›

Đồ án Khảo sát khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic từ một số sản phẩm lên men truyền thống Việt Nam

pdf 79 trang thiennha21 12/04/2022 8590
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic từ một số sản phẩm lên men truyền thống Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_kha_nang_sinh_hop_chat_khang_khuan_cua_vi_khu.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic từ một số sản phẩm lên men truyền thống Việt Nam

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ MỘT SỐ SẢN PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Ths. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Phan Thị Thùy Linh MSSV: 1051110100 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, hình ảnh, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đây. Nếu có bất kỳ sự gian dối nào, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 Sinh viên Phan Thị Thùy Linh iii
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước tiên cho em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, Quý thầy cô giảng dạy tại khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học cùng với tất cả các thầy cô đã truyền dạy kiến cho em trong những học kì vừa qua. Những năm học vừa qua đã giúp em tích lũy được những kiến thức vô cùng quan trọng và cần thiết cho em, những kiến thức này sẽ giúp em rất nhiều trong cuộc sống và áp dụng vào trong công việc sau này giúp ích cho xã hội, cuộc sống. Đặc biệt, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Bên cạnh đó em cũng xin cảm ơn các thầy trong phòng thí nghiệm đã tạo cơ hội cho em có không gian thực hiện đồ án và cũng cảm ơn những người bạn đã quan tâm và gúp đỡ em nhiệt tình trong thời gian vừa qua. Đồng thời em xin kính chúc Quý thầy cô trường Đại Học Kỹ Thuật Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh luôn mạnh khỏe để tiếp bước con đường sự nghiệp “Trồng Người” của mình. Chúc các bạn dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp. Cuối cùng, con gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, cùng các anh chị em trong gia đình đã quan tâm và nâng đỡ con mỗi khi con khó khăn trong quá trình học tập cũng như trong cuộc sống để con có được thành tựu như hôm này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 Sinh viên Phan Thị Thùy Linh iv
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮC viii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Nội dung nghiên cứu 3 4. Phạm vi nghiên cứu 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1. Vi khuẩn lactic 4 1.2. Đặc điểm chung của khuẩn lactic 4 1.2.1 Đặc điểm hình thái của khuẩn lactic 5 1.2.2. Đặc điểm sinh lý- sinh hóa 7 1.2.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 7 1.2.2.2. Quá trình trao đổi chất 9 1.2.3. Cơ sở sinh học của quá trình hình thành các hợp chất kháng khuẩn 10 1.2.3.1. Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn lactic sản sinh 11 1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic 15 1.3.1. Môi trường nuôi cấy 15 1.3.2. Điều kiện nuôi cấy 16 1.3.3. Chất ức chế và chất làm bất hoạt bacteriocin 17 1.4. sự phân bố của vi khuẩn lactic 17 1.4.1. Sữa chua lên men 18 1.4.2. Rau cải muối chua 19 1.4.3. Các sản phẩm lên men từ thịt (nem chua) 20 1.5. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh hợp chất kháng khuẩn trong và ngoài nƣớc 20 v
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.5.1. Các nghiên cứu trong nước 20 1.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 22 CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Vật liệu 26 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 26 2.1.2. Thời gian thực hiện 26 2.2. vật liệu nguyên cứu 26 2.2.1. nguồn mẫu phân lập vi khuẩn lactic 26 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị 26 2.2.3. Hóa chất dụng cụ và thiết bị 27 2.2.3.1. Môi trường nuôi cấy và phân lập 27 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị 27 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.3.1. Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu 28 2.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu 28 2.3.3. Phương pháp tăng sinh 29 2.3.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 29 2.3.4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 29 2.3.4.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu 30 2.3.5. Phương pháp định danh vi sinh vật 31 2.3.5.1. Phương pháp nhuộm Gram 32 2.3.5.2. Phương pháp nhuộm bào tử 32 2.3.5.3. Phương pháp thử nghiệm catalase 32 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 32 2.3.6.1. Phương pháp đo đường kính vòng tròn kháng khuẩn 32 2.3.6.2. Phương pháp đồng nuôi cấy 33 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu 33 2.4. Bố trí thí nghiệm 34 2.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và đinh danh sơ bộ vi khuẩn lactic 35 2.4.1.1. Phân lập vi khuẩn lactic 35 2.4.1.2. Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic 36 vi
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Thí nghiệm 2: Sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn mạnh 36 2.4.2.1. Thí nghiệm 2.1: Sàng lọc các chủng LAB có khả năng đối kháng mạnh đối với vi khuẩn chỉ thị 36 2.4.2.2. Thí nghiệm 2.2: Sàng lọc các chủng LAB có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn đối kháng mạnh với vi khuẩn chỉ thị 36 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 38 3.1.1. Kết quả phân lâp khuẩn lactic 38 3.1.2. Kết quả định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 39 3.2. Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic co khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn chỉ thị 41 3.2.1. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng cua sinh khối khuẩn lactic đối với vi khuẩn chỉ thị 41 3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập 45 KẾT LUÂN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 1. Kết luận 49 2. Đề nghị 49 Tài liệu tham khảo 51 Phụ lục vii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮC EMP: Embden – Meyerhoff – Parnas LAB: Lactic Acid Bacteria WHO: World Health Organization viii
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách mẫu phân lập vi khuẩn lactic 26 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn lactic phân lập 37 Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 39 DANH MỤC CÁC ẢNH ix
  9. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. Một số chủng lactic điển hình 5 Hình 1.2. Chủng vi khuẩn Lactobacteriumbungaricus 18 Hình 1.3. Chủng vi khuẩn L. brevis và chủng Str. Cremoris 19 Hình 2.1 Phương pháp pha loãng mẫu 28 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 34 Hình 2.3 Quy trình phân lập vi khuẩn lactic 35 Hình 3.1 Hình dáng khuẩn lạc của chủng SCPR03 quan sát được dưới kính hiển vi 39 Hình 3.2. Kết quả nhuộm gram và nhuộm bào tử của chủng SCYK 02 41 Hình 3.3. Mẫu thử catalase của 2 chủng NCTC02 và NCTC03 41 Hình 3.5. Đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn chỉ thị của các chủng SCPR01, SCPR02, SCPR03, SCYK01, SCYK02 VÀ SCYK03 (mm). 42 Hình 3.6. Đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn của các chủng CPMC, NCVS, MCTC, KCHQ, NCTC01, NCTC02 VÀ CCTC (mm) 43 Hình 3.4.Vòng kháng vi khuẩn chỉ thị của chủng vi khuẩn SCPR02 và chủng SCPR03. 44 Hình 3.4. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch sau ly tâm vi khuẩn lactic không trung hòa acid hữu cơ 46 Hình 3.6. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch sau ly tâm vi khuẩn lactic trung hòa acid hữu cơ. 47 x
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Sản phẩm lên men được biết đến từ lâu nhờ việc bổ sung muối và đường vào để thu được một loại sản phẩm ăn ngon và có giá trị dinh dưỡng cao. Thực tế việc bổ sung này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của một vài loài vi sinh vật có sẵn trong sản phẩm để sinh ra một số chất làm cho sản phẩm có hương vị đặc biệt có tác dụng bảo quản sản phẩm lâu bị hỏng. Ngày nay người ta đã biết rằng các đặc tính quý báu đó của sản phẩm là kếtquả của quá trình lên men đường thành acid lactic, thực hiện bởi nhóm vi khuẩn lactic có trong hệ vi sinh vật tự nhiên của các sản phẩm. Các vi sinh vật này cũng có thể được thêm vào trong quá trình sản xuất (chủng khởi động – starter cultures). Như nem chua là sản phẩm thịt lên men lactic cổ truyền của người Việt Nam được rất nhiều người ưa thích. Nem chua chế biến theo phương pháp truyền thống, cho chất lượng sản phẩm không ổn định do nhiều yếu tố như: phụ thuộc vào hệ vi sinh vật tự nhiên và trong thịt, chất lượng nguyên liệu thịt, điều kiện và qui mô sản xuất. Những yếu tố này rất khó kiểm soát trong điều kiện sản xuất thủ công, gây ra sự mất ổn định cho chất lượng sản phẩm. Đặc biệt thịt nguyên liệu do quá trình giết mổ vận chuyển thủ công nên sự nhiễm tạp các vi sinh vật không mong muốn là rất lớn vì vậy nguy cơ ô nhiễm các vi sinhvật gây bệnh là rất cao gây nguy hiểm cho sức khỏe con người. Hay như xúc xích lên men là một trong những sản phẩm thịt lên men khá phổ biến trên thế giới.Tùy từng vùng, địa phương mà mỗi nơi có những sản phẩm đặc trưng rất nổi tiếng như: Chorozi (Tây Ba Nha), Salami (Ý) hay Summer (Mỹ). Trong số đó xúc xích lên men Summer là sản phẩm thịt lên men ở nhiệt độ cao, thời gian lên men ngắn rất giống với sản phẩm nem chua Việt Nam. Tuy nhiên việc sử dụng các sản phẩm lên men trên cũng thường hay gặp các vấn đề về ngộ độc thực phẩm, điều này đã và đang trở thành một trong những vấn đề cấp thiết cần được giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người. Bên cạnh đó, việc dùng chất bảo quản thực phẩm hóa học đang bị hạn chế sử dụng vì những tác dụng 1
  11. Đồ án tốt nghiệp phụ không có lợi của nó. Vì vậy, việc tìm ra những chất bảo quản vừa an toàn, vừa hiệu quả đang là vấn đề thách thức cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Kết quả nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy vi khuẩn lactic không những có thể lên men lactic rau quả mà còn có những tác động hiệu quả trong việc bảo quản thực phẩm. Đặc tính của vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, có thử nghiệm oxidase và catalase âm tính, hình que hay hình cầu, không tạo bào tử (Abee và ctv, 1999). Hệ vi sinh vật này là một trong những nguồn vi sinh vật sinh ra bacteriocin, dạng chất kháng khuẩn có khả năng chống lại sự phát triển của các mầm bệnh và được ứng dụng như chất bảo quản thực phẩm. Hầu hết vi khuẩn lactic đều tổng hợp được bacteriocin nên thành phần kháng khuẩn này rất đa dạng như Lactacin, Nisin, Acidolin, Từ rất lâu các bacteriocin này đã được ứng dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, điển hình là Nisin. Năm 1953, thương phẩm Nisaplin xuất hiện trên thị trường như chất bảo quản thực phẩm và đến năm 1969, tổ chức WHO công nhận Nisin là chất bảo quản an toàn có nguồn gốc sinh học. Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện chủ yếu trong sản phẩm lên men truyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, nem chua. Do đó, việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn mạnh là một yếu tố hết sức quan trọng và cần thiết ứng dụng trong công nghệ sản xuất và bảo quản thực phẩm, thay thế cho các chất phụ gia hóa học, ngoài ra còn ứng dụng trong tạo chế phẩm sinh học nhằm nâng cao tỷ lệ sống của động vật đối với vi khuẩn gây bệnh và xa hơn nữa là ứng dụng trong y học. Với ý nghĩa thực tiễn và khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic từ một số sản phẩm lên men truyền thống Việt Nam”. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu bước đầu phân lập và tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ một số nguồn sản phẩm lên men có sẵn trên thị trường. Qua đó có thể tiến hành định danh và tiếp tục nghiên cứu điều kiện sinh chất kháng khuẩn cao để có thể ứng dụng vào sản xuất chất bảo quản thực phẩm tự nhiên. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp 2. Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn có tính đối kháng mạnh đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị từ các sản phẩm lên men truyền thống 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và tiến hành định danh sơ bộ vi khuẩn lactic. - Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn. 4. Phạm vi nghiên cứu - Chỉ tiến hành phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu thực phẩm lên men truyền thống của Việt Nam. - Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic đối với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị là Escheria coli, Salmonella, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis và Listeria monocytogenes. 3
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vi khuẩn lactic Theo Bergey’s Manual of systematic Bacteriology vi khuẩn thuộc họ lactoc thuộc: Giới: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillaceae Họ: lactobacillaceae Chi: lactobacillus Vi khuẩn lactic (LAB) thuộc họ Lactobacillaceae. Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau. Tất cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, không di động, hô hấp tùy nghi (kị khí và hiếu khí) và không chứa các men hô hấp như cytochrome và catalase. Chúng thu nhận năng lượng nhờ quá trình phân giải carbonhydrat và sinh ra acid lactic, sinh sản bằng hình thức phân đôi tế bào. Việc phân loại vi khuẩn lactic thành các chi khác nhau chủ yếu dựa vào hình thái, con đường lên men glucose, sự tăng trưởng ở các nhiệt độ khác nhau, cấu hình của acid lactic được sản xuất, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao và khả năng chịu acid hoặc chịu kiềm (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010). 1.2. Đặc điểm chung của khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, thử nghiệm oxydase và catalase âm tính, hình que hay hình cầu, không tạo bào tử, không di động, kỵ khí tùy nghi và lên men carbohydrate tạo sản phẩm chính cuối cùng là acid lactic (Abee và ctv, 1999). Ngoài ra, nó còn sản sinh ra acid acetic, ethanol, các hợp chất thơm, bacteriocin, exopolysaccharide và một số enzyme quan trọng khác (Vuyst và Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic thường được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, đặc biệt là các thực phẩm lên men vì nó có thể sản xuất ra một vài hợp chất góp phần vào tăng 4
  14. Đồ án tốt nghiệp mùi, vị, màu sắc và kết cấu của thực phẩm. Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy rằng vi khuẩn lactic không những có thể lên men rau quả mà còn có thể ứng dụng trong bảo quản thực phẩm do chúng có khả năng sinh ra các hợp chất kháng khuẩn như bacteriocin, là hợp chất kháng khuẩn có khả năng chống lại sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh. Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic hiện diện chủ yếu trong các sản phẩm lên men truyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, nem chua và một số sản phẩm men tiêu hóa đông khô (Ngô Thị Phương Dung và ctv, 2011). - Vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống khác nhau: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Ngày nay người ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium. Hình 1.1. Một số chủng lactic điển hình Pediococcus I (a), Streptococcus (b), Lactobacillus (c), Leuconostoc (d) 1.2.1 Đặc điểm hình thái của khuẩn lactic Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài. Nhóm vi khuẩn 5
  15. Đồ án tốt nghiệp này có rất nhiều hình dạng khác nhau: có hình trực khuẩn ngắn hoặc dài ở dạng đơn, đôi hoạt xếp thành chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi. Ngoài ra vi khuẩn lactic còn có dạnh hình que. Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng; có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem ; hoặc khuẩn lạc có kích thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid. Vi khuẩn lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, đường disaccharide, protein tan, peptone và acid. Phần lớn chúng không thủy phân được tinh bột và các polisaccharide khác. Vi khuẩn lên men lactic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua. Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae, thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que. Theo khóa phân loại của Bergey 1986 giới thiệu về các giống của vi khuẩn lactic, thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus. Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae một nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic. Trong 5 giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu nhiều nhất đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Đây là những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn không tạo bào tử. Tất cả vi khuẩn lactic đều không chuyển động, gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi. - Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào 0,5-1µm. Sau khi phân chia theo một phương, chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn. - Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5 – 0,8 µm và chiều dài khoảng 1,6 µm. Trong một số điều kiện chúng cũng có dạng 6
  16. Đồ án tốt nghiệp hơi tròn, chiều dài khoảng 1 – 3 µm. Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung. - Giống Lactobacillus có dạng hình que. Tùy vào điều kiện của môi trường sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài. Sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẽ. - Giống Pedicoccus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn. Có hoạt tính thủy phân protein rất yếu. - Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể phân nhánh dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy truyền chúng trở thành dạng trực khuẩn dạng thẳng hay uốn cong. Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 – 8 μm. Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2 ÷ 3 %) liên cầu khuẩn (khoảng 1 %). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8 ÷ 4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5 ÷ 6. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25 ÷ 350C, ưa nhiệt là 40 ÷ 450C và ưa lạnh là thấp hơn 50C. Khi gia nhiệt khoảng 60 ÷ 800C thì hầu hết chúng bị chết sau 10 ÷ 30 phút. Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại rau, quả, sữa, thịt, ). 1.2.2. Đặc điểm sinh lý- sinh hóa 1.2.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở 7
  17. Đồ án tốt nghiệp bản như carbon, nitơ, phosphate và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ * Nhu cầu dinh dưỡng carbon: - Nguồn carbon tốt nhất là các loại đường như glucose, frutose, maltose, galactose, sarcharose, lactose cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin). - Nguồn dinh dưỡng quan trọng cho vi khuẩn lactic là monosarcharid và disarcharide. Các nguồn carbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như acid malic, pyruvic, fumaric, aketic. Tuỳ từng loại vi khuẩn lên men lactic đồng hình hay dị hình mà có các sản phẩm tạo ra trong quá trình lên men khác nhau khi chúng sử dụng các axid gluconic tạo thành CO2, acid acetic, acid lactic. Khi sử dụng acid amin như acid glutamic. Arginin, tirozin thì xảy ra quá trình đề cacbonxyl và tạo ra CO2. - Các loại vi khuẩn khác nhau thì sử dụng các nguồn cacbon khác nhau, chẳng hạn: Streptococcus lactic sử dụng tốt glucose, lactose, maltose. Lactobacillus bulgaricus, sử dụng glucose, maltose, galactose, sarcharose, dextrin nhưng không sử dụng được lactose * Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, tryptone, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone, Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém *Nhu cầu về Vitamin: Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào 8
  18. Đồ án tốt nghiệp môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men * Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác: Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic. *Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, phosphor, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. 1.2.2.2. Quá trình trao đổi chất Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: - Vi khuẩn lên men lactic đồng hình: Thực hiện quá trình lên men tạo ra sản phẩm chủ yếu là acid lactic. Do trong hệ enzyme của chúng có chứa aldolaza và triozophotphatizomeraza nên quá trình lên men này xảy ra theo con đường EMP. - Vi khuẩn lên men lactic dị hình: Thực hiện quá trình lên men, ngoài axid lactic chúng còn tạo ra các sản phẩm phụ khác như acid acetic, rượu etylic, CO2, một số chất thơm Đây là quá trình lên men rất phức tạp, không theo con đường EMP vì chúng không có hai enzyme cơ bản là aldolaza và triozophotphatizomeraza. 9
  19. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3. Cơ sở sinh học của quá trình hình thành các hợp chất kháng khuẩn Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hóa tự dưỡng nên sự oxy hóa các chất trong quá trình trao đổi chất cung cấp nguồn năng lượng cho các hoạt động sống của vi khuẩn. Dựa vào sản phẩm cuối cùng được hình thành trong quá trình lên men glucose, quá trình lên men lactic được chia thành 2 quá trình lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010). Trong quá trình lên men lactic đồng hình, acid pyruvic được tạo thành qua con đường Embden – Meyerhoff – Parnas (EMP). Sau đó acid pyruvic sẽ tạo thành acid lactic dưới tác dụng của enzyme lactate dehydrogenase. Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90%, chỉ một lượng nhỏ pyruvate bị khử carbon tạo thành acid acetic, ethanol, CO2 Lượng sản phẩm phụ tạo thành phụ thuộc vào sự có mặt của oxy (Khalid, 2011). Vi khuẩn lên men lactic đồng hình như Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus và một số Lactobacilli sản xuất acid lactic là sản phẩm chính cuối cùng hoặc duy nhất của quá trình lên men glucose. Các vi khuẩn lên men lactic đồng hình sử dụng con đường EMP để tạo ra 1 phân tử acid lactic từ mỗi mole glucose và thu được nguồn năng lượng gấp hai lần so với quá trình lên men lactic dị hình với mỗi mole glucose. Vi khuẩn lên men lactic dị hình như Weisella, Leuconostoc và một số chủng Lactobacilli khác cũng tạo ra số lượng acid lactic, CO2 và ethanol bằng nhau từ glucose thông qua con đường hexose monophosphate hoặc pentose phosphate (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010). Trong quá trình lên men lactic dị hình chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như acid acetic, ethanol, CO2 Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm. Sản phẩm phụ tạo thành phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh. Acid lactic thường chiếm 40%, acid succinic 20%, rượu etylic 10%, acid acetic 10% và các loại khí khác gần 20% lượng sản phẩm tạo thành. Acid hữu cơ được sản xuất trong quá trình lên men tạo ra môi trường acid không thuận lợi cho sự phát triển của nhiều vi khuẩn gây bệnh và gây hư hỏng thực 10
  20. Đồ án tốt nghiệp phẩm như acid lactic, acid acetic và acid propionic. Acid thường thể hiện tính kháng khuẩn thông qua việc can thiệp tính ổn định điện thế trên màng tế bào, ức chế hoạt động vận chuyển, làm giảm pH trong tế bào và ức chế chức năng chuyển hóa. Nó có tính kháng khuẩn diện rộng ức chế cả vi khuẩn gram dương và gram âm cũng như nấm men và nấm mốc (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010).Một ví dụ điển hình là acid propionic được sản xuất bởi vi khuẩn sinh acid propionic, những chủng này hình thành một số sản phẩm bảo quản sinh học cơ bản, có hoạt động kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh bao gồm nấm men và nấm mốc. Ngoài các acid hữu cơ, các chủng khởi động quá trình lên men lactic cũng có thể sản xuất một loạt các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con đường lên men dị hình, H2O2 được sản xuất trong quá trình tăng trưởng hiếu khí và diacetyl được hình thành từ sự phân hủy pyruvate có nguồn gốc từ citrate. Đặc biệt, H2O2 có tác dụng oxy hóa mạnh mẽ trên màng lipid, protein của tế bào và được sản xuất bằng cách sử dụng các enzyme như protein flavo oxidoreductases peroxidase NADH, NADH oxidase và oxidase α-glycerophosphate (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010). Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy rằng mỗi hợp chất kháng khuẩn được sản xuất trong quá trình lên men ngăn cản vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm trước khi nó có thể tồn tại hoặc phát triển trong thực phẩm hoặc đồ uống, kể từ thời điểm sản xuất tới thời gian tiêu thụ. Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic đã được xác định bởi khả năng kháng lại các vi khuẩn không mong muốn nhờ vào các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất ra trong quá trình lên men (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010). 1.2.3.1. Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn lactic sản sinh LAB biểu thị một loạt các hoạt động kháng khuẩn. Trong số các hoạt động đó, việc sản xuất acid lactic và acid acetic là quan trọng nhất. Ngoài ra, một số chủng LAB được biết đến để sản xuất các hợp chất kháng khuẩn như ethanol, acid formic, acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, reutericyclin và bacteriocin. Bên cạnh việc sản xuất ra hợp chất như bacteriocin, một số LAB còn có thể tổng 11
  21. Đồ án tốt nghiệp hợp peptide kháng khuẩn khác góp phần vào việc bảo quản thực phẩm một cách an toàn. Một trong những đặc điểm của các hợp chất kháng khuẩn là khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh đường ruột như Helicobacter pylori, Escherichia coli, Salmonella (Vuyst và Leroy, 2007). a. Acid hữu cơ Sản phẩm chính của quá trình lên men là các acid hữu cơ, tùy vào từng loại vi sinh vật và điều kiện môi trường mà sản phẩm acid là khác nhau (Yang, 2000). Acid lactic là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic. Acid lactic làm giảm pH môi trường dẫn đến ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh nên có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Khi acid lactic đi qua màng tế bào, nó sẽ giải phóng ra proton H+, làm acid hóa nội bào, phá hủy cơ chế vận chuyển qua màng tế bào gây chết tế bào vi khuẩn (Đặng Phương Nga và ctv, 2007). Mặt khác, pH giảm cũng ức chế quá trình đường phân, tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến chết tế bào. Quá trình lên men lactic dị hình cho sản phẩm acid acetic và acid, có thể tương tác với màng tế bào vi khuẩn gây acid hóa nội bào và làm biến tính protein. Acid acetic thể hiện tính kháng khuẩn hiệu quả hơn acid lactic điển hình là với Listeria monocytogenes và Bacillus cereus. Acid acetic cùng với acid acetic làm giảm pH môi trường và do đó làm tăng khả năng kháng khuẩn của acid lactic (Yang, 2000). b. Hydrogen peroxide và carbon dioxide Tính kháng khuẩn của hydrogen peroxide chủ yếu thông qua việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc superoxide và các gốc hydroxyl tự do. Các chủng Lactobacillus, Lactococcus sản xuất hydrogen peroxide có khả năng ức chế Staphylococcus aureus và Pseudomonas sp. Carbon dioxide được sản xuất thông qua con đường lên men lactic dị hình có thể ức chế enzyme decarboxylase và sự tích tụ của khí carbon dioxide trong lớp đôi lipid kép có thể gây ra rối loạn chức năng trong thẩm thấu. Carbon dioxide có khả 12
  22. Đồ án tốt nghiệp năng ức chế nhiều vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm đặc biệt là vi khuẩn gram âm, mức độ ức chế khác nhau đáng kể giữa các vi sinh vật (Yang, 2000). c. Diacetyl và acetaldehyd Diacetyl thường được sản xuất bởi các dòng vi khuẩn lactic lên men citrate. Hiệu quả kháng khuẩn của diacetyl đã được biết đến từ những năm 1930. Nó ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gram âm bởi phản ứng với các protein arginine, do đó ảnh hưởng đến việc sử dụng arginine. Và vi khuẩn gram âm là nhạy cảm hơn với diacetyl so với vi khuẩn gram dương. Diacetyl 344 mg/ml ức chế các chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella, Yersinia, Escherichia coli và Aeromonas. Acetaldehyde 10 – 100 ppm ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium và E. coli trong các sản phẩm sữa (Yang, 2000). d. Acid béo Các acid béo không bão hòa có khả năng ức chế vi khuẩn gram dương, các hoạt động kháng nấm của acid béo phụ thuộc vào chiều dài chuỗi và pH của môi trường (Yang, 2000). e. Reuterin Reuterin có khả năng ức chế sự phát triển của hầu hết các vi sinh vật có hại như vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm men, nấm mốc, kí sinh trùng và thậm chí cả virus. Reuterin có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do nó cạnh tranh với các ribonucleotide trong việc gắn với vị trí nhận biết ribose của ribonucleotide reductase - enzyme đầu tiên khởi động quá trình tổng hợp DNA. f. Bacteriocin Hầu hết vi khuẩn lactic đều tổng hợp được bacteriocin hay những chất gần giống bacteriocin nên chủng loại của các hợp chất kháng khuẩn này rất đa dạng như lactacin, nisin, acidolin, Các chất này có bản chất là kháng sinh nên có thể ức chế các tế bào trong cùng họ hay khác họ (Đặng Phương Nga và ctv, 2007). Từ rất lâu các bacteriocin này đã được ứng dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, điển hình là nisin. Năm 1953, dạng thương phẩm của nisin là Nisaplin xuất hiện trên thị trường như chất bảo quản thực phẩm và đến năm 1969, tổ chức WHO công nhận 13
  23. Đồ án tốt nghiệp Nisin là chất bảo quản an toàn có nguồn gốc sinh học (Ngô Thị Phương Dung và ctv, 2011). Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ở riboxom của cả vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương để ức chế các vi sinh vật cạnh tranh khác. Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm nhưng không trực tiếp làm chết vi sinh vật. Chính vì lý do này nên thời kỳ đầu người ta chỉ tập trung vào phát triển các chất kháng sinh, còn các chế phẩm bacteriocin bị xem nhẹ và không được quan tâm đúng mức. Theo thời gian sử dụng chất kháng sinh, hiện tượng kháng thuốc xuất hiện và ngày càng trở nên trầm trọng đã gián tiếp xác nhận đặc tính quý giá của các bacteriocin là nguy cơ gây ra hiệu ứng trên của chúng rất thấp. Nhờ vậy mà việc nghiên cứu, sản xuất và sử dụng các bacteriocin đã được phục hồi và phát triển. Các chế phẩm bacteriocin điển hình là nisin, diplococin, subtilin, lactostrepcin, bacteriocin S50, monocin (từ Lactococcus), pediocin A, pediocin PA–1, pediocin AcH (từ Pediococcus), lactocidin, acidolin, acidolin, acidophilin, reuterin, lactocin F, lactocin 27, helveticin J (từ Lactobacillus), leuconocin S, carnocin UI49, micrograd (từ Leuconostoc), propionicin PLG–1, jensenin G (từPropionicbacterium) (Lê Thị Hồng Vân, 2008). Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin. Một vài bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn lactic như nisin không chỉ ức chế các loài liên quan chặt chẽ mà còn chống lại các tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm và vi khuẩn gram dương, thêm vào đó bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác. Vì vậy, trong những năm gần đây bacteriocin đã nhận được sự quan tâm đáng kể trong việc sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và ứng dụng trong dược phẩm vì tính an toàn của chúng. Những nghiên cứu đã được thực hiện để giải quyết mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của bacteriocin lớp I và lớp II. Phần lớn bacteriocin trong lớp I và II hoạt động trong trong vùng các phân tử có kích thước nano, gây ra tính thấm của màng dẫn đến sự hao hụt các thành phần của màng, hao tổn các ion, ATP và 14
  24. Đồ án tốt nghiệp các phân tử quan trọng khác từ vi khuẩn đích (Vuyst và Leroy, 2007). Ngoài ra Klaenhammer (1999) đã đề nghị thêm nhóm 4, là nhóm chứa các bacteriocin phức tạp, đòi hỏi carbohydrate hay lipid để có hoạt tính. Tuy nhiên bacteriocin của nhóm này chưa được miêu tả nhiều ở mức độ sinh hóa để mở rộng định nghĩa. Nhóm này bao gồm cả glycoprotein như lactocin hoặc lipoprotein như lacstrepcin (J.Delves-broughton và ctv, 1996). *Cơ chế hoạt động của bacteriocin Mặc dù bacteriocin có thể được tìm thấy trong nhiều vi khuẩn Gram dương và Gram âm, nhưng những sản phẩm được sản xuất bởi LAB đã nhận được sự quan tâm đặc biệt trong những năm gần đây do ứng dụng tiềm năng của nó trong ngành công nghiệp thực phẩm như chất bảo quản tự nhiên (Vuyst và Leroy, 2007). Bacteriocin được sản xuất bởi LAB là các peptide hoặc protein nhỏ được tổng hợp do ribosome có hoạt tính kháng lại các vi khuẩn gram dương, trong khi tế bào sản xuất miễn nhiễm với chính bacteriocin do chúng tạo ra. Nó có khả năng kháng lại các vi sinh vật gây hư hỏng và các tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm như Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus. Bên cạnh hoạt động kháng khuẩn đối với các vi khuẩn không mong muốn, bacteriocin còn được cho rằng góp phần vào tính cạnh trạnh giữa các tế bào sản xuất. Người ta đã chứng minh được hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Gram âm nhưE. coli và Salmonella của bacteriocin nhưng thường chỉ khi màng ngoài của chúng đã bị tổn thương, ví dụ như sốc áp suất thẩm thấu, xử lý pH thấp, bị tác động bởi các chất hoạt động bề mặt hoặc tác nhân chelate hoặc sau khi xử lý với dòng điện hoặc áp suất cao (Vuyst và Leroy, 2007). 1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic 1.3.1. Môi trường nuôi cấy Kelstrup và Gibbons (2002) đã thấy rằng sự gia tăng tính nhớt của dịch môi trường bằng cách thêm agar, dextran, glycerol hay tinh bột sẽ gia tăng năng suất sản sinh bacteriocin của vi khuẩn Streptococcus cô lập từ khoang miệng của người và 15
  25. Đồ án tốt nghiệp động vật gặm nhắm. Một nghiên cứu khác của Riley (2007) về staphylococcin 1580 cho thấy nuôi trong môi trường bán rắn sẽ cho năng suất lớn hơn 20 lần so với môi trường lỏng. Quá trình tổng hợp bacteriocin của Streptococcus mutans chỉ diễn ra trong điều kiện môi trường nuôi cấy nhất định. Sự sản xuất bacteriocin của các chủng Streptococcus mutans có thể được gia tăng nếu bổ sung 4% cao nấm men vào môi trường cơ bản Trypticase, còn các chủng Corynebacteria và Staphylococcus phụ thuộc vào hàm lượng amino acid trong môi trường nuôi cấy. Khả năng sản sinh bacteriocin của Staphylococcin 426 tăng nếu thêm 0,5% mannitol vào môi trường brain heart infusion nhưng ngược lại điều đó làm giảm khả năng sản sinh bacteriocin của Staphylococcin 414. Glucose làm tăng khả năng sản sinh bacteriocin của Streptococcin A–FF22 nhưng lại làm giảm khả năng sản sinh bacteriocin của Streptococcin B–74628. Những nghiên cứu khác cho thấy thành phần môi trường nuôi cấy là rất quan trọng (Kelstrup và Funder-Nielsen, 1997). 1.3.2. Điều kiện nuôi cấy Điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau như nhiệt độ, thời gian, oxy và pH ảnh hưởng đến khả năng sản sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn. Bacteriocin được sản xuất nhiều hơn ở điều kiện nhiệt độ tối ưu, nhiệt độ quá cao ngăn cản sự sản sinh bacteriocin (Lê Thị Hồng Vân, 2008). Việc sản sinh bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương thường xảy ra trong khoảng pha log đến pha ổn định, lượng bacteriocin ở các pha trong chu kỳ tăng trưởng là khác nhau. Bacteriocin được Streptocin STH1 sản xuất nhiều nhất trong suốt pha log và giảm dần khi bước vào pha ổn định ngược lại Streptococcin A – FF22 bắt đầu sản sinh bacteriocin ở cuối pha log và hoạt tính giảm dần khi nuôi kéo dài. Staphylococcin C55 sản sinh bacteriocin bắt đầu ở pha log và đạt tối đa trong khoảng 24 đến 48 giờ phát triển sau đó suy tàn dần (Lê Thị Hồng Vân, 2008). Meitert (2005) cho thấy rằng một vài chủng C. diphtheriae sản xuất bacteriocin liên tục nhưng một vài chủng khác lại sản xuất gián đoạn. Theo nghiên cứu của Lachowicz (2002) về khả năng sản sinh bacteriocin của Staphylococcin A– 16
  26. Đồ án tốt nghiệp 1262a trên môi trường rắn hoạt tính được nhận thấy đầu tiên sau 8 giờ, đạt đến tối đa từ 18 đến 24 giờ và sau đó giảm dần về 0. Những nghiên cứu khác cũng cho kết quả rằng hoạt tính bacteriocin bị mất đi khi nuôi kéo dài. Sự ảnh hưởng này liên quan đến sự xuất hiện của chất làm bất hoạt bacteriocin hay enzyme phá hủy hoặc thay đổi chúng. Việc thay đổi pH môi trường cũng quyết định đến khả năng sản sinh bacteriocin của một số chủng vi khuẩn. Một số nghiên cứu cho thấy rằng khả năng sản sinh bacteriocin của Streptococcin A–FF22 trên agar Todd–Hewitt tăng khi điều chỉnh pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến 6,5 (Lê Thị Hồng Vân, 2008). 1.3.3. Chất ức chế và chất làm bất hoạt bacteriocin Davie và Brock (2003) cho thấy rằng acid teichoic có trong lớp vỏ tế bào S. faecalis subsp. zymogenes X14 làm tăng tính miễn dịch của vi khuẩn với bacteriocin do chính nó sản xuất ra (hemolysin). Việc thải ra các sản phẩm ức chế trong quá trình phát triển đã làm mất bacteriocin trong môi trường nuôi cấy. Hoạt tính của bacteriocin trong dịch nổi môi trường nuôi cấy Staphylococcin 1580 được gia tăng khi thẩm tách, điều đó cho thấy rằng các chế phẩm này có thể chứa chất ức chế bacteriocin. Một số bacteriocin được sản xuất bởi Bacteriocinogenic có thể bị phá hủy bởi protease. Tác động này lần đầu tiên được chứng minh ở Serratia marcescens, Clostridium botulinum và Streptococcus nhóm A. Việc đun chế phẩm bacteriocin ổn định nhiệt sẽ làm bất hoạt protease do đó bảo vệ được bacteriocin (Lê Thị Hồng Vân, 2008). 1.4. sự phân bố của vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic rất phổ biến trong tự nhiên. Thường gặp nhất và nhiều nhất là trong các loại thực phẩm lên men như : sữa và các sản phẩm từ sữa (sữa chua, phomat, bơ chua ) trong thịt và các sản phẩm từ thịt (xúc xích, salami, nem chua ) trong các loại thủy sản, ngũ cốc ủ chua; trong bia, rượu vang và rau quả muối chua. Các môi trường này hoặc có sẵn, hoặc được bổ sung các nguồn cơ chất cần thiết, đặc trưng cũng như đảm bảo các điều kiện thích hợp cho sự phát triển của 17
  27. Đồ án tốt nghiệp chúng. Một số các đại diện thường xuất hiện ở nhóm sản phẩm này là: S. lastic, S. cremort's, L. plantarum, L. bulgaricus, L. cesei, L. brevis, L. oenos, L. cremort's.Vi khuẩn lactic còn có ở trong đất, trên bề mặt thực vật (chủ yếu là rau quả và các loại hạt). Chúng sống nhờ các chất sinh trưởng tiết ra từ mô cây. Người ta cũng tìm thấy vi khuẩn lactic trên da, trong tuyến nước bọt, ở niêm mạc và hệ tiêu hóa (nhất là ở đoạn ruột cuối) của người và một số động vật. Hầu hết các loài được phân lập từ đường ruột và các nguồn thịt, cá đều có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh. Đây 1à một đặc tính quý báu của vi khuẩn lactic hiện đang được đẩy mạnh khai thác và đã ứng dụng có hiệu quả. 1.4.1. Sữa chua lên men Sữa chua hay yaourt thực chất là sữa bò tươi được cho lên men với các chủng vi khuẩn có lợi cho đường ruột Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus thermophillus. Chúng chuyển hóa sữa thành lactic, tạo ra độ chua hấp dẫn. Hầu như các loại sữa chua đều được sản xuất từ sữa thanh trùng, do đó mỗi quá trình vi sinh vật xảy ra trong sữa chua là do hệ sinh vật từ giống chuẩn gây ra. Các chủng lên men lactic chủ yếu là giống: -Lactobacterium bungaricus: là trực khuẩn dài, nhiệt độ phát triển tối ưu là 200C, có khả năng lên men glucose, lactose. Có khả năng tạo acid cao (3,7 % acid lactic). - Lactobacterium casei: là những trực khuẩn rất ngắn gây chua sữa tự nhiên. Yếm khí tùy tiện, lên men tốt đường glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có acid lactic từ 0,8 – 1 %. Ở điều kiện bình thường gây chua sữa trong vòng từ 10 – 12 giờ. Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone. Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển 100C, tối ưu là ở 360C và tối đa là 450C, chúng thủy phân casein và gelatin rất yếu. - Steptococus lactic : là cầu khuẩn, sinh trưởng và lên men mạnh khi nuôi cấy 280C, phát triển khá ở 350C và thấp nhất ở 200C. 18
  28. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Chủng vi khuẩn Lactobacteriumbungaricus Sữa chua có giá trị dinh dưỡng cao, chứa đầy đủ các chất protein (với nhiều acid amin cần thiết nhất là lysine), glucid, lipid, các loại muối khoáng (nhất là canxi) và vitamin chủ yếu vitamin nhóm B và nhóm A. - Ngoài giá trị dinh dưỡng trên thì sữa chua còn cung cấp cho cơ thể 1 lượng lớn các vi khuẩn có lợi (Lactobacillus acidophilus, Bifido bacterium ) hỗ trợ khả năng tiêu hóa và giúp tăng cường chất đề kháng. 1.4.2. Rau cải muối chua Muối chua rau củ nhằm hai mục đích cơ bản: bảo quản nguyên liệu và làm tăng giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan của rau củ. Nguyên tắc muối chua rau quả là tạo điều kiện thuận lợi để phát triển vi khuẩn lactic đồng thời hạn chế tác dụng của vi khuẩn gây thối rữa. Các vi khuẩn lactic có tham gia trong quá trình lên men như: L. brevis, Str. Cremoris Hình 1.3. Chủng vi khuẩn L. brevis (a) và chủng Str. Cremoris (b) 19
  29. Đồ án tốt nghiệp 1.4.3. Các sản phẩm lên men từ thịt (nem chua) Sản phẩm lên men từ thịt là sản phẩm hình thành do lên men lactic từ thịt, được sản xuất khắp nơi trong và ngoài nước (xúc xích, salami, nem chua ). Các vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men thuộc họ Latobaceriaceae là các vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, không di động và hiếu khí tùy tiện. Vi khuẩn lactic đồng hình: L. acitophilus, L. bulgarius, L. delbruckii, Str. Lactic, Str. Cremoris Vi khuẩn lactic dị hình: Str. Cumoris, Str. Falecalis, L. brevis, L. lycopssici. 1.5. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh hợp chất kháng khuẩn trong và ngoài nƣớc 1.5.1. Các nghiên cứu trong nước Hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên các nghiên cứu về ứng dụng của bacteriocin còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan. - Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của loài Lactobacillus plantarum L24. Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy. Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Một số đặc tính của Bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn lactobacill. Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh.Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Năm 2004, các tác giả Tăng Thị Chính, Đặng Đình Kim thuộc Viện công nghệ môi trường - Viện KH&CN Việt Nam đã nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm chế phẩm trong nuôi tôm cao sản. Một trong những loại vi sinh vật được dùng là Lactobacillus. Chế phẩm có tác dụng làm tăng tính ngon miệng, giúp tiêu hoá các chất dinh dưỡng có trong thức ăn, tăng cường sức đề kháng, phòng ngừa các bệnh đường ruột như nhiễm E. coli, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại. Do đó nâng cao năng suất nuôi tôm. 20
  30. Đồ án tốt nghiệp - Một số tính chất của bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bò. Các tác giả Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú và Lê Thanh Bình thuộc Viện Công nghệ sinh học – Viện KHCN Việt Nam, năm 2008. - Năm 2011, các tác giả Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly và Huỳnh Xuân Phong thuộc Viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ đã nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn. Kết quả phân lập được 46 dòng vi khuẩn lactic và đươc kiểm tra tính kháng khuẩn. 23 dòng biểu hiện tính kháng khuẩn chỉ thị B. subtilis, trong đó có 10 dòng có khả năng tổng hợp bacteriocin. Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào các sản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan có nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nơi đã sử dụng Bacteriocin trong quá trình làm nem chua. Kết quả đã kéo dài thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và góp phần tạo hương vị cho nem chua. Thêm vào đó là các nghiên cứu khác ứng dụng khả năng kháng khuẩn để tạo nên probiotic như: * Từ bã khoai mì mà ngay cả động vật cũng chê, các chuyên gia thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tạo ra thức ăn kích thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi kể cả thủy sản. ProBio-S lại là chế phẩm dạng lỏng, được sản xuất bằng cách cho bã tươi vào những bao tải lớn rồi cấy chế phẩm EM-S chứa nhiều chủng vi sinh vật hữu ích như Bacillus spp., Lactobacillus spp., Saccharomyces spp. với tỷ lệ 1lít EM-S/25kg bã (1ml chứa 1010 tế bào vi sinh vật hữu ích). Ba ngày ủ làm cho lượng vi sinh vật tăng mạnh. Với những chủng vi sinh vật hữu dụng nói trên, chế phẩm ProBio-S giúp cân bằng hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột của vật nuôi cũng như giảm lượng vi sinh vật có hại. Nhờ thế mà vật nuôi tiêu hoá tốt hơn, giảm tỷ lệ bệnh đường ruột, tăng trọng nhanh hơn. Giá thành của ProBio-S là 5.000-6.000 đồng/kg. Kết quả thử nghiệm sơ bộ trên 15-20 con lợn 1 tháng tuổi cho thấy sau ba tháng được ăn hai chế phẩm trên, lợn tăng trọng nhanh hơn 1,1- 21
  31. Đồ án tốt nghiệp 1,3kg so với những con đối chứng (chỉ ăn thức ăn bình thường). * Võ Thị Hạnh với chế phẩm Probiotic Bio I và Bio II gồm hỗn hợp các vi sinh vật sống và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản đã nhận được giải thưởng WIPO dành cho nhà khoa học nữ xuất sắc nhất * Trong thủy sản, công ty công nghệ hóa sinh Việt Nam đã sản xuất những sản phẩm phục vụ công tác môi trường nuôi tôm, cá đạt hiệu quả: - BIO - DW - làm sạch nước, nền đáy ao nuôi; ngăn chặn dịch bệnh; tăng sản lượng tôm, cá. - BIO - PROBIOTIC - Thức ăn bổ sung cho tôm, cá. - EMC - Phức hợp vi sinh vật có lợi, VITAMIN và các ENZYME hữu hiệu dùng nuôi tôm 1.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Y học hiện phải đối mặt với thực tế nhiều loại thuốc đang mất dần hiệu quả trong điều trị do bị sử dụng quá thường xuyên. Thêm vào đó, các chất có tính kháng khuẩn được đưa vào cả chất tẩy rửa đến xà phòng, mỹ phẩm, kích thích sự lờn thuốc ở các vi khuẩn cần tiêu diệt. Bởi vậy, phát hiện ra loại thuốc kháng sinh chống lại được sự lờn thuốc được xem như một hy vọng của ngành dược phẩm tương lai. Các nhà nghiên cứu chuẩn bị đưa ra thị trường một loại thuốc kháng vi khuẩn có chứa loại protein này với tên gọi Jensenin P. Hiên nay việc nghiên cứu , ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm. Và cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công , góp phần vào việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại. Bacteriocin là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà việc ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú hơn. Năm 1970, nhóm tác giả Kekessy và Piguet thuộc viện Vệ sinh và An toàn thực phẩm - Thuỵ Sĩ đã nghiên cứu một phương pháp mới trong việc phát hiện bacteriocin. Chủng vi sinh vật đối kháng được nuôi ủ trên đĩa môi trường thạch 22
  32. Đồ án tốt nghiệp dinh dưỡng, sau đó tạo giếng có đường kính 0,5 mm bằng cách khoét bỏ agar trên đĩa. Cho một lượng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin vào giếng, sau thời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽ xuất hiện, thể hiển bởi một vòng sáng rõ quanh giếng. Năm 1976, nhóm tác giả John Tagg, Adnan Dajani và Wannamaker thuộc khoa vi sinh- Trường Đại Học Otago, New Zealand, Trường Đại Học Dược Minnesota, Minnesota đã nghiên cứu về những loại bacteriocin của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết quả có giá trị. Nghiên cứu đã cho biết được tính đối kháng của bacteriocin, cách đặt tên và phân loại bacteriocin, chiết tách và tinh sạch bacteriocin, phân tích hoạt tính bacteriocin, các loại hoạt động của bacteriocin và ứng dụng của bacteriocin. Năm 1999, các tác giả Callewaert và Vuyst thuộc Khoa công nghệ sinh học ứng dụng -Đại học Brussel, Bỉ đã nghiên cứu việc sinh tổng hợp bacteriocin của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng dụng cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men. Việc sinh tổng hợp thu nhận bacteriocin bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen . Cũng trong năm 1999, nhóm tác giả Farida Khalid, Roquya Siddiqi và Naheed Mojgani thuộc khoa vi sinh -Trường đại học Karachi-Pakistan đã nghiên cứu tìm ra một loại bacteriocin mới có tên lactocin LC-09. Lactocin LC-09 được phân lập từ chủng vi khuẩn Lactobacillus có trong một mẫu bệnh. Loại này ức chế được một số loài thuộc giống Lactobacillus và vi khuẩn Gram dương khác như Listeria ivanovii, Streptococcus agalactii và S. peyogenes. Đặc tính của Lactocin LC-09 là chịu nhiệt (4 giờ ở 1000C) và thích hợp với môi trường có pH acid. Loại bacteriocin này bị khử hoạt tính bằng cách sử dụng enzim protease. Có thể dùng acridine orange, ethidium bromide để gây đột biến trong việc sản sinh ra loại bacteriocin này. Năm 2002 Soore cùng cộng sự đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng khuẩn đặc biệt của vi khuẩn lactic gọi là bacteriocin. Bacteriocin được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất 23
  33. Đồ án tốt nghiệp bảo quản khác. Bacteriocin có bản chất là protein nên rất an toàn đối với sức khoẻ con người. Năm 2004, nhóm tác giả Todorov SD, Van Reenen CA và Dicks KM thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia đại mạch. Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum được phân lập từ bia đại mạch (kích thước phân tử 10kDa) ức chế sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus casein, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiellapneumoniae và Escherichia coli. Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất. Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền thống suan - tsai của Đài Loan. Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Năm 2006, Stefan Marcinowski, giám đốc điều hành nghiên cứu tại BASF cho biết kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn có lợi Lactobacillus do công ty hoá chất BASF của Đức phát triển. Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng miệng. Chủng Lactobacillus mới có tên là L. anti-caries có khả năng sinh bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng kết thành khối không thẻ dính trên bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc miệng. Tháng 3/2007 nhóm tác giả Todorov và Dicks KM thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza. Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14 kDa) ức chế sự phát triển của Lactobacillus casei, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiellapneumoniae vàLactobacillus curvatus. Sự phát triển của chủng ST712BZ trên môi trường BHI, M17, sữa đậu nành và mật đường tương tự như trên môi trường MRS với việc 24
  34. Đồ án tốt nghiệp sinh tổng hợp bacteriocin cực đại (12800 AU/ml) được ghi nhận trên môi trường MRS sau 24h. Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường, nhiệt độ và pH có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất. Các nhà nghiên cứu CSIRO để tìm ra một vài bacteriocin và sử dụng chúng để tiêu diệt những con vi khuẩn gây bệnh giống trong gà và lợn. Bộ gen cho phân tử bacteriocin sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gây bệnh hoặc virus mà có thể sinh sản và tiết ra bacteriocin. Lợi ích chính của việc sử dụng bacteriocin là nó sẽ giảm mầm bệnh nguy hiểm của con người chống cự lại thuốc kháng sinh. Bacteriocins còn bị phân hủy nhanh bởi những động vật để mà không còn cặn bã trong thịt. Các nhà nghiên cứu thuộc Đại học Tổng hợp Klemson vừa phát hiện ra một loại thuốc chống vi khuẩn mới không gây tính lờn thuốc từ chính những vi khuẩn tạo ra loại pho mát Thụy Sĩ. Những vi khuẩn này tiết ra một loại protein có tên bacteriocin, tạo nên tính chất của pho mát. Các thử nghiệm sơ bộ cho thấy chúng có tác dụng chống lại hơn 150 loại vi khuẩn thường gặp. 25
  35. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM. 2.1.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày 23/04/2014 đến ngày 30/06/2014 2.2. vật liệu nguyên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn lactic Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn lactic là những sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống được phân lập từ các nguồn khác nhau được trình bày Bảng 2.1. Bảng 2.1 Danh sách mẫu phân lập vi khuẩn lactic Mẫu phân lập Đợt phân lập Địa điểm thu mẫu Cải chua 1 Siêu thị coopmart tươi sống, Thanh Đa, Bình Thạnh Măng chua 1 Chợ Thanh Đa, quận Bình Thạnh Cà pháo 1 Cà pháo thủ công Nem chua 1 Cửa hàng vissan, Bình Thạnh Sữa chua 2 sữa chua thủ công Kim chi Hàn Quốc 2 Siêu thị coopmart miền đông, Bình Thạnh Nem chua thủ công 3 Chợ Gò Vấp, Gò Vấp Sữa chua Probi 3 Cửa hàng vissan, Bình Thạnh Sữa chua uống yakult 3 Siêu thị Big C, Gò Vấp 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng nghiên cứu là vi khuẩn Escheria coli, Salmonella, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis và Listeria monocytogen 26
  36. Đồ án tốt nghiệp được cung cấp giống bởi Phòng Thí Nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm – Môi Trường trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.2.3. Hóa chất dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Môi trường nuôi cấy và phân lập Môi trường MRS broth và MRS agar Môi trường TSB (HiMedia - Ấn Độ) Môi trường TSA (HiMedia - Ấn Độ) 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị a. Dụng cụ Đĩa petri Giấy đo pH Ống nghiệm Bình môi trường 250 ml, 500 ml Erlen loại 100 ml, 250 ml Dây cấy ria, que cấy trang Ống đong 50 ml, 100 ml Đèn cồn Các loại đầu típ Dụng cụ đục lỗ thạch, thước đo Pipette 1 ml, 10 ml, 25 ml Kẹp gắp thạch Ống ly tâm Eppendorf Bông y tế và bông không thấm nước Ống Falcon Micropipette 100 μl, 1000 μl Đũa thủy tinh 27
  37. Đồ án tốt nghiệp b. Thiết bị Tủ cấy vi sinh Tủ ấm 300C, 370C Tủ sấy Tủ lạnh Máy đo UV – VIS Máy ly tâm Cân phân tích Bếp từ 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1.Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu Sử dụng các dụng cụ như kẹp gắp hoặc kéo cắt mẫu tiến hành lấy mẫu đại diện tại địa điểm thu mẫu cho vào túi nlong vô trùng ( khối lượng mẫu lấy tối thiểu là 200 g). Bảo quảnmẫu cho vào hộp kín vận chuyển về phòng thí nghiệm. Cân 10 g mẫu ( sai số ± 0,1) cho vào bao ny long vô trùng đồng nhất mẫu . Trường hợp mẫu không được phân tích ngay cần bảo quản mẫu trong tủ lạnh ở nhiệt độ -40C cho đến khi phân tích. Trước khi tiến hành phân tích các mẫu đã được bảo quản lạnh cần được rã đông mẫu trong điều kiện vô trùng bằng cách để mẫu ở nhiệt độ 2 – 50C trong 18 h hoặc nhiệt độ phòng trong 2 giờ (Trần Linh Thước, 2010). 2.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: pha loãng mẫu là một trong những cơ bản nhưng rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lõng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Đối với mẫu lỏng: dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta 28
  38. Đồ án tốt nghiệp được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi đến nồng độ cần thiết. Đối với mẫu rắn: cân chính xác 10 g mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1 ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10-2. Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng ( Phạm Minh Nhựt, 2013). Hình 2.1 phương pháp pha loãng mẫu 2.3.3. Phương pháp tăng sinh Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Đối với giống vi khuẩn lactic được giữ trên môi trường MRS agar hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10ml môi trường MRS broth. Sau đó tiến hành nuôi cấy ở 370C trong 48 giờ. Đối với giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol,tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 29
  39. Đồ án tốt nghiệp 10ml môi trường TSB rồi đem đi lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. 2.3.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển đến tủ mát (3 – 50C) để bảo quản. Quá trình này được lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển giống một lần. Đối với chủng LAB: cấy chuyển định kỳ 2 tuần/1 lần trên ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS agar. Bảo quản trong trong tủ mát. Đối với các giống vi sinh vật chỉ thị: cấy chuyển định kỳ 1 tháng/1 lần trên ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA. Bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.4.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, ta có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Vi sinh vật được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch, thu cặn có chứa sinh khối. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh - 150C(Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.5. Phương pháp định danh vi sinh vật 2.3.5.1. Phương pháp nhuộm Gram 30
  40. Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc: dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod. Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dày bắt màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi tẩy cồn. Vi khuẩn gram âm có lớp peptidoglycan mỏng không bắt màu thuốc nhuộm nên mất màu khi tẩy cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Kết quả là vi khuẩn Gram dương bắt màu tím và gram âm bắt màu hồng (Prescott và ctv, 2005). Các bước tiến hành: Làm tiêu bản: - Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên lame. - Các chủng LAB được nuôi cấy trong erlen chứa 10ml môi trường MRS broth ủ ở 370C trong 24 giờ. Dùng que cấy lấy sinh khối hòa vào giọt nước để làm vết bôi. - Cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn Nhuộm tiêu bản: - Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh (Gentian violet) trong 45 giây, rửa nước và để khô. - Nhuộm lugol trong 1 phút, rửa nước. - Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fuchsin hoặc safranin từ 10 – 30 giây, rửa nước. - Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu. LAB là vi khuẩn Gram dương khi quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy bắt màu tím. 2.3.5.2. Phương pháp nhuộm bào tử Nguyên tắc: dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid. Trước hết để tế bào chất bào tử dễ bắt màu nên xử lý nhiệt. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh (thường dùng là Malachite). Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt 31
  41. Đồ án tốt nghiệp màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu đỏ (Prescott và ctv, 2005). Cách tiến hành: Làm tiêu bản: - Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên lame. - Các chủng LAB được nuôi cấy trong erlen chứa 10ml môi trường MRS broth ủ ở 370C trong 24 giờ. Dùng que cấy lấy sinh khối hòa vào giọt nước để làm vết bôi. - Cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tiêu bản: - Đặt một cốc nước trên bếp từ và đun sôi. Sau đó đặt lên trên miệng cốc một miếng giấy lọc. - Cho dung dịch Malachite Green 5% vào vết bôi và đặc lame có sinh khối của vi khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong 5 phút. - Sau đó, rửa vết bôi bằng nước trong khoảng thời gian 30 giây. - Nhuộm lại bằng Safranin hoặc Fuchsin trong 30 giây, rửa nước, thấm khô. - Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu. LAB không tạo bào tử nên khi quan sát dưới kính hiển vi thấy tê bào bắt màu đỏ. 2.3.5.3. Phương pháp thử nghiệm catalase Nguyên tắc: phương pháp này nhằm xác định vi sinh vật có enzyme catalase hay không. Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy nghi chứa chuỗi chuyển điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus spp). Enzyme catalase có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxi trong tế bào vi sinh vật. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxi là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2. Enzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí. Vi sinh vật có enzyme catalase sẽ có hiện tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2010). Cách tiến hành: 32
  42. Đồ án tốt nghiệp - Dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame. - Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vết bôi và quan sát hiện tượng sủi bọt. LAB không có enzyme catalase nên không có hiện tượng sủi bọt khí. 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 2.3.6.1. Phương pháp đo đường kính vòng tròn kháng khuẩn Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch là phương pháp phổ biến dùng để xác định mức độ đối kháng của các chủng LAB đối với các vi khuẩn chỉ thị thông qua khả năng tạo vòng tròn kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị.Một đơn vị hoạt tính kháng khuẩn được định nghĩa như một đơn vị hoạt tính AU (Arbitrary unit). Một AU là một đơn vị diện tích của vùng ức chế trên mỗi đơn vị thể tích, trong trường hợp này là mm2/ml. Hoạt tính kháng khuẩn được tính theo công thức sau (Usmiati và Marwati, 2009): Hoạt tính kháng khuẩn (mm2/ml) Trong đó: Lz: diện tích vòng kháng khuẩn, bao gồm cả diện tích lỗ (mm2) Ls: diện tích lỗ (mm2) V: thể tích mẫu cho vào (ml) 2.3.6.2. Phương pháp đồng nuôi cấy Đối với dịch sau ly tâm của LAB sau khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp được xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp đồng nuôi cấy (Vaseeharan và Ramasamy, 2003). Phần trăm tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị được tính theo công thức sau (Schillinger và Lucke, 1989; Nguyễn Hoài Hương và ctv, 2012): % tỷ lệ ức chế 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2007 và phần mềm Statgraphics centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. 33
  43. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm Nguồn mẫu Phân lập Định danh sơ bộ Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn của LAB Đánh giá mức độ đối kháng của dịch LAB sau ly tâm đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị trên môi trƣờng tối ƣu Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 34
  44. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và đinh danh sơ bộ vi khuẩn lactic 2.4.1.1. Phân lập vi khuẩn lactic Nguồn mẫu 10 gam mẫu + 90 ml môi trƣờng MRS broth có bổ sung nystatin (50 mg/l) đồng nhất mẫu độ pha loãng 10-1 Lắc mẫu với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý đến độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 -5 -6 -7 Hút 0,1ml ở mỗi độ pha loãng 10 , 10 , 10 cấy trang trên đĩa 0 chứa môi trƣờng MRS agar, ủ ở 37 C trong 48 h Chọn những khuẩn lạc đặc trƣng cấy sang môi trƣờng MRS agar làm thuần Giữ giống trong ống thạch nghiêng và trong glycerol 40% Hình 2.3 Quy trình phân lập vi khuẩn lactic Các mẫu sau khi được thu về tiến hành cắt 10 gam mẫu cho vào erlen chứa 90 ml môi trường MRS broth có bổ sung nystatin (50 mg/l) và đem lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. 35
  45. Đồ án tốt nghiệp Các mẫu sau khi tăng sinh, được pha loãng đến độ pha loãng 10-7 và tiến hành hút 0,1 ml dịch sau pha loãng ở mỗi độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7rồi cấy trang trong môi trường MRS agar có bổ sung nystatin (50 mg/l). Ủ ở 370C trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường MRS agar và cấy làm thuần. Sau đó bảo quản các chủng này trong glycerol 40% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.4.1.2. Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic Các chủng LAB phân lập được tiến hành định danh sơ bộ thông qua các phương pháp: nhuộm gram, nhuộm bào tử và thử nghiệm catalase. Tiến hành chọn các chủng gram dương, không tạo bào tử, catalase âm tính và ghi nhận hình dạng quan sát được dưới kính hiển vi, loại bỏ các chủng không phù hợp. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn mạnh Trong nội dung thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành 2 thí nghiệm: chọn lọc các chủng LAB có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn chỉ thị và từ đó chọn lọc các chủng LAB có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn chỉ thị. 2.4.2.1. Thí nghiệm 2.1: Sàng lọc các chủng LAB có khả năng đối kháng mạnh đối với vi khuẩn chỉ thị Tiến hành sàng lọc khả năng đối kháng của sinh khối các chủng LAB phân lập được đối với vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Phương pháp thực hiện như sau: Các chủng vi khuẩn chỉ thị được nuôi cấy trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB rồi đem đi lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo OD bước sóng 600nm, sau đó pha loãng để đạt mật độ 107 cfu/ml rồi cấy trang trên các đĩa chứa môi trường TSA. Chờ dịch mẫu khô rồi đục lỗ thạch (đường kính 7 mm) trên các đĩa TSA vừa được trang. Các chủng LAB được tăng sinh trong erlen chứa 10ml môi trường MRS broth, ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng/ 15 phút, bỏ cặn thu dịch sau ly tâm. Gắp bỏ thạch trên 36
  46. Đồ án tốt nghiệp các đĩa TSA sau đó bơm 50 μl dịch LAB sau ly tâm và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Chủng LAB có hoạt tính kháng khuẩn có sự xuất hiện của quầng trong bao quanh các lỗ thạch LAB. 2.4.2.2. Thí nghiệm 2.2: Sàng lọc các chủng LAB có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn đối kháng mạnh với vi khuẩn chỉ thị Các chủng vi khuẩn phân lập được sàng lọc thông qua khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục. Phương pháp được thực hiện như sau: Tiến hành tăng sinh các chủng LAB đối kháng mạnh với vi khuẩn chỉ thị trong erlen chứa 10 ml môi trường MRS broth ở 370C trong 48 giờ, sau đó tiến hành ly tâm để loại bỏ sinh khối, thu lấy dịch trong. Chỉnh pH dịch LAB trong các môi trường sau ly tâm về pH 6.0 bằng NaOH 2N vô trùng để loại bỏ hoạt động ức chế của acid hữu cơ Chuẩn bị các ống nghiệm mỗi ống chứa 2 ml TSB vô trùng. Hút 2 ml dịch sau ly tâm cho vào ống nghiệm chứa 2 ml môi trường TSB. Hút 200 μl vi khuẩn chỉ thị đã tăng sinh trong môi trường TSB trong 24 giờ và chỉnh về mật độ 107 cfu/ml cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn dịch sau ly tâm vi khuẩn và môi trường TSB. Tiến hành ủ ở 370C trong 24 giờ và đo OD để xác định tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị. Xác định chủng vi khuẩn có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn mạnh nhất để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo. 37
  47. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 3.1.1. Kết quả phân lâp khuẩn lactic Từ 9 mẫu thực phẩm lên men truyền thống, đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS có bổ sung nystatin (50 mg/l). Kết quả phân lập được trình bày Bảng 3.1. Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn lactic phân lập Nguồn mẫu Kí hiệu Đợt Hình dáng khuẩn lạc Cà pháo CPMC 1 Tròn, lồi, bờ láng, trắng đục, d> 1mm Nem chua Vissan NCVS 1 Tròn, lồi, bóng, bờ lõm, trắng đục, d > 1mm Măng chua MCTC 1 Tròn, lồi, bóng, bờ đều, trắng đục, d > 0.5mm Cải chua CCTC 1 Tròn, dẹp, bóng, bờ lõm, trắng trong, d > 0.5 mm Sữa chua SCTC 2 Tròn, lồi, bóng, bờ đêu, trắng đục, d > 0.5 mm Kim chi Hàn Quốc KCHQ 2 Tròn, lồi, bóng, bờ đều, trắng đục, d > 1 mm Sữa chua Probi SCPR01 3 Tròn, dẹp, bóng, bờ đều, trắng trong, d > 0.5 mm SCPR02 3 Bầu dục, lồi, bóng, bờ đều, trắng trong, d > 0.5 mm SCPR03 3 Tròn, lồi, bóng, bờ đều, trắng trong , d 0.5 mm SCYK03 3 Tròn, dẹp, bóng, bờ lõm, trắng trong , d > 0.5 mm Nem chua thủ công NCTC01 3 Bầu dục, lồi, bóng, bờ đều, trắng đục, d > 0.5 mm NCTC02 3 Tròn, lồi, bóng, bờ đều, trắng đục. d > 1 mm Bầu dục, lồi, không bóng, bờ đều, trắng đục, d > NCTC03 3 0.5 mm 38
  48. Đồ án tốt nghiệp Kết quả phân lập từ 9 mẫu thực phẩm thu được 15 chủng vi khuẩn. Để xác định cần tiến hành định danh sơ bộ thông qua các thử nghiệm sinh hóa như nhuộm Gram, nhuộm bào tử và thử nghiệm catalase. Hình 3.1 Hình dáng khuẩn lạc của chủng SCPR03 quan sát được dưới kính hiển vi Khuẩn lạc hình trứng, tròn, lồi, bờ đều, có màu trắng đục, tỏa mùi chua của acid. Các khuẩn lạc từ các nguồn mẫu trên được cầy chuyền làm thuần và bảo quản giống thạch nghiêng ở nhiệt độ -4℃. 3.1.2. Kết quả định danh sơ bộ vi khuẩn lactic Từ 15 chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành loại bỏ các chủng không phải vi khuẩn lactic bằng cách định danh sơ bộ thông qua 1 số thử nghiệm sinh hóa như nhuộm Gram, nhuộm bào tử và thử nghiệm catalase. Vi khuẩn lactic có đặc điểm sinh hóa sơ bộ là vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử và có thử nghiệm catalase âm tính ( Ashmaig và ctv, 2009). Kết quả thử nghiệm sinh hóa sơ bộ được trình bày ở bảng 3.2 39
  49. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2.Kết quả định danh sơ bộ vi khuẩn lactic Nguồn phân Ký hiệu Hình dạng Sinh bào Thử nghiệm Đợt Gram lập mẫu tế bào tử catalase Cải chua CCTC 1 + Que ngắn - - Nem chua NCVS 1 + Que dài - - Cà pháo CPMC 1 + Que dài - - Măng chua MCTC 1 + Que dài - - Kim chi KCHQ 2 + Que ngắn - - Hàn Quốc Sữa chua SCTC 2 + Hình tròn + + Sữa chua SCPR01 3 + Que dài - - Probi SCPR02 3 + Que ngắn - - SCPR03 3 + Que ngắn - - Sữa chua SCYK01 3 + Que dài - - Yakult SCYK02 3 + Que ngắn - - SCYK03 3 + Que dài - - Nem chua NCTC01 3 + Que ngắn - - thủ công NCTC02 3 + Que ngắn - - NCTC03 3 - Que dài - + ( - ): Âm tính, ( + ): dương tính Nguyên tắc phương pháp nhuộm gram là dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod. Kết quả là vi khuẩn Gram dương bắt màu tím và gram âm bắt màu hồng (Prescott và ctv, 2005). 40
  50. Đồ án tốt nghiệp Nhuộm bào tử là dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu đỏ (Prescott và ctv, 2005). Hình 3.2.Kết quả nhuộm gram và nhuộm bào tử của chủng SCYK 02 A: Nhuộm gram dương tính. B: Nhuộm bào tử âm tính Trên cơ sở đó, từ 15 chủng vi khuẩn phân lập ban đầu, sau khi định danh sơ bộ, chủng SCTC với chủng NCTC03 có thử nghiệm catalase dương tính, đồng thời chủng SCTC có khả năng sinh bào tử nên 2 chủng trên không là vi khuẩn lactic ttrong khi 13 chủng còn lại mang đặc điểm của vi khuẩn lactic. Những chủng này được bảo quản ở nhiệt độ -4℃ và được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. A B Hình 3.3. Mẫu thử catalase của 2 chủng NCTC02 và NCTC 03 A: Mẫu thử catalase của chủng NCTC03 dương tính (loại) B: Mẫu thử catalase của chủng NCTC02 âm tính Vi sinh vật có enzyme catalase sẽ có hiện tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2010). 41
  51. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic co khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn chỉ thị 3.2.1. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng cua sinh khối khuẩn lactic đối với vi khuẩn chỉ thị Bản thân tế bào vi khuẩn lactic đã có sự hiện diện các hợp chất kháng khuẩn như reuterin, reutericyclin và ngoài ra trong quá trình tăng trưởng chúng cũng sản sinh thêm các hợp chất kháng khuẩn khác gồm acid lactic, bacteriocin, CO2, H2O2 và diacetyl. Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của 13 chủng lactic trên đối kháng với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị (E. coli, S. aureus, B. subtilis, Salmonella, L. monocytogenes) bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch, sau ủ thời gian 24 giờ xuất hiện các vòng kháng khuẩn với kích thước khác nhau được trình bày ở hình 3.5 và hình 3.6. Hình 3.5. Đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn chỉ thị của các chủng SCPR01. SCPR02, SCPR03, SCYK01, SCYK02 VÀ SCYK03 (mm). Các chữ cái mang nghiệm thức khác nhau thể hiện sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P < 0.05) 42
  52. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6. Đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn của các chủng CPMC, NCVS, MCTC, KCHQ, NCTC01, NCTC02 VÀ CCTC (mm). Các chữ cái mang nghiệm thức khác nhau thể hiện sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P < 0.05) Kết quả sàng lọc khả năng đối kháng của sinh khối của vi khuẩn lactic với vi khuẩn chỉ thị được trình bày ở hình 3.5 và hình 3.6. Kết quả này cho thấy 13 chủng vi khuẩn lactic phân lập đều có tính đối kháng với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị thông qua vòng kháng khuẩn thể hiện ở Hình 3.4. Khi tiến hành đánh giá mức độ đối kháng của 13 chủng vi khuẩn Lactic phân lập được từ các sản phẩm lên men truyền thống đối với từng loại vi khuẩn chỉ thị nhận thấy rằng đối với chủng chỉ thị E. coli trong 13 chung vi khuẩn lactic thì chủng SCPR01, SCPR02, SCYK01 và chủng NCTC02 thể hiện tính kháng khuẩn cao nhất và đối kháng mạnh ở mức ý nghĩa thống kê (P < 0.05) đối với các chủng còn lại.Đối với chủng vi khuẩn chỉ thị S. aureus thì trong 13 chủng vi khuẩn lactic thì có 2 43
  53. Đồ án tốt nghiệp chủng thể hiện tính kháng khuẩn mạnh và đối kháng cao ở mức ý nghĩa thống kê (P < 0.05) là chủng SCPR02 và chủng NCTC02. Đối với chủng vi khuẩn chỉ thị B. subtilis thì có chủng SCPR01, SCPR02, SCYK01 và chủng NCTC02 là thể hiện tính đối kháng mạnh, kháng khuẩn cao ở mức ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Đối với chủng vi khuẩn chỉ thị L. monocytogenes và chủng vi khuẩn chỉ thị Samonella thì chỉ có chủng NCTC02 là thể hiện tính kháng khuẩn cao và đối kháng mạnh ở mức ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Hình 3.4. Vòng kháng vi khuẩn chỉ thị của chủng vi khuẩn SCPR02 và chủng SCPR03. 44
  54. Đồ án tốt nghiệp Theo nghiên cứu của Olanrewaju (2007) đối với vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ kunnu và sữa bò, nghiên cứu của Pishva và ctv (2009) đối với các chủng Lactobacillus phân lập từ sữa chua truyền thống, nghiên cứu của Soleimani và ctv (2010) đối với các chủng vi khuẩn lactic probiotic thì các chủng này đều thể hiện tính kháng rất mạnh đối với S. aureus. Điều này chứng tỏ rằng các chủng vi khuẩn lactic dù khác nguồn gốc phân lập nhưng sinh khối của chúng đều đối kháng mạnh với S. aureus nói riêng và một số chủng vi khuẩn khác nói chung. Như vậy, kết quả đánh giá tính đối kháng của 13 chủng vi khuẩn lactic với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị đã cho thấy tất cả sinh khối của các chủng này đều thể hiện tính đối kháng với vi khuẩn chỉ thị. Tuy nhiên cũng không thể khẳng định được rằng các chủng trên có khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn có tính đối kháng mạnh. Còn các chủng còn lại cũng chưa khẳng định được chúng sẽ không sinh ra các hợp chất kháng khuẩn. Với mục tiêu nghiên cứu ban đầu là đánh giá khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị nên sẽ tiến hành đánh giả khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của 13 chủng vi khuẩn lactic phân lập được. 3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập. Các chủng vi khuẩn lactic được đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục bằng cách ủ các ống nghiệm có chứa 2 ml môi trường TSB, 2 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic (trong 48 giờ) và 200 μl dịch nuối cấy vi khuẩn chỉ thị được nuôi cấy trong 24 giờ sau khi đã được pha loãng để đạt mật độ vi khuẩn 107 cfu/ml. Ủ trong 24 giờ ở 370C sau đó tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định tỷ lệ ức chế vi khuẩn (Vaseeharan và Ramasamy, 2003). Kết quả đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic trong 2 trường hợp: dịch sau ly tâm không trung hòa acid hữu cơ và dịch sau ly tâm đã trung hòa acid hữu cơ. Kết quả đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic của dịch sau ly tâm không trung hòa acid hữu cơ được trình bày ở Hình 3.4. 45
  55. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch sau ly tâm vi khuẩn lactic không trung hòa acid hữu cơ Các chữ cái mang nghiệm thức khác nhau thể hiện sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P 50%), có CPMC, NCVS, MCTC, SCPR01, SCPR03, SCYK03, NCTC01 chủng phân lập từ cà pháo, nem chua Vissan, măng chua, sữa chua Probi, sữa chua yakult, nem chua, dịch vi khuẩn lactic sau ly tâmkhông trung hòa acid của CPMC thể hiện tính kháng khuẩn yếu hơn so với các chủng còn lại, tỷ lệ ức chế đối với vi khuẩn L. monogenes thấp nhất là 50.37 % . Còn 6 chủng còn lại có tính kháng khuẩn tương đối cao, chủng SCPR03 tỷ lệ ức chế khá mạnh đối với vi khuẩn L. monogenesđạt 80.03 %. Điều này chứng minh rằng tất cả các chủng khảo sát đều có 46
  56. Đồ án tốt nghiệp khả năng làm giảm pH của môi trường xuống, dẫn đến sự ức chế khả năng phát triển của vi khuẩn chỉ thị. Mặc khác có 6 chủng KCHQ, SCTC, SCPR02, SCYK01, SCYK02 và chủng NCTC có tỷ lệ kháng khuẩn thấp (tỷ lệ kháng khuẩn dưới 50 %), chứng tỏ rằng khả năng sinh hợp chất hữu cơ của các chủng này không cao. Từ kết quả trên có thể khẳng định rằng khả năng kháng khuẩn hay ức chế vi khuẩn của dịch vi khuẩn lactic sau ly tâm chủ yếu là do sự hiện diện của acid hữu cơ hình thành trong quá trình sinh trưởng và phát triển của khuẩn lactic. Tuy nhiên, kết quả trên vẫn chưa chứng minh được rằng khả năng kháng khuẩn, ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn lactic sau ly tâm chủ yếu là do sự hiện diện của acid trung hòa hay là vẫn còn có sự xuất hiện của các hợp chất có khả năng kháng khuẩn khác. Vì thế, cần phải tiến hành trung hòa acid hữu cơ tạo thành để xác định xem các chủng lactic trên còn có thể sản sinh ra các hợp chất kháng khuẩn khác hay không. Đối với dịch khuẩn lactic sau ly tâm có trung hòa acid hữu cơ bằng NaOH 2N vô trùng, kết quả đối kháng vi khuẩn chỉ thị được thể hiện Hình 3.6. Hình 3.6. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch sau ly tâm vi khuẩn lactic trung hòa acid hữu cơ. Các chữ cái mang nghiệm thức khác nhau thể hiện sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P < 0.05) 47
  57. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào Hình 3.6. thấy rằng dịch của khuẩn lactic sau ly tâm có trung hòa acid hữu cơ bằng NaOH 2N vô trùng vẫn thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị. Điều này chứng minh rằng ngoài khả năng tạo sản phẩm acid hữu cơ thì các chủng vi khuẩn lactic vẫn có thể sản sinh ra các hợp chất kháng khuẩn khác. Xét tỷ lệ ức chế của vi khuẩn chỉ thị E. Coli, hầu như cả 13 chủng đều có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị. Tuy nhiên các chủng vi khuẩn lactic KCHQ, SCTC, SCPR02, SCYK01, SCYK02 và chủng NCTC có tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị quá thấp nên không đưa vào đồ thị , vì vậy ta chỉ xét tỷ lệ ức chế của 7 chủng còn lại (tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị > 50%). Trong đó, chủng SCYK03, CPMC, NCVS, MCTC, SCYK01, NCTC02 và chủng SCPR03 có khả năng ức chế vi khuẩn mạnh hơn hẳn so với 6 chủng vi khuẩn lactic còn lại và có ý nghĩ thống kê (P < 0.05). Chủng SCYK03 có tỷ lệ ức chế khá cao, đạt 77,7%. Bên cạnh đó 4 dịch ly tâm sau trung hòa của các vi khuẩn chỉ thị khác Salmonella, B. sutilis, L. monogenes cũng cao hơn 1 cách có ý nghĩa thống kê ( P < 0.05). Từ kết quả trên có thể nhận thấy rằng tất cả các chủng vi khuẩn đều sinh ra các hợp chất kháng khuẩn khác. Các hợp chất kháng khuẩn này có thể là bacteriocin, hydroxyl peroxide, diacetyl, reuterin (Yang, 2000). Từ kết quả này thì các chủng như SCPR03, SCYK01 có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn trội hơn so với các chủng còn lại. nhưng nếu xét khả năng ức chế khuẩn từng vi khuẩn chỉ thị thì có thể nhận thấy rằng chủng SCPR03 có khả năng ức chế trội hơn so với SCPR03. Từ kết quả trên cho thấy rằng các chủng vi khuẩn lactic hiện diện trong các sản phẩm lên men chua truyền thống tại một số vùng ở Việt Nam có khả năng đối kháng khá tốt với các chủng vi khuẩn chỉ thị khảo sát. Đồng thời, một số chủng phân lập cũng sinh ra các hợp chất kháng khuẩn có khả năng đối kháng tốt với vi khuẩn chỉ thị. Các hợp chất kháng khuẩn đó có thể do có sự hiện diện của acid hữu cơ tạo nên khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị nhưng khi tiến hành trung hòa acid thì các dịch nuôi cấy vẫn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Điều này chứng tỏ ngoài acid hữu cơ, các chủng vi khuẩn vẫn có khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn 48
  58. Đồ án tốt nghiệp khác như hydroxy peroxide, carbon dioxide và có thể có sự hiện diện của bacteriocin trong môi trường nuôi cấy. Từ kết quả nghiên cứu đánh giá khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn từ một số nguồn mẫu khác nhau giúp có cái nhìn khái quát về sự phân bố của các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn mạnh trong các sản phẩm lên men truyền thống tại Việt Nam. Đồng thời kết quả nghiên cứu này cũng có thể làm tiền đề cho các nghiên cứu về chọn lọc các chủng vi khuẩn lactic nhằm ứng dụng trong một số lĩnh vực như sản xuất giống khởi động, chế phẩm men vi sinh. 49
  59. Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận - Đã phân lập và tuyển chọn được 15 chủng vi khuẩn được phân lập thực phẩm lên men truyền thống như nem chua thủ công, nem chua vissan, kim chi Hàn Quốc, sữa chua Probi của vinamilk, sữa chua Yakult, cà pháo muối chua, măng chua thủ công có bán trên thị trường. - Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa riêng của vi khuẩn lactic theo khóa phân loại của Bergey và các tiêu chuẩn do Sharpe đưa ra (1961), 13 chủng đã được xác định thuộc vi khuẩn lên men lactic. Qua phương pháp đo độ đục (turbidimetric method), cả 13 chủng vi khuẩn lactic đều có khả năng ức chế vi snh chỉ thị E. coli, Salmonella, S. aureus, L. monogenes và vi khuẩn B, subtilis. Đặc biệt là các chủng SCPR03, NCTC01 và chủng SCYK03 có khả năng ức chế cao hơn so với các chủng còn lại. 2. Đề nghị - Tiếp tục đánh giá thêm khả năng ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl và thành phần nuôi cấy để tìm môi trường tối ưu nhất cho vi khuẩn lactic sinh trưởng. - Xây dựng đường cong tăng trưởng của SCPR03 ở các thời điểm khác nhau. - Kiểm tra sinh hóa các chủng vi khuẩn lactic phân lập bằng bộ kit API để định danh đến cấp loài. - Tách chiết bacteriocin và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn lactic . - Thử nghiệm khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm của bacteriocin thu được tách chiết được từ vi khuẩn lactic phân lập. 50
  60. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly, Huỳnh Xuân Phong.2011. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn. Tạp chí Khoa họcTrường Đại Học Cần Thơ 2011: 19a 176 – 184. Nguyễn Lân Dũng, Dương VĂn Hợp. giới thiệu kỹ thuật bảo quản sinh vật. 03/03/2007. visinhvat.htm Nguyễn Hoài Hương, Dương Thúy Vy, Trần Linh Châu, Đoàn Kim Như. 2012. Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên len lactic từ nem chua truyền thống làm giống khởi động lên men nem chua probiotic. Hội nghị Công Nghệ Sinh Học toàn quốc khu vực phía Nam lần thứ II: 8 – 11. Đặng Phương Nga, Nguyễn Thị Yên, Đôc Thu Phương, Nguyễn Bá Tú, Lại Thu Hiền. 2007. Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio trong nước nuôi tôm của Bacillus subtilis HY1 và lactococcus lactic CC4K. Tạp chí Công nghệ sinh học 5(3): 383 – 390. Phạm Minh Nhựt. 2013. Thực hành vi sinh đại cương. Trường Đai Học Kỹ Thuât Công Nghệ TpHCM. Trần Linh Thước. 2010. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, tái bản lần thứ 6. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. Lê Thị Hồng Vân. 2008. Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa. 51
  61. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH Abee, Tjakko, Beldman G., Broek B., Houben J., Nout T., Rombouts F Schoustra S.,Voragen F., Wouters J., Noomen A., Walstra P., 1999. Food fermentation part 1, Department of Food Technology and Nutrititional Sciences, Wagening Agriculture University. Ashmaig A., Hasan A., EI Gaali E., 2009. Identification of lactic acid bacteria isolated from traditional Sudanese fermented camel’s milk (Gariss). African journal of Microbiology Research 3(8): 451 – 457. De Vuyst L., Leroy F., 2007. Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria : Production Purification and Food Applications. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 13: 194 – 199. Kelstrup J., Funder – Nielsen T.D., 1997. Synthesis of bacteriocins in liquip cultures of streptococcus mutans. Journal de Biologie Buccale 5(2): 99 – 106. Prescott H., 2005. The gram stain. In : Microbiology. McGraw – Hill Science, engineering and math, New York, pp: 1 – 3. Olanrewaju O., 2007. Antagonistic effect of lactobacillus isolated from kunnu and cowmilk on selected pathogenic microorganisms. Internet Journalsof Food Safety 9: 63 – 66. Rattanachaikunsopon P., Phumkhachorn P., 2010. Lactic Acid Bacteria: their antimicrobial compounds and their uses in food production. Annals of Biological Research 1(4): 218 – 228. Suskovic J., Kos B., Beganovi J., Lebos Pavunc A., Habjanic K., Matosic S., 2010. Antimicrobial activity – The most important property of probiotic and starter lactic acid bacteria. Food technology and Biotechnology 48 (3): 296 – 307. vaseeha Torodov SD., Dicks L.M.T., 2005. Effect of growth medium on bacteriocin production by lactobacillus plantarum sakeiST22Ch isolated from Salpicao, 52
  62. Đồ án tốt nghiệp a traditional meat – product from Portugal. Chemical enginerring transactions 27: 283 – 288. Usmitia S., Marwati T., 2009. Selection and optimization process of bateriocin production from lactobacillus sp. Indonesian Journals of Agriculture 2(2): 82 – 92. Yang Z., 2000. Antimicrobial compounds and extracellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria: structures and properties. Department of Food Technology, University of Helsinki. 53
  63. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM MRS (g/l) Bacteriological peptone 10 Beef extract 10 Yearst extract 5 D- Glucose 20 Sodium acetate 5 Dipotassium phosphate 2 Ammonium citrate 2 Magnesium sulfate 0.2 Manganese sulfate 0.05 Tween 80 1 Nystatin 50 1
  64. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KÊT QUẢ SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC A.1. Kết quả sàng lọc vi khuẩn lactc dựa vào đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MCTC SCYK01 SCYK02 SCYK03 NCTC01 NCTC02 CCTC E.Coli 9 8.5 9 13 11.5 13 10.5 9 8.5 11.5 12.5 11 11.5 9.5 10.5 13 12 13 12 11.5 12.5 B. Sub 9 10 9 14 12 13 9 10 11 11 11.5 10 10.5 9.5 9 12 13 14 8 8 8 Sal 8.5 9 8 11 11 11 9 9.5 8.5 10 10 11 10.5 9 10.5 12 11.5 12 10.5 8 9.5 L.mono 9 8 8.5 11.5 11 11 10.5 10 9.5 10.5 10.5 10 11 9 10.5 13 13 12.5 11.5 11 11.25 S. au 9 10 9 12 12 12 9.5 9.5 9 11 11.5 11 9.5 10 9.5 13 13 13.5 9 9 9 CPMC NCVS KCHQ SCPR01 SCPR02 SCPR03 E.Coli 12 12 12 9.5 9.5 9.5 12 12 12 9.5 9.5 9.5 12 12 12 9.5 9.5 9.5 B. Sub 9 9 9 8 8 8 9 9 9 8 8 8 9 9 9 8 8 812 Sal 12 11 12 9 10.5 9.5 12 11 12 9 10.5 9.5 12 11 12 9 10.5 9.5 L.mono 11 10 10.5 8.5 8.5 9 11 10 10.5 8.5 8.5 9 11 10 10.5 8.5 8.5 9 S. au 11 10 11.5 9 8 8.5 11 10 11.5 9 8 8.5 11 10 11.5 9 8 8.5 2
  65. Đồ án tốt nghiệp A.2. kết quả sàng lọc vi khuẩn lactic dựa vào tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị (%) MCTC SCYK01 SCYK02 SCYK03 NCTC01 NCTC02 CCTC E.Coli 71.3 73.9 65.61 61.5 58.8 60.03 22.6 28.3 22.81 80.5 83.4 79.1 70.5 71.6 66.13 50.7 48 54.81 1.4 0.78 1.96 B. Sub 72.34 69.8 71.37 57.6 60.03 58.59 8.8 7.52 13.26 78 78.5 74.5 62.3 65.8 71.76 51.2 49.8 50.77 5.1 8.16 8.43 Sa 71.05 73.2 66.89 44.7 42.85 49.52 14.2 13.7 12.51 13.8 14.25 12.36 70 73.5 64.73 42.5 47.6 49.61 5.5 4.7 6.72 L.mono 71.1 68.85 70.41 48.2 49.8 43.39 25.01 23.8 25.89 30.5 28.8 15.4 68.9 70.8 62.86 41.2 43.5 54.2 0.8 1.04 1.55 S. au 65.78 71.03 69.74 48 51.25 42.38 17.2 18.8 13.08 17.2 15.8 16.02 76.31 62.5 67.8 45.7 44.3 48.57 6.15 8.2 6.71 3
  66. Đồ án tốt nghiệp CPMC NCVS KCHQ SCPR01 SCPR02 SCPR03 E.Coli 59 57.6 58 78.5 79.2 74.08 5.47 6.2 8.4 69.2 71.03 65.48 1.89 0.87 1.05 81.02 82.4 74.12 B. Sub 63.7 69.5 60.39 80.2 83.4 73.37 9 10.5 8.85 68.2 71.11 62.26 0.54 0.34 0.14 83.4 82.7 80.26 Sal 61.3 63.5 55.98 80.5 82.8 75.62 7.25 6.18 9.61 70.3 71.24 66.78 2.3 1.77 2.14 81.2 78.3 80.08 L.mono 51.7 52.8 46.61 77.6 75.2 76.43 10.3 8.57 8.37 68.8 70.35 64.67 6.88 7.2 7.83 82.5 79.4 87.19 S. au 62.7 65.8 55.73 82.2 78.26 84.49 10.3 8.27 10.23 62.58 68.2 68.81 9.23 8.17 9.96 82.34 85.7 76.07 4
  67. Đồ án tốt nghiệp A.3. Kết quả sàng lọc vi khuẩn lactic dựa vào tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị (%) MCTC SCYK01 SCYK02 SCYK03 NCTC01 NCTC02 CCTC E.Coli 68.6 70.35 65.8 55.45 50.6 53.27 24.15 23.7 20.16 79.51 73.5 80.1 65.25 63.7 66.2 45.15 40.7 43.25 1.01 1.34 0.97 TH B. Sub TH 68.54 69.3 65.4 49.95 50.2 51.7 8.13 9.25 7.88 70 70.43 69.5 63.24 63.5 64.8 47.88 48.2 46.76 2.11 2.39 2.25 Sa THl 62.24 63.5 61.7 49.95 50.2 51.35 8.13 6.75 8.94 70.01 71.32 69.7 63.24 62.1 64.3 41.26 43.7 42.5 3.56 3.7 4.2 L.mono 61.24 62.2 60.73 40.01 41.35 39.8 23.01 23.5 22.8 61.15 62.7 60.89 61.6 61.72 59.7 38.77 39.2 38.56 0.9 1.07 0.56 TH S. au TH 72.7 72.3 71.46 39 39.4 40.2 13.34 15.7 14.4 63.34 64.2 63.7 60.46 61.2 61.4 67.89 68.2 68.8 5.87 6.3 5.78 5
  68. Đồ án tốt nghiệp CPMC NCVS KCHQ SCPR01 SCPR02 SCPR03 E.Coli 50.12 49.7 53.4 64.25 63.1 60.17 3.9 5.25 4.2 55.25 59.5 53.4 0.55 0.67 1.05 73.25 70.06 75.7 TH B. Sub 57.25 58.2 56.8 64.25 62.3 65.6 4.33 4.7 3.92 52.54 53.1 52.4 0.101 0.23 0.18 72.76 73.1 74.2 TH Sal TH 57.25 59.7 60.2 64.57 67.5 63.41 4.33 4.72 5.03 52.54 53.2 51.47 0.101 0.5 0.34 72.76 73.05 71.02 L.mono 41.21 42.7 38.9 60.6 61.3 60.9 5.25 5.38 6.04 51.24 52.7 50.9 3.58 3.7 4.06 73.6 74.2 74.03 TH S. au 52.04 50.6 51.55 71.46 72.8 71.5 5.7 6.23 6.03 52.87 53.1 52.8 5.79 5.85 6.34 74.52 74.7 75.2 TH 6
  69. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: SỐ LIỆU THỐNG KÊ C.1. Vòng kháng vi khuẩn chỉ thị cua vi khuẩn lactic ANOVA Table for EColi by VI KHUAN LACTIC Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 71.6026 12 5.96688 19.00 0.0000 Within groups 8.16667 26 0.314103 Total (Corr.) 79.7692 38 Multiple Range Tests for EColi by VI KHUAN LACTIC Method: 95.0 percent LSD VI KHUAN LACTIC Count Mean Homogeneous Groups MCTC 3 8.83333 X SCYK02 3 9.33333 X SCPR03 3 9.5 X SCPR01 3 9.5 X NCVS 3 9.5 X NCTC01 3 10.5 X SCYK03 3 11.6667 X KCHQ 3 12.0 XX CCTC 3 12.0 XX CPMC 3 12.0 XX SCPR02 3 12.0 XX SCYK01 3 12.5 XX NCTC02 3 12.6667 X 7
  70. Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for B sub by VI KHUAN LACTIC Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 108.603 12 9.05021 30.69 0.0000 Within groups 7.66667 26 0.294872 Total (Corr.) 116.269 38 Multiple Range Tests for B sub by VI KHUAN LACTIC Method: 95.0 percent LSD VI KHUAN LACTIC Count Mean Homogeneous Groups SCPR03 3 8.0 X NCVS 3 8.0 X SCPR01 3 8.0 X CPMC 3 9.0 X KCHQ 3 9.0 X SCPR02 3 9.0 X MCTC 3 9.33333 XX SCYK02 3 10.0 XX NCTC01 3 10.1667 XX SCYK03 3 10.8333 X CCTC 3 12.0 X NCTC02 3 12.6667 XX SCYK01 3 13.0 X 8
  71. Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for Salmonella by VI KHUAN LACTIC Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 46.8077 12 3.90064 8.45 0.0000 Within groups 12.0 26 0.461538 Total (Corr.) 58.8077 38 Multiple Range Tests for Salmonella by VI KHUAN LACTIC Method: 95.0 percent LSD VI KHUAN LACTIC Count Mean Homogeneous Groups MCTC 3 8.5 X SCYK02 3 9.0 XX CCTC 3 9.33333 XXX NCVS 3 9.66667 XX SCPR03 3 9.66667 XX SCPR01 3 9.66667 XX NCTC01 3 10.0 XXX SCYK03 3 10.3333 XX SCYK01 3 11.0 XX KCHQ 3 11.6667 X SCPR02 3 11.6667 X CPMC 3 11.6667 X NCTC02 3 11.8333 X 9
  72. Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for L mono by VI KHUAN LACTIC Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 57.5641 12 4.79701 21.53 0.0000 Within groups 5.79167 26 0.222756 Total (Corr.) 63.3558 38 Multiple Range Tests for L mono by VI KHUAN LACTIC Method: 95.0 percent LSD VI KHUAN LACTIC Count Mean Homogeneous Groups MCTC 3 8.5 X SCPR01 3 8.66667 X NCVS 3 8.66667 X SCPR03 3 8.66667 X SCYK02 3 10.0 X NCTC01 3 10.1667 X SCYK03 3 10.3333 X KCHQ 3 10.5 XX CPMC 3 10.5 XX SCPR02 3 10.5 XX SCYK01 3 11.1667 X CCTC 3 11.25 X NCTC02 3 12.8333 X 10
  73. Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for S aureus by VI KHUAN LACTIC Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 78.0256 12 6.50214 26.69 0.0000 Within groups 6.33333 26 0.24359 Total (Corr.) 84.359 38 Multiple Range Tests for S aureus by VI KHUAN LACTIC Method: 95.0 percent LSD VI KHUAN LACTIC Count Mean Homogeneous Groups NCVS 3 8.5 X SCPR03 3 8.5 X SCPR01 3 8.5 X CCTC 3 9.0 XX SCYK02 3 9.33333 X MCTC 3 9.33333 X NCTC01 3 9.66667 X KCHQ 3 10.8333 X CPMC 3 10.8333 X SCPR02 3 10.8333 X SCYK03 3 11.1667 X SCYK01 3 12.0 X NCTC02 3 13.1667 X 11
  74. Đồ án tốt nghiệp C.2. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch sau ly tâm vi khuẩn lactic chưa trung hòa acid. Multiple Range Tests for EColi by vi khuan lactic Method: 95.0 percent LSD vi khuan lactic Count Mean Homogeneous Groups SCPR02 3 1.27267 X CCTC 3 1.38 X KCHQ 3 6.68667 X SCYK02 3 24.5667 X NCTC02 3 51.1667 X CPMC 3 58.2 X SCYK01 3 60.2 X SCPR01 3 68.5667 X NCTC01 3 69.4067 X MCTC 3 70.27 X NCVS 3 77.2633 X SCPR03 3 79.1833 XX SCYK03 3 81.0 X 12
  75. Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for Smonella by vi khuan lactic Method: 95.0 percent LSD vi khuan lactic Count Mean Homogeneous Groups SCPR02 3 2.07 X CCTC 3 5.64333 X KCHQ 3 7.68333 X SCYK02 3 13.47 X SCYK01 3 45.69 X NCTC02 3 49.57 X CPMC 3 60.26 X NCTC01 3 69.41 X SCPR01 3 69.4383 X MCTC 3 70.3833 X SCYK03 3 79.3267 X NCVS 3 79.6433 X SCPR03 3 79.8633 X Multiple Range Tests for S au by vi khuan lactic Method: 95.0 percent LSD vi khuan lactic Count Mean Homogeneous Groups CCTC 3 7.01667 X SCPR02 3 9.12 XX KCHQ 3 9.6 X SCYK02 3 16.36 X NCTC02 3 46.19 X SCYK01 3 47.2067 X CPMC 3 61.4133 X SCPR01 3 66.53 X SCYK03 3 68.34 XX MCTC 3 68.8467 X NCTC01 3 68.8733 X SCPR03 3 81.37 X NCVS 3 81.6467 X 13
  76. Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for l mono by vi khuan lactic Method: 95.0 percent LSD vi khuan lactic Count Mean Homogeneous Groups CCTC 3 1.31 X SCPR02 3 7.30667 X KCHQ 3 9.07667 X SCYK02 3 24.9 X NCTC02 3 46.3333 X SCYK01 3 47.1267 X CPMC 3 50.3667 X SCYK03 3 66.7267 X NCTC01 3 67.5233 X SCPR01 3 67.9367 XX MCTC 3 70.1233 X NCVS 3 76.4067 X SCPR03 3 83.0333 X Multiple Range Tests for B. sub by vi khuan lactic Method: 95.0 percent LSD vi khuan lactic Count Mean Homogeneous Groups SCPR02 3 0.34 X CCTC 3 7.23333 X KCHQ 3 9.45333 X SCYK02 3 9.86 X NCTC02 3 50.5933 X SCYK01 3 58.7367 X CPMC 3 64.53 X NCTC01 3 66.6167 X SCPR01 3 67.19 X MCTC 3 71.1667 X SCYK03 3 77.0033 X NCVS 3 78.99 X SCPR03 3 82.1233 X 14
  77. Đồ án tốt nghiệp C.3. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch sau ly tâm vi khuẩn lactic đã trung hòa acid bằng NaOH 2N vô trùng. Multiple Range Tests for E Coli TH by vi khuan lactic Method: 95.0 percent LSD vi khuan lactic Count Mean Homogeneous Groups SCPR02 3 0.756667 X CCTC 3 1.105 XX KCHQ 3 4.45 X SCYK02 3 22.67 X NCTC02 3 43.0333 X CPMC 3 51.0733 X SCYK01 3 53.1067 XX SCPR01 3 56.05 X NCVS 3 62.5067 X NCTC01 3 65.05 XX MCTC 3 68.25 X SCPR03 3 73.0033 X SCYK03 3 77.7033 X 15
  78. Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for b sub TH by vi khuan lactic Method: 95.0 percent LSD vi khuan lactic Count Mean Homogeneous Groups SCPR02 3 0.170333 X CCTC 3 2.25 X KCHQ 3 4.31667 X SCYK02 3 8.42 X NCTC02 3 47.6133 X SCYK01 3 50.6167 X SCPR01 3 52.68 X CPMC 3 57.4167 X NCTC01 3 63.8467 X NCVS 3 64.05 X MCTC 3 67.7467 X SCYK03 3 69.9767 X SCPR03 3 73.3533 X Multiple Range Tests for sal TH by vi khuan lactic Method: 95.0 percent LSD vi khuan lactic Count Mean Homogeneous Groups SCPR02 3 0.313667 X CCTC 3 3.82 X KCHQ 3 4.69333 X SCYK02 3 7.94 X NCTC02 3 42.4867 X SCYK01 3 50.5 X SCPR01 3 52.4033 X CPMC 3 59.05 X MCTC 3 62.48 X NCTC01 3 63.2133 X NCVS 3 65.16 X SCYK03 3 70.3433 X SCPR03 3 72.2767 X 16
  79. Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for l mono TH by vi khuan lactic Method: 95.0 percent LSD vi khuan lactic Count Mean Homogeneous Groups CCTC 3 0.842333 x SCPR02 3 3.78 X KCHQ 3 5.55667 X SCYK02 3 23.1033 X NCTC02 3 38.8433 X SCYK01 3 40.3867 X CPMC 3 40.9367 X SCPR01 3 51.6133 X NCVS 3 60.9333 X NCTC01 3 61.0067 X MCTC 3 61.39 X SCYK03 3 61.58 X SCPR03 3 73.9433 X Multiple Range Tests for S au TH by vi khuan lactic Method: 95.0 percent LSD vi khuan lactic Count Mean Homogeneous Groups CCTC 3 5.98333 x KCHQ 3 5.98667 X SCPR02 3 5.99333 x SCYK02 3 14.48 X SCYK01 3 39.5333 X CPMC 3 51.3967 X SCPR01 3 52.9233 X NCTC01 3 61.02 X SCYK03 3 63.7467 X NCTC02 3 68.2967 X NCVS 3 71.92 X MCTC 3 72.1533 X SCPR03 3 74.8067 X 17