Đồ án Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu

118 trang thiennha21 12/04/2022 4120

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_kha_nang_doi_khang_cua_nam_trichoderma_spp_vo.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM Trichoderma spp. VỚI CÁC NẤM GÂY BỆNH PHỔ BIẾN TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : TRẦN HÀ PHƯƠNG HẢO MSSV: 1211100073 Lớp: 12DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2016
LỜI CAM ĐOAN Tôi tên: TRẦN HÀ PHƢƠNG HẢO. Sinh ngày 26 tháng 10 năm 1994 tại tỉnh Tiền Giang. Quê quán: Xã Tân Lập 1 – huyện Tân Phước – tỉnh Tiền Giang. MSSV: 1211100073 Lớp: 12DSH02 Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Tôi xin cam đoan: - Đồ án tốt nghiệp là thành quả từ sự nghiên cứu hoàn toàn thực tế trên cơ sở các số liệu thực tế và được thực hiện theo hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn. - Đồ án được thực hiện hoàn toàn mới, là thành quả của riêng tôi, không sao chép theo bất cứ đồ án tương tự nào. - Mọi sự tham khảo sử dụng trong đồ án đều được trích dẫn các nguồn tài liệu trong báo cáo và danh mục tài liệu tham khảo. - Mọi sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế của nhà trường, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tp.HCM, ngày 30 tháng 07 năm 2016 Sinh viên TRẦN HÀ PHƢƠNG HẢO
LỜI CẢM ƠN Qua 4 năm học tập và rèn luyện tại trường Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, được sự chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý thầy cô khoa Môi Trường – Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức về lý thuyết và thực hành trong suốt thời gian học tập. Và trong thời gian thực hiện đồ án tại Công Ty TNHH Điền Trang, tôi có nhiều cơ hội áp dụng kiến thức học ở trường vào môi trường thực tế ở công ty, đồng thời học hỏi được nhiều kinh nghiệm làm việc của các anh chị tại công ty. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Công ty TNHH Điền Trang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho để tôi có thể thực hiện đề tài tốt nghiệp tại công ty. Em cảm ơn các anh, chị ở phòng Nghiên cứu và Phát triển của Công ty TNHH Điền Trang đã hỗ trợ, chia sẽ và giúp đỡ cho em trong thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cám ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai, người đã hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo và tận tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, nơi là chỗ dựa vững chắc cho con trong suốt thời gian học tập. Trong quá trình viết luận văn báo cáo, do kiến thức còn hạn hẹp nên không tránh khỏi những thiếu sót trong cách hiểu và những lỗi trình bày, tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô và Ban lãnh đạo nhà trường, các anh chị trong công ty để giúp bài báo cáo tốt nghiệp của tôi đạt kết quả tốt hơn. Tp.HCM, ngày 30 tháng 07 năm 2016 Sinh viên TRẦN HÀ PHƢƠNG HẢO
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 3. Mục đích nghiên cứu 3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 3 6. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài 3 7. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp 4 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu 5 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố cây hồ tiêu 5 1.1.2. Phân bố địa lý 5 1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hồ tiêu 6 1.1.3.1. Tình hình sản xuất 6 1.1.3.2. Tình hình tiêu thụ 9 1.1.4. Tình hình nghiên cứu dịch hại cây hồ tiêu ở Thế giới và Việt Nam 11 1.1.4.1. Thế Giới 11 1.1.4.2. Ở Việt Nam 12 1.2. Một số nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu 14 1.2.1. Nấm Phytophthora spp. 14 1.2.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora spp 14 i
Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.2. Vòng đời 15 1.2.1.3. Phytophthora gây bệnh trên cây hồ tiêu 16 1.2.2. Nấm Fusarium spp. 18 1.2.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium spp. 18 1.2.2.2. Vòng đời 20 1.2.2.3. Fusarium gây bệnh trên cây hồ tiêu 21 1.2.3. Nấm Colletotrichum spp. 23 1.2.3.1. Đặc điểm sinh học của nấm Colletotrichum spp 23 1.2.3.2. Vòng đời 25 1.2.3.3. Colletotrichum gây bệnh trên cây hồ tiêu 26 1.3. Biện pháp sinh học trong quản lý bệnh hại cây trồng 27 1.3.1. Lịch sử biện pháp sinh học 27 1.3.1.1. Thế giới 27 1.3.1.2. Việt Nam 28 1.3.2. Khái niệm 28 1.3.3. Ưu và nhược điểm của biện pháp sinh học trong nông nghiệp 28 1.3.3.1. Ưu điểm 28 1.3.3.2. Nhược điểm 29 1.3.4. Các ứng dụng sinh học trong quản lý bệnh hại trên cây hồ tiêu 29 1.4. Nấm Trichoderma spp. trong quản lý bệnh cây trồng 31 1.4.1. Nấm Trichoderma spp 31 1.4.1.1. Phân loại 31 1.4.1.2. Sự phân bố của nấm Trichoderma spp 31 1.4.1.3. Đặc điểm hình thái 32 1.4.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học 33 1.4.1.5. Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh cây trồng 34 1.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp của nấm Trichoderma 38 ii
Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.1. Khả năng kiểm soát bệnh cây 38 1.4.2.2. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng 39 1.4.2.3. Khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. 40 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 41 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 41 2.2. Vật liệu 41 2.2.1. Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh 41 2.2.1.1. Nấm đối kháng 41 2.2.1.2. Nấm gây bệnh 41 2.2.2. Trang thiết bị và hóa chất sử dụng 41 2.2.3. Môi trường nuôi cấy 41 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 42 2.3.1. Phương pháp thu mẫu 42 2.3.1.1. Thu mẫu đất (Theo TCVN 4046 – 85) 42 2.3.1.2. Thu mẫu bệnh 42 2.3.2. Phân lậpTrichoderma spp. và nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu 44 2.3.2.1. Phân lập nấm Trichoderma spp. trong đất 44 2.3.2.2. Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu 45 2.3.2.3. Phân lập nấm Fusarium gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu 46 2.3.2.4. Phân lập nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây hồ tiêu 47 2.3.3. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm 48 2.3.4. Xác định hoạt tính cellulose: Phương pháp khuếch tán trên thạch 49 2.3.5. Xác định khả năng đối kháng 49 2.3.6. Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu. 50 2.3.6.1. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Phytophthora sp. (phân lập trong mẫu đất trồng tiêu) 50 iii
Đồ án tốt nghiệp 2.3.6.2. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Fusarium sp. (phân lập từ rễ cây tiêu bị bệnh chết chậm) 51 2.3.6.3. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Colletotrichum sp. (phân lập từ lá cây hồ tiêu bị bệnh thán thư) 51 2.3.7. Phương pháp phân tích số liệu 51 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1. Kết quả phân lập nấm Trichoderma spp. 52 3.2. Kết quả phân lập nấm bệnh 55 3.2.1. Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp 55 3.2.2. Kết quả phân lập nấm Fusarium sp. 56 3.2.3. Kết quả phân lập nấm Colletotrichum sp. 57 3.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng Trichoderma 61 3.4. Đánh giá khả năng đối kháng Trichoderma spp. với nấm bệnh đã đƣợc phân lập 63 3.4.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp. 63 3.4.2. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu 67 3.4.3. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Fusarium sp. gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu 72 3.4.4. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây tiêu 77 3.4.5. Tổng hợp khả năng đối kháng của các Trichoderma spp. với 3 nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu 83 KẾT LUẬN 85 KIẾN NGHỊ 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 PHỤ LỤC 1 1 PHỤ LỤC 2 10 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VPA: Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam IAA: Acid indolacetic EU: Liên minh châu Âu (European Union) USD: Đô la Mỹ (United States dollar) ITC: Trung tâm thương mại quốc tế CABI: Tổ chức phi lợi nhuận PDA: Potato Dextro Agar CMC: Carboxy methyl cellulose DRBC: Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol WA: Water agar NPK: Nitơ photpho kali (Ure – lân – kali) ĐK: Đối kháng ĐC: Đối chứng. NSC: Ngày sau cấy v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu năm 2014 7 Bảng 1.2: Giá tổng hợp của tiêu đen và tiêu trắng (Đơn vị: USD) 10 Bảng 1.3: Tần suất xuất hiện sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu tại ba vùng điều tra 12 Bảng 3.1: Mật số nấm Trichoderma trong đất Bình Phước 52 Bảng 3.2: Số chủng Trichoderma bắt ra ở mỗi vườn 52 Bảng 3.3: Các chủng Trichoderma spp. phân lập từ các mẫu đất tỉnh Bình Phước 54 Bảng 3.4: Bán kính tản nấm Trichoderma spp. sau các ngày nuôi cấy 64 Bảng 3.5: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Phytophthora sp 68 Bảng 3.6: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Fusarium sp 73 Bảng 3.7: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Colletotrichum sp. 78 Bảng 3.8: Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với Phytophthora sp. sau 3 NSC và Fusarium sp., Colletotrichum sp. sau 7 NSC. 83 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1: Tăng trưởng về số lượng hồ tiêu ở Đông Nam Á và các quốc gia khác 8 Biểu đồ 1.2: Nhập khẩu hồ tiêu của 28 quốc gia EU từ một số nước Đông Nam Á 11 giai đoạn 2010 – 2014 (đơn vị: USD) 11 Biểu đồ 3.1 Đường kính phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp. 61 Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Phytophthora sp. 5 NSC 70 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Fusarium sp. 7 NSC 75 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Colletotrichum sp. 7NSC 80 vii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Bản đồ phân bố các vùng trồng tiêu tại Việt Nam 6 Hình 1.2: Các sản phẩm của cây hồ tiêu 9 Hình 1.3: Chu kì sống của Phytophthora 15 Hình 1.4: Triệu chứng của bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu 16 Hình 1.5: Thiệt hại của bệnh chết nhanh 18 Hình 1.6: Fusarium gây cây héo rủ và các loại bào tử 20 Hình 1.7: Triệu chứng của bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu 22 Hình 1.8: Thiệt hại của bệnh chết chậm 23 Hình 1.9: Cọng mang bào tử đính và bào tử đính của nấm Colletotrichum 24 Hình 1.10: Triệu chứng của bệnh thán thư trên cây hồ tiêu 26 Hình 1.11: Thiệt hại do nấm Colletotrichum gây ra 27 Hình 1.12: Nấm Trichoderma mọc trong tự nhiên 32 Hình 1.13: Khuẩn lạc của nấm Trichoderma Harzianum 32 Hình 1.14: Vách tế bào Rhizoctonia solani bị enzyme của Trichoderma chọc thủng 35 Hình 1.15: Nấm Trichoderma (vàng) ký sinh trên nấm Pythium (xanh) 36 Hình 1.16: Sự phát triển rễ cây giữa việc sử dụng và không sử dụng Trichoderma 39 Hình 1.17: Gia tăng sản lượng ớt với hạt giống xử lý và không xử lý Trichoderma 39 Hình 2.1: Thu mẫu đất 42 Hình 2.2: Thu mẫu lá tiêu bệnh thán thư 43 Hình 2.3: Lấy mẫu rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm 43 Hình 2.3: Bẫy nấm Phytophthora bằng cánh hoa hồng 46 Hình 2.4: Rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm 47 Hình. 3.1: Nấm Trichoderma trên môi trường DRBC sau 3 ngày. 52 Hình 3.2: Hình thái đại thể và vi thể của nấm Trichoderma sp. phân lập từ đất 53 Hình 3.3: Cánh hoa hồng bị chuyển màu và đặt trên môi trường WA 55 Hình 3.4: Nấm Phytophthora sp. trên trường PDA 55 viii
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5: Bào tử và các du động bào tử của Phytophthora sp. dưới hính hiển vi 56 Hình 3.6: Nấm Fusarium sp. trên môi trường WA 56 Hình 3.7: Nấm Fusarium sp. trên môi trường PDA 57 Hình 3.8: Đại bào tử và các tiểu bào tử của nấm Fusarium sp 57 Hình 3.9: Tơ nấm Colletotrichum sp. phát triển từ mẫu lá bệnh 58 Hình 3.10: Nấm Colletotrichum sp. trên môi trường PDA 58 Hình 3.11: Bào tử nấm Colletotrichum sp. 59 Hình 3.12: Khả năng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp. 62 Hình 3.13: Hình thái chủng nấm Trichoderma sp. phát triển qua các ngày 63 Hình 3.14: Các chủng Trichoderma có khả năng phủ kín đĩa sau 4 ngày nuôi cấy 66 Hình 3.15: Trichoderma sp. đối kháng với Phytophthora sp. theo dõi qua các ngày 67 Hình 3.16: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Phytophthora sp. và đĩa nấm Phytophthora sp. sau 7 ngày nuôi cấy 71 Hình 3.17: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với Fusarium sp. theo dõi qua các ngày. 72 Hình 3.18: Chủng Trichoderma spp. có khả năng đối kháng cao với nấm Fusarium sp. và đĩa nấm bệnh Fusarium sp. sau 7 ngày nuôi cấy 76 Hình 3.19: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. 77 Hình 3.20: Khuẩn ty Trichoderma sp. quấn chặt lấy khuẩn ty Colletotrichum sp 81 Hình 3.21: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Colletotrichum sp. sau 7 ngày nuôi cấy và đĩa nấm bệnh Colletotrichum sp. sau 5 ngày nuôi cấy 82 ix
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hồ tiêu là một trong những loại cây công nghiệp xuất khẩu chủ lực của nước ta. Sản lượng xuất khẩu hồ tiêu hằng năm đứng hàng đầu thế giới. Theo Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam (VPA), sản lượng hồ tiêu trong tháng 11 năm 2015 của cả nước xấp xỉ khoảng 124.000 tấn, kim ngạch đạt gần 1,2 tỷ, tăng 2,8 % giá trị so với năm 2014. Do giá trị xuất khẩu cao nên diện tích trồng tiêu ngày càng tăng. Trong đó, Bình Phước dẫn đầu cả nước về diện tích và sản lượng, tổng diện tích trồng tiêu trên toàn tỉnh là 13.000 ha và cho sản lượng trên 30.000 tấn/năm. Để đạt được năng suất cao, nhiều hộ nông dân đã bón quá nhiều phân vô cơ đến mức báo động: 1200 kg N, 1230 kg P2O5 và 1425 kg K2O/ha, vượt 4 - 5 lần khuyến cáo phân bón cho cây tiêu (Đỗ Trung Bình, 2013). Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào phân bón hóa học mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất cũng bị tàn phá nghiêm trọng. Đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng trong đất bị mất cân đối, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hại không dự báo trước, việc trồng trọt về sau ngày càng khó khăn hơn. Trong những năm gần đây hiện tượng chết nhanh và chết chậm trên cây tiêu diễn ra khá phổ biến ở nhiều vùng với tỷ lệ cây bệnh từ 10 – 15 %. Thậm chí, có nhiều vườn có tỷ lệ thiệt hại lên đến 80 – 90 % (Lê Văn Trịnh, 2009). Bệnh đã gây thiệt hại nặng hàng trăm hecta hồ tiêu trong tỉnh Bình Phước. Trước tình hình đó, các biện pháp sinh học được xem là giải pháp giúp giảm lượng phân bón, tăng năng suất cây trồng và thân thiện với môi trường. Hiện nay, theo định hướng phát triển nền nông nghiệp bền vững, có giá trị xuất khẩu cao, việc tăng cường sử dụng những chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng đang được chú trọng. Chế phẩm nấm Trichoderma được ứng dụng phổ biến vì chi phí thấp, cách sử dụng đơn giản và quan trọng nhất là hiệu quả đem lại 1
Đồ án tốt nghiệp cao. Trichoderma là một loại vi nấm hoại sinh trong đất có khả năng đối kháng các vi nấm gây bệnh thực vật với phổ tác động rộng, thông qua ba cơ chế bao gồm ký sinh, tiết ra kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào của nấm bệnh (Nguyễn Văn Đĩnh và cộng sự, 2007), đặc biệt là không gây hại cho con người và thân thiện với môi trường. Xuất phát từ những yêu cầu trên, việc phân lập các chủng nấm Trichoderma ở trong đất, có khả năng đối kháng tốt với các nấm Phytophthora, Fusarium, Colletotrichum, làm nguồn vật liệu để sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma là lý do mà em chọn đề tài: ―Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu‖. 2. Tình hình nghiên cứu Trong nước Nguyễn Ngọc Phúc năm 2005, đã tiến hành khảo sát mật độ Trichoderma trong đất và mối liên hệ của chúng với các yếu tố môi trường như: pH, độ ẩm, hàm lượng Mg, Ca, Từ đó, phân lập các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với các nấm bệnh Đỗ Thu Hà và Lê Tố Nga (2015) phân lập các chủng nấm trong đất tại Đà Nẵng và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng đối kháng tốt với chủng nấm Fusarium, Colletotrichum gây bệnh trên cây ớt, lên men xốp tạo chế phẩm sinh học. Phạm Thị Thiên (2014) đã khảo sát khả năng kết hợp một số chủng Bacillus có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh IAA với nấm Trichoderma sp. để kiểm soát sinh học nấm Pythium sp. và Fusarium sp. gây bệnh trên cây hồ tiêu. Trần Kim Loan và cộng sự (2008) thuộc viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, với chế phẩm sinh học Trichoderma (Tricho – VN) phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora gây ra trên cây hồ tiêu. 2
Đồ án tốt nghiệp Nước ngoài S. Goswami và cộng sự (2015) các chủng Trichoderma được phân lập từ đất của vườn chè ở Ấn Độ được đánh giá khả năng đối kháng chống lại mầm bệnh trên cây trà, chủ yếu là nấm Pestalotia theae và Fusarium solani. Mausam Verma và cộng sự (2007), 18 chủng Trichoderma từ đất của các vùng khác nhau ở Ấn Độ được phân tích về khả năng kiểm soát sinh học chống lại bệnh bạc lá khoai môn, mầm bệnh chính là Phytophthora colocasiae. 3. Mục đích nghiên cứu Tìm ra các chủng nấm Trichoderma spp. có khả năng đối kháng với nấm bệnh Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp., làm cơ sở cho việc sử dụng trong phòng trừ nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập một số chủng Trichoderma spp. trong đất trồng tiêu tại một số vườn thuộc tỉnh Bình Phước. Phân lập các nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu: Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh, Fusarium sp. gây bệnh chết chậm và Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư. Khảo sát đối kháng của nấm Trichoderma spp. phân lập được trong đất với các nấm Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp. gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu trong điều kiện phòng thí nghiệm. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu Sử dụng các phương pháp thường quy trong nghiên cứu khoa học. 6. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài Dựa hình thái đại thể, hình thái vi thể và tốc độ tăng trưởng, người thực hiện đề tài đã phân lập được 34 chủng Trichoderma khác nhau hoàn toàn từ các mẫu đất ở tỉnh Bình Phước. Phân lập được 3 chủng nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu là Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp. từ đất và các mẫu bệnh. 3
Đồ án tốt nghiệp Trong số 34 chủng Trichoderma spp. có 8 chủng đối kháng 100 % với Phytophthora sp., 3 chủng đối kháng 100 % với Fusarium sp và 18 chủng có khả năng đối kháng 100 % với Colletotrichum sp. Chủng BP2_B.2 có khả năng đối kháng cao với cả 3 chủng nấm bệnh chỉ sau 3 ngày nuôi cấy. Khảo sát sinh enzyme cellulase, chủng BP3_03.4 có hoạt tính enzyme rất mạnh. Ứng dụng tốt trong phân hủy các hữu cơ, dùng làm compost. 7. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp “Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu”, có tất cả 3 chương gồm: Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Giới thiệu tổng quan về nguồn gốc, phân bố, tình hình sản xuất, tiêu thụ và thực trạng canh tác cây hồ tiêu ở Việt Nam. Qua đó, trình bày các đặc điểm sinh học cũng như triệu chứng, thiệt hại của một số nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu như nấm Phytophthora spp., nấm Fusarium spp., nấm Colletotrichum spp. Từ đó, đưa ra các kết quả nghiên cứu và ứng dụng của các biện pháp sinh học trong nông nghiệp, nổi bật là nấm Trichoderma spp. trong quản lý bệnh hại trên cây hồ tiêu, cụ thể như khả năng phân hủy chất hữu cơ hay những cơ chế đối kháng với nấm bệnh cây trồng. Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP: Trình bày về vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu bao gồm phần trình bày về thời gian và địa điểm tiến hành đề tài, nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh. Phương pháp nghiên cứu tập trung ở phần thu mẫu, phân lập nấm Trichoderma spp. và nấm bệnh, cũng như đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm bệnh bằng phương pháp sử lý số liệu thống kê SAS. Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trình bày kết quả phân lập nấm Trichoderma spp. và nấm bệnh. Qua đó, đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu đã được phân lập. 4
Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố cây hồ tiêu [22] Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) thuộc họ Piperaceae, là một loại dây leo thân gỗ lâu năm. Có nguồn gốc từ bang Tây Ghats (Ấn Độ), được trồng cách nay khoảng 6.000 năm (Sasikumar và cộng sự, 1999; Ravindran và cộng sự, 2000). Hạt tiêu đen là một loại gia vị phổ biến được sử dụng để tăng hương vị cho nhiều loại món ăn trên toàn thế giới. Ở Ấn Độ, hồ tiêu được mệnh danh là ―Vua của các loại gia vị‖. Ở Việt Nam, cây hồ tiêu mọc hoang được tìm thấy từ trước thế kỷ XVI, nhưng đến thế kỷ XVII mới được trồng. Đến cuối thế kỷ XIX, hồ tiêu được trồng với diện tích tương đối khá lớn ở Phú Quốc, Hòn Chồng và Hà Tiên (Kiên Giang), chủ yếu do người Hoa gốc ở đảo Hải Nam theo Mạc Cửu di cư vào Hà Tiên. Cũng trong khoảng thời gian này và đầu thế kỷ XX, cây hồ tiêu theo chân các chủ đồn điền người Pháp phát triển lên vùng Bình Long, Bà Rịa - Vũng Tàu, Quảng Trị và Quảng Nam. 1.1.2. Phân bố địa lý Hồ tiêu là loại cây đặc trưng ở vùng nhiệt đới, thích hợp trong điều kiện mưa đều. Nhiệt độ thích hợp khoảng 20 – 30oC, nhiệt độ đất ở độ sâu 30 cm trong khoảng 25 - 28oC. Hồ tiêu là cây ưa bóng trong giai đoạn cây con, ánh sáng tán xạ thích hợp cho yêu cầu sinh trưởng, phát dục và phân hoá mầm hoa. Giai đoạn tiêu ra hoa đậu quả, nuôi quả đến khi quả chín, cây tiêu cần nhiều ánh sáng. Việc có đủ ánh sáng trong giai đoạn nuôi quả giúp giảm rụng quả non và tăng dung trọng hạt tiêu [66]. Hồ tiêu thường được trồng nhiều ở những vùng có khí hậu nóng, ẩm như: Ấn Độ, Hải Nam (Trung Quốc), Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Thái Lan, Ngoài các vùng này, hồ tiêu còn được trồng phổ biến ở Brazil và Madagascar. Ở Việt Nam, tiêu được trồng chủ yếu ở vùng Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Kiên Giang (Phú Quốc). 5
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1: Bản đồ phân bố các vùng trồng tiêu tại Việt Nam (Nguồn: Syngenta, Kỹ thuật canh tác hồ tiêu) 1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hồ tiêu 1.1.3.1. Tình hình sản xuất Vào thế kỷ XVII, cây hồ tiêu đã trở thành cây công nghiệp có nhiều tiềm năng và triển vọng không những của nông nghiệp Việt Nam mà của cả thế giới. Sự phát triển ngoạn mục này bắt đầu từ những năm 1983 - 1990, khi giá hồ tiêu trên thị trường thế giới tăng cao. Diện tích trồng tiêu của Việt Nam đã liên tục tăng và đạt gần 9.200 ha, từ 400 ha vào những năm 1970. Với tốc độ tăng bình quân năm 1996 là 27,29 %, diện tích canh tác của Việt Nam đã vượt mức 50.000 ha vào năm 2004. Trong hơn 5 năm trở lại đây, từ cuối năm 2008 đến nay khi giá tiêu tăng gấp đôi các năm trước và đến 6
Đồ án tốt nghiệp năm 2011 giá tiêu đã đạt mức kỷ luật 5,500 - 5,800 USD/tấn đối với tiêu đen và 8,000 – 8,500 USD/tấn tiêu trắng, đã gia tăng diện tích trồng tiêu lên nhanh chóng [11]. Tăng nhanh từ 60.000 ha năm 2013, tăng lên 85.000 ha năm 2014, tăng khoảng 25.000 ha gần bằng 41,7%. Năm 2015 mặc dù chưa có thống kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015). Tây Nguyên là vùng trồng tiêu lớn nhất của cả nước với tổng diện tích năm 2014 là 43.938,9 ha. Đông Nam Bộ có 34.285,6 ha. Còn lại là các tỉnh Duyên Hải Nam Trung Bộ có 3.022,9 ha, Bắc Trung Bộ có 3.599,3 ha, Đồng bằng Sông Cửu Long có 744,2 ha (Theo số liệu Tổng Cục Thống kê Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015). Bảng 1.1: Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu năm 2014 Tổng Diện tích Trồng mới Năng suất Sản lƣợng Tỉnh diện tích thu hoạch (Ha) (Tạ/Ha) (Tấn) (Ha) (Ha) Tổng cộng 85.591 13.927,5 58.526,6 25,9 151.760,8 Duyên hải Nam 3.022,9 508,1 2.249,0 15,1 3.393,2 Trung Bộ Tây Nguyên 43.938,9 8.200,5 26.422,2 31,4 83.076,0 Đông 34.285,6 4.871,5 26.344,3 23,2 61.047,9 Nam Bộ Đồng bằng sông 744,2 69,0 613,9 25,9 1.591,8 Cửu Long Bắc 3.599,3 278,5 2.897,2 9,2 26.520 Trung Bộ (Nguồn: Theo số liệu của Tổng Cục Thống kê, số liệu sơ bộ, 2015) 7
Đồ án tốt nghiệp Năng suất hồ tiêu của Việt Nam có sự khác biệt giữa các vùng trồng tiêu. Năm suất bình quân của cả nước năm 2006 đạt 21,19 tạ/ha, năm 2014 đạt đến 25,9 tạ/ha. Vùng Tây Nguyên có năng suất bình quân cao nhất 31,4 tạ/ha (năm 2014), trong khi đó các tỉnh Bắc Trung Bộ chỉ có 9,2 tạ/ha, bằng 29,3% của các tỉnh Tây Nguyên. Các tỉnh có năng suất cao như: Gia Lai đạt 39,4 tạ/ha, Đắk Lắk đạt 30,7 tạ/ha, Bình Phước 28,7 tạ/ha và Kiên Giang đạt 26 tạ/ha (Theo số liệu Tổng Cục Thống kê Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015). Dựa vào các số liệu thống kê cho thấy những năm gần đây hồ tiêu được phát triển khá nhanh ở Việt Nam, nhất là các tỉnh ở Tây Nguyên và Đông Nam Bộ. Biểu đồ 1.1: Tăng trưởng về số lượng hồ tiêu ở khu vực Đông Nam Á và các quốc gia khác (Nguồn: Nedspice, năm 2014) Trong định hướng phát triển ngành hồ tiêu Việt Nam, Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn vừa phê duyệt Quy hoạch phát triển Ngành hồ tiêu Việt Nam đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2030 nhằm tăng năng suất và giá trị ngành hồ tiêu đáp ứng nhu cầu thị trường, đặc biệt là thị trường xuất khẩu; khai thác lợi thế về đất 8
Đồ án tốt nghiệp đai, nguồn nước, khí hậu, thời tiết để phát triển hồ tiêu theo hướng sản xuất hàng hóa, tập trung, hiệu quả và bền vững. Mục tiêu của quy hoạch là phấn đấu đến năm 2020, tầm nhìn 2030 diện tích trồng hồ tiêu cả nước duy trì ổn định ở mức 50.000 ha, năng suất đạt 30 tạ/ha, sản lượng đạt 140.000 tấn và sản phẩm tiêu chất lượng cao đạt 90 % (Quyết định 1442 về quy hoạch phát triển Ngành hồ tiêu Việt Nam đến năm 2020, tầm nhìn 2030 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ngày 27/06/2014). 1.1.3.2. Tình hình tiêu thụ Hình 1.2: Các sản phẩm của cây hồ tiêu Hồ tiêu là một trong những loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế và giá trị xuất khẩu cao. Trên thị trường thế giới, các sản phẩm hồ tiêu được giao dịch ở các dạng: tiêu đen, tiêu trắng, tiêu xanh và dầu nhựa tiêu [39]. Từ năm 2003, Việt Nam đã bắt đầu xuất khẩu tiêu trắng, tuy vậy lượng tiêu trắng xuất khẩu chiếm tỷ trọng không đáng kể. Số lượng tiêu trắng xuất khẩu hàng năm tăng 9
Đồ án tốt nghiệp lên, chất lượng tiêu trắng ngày càng được nâng cao đáp ứng nhu cầu khách hàng của thị trường thế giới. Việc gia tăng mặt hàng xuất khẩu tiêu trắng đã làm tăng đáng kể giá trị xuất khẩu hồ tiêu của nước ta [39]. Bảng 1.2: Giá tổng hợp của tiêu đen và tiêu trắng (Đơn vị: USD) Tiêu đen Tiêu trắng Tháng 2013 2014 2015 2013 2014 2015 1 6.584 7.633 9.166 9.033 10.157 12.729 2 6.749 6.863 9.007 9.167 9.712 12.945 3 6.567 6.664 8.959 9.070 9.464 12.830 4 6.437 7.115 8.964 9.086 10.330 12.657 5 6.348 7.648 8.885 9.024 10.330 12.657 6 6.237 7.821 8.982 10.413 7 6.292 8.995 9.067 11.412 8 6.399 9.407 9.064 12.461 9 6.823 9.726 9.117 12.806 10 7.068 9.770 9.360 13.023 11 7.460 9.866 9.842 12.008 12 7.858 9.666 10.562 13.649 (Nguồn: Cục Xúc tiến Thương mại, tháng 7/2015) Từ năm 1999, Việt Nam trở thành nước sản xuất tiêu lớn thứ 3 thế giới chỉ sau Ấn Độ và Indonesia và là nước xuất khẩu hạt tiêu lớn thứ 2 thế giới sau Indonesia. Và hiện nay, Việt Nam đứng đầu thế giới về sản lượng xuất khẩu hồ tiêu, chiếm tới 50 % sản lượng xuất khẩu của toàn thế giới. Hồ tiêu Việt Nam hiện được xuất khẩu tới gần 80 quốc gia và các vùng lãnh thổ. Đặc biệt là xuất khẩu các loạt hàng chất lượng cao vào Mỹ, Nhật và các nước EU ngày càng tăng [19]. 10
Đồ án tốt nghiệp 350000 323479 321692 300000 278080 250000 200000 150000 88861 92017 100000 72025 50000 134 145 32 136 185 12 152 693 20 0 2012 2013 2014 Việt Nam Indonesia Thái Lan Campuchia Bangladesh Biểu đồ 1.2: Nhập khẩu hồ tiêu của 28 quốc gia EU từ một số nước Đông Nam Á giai đoạn 2010 – 2014 (đơn vị: USD) (Nguồn: Trung tâm thương mại quốc tế ITC, tháng 10/2015) 1.1.4. Tình hình nghiên cứu dịch hại trên cây hồ tiêu ở Thế giới và Việt Nam 1.1.4.1. Thế Giới [16] Bọ ăn lá, Longitarsus nigripennis là sâu hại nghiêm trọng nhất trên tiêu ở Ấn Độ và phạm vi ảnh hưởng của nó là 20 – 30 % ở vùng đồng bằng của Malabar (bắc Kerala) và 5 – 10 % ở Wynad và Travancore (nam Kerala). Rệp vảy, Lepidosaphes piperis là côn trùng gây hại chủ yếu trên tiêu ở vùng cao. Một số loài khác được ghi nhận trên tiêu ở Ấn Độ, Lepidosaphes piperis và Aspidiotus destructor. Chín loài rệp sáp có tên lần lượt là Icerya sp., I. aegyptiaca, Planococcus sp., P. citri, P. minor, Ferrisia virgate, Pseudococcus sp., P. longispinus và P. orchidicola được ghi nhận gây hại trên tiêu. Rệp sáp thường gây hại trên những bộ phận non của cây tiêu như chồi non, lá non, quả non, thường không quan sát được triệu chứng gây 11
Đồ án tốt nghiệp hại rõ ràng trên vườn; Tuy nhiên, sự gây hại nghiêm trọng của P. longispinus trên chồi non làm héo cây con trong vườn ươm. Planococcus sp. gây hại các bộ phận dưới đất làm biến vàng dẫn đến chết những dây tiêu non trên đồng và trong vườn ươm. Bọ cánh cứng ăn lá được ghi nhận trên tiêu gồm Neculla pollinaria, Pagria costatipennis, Hermaeophaga sp. và Lanka sp. ở Kerala và Tegyrius sp. ở Karnataka, Eugnathus curvus và Myllocerus sp. tất cả những loài này thường ăn lá non tạo thành những lỗ nhỏ. 1.1.4.2. Ở Việt Nam [16], [17], [24] Bảng 1.3: Tần suất xuất hiện sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu tại ba vùng điều tra Tần suất xuất hiện (%) Mức độ Dịch hại Đông Nam Bộ Tây Nguyên Quảng Trị gây hại Chết nhanh 77,5 60,2 54,3 +++ Chết chậm 62,0 54,0 56,1 ++ Bệnh virus 37,8 39,5 27,4 + Thán thƣ 22,1 15,6 12,6 ++ Rệp sáp 84,4 75,1 67,8 ++ Tuyến trùng 41,5 47,8 35,7 ++ Khác 8,7 3,9 6,5 + (Nguồn: Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam, năm 2016) Nguyên nhân làm giảm năng suất, diện tích và chất lượng hồ tiêu của nước ta hiện nay chủ yếu là nấm bệnh và sâu hại. Theo CABI có khoảng 44 loài dịch hại trên cây hồ tiêu, riêng Việt Nam theo nghiên cứu của Diệp Hồ Tùng và cộng sự (1999) có 22 loài sâu bệnh hại tiêu ở Phú Quốc. Hồ Ngọc Thành đã tiến hành nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh hồ tiêu ở Xuân Lộc - Đồng Nai là do nấm Phytophthora spp. gây ra. Ông phân lập từ 12
Đồ án tốt nghiệp cây hồ tiêu bị bệnh và lây bệnh nhân tạo cho tiêu trong vườn ươm, tiêu sản xuất thì cả hai trường hợp đều bị chết nhanh sau 7 – 9 ngày. Theo Nguyễn Ngọc Châu (1995) thì thành phần bệnh hại hồ tiêu ở Tân Lâm - Quảng Trị có tới 65 loài, trong đó tuyến trùng 49 loài, nấm bệnh 7 loài. Trong số 49 loài tuyến trùng ký sinh có 4 loài ký sinh gây hại nặng trên cây hồ tiêu là Meloidogyne incognita gây sần rễ có khả năng gây thành dịch trên diện rộng, Radophlus reniformis gây đen nụ, Xyphenema amenicanum mang virus gây vàng lá tiêu, Pratrichodorus nanus mang virus gây bệnh xắn lá tiêu. Trong 7 loài nấm bệnh, gây bệnh chủ yếu là thán thư (Collectotrichum goeosprioides), đen lá (Lasiodiplodia theobromae), thối rễ (Fusarium solani). Theo Nguyễn Vĩnh Trường và cộng sự (2001) khi phân tích mẫu đất bị bệnh chết nhanh ở Tân Lâm - Quảng trị và Long Khánh - Đồng Nai xác định nấm gây chết héo là Phytophthora capsicii. Một số nghiên cứu về tuyến trùng hại rễ hồ tiêu của Vũ Thị Nga (2003) ở Bình Long cũng cho thấy các giống Meloidogyne encognita, Criconemoides sp., Helicotylenchus sp., Tylencherhynchus sp. đều có tỷ lệ xuất hiện 100 % trong các mẫu đất phân lập. Theo Nguyễn Thị Chắt (2001) dịch hại chính trên cây hồ tiêu tại Phú Yên, Bình Phước và Bà Rịa – Vũng Tàu gồm: mối Coptotermes sp., rầy nâu Toxoptera sp., rệp sáp giả một cặp đuôi ngắn Pseudococcus sp., rệp sáp giả vằn Ferrisia virgate, ruồi trắng Aleyrodicus sp., bọ đầu dài Lophobaris sp., Diconocoris sp. và Meloidogyne sp. Nhìn chung tình hình bệnh hại hồ tiêu ở Việt Nam cũng có diễn bến tương tự trong khu vực và thế giới, đôi lúc còn phức tạp hơn. Đó là những khó khăn, thách thức đòi hỏi chúng ta phải có những nghiên cứu chắc chắn và xây dựng được một chiến lược về phòng trừ bệnh hại hồ tiêu có hiệu quả. 13
Đồ án tốt nghiệp 1.2. Một số nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu 1.2.1. Nấm Phytophthora spp. 1.2.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora spp [46] Theo A. Drenth và B. Sendall (2004) có thể xác định một số loài Phytophthora thông qua các đặc điểm hình thái: túi bào tử, bào tử áo (chlamydospores) và sự trương phồng của sợi nấm, tạo tiếp hợp tử và sinh sản hữu tính là dị tản hoặc đồng tản: Túi bào tử: o Hình thái (hình dạng, kích thước, tỷ lệ chiều dài: chiều rộng), các túi bào tử thời kỳ già yếu (phát tán nang bào tử). o Chiều dài cuống trên túi bào tử. o Sự phát triển của các túi bào tử. o Nhánh của cuống túi bào tử mà trên đó túi bào tử được sinh ra. Một số loài Phytophthora tạo ra túi bào tử trên các bề mặt của môi trường thạch. Tuy nhiên, nhiều loài cần phải được nuôi cấy trong môi trường nước, dung dịch muối khoáng hoặc dịch pha loãng được chiết từ đất trước khi chúng tạo ra các túi bào tử. Điều quan trọng là nấm Phytophthora tạo ra các túi bào tử rất phụ thuộc vào ánh sáng. Bào tử áo (chlamydospores) và sự trương phồng của sợi nấm Bào tử áo là bào tử vách dày có chức năng như một bào tử nghỉ. Chúng có thể là một sợi đốt (hình thành giữa các sợi nấm) hoặc ở tận cùng (đầu của sợi nấm). Chúng khác nhau từ sự trương phồng của sợi nấm. Các hình thái của bào tử áo không khác biệt nhiều giữa loài và do đó các bào tử rất ít sử dụng trong việc xác định loài. Tuy nhiên, sự hiện diện (P. palmivora) hay không có (P. heveae) bào tử áo có thể dễ dàng xác định loài. Sinh sản hữu tính Khoảng một nửa số loài Phytophthora là đồng tản (homothallic) chúng sản xuất bộ phận sinh sản đực, bộ phận sinh sản cái và bào tử động trên cùng một môi trường. Số còn lại là dị tản (heterothallic). Dạng dị tản tạo ra túi giao tử (túi giao tử đực và túi 14
Đồ án tốt nghiệp noãn) chỉ khi có sự hiện diện của một dòng phân lập mọc đối trên cùng môi trường. Việc xác định loài nấm thuộc nhóm đồng tản hay dị tản phụ thuộc vào túi bào tử đực của chúng là amphigynuos (túi giao tử đực nằm quanh thân túi noãn) hay paragynuos (túi giao tử đực nằm tiếp theo túi noãn). 1.2.1.2. Vòng đời [23] Hình 1.3: Chu kì sống của Phytophthora (Nguồn: SI-AMMOUR, năm 2002) Khi Phytophthora được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, khuẩn ty (Mycelium) phát triển rất nhanh. Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo ra những bào tử vô tính được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặc túi bào tử động (Zoosporangia). Túi bào tử này nảy mầm trong môi trường nước hoặc khi nhiệt độ môi trường giảm. Chúng phóng thích ra những bào tử động (Zoospores) với hệ lông roi không đều nhau (Heterokont flagella). Những bào tử động sau khi được phóng thích sẽ bơi lội hàng giờ liền và cuối cùng ngừng bơi lội để cuộn tròn hay kết kén. Sau một thời gian chúng hình thành vách tế bào. Ở giai đoạn này, bào tử được gọi là kén hay nang (Cyst). Bào tử áo (Chlamydospore) ở dạng hình cầu hay oval, là một cấu trúc nghỉ vô tính. Cấu trúc hữu tính bao gồm túi giao tử đực (Antheridium – bộ phận sinh sản đực) và túi noãn 15
Đồ án tốt nghiệp (Oogonium - bộ phận sinh sản cái). Quá trình giảm phân hình thành nên túi giao tử đực và túi noãn. Đây chỉ là giai đoạn đơn bội trong vòng đời của Phytophthora. Giai đoạn lưỡng bội đóng vai trò quyết định trong suốt chu kì sống của chúng. Các vòi thụ tinh từ túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử đực vào noãn. Hợp tử sau khi được thụ tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp tùy thuộc vào sự kết hợp của trứng với một hay nhiều ống giao tử đực. Giống Phytophthora bao gồm một số loài nấm dị tản (Heterothallic) (có hai kiểu lai A1 và A2) chẳng hạn như P. infestans. Số còn lại là những loài nấm đồng tản (Homothallic) bao gồm cả P. sojae hoặc P. porri. 1.2.1.3. Phytophthora gây bệnh trên cây hồ tiêu Triệu chứng Hình 1.4: Triệu chứng của bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu Nấm Phytophthora tồn tại trong đất dạng ngủ vào mùa khô và bắt đầu hoạt động nhiều trong mùa mưa khi ẩm độ đất tăng lên. Bệnh có 2 giai đoạn tồn tại là trong không khí và trong đất: 16
Đồ án tốt nghiệp Nấm tồn tại trong không khí gây bệnh trên lá, thân và hoa. Bệnh xuất hiện trên lá non, mọc gần mặt đất với triệu chứng xuất hiện như: đốm màu nâu đen, sau đó lây lan nhanh chóng, rồi lan khắp hết lá. Những đốm trên lá có đặc điểm đáng chú ý là có lớp tơ ở mép vết bệnh. Lá bị bệnh sẽ rụng sớm. Thêm vào đó, nấm gây bệnh tấn công phần thân non và gây thối thân. Khi thân hoặc nhánh xuất hiện triệu chứng nhiễm bệnh, tán lá phía trên chuyển sang màu vàng và đôi khi biểu hiện ―héo lá‖. Bệnh gây hại trên lá, dẫn đến rụng lá với các mức độ khác nhau, trên các nhánh khác nhau, tùy theo mức độ gây hại của bệnh. Tuy nhiên, sự nhiễm bệnh trên lá không làm chết cây. Bệnh làm cây giảm sức đề kháng. Khi mùa mưa bắt đầu, ẩm độ đất tăng lên, hệ thống rễ phát triển mạnh, những rễ tơ dễ bị xâm nhiễm. Bào tử nấm trong đất xâm nhập vào cây qua rễ tơ, sau đó lây lan sang rễ chính, cuối cùng là vùng cổ rễ, hoặc vùng gốc cây. Dựa vào mức độ xâm nhiễm của bệnh, cây sẽ biểu hiện thông qua nhiều triệu chứng khác nhau như: tán lá chuyển vàng, gãy thân ở các đốt, héo và rụng lá. Khi bệnh xuất hiện ở phần gốc cây, toàn bộ cây sẽ tàn lụi và làm chết cây vì thế nông dân gọi bệnh này là bệnh chết nhanh. Bệnh lây lan dần sang các cây bên cạnh và dẫn đến chết cây hàng loạt. Thiệt hại Ở Việt Nam, bệnh chết nhanh hay còn gọi là thối gốc, rễ trên cây tiêu, đã gây thiệt hại lớn cho người trồng tiêu trên cả nước, làm năng suất hồ tiêu hàng năm giảm 15 – 20 %, nhiều vườn tiêu bị thiệt hại lên tới 100 %, do không có kinh nghiệm phòng trừ, quản lý bệnh, sử dụng thuốc hóa học không đúng cách và đặc biệt là sử dụng lại giống đã bị nhiễm bệnh (Trần Thu Hà, 2013). Thực tế cho thấy đã có nhiều phương pháp được bà con nông dân áp dụng, tuy nhiên vì một số lý do nên kết quả không được cao. Hơn nữa, hiện nay ở Việt Nam chưa có giống tiêu chống chịu được bệnh chết nhanh. Theo số liệu tổng hợp của Chi cục Trồng trọt – Bảo vệ Thực vật Bình Phước (Trung tâm Bảo vệ Thực vật, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn), hồ tiêu toàn 17
Đồ án tốt nghiệp tỉnh hiện có 11.600 ha, tăng hơn 1.000 ha so năm 2013. Tuy nhiên diện tích tiêu chết vì bệnh đang tăng nhanh. Bệnh chết nhanh được coi là bệnh nan y với cây tiêu đang gia tăng so với năm 2013. Cụ thể, đến ngày 15/9, bệnh chết nhanh có 347 ha. Đứng đầu là thị xã Bình Long với 238 ha nhiễm bệnh chết nhanh (159 ha nhẹ và 79 ha mức trung bình). Bệnh chết nhanh chỉ sau 2 tuần là chết nọc do nấm tấn công bộ rễ làm cây héo nhanh, người trồng tiêu không thể cứu chữa dẫn đến thiệt hại cả vườn. Hình 1.5: Thiệt hại của bệnh chết nhanh [38] 1.2.2. Nấm Fusarium spp. 1.2.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium spp. Nấm Fusarium thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) [14]. Fusarium gồm nhiều loài khác nhau, gây nhiều loại bệnh trên cây trồng. Tuy nhiên, nhiều loài nấm Fusarium là nấm hoại sinh sống phổ biến trong đất. Fusarium là nguyên nhân chính của bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu. Hệ sợi nấm lan toả khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ. Lấp kín mạch gỗ sẽ cản trở quá trình vận chuyển nước làm héo cây, Fusarium spp. cũng sản xuất một số chất 18
Đồ án tốt nghiệp độc tiết vào mạch dẫn cây chủ làm héo rũ. Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già. Cơ thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, giữa các vách ngăn có lỗ nhỏ ở giữa. Trong tế bào có một hoặc nhiều nhân. Vách tế bào bằng chitin, glucan [17]. Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển là 25 – 30oC. Nấm Fusarium phát triển nhanh trên môi trường PDA và hình thành tản nấm có hình dạng tơi xốp, lan rộng trên môi trường nuôi cấy. Mặt trên của tản nấm có màu trắng, vàng cam hoặc tím hồng. Mặt dưới không màu, vàng cam hay màu nâu. Sinh sản sinh dƣỡng Sợi nấm: Từ một sợi nấm riêng rẽ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ sinh trưởng và phân nhánh thành hệ sợi nấm. Bào tử áo hình thành ở các sợi nấm trong mô cây bị nhiễm bệnh. Chúng cũng có thể được hình thành từ đại bào tử có nguồn gốc từ khối bào tử trên các tổn thương. Bào tử áo là những tế bào hơi tròn, tế bào chất được cô đặc lại [53], có màng dày bao bọc, thỉnh thoảng vách tế bào xù xì hoặc có sắc tố [56]. Ở bào tử này, chất dinh dưỡng được chuyển từ tế bào bên cạnh làm phồng lên, chứa nhiều chất dự trữ và có thể chịu đựng những điều kiện bất lợi trong một thời gian khá dài. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng sẽ nảy mầm và phát triển thành sợi nấm mới [17]. Sinh sản vô tính Ở các loài Fusarium có 2 loại: đại bào tử và tiểu bào tử. Đại bào tử được hình thành từ thể bình trên cuống bào tử có nhánh hay không có nhánh [17]. Đại bào tử lớn có kích thước 3 – 8 µm x 11 - 70 μm. Hầu hết các loài Fusarium, đại bào tử có từ 3 - 7 vách ngăn, tuy nhiên có nhiều loài có từ 1 - 3 vách ngăn (F. dimerum, F. dlamini, F. poae) hoặc nhiều hơn 7 vách ngăn (F. decemcellulare, F. coccophilum) [17]. Đại bào tử có hình lưỡi liềm. Tiểu bào tử có kích thước 2 – 4 µm x 4 - 8 μm, được hình thành từ cuống bào tử phân sinh phân nhánh hoặc không phân nhánh, mọc trực tiếp từ sợi nấm hoặc tụ lại 19
Đồ án tốt nghiệp thành dạng bọc giả trên đầu cành hoặc hình thành dạng chuỗi [45]. Bào tử có 0 - 1 vách ngăn (đặc biệt có loài có 2 - 3 vách ngăn). Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau như: hình cầu, hình liềm, hình trứng, hình chùy [51]. Hình 1.6: Fusarium gây cây héo rủ (A), và các loại bào tử : đại bào tử đính (C), tiểu bào tử đính (D), (Phialide = thể bình , mycelium = khuẩn ty) (B), terminal chlamydospore = bào tử vách dày hoàn chỉnh (E) [2] 1.2.2.2. Vòng đời [57] Vòng đời của Fusarium bắt đầu với giai đoạn hoại sinh khi nấm tồn tại trong đất ở dạng bào tử hậu. Bào tử hậu không hoạt động cho đến khi được kích thích nảy mầm bằng cách sử dụng chất dinh dưỡng từ đỉnh sinh trưởng của các rễ tơ của cây. Sau khi nảy mầm, tản nấm phát triển và bào tử được hình thành trong 6 - 8 giờ, bào tử hậu trong 2 - 3 ngày. Sau khi xâm nhập vào các tế bào biểu bì của cây ký chủ, nấm tiếp tục xâm nhập vào bên trong rễ của cây và sự phát triển của bệnh thấm qua mạch trong. Trong các giai đoạn của bệnh, các loại nấm phát triển trong các hệ thống mạch sau đó là các tế bào nhu mô lân cận, sản xuất với số lượng lớn các bào tử và bào tử hậu. Các 20
Đồ án tốt nghiệp tác nhân gây bệnh tồn tại trong mảnh vỡ cây bệnh trong đất như sợi nấm và trong tất cả các bào tử của nó, nhưng hầu hết thường là bào tử hậu. 1.2.2.3. Fusarium gây bệnh trên cây hồ tiêu Triệu chứng Cây tiêu có biểu hiện sinh trưởng chậm, lá úa vàng. Lá, hoa, các đốt và trái cũng rụng dần từ dưới gốc lên ngọn. Cây bị bệnh kém phát triển, năng suất thấp, bộ rễ cây thường bị thối. Quan sát thấy trên rễ có nhiều mụn u sưng, vết thâm đen. Gốc thân, cổ rễ bị thâm đen, thối khô. Các bó mạch bên trong bị chuyển màu thâm đen. Do bộ rễ bị tổn thương, quá trình thoát nước, vận chuyển muối khoáng bị gián đoạn nên cây mới bị bệnh có biểu hiện sinh trưởng kém, lá bị vàng và rụng dần, cây còn nhỏ có thể bị chết khô hoàn toàn. Trường hợp cây tiêu bị bệnh nhẹ thì dây tiêu không chết nhưng sinh trưởng không bình thường và cằn cỗi. Khi bệnh nặng, toàn bộ gốc thân cây bệnh có các vết nâu đen, dần dần vết bệnh lan rộng làm thối lớp vỏ gốc, bó mạch của thân cây hóa nâu gốc, sau đó cây chết khô. Thời gian từ khi có biểu hiện bị bệnh đến khi chết có thể kéo dài cả năm. Bệnh làm chết cả khóm hoặc chỉ chết 1 - 2 dây. 21
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7: Triệu chứng của bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu Thiệt hại Theo Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1991) cho biết ở tất cả các vùng trồng tiêu của Việt Nam đều gặp những vườn tiêu chết toàn bộ, chỉ còn trơ lại cây nọc, gây thiệt hại rất lớn. Bệnh làm chết cả tiêu kiến thiết cơ bản và tiêu kinh doanh. Có 10 – 30 % diện tích tiêu bị hại nặng không có khả năng cho thu hoạch. Một số vùng trồng tiêu lâu năm ở Phú Quốc, Quảng Trị và Quảng Bình bệnh này phát triển mạnh tạo thành dịch lớn, gây thiệt hại nặng nề và đe dọa ngành sản xuất tiêu ở đây [33]. Theo số liệu tổng hợp của Chi cục Trồng trọt – Bảo vệ Thực vật (Trung tâm Bảo vệ Thực vật, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) ở tỉnh Bình Phước năm 2014, bệnh chết chậm gây hại 774 ha, trong đó mức độ nhẹ 556 ha, mức độ trung bình 218 ha. Trong đó, đứng đầu là thị xã Bình Long với 650 ha bị nhiễm bệnh chết chậm, trong đó 447 ha ở mức độ nhẹ, 203 ha mức trung bình. Cây tiêu sinh trưởng kém nhưng không làm tiêu chết ngay mà giảm năng suất. 22
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.8: Thiệt hại của bệnh chết chậm [30] 1.2.3. Nấm Colletotrichum spp. 1.2.3.1. Đặc điểm sinh học của nấm Colletotrichum spp. Phân loại các loài nấm Colletotrichum chủ yếu dựa vào các đặc điểm điển hình của hình thái khuẩn lạc, tản nấm, hình dạng, kích thước bào tử, lông gai và giác bám. Nấm Colletotrichum thuộc bộ nấm đĩa dài (Molanconiales) của lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes). Đặc điểm của lớp nấm này là sợi nấm có vách ngăn và dịch trong suốt [40]. Ở giai đoạn sinh sản hữu tính, Colletotrichum thuộc lớp nấm nang Ascomycete có tên là Glomerella cũng cho ra dạng bào tử đơn bào. Ở giai đoạn sinh sản vô tính, bào tử đính đơn bào có dạng hình thoi, hình liềm hoặc hình trụ, không màu và đôi khi có giọt dịch bên trong bào tử [32]. Bào tử túi hình trụ hoặc hình chùy, kích thước 35 – 80 µm x 8 – 14 µm [32]. Bào tử phân sinh hình thành trên cành bào tử ngắn, hẹp, trong suốt, đầu hơi tù, đỉnh 23
Đồ án tốt nghiệp tròn, không có vách ngăn, kích thước từ 9 – 24 µm x 3 – 6 µm [41]. Bào tử nảy mầm và hình thành giám bám màu nâu, hình ovan, kích thước 6 – 20 µm x 4 - 12 µm [32]. Theo Đinh Thị Mỹ Lệ (2005) những loài có dạng bào tử hình liềm thì rất dễ phân biệt, những loài có dạng bào tử hình trụ thì có thể dễ bị nhầm lẫn. Tuy nhiên, sự xác định các loài nấm có bào tử dạng thẳng có thể phức tạp bởi vì bào tử của các loài nấm có dạng thẳng rất giống nhau về hình thái nhưng những đặc điểm của khuẩn lạc thì rất đa dạng [32]. Đa số khuẩn lạc nấm Colletotrichum có dạng hình tròn, mép rìa của khuẩn lạc có dạng mép rìa tròn hoặc mép rìa gợn sóng. Trên môi trường PDA, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm. Khuẩn lạc phát triển bằng phẳng hoặc có sự phân tầng. Hình 1.9: Cọng mang bào tử đính và bào tử đính của nấm Colletotrichum (Seta = cuống bào tử, germtubes = ống mầm, hyphae stroma = khuẩn ty dinh dưỡng, conidium (dia) = bào tử đính, conidiophore = cọng mang bào tử đính [2] 24
Đồ án tốt nghiệp Theo Lê Hoàng Lệ Thủy (2004) thì Barnet và cộng sự (1998) mô tả ổ nấm Colletotrichum có dạng đĩa đài tròn hoặc dạng gối, có gai cứng ở mép rìa đĩa đài và giữa ổ nấm, có sáp sẫm màu, nhọn ở đầu và có vách ngăn (Phạm Văn Kim, 2002), đĩa cành thuôn về phía đỉnh, phồng nhẹ ở phần gốc, kích thước chiều dài khoảng 500 µm, đường kính 4 – 8 µm, có từ 1 – 4 vách ngăn (CABI, 2003) [32]. Nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 4oC nhưng nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là tử 25 – 29oC và độ ẩm cao, trong điều kiện này nấm gây hại nghiêm trọng cho cây trồng. 1.2.3.2. Vòng đời [55] Chu kỳ sinh sản vô tính Đĩa đài của nấm Colletotrichum trên cây bị nhiễm bệnh tạo ra bào tử, bào tử phát tán nhờ gió, cũng có thể lây lan bởi mưa, nước mưa văn lên các cây khác. Khi bào tử tiếp xúc với cây chủ, nó thâm nhập vách tế bào. Một khi bên trong cây chủ, nấm Colletotrichum sinh trưởng và phát triển hệ sợi nấm. Các triệu chứng của nhiễm nấm Colletotrichum xuất hiện khi hệ sợi nấm phát triển xuyên qua bề mặt vết thương bộ phân ký chủ và sản xuất các đĩa dài. Chu kỳ sinh sản hữu tính Colletotrichum có hình thức sinh sản đặc biệt tạo ra các sợi nấm riêng biệt thay vì một hệ sợi nấm. Các sợi nấm riêng lẽ này là một hình thức sinh sản hữu tính của Colletotrichum. Hai sợi nấm riêng lẽ khác nhau của Colletotrichum dính vào với nhau và tạo ra một bào tử mới thông qua sinh sản hữu tính. Bào tử này được gọi là một ascospore (bào tử nang), và nó có thể tồn tại trong môi trường trong một thời gian rất dài. Sinh sản hữu tính tạo ra con đa dạng di truyền và đa dạng di truyền này sẽ giúp Colletotrichum tồn tại trong điều kiện và môi trường khác nhau. 25
Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.3. Colletotrichum gây bệnh trên cây hồ tiêu Triệu chứng Nấm tồn tại trong đất, không khí và xác bã thực vật. Bệnh phát triển nhiều trong điều kiện vườn tiêu chăm sóc kém, thiếu phân bón, tưới nước không đều trong mùa khô. Đầu tiêu lá xuất hiện những đốm lớn màu vàng nhạt, sau đó chuyển thành màu nâu rồi đậm dần thành màu đen, rìa vết bệnh có quầng đen. Hình dạng của những đốm này không nhất định. Khi vết bệnh già, ở rìa vết bệnh sẽ xuất hiện những quầng sáng màu vàng ngăn cách phần mô khỏe mạnh và mô đã nhiễm bệnh. Bệnh gây hại ở đầu hoặc mép lá, sau đó lan rộng dần, làm lá khô đen và rụng. Bệnh thường xuất hiện quanh năm nhưng nhiều nhất là vào mùa mưa. Nếu không xử lý kịp thời, bệnh có thể lây lan qua gié bông, gié quả làm bông và quả bị khô đen. Hoặc gây hại trên thân nhánh làm tháo đốt, khô cành. Bệnh cũng có thể bùng phát kèm theo khi tiêu bị bệnh chết nhanh. Hình 1.10: Triệu chứng của bệnh thán thư trên cây hồ tiêu [43] Thiệt hại Vườn tiêu bị nấm thán thư tấn công làm các gié tiêu bị rụng, bệnh làm quả mới tượng bị khô và lép, còn các đốt thân thì thường ngắn lại, cây tiêu cằn cỗi ra bông ít, chùm bông ngắn, tỉ lệ đậu trái thấp, giảm năng suất và sản lượng. Khả năng lây lan của nấm bệnh thán thư nhanh, diện rộng. 26
Đồ án tốt nghiệp Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, nhiều vườn tiêu đang trong giai đoạn ra hoa, kết trái bị rụng bông và trái non rất nhiều, có vườn rụng tới 70 - 80%. Nguyên nhân là chủ yếu là thời tiết diễn biến thất thường, thiếu dinh dưỡng, bệnh thán thư, Hình 1.11: Thiệt hại do nấm Colletotrichum gây ra 1.3. Biện pháp sinh học trong quản lý bệnh hại cây trồng 1.3.1. Lịch sử biện pháp sinh học 1.3.1.1. Thế giới Trước thế kỷ 18, Người Trung Quốc đã biết dùng kiến vàng trong vườn cam quýt, bọ rùa trong việc hạn chế rệp muội. Đến năm 1685, Martin Lister đã ghi nhận là ong cự chui từ sâu ong non bộ cánh vảy là kết quả của ong cái đã đẻ trứng vào sâu non. Sách báo thế kỷ 18 đã có nhiều tài liệu công bố về côn trùng ký sinh và côn trùng bắt mồi như Gedert, Reaumur, Darwin, Reaumur là người đầu tiên khuyến cáo biện pháp sinh học. Trong thế kỷ 19, đã có nhiều công trình nghiên cứu về phân loại, sinh học và sinh thái các thiên địch của sâu hại. Năm 1908, Porter đã chứng minh được rằng các hoạt động của vi sinh vật gây bệnh cây trồng có thể ức chế bằng các sản phẩm trao đổi chất của nó. Wood và Tveit 27
Đồ án tốt nghiệp năm 1955 đã đưa ra 3 cơ chế đối kháng giữa vi sinh vật là cạnh tranh, kháng sinh và tiêu diệt nhau. 1.3.1.2. Việt Nam Trước kia, nông dân đã biết dùng kiến vàng để trừ sâu hại trong vườn cam quýt. Từ thập niên 1970, Biện pháp sinh học ở nước ta mới đã đạt được một số thành tựu, các nghiên cứu tập trung vào 2 hướng: Bảo vệ duy trì và phát triển quần thể thiên địch có sẵn. Bổ sung thiên địch vào sinh quần cây trồng nông lâm nghiệp. 1.3.2. Khái niệm Theo Nguyễn Văn Đĩnh và cộng sự (2004), Biện pháp sinh học là dùng các sinh vật để khống chế hay tiêu diệt các sinh vật hại, rộng hơn là dùng các sinh vật, sản phẩm của chúng để kìm hãm sinh vật hại, làm cho chúng giảm số lượng và độc tính, không gây hại với các loại sinh vật có ích an, toàn với sức khỏe con người và môi trường. 1.3.3. Ưu và nhược điểm của biện pháp sinh học trong nông nghiệp 1.3.3.1. Ưu điểm Không gây ô nhiễm môi trường, an toàn cho người và động vật. Ngoài ra còn phù hợp với phát triển của nền nông nghiệp Việt Nam. Hiệu quả kinh tế cao, sinh vật có khả năng tồn tại lâu trong quần xã, kiểm soát sự phá hoại của sinh vật gây hại. Không ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng nông sản. Trong khi biện pháp hoá học để lại dư lượng thuốc bảo vệ thực vật cao, gây ngộ độc và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Phóng thích thiên địch tốn ít thời gian hơn phun thuốc và không gây mùi khó chịu như sử dụng thuốc hóa học, nhất là trong nhà kính nóng ẩm. Việc phóng thích thiên địch được tiến hành ngay sau khi gieo trồng, nông dân có thể kiểm tra sự thành công của biện pháp này chỉ cần một vài lần kiểm tra sau đó nhưng đối với biện pháp hoá học cần sự kiểm ta thường xuyên trong suốt vụ. 28
Đồ án tốt nghiệp Các chế phẩm sinh học và thiên địch tiêu diệt được nhiều loài sinh vật gây hại, có sức tàn phá lớn. Các biện pháp đấu tranh sinh học duy trì được hệ sinh thái trong tự nhiên góp phần bảo vệ các loài sinh vật. 1.3.3.2. Nhược điểm Tác động thường chậm nên không có khả năng dập dịch. Nghiên cứu và nhân nuôi cần trang thiết bị và kinh phí cao. Sản phẩm sinh học thường chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường. Quy trình áp dụng khắt khe, đòi hỏi người sử dụng phải có trình độ nhất định. Sinh vật, thiên địch rất nhạy cảm và dễ tổn thương. Khi du nhập nhiều loài thiên địch về Việt Nam, chúng không phát triển, hiệu quả sử dụng không cao (chưa thích nghi được với môi trường). Khi tiêu diệt sinh vật gây hại này lại tạo điều kiện cho các sinh vật gây hại khác phát triển. Một loài thiên địch có thể vừa là sinh vật có lợi vừa là sinh vật có hại. 1.3.4. Các ứng dụng sinh học trong quản lý bệnh hại trên cây hồ tiêu Các nhà khoa học đã sử dụng chế phẩm sinh học chitin, chitosan và chitosan oligomer cho cây hồ tiêu, tách chiết từ vỏ tôm cua, côn trùng, vách tế bào nấm. Đây là những thành phần không độc hại, phân hủy sinh học nhanh và an toàn với môi trường. Ở cây tiêu kiến thiết cơ bản, các thành phần chitosan và chitosan oligomer có hoạt tính kích thích tăng trưởng hồ tiêu, tăng số lượng vi sinh vật có lợi, hạn chế nấm gây hại trong đất và tăng cường hệ thống đề kháng. Ứng dụng vào tiêu kinh doanh, các chế phẩm được tưới cho tiêu ba lần, mỗi lần cách nhau 15 ngày. Sau ba tháng, số lượng nấm mốc và xạ khuẩn có trong đất tăng lên nhanh chóng [7]. Hầu hết số xạ khuẩn và nấm mốc này có khả năng tổng hợp các loại enzyme làm tan vách tế bào của các loại nấm gây bệnh và một số côn trùng, giúp cho cây hồ tiêu có khả năng làm tăng đề kháng với các loại nấm bệnh trong đất. 29
Đồ án tốt nghiệp Trong quá trình canh tác, khi bón các chế phẩm chitosan và chitosan oligomer đã làm giảm đáng kể số lượng nấm Fusarium và tuyến trùng gây hại trên cây hồ tiêu. Mặt khác, khi phun chế phẩm chitosan oligomer nồng độ 200 mg/l lên lá, lượng diệp lục trong lá cây hồ tiêu tăng gần 50 %. Cây được kích thích sinh trưởng thân dây chính và các cành nhánh phát triển nhanh hơn [7]. Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm tại Viện Khoa học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam đã cho kết luận là các chủng nấm Trichoderma và Bacillus có khả năng ức chế và bào mòn vách tế bào của các chủng nấm Phytophthora spp., Fusarium spp., và Sclerotium spp. làm cho các nấm bệnh này không phát triển được hoặc bị tiêu diệt. Theo Nguyễn Văn Tuất (2012), các chủng nấm Trichoderma, Glioclacdium có hàm lượng chitinase giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh với các nấm gây bệnh, trong quá trình đó chúng tiết ra hệ enzyme phân hủy tế báo nấm gây bệnh, các enzyme này có đốc tính rất mạnh với nấm bệnh và được coi là nhân tố tích cực trong phòng trừ bệnh hại cây trồng. Thực tế, ứng dụng các chế phẩm Trichoderma và Bacillus trên đồng ruộng phòng trị bệnh chết nhanh cho hồ tiêu có hiệu lực rất cao. Chế phẩm Pseudomonas có khả năng ngăn chặn sự phát triển và phát tán lây lan của nấm bệnh, khống chế các bệnh do nấm Phytophthora, Fusarium, Palmivora gây bệnh chết nhanh, chết chậm, xì mủ, thối lở cổ rễ, có khả năng thẩm thấu vào bên trong tế bào, phân bổ kháng sinh cho thân, cành, lá, rễ, bảo vệ bộ rễ, thân tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh. Anisaf SH - 01 có thành phần là Polyphenol được chiết xuất từ thực vật không gây độc hại cho cây trồng, vật nuôi, đảm bảo vệ sinh an toàn nông sản và bảo vệ môi trường sinh thái. Các nhà khoa học Trung tâm Phát triển Công nghệ cao thuộc Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã triển khai nghiên cứu ứng dụng của thuốc trên cây hồ tiêu. Kết quả cho thấy sản phẩm có tác dụng phòng trừ rệp sáp, hạn chế bệnh vàng lá, tuyến trùng, hồ tiêu ở nồng độ 1 %, lượng nước thuốc sử dụng là 3 - 5 lít/cây, sử dụng theo đường phun cả cây với kết hợp với tưới gốc. Ngoài việc sử dụng 30
Đồ án tốt nghiệp thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật Anisaf SH - 01, các nhà nghiên cứu đồng thời sử dụng các chế phẩm Anisaf SH - 01 (1) và Anisaf SH - 01 (2) nhằm hỗ trợ quá trình hấp thu dinh dưỡng của cây trồng và cải tạo chất lượng đất [42]. 1.4. Nấm Trichoderma spp. trong quản lý bệnh cây trồng 1.4.1. Nấm Trichoderma spp. 1.4.1.1. Phân loại [26] Nấm Trichoderma spp. là một trong những vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại vẫn chưa được biết đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự khác biệt về hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh sản bào tử vô tính. Năm 1801, Persoon ex Gray đã xác định Trichoderma thuộc: Giới (Kingdom): Fungi Ngành (Division): Ascomycota Lớp (Class): Euascomycetes Bộ (Order): Hypocreales Họ (Family): Hypocreaceae Chi (Genus): Trichoderma 1.4.1.2. Sự phân bố của nấm Trichoderma spp [26] Nấm Trichoderma spp. khá phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là trong môi trường đất. Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác. Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm của nhiều loài nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma. Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau. Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có liên hệ 31
Đồ án tốt nghiệp mật thiết với nhau. Nhìn chung, các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất acid nhiều hơn ở vùng đất trung tính hoặc kiềm. Hình 1.12: Nấm Trichoderma mọc trong tự nhiên (Nguồn: Google hình ảnh) 1.4.1.3. Đặc điểm hình thái [26] Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma spp. Ông cho rằng: Tùy từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau. Khuẩn ty (sợi nấm) có tốc độ phát triển rất nhanh, trên môi trường PDA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trường PDA hóa vàng. Hình 1.13: Khuẩn lạc của nấm Trichoderma Harzianum [25] 32
Đồ án tốt nghiệp Một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định. Cuống bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau. Số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), có kích thước từ 1 – 7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng như bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động như chồi mầm. Bào tử đính của Trichoderma mọc ở đỉnh của cuống sinh bào tử, mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Bào tử có hình bầu dục với kích thước khoảng 3 – 5 µm x 2 – 4 µm, rất hiếm khi bào tử của nấm này có hình cầu. Vách bào tử trơn láng, tuy nhiên ở một vài loài Trichoderma (T. viride) bào tử có vách xù xì như có nhiều mụn cơm (Mecray, 2002). Nhờ có khả năng tạo thành bào tử áo (chlamydospores) nên nấm Trichoderma có khả năng tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng. Chlamydospores dạng hình cầu méo, đơn bào, mặc dù cũng có một số loài có khả năng hình thành nên các bào tử áo đa bào (Papavizas, 1985), Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ, làm tăng khả năng sống sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học. 1.4.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học [26] Đa số các chủng nấm Trichoderma phát triển tốt ở pH 4.5 – 6.5, nhiệt phát triển tối ưu thường là 25 – 30oC. Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Trichoderma có thể sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là hai enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm bệnh. 33
Đồ án tốt nghiệp Trong quá trình sinh sản vô tính của nấm Trichoderma, có thể xảy ra hiện tượng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loài Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật 1.4.1.5. Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh cây trồng Nhiều cơ chế được ứng dụng trong phòng trừ sinh học của Trichoderma spp. đối với nấm gây bệnh, ba cơ chế đối kháng chính là ký sinh, cạnh tranh và tiết ra kháng sinh. Kháng sinh Godtfredson và Vangedal (1965) đã mô tả hoạt chất amin của Trichoderma là một hợp chất có 3 đơn vị isopren như một hợp chất kháng sinh. Dennis và Webster (1971) đã báo cáo, acetaldehyde là thành phần kháng sinh dễ bay hơi được sản xuất bởi Trichoderma. Trên đĩa cấy Trichoderma đối kháng sự phát triển của P. meadii gần như hoàn toàn. Với P. vexans và R. solani, đối kháng không hoàn toàn vì tỷ lệ phát triển của R. solani và P. vexans cao hơn P. meadii. Các nghiên cứu cho thấy, một lượng dịch tiết của Trichoderma có đặc tính kháng sinh. Sản phẩm của nấm Trichoderma là một acid bazơ đơn chưa bão hòa ở thể hoạt động chống lại những loài nấm gây bệnh [54]. 34
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.14: Vách tế bào của nấm Rhizoctonia solani bị enzyme của nấm Trichoderma chọc thủng và sau đó xâm nhập vào [15] T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự phát triển của Rhizoctonia solani và Pythium spp. Isonitriles được sản xuất bởi T. hamatum, T. harzianum, T. viride, T. koningii, T. polysporum hạn chế sự phát triển của nấm bệnh. Ở loài T. atroviride và T. viride tiết 6 - pentyl alpha-pyrone (α – pyrones) có hương dừa, hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự nảy mầm của những noãn bào tử nấm gây bệnh Phytophthrora cinnamomea và Botrytis cinnerea. Peptaibols do T. polysporum, T. harzianum, T. koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá huỷ thành tế bào ngăn chăn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. Steroids (viridin) là một độc tố thực vật có hiệu lực như một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử, được sản xuất bởi T. virens [26]. Ký sinh 35
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.15: Nấm Trichoderma (vàng) ký sinh trên nấm Pythium (xanh) trên hạt đậu Hà Lan [15] Theo Chet (1990) nấm Trichoderma ký sinh gồm 4 giai đoạn [18]: o Nhận ra vật chủ nhờ tính hướng hóa chất, nấm ký sinh phân nhánh hướng về những nấm đã được định trước (do những nấm này tiết ra các hóa chất). o Sự nhận dạng đặc hiệu do sắp xếp bởi lectin trên bề mặt tế bào của nấm và mầm bệnh. o Trichoderma ký sinh và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình thành các dạng móc hay giác bám. o Tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ. Trong nghiên cứu invitro, đối kháng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh R. solani và P. meadii, hoạt động ký sinh của Trichoderma đã được quan sát trên sợi nấm của mầm bệnh trong những sợi nấm cuộn, quá trình thâm nhập và sự tiêu biến sợi nấm. Như sự ảnh hưởng lẫn nhau giữa sợi nấm và mầm bệnh thường xuyên được theo dõi qua nét đặc trưng trên Trichoderma. Weinding (1932) đã theo dõi sợi nấm 36
Đồ án tốt nghiệp Trichoderma phát triển gần kề sợi nấm Rhizoctonia, cuộn xung quanh và sau đó tìm thấy mọc bên trong nấm bệnh [54]. Cạnh tranh [25], [26], [54]. Trichoderma cạnh tranh với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dưỡng chất một cách thụ động bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores). Cạnh tranh mô già hoặc mô chết với nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khoẻ). Nấm Trichoderma sử dụng những mô già và mô chết của cây chủ, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và tiêu diệt đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. Cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Pythium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Pythium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh. Các nghiên cứu với T. viride và T. harzianum để kiểm soát bệnh thối rữa than, rễ đã cho thấy rằng với một mật độ 105 CFU/gram đất trồng đã cho sự hiệu quả giảm bớt bệnh hại. Điều này cho thấy rằng với một mức độ nhất định Trichoderma sẽ cho sự cạnh tranh với các mầm bệnh trong đất trồng. Wells (1988) nghĩ rằng sự có mặt ở khắp mọi nơi của Trichoderma ở đất nông nghiệp và đất tự nhiên khắp thế giới là bằng chứng trực tiếp cho thấy chúng vừa cạnh tranh không gian và vừa cạnh tranh nguồn dinh dưỡng. 37
Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp của nấm Trichoderma Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho ta thấy: 1.4.2.1. Khả năng kiểm soát bệnh cây Nhiều chủng nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát các loài nấm gây bệnh cho cây trồng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với các loại nấm gây bệnh thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium [6]. Các loài nấm Trichoderma nói chung phát triển trong môi trường tự nhiên trên bề mặt của rễ cây, do đó có tác dụng kiểm soát sinh học với một số bệnh trên rễ gây ra bởi tuyến trùng và nấm, nó còn giúp tái tạo, phục hồi các rễ bị tổn thương do tuyến trùng hoặc rệp sáp gây ra. Nấm Trichoderma còn tạo ra các chất có hoạt tính tương tự như ―thuốc kháng sinh‖, có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh đồng thời Trichoderma còn ký sinh các loài nấm gây bệnh, tiết ra các enzyme phân hủy chúng [31]. Ngoài ra nấm Trichoderma phòng trừ được các bệnh trên lá do loài nấm này kích thích bộ rễ tổng hợp chất đề kháng để chống lại các tác nhân vi sinh vật xâm nhập, các chất đề kháng này từ rễ di chuyển đến các bộ phận phía trên của cây [6]. Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số chủng nấm Trichoderma có khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những chủng nấm này cũng có khả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm. 38
Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.2. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng Hình 1.16: Sự phát triển của hệ rễ cây trồng giữa việc sử dụng và không sử dụng Trichoderma [25] Ghi chú: Without T-22: không được xử lí với T-22 With T-22: đã xử lí với T-22 Hình 1.17: Sự gia tăng sản lượng trên cây ớt với hạt giống được xử lý và không xử lý Trichoderma [25] Nấm Trichoderma kích thích sự tăng trưởng và phát triển của bộ rễ. Trichoderma bám vào những vùng rễ cây như những sinh vật cộng sinh khác. Nó tiết ra đất những chất kích thích để rễ cây ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả 39
Đồ án tốt nghiệp năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành một lớp thành bảo vệ vùng rễ tránh sự xâm nhập của nấm bệnh, làm giảm khả năng nhiễm bệnh nhờ Trichoderma bám vào các đầu rễ cây, tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều cao của cây, tăng năng suất cây trồng. Hiện nay, một chủng nấm Trichoderma đã được phát hiện có khả năng tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán [6]. 1.4.2.3. Khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân của nấm Trichoderma mà trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân hủy hữu cơ được nhanh chóng. Sử dụng chế phẩm Trichoderma ủ phân hữu cơ để bón cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất. Phân giải nhanh các chất hữu cơ thành dạng dễ tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số nấm bệnh gây hại cho cây trồng, chất lượng phân cao hơn. Chế phẩm nấm Trichoderma được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm rạ, sau đó được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ. Phân hữu cơ được bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng. Kết quả nghiên cứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân hữu cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50% phân hữu cơ với 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46%. Khi bón 100% phân hữu cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trể hơn và ít gây hại cho cây lúa và quần thể vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn so với bón 100% phân vô cơ (Lưu Hồng Mẫn và cộng sự, 2001) [14]. Với những hiệu quả mà chế phẩm Trichoderma mang lại, bà con nông dân nên sử dụng chế phẩm sinh học thay cho việc dùng các loại phân bón hóa học để cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng, góp phần bền vững môi trường đất canh tác nông nghiệp. 40
Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện từ ngày 24 tháng 3 đến ngày 15 tháng 6, tại phòng Nghiên cứu và Phát triển của Công ty TNHH Điền Trang, số 67, Đường 16, Khu phố 4, Phường Cát Lái, Quận 2, TP.HCM. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh 2.2.1.1. Nấm đối kháng Các chủng nấm đối kháng Trichoderma được phân lập từ mẫu đất thu thập tại vườn trồng tiêu thuộc huyện Bù Gia Mập và Bù Đốp, tỉnh Bình Phước. Các chủng nấm Trichoderma sau khi được phân lập sẽ tiến hành khảo sát khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp., Fusarium sp., Phytophthora sp. gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu. 2.2.1.2. Nấm gây bệnh Nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên lá, Fusarium sp. gây bệnh chết chậm, Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu được phân lập từ các vườn hồ tiêu bị nấm bệnh tấn công ở tỉnh Bình Phước. 2.2.2. Trang thiết bị và hóa chất sử dụng Một số trang thiết bị và hóa chất phục vụ cho nghiên cứu đề tài được cung cấp bởi Công ty TNHH Điền Trang. 2.2.3. Môi trường nuôi cấy Môi trường DRBC (Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol) Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) Môi trường CMC (Carboxy methyl cellulose) Môi trường WA (Water Agar). 41
Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu mẫu 2.3.1.1. Thu mẫu đất (Theo TCVN 4046 – 85) Các mẫu đất được lấy trên vườn theo quy tắc đường thẳng góc: Mỗi vườn lấy 5 mẫu, một mẫu ở trung tâm và bốn mẫu ở 4 góc vườn. Ở mỗi điểm chiếu theo rìa tán lá tiêu, đào một hố nhỏ sâu 15 cm, sau đó dùng dao nạo một lớp đất mỏng đều đặn từ trên xuống dưới theo chiều thẳng đứng, lấy khoảng 200 g. Mẫu sau khi lấy được đựng trong bao zip, ghi rõ tên vườn, vị trí cây lấy mẫu, Đánh số vào vị trí cây lấy mẫu. Hình 2.1: Thu mẫu đất 2.3.1.2. Thu mẫu bệnh Các phương lấy mẫu bệnh ở lá, thân và rễ. (QCVN 01 – 172: 2014). Thu mẫu bệnh ở lá Lấy những lá tiêu trên bề mặt xuất hiện những vùng bị nâu vàng hay màu đen với nhiều hình dạng cũng như kích cỡ khác nhau ở khắp mặt lá. Bề mặt bên ngoài vết bệnh có màu vàng ngăn cách giữa phần lá chưa bị bệnh và đã bị bệnh, phần bị bệnh bên trong là những vòng tròn đồng tâm và có những viền đen bao bọc phía bên ngoài. Đựng mẫu rễ trong bao zip, ghi rõ ngày lấy mẫu, ký tự mã hóa mẫu và đánh dấu vị trí cây lấy mẫu. Mẫu lấy về phân lập càng sớm càng tốt, trong trường hợp nếu không phân lập được thì bảo quản trong điều kiện khô ráo ở nhiệt độ 14 – 20oC. 42
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2: Thu mẫu lá tiêu bệnh thán thư Thu mẫu bệnh ở rễ Đào rễ tơ ở độ sâu 15 - 20 cm và cách gốc 20 - 30 cm. Chọn những rễ tơ có triệu chứng các chấm đen, vết thối trên rễ và đầu mút. Dựng mẫu rễ vào bao zip, ghi rõ ngày lấy mẫu, ký hiệu mã hóa mẫu và đánh dấu vị trí cây lấy mẫu. Mẫu lấy về phân lập càng sớm càng tốt, trong trường hợp nếu không phân lập được thì bảo quản trong điều kiện khô ráo ở nhiệt độ 14 – 20oC. Hình 2.3: Lấy mẫu rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm 43
Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Phân lập nấm Trichoderma spp. và nấm bệnh phổ biến trong đất và trên cây hồ tiêu 2.3.2.1. Phân lập nấm Trichoderma spp. trong đất (TCVN 4833 – 89, TCVN 4881 - 89) Quy trình Mẫu đất Trộn đều mẫu Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml nước muối sinh lý Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-2, 10-3 Hút 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào đĩa petri, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Đổ đĩa (môi trường DRBC nguội 40 - 45oC) và lắc đều Ủ ở nhiệt độ phòng từ 2 – 3 ngày Đọc kết quả: đếm khuẩn lạc đặc Chọn các khuẩn lạc đặc trưng,riêng lẻ Làm thuần 44
Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình 30 mẫu đất thu thập từ 6 vườn hồ tiêu thuộc tỉnh Bình Phước (mỗi vườn lấy 5 mẫu), dùng để phân lập nấm Trichoderma spp. theo phương pháp của Aneza (2002). Cân 25 g đất/mẫu cho vào bình tam giác chứa 225 ml nước cất vô trùng, đặt 15 phút trên máy lắc, pha loãng dung dịch mẫu bằng cách lấy 1 ml dung dịch đất cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất vô trùng, đồng nhất mẫu và nước cất bằng máy vortex. Sau đó, tiếp tục pha loãng ra các nồng độ 10-2, 10-3. Dùng micropipette vô trùng riêng cho từng độ pha loãng, hút 1 ml dung dịch mẫu ở mỗi nồng độ 10–1, 10–2, 10–3 vào đĩa petri vô trùng. Mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần. Môi trường DRBC nguội 40 – 45oC, đổ môi trường vào đĩa petri đã hút mẫu. Lắc dàn đều mẫu, đợi bề mặt thạch khô, úp ngược đĩa petri, ủ ở nhiệt độ phòng từ 2 – 3 ngày. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng, riêng lẻ. Tiến hành làm thuần trên môi trường PDA. Theo dõi từng ngày, ủ ở nhiệt độ phòng 4 – 5 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi. Cấy chuyền, tiếp tục làm thuần trên môi trường PDA. 2.3.2.2. Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu Mẫu đất bệnh được thu thập ở các cây hồ tiêu bị bệnh chết nhanh, tiến hành chẩn đoán nhanh sự hiện diện của nấm Phytophthora bằng phương pháp bẫy cánh hoa hồng. Phương pháp được thực hiện như sau: o Thu thập mẫu đất ở gốc cây tiêu bị chết nhanh. o Cân 100 g đất, hòa vào nước cất vô trùng trong cốc tỉ lệ 1 phần đất: 2 phần nước. Khuấy nhẹ đất trong cốc, để lắng xuống trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm). o Cắt cánh hoa hồng (hoa màu hồng hay màu đỏ) có kích thước 0,5 x 0,5 cm thả vào cốc nước. o Để yên cốc qua đêm ở nhiệt độ phòng. 45
Đồ án tốt nghiệp o Quan sát cánh hoa hồng sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày. Khi thấy cánh hoa bị chuyển màu, đem quan sát dưới kính hiển vi. Nếu thấy xuất hiện các bào tử hình trứng có vách mịn, du động bào tử chuyển động trong nước, thì đem đặt cánh hoa hồng lên môi trường WA. o Theo dõi sự phát triển của sợi nấm trên môi trường WA. Tiến hành làm thuần, dùng que cấy lấy ít tơ nấm cấy sang môi trường PDA. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ phòng. Quan sát đĩa cấy nấm Phytophthora mọc hình bông cúc, ít sợi nấm, tơ nấm màu trắng bông xốp. Hình 2.3: Bẫy nấm Phytophthora bằng cánh hoa hồng 2.3.2.3. Phân lập nấm Fusarium gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu Mẫu bệnh được thu thập từ các rễ cây hồ tiêu có triệu chứng thâm đen, hư thối. Sau khi thu mẫu về, tiến hành phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm. Rửa mẫu dưới vòi nước đang chảy để loại bỏ đất và bụi bẩn. Nhúng dụng cụ trong cồn 90o và hơ khô trên ngọn lửa. Khử trùng bề mặt rễ bằng dung dịch Javen 1 % khoảng 10 - 15 giây, sau đó rửa lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng. 46
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4: Rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt rễ thành từng mẫu cấy nhỏ 1 - 2 mm ở phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, sau đó cấy lên môi trường WA. Dùng kẹp ấn nhẹ những mẫu cấy lên mặt thạch gần mép đĩa môi trường. Đặt ngược đĩa cấy để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường ở nhiệt độ phòng trong 3 - 5 ngày cho đến khi tản nấm phát triển, quan sát hàng ngày dưới kính hiển vi để kiểm tra các sợi nấm mọc từ các mẫu cấy. Cấy truyền lên môi trường PDA, làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm. 2.3.2.4. Phân lập nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây hồ tiêu Mẫu bệnh được thu thập từ các lá tiêu có những đốm màu nâu hay đậm dần thành màu đen, rìa vết bệnh có quầng đen. Rửa sạch mẫu lá dưới vòi nước đang chảy. Sau khi rửa sạch có thể nhìn thấy rõ những triệu chứng điển hình của bệnh thán thư. Nhúng các mẫu vào dung dịch cồn 70o để khử trùng bề mặt khoảng 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô trên giấy thấm vô trùng. Nhúng dụng cụ trong cồn 90o và hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng kéo cắt mẫu thành những mẫu cấy nhỏ khoảng 3 – 5 mm, là phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe, cấy vào môi trường WA. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ phòng. Quan sát hàng ngày dưới kính hiển vi để kiểm tra các sợi nấm mọc từ các mẫu cấy. Cấy truyền chúng sang môi trường PDA cho đến khi 47
Đồ án tốt nghiệp thu được nấm thuần. Làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm. Cấy truyền chúng sang môi trường PDA cho đến khi thu được nấm thuần. 2.3.3. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm Hình thái đại thể: Dùng que cấy vô trùng lấy ít sợi nấm, cấy điểm vào giữa đĩa petri có đổ một lớp mỏng môi trường thạch. Ủ ở nhiệt độ phòng, quan sát khuẩn lạc theo từng ngày. Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm: o Kích thước, hình dạng khuẩn lạc để biết tốc độ phát triển của nó. o Màu sắc khuẩn lạc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. o Màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra. o Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên môi trường. o Đặc điểm của mép khuẩn lạc. o Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt khuẩn lạc. Hình thái vi thể: Dùng phương pháp phòng ẩm. Chuẩn bị môi trường thích hợp, đổ vào các đĩa petri. Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa petri. Sau đó, đặt ba thanh đũa tre lên đĩa rồi đặt lame lên ba thanh đũa tre. Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm đã làm thuần cấy vào 4 mặt bên của khối thạch. Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử. Lấy lam ra, nhuộm nấm bằng phương pháp nhuộm methylene blue. Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 20X về các đặc điểm sau: o Hình dạng cuống sinh bào tử. o Hình dạng thể bình. o Hình dạng các thể bọng. 48
Đồ án tốt nghiệp o Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. o Đặc điểm bào tử đính, Màu sắc, kích thước bào tử. 2.3.4. Xác định hoạt tính cellulose: Phương pháp khuếch tán trên thạch Nguyên tắc Cellulase tác động lên cơ chất CMC trong môi trường thạch. CMC bị phân hủy thành các đường khử làm độ đục của môi trường bị giảm và trở nên trong suốt khi nhuộm bằng Lugol. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh hoạt tính của enzyme. Tiến hành Dùng que cấy vô trùng lấy ít sợi nấm Trichoderma từ đĩa môi trường PDA đã được làm thuần, rồi cấy 1 điểm lên tâm đĩa môi trường CMC và ủ 4 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau 4 ngày, đổ dung dịch lugol vào đĩa môi trường CMC nuôi cấy nấm, để yên 5 phút rồi đổ lugol thừa ra và tiến hành đo đường kính vòng phân giải. Ở mỗi chủng, tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần. Xác định khả năng sinh enzyme cellulase bằng cách đo kích thước vòng phân giải và kích thước tản nấm [8]. o D – d ≥ 25 mm: hoạt tính enzyme rất mạnh. o D – d ≥ 20 mm: hoạt tính enzyme mạnh. o D – d ≥ 15 mm: hoạt tính enzyme trung bình. o D – d ≥ 10 mm: hoạt tính enzyme yếu. Trong đó: D: đường kính vòng phân giải CMC (mm). d: đường kính phát triển của tản nấm sau 4 ngày (mm). 2.3.5. Xác định khả năng đối kháng Phương pháp đồng nuôi cấy: Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với các chủng nấm gây bệnh trong điều kiện in vitro được đánh giá bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường PDA. Các tương tác nhóm đã được khảo nghiệm bằng 49
Đồ án tốt nghiệp phần trăm phát triển của vòng ức chế theo công thức sau (Fokkema, 1976; Dhanasekaran và cộng sự, 2012): Trong đó: RĐC: Bán kính vòng phát triển của nấm gây bệnh trên đĩa đối chứng (mm) RĐK: Bán kính vòng phát triển của nấm gây bệnh trên đĩa đối kháng (mm) Mức độ đối kháng của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh được phân thành 4 cấp và đánh giá mức độ kháng (Trần Kim Loang và cộng sự, 2009). Tóm tắt như sau: o Đối kháng cao (+++): Nấm Trichoderma ức chế nấm gây bệnh ≥60%. o Đối kháng trung bình (++): Nấm Trichoderma ức chế nấm gây bệnh ≥40-59. o Đối kháng yếu (+): Nấm Trichoderma ức chế nấm gây bệnh ≤40-20. o Không đối kháng (-): Nấm Trichoderma ức chế nấm gây bệnh ≤19. 2.3.6. Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu. 2.3.6.1. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Phytophthora sp. (phân lập trong mẫu đất trồng tiêu). 34 chủng nấm Trichoderma đựợc đánh giá khả năng đối kháng đối với sự phát triển của nấm Phytophthora sp. gây hại ở cây hồ tiêu trên môi trường PDA, trong điều kiện phòng thí nghiệm. Khuẩn ty nấm Trichoderma và Phytophthora sp. (đường kính 0,5 cm) được cấy trên môi trường PDA trong đĩa petri ở hai vị trí đối diện, trong đó khoảng cách giữa 2 dòng nấm là 7 cm và vị trí cấy khuẩn ty tính cạnh đĩa petri là 1 cm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 34 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. Chỉ tiêu theo dõi Ghi nhận bán kính khuẩn ty nấm Trichoderma và Phytophthora sp. ở các thời điểm 2, 3, 4, 5, 7, 9 và 11 ngày sau khi cấy. 50
Đồ án tốt nghiệp 2.3.6.2. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Fusarium sp. (phân lập từ rễ cây tiêu bị bệnh chết chậm) 34 chủng nấm Trichoderma đựợc đánh giá khả năng đối kháng đối với sự phát triển của nấm Fusarium gây hại ở cây hồ tiêu trên môi trường dinh dưỡng PDA, trong điều kiện phòng thí nghiệm. Khuẩn ty nấm Trichoderma và Fusarium (đường kính 0,5 cm) được cấy trên môi trường PDA trong đĩa petri ở hai vị trí đối diện, trong đó khoảng cách giữa 2 dòng nấm là 7 cm và vị trí cấy khuẩn ty tính cạnh đĩa petri là 1 cm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 34 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. Chỉ tiêu theo dõi Ghi nhận bán kính khuẩn ty nấm Trichoderma và Fusarium sp. ở các thời điểm 2, 3, 4, 5, 7, 9 và 11 ngày sau khi cấy. 2.3.6.3. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Colletotrichum sp. (phân lập từ lá cây hồ tiêu bị bệnh thán thư) 34 chủng nấm Trichoderma đựợc đánh giá khả năng đối kháng đối với sự phát triển của nấm Colletotrichum gây hại ở cây hồ tiêu trên môi trường PDA, trong điều kiện phòng thí nghiệm. Khuẩn ty nấm Trichoderma và Colletrotrichum sp. (đường kính 0,5 cm) được cấy trên môi trường PDA trong đĩa petri ở hai vị trí đối diện, trong đó khoảng cách giữa 2 dòng nấm là 7 cm và vị trí cấy khuẩn ty tính cạnh đĩa petri là 1cm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 34 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. Chỉ tiêu theo dõi Ghi nhận bán kính khuẩn ty nấm Trichoderma và Colletotrichum sp. ở các thời điểm 2, 3, 4, 5, 7, 9 và 11 ngày sau khi cấy. 2.3.7. Phương pháp phân tích số liệu Tất cả số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 và SAS (Statistical Analysis System) 9.1 51
Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập nấm Trichoderma spp. Xác định những vườn cần lấy mẫu, tiến hành thu thập mẫu đất và phân lập nấm Trichoderma trên môi trường DRBC. Hình. 3.1: Nấm Trichoderma trên môi trường DRBC sau 3 ngày. Dựa trên mô tả đặc điểm hình thái điển hình của nấm Trichoderma của Gary J. Samuels (2004). Có 75 chủng nấm Trichoderma được phân lập từ 30 mẫu đất (mỗi vườn lấy 5 mẫu). Bảng 3.1: Mật số nấm Trichoderma trong đất Bình Phước Vƣờn BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 BP6 Mật số Trichoderma 1070 1990 2440 890 222 465 (CFU/g) Bảng 3.2: Số chủng Trichoderma bắt ra ở mỗi vườn Vƣờn BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 BP6 Số chủng Trichoderma đƣợc 19 15 24 3 9 5 phân lập trong mỗi vƣờn 52
Đồ án tốt nghiệp Nhận xét: - Mặc dù các vườn được lấy mẫu ở các điều kiện tự nhiên khác nhau, tuy nhiên tất cả các vườn đều có sự hiện diện Trichoderma. Từ đó cho thấy, Trichoderma là giống vi nấm phân bố rộng rãi trong tự nhiên, thích hợp với nhiều điều kiện. Bên cạnh đó, kết quả phân lập cho thấy có nhiều trường hợp phân lập cùng 1 chủng Trichoderma nhưng hiện diện trong 2 vườn. Điều này chứng tỏ các chủng Trichoderma có thể tồn tại trong nhiều khu vực địa lí khác nhau. Kết quả này phù hợp với nhận định của Turner và cộng sự (1997). - Giữa các vườn có sự lặp lại các chủng Trichoderma nên dựa vào hình thái đại thể và hình thái vi thể, người thực hiện đề tài bắt được 34 chủng có đặc điểm hình thái khác nhau trong tổng số 75 chủng Trichoderma phân lập từ 30 mẫu đất (phụ lục 1). Hình 3.2: Hình thái đại thể và vi thể của nấm Trichoderma sp. phân lập từ đất 53
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3: Các chủng nấm Trichoderma spp. phân lập từ các mẫu đất của tỉnh Bình Phước Trichoderna spp. phân lập Trichoderna spp. phân lập STT tại huyện Bù Gia Mập tại huyện Bù Đốp Vƣờn 1 Vƣờn 2 Vƣờn 3 Vƣờn 4 Vƣờn 5 1 BP1_01.1 BP2_02.4 BP3_01.1 BP4_01.1 BP5_03 2 BP1_01.3 BP2_03.3 BP3_01.2 _ BP5_B.2 3 BP1_02 BP2_03.4 BP3_01.3 _ _ 4 BP1_02.3 BP2_03.5 BP3_02.1 _ _ 5 BP1_04.1 BP2_04.2 BP3_02.2 _ _ 6 BP1_04.3 BP2_04.3 BP3_02.3 _ _ 7 BP1_B BP2_04.4 BP3_02.4 _ _ 8 _ BP2_B.1 BP3_02.5 _ _ 9 _ BP2_B.2 BP3_03.3 _ _ 10 _ _ BP3_03.4 _ _ 11 _ _ BP3_04.2 _ _ 12 _ _ BP3_04.3 _ _ 13 _ _ BP3_04.5 _ _ 14 _ _ BP3_B.4 _ _ 15 _ _ BP3_B.7 _ _ 54
Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả phân lập nấm bệnh 3.2.1. Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp. Hình 3.3: Cánh hoa hồng bị chuyển màu và đặt trên môi trường WA Sau 2 – 3 ngày bẫy Phytophthora, có 23 mẫu đất làm cánh hoa hồng chuyển màu. (Trong đó, vườn BP1, BP2, BP3, BP4 có tất cả mẫu đất đều làm chuyển màu cánh hoa hồng). Đặt các mẫu cánh hoa hồng đã chuyển màu lên môi trường WA), sau 4 ngày đĩa nấm bệnh xuất hiện sợi nấm mọc lên. Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm mọc trên môi trường WA, cấy điểm sang đĩa môi trường PDA. Sau 2 ngày thu được khuẩn lạc nấm Phytophthora sp. có những đặc điểm (Hình 3.4) như: màu trắng, mọc tỏa ra theo hình bông cúc. Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu Lê Quang Luân, 2014. Hình 3.4: Nấm Phytophthora sp. trên trường PDA 55
Đồ án tốt nghiệp Để khẳng định mẫu nấm thu được là Phytophthora sp. tiếp tục xem dưới kính hiển vi. Kết quả nhận thấy du động bào tử (Hình 3.5 A) và bào tử (Hình 3.5 B), so sánh với mô tả của Nguyễn Vĩnh Trường (2008) đây chính là nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu. A B Hình 3.5: Bào tử (A) và các du động bào tử (B) của nấm Phytophthora sp. dưới hính hiển vi 3.2.2. Kết quả phân lập nấm Fusarium sp. Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh trên môi trường WA, từ mẫu bệnh xuất hiện sợi nấm mọc ra và lan ra môi trường (Hình 3.6). Hình 3.6: Nấm Fusarium sp. trên môi trường WA Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm trên môi trường WA, cấy điểm sang đĩa môi trường PDA, tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 5 – 7 ngày thu được khuẩn lạc 56
Đồ án tốt nghiệp nấm Fusarium sp. có những đặc điểm (Hình 3.7) như: màu trắng nhạt, mọc tỏa ra theo cấu trúc hình tròn, bề mặt khuẩn lạc xốp. Hình 3.7: Nấm Fusarium sp. trên môi trường PDA Để khẳng định mẫu nấm thu được là Fusarium sp., tiếp tục quan sát dưới kính hiển vi. Kết quả quan sát cho thấy đại bào tử (Hình 3.8 A) có dạng hình liềm và tiểu bào tử (Hình 3.8 B) có dạng hình chùy. Như vậy, các đặc điểm hình thái đại thể và hình thái vi thể của nấm tương đồng với các đặc điểm của Fusarium gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu. Hình 3.8: Đại bào tử (A) và các tiểu bào tử (B) của nấm Fusarium sp. 3.2.3. Kết quả phân lập nấm Colletotrichum sp. Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh trên môi trường WA, từ mẫu bệnh xuất hiện sợi nấm mọc ra và lan ra môi trường (Hình 3.9). 57
Đồ án tốt nghiệp Tơ nấm Colletotrichum sp. Hình 3.9: Tơ nấm Colletotrichum sp. phát triển từ mẫu lá bệnh Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm trên môi trường WA, cấy điểm sang đĩa môi trường PDA, tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 5 – 7 ngày thu được khuẩn lạc nấm Colletotrichum sp. có những đặc điểm (Hình 3.10) như: màu trắng sữa, mọc tỏa ra theo cấu trúc hình tròn, giữa tản nấm phồng lên và xẹp dần về phía mép, kết quả này cũng tương tự nghiên cứu Phạm Đình Quân (2009). Hình 3.10: Nấm Colletotrichum sp. trên môi trường PDA Để khẳng định mẫu nấm thu được là Colletotrichum sp., tiếp tục quan sát dưới kính hiển vi. Kết quả quan sát thấy bào tử (Hình 3.11) có dạng hình trụ, so sánh với mô tả của Trần Thị Hà Giang (2014) đây chính là nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây hồ tiêu. 58
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11: Bào tử nấm Colletotrichum sp. 59
Đồ án tốt nghiệp 3.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng nấm Trichoderma 30 25.7a 25 20 15 10.7bc 12.5b bcd 10.2bcde 10.3 10bcdef 9.3bcdefg 7.7cdefg 9.2bcdefg 10 7defghi efghij 4.7hijklm 6.7 ghijk defghi ghijk 5.8ghijk 6 hijklmn 7 ghijk 6 5.5hijkl 5.5hijkl 4.5 4ijklmn 4.3hijklmn 6.5 5hijklm 5hijklm hijklmn ijklmn 4.5 3.5ijklmn jklmn 5 3.3jklmn 3.5 3klmn 3.3 2lmn mn 1n 1n 1.5 0 Biểu đồ 3.1 Đường kính phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp. 61
Đồ án tốt nghiệp Khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật là một trong những yếu tố quyết định khả năng phân giải các chất hữu cơ. Kết quả quan sát đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma phân lập được ở biểu đồ 3.1 cho thấy, tất các chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase phân giải cellulose. Nhưng nhìn chung khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng Trichoderma khảo sát đều yếu và rất yếu. Trong đó, chủng Trichoderma BP3_B4 và BP3_B7 có đường kính vòng phân giải chỉ 1 mm. Bên cạnh các chủng có khả năng sinh enzyme cellulose yếu, chủng Trichoderma BP3_03.4 lại có khả năng phân giải cellulose mạnh, đường kính vòng phân giải là 25,7 mm. Hình 3.12: Khả năng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp. 62
Đồ án tốt nghiệp 3.4. Đánh giá khả năng đối kháng Trichoderma spp. với nấm bệnh đã đƣợc phân lập 3.4.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm Trichoderma spp. phân lập từ đất Hình 3.13: Hình thái chủng nấm Trichoderma sp. phát triển qua các ngày 63
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4: Bán kính tản nấm Trichoderma spp. sau các ngày nuôi cấy Bán kính tản nấm Trichodema spp. (cm) sau các ngày Các chủng nuôi cấy Trichoderma 3NSC 4NSC 5NSC ef cde a BP1_01.1 45,7 70,7 80 d cd a BP1_01.3 52,7 72,0 80 efghi abc a BP1_02 43,7 75,0 80 d bcd a BP1_04.1 51,0 72,3 80 ghij jklm c BP1_02.3 41,7 56,0 73,0 d bcd a BP1_04.3 50,7 73,3 80 e abc a BP1_B 46,3 75,7 80 cd ab a BP2_02.4 53,7 78,0 80 efghi klm cd BP2_03.3 43,0 54,0 70,3 b a a BP2_03.4 61,7 80,0 80 efg bcd a BP2_03.5 45,3 72,7 80 k lm d BP2_04.2 37,0 52,7 65,0 b a a BP2_04.3 65,3 80,0 80 l n e BP2_04.4 31,3 43,7 58,3 c a a BP2_B.1 57,0 80,0 80 a a a BP2_B.2 80,0 80,0 80 efgh fgh a BP3_01.1 44,7 63,3 80 hij m cd BP3_01.2 41,0 50,7 70,3 l n e BP3_01.3 32,0 42,7 55,3 ijk hijkl c BP3_02.1 40,7 58,0 72 efghij hijkl ab BP3_02.2 42,7 58,0 78,9 jk ijkl a BP3_02.3 39,0 57,3 80 64
Đồ án tốt nghiệp hij fghi a BP3_02.4 41,0 62,3 80 cd a a BP3_02.5 54,3 80,0 80 fghij ghij a BP3_03.4 42,0 61,0 80 e cd a BP3_03.3 46,0 71,0 80 hij hijkl bc BP3_04.2 41,0 58,0 74,3 efghi fg a BP3_04.3 44,0 64,7 80 ef hijkl a BP3_04.5 45,7 58,0 80 hij def a BP3_B.4 41,3 68,0 80 efghi ghijk a BP3_B.7 43,3 59,7 80 cd bc a BP4_01.1 53,3 74,0 80 efghi efg a BP5_03 44,0 65,0 80 ghij hijk a BP5_B.2 41,7 58,7 80 Sự tăng trưởng của nấm là một chỉ tiêu quan trọng để lựa chọn chủng vi sinh vật ứng dụng tạo chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy đa số các chủng Trichoderma đều phát triển rất nhanh trên môi trường PDA. Sau 5 ngày nuôi cấy, tản nấm phát triển đầy đĩa với bán kính 80 (mm). Đặc biệt chủng Trichoderma BP2_B.2 có tốc độ tăng trưởng cao nhất, tản nấm phát triển đầy đĩa chỉ sau 3 ngày nuôi cấy. Nhưng bên cạnh đó, vẫn có những chủng Trichoderma như BP2_04.2, BP2_04.4 và BP3_01.3 mà người thực hiện đề tài phân lập có khả năng sinh trưởng yếu. Sau 5 ngày nuôi cấy, bán kính tăng trưởng trung bình sau 3 lần khảo sát chỉ đạt gần 65 mm. 65
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14: Các chủng Trichoderma có khả năng phủ kín đĩa sau 4 ngày nuôi cấy 66
Đồ án tốt nghiệp 3.4.2. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu Hình 3.15: Trichoderma sp. đối kháng với Phytophthora sp. theo dõi qua các ngày 67
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Phytophthora sp. sau các ngày theo dõi Các chủng Tỉ lệ đối kháng (%) sau các ngày theo dõi Trichoderma 3NSC 4NSC 5NSC 55,9cd 74,7bc 81,1bcd BP1_01.1 44,7gh 71,1cd 78,2def BP1_01.3 46,4fgh 61,3f 74,8efg BP1_02 52de 73,3bc 81,5bcd BP1_04.1 44,7gh 59,6fg 70,0hij BP1_02.3 55,3cd 74,7bc 85,2b BP1_04.3 49,2ef 61,8f 78,2def BP1_B 47,5fg 67,6de 79,2cde BP2_02.4 43,0hi 61,8f 70,4ghij BP2_03.3 62,1b 73,8bc 82,9bc BP2_03.4 51,9de 67,1e 78,5cdef BP2_03.5 31,6lmn 58,2fg 67,0jkl BP2_04.2 48,6efg 59,6fg 66,3jklm BP2_04.3 24,8o 48,4mno 57,4pq BP2_04.4 46,9fhg 75,5b 79,6cd BP2_B.1 74,0a 100a 100a BP2_B.2 36,2ik 52,9ijk 66,7jkl BP3_01.1 39,6ij 56,4ghi 66,3jklm BP3_01.2 34,5klm 49,3klmno 59,3opq BP3_01.3 35,0klm 50,2jklmn 61,1nop BP3_02.1 32,8klmn 49,3klmno 58,2pq BP3_02.2 68
Đồ án tốt nghiệp 36,2kj 57,3gh 74,3fgh BP3_02.3 34,5kml 51,6jklm 61,5nop BP3_02.4 39,5ij 53,8hij 63,3lmno BP3_02.5 35,6ikl 52,4jkl 68,9ijk BP3_03.4 29,4n 46,2o 55,6q BP3_03.3 31,6lmn 46,7no 56,3q BP3_04.2 36,2jk 53,3ij 64,0lmn BP3_04.3 33,3klmn 50,7jklm 64,4klmn BP3_04.5 31,1mn 58,7fg 73,0ghi BP3_B.4 36,7jk 51,1jklm 61,1nop BP3_B.7 54,5c 72,0bc 79,6cd BP4_01.1 31,6lmn 48,9lmno 61,5nop BP5_03 36,7jk 52,0jklm 61,8mnop BP5_B.2 69
Đồ án tốt nghiệp 120 100a 100 81.1bcd b bc bcd 85.2 79.2cde 82.9 ghi 81.5 cdef 73 def 78.5 cd jkl cd 78.2 78.2def 79.6 66.7 ijk klmn 79.6 80 efg 67jkl 74.3fgh 68.9 64.4 74.8 hij 70.4ghij 66.3jklm mnop 70 66.3jklm nop 63.3lmno lmn 61.8 61.1 64 nop 59.3opq 61.5nop 56.3q 61.1 61.5nop pq 58.2pq 60 57.4 55.7q 40 20 0 Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ (%) đối kháng của nấm Trichoderma spp. với nấm Phytophthora sp. 5 NSC 70
Đồ án tốt nghiệp Khả năng đối kháng là chỉ tiêu quyết định và là yếu tố quan trọng nhất thể hiện hiệu quả ức chế của vi sinh vật trong phòng trừ bệnh hại cây trồng. Tỷ lệ đối kháng của các chủng Trichoderma khảo sát được trình bày ở bảng 3.5 cho thấy các chủng Trichoderma phân lập được trong đất Bình Phước đều có khả năng ức chế nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sau 4 ngày nuôi cấy, chủng nấm Trichoderma BP2_B.2 có khả năng ức chế 100 % nấm Phytophthora sp. theo cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, nhờ vào tốc độ phát triển nhanh. Sau 11 ngày nuôi cấy, 8 chủng Trichoderma khác là BP1_01.1, BP1_04.1, BP1_04.3, BP1_B, BP2_02.4, BP2_03.4, BP2_B.1 và BP4_01.1 cũng có khả năng đối kháng 100 % nấm Phytophthora sp (Phụ lục 2). Bên cạnh đó, ngoài khả năng cạnh tranh dinh dưỡng thì sự đối kháng nấm bệnh còn phụ thuộc vào khả năng tiết kháng sinh, enzyme chitinase và các yếu tố cơ học khác. ĐC Hình 3.16: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Phytophthora sp. và đĩa nấm Phytophthora sp. sau 7 ngày nuôi cấy 71
Đồ án tốt nghiệp 3.4.3. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Fusarium sp. gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu Hình 3.17: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với Fusarium sp. theo dõi qua các ngày. 72
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Fusarium sp. sau các ngày theo dõi Các chủng Tỉ lệ (%) đối kháng sau các ngày theo dõi Trichoderma 3NSC 5NSC 7NSC 12,1cdefg 36,4ijklm 52,0efghij BP1_01.1 15,1bcde 37,1hijkl 52,0efghij BP1_01.3 10,6cdefg 41,2fghi 53,5defghij BP1_02 12,1cdefg 37,2hijkl 52,3defghij BP1_04.1 15,1bcde 34,3klmn 47,3ijk BP1_02.3 16,7bcd 43,1defgh 56,6defgh BP1_04.3 13,6cdef 42,2efghi 53,5defghij BP1_B 15,1bcde 44,0cdefg 57,4defg BP2_02.4 13,6cdef 34,3jkml 48,1hijk BP2_03.3 15,1bcde 48,1cde 61,2cd BP2_03.4 12,1cdefg 40,2fghij 55,8defghi BP2_03.5 10,7cdefg 27,4no 40,3kl BP2_04.2 22,7b 50,0c 60,5de BP2_04.3 12,1cdefg 19,6p 38,0l BP2_04.4 12,1cdefg 44,1cdefg 69,7bc BP2_B.1 100a 100a 100a BP2_B.2 15,1bcde 49,0cd 59,7def BP3_01.1 9,1defg 25,5op 75,2b BP3_01.2 10,7cdefg 31,4lmno 45,7jkl BP3_01.3 15,1bcde 37,3hijkl 51,2fghij BP3_02.1 15,2bcde 30,4mno 49,6ghij BP3_02.2 73
Đồ án tốt nghiệp 6,0fg 42,1efghi 55,0defghi BP3_02.3 12,1cdefg 46,1cdef 58,1defg BP3_02.4 7,6efg 100a 100a BP3_02.5 12,1cdefg 32,4lmn 48,0hijk BP3_03.4 10,7cdefg 71,6b 100a BP3_03.3 12,1cdefg 32,4lmn 48,0hijk BP3_04.2 12,1cdefg 43,1defgh 50,7ghij BP3_04.3 4,5g 34,3jklm 51,2fghij BP3_04.5 9,1defg 41,2fghi 57,3defg BP3_B.4 16,2bcd 39,2ghijk 52,0efghij BP3_B.7 10,7cdefg 42,2efghi 55,0defghi BP4_01.1 18,2bc 49,0cd 77,5b BP5_03 12,1cdefg 48,1cde 59,7def BP5_B.2 Kết quả đánh giá tính đối kháng của các chủng Trichoderma spp. phân lập trong đất Bình Phước đối với nấm Fusarium sp. gây bệnh chết chậm ở cây hồ tiêu trên môi trường dinh dưỡng PDA (Bảng 4.4 và Hình 4.5) cho thấy, các chủng Trichoderma spp. đều có khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp. ở thời điểm sau 7 ngày nuôi câý. Phần lớn các chủng Trichoderma đối kháng nấm Fusarium sp. ở mức độ trung bình từ 40 – 59 %. Nhưng bên cạnh đó vẫn có các chủng có khả năng đối kháng cao lên đến 100 % như BP2_B.2 sau 3 ngày nuôi cấy và BP3_03.3, BP3_2.5 sau 7 ngày nuôi cấy. 74
Đồ án tốt nghiệp 120 100a 100a 100a 100 b 80 75.2b 77.5 bc 69.7 defg efghij cd 58.1 52 61.2 de 57.3defg defg 60.5 def 51.2fghij def efghij defgh57.4 59.7 55defghi 59.7 52 56.6 defghi 51.2fghij defghi 60 defghij defghij 55.8 55 52.3 53.5 49.6ghij ghij defghij 45.7jkl hijk 50.7 53.5 48.1hijk 48 52efghij 47.3ijk kl 48hijk 40.3 38l 40 20 0 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ (%) đối kháng của Trichoderma spp. với Fusarium sp. 7 NSC 75
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.18: Chủng Trichoderma spp. có khả năng đối kháng cao với nấm Fusarium sp. và đĩa nấm bệnh Fusarium sp. sau 7 ngày nuôi cấy 76
Đồ án tốt nghiệp 3.4.4. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây tiêu Hình 3.19: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. 77
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7: Tỷ lệ (%) đối kháng nấm Trichoderma spp. đối với nấm Colletotrichum sp. qua các ngày theo dõi Các chủng Tỉ lệ đối kháng (%) sau các ngày theo dõi Trichoderma 3NSC 5NSC 7NSC 6,4ghi 59,8cde 69,6de BP1_01.1 1,6i 49,0ijkl 68,2def BP1_01.3 6,3ghi 51,0ghijkl 63,7efghij BP1_02 9,5fgh 53,9efghij 67,4defg BP1_04.1 0,0i 41,2mn 57,1hijk BP1_02.3 1,6i 50,0hijkl 100,0a BP1_04.3 6,4ghi 59,8cde 69,6de BP1_B 6,3ghi 51,0ghijkl 64,4defghi BP2_02.4 3,2hi 45,1lm 57,8ghijk BP2_03.3 0,0i 48,1jkl 100,0a BP2_03.4 1,6i 54,9defghi 74,1cd BP2_03.5 0,0i 33,4o 51,8kl BP2_04.2 20,6bcd 55,9defgh 66,7defgh BP2_04.3 1,6i 22,5p 42,2lm BP2_04.4 0,0i 52,0fghijk 65,9defgh BP2_B.1 100,0a 100,0a 100,0a BP2_B.2 22,2bc 57,2defg 70,4de BP3_01.1 12,7efg 52,0fghijk 83,6bc BP3_01.2 20,6bcd 60,8cd 83,7bc BP3_01.3 22,2bc 49,0ijkl 62,2efghij BP3_02.1 19,0bcde 52,9fghij 85,9b BP3_02.2 78
Đồ án tốt nghiệp 20,6bcd 51,9fghijk 65,9defgh BP3_02.3 17,5cde 46,1klm 62,9efghij BP3_02.4 17,4cde 67,7bc 100,0a BP3_02.5 20,6bcd 57,8cdef 58,8fghijk BP3_03.4 14,3def 48,1jkl 56,9hijk BP3_03.3 20,6bcd 37,2no 39,2m BP3_04.2 25,4b 54,9defghi 100,0a BP3_04.3 22,2bc 59,8cde 69,6de BP3_04.5 17,5cde 48,1jkl 56,9hijk BP3_B.4 20,6bcd 48,1jkl 54,9ijk BP3_B.7 3,2hi 49,0ijkl 49,0klm BP4_01.1 20,6bcd 67,6b 71,6de BP5_03 20,6bcd 53,9efghij 53,9jk BP5_B.2 79