Đồ án Tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập và đánh giá hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải chế biến thủy sản

pdf 105 trang thiennha21 12/04/2022 50
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập và đánh giá hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải chế biến thủy sản", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_tim_hieu_kha_nang_tang_sinh_phan_lap_va_danh_gia_hoat.pdf

Nội dung text: Đồ án Tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập và đánh giá hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải chế biến thủy sản

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU KHẢ NĂNG TĂNG SINH PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT LỰC CỦA VI KHUẨN AOB VÀ NOB CÓ NGUỒN GỐC TỪ NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN THỦY SẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: VI SINH MÔI TRƯỜNG Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Trương Cao Dương MSSV: 0851110028 Lớp: 08DSH5 TP. Hồ Chí Minh, 2012
  2. LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hương, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.Hồ Chí Minh. Những kết quả có được trong đồ án này là hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về đồ án tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 21 tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành nhất đến ba mẹ và gia đình đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em được cắp sách đến trường, theo đuổi con đường học vấn mà em đã chọn suốt 16 năm qua. Lời thứ hai, cho em gửi lời tri ân chân thành nhất đến các thầy các cô những người đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức hay và bổ ích nhất trong suốt những năm em ngồi trên ghế nhà trường và giảng đường đại học, cho em một hành trang tri thức vững chắc vào đời để thực hiện những ước mơ, những hoài bão mà em đang ấp ủ. Em xin chân thành cảm ơn các thầy các cô cùng ban giám hiệu nhà trường đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất từ điều kiện học tập, trang thiết bị máy móc hiện đại để em có thể làm việc và thực hiện đề tài tốt nghiệp của em đạt kết quả tốt nhất. Và đặc biệt là em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương: cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo hết mình, giúp đỡ tận tình em trong suốt thời gian dài làm đồ án để em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình với kết quả tốt nhất. Lời cuối cùng, cho em gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn của em, những người luôn động viên, luôn sát cánh bên em và giúp đỡ em hết mình để em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp với kết quả tốt nhất. Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày 21 tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện ii SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AOB: Ammonia-Oxidizing Bacteria cBOD: carbonaceous BOD CBTS: Chế biến thủy sản DO: Dissolved Oxygen ĐC: Đối chứng MLVSS: Mixed liquor volatile suspended solids NOB: Nitrite-Oxidizing Bacteria RAS: Return Activated Sludge TN: Thí nghiệm TS4: Thủy sản 4 W1: Winogradsky 1 W2: Winogradsky 2 iii SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các giống của vi khuẩn nitrate hóa. 17 Bảng 1.2. Sinh lý học cơ bản và những đặc trưng về cấu trúc của Nitrosomonas và Nitrobacter. 18 Bảng 1.3. Sự tăng về kích thước quần thể của Nitrosomonas và Nitrobacter sau 72 giờ. 13 Bảng 1.4. Nồng độ DO và quá trình nitrate hóa đạt được. 23 Bảng 1.5. pH và quá trình nitrate hóa. 24 Bảng 1.6. Nhiệt độ và quá trình nitrate hóa. 25 Bảng 1.7. Những dạng của sự ức chế và độc chất. 27 + - - Bảng 2.1. Cường độ màu của NH4 - NO2 & NO3 với thuốc thử tương ứng trong phản ứng định tính. 38 Bảng 2.2. Thể tích mẫu còn lại của 10 bình AOB nuôi cấy sau khi đã lấy mẫu định lượng.41 Bảng 2.3. Kết quả OD của 6 chủng vi khuẩn sau 48 giờ nuôi lắc và thể tích huyền phù tế bào cần hút cho thí nghiệm khảo sát. 42 Bảng 2.4. Kết quả OD của 3 chủng vi khuẩn khảo sát sau 48 giờ tăng sinh và thể tích huyền phù tế bào cần hút cho thí nghiệm. 44 Bảng 3.1. Thử nghiệm định tính mẫu tăng sinh AOB trong môi trường W1 từ nước thải TS4. 48 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của 4 chủng vi khuẩn phân lập được trên W1. 49 + - - Bảng 3.3. Hàm lượng NH4 - NO2 & NO3 qua “Thử nghiệm định tính” 10 bình mẫu nuôi cấy AOB. 51 + - - Bảng 3.4. Hàm lượng NH4 - NO2 & NO3 trong 10 bình mẫu AOB và hiệu quả chuyển hóa cơ chất. 53 Bảng 3.5. Kết quả định tính 10 bình mẫu AOB tiếp tục được tăng sinh trong vòng 13 ngày (sau khi đã được thay môi trường AOB mới). 56 Bảng 3.6. Tổng kết các chủng vi khuẩn nitrate hóa phân lập được trên môi trường W2. 58 Bảng 3.7. Hiệu quả chuyển hóa nitrite và nitrate hóa sau 6 ngày tăng sinh. 61 iv SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1. Hiện tượng cá chết hàng loạt trên sông do nhiễm độc. 08 + Hình 1.2. pH và sự chuyển đổi của NH3 và ion NH4 09 Hình 1.3. Hiện tượng tảo nở hoa. 10 Hình 1.4. Hội chứng da xanh ở trẻ em. 10 Hình 1.5. Chu trình nitơ trong nước thải. 11 Hình 1.6. Quy trình phân lập tuyển chọn, cải biến các VSV nguồn gốc tự nhiên để sản xuất chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm. 28 + Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn NH4 42 - Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn NO2 42 Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn NO3 43 + - - Hình 3.1. Nồng độ các dạng nitơ NH4 - NO2 & NO3 trong 11 bình tăng sinh AOB. 54 Hình 3.2. Hiệu quả xử lý N – Amoni và hiệu quả nitrate hóa của các quần thể vi sinh vật trong 10 bình tăng sinh AOB. 54 Hình 3.3. Các mẫu vi khuẩn phân lập trên thạch W2: a) Mẫu 1, b) Mẫu 2, c) Mẫu 3, d) Mẫu 5, e) Mẫu 7, f) Mẫu MV1. 59 Hình 3.4. Biến thiên N – nitrite trong môi trường W2 khi cấy vi khuẩn phân lập từ nước thải CBTS. 60 Hình 3.5. Nồng độ N – nitrate (mg/L) sinh ra trong môi trường W2 khi cấy các chủng phân lập. 60 - Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện khả năng chuyển hóa N – NO2 của 3 mẫu trong suốt thời gian khảo sát. 62 Hình 3.7. Biến đổi nồng độ N – nitrate tạo thành theo thời gian khảo sát các mẫu phân lập 62 Hình 3.8. Biến đổi hiệu quả chuyển hóa nitrite và nitrate hóa theo thời gian của các mẫu phân lập. 63 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải CBTS. 46 v SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ BIỂU ĐỒ v LỜI MỞ ĐẦU vi 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 2.1 Trên thế giới 2 2.2 Tại Việt Nam 2 3. Mục đích nghiên cứu 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 5. Phương pháp nghiên cứu 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Giới thiệu về những hợp chất có bản chất nitơ (Nitrogenous Compounds) 5 1.1.1 Amino acids 5 1.1.2 Proteins 6 1.1.3 Urea 6 1.2 Những ảnh hưởng của những chất thải có bản chất nitơ đến môi trường sống và nước thải 7 1.2.1 Sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO) 7 1.2.2 Độc tính (Toxicity) 7 1.2.3 Sự thiếu oxi trong nước (Eutrophication) 9 1.2.4 Sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia) 10 1.3 Chu trình nitơ trong nước thải (The Wastewater Nitrogen Cycle) 11 1.4 Giới thiệu về quá trình nitrate hóa trong môi trường (Introduction to Nitrification) 14 1.5 Những vi khuẩn oxi hóa nitơ hay vi khuẩn nitrate hóa (Nitrifying Bacteria) 15 1.6 Những sinh vật chỉ thị hay những chất chỉ thị cho quá trình Nitrate hóa (Indicators of Nitrification) 21 vi SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG 1.7 Những yếu tố hay điều kiện môi trường ảnh hưởng đến vi khuẩn nitrate hóa và quá trình nitrate hóa 22 1.7.1 Sự tích lũy NO2 22 1.7.2 Oxi hòa tan (DO) 22 1.7.3 Tính kiềm và pH 23 1.7.4 Nhiệt độ (Temperature) 24 1.7.5 Sự ức chế và độc tính (Inhibition and Toxicity) 25 1.8 Tăng cường sinh học (Bioaugmentaion) [10] 26 1.8.1 Định nghĩa 26 1.8.2 Phương pháp tăng cường sinh học 27 1.9 Các nghiên cứu liên quan đến quá trình phân lập, nuôi cấy các chủng vi khuẩn Nitrate hóa 27 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Thời gian và địa điểm 31 2.2 Vật liệu – Hóa chất – Dụng cụ & thiết bị 31 2.2.1 Vật liệu 31 2.2.2 Hóa chất 31 2.2.2.1 Thành phần môi trường phân lập, nuôi cấy 31 2.2.2.2 Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 33 2.2.3 Dụng cụ và thiết bị 33 2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Nội dung nghiên cứu chính 34 2.3.2 Phương pháp thu nhận và vận chuyển mẫu nước thải 34 2.3.3 Phương pháp phân lập 34 2.3.4 Phương pháp định tính môi trường nuôi cấy 35 2.3.5 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn phân lập 37 2.3.6 Khảo sát khả năng mọc trên môi trường agar hữu cơ đối với 4 chủng nghi ngờ là vi khuẩn nitrite hóa đã phân lập được trên môi trường W1 40 2.3.8 Thử nghiệm tăng sinh khối 10 bình nuôi cấy AOB: 41 vii SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG 2.3.9 Khảo sát khả năng chuyển hóa của 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa đã phân lập được trên môi trường W2 lỏng 41 2.3.10 “Khảo sát khả năng chuyển hóa” của 3 chủng vi khuẩn nitrate hóa chọn lọc trên môi trường giàu vi lượng NOB (1g NaNO2/l) 44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 47 3.1 Kết quả tăng sinh phân lập và khảo sát hoạt lực nitrite hóa của AOB từ nước thải nhà máy chế biến thủy sản (CBTS) 48 3.1.1 Tăng sinh phân lập AOB lần I 48 3.1.1.1 Kết quả thử nghiệm định tính 48 3.1.1.2 Kết quả phân lập 49 3.1.1.3 Kết quả khảo sát khả năng mọc của 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa trên môi trường agar hữu cơ 50 3.1.2 Tăng sinh phân lập AOB lần II 50 3.1.3 Tăng sinh phân lập AOB lần III 51 3.1.3.1 Kết quả thử nghiệm định tính 51 + - - 3.1.3.2 Kết quả định lượng hàm lượng NH4 - NO2 & NO3 có trong 10 bình nuôi cấy AOB vừa mới phân lập được ở trên 52 3.1.3.3 Kết quả định tính lại 10 bình AOB sau khi thêm môi trường mới vào và tăng sinh tiếp tục trong 13 ngày 55 3.2 Kết quả tăng sinh phân lập và khảo sát hoạt lực nitrate hóa của các chủng NOB có nguồn gốc từ nhà máy chế biến thủy sản (CBTS) 57 3.2.1 Tăng sinh phân lập NOB lần I 57 3.2.1.1 Kết quả định tính 57 3.2.1.2 Kết quả phân lập 57 3.2.1.3 Khảo sát khả năng chuyển hóa của 6 mẫu vi khuẩn phân lập được trên môi trường lỏng W2 59 3.2.1.4 Khảo sát khả năng chuyển hóa của các quần thể NOB trong thí nghiệm tăng sinh trên môi trường lỏng NOB (1g NaNO2/l) 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 4.1 Kết luận 66 4.2 Kiến nghị 66 viii SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 70 PHỤ LỤC BẢNG 92 ix SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: - Việt Nam được mệnh danh là “Rừng vàng - Biển bạc” với sự phong phú và đa dạng về tài nguyên thiên nhiên. Nước ta có chiều dài bờ biển dài hàng ngàn km từ Bắc vào Nam, chính vì vậy mà chúng ta sở hữu được một nguồn tài nguyên biển vô cùng vô tận, đặc biệt nhất là nguồn lợi thủy hải sản vô cùng phong phú. Chính vì thế đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp đánh bắt và chế biến thủy hải sản ở các tỉnh ven biển và ở các thành phố lớn của nước ta. - Ngành công nghiệp chế biến thủy sản ở nước ta đã phát triển không ngừng trong những năm gần đây và đang là ngành mũi nhọn trong việc thúc đẩy phát triển nền kinh tế của nước nhà, mang lại nhiều lợi nhuận kinh tế cho đất nước, tạo ra nhiều công ăn việc làm cho người dân Tuy nhiên, bên cạnh những mặt tích cực ấy, thì còn rất nhiều công ty, nhà máy xí nghiệp chế biến thủy hải sản ở nước ta chưa có đầu tư và vận hành hệ thống xử lý nước thải; nước thải chế biến thủy sản được thải với lượng lớn ra ngoài môi trường, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, đặc biệt là môi trường nước. - Nước thải chế biến thủy sản (nước thải giết mổ và rửa thủy sản) chứa hàm lượng hữu cơ rất cao, đặc biệt là các chất hữu cơ có chứa nitơ, khi chúng được thải ra ngoài môi trường sẽ gây ô nhiễm cho chủ yếu là các nguồn nước mặt như ao, hồ, sông, suối và ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Chính vì vậy để khắc phục tình trạng ô nhiễm này đã có nhiều biện pháp xử lý khác nhau nhằm hạn chế và giảm bớt hàm lượng chất thải hữu cơ có chứa nitơ trong hệ thống xử lý nước thải trước khi nước được thải ra ngoài. Và phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là xử lý bằng phương pháp sinh học để xử lý nước thải chế biến thủy sản (phù hợp với tính chất của nước thải chế biến thủy sản là giàu chất hữu cơ) với việc bổ sung vi sinh vật được phân lập nuôi cấy từ bên ngoài vào hệ thống xử lý nước thải nhằm tăng cường hiệu quả xử lý trước khi nước được thải ra ngoài. Dựa vào điểm này, chúng tôi đã đi đến quyết định chọn đề tài “Tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập và đánh giá hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải CBTS” với mục đích là tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa có khả năng xử lý nitơ từ nguồn nước thải chế biến thủy sản để có thể ứng dụng tạo ra các chế phẩm sinh học để bổ sung vào hệ thống xử lý nước thải giúp tăng hiệu quả xử lý nước thải cũng như loại bỏ hoàn toàn các chất thải có bản chất nitơ ra khỏi nước thải trước khi được thải ra ngoài môi trường. 1 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG 2. Tình hình nghiên cứu: 2.1 Trên thế giới: - Sự phân lập vi khuẩn nitrate hóa trong môi trường nuôi cấy thuần khiết đã được thực hiện thành công đầu tiên bởi Winogradsky (1890). Sự thành công này của ông đã được biết đến vài năm trước khi quá trình nitrate hóa được tìm ra là do những sinh vật sống thực hiện (Schloesing & Muntz, 1877) và sự cố gắng của Frankland cùng các cộng sự (1890) để phân lập những sinh vật ấy bằng những phương pháp vi khuẩn học thường dùng đã gặp thất bại. - Năm 1950, bằng phương pháp cải tiến từ phương pháp của Winogradsky, Jane Meiklejohn đã thành công trong việc phân lập chủng Nitrosomonas europaea từ sự nuôi cấy thuần khiết. Và cũng trong nghiên cứu này, bà cũng đã tìm ra được môi trường thích hợp (có bổ sung thành phần vi lượng cần thiết) để duy trì hoạt tính của các chủng vi khuẩn nitrate hóa (qua nhiều lần cấy chuyển môi trường để tăng sinh mà không bị mất hoạt tính như ban đầu bà đã vấp phải khi mới bắt đầu nghiên cứu). [11] - Năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra một kỉ nguyên mới trong việc phân lập và nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện ra và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxi hóa NH3 khác. - Năm 1968, S.Soriano và N.Walker đã thành công trong việc phân lập và tinh sạch được Nitrosomonas và Nitrosocystis spp. bằng việc sử dụng môi trường agar tinh chế và một phương pháp thu nhận những tập đoàn với những pipet mao quản thủy tinh được hoạt động bởi máy vi thao tác đơn trước đây đã được mô tả bởi Soriano (1935). [20] 2.2 Tại Việt Nam: - Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thanh (2007) đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn nitrate hóa ứng dụng vào xử lý nước hồ bị ô nhiễm. [1] - Hoàng Phương Hòa, Trần Văn Nhị, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc (2008) đã phân lập được 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa từ nước lợ nuôi tôm và ứng dụng xử lý nitơ trong ao nước nuôi tôm. [2] 3. Mục đích nghiên cứu: - Tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập và đánh giá hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải CBTS. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu: - Tìm hiểu khả năng tăng sinh, phân lập các chủng vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải CBTS. 2 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - Đánh giá hoạt lực của các chủng vi khuẩn AOB và NOB phân lập được trên môi trường nuôi cấy tương ứng của chúng. 5. Phương pháp nghiên cứu: - Phương pháp thu nhận và bảo quản mẫu nước thải. - Phương pháp phân lập vi khuẩn nitrate hóa. - Phương pháp thử nghiệm định tính. - Phương pháp xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn phân lập. + - - - Phương pháp định lượng NH4 - NO2 và NO3 trong môi trường nuôi cấy. 3 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG 1.1 Giới thiệu về những hợp chất có bản chất nitơ (Nitrogenous Compounds): - Sự đa dạng hóa của những hợp chất có thể rất khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc xả thải bao gồm cả những chất thải có bản chất nitơ. Ví dụ về những hợp chất có bản chất nitơ đã được tìm thấy trong nước thải công nghiệp bao gồm: analine (CH3CHNH2COOH), chất ức chế sự ăn mòn, chất thải của các sản phẩm từ sữa và chất thải từ lò mổ - Analine: được sử dụng trong sản xuất thuốc nhuộm, những hóa chất chụp ảnh và những chất dùng làm thuốc. Nitrite: được dùng làm chất ức chế ăn mòn trong hệ thống nước công nghiệp. Những chất thải từ sữa: bao gồm những protein có chứa nitơ, kể cả casein và nhiều protein hiện diện trong thịt và máu từ chất thải lò mổ hay nhà máy chế biến thủy sản. + - Nước thải trong nhà bao gồm những hợp chất nitơ hữu cơ và NH4 . Nitơ trong nước thải trong nhà bắt nguồn từ sự chuyển hóa protein trong cơ thể con người. Trong nước thải trong nhà mới được thải ra, khoảng chừng 60% nitơ là ở trạng thái hữu cơ, như + là những chất thải có chứa protein và 40% nitơ là dưới dạng vô cơ, như NH4 . Những hợp chất hữu cơ như: amino acid, protein, urea có nguồn gốc từ những hợp chất nitơ hữu cơ từ + nước thải trong nhà, trong khi đó NH4 là hợp chất có nguồn gốc vô cơ từ nước thải trong nhà. - - Nếu không thải ra bằng những ngành nghề sản xuất kinh doanh riêng biệt, thì NO3 - và NO2 không được tìm thấy trong hệ thống cống rãnh thành phố. Những điều kiện bên + - trong hệ thống cống rãnh không thuận lợi cho sự oxi hóa NH4 hay NO2 ; tức là quá trình nitrate hóa không xảy ra. 1.1.1 Amino acids: - Amino acid: là những hợp chất nitơ hữu cơ, chúng chứa nhóm carboxylic acid (- COOH) và nhóm amino (-NH2). Nhóm amino trong tất cả các amino acid luôn luôn được liên kết với carbon kế cận nhóm carboxylic acid. Amino acid là những hợp chất khung của cấu trúc protein, chúng tạo thành các phân tử protein. Trong thời gian suy giảm của amino acid, nhóm amino được phóng thích. - Sự khử nhóm NH2 ra khỏi một hợp chất hữu cơ là phản ứng sinh hóa chịu trách nhiệm về sự giảm đi của nhóm amino. Sự khử nhóm NH2 khỏi một hợp chất hữu cơ của amino acid có thể xảy ra trong hệ thống cống rãnh và hệ thống xử lý nước thải (cụ thể là trong bể aerotank). Sự khử nhóm NH2 có thể xảy ra trong sự hiện diện hay không có oxi hòa tan. Những amino acid có cấu trúc đơn giản có thể được phân hủy trong hệ thống cống rãnh. Còn những amino acid có cấu trúc phức tạp hơn có thể được phân hủy trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). 5 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - Khi mà nhóm amino (-NH2) được phóng thích vào nước thải, nó được biến đổi + nhanh chóng thành NH4 . Sự biến đổi này xảy ra trong nước thải do có sự hiện diện của ion H+: + + NH2 2H Æ NH4 1.1.2 Proteins: - Protein: là những hợp chất nitơ hữu cơ (chứa tới 15 – 17% nitơ) và là thành phần quan trọng của tế bào sinh vật; chúng chứa những amino acid. Protein là những chất keo và có cấu trúc rất phức tạp. Vì chúng là những chất keo tự nhiên và có cấu trúc phức tạp nên sự phân hủy protein là rất chậm và sự khử NH2 thường xảy ra trong hệ thống xử lý nước thải (bể bùn hoạt tính) chứa đựng nồng độ chất rắn cao và sự thông khí kéo dài. - Protein phải được hút bám trên bề mặt của vi khuẩn và được hòa tan thành những hợp chất đơn giản, chúng có thể đi vào những tế bào vi khuẩn để mà được phân hủy. Khi protein phân hủy, thì những amino acid được giải phóng. Sự khử nhóm amino (-NH2) của + các amino acid đưa đến sự tạo ra NH4 . - Những protein hình thành nên nhiều tế bào chất bên trong tế bào vi khuẩn và cung cấp như là phần hợp thành cấu trúc bên trong vách tế bào vi khuẩn. Những enzyme của vi khuẩn vẫn có protein trong thành phần cấu tạo. Khi mà vi khuẩn chết đi trong một hệ thống xử lý nước thải, những chất hợp thành tế bào này được giải phóng và đáp ứng như là nguồn thức ăn cho sự sống của những vi khuẩn khác. Khi mà những chất hợp thành tế bào bị phân + hủy, NH4 được tạo ra trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). 1.1.3 Urea: - Urê: có trong thành phần nước tiểu của người và động vật, chiếm khoảng 2.2% nước tiểu và chứa tới 46.6% nitơ. Urê là một hợp chất nitơ hữu cơ đơn giản nhất, nó chứa 2 + nhóm amino. Trong hệ thống cống rãnh urê bị thủy phân tạo thành NH4 . Thủy phân là sự phân cắt hay một phân tử với sự cộng thêm nước thông qua hoạt động của vi khuẩn. Vi khuẩn dùng enzyme urease để phân cắt urê: + H2NCONH2 2H2O Æ 2NH4 CO2 - Trong hệ thống cống rãnh nhiều hợp chất nitơ hữu cơ nhanh chóng được thủy phân và khử nhóm NH2. Do sự thủy phân và sự khử nhóm NH2 trong hệ thống cống rãnh, nồng + độ NH4 đầu vào mà hệ thống xử lý nước thải nhận được từ nước thải trong nhà thường là + 15 – 30mg/l. Những ion NH4 được phóng thích thêm ra trong hệ thống xử lý nước thải (bể bùn hoạt tính) từ những amino acid có cấu trúc phức tạp, protein và những chất thải có bản chất nitơ khác nữa. 6 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG 1.2 Những ảnh hưởng của những chất thải có bản chất nitơ đến môi trường sống và nước thải: - Sự hiện diện của những chất thải có bản chất nitơ và những chất thải có chứa nitơ trong nước thải cuối cùng của một hệ thống nước thải nhà máy hay xí nghiệp được thải ra, có thể tác động bất lợi và gây ô nhiễm đến chất lượng của nguồn nước tiếp nhận (các nguồn nước mặt như: sông, suối, ao, hồ ). Nguồn gốc của những chất thải có bản chất + - - nitơ gây ô nhiễm nguồn nước nhận chính là những ion NH4 , NO2 và NO3 . Những tác động gây ô nhiễm quan trọng có liên quan tới sự hiện diện của những chất thải có bản chất nitơ ấy bao gồm: sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO), độc tính (Toxicity), sự thiếu oxi trong nước (Eutrophications) và sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia). - Để giảm bớt những ảnh hưởng bất lợi của những chất thải có bản chất nitơ cho nguồn nước tiếp nhận, một hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) phải đảm bảo yêu cầu xử lý và giảm lượng chất thải có bản chất nitơ xuống dưới hoặc bằng mức cho phép của tiêu chuẩn xả thải trong nước thải đầu ra của hệ thống xử lý nước thải ấy. Hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) phải đảm bảo quá trình oxi hóa nitơ (nitrify) và quá trình khử nitơ (denitrify) những chất thải có bản chất nitơ xảy ra hoàn tất trong cả quá trình hoạt động của hệ thống. Yêu cầu của quá trình nitrate hóa (nitrification) thường được đưa ra như giới hạn thải ra NH3 và yêu cầu của quá trình phản nitrate (denitrification) thường được đưa ra như giới hạn Tổng nitơ hay Tổng nitơ Kjeldahl (TKN). 1.2.1 Sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO): - Việc thải ra những chất thải có bản chất nitơ vào nguồn nước nhận là kết quả của sự cạn kiệt nguồn oxi hòa tan trong nguồn nước nhận ấy. Sự cạn kiệt xảy ra thông qua sự tiêu thụ oxi hòa tan bởi hoạt động của vi khuẩn. + - - - - Đầu tiên, NH4 được oxi hóa thành NO2 và NO2 được oxi hóa thành NO3 bên trong nguồn nước tiếp nhận. Quá trình oxi hóa mỗi ion xảy ra bằng oxi hòa tan được di + - chuyển từ nguồn nước tiếp nhận vào vi khuẩn và gia tăng thêm NH4 và NO2 . Tiếp theo, + - - NH4 , NO2 và NO3 đáp ứng như là nguồn nitơ dinh dưỡng cho sự tăng trưởng của những thực vật sống ở nước, chủ yếu là những loài tảo. Khi những thực vật ấy chết đi, oxi hòa tan sẽ được di chuyển từ nguồn nước tiếp nhận vào vi khuẩn để phân hủy những thực vật đã chết ấy. + O2 + O2 + - - NH4 NO2 NO3 1.2.2 Độc tính (Toxicity): 7 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Hình 1.1: Hiện tượng cá chết hàng loạt trên sông do nhiễm độc.[23] + - - - Ba ion có bản chất nitơ trên (NH4 - NO2 & NO3 ) có thể là độc chất cho sự sống + - của những loài thủy sinh vật, đặc biệt nhất là cá. Những ion NH4 và NO2 là vô cùng độc. - Và NO2 là độc nhất trong 3 loại ion có bản chất nitơ. + - Mặc dù NH4 là nguồn dinh dưỡng nitơ ưa thích nhất cho phần lớn sinh vật sống, + NH4 được biến đổi thành NH3 với sự tăng lên của pH. Nó là NH3 khi ở pH cao và độc cho sự sống của thủy sinh vật. 8 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG + Hình 1.2: pH và sự chuyển đổi của NH3 và ion NH4 .[16] 1.2.3 Sự thiếu oxi trong nước (Eutrophication): 2- - Trong khi phosphate (PO4 ) là nguồn gốc chính yếu của sự thiếu oxi trong nước thì những chất thải có bản chất nitơ cũng góp phần quan trọng cho vấn đề ô nhiễm nước này. - Sự thiếu oxi trong nước nói đến sự thải ra những chất dinh dưỡng của thực vật (chủ yếu là: phốt pho và nitơ) vào nước sạch (như: hồ và ao). Sự hiện diện những chất dinh dưỡng này kích thích sự tăng trưởng nhanh chóng hay sự ra hoa của thực vật thủy sinh, bao gồm cả tảo. Khi những thực vật thủy sinh này già và chết đi, xác của chúng sẽ làm cho nguồn nước thiếu oxi do quá trình hoạt động phân hủy hiếu khí của những vi sinh vật diễn ra. Sự thiếu oxi trong nước dẫn đến sự lão hóa nhanh chóng của nguồn nước ngọt khi chúng mất khá nhiều oxi cho sự phân hủy này. Và sự tích lũy xác những thực vật thủy sinh ngày càng nhiều dẫn đến khả năng phân hủy của nguồn nước bị giảm đi đến mức chúng 9 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG không thể phân hủy được nữa, không tự làm sạch được nữa thì dẫn đến nguồn nước ấy bị ô nhiễm. Hình 1.3: Hiện tượng tảo nở hoa.[23] 1.2.4 Sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia): Hình1.4: Hội chứng da xanh ở trẻ em.[23] - Từ “Methemoglobinemia” hay “Hội chứng da xanh ở trẻ em” nói đến một căn bệnh của những đứa trẻ còn nhỏ (dưới 6 tháng tuổi) ăn uống phải nước ngầm đã nhiễm bẩn - - NO3 . Khi một đứa bé ăn uống những thứ được làm ra từ nước ngầm đã bị nhiễm bẩn NO3 - thì những ion này dễ dàng được biến đổi thành NO2 trong đường tiêu hóa của đứa bé. Ion - NO2 này xâm nhập vào hệ tuần hoàn của đứa trẻ và nhanh chóng liên kết với Fe trong nhân của Hemoglobin hay những Tế bào hồng cầu. - - Sự hiện diện của NO2 trong nhân ngăn cản Hemoglobin thu được oxi khi nó đi qua phổi của đứa trẻ. Sự thiếu oxi trong cơ thể của đứa trẻ dẫn đến da của đứa trẻ trở nên xanh 10 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG xao, vì thế mới có thuật ngữ “Blue baby syndrome”. Nếu thiếu oxi trong não của đứa trẻ, chứng liệt hay chết có thể xuất hiện. - Methemoglobinemia thường thường liên đới với những vùng nông thôn, nơi mà nước dùng để uống được thu từ nước ngầm. Methemoglobinemia không có dấu hiệu để cảnh báo và mặc dù nó có thể xuất hiện với những người trưởng thành; nó có thể độc hơn nhiều với những đứa trẻ sơ sinh bởi vì pH trong cơ thể chúng thấp hơn và trọng lượng cơ - thể chúng thấp hơn khi so sánh với những người trưởng thành. Và khi ion NO3 ở nồng độ cao cũng có thể làm tăng nguy cơ gây ung thư dạ dày ở mọi lứa tuổi. 1.3 Chu trình nitơ trong nước thải (The Wastewater Nitrogen Cycle): Hình 1.5: Chu trình nitơ trong nước thải.[16] - Có nhiều hợp chất có bản chất nitơ tồn tại trong môi trường sống và trong hệ thống xử lý nước thải. Phần lớn nitơ tìm thấy trong môi trường sống tồn tại dưới dạng nitơ phân tử (N2) trong bầu khí quyển chúng ta (chúng chiếm tới 76% trong bầu khí quyển so với các khí khác). - Mặc dù sự cấu thành không nhiều của nitơ trong sinh khối so với carbon hay oxi nhưng nitơ là một yếu tố thiết yếu của tất cả sự sống sinh vật. Nó được kết hợp chặt chẽ 11 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG trong nguyên liệu tế bào và được dùng cho sự tăng trưởng, tạo ra enzyme và thông tin về di truyền học. Tuy nhiên, nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ nối với nhau bằng 3 dây nối N N, nó rất khó để hầu hết sinh vật có thể bẻ gãy. May thay, nitơ phân tử được tạo ra sẵn có cho sự sống sinh vật khi mà liên kết 3 bị bẻ gãy bởi một nhóm vi khuẩn duy + nhất và được cố định lại hay biến đổi thành NH4 . + - Những vi khuẩn biến đổi nitơ phân tử thành NH4 là những vi khuẩn cố định nitơ. Những vi khuẩn này có thể sống tự do trong đất xung quanh rễ của thực vật hay có thể tăng trưởng cộng sinh trong rễ của những cây họ đậu. + - Sự cố định nitơ tức là sự chuyển đổi nitơ phân tử thành NH4 , được hoàn thành bởi enzyme nitrogenase chỉ được tìm thấy trong những vi khuẩn cố định nitơ. Trước khi sự sử dụng phân bón nitơ lan rộng, thực vật tăng trưởng nốt sần hay những cây họ đậu cung cấp nitơ cho đất. Ví dụ những cây họ đậu bao gồm: Cỏ linh lăng, Cỏ ba lá và những cây Đậu nành. - Một vài loài tảo cũng có thể sử dụng nitơ phân tử để sản xuất ra amino acid và protein. Tảo lấy nitơ phân tử từ không khí và đồng hóa chúng thành những phân tử hữu cơ. Cuối cùng, những phân tử hữu cơ này với nitơ liên kết thành cấu trúc của chúng và được tiêu thụ trong suốt chiều dài của chuỗi thức ăn; như là tảo được tiêu thụ bởi những dạng sống cao hơn. - Sự di chuyển của nitơ và sự thay đổi chính nó trong các trạng thái oxi hóa từ không khí sang sinh vật sống đến hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) và sự trở lại của nó vào không khí là chu trình nitơ trong nước thải. Chu trình này liên kết với những hợp chất có bản chất nitơ then chốt liên tiếp như: nitơ phân tử (N2), amino acid, protein, + - - urea, NH4 , NH3, NO2 và NO3 . Trong đó, amino acid và protein là những dạng hữu cơ của + - - nitơ; còn nitơ phân tử (N2), NH4 , NH3, NO2 và NO3 là những dạng vô cơ của nitơ. - - - Sự sản sinh ra NO2 và NO3 trong hệ thống cống rãnh là hiếm thấy. Những điều kiện trong hệ thống cống rãnh là không phù hợp cho sự tạo ra hay quá trình nitrate hóa của những ion này. Những điều kiện bất lợi trong hệ thống cống rãnh ngăn cản quá trình nitrate hóa bao gồm: sự thiếu oxi thích hợp, quần thể vi khuẩn nitrate hóa nhỏ và thời gian nước - - được giữ lại ngắn. Tuy nhiên, lượng rất lớn NO2 và NO3 có thể được tìm thấy trong hệ thống cống rãnh nếu chúng được thải ra từ nguồn nước thải công nghiệp có những ion này, như là nước thải nhà máy thép. - Những amino acid và protein trong mô thực vật, trong rễ, trong hạt và từ thịt vật nuôi được thải trực tiếp vào hệ thống cống rãnh (rác vứt bỏ đi, nước thải chế biến thực phẩm) và gián tiếp vào hệ thống cống rãnh (chất thải có bản chất là phân). Nhiều vi khuẩn 12 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG trong hệ thống cống rãnh khử nhóm amino (-NH2) ra khỏi các amino acid và protein. Sự + khử nhóm NH2 được hoàn thành với enzyme deaminase và đưa đến kết quả là tạo ra NH4 . + Sự tạo thành NH4 còn được biết đến như là quá trình amôn hóa. Sự khử nhóm NH2 của amino acid phenylalanine được cho thấy: + Phenylalanine –ProteusÆ NH4 Phenylpyruvic acid. - Urea: là một hợp chất nitơ hữu cơ, chúng được tìm thấy trong nước tiểu, phân bón và những chất thải từ chăn nuôi. Khi mà được thủy phân bởi enzyme urease của vi khuẩn, + NH4 được giải phóng. Enzyme urease được tìm thấy trong nhiều sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ liên kết với phân bao gồm: Citrobacter. Sự thủy phân urea thành NH3 và CO2 bởi hoạt động của vi khuẩn là rất nhanh chóng. Ở pH của hệ thống cống rãnh NH3 nhanh + chóng được biến đổi thành NH4 . NH2COHN2 H2O –CitrobacterÆ 2NH3 CO2 - Những amino acid và những protein không được phân hủy trong hệ thống cống rãnh có thể được phân hủy trong hệ thống xử lý nước thải (bể aerotank). Sự phân hủy + những amino acid và protein trong bể aerotank cũng đưa đến kết quả sản sinh ra NH4 . + - Những ion NH4 trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) có vài nhiệm vụ. Chúng có thể được dùng như nguồn dinh dưỡng nitơ bởi những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ và vi khuẩn nitrate hóa. Chúng có thể được giải phóng ra ngoài không khí như NH3 ở pH cao và dưới những điều kiện hoạt động thích hợp, Nitrosomonas - + có thể oxi hóa chúng thành NO2 . Nếu những ion NH4 không được sử dụng như nguồn dinh dưỡng, hóa thành khí hay oxi hóa, chúng được chảy vào trong hệ thống nhánh của bể aerotank. - - Dưới nhiệt độ lạnh hay điều kiện phương pháp hệ thống có giới hạn, ion NO2 có - thể tích lũy lại trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). NO2 cũng có một - vài nhiệm vụ trong hệ thống bùn hoạt tính. Chúng có thể bị oxi hóa hóa học thành NO3 nếu Cl2 được dùng để kiểm soát sự tăng trưởng không mong muốn của những sinh vật - dạng sợi. NO2 còn có thể được oxi hóa sinh học bởi Nitrobacter dưới những điều kiện + - - hoạt động thuận lợi. Nếu NH4 và NO2 không có sẵn trong bể aerotank, NO3 được dùng như là nguồn dinh dưỡng nitơ bởi những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ. Nếu những - ion NO2 không bị oxi hóa hay được dùng như nguồn dinh dưỡng nitơ, chúng được chảy - vào hệ thống nhánh của bể aerotank. Trong bể lắng 2, NO2 có thể được khử thành các khí N2O và N2. 13 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - - NO3 trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) có một vài nhiệm vụ. + - Trong sự vắng mặt của NH4 trong bể aerotank, NO3 có thể được dùng như nguồn dinh - dưỡng nitơ. Nếu NO3 không được dùng như một nguồn dinh dưỡng nitơ thì chúng được - chảy vào hệ thống nhánh của bể aerotank. Trong bể lắng 2, NO3 có thể được khử nitrate. - - Những ion NO3 là quan trọng chủ yếu trong chu trình nitơ nước thải. Chúng là sản phẩm của quá trình nitrate hóa, cơ chất của quá trình phản nitrate hóa và là nguồn dinh + - dưỡng nitơ khi mà NH4 không có sẵn. NO3 được sử dụng như nguồn dinh dưỡng nitơ - thông qua một hệ thống sinh học được biết như sự đồng hóa nitrate. Những ion NO3 rất dồi dào, nguồn nitơ vô cơ trong nguồn nước. - Sự phản nitrate có thể xảy ra trong lớp bùn của bể lắng 2 (trong Hệ thống xử lý nước thải) khi mà điều kiện kỵ khí xảy ra trong lớp bùn. Ở đây vi khuẩn kỵ khí tùy nghi sử - - dụng NO2 và NO3 để phân hủy cBOD hòa tan (carbonaceous BOD). Sự phân hủy này được liên kết với sự giải phóng phân tử nitơ. + - Những ion NH4 có thể được loại bỏ bởi hoạt động trộn hay sự hóa khí vào không khí như NH3. Tuy nhiên lượng NH3 mất đi qua sự hóa khí là rất nhỏ, tức là ít hơn 10%. + - Khi mà những chất thải nitơ hữu cơ không còn có sẵn nữa để giải phóng ra NH4 , + + lượng NH4 giảm. Sự giảm NH4 xảy ra vì chúng được dùng như là nguồn dinh dưỡng nitơ - - và bị oxi hóa thành NO2 và NO3 . Nếu quá trình nitrate hóa bắt đầu một cách đúng đắn, - - không có sự tích lũy của NO2 xảy ra. Một vài ion NO3 có thể được loại bỏ đi như là + nguồn dinh dưỡng nitơ khi mà NH4 bị cạn kiệt. Nếu quá trình phản nitrate xảy ra thì - lượng NO3 sẽ bị giảm rất lớn, có lẽ được loại trừ. 1.4 Giới thiệu về quá trình nitrate hóa trong môi trường (Introduction to Nitrification): + - - Quá trình nitrate hóa sinh học là sự biến đổi hay oxi hóa NH4 thành NO2 và sau - + - đó thành NO3 . Trong thời gian oxi hóa NH4 và NO2 , oxi được cộng thêm vào những ion này bởi một nhóm sinh vật duy nhất, những vi khuẩn nitrate hóa. Quá trình nitrate hóa xảy ra trong tự nhiên và trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). Quá trình nitrate hóa trong đất là đặc biệt quan trọng trong tự nhiên, bởi vì nitơ được hấp thu bởi - thực vật như là nguồn dinh dưỡng dưới dạng NO3 . Quá trình nitrate hóa trong nước có liên quan đến xử lý nước thải, nhất là đảm bảo yêu cầu xả thải theo đúng quy chuẩn cho phép. + - NH4 và NH3 là những dạng của hợp chất nitơ, chúng được oxi hóa trong suốt quá + trình nitrate hóa. Số lượng của NH4 và NH3 trong bể aerotank của hệ thống xử lý nước thải được quyết định bởi pH và nhiệt độ trong hệ thống. 14 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG + - - Sự oxi hóa NH4 và NO2 được hoàn thành thông qua sự thêm vào oxi hòa tan bên trong những tế bào vi khuẩn. Bởi vì quá trình nitrate hóa hay sự thêm vào oxi của những phản ứng hóa sinh xảy ra bên trong những tế bào sinh học, quá trình nitrate hóa xảy ra thông qua những phản ứng hóa sinh. + - Những ion NH4 được tạo ra trong nước thải từ sự thủy phân urea và sự phân hủy những hợp chất nitơ hữu cơ. Sự thủy phân và sự phân hủy những hợp chất nitơ hữu cơ đưa + đến kết quả là sự giải phóng ra những nhóm amino (-NH2) và sự tạo thành NH4 . + - - Mặc dù có nhiều sinh vật có khả năng oxi hóa NH4 và NO2 , nhưng những sinh vật ban đầu chịu trách nhiệu chính trước nhất cho quá trình nitrate hóa trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) đó là 2 giống vi khuẩn nitrate hóa, Nitrosomonas và Nitrobacter. Những giống này sở hữu những enzyme và cấu trúc tế bào đặc biệt cho phép chúng hoàn thành quá trình nitrate hóa quan trọng này. - Tốc độ của quá trình nitrate hóa đạt được bởi những vi khuẩn nitrate hóa thường là 1.000 – 10.000 lần lớn hơn tốc độ của quá trình nitrate hóa bằng những sinh vật khác. Bên cạnh những vi khuẩn nitrate hóa, có 2 Protozoa chúng hiện diện với số lượng rất lớn trong lúc quá trình nitrate hóa diễn ra nhanh nhất. Những Protozoa này là: Epistylis và Vorticella. - Mặc dù hệ thống bùn hoạt tính được dùng cho quá trình nitrate hóa, nhưng hệ thống này không phải là lý tưởng cho quá trình nitrate hóa. Vì kích thước quần thể lớn và sự tăng trưởng nhanh chóng của các sinh vật khác trong bể aerotank so sánh với kích thước quần thể nhỏ và sự tăng trưởng chậm của những vi khuẩn nitrate hóa, kích thước quần thể của những vi khuẩn nitrate hóa được làm giảm đi từ từ, tạo ra khó khăn để đạt được và duy trì quá trình nitrate hóa mong muốn. Khoảng chừng 90% đến 97% vi khuẩn trong hệ thống bùn hoạt tính là những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ, còn khoảng chừng 3% đến 10% là vi khuẩn nitrate hóa. 1.5 Những vi khuẩn oxi hóa nitơ hay vi khuẩn nitrate hóa (Nitrifying Bacteria): - Vi khuẩn nitrate hóa sống rất đa dạng trong môi trường sống của chúng ta bao gồm: nước ngọt, nước có thể uống được, nước thải, nước biển, nước lợ và trong đất. - Mặc dù một vài giống vi khuẩn nitrate hóa có khả năng sử dụng một vài hợp chất hữu cơ để thu carbon, giống chủ yếu của những vi khuẩn nitrate hóa trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính), Nitrosomonas và Nitrobacter, sử dụng CO2 hay carbon vô cơ như là nguồn carbon cho sự tổng hợp nguyên liệu tế bào. Mỗi phân tử CO2 đồng hóa thành nguyên liệu tế bào bởi những vi khuẩn nitrate hóa, khoảng chừng 30 phân + - tử của NH4 hay 100 phân tử của NO2 có thể được oxi hóa. 15 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG + - - Vì lượng NH4 và NO2 rất lớn cần để đồng hóa CO2, vi khuẩn nitrate hóa có tốc độ sinh sản rất chậm. Thậm chí dưới những điều kiện tốt nhất thì tốc độ sinh sản của vi khuẩn nitrate hóa là rất nhỏ. - Vi khuẩn nitrate hóa thu được năng lượng bởi quá trình oxi hóa những cơ chất vô + - - + cơ, cụ thể là NH4 và NO2 . Ion NO2 là sản phẩm của sự oxi hóa NH4 bởi Nitrosomonas - cung cấp như là cơ chất cho Nitrobacter. Nếu NO2 không được thải ra khỏi hệ thống bùn - hoạt tính thì NO2 có thể được sản sinh ra trong bể aerotank để mà Nitrobacter dùng làm cơ chất năng lượng. - Có 2 phản ứng sinh năng lượng xảy ra trong suốt quá trình nitrate hóa. Nhiều năng + lượng được lấy từ dạng phản ứng đầu tiên, tức là, sự oxi hóa NH4 , hơn là phản ứng thứ 2, - tức là sự oxi hóa NO2 : + - + NH4 1.5O2 –NitrosomonasÆ NO2 2H H2O Năng lượng. - - NO2 0.5O2 –NitrobacterÆ NO3 Năng lượng. - Phản ứng sinh năng lượng xảy ra trong những tế bào vi khuẩn và cả 2 phản ứng này - đều sử dụng oxi phân tử tự do. Từ đó sự tích lũy NO2 không xuất hiện. Toàn bộ phản ứng + - nitrate hóa được điều khiển bằng sự oxi hóa NH4 sang NO3 . Toàn bộ phản ứng nitrate hóa là một sự kết hợp của 2 phản ứng sinh năng lượng trên: + - + NH4 2O2 –Vi khuẩn Nitrate hóaÆ NO3 2H H2O. + - Mặc dù NH4 được dùng như một nguồn năng lượng bởi những vi khuẩn nitrate + hóa, không phải tất cả NH4 có trong tế bào vi khuẩn đều được nitrate hóa. Một vài ion + NH4 được dùng như là nguồn dinh dưỡng nitơ và được đồng hóa thành nguyên liệu tế bào mới (C5H7O2N). Sự tăng trưởng của những tế bào mới trong hệ thống bùn hoạt tính được tạo thành do sự tăng lên của những chất rắn lơ lửng huyền phù trộn lẫn trong nước (MLVSS) (Mixed liquor volatile suspended solids). - + 4CO2 HCO3 NH4 4H2O Æ C5H7O2N 5O2 3H2O. - Có vài giống vi khuẩn nitrate hóa. Các giống có thể được tập hợp lại thành nhóm + - với nhau dựa theo chúng oxi hóa NH4 hay NO2 : Bảng 1.1: Các giống của vi khuẩn nitrate hóa.[16] 16 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Cơ chất năng lượng Sản phẩm oxi hóa Các giống vi khuẩn (Energy Substrate) (Oxidized Product) nitrate hóa (Genera of Nitrifying Bacteria) - + NO2 Nitrosococcus NH4 Nitrosocystis Nitrosolobus Nitrosomonas Nitrosospira - - NO3 Nitrobacter NO2 Nitrococcus Nitrospira - Những vi khuẩn nitrate hóa không có khả năng gây bệnh, chúng không có trong đường ruột của con người. Vì vậy những vi khuẩn nitrate hóa không đi vào hệ thống cống rãnh và hệ thống xử lý nước thải với lượng lớn thông qua nước thải gia đình. Vi khuẩn nitrate hóa xuất xứ từ đất và nước. - Những vi khuẩn nitrate hóa Nitrosomonas và Nitrobacter có ở mức độ lớn, nếu không hoàn toàn, là nguyên nhân của quá trình nitrate hóa trong đất. Bởi vì những vi khuẩn nitrate hóa bị tiêu diệt bởi ánh sáng tử ngoại, chúng không được tìm thấy lượng lớn trên bề mặt của đất. Tuy nhiên, chúng được tìm thấy với số lượng lớn trực tiếp bên dưới bề mặt của đất nơi ánh sáng cực tím không thể lọt vào được. - Trong hệ thống xử lý nước thải, 2 loài vi khuẩn nitrate hóa chịu trách nhiệm chính + - cho sự oxi hóa NH4 và NO2 là Nitrosomonas europeae và Nitrobacter agilis. Những giống vi khuẩn nitrate hóa khác cũng quan trọng không kém trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). - Nitrosomonas và Nitrobacter là những vi khuẩn gram âm và hiếu khí bắt buộc, chúng yêu cầu oxi phân tử tự do hay oxi hòa tan nhằm để oxi hóa cơ chất. Mặc dù những vi khuẩn nitrate hóa có thể sinh trưởng phát triển và sinh sản trong sự hiện diện của phần lớn những hợp chất hữu cơ, một vài dạng hợp chất hữu cơ có thể ức chế hoạt động của chúng, tức là, ức chế quá trình nitrate hóa. Những hợp chất ức chế đó bao gồm: Cồn và Acid. Một vài hợp chất hữu cơ có chứa nhóm amino (-NH2), như là Methylamine (CH2NH2), cũng ức chế hoạt động của vi khuẩn nitrate hóa. - Với vài ngoại lệ, những vi khuẩn nitrate hóa là những sinh vật tự dưỡng bắt buộc (nghiêm ngặt). Bởi vì chúng là những vi sinh vật tự dưỡng bắt buộc, vài dạng hợp chất hữu 17 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG cơ đơn giản còn lại trong bể aerotank có thể ức chế vi khuẩn nitrate hóa, tức là, ức chế quá trình nitrate hóa. Vì vậy một quần thể sinh vật tự dưỡng hóa năng hữu cơ lớn và đa dạng hiện diện trong bể aerotank để mà oxi hóa những hợp chất hữu cơ có dạng đơn giản ấy. Bảng 1.2: Sinh lý học cơ bản và những đặc trưng về cấu trúc của Nitrosomonas và Nitrobacter.[16] Điểm đặc trưng Nitrosomonas Nitrobacter Vô cơ (CO ) Vô cơ (CO ) Nguồn carbon 2 2 Cầu khuẩn (Coccus) Hình que (Bacillus) Hình dạng tế bào 0.5 – 1.5 Kích thước tế bào 0.5 1.0 (µm) Đất và nước Đất và nước Môi trường sống Có Có hoặc Không Di động Hiếu khí bắt buộc Hiếu khí bắt buộc Nhu cầu oxi 5.8 – 8.5 6.5 – 8.5 Khoảng pH tăng trưởng Sinh sản nhân đôi Nảy chồi Cách thức sinh sản 8 – 36 giờ 12 – 60 giờ Thời gian thế hệ 5 – 30oC 5 – 40oC Khoảng nhiệt độ tăng trưởng 0.04 - 0.13 pound sinh 0.02 – 0.07 pound sinh Hiệu suất sinh bùn khối/g NH + được oxi khối/g NO - được oxi (Sludge yield) 4 2 hóa hóa Hiện diện Hiện diện Màng tế bào - Vi khuẩn nitrate hóa có thể tăng trưởng và sinh sản bằng những tế bào riêng biệt hay khối tập hợp nhỏ dính chặt vào nhau trong chất nhờn. Trong hệ thống bùn hoạt tính, những vi khuẩn nitrate hóa được tìm thấy hút bám trên bề mặt của những hạt keo và lơ lửng trong bể. 18 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - Những vi khuẩn nitrate hóa sinh sản vô tính. Nitrosomonas: sinh sản bằng sự tự phân đôi hay sự phân cắt hoàn toàn thành hai phần; trong khi đó, Nitrobacter: sinh sản bằng cách nảy chồi. - Vì những vi khuẩn nitrate hóa thu được một lượng rất nhỏ năng lượng từ sự oxi hóa + - NH4 và NO2 , sự sinh sản hay thời gian thế hệ là chậm và quần thể nhỏ. Kích thước quần thể vi khuẩn nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính là rất nhỏ khi mà so sánh với kích thước quần thể của các sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ. - Sự khác nhau trong kích thước quần thể giữa vi khuẩn nitrate hóa và những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ là do 2 lý do. Thứ nhất, trong hầu hết hệ thống bùn hoạt tính thành phố và công nghiệp, nồng độ của chất thải có bản chất carbon vượt qúa giới hạn nồng độ của những chất thải có bản chất nitơ. Vì vậy nhiều cơ chất có giá trị để tăng trưởng nhiều vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ. Thứ hai, những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ thu được nhiều năng lượng từ sự sinh sản hơn những vi khuẩn nitrate hóa khi chúng oxi hóa những cơ chất tương ứng của chúng. Vì vậy những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ có thể sinh sản nhanh hơn nhiều những vi khuẩn nitrate hóa có thể sinh sản. - So sánh thời gian thế hệ của những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ với vi khuẩn nitrate hóa thì vi khuẩn nitrate hóa dài hơn nhiều. Thời gian thế hệ của hầu hết những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ trong hệ thống bùn hoạt tính là 15 đến 30 phút. Dưới những điều kiện thuận lợi, thời gian thế hệ của những vi khuẩn nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính là 48 đến 72 giờ. - Trong quần thể vi khuẩn nitrate hóa cũng có một kích thước quần thể khác biệt giữa Nitrosomonas và Nitrobacter. Kích thước quần thể Nitrosomonas là lớn hơn Nitrobacter. + Bởi vì Nitrosomonas thu được nhiều năng lượng từ sự oxi hóa NH4 hơn Nitrobacter thu - được từ sự oxi hóa NO2 , Nitrosomonas có thời gian thế hệ ngắn hơn và có thể tăng nhanh chóng về số lượng khi so sánh với Nitrobacter. Một kích thước quần thể lớn của Nitrosomonas hơn Nitrobacter trong hệ thống bùn hoạt tính đáp ứng cho khả năng oxi hóa + - NH4 nhiều hơn khả năng oxi hóa NO2 . - Sự khác nhau trong thời gian thế hệ giữa Nitrosomonas và Nitrobacter ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình nitrate hóa. Sự khác nhau ấy là nguyên nhân gây nên sự tích lũy - NO2 trong suốt thời gian những điều kiện hoạt động không thuận lợi trong hệ thống bao gồm: nhiệt độ lạnh, quá trình rửa trôi cơ học, mức oxi hòa tan thấp, độc chất - Mặc dù kích thước quần thể cơ bản của vi khuẩn nitrate hóa phụ thuộc vào lượng + - cơ chất sẵn có (NH4 và NO2 ), sự tăng trưởng và sinh sản của quần thể bị ảnh hưởng mạnh 19 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG bởi vài yếu tố hoạt động bao gồm: oxi hòa tan, tính kiềm và pH, nhiệt độ, chất ức chế, chất độc và phương thức hoạt động của cả hệ thống xử lý nước thải. Bảng 1.3: Sự tăng về kích thước quần thể của Nitrosomonas và Nitrobacter sau 72 giờ.[16] Thời gian Nitrosomonas Nitrobacter (giờ) Sự phân Vi khuẩn Sự phân Vi khuẩn bào bào 0 0 1 0 1 8 1 2 0 1 16 2 4 1 2 24 3 8 2 4 32 4 16 2 4 40 5 32 3 8 48 6 64 4 16 56 7 128 4 16 64 8 256 5 32 72 9 512 6 64 - Ví dụ, tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn nitrate hóa bị ảnh hưởng trực tiếp bởi nhiệt độ. Với sự tăng lên của nhiệt độ, sự tăng trưởng của vi khuẩn nitrate hóa tăng nhanh và quá trình dễ dàng kết thúc. Vì vậy khi nhiệt độ giảm, tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn nitrate hóa giảm và quá trình nitrate hóa được hoàn tất với nhiều khó khăn. Vì vậy trong thời gian - - nhiệt độ thấp, sự tích lũy NO2 có thể xảy ra vì Nitrobacter oxi hóa NO2 chậm hơn nhiều + so với Nitrosomonas oxi hóa NH4 . - Sự hiện diện vi khuẩn nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính có thể được nhận - - biết bởi sự tạo ra NO2 hay NO3 ở bên trong bể aerotank. - Việc phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa rất khó thực hiện trên môi trường thạch do thời gian thế hệ kéo dài và chúng không có khả năng cạnh với vi khuẩn dị dưỡng. Chính vì vậy, để phân lập được các chủng vi khuẩn nitrate hóa phải dùng silica gel thay cho thạch [5]. 20 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG 1.6 Những sinh vật chỉ thị hay những chất chỉ thị cho quá trình Nitrate hóa (Indicators of Nitrification): - - Hệ thống bùn hoạt tính (của một hệ thống xử lý nước thải) oxi hóa nitơ nếu NO2 và - NO3 được sinh ra trong bể aerotank. Dù có nhiều cơ chế khác nhau của sự mất đi và sinh + + ra NH4 trong bể aerotank; do đó, một mình sự giảm nồng độ của NH4 trong bể aerotank không biểu lộ quá trình nitrate hóa. Quá trình nitrate hóa được chứng minh bằng sự sản - - - - sinh ra NO2 hay NO3 . Tuy nhiên, nếu sự kiểm tra NO2 hay NO3 trong hệ thống không được thực hiện, thì quá trình nitrate hóa có thể được nghi ngờ bởi sự hiện diện của sinh vật chỉ thị sinh học, chất chỉ thị hóa học và những sinh vật báo hiệu tự nhiên khác. - Những sinh vật chỉ thị sinh học của quá trình nitrate hóa bao gồm: sự tăng trưởng của Tảo và Bèo tấm trong bể lắng 2, sự tăng lên có ý nghĩa của nhu cầu oxi pha trộn trong nước và sự giảm đi có ý nghĩa của mức oxi hòa tan trong hệ thống. Tảo và Bèo tấm thu - được chất dinh dưỡng nitơ từ NO3 . Vì vậy sự hiện diện của chúng trong bể lắng 2 là một - sự chỉ thị của sự sản sinh ra NO3 hay quá trình nitrate hóa trong bể aerotank. - Bèo tấm: là những thực vật có hoa bé nhỏ nhất và đơn giản nhất. Bèo tấm sinh sôi nảy nở nhanh chóng và nổi trên mặt nước. Có 3 giống Bèo tấm chúng được tìm thấy trong hệ thống bùn hoạt tính của hệ thống xử lý nước thải. Những giống này là: Lemna, Spirodella, và Wolffia. - Khi mà quá trình nitrate hóa xảy ra trong bể aerotank, lượng lớn oxi hòa tan được + - tiêu thụ bởi những vi khuẩn nitrate hóa do chúng oxi hóa NH4 và NO2 . Vì vậy, khi quá trình nitrate hóa xảy ra, sự đòi hỏi có ý nghĩa của sinh khối về oxi hòa tan xuất hiện và mức độ oxi hòa tan trong bể aerotank giảm đi. - Những chất chỉ thị hóa học của quá trình nitrate hóa bao gồm sự tăng lên nhu cầu Cl2 để khử trùng trong phụ lưu bể lắng 2. Nếu quá trình nitrate hóa không hoàn tất xảy ra - - và NO2 tích lũy và NO2 phản ứng nhanh chóng với Cl2, đưa đến kết quả là sự tiêu diệt - coliform kém đi trong phụ lưu của bể lắng 2. Sự sản sinh ra NO2 trong bể aerotank đưa đến kết quả là sự phá hủy tính kiềm. Sự phản nitrate hóa trong bể lắng 2 (do kết quả nitrate hóa trong bể aerotank) trả lại tính kiềm cho nước thải. Sự trả lại tính kiềm đưa đến sự tăng tính kiềm hay pH. - Nếu vài sinh vật chỉ thị sinh học, hóa học hay tự nhiên của quá trình nitrate hóa xảy ra trong hệ thống bùn hoạt tính chúng không được yêu cầu nitrate hóa, khi đó sự nitrate hóa sẽ bị nghi ngờ. Để xác định dạng nitrate hóa đang xảy ra, sự kiểm tra nước trong hệ + - - thống về nồng độ NH4 , NO2 và NO3 sẽ được thực hiện. 21 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG 1.7 Những yếu tố hay điều kiện môi trường ảnh hưởng đến vi khuẩn nitrate hóa và quá trình nitrate hóa: - 1.7.1 Sự tích lũy NO2 : - - Sự tích lũy NO2 một phần ức chế đến hoạt động của enzyme bên trong vi khuẩn - - nitrate hóa. Sự ức chế này ngăn cản sự oxi hóa nhanh chóng NO2 thành NO3 . Những yếu tố hoạt động chịu trách nhiệm chính cho sự ức chế này bao gồm: nhiệt độ lạnh, sự thiếu hụt + những chất dinh dưỡng then chốt, nồng độ NH4 cao ở phụ lưu, những chất thải ức chế và độc, sự thay đổi pH, thời gian lưu nước ngắn trong bể aerotank và mức oxi hòa tan thấp nhất thời. - - Sự tích lũy NO2 trong hệ thống bùn hoạt tính có thể là sự cố thay đổi theo mùa vì - sự thay đổi nhiệt độ và nồng độ MLVSS. Sự tích lũy NO2 thường xảy ra tại thời điểm cuối mùa đông hay ngay từ đầu mùa xuân trong hệ thống bùn hoạt tính. 1.7.2 Oxi hòa tan (DO): - Có nhiều nhu cầu hoạt động được biết ảnh hưởng đến vi khuẩn nitrate hóa hay quá trình nitrate hóa, nồng độ oxi hòa tan là một trong những nhu cầu quan trọng ấy. Tuy nhiên nồng độ DO tối ưu nhất để hoàn thành quá trình nitrate hóa là rất thấp, từ 2 – 3 mg/l và không may, nhiều hệ thống bùn hoạt tính được thông khí vượt qúa để hoàn thành quá trình nitrate hóa. - Sự thông khí vượt quá thực tiễn không mang lại lợi nhuận và có thể góp phần làm chia cắt những hạt keo hay làm tăng những bọt khí. Để quá trình nitrate hóa có hiệu quả, + lượng DO được duy trì trong bể aerotank sẽ được điều chỉnh để phù hợp với nồng độ NH4 - - trong phụ lưu nước pha trộn, NO2 và NO3 . Ngoài ra, để nồng độ DO trong bể aerotank, xáo trộn đủ phải được duy trì để ngăn cản sự phân tầng của DO. Và DO phải thâm nhập vào lõi của những hạt keo. - Bởi vì vi khuẩn nitrate hóa là hiếu khí bắt buộc, chúng chỉ có thể oxi hóa nitơ khi có sự hiện diện của oxi hòa tan. Ở nồng độ DO 0.5 mg/l quá trình nitrate hóa không xảy ra. Những yếu tố chủ yếu cho giới hạn này về lượng của quá trình nitrate hóa là sự thiếu oxi cho sự khuếch tán qua các hạt keo và sự cạnh tranh về oxi bởi những sinh vật khác. - Sự tăng nồng độ oxi cho phép tốt hơn sự thâm nhập DO vào hạt keo và khuyến khích thêm quá trình nitrate hóa. Trong khoảng DO từ 0.5 – 1.9mg/l, quá trình nitrate hóa tăng tốc, nhưng nó không có hiệu quả lắm. Quá trình nitrate hóa có ý nghĩa được hoàn tất ở nồng độ DO từ 2.0 – 2.9mg/l, trong khi đó quá trình nitrate hóa đạt cao nhất xuất hiện gần với nồng độ DO 3.0mg/l. 22 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Bảng1.4: Nồng độ DO và quá trình nitrate hóa đạt được.[16] Quá trình nitrate hóa đạt được Nồng độ DO (mgO2/l) Ít, một số lượng không xác định, quá 0.5mg/l trình nitrate hóa xuất hiện. Quá trình nitrate hóa xảy ra nhưng 0.5 – 1.9mg/l yếu kém. Quá trình nitrate hóa có ý nghĩa xảy 2.0 – 2.9mg/l ra. Quá trình nitrate hóa đạt tối đa. 3.0mg/l - Bởi vì vi khuẩn nitrate hóa phải giảm bớt CO2 cho tăng trưởng tế bào, sinh sản và + - thu được ít năng lượng từ sự oxi hóa NH4 và NO2 . Chúng cạnh tranh kém với những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ về DO trong bể aerotank. Vì vậy mức DO trong bể aerotank sẽ được giám sát một cách cẩn thận và không cho phép xuống dưới 1.5mg/l. Dưới giá trị này sự giảm bớt hoạt động nitrate hóa xuất hiện. - Những vi khuẩn nitrate hóa có thể vẫn còn sống trong sự vắng mặt của DO chỉ trong một khoản thời gian rất ngắn. Sự vắng mặt của DO ít hơn 4 giờ không ảnh hưởng bất lợi đến hoạt động của vi khuẩn nitrate hóa cho đến khi DO được khôi phục. Sự vắng mặt DO nhiều hơn 4 giờ ảnh hưởng bất lợi đến hoạt động của vi khuẩn nitrate hóa cho đến khi DO được khôi phục lại. Sự vắng mặt DO trong 24 giờ hay nhiều hơn có thể phá hủy quần thể vi khuẩn nitrate. 1.7.3 Tính kiềm và pH: - Nồng độ ion H+ hay pH của môi trường sống của sinh vật có ảnh hưởng tác động rất lớn đến bên trong sinh vật. Quá trình nitrate hóa bắt đầu rất chậm ở pH thấp và nó có thể xảy ra trong hầu hết môi trường; quá trình nitrate hóa xảy ra ở pH dưới 5.0 không phải do vi khuẩn nitrate hóa thực hiện mà do những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ thực hiện, bao gồm cả nấm. Ở giá trị pH trung tính thì vi khuẩn nitrate hóa có ưu thế hơn. Và ở giá trị pH kiềm thì quá trình nitrate hóa chủ yếu là do vi khuẩn nitrate hóa thực hiện. Bảng 1.5: pH và quá trình nitrate hóa.[16] 23 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG pH Tác động đến quá trình nitrate hóa Sự hiện diện của vi khuẩn nitrate hóa; nitrate hóa của 4.0 – 4.9 những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ xảy ra. Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa; tốc 5.0 – 6.7 độ nitrate hóa chậm chạp. Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa; tốc 6.7 – 7.2 độ nitrate hóa tăng lên. Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa; tốc 7.2 – 8.0 độ nitrate hóa được xem là hằng số. Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa. 7.5 – 8.5 - pH thấp trong nước thải có một ảnh hưởng đầu tiên đến vi khuẩn nitrate hóa bởi sự ức chế hoạt động của enzyme và ảnh hưởng thứ 2 là đến tính kiềm. Quá trình nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính bắt đầu tăng tốc khi pH 6.7. Khoảng pH tối ưu cho quá trình nitrate hóa là 7.2 đến 8.0. Ở khoảng pH từ 7.2 đến 8.0 thì tốc độ của quá trình nitrate hóa được thừa nhận là không thay đổi. Và nhiều hệ thống bùn hoạt tính oxi hóa nitơ ở pH gần trung tính. Ở pH cao hơn sẽ tác động bất lợi đến các sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ làm nhiệm vụ phân hủy cBOD. May thay những vi khuẩn nitrate hóa thích nghi với môi trường chậm hơn khi ở pH thấp hơn tối ưu. Tuy nhiên, sự thích nghi với môi trường này có thể yêu cầu sự tăng dần dần hay giảm dần dần của pH. 1.7.4 Nhiệt độ (Temperature): - Trong tất cả các yếu tố hoạt động ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa, nhiệt độ có sự ảnh hưởng ý nghĩa trên hết trong sự tăng trưởng của vi khuẩn nitrate hóa và do đó, ảnh hưởng đến tốc độ của quá trình nitrate hóa. Tốc độ của quá trình nitrate hóa giảm theo sự giảm của nhiệt độ và ngược lại, tăng theo sự tăng của nhiệt độ và nhất là trong khoảng từ 8 đến 30oC. Nitrosomonas tăng gần 10% tốc độ tăng trưởng khi nhiệt độ tăng 1oC. Dưới 10oC tốc độ quá trình nitrate hóa hạ xuống đột ngột. Trên 10oC thì tốc độ quá trình nitrate hóa hầu như tương ứng về nhiệt độ. Nitrosomonas được phân lập từ hệ thống bùn hoạt tính có tốc độ tăng trưởng tối ưu ở 30oC. Vì vậy, những mục đích của hoạt động, nhiệt độ tối ưu cho quá trình nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính được tính toán phổ biến là ở 30oC. Không có sự tăng trưởng của Nitrosomonas hay Nitrobacter xảy ra dưới 4oC. Bảng 1.6: Nhiệt độ và quá trình Nitrate hóa.[16] 24 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Nhiệt độ (toC) Sự ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa o Quá trình nitrate hóa dừng lại. 45 C o Khoảng nhiệt độ tối ưu. 28 – 32 C o Tốc độ quá trình nitrate hóa khoảng chừng 50% 16 C so với khi ở 30oC. o Sự giảm bớt có ý nghĩa về tốc độ, khoảng chừng 10 C 20% về tốc độ so với khi ở 30oC. o Quá trình nitrate dừng lại. 5 C - Tác động ức chế của nhiệt độ lạnh là rất lớn đến Nitrobacter hơn Nitrosomonas. Vì - vậy mà không kỳ lạ khi NO2 tích lũy lại trong thời gian nhiệt độ lạnh vào mùa đông. 1.7.5 Sự ức chế và độc tính (Inhibition and Toxicity): - Có vài dạng sự ức chế và độc tính có thể xảy ra trong thời gian quá trình nitrate hóa. Sự ức chế là sự mất đi tạm thời của hoạt động enzyme. Độc tính là sự mất đi lâu dài của hoạt động enzyme hay hư hại không thể thay đổi được của cấu trúc tế bào. - Tất cả vi khuẩn nitrate hóa có thể khắc phục sự ức chế bằng sự sửa chữa những hệ thống enzyme đã bị hỏng. Vì vi khuẩn nitrate hóa chỉ thu được một lượng rất nhỏ năng + - lượng từ sự oxi hóa NH4 và NO2 , và không may, năng lượng đủ thường không có sẵn cho duy trì sự thích nghi với khí hậu. Vì vậy, với sự tăng lên dù là rất ít của những chất gây ức chế cũng có thể gây ra những sự thay đổi đáng chú ý trong sự tăng trưởng của vi khuẩn nitrate hóa. - Với lượng năng lượng rất ít có sẵn để thích nghi với khí hậu, vi khuẩn nitrate hóa dễ bị tổn thương với nồng độ rất thấp của những chất thải vô cơ và những chất thải hữu cơ. Những chất thải có độc tính cao với vi khuẩn nitrate hóa bao gồm: cyanide, những hợp chất halogenated, những kim loại nặng, hydantoin, mercaptans, phenols và thiourea. - Vi khuẩn nitrate hóa còn bị ức chế bởi nồng độ rất thấp của NH3 tự do và nitrous + acid tự do. NH3 tự do được sinh ra từ NH4 dưới pH cao trong bể aerotank. Còn acid - nitrous tự do được sinh ra từ NO2 dưới pH thấp trong bể aerotank. Sự ức chế hay độc tính từ NH3 tự do và acid nitrous tự do được biết đến như là sự ức chế bởi cơ chất ban đầu gây ra. + - Với sự tăng lên của pH, những ion NH4 dễ dàng chuyển đổi thành NH3 tự do: + - NH4 OH NH3 H2O 25 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - NH3 tự đo ức chế Nitrosomonas và Nitrobacter. NH3 tự do có thể ức chế Nitrosomonas ở nồng độ bằng với 10mg/l. NH3 tự do có thể ức chế Nitrobacter ở những nồng độ bằng với 0.1mg/l. - - Với sự giảm pH, ion NO2 dễ dàng chuyển đổi nhiều hơn thành acid nitrous tự do: - + NO2 H ↔ NHO2 - Acid nitrous tự do ức chế Nitrosomonas và Nitrobacter ở nồng độ rất thấp. Cả 2 giống vi khuẩn có thể bị ức chế bởi acid nitrous tự do ở nồng độ bằng với 1.0mg/l. - Sự ức chế cơ chất trong hệ thống bùn hoạt tính thường xảy ra ở nồng độ từ 400 đến + + - - 500mg/l NH4 , hay khi NH4 được biến đổi thành NO2 ở tốc độ cao hơn NO2 được biến - + đổi thành NO3 . Vì vậy sự quá dư thừa NH4 chảy ra hay sự khử nhóm NH2 của những hợp chất nitơ hữu cơ có thể ức chế quá trình nitrate hóa. - Ngoài những vi khuẩn có khả năng quang hợp ra, sự bức xạ cực tím gây tổn hại đến hầu hết các loại vi khuẩn, bao gồm cả vi khuẩn nitrate hóa. Hầu hết những bước sóng gây hại là 265nm. Có thể do bức xạ tia cực tím là nguyên nhân gây ra sự ngưng hoạt động của hệ thống enzyme, đặc biệt là những tế bào còn non hay những tế bào đang tăng trưởng nhanh chóng. Bảng 1.7: Những dạng của sự ức chế và độc chất.[16] Dạng của sự ức chế hay độc chất Sự mô tả và ví dụ Khử trùng bằng clo của RAS và Cl2 tự do còn dư lại nhánh. Những kim loại nặng và cyanide. Vô cơ Những chất thải công nghiệp, e.g., Hữu cơ phenol. pH 5.0 NH tự do và NHO tự do. Cơ chất 3 2 Sự bức xạ cực tím. Ánh sáng mặt trời o Nhiệt độ 5 C 1.8 Tăng cường sinh học (Bioaugmentaion) [10]: 1.8.1 Định nghĩa: 26 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - Tăng cường sinh học là việc sử dụng những vi sinh vật được nuôi cấy đặc biệt từ môi trường bên ngoài để bổ sung vào trong các hệ thống xử lý nước thải nhằm tăng hiệu quả xử lý nước thải. 1.8.2 Phương pháp tăng cường sinh học: Hình 1.6: Quy trình phân lập tuyển chọn, cải biến các VSV nguồn gốc tự nhiên để sản xuất chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm. (Gray NF, 2004)[10] - Những vi sinh vật được dùng thường là những loài có sẵn trong tự nhiên, được phân lập từ những nơi đặc biệt, nơi mà sự chọn lọc tự nhiên cho phép chúng thích nghi với những điều kiện khác thường. - Những vi sinh vật này được tăng sinh trong phòng thí nghiệm và được nuôi cấy trong một môi trường với sự giàu chất gây ô nhiễm mà chúng được yêu cầu phân hủy. Từ đó những giống tốt nhất có thể được phân lập và tăng sinh cho mục đích sử dụng thương mại. 1.9 Các nghiên cứu liên quan đến quá trình phân lập, nuôi cấy các chủng vi khuẩn Nitrate hóa: - Sự phân lập vi khuẩn nitrate hóa trong môi trường nuôi cấy thuần khiết đã được thực hiện thành công đầu tiên bởi Winogradsky (1890). Sự thành công này của ông đã được biết đến vài năm trước khi quá trình nitrate hóa được tìm ra là do những sinh vật sống thực hiện (Schloesing & Muntz, 1877) và sự cố gắng của Frankland cùng các cộng sự 27 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG (1890) để phân lập những sinh vật ấy bằng những phương pháp vi khuẩn học thường dùng đã gặp thất bại. - Bằng sự hiểu biết sâu sắc của mình, Winogradsky đã khám phá ra phương thức tự dưỡng trong sự sống của những vi khuẩn oxi hóa lưu huỳnh và sắt; và đi đến kết luận rằng những vi khuẩn nitrate hóa cũng có thể là tự dưỡng, và vì vậy ông đã thành công trong việc phân lập chúng bằng việc sử dụng những môi trường phân lập nuôi cấy không phải từ chất liệu hữu cơ. Trong năm 1892, Winogardsky đã mô tả được 2 chủng, Nitrosomonas và - Nitrosococcus (chúng oxi hóa NH3); và một chủng, Nitrobacter (chúng oxi hóa NO2 ). - Và sau đó, những phương pháp nghiên cứu phân lập của ông đã được sử dụng rộng rãi thành công bởi những nghiên cứu tiếp theo sau của các nhà khoa học cùng các cộng sự của họ như: Boullanger & Massol (1903), Bonazzi (1919), Gibbs (1919), Nelson (1931) và Kingma Boltjes (1934, 1935). - Năm 1950, bằng phương pháp cải tiến từ phương pháp của Winogradsky, Jane Meiklejohn đã thành công trong việc phân lập chủng Nitrosomonas europaea từ sự nuôi cấy thuần khiết. Và cũng trong nghiên cứu này, bà cũng đã tìm ra được môi trường thích hợp (có bổ sung thành phần vi lượng cần thiết) để duy trì hoạt tính của các chủng vi khuẩn nitrate hóa (qua nhiều lần cấy chuyển môi trường để tăng sinh mà không bị mất hoạt tính như ban đầu bà đã vấp phải khi mới bắt đầu nghiên cứu) [11]. - Và cũng trong năm 1953, Jane Meiklejohn đã nghiên cứu và tìm ra lượng sắt tối - ưu cho vào môi trường nuôi cấy để tăng khả năng chuyển hóa từ NH3 thành NO2 của các chủng Nitrosomonas spp. [12]. - Năm 1958, bằng nghiên cứu thực nghiệm của mình, R.F.Lewis và D.Pramer đã khám phá ra rằng: sự phân lập Nitrosomonas tốt hơn khi có sự kết hợp với những vi khuẩn dị dưỡng được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy [18]. - Năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra một kỉ nguyên mới trong việc phân lập và nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện ra và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxi hóa NH3 khác. - Năm 1968, S.Soriano và N.Walker đã thành công trong việc phân lập và tinh sạch được Nitrosomonas và Nitrosocystis spp. bằng việc sử dụng môi trường agar tinh chế và một phương pháp thu nhận những tập đoàn với những pipet mao quản thủy tinh được hoạt động bởi máy vi thao tác đơn trước đây đã được mô tả bởi Soriano (1935) [20]. - Năm 1998, Martin Hessels e và S rensen đã tìm ra được một kỹ thuật vi khuẩn lạc để ước lượng khả năng phát triển của vi khuẩn nitrite hóa: Nitrosomonas europaea và Nitrosospira sp. dựa trên sự phân ra trên những màng lọc [15]. 28 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - Năm 2003, Patrick Chain, Jane Lamerdin, Frank Larimer và nhiều cộng sự khác nữa đã thành công trong việc tìm ra và hoàn tất chuỗi gene của vi khuẩn nitrite hóa và chủng Nitrosomonas europaea [17]. - Mới đây, 3 nhà khoa học: Kh.Elbanna, R.M.El-Shahawy và K.M.Atalla (2011) đã tìm ra được một phương pháp mới đơn giản là sử dụng những chất chỉ thị hóa học thay thế những phương pháp hóa học cổ điển để điều tra những vi khuẩn nitrate hóa trong những môi trường khác nhau với hiệu quả rất cao [13]. - Và ngày nay với sự tiến bộ vượt bậc về mặt khoa học kỹ thuật, người ta đã áp dụng kỹ thuật PCR để xác định đoạn gene amoA (mã hóa cho trung tâm hoạt động của enzyme chìa khóa trong quá trình nitrite hóa là ammonia monooxygenase-AOB) và phương pháp phát hiện trực tiếp vi khuẩn này bằng kỹ thuật FISH (Fluorescence in situ hybridization). Và đã có nhiều ứng dụng các chủng vi khuẩn nitrate hóa vào thực tiễn cuộc sống và đặc biệt nhất là ứng dụng các chủng vi khuẩn này vào hệ thống xử lý nước thải để xử lý các chất thải có bản chất nitơ với hiệu quả rất cao. - Trên thị trường Việt Nam hiện nay có rất nhiều chế phẩm sinh học được giới thiệu để xử lý nước thải, trong đó có nước thải giàu nitơ như: TP- 05- Super (Công Ty Cổ phần Công nghệ Sinh học Thú Y, Biên Giang, Thành phố Hà Đông, Hà Nội), Tidy Pro, Bio 100 Treatment (Công ty TNHH Giải Pháp chăn Nuôi Xanh, 18/6A ấp Mới 1, xã Tân Xuân, huyện Hóc Môn, Tp Hồ Chí Minh), C.Zyme, M.Zyme (Công ty TNHH Long Hiệp, Lô B1, KCN Suối Dầu, Cam Lâm, Khánh Hoà) , theo đăng ký có ghi sự có mặt của các vi khuẩn nitrate hóa [24]. Tuy nhiên, hoạt lực của các chế phẩm này không rõ ràng, đó là lý do tại sao chúng tôi quyết định tìm hiểu khả năng tăng sinh, phân lập vi khuẩn nitrate hóa để xử lý nước thải giàu nitơ. 29 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG 2.1 Thời gian và địa điểm: - Đề tài được thực hiện từ: 21/4 đến 21/7 năm 2012. - Địa điểm lấy mẫu nước thải: “Công ty CP Thủy sản số 4”, 320 Hưng Phú, P.9, Q.8, TP.HCM. - Đồ án được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.Hồ Chí Minh. 2.2 Vật liệu – Hóa chất – Dụng cụ & thiết bị: 2.2.1 Vật liệu: - Mẫu nước thải được lấy từ: “Công ty CP Thủy sản số 4”, 320 Hưng Phú, P.9, Q.8, TP.HCM. 2.2.2 Hóa chất: 2.2.2.1 Thành phần môi trường phân lập, nuôi cấy: - Môi trường Winogradsky phân lập Nitrosomonas spp. (W1):[3] (NH4)2SO4 : 2g/l K2HPO4.3H2O : 1.308g/l MgSO4.7H2O : 0.5g/l FeSO4.7H2O : 0.4g/l NaCl : 2g/l CaCO3 : 5g/l Nước cất 1l - Môi trường phân lập Nitrobacter spp. (W2):[3] NaNO2 : 1.0g/l MgSO4.7H2O : 0.5g/l FeSO4.7H2O :0.03g/l NaCl : 0.3g/l Na2CO3 : 1.0g/l K2HPO4.3H2O : 1.308g/l Nước cất 1l Chỉnh pH về 7.3 - Môi trường tăng trưởng muối khoáng AOB (giàu vi lượng):[6] (NH4)2SO4 : 2g/l NaCl : 0.585g/l KH2PO4 : 0.054g/l KCl : 0.075g/l 31 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG CaCl2.2H2O : 0.147g/l MgSO4.7H2O : 0.049g/l CaCO3 : 5g/l Dung dịch khoáng vi lượng 1ml/l - Dung dịch khoáng vi lượng bổ sung vào môi trường AOB:[6] Na2EDTA : 4292mg/l FeCl2.4H2O : 1988mg/l MnCl2.2H2O : 81mg/l NiCl2.6H2O : 24mg/l CoCl2.6H2O : 24mg/l CuCl2.2H2O : 17mg/l ZnCl2 : 68mg/l Na2MoO4.2H2O : 24mg/l Na2WO4.2H2O : 33mg/l H3BO3 : 62mg/l - Môi trường muối khoáng NOB (giàu vi lượng):[9] Gồm có 900ml nước cất 100ml dung dịch gốc 1ml dung dịch vi lượng 2g NaNO2. Dung dịch gốc: CaCO3 : 0.07g/l NaCl : 5g/l MgSO4.7H2O : 0.5g/l KH2PO4 : 1.5g/l Dung dịch vi lượng: HCl (0.01M) : 1000ml MnSO4.H2O : 33.8mg H2BO3 : 49.4mg ZnSO4.7H2O : 43.1mg (NH4)6Mo7O24 : 37.1mg FeSO4.7H2O : 973mg CuSO4.5H2O : 25mg - Môi trường hữu cơ kiểm tra sự nhiễm vi khuẩn dị dưỡng hay nấm:[6] Cao nấm men : 0.5g/l Peptone : 0.5g/l Cao thịt : 0.5g/l 32 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Nước cất 1l pH 7.3 2.2.2.2 Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm: - Thuốc thử dùng định tính: Griess A & Griess B, Nessler, Diphenylamine.[3] - Thuốc nhuộm gram: Tím Gentian Violet, dung dịch Lugol, cồn 96o, Fuchsin, dầu soi kính. [8] - Thuốc nhuộm tiên mao: dung dịch A, dung dịch B. [22] + - - - Các hóa chất dùng định lượng NH4 , NO2 và NO3 .[4, 7] 2.2.3 Dụng cụ và thiết bị: - Dụng cụ: Đèn cồn. Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 1000ml. Bình tam giác: 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml. Pipet các loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 25ml. Bóp cao su. Đũa thủy tinh. Ống nghiệm. Giá đỡ ống nghiệm. Đĩa petri: đĩa thủy tinh và đĩa nhựa. Dây cấy vòng. Dây cấy thẳng. Lam kính. Micropipet: 100µl, 1000µl. Cuvet thạch anh. Bông không thấm. Cồn khử trùng 70o Giấy lọc. - Thiệt bị máy móc: Máy lắc. Tủ cấy vô trùng. Máy nước cất. Máy đo pH. Tủ hút. Bếp từ, bếp đun. 33 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Nồi hấp Autoclave. Kính hiển vi quang học. Máy đo quang phổ. Tủ lạnh. 2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu: 2.3.1 Nội dung nghiên cứu chính: - Tăng sinh, phân lập các chủng vi khuẩn AOB và NOB từ nguồn nước thải chế biến thủy sản. - Các chủng AOB sau khi được tăng sinh thì tiến hành định tính và định lượng kiểm tra khả năng chuyển hóa cơ chất của các quần thể vi sinh vật trong môi trường và thay môi trường mới để tiếp tục tăng sinh. - Các chủng NOB đã phân lập được tiến hành định danh sơ bộ các chủng ấy về mặt hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm tiên mao và kiểm tra khả năng di động. - Từ các chủng NOB đã phân lập được tiến hành các thử nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa cơ chất của chúng trên môi trường lỏng W2. - Chọn ra các chủng NOB có khả năng chuyển hóa cơ chất mạnh nhất để tiếp tục khảo sát trên môi trường có nhiều thành phần khoáng vi lượng NOB. 2.3.2 Phương pháp thu nhận và vận chuyển mẫu nước thải: - Vì thời gian thực hiện đề tài rất ngắn và điều kiện lấy mẫu rất hạn chế nên sinh viên chỉ thực hiện phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa trên mẫu nước thải chế biến thủy sản được lấy từ “Công ty CP Thủy sản số 4” mà thôi. - Mẫu nước thải được lấy từ bể tập trung nước thải của “Công ty CP Thủy sản số 4” và được cho vào can nhựa 2L (đã được rửa sạch), không được lấy quá đầy (còn chừa lại khoảng chừng 5 – 10cm khoảng không khí phía trên) và được vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm sau khoảng 1 giờ vận chuyển bằng xe máy. Và tiến hành phân lập mẫu ngay trong vòng 24 giờ. 2.3.3 Phương pháp phân lập:[3] - Nguyên tắc: Phân lập là quá trình tách riêng một vi sinh vật từ mẫu hoặc quần thể ban đầu để thu nhận giống ở dạng thuần khiết. Giống vi sinh vật thuần khiết chỉ gồm các tế bào được sinh ra từ một tế bào ban đầu. - Cách thực hiện: ¾ Phân lập lần thứ I trên cả 2 môi trường W1 và W2: Mẫu nước thải chế biến thủy sản được khuấy thật đều và cho vào cốc 250ml Æ tiến hành pha loãng mẫu bằng cách: hút 34 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG 1ml mẫu nước thải cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý (đã vô trùng) thì ta được nồng độ pha loãng là 10-1 và từ độ pha loãng 10-1 ấy ta lại hút ra 1ml cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý khác thì ta được nồng độ pha loãng 10-2; và cứ tiếp tục như vậy ta được nồng độ pha loãng 10-3 và 10-4 Æ ta chọn 2 nồng độ pha loãng 10-2 và 10-4 để phân lập mẫu: dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu cho vào 4 bình tam giác 100 đã chứa sẵn 30ml môi trường W1 và 4 bình tam giác 100 đã chứa sẵn 30ml môi trường W2 tương ứng Æ ta có: 4 bình mẫu 10-2, 4 bình mẫu 10-4 và 2 bình ĐC tương ứng với 2 môi trường phân lập W1 & W2 Æ đem 10 bình mẫu lắc trên máy lắc: 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28 2oC), trong vòng 2 – 3 tuần. ¾ Phân lập lần thứ II trên môi trường W1 : Mẫu nước thải chế biến thủy sản được khuấy thật đều và cho vào cốc 250ml Æ tiến hành pha loãng mẫu bằng cách: hút 1ml mẫu nước thải cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý (đã vô trùng) thì ta được nồng độ pha loãng là 10-1 và từ độ pha loãng 10-1 ấy ta lại hút ra 1ml cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý khác thì ta được nồng độ pha loãng 10-2; và cứ tiếp tục như vậy ta được nồng độ pha loãng 10-3 và 10-4 Æ ta chọn 2 nồng độ pha loãng 10-2 và 10-4 để phân lập mẫu: dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu cho vào 4 bình tam giác 100 đã chứa sẵn 30ml môi trường W1 tương ứng Æ ta có: 2 bình mẫu 10-2, 2 bình mẫu 10-4 và 1 bình ĐC Æ dùng bao nilon đen bịt kín toàn bộ bình tam giác (chừa phần miệng bình lại) tạo điều kiện tối suốt quá trình ủ mẫu Æ cuối cùng đem 5 bình mẫu lắc trên máy lắc: 210 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28 2oC), trong vòng 2 – 3 tuần. ¾ Phân lập lần thứ III trên môi trường AOB: Mẫu nước thải chế biến thủy sản được khuấy thật đều và cho vào cốc 250ml Æ tiến hành pha loãng mẫu bằng cách: hút 1ml mẫu nước thải cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý (đã vô trùng) thì ta được nồng độ pha loãng là 10-1 và từ độ pha loãng 10-1 ấy ta lại hút ra 1ml cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý khác thì ta được nồng độ pha loãng 10-2; và cứ tiếp tục như vậy ta được nồng độ pha loãng 10-3 và 10-4 Æ ta chọn 4 nồng độ pha loãng 10-0, 10-1, 10-2 và 10-3 để phân lập mẫu: dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu cho vào 10 bình tam giác 100 đã chứa sẵn 30ml môi trường AOB (vô trùng) tương ứng Æ ta có: 4 bình mẫu 10-0, 2 bình mẫu 10- 1, 2 bình mẫu 10-2, 2 bình mẫu 10-3 và 1 bình ĐC Æ dùng bao nilon đen bịt kín toàn bộ bình tam giác lại (chừa phần miệng bình ra) tạo điều kiện tối suốt quá trình ủ mẫu Æ cuối cùng đem 11 bình mẫu lắc trên máy lắc: 210 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28 2oC), trong vòng 2 – 3 tuần. 2.3.4 Phương pháp định tính môi trường nuôi cấy:[3] 35 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - Nguyên tắc: Phương pháp định tính môi trường nuôi cấy nhằm mục đích kiểm tra nhanh chóng trong canh trường nuôi cấy của chúng ta có hay không có vi sinh vật mà ta cần phân lập bằng cách sử dụng các loại thuốc thử tương ứng khác nhau đối với từng mục đích phân lập của chúng ta. - Cách thực hiện: Sau 2 đến 3 tuần ủ và lắc mẫu trên máy lắc: ta thấy môi trường trong các bình mẫu thí nghiệm chuyển sang đục (có sinh khối vi sinh vật phát triển) hơn so với môi trường trong bình ĐC (không cấy mẫu nước thải vào) thì ta tiến hành lấy mẫu để thực hiện các phản ứng định tính và kiểm tra các thành phần trong canh trường nuôi cấy của chúng ta như sau: + • Phản ứng định tính amoni (NH4 ): dùng pipet vô trùng lấy một giọt canh trường trong bình nuôi cấy cho lên lam kính sạch (làm tương tự cho mẫu ĐC âm và mẫu ĐC dương) Æ sau đó nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên giọt canh trường nuôi cấy Æ ta thấy: giọt canh trường xuất hiện màu vàng có kết tủa nâu thì là phản ứng dương tính (+), còn nếu giọt canh trường không chuyển màu tức là phản ứng âm tính (-) với thuốc thử Nessler. - • Phản ứng định tính nitrite (NO2 ): dùng pipet vô trùng lấy một giọt canh trường trong bình nuôi cấy cho lên lam kính sạch (làm tương tự cho mẫu ĐC âm và mẫu ĐC dương) Æ sau đó nhỏ lần lượt từng giọt thuốc thử Griess A và Griess B lên giọt canh trường nuôi cấy Æ ta thấy: giọt canh trường nuôi cấy xuất hiện màu hồng là phản ứng dương tính (+), còn giọt canh trường không chuyển màu tức là phản ứng âm tính (-) với thuốc thử Griess A và Griess B. - • Phản ứng định tính nitrate (NO3 ): dùng pipet vô trùng lấy một giọt canh trường trong bình mẫu nuôi cấy cho lên lam kính sạch (làm tương tự cho mẫu ĐC âm và mẫu ĐC dương) Æ sau đó nhỏ 1 giọt thuốc thử Diphenylamine lên giọt canh trường nuôi cấy Æ ta thấy: giọt canh trường nuôi cấy xuất hiện màu xanh dương là phản ứng dương tính (+), còn giọt canh trường không chuyển màu tức là phản ứng âm tính (-) với thuốc thử Diphenylamine. + - - Bảng 2.1: Cường độ màu của NH4 - NO2 & NO3 với thuốc thử tương ứng trong phản ứng định tính. 36 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Phản ứng định tính + của amoni (NH4 ) với thuốc thử Nessler Không màu - Màu vàng nhạt Màu vàng Màu nâu - rất + + + không có - ít NH4 sậm -NH4 nhiều NH4 + NH4 trung bình Ký hiệu: - + + + + + + Phản ứng định tính - của nitrite (NO2 ) với thuốc thử Griess A & Griess Màu hồng nhạt Màu hồng B Không màu - Màu hồng rất - không có - ít NO2 đậm vừa - sậm - rất nhiều - - - NO2 NO2 trung NO2 bình Ký hiệu: - + + + + + + Phản ứng định tính - của nitrate (NO3 ) với thuốc thử Diphenylamine Không màu - Màu xanh Màu xanh Màu xanh không có dương nhạt - ít dương đậm dương thẫm - - - - - NO3 NO3 vừa - NO3 rất nhiều NO3 trung bình Ký hiệu: - + + + + + + 2.3.5 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn phân lập: - Việc xác định các đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được, bước đầu giúp chúng ta định danh sơ bộ các chủng ấy và thuận lợi hơn cho các nghiên cứu tiếp theo. Đặc điểm hình thái vi khuẩn được xác định qua các phương pháp phổ biến sau đây: ™ Phương pháp xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc: phương pháp này giúp chúng ta có thể quan sát được hình thái khuẩn lạc (tròn hay méo, nhăn hay không nhăn, 37 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG bóng hay không bóng, lồi hay lõm, màu sắc ) của các chủng vi khuẩn phân lập được bằng mắt thường khi vi khuẩn được cấy lên môi trường thạch. Phương pháp này được thực hiện từng bước theo tài liệu của Benson (2001) [8]. ™ Phương pháp nhuộm gram: phương pháp này giúp chúng ta quan sát được hình thái tế bào vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi quang học như: hình cầu, hình que hay hình xoắn, có liên kết với nhau không hay riêng lẻ, gram âm (-) hay gram dương (+) Phương pháp này được thực hiện từng bước như trong tài liệu của Benson (2001) [8]. ™ Phương pháp nhuộm tiên mao: phương pháp này giúp chúng ta quan sát được vi khuẩn có tiên mao hay không và các kiểu tiên mao của chúng như thế nào Từ đó biết được chúng di động theo kiểu nào. Phương pháp này được thực hiện từng bước theo tài liệu của GS.TS Nguyễn Lân Dũng [22]. ™ Phương pháp kiểm tra khả năng di động: phương pháp này giúp chúng ta khẳng định chính xác hơn vi khuẩn phân lập được có khả năng di động hay không thông qua việc cấy vi khuẩn vào thạch mềm trong ống nghiệm. Phương pháp này được thực hiện theo tài liệu của GS.TS Nguyễn Lân Dũng [22]. 2.3.6 Khảo sát khả năng mọc trên môi trường agar hữu cơ đối với 4 chủng nghi ngờ là vi khuẩn nitrite hóa đã phân lập được trên môi trường W1: - Sau khi định tính 4 bình nuôi cấy W1 thì canh trường nuôi cấy trong 4 bình mẫu đều có hoạt tính. Chính vì vậy mà ta tiến hành lấy sinh khối trong 4 bình nuôi cấy cấy chuyển sang môi trường thạch (với 2% agar) để mà phân lập. Trên môi trường thạch đã chọn và thuần khiết được 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa. - Từ 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa ấy tiến hành cấy chuyển lại môi trường lỏng W1 để tăng sinh và kiểm tra lại hoạt tính của chúng. Qua quá trình tiến hành thử nghiệm định tính lại canh trường nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn thì cả 4 chủng đều không có hoạt tính như ban đầu. - Chính vì vậy, để khẳng định lại một lần nữa 4 chủng vi khuẩn ấy có phải là 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa hay không, chúng tôi tiến hành cấy chuyển 4 chủng vi khuẩn ấy sang môi trường agar hữu cơ xem chúng có mọc được trên môi trường ấy không. - Cách tiến hành như sau: môi trường hữu cơ đã được bổ sung 2% agar trong đĩa petri (đã được chuẩn bị sẵn trước đó) Æ ta dùng dây cấy vòng lấy sinh khối 4 chủng từ môi trường thạch W1 cấy ria sang môi trường thạch hữu cơ trên Æ ủ đĩa ở nhiệt độ phòng 28 2oC Æ sau 48 giờ thì quan sát mẫu. + - - 2.3.7 Thí nghiệm định lượng 3 chỉ tiêu NH4 - NO2 và NO3 trong 10 bình mẫu AOB đã phân lập được:[4, 7] 38 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - Sau khi định tính 10 bình AOB đã phân lập được ở trên và cả 10 bình đều có hoạt tính hết cả Æ tức là có các chủng vi khuẩn nitrate hóa (vừa có vi khuẩn nitrite hóa và vừa có vi khuẩn nitrate hóa) trong canh trường nuôi cấy Æ để kiểm tra khả năng chuyển hóa của các quần thể vi sinh vật trong 10 bình mẫu ấy Æ chúng tôi tiến hành lấy mẫu và định + - - lượng 3 chỉ tiêu NH4 - NO2 và NO3 có trong canh trường nuôi cấy như sau (mỗi bình mẫu lặp lại 3 lần): + ¾ Định lượng NH4 còn lại trong bình nuôi cấy: dùng pipet vô trùng hút 3ml mẫu cho vào cốc thủy tinh và thêm 147ml nước cất vào để pha loãng mẫu, từ mẫu đã được pha loãng 50 lần ấy ta khuấy đều và hút ra 3 bình mỗi bình 50ml mẫu đã được pha loãng và tiến hành thêm lần lượt các hóa chất vào như sau: thêm 0.5ml ZnSO4 và 0.25ml NaOH 6N vào 50ml mẫu Æ khuấy đều rồi lọc mẫu qua giấy lọc để loại tủa Æ mẫu sau khi được lọc thêm: 1ml Na2S2O3 N/70, 1 giọt EDTA và 2ml Nessler Æ đợi 5 phút Æ đem mẫu đo quang ở OD 430nm Æ từ giá trị OD đo được ta thế vào phương trình đường chuẩn NH3 + lập trước đó (xem hình 2.1) và tính được lượng NH4 còn lại trong bình nuôi cấy. 0.18 y = 0.169x - 0.000 0.16 R² = 0.998 0.14 0.12 0.1 OD 430nm 0.08 OD 430nm Linear (OD 430nm) 0.06 0.04 0.02 0 ‐0.02 0 0.5 1 1.5 N - NH + (mg/L) 4 + Hình 2.1: Phương trình đường chuẩn NH4 . - ¾ Định lượng NO2 sinh ra trong bình nuôi cấy: dùng micropipette vô trùng hút 10µl mẫu cho vào Erlen Æ thêm 25ml mước cất vào Erlen chứa mẫu Æ thêm: 0.5ml dd EDTA và 0.5ml dd Acidsulfanilic vào Erlen Æ đợi trong 10 phút Æ thêm tiếp: 0.5ml dd Naphthylamine và 0.5ml dd đệm Acetate vào Erlen Æ đợi trong 20 phút Æ lắc mẫu thật đều và đem đo quang OD 520nm Æ từ giá trị OD đo được ta thế vào phương trình - đường chuẩn nitrite đã lập trước đó (xem hình 2.2) thì ta tính được lượng NO2 sinh ra trong 10 bình nuôi cấy AOB. 39 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG 0.7 y = 2.528x + 0.008 0.6 R² = 0.999 0.5 0.4 0.3 OD 520 nm OD 520nm 0.2 Linear (OD 520 nm) 0.1 0 0 0.1 0.2 0.3 - N-NO2 (mg/ml) Hình 2.2: Phương trình đường chuẩn NH3. - ¾ Định lượng NO3 sinh ra trong bình nuôi cấy: từ 1 bình mẫu nuôi cấy Æ dùng pipet vô trùng hút ra 3ml mẫu cho vào cốc, sau đó thêm 27ml mước cất vào để pha loãng mẫu Æ từ mẫu đã pha loãng ấy hút ra 10ml mẫu cho vào cốc thủy tinh Æ thêm 1ml dd Urea-acetic vào cốc mẫu Æ đem cô cạn mẫu trên bếp điện Æ mẫu thật nguội thì thêm 1ml PDA vào cốc mẫu Æ lắc cốc cho mẫu tan đều vào acid Æ 10 phút sau: thêm 25ml nước cất vào cốc và lắc đều Æ dùng dd NaOH 10% để trung hòa acid dư trong cốc mẫu (cho đến khi pH trung tính và dung dịch trong cốc chuyển sang màu vàng là được) Æ chuyển dung dịch màu vàng vào bình định mức 100 và dùng nước cất định mức đến vạch Æ đem đo quang OD 410nm Æ từ giá trị OD đo được ta thế vào phương trình đường chuẩn - nitrate đã lập trước đó (xem hình 2.3) và tính được lượng NO3 sinh ra trong môi trường nuôi cấy AOB. 1.6 y = 0.236x + 0.046 R² = 0.993 1.4 1.2 1 0.8 0.6 OD 410nm 0.4 0.2 0 0246 - N - NO3 (µg/ml) 40 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - Hình 2.3: Phương trình đường chuẩn NO3 . 2.3.8 Thử nghiệm tăng sinh khối 10 bình nuôi cấy AOB: + - - - Sau khi lấy mẫu định lượng 3 chỉ tiêu NH4 - NO2 và NO3 có trong 10 bình nuôi cấy AOB thì lượng môi trường (Vml) còn lại rất ít trong 10 bình nuôi cấy: Bảng 2.2: Thể tích mẫu còn lại của 10 bình AOB nuôi cấy sau khi đã lấy mẫu định lượng. STT Bình mẫu nuôi cấy AOB Thể tích môi trường còn lại trong bình (ml) o 1 Bình 10 (1) 6.8 o 2 Bình 10 (2) 7.5 o 3 Bình 10 (3) 12 o 4 Bình 10 (4) 10.2 -1 5 Bình 10 (1) 5 -1 6 Bình 10 (2) 5.8 -2 7 Bình 10 (1) 6.8 -2 8 Bình 10 (2) 2.35 -3 9 Bình 10 (1) 7 -3 10 Bình 10 (2) 4.75 - Vì vậy cần phải thêm môi trường AOB mới vào 10 bình mẫu ấy nhằm cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển. - Cách tiến hành: dùng pipet vô trùng hút 35ml môi trường AOB mới (vô trùng) cho vào mỗi bình nuôi cấy Æ bọc kín 10 bình mẫu lại bằng bao nilon đen (chừa phần miệng Erlen lại) Æ đem lắc tiếp tục 10 bình mẫu trên máy lắc: 210 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28 2oC). 2.3.9 Khảo sát khả năng chuyển hóa của 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa đã phân lập được trên môi trường W2 lỏng: - Vì không thể dùng “Phương pháp định tính” để khẳng định được 6 chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường W2 là các chủng vi khuẩn nitrate hóa được (vì hóa chất bị tạp nhiễm nitrate trong đó) nên muốn xác định chính xác các chủng ấy có phải là các chủng vi khuẩn nitrate hóa thực sự hay không? Chúng tôi tiến hành cấy chuyển 6 41 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG chủng vi khuẩn ấy sang môi trường lỏng W2 để xem chúng có chuyển hóa được cơ chất từ - - NO2 sang NO3 hay không? - Cách tiến hành: ¾ Giai đoạn tăng sinh: ban đầu 6 chủng vi khuẩn được tăng sinh trong bình tam giác chứa 30ml môi trường W2 (vô trùng) Æ sau 48 giờ ủ và lắc mẫu trên máy lắc Æ ta tiến hành đo OD 600nm để xác định mật độ tế bào 6 chủng sau 48 giờ ủ và lắc mẫu Æ từ giá trị OD đó ta tính được mật độ tế bào và thể tích dung dịch huyền phù tế bào cho vào các bình mẫu để khảo sát khả năng chuyển hóa của chúng tại các mốc thời gian: 0 ngày – 2 ngày – 4 ngày – 6 ngày. Bảng 2.3: Kết quả OD của 6 chủng vi khuẩn sau 48 giờ nuôi lắc và thể tích huyền phù tế bào cần hút cho thí nghiệm khảo sát. Các chủng W2 khảo OD sau 48 giờ lắc Thể tích huyền phù tế bào sát mẫu cần hút cho thí nghiệm (ml) Chủng 1 0.075 0.3922 Chủng 2 0.052 0.5656 Chủng 3 0.024 1.2255 Chủng 5 0.053 0.5549 Chủng 7 0.037 0.7949 Chủng MV1 0.021 1.4006 ¾ Giai đoạn cấy và ủ mẫu: dùng pipet vô trùng hút lượng mẫu huyền phù tế bào (Vml) phù hợp như đã tính ở trên cho vào các bình tam giác chứa 40ml môi trường W2 để khảo sát: mỗi chủng cấy 4 bình, vậy ta có tất cả 24 bình mẫu Æ sau đó đem tất cả 24 bình mẫu ủ và lắc trên máy lắc (210 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng. ¾ Giai đoạn khảo sát (định lượng các thành phần trong môi trường nuôi cấy): cứ đúng mốc thời gian khảo sát thì có 6 bình mẫu (tương ứng với 6 chủng khảo sát) được lấy - - ra để tiến hành phân tích định lượng 2 chỉ tiêu: NO2 và NO3 có trong môi trường khảo sát. Mỗi bình mẫu (tương ứng với 1 chủng vi khuẩn khảo sát) đều được định lượng 2 chỉ tiêu sau (và mỗi chỉ tiêu lập lại 2 lần): - • Định lượng NO2 : Hút 25ml nước cất cho vào Erlen Æ sau đó dùng micropipette hút 10µl mẫu (canh trường nuôi cấy khảo sát) cho vào Erlen trên Æ thêm hóa chất vào 42 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Erlen chứa mẫu: 0.5ml dd EDTA và 0.5ml dd Acidsulfanilic Æ đợi 10 phút Æ tiếp tục thêm: 0.5ml dd Naphthylamine và 0.5ml dd đệm Acetate vào Æ đợi 20 phút Æ lắc đều mẫu và đo quang OD 520nm Æ thế giá trị OD vào phương trình đường chuẩn đã lập - trước đó Æ tính được hàm lượng NO2 trong canh trường khảo sát. - • Định lượng NO3 : dùng pipet hút 10ml mẫu cho vào cốc thủy tinh Æ thêm 1ml dd Urea-acetic vào cốc Æ cô cạn mẫu trên bếp điện Æ mẫu thật nguội thì thêm 1ml PDA vào cốc Æ lắc cho mẫu tan đều vào acid Æ đợi 10 phút sau Æ thêm 25ml nước cất vào trong cốc và lắc cho đều cốc Æ dùng dd NaOH 10% để trung hòa acid dư trong cốc (cho đến khi pH trong cốc là trung tính và dung dịch trong cốc chuyển sang màu vàng là được) Æ chuyển dung dịch màu vàng vào bình định mức 100 và dùng nước cất định mức đến vạch Æ đem mẫu đo quang OD 410nm Æ từ giá trị OD đó ta thế vào phương trình đường - chuẩn nitrate đã lập trước đó thì ta có thể tính được lượng NO3 có trong mẫu khảo sát. 2.3.10 “Khảo sát khả năng chuyển hóa” của 3 chủng vi khuẩn nitrate hóa chọn lọc trên môi trường giàu vi lượng NOB (1g NaNO2/l): - Sau khi đã chọn được 3 chủng trong 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa (phân lập được trên môi trường W2) có khả năng chuyển hóa cơ chất mạnh nhất trong môi trường lỏng W2 ở trên, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng chuyển hóa của 3 chủng mà chúng tôi đã chọn được ở trên trong môi trường lỏng giàu vi lượng NOB để xem khả năng chuyển hóa cơ chất của 3 chủng ấy. - Cách tiến hành: ™ Giai đoạn tăng sinh: Ban đầu 3 chủng vi khuẩn nitrate hóa (Chủng 2, Chủng 3 và Chủng MV1) được tăng sinh trong bình tam giác chứa 30ml môi trường lỏng NOB (1g NaNO2/l) Æ sau 48 giờ lắc mẫu trên máy lắc Æ ta tiến hành đo OD 600nm để xác định mật độ tế bào của 3 chủng sau 48 giờ ủ và lắc mẫu Æ từ giá trị OD đó ta tính được nồng độ tế bào và tính được thể tích huyền phù tế bào (để đảm bảo được mật độ tế bào giữa 3 chủng khi cho vào các bình mẫu khảo sát là như nhau) cho vào các bình mẫu để khảo sát khả năng chuyển hóa của 3 chủng vi khuẩn ấy tại các mốc thời gian là: 0 ngày – 2 ngày – 4 ngày – 6 ngày – 8 ngày – 10 ngày và 12 ngày. • Công thức tính thể tích mẫu cần cho thử nghiệm: C1 V1 C2 V2 9 OD 1.02 10 C2 • Trong đó: 6 C1 10 : là mật độ tế bào cần cho vào bình khảo sát (cfu/ml) 43 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG V1 30ml: là thể tích môi trường NOB có trong bình Erlen để tăng sinh vi khuẩn trong 48 giờ. C2: là mật độ tế bào vi khuẩn có trong bình tăng sinh sau 48 giờ (cfu/ml) V2: là thể tích dịch huyền phù vi khuẩn cần hút (ml) Bảng 2.4: Kết quả OD của 3 chủng khảo sát sau 48 giờ tăng sinh và thể tích huyền phù tế bào cần hút cho thí nghiệm. 3 chủng khảo sát OD sau 48 giờ lắc Vmẫu cần hút cho thí mẫu nghiệm (ml) Chủng 2 0.063 0.4668 Chủng 3 0.024 1.2255 Chủng MV1 0.019 1.5479 ™ Giai đoạn cấy và ủ mẫu: dùng pipet vô trùng hút lượng mẫu huyền phù tế bào (Vml) phù hợp như đã tính ở trên cho vào các bình tam giác chứa 40ml môi trường NOB để khảo sát: mỗi chủng cấy 7 bình, vậy ta có tất cả 21 bình mẫu Æ sau đó đem tất cả 21 bình mẫu ủ và lắc trên máy lắc (210 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng. ™ Giai đoạn khảo sát (định lượng các thành phần trong môi trường nuôi cấy): cứ đúng mốc thời gian khảo sát thì có 3 bình mẫu (tương ứng với 3 chủng khảo sát) được lấy - - ra để tiến hành phân tích định lượng 2 chỉ tiêu: NO2 và NO3 có trong môi trường khảo sát. Mỗi bình mẫu (tương ứng với 1 chủng vi khuẩn khảo sát) đều được định lượng 2 chỉ tiêu sau (và mỗi chỉ tiêu lập lại 3 lần): - • Định lượng NO2 : Hút 25ml nước cất cho vào Erlen Æ sau đó dùng micropipette hút 10µl mẫu (canh trường nuôi cấy khảo sát) cho vào Erlen trên Æ thêm hóa chất vào Erlen chứa mẫu: 0.5ml dd EDTA và 0.5ml dd Acidsulfanilic Æ đợi 10 phút Æ tiếp tục thêm: 0.5ml dd Naphthylamine và 0.5ml dd đệm Acetate vào Æ đợi 20 phút Æ lắc đều mẫu và đo quang OD 520nm Æ thế giá trị OD vào phương trình đường chuẩn đã lập - trước đó Æ tính được hàm lượng NO2 trong canh trường khảo sát. - • Định lượng NO3 : dùng pipet hút 10ml mẫu cho vào cốc thủy tinh Æ thêm 1ml dd Urea-acetic vào cốc Æ cô cạn mẫu trên bếp điện Æ mẫu thật nguội thì thêm 1ml PDA vào cốc Æ lắc cho mẫu tan đều vào acid Æ đợi 10 phút sau Æ thêm 25ml nước cất vào trong cốc và lắc cho đều cốc Æ dùng dd NaOH 10% để trung hòa acid dư trong cốc (cho đến khi pH trong cốc là trung tính và dung dịch trong cốc chuyển sang màu vàng là được) Æ 44 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG chuyển dung dịch màu vàng vào bình định mức 100 và dùng nước cất định mức đến vạch Æ đem mẫu đo quang OD 410nm Æ từ giá trị OD đó ta thế vào phương trình đường - chuẩn nitrate đã lập trước đó thì ta có thể tính được lượng NO3 có trong mẫu khảo sát. 45 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Nhuộm Trên MT W2 tiên mao Nhuộm gram Khảo sát khả Trên MT năng chuyển hóa NOB Quan 6 chủng Tăng sát KL VK thuần sinh khiết Khảo sát khả năng di động Cấy sang MT agar Thêm MT + Định lượng: NH4 AOB mới vào Phân lập VK - NO - & NO - nitrate hóa 2 3 trên W2 Thử nghiệm định tính 3.Phân lập VK nitrite hóa trên AOB Nước Có hoạt tính thải TS4 Thử nghiệm Thử nghiệm định tính định tính 1. Phân lập 2.Phân lập VK nitrite VK nitrite hóa trên W1 hóa trên W1 Có hoạt Nhuộm tính gram 4 chủng Cấy chuyển Định tính: không VK thuần sang MT agar có hoạt tính khiết Quan sát KL Cấy chuyển sang Bỏ Cấy chuyển MT agar hữu cơ lại MT lỏng W1 4 chủng Định tính: không đều mọc Không phải có hoạt tính tốt VK nitrite hóa Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải CBTS. 46 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 47 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG - Để đáp ứng nhu cầu tăng cường sinh học trong xử lý nước thải giàu Nitơ, nước thải nhà máy chế biến thủy sản được sử dụng để phân lập các vi khuẩn của quá trình nitrate hóa (nitrification) bao gồm vi khuẩn nitrite hóa hay vi khuẩn oxy hóa amôn (Ammonium Oxidizing Bacteria - AOB) và vi khuẩn nitrate hóa hay vi khuẩn oxy hóa nitrite (Nitrite Oxidizing Bacteria - NOB). Thông thường hai dạng vi khuẩn này được tăng sinh và phân lập trên môi trường Winogradsky 1 (W1) và Winogradsky 2 (W2) như Giáo trình thực tập Vi sinh vật học của Egorov hướng dẫn. Đây là các môi trường chỉ chứa các chất vô cơ vì + - đây là các vi khuẩn dinh dưỡng hóa năng vô cơ, hiếu khí bắt buộc, sử dụng NH4 hay NO2 + là nguồn năng lượng. Nồng độ N-NH4 trong môi trường W1 khá cao, đạt đến 583 mg/L, - trong khi đó nguồn năng lượng trong môi trường W2 là NO2 chỉ đạt 165 mg/L. 3.1 Kết quả tăng sinh phân lập và khảo sát hoạt lực nitrite hóa của AOB từ nước thải nhà máy chế biến thủy sản (CBTS): 3.1.1 Tăng sinh phân lập AOB lần I: - Nước thải “Công ty CP thủy sản số 4” được pha loãng theo các nồng độ 10-2 và 10- 4, tăng sinh trong môi trường W1 trên máy lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28 2oC). 3.1.1.1 Kết quả thử nghiệm định tính: - Sau 2 – 3 tuần lắc mẫu, môi trường tăng sinh trở nên đục, đục do sinh khối vi sinh vật phát triển hơn nhiều so với bình đối chứng (ĐC) chỉ có môi trường không được cấy mẫu nước thải. Để đánh giá sơ bộ, các bình tăng sinh được đem thử định tính sự có mặt - của AOB và thậm chí NOB. Các phép thử định tính dựa trên màu hồng đặc trưng của NO2 - tác dụng với với thuốc thử Griess, màu xanh dương của NO3 với Diphenylamine trong + H2SO4 đậm đặc và màu vàng nâu của NH4 khi gặp thuốc thử Nessler. Mức độ đậm nhạt của màu tương ứng với nồng độ các chất muốn kiểm tra và được phân thành 4 mức: âm tính (-), dương tính yếu (+), dương tính trung bình (++) và dương tính mạnh (+++) (xem phần phương pháp và phụ lục A). Bảng 3.1: Thử nghiệm định tính mẫu tăng sinh AOB trong môi trường W1 từ nước thải TS4. 48 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG + - STT Tên bình Độ đục Định tính NH4 Định tính NO2 ĐC Đối chứng - + + + - -2 1 Bình 10 (1) + + + + + + -2 2 Bình 10 (2) + + + + + + -4 3 Bình 10 (1) + + + + + + -4 4 Bình 10 (2) + + + + + + + - ¾ Kết quả định tính cho thấy có sự giảm NH4 và sự xuất hiện NO2 ở tất cả các bình -2 - tăng sinh, khi hệ số pha loãng thấp (10 ) thì nồng độ NO2 xuất hiện càng cao (+++) và ngược lại, điều này chứng minh rằng trong nước thải của “Công ty CP thủy sản số 4” có chứa AOB. 3.1.1.2 Kết quả phân lập: - Sau khi tiến hành tăng sinh vi khuẩn AOB, chúng tôi tiến hành phân lập chủng thuần khiết bằng phương pháp cấy ria truyền thống trên môi trường W1 agar tương ứng để phân lập vi khuẩn. Khác với lý thuyết là các vi khuẩn AOB tăng trưởng rất chậm, có thời gian thế hệ 8-36 giờ, các chủng phân lập mọc khá nhanh chóng có hình thái được trình bày trong bảng 3.2 (xem thêm phụ lục B). Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái của 4 chủng vi khuẩn phân lập được trên W1. Tên chủng Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào Gram Chủng 1 Màu vàng đậm – hơi Cầu khuẩn – nhỏ - bóng – lồi Chủng 2 Màu vàng đậm – Cầu khuẩn – nhỏ li ti - nhăn – không bóng – lồi Chủng 3 Màu cam nhạt đục Cầu khuẩn – nhỏ - sữa – tròn – bóng – lồi Chủng 4 Màu trắng đục – Cầu khuẩn – nhỏ - bóng – lồi - Sau khi đã lựa chọn ra được “4 chủng vi khuẩn thuần khiết” trên môi trường thạch thì chúng tôi tiến hành cấy chuyển 4 chủng vi khuẩn này từ môi trường agar sang môi trường W1 lỏng để tăng sinh lại và kiểm tra hoạt tính của 4 chủng vi khuẩn trên đã 49 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028
  60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG phân lập được trên máy lắc với 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28 2oC). Khi môi trường nuôi cấy lỏng chuyển từ trong sang đục (do sinh khối vi sinh vật phát triển trong môi trường nuôi cấy) sau 24 giờ hoạt tính nitrite hóa được kiểm tra bằng “Thử nghiệm định tính”. Kết quả cho thấy: 4 chủng vi khuẩn phân lập đều không có hoạt tính (xem thêm phần phụ lục C). 3.1.1.3 Kết quả khảo sát khả năng mọc của 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa trên môi trường agar hữu cơ: - Vì kết quả định tính lại canh trường nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa phân lập được ở trên đều không có hoạt tính, nên chúng tôi nghi ngờ 4 chủng đó không phải là vi khuẩn nitrite hóa mà là các chủng vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ. Chính vì vậy mà chúng tôi tiến hành cấy chuyển 4 chủng vi khuẩn nghi ngờ ấy sang môi trường hữu cơ agar để khảo sát khả năng mọc của chúng. (xem phần phụ lục D) - Tất cả 4 chủng W1 phân lập được đều mọc tốt trên môi trường agar có thành phần dinh dưỡng hữu cơ sau 48 giờ ủ mẫu ở nhiệt độ phòng (28 2oC), chúng là những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ chứ không phải là các chủng vi khuẩn nitrite hóa nên các chủng vi khuẩn này bị loại bỏ. ¾ Như vậy đúng như kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả việc phân lập các AOB gặp khó khăn vì chúng tăng trưởng rất chậm nên khó phân lập chủng thuần khiết, chúng thường bị các vi khuẩn dinh dưỡng hóa năng hữu cơ lấn át. Việc phân lập đòi hỏi agar tinh khiết hoặc thạch silica gel là điều khó đạt được trong điều kiện chúng tôi. Từ đó chúng tôi thay đổi cách tiếp cận vấn đề. Theo lý thuyết để sản xuất chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm, người ta phân lập các chủng vi sinh từ các nguồn ô nhiễm, làm thuần, nghiên cứu hoạt tính, cải biến hoạt tính rồi sản xuất chế phẩm. Tuy nhiên trong trường hợp AOB là vi khuẩn thuần túy dinh dưỡng hóa năng vô cơ việc phân lập và làm thuần gặp nhiều khó khăn. Hơn nữa, ứng dụng chúng trong xử lý nước thải dựa chủ yếu vào họat tính quần thể hơn là hoạt tính cá thể, nên chúng tôi thay đổi mục tiêu “phân lập” thành mục tiêu “tăng sinh” vi khuẩn AOB nhằm tăng sinh khối vi khuẩn này đủ cho những thí nghiệm xử lý nước thải về sau (không phải nhiệm vụ của ĐATN này). 3.1.2 Tăng sinh phân lập AOB lần II: - Lập lại bước tăng sinh trong thí nghiệm trên, song song việc tuân thủ các yêu cầu ngặt nghèo của AOB là yêu cầu oxy hòa tan phải nằm trong khoảng 2.0 – 3.0 mgO2/L, pH phải kiểm soát trong khoảng 7.2 – 8.0 , không để ánh sáng chiếu vào, không tiếp xúc cao su (nút bình tam giác dùng để thí nghiệm làm bằng nút bông không thấm, không dùng nút 50 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028