Đồ án Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus Plantarum

Nội dung text: Đồ án Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus Plantarum

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th.S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Lê Trần Hồng Xuân MSSV: 1951110191 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số liệu,kết quả trong đồán là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì nghiên cứu nào khác. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 Lê Trần Hồng Xuân
3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành được Đồ án tốt nghiệp của mình, em xin chân thành cám ơn thầy Phạm Minh Nhựt đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiến thức trong suốt quá trình thực hiện Đồ án. Em chân thành cám ơn thầy, cô phụ trách Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm – Môi Trường,Trường Đại Học Công Nghệ Tp. HCM đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành Đồ án tốt nghiệp của mình. Em xin cám ơn thầy, cô thuộc Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường,Trường Đại Học Công Nghệ Tp. HCM đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho em nhiều kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trường Tôi xin cám ơn tất cả các bạn làm việc tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ và gia đình đã luôn ở bênh cạnh, cổ vũ, động viên và giúp đỡ con mỗi khi gặp khó khăn trong suốt quá trình học tập. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 Lê Trần Hồng Xuân
4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG MỤC LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Phạm vi nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1 Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus plantarum 3 1.1.1. Đặt điểm chung của vi khuẩn L. plantarum 3 1.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của L. plantarum 5 1.1.3. Cơ sở sinh học của quá trình hình thành các hợp chất kháng khuẩn của vikhuẩn L. plantarum 6 1.2. Hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn L. plantarum và cơ chế hoạt động 7 1.2.1. Acid hữu cơ 7 Hydrogen peroxide 8 1.2.2. Carbon dioxide 8 1.2.3. Bacteriocin 9 1.3. Giới thiệu về bacteriocin 9 1.3.1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu bacteriocin 9 1.3.2. Phân loại bacteriocin 10 1.3.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin 13 1.4. Tổng quan về phương pháp vi gói 14 1.4.1. Khái niệm, đặc điểm, ưu và nhược điểm của phương pháp vi gói 14 1.4.1.1. Khái niệm vi gói 14 i
5. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.2. Đặc điểm vi gói 15 1.4.1.3. Ưu điểm của vi gói 16 1.4.1.4. Nhược điểm của phương pháp vi gói 16 1.4.2. Các phương pháp vi gói 16 1.4.2.1. Phương pháp sấy phun 17 1.4.2.2. Phương pháp nhỏ giọt 17 1.4.2.3. Phương pháp polymer hoá liên kết bề mặt 18 1.4.2.4. Phương pháp ngưng tụ polymer hoá 18 1.4.2.5. Phương pháp tách pha đông tụ 18 1.4.3. Vật liệu vi gói, đặc điểm của vật liệu vi gói 18 1.4.3.1. Gelatin 18 1.4.3.2. Alginate 21 1.4.3.3. Các hợp chất vi gói khác 23 1.5. Quorum sening và quá trình hình thành bacteriocin 25 1.5.1. Khái niệm về quorum sening 25 1.5.2. Vật chất liên lạc, dấu hiệu liên lạc và cơ chế tác động của quorum sening 26 1.5.3. Ứng dụng của hệ thống quorum sening 28 1.5.4. Vai trò của quorum sening trong quá trình hình thành bacteriocin 28 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 30 2.1.1. Thời gian nghiên cứu 30 2.2. Vật liệu nghiên cứu 30 2.2.1. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum 30 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị 30 2.2.3. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 30 2.2.3.1. Môi trường nuôi cấy và phân lập 30 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị 30 2.3. Phương pháp nghiên cứu 31 ii
6. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Phương pháp pha loãng mẫu 31 2.3.2. Phương pháp tăng sinh 31 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 32 2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 32 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu 32 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 33 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu 33 2.4. Bố trí thí nghiệm 34 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng sinhhợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum 34 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn gelatin và alginat đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum 35 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh huổng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum 36 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn chỉ thị đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum 36 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum 37 2.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản bằng lactose đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum 37 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 38 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn gelatin – alginate đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 40 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 42 3.4. Kết quả đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các mật độ vi khuẩn chỉ thị khác nhau 44 iii
7. Đồ án tốt nghiệp 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 46 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản bằng lactose 10% đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 48 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 4.1. Kết luận 51 4.2. Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 iv
8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic) MRS de Man, Rogosa, Sharpe TSA Trypicase soya Agar MRS OPTSC01 Môi trường MRS tối ưu v
9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1.Một số chủng Lactobacillus plantarum 3 Hình 1.2.Tế bào vi khuẩn L. plantarum 3 Hình 1.3.Cấu trúc cơ bản của gelatin 20 Hình 1.4.Cấu tạo hoá học của alginate 22 Hình 1.5.Cấu trúc hoá học của Kappa – carrageenan 24 Hình 1.6.Cấu trúc hoá học của Chitosan 25 Hình 1.7.Cơ chế hoạt động của quorum sening 27 Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm 34 Hình 3.1.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau 38 Hình 3.2.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 cố định ở các tỷ lệ phối trộn alginate – gelatin khác nhau 41 Hình 3.3.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị ở các tỷ lệ cấy vi khuẩn L. plantarum SC01 43 Hình 3.4.Kết quả đánh giá khả năng vi khuẩn L. plantarum SC01 khi được cố định trong hỗn hợp alginate 2,5 % - gelatin 6 % ức chế vi khuẩn chỉ thị ở các mật độ khác nhau 44 Hình 3.5.Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy L. plantarum SC01 khi được cố định trong hỗn hợp alginate 2,5 % - gelatin 6 % đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 46 Hình 3.6.Ảnh hưởng của thời gian bảo quản bằng lactose 10 % đến khả năng hình thành hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 khi được cố định trong hỗn hợp alginate 2,5 % - gelatin 6 %. 48 vi
10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Sản phẩm lên men truyền thống là một trong những sản phẩmphổ biến và lâu đời ở các dân tộc trên thế giới.Đó là một loại sản phẩm được sản xuất thủ công, mang sắc thái và bản sắc riêng của mỗi dân tộc, mỗi vùng miền.Nước ta có nguồnnông sản dồi dào làm tiền đề để sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống.Đặc biệt là các sản phẩm lên men chua.Ở nước ta, hệ vi khuẩn lactic hiện diện rất phong phú về chủng loại. Vi khuẩn lactic là hệ vi sinh vật được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như trongchế biến và bảo quản thực phẩm cũng như sản xuất chế phẩm vi sinh có lợi. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn lactic sản sinh ra môi trường một số hợp chất thứ cấp như acid hữu cơ, hydrogen peroxide, carbon dioxie, bacteriocin và các enzymee làm tăng hương vị, màu sắc và kết cấu cho sản phẩm. Ngoài việc tăng tính cảm quan cho sản phẩm, các hợp chất này còn có khả năng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn có hại, giúp cho quá trình bảo quản thực phẩm tốt hơn. Năm 2013, Lê Ngọc Thuỳ Trang thực hiện nghiên cứu “Tuyển chọn và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản sinh hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic”, kết quả đã phân lập được chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 từ sữa chua lên men truyền thống cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn rất mạnh, đồng thời xác định được thành phần môi trường MRS OPTSC01 là tối ưu cho sự sản sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01. Từ nghiên cứu này đã mở ra những hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm hoàn thiện cũng như đánh giá toàn diện khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn từ chủng vi khuẩn này. Với ý nghĩa thực tiển và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum”. Nghiên cứu này hy vọng sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếptheo trong việc tạo ra các chất bảo quản sinh học đem lại hiệu quả bảo quản thực phẩm ngày càng cao. Đề tài mang tính kế thừa và 1
11. Đồ án tốt nghiệp được thực hiện tại được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 2. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn có tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn chỉ thị của vi khuẩn Lactibacillus plantarum SC01 có nguồn gốc từ sữa chua lên men truyền thống. 3. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum - Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn cơ chất vi gói đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum - Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ vi khuẩn, mật độ vi khuẩn và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum - Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum 4. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01 được phân lập bởi Lê Ngọc Thuỳ Trang(2013). - Đánh giá khả năng đối kháng của L. plantarum SC01 đối với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị là Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Listeria monocytogenes. 2
12. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus plantarum Theo Bergey và ctv (1923 ) vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuộc: Giới :Bacteria Ngành :Firmicutes Lớp :Bacilli Bộ :Lactobacillales Họ :Lactobacillaceae Chi :Lactobacillus Loài :Lactobacillus plantarum b) a) Hình 1.1. Một số chủng Lactobacillus plantarum: Lactobacillus plantarum299V (a), I kLactobacillus plantarum WCFS1 (b) 1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn L. plantarum L.plantarum thuộc nhóm vi khuẩn lactic, kỵ khí tuỳ nghi,Gram dương, hình que. Khuẩn lạc đặc trưng trên môi trườngMRS – agar có hình dạng tròn, màu trắng sữa, tế bào có dạng hình que thường kết đôi hoặc chuỗi. Tính chất đặc trưng của vi khuẩn này là có khả năng dị hoá arginine và sinh ra nitric oxide (NO), không có khả năng phân giải amino acid ngoại trừ tyrosine và arginine. Vi khuẩn L.plantarum có khả năng lên men đường lactose, và hiện diện trong nhiều môi trường khác nhau như thịt, sữa, nhiều loại rau quả lên men.Đây là loài vi khuẩn chịu acid và có thể phát triển được trong môi trường có chứa muối mật, điều này giúp cho vi khuẩn tồn tại được trong dạ dày và ruột 3
13. Đồ án tốt nghiệp củangười.L.plantarum phát triển được ở nhiệt độ từ 15-450C và trongmôi trường có độ pH thấp (pH 3,2). Trong quá trình lên men, L.plantarumsử dụng nguồn carbon làm nguồn năng lượng để sản xuất ra acid lactic, ethanol, acid acetic, carbon dioxide, các peptide kháng khuẩn và exopolysaccharide.Ngoài ra, L.plantarum có hoạt tính tannase và có thể chuyển hoá acid phenolic. Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn L. plantarum Về di truyền, bộ gene của L. plantarumbao gồm 5 operon rRNA được phân bố đều xung quanh nhiễm sắc thể (NST), 62 gene mã hoá tRNA, 3.052 gene mã hoá protein, một số gene mã hoá cho enzyme phân giải pentose và hexose, một số gene mã hoá phosphotransferase, mannose và fructose nênL.plantarum được xem là vi khuẩncó genome tương đối lớn so với Lactobacillus spp (Aldam, 2013). Bộ nhiễm sắc thể của L.plantarum có chứa 3.308.274 cặp base, và có ba plasmid là pWCFS101 chứa 1.917bp, pWCFS102 chứa 2.365 bp, pWCFS103 chứa 36.069 bp.Vì thế, L.plantarumcó thể thích ứng được với nhiều loại môi trường khác nhau. Số lượng gene mã hoá protein bề mặt lớn (khoảng 217 protein) có thể hoạt động để nhận biết hoặc liên kết với các thành phần nhất định của môi trường, những gene này cho thấy sự tương đồng với protein để thể hiện một số chức năng như tăng khả năng tổng hợp chất nhầy và tăng độ bám dính gian bào. 4
14. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của L. plantarum L. plantarum thuộc nhóm vi khuẩn lactic do đó nhu cầu dinh dưỡng của chúng cũng gần giống với nhu cầu dinh dưỡng của nhóm vi khuẩn lactic, chúng đòi hỏi trong môi trường phải có: Nguồn carbon chủ yếu được dung để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào đồng thời tạo ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid malic, acid fumalic, acid pyruvic, acid acetic; ethanol và CO2. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều dạng hydrat carbon từ monosaccharide (glucose, fructose, manose), disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin). Nguồn cung cấp carbon quan trọng nhất cho khuẩn lactic là đường lactose, vi khuẩn lactic sử dụng enzymee lactose để thuỷ phân đường lactose thành glucose và galactose. Nhu cầu về nguồn nitơ, phần lớn các vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, vì vậy chúng rất cần các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển. Các nguồn nitơ mà vi khuẩn latic có thể sử dụng như cao thịt, cao nấm men, trypton, pepton, . Các acid amin cũng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic. Nhu cầu và vai trò của acid amin đối với từng loài khác nhau là khác nhau, nồng độ acid amin quá cao có thể gây ức chế, kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn lactic. Đối với nhu cầu vitamin, vitamin vừa đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào vừa điều hoà quá trình cân bằng năng lượng trong cơ thể. Tuy nhiên, đa số vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin, do đó cần phải bổ sung vào môi trường các nguồn cơ chất có chứa nhiều vitamin như dịch chiết khoai tây, cà rốt, nước ngô hoặc dịch tự phân nấm men, Đối vớicác chất hữu cơ khác,vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các base nitơ (adenine, guanine, thymine ) hay acid hữu cơ (acid oleic, acid linoleic, acid linolenic). Các chất này có tác dụng điều hoà sinh trưởng và tăng khả năng tích tụ một số sản phẩm trao đổi chất. 5
15. Đồ án tốt nghiệp Các muối vô cơ, để đảm bảo cho sự sinh trường và phát triển, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, kali, natri, phospho, lưu huỳnh, v.v Bên cạnh đó cũng có vài điểm khác biệt về nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Lactobacillus plantarum so với các vi khuẩn lactic khác như: có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon lên men khác nhau, có thể phát triển trong môi trường không chứa catalase. L.plantarum sử dụng mangan trong quá trình tăng trưởng và có thể tích lũy cao ở gian bào. Mangan giúp chúng chống lại độc tính của oxy bằng cách giảm các gốc oxy có trong H2O2. 1.1.3. Cơ sở sinh học của quá trình hình thành các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L.plantarum Vi khuẩn L.plantarum là vi khuẩn kị khí tuỳ nghi, có thể phát triển được trong điều kiện môi trường có và không có sự hiện diện của oxi, sự oxi hoá các hợp chất hữu cơ sẽcung cấp nguồn năng lượng cho hoạt động sống của vi khuẩn. L.plantarum có khả năng lên men đồng hình và lên men dị hình. Acid lactic là sản phẩm cuối cùng hoặc duy nhất của quá trình lên men glucosetheo con đường lên men đồng hình. Trong trường hợp lên men đồng hình, acid pyruvic được tạo thành theo con đường Embden – Mayerhoff – Parnas (EMP). Sau đó acid pyruvic sẽ tạo thành acid lactic dưới tác dụng của enzyme lactate dehydrogenase.Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90%, chỉ một lượng nhỏ acid pyruvic bị khử carbon để tạo thành acid acetic, ethanol, CO2 và aceton.Lượng sản phẩm phụ tạo thành phụ thuộc vào sự có mặt của oxy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013).Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình sử dụng con đường EMP tạo ra hai phân tử acid lactic từ một phân tử glucose và thu được năng lượng gấp hai lần so với vi khuẩn lên men dị hình (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010). Quá trình lên men hexose đặc trưng được thực hiện bởi vi khuẩn lactic bằng con đường lên men đồng hình hoặc lên men dị hình tạo ra các sản phẩm acid lactic, acid acetic, ethanol và carbon dioxide với số lượng bằng nhau. 6
16. Đồ án tốt nghiệp Pentose được lên men bởi nhiều vi khuẩn lactic lên men đồng hình và dị hình bằng con đường chung là từ phosphoketolase của vi khuẩn lactic lên men đồng hình bằng xúc tác pentose. Quá trình lên men pentose tạo ra lượng acid lactic và acid acetic bằng nhau (Suskovic và ctv, 2010). Nhiều acid hữu cơ như là acid lactic, acid acetic, acid propionic là những sản phẩm cuối cùng trong quá trình lên men làm cho môi trường có tính acid dẫn đến ức chế các vi sinh vật gây bệnh và nhiều vi sinh vật hư hỏng. Acid thể hiện hoạt tính kháng khuẩn bằng cách can thiệp vào quá trình duy trì tính ổn định điện thế màng tế bào, ức chế hoạt động vận chuyển các chất, làm giảm độ pH trong tế bào và ức chế một loạt các chức năng trao đổi chất khác. Chúng cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương cũng như cả nấm men và nấm mốc (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010). 1.2. Hợp chất kháng khuẩn từvi khuẩn L. plantarum và cơ chế hoạt động Vi khuẩnL. plantarum được coi như là nguồn sản xuất các chất kháng sinh, các sản phẩm được tạo ra qua quá trình trao đổi chất như là acid hữu cơ (acid lactic và acid acetic), acetaldehyde, các hợp chất kháng khuẩn khác có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin (Suskovic và ctv, 2010). 1.2.1. Acid hữu cơ Sản phẩm chính của quá trình lên men là các acid hữu cơ, tùy vào từng loại vi khuẩn và điều kiện môi trường mà sản phẩm acid được tạo ra là khác nhau (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). Sản phẩm quan trọng và đặc trưng nhất của quá trình lên men lactic là acid lactic và acid acetic. Số lượng và loại acid tạo ra trong quá trình lên men ảnh hưởng đến hoạt động của các vi sinh vật khác có trong đó. Ví dụ, acid acetic có thể kháng được nấm men mạnh hơn acid lactic, một vài nấm men trong quá trình oxy hoá có thể sử dụng acid hữu cơ như một nguồn carbon và là nguồn năng lượng do đó gây ra hư hỏng thông qua việc khử acid trong quá trình lên men, đặc biệt là trong thực vật (Suskovic và ctv, 2010) 7
17. Đồ án tốt nghiệp Tác dụng ức chế của các acid hữu cơ chủ yếu dựa vào sự chưa phân ly của phân tử, các chất này sẽ khuếch tán qua màng tế bào, hướng tới các vùng tế bào chất có tính kiềm và cản trở các quá trình trao đổi chất cần thiết xảy ra. Tác động của acid lactic và acid acetic là làm giảm pH trong tế bào và làm giảm năng lượng điện thế màng (Suskovic và ctv, 2010), pH giảm giúp tiêu diệt các vi khuẩn có hại như E. Coli, Clostridium perfringens, Staphylococcus auraus, v.v Theo Đặng Phương Nga và công sự (2007), khi acid lactic đi qua màng sẽ phóng ra proton H+ làm acid hoá nội bào, phá huỷ cơ chế vận chuyển qua màng dẫn đến chết tế bào. Ngoài ra, do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trường acid bên ngoài, H+ từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn là pH nội bào giảm. Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+ ra khỏi tế bào làm cho vi khuẩn bị mất năng lượng. Bên cạnh đó, pH giảm cũng gây ức chế quá trình đường phân, tế bào vi khuẩn bị cạn kiệt năng lượng, đây cũng nguyên nhân làm cho tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt. 1.2.2. Hydrogen peroxide Hydrogen peroxide là sản phẩm phụ của quá trình lên men lactic, có khả năng oxy hóa mạnh mẽ lớp màng lipid, khi tiếp xúc với tế bào vi khuẩn chúng sẽ tiến hành oxy hoá mạnh mẽ tế bào và phá vỡ cấu trúc cơ bản của protein tế bào (Suskovic và ctv, 2010). Bên cạnh đó, hydrogen peroxide còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn bằng cách oxy hoá các nhóm sulfhydryl từ đó gây biến tính một số enzyme và peroxy lipid màng làm tăng tính thấm của màng.Hydrogen peroxide còn là tiền thân cho việc sản xuất các gốc tự do như superoxide (O-) và hydroxyl (OH), các gốc này có khả năng gây tổn hại DNA của tế bào vi khuẩn. Ví dụ như trong nguyên liệu là sữa, thông qua quá trình oxy hoá các ion thiocyanate (SCN-) bởi hydrogen peroxide được sản xuất bởi các LAB, dưới tác dụng của enzyme lactoperoxidase sẽ tạo ra sản phẩm là một phức chất lactoperoxidase. Phức chất này oxy hoá các cơ chất đặc trưng trên màng tế bào và làm rối loạn quá trình trao đổi chất và có thể làm chết vi khuẩn 1.2.3. Carbon dioxide 8
18. Đồ án tốt nghiệp Carbon dioxideđược sản xuất thông qua con đường lên men dị hình, cho khả năng bảo quản thực phẩm cao gấp đôi so với các hợp chất kháng khuẩn khác.Ngoại trừ hoạt động kháng khuẩn, carbon dioxide còn tạo ra môi trường kỵ khí bằng cách thay thế cho các phân tử oxi có mặt trong môi trường.Carbon dioxide có khả năng ức chế sự tổng hợp enzyme decarboxylase và tích tụ trong lớp màng kép phospholipid dẫn đến sự rối loạn chức năng thẩm thấu, do đó có thể kháng được nấm (Suskovic và ctv, 2010). Carbon dioxide có khả năng ức chế nhiều loại sinh vật gây hư hỏng thực phẩm, đặc biệt là vi khuẩn Gram âm. Tác động ức chế từ carbon dioxide là khác nhau giữa các loài sinh vật. Carbon dioxide ở mức 10% có thể làm giảm 50% tổng số lượng vi khuẩn và ở mức độ từ 20-50%, carbon dioxide có hoạt tính kháng nấm mạnh (Ammor và ctv, 2006). 1.2.4. Bacteriocin Được sản xuất bởi nhiều chủng vi khuẩn lactic, bacteriocin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình phát triển của các vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, ngăn ngừa sự xâm nhiễm của các vi sinh vật khác bằng cách ức chế chúng hoặc liên kết với các receptor đặc biệt của tế bào. Bacteriocin được sử dụng như một tác nhân ức chế các vi khuẩn gây bệnh và gây hư hỏng trong các thực phẩm, duy trì giá trị dinh dưỡng và vitamin, cung cấp thực phẩm tươi mới. Trong công nghiệp chế biến đồ hộp, nisin được sử dụng nhằm giảm khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn, kìm hãm và ngăn ngừa quá trình thối rữa. 1.3. Giới thiệu về bacteriocin 1.3.1. Lịch sự phát hiện và nghiên cứu bacteriocin Bacteriocin đầu tiên được A. Gratia phát hiện vào năm 1925 khi ông đang thực hiện các nghiên cứu để tìm cách tiêu diệt vi khuẩn. Ông gọi phát hiện đầu tiên của mình là colicinvì nó có khả năng tiêu diệt E. Coli. Thuật ngữ “colicin” được đặt tên bởi Gratia và Fredericq (1946), còn “bacteriocin” được sử dụng bởi Jacob và ctv (1953).Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ở ribosome của cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn 9
19. Đồ án tốt nghiệp Gramdương, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế sự phát triển của các loài vi khuẩn khác nhau. Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kiềm hãm chứ không giết chết vi sinh vật (Lê Thị Hồng Vân, 2008). Do vậy, nhiều năm về trước, người ta chỉ tập trung sản xuất kháng sinh mà không chú trọng đến các chế phẩm bacteriocin. Nhiều năm trở lại đây, việc sử dụng thuốc kháng sinh đã gây ra nhiều hiện tượng lờn thuốc, sốc thuốc,v.v gây hậu quả nghiêm trọng.Vì vậy, hiện nay các chế phẩm bacteriocin bắt đầu được quan tâm, chú trọng. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về bacteriocin và công dụng của chúng. Việc nghiên cứu để tìm ra các gene mã hoá cho sự tổng hợp bacteriocin vẫn đang thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Gần đây, bacteriocin được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia.Hai chế phẩm bacteriocin đã có mặt trên thị trường là ALTA TM 2341, có chứa pediocin PA1 được sản xuất bởi Pediococcus acidilactici, và Microgard TM, một sản phẩm thương mại của quá trình sữa lên men có chứa các chất chuyển hóa kháng sinh. Việc sử dụng kháng sinh có chứa các màng cố định bacteriocin đánh dấu cho sự phát triển của bao bì kháng sinh một kỹ thuật mới phát triển gần đây (Suskovic và ctv, 2010).các 1.3.2. Phân loại bacteriocin Theo Heng và ctv(2007) bacteriocin được chia làm bốn lớp chính: - Lớp I: các lantibiotic hay các peptide kháng khuẩn của vi khuẩn có chứa gene không biến đổi mã hoá cho acid amin lanthionine (Lan) hoặc 3- methylanthionine (MeLan), cũng như các acid amin biến đổi cao khác bao gồm các acid amin không bão hoà như acid amin 2,3-dehydroalanine (Dha) và dehydrobutyrine (Dhb). Các lantibiotic được tổng hợp ở ribosome như là các peptide tiền thân sau đó phải trải qua một loạt các phản ứng biến đổi sau dịch mã để sản xuất các acid amin. Cho đến nay, các lantibiotic chỉ được sản xuất bởi các vi khuẩn Gram dương.Lantibiotic được phân loại dựa vào các cấu trúc liên kết vòng và các hoạt tính sinh học của chúng. Chúng được chia làm ba loại, loại 10
20. Đồ án tốt nghiệp A (kéo dài cấu trúc amphipathic), loại B (hình cầu nhỏ và nhiều cấu trúc nhỏ) và loại C. Dựa vào kích thước, vai trò, trình tự peptide dẫn đầu mà các lantibiotic loại A được chia thành hai phân nhóm nhỏ là AI và AII (Heng và ctv, 2007). Trong các lantibioticthuộcnhóm AI thì nisin được chú ý hơn cả, quá trình tổng hợp nisin đòi hỏi sự tham gia phối hợp của ít nhất 11 loại gen với các chức năng khác nhau. Thí dụ như nisinA dùng để mã hoá các peptide tiền thân sau đó sẽ được thực thi bởi nisinB, nisinC cắt các liên kết hydro, nisinT là một ABC vận chuyển, nisinP là một protein màng, v.v Các lantibiotic loại B hình cầu và có hình dạng nhỏ hơn các lantibiotic loại A, điển hình cho nhóm này là Mersacidin, một peptide có 20 acid amin và có các tính năng đặc biệt như ba dòng MeLan, một DHA và một lượng nhỏ S-[(Z)- 2-aminovinyl]-(3S)-3-methyl-D-cysteine (AviMeCys)]. Mersacidin không hình thành các lỗ trong màng tế bào vi khuẩn mà ức chế tổng hợp thành peptidoglycan (Heng và ctv, 2007). Ngoài ra còn có cinnamicin, một lantibiotic loại B chứa 19 acid amin được sản xuất bởi Streptomyces cinamoneus - Lớp II: peptidebacteriocin hay các bacteriocin không chứa lantibiotic. Lớp này có số lượng lớn với hơn 50, có nguồn gốc rất đa dạng, từ khoang miệng, đường tiêu hoá của người và động vật đến các loài có trong các ngành công nghiệp sản xuất sữa và thực phẩm. Lớp II bao gồm các chất ức chế hoạt động như là peptide đơn hoặc các hoạt động phối hợp của hai hay nhiều peptide. Lớp này được chia thành lớp IIa (các bacteriocin giống pediocin), lớp IIb (bacteriocin đa phần) và lớp IIc (các bacteriocin dạng vòng). Trong các bacteriocin thuộc nhóm II thì các bacteriocin lớp IIa chiếm một số lượng tương đối lớn (khoảng hơn 20).Các bacteriocin giống pediocin này có khả năng tiêu diệt Listeria monocytogenes, một tác nhân gây hư hỏng thực phẩm.Đại diện cho lớp này là pediocin PA-1, một peptide gồm 44 acid amin được sản xuất bởi LAB Pediococcus. Pediocin PA-1 được sử dụng với tên 11
21. Đồ án tốt nghiệp thương mại là Alta TM 2341, một sản phẩm dùng để bảo quản thực phẩm chống lại vi khuẩn Listeria. - Lớp III: các bacteriocin lớn và được chia thành hai nhóm riêng biệt: một là enzyme bacteriolytic (hoặc bacteriolysin) (IIIA) tạo điều kiện cho quá trình giết chết các chủng mẫn cảm với tế bào ly giải, hai là các protein kháng khuẩn không làm thủng màng tế bào (IIIb). Lớp IIIa lại được chia ra thành 2 nhóm nhỏ: Lysostaphin- bacteriolysin đầu tiên được tổng hợp như một tiền chất protein với 493 acid amin vàphải trải qua các quá trình biến đổi liên tiếp để tạo thành phân tử lysostaphin hoàn chỉnh. Lysostaphin có khả năng tiêu diệt các tụ cầu khuẩn có ảnh hưởng xấu đến con người và động vật như Staphylococcus epidermidis. Chính vì lý do này mà trong những năm qua lysostaphin đã được khuyến cáo sử dụng trong một loạt các ứng dụng trong lĩnh vực y tế và nông nghiệp. Zoocin A và các bacteriolysins khác: trong 10 năm qua, nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện để tìm cách sản xuất bacteriolysis từ vi khuẩn acid lactic mà chủ yếu là từ Streptococcus và Enterococcus. Zoocin A là enzyme bacteriolysin đầu tiên được sản xuất từ Streptococcus. Ngoài zoocin A chỉ có 2 enzyme bacteriolysin khác được sản xuất từ vi khuẩn lactic đó là millericin B được sản xuất từ Streptococcus milleri và enterolysin được sản xuất từ E.feacelis. Và lớp IIIb là các bacteriocin không phải là bacteriolysin, trái ngược với các bacteriolysin, một số bacteriocin có khả năng tiêu diệt các tế bào vi khuẩn mà không làm thủng màng tế bào. Các bacteriocin thuộc lớp này tác động bằng cách làm tiêu hao năng lượng proton, dẫn đến không thể tổng hợp ATP để cung cấp năng lượng cho tế bào, tế bào sẽ đói dần và chết. Thuộc lớp này có một số bacteriocin chủ yếu như helveticin J được sản xuất bởi Lactobacillic helveticus, dysgalacticin và streptococcin A-M57 được sản xuất từ Streptococcusdysgalactiae, v.v 12
22. Đồ án tốt nghiệp - Lớp IV: các peptidevòng được ribosome tổng hợp sau quá trình phiên mã bằng cách hình thành liên kết hoá trị giữa acid amin đầu tiên và acid amin cuối cùng của các peptide, cho đến nay lớp này chỉ gồm một số ít bacteriocin. Đại diện cho lớp này có enterocin AS-48 được sản xuất bởi E.faecalis spp, enterocin cho phổ tác động rộng ở cả vi khuẩn Gram dương lẫn vi khuẩn Gram âm; gassericin A and reutericin 6 là các peptide vòng được sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus gasseri vàvi khuẩn Lactobacillus reuteri 1.3.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin Cơ chế hoạt động của bacteriocin rất đa dạng như là làm biến đổi các enzyme, ức chế sự sản sinh bào tử, xâm nhập vào tế bào làm mất lực đẩy proton, làm giảm thế năng màng nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào từ đó tạo ra các lỗ thủng dẫn đến tế bào bị phá vỡ.Tác động quan trọng nhất là tương tác giữa bacteriocin với các anionic lipid dồi dào trong màng tế bào và từ đó hình thành các lỗ trong màng tế bào nhạy cảm.Tuy nhiên, bacteriocin được chia thành từng lớp nhỏ khác nhau tương ứng với cơ chế hoạt động khác nhau, như là: Các lantibiotic được tìm thấy chỉ được sản xuất bởi các vi khuẩn Gram dương. Điển hình nhất là nisin được sản xuất bởi vi khuẩn Lactococcus lactic, nisin được Rogers phát hiện ra vào năm 1928 và có một lịch sử dài nghiên cứu. Tác động kháng khuẩn của nisin được thể hiện bằng cách: nisin sẽ bám dính lên các tế bào vi khuẩn, phá vỡ thành tế bào dẫn đến sự thất thoát các ion kali, magiera ngoài.Thông qua sự tương tác giữa màng tế bào với tiền thân là lớp lipid II, nisin ức chế tổng hợp thành peptidoglycan dẫn đến làm suy giảm các thành phần nội bào. Nisin có tác dụng ức chế sự tổng hợp thành tế bào peptidoglycan nên có chúng có thể tác động lên cả vi khuẩn Gram dương như Listeria, Entercoccus, Sporothermodurans và Clostridium. Khi sử dụng, nisin không có tác dụng lên vi khuẩn Gram âm (nhưE. Coli), nấm men và nấm mốc. Cinnamicin là một lantabiotic có tác động ức chế phospholipase A2 (một enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp prostaglandin và leukotriene có trong hệ thống miễn dịch của người) thông qua việc cô lập chất nền 13
23. Đồ án tốt nghiệp phosphatidylethanolamine. Do hoạt động này mà cinnamicin được sử dụng như một loại thuốc chống viêm và chống dị ứng. Plantaricin C, một lantabiotic được thu nhận từ L.plantarum thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của mình thông qua lớp trung gian của lớp lipid II. Trái ngược với nisin, lớp lipid II không thấm được tế bào Leuconostoc lactic hoặc tạo lỗ chân lông trong liposome dưới tác nhân phụ 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphocholine từ lớp lipid II. Tuy nhiên, lantacirin C đã được chứng minh là một chất ức chế mạnh mẽ trong sự tổng hợp lớp lipid II và phản ứng FemX (tức là việc bổ sung Gly vào vị trí đầu của chuỗi bên pentape peptide II) Hầu hết các bacteriocin thuộc lớp II đều làm tiêu tan lượng proton của các tế bào bằng cách tạo thành các lỗ. Hoạt động của bacteriocin lớp IIa phụ thuộc vào mannose permease của hệ thống phosphotransferase (PTS). Ví dụ nhưcơ chế tác động của pediocin PA-1 gồm 3 bước cơ bản như sau: đầu tiên pediocin PA-1 sẽ liên kết với màng tế bào chất, tiếp theo là sẽ chèn vào màng tế bào, sau khi đã chèn được vào trong, pediocin PA-1 hình thành phức có tính thấm với màng tế bào tạo nên động lực phá vỡ proton và làm chết tế bào vi khuẩn (Heng và ctv, 2007). Lysostaphin thể hiện tác động kháng khuẩn bằng cách mã hoá tổng hợp glycylglycine endopeptidase, chất này có thể tiêu diệt các tế bào nhạy cảm bằng cách phá vỡ các liên kết hydro giữa các pentaglycine crossbridges có trong thành peptidoglycan.Vì thế, lysostaphin có thể giết chết hầu hết các tụ cầu khuẩn như Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis. 1.4. Tổng quan về phương pháp vi gói 1.4.1. Khái niệm, đặc điểm, ưu và nhược điểm của phương pháp vi gói. 1.4.1.1. Khái niệm vi gói. Vi gói là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay. Vi gói là phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polymer có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginate, chitosan, cellulose, hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamide, polystyrene, polyacrylate, polyacrylamide, polyester, 14
24. Đồ án tốt nghiệp polyvinyl pyrrolidone (PVP), polyethylene glycol (PEG), để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào vi sinh vật sống trong các nang nhỏ. Giúp tế bào cách ly với môi trường xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như tổn thất số lượng tế bào, bằng cách này các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường cực đoan như acid cao, pH thấp, muối mật, sốc nhiệt, . Ngoài ra, vi gói còn giúp ổn định, tăng giá trị về mặt cảm quan cho sản phẩm. Vi gói có nhiều loại: vi gói đơn nhân là phần nhân bên trong vi gói chỉ chứa một khối dung dịch hoặc chất rắn, vi gói đa nhân là bên trong vi gói có chứa nhiều nhân nhỏ (vi gói trong vi gói), vi gói nhiều lớp là vi gói được thiết kế với nhiều lớp bao khác nhau (Đỗ Quốc Cường,2007). 1.4.1.2. Đặc điểm vi gói. Mỗi loại vật liệu vi gói và mỗi loại tế bào sống hoạt động ở các điều kiện khác nhau nên phải lựa chọn điều kiện để tạo thành vi gói như pH, nhiệt độ, thời gian, v.v Vi gói không làm tổn hại đến tế bào sống mà còn bảo vệ tế bào sống, cho phép cố định lượng tế bào lớn hơn các phương pháp cố định tế bào khác.Độ bền cơ học của lớp màng vi gói là một đặc điểm quan trọng. Nó phải có độ bền tương đối để bảo vệ được các tế bào sống, tuy nhiên lớp màng vi gói này lại không được quá vững chắc vì như thế sẽ ảnh hưởng đến khả năng phóng thích tế bào khi cần thiết. Kích thước hạt vi gói cũng là một đặc điểm cần chú ý. Giữa kích thước hạt vi gói, độ bền vững của hạt và khả năng phóng thích tế bào có mối quan hệ với nhau. Kích thước hạt vi gói càng lớn thì độ bền của hạt càng cao, khả năng bảo vệ tế bào sống càng cao, nhưng khả năng phóng thích càng nhỏ. Kích thước hạt vi gói càng nhỏ thì độ bền càng thấp, khả năng bảo vệ tế bào sẽ thấp đi nhưng khả năng phóng thích sẽ dễ dàng hơn. Ngoài ra còn có một số đặc điểm khác như sự mài mòn của các hạt vi gói do sự va chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt vi gói (Đỗ Quốc Cường, 2007). 15
25. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.3. Ưu điểm của vi gói. Vi gói gói giúp bảo vệ tế bào sống, tạo ra mật độ vi sinh vật lớn, hạt vi gói như tấm áo choàng bảo vệ các tế bào sống chống chịu điều kiện khắc nghiệt của môi trường cực đoan như acid, nhiệt độ, Có thể sử dụng các kỹ thuật tập hơp vi sinh vật để thu được hoạt tính cao nhất.Vi gói có thể làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại, từ đó giúp cho thời gian bảo quản chủng, giống tế bào vi sinh vật được lâu dài. Trong các ngành thực phẩm có các sản phẩm lên men như sản xuất bia, rượu, thì kỹ thuật vi gói là một trong những lựa chọn để cố định tế bào vi sinh vật sử dụng trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng vi sinh vật tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn (Đỗ Quốc Cường, 2007). 1.4.1.4. Nhược điểm của phương pháp vi gói. Tế bào vi sinh vật sinh ra nhiều enzyme trong quá trình trao đổi chất, có những enzyme xúc tác cho những phản ứng không mong muốn có thể làm tổn hại đến lớp vật liệu vi gói và cả chính tế bào. Nếu kích thước vi gói quá lớn có thể làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm.Đa số các vật liệu vi gói như gelatin, thạch, các loại tinh bột, đều là các nguồn dinh dưỡng mà vi sinh vật có thể tiêu hoá được. Điều này khá nghiêm trọng vì sinh vật được vi gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hoá lớp vi gói và làm cho lớp vi gói bị rách, thủng và như vậy hiệu quả lớp vi gói sẽ giảm xuống đáng kể. Có bằng chứng cho thấy một số chủng vi khuẩn có khả năng tiêu hoá, sử dụng vật liệu vi gói. Vì vậy, mỗi chủng vi sinh vật ta phải nghiên cứu vật liệu vi gói phù hợp nhất cho đối tượng vi sinh vật đó (Đỗ Quốc Cường,2007). 1.4.2. Các phương pháp vi gói Có rất nhiều phương pháp để vi gói các thành phần thực phẩm, việc chọn phương pháp vi gói phải phù hợp với nguyên liệu vi gói hoặc ứng dụng của sản phẩm vi gói. Ba bước cơ bản của kỹ thuật vi gói bao gồm: hình thành lớp xung quanh vật liệu, đảm bảo không xảy ra sự rò rỉ và các vật liệu không mong 16
26. Đồ án tốt nghiệp muốn được loại ra ngoài (Wilson and Shah, 2007). Sau đây là một số phương pháp vi gói được sử dụng phổ biến. 1.4.2.1. Phương pháp sấy phun Sấy phun là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng đểvi gói do tính kinh tế cao, và cũng là một trong những phương pháp vi gói được sử dụng lâu đời nhất. Từ những năm 1930, phương pháp này đã được sử dụng để đóng gói kẹo gum cao su.Các bước cơ bản trong kỹ thuật sấy phun bao gồm: xử lý phân tán hoặc nhũ tương, đồng hoá phân tán và đưa khối chất vào buồng sấy (Wilson và Shah, 2007). Vật liệu vi gói các viên nang là hydrocolloid thực phẩm như là tinh bột, maltodextrin, gums (Wilson and Shah, 2007). Vật liệu nên có tính chất nhũ hoá tốt, có độ nhớt thấp và có sự bảo vệ tốt đối với các thành phần vi gói bên trong. Chất vận chuyển được hydrat hoá trong nước, các chất cần vi gói sẽ được thêm vào và đồng hoá trong giai đoạn này. Hỗn hợp này sau đó sẽ được đưa vào máy sấy phun khác nhau, các máy này vận hành nhờ một bánh xe hoặc một vòi phun, nước sẽ bị bốc hơi do không khí nóng (100 – 1600C) sau đó các hạt nhỏ sẽ được đưa đến dưới cùng của máy sấy phun, nơi các hạt vi gói được thu thập (Wilson và Shah, 2007). 1.4.2.2. Phương pháp nhỏ giọt. Phương pháp nhỏ giọt ứng dụng nguyên lý cơ bản là khi một chất lỏng để rơi tự do thì sẽ tạo thành giọt hình cầu do sức căng bề mặt của chất lỏng. Phương pháp nhỏ giọt được thực hiện theo nguyên tắc tạo giọt đồng thời và lồng vào nhau của dung dịch tế bào và dung dịch tạo vỏ vi gói. Trong điều chế vi gói, sự nhỏ giọt không thể thực hiện bằng cách cho chảy tự nhiên nhờ vào trọng lực do các ống tạo giọt có đường kính rất nhỏ. Sự tạo giọt trong vi gói phải được thực hiện bằng cách ép các chất lỏng qua các ống đồng tâm, ở quy mô nhỏ có thể dùng bơm tiêm để ép chất lỏng qua bộ phận tạo giọt. Hệ thống còn có thể được gắn thêm một thiết bị siêu âm để ngắt giọt nên có thể điều chỉnh được kích thước của vi gói. 17
27. Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.3. Phương pháp polymer hoá liên kết bề mặt. Nguyên tắc: Tạo một phản ứng polymer hoá ngay trên bề mặt tiểu phân phân tán. Để thực hiện phản ứng polymer hoá, các monomer được hoà tan hoặc phản ứng trong dung dịch chứa tế bào tự do. Các tế bào tự do dễ được bao bọc bởi màng polymer tại thời điểm polymer được hình thành, do đó phương pháp này còn được gọi là phương pháp polymer hoá insitu. Sau khi thực hiện phản ứng polymer hoá, các vi gói sẽ được tách ra khỏi môi trường lỏng bằng phương pháp ly tâm, lọc hoặc bằng cách cất loại dung môi. Kích thước hạt vi gói thực hiện bằng phương pháp polymer hoá thường nhỏ hơn các phương pháp vi gói khác, thường kích thước hạt vi gói nằm trong khoảng 3 – 2000µm (Đỗ Quốc Cường, 2007). 1.4.2.4. Phương pháp ngưng tụ polymer hoá. Phương pháp ngưng tụ polymer hoá liên kết bề mặt được ứng dụng rất nhiều để điều chế các vi gói. Nguyên tắc của phương pháp này tương tự phương pháp polymer hoá, nhưng sử dụng hai loại polymer, một phản ứng ngưng tụ được thực hiện để tạo thành một polymer mới có liên kết chéo và có phân tử lượng lớn hơn bao phân tiểu phân phân tán (các tế bào tự do) (Đỗ Quốc Cường, 2007). 1.4.2.5. Phương pháp tách pha đông tụ. Phương pháp này thường được áp dụng đối với các dung dịch polymer than nước, polymer được dùng phải có màng phim. Nếu chỉ sử dụng một loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ đơn giản, nếu sử dụng nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ phức. 1.4.3. Vật liệu vi gói, đặc điểm của vật liệu vi gói. 1.4.3.1. Gelatin Gelatin là một chất trong hơi đục, không màu, dễ gãy (khi khô), có nguồn gốc từ collagen thu được từ các sản phẩm khác nhau của động vật. Nó thường được sử dụng như một chất gel trong dược phẩm, thực phẩm, nhiếp ảnh và sản xuất mỹ phẩm. 18
28. Đồ án tốt nghiệp Có nhiều định nghĩa khác nhau về gelatin: gelatin là một polypeptide có khối lượng phân tử lớn có nguồn gốc từ collagen- một thành phần protein chính của mô liên kết – có nhiều trong xương, da, và nội tạng;gelatin cũng là từ để chỉ những hợp chất protein có nguồn gốc từ collagen (Cao Thị Huỳnh Châu, 2007). Theo Hofmeister: Gelatin là sản phẩm của sự thuỷ phân Colagen bởi nhiệt: C102H149N31O38 + H2O -> C102H151N31O39 a. Cấu tạo, nguồn gốc của gelatin Thành phần hoá học của gelatin bao gồm: 85 – 90% protein, 0,5 – 2% muối khoáng, 8 – 13% nước. Gelatin là một hỗn hợp của các peptid và protein được thu nhận từ sự thuỷ phân collagen chiết xuất từ da, xương và các mô liên kết của động vật như da cá, da và xương heo, Collagen được biến tính ở nhiệt độ cao làm tháo cấu trúc xoắn ba tạo thành các chuỗi tách rời, được làm lạnh và hấp thu nước mạnh để tạo thành gelatin. Gelatin có chứa 18 loại acid amin (không có tryptophan và cysteine), có hàm lượng glycine, proline và hydroxyproline cao. Prolin 12% 22% Hydroxylysine 12% Glutamic 6% Arginin 10% Alanime 9% 8% Aspartic Các amino acid khác Cấu trúc phân tử gelatin gồm 18 phân tử acid amin liên kết với nhau theo một trật tự nhất định, xác định, tuần hoàn, tạo nên chuỗi polypeptide, các chuỗi 19
29. Đồ án tốt nghiệp polypeptide có chiều dài khác nhau, mỗi chuỗi có một đầu là nhóm amino còn một đầu là nhóm cacboxyl. Cấu trúc thường gặp của gelatin là Gly-X-Y (với X chủ yếu là nhóm proline còn Y chủ yếu là nhóm hydroxyproline). Gelatin có cấu trúc cơ bản như sau: -Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro. Hình 1.3. Cấu trúc cơ bản của gelatin b. Tính chất của gelatin. Gelatin là chất rắn, vảy, bột hoặc hạt, không mùi không vị, trong suốt, có màu từ trắng đến vàng nhạt.Gelatin không tan trong nước lạnh nhưng dễ tan trong nước ấm. Khi tăng nhiệt độ lên trên 400C những hạt gelatin này sẽ hoà tan vào nước để tạo thành dung dịch. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hoà tan của gelatin là nhiệt độ, nồng độ và kích thước hạt. Gelatin là nguyên liệu không độc, được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm và trong y học của tất cả các nước. Độ nhớt là một trong những tính chất quan trọng để đánh giá chất lượng của gelatin thành phẩm, độ nhớt lý tưởng của gelatin phải đạt trong khoảng 25- 45 milipoise ở 600C.Tuy nhiên, nhiều nhà sản xuất quy định sử dụng gelatin có độ nhớt trong khoảng 38 ± 2 miliposie.Gelatin thường chứa sắt với hàm lượng thay đổi phụ thuộc vào nguồn nước sử dụng trong quá trình sản xuất gelatin.Giới hạn sắt trong gelatin không quá 15 ppm. 20
30. Đồ án tốt nghiệp Khả năng tạo gel là một tính chất rất quan trọng của gelatin, độ bền của khối gel được đặc trưng bởi độ Bloom. Độ Bloom là khối lượng tính bằng gam cần thiết tác động lên bề mặt gel tạo bởi pitong có đường kính 13 mm để khối gel lún xuống 4 mm, khối gel có hàm lượng gelatin là 6,67% , được tạo gel ở 100C trong 16-18 giờ. Gelatin trên thị trường có độ Bloom từ 150-300 Bloom . Gelatin có thể hoạt động như một acid hoặc một kiềm tuỳ thuộc vào độ pH. Trong dung dịch acid gelatin tích điện dương còn trong dung dịch base nó tích điện âm. Điểm trung gian ở đó có sự tích điện bằng 0 được gọi là điểm đẳng điện.Điểm đẳng điện có ảnh hưởng đến độ nhớt và độ bền gel từ đó ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng của gelatin.Gelatin được biết đến như một trong những môi trường nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật nên nó là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển nếu có hàm lượng ẩm cao. Theo quy định thì một gram gelatin phải không được chứa nhiều hơn 100 vi sinh vật và tuyệt đối không được có Samonella hay E. Coli. c. Ưu và nhược điểm của chất gói là gelatin Ưu điểm: Rẻ tiền, thao tác đơn giản, dễ dàng tạo gel bao quanh tế bào, không độc với vi khuẩn và cơ thể người, dễ dàng bị thuỷ giải trong môi trường dạ dày – ruột để phóng thích tế bào, Nhược điểm: Gelatin dễ dàng đông lại khi nhiệt độ xuống dưới 400C nên phải luôn duy trì nhiệt độ này để gelatin ở dạng dung dịch, tuy nhiên nhiệt độ cao khi bổ sung tế bào để vi gói sẽ làm chết tế bào. 1.4.3.2. Alginate Alginate còn có tên gọi khác là acid alginic hay align, là một anion polysaccharide có nhiều trong tảo nâu. Trên thị trường alginate được bán ở dạng sợi dạng hạt hay dạng bột. a. Cấu tạo, nguồn gốc của alginate Alginate là một polysaccharide mạch thẳng, không phân nhánh, phân tử lượng trung bình khoảng 200.000 Dalton, được chiết xuất từ tảo nâu.Alginate thường được chiết bằng kiềm sau đó tủa bằng acid hay bằng muối calcium. 21
31. Đồ án tốt nghiệp Thành phần chính của alginate là acid alginic cấu tạo bởi các đơn vị acid guluronic và acid mannuronic liên kết với nhau bởi dây nối α-(1→4)-L-guluronic (G) và ß-(1→4)-D-mannuronic (M). Alginate được sản xuất từ tảo nâu Phaeophyta, là thành phần chính của thành tế bào, trong tảo các acid chủ yếu ở dạng muối hỗn hợp (Na, K, Mg, Ca). Hình 1.4. Cấu tạo hoá học của alginate c. Tính chất của alginate Là một polymer có tính acid yếu, không màu, không mùi, có khả năng trương nở trong nước. Alginate có tính ưa nước, khi thêm acid hay ion Ca2+ dung dịch Na- alginate có thể tạo thành dạng gel. Các alginate tích điện âm nên có thể tạo keo tụ với các chất tích điện dương. Alginate có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel. Khi hoà tan alginate vào nước chúng dễ tạo dung dịch nhớt, độ nhớt của dung dịch alginate phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: xuất xứ các loại tảo sử dụng để chiết xuất, thông thường tảo ở vùng ôn đới có độ nhớt cao hơn tảo ở vùng nhiệt đới, trọng lượng phân tử của alginate càng cao thì độ nhớt của dung dịch càng tăng.Nhiệt độ tăng 10C thì độ nhớt tăng lên 25%, khi tăng nhiệt độ rồi lại hạ nhiệt độ thì độ nhớt của dung dịch alginate thấp hơn ban đầu.Quá trình bảo quản cũng ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch alginate, khi ở dạng bột alginate tiếp 22
32. Đồ án tốt nghiệp tục bị thuỷ phân và sau một thời gian thì độ nhớt của nó giảm xuống đáng kể.Giá trị pH của dung dịch: ở pH 5,5, nhóm COO- sẽ nhận thêm ion H+ để tạo thành nhóm –COOH làm cho lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi giảm xuống, chúng trở nên gần nhau hơn và dễ dàng tạo liên kết hydro làm tăng độ nhớt. Khi pH > 11, alginate bị khử polymer hoá làm giảm độ nhớt do các liên kết glucoside sẽ bị thuỷ phân trong môi trường kiềm. Khả năng tạo gel của dung dịch alginate có thể được mô tả như sau: khi cho alginate kết hợp với cation hoá trị II và III, thường là Ca2+ sẽ thấy xuất hiện các vùng nối giữa các mạch phân tử alginate và tạo gel. Các gel này được hình thành ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ <1000C và tan chảy khi đun nóng. Dung dịch alginate cũng tạo gel khi bị acid hoá, nhưng loại gel này mềm hơn so với calcium gel. Trong quá trình hình thành gel cần có cơ chế liên kết giữa hai hay nhiều chuỗi alginate. Chuỗi phân tử alginate cấu tạo từ các đơn vị glucoronic acid có hình dạng tương tự như một hộp đựng trứng với các nếp và khe hở mà ion Ca2+có thể chui vào, định vị và liên kết, trong khi các ion Ca2+ giữa các phân tử alginate lại với nhau thành các chuỗi alginate. Cấu trúc giữa các mạch glucoronic acid tạo khoảng cách giữa các nhóm carboxyl và hydroxyl thích hợp với một lượng lớn các liên kết của calcium. c. Ưu, nhược điểm của chất gói là alginate Ưu điểm: alginate có khả năng tạo màng rất tốt, các màng rất đàn hồi, bền, dễ dàng tạo gel bao quanh tế bào vi khuẩn, không độc với cơ thể, rẻ tiền, thực hiện dễ dàng, đơn giản, hình dạng vi gói đẹp và tương đối đồng đều, quy trình vi gói có thể thực hiện ở nhiệt độ bình thường nên không làm tổn thương tế bào vi gói, Nhược điểm: mẫn cảm với môi trường acid, có thể tạo vết nứt rạn làm mất tính ổn định cơ học trong môi trường acid, hạt vi gói thường chìm xuống gây khó khăn cho quá trình thu hồi sản phẩm, 1.4.3.3. Các hợp chất vi gói khác a. Kappa-carrageenan và hỗn hợp của kappa – carrageenan 23
33. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Cấu trúc hoá học của Kappa - carrageenan Kappa – carrageenan là hỗn hợp các polysaccharide trung tính tương tự agar –agar được chiết tách từ các loại tảo lớn ở biển, hoà tan trong nước hoặc trong dung dịch muối, có khoảng 4-5%carragenin.Kappa-carrageenan là polysaccharide có chứa galactose và galactose sulfate.Ở nhiệt độ cao (60-900C) mới thuỷ phân kappa – carrageenan có nồng độ 2-5% (Klein và Vorlop, 1985). Gel hoá kappa-carrageenan thực hiện việc thay đổi nhiệt độ, kappa – carrageenan được ứng dụng trong cố định enzyme, cố định tế bào. Nhiều nghiên cứu cho thấy, kappa – carrageenan là nguyên liệu tốt để cố định tế bào vi sinh vật dùng trong công nghiệp sản xuất nhiều chất khác nhau. Nguyên tắc: bổ sung từ từ dung dịch tạo gel (potassium chloride, hoặc các cation khác như ammonium, calcium, aluminum) vào trong dung dịch muối kappa – carrageenan có chứa sẵn tế bào (hoặc enzyme) sẽ thu được chế phẩm bao gói tế bào. Hỗn hợp kappa – carrageenan – locust bean tạo hiệu quả tốt hơn cho sản phẩm lên men lactic (sữa chua) vì tính mẫn cảm với acid hữu cơ thấp hơn. b. Chitosan Chitosan là một dẫn xuất của chitin, là một polysaccharide mạch thẳng tích điện âm bởi các nhóm amin nhờ sự khử acetyl của chitin, chiết tách từ vỏ các loài giáp xác, được cấu tạo từ các đơn vị D-glusosamine và 2-acetamino-2- deoxy-D-glucosamine. Chitin là đơn vị thành phần cấu trúc vỏ của động vật giáp 24
34. Đồ án tốt nghiệp xác như tôm nên nguồn tách chiết để sản xuất chitosan chủ yếu là từ vỏ, xác động vật giáp xác, chế phẩm của ngành nghề chế biến sản xuất thuỷ sản. Hình 1.6. Cấu trúc hoá học của chitosan Màng chitosan tạo thành có tính kháng khuẩn, kháng nấm và hạn chế sự thất thoát. Chitosan hoà tan trong nước ở pH<6 và giống như alginate, tạo cấu trúc gel bằng cách gel hoá kích thích ion. Chitosan là polycation chứa các nhóm + amine, nên liên kết với các anion và polyanion như polyphosphate, [Fe(CN)6] , 3 [Fe(CN)6] acid polyaldehydrocarbonic. Ngoài ra, chitosan còn được sử dụng làm vỏ bọc chất gói gelatin. Bởi vì không làm tăng khả năng sống của tế bào probiotic nên chitosan thường được sử dụng làm vỏ bọc. 1.5. Quorum sening và quá trình hình thành bacteriocin 1.5.1. Khái niệm về quorum sening Trong vòng ba thập kỷ trở lại đây, các nhà khoa học đã khám phá ra quá trình “quorum sening” như là một quá trình truyền thông tin ở thế giới vi khuẩn,đó là việc tổng hợp và dò tìm một loại phân tử tín hiệu (được gọi làautoinducer)thực hiện điều hoà cho quá trình biểu hiện gen. Quá trình này được chứng minh là có liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện gene mã hoá các yếu tố độc lực ở một số loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản như Vibrio harveyi, V.parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, E.ictaluri (Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, 2012). Theo Phạm Minh Nhựt (2010) thì quorum sening là cơ chế thông tin liên lạc giữa tế bào với tế bào, phối hợp với sự biểu 25
35. Đồ án tốt nghiệp hiện gene trong tế bào vi khuẩn để đáp ứng lại mật độ tế bào bằng cách sản xuất, giải phóng và dò tìm các phân tử dấu hiệu nhỏ, được gọi là các phân tử autoinducer (hay còn gọi là chất kích thích). Quorum sening là một hệ thống kích thích và phản ứng tương quan trong mật độvi khuẩn, là một dạng liên lạc của vi khuẩn dựa trên cơ sở sản xuất và tiết ra các phân tử tín hiệu (autoinducer). Nhiều loài vi khuẩn đặc biệt sử dụng quorum sening để phối hợp biểu hiện gene mật độ vi khuẩn sẵn có. Khi mật độ vi khuẩn gia tăng, các phân tử tín hiệu sẽ được tích luỹ trên môi trường ngoại bào và thông qua đó giúp chúng kiểm soát số lượng cũng như sự hiện diện của các vi khuẩn khác. Những phân tử này khi đạt đến ngưỡng nhất định nào đó sẽ kích hoạt tín hiệu bên trong vi khuẩn và cực đại hoá một gene đặc hiệu nào đó. Bên cạnh đó, nhiều loài côn trùng cũng sử dụng quorum sening để xác định nơi làm tổ của mình. Một số hiểu biết về quorum sening được biết đến từ việc nghiên cứu vi khuẩn, vi khuẩn sử dụng quorum sening để phối hợp với các chức năng nhất định như là hình thành màng sinh học, độc tính, kháng kháng sinh dựa trên mật độ vi khuẩn sẵn có. Quorum sening có thể xảy ra trong cùng một loài vi khuẩn hoặc giữa các loài vi khuẩn với nhau và có thể điều chỉnh một loạt các quá trình khác nhau. Về bản chất, đó như một sinh vật dự báo cho mật độvi khuẩn hoặc tốc độ khuếch tán trực tiếp của vi khuẩn vào môi trường. Các phân tử tín hiệu rất đa dạng, oligopeptide là phân tử tín hiệu ở nhóm vi khuẩn Gram dương, N-Acyl Homoserine lactones (AHL) rất phổ biến ở nhóm vi khuẩn Gram âm và một phân tử autoinducers gọi là autoinducer -2 (Al-2) trong cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. 1.5.2. Vật chất liên lạc, dấu hiệu liên lạc và cơ chế tác động của quorum sening Vi khuẩn cũng có các cơ quan đặc biệt để nhận biết các tác nhân cảm ứng. Khi các tác nhân cảm ứng bao quanh cơ quan thụ cảm của vi khuẩn khi đó sẽ làm hoạt hoá sự sao chép của các gene bao gồm sự tổng hợp các chất gây cảm ứng. 26
36. Đồ án tốt nghiệp Khi trong môi trường chỉ có một vài loài vi khuẩn thì sự truyền thông tin làm giảm sự tập trung của các tác nhân gây cảm ứng, do đó vi khuẩn tạo ra rất ít các chất gây cảm ứng. Lúc đầu, khi ở mật độ thấp sự truyền thông tin sẽ khuếch tán và xâm nhập vào môi trường khác. Tại đây, vi khuẩn có những cơ chế bên trong để truyền thông tin tập trung cho đồng loại. Cứ tiếp tục như thế, thông tin được truyền tới cho các vi khuẩn có mặt ở các môi trường khác nhau và sẽ được trả lời. Có nhiều kiểu cơ chế thụ cảm và nhiều loại vi khuẩn tham gia với các cơ chế khác nhau. Sự khác nhau này phụ thuộc vào vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Những loài vi khuẩn khác nhau thì có những dấu hiệu khác nhau, một loại vi khuẩn riêng lẻ có thể có một hoặc nhiều hệ thống quorum sening do đó chúng sử dụng nhiều tín hiệu liên lạc khác nhau. Vì thế, với cùng một thông tin vi khuẩn có thể có nhiều cách phản ứng khác nhau.Có dấu hiệu cho rằng các loài khác nhau có thể liên lạc với nhau qua hệ thống quorum sening. Trong điều kiện tự nhiên, nhiều loài vi khuẩn cùng tồn tại trong một không gian hẹp, giữa các loài sẽ có một hệ thống querum sening, khi loài này sản sinh ra các chất liên lạc với vi khuẩn cùng loài để phối hợp tập tính, thay đổi cách tăng trưởng và hình thành màng sinh học (biofilm), những chất này giúp chúng tạo thành một quần thể gắn kết điều này sẽ ức chế hoạt động của các loài vi khuẩn khác. Những lý do trên cho thấy rằng muốn hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có hại hoặc kích thích sự phát triển của vi khuẩn có lợi chỉ việc cắt đứt hay cắt ngắn sợi dây liên lạc quorum sening của vi khuẩn. Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của quorum sening 27
37. Đồ án tốt nghiệp 1.5.3. Ứng dụng của hệ thống quorum sening Từ những hiểu biết về hệ thống quorum sening của vi khuẩn giúp ngăn chặn hay giảm bớt tác hại của chúng bằng cách làm nhiễu hệ thống truyền tin của chúng, từ đó vi khuẩn không có khả năng tập trung đủ số lượng vi khuẩn để gây bệnh hoặc không tổng hợp được những gen gây bệnh do đó không biểu hiện bệnh được. Cách này được sử dụng phổ biến trong y học, thay vì phải sử dụng thuốc kháng sinh, ta có thể phá huỷ tín hiệu liên lạc của vi khuẩn làm cho vi khuẩn không thể tổng hợp được protein gây bệnh. Gần đây, trong nuôi trồng thuỷ sản với những nghiên cứu về sự phá huỷ hệ thống quorum sening của vi khuẩn gây bệnh, giúp ngăn ngừa và phòng trừ dịch bệnh trong quá trình nuôi. Những nghiên cứu về quá trình quorum sensing ở vi sinh vật trong nuôi trồng thuỷ sản còn hạn chế, tuy nhiên các kết quả đạt được cũng cho thấy nhiều điều thú vị. Chẳng hạn như hợp chất halogen furanons được chiết xuất từ tảo biển đã được chứng minh là có khả năng làm giảm tác động của gene điều khiển quá trình quorum sening ở vibrio qua đó bảo vệ cá, tôm không bị bệnh. Đối với những vi khuẩn có lợi, chúng ta có thể tác động làm tăng khả năng hình thành các màng sinh học từ đó làm tăng nhanh số lượng vi khuẩn có lợi mà ta mong muốn. Ví dụ như thành lập bộ lọc sinh học để làm sạch nước hay thiết lập các hàng rào sinh học để giữ lại các chất bẩn, v.v 1.5.4. Vai trò của quorum sening trong quá trình hình thành bacteriocin Hệ thống quorum sening rất phổ biến ở vi khuẩn lactic, hiện nay tất cả các trường hợp đều liên quan đến việc sản xuất các peptide kháng khuẩn, các lantibiotic hoặc các peptide tuyến tính , các chủng vi khuẩn lactic thường sử dụng hệ thống quorum sening để kiểm soát biểu hiện bacteriocin, khi nồng độ bacteriocin cao sẽ ngăn chặn sự phát triển của dòng vi khuẩn cạnh tranh. Một số chủng LAB sản xuất nhiều hơn một loại bacteriocin. 28
38. Đồ án tốt nghiệp Quorum sening của vi khuẩn acid lactic liên quan đến các peptide được cảm nhận trực tiếp bằng màng kinase histidine sau đó tín hiệu được truyền đến một bộ phận phản ứng trong tế bào, quá trình điều hoà phiên mã được thực hiện bởi các gene mục tiêu mà thường là các gene cấu trúc cho các phân tử cảm ứng. Quorum sening được nghiên cứu rộng rãi ở vi khuẩn Gram âm, trong đó các phân tử thuộc loại homonserine N-acetyl hoạt động như một kích thích tố diffusible quy định về mật độ tế bào phụ thuộc vào kiểu hình. Một số quorum sening điển hình của vi khuẩn Gram âm là bioluminescence (luxI) được tìm thấy ở Photobacterium fischeri, nơi tổng hợp các homonserine lacton tín hiệu đơn phân là các protein lux. Protein lux có thể ràng buộc các phân tử homonserine lacton dẫn đến kích thích phiên mã của các gen lux. Quá trình này dẫn đến sự biểu hiện tế bào của các gene phát sáng và cuối cùng là kiểu hình phát sáng (Kuipers và ctv, 1998). Đối với vi khuẩn Gram dương, quorum sening xảy ra trong quá trình phát triển ở vi khuẩn Bacillus subtilisvà Steptococcus pneumonia và sản xuất peptide kháng khuẩn ở một số loài vi khuẩn. Các vi khuẩn Gram dương sử dụng các peptide hoặc các peptide sau phiên mã như các phân tử cảm ứng. Quá trình tự động điều khiển tổng hợp nisin được xem như là một quorum sening đặc biệt của vi khuẩn lactic. Hệ có hai thành phần bao gồm điều chỉnh phản ứng NisR và các protein cảm biến, các kinase histidine được kích hoạt bởi các nisin ngoại bào (Kuipers và ctv, 1998). 29
39. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2.NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM. 2.2.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 10/2013 đến tháng 06/2014. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum Vi khuẩn L. plantarum được phân lập bởi Lê Ngọc Thuỳ Trang(2013), được bảo quản trong glycerol 20 % ở nhiệt độ -40C tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM. 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu là vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonellasp., Listeria monocytogenes được cung cấp bởi Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại Học Công nghệ Tp.HCM. 2.2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Môi trường nuôi cấy và phân lập Môi trường MRS OPTSC01(Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013) Môi trường TSB (HiMedia - Ấn Độ) 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị a. Dụng cụ Ống nghiệm Đũa thủy tinh Ống đong 200, 100 ml Bình môi trường 100 ml, 250 ml Các loại đầu típ Đèn cồn Pipete 1ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml Dây cấy ria Ống ly tâm Eppendort Bông y tế, bông không thấm nước 30
40. Đồ án tốt nghiệp Ống Falcon Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml Micropipete 100 µl, 1000 µl Giấy đo pH b. Thiết bị Tủ ủ 370C Cân phân tích Tủ lạnh Bếp đun, bếp từ Máy lắc Máy ly tâm Máy đo OD Máy nước cất Tủ cấy vi sinh Autoclave 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích.Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Đối với mẫu lỏng: dùng micropipette hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ốngnghiệm 10-1 hút tiếp 1ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi đến nồng độ cần thiết. Đối với mẫu rắn:cân chính xác 10g mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2 và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng (Phạm Minh Nhựt, 2013). 2.3.2. Phương pháp tăng sinh Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi 31
41. Đồ án tốt nghiệp lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Đối với giống vi khuẩn lactic được giữ trên môi trường MRS agar hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10ml môi trường MRS broth. Sau đó tiến hành nuôi cấy ở 370C trong 48 giờ.Đối với giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10ml môi trường TSB rồi đem đi lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Các ống giống được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 3 – 50C. Quá trình này được lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển giống một lần. Đối với chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum: cấy chuyển định kỳ 1 tháng/1 lần trên ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS agar. Bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C. Đối với các giống vi sinh vật chỉ thị: cấy chuyển định kỳ 1 tháng/1 lần trên ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA. Bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, ta có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là 32
42. Đồ án tốt nghiệp việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Vi sinh vật được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch, thu cặn có chứa sinh khối. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh - 150C(Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn Để xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic, thực hiện bằng phương pháp đồng nuôi cấy dịch sau ly tâm của vi khuẩn khảo sát đối với vi khuẩn chỉ thị.) Các chủng vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB rồi đem lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, dịch nuôi cấy vi khuẩn chỉ thị được đo OD ở bước sóng 600nm để xác định mật độ. Tiến hành pha loãng để đạt mật độ 106 cfu/ml. Chuẩn bị sẵn các ống nghiệm, mỗi ống chứa 2 ml TSB vô trùng. Hút 2 ml dịch L. plantarum SC01 ở các dạng nuôi cấy sau ly tâm và sau khi trung hoà bằng NaOH 2,0N cho vào các ống nghiệm chứa 2 ml môi trường TSB vô trùng. Sau đó, hút 200 µl vi khuẩn chỉ thị cho vào các ống nghiệm chứa 2 ml môi trường TSB vô trùng và 2 ml dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 của các nghiệm thức sau ly tâm. Tiến hành ủ các ống nghiệm ở 370C trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành đánh giá mức độ kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị ở mỗi thí nghiệm. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị được tính theo công thức sau (Nguyễn Hoài Hương và ctv, 2012): % tỷ lệ ức chế = ( − 푶푫푻푵) 풙 % 푶푫Đ푪 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và phần mềm Statgraphics centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. 33
43. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm Vi khuẩn L. plantarum SC01 Khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn alginate – gelatin Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống L. plantarum SC01 Khảo sát nồng độ vi khuẩn chỉ thị Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 Hình thức nuôi cấy vi khuẩn L. plantarum SC01 có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn. Do đó, việc xác định hình thức nuôi cấy phù hợp sẽ giúp thu được hoạt tính kháng khuẩn có hoạt tính cao nhất. L. plantarum SC01 sau khi được tăng sinh trong 48 giờ, được đo OD600nm và điều chỉnh về mật độ 107 cfu/ml để đánh giá khả năng sinh các hợp chất như sau: - Nghiệm thức 1: L. plantarumtự do (107 cfu/ml). 34
44. Đồ án tốt nghiệp - Nghiệm thức 2: L. plantarum đồng nuôi cấy(107 cfu/ml) với E. Coli(103 cfu/ml). - Nghiệm thức 3: L. plantarum SC01(107 cfu/ml) cố định trong alginate 2,5%. - Nghiệm thức 4: L. plantarum SC01 (107 cfu/ml) cố định trong alginate 2,5% + gelatin 10%. Sau khi bố trí, các nghiệm thức được đem ủ ở 370C trong 48 giờ. Sau đó, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, bỏ cặn, thu dịch và chỉnh pH dịch sau ly tâm về 6,0 bằng NaOH 2,0N vô trùng rồi tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp đã trình bày trong phần 2.3.4. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn alginate và gelatin đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 Từ kết quả thí nghiệm 1, dịch vi khuẩn L. plantarumSC01 khi được cố định trong hỗn hợp alginate – gelatin cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn cao hơn so với các hình thức nuôi cấy khác. Do đó, tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ gelatin khi được phối trộn với alginate 2,5% đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn. Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức tương ứng với 5 nồng độ gelatin khác nhau là 6 %, 8 %, 10 %, 12 % và 14% theo thể tích. Vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi tăng sinh trong 10 ml môi trường MRS OPTSC01 ở 370C trong 48 giờ được phối trộn với hỗn hợp gelatin – alginate 2,5% với tỉ lệ dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 : gelatin – alginate là1: 2. Vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các nghiệm thức được nuôi cấy trong các erlen chứa 50 ml môi trường MRS OPTSC01 ở 370C trong 48 giờ.Sau đó, đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ tủa thu dịch trong. Chỉnh pH dịch sau ly tâm về pH 6,0 bằng NaOH 2,0N vô trùng. Tiến hành đánh giá mức độ kháng khuẩn của dịch L. plantarum SC01 ở các nghiệm thức với vi khuẩn chỉ thị theo phương pháp đã trình bày trong 2.3.4. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 35
45. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩnL.plantarum SC01 Vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi tăng sinh ở 370C trong 48 giờđược phối trộn với hỗn hợp gel gelatin – alginate với tỉ lệ dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 : gelatin – alginate là 1: 2. Sau đó, vi khuẩn L. plantarum SC01 được nuôi cấy trong các erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTCS01 với các tỉ lệ bổ sung L. plantarum SC01khác nhau: 1 %, 2 %, 3 % và 4% theo thể tích. Đem các erlen ủ ở 370C trong 48 giờ sau đó ly tâm ở 4000 vòng / phút, loại bỏ tủa thu dịch trong và chỉnh pH dịch sau ly tâm về pH 6,0 bằng NaOH 2,0N vô trùng để loại bỏ hoạt động ức chế củacác acid hữu cơ. Sau đó, tiến hành đánh giá mức độ kháng khuẩn của dịch L. plantarum SC01 ở các nghiệm thức với vi khuẩn chỉ thị theo phương pháp đã trình bày ở phần 2.3.4. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn chỉ thị đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarumSC01 Vi khuẩn L. plantarum SC01 đượccố định tronghỗn hợp gel gelatin – alginate với tỉ lệ 1 : 2. Sau đó được nuôi cấy trong các erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTCS01 ở 370C trong 48 giờ, đem ly 4000 vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch trong và chỉnh pH dịch sau ly tâm về pH 6,0 bằng NaOH 2,0N vô trùng. Vi khuẩn chỉ thị được nuôi cấy trong erlen chứa 10ml môi trường TSB, đem lắc với tốc độ 150 vòng/phút. Tiến hành đo OD600nmvà pha loãng để đưa về các mật độ 104, 105, 106, 107 và 108 cfu/ml. Hút 2 ml dịch nuôi cấy L. plantarum SC01 sau ly tâm vào các ống nghiệm chứa 2 ml môi trường TSB vô trùng đã chuẩn bị, hút tiếp 200 µl dịch vi khuẩn chỉ thị ở các mật độ khác nhau. Các ống nghiệm được ủ ở 370C trong 24giờ, tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy L. plantarum SC01 với vi khuẩn chỉ thị ở các mật độ khác nhau, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 36
46. Đồ án tốt nghiệp 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L.plantarumSC01 Vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi được phối trộn với hỗn hợp gelatin – alginate theo tỉ lệ 1 : 2. Thí nghiệm được bố trí để khảo sát khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01ở các mốc thời gian 0,4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 và 48 giờ sau khi nuôi cấy. Tại mỗi thời điểm, tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy L. plantarum SC01 với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ sinh khối vi khuẩn, thu dịch trong và chỉnh pH dịch sau ly tâm về 6,0 bằng NaOH 2,0N vô trùng. Tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp đã trình bày trong 2.3.4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. 2.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản bằng lactose đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L.plantarum SC01 L. plantarum SC01 sau khi được tăng sinh trong 48 giờ tiến hành phối trộn với hỗn hợp gelatin – alginate theo tỷ lệ 1 : 2.Cho L. plantarum SC01 đã được cố địnhđược vào các erlen chứa lactose 10% theo thể tích rồi đem bảo quản lạnh ở 40C. Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức ở 5 thời gian bảo quản khác nhau: bảo quản trong 0 tuần,bảo quản trong 1 tuần, bảo quản trong 2 tuần, bảo quản trong 3 tuần và bảo quản trong 4 tuần. Sau mỗi thời gian bảo quản, L. plantarum SC01 được nuôi cấy trong erlen chứa 50 ml môi trường MRS OPTSC01 ở 370C trong 48 giờ rồi đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút, bỏ tủa, thu dịch trong và chỉnh pH dịch sau ly tâm về pH 6,0 bằng NaOH 2,0N vô trùng. Tiến hành xác định khả năngkháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các thời gian bảo quản khác nhau theo phương pháp đã trình bày ở phần 2.3.4. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 37
47. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng hình thành hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L.plantarum SC01 Từ nghiên cứu của Nilsang (2010) cho thấy rằnghình thức nuôi cấy có ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp các chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic. Nghiên cứu ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01 được trình bày ởHình 3.1. 80% 70% b a a a a b b a 60% d d d 50% E. coli d Salmonella 40% b b S. aureus Tỷ (%) lệ chế ức Tỷ c 30% c d c c c B. subtilis 20% L. monocytogenes 10% 0% SCO1 10^7 SC01 10^7 + E. Alginate 2,5 % Gelatin 10 % + coli 10^3 alginate 2,5 % Hình 3.1. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau. Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Dựa vào kết quả ức chế sự phát triển của vi khuẩn chỉ thị ở hình Hình 3.1 nhận thấy rằnghình thức nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01. Dịch sau ly tâm ở các nghiệm thứcnuôi cấy L. plantarum SC01 được trung hòa bằng NaOH 2N về pH 6,0 đều cho kết quả ức chế với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị nhưng tỷ lệ ức chế khác nhau và tỷ lệ ức chế đối với 38
48. Đồ án tốt nghiệp từng chủng vi khuẩn chỉ thị đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Ở nghiệm thức vi khuẩncố định trong hỗn hợp gelatin 10 % - alginate 2,5 %,L. plantarum SC01 sinh hợp chất có khả năng kháng khuẩn cao nhất và đồng đều nhất với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị (E. Coli, Salmonella, S. aureus, B. subtilis và L. monocytogenes) so với 3 nghiệm thức còn lại (tỷ lệ ức chế gần 70% trong đó tỷ lệ ức chế đối với Salmonella và L. monocytogenes là trên 60%), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Ở nghiệm thức L. plantarum SC01 ở mật độ 107 cfu/ml đồng nuôi cấy với E. Coli 103 cfu/ml sinh ra các hợp chất kháng khuẩn cho tỷ lệ ức chế 5 chủng vi khuẩn chỉ thị là thấp nhất (20 – 30 %). Ở 2 nghiệm thức bổ sung vi khuẩn ở dạng tự do, các hợp chất kháng khuẩn thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị thấp hơn 2 nghiệm thức nuôi cấy cố định và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Trong 2 nghiệm thức này, nghiệm thức đồng nuôi cấy L. plantarum SC01 với E. Colicho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn thấp nhất. Điều này có thể do sự có mặt của E. Coli chẳng những không cảm ứng để giúp vi khuẩn L. plantarum sản sinh hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính mạnh mà cònlàm giảm khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01. Đối với các nghiệm thức cố định, các hợp chất kháng khuẩn do L. plantarum SC01 sản sinh cho khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị cao hơn so với dạng tự do. Điều này có thể là do khi cố định giúp cho tế bào chống lại được các tác nhân bất lợi từ môi trường bên ngoài, đặc biệt là áp suất thẩm thấu.Từ đó, tế bào vi khuẩn khi được cố định cho khả năng hình thành hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính cao hơn. Trong 2 hình thức nuôi cấy ở dạng cố định, L. plantarum SC01 khi được cố định trong hỗn hợp gelatin – alginate cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn cao nhất. Điều này có thể do alginate là chất vi gói dễ bị rạn nứt trong môi trường acid do đó khi phối trộn với gelatin sẽ giúp làm tăng độ bền của vi gói từ đó cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn tốt hơn. Theo nghiên cứu của Nilsang (2010) đã chứng minh rằng vi khuẩn lactic ở các hình thức nuôi cấy khác nhau cho khả năng sản sinh bacteriocin khác nhau và tế 39
49. Đồ án tốt nghiệp bào vi khuẩn lactic khi được cố định sản sinh bacteriocin cao nhất. Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đối với vi khuẩn LAB7 ở hai điều kiện nuôi cấy là vi khuẩn LAB7 tự do với mật độ 108 cfu/ml và LAB7 cố định trong calcium alginate với mật độ tế bào là 106 cfu/hạt được nuôi cấy trong môi trường MRS broth ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tế bào vi khuẩn LAB7 khi được cố định cho khả năng sản sinh acid lactic là 2,92 g/l/h cao hơn so với vi khuẩn LAB7 tự do. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn LAB7 khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn E. ColiTISTR 780 là 3200 AU/ml sau 10 giờ nuôi cấy và với vi khuẩn S. aureus TSITR 1466 là 800 AU/ml sau 8 giờ nuôi cấy trong khi tế bào vi khuẩn LAB7 tự do cho khả năng sinh bacteriocin khi đồng nuôi cấy với E. ColiTISTR 780 là 1600 AU/ml và với S. aureus TSITR 1466 chỉ là 400 AU/ml trong cùng thời gian nuôi cấy.Kết quả thí nghiệm này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu trên. Điều này chứng tỏ hình thức nuôi cấy có ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 Do đó, kết quả thí nghiệmkhảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy cho thấy rằng vi khuẩnL. plantarum SC01 sản sinh ra các hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính ức chế vi khuẩn chỉ thị mạnh nhất khi được cố định trong hỗn hợp gelatin 10 % - alginate 2,5 %. Và kết quả thí này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn gelatin – alginate đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 Ở thí nghiệm 1 đã xác định vi khuẩn L. plantarum SC01 sinh hợp chất kháng khuẩn mạnh nhất khi được cố định trong hỗn hợp gelatin và alginate. Ở thí nghiệm này, tiến hành đánh giá tỷ lệ gelatin phối trộn với alginate 2,5%. Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn gelatin – alginate đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 được trình bày trên Hình 3.2. 40
50. Đồ án tốt nghiệp 80% a a a 70% a a 60% E. coli 50% b b Salmonella b b b c b 40% c c S. aureus c 30% B. subtilis Tỷ lệ ức chế (%) chế ức lệ Tỷ c c L. monocytogenes 20% d d d d d d 10% e e 0% Alginate + Alginate + Alginate + Alginate + Alginate + Gelatin 6 % Gelatin 8 % Gelatin 10 % Gelatin 12% Gelatin 14 % Hình 3.2.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 cố định ở các tỷ lệ phối trộn alginate – gelatin khác nhau. Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Khả năng đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ gelatin phối trộn với alginate 2,5% đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01 thông qua khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị được thể hiện trên Hình 3.2. Kết quả cho thấy rằng dịch sau ly tâm khi trung hoà của L. plantarum SC01 được cố định trong hỗn hợp gelatin – alginate ở 5 nghiệm thức tỷ lệ phối trộn gelatin đều cho kết quả đối kháng với 5 chủng vi khuẩn chỉ nhưng tỷ lệ ức chế khác nhau và tỷ lệ ức chế đối với từng chủng vi khuẩn chỉ thị đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Kết quả trên cho thấy tỷ lệ phối trộn gelatin – alginate có ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Trong 5 nghiệm thức khảo sát, L. plantarum SC01 được cố định trong hỗn hợpgelatin 6 % - alginate 2,5 % cho kết quả đối kháng với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị cao nhấtvà đồng đều nhất so với 4 nghiệm thức tỷ lệ phối trộn còn lại (tỷ lệ ức chế đối với E. Coli, B. subtillis, L. monocytogenes gần 70 % và tỷ lệ ức chế với Salmonella, S. aureus trên 60 %), thể 41
51. Đồ án tốt nghiệp hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với 4 nghiệm thức còn lại (P < 0,05). Đối với nghiệm thức plantarum SC01 khi được cố định trong gelatin 14 % - alginate 2,5 % cho tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị là thấp nhất. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy sự hiện diện của gelatin khi phối trộn với alginate để cố định L. plantarum SC01 tăng dần thì kết quả sản sinh hợp chất kháng khuẩn của chủng vi khuẩn này lại giảm dần. Điều này có thể do khi nồng độ gelatin tăng lên thì độ hoà tan của nó trong dung dịch gelatin – alginate sẽ giảm xuống, làm cho khả năng liên kết với alginate kém đi dẫn đến khả năng tạo gel kém, tạo hạt vi gói có độ bền kém. Đồng thời, khi tăng nồng độ gelatin, độ nhớt của dung dịch tăng lên gây khó khăn trong quá trình vi gói, kích thước hạt không đồng đều, điều này cũng ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng vi gói làm ảnh hưởng đến khả năng bao gói vi khuẩn cũng như ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn. Vì vậy khi nồng độ tỷ lệ gelatin càng cao thì tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị càng thấp. Trong thí nghiệm nâng cao chất lượng sữa chua bằng vi gói vi khuẩn lactic, Đỗ Quốc Cường (2009) cho rằng nồng độ gelatin từ 10% trở lên có thể tạo được vi gói với alginate 2% và nồng độ gelatin càng cao thì khả năng vi gói càng cao. Điều này có phần khác biệt với kết quả thí nghiệm trên, nguyên nhân có thể do mục đích thực hiện nghiên cứu không giống nhau; vi khuẩn được chọn vi gói khác nhau; nồng độ alginate sử dụng và các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, ) trong quá trình tiến hành thí nghiệm không giống nhau. Vì vậy, đối với thí nghiệm đánh giá tỷ lệ gelatin phối trộn với alginate đến khả năng hình thành hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01, chủng này sinh các hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính ức chế vi khuẩn chỉ thị mạnh nhất khi được cố định trong hỗn hợp gelatin 6 % - alginate2,5 %. Kết quả thí nghiệm này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giốngđến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 42
52. Đồ án tốt nghiệp Trong kết quả nghiên cứu của Sahingil và ctv (2009) cho thấy rằng khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn phụ thuộc vào mật độ tế bào vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01, được trình bày trên Hình 3.3. 70% a a a a 60% a a a a a b 50% E. coli b b Salmonella 40% b c b S. aureus 30% B. subtilis Tỷ lệ ức chế (%) chế ức lệ Tỷ c c L. monocytogenes 20% c c 10% d 0% 1 % 2 % 3 % 4 % Hình 3.3.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị ở các tỷ lệ cấy vi khuẩn L. plantarum SC01. Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P <0,05). Kết quả đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng hình thành hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01 thông quả khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn chỉ thị được thể hiện ở Hình 3.3. Dịch tế bào sau ly tâm và trung hoà bằng NaOH vô trùng củaL. plantarum SC01 cố định trong gelatin 6 % - alginate 2,5 % ở 4 nghiệm thức tỷ lệ cấy L. plantarum SC01 đều cho kết quả đối kháng với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị nhưng tỷ lệ ức chế khác nhau và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Ở nghiệm thức cấy giốngvới tỷ lệ 3 % và 4 %, L. plantarum SC01sản 43
53. Đồ án tốt nghiệp sinh hợp chất kháng khuẩn có tỷ lệ ức chế cao nhất đối với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với 2 nghiệm thức còn lại (tỷ lệ ức chế đối với Salmonella và B. subtilistrên 60 %, tỷ lệ ức chế đối với E. Coli, S. aureus và L. monocytogenes gần 60%). Nghiệm thức tỷ lệ cấy giống 1 % cho tỷ lệ ức chế với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị là thấp nhất (tỷ lệ ức chế đối với E. Colivà S. aureus thấp hơn 10%, tỷ lệ ức chế L. monocytogenes trên 10%, tỷ lệ ức chế Salmonella và B. subtilistrên 20%). Kết quả của thí nghiệm cho thấy rằng tỷ lệ cấy giống cao sẽ sản sinh ra nhiều hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính cao.Xét về tỷ lệ ức chế của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 khi được cố định trong gelatin 6 % - alginate 2,5 % ở tỷ lệ cấy giống 3 % đối với từng vi khuẩn chỉ thị, dịch L. plantarum SC01 cho tỷ lệ ức chế mạnh đối với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với tỷ lệ cấy L. plantarum SC01 4 %. Tuy nhiên xét về mức độ đồng đều về khả năng ức chế các chủng vi khuẩn chỉ thị và xét về giá trị kinh tế, chọn tỷ lệ cấy giốngL. plantarum SC01 3% cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.4. Kết quả đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn củavi khuẩn L. plantarum SC01 ở các mật độ vi khuẩn chỉ thị khác nhau Kết quả đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các mật độ vi khuẩn chỉ thị khác nhau được thể hiện trên Hình 3.4 44
54. Đồ án tốt nghiệp 70% a a ab b c 60% a a ab a a b b b b ab b b 50% b b a c a E. coli b b Salmonella 40% c S. aureus 30% B. subtilis L. monocytogenes Tỷ lệ ức chế (%) chế ức lệ Tỷ 20% 10% 0% VKCT 10^4 VKCT 10^5 VKCT 10^6 VKCT 10^7 VKCT 10^8 Hình 3.4. Kết quả đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn củavi khuẩn L. plantarum SC01 ở các mật độ vi khuẩn chỉ thị khác nhau. Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P 0,05). Xét về tỷ lệ ức chế từng chủng vi khuẩn chỉ thị, L. plantarum SC01 cho khả năng ức chế mạnh nhất đối với vi khuẩn E. Coli (tỷ lệ ức chế gần 70%) khi mật độE. Coli là 104 cfu/ml nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) so với các mật độ 105, 106, 108 (cfu/ml). Khả năng ức chế vi khuẩn E. Coli thấp nhất ở nghiệm thức mật độ 107 cfu/ml. Đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị còn lại (Salmonella, S. aureus, B. subtilis và L. monocytogenes)dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 ly tâm sau khi trung hòa cho khả năng ức chế vi khuẩn 45
55. Đồ án tốt nghiệp chỉ thị là như nhau ở cả 5 nghiệm thức mật độ vi khuẩn chỉ thị và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Kết quả khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn chỉ thị đến khả năng hình thành hợp chất kháng khuẩn của plantarum SC01 cho thấy rằng mật độ vi khuẩn chỉ thị không có ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Kết quả thí nghiệm này không tương đồng với kết quả của Lê Ngọc Thuỳ Trang (2013) khi nghiên cứu L. plantarum SC01 ở dạng tự do cho tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị càng thấp khi mật độ vi khuẩn chỉ thị càng cao. Sự khác biệt này có thể do khi được vi gói tế bào vi khuẩn được bảo vệ tốt hơn từ đó cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn cao hơn. Từ kết quả của thí nghiệm này tiếp tục sử dụng mật độ vi khuẩn chỉ thị 106 cfu/ml trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L.plantarum SC01 Theo nghiên cứu của Zalán và ctv (2005), thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của Lactobacillus. Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 được trình bày trên Hình 3.5. 46
56. Đồ án tốt nghiệp 80% 70% 60% E. coli 50% Salmonella 40% S. aureus 30% B. subtilis Tỷ lệ ức chế (%) chế ức lệ Tỷ 20% L. monocytogenes 10% 0% 0h 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 32h 36h 40h 44h 48h Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Dựa vào kết quả ức chế sự phát triển của vi khuẩn chỉ thị trên Hình 3.5 nhận thấy rằng thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự hình thành các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarumSC01. Khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarumSC01thể hiện ở tỷ lệ ức chế sự phát triển củavi khuẩn chỉ thị ở các thời gian khác nhau. Trong khoảng thời gian từ 0 giờ đến 4 giờ, L. plantarumSC01 chưa sản sinh ra các hợp chất kháng khuẩn nên chưa có khả năng ức chế sự phát triển của 5 chủng vi khuẩn chỉ thị E. Coli, Salmonella, S. aureus, B. subtilis và L. monocytogenes.Đến thời điểm 8 giờ nuôi cấy, L. plantarumSC01 bắt đầu sản sinh ra các hợp chất kháng khuẩn, nhưng có hoạt tính khá thấpchỉ có khả năng ức chế sự phát triển của B. subtilis (0,36%)và L. monocytogenes (1,36%) nhưng không có khả năng ức chế E. Coli, Salmonella, S. aureus. Từ 12 giờ đến 16 giờ, L. plantarumSC01 sản sinh các hợp chất kháng khuẩn cho khả năng ức chế Salmonella, S. aureus, B. subtilis và L. 47
57. Đồ án tốt nghiệp monocytogenesnhưng tỷ lệ ức chế là rất thấp và chưa có khả năng ức chếsự phát triển của E. Coli. Từ thời điểm 20 giờ, các hợp chất kháng khuẩn do L. plantarumSC01 sản sinh bắt đầu cho khả năng ức chế sự phát triển của 5 chủng vi khuẩn chỉ thị và tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị tăng dần từ 20 giờ đến 48 giờ.Tại thời điểm 48 giờ, dịch L. plantarumSC01 sau khi ly tâm và được chỉnh pH sản sinh ra các hợp chất kháng khuẩn cho tỷ lệ ức chế sự phát triển của 5 chủng vi khuẩn chỉ thị cao nhất. Kết quả của thí nghiệm này tương đồng với kết quả khảo sát đường cong tăng trưởng của L. plantarum SC01 của Lê Ngọc Thuỳ Trang (2013). Đồng thời cũng phù hợp với kết quả của Zalán và ctv (2005) khi tiến hành khảo sát khả năng sinh hydrogen peroxide và bacteriocin của vi khuẩn L. plantarum 2142 tại các mốc thời gian 0, 2, 24, 48 và 72 giờ bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự phát triển của L. monocytogenesvà B. cereus bị ức chế bởi hydrogenperoxide trong đệm phosphate do L. plantarum 2142 sản sinh ra sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy. Và kết quả nghiên cứuL. plantarum ST194BZ của Todorov và Dicks (2005) cho thấy rằng sau 6 giờ nuôi cấy trong muôi trường MRS lượng bacteriocin tạo thành tương đối thấp (400AU/ml) và sau 13giờ - 14 giờ nuôi cấy lượng bacteriocin tạo thành là cao nhất (12800 AU/ml). Do điều kiện thí nghiệm không thể khảo sát với thời gian cách nhau 1 giờ nên cũng chưa xác định được tại thời điểm nào L. plantarum SC01 sinh các hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính mạnh nhất. Tuy nhiên, kết quả của thí nghiệm này cũng rất có ý nghĩa trong việc xác định được thời điểm mà vi khuẩn L. plantarum bắt đầu sản sinh các hợp chất kháng khuẩn khi cố định trong hỗn hợp gelatin – alginate. 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản bằng lactose 10 % đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 Sau khi tiến hành khảo sát cácyếu tố ảnh hưởng và thời gian sản sinh các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 khi được cố định. Tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản bằng lactose đến khả năng hình 48
58. Đồ án tốt nghiệp thành hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01 nồng độ lactose được chọn làm thí nghiệm là 10 %theo thể tích. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩnL. plantarum SC01 thông qua khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị được trình bày trên Hình 3.6. 90% a 80% a a a a a a b a b a a b a a b b 70% c b b 60% d E. coli c 50% c c c Salmonella 40% S. aureus 30% B. subtilis Tỷ lệ ức chế (%) chế ức lệ Tỷ 20% L. monocytogenes 10% 0% 0 Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản bằng lactose 10 % đến khả năng hình thành hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Dựa vào kết quả ức chế sự phát triển vi khuẩn chỉ thị của L. plantarum SC01 trên Hình 3.6 nhận thấy rằng thời gian bảo quản có ảnh hưởng đến khả năng hình thành hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01. Dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 sau ly tâm và điềuchỉnh pH ở 5 nghiệm thức đều cho kết quả ức chế đối với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị nhưng tỷ lệ ức chế khác nhau và tỷ lệ ức chế đối với từng chủng vi khuẩn chỉ thị thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Đồng thời, tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị giảm dần theo thời gian khảo sát và giảm mạnh ở tuần thứ 4. Trong 5 nghiệm thức thời gian bảo quản, tại thời điểm vừa cố định vi khuẩn L.plantarum SC01khả năng sinhhợp chất kháng khuẩn của chúngcó hoạt tính ức chế cao nhất với vi khuẩn chỉ thị. Sau 1 tuần bảo quản trong lactose 10% ở nhiệt độ 40C thì hoạt tính ức chế của các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn này giảm 49
59. Đồ án tốt nghiệp không đáng kể(1,37 %). Tại thời điểm 2 và 3 tuần bảo quản, hoạt tính của các hợp chất này cũng giảm dần với tỷ lệ giảm tỷ lệ ức chế lần lượt là 4,66 % và 6,25 %. Tuy nhiên, đến thời gian bảo quản 4 tuần, tế bào L. plantarum SC01 khi được cố định sinh ra các hợp chất kháng khuẩn có tỷ ức chế vi khuẩn chỉ thị chỉ đạt 57,49 % và tỷ lệ ức chế giảm đến 37,35 % so với thời điểm ban đầu. Kết quả thí nghiệm này cho thấy thời gian bảo quản có ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01, thời gian bảo quản càng lâu thì khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01 càng giảm.Điều này do trong quá trình bảo quản, thường sử dụng nhiệt độ lạnh nhằm để kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật để tránh cho vi sinh vật đi vào phase tử vong. Do đó, trong thời gian đầu sau khi bảo quản, tế bào vi khuẩn vẫn giữ được hoạt tính nhưng khi thời gian bảo quản quá dài (4 tuần), hoạt tính của tế bào vi khuẩn bị ảnh hưởng donhững tác nhân vật lý trong quá trình bảo quản có thể làm vỡ lớp vi gói, giải phóng tế bào ra ngoài; thời gian bảo quản càng lâu, nguồn dinh dưỡng càng cạn kiệt dẫn đến sự cạnh tranh dinh dưỡng giữa các vi khuẩn làm số lượng vi khuẩn bị giảm đáng kể hoặc cũng có thể do tế bào bị già và chết đi. Từ kết quả nghiên cứu này, việc bảo quản vi khuẩn L.plantarum SC01 trong môi trường đường lactose 10% thật sự có hiệu quả trong việc đảm bảo tỷ lệ sống cũng như hoạt tính của chúng. Tuy nhiên, việc bảo quản chỉ nên thực hiện trong một thời gian nhất định (từ 1 tuần đến 3 tuần) nhằm đảm bảo vẫn giữ nguyên hoạt tính của vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm này có ý nghĩa rất lớn, đặc biệt là ứng dụng trong quá trình sản xuất vì sẽ tiết kiệm được rất nhiều thời gian cũng như chi phí cho quá trình chuẩn bị vi khuẩn trước khi đưa vào giai đoạn sản xuất. Tóm lại, từ các kết quả thí nghiệm đã tiến hành khảo sát khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của chủng này khá tốt dù khi được cố định trong hỗn hợp alginate – gelatin hoặc khi nuôi cấy ở dạng tự do (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013). Đồng thời cũng đã xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn của chúng cũng như điều kiện bảo quản vi khuẩn khi được cố 50
60. Đồ án tốt nghiệp định trong hỗn hợp alginate – gelatin. Các kết quả của nghiên cứu này rất có ý nghĩa nhằm hướng đến khả năng ứng dụng của các hợp chất kháng khuẩn cũng như bản thân sinh khối vi khuẩn L. plantarum SC01 trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm, sản xuất chế phẩm vi sinh trong chăn nuôi, thủy sản hay ứng dụng ủ chua thức ăn xanh cho gia súc. 51
61. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận - Tế bào vi khuẩn L. planarum SC01 khi được cố định trong hỗn hợp sinh gelatin – alginate cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn cao nhất. - Tế bào vi khuẩn L. planarum SC01 khi được cố định trong gelatin 6% - alginate 2,5% cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn cho tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị cao nhất. - Vi khuẩn L. plantarum khi được cố định cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn cao nhất với tỷ lệ cấy giống3 % theo thể tích. - Khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01 không bị ảnh hưởng bởi các mật độ vi khuẩn chỉ thị khác nhau. - Xác định được thời điểm L. plantarumSC01 bắt đầu sinh hợp chất kháng khuẩn khi được nuôi cấy trong 48 giờ vàcho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn cao nhất tại thời điểm 48 giờ. - Vi khuẩn L. plantarum SC01 cố định khi được bảo quản trong môi trường lactose 10% trong thời gian nhất định (1 đến 3 tuần) vẫn cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn tốt. 4.2. Đề nghị - Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. planarum SC01 cố định trong alginate 2,5 % - gelatin 6 %. - Khảo sát lại ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum với các khoảng thời gian ngắn hơn. - Ứng dụng các hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn L. plantarum SC01 sản sinh vào quá trình bảo quản thực phẩm. - Tách, chiết và tinh sạch bacteriocin tạo chế phẩm sinh học cho hiệu quả bảo quản thực phẩm cao hơn. 52
62. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Cái Ngọc Bảo Anh, Võ Đăng Bảo Quốc. 2012. Đặc tính điều trị của chủng vi khuẩn acid lactic. sinh-axit-lactic. Cao Thị Huỳnh Châu. 2007. Đáng giá chất lượng gelatin da cá tra. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ thực phẩm, Đại Học Cần Thơ. Đỗ Quốc Cường. 2009.Nâng cao chất lượng sữa chua bằng phương pháp vi gói vi khuẩn lactic. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại Học Công Nghệ Tp. HCM Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp. Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản visinhvật.03/03/2007. atbaoquanvisinhvat.htm Nguyễn Hoài Hương, Dương Thúy Vy, Trần Linh Châu, Đoàn Kim Như. 2012. Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic từ nem chua truyền thống làm giống khởi động lên men nem chua probiotic. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc khu vực phía Nam lần thứ II: 8 – 11. Đặng Phương Nga, Nguyễn Thị Yên, Đỗ Thu Phương, Nguyễn Bá Tú, Lại Thuý Hiền, 2007.Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio trong nước nuôi tôm của Baclillus subtilis HY1 và Lactococcus lactis CC4K. Tạp chí công nghệ sinh học 5(3): 383 – 390. Phạm Minh Nhựt. 2010. Đáng gía tính đối kháng vi khuẩn Vibrio spp. và nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá chẽm (Lates calcarifer) bằng các chủng vi khuẩn phân huỷ N- Hexanoyl Homoserine Lactone. Luận văn Thạc Sỹ Khoa Học Nông Nghiệp, Đại Học Nâm Lâm Tp. HCM. Phạm Minh Nhựt. 2010. Thực hành vi sinh đại cương. Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. HCM. 53
63. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh. 2012. Khả năng ức chế quá trình phát sáng sinh học ở Vibrio harveyi bởi enzymee AHL - lactonase tái tổ hợp. Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Lê Ngọc Thùy Trang. 2013. Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại Học Công Nghệ Tp. HCM. Lê Thị Hồng Vân. 2008. Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Luận văn tốt nghiệp đại học, Khoa kỹ thuật hoá học, Đại Học Bách Khoa Tp. HCM. TÀI LIỆU TIẾNG ANH Adlam K., 2013. Lactobacillus plantarum and it’s biological implications. m_and_its_biological_implications Amed T., Kanwal R., 2004. Biochemical Characteristics of Lactic Acid Producing Bacteria And Preparation of Camel Milk Cheese By Using Starter Culture. Pakistan Veterinary Journal 24 (2): 87 – 91. Ammor S., Tauveron G., Dufour E., Chevallier I, 2005. Antibacterial activity of lactic acid bacteria against spoilage and pathogenic bacteria isolated from the same meat small-scale facility 1—Screening and characterization of the antibacterial compounds. Food Control 17(2006): 454 – 461. De Vries M.C., Vaughan E.E., Kleerebezem M., De Vos W.M., 2005.Lactobacillus plantarum – survival, functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract.International Dairy Journal16: 1018 – 1028. Heng N.C.K., Wescombe P.A., Burton J.P., Jack R.W., Tagg J.R., 2007.The Diversity Of Bacteriocins In Gram – Positive Bacteria. In: Bacteriocins: Ecology and Evolution(Eds. Riley M.A., Chavan M.A.), University of Massachusetts Biology Department, Amherst, USA. Kuiper O.P, De Ruyter P.G.G.A, De Vos W.M, 1998. Quorum sensing – controlled gene expression in lactic acid bacteria.Journal of Biotechnology64: 15 – 21. 54