›

Đồ án Khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra

pdf 70 trang thiennha21 12/04/2022 9000
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_mot_so_dac_tinh_cua_vi_khuan_bacillus_n6_1_do.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN BACILLUS N6.1 ĐỐI KHÁNG EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : MAI NGỌC TUYỀN MSSV: 107111217 Lớp: 07DSH4 TP. Hồ Chí Minh, 2011
  2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nuôi trồng thủy sản là một trong những thế mạnh của Việt Nam. Tính đến thời điểm này, kim ngạch xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đạt hơn 3 tỷ USD với trên 843.000 tấn thủy sản các loại. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn dự báo, giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đến hết quý IV năm 2010 nhiều khả năng sẽ đạt mức 4,74 tỷ USD, trong đó riêng kim ngạch xuất khẩu cá tra sẽ chiếm ưu thế đạt khoảng 1,38 tỷ USD. Sản lượng cá tra ngày càng gia tăng thì luôn đi kèm theo sự phát sinh của dịch bệnh. Một trong những bệnh quan trọng trên cá tra nuôi là bệnh gan thận mủ, đã có một số công trình nghiên cứu về bệnh này. Và nguyên nhân gây bệnh được xác định chủ yếu do vi khuẩn E. ictaluri (Crumlish và ctv, 2002). Khi bệnh xảy ra, nông dân thường lạm dụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn để phòng bệnh và điều trị cho cá việc này đã tạo ra những chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc (Schwarz và ctv., 2001; Akinbowale và ctv., 2006). Để thay thế dần dần phương pháp phòng bệnh truyền thống, phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học như sử dụng vaccine, các chất kích thích miễn dịch, các peptide kháng khuẩn, prebiotic (hợp chất tiền sinh học), đặc biệt là phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) ngày càng được ưa chuộng. Việc sử dụng vi sinh vật thay thế kháng sinh để chữa bệnh đã trở thành bước tiếp cận đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản. Với ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành “Khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra”. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh – Phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II. 1.2. Tình hình nghiên cứu Trong năm 2010, Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II đã tiến hành phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra. Nguồn vi sinh vật phân lập từ hệ tiêu hóa, nước, bùn 1
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt ao nuôi cá tra và nguồn vi sinh từ ngân hàng vi sinh. Đã tiến hành 5 đợt thu mẫu với tổng số mẫu là 284 mẫu (hệ tiêu hóa, nước và bùn), số khuẩn lạc đã sàng lọc qua AHLs là 592, vi khuẩn lactic là 120 khuẩn lạc, vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus là 165 khuẩn lạc Một số nghiên cứu khác về các vi khuẩn probiotic có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Sàng lọc những vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh vẫn là cách tiếp cận được sử dụng chủ yếu trong việc phân lập vi khuẩn probiotic. Trong quá trình sàng lọc này, đa số các nhà nghiên cứu áp dụng phương pháp xác định hoạt tính ức chế in vitro (Spangaard và ctv., 2001; Chythanya và ctv., 2002; Hjelm và ctv., 2004). Hiện nay, có bốn phương pháp thường được sử dụng để sàng lọc các chủng vi khuẩn tiết ra các hợp chất ức chế in vitro: phương pháp lớp kép (Dopazo và ctv., 1988), phương pháp đục lỗ trên mặt thạch, phương pháp cấy ria vuông góc, và phương pháp đĩa giấy khuếch tán. Tất cả các phương pháp trên đều dựa trên một nguyên tắc là khi một chủng vi khuẩn sản xuất ra một hợp chất ngoại bào có tính chất ức chế một chủng vi khuẩn khác, hoạt tính này sẽ được thể hiện thông qua việc ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn khác trong môi trường agar. 1.3. Mục đích nghiên cứu Làm cơ sở để tạo ra những sản phẩm probiotic phù hợp có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E. ictaluri 1.4. Nội dung nghiên cứu Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối kháng với E.ictaluri của Bacillus N6.1 Khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật Khả năng phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone Khảo sát bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 lên sự phát triển của E. ictaluri bằng phương pháp nuôi chung (co-culture) 2
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CHƯƠNG II: TỒNG QUAN 2.1. Tình hình nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Trong các năm gần đây, nghề nuôi thủy sản trong nước đã phát triển nhanh và có nhiều nổi bật. Hiện nay ở Đồng bằng sông Cửu Long, mặc dù diện tích nuôi cá tra không lớn (năm 2009 là 5540 ha) nhưng sản lượng hàng năm cho trên 1.000.000 tấn. Năm 2010, tình hình sản xuất, tiêu thụ cá tra ở vùng ĐBSCL có nhiều biến động. Đến hết tháng 11/2010, tổng sản lượng sản xuất cá tra toàn vùng đạt gần 2,4 tỉ con cá giống, diện tích thả nuôi 5.420 ha, đạt 90,3% kế hoạch năm; nhờ nâng cao năng suất (trung bình đạt 261,2 tấn/ha/vụ) nên sản lượng cá thu hoạch 1.141.000 tấn, đạt 95,1%/năm. Sản lượng cá xuất khẩu đạt 600.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,3 tỉ USD, giảm 2,8% về lượng, 7,8% về kim ngạch xuất khẩu so cùng kỳ năm 2009. Dự kiến cả năm xuất khẩu đạt 645.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,4 tỉ USD. Đi sâu vào hình thức và mô hình nuôi, nghề nuôi cá tra có sự chuyển đổi từ mô hình nước chảy trong lồng bè, đăng quần trên sông vùng thượng nguồn sông Tiền và sông Hậu sang mô hình nuôi ao dọc cồn bãi ven sông và càng dịch chuyển về phía hạ lưu với chất lượng cá tốt hơn. Tuy nhiên, tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra đang thể hiện sự thiếu bền vững, trong đó có nhiều nguyên nhân chủ yếu là: Việc phát triển cá tra quá nhanh trong những năm vừa qua, đôi khi vượt quá quy hoạch của ngành, vượt ngoài sự quản lý của nhà nước dẫn đến các sự cạnh tranh không lành mạnh nhất là việc tiêu thụ sản phẩm trên thị trường quốc tế. Sự không ổn định về mặt cung cầu do thiếu cơ chế liên kết phối hợp giữa các chuổi trong hệ thống đã dẫn đến các hệ lụy về biến động giá cả trên thị trường, chất lượng sản phẩm, ô nhiễm môi trường, sự phá sản của người nuôi . Với số lượng lên đến trên 3 tỉ con giống hàng năm nhưng việc quản lý đàn cá bố mẹ của các trại sản xuất trong thời gian dài vừa qua chưa thật sự được quan tâm về mặt quản lý và hổ trợ về mặt kỹ thuật. Hệ quả dẫn đến chất lượng con giống cá tra đang có 3
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt biểu hiện giảm sút, tốc độ tăng trưởng chậm hơn, dể nhiễm bệnh trong quá trình ương nuôi, tỉ lệ hao hụt cao khi nuôi. Bệnh cá tra nuôi là một trong những nguyên nhân gây hao hụt cho người nuôi. Trong đó các loại bệnh gan thận mủ, bệnh trắng gan, trắng mang là những bệnh gây thiệt hại to lớn cho người nuôi có thể thiệt hại đến 20 – 30% sản lượng ao nuôi. Ngoài ra các bệnh nội và ngoại ký sinh cũng là tác nhân gây tổn thất cho ao nuôi. Vấn đề ảnh hưởng đến môi trường nuôi cũng như chất lượng môi trường nước cấp cho ao nuôi cũng là một thách thức đối với sự ổn định và bền vững trong nghề nuôi cá tra. Việc giải quyết chất thải và nước thải từ ao nuôi cá tra là thách thức lớn, đỏi hỏi phải có những giải pháp công nghệ và kỹ thuật để đảm bảo sự bền vững về môi trường. Vần đề thị trường tiêu thụ cá tra, tương tự với sản phẩm tôm nuôi, chất lượng sản phẩm chế biến đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm và đáp ứng yêu cầu truy xuất nguồn gốc của nhà nhập khẩu cũng được đặt ra đối với việc sản xuất, chế biến, bảo quản và xuất khẩu sản phẩm cá tra.(Oanh Lê - Nguồn viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II) Hình 2.1: Thu hoạch cá tra ở ĐBSCL 4
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Edwardsiella spp. và bệnh gan thận mủ trên cá tra 2.2.1. Vi khuẩn Edwardsiella spp. 2.2.1.1. Phân loại Phân loại khoa học, Edwardsiella thuộc: Ngành: Proteobacteria. Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Edwardsiella thường gặp hai loài gây bệnh là: E.tarda và E.ictaluri. E.tarda là tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn ở cá nước ấm, đặc biệt là cá da trơn. E. ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội tạng gan, thận, tụy của cá không vảy, gây bệnh nhiễm trùng đường ruột trên cá da trơn ở Mỹ, là tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra ở Việt Nam. Edwardsiella thường gây bệnh ở động vật máu lạnh: rắn, cá sấu, cá và một số động vật thủy sản khác. Ở Việt Nam đã phân lập được E.tarda từ cá trê giống; E.ictaluri từ cá tra, cá basa . Bệnh gây thiệt hại trong các ao nuôi cá hương (cỡ từ 4-6cm) đến 5-6 tháng tuổi, ít xuất hiện hơn ở cá có kích cỡ trên 15cm, tỷ lệ tử vong của cá từ 60-70%, có trường hợp tới 100%. Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào mùa xuân, mùa thu và trong ao nuôi mật độ cao, nuôi cá lồng bè. A B Hình 2.2: Vi khuẩn E.ictaluri (hình A) và cá tra bị bệnh do nhiễm Edwardsiella (hình B) 5
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.2.1.2. Đặc điểm sinh hóa Theo Hawke và ctv. (1981) Edwardsiella ictaluri, là loài thuộc Enterobacteriacea, Gram âm, hình que, ngắn, kích thước 0.75x1.5-2.5μm. Di động yếu ở 25-300C, không di động khi nhiệt độ cao hơn, catalase dương tính, cytochrome oxidase âm tính và lên men glucose (Shott, 1989). Không sinh ra H2S và Indole âm tính. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển chậm trên môi trường BHI (36-48 giờ tại 28-300C). Ở Việt Nam, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh chủ yếu trên cá tra (ở tất cả các giai đoạn phát triển). Tỷ lệ hao hụt lớn trên cá tra giống, nhưng gây thiệt hại về kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g ( Thanh Dung và ctv., 2004). Theo Ferguson và ctv (2001), bệnh này được ghi nhận xuất hiện ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 và có tên là BNP (Bacilliaty Necrosis of Pangaius). Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đã được phân lập trên cá tra nuôi bè ở Việt Nam, với dấu hiệu có nhiều nốt trắng trên gan (Thanh Dung và ctv., 2005) 2.2.2. Bệnh gan thận mủ trên cá tra 2.2.2.1. Lịch sử phát hiện Bệnh gan thận mủ trên cá tra xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm 1998, tác nhân gây bệnh lúc đầu được xác định bởi nhóm nghiên cứu của trường Đại học Stirling phối hợp với trường Đại học Cần Thơ là Bacillus sp. (Ferguson và ctv., 2001). Đến năm 2002 nhóm nghiên cứu này đã đính chính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv., 2002). E. ictaluri được báo cáo đầu tiên trên cá nheo Mỹ, Ictalurus punctatus (Hawke, 1979). E. ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá da trơn, hội chứng này được gọi tắt là ESC (Enteric Septicaemia of Catfish) và có thể dẫn đến tỉ lệ chết cao ở cá nheo Mỹ (Austin và Austin, 1999). Bệnh này được tìm thấy tại bất cứ nơi nào nuôi cá nheo tại nước Mỹ. Bệnh xảy ra ở tất cả các kích cỡ cá nuôi nhưng tập trung ở giai đoạn cá hương và cá giống 6
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt (USDA/APHIS, 2003). Bệnh xảy ra theo mùa, đặc biệt xảy ra thường xuyên khi nhiệt độ nước nằm trong khoảng 20 – 29oC (Tucker và ctv., 2004). Cá bị bệnh ESC thường giảm ăn, lờ đờ, bơi dạng xoay vòng, xuất huyết xung quanh vùng miệng và phần bụng. Nhiều vết lở loét nhỏ màu trắng có thể xuất hiện trên bề mặt da. Cá nhiễm bệnh thường lồi mắt và bụng trương to. Bệnh do vi khuẩn t Bệnh xuất huyết: ị Aeromonas hydrophila, ng và th ng và Clostridium botulinum, ố Pseudomonas spp., Edwardsiella tarda: mass mortality: 70-80% cá tra gi tra cá ở p ặ Edwardsiella ichtaluri gây bệnh g ng gan thận mủ ờ Tỉ lệ chết cao: 80-100% nh thư nh ệ Bệnh do ký sinh trùng: Các b Các Cryptobia spp., Ichthyophthyrius multifiliis, Trichodina, Epistylis. tỉ lệ chết: 15-20% Hình 2.3: Các bệnh thường xuyên xuất hiện trên cá tra qua các giai đoạn nuôi (Lý Thị Thanh Loan và ctv., 2007). 2.2.2.2. Dấu hiệu bệnh lý Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da (phía mặt lưng), đường kính khoảng 3- 5mm. Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng bên trong cơ và làm cho da bị mất sắc tố. Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do vây đuôi bị rách, gẫy. Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, khi ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi. Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng cơ xung quanh. Bệnh xuất hiện khi 7
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt chất lượng nước trong môi trường nuôi xấu, nuôi với mật độ dày. Nhiệt độ thích hợp để phát triển khoảng 300C. 2.2.2.3. Một số nghiên cứu về biện pháp phòng bệnh gan thận mủ Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới trong lĩnh vực sản xuất vaccine phòng bệnh do E. ictaluri gây ra trên cá da trơn. Shoemaker và ctv. (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của ba loại vaccine sống cải tiến dưới dạng đông khô (Immuno X+5, Immuno2 X+5, Serial 1A) và một loại vaccine sống truyền thống (RE-33). Cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm ở các ngày tuổi khác nhau (từ 7 ngày tuổi đến 31 ngày tuổi). Kết quả cho thấy hiệu lực của vaccine đã thể hiện được ngay từ khi cá được gây miễn dịch ở giai đoạn 7 ngày tuổi và 10 ngày tuổi. Tỉ lệ sống của cá 7 ngày tuổi được gây miễn dịch dao động trong khoảng 58,4 – 77,5%, đối với cá 10 ngày tuổi thì dao động trong khoảng 64,1 – 78,9%. Ba năm sau đó, nhóm tác giả này cũng đã nghiên cứu phương pháp in vivo đối với việc sử dụng các loại vaccine sống cải tiến này, khi gây miễn dịch từ giai đoạn trứng của cá nheo Mỹ, bằng phương pháp ngâm trong thời gian 10 phút. Kết quả cho thấy phương pháp gây miễn dịch này là khá hiệu quả, với tỉ lệ bảo hộ khoảng 59,7% (Shoemaker và ctv., 2002). Trong những năm gần đây, một số nhóm nghiên cứu đã quan tâm đến việc phát triển các chế phẩm vi sinh (probiotic) và một số chế phẩm sinh học khác bổ sung vào thức ăn để phòng bệnh E. ictaluri ở cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus). Shelby và ctv. (2007) bổ sung hai loại chế phẩm vi sinh có chứa Pediococcus sp. và Enterococcus sp. (riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau) vào thức ăn của cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) giống và cho ăn trong vòng 5-8 tuần. Sau đó tiến hành đo các chỉ tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) và các thông số miễn dịch như protein huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement. Các số liệu về vi sinh cho thấy hai chủng vi khuẩn probiotic vẫn tồn tại được trong thức ăn sau khi bổ sung trong thời gian bảo quản khoảng 4 tuần. Tuy nhiên các tác giả không tìm thấy sự khác biệt nào về 8
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt tăng trọng, đáp ứng miễn dịch cũng như tính kháng bệnh của cá sau thời gian cho ăn thức ăn có bổ sung probiotic. Aboagye và ctv. (2008) thử nghiệm ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh Lymnozyme đến tỉ lệ sống của cá nheo Mỹ sau khi được gây nhiễm thực nghiệm với Edwardsiella ictaluri. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nghiệm thức có bổ sung Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục trong hai tuần, tỉ lệ chết của cá sau khi gây nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm một cách có ý nghĩa thống kê (p = 0,002) so với nghiệm thức đối chứng (80%). Các nhà khoa học Nauy và Mỹ đã nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của hai lọai peptide tổng hợp cecropin B và cecropin P1 đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá, trong đó có E. ictaluri (Kjuul và ctv., 1999). Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cecropin B dao động từ 0,3-1,3 µm. Các dẫn xuất của cecropin B đã được biết đến có họat tính kháng khuẩn đối với nhiều loài vi khuẩn gây bệnh, và có khả năng tăng cường tính đề kháng của cá nheo Mỹ gây cảm nhiễm với E. ictaluri (Kelly và ctv., 1993). Prebiotic là những hợp chất bổ sung vào thức ăn, có tác dụng kích thích sinh trưởng và hoạt tính của hệ vi khuẩn có lợi hiện diện trong hệ tiêu hóa của vật chủ (Delzenne & Roberfroid, 1994). Prebiotic thường được sử dụng kết hợp với probiotic (gọi là synbiotic). Các hợp chất đường mạch ngắn đang được sử dụng phổ biến như là prebiotic bổ sung vào thức ăn thủy sản, trong số đó bao gồm: Inulin, fructose- oligosaccharide, transgalacto-oligosaccharide, lactulose (Mahious, 2005), isomalto- oligosaccharide (Li và ctv., 2009). Hiệu quả về dinh dưỡng và sức khỏe của một số oligosaccharide đã được chứng minh trên cá (Glencross và ctv., 2003; Li & Gatlin, 2005; Pryor và ctv., 2003). Isomalto-oligosaccharide ở nồng độ 0,2% sử dụng kết hợp với vi khuẩn probiotic Bacillus OJ (108 cfu/g thức ăn) bổ sung vào thức ăn cho tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) đã giúp điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường phản ứng miễn dịch và khả năng đề kháng đối với virus đốm trắng, thông qua 9
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt hiệu ứng tương hỗ của hai loại chế phẩm này (Li và ctv., 2009). Mannan-oligosaccharide (MOS), một loại prebiotic chiết xuất từ nấm men, đã được chứng minh là có hiệu quả tăng cường đáp ứng miễn dịch và tính đối kháng đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus (Welker và ctv., 2007). 2.3. Tổng quan về probiotic trong nuôi trồng thủy sản 2.3.1. Định nghĩa probiotic Thuật ngữ probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy lạp “probios” có nghĩa là “cho sự sống”. Qua thời gian cùng với sự phát triển của khoa học và sự hiểu biết của nhân loại thuật ngữ này được định nghĩa nhiều lần. Vào năm 1965, Lilly và Still đã định nghĩa probiotic là những nhân tố thúc đẩy sự phát triển được sản xuất bởi vi sinh vật. Vào năm 1974, Parker đã định nghĩa probiotic dựa trên mối quan hệ giữa vi sinh với vật chủ “probiotic là những sinh vật và những cơ chất có lợi cho động vật có khả năng cải thiện hệ vi sinh đường ruột”. Đến năm 1989, Fuller đã mở rộng định nghĩa về probiotic: “probiotic là sinh vật sống được cung cấp dưới dạng thức ăn cho động vật nhằm cải thiện cân bằng hệ sinh vật đường ruột”. Havenaar và Huis Int Veld (1992) định nghĩa “probiotic là một chủng hay một hỗn hợp vi sinh vật sống, cung cấp cho người hoặc động vật, có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện đặc tính hệ vi sinh vật bản địa”. Gatesoup (1999) định nghĩa “probiotic là những sinh vật sống cung cấp dưới dạng thức ăn nhằm cải thiện sức khỏe cho vật chủ”. FAO/WHO (2002), Reid và cộng sự (2003) lại định nghĩa “probiotic là những vi sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ” Vào năm 2003, Jean Fioramonti và cộng sự đã định nghĩa probiotic một cách ngắn gọn nhưng đầy xúc tích: “probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật ảnh hưởng có lợi lên sức khỏe và tốt cho vật chủ”. 10
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Trước đây, probiotic thường được ứng dụng cho con người và động vật trên cạn, vì vậy thuật ngữ probiotic thường được ngụ ý là những vi khuẩn gram dương chủ yếu là Lactobacillus và dần dần các sinh vật được áp dụng làm probiotic ngày càng nhiều gồm cả vi khuẩn gram âm, gram dương, bacteriophage, nấm men và tảo đơn bào, phạm vi sử dụng rộng hơn, ngoài con người và động vật trên cạn, probiotic ngày nay được ứng dụng trên cả đối tượng động vật thủy sản. Khác với người và động vật trên cạn, động vật thủy sản được bao bọc bởi môi trường nước và ở đó các tác nhân gây bệnh tồn tại một cách độc lập với vật chủ. Những vi sinh vật gây bệnh được hấp thụ liên tục bởi vật chủ thông qua quá trình tiêu thụ thức ăn, động vật thủy sản tiêu hóa một lượng lớn vi khuẩn từ môi trường nước, kết quả của mối tương tác tự nhiên giữa khu hệ vi sinh trong môi trường và đối tượng thủy sản. Trong nuôi trồng thủy sản mối tương tác giữa probiotic và vật chủ không chỉ giới hạn trong đường ruột của vật chủ, probiotic còn có thể hoạt động trên mang, da và cả môi trường nước xung quanh vật chủ. Do vậy, Verschuere và cộng sự (2000) đã đề xuất một định nghĩa mới cho phép mở rộng ứng dụng của thuật ngữ probiotic trong nuôi trồng thủy sản “probiotic là hỗn hợp vi sinh vật sống được thêm vào có lợi cho vật chủ bằng cách thay đổi các nhân tố liên quan đến vật chủ hoặc quần xã vi sinh vật xung quanh, cải thiện khả năng sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng cường chống chịu bệnh, cải thiện chất lượng môi trường sống của vật chủ”. 2.3.2. Đặc điểm chung của probiotic Có khả năng sống sót trong môi trường acid dạ dày, tồn tại tạm thời hoặc hình thành khuẩn lạc trong ruột non. Không gây hại cho vật chủ. Probiotic phải tới đúng vị trí cần tác động trong cơ thể vật chủ. Biểu hiện có lợi đối với vật chủ (cạnh tranh đối kháng với các sinh vật gây bệnh, sinh các enzyme hoặc các chế phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng được). 11
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Không chứa gen gây độc hoặc gen kháng kháng sinh 2.3.3. Các cơ chế tác động của probiotic Gia tăng khả năng bám hoặc đối kháng trực tiếp, những ảnh hưởng có hại của tác nhân gây bệnh là những yếu tố quan trọng của probiotic để làm giảm tính gây độc trong suốt quá trình nhiễm bệnh. Các chủng probiotic phải có đặc tính kháng lại vi khuẩn gây bệnh ở điều kiện in vitro lẫn in vivo thông qua một số cơ chế khác nhau. Đa số các nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong thập niên qua, trong đó có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic. Nhìn chung, probiotic có các cơ chế tác động sau: 2.3.3.1. Sản sinh ra các hợp chất ức chế Kháng khuẩn là một hiện tượng phổ biến trong tự nhiên. Vì vậy, sự tương tác giữa các vi sinh vật đóng vai trò quan trọng đảm bảo trạng thái cân bằng giữa vi sinh vật hữu ích và những vi sinh vật gây bệnh. Những loài vi khuẩn khác nhau có thể giải phóng ra một số hợp chất hóa học có khả năng tiêu diệt hoặc kiềm hãm các vi khuẩn khác để đấu tranh giành lấy năng lượng hay các chất hóa học (Fredrickson và Stephanopoulos, 1981). Những hợp chất này bao gồm: bacteriocin, siderphore, lysozyme, protease, hydrogen peroxide và các acid hữu cơ. Vi khuẩn sinh acid lactic tạo hợp chất bacteriocin giúp ức chế các vi khuẩn khác. Có rất nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của một số chủng vi khuẩn được chọn lựa bổ sung vào môi trường ương nuôi ấu trùng. Gaixa (1889) đã có báo cáo đầu tiên về sự tồn tại của vi khuẩn trong nước biển có khả năng ức chế Vibrio sp. Sau đó, Rosenfeld và Zobell (1947) mô tả một nghiên cứu sản sinh chất ức chế vi sinh vật biển và kể từ đó nhiều nghiên cứu tiếp theo, theo hướng sử dụng vi sinh vật như một tác nhân kiểm soát sinh học. Nogami và Maeda (1992), Nogami và ctv (1997) đã chứng minh vi khuẩn Thalasobacter utilis ức chế vi khuẩn Vibrio anguillarum, do đó làm gia tăng khả năng sống sót của ấu trùng cua xanh Portunus trituberculatus, đồng thời cũng làm giảm số lượng Vibrio trong nước ương ấu 12
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt trùng. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng này ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn V. angillarum trên cá bơn trưởng thành Scophthalmus maximus và Limanda limanda. Sử dụng V. alginolyticus như một probiotic đã được đề cập để tăng cường khả năng sống sót và phát triển của ấu trùng tôm chân trắng Litopenaeus vannamei ở các trại nuôi ở Ecuador. Gần đây một chủng vi khuẩn nước mặn, Pseudomonas I2 được phân lập từ cửa sông, có khả năng sinh hợp chất ức chế lại Vibrio gây bệnh trên tôm. Hợp chất kháng khuẩn này được chứng minh có khối lượng phân tử thấp, bền nhiệt, tan trong chloroform, và kháng được sự thủy giải của các ezyme (Chythanya và cộng sự, 2002). 2.3.3.2. Cạnh tranh chất dinh dưỡng hay năng lượng sẵn có Đấu tranh giành lấy các chất dinh dưỡng hay năng lượng có sẵn có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột hay trong môi trường nuôi thủy sản. Minh chứng điển hình cho tác động này là những vi khuẩn có khả năng sinh siderophore. Tất cả vi khuẩn đều cần sắt để tăng trưởng, siderophore là chất có trọng lượng phân tử thấp, có khả năng gắn với ion sắt. Siderophore có thể hòa tan sắt kết tủa thành dạng dễ sử dụng, do đó nó là một công cụ thu lượm sắt hiệu quả. Các chủng vi khuẩn vô hại có thể sản xuất siderophore được sử dụng như probiotic để cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh khi tính gây bệnh có liên quan đến việc sản xuất siderophore và đấu tranh giành lấy phân tử sắt trong môi trường thiếu sắt ở giai đoạn cần thiết (Verchuere và ctv., 2000). Chủng Vibrio E có thể cải thiện khả năng đề kháng đối với vi khuẩn gây bệnh Vibrio P, Vibrio splendidus ở ấu trùng cá bơn. Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng, Vibrio E có thể phát triển trong môi trường đã bị tách hết sắt trong khi Vibrio P thì không. Hơn nữa, cá bơn bột được cho ăn rotifer được làm giàu chất siderophore deferoxamine của Vibrio E đã đạt được tỉ lệ sống cao hơn sau khi gây nhiễm với Vibrio P, so với lô đối chứng (Gatesoupe, 1997). Từ những kết quả có liên quan trong các thí nghiệm in vitro và in vivo, các nhà khoa học đã kết 13
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt luận rằng hiệu quả probiotic của Vibrio E có thể một phần là do sự đấu tranh giành lấy phân tử sắt với tác nhân gây bệnh. 2.3.3.3. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại Khả năng hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic trong biểu mô ruột và trong lớp nhầy đường ruột vật chủ là cơ chế bảo vệ vật chủ chống lại tác nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh các thụ quan bám dính, dinh dưỡng và không gian, oxy và sự sản sinh các cơ chất kháng khuẩn. Một số cơ chế liên quan đến sự bám dính của vi sinh vật lên tế bào biểu mô ruột bao gồm: Liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, vị trí gắn dựa trên các cấu trúc chuyên biệt. Những đặc tính này là một thế mạnh cạnh tranh quan trọng giúp duy trì vi khuẩn trong đường ruột động vật. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành khuẩn lạc của vi sinh vật có thể phụ thuộc vào: Mối quan hệ với vật chủ như: nhiệt độ cơ thể, enzyme, đặc tính do kháng di truyền. Ví dụ, vi khuẩn có thể theo nguồn nước và thực phẩm đến miệng và đóng góp vào quá trình dinh dưỡng, ở đó một số chủng được giữ lại trở thành quần cư của vi khuẩn đường ruột. Những chủng còn lại bị tiêu diệt thông qua quá trình tiêu hoá và bị loại thải thông qua quá trình bài tiết. Ngoài ra, sự sinh trưởng của vi khuẩn trong đường ruột còn có thể bị ức chế do hợp chất kháng khuẩn tiết ra từ vật chủ. Các yếu tố có mối quan hệ với vi sinh vật như: ảnh hưởng của các hợp chất kháng khuẩn, protease, bacteriocin, hydrogen peroxide, sự hình thành NH3, diacetyl, và sự biến đổi pH do sản sinh các acid hữu cơ. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chủng Lactobacillus plantarum có khả năng bám dính và hình thành màng nhầy bên trong đường ruột, chủng này sử dụng vị trí gắn chuyên biệt là manose để cạnh tranh vị trí gắn với các chủng gram âm gây bệnh trên lớp nhầy đường ruột của cá. Ngoài ra, sự hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic đóng vai trò quan trọng trong điều hòa và kích thích hệ thống miễn dịch của tế bào chủ. 14
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.3.3.4. Đóng góp về mặt dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vi sinh vật ảnh hưởng có lợi cho quá trình tiêu hóa của động vật thủy sản: khử độc các hợp chất độc hại trong thức ăn, phân hủy các hợp chất khó tiêu như chitin, cellulose trong thức ăn nhờ các enzyme thủy giải (cellulase, amylase ). Ngoài ra probiotic còn cung cấp vitamin (biotin và vitamin B12), carotenoid, protein, acid béo chuỗi ngắn và chuỗi acid béo không bão hòa (PUFAs-polyunsaturated fatty acids) như eicosapentaenoic acid (EPA) và docosahexaenoic acid (DHA) cần thiết cho sự sinh trưởng của cá. Ở mức độ in vivo, có nhiều báo cáo cho rằng khi cho cá ăn probiotic ở nồng độ từ 103-1012 cfu/g trong thời gian từ 30-90 ngày có thể gia tăng tỷ lệ sống sót, tăng trọng, giảm hệ số chuyển đổi thức ăn. Ở cá, có báo cáo cho rằng Bacteroides và Clostridium đã đóng góp về mặt dinh dưỡng cho vật chủ đặc biệt là cung cấp acid béo và vitamin. Một số vi sinh vật như Agrobacterium sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., Microbacterium sp., và Staphylococcus sp có thể đóng góp vào quá trình tiêu hóa ở cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvelinus alpinus L.). Một số chủng Bacillus (Bacillus licheniformis, B. subtilis, B. polymixa, B. laterosporus và B. circulans) thúc đẩy tăng trưởng của ấu trùng cá tầm Acipenser nudiventris: tăng chiều dài và khối lượng, tăng hệ số chuyển đổi thức ăn, tăng hệ số tăng trưởng đặc hiệu (Specific Growth Rate). Ngoài ra một số vi khuẩn còn tham gia vào quá trình tiêu hóa của những loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng cách sản sinh các enzyme ngoại bào như protease, lipase, đồng thời cung cấp các nhân tố dinh dưỡng cần thiết. Những nghiên cứu tương tự cho thấy hệ vi sinh vật khu trú ở tôm Penaeus chinensis bổ sung nguồn enzyme tiêu hóa và các hợp chất đồng hóa tương tự như ở động vật. 2.3.3.5. Cải thiện chất lượng nước Chất lượng nước đã được cải thiện nhờ bổ sung các chủng probiotic đặc biệt là các chủng Bacillus sp. Các chủng Gram dương chuyển đổi các hợp chất hữu cơ thành 15
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CO2 tốt hơn các chủng gram âm. Có báo cáo cho rằng việc sử dụng các chủng Bacillus sp. cải thiện chất lượng nước, tăng khả năng sống và tăng tốc độ phát triển của Penaeus monodon và làm giảm tác nhân gây bệnh Vibrio. Việc xử lý nước nuôi thủy sản bằng probiotic đã cho thấy tác dụng giảm được chất hữu cơ trong nước ao nuôi thủy sản, giảm hàm lượng BOD và giảm độc tố do amoni, nitrite và hydro sulfua, khống chế được vi khuẩn gây bệnh, tăng năng suất tôm cá. 2.3.3.6. Tăng cường đáp ứng miễn dịch Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi probiotic, quá trình hình thành khuẩn lạc và sự bám dính của probiotic trong ruột cá là điều kiện cần thiết để tăng cường đáp ứng miễn dịch thông qua liên kết giữa các kiểu phân tử liên quan đến vi khuẩn- BAMPs (bacteria associated molecular patterns) có tính bảo tồn cao và các thụ thể chyên biệt trên bề mặt của tế bào biểu mô ruột. Một số nghiên cứu đã chứng minh Clostridium butyricum giúp gia tăng khả năng kháng Vibrio của cá hồi và gia tăng hoạt tính thực bào của bạch cầu. Rengpipat và ctv (2000) cho rằng sử dụng Bacillus sp. (chủng S11) đã bảo vệ tôm sú Penaeus monodon khỏi tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ thống miễn dịch dịch thể ở tôm. Balca´zar (2003) chứng minh sử dụng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp và Vibrio sp ảnh hưởng tốt tới sự phát triển và khả năng sống sót của ấu trùng tôm thẻ chân trắng đồng thời bảo vệ chống lại Vibrio harveyi và virus gây hội chứng đốm trắng. Sự bảo vệ này xuất phát từ sự kích thích hệ thống miễn dịch bằng việc gia tăng thực bào và hoạt động kháng khuẩn. Ngoài ra, nhiều tác giả chứng minh sử dụng vi khuẩn lactic Lactobacillus rhamnosus (chủng ATCC 53103) ở hàm lượng 105 cfu/g, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, L. sakei kích thích miễn dịch ở cá hồi Oncorhynchus mykiss bằng cách thúc đẩy hoạt tính thực bào, sản sinh superoxide, lyzozyme, tăng cường hoạt tính bổ trợ (ACH50). 16
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.3.3.7. Tác động kháng virus Một số vi khuẩn được sử dụng như probiotic có tác dụng kháng virus, mặc dù cơ chế này vẫn chưa được hiểu chính xác. Việc kiểm tra trong phòng thí nghiệm chỉ ra có sự bất hoạt virus nhờ các hợp chất hóa học và hợp chất sinh học như là dịch chiết từ tảo biển và dịch chiết ngoại bào từ vi khuẩn. Kamei và ctv (1988) báo cáo cho rằng các chủng Pseudomonas sp, Vibrios sp, Aeromonas sp và nhóm Coryneform phân lập từ các trại ấp trứng cá hồi có hoạt tính kháng virus IHHNV (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus). Direkbusarakom và ctv (1998) phân lập được hai chủng Vibrio sp. là NICA 1030 và NICA 1031 có hoạt tính kháng IHHNV và Oncorhynchus masou virus (OMV) với tỷ lệ giảm hai virus trên lần lượt từ 62% và 99%. 2.3.4. Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản Khi đưa probiotic vào môi trường nước ao, các vi sinh vật sẽ sinh sôi và phát triển rất nhanh trong môi trường nước. Sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi sẽ có các tác dụng sau đây trong các ao hồ nuôi thủy sản: Phân hủy các chất hữu cơ trong nước, hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy. Giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH3, H2S phát sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước. Giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, do đó sẽ giảm chi phí thay nước. Nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (kích thích hệ miễn dịch không đặc hiệu ở tôm, cá). Ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại). Trong 17
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt môi trường nước, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế được sự phát triển của mầm bệnh. Ngoài ra, một số probiotic còn được sử dụng bằng cách trộn vào thức ăn để nâng cao khả năng hấp thu của tôm cá, làm giảm hệ số thức ăn và phòng chống các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cho tôm cá. Vì vậy, sử dụng probiotic sẽ có ý nghĩa nhiều mặt trong việc nâng cao hiệu quả kinh tế cho các mô hình nuôi thủy sản như: Làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn (giảm hệ số thức ăn). Tôm cá mau lớn, rút ngắn thời gian nuôi. Tăng tỷ lệ sống và tăng năng suất do tôm cá nuôi ít bị hao hụt. Giảm chi phí thay nước. Giảm chi phí sử dụng kháng sinh và hóa chất trong điều trị bệnh 2.3.5. Giới thiệu về quorum sensing và khả năng bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản 2.3.5.1. Định nghĩa quorum sensing Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau bằng cách sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học. Chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này. Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm sóat việc biểu thị gen đối với sự thay đổi về mật độ tế bào. Quá trình này được gọi là quorum sensing. Nhiều kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học . Trong thế giới vi sinh vật tồn tại cả hai lọai ngôn ngữ quorum sensing, ngôn ngữ phổ biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một loài và giữa các loài. Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm được điều khiển bởi phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL). Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình 18
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide có chiều dài 5 đến 17 amino acid Quá trình giao tiếp thông qua hệ thống tín hiệu protein I /protein R được xem như là cơ chế chuẩn được các vi khuẩn Gram âm sử dụng để thông tin liên lạc với nhau. Hệ thống quorum sensing kiểu này được sử dụng để kiểm soát việc biểu hiện gen ở trên 25 loài vi khuẩn Gram âm. Trong mọi trường hợp, AHL là một loại phân tử tín hiệu mà việc tổng hợp phụ thuộc vào protein I. Một protein khác (protein R) chịu trách nhiệm việc nhận biết phân tử tín hiệu AHL và sau đó là quá trình hoạt hóa việc phiên mã của một số gen đích. Phân tử tín hiệu AHL đã được chứng minh là có liên quan đến quá trình quorum sensing ở nhiều tác nhân gây bệnh ở người và thực vật như Pseudomonas aeruginosa (Rumbaugh và ctv., 2000), Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens (Whitehead và ctv., 2001), cũng như ở Vibrio harveyi (Manefield và ctv., 2000) và những loài vi khuẩn gây bệnh khác trong nuôi trồng thủy sản (Bruhn và ctv., 2005). 2.3.5.2. Hệ thống quorum sensing của vi khuẩn Edwardsiella spp. Hệ thống quorum sensing gần đây cũng được phát hiện ở nhóm vi khuẩn gây bệnh quan trọng trên cá (Edwardsiella spp.). Han và ctv. (2010) xác định có bốn loại phân tử tín hiệu AHL (BHL, HHL, 3-oxo-HHL và một phân tử AHL chưa xác định được) liên quan đến độc lực của Edwardsiella tarda, tác nhân gây bệnh trên các loài cá nước ngọt và nước mặn như lươn, cá nheo Mỹ, cá đối, cá tráp, cá rô phi, ca bơn. Gần đây, nhóm nghiên cứu trên lại xác định bốn loại phân tử tín hiệu AHL nói trên cũng tồn tại ở Edwardsiella ictaluri, vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) và bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở Việt Nam 19
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.3.5.3. Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh Hình 2.4: Một số phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Có hai chiến lược chủ yếu trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn, hoặc giết chết vi khuẩn gây bệnh, hoặc làm suy giảm độc lực của nó để sau đó mầm bệnh không thể thích nghi với môi trường bên trong vật chủ hoặc dễ dàng bị đào thải bởi hệ miễn dịch tự nhiên của vật chủ. Việc phát hiện ra hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn, có chức năng gắn liền với việc sản xuất ra các hợp chất trao đổi chất thứ cấp và những yếu tố liên quan đến độc lực, là tiền đề cho cách tiếp cận thứ hai. Việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh đã được đề nghị như là cách tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn. Một số phương pháp bẻ gãy hệ thống quorum sensing đã được nghiên cứu, bao gồm (Hình 2.4) : (1) Ức chế quá trình sinh tổng hợp phân tử tín hiệu quorum sensing (2) Ứng dụng các hợp chất đối kháng quorum sensing (3) Ức chế bằng hóa học đối với phân tử tín hiệu quorum sensing (4) Phân hủy sinh học bằng các enzyme của vi khuẩn. 20
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Một số báo cáo liên quan đến việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở các vi khuẩn gây bệnh trong nước, cùng với những kết quả đạt được đối với vi khuẩn gây bệnh ở người và thực vật, đã chỉ ra rằng phương pháp tiếp cận mới này có nhiều tiềm năng trong việc kiểm soát bệnh trong nuôi trồng thủy sản 2.3.5.4. Quá trình phân hủy sinh học bằng enzyme đối với phân tử tín hiệu quorum sensing Khả năng phân hủy phân tử AHL phân bố rộng rãi trong giới vi khuẩn. Những enzyme có thể phân hủy phân tử AHL đã được phát hiện ở nhiều lòai vi khuẩn thuộc nhóm β-Proteobacteria (Zhang và ctv., 2002), α- Proteobacteria (Uroz và ctv., 2003) và γ- Proteobacteria cũng như ở một số lòai thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (Dong và ctv., 2002). Những loài vi khuẩn thuộc các nhóm này có khả năng khóa hệ thống quorum sensing của những lòai vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc. Quá trình bẻ gãy các phân tử tín hiệu AHL có thể được xúc tác bởi hai lọai enzyme: AHL- acylase và AHL-lactonase (Hình 2.5). Hình 2.5: Quá trình bẻ gãy phân tử AHL bằng enzyme. Enzyme AHL-acylase có khả năng bẻ gãy mạch cacbon, phân hủy AHL thành acid béo và homoserine lactone (Dong và ctv., 2001; Lee và ctv., 2002; Wang và ctv., 2004), tuy nhiên không làm thay đổi nhiều đến cấu trúc của phân tử AHL. Trong khi đó enzyme AHL-lactonase, điều khiển bởi gen aiiA, có khả năng phân hủy phân tử 21
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt AHL bằng cách xúc tác phản ứng mở vòng lactone. Điều này dẫn đến sự thay đổi về cấu trúc hình thể tương đối của phân tử AHL, gây trở ngại cho việc gắn kết của phân tử AHL với protein điều tiết việc phiên mã protein R, vì vậy một số kiểu hình (trong đó có yếu tố độc lực ở vi khuẩn gây bệnh) không thể được biểu hiện. Gen aiiA đầu tiên được tìm thấy ở chủng vi khuẩn Gram dương Bacillus sp. 240B1 (Dong và ctv., 2000). Các dạng tương đồng của gen aiiA sau đó được tìm thấy ở nhiều lòai Bacillus khác, bao gồm Bacillus thuringiensis, B. cereus, B. anthracis, B. mycoides và B. subtilis (Dong và ctv., 2002; Lee và ctv., 2002; Uroz và ctv., 2003; Wang và ctv., 2004; Dong & Zhang, 2005; Pan và ctv., 2008). Các gen này có độ tương đồng cao (89 – 96%) so với gen aiiA của chủng 240B1. Gần đây, Yin và ctv. (2010) đã phân lập được gen aiiA từ ADN của Bacillus amyloliquefaciens, một lòai gần gũi với B. subtilis. Gen này có độ tương đồng 87 – 99,3% so với các dạng tương đồng ở các lòai Bacillus khác, trong khi trình tự acid amin của AHL-lactonase có độ tương đồng 89,6 – 99,6%. Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng gen aiiA tái tổ hợp như là một biện pháp kiểm soát sinh học đối với các bệnh trên cây trồng có liên quan đến việc tiết ra phân tử tín hiệu AHL. Báo cáo đầu tiên được ghi nhận trong nghiên cứu của Dong và ctv. (2000). Trong nghiên cứu này, gen aiiA được gắn vào plasmid của chủng Erwinia carotovora SCG1, vi khuẩn gây bệnh thối rễ ở bắp cải Trung Quốc. Kết quả cho thấy sự biểu hiện của enzyme AHL lactonase làm giảm mạnh tín hiệu AHL ở Erwinia carotovora SCG1, từ đó làm giảm độc lực của chủng vi khuẩn này. Một nghiên cứu khác năm 2004 của cùng nhóm tác giả khẳng định, B. thuringiensis chỉ bẻ gãy phân tử tín hiệu AHL tiết ra bởi Erwinia carotovora mà không làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng bình thường khi hai lòai được nuôi chung với nhau. Khi gen aiiA bị đột biến, B. thuringiensis bị mất khả năng kiểm sóat tác nhân gây bệnh (Dong và ctv., 2004; Zhou và ctv., 2006). Bên cạnh đó, Dong và ctv. (2001) tiến hành tái tổ hợp gen aiiA vào trong bộ gen của cây thuốc lá và cây khoai tây. Hoạt tính của enzyme AHL- lactonase được phát hiện trong cả hai loại cây được tái tổ hợp. Điều này giúp cho 22
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt chúng tăng sức đề kháng đối với bệnh thối rễ do E. carotovora. Tiếp tục phương pháp tiếp cận của Dong và ctv., Ban và ctv. (2009) tổng hợp được gen aiiA và sau đó gắn nó vào trong bộ gen của cây thảo dược Amorphallus konjac, điều này cũng giúp cho loài cây này tăng sức đề kháng bệnh thối rễ do E. carotovora. 2.4. Khái quát về Bacillus 2.4.1. Đặc điểm chung của chi Bacillus Theo Bergey/s Manual of Systematic Bacteriology, Bacillus được phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Chi Bacillus bao gồm 51 loài đã được xác định chính xác và nhiều loài khác chưa được phân loại rõ ràng. Bacillus có mặt rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt trong đất, không khí, nước, trên cơ thể thực vật, bụi cỏ khô và rơm rạ, hầu hết là các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí, tạo nội bào tử, các tế bào tồn tại riêng lẽ hay dính nhau thành chuỗi ngắn. Nội bào tử được miêu tả đầu tiên bởi Cohn khi nghiên cứu về B. subtilis và sau đó là Koch trong các nghiên cứu về các loài gây bệnh như B. anthracis vào năm 1976. Tuy nhiên, cũng có một số loài Bacillus không tạo bào tử như B. thermoamylovorans (Combet- Blanc và ctv.,1995), B. halodenitrificans (Denariaz và ctv.,1989), một số khác có Gram âm hay Cram dương yếu như B. thermosphaericus ( Andersson và ctv., 1995), B. horti (Yumoto ctv., 1998), B. oleronius (Kuhnigk ctv., 1995), B. azotoformans (Pichinoty ctv., 1983). Thêm vào đó, khi phân loại dựa vào giải 23
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt trình tự RNA/ DNA, dạng vi khuẩn không tạo bào tử, kỵ khí bắt buộc cũng thuộc nhóm Bacillus như B. infernus (Boone và ctv., 1995). Phản ứng Gram của Bacillus có thể thay đổi theo chu trình sống của nó, chỉ các tế bào trẻ mới chắc chắn Gram dương. Wiegel (1981) đã cho thấy rằng dưới kính hiển vi, cấu trúc của vách tế bào, không hoàn toàn giống nhau như phản ứng nhuộm Gram. Tức là, vách tế bào của một sinh vật nhuộm ra Gram âm, có thể có cấu trúc Gram dương thật sự. Một vách tế bào có cấu trúc Gram âm sẽ luôn luôn nhuộm ra Gram âm. Tuy nhiên, một vách tế bào có cấu trúc Gram dương, có thể nhuộm ra Gram âm hoặc dương dưới một số điều kiện nhất định. Tế bào sinh dưỡng Bacillus thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước từ 0,5 – 1,2x 2,5- 10 µm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài. Đối với Bacillus có nội bào tử thì bào tử hình trụ, oval, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục. Tùy theo loài, bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc ở cuối, và túi bào tử phồng hoặc không phồng . Dưới - một số điều kiện đặc biệt (có HCO3 trong bình kỵ khí hoặc môi trường CO2), B. anthracis, B. subtilis, B. licheniformis và B. megaterium tạo ra một vỏ polypeptide ( poly- γ- D- glutamic acid) nhìn thấy được khi nhuộm tế bào với polychrome methylene blue. Trừ B. anthracis và B. mycoides, hầu hết các loài Bacillus đều di động, mặc dù có sự khác biệt rất lớn về khả năng di động trong mỗi loài. Đa số các loài có catalase dương tính. 2.4.2. Dinh dưỡng và tăng trưởng 2.4.2.1. Môi trường nuôi cấy Phần lớn các chi Bacillus phát riển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thương mại gồm các thành phần cơ bản như: pepton, cao thịt, glucose, lactose, chất khoáng, , mặc dù trong một số trường hợp đặc biệt, các môi trường này cần được điều chỉnh pH hoặc nồng độ muối (pH từ 2-11, và nồng độ muối từ dưới 2-25%). Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện phát triển tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 phút. 24
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Trong môi trường nuôi cấy lỏng chúng tạo váng trên bề mặt. Trên môi trường thạch tạo khuẩn lạc to, tròn hay hình dạng bất thường, có màu xám ngả vàng nhạt, bề mặt khóm sần sùi, hơi nhăn hoặc tạo màng mịn lan trên bề mặt thạch. Hình dạng khuẩn lạc thay đổi tùy theo độ tuổi, và các đĩa nuôi cấy riêng lẻ có thể tạo ra các dạng khuẩn lạc khác nhau. B. larvae và B. popilliae trong môi trường nuôi cấy cần có thêm thiamine. Chúng thường phát triển trên môi trường J chứa trypton, glucose, dịch chiết nấm men. B. pasteuri cần bổ sung 0.5-1% urea vào tất cả môi trường nuôi cấy. B. stearothermophilus phát triển trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung calci và sắt. Môi trường tối thiểu B. subtilis và nhiều thành viên khác trong chi phát triển được trong môi trường muối đơn giản chứa các ion ammonium như nguồn nitrogen và glucose như nguồn cacbon. Môi trường muối tối thiểu thường được sử dụng là Spizizen’s minimal medium (SMM). Môi trường tạo bào tử Hầu hết các loài Bacillus cần một môi trường đặc biệt để có thể tạo bào tử. Sự tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng hàm mũ do nồng độ dinh dưỡng bị cạn kiệt, đặc biệt là việc thiếu nguồn cacbon, nitrogen hoặc phospho. Có thể sử dụng môi trường nhân tạo để cảm ứng tạo bào tử như Difico sporulation agar (DSM), 2x SG agar, CDSM medium. 2.4.2.2. Nhiệt độ phát triển Phần lớn các chủng Bacillus ưu nhiệt trung tính, và tạo khuẩn lạc đặc trưng sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C. Các loài ưu nhiệt như B. stearothermophilus phát triển từ 55 đến 700C, thường là khoảng 600C. Các loài này ưu nhiệt bắt buộc và không thể phát triển ở 370C. Loài ưu nhiệt trung bình như B. coagulans phát triển tốt tại 45- 500C. Loài gây bệnh cho côn trùng như B. larvae và B. popilliae phát triển ở nhiệt độ từ 25- 300C. Tương tự như vậy đối với B. thuringiensis và B. cereus. 25
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.4.3. Hệ enzyme của vi khuẩn Bacillus Bacillus rất đa dạng về hình thái, do đó các enzyme của chúng cũng vô cùng phong phú. Ở các loài Bacillus khác nhau đã tìm thấy các enzyme thuộc các nhóm cacbonhydrate (gồm amylase, cellulase, chitinase, protease, penicillinase, lipase, thiaminase, enzyme phân giải vi khuẩn ) Trong nhóm enzyme amylase thường gặp nhất là α – amylase. Chúng thủy phân liên kết α – 1,4 glucosidase của tinh bột tạo thành các polysaccharite. Có 2 loại α – amylase chính được tạo từ Bacillus là: Enzyme dịch hóa tinh bột ( liquefying enzyme) và enzyme đường hóa ( saccharifying enzyme). Hai loại enzyme này có thể phân biệt với nhau dựa trên sự tác động của chúng đối với tinh bột. Trước kia người ta cho rằng α – amylase và cyclodextrin glucosytransferase của B. maceransualaf là những enzyme duy nhất phân giải tinh bột của chi Bacillus , nhưng gần đây người ta đã tìm thấy những enzyme khác cũng thủy phân tinh bột như β- amylase và các enzyme cắt mạch nhánh Phần lớn trong số 34 loài Bacillus có tên trong Bergey/s Manual of Systematic Bacteriology đều có khả năng sinh tổng hợp protease. Trong đó những lòai quan trọng nhất là: B. subtilis, B. polymyxa, B. megaterium, B. thermoproteolyticus thường được chia làm 4 nhóm dựa vào cơ chế tác động của chúng: protease chứa serine, protease chứa kim loại, protease chứa lưu huỳnh, protease acid. Các protease ngọai bào của Bacillus thường thuộc nhóm protease kim loại và serine 2.4.4. Ứng dụng của Bacillus Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có khả năng sinh các loại enzyme như amylase, alkaline phosphatase, cellulase, cyclodextran, glucanotransferase, galactosidase, chitinase, glucose isomerase, glucanase, lipase, serine protease, urease, . Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic acid, Dưới điều 26
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin vừa có tình kháng khuẩn và kháng khối u. Trong chế phẩm sinh học, Bacillus thuringiensis được ứng dụng làm thuốc trừ sâu vi sinh, Bacillus thuringiensis làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt lăng quăng. Do khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzyme ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, E. coli, S. aureus, Salmonella, Shigella, Vibrio spp., nên Bacillus sp. được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản Bacillus ứng dụng trong thủy sản như: làm tăng khả năng sống, thúc đẩy sinh trưởng (Gomez-Gil và ctv., 2000), kích thích tiêu hóa (Ziaei-Nejad và ctv., 2006), tăng cường đáp ứng miễn dịch (Gatesoupe, 1999) và cải thiện chất lượng nước (Kennedy và ctv., 1998; Moriarty và ctv., 1998). Các chủng B. subtilis sản xuất enzyme ngoại bào như protease và một số enzyme khác đã đóng góp vào hoạt tính enzyme tự nhiên của chủng chủ (Ziaei Nejad và ctv., 2006), đóng góp nguồn vi lượng và đa lượng bổ sung thức ăn (Verschuere và ctv., 2000). Hơn nữa, B. subtilis sản sinh các hợp chất kháng khuẩn, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống góp phần ức chế vi khuẩn gây bệnh (Vaseeharan và ctv., 2003). B.licheniformis được chứng minh có hoạt tính kháng virut (Arena và ctv., 2006), trong khi đó B. pumilus sản xuất enzyme ngoại bào bao gồm amylase, cellulase, là những enzyme quan trọng trong hoạt động tiêu hóa của cá bột (Ghosh và ctv., 2002). Hơn nữa Bacillus có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, giúp giảm chu kì thay nước và cải thiện môi trường, do có khả năng khử nitrate, phân hủy chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa nhờ có các enzyme ngoại bào như protease, amylase, lipase .Ngoài ra, một số chủng Bacillus còn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng Vibrio sp, Aeromonas sp, giúp phòng và ức chế bệnh trong nuôi trồng thủy sản. 27
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Thời gian Từ 1/4/2011 đến 30/6/2011 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu Phòng Sinh học Thực Nghiệm - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 được phân lập từ nước ao nuôi cá tra được nhận từ Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri Gly 09M) trên cá tra nhận từ Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Chủng CV026, thể đột biến từ chủng vi khuẩn Chromobacterium violaceum (McClean và ctv., 1997), được sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị để phát hiện nồng độ dư lượng AHL còn lại trong môi trường chủng này có khả năng tạo sắc tố màu tím violacein khi có sự hiện diện của các phân tử AHL mạch ngắn (từ 4-8 cacbon) trong môi trường. Chủng CV026 được nuôi cấy trong môi trường BHI, có bổ sung 20mg/l kanamycin. 3.2.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm, hóa chất và môi trường 3.2.2.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm Tủ cấy vô trùng Microflow Tủ ấm lắc Orbital incubator SI 50 Tủ ấm Memmert Tủ sấy Memmert Máy ly tâm Máy khuấy từ gia nhiệt IKA 28
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Cân điện tử 4 số lẻ AY220 Máy đo pH để bàn Thermo Orion Tủ mát Sanyo Tủ lạnh sâu (– 80oC) Nồi hấp vô trùng Hirayama Máy cất nước Hamilton Máy đo giá trị OD Máy vortex Các loại đầu típ và micropipet Eppendorf Erlen các loại Ống nghiệm Đĩa petri Một số thiết bị và dụng cụ khác như que cấy, que trang, đèn cồn, nhíp, dụng cụ đục lỗ, bông thấm, bông không thấm 3.2.2.2. Hóa chất và môi trường Dung dịch đệm Phosphate Buffer Saline (PBS). Nước muối sinh lý 0.85%. Thuốc thử cho các phản ứng khả năng sinh enzyme ngoại bào: Lugol, TCA 25% (tricloric acetic acid 25%) CMC 1%, glycerol 40%, CaCl2, Môi trường dinh dưỡng thông thường: Nutrient Agar (NA),Brain Heart Infusion Agar (BHIA), Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Blood Agar (BA) Môi trường tạo bào tử Bacillus: Difco Sporulation Medium (DSM) Môi trường thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào: enzyme cellulase, amylase, protease và lipase. 29
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 3.3. Bố trí thí nghiệm 3.3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào Đối với các chủng vi sinh vật dùng làm probiotic trong thủy sản, khả năng sinh các enzyme ngoại bào là một tiêu chí chọn lọc quan trọng giúp hổ trợ tiêu hóa cho vật chủ và cải thiện môi trường sống của động vật nước ngọt bằng cách phân hủy nhanh chóng thức ăn dư thừa. Các enzyme thử nghiệm là amylase, protease, cellulase, lipase (Ertuğrul và ctv, 2007; Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc Huy, 2010; Trần Linh Thước, 2010). 3.3.1.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của Bacillus N6.1 Một số vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào có tác dụng phân hủy tinh bột thành các đường đơn. Phản ứng này nhận biết được khi ta nhỏ dung dịch lugol vào trong môi trường thạch nuôi cấy, nếu trong môi trường có tinh bột thì môi trường chuyển sang màu xanh đậm, ngược lại thì lugol sẽ không làm chuyển màu môi trường. Cách tiến hành: Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC trong 24 giờ Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) bổ sung 0.5% tinh bột tan Ủ ở 30oC trong 24 giờ Nhỏ lugol, đọc kết quả:  Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc  Âm tính: Xuất hiện màu xanh đậm xung quanh khóm khuẩn lạc 3.3.1.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme lipase của Bacillus N6.1 Một số sinh vật có khả năng tiết ra các enzyme lipase phân giải dầu thực vật và một số hợp béo khác. Trong thử nghiệm lipase môi trường có chứa CaCl2 và Tween80. Nếu vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme lipase sẽ phân giải Tween 80 tạo các acid béo tự do, các acid béo này sẽ tủa khi có mặt Ca2+, tạo nên vùng mờ đục dưới và xung quanh khuẩn lạc. 30
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Cách tiến hành: Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHI ủ ở 30oC, 24 giờ Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) có bổ sung CaCl2 (100ppm) và Tween 80 (10ml/l) Ủ 30oC, trong 24 giờ Đọc kết quả.  Dương tính: Tủa mờ đục xung quanh khóm khuẩn lạc  Âm tính: Không có tủa mờ đục xung quanh khóm khuẩn lạc 3.3.1.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme protease của Bacillus N6.1 Thử nghiệm 2 enzyme trong nhóm protease là gelatinase và caseinase.  Đối với những sinh vật có nhóm enzyme gelatinase thì nó sẽ phân hủy được gelatine tạo vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc. Cách tiến hành: Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC trong 24 giờ Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) có bổ sung 1% gelatine. Ủ 30oC, trong 24 giờ Nhỏ TCA 25% ( Trichloric Acetic Acid 25%) , xem kết quả  Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc  Âm tính: Không xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc.  Môi trường có casein sẽ có màu trắng đục, vi khuẩn tiết enzyme caseinase sẽ tạo vùng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Cách tiến hành: Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC, trong 24 giờ. Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường Skim milk Agar (1% skim milk) 31
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Ủ 30oC, 24 giờ, đọc kết quả.  Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khuẩn lạc  Âm tính: Xung quanh khuẩn lạc có màu trắng đục 3.3.1.4. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của Bacillus N6.1 Chủng kiểm tra được nuôi trên môi trường có bổ sung CMC 1% (Carbonyl methyl cellulose), những vi khuẩn có enzyme cellulase sẽ phân giải CMC và sau khi nhuộm với lugol sẽ tạo được các vòng trong xung quanh khuẩn lạc. Cách tiến hành: Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC, trong 24 giờ Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) có bổ sung CMC 1% Ủ 30oC, trong 24 giờ. Nhỏ lugol, đọc kết quả.  Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc  Âm tính: Xuất hiện màu xanh đậm xung quanh khóm khuẩn lạc 3.3.2. Dựng đường chuẩn tương quan giữa giá trị OD và mật độ vi khuẩn Bacillus N6.1; E.ictaluri Chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 và E.ictaluri (- 80oC) sau khi hoạt hoá trên môi trường BHIA, chọn một khuẩn lạc đặc trưng nuôi trong erlen chứa 50ml môi trường BHIB ủ ở 30oC, lắc 120 vòng /phút trong 24 giờ Đo giá trị OD ở bước sóng 600nm của canh khuẩn được tăng sinh trong môi trường BHIB sau 24 giờ ở các nồng độ pha loãng tăng dần 20, 2-1, 2-2, 2-3 Tại mẫu pha loãng có giá trị OD600nm gần bằng 0, tiến hành pha loãng và trải đĩa ở 3 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, mỗi nồng độ trải 3 đĩa. Ủ ở 30oC sau 24 giờ tiến hành đếm khuẩn lạc. 32
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Đếm số khuẩn lạc ở mỗi đĩa (Chọn đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25- 300 khuẩn lạc).Tính số khuẩn lạc trung bình, từ đó suy ra mật độ vi khuẩn (cfu/ml) ở các nồng độ khác nhau => dựng đường chuẩn 3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối kháng với E. ictaluri của Bacillus N6.1 Mục đích: Xác định khoảng chịu pH, nhiệt độ, NaCl của chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 trong môi trường nuôi trồng thủy sản Chủng Bacillus N6.1 (-80oC) sau khi hoạt hoá trên môi trường BHIA, chọn một khuẩn lạc đặc trưng tăng sinh trong ống nghiệm chứa 10 ml môi trường BHIB ủ ở o 30 C, lắc 120 vòng /phút. Sau 24 giờ, đo OD600nm, dựa vào phương trình đường chuẩn xác định mật độ, điều chỉnh về 2x106 (cfu/ml). Sau đó nuôi trên ống nghiệm chứa 10ml môi trường BHIB ở các điều kiện pH (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), nhiệt độ (25oC, 30oC, 35oC, 40oC), nồng độ muối (0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%) ở 30oC, lắc 120 vòng/phút. Sau 24 giờ tiến hành đo OD600nm ở tất cả các điều kiện trên. Đồng thời sử dụng phương pháp giếng khuếch tán (well diffusion method) để đánh giá khả năng đối kháng của Bacillus N6.1 bằng cách vi khuẩn gây bệnh E. ictaluri (-80oC) sau khi hoạt hoá trên môi trường BA, chọn một khuẩn lạc đặc trưng tăng sinh trong ống nghiệm chứa 10 ml o môi trường BHIB ủ ở 30 C, lắc 120 vòng/phút. Sau 24 giờ, đo OD600nm, dựa vào phương trình đường chuẩn xác định mật độ, điều chỉnh về 2x108 (cfu/ml). Trải 50µl canh khuẩn gây bệnh lên môi trường thạch BHI, để khô trong 15 phút. Sau đó khoan 3 giếng (đường kính 8mm) trên mỗi đĩa. Hút 50µl canh khuẩn Bacillus N6.1 nhỏ vào giếng trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, ủ ở nhiệt độ 300C và đo kích thước vòng kháng khuẩn sau 24 giờ. 33
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Bacillus N6.1(-80oC) Hoạt hoá vi khuẩn bằng cách E. ictaluri (-80oC) cấy ria lên BHIA Ủ 30oC, 24 giờ Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên Hoạt hóa vi khuẩn bằng cách 10ml BHIB cấy ria lên BA Ủ 30oC, 24 giờ Ủ 30oC, 48 giờ Đo OD600nm, xác định mật độ điều chỉnh về 2x106 cfu/ml Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên 10 ml BHIB Ủ 30oC, 24 giờ Đo OD 600, điều Khảo sát ảnh Khảo sát ảnh Khảo sát ảnh chỉnh về 2x108 hưởng của nhiệt độ hưởng của pH ( hưởng của muối % cfu/ml 0C( 25,30,35,40) 4,5,6,7,8,9,10) (0.5,1,2,3,4,5,6) 4,5,6,7,8,9,10) Hút 50 µl trải trên BHIA, để khô 15 phút và đục lỗ 8 mm (3 lỗ/đĩa) Ly tâm 10000 vòng, 10 phút (2 lần rửa dịch) (Hút 50 µl nhỏ vào giếng) Ủ 30oC, 24 giờ Đo OD , tính mật độ 600nm Đo đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn Hình 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối kháng với E. ictaluri của Bacillus N6.1 34
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 3.3.4. Khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật Khi vi khuẩn tạo thành bào tử, chúng sẽ có khả năng chịu đựng và tồn tại trong một thời gian dài ở các điều kiện khắc nghiệt và bất lợi. Do đó khả năng sống sót của chúng ở các điều kiện pH thấp hoặc muối mật sẽ cao hơn so với vi khuẩn ở dạng tế bào sinh dưỡng.Vì vậy các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường DSM trước khi khảo sát 3.3.4.1. Khả năng chịu acid dạ dày Mục đích: Khảo sát khả năng chịu đựng acid trong cơ thể vật chủ khi vi khuẩn đi qua dạ dày Vi khuẩn Bacillus N6.1 (-80oC) được cấy ria trên môi trường thạch BHI, ủ 30oC trong 24 giờ, chọn một khuẩn lạc tăng sinh trên 50 ml môi trường DSM ủ 30oC, lắc 120 vòng/phút. Sau 48 giờ, đo OD600nm, dựa vào phương trình đường chuẩn xác định mật độ, điều chỉnh về 2x107 (cfu/ml). Chuyển dịch vi khuẩn vào 10ml BHIB có pH 2, 3 và 4, ủ ở nhiệt độ 30oC, lắc 120 vòng/phút. Thu mẫu dịch khuẩn vào các thời điểm 0, 1, 2, 3, 6, 24 giờ, ly tâm 10000 vòng trong 10 phút (2 lần rửa dịch) thu sinh khối và pha loãng theo hệ số thập phân trong dung dịch NaCl (0,85%). Trải 50µl dịch khuẩn trên môi trường thạch BHI, ủ 30oC, 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa ở các độ pha loãng. Tính toán phần trăm vi khuẩn còn sống (Mourad and Nour-Eddine, 2006; Verdenelli et al., 2009). (Jacobsen et al., 1999) 35
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Bacillus N6.1 (-80oC) Cấy ria trên môi trường thạch BHI (ủ 24 giờ, 30oC) Tăng sinh trên DSM (50ml) ủ 30oC, 120 vòng/phút, 48 giờ Xác định mật độ (Đo OD600nm) 7 Điều chỉnh về 2x10 (cfu/ml) nuôi trong 10 ml môi trường BHIB có pH 2,3 và 4 (sử dụng HCl 0,5M) Thu mẫu dịch khuẩn vào thời điểm 0, 1, 2, 3, 6, 24 giờ Ly tâm 10000 vòng, 10 phút, rửa dịch (2 lần) Pha loãng theo hệ số thập phân, trải trên môi trường thạch BHI, ủ 24-48 giờ, đếm khuẩn lạc, tính tỉ lệ % sóng sót Hình 3.2: Khả năng chịu acid dạ dày 3.3.4.2. Khả năng chịu muối mật Bacillus N6.1 (-80oC) được cấy ria trên môi trường thạch BHI, ủ 30oC trong 24 giờ, chọn một khuẩn lạc tăng sinh trên 50 ml môi trường DSM ủ 30oC, lắc 120 vòng/phút. Sau 48 giờ, đo OD600nm, dựa vào phương trình đường chuẩn xác định mật độ, điều chỉnh về 2x107 (cfu/ml). Chuyển dịch vi khuẩn vào 10ml BHIB có hàm lượng muối mật 0,3%; 0,5%; 1% và 2% (Bile salt, India), ủ ở nhiệt độ 30oC, lắc 120 vòng/phút. Thu mẫu dịch khuẩn vào các thời điểm 0, 1, 2, 3, 6, 24 giờ, ly tâm 10000 vòng trong 10 phút (2 lần rửa dịch) thu sinh khối và pha loãng theo hệ số thập phân trong dung dịch NaCl (0,85%). Trải 50µl dịch khuẩn trên môi trường thạch BHI, ủ 24- 36
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 48 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa ở các độ pha loãng.Tính toán phần trăm vi khuẩn còn sống (Verdenelli et al., 2009). Bacillus N6.1 (-80oC) Cấy ria trên môi trường thạch BHI (ủ 24 giờ, 30oC) Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên DSM ( 50ml) ủ 30oC, 120 vòng/phút, 48 giờ 7 Xác định mật độ (Đo OD600nm).Điều chỉnh về 2x10 (cfu/ml) nuôi trong 10 ml môi trường BHIB có muối mật 0,3%; 0,5%; 1%; 2% Thu mẫu dịch khuẩn vào thời điểm 0, 1, 2, 3, 6, 24 giờ Ly tâm 10000 vòng, 10 phút, rửa dịch (2 lần) Pha loãng theo hệ số thập phân, trải trên môi trường thạch BHI, ủ 24-48 giờ, đếm khuẩn lạc, tính tỉ lệ % sóng sót Hình 3.3: Khả năng chịu muối mật 3.3.5. Khả năng phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone 3.3.5.1. Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein Giống vi khuẩn Chromobacterium violaceum (CV026) lưu giữ ở (-80oC) được cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường BHIA. Sau đó ủ ở 30oC trong 24 giờ để tạo giống cấp 1. 37
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Từ giống cấp 1, chọn một khuẩn lạc cấy chuyền sang erlen chứa 10ml môi trường BHI có bổ sung kanamycin với nồng độ 20 ppm. Sau đó ủ trong tủ ấm lắc ở 30oC trong 24 giờ để tạo giống cấp 2. Tiến hành pha loãng dung dịch C6-HHL (N-hexanoyl homoserine lactone) từ nồng độ 2500 mg/l thành các nồng độ 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 ppm trong môi trường BHI. Sử dụng 1 đĩa petri chứa BHIA. Nhỏ 50µl canh khuẩn CV026 (tương ứng với nồng độ 109 cfu/ml) lên mỗi đĩa. Dùng que cấy tam giác trải đều dịch khuẩn trên đĩa và để khô. Dung dịch C6-HHL ở các nồng độ khác nhau, sử dụng 3 x 10µl dung dịch C6- HHL nhỏ vào 3 vị trí trên đĩa BHIA đã trang sẵn dịch khuẩn CV026. Để trong box cấy vô trùng cho đến khi khô, sau đó dán parafilm và ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ 30oC. Sau khi ủ trong 24 giờ, trên đĩa xuất hiện 3 vòng tròn sắc tố violacein tương ứng tại 3 vị trí đã nhỏ dung dịch HHL (Hình 3.4). Tiến hành đo đường kính của các vòng tròn này, và xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa ln [HHL] và đường kính đường tròn sắc tố violacein (mm) Hình 3.4: Các vòng tròn sắc tố violacein tiết ra bởi vi khuẩn CV026 khi có sự hiện diện của phân tử AHL. 38
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 3.3.5.2. Khả năng phân hủy phân tử HHL của Bacillus N6.1 Chuẩn bị vi khuẩn chỉ thị cho HHL: Chromobacterium violaceum (CV026) đuợc hoạt hóa trong môi trường BHI có chứa kanamycin với nồng độ 20 ppm Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn phân lập được bảo quản ở – 80oC, được cấy chuyền sang đĩa BHIA và ủ ở 30oC trong 24 giờ để tạo giống cấp 1. Chọn một khuẩn lạc trên đĩa BHIA, cấy chuyền sang các Erlen chứa 20ml dung dịch BHI, ủ trong 24 giờ để tạo giống cấp 2. Từ các giống cấp 2 này, tiến hành pha loãng và đo mật độ quang ở bước sóng 600nm Từ mật độ vi khuẩn xác định được, tính toán thể tích cần thiết cấy vào các Erlen chứa 20ml dung dịch BHI để đạt mật độ 2x107 cfu/ml. Bổ sung vào mỗi erlen 5ppm dung dịch HHL. Sử dụng một erlen đối chứng, chỉ chứa HHL mà không bổ sung vi khuẩn. Tất cả erlen được đặt trong tủ ấm lắc ở tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ. Sau đó lấy 3 x (10µl) dịch nổi nhỏ lên bề mặt đĩa BHIA đã tráng sẵn 50µl dịch vi khuẩn CV026 đã chuẩn bị trước đó. Sau đó ủ ở 30oC trong 12 giờ Sau thời gian ủ, đo đường kính các vòng tròn violacein và dựa vào đường chuẩn đã thiết lập để tính toán nồng độ HHL còn lại trong môi trường. 39
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt o Bacillus N6.1(-80 C) Cấy ria trên môi trường BHIA (ủ 24-48h, 30oC) Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trong 10ml môi trường BHI (ủ 24h, 30oC, 120 vòng/phút) 7 o Nuôi vi khuẩn trên (2x10 cfu/ml) CV026 (-80 C) cấy ria trên trong môi trường BHI + 5ppm HHL/L môi trường BHIA Ủ 24h, 30oC, 120 v/p Chọn 1 khuẩn lạc tăng sinh Đối chứng Lô thí nghiệm trên môi trường BHI + BHI + 5ppm HHL/L Ủ ở 30oC, 120 v/p kanamycin 20ppm Ủ 24h, 30oC, 120 v/p Trải 50µl dịch CV026 trên môi Thu 10µl dịch trên (sau 0, 6, 12, 18, trường BHIA (1x109 tb/ml), để 24 giờ) nhỏ vào đĩa đã trải CV026 khô 15 phút Ủ ở 30oC, 24h Đo kích thước đường kính violacein (sắc tố màu tím) Hình 3.5: Khảo sát khả năng phân hủy phân tử tín hiệu HHL 40
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 3.3.6. Khảo sát bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 lên sự phát triển của E. ictaluri bằng phương pháp nuôi chung Hoạt hóa chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ 300C, 24 giờ Chọn một khuẩn lạc tăng sinh trên môi trường BHIB ủ 300C, 120 vòng/phút, 24 giờ 7 Sau 24 giờ. Đo OD600nm điều chỉnh về 2x10 cfu/ml tiến hành 2 thí nghiệm nuôi chung với E.ictaluri (2x106 cfu/ml) và nuôi riêng ủ 300C, 120 vòng/phút, 24 giờ Tiến hành lọc qua màng lọc 0.2 µm và không lọc ở 2 điều kiện trên. Hút 50µl nhỏ vào giếng đã tráng E.ictaluri trên BHIA Ủ 300C, 24 giờ. Đo đường kính vòng kháng khuẩn. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Phương pháp pha loãng Vệ sinh bằng cồn khắp mặt trong của tủ cấy. Cho các dụng cụ vào bên trong tủ cấy. Rửa tay bằng cồn. Lắc đều mẫu cần pha loãng bằng máy vortex Mở nút ống nghiệm hoặc nút bông của erlen, hơ nhanh miệng trên ngọn đèn cồn. Dùng micropipet hút 100 l Mở nút eppendorf chứa 900µl nước muối sinh lý, cho 100 l mẫu vào. Ta sẽ được mẫu pha loãng 10-1 Từ ống pha loãng 10-1, tiếp tục hút 100µl cho vào ống chứa 900µl nước muối sinh lý ta sẽ được độ pha loãng 10-2.Tương tự như vậy để pha loãng 10-4, 10-5 3.4.2. Phương pháp tráng đĩa Lấy eppendorf đã pha loãng ở nồng độ cần tiến hành tráng đĩa. Vệ sinh bằng cồn khắp mặt trong của tủ cấy. 41
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Cho các dụng cụ trên vào tủ cấy Rửa tay bằng cồn. Lắc kỹ ống eppendorf bằng máy vortex trong 1 phút. Mở nút ống eppendorf chứa mẫu, hơ nhanh miệng trên ngọn đèn cồn. Dùng micropipet hút 50 l dung dịch mẫu. Tay trái hé mở nắp đĩa thạch, tay phải cầm micropipet cho vào 50  mẫu. Dùng que gạt nhúng vào cồn, hơ trên ngọn đèn cồn, làm nguội trong không khí 15 giây, tiếp tục làm nguội que gạt trên phần thạch không có dung dịch vi khuẩn, khi que cấy đã nguội thì gạt giọt dịch trải đều khắp mặt thạch: tay trái hé mở nắp hộp, ngón út trái xoay nhẹ cho đĩa chuyển động tròn, tay phải liên tục gạt cho tới khi mặt thạch khô ráo. Thay đầu tip và tiếp tục với các ống còn lại Chú ý: Để các tế bào vi sinh vật tách rời nhau và phân bố đều trên mặt thạch, sau khi nhỏ dịch pha loãng cần tiến hành gạt ngay. Nếu để lâu giọt dịch sẽ bị khô, các tế bào gắn chặt vào mặt thạch, việc gạt dàn đều chúng sẽ rất khó khăn, dẫn đến kết quả sai lệch. Các đĩa thạch đã được tráng sẽ được dán parafilm và cho vào tủ ấm ở 30oC trong vòng 24-48 giờ. 3.4.3. Phương pháp giếng khuếch tán (well diffusion method) 3.4.3.1. Chuẩn bị vi khuẩn khảo sát Các chủng vi khuẩn phân lập (– 80oC) được cấy ria trên môi trường BHIA và ủ ở 30oC trong 48 giờ để tạo giống cấp 1. Chọn một khuẩn lạc trên đĩa BHIA (đối với mỗi chủng), cấy chuyền sang ống nghiệm 5ml dung dịch BHI, ủ trong 24 giờ để tạo giống cấp 2. 42
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Từ các giống cấp 2 này, tiến hành pha loãng 10 lần và đo mật độ quang ở bước sóng 600nm sao cho OD nằm trong khoảng 0,1-1. Điều chỉnh về mật độ vi khuẩn là 2×106 cfu/ml, tăng sinh trong môi trường BHIB, ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ 30oC. 3.4.3.2. Chuẩn bị vi khuẩn gây bệnh Tương tự với vi khuẩn gây bệnh (– 80oC) được cấy ria trên đĩa thạch máu (Blood agar + máu cừu), ủ ở 28oC, 48 giờ. Chọn 1 khuẩn lạc cấy trong 10 ml BHI, ủ trong 18-24 giờ. Đo độ hấp thu ở bước sóng 600nm, điều chỉnh về mật độ vi khuẩn 2×108 cfu/ml. Dùng 50 µl dịch vi khuẩn gây bệnh trên tráng lên môi trường BHIA và đợi khô trong 15 phút. Sau đó dùng ống sắt hình trụ (có đường kính 8mm) khoan 3 lỗ trên đĩa thạch. Các khối thạch sau khi đục được lấy ra và bỏ. Dùng 50µl dịch vi khuẩn cần khảo sát sau khi đã ủ 24 giờ, nhỏ vào mỗi lỗ trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn gây bệnh, sau đó dán parafilm Ủ trong tủ ấm nhiệt độ 28-32oC trong 24 giờ. Tiếp theo đo vòng kháng khuẩn (mm). Nếu chủng vi khuẩn tạo vòng kháng khuẩn có đường kính ≥17 mm được cho là đối kháng mạnh. 3.4.4. Phương pháp định lượng vi sinh vật 3.4.4.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp này cho phép xác định số tế bào sống Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu Chuẫn bị các chuỗi pha loãng Cấy mẫu vào môi trường, ủ mẫu Đếm số khuẩn lạc hình thành. Đếm tất cả các khuẩn lạc đơn lẽ mọc trên môi trường Tùy chọn những đĩa có số khuẩn lạc từ 15-300 43
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Tính toán (dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính ra số khuẩn lạc vi sinh vật trong dung dịch ban đầu) 3.4.4.2. Phương pháp đo độ đục Giống vi khuẩn cần đo, tiến hành pha loãng 10 lần và đo mật độ quang ở bước sóng 600nm sao cho OD nằm trong khoảng 0,1-1. Dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra mật độ vi khuẩn trong dung dịch ban đầu. 3.4.5. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 13.0 (SPSS Inc., 1989-2004). Multiple comparation (Tukey’s) test được sử dụng để kiểm tra sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức. Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị là p < 0,05. Các đồ thị được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel phiên bản 2007. 44
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào Đối với các chủng vi sinh dùng làm probiotic trong thủy sản, khả năng sinh các enzyme ngoại bào là một trong những tiêu chí chọn lọc quan trọng giúp hỗ trợ tiêu hóa cho vật chủ và cải thiện môi trường sống của động vật nước ngọt bằng cách phân hủy nhanh chóng thức ăn dư thừa. Kết quả thí nghiệm này nhằm xác định khả năng sinh các enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus N6.1. 4.1.1. Khả năng sinh enzyme amylase của Bacillus N6.1. N6.1 Hình 4.1: Khả năng sinh enzyme amylase Dựa vào hình 4.1, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng phân hủy tinh bột, điều này chứng tỏ chúng có khả năng tiết ra enzyme amylase. Do đó, khi cung cấp chủng vi khuẩn này dưới dạng probiotic cho các động vật thủy sản thì giúp cho tôm, cá có thể dễ dàng phân hủy các loại thức ăn giàu tinh bột, giúp cho các quá trình tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn. 45
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 4.1.2. Khả năng sinh enzyme lipase của Bacillus N6.1. N6.1 Hình 4.2: Khả năng sinh enzyme lipase Dựa vào hình 4.2, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 không có khả năng phân hủy dầu thực vật và một số hợp chất béo khác, điều này chứng tỏ rằng chúng không có khả năng tiết ra enzyme lipase. Do đó, khi cung cấp chủng vi khuẩn này dưới dạng probiotic cho các động vật thủy sản thì cần lưu ý đến hàm lượng lipid có trong thức ăn. 4.1.3. Khả năng sinh enzyme protease của Bacillus N6.1. N6.1 Hình 4.3: Khả năng sinh enzyme gelatinase 46
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Dựa vào hình 4.3, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng phân hủy gelatine, điều này chứng tỏ rằng chúng có khả năng tiết ra enzyme gelatinase. Do đó, khi cung cấp chủng vi khuẩn này dưới dạng probiotic cho các động vật thủy sản thì giúp cho tôm, cá có thể dễ dàng phân hủy các loại thức ăn giàu gelatine, giúp cho các quá trình tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn N6.1 Hình 4.4: Khả năng sinh enzyme caseinase Dựa vào hình 4.4, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng phân hủy casein, điều này chứng tỏ rằng chúng có khả năng tiết ra enzyme caseinase. Do đó, khi cung cấp chủng vi khuẩn này dưới dạng probiotic cho các động vật thủy sản thì giúp cho tôm, cá có thể dễ dàng phân hủy các loại thức ăn giàu casein, giúp cho các quá trình tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn Kết quả ở hình 4.3 và 4.4 chứng tỏ chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng phân hủy các loại thức ăn giàu protein 47
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 4.1.4. Khả năng sinh enzyme cellulase của Bacillus N6.1. Hình 4.5: Khả năng sinh enzyme cellulase Dựa vào hình 4.5, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng phân hủy cellulose, điều này chứng tỏ rằng chúng có khả năng tiết ra enzyme cellulase. Do đó, khi cung cấp chủng vi khuẩn này dưới dạng probiotic cho các động vật thủy sản thì giúp cho tôm, cá có thể dễ dàng phân hủy các loại thức ăn giàu cellulose, giúp cho các quá trình tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn Kết quả sinh enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus N6.1. được tóm tắt ở Bảng 4.1. Bảng 4.1: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của Bacillus N6.1 Enzyme Kết quả Amylase + Lipase - Gelatinase + Caseinase + Cellulase + (+): Kết quả dương tính 48
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt (-): Kết quả âm tính Trong số 5 loại enzyme ngoại bào khảo sát thì Bacillus N6.1 có khả năng sản xuất ra 4 loại enzyme. Qua bảng 4.1 cho thấy chủng Bacillus N6.1 có khả năng phân hủy tinh bột nhờ tiết ra enzyme amylase, phân hủy gelatin, casein nhờ tiết ra enzyme gelatinase và caseinase. Ngoài ra Bacillus N6.1 còn thể hiện hoạt tính phân giải cellulose nhờ tiết enzyme cellulase, hoạt tính này càng tăng lên đáng kể khi môi trường nuôi có bổ sung thêm CMC. Tuy nhiên qua quá trình khảo sát chủng này cho kết quả âm tính trên môi trường thử nghiệm lipase hay chúng không sinh enzyme lipase vì vậy chủng này không có khả năng phân giải dầu thực vật và các hợp chất béo khác. Trong một số nghiên cứu trước đây đa số các chủng Bacillus spp. có khả năng sinh enzyme ngoại bào. Theo khảo sát của Nguyễn Đức Quỳnh Như và ctv (2009), từ 32 chủng qua sàng lọc từ mẫu đất và nước tại Cần Giờ được đem đi thử nghiệm khả năng sinh enzyme protease, amylase, lipase trên môi trường TSB, kết quả cũng chọn được 14 chủng có khả năng sinh tất cả các enzyme trên. Kết quả này chứng tỏ Bacillus N6.1 là chủng vi khuẩn có tính ưu việt và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp nói chung, nuôi trồng thủy sản nói riêng. Việc cung cấp các chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào là điều hết sức cần thiết, giúp cho quá trình tiêu hóa thức ăn của vật nuôi tốt hơn, tăng cường hiệu quả tiêu thụ thức ăn. Tuy nhiên, khi sử dụng chủng này, cần lưu ý là hạn chế sử dụng các loại thức ăn giàu lipid vì chủng này không có khả năng tiết ra enzyme lipase để phân giải lipid. 4.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn tương quan giữa giá trị OD600nm và mật độ vi khuẩn Bacillus N6.1; E. ictaluri 49
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Xây dựng đường chuẩn nhằm xác định mật độ vi khuẩn trong dịch nuôi ở các khảo sát của đề tài. Kết quả đường chuẩn của Bacillus N6.1, E.ictaluri được biểu diễn ở biểu đồ hình 4.6 và 4.7 1.20E+08 1.00E+08 y = 145606246.07x - 3420567.95 R² = 0.987 8.00E+07 6.00E+07 4.00E+07 2.00E+07 Mật độ vi khuẩn (cfu/ml) khuẩn độ vi Mật 0.00E+00 0 0.2 0.4 0.6 0.8 OD600nm Hình 4.6: Đường chuẩn tương quan giữa giá trị OD600nm và mật độ vi khuẩn Bacillus N6.1. Dựa vào hình 4.6, ta có phương trình đường chuẩn Bacillus N6.1 là: y = 145606246,07x – 3420567,95 Trong đó: x: là giá trị OD600nm y: là mật độ vi khuẩn Bacillus N6.1 (cfu/ml) . 50
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 5.00E+08 4.50E+08 y = 752784796.45x - 5927396.13 4.00E+08 R² = 0.995 3.50E+08 3.00E+08 2.50E+08 2.00E+08 1.50E+08 1.00E+08 Mật độ vi khuẩn khuẩn độ Mật vi (cfu/ml) 5.00E+07 0.00E+00 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 OD600nm Hình 4.7: Đường chuẩn tương quan giữa giá trị OD600nm và mật độ vi khuẩn E.ictaluri. Dựa vào hình 4.7, ta có phương trình đường chuẩn E.ictaluri là: y = 752784796,45x – 5927396,13 Trong đó: x: là giá trị OD600nm y: là mật độ vi khuẩn E.ictaluri (cfu/ml) 4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối kháng với E.ictaluri của Bacillus N6.1 4.3.1. Ảnh hưởng của pH lên tăng trưởng và khả năng đối kháng E.ictaluri Giá trị pH ảnh hưởng khá lớn đến sự tăng trưởng và khả năng đối kháng của vi sinh vật có lợi đối với các vi sinh vật gây hại và gây bệnh. Do đó việc xác định được giá trị pH tối ưu đóng vai trò cần thiết. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 300C, 120 vòng/phút. Tại các nồng độ pH khác nhau, đem đo OD600nm và ghi nhận kết quả. Đồng thời với việc đo OD600nm, tiến hành thu dịch vi 51
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt khuẩn và khảo sát khả năng đối kháng với E.ictaluri. Kết quả được trình bày trong hình 4.8 Hình 4.8: Ảnh hưởng của pH lên tăng trưởng và khả năng đối kháng E.ictaluri của Bacillus N6.1. Các nghiệm thức với các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Dựa vào hình 4.8, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng chịu tất cả các giá trị pH khảo sát. Tuy nhiên, pH thích hợp cho vi khuẩn Bacillus N6.1 phát triển từ pH 5 đến pH 8 và chúng phát triển mạnh nhất ở pH 8. Ở pH 8, Bacillus N6.1 phát triển mạnh nhất và mật độ vi khuẩn cao một cách khác biệt có ý nghĩa so với các giá trị pH còn lại (P < 0,05). Trong khi đó tại pH 4, 9, 10 mật độ vi 52
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt khuẩn thấp nhất, chứng tỏ các giá trị pH này không thích hợp cho sự phát triển của chủng vi khuẩn Bacillus N6.1. Đồng thời dựa vào hình 4.8, chúng tôi nhận thấy rằng các điều kiện pH không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn mà còn ảnh hưởng đến khả năng đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh. Tại pH 8, Bacillus N6.1 đạt mật độ cao nhất (OD600nm = 0.915±0.054) cũng tương ứng với đường kính vòng kháng khuẩn là cao nhất (25.83±0.44) và có sự khác biệt ý nghĩa so với các giá trị pH còn lại (P < 0,05). Ở các pH 5, 6, 7 khả năng đối kháng cũng mạnh nhưng thấp hơn pH 8 , đường kính vòng kháng khuẩn khoảng từ 20-24 mm. Tại pH 4, 9, 10 mật độ vi khuẩn thấp nhất đồng thời khả năng đối kháng với E.ictaluri cũng yếu nhất. Kết quả này chứng tỏ chủng Bacillus N6.1 tăng trưởng tốt và có khả năng đối kháng mạnh khi nuôi ở điều kiện pH trung tính và phát triển mạnh nhất ở điều kiện pH hơi kiềm, không thích hợp với điều kiện quá kiềm hoặc quá acid. Mật độ vi khuẩn có ảnh hưởng đến khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh, mật độ vi khuẩn càng cao thì khả năng đối kháng càng mạnh. So với một số thử nghiệm định tính, các chủng Bacillus spp. từ 32 chủng qua sàng lọc từ mẫu đất và nước tại Cần Giờ được đem đi thử nghiệm đều phát triển được ở pH từ 5 - 10, một số phát triển ở pH từ 5 - 9 (Nguyễn Đức Quỳnh Như và ctv, 2009). Vì vậy, khi chủng Bacillus N6.1 được ứng dụng làm vi sinh vật probiotic thì nên nuôi ở pH từ 7-8 để đạt hiệu quả cao nhất. 4.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng và khả năng đối kháng E.ictaluri Nhiệt độ ảnh hưởng khá lớn đến sự tăng trưởng và khả năng đối kháng của vi sinh vật có lợi đối với các vi sinh vật gây hại và gây bệnh. Do đó việc xác định được giá trị nhiệt độ tối ưu đóng vai trò cần thiết. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 300C, 120 vòng/phút. Tại các nhiệt độ khác nhau, đem đo OD600nm và ghi nhận kết quả. Đồng thời với việc đo OD600nm, tiến hành thu dịch vi khuẩn và khảo sát khả năng đối kháng với E.ictaluri. Kết quả được trình bày trong hình 4.9. 53
  55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Hình 4.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng và khả năng đối kháng E.ictaluri của Bacillus N6.1. Các nghiệm thức với các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Dựa vào hình 4.9, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng chịu được tất cả các nhiệt độ khảo sát. Tuy nhiên, ở 30oC và 35oC Bacillus N6.1 phát triển mạnh nhất và cho mật độ cao nhất và có sự khác biệt ý nghĩa so với các giá trị nhiệt độ còn lại (P < 0,05) . Trong khi đó tại 25oC và 40oC mật độ vi khuẩn thấp, chứng tỏ các giá trị nhiệt độ này không thích hợp cho sự phát triển của chủng vi khuẩn Bacillus N6.1. 54
  56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Đồng thời dựa vào hình 4.9, chúng tôi nhận thấy rằng các điều kiện nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn mà còn ảnh hưởng đến khả năng đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh. Tại 250C, 300C và 350C, khả năng đối kháng của Bacillus N6.1 với E.ictaluri là mạnh nhất và có sự khác biệt ý nghĩa so với các giá trị nhiệt độ còn lại (P < 0,05). Ở nhiệt độ 40oC mật độ vi khuẩn thấp, khả năng đối kháng với E.ictaluri yếu Kết quả này chứng tỏ chủng Bacillus N6.1 tăng trưởng tốt và có khả năng đối kháng mạnh khi nuôi ở điều kiện nhiệt độ từ 30-35oC. Mật độ vi khuẩn có ảnh hưởng đến khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh, mật độ vi khuẩn càng cao thì khả năng đối kháng càng mạnh. So với một số thử nghiệm định tính, các chủng Bacillus spp. từ 32 chủng qua sàng lọc từ mẫu đất và nước tại Cần Giờ được đem đi thử nghiệm đều phát triển được ở nhiệt độ 20-40oC (Nguyễn Đức Quỳnh Như và ctv, 2009). Vì vậy, khi chủng Bacillus N6.1 được ứng dụng làm vi sinh vật probiotic thì nên nuôi ở nhiệt độ từ 30-35oC để đạt hiệu quả cao nhất. 4.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên tăng trưởng và khả năng đối kháng E.ictaluri Nồng độ muối ảnh hưởng khá lớn đến sự tăng trưởng và khả năng đối kháng của vi sinh vật có lợi đối với các vi sinh vật gây hại và gây bệnh. Do đó việc xác định được nồng độ muối thích hợp đóng vai trò cần thiết. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 300C, 120 vòng/phút. Tại các nồng độ muối khác nhau, đem đo OD600nm và ghi nhận kết quả. Đồng thời với việc đo OD600nm, tiến hành thu dịch vi khuẩn và khảo sát khả năng đối kháng với E.ictaluri. Kết quả được trình bày trong hình 4.10. 55
  57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Hình 4.10: Ảnh hưởng của nồng độ muối lên tăng trưởng và khả năng đối kháng E.ictaluri của Bacillus N6.1. Các nghiệm thức với các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Dựa vào hình 4.10, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng chịu được tất cả các nồng độ muối khảo sát. Tuy nhiên, ở nồng độ muối 4% Bacillus N6.1 phát triển mạnh nhất, cho mật độ cao nhất và có sự khác biệt ý nghĩa so với các nồng độ muối còn lại (P < 0,05). Tại nồng độ muối 3%, chủng này cũng phát triển mạnh nhưng mật độ thấp hơn so với nồng độ muối 4%. Ở nồng độ muối 1, 2, 5% 56
  58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt chủng này cũng phát triển nhưng mật độ không cao. Trong khi đó tại nồng độ muối 0,5% và 6% mật độ vi khuẩn thấp. Đồng thời dựa vào hình 4.10, chúng tôi nhận thấy rằng tại nồng độ muối 3, 4, 5%, Bacillus N6.1 khả năng đối kháng của Bacillus N6.1 với E.ictaluri là mạnh nhất và có sự khác biệt ý nghĩa so với các nồng độ muối còn lại (P < 0,05). Ở các nồng độ muối 0.5, 1, 2, 6% khả năng đối kháng với E.ictaluri yếu Kết quả này chứng tỏ chủng Bacillus N6.1 phát triển mạnh nhất khi nồng độ muối trong môi trường từ 3 - 4%. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn không tương đồng với khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh, khả năng đối kháng ở nồng độ muối 3% cao nhất. Điều này có thể là do ở nồng độ 3%, Bacillus N6.1 thích nghi và có khả năng tiết ra một số hợp chất ức chế mạnh sự phát triển của E.ictaluri so với các nồng độ muối còn lại. Một số thử nghiệm định tính trước đây, các chủng Bacillus spp. từ 32 chủng qua sàng lọc từ mẫu đất và nước tại Cần Giờ được đem đi thử nghiệm có 4 chủng chịu được 8% muối, 3 chủng chịu được 10% muối (Nguyễn Đức Quỳnh Như và ctv, 2009). Vì vậy, khi chủng Bacillus N6.1 được ứng dụng làm vi sinh vật probiotic thì nên nuôi nồng độ muối 3- 4% để đạt hiệu quả cao nhất. 4.4. Khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật Việc thử nghiệm khả năng chịu được pH thấp và muối mật đóng vai trò khá quan trọng trong quá trình chọn lọc vi khuẩn probiotic. Vì các chủng này chủ yếu cung cấp cho cơ thể vật chủ qua đường tiêu hóa, nếu chúng không chịu được pH thấp và muối mật của dạ dày thì khả năng sống sót của chúng rất thấp. Khi đó sẽ không có hiệu quả trong việc phòng bệnh cũng như hổ trợ tiêu hóa. 4.4.1. Khả năng chịu đựng acid dạ dày pH thấp là một trong những tiêu chí lựa chọn chính cho chủng probiotic (Quwehand và ctv. 1999, Çakır 2003). Vì để vào được ruột non thì vi sinh vật phải đi qua các điều kiện pH thấp của dạ dày (Chou và Weimer,1999,Çakır 2003). 57
  59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Hình 4.11: Khả năng chịu pH thấp của Bacillus N6.1 Dựa vào hình 4.11, chúng tôi nhận thấy rằng ở pH 2, ban đầu vi khuẩn Bacillus N6.1 có mật độ trung bình là 2x107 cfu/ml tương ứng với tỉ lệ sống là 100%, nhưng sau 1 giờ tiếp xúc với với điều kiện pH thấp thì tỉ lệ sống giảm xuống 97.9%. Nhưng tỉ lệ sống lại tăng lên sau 2 giờ tiếp xúc và >100% sau 24 giờ. Ở pH 3, 4 cũng tương tự như vậy sau 1 giờ tiếp xúc với với điều kiện pH thấp thì tỉ lệ sống giảm xuống 97.9%, 99.7%, sau 2 giờ lại tỉ lệ sống lại tăng lên. Nguyên nhân có thể là do chủng này được tăng sinh trong môi trường DSM đã tạo thành bào tử, mà bào tử lại có khả năng sống trong các điều kiện bất lợi của môi trường hơn so với dạng tế bào sinh dưỡng. Do đó, ban đầu ở pha thích nghi mật độ vi khuẩn giảm xuống , nhưng sau đó vi khuẩn bắt đầu thích nghi được chúng phát triển nên mật độ tăng lên. Tuy nhiên ở 3 điều kiện pH thấp sau 24 giờ thì tỉ lệ sống của Bacillus N6.1 cao nhất ở pH 4, pH 3. Kết quả này chứng tỏ 58
  60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt vi khuẩn Bacillus N6.1 là chủng có thể làm probiotic bổ sung vào thức ăn cho các loài thủy sản, đặc biệt là tôm cá vì chủng này có tỉ lệ sống trong điều kiện pH thấp rất cao. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu sự tồn tại của vi khuẩn probiotic trong các điều kiện acid, có khả năng chịu acid dạ dày (pH thử nghiệm bằng 3(Audet và ctv 1988; Jankowski và ctv 1997, Krasaekoopt và ctv 2003; Doleyres và Lacroix 2004). Theo Prasad, và cộng sự, 1998. Khi kiểm tra tất cả các chủng, thì các chủng tồn tại được trong pH 3. Các chủng này được tiếp tục thử nghiệm với pH 2 thì khả năng chịu đựng kém đi. 4.4.2. Khả năng chịu đựng muối mật Hình 4.12: Khả năng chịu muối mật (Bile salt, India) của Bacillus N6.1. Dựa vào hình 4.12, chúng tôi nhận thấy rằng ở nồng độ muối mật 0.3%, ban đầu mật độ vi khuẩn là 2x107 cfu/ml tương ứng với tỉ lệ sống là 100%, sau 1 giờ tiếp xúc tỉ 59
  61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt lệ sống tăng lên và tiếp tục tăng cao sau 2 giờ tiếp xúc. Nhưng tỉ lệ sống lại bắt đầu giảm sau 3 giờ, và giảm mạnh sau 24 giờ. Ở nồng độ muối mật 0.5, 1, 2% cũng tương tự như vậy. Nguyên nhân có thể là do chủng này đã tạo thành bào tử khi được tăng sinh trong môi trường DSM, mà bào tử lại có khả năng sống trong các điều kiện bất lợi của môi trường hơn so với dạng tế bào sinh dưỡng. Do đó, chủng vi khuẩn này thích nghi được và chúng phát triển làm mật độ tăng lên, nhưng khả năng sống trong điều kiện muối mật kém, sau 6 giờ chúng ngừng tăng trưởng bắt đầu đi vào pha tàn lụi nên mật độ giảm xuống, dẫn đến tỉ lệ sống giảm sau 24 giờ. Tuy nhiên ở 4 nồng độ muối mật sau 24 giờ thì tỉ lệ sống của Bacillus N6.1 cao nhất ở 0.3% và 0.5% và thấp nhất là ở nồng độ 2%. Kết quả này chứng tỏ vi khuẩn Bacillus N6.1 là chủng có thể làm probiotic bổ sung vào thức ăn cho các loài thủy sản, đặc biệt là tôm cá vì chủng này có tỉ lệ sống cao trong các điều kiện muối mật sau 3 giờ Theo kết quả nghiên cứu của Prasad và ctv, 1998., các chủng Bacillus spp. có thể phát triển trong 0,3% muối mật sau 4 giờ Một số nghiên cứu khác cho thấy vi khuẩn probiotic có thể phát triển trong MRS có bổ sung 0,5% muối mật (Noriega và ctv, 2006). Nghiên cứu sử dụng nồng độ muối mật từ 1% - 3% đã chỉ ra rằng bào tử của vi khuẩn có thể tồn tại tốt hơn so với các tế bào sinh dưỡng (Chandramouli và ctv, 2004.; Kailasapathy 2005). 60
  62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 4.5. Khả năng phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone 4.5.1. Dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ phân tử tín hiệu quorum sensing (N-hexanoyl homoserine lactone, HHL) và đường kính vòng sắc tố violacein Hình 4.13: Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ phân tử HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein Dựa vào đường chuẩn mối tương quan giữa nồng độ C6-HHL và đường kính vòng sắc tố, ta thiết lập phương trình y = 11,20x + 17,53 để quy đổi từ đường kính vòng tròn violacein sang nồng độ C6-HHL (N-Hexanoyl homoserine lactone). Trong đó: x: ln[HHL] y: đường kính vòng tròn violacein (mm) 61
  63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 4.5.2. Khả năng phân hủy phân tử HHL của Bacillus N6.1 HHL được sử dụng như một hợp chất thử nghiệm bởi vì nó được tạo ra do tác nhân gây bệnh như Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda và Vibrio salmonicida (Swift và ctv.,1997; Morohoshi và ctv, 2004;. Bruhn và ctv, 2005). Quá trình bẻ gãy các phân tử tín hiệu AHL được xúc tác bởi hai lọai enzyme: AHL-acylase và AHL-lactonase. Hình 4.14: Khả năng phân hủy phân tử tín hiệu C6- HHL của Bacillus N6.1 Dựa vào hình 4.14, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ HHL trong mẫu giảm dần theo thời gian khảo sát và có sự khác biệt ý nghĩa so với đối chứng (P < 0,05), điều này chứng tỏ vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng phân hủy HHL mặc dù sự phân hủy HHL xảy ra không hoàn toàn sau 24 giờ. Nồng độ HHL bắt đầu giảm sau 6 giờ và giảm 62
  64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt nhiều nhất sau 24 giờ, pH đo được sau 24 giờ là 8.08, pH này là phù hợp không làm ảnh hưởng đến nồng độ C6-HHL trong môi trường Theo nghiên cứu của Defoirdt và ctv (2010), Đoàn Thanh Loan và ctv (2010), các chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được nuôi cấy trong môi trường có chứa HHL. 8 Vi khuẩn nuôi ở 10 cfu/ml trong đệm LB20 bổ sung 5 mg HHL/L để xác định khả năng phân hủy HHL. Tất cả các vi khuẩn phân lập như: Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis và Bacillus thuringiensis có khả năng phân hủy HHL trong vòng 6-9 giờ. Nồng độ HHL giảm sau 6 giờ, từ 5mg/l còn lại 0,7 - 0,9 mg/l gần như hoàn toàn. Và Bacillus cereus và Bacillus thuringiensis có khả năng phân hủy lactonase enzyme AiiA (Đồng và cộng sự, 2002; Lee và cộng sự, 2002) phân lập từ tôm thẻ chân trắng. 4.6. Khảo sát bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 lên sự phát triển của E. ictaluri bằng phương pháp nuôi chung (co-culture) Để biết được bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 đối với E.ictaluri chúng tôi tiến hành khảo sát như ở phần 3.3.6 và ghi nhận kết quả. Kết quả được trình bày trong bảng 4.2 Bảng 4.2: Khảo sát bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 đối với E. ictaluri bằng phương pháp nuôi chung Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Phương pháp nuôi Dịch sau lọc Canh khuẩn Bacillus N6.1 0 23.7 ± 2.1 Bacillus N6.1 + E. ictaluri (nuôi chung) 14.5 ± 1.32 22.3 ± 5.9 Dựa vào bảng 4.2, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng đối kháng của Bacillus N6.1 chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh. Ở 2 điều kiện nuôi khác nhau dịch sau khi lọc xảy ra đối kháng khi Bacillus N6.1 được nuôi chung với vi khuẩn gây bệnh E.ictaluri. Mặt khác, khả năng đối kháng của dịch vi khuẩn khi có tế bào sinh dưỡng ở 2 điều kiện nuôi cũng khác nhau. Ở điều kiện nuôi riêng Bacillus N6.1 khả 63
  65. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt năng đối kháng của chủng vi khuẩn này với E.ictaluri mạnh hơn, đường kính vòng kháng khuẩn to hơn ở điều kiện nuôi chung Nhìn chung, chủng vi khuẩn này khi ở điều kiện bình thường thì chúng không tiết ra hợp chất đối kháng, nhưng khi gặp điều kiện bất lợi, có sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh thì chúng lại tiết ra hợp chất ức chế vi khuẩn gây bệnh. Điều này lí giải tại sao dịch sau khi lọc 0.2 µm ở điều kiện nuôi riêng lại không có khả năng đối kháng. Tuy nhiên, canh khuẩn ở 2 điều kiện nuôi có khả năng đối kháng không tương đồng do ở điều kiện nuôi chung, Bacillus N6.1 vừa tiết ra chất đối kháng chống lại E.ictaluri vừa bị cạnh tranh dinh dưỡng nên không phát triển, mật độ giảm dẫn đến đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ hơn ở điều kiện nuôi riêng Kết quả này chứng tỏ bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 là tiết chất đối kháng khi có sự hiện diện của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Tóm lại, chủng Bacillus N6.1 có khả năng sinh một số enzyme ngoại bào, chủng này tăng trưởng và đối kháng mạnh ở nồng độ muối 3-5%, pH từ 7-8 và nhiệt độ từ 30- 35oC. Có khả năng chịu muối mật và acid dạ dày, đồng thời có khả năng phân hủy tính hiệu HHL, tiết chất đối kháng khi có sự hiện diện của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Vì vậy, chủng này là chủng tiềm năng có thể sử dụng làm chế phẩm probiotic phục vụ cho nuôi trồng thủy sản. 64
  66. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Theo kết quả của một số khảo sát cho thấy vi khuẩn Bacillus N6.1có một số đặc tính sau: Có khả năng sinh các enzyme ngoại bào như: amylase, cellulase, caseinase, gelatinase, nhưng không có khả năng sinh enzyme lipase Tăng trưởng và đối kháng mạnh ở nhiệt độ từ 30-35oC, tốt nhất ở 30oC. Ở nồng độ muối từ 3-4%, pH từ 7-8, tốt nhất ở pH 8 Có khả năng chịu đựng acid dạ dày và nồng độ muối mật từ 0.3-2% Có khả năng phân hủy tín hiệu HHL sau 6 giờ, và nồng độ HHL còn lại trong môi trường giảm mạnh sau 24 giờ nhưng không phân hủy hoàn toàn Có khả năng sản xuất các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong môi trường khi tiến hành nuôi chung nhưng không có khả năng hình thành các hợp chất này trong điều kiện không có sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh. 5.2. Đề nghị Để có thể đưa chủng này vào ứng dụng thực tế, cần tiến hành thêm một số khảo sát sau: Định danh bằng sinh học phân tử để xác định chính xác tên loài Khả năng tương thích với các chủng khác Khả năng bảo hộ cá tra ở điều kiện in vivo Một số thông số kỹ thuật lên men nếu chủng này được chọn làm probiotic 65
  67. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Hạnh, V.T., L.T.B. Phượng, L.T. Hưng, T.T.H. Vân và T.T. Phong (2004). Nghiên cứu sản xuất chế phẩm VEM dùng trong nuôi trồng thủy sản, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc về NC&ƯD KHCN trong nuôi trồng thủy sản. Lý Thị Thanh Loan, Đỗ Quang Tiền Vương, Nguyễn Thanh Trúc, Thới Ngọc Bảo, Đặng Ngọc Thùy, Lưu Đức Điền (2007). Quan trắc, cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh một số vùng nuôi thủy sản ở các tỉnh phía nam – năm 2005, Tuyển tập Nghề Cá Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007. Nguyễn Văn Minh (2010). Phân lập và sàn lọc một số vi khuẩn làm probiotic trong nuôi trồng thủy sản từ trùng quế(Peryonyx escavatus),luận văn thạc sĩ, Đại học khoa học Tự nhiên, Tp HCM. Nguyễn Đức Quỳnh Như, Trần Thị Thanh Thảo, Huỳnh Bái Nhi, Trần Cát Đông, (2009). Phân lập và sàng lọc một số chủng Bacillus làm probiotic trong nuôi thủy sản, Bộ KH và CN, Tuyển tập hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc khu vực phía nam, tr 444-449. Đặng Thị Hoàng Oanh .Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ Nguyễn Thanh Phương (2007). Báo cáo tổng kết đề tài “Quan trắc môi trường và xác định tác nhân gây bệnh trên cá da trơn (Tra – Pangasianodon hypophthalmus và Basa – Pangasius bocourti) và Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ở tỉnh An Giang”. Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, 81 trang. Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004).Bệnh học thủy sản, NXB Nông nghiệp Tp HCM. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Vũ Hồng Như Yến (2007). Hổn hợp vi khuẩn phân hủy N- ACYL Hormoserine Lactone giúp nâng cao tỉ lệ sống của ấu trùng cá Turbot 66
  68. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt (Scophthalmus maximus L.).Tuyển tập nghề nuôi cá sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2008). Chuyên đề 3: Các phương pháp xác định cơ chế tác động của vi khuẩn Probiotic. Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy (2010).Khảo sát các điều kiện nuôi cấy và phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7, Đại học Đà Nẵng. Tài liệu tiếng anh Aboagye, D.L., Daniels, W.H., Terhune, J.S., Arias, C.R. (2008). The effect of the probiotic Lymnozyme on survival of channel catfish challenged with Edwardsiella ictaluri. Aquaculture America 2008 – Meeting abstract. Austin, B. & Austin, D.A. (1999). Enterobacteriacea representatives. In: Bacterial Fish Pathogens: Diseases of Farmed and Wild Fish (ed. By B. Austin & D.A. Austin), 3rd edn, pp. 81-84. Springer Praxis Publishing, Chichester. Brown, M.R., S.M. Barrett, J.K. Volkman, S.P. Nearhos, J.A. Nell, and G.L. Allan (1996) Biochemical composition of new yeasts and bacteria evaluated as food for bivalve aquaculture. Aquaculture 143:341-360. Crumlish, M., Dung, T.T., Turnbull, J.F., Ngoc, N.T.N., Ferguson, H.W. (2002). Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 25, 733-736 Ferguson, H.W., Turnbull, J.F., Shinn, A., Thompson, K., Dung, T.T., Crumlish, M. (2001). Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 24, 509-513 67