,7 1:3 (16ml/50ml) 3,2 10,7 1:5 (10ml/50ml) 2 6,7 Bảng 3.2. Tỷ lệ pha loãng dung dịch Xylose chuẩn + Hút vào mỗi ống nghiệm 1,8 ml dung dịch xylan 1% + Thêm 3 ml dung dịch DNS và 200 µl dung dịch xylose chuẩn. + Chuẩn bị ống đối chứng với 200 µl dung dịch đệm Na-citrate 0,05M pH 3,5 thay cho dung dịch xylose chuẩn. + Đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 540 nm trên máy quang phổ.  Tiến hành phản ứng + Hút 1,8 ml dung dịch cơ chất cho vào 3 ống nghiệm có dung tích 25ml (hai ống nghiệm cho mỗi lần xác định) và một ống đối chứng. + Đặt vào bể ổn định nhiệt có nhiệt độ 50º trong 5phút. + Tại thời điểm 0, bắt đầu tính giờ, thêm 200µl dung dịch enzyme đã pha loãng vào ống nghiệm thứ nhất, và trộn bằng máy vortex, tiếp tục thêm enzyme vào khoảng trên mỗi ống nghiệm ngoài trừ ống đối chứng. + Sau 5 phút phản ứng, thêm 3 ml dung dịch DNS vào mỗi ống và lắc đều. + Thêm 3 ml thuốc thử DNS, sau đó thêm 200µl dung dịch enzyme vào ống đối chứng. + Đun sôi cách thủy các ống nghiệm trong thời gian 5 phút, sau đó làm mát trong nƣớc lạnh cho đến nhiệt độ phòng. + Đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 540 nm và tính theo đƣờng chuẩn xylose trên máy quang phổ. 36
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013  Tính toán kết quả Một đơn vị hoạt tính xylanase (BXU) là lƣợng enzyme thủy phân xylan sinh ra lƣợng đƣờng khử tƣơng ứng với 1 nmol xylose trong 1 giây ở các điều kiện phản ứng. Một đơn vị hoạt tính xylanase (UI) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme thủy phân xylan sinh ra đƣờng khử tƣơng ứng với 1µmol xylose trong 1 phút ở các điều kiện phản ứng. Nhƣ vậy 1 UI = BXU ; 1UI = 1 µmol xylose/ml/phút HT (UI) = Trong đó: - X: số µmol xylose suy ra từ đƣờng chuẩn - K: hệ số pha loãng - v: thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme - t: thời gian phản ứng 2.5.2. Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel. 37
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Quan sát hình thái Trichoderma spp. trên môi trƣờng PGA 3.1.1. Quan sát đại thể Mặt dư i khẩn lạc Mặt trên khuẩn lạc Bào tử Hình 3.1. Hình thái đại thể của Trichoderma spp. Hình thái đại thể sau khi quan sát ở thời gian 24h thì tơ có dạng bông, khi còn non khuẩn lạc có màu trắng, khi già thì khuẩn lạc có màu xanh lục, đây là màu 38
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 của bào tử đính. Trichoderma spp. này không tiết sắc tố màu vàng ra môi trƣờng thạch. 3.1.2. Quan sát vi thể Sau khi nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 24h thì khuẩn ty có vách ngăn, cuống sinh bào tử có dạng phân nhánh giống nhƣ cành cây. Hình 3.2. Hình thái vi thể của Trichoderma spp. nuôi ủ ở 24h Sau khi nuôi ủ trong thời gian là 36h thì khuẩn lạc lên tơ già, mỗi nhánh mang nhiều tế bào sinh ra bào tử đính, mang bào tử đính riêng rẽ, bào tử đính dính nhau thành cụm. Hình 3.3. Hình thái vi thể c ủa Trichoderma spp. nuôi ủ ở 36h Sau 48h nuôi cấy, bào tử phát triển mạnh, đính dính nhau thành nút thắt bào tử. Hình 3.4. Hình thái vi thể của Trichoderma spp. nuôi ủ ở 48h 39
  55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 3.2. Định tính enzyme xylanase của Trichoderma spp. 16h 32h 11mm 31mm 40h 48h 34mm 49mm 56h 64h 58mm 59mm Hình 3.5. Kết quả vành phân giải xylanase của Trichoderma spp. 40
  56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Khi nuôi ủ ở thời gian 8h thì vi sinh vật chƣa phát triển nên chƣa thấy đƣợc vòng phân giải enzyme. Bắt đầu từ 16h đến 40h nấm mốc phát triển enzyme xylanase thủy phân cơ chất xylan tạo vòng phân giải lớn dần (11mm đến 34mm). Thời điểm từ 48h đến 56h tơ non phát triển mạnh và đạt kích thƣớc 49mm. Thời gian sau nuôi ủ 56h và 64h là giai đoạn nấm mốc phát triển tiếp tục bắt đầu sinh bào tử. Nhƣng ở thời gian nuôi cấy 56h và 64h thì nấm mốc sinh bào tử cho nên sinh ra enzyme xylanase không tốt bằng thời gian 48h nấm mốc phát triển tơ non. 3.3. Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp. Nhằm xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật có trong giống mốc Trichoderma spp. sau khi nuôi cấy ở thời gian là 48h, ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Kết quả số tế bào đếm đƣợc trong 1g mốc giống ở nồng độ pha loãng 10-4 là 4.48×1011. Sau đó ta tiến hành cấy vào môi trƣờng lên men bán rắn. 3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase của Trichoderma spp. Thí nghiệm 1: Kết quả khảo sát tỷ lệ cơ chất đến sinh tổng hợp xylanase Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein và xác định hoạt tính xylanase. Ta có kết quả ở bảng 3.1 nhƣ sau: 41
  57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Bảng 3.1. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của Trichoderma spp. với tỷ lệ cơ chất khác nhau Thời gian HL HT Nồng độ Tỷ lệ nuôi cấy protein xylanase Độ ẩm dinh CM:BM (h) (mg/g) (IU/g) dƣỡng 6:4 21,87 78,96 7:3 25,33 94,16 5:5 50 x1 48 26,40 100,70 3:7 26,77 101,34 4:6 35,47 139,48 40 160 35 140 30 120 25 100 Hàm lượng protein (mg/g) 20 80 Hoạt tính Xylanase 15 60 (IU/g) 10 40 Hàm Hàm lƣợng protein(mg/g) 5 20 Hoạt tính Xylanase (IU/g) 0 0 6:4 7:3 5:5 3:7 4:6 Tỷ lệ cơ chất Đồ thị 3.1. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. với tỷ lệ cơ chất khác nhau Kết quả đồ thị cho thấy hoạt tính xylanase ở tỷ lệ 6:4 là 78,96 UI/g tăng dần lên và đạt cao nhất ở môi trƣờng có tỷ lệ 4:6 là 139,48 UI/g. Hàm lƣợng protein ở môi trƣờng 4:6 cao nhất là 35,47mg, và giảm dần xuống thấp nhất ở 6:4 là 21,87 mg. 42
  58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Kết quả này giải thích nhƣ sau: bã mía có khả năng giữ nƣớc cao và có cấu trúc phức tạp hơn cám mì, khi pha chế môi trƣờng có tỷ lệ cám mì – bã mía khác nhau cùng với một lƣợng nƣớc, thì môi trƣờng có tỷ lệ cám mì – bã mía là 6:4 có độ ẩm và lƣợng bã mía thấp hơn các môi trƣờng khác. Còn môi trƣờng có tỷ lệ cám mì – bã mía là 4:6 có độ ẩm và hàm lƣợng bã mía cao hơn nên có độ xốp và độ thoáng khí cũng cao hơn, thích hợp hơn cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp xylanase của Trichoderma. Nhƣng khi ở tỷ lệ 6:4 thì hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein giảm xuống còn 78,96 UI/g và 21,87 mg do hàm lƣợng bã mía ít không tạo đƣợc độ thông thoáng cho nấm mốc phát triển. Dựa vào kết quả trên cho thấy môi trƣờng có tỷ lệ 4:6 là tốt nhất nhƣng còn phụ thuộc vào các yếu tố khác nhƣ độ ẩm, pH nên cần phải tiếp tục khảo sát. Chúng tôi chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía là môi trƣờng nuôi cấy cho các thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 2. Kết quả khảo sát độ ẩm môi trƣờng đến sinh tổng hợp xylanase Độ ẩm vừa ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng vừa ảnh hƣởng đến sự trao đổi chất của vi sinh vật trong quá trình lên men bán rắn. Trong thí nghiệm này chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía để khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm. Thêm nƣớc cất vào môi trƣờng bán rắn điều chỉnh độ ẩm 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. Sau đó cấy dịch huyền phù từ môi trƣờng nhân giống cấp 1 (môi trƣờng lúa). Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein và xác định hoạt tính xylanase. Ta có kết quả ở bảng 3.2 nhƣ sau: 43
  59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Bảng 3.2. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của Trichoderma spp. có độ ẩm môi trƣờng khác nhau Thời gian HL protein HT xylanase Tỷ lệ nuôi cấy Độ ẩm pH (mg/g) (IU/g) CM:BM (h) 45% 32,53 93,10 50% 34,13 99,22 55% 39,73 149,68 4:6 5 48 60% 38,67 119,07 65% 36,27 114,21 70% 34,40 108,09 45 160 40 140 35 120 30 100 Hàm lượng protein 25 (mg/g) 80 20 Hoạt tính Xylanase 60 (IU/g) 15 10 40 5 20 Hoạt tính Xylanase (IU/g) Hàm lƣợng protein(mg/g) 0 0 45% 50% 55% 60% 65% 70% Độ ẩm Đồ thị 3.2. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có độ ẩm khác nhau Trong thí nghiệm này ta chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía để khảo sát độ ẩm. Theo kết quả ở bảng 3.2 và đồ thị 3.2. Cho ta thấy hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein tăng dần từ môi trƣờng có độ ẩm từ 45 – 55% và đạt cao nhất tại độ ẩm 55% là 149,68 UI/g và 39,73 mg, sau đó giảm xuống khi độ ẩm đạt 60%. 44
  60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Điều này có thể do tăng độ ẩm thích hợp có tác dụng làm phồng cơ chất, tăng độ xốp tạo điều kiện cho Trichoderma tiếp xúc với cơ chất dễ dàng hơn. Còn ở môi trƣờng có độ ẩm càng thấp thì hoạt lực xylan và hàm lƣợng protein cũng thấp do cơ chất bị khô làm bất lợi cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp xylanase của Trichoderma spp. Đối với môi trƣờng có độ ẩm cao hơn 55% thì hoạt lực xylan và hàm lƣợng protein cũng giảm. Có thể do môi trƣờng này quá ẩm, độ xốp giảm cản trở sự khuếch tán oxy từ bên ngoài vào môi trƣờng. Thí nghiệm 3. Kết quả khảo sát pH môi trƣờng đến sinh tổng hợp xylanase Bảng 3.3. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có pH khác nhau Thời gian Nồng độ HL protein HT xylanase Tỷ lệ nuôi cấy pH Độ ẩm dinh (mg/g) (IU/g) CM:BM (h) dƣỡng 4.5 29,33 110,20 5 32,80 135,75 5.5 4:6 55% x1 48 41,60 150,74 6 37,07 141,45 6.5 36,27 136,38 45
  61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 45 160 40 140 35 120 30 100 Hàm lượng protein 25 (mg/g) 80 20 Hoạt tính Xylanase 60 (IU/g) 15 10 40 Hàm Hàm lƣợng protein(mg/g) 5 20 Hoạt tính Xylanase (IU/g) 0 0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 pH Đồ thị 3.3. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có pH khác nhau Theo kết quả bảng 3.3 và đồ thị 3.3 ta thấy hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein ở môi trƣờng pH 4.5 là thấp nhất (110,20 UI/g và 29,33 mg/g), tăng dần pH lên đến 5.5 hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein đạt cao nhất là 150,74 UI/g và 41,60 mg/g, ở pH 6.0 và 6.5 thì hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein giảm dần. Hiện tƣợng này có thể do môi trƣờng quá kiềm hoặc quá acid, do đó ảnh hƣởng đến sự ion hóa của cơ chất, độ bền bên trong cơ chất làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme của Trichoderma hoạt động trong môi trƣờng pH thích hợp thì hoạt tính enzyme cũng tăng theo thời gian nuôi cấy. Thí nghiệm 4. Kết quả khảo sát nồng độ dinh duỡng đến sinh tổng hợp xylanase Cơ chất mà tất cả chất dinh dƣỡng cho vi sinh vật là cơ chất lý tƣởng. Tuy nhiên, nhiều cơ chất nghèo dinh dƣỡng, vì vậy cần phải bổ sung thêm các chất dinh dƣỡng từ bên ngoài khi pha chế môi trƣờng có nồng độ dinh dƣỡng x1, x2, .,x5, chỉnh độ ẩm đến 55% và pH 5,5 với tỷ lệ cám mì – bã mía là 4:6. Sau khi nuôi cấy 48h, xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme xylanase. 46
  62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Bảng 3.4. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau Thời gian Nồng độ HL protein HT xylanase Tỷ lệ nuôi cấy dinh pH Độ ẩm (mg/g) (IU/g) CM:BM (h) dƣỡng x1 32,53 120,34 x2 34,40 128,57 x3 4:6 5.5 55% 48 35,47 135,75 x4 42,40 170,80 x5 39,47 149,47 45 180 40 160 35 140 30 120 Hàm lượng protein 25 100 (mg/g) 20 80 Hoạt tính Xylanase 15 60 (IU/g) 10 40 Hàm Hàm lƣợng protein(mg/g) 5 20 Hoạt tính Xylanase (IU/g) 0 0 x1 x2 x3 x4 x5 Nồng độ dinh dƣỡng Đồ thị 3.4. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme xylanase và hàm lƣợng protein tăng dần lên từ môi trƣờng có nồng độ dinh dƣỡng x1 đến x3, Ở nồng độ dinh dƣỡng x4 (170,80 IU/g và 42,40 mg) là cao nhất, sau đó giảm dần xuống môi trƣờng có nồng độ dinh dƣỡng x5 hoạt tính enzyme xylanase và hàm lƣợng protein là 149,47 UI/g và 39,47 mg/g. 47
  63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Thí nghiệm 5. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp xylanase Bảng 3.5. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có thời gian nuôi cấy khác nhau Thời gian HL protein HT xylanase Tỷ lệ Nồng độ nuôi cấy pH Độ ẩm (mg/g) (IU/g) CM:BM dinh dƣỡng (h) 8h 30,93 156,65 16h 32,80 162,77 24h 34,13 170,54 32h 36,27 177,76 40h 36,80 180,51 4:6 5.5 55% x4 48h 44,93 199,72 56h 43,73 190,64 64h 42,13 185,58 72h 41,6 169,32 80h 39,73 160,87 48
  64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 50 250 45 40 200 35 30 150 Hàm lượng protein (mg/g) 25 Hoạt tính Xylanase 20 100 (IU/g) 15 Hoạt tính Xylanase (IU/g) Hàm lƣợng protein(mg/g) 10 50 5 0 0 8h 16h 24h 32h 40h 48h 56h 64h 72h 80h Thời gian nuôi cấy Đồ thị 3.5. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có thời gian nuôi cấy khác nhau Theo kết quả bảng 3.5 và đồ thị 3.5 ta thấy hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein tăng rõ rệt từ 8 – 48h, đạt giá trị cao nhất tại 48h, sau đó bắt đầu giảm dần xuống. Điều này có thể giải thích, sau 48h nuôi cấy Trichoderma spp. thì chúng phát triển mạnh và cơ chất bị thủy phân gần hết sau 48h nên hoạt tính và hàm lƣợng bắt đầu giảm xuống. 49
  65. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Thí nghiệm 6. Kết quả khảo sát tỷ lệ giống đến sinh tổng hợp xylanase Bảng 3.6. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có tỷ lệ giống khác nhau Tỷ lệ Nồng độ Thời HL HT giống Tỷ lệ Độ ẩm pH dinh gian nuôi protein xylanase (bào CM:BM dƣỡng cấy (h) (mg/g) (UI/g) tử/g) 1.12x1011 42,40 135,97 2.24x1011 44,27 152,43 3.36x1011 4:6 5.5 55% x4 64 45,33 165,52 4.48x1011 49,87 212,39 5.60x1011 46,40 173,54 52 250 50 200 48 150 Hàm lượng protein 46 (mg/g) 44 Hoạt tính Xylanase 100 (IU/g) 42 50 40 Hàm Hàm lƣợng protein(mg/g) Hoạt tính Xylanase (IU/g) 38 0 Tỷ lệ giống Đồ thị 3.6. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có tỷ lệ giống khác nhau Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme và hàm lƣợng protein đạt cao nhất tại 4.48x1011 (212,39 UI/g và 49,87 mg/g). Kết quả mật độ bào tử phải là 4.48x1011 để đảm bảo các tiểu phần cơ chất đƣợc bảo phủ bởi hệ sợi nấm nhằm hạn chế sự tạp 50
  66. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 nhiễm. Nếu tỷ lệ giống quá cao dẫn đến sự cạnh tranh về dinh dƣỡng, oxy diễn ra mạnh nên cơ chất bị phân hủy hết làm cho hoạt tính enzyme bị giảm xuống. Từ các nghiệm thức khảo sát sinh tổng hợp enzyme chúng tôi chọn kết quả tốt nhất để bố trí nghiệm tinh sạch protein enzyme. 3.5. Kết quả bố trí thí nghiệm 3.5.1. Khảo sát dung môi và tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase Thí nghiệm 1. Khảo sát ảnh hƣởng của các dung môi dung môi để tách chiết enzyme xylanase theo tỷ lệ 1:4 ta có kết quả sau Bảng 3.7. Kết quả khảo sát các dung môi để tách chiết enzyme xylanase HL Protein HT enzyme HTR Dung môi (mg/g) (UI/g) (UI/mg) H2O 58,8 176,77 3,068 Acetate 57,6 160,16 2,780 Citrate 65,8 173,58 2,638 NaCl 50,03 151,43 3,029 80 180 70 175 60 170 165 50 Hàm lượng protein 160 (mg/g) 40 155 Hoạt tính xylanase 30 150 (UI/g) 20 145 10 140 Hoạt tính xylanase(UI/g) Hàm Hàm lƣợng protein(mg/g) 0 135 NaCl H2O CitrateAcetate Dung môi Đồ thị 3.7. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của các dung môi tách chiết enzyme xylanase 51
  67. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Chúng tôi nhận thấy trong quá trình tách chiết enzyme bằng các dung môi cùng một tỉ lệ là 1:4 thì nƣớc cất thu đƣợc hoạt tính riêng cao nhất 3,006 (UI/mg). Điều này đúng với lý thuyết, khi tách chiết enzyme bằng nƣớc thu đƣợc hàm lƣợng protein enzyme chiếm vào khoảng 90% trở lên. Vậy dựa vào bảng kết quả chúng tôi tiến hành tách chiết ezyme bằng nƣớc cất cho các thí nghiệm sau. Thí nghiệm 2. Khảo sát tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase Bảng 3.8. Kết quả tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase HL protein HT enzyme HTR Tỷ lệ (mg/g) (UI/g) (UI/mg) 1:3 46,29 105,88 2,287 1:4 47,06 138,01 2,932 1:5 56,16 176,77 4,602 1:6 43,8 125,07 2,855 1:7 43,63 134,92 3,092 1:8 38,41 152,28 2,711 1:9 51,31 157,42 3,068 1:10 52,0 133,38 2,565 60 200 180 50 160 140 40 Hàm lượng protein 120 (mg/g) 30 100 Hoạt tính Xylanase 80 (IU/g) 20 60 40 10 Hoạt tính xylanase (IU/g) Hàm Hàm lƣợng protein(mg/g) 20 0 0 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:091:10 Tỷ lệ dung môi Đồ thị 3.8. Biểu diễn tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase 52
  68. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Sau khi khảo sát quá trình tách chiết enzyme bằng nƣớc cất qua các tỷ lệ chúng tôi thấy hoạt tính riêng cao nhất là 4,602 (UI/mg) tƣơng ứng với tỉ lệ 1:5. Quá trình chiết là quá trình khuếch tán chất tan (enzyme) trong canh trƣờng vào nƣớc. Quá trình khuếch tán tuân theo định luật Flick: “Lƣợng chất khuếch tán tỉ lệ thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất tan với gradient nồng độ và thời gian khuếch tán”. Khi tỉ lệ canh trƣờng : nƣớc cất tăng, diện tích bề mặt tiếp xúc giữa nƣớc và canh trƣờng tăng. Lƣợng nƣớc cất làm chênh lệch nồng độ chất tan giữa bề mặt tiếp xúc với các lớp nƣớc bên ngoài. Cả hai yếu tố trên làm cho lƣợng chất tan chiết đƣợc tăng khi tỷ lệ nƣớc cất tăng. Tuy nhiên, khi lƣợng nƣớc cất đạt đến một giới hạn nào đó thì nồng độ enzyme trong dịch chiết giảm nhanh, dẫn đến hoạt tính của enzyme cũng giảm nhanh. Qua kết quả trên chúng tôi quyết định chọn chiết enzyme bằng nƣớc cất với tỉ lệ 1:5. 3.5.2. Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme xylanase từ dịch chiết bằng phương pháp kết tủa Thí nghiệm 3. Tủa cồn 96o Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzyme xylanase HL Protein HT enzyme HTR DC : Cồn (mg) (UI/g) (UI/mg) 1:1 40,33 189,4 4,69 1:2 42,33 166,6 3,94 1:3 44,66 178 3,99 1:4 44,50 197 4,43 1:5 52,50 317,4 6,05 1:6 52 313,6 6,03 53
  69. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 60 350 300 50 250 40 Hàm lượng protein 200 (mg/g) 30 150 Hoạt tính Xylanase (IU/g) 20 100 10 50 Hàm Hàm lƣợng protein(mg/g) Hoạttính xylanase (IU/g) 0 0 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Tỷ lệ dịch E/Cồn Đồ thị 3.9. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme xylanase từ các phân đoạn tủa bằng cồn Từ kết quả bảng 3.9 ta rút ra kết luận rằng tủa enzyme bằng cồn ở tỷ lệ 1:5 ta sẽ thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao nhất 6,05 (UI/mg) nên chúng tôi chọn tủa trong dung môi cồn ở tỉ lệ 1:5. Khi thể tích dung môi tăng dần thì hoạt tính enzyme càng tăng, vì khi số phân tử dung môi trong hỗn hợp tăng chúng sẽ tách triệt để hơn lớp phân tử nƣớc bao xung quanh lớp phân tử protein, làm giảm tính tan của protein và làm tăng khả năng kết tủa của chúng. Nếu ta tiếp tục tăng thể tích dung môi thì hằng số điện môi giảm, các phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành không hoạt động, do đó hoạt tính enzyme cũng giảm. Ngoài ra, càng về sau, khi enzyme bị tủa hết, nếu tiếp tục tăng lƣợng dung môi thì sẽ có nhiều protein tạp khác bị tủa. 54
  70. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Thí nghiệm 4: Acetone Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tỷ lệ acetone dùng để tủa enzyme xylanase DC : HL Protein HT enzyme HTR Acetone (mg/g) (UI/g) (UI/mg) 1:1 56,66 310 5,47 1:2 58,03 361,1 6,22 1:3 60,03 380,13 6,33 1:4 66,08 427,6 6,47 1:5 63,66 399,1 6,27 1:6 57,63 300,51 5,21 70 450 400 60 350 50 300 Hàm lượng protein 40 250 (mg/g) 30 200 Hoạt tính Xylanase (IU/g) 150 20 100 10 50 Hoạt tính xylanase (IU/g) Hàm Hàm lƣợng protein(mg/g) 0 0 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Tỷ lệ dịch E/Acetone Đồ thị 3.10. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme xylanase từ các phân đoạn tủa bằng acetone Từ kết quả bảng 3.10 ta rút ra kết luận rằng tủa enzyme bằng acetone ở tỷ lệ 1:4 ta sẽ thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao nhất 6,47 (UI/g) nên chúng tôi chọn tủa trong dung môi muối ở tỷ lệ 1:4. 55
  71. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Thí nghiệm 5. Muối Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tỷ lệ muối (NH4)2SO4 dùng để tủa enzyme xylanase Nồng độ HL Protein HT enzyme HTR muối (%) (mg/g) (UI/g) (UI/mg) 50 57,60 281,5 4,88 55 61,72 289 4,68 60 63,67 348,5 5,47 65 67,44 513,8 7,618 70 58,26 317,4 5,45 70 600 68 500 66 64 400 Hàm lượng protein 62 (mg/g) 300 60 Hoạt tính Xylanase 58 200 (IU/g) 56 100 Hoạt tính xylanase (IU/g) Hàm Hàm lƣợng protein(mg/g) 54 52 0 50 55 60 65 70 Nồng độ muối Đồ thị 3.11. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme xylanase từ các phân đoạn tủa bằng muối Từ kết quả bảng 3.11 ta rút ra kết luận rằng nếu có tủa enzyme bằng muối ở nồng độ 65o ta sẽ thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao nhất 7,618 (UI/mg) nên chúng tôi chọn tủa trong dung dịch muối ở nồng độ 65o. 56
  72. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Bảng 3.12. So sánh kết quả tủa enzyme xylanase Tác nhân HT enzyme HL protein cao HLR cao nhất tủa cao nhất (UI/g) nhất (mg) (UI/mg) Cồn 317,4 52,50 6,05 Acetone 427,6 66,08 6,47 Muối 513,8 67,44 7,618 8 7 6 5 4 3 HT enzyme 2 Hoạt tính enzyme Hoạt tính enzyme (UI/g) 1 0 Cồn Acetone Muối Tác nhân tủa Đồ thị 3.12. Kết quả tủa enzyme xylanase từ các tác nhân tủa Sau khi tiến hành tủa enzyme với 3 dung môi khác nhau cho đƣợc kết quả sử dụng dung dịch muối (NH4)2SO4 bão hòa thu đƣợc enzyme có hoạt tính cao nhất nên chúng tôi quyết định chọn muối là tác nhân tủa cho các thí nghiệm tiếp theo. 57
  73. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 3.5.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme xylanase Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến chế phẩm enzyme xylanase Bảng 3.13. Kết quả ảnh hƣởng của pH đến chế phẩm enzyme xylanase Hoạt tính enzyme pH (UI/g) 3 208,13 4 308,03 5 238,09 6 117,54 7 134,87 350 300 250 200 150 HT enzyme 100 Hoạt tính enzyme Hoạt tính enzyme (UI/g) 50 0 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH Đồ thị 3.13. Biểu diễn hoạt tính xylanase theo pH của chế phẩm enzyme xylanase Enzyme rất nhạy với pH của môi trƣờng. pH của môi trƣờng thƣờng ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa cơ chất enzyme và đặc biệt ảnh hƣởng đến độ bền enzyme. Chính vì thế, pH có ảnh hƣởng rất mạnh đến phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định, qua thí nghiệm chúng tôi nhận thấy 58
  74. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 rằng hoạt tính của enzyme xylanase ở pH 3 là 208,13 UI/g, tăng dần lên và cao nhất là 308,03 UI/g khi ở pH 4. Càng tăng độ pH lên pH 5, 6, 7 thì hàm lƣợng enzyme càng giảm dần xuống còn 117,54 UI/g. Từ bảng 3.13 và đồ thị 3.12 chúng tôi kết luận pH tối ƣu cho hoạt động của chế phẩm enzyme là 4. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến chế phẩm enzyme xylanase Bảng 3.14. Kết quả ảnh hƣởng của nhiệt độ đến chế phẩm enzyme xylanase Hoạt tính enzyme Nhiệt độ (UI/g) 30 158,18 40 377,4 50 421,3 60 407,93 70 374,63 450 400 350 300 250 200 HT enzyme 150 100 Hoạt tính enzyme Hoạt tính enzyme (UI/g) 50 0 30o 40o 50o 60o 70o Nhiệt độ Đồ thị 3.14. Biểu diễn hoạt tính xylanase theo nhiệt độ của chế phẩm enzyme xylanase 59
  75. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Nhiệt độ là một yếu tố vật lý có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng enzyme, chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất, nâng cao ái lực giữa enzyme và cơ chất. Nhiệt độ enzyme không cố định mà có thể thay đổi tùy theo cơ chất, tốc độ phản ứng không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Thông thƣờng khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng tăng nhƣng với một ngƣỡng tới hạn, vƣợt quá ngƣỡng đó tốc độ phản ứng của enzyme sẽ giảm. Từ các kết quả trên cho thấy rằng ở nhiệt độ 30oC hoạt tính enzyme thấp (158,18 UI/g) khi tăng nhiệt độ lên 50oC thì hoạt tính enzyme tăng cao nhất (421,3 UI/g) và khi càng tăng nhiệt độ lên 60oC và 70oC thì hoạt tính enzyme có xu hƣớng giảm từ từ còn 407,93 và 374,63. Từ kết quả trên chúng tôi kết luận nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của chế phẩm là 50oC. 3.6. Tinh sạch enzyme xyalanse bằng phƣơng pháp chạy sắc ký lọc gel Sau khi tiến hành chiết xuất enzyme bằng các dung môi nhƣ nƣớc cất, đệm acetate pH5, NaCl và tủa enzyme bằng các tác nhân nhƣ cồn, muối, acetone, ta thu đƣợc kết quả là chiết xuất enzyme bằng nƣớc cất và tủa enzyme bằng muối sẽ cho hoạt tính enzyme cao nhất nên ta chọn các tác nhân đó để thu enzyme và tủa ở tỷ lệ độ hòa tan muối là 65%. Quá trình tinh sạch đƣợc thực hiện trên gel Biogel P-100 của hàng Bio – Rad, Mỹ. Sau khi ly trích enzyme bằng muối (NH4)2SO4 ta thu đƣợc dịch chiết enzyme, tiến hành chạy sắc ký để tinh sạch sản phẩm. Trƣớc khi chạy sắc ký ta tiến hành loại muối bằng màng thẩm tích. Màng này chỉ cho muối (NH4)2SO4 đi qua còn protein đƣợc giữ lại, ta thu mẫu và tiến hành chạy sắc ký. Sau khi chạy sắc ký ta thu đƣợc 2 peak. Sau đó tiến hành xác định hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein của 2 peak. 60
  76. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 -0.1 Đồ thị 3.15. Sắc ký đồ trên excel khi chạy sắc ký enzyme xylanase Bảng 3.15. Hiệu suất tinh sạch Nghiệm Σ HT Σ HL Hoạt tính Độ tinh Hiệu thức riêng sạch (lần) suất (%) Trƣớc sắc 544,0 340 1,6 1 100 ký Sau sắc ký 371,5 13,9 26,7 16,7 68,3 Ta thấy rằng enzyme sau tinh sạch có hoạt tính và hàm lƣợng protein thấp hơn so với tổng hoạt tính enzyme và hàm lƣợng protein trƣớc tinh sạch. Điều này xảy ra là do các thao tác, tủa, ly tâm trong quá trình tinh sạch đó làm thất thoát enzyme. Tuy nhiên hoạt tính riêng lại cao hơn nhiêu lần, hiệu suất tinh sạch khá cao. 61
  77. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Giá trị Hàm lƣợng Hoạt tính xylanase Các yếu tố tối ƣu Protein (mg/g) (UI/g) Tỉ lệ CM:BM 4:6 35,47 139,48 Độ ẩm (%) 55% 39,73 149,68 pH 5.5 41,60 150,74 Nổng độ dinh dƣỡng x4 42,40 170,80 Thời gian nuôi cấy 48h 46,93 199,72 Tỷ lệ giống 4.48x1011 49,87 212,39 Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ sử dụng các dung môi để tách chiết enzyme xylanase cho chúng tôi kết quả là khi sử dụng nƣớc cất để tách chiết enzyme thì sẽ cho hoạt tính enzyme (176,77 UI/g) và hàm lƣợng protein (68,8 mg/g) với tỷ lệ tách 1:5 là cao nhất. Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme xylanase từ dịch chiết thô bằng phƣơng pháp tủa cho chúng tôi kết quả khi dùng tác nhân tủa là muối ammonisulfate sẽ cho hoạt tính enzyme (513,8 UI/g) và hàm lƣợng protein (67,44 mg/g) với nồng độ là 65% là cao nhất. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến chế phẩm enzyme xylanase cho chúng tôi kết quả là với pH 4 sẽ cho hoạt tính enzyme (308,03 UI/g) là cao nhất. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm enzyme xylanase cho chúng tôi kết quả là với nhiệt độ phản ứng giữa enzyme và cơ chất ứng với 50oC sẽ cho hoạt tính enzyme (421,3 UI/g) là cao nhất. Hiệu suất và độ tinh sạch của enzyme xylanase sau khi tiến hành chạy sắc ký lọc gel là: Hoạt tính riêng Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất (%) 26,7 16,7 68,3 62
  78. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 4.2. Đề nghị - Thực hiện phƣơng pháp tối ƣu hóa môi trƣờng thực nghiệm - Tiếp tục thực hiện phƣơng pháp sắc ký lọc gel với enzyme xylanase đƣợc tủa bằng cồn và acetone. - Thực hiện phƣơng pháp chạy điện di trên gel SDS để xác định trọng lƣợng phân tử của protein. 63
  79. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1]. Phạm Thị Trân Châu. PGS. TS. Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học, tập 3 Enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo dục. [2]. Nguyễn Lân Dũng và các tác giả (1979), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [3]. Nguyễn Đức Lƣợng (2000), Công nghệ vi sinh vật tập 1 – Cơ sở vi sinh vật học công nghiệp, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh. [4]. Nguyễn Thị Uyên Thảo (2007), Nghiên cứu tạo chế phẩm xylanase từ vi nấm Trichoderma, Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, trƣờng Đại Học Khoa học tự nhiên TP.HCM. [5]. Lê Ngọc Tú và cộng sự (1982), Enzyme và vi sinh vật, tập 2, Nxb Khoa Học và Kỹ thuật, Hà Nội, trang 124 – 185. [6]. Nguyễn Đức Lƣợng, Công nghệ enzyme và protein, NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM, 2004. [7]. Lê Tú Ngọc và các tác giả, Hóa sinh công nghiệp, NXB KH & KT Hà Nội. [8]. Nguyễn Thị Thu Thảo, Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ Trichoderma spp. tạo chế phẩm bóc vỏ tiêu đen sản xuất tiêu tr ng, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học. Trƣờng Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM. [9]. Trần Linh Thƣớc, Tài liệu thực tập chuyên đề cao học chuyên ngành vi sinh hóa X, XI, trƣờng Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM. Tài liệu Tiếng Anh [11]. Bastawde K. B. (1998), “Xylanase structure, microbial xylanase, and their mode of action”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 8, pp 353 – 368. [12]. Collins T, Charles Gerday., Georges Feller (2004), “Xylanase, Xylanase families and extremophilic xylanase”, Periodical 29, p3 – 23. 64
  80. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 [13]. Esposito E., Silva M. D., (1998), “Systematics and environmental application of the genus Trichoderma”. Crical reviews in Microbiology, 24 (2), pp 89 – 98. [14]. Ridder E. R., Nokes S. E., Knutson B. L., (1999), “Optimization of solid – state fermentation parametersfor the production of xylanase bt Trichoderma longibrachiatum on wheat bran in a forced aeration system”, Transactions of The ASABE. Vol. 42(6): 1785 – 1790, Published by the American Society of Agricultural and Biological Engineers, St. Joseph, Michigan. [15]. Shallom D, Shoham Y. (2003), “Microbial hemicellulase”, Current Opinion Microbiol., 6 (3), pp. 219 – 228. Tài liệu Internet [16]. [17]. www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC [18]. [19]. [20]. [21]. rShow=410 65
  81. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 PHỤ LỤC A Phụ lục A1: Đƣờng chuẩn Bardford y = 0.0034x + 0.0067 BRADFORD R² = 0.9974 0.25 0.2 0.15 OD 0.1 0.05 0 0 10 20 30 40 50 60 70 NỒNG ĐỘ Phụ lục A2: Đƣờng chuẩn xylose 1
  82. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 PHỤ LỤC B Hình B1: Nấm mốc hình thành bào tử trên môi trƣờng lúa Hình B2. Nấm mốc trên môi trƣờng cám mì : bã mía 2
  83. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Hình B3. Chế phẩm enzyme thô Hình B4. Nấm mốc trên môi trƣờng thạch nghiêng 3
  84. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 PHỤ LỤC C Hình C1. Máy khuấy Hình C2. Cân phân tích Hình C3. Kính hiển vi 4
  85. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Hình C4. Máy Vortex Hình C5. Tủ hút Hình C6. Microwave Hình C7. Máy đo quang phổ Hình C8. Tủ ủ 5
  86. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013 Hình C9. Autoclave 6