›

Đồ án Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống

pdf 111 trang thiennha21 12/04/2022 3040
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_danh_gia_bien_di_di_truyen_cac_nhom_tom_su_penaeus_mon.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ BIẾN DỊ DI TRUYỀN CÁC NHÓM TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) LÀM VẬT LIỆU BAN ĐẦU CHO CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.s Bùi Thị Liên Hà Sinh viên thực hiện : Trần Thị Thanh Trúc MSSV: 115 111 0388 Lớp: 11DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Nhóm thực hiện đồ án với đề tài “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống” cam đoan rằng nội dung trong đồ án này là do nhóm thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của Th.s Bùi Thị Liên Hà – cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viên Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là hoàn toàn trung thực chưa từng được ai sử dụng để công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi tham khảo dùng trong đồ án này được trích dẫn rõ ràng, tên tác giả, tên công trình, thời gian và địa điểm công bố. Mọi hành vi sao chép không hợp lệ hay vi phạm quy chế đào tạo, nhóm thực hiện đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Sinh viên Trần Thị Thanh Trúc i
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Qua thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II, em đã học hỏi được nhiều kinh nghiệm, kiến thức thực tiễn cũng như được thực hành trên các thiết bị hiện đại mà em đã được học trên lý thuyết. Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Th.s Phạm Minh Nhựt đã tạo điều kiện cho em có cơ hội được thực tập tốt nghiệp tại Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến với các quý thầy cô trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đặc biệt là thầy cô thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã tận tình giảng dạy, trang bị kiến thức giúp em nắm bắt và chủ động trong quá trình thực tập. Em xin trân trọng cảm ơn chị Th.s Bùi Thị Liên Hà cùng các anh chị đang công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy sản II đã trực tiếp hướng dẫn cũng như tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập. Và cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh và ủng hộ em vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt bài báo cáo này. Tuy đã rất cố gắng nhưng không tránh khỏi thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý quý báu từ quý thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn. ii
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ HÌNH ẢNH x MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 1.1 Giới thiệu về tôm sú 8 1.1.1 Vị trí phân loại 8 1.1.2 Phân bố 8 1.1.3 Đặc điểm hình thái cấu tạo 9 1.1.4 Chu kì phát triển. 10 1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng. 12 1.1.6 Đặc điểm về sinh trưởng, sinh sản và phát triển. 13 1.1.7 Tình hình nuôi trồng tôm sú ở thế giới. 14 1.1.8 Tình hình nuôi trông tôm sú ở Việt Nam. 14 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 15 1.2.1. Đa dạng di truyền. 15 1.2.2. Quần thể 16 1.2.3 Nguyên nhân xuất hiện đa dạng di truyền trong quần thể. 17 1.2.4 Ý nghĩa của đa dạng di truyền trong nuôi trồng thủy sản. 18 1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE 19 1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật Microsatellite 19 1.3.2 Tính chất 20 1.3.3. Ưu - nhược điểm của microsatellite 20 1.3.4 Các loại Microsatellite 21 1.3.5. Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite 22 iii
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.3.5.1. Cơ chế hình thành Microsatellite 22 1.3.5.2 Vai trò của Microsatellite 22 1.3.6. Các phương pháp phát hiện Microsatellite 23 1.3.6.1. Phương pháp lai 24 1.3.6.2. Phương pháp PCR 24 1.3.6.3. Phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite 25 1.4. ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ 28 1.5 KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 29 1.5.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR 29 1.5.2 Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR 30 2.6 KỸ THUẬT ĐIỆN DI 31 2.6.1 Điện di trên gel agarose. 31 2.6.1.1 Khái niệm 31 2.6.1.2 Các bước thực hiện 32 2.6.2 Điện di mao quản Capillary Electrophoresis (CE) 33 2.6.2.1. Nguyên tắc 33 2.6.2.2. Cơ chế điện di 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 2.1 Vật liệu 35 2.1.1 Vật liệu sinh học 35 2.1.2 Hóa chất 36 2.1.2.1 Mồi (primer) 36 2.1.2.2 Thang (ladder) 38 2.1.2.3.Hóa chất ly trích DNA. 38 2.1.2.4. Hóa chất chạy PCR 38 2.1.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose 39 2.1.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản 39 2.1.2.7. Dụng cụ thí nghiệm 39 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.2.1 Phương pháp trích ly DNA tổng số 40 2.2.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA 43 2.2.3 Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR và khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite 44 2.2.3.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite 45 2.2.3.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 47 2.2.3.3 Khảo sát hàm lượng DNA khuôn 48 2.2.3.4 Khảo sát tính ổn định của quy trình PCR. 49 2.3. Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các phần mềm Cervus, Fstat, Genepop . 50 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Kết quả trích ly DNA 53 3.2 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite 55 3.2.1 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite W1 trên bốn mẫu tôm A09, T30, G30, N03 đại diện cho bốn vùng Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. 55 3.2.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite P1 trên bốn mẫu tôm A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa 56 3.2.3. Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite L1 trên bốn mẫu tôm A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. 57 3.3 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu 59 3.3.1 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite W1. 60 3.3.2 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite P1. 60 3.3.3. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite L1. 61 3.3.4. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite N1 62 3.4. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn. 64 3.4.1. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite W1 64 3.4.2. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite L1 65 3.4.3. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite P1 66 v
  7. Đồ án tốt nghiệp 3.4.4. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite N1 67 3.5. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR và sàng lọc các cặp mồi microsatellite. 69 3.5.1. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR 69 3.5.2 Sàng lọc các cặp mồi microsatellite 72 3.6 Kết quả phân tích đa dạng di truyền của bốn quần đàn tôm sú 74 3.6.1 Kết quả thông tin đa hình của 4 quần đàn tôm sú: Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. 74 3.6.2 Sự khác biệt di truyền của các quần đàn mẫu phân tích 78 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80 4.1 Kết luận 81 4.2 Kiến nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 Tài liệu tiếng việt 83 Tài tiệu tiếng anh 85 Tài liệu internet 87 PHỤ LỤC A A1 PHỤ LỤC B B1 vi
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT μl : Microlite μM : Micromol/lite μg : Microgram Ar : Allelic richness (mức độ phong phú alen) bp : Base pair ctv : cộng tác viên TP HCM : Thành phố Hồ Chí Minh DMSO : Dimethyl sulfoxide DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid GTE : Glucose-Tris-EDTA He : Expected heterozygosity (dị hợp tử mong đợi) Ho : Observed heterrozygosity (dị hợp tử phát hiện) HWE : Cân bằng Hardy - Weinberg ISSR : Inter Simple Sequence Repeats M : Ladder DNA (thang DNA) Marker : Chỉ thị mM : Milimolar (milimol/lite) Na : Number of alleles per locus (số lƣợng alen trên locus) NS : không khác biệt có ý nghĩa NST : Nhiễm sắc thể PCR : Polymerase chain reaction CE : Capillary Electropherosis (Điện di mao quản) EOF : Electro – Osmotic Flow xi vii
  9. Đồ án tốt nghiệp EFF : Electric Field Force PIC : Polymorphic Information Content (thông tin đa hình) SDS : Sodium Dodecyl Sulphate SSR : Single sequence repeat - Microsatellite STE : Sodium Chloride-Tris-EDTA RE : Restristion Enzyme (enzyme cắt giới hạn) Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp) TBE : Tris Borate EDTA Tm : Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy) VNCNTTS II : Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II VNTR : Variable Number Tamdem Repeat viii
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách 137 mẫu tôm sú. 35 Bảng 2.2 Thông tin các cặp mồi. 37 Bảng 2.3 Gradient nhiệt độ lai cho 15 cặp mồi microsatellite 46 Bảng 2.4. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite 47 Bảng 2.5. Hàm lượng DNA khuôn khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite 48 Bảng 2.6. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi microsatellite, DNA khuôn, Taq polymerase cho một phản ứng PCR. 49 Bảng 3.1.Kết quả đo OD kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của DNA 54 Bảng 3.2. Nhiệt độ bắt cặp (Ta) sau khi tối ưu của 15 cặp mồi microsatellite 59 Bảng 3.3. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 15 cặp mồi microsatellite 64 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của 15 cặp mồi microsatellite 69 Bảng 3.5. Hiệu suất PCR và số allen của 15 cặp mồi microsatellite trên 28 mẫu DNA tôm sú. 72 Bảng 3.6. Thông tin đa dạng di truyền của 4 quần đàn tôm sú. 75 Bảng 3.7. Giá trị Fst được phân tích theo nhóm. 79 Bảng 3.8. Tổng hợp kết quả tối ưu của 10 cặp mồi microsatellite 81 ix
  11. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ HÌNH ẢNH Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon) 8 Hình 1.2. Đặc điểm cấu tạo bên ngoài của tôm sú (Penaeus monodon) 9 Hình 1.3. Vòng đời tôm sú (Penaeus monodon) 12 Hình 1.4. Quá trình giao vĩ của tôm sú (Penaeus monodon) 13 Hình 1.5. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. 25 Hình 1.6. Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite. 26 Hình 2.1. Thang chuẩn DNA 100bp 38 Hình 2.2 Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp các cặp mồi 50 Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ 56 Hình 3.3. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ 57 Hình 3.4. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ 58 Hình 3.5. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. 60 Hình 3.6. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. 60 Hình 3.6. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. 61 Hình 3.7. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. 62 Hình 3.8. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite N1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. 63 Hình 3.9. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite W1 65 Hình 3.10. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite L1 . 66 Hình 3.11. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite P1 . 67 x
  12. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite N1 . 67 Hình 3.12. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite N1 . 68 Hình 3.13. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi microsatellite W1 70 Hình 3.14. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi microsatellite P1 70 Hình 3.15. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi microsatellite N1 71 Hình 3.16. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi microsatellite L1 71 Hình 3.17. Biểu đồ thể hiện hiệu suất PCR (%) của 15 cặp mồi microsatellite 73 Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện số allen của 15 cặp mồi microsatellite 73 Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện giá trị Ho và He theo từng quần đàn tôm sú 78 xi
  13. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài Tôm sú là đối tượng nuôi phổ biến ở các vùng nước lợ, mặn trên toàn quốc. Trong báo cáo tổng kết ngành thủy sản 2004 và kế hoạch 2005 của Bộ Thủy Sản cho biết hằng năm, ước tính có khoảng hơn 10 tỷ tôm sú giống giai đoạn PL15 được sản xuất từ hàng nghìn trại sản xuất tôm giống. Tôm bố mẹ cung cấp cho các trại sản xuất tôm giống hiện nay hầu như hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn tôm bố mẹ khai thác tự nhiên và nhập nội. Sử dụng nguồn tôm bố mẹ còn mang tính thụ động, tự nhiên, cộng với những yếu tố khác do chính điều kiện sản xuất, kinh doanh tại các trại sản xuất tôm giống không được đảm bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng, mang mầm bệnh, tiềm ẩn rủi ro lớn cho người nuôi tôm. Do đó, để có được nguồn giống tăng trưởng tốt, sức chống chịu, kháng bệnh tốt cung cấp cho người nuôi trồng tôm sú, không phải phụ thuộc vào nguồn tự nhiên hay nhập nội thì việc nghiên cứu sản xuất giống tôm sú cung cấp cho người nuôi sản phẩm giống tốt, có tốc độ sinh trưởng nhanh, chống chịu tốt là điều hết sức cần thiết. Nước ta có diện tích mặt nước ngọt, lợ, biển khá lớn, bao gồm các sông, suối, ao, hồ chứa nước với thành phần giống loài thủy sản phong phú là tiềm năng to lớn để phát triển và nuôi trồng thủy sản. Năm 2012, diện tích nuôi trồng thủy sản toàn quốc ước tính 1.200.000 ha, trong đó diện tích nuôi tôm sú chiếm phần lớn với 622.118 ha chiếm 88,1%, hàng thủy sản Việt Nam đã có mặt ở trên 164 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới. Kim ngạch xuất khẩu năm 2014 đạt 7,9 tỷ USD, tăng gấp 18% lần so với cùng kì năm trước. Sự tăng trưởng này chủ yếu nhờ vào kết quả xuất khẩu của mặt hàng tôm, với giá trị xuất khẩu cao nhất từ trước tới nay khoảng 4,1 tỷ USD, tăng 25% so với năm 2013 ( 1
  14. Đồ án tốt nghiệp Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chú ý đến nâng cao chất lượng di truyền, tăng khả năng chống chịu ở tôm sú đã được thực hiện nhằm đặt ra cơ sở khoa học, kỹ thuật để có thể nâng cao chất lượng của loài thủy sản giá trị cao này như “Nghiên cứu buồng trứng và khả năng sinh sản của các dòng tôm sú gia hóa” (Nguyễn Văn Bình, 2012), “Đánh giá tính đa hình của ba quần đàn tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp microsatellite” (Nguyễn Thị Thảo và ctv, 2004) với mục tiêu có được sản phẩm giống tôm sú tốt, cải thiện di truyền sản phẩm giống, tập trung cao vào các tính trạng kinh tế quan trọng là sức sinh trưởng, kháng bệnh, chống chịu và phải đa hình di truyền. Các nghiên cứu xác định biến dị di truyền kết hợp với các biến dị hình thái thể hiện về sinh trưởng, sức sống với các chỉ thị ở mức độ phân tử của các quần thể tôm sú, giữa các cá thể trong cùng một quần đàn là hướng nghiên cứu phù hợp cần thiết, ứng dụng cao. Chính vì thế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn giao cho Viện Nghiên cứu và Nuôi trồng thủy sản II thực hiện đề tài cấp nhà nước “Ứng dụng di truyền số lượng và di truyền phân tử để tạo vật liệu ban đầu cho chọn giống tôm sú (Penaeus monodon) theo tính trạng tăng trưởng”, đề tài này được thực hiện trong 4 năm (1/2012 – 12/2015) và nhóm thực hiện đồ án tham gia vào một phần nhỏ với đề tài “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (Penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống” nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chương trình chọn giống tôm sú quốc gia. Đề tài được thực hiện ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II dưới sự hướng dẫn của Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà. 2. Tình hình nghiên cứu Trên thế giới Trên thế giới, có những đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền đã được thực hiện như: -“Sử dụng chỉ thị microsatellite phân tích đa dạng di truyền tôm sú (Penaeus monodon) ở Philippines” (Zhenkang Xu và ctv, 2001). Trong nghiên cứu này đã 2
  15. Đồ án tốt nghiệp phân lập được 49 cặp mồi microsatellite từ ngân hàng gen của loài tôm sú (Penaeus monodon), qua sàng lọc đã chọn ra được 36 cặp tốt nhất được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền quần đàn tôm sú nuôi tự nhiên cho kết quả thông tin đa hình dao động trong khoảng từ 0,63 – 0,96. -“Sử dụng các chỉ thị microsatellite trong chọn giống tôm sú (Penaeus monodon)” (Wuthisuthimethavee và ctv, 2003). Nghiên cứu này được tác giả thực hiện trên quần đàn tôm sú hoang dã ở Thái Lan, sử dụng 30 cặp mồi microsatellite tự thiết kế để đánh giá tính đa hình. Kết quả cho thấy thông tin đa hình (PIC) dao động trong khoảng từ 0,4275 – 0,9264. -“Sử dụng các chỉ thị microsatellite để phân tích sự khác biệt di truyền giữa các quần đàn tôm sú vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương” (En-Min You và ctv, 2005). Trong bài báo này, các tác giả đã sử dụng 10 cặp mồi microsatellite có số dị hợp tử mong đợi >0,92 của Pan và ctv (2004) để phân tích khác biệt di truyền của 330 cá thể tôm sú thuộc 2 vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Kết quả phân tích thông tin đa dạng di truyền cho thấy: số dị hợp tử quan sát được dao động từ 0,638 – 0,743. Sự khác biệt có ý nghĩa về cân bằng di truyền Hardy – Weinberg (p<0,05). Giá trị sai khác di truyền (Fst) giữa quần đàn tôm sú Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương là khá cao (Fst=0,069; p≤ 0,0067). -“Đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú (Penaeus monodon) nuôi tự nhiên và hoang dã bằng chỉ thị microsatellite” (D.Aziz và ctv, 2011). Tác giả và cộng sự đã tiến hành thu mẫu tôm sú nuôi tự nhiên và hoang dã ở Malaysia, bằng 30 cặp mồi microsatellite được lấy từ ngân hàng gen Biobasic, Canada, các tác giả đã công bố kết quả phân tích đa dạng di truyền của mẫu tôm sú trên. Số lượng allen trên mỗi cặp mồi là từ 3 – 36, số dị hợp tử quan sát He= 0,5166 nhỏ hơn so với dị hợp tử mong đợi He=0,5552. Giá trị sai khác di truyền (Fst) giữa quần đàn tôm sú nuôi tự nhiên và hoang dã là rất cao (Fst=0,6308; p≤ 0,009). Trong nước 3
  16. Đồ án tốt nghiệp Những nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện như: Trường Đại học quốc gia TP HCM, Viện NCNTTS I và Viện NCNTTS II đã có những khảo sát đa dạng di truyền một số quần thể đàn tôm sú (Penaeus monodon) bằng hai kỹ thuật RAPD và mtDNA PCR-RFLP. Theo đó, kết quả chỉ đánh giá khả năng ứng dụng từng kỹ thuật vào các mục đích tìm hiểu khác nhau, nhưng đây là một nỗ lực trong đánh giá di truyền một số quần thể tự nhiên. Để đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc và làm cơ sở cho việc quản lý, bảo tồn nguồn gen tôm càng xanh tại Việt Nam. Nghiên cứu “So sánh sự đa dạng di truyền giữa tôm càng xanh Việt Nam và tôm càng xanh Trung Quốc sử dụng phương pháp Microsatellite và RAPD” (Nguyễn Thành Tâm và Phạm Thanh Liêm, 2012) nhằm kiểm tra sự khác biệt di truyền của hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc cùng với 6 cặp mồi microsatellite và 5 mồi ngẫu nhiên RAPD. Theo kết quả báo cáo không có sự khác biệt di truyền giữa quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc khi phân tích bằng chỉ thị microssatellite tuy nhiên với 5 mồi ngẫu nhiên RAPD cho kết quả thông tin đa hình (PIC) của quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc lần lượt là 0,84 và 0,88. Một số các nghiên cứu thăm dò khác: “Microsatellite nghiên cứu biến dị về màu sắc thịt trắng và thịt vàng của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Hữu Ninh, 2003); “Bước đầu thăm dò, ứng dụng một số chỉ thị DNA phân tích đa dạng di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Bùi Thị Liên Hà, 2004).v.v 3. Mục đích nghiên cứu - Tìm được một số chỉ thị microsatellite phù hợp và tiềm năng trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần đàn tôm sú Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. - Cung cấp thông tin di truyền cho chương trình chọn giống quốc gia. 4
  17. Đồ án tốt nghiệp 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite qua quy trình PCR. - Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu tôm sú thuộc 4 nhóm khác nhau trong chọn giống thông qua chỉ thị microsatellite nhằm phục vụ cải tạo giống tôm sú. 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp trích ly DNA tổng số dựa trên quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và ctv, 1988). - Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA - Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR và khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite - Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các phần mềm Cervus 3.0.3, Fstat, Genepop. 6. Các kết quả đạt được của đề tài - Tối ưu hóa các phản ứng khuếch đại của các chỉ thị microsatellite. - Kiểm tra độ ổn định và tính chính xác của các chỉ thị microsatellite lựa chọn. - Phân tích đa dạng di truyền của các nhóm mẫu tôm sú chọn giống. - Đưa ra nhận định hỗ trợ cho chương trình chọn giống tôm sú. 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (Penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống” bao gồm 4 chương: 5
  18. Đồ án tốt nghiệp Chương 1. Tổng quan tài liệu: tóm tắt về các đặc điểm, đặc tính của đối tượng nghiên cứu là loài tôm sú (Penaeus monodon). Giới thiệu về kỹ thuật microsatellite và các cặp mồi microsatellite sử dụng trong báo cáo này. Chương 2.Vật liệu và phương pháp: nêu ra các vật liệu sử dụng và những phương pháp dùng để phân tích trong đề tài. Chương 3. Kết quả và thảo luận: báo cáo về các kết quả đã đạt được trong đề tài và đưa ra nhận xét, so sánh với các nghiên cứu liên quan. Chương 4. Kết luận và kiến nghị: đưa ra các kết luận chung về các kết quả đã đạt được và đề xuất các hướng giải quyết tiếp theo để hoàn thiện hơn. 6
  19. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.1 Giới thiệu về tôm sú 1.1.1 Vị trí phân loại Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác đại dương được nuôi để dùng làm thực phẩm, là đối tượng rất quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản. Theo Hothuis (1980) và Barnes (1987) (trích dẫn bởi Nguyễn Văn Chung và Trần Ngọc Hải, 2004) tôm được phân loại trong hệ thống phân loại như sau: Ngành: Arthropoda Lớp : Malacostraca Bộ : Decapoda Họ : Penaeidae Giống : Penaeus Loài : Penaeus monodon (Fabricius, 1798). Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon) 1.1.2 Phân bố Trên thế giới, tôm sú được phân bố chủ yếu ở Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, Đông và Đông Nam Châu Phi, Pakistan, Nhật Bản, Malaysia. Đặc biệt, bắt gặp nhiều nhất ở vùng Đông Nam Á như: Philippins, Indonesia, Thái Lan, Việt Nam Tôm 8
  21. Đồ án tốt nghiệp trưởng thành có tập tính sống ở biển khơi, thường được tìm thấy ở độ sâu 180m, nhưng tôm giống thường xuất hiện ở vùng ven bờ. ( Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2004). Ở Việt Nam, theo Nguyễn Văn Chung (1995) (được trích dẫn bởi Nguyễn Đel, 2009). Tôm sú phân bố ở vịnh Bắc Bộ, ven biển Nam Trung Bộ, vùng Tây Nam Bộ, sông Ông Đốc, Khánh Hội, Kim Quy, Hòn Chông, Hà Tiên Tôm sống ở độ sâu từ 0 – 126m, đáy cát bùn hay bùn cát, thích hợp nhất là các thủy vực có độ mặn cao, ổn định. 1.1.3 Đặc điểm hình thái cấu tạo Hình 1.2. Đặc điểm cấu tạo bên ngoài của tôm sú (Penaeus monodon) Quan sát cơ quan bên ngoài của tôm sú gồm các bộ phận sau: Chủy: tôm sú có chủy dài kéo dài đến rìa của cuốn râu I, hơi cong lên ở vuốt, hình dạng như lưỡi kiếm, có răng cưa ở phía trên lưng và cả phần phía dưới, nhờ có răng cưa này mà ta phân biệt được các loài tôm khác nhau trong giống penaeus. Với tôm sú, phía trên chủy có 7-8 răng và phía dưới chủy có 3 răng: 9
  22. Đồ án tốt nghiệp Antennule và Antennae là cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho cơ thể của tôm. 3 cặp châm hàm: giúp cho việc ăn 5 cặp chân ngực: giúp để ăn và bò 5 cặp chân bụng: dùng để bơi. Hai đôi mắt kép có 2 cuống mắt Carapace có gai râu và gai gan nhưng không có gai hốc mắt. Đuôi có một cặp chân đuôi giúp cho tôm có thể bơi lên cao hay bơi xuống thấp. Cơ quan sinh dục nằm ở dưới bụng: tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước to hơn con đực. Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái thông qua cơ quan sinh dục phụ bên ngoài. Petasma và thelycum là cơ quan phân biệt đực cái ở tôm, Petasma có ở con đực và thelycum có ở con cái. Con đực: cơ quan sinh dục chính của con đực nằm ở phía trong phần đầu ngực, bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2, lỗ sinh dục đực mở ra hốc háng đôi chân ngực thứ 5. Tinh trùng thuộc dạng chứa trong túi. Con cái: buống trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn trứng mở ra ở khớp háng đôi chân ngực thứ 3. Thelycum nằm giữa gốc đôi chân bò thứ 4 và 5. 1.1.4 Chu kì phát triển. Vòng đời của tôm sú chia làm 6 thời kì: phát triển phôi, ấu trùng và hậu ấu trùng, giai đoạn ấu niên, giai đoạn thiếu niên, giai đoạn sắp trưởng thành, giai đoạn trưởng thành (Nguyễn Văn Chung và ctv, 1997) Phát triển phôi: trứng tôm sú hình cầu, màu vàng xanh, đường kính trung bình 0,3mm. Thời gian để phôi phát triển qua 2 giai đoạn tế bào, giai đoạn phôi nang và thời điểm xuất hiện Nauplius trong trứng là 0,5; 1,5; 8 giờ sau khi đẻ xong. 10
  23. Đồ án tốt nghiệp Ấu trùng và hậu ấu trùng: ấu trùng và hậu ấu trùng tôm lột xác nhiều lần, phát triển qua các giai đoạn Nauplius, Zoea, Mysis, Postlarvae. - Giai đoạn Nauplius: nauplius mới nở hình quả lê, qua 5 lần lột xác biến đổi dần và trở nên dài ra. Nauplius sống phù du trôi nổi ở tầng trên, dinh dưỡng chủ yếu bằng noãn hoàng, vận động theo kiểu zích zắc, không định hướng, không liên tục, hướng quang mạnh. - Giai đoạn Zoea: cơ thể bao gồm 3 phần rõ rệt (đầu- ngực- bụng). Zoea bơi nhờ 2 đôi râu (đôi 1 phân đốt, đôi 2 phân nhánh) bơi lội có định hướng về phía trước. Ấu trùng Zoea bắt đầu ăn thức ăn ngoài bằng hình thức ăn lọc. Do chúng bắt mồi liên tục nên chúng có phần đuôi phân dài (Lục Minh Diệp (2003) trích dẫn bởi Nguyễn Văn Bình, 2012). Ba giai đoạn phụ của ấu trùng Zoea phân biệt nhờ sự xuất hiện của chùy trán, cuống mắt kép, sự phân đốt của phần bụng và sự phát triển của gai cứng, gai bên các đốt bụng. Thời gian phát triển các giai đoạn phụ là từ 30-48 h tùy theo nhiệt độ. - Giai đoạn Mysis: trải qua 3 giai đoạn biến thái phụ. Cơ thể tôm sú đã giống dạng trưởng thành hơn so với Zoea. Mysis sống ở tầng trên, đặc trưng của Mysis là bơi ngược về sau, đầu chúc xuống dưới. Phân biệt các giai đoạn phụ của Mysis dựa vào sự xuất hiện và phân đốt của chân bơi. - Giai đoạn ấu hậu ấu trùng Postlarvae: hình dạng giống tôm trưởng thành nhưng chưa hoàn thiện về màu sắc. Postlarvae bơi thẳng, có định hướng về phía trước, hoạt động bơi lội chủ yếu nhờ vào chân bụng. Tuổi của Postlarvae được tính theo ngày kể từ khi biến thành Postlarvae đầu tiên. Từ P1-P5 chúng sống trôi nổi, từ P5 trở đi chúng sống đáy. Giai đoạn ấu niên: từ P5-P20 tôm chuyển sang sống đáy, giai đoạn này tôm bắt đầu bò bằng chân bò và bơi bằng chân bơi. 11
  24. Đồ án tốt nghiệp Giai đoạn thiếu niên: tôm bắt đầu ổn định về tỷ lệ và bây giờ có thể phân biệt được tôm đực và tôm cái dựa vào petasma của con đực và thelycum của con cái. Giai đoạn sắp trưởng thành: giai đoạn này đặc trưng bởi sự phát triển của tuyến sinh dục đực, con đực đã bắt đầu có tinh trùng nằm trong túi tinh và con cái có buồng trứng phát triển, khi con cái giao vĩ thì nó có túi tinh. Giai đoạn trưởng thành: là giai đoạn chín sinh dục hoàn toàn, di cư xa bờ tới vùng biể sâu để sinh sản. Hình 1.3. Vòng đời tôm sú (Penaeus monodon) 1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng. Tôm sú là loài ăn tạp, thức ăn của tôm bao gồm giáp xác, giun nhiều tơ, nhuyễn thể, các côn trùng, tảo và các mảnh thực vật. Tính ăn của chúng thay đổi theo giai đoạn, ở giai đoạn tôm bột và tôm giống chúng ăn nhiều các mảnh thực vật, vi tảo Khi tôm lớn chúng ăn các loại động vật không xương sống như ruốc, mọi giáp xác chân đều, giun nhiều tơ Ở giai đoạn thành thục, trong suốt mùa sinh sản tôm ăn nhiều nhuyễn thể trong khi những tháng khác tôm ăn nhiều cá hơn (Dall, 1998), được trích dẫn bởi Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004). 12
  25. Đồ án tốt nghiệp Tôm ăn suốt ngày đêm nhưng ăn nhiều vào ban đêm, tôm giảm ăn vào những lúc lột xác, khả năng bắt mồi của tôm còn phụ thuộc rất lớn vào môi trường sống (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004). 1.1.6 Đặc điểm về sinh trưởng, sinh sản và phát triển. Hiện tượng lột xác: trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích thước tăng lên đến mức độ nhất định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ cũ để lớn lên. Sự lột xác thường xảy ra vào ban đêm. Sự lột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường hợp nhưng không tăng thể trọng. Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác xảy ra như sau: lớp biểu bì giữa khớp đầu ngực và phần bụng bị nứt ra, các phần phụ của đầu ngực rút ra trước, theo sau là phần bụng và các phần phụ phía sau rút ra khỏi lớp vỏ cứng, với động tác uốn cong mình toàn cơ thể. Lớp vỏ mới mềm sẽ cứng lại sau 1-2h đối với tôm nhỏ, 1-2 ngày đối với tôm lớn. Hiện tượng giao vĩ và đẻ trứng: khi tôm cái vừa lột xác, tôm đực thường giao vĩ, các túi tinh với sự giúp đỡ của petasma sẽ được đưa vào thelycum của con cái. Hoạt động giao vĩ thường diễn ra vào ban đêm, sức sinh sản của tôm sú là khoảng 200.000- 1.700.000 trứng. Hình 1.4. Quá trình giao vĩ của tôm sú (Penaeus monodon) 13
  26. Đồ án tốt nghiệp 1.1.7 Tình hình nuôi trồng tôm sú ở thế giới. Nghề nuôi tôm trên thế giới đã xuất hiện cách đây vài thế kỷ nhưng mãi đến năm 1964 quy trình về sản xuất tôm bột mới được hình thành. Tôm sú là loài có sản lượng đánh bắt và nuôi hàng đầu trên thế giới. Theo thống kê của tổ chức Nông Lương thế giới (Food Agriculture Organization- FAO), sản lượng tôm sú chiếm 52% năm 1997 trên tổng số sản lượng tôm nuôi trên thế giới, Đông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lượng tôm toàn thế giới trong số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển. Do nhu cầu thị trường ngày càng cao nên nghề nuôi tôm ngày càng phát triển và được cải tiến. Điều đó đã chứng tỏ rằng nuôi tôm sú công nghiệp đã mang lại hiệu quả cao cho người nuôi, tạo ra lượng tôm lớn cho nhu cầu xuất khẩu. Hiện nay, trên thế giới có trên 60 quốc gia nuôi tôm tập trung thành 2 khu vực chính là Nam Mỹ (các nước Tây bán cầu) và Đông Nam Á (các nước Đông bán cầu). Các quốc gia Đông Nam Á với điều kiện thiên nhiên ưu đãi và ứng dụng nhanh về khoa học kỹ thuật vào sản xuất nên sản lượng tôm chiếm 80% tổng sản lượng tôm trên toàn thế giới. Các nước có sản lượng lớn như Trung Quốc, Thái Lan (276.000 tấn), Ấn Độ (971.00 tấn), Banglades, Việt Nam (50.000 tấn) (theo thông tin chuyên đề, bộ Thủy sản số 4, 2003) 1.1.8 Tình hình nuôi trông tôm sú ở Việt Nam. Ở Việt Nam nghề nuôi tôm là truyền thống có từ lâu, nuôi tôm với hình thức quảng canh cổ truyền, bán thâm canh với con giống tự nhiên. Theo Trần Ngọc Hải và Nguyễn Thanh Phương (2009) thì ở nước ta, nghiên cứu sinh sản nhân tạo các loài tôm đầu tiên được tiến hành ở miền Bắc từ thập niên 70 với các loài tôm Penaeus merguiensis, P. penicilatus và P. japonicus. Từ năm 1984- 1985, tôm sú penaeus monodon đã được sinh sản nhân tạo thành công ở Nha Trang và dần trở thành đối tượng chủ yếu trong sản xuất giống và nuôi tôm biển ở nước ta. Cho đến nay, thủy sản là một trong những ngành có tốc độ tăng trưởng xuất khẩu cao nhất trong 9 tháng đầu năm 2014. Theo số liệu của Tổng cục Thống kê, sản 14
  27. Đồ án tốt nghiệp lượng thủy sản 9 tháng đầu năm ước đạt 4,7 triệu tấn, tăng 4,9% so với cùng kì năm trước. Trong đó, sản lượng cá đạt 3,4 triệu tấn, tăng 3,2%; tôm đạt 0,57 triệu tấn, tăng 14,8%. Giá trị sản xuất thủy sản 9 tháng đầu năm 2014 (theo giá so sánh 2010) ước đạt 134.000 tỷ đồng, tăng 6,5% so với cùng kỳ năm ngoái. Giá trị xuất khẩu đạt 5,7 tỷ USD tăng 23%. Do tôm chân trắng có hiệu quả kinh tế cao và ổn định hơn nhiều so với tôm sú nên đã có sự dịch chuyển lớn về diện tích nuôi tôm chân trắng và tôm sú. Tổng diện tích thả nuôi lũy kế đạt 663 nghìn ha (tăng 5,2% so với cùng kỳ năm 2013); trong đó diện tích tôm sú là 572 nghìn ha (giảm 1,8%), diện tích tôm chân trắng là 91 nghìn ha (tăng 91,8%). Tổng sản lượng thu hoạch lũy kế ước đạt 395 nghìn tấn (tăng 50%); trong đó sản lượng tôm sú là 180 nghìn tấn, tôm chân trắng là 215 nghìn tấn. (www.tongcucthuysan.gov.vn). 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 1.2.1. Đa dạng di truyền. Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, vi sinh vật. Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau. Đa dạng di truyền còn là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau, là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong cùng một quần thể hoặc giữa các quần thể. Đa dạng di truyền biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp base cơ bản, thành phần của acid nucleic, tạo thành mã di truyền. Tập hợp các biến dị gen trong cùng một quần thể giao phối cùng loài có được nhờ chọn lọc. Mức độ sống sót của các biến dị khác nhau dẫ đến tần suất khác nhau của các gen trong tập hợp gen. Điều này cũng tuong tự như trong tiến hóa của quần thể. Như vậy tầm quan trọng của biến dị gen là rất rõ ràng, nó tạo sự thay đổi tiến hóa tự nhiên cũng như chọn lọc nhân tạo. 15
  28. Đồ án tốt nghiệp Di truyền quần thể là một lĩnh vực sinh học mà những nghiên cứu của nó tập trung vào thành phần di truyền của quần thể sinh học (tần suất phân bố của allen) và sự thay đổi của thành phần di truyền được bắt nguồn từ áp lực của sự tiến hóa, chọn lọc tự nhiên, xu hướng chuyển đổi kết cấu di truyền, đột biến và phân bố gen được quan tâm như những ảnh hưởng chủ đạo trong tần xuất phân bố allen trong cả quần thể nuôi gia hóa và quần thể tự nhiên. Những ứng dụng chủ yếu của di truyền quần thể trong nghề nuôi tôm và nghề nuôi trồng thủy sản gồm sự mô hình hoá cấu trúc quần thể trong tự nhiên, xác định cá thể có đóng góp vào quá trình sinh sản, ước tính giả định khả năng sinh sản của kích thước quần thể hiệu quả, đánh giá tỷ lệ cận huyết và hệ thống hóa dữ liệu yếu tố biến dị di truyền trong quần thể khảo sát. 1.2.2. Quần thể Trong tiến hóa, cá thể không được xem là đơn vị thích hợp bởi vì kiểu gen của một cá thể được giữ nguyên trong quãng đời của nó hơn nữa cá thể có tính tạm bợ (dù có thể sống tới cả nghìn năm như cây tùng). Ngược lại, một quần thể thì có tính liên tục qua thời gian và mặt khác thành phần di truyền của nó có thể thay đổi tiến hóa qua các thế hệ. Sự hình thành các quần thể địa phương tại những vùng lãnh thổ khác nhau chính là phương thức thích ứng của loài trước tự nhiên. Quần thể được xem là đơn vị tiến hóa cơ sở. Đối với các loài sinh sản hữu tính, quần thể là tập hợp các cá thể cùng loài, trải qua nhiều thế hệ, cùng chung sống trong một khoảng không giai xác định, trong đó các cá thể có thể giao phối tự do với nhau và được cách ly ở mức độ nhất định với các nhóm cá thể lân cận thuộc loài đó. Theo A.V.Yablokov (1986), quần thể là nhóm các cá thể cùng loài và có khả năng giao phối tự do với nhau, chiếm cứ một khu phân bố xác định và trải qua một thời gian tiến hóa lâu dài để hình thành nên hệ thống di truyền độc lập và một ổ sinh thái riêng. 16
  29. Đồ án tốt nghiệp Nói cách khác, quần thể là một nhóm sinh vật có khả năng giao phối qua lại và cùng chia sẻ một vốn gen chung (Ridley 1993). Nó còn được gọi là quần thể Mendel mà tập hợp lớn nhất là loài (species). Năm 1908, nhà toán học người Anh Godfrey H.Hardy và bác sĩ người Đức Wilhelm Weinberg đã độc lập chứng minh rằng có tồn tại một mối quan hệ đơn giản giữa các tần số allen và các tần số kiểu gen. Nội dung của của nguyên lý: Trong một quẩn thể ngẫu phối kích thước lớn, nếu như không có áp lực của các quá trình đột biến, di nhập cư, biến động di truyền và chọn lọc, thì tần số các allen được duy trì ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác. 1.2.3 Nguyên nhân xuất hiện đa dạng di truyền trong quần thể. Trong quần thể ngẫu phối, bằng cách chọn lọc và lai các dạng được chọn với nhau có thể tạo ra các dòng có mức độ biểu hiện tính trạng khác hẳn ở quần thể ban đầu. Điều đó chứng tỏ tính bất đồng nhất về mặt di truyền trong quần thể. Trong quần thể tự nhiên, các cá thể có cùng kiểu hình giống nhau nhưng kiểu gen thì rất đa dạng. Sự đa dạng gen chủ yếu do đột biến tạo gen dị hợp tử và quá trình giao phối tái tổ hợp. Trong đó biến dị tổ hợp và đột biến gen có ý nghĩa quan trọng nhất. Biến dị tổ hợp là những tổ hợp sắp xếp gen mới mà đời con thu được khác với bố mẹ do sự phân ly độc lập và sự trao đổi chéo của các gen khi chúng nằm trên các cặp nhiễm sắc thể khác nhau. Các cá thể mang biến dị tổ hợp chỉ thừa hưởng nguyên gốc vật chất di truyền của thế hệ trước mà vật chất di truyền không hề bị biến đổi về mặt chất lượng. Đột biến là những biến đổi về cấu trúc, số lượng của DNA và NST. Có ý nghĩa quan trọng trong sự hình thành loài, là nguyên liệu cho quá trình tiến hóa và chọn giống. Ngoài ra, đa dạng di truyền còn do hiện tượng di nhập gen, sự phiêu bạt gen, chọn lọc tự nhiên, chọn lọc nhân tạo . 17
  30. Đồ án tốt nghiệp 1.2.4 Ý nghĩa của đa dạng di truyền trong nuôi trồng thủy sản. Trong nuôi trồng thủy sản các quần thể bố mẹ tương đối nhỏ thường được lưu giữ riêng biệt, đây là nguyên nhân làm cấu trúc di truyền của nguồn giống thủy sản nuôi có thể thay đổi nhanh chóng theo thời gian chỉ qua vài thế hệ. Vì khi quần thể quá nhỏ sẽ xảy ra hiện tượng phiêu bạt gen làm thay đổi cấu trúc di truyền của quần thể do kích thước quần thể quá nhỏ, xu hướng bắt cặp lẫn nhau giữa các cá thể có quan hệ huyết thống với nhau là không tránh khỏi. Do đó nguy cơ mất dần những biến dị di truyền sẽ xảy ra nhanh chóng vì không tích lũy đủ các biến dị di truyền để đáp ứng mọi thay đổi của điều kiện sống. Hiện tượng sinh sản cùng dòng hay giao phối giữa các cá thể có quan hệ gần gũi là những tác nhân góp phần gia tăng cấp độ cần huyết dẫn tới suy thoái cận huyết. Vì vậy, trong thực tiễn chiến lược phát triển nhằm duy trì nguồn vật liệu di truyền cơ bản và bền vững cho nuôi trồng rất được đưa vào quy chế và áp dụng rộng rãi. Đây là vấn đề then chốt trong nuôi trồng thủy sản, vì thành quả di truyền đạt được từ một chương trình chọn giống sẽ phụ thuộc chủ yếu vào sự tích lũy đầy đủ đa dạng di truyền có mặt trong nguồn bố mẹ. Mức độ biến dị di truyền hiện diện trong quần thể khảo sát sẽ được chi phối chủ yếu bởi cấp độ đa dạng của bố mẹ và hệ thống giao phối. Biến dị di truyền là điều kiện tối cần thiết cho sự tồn tại của quần thể vì một quần thể có yếu tố đa dạng di truyền càng cao càng có tiềm năng thích nghi và cung cấp nguồn vật liệu tốt nhất cho chương trình chọn giống. Nghiên cứu đa dạng di truyền giúp nhà khoa học và người nuôi có được những giải pháp tốt hơn trong việc xử lý vấn đề hiện tại. Do đó cách tiếp cận của cải tiến con giống truyền thống và di truyền hiện đại trong nuôi trồng thủy sản có thể được tận dụng từ giả thuyết và phương pháp luận trong di truyền quần thể nhằm định dạng, kiểm soát và bảo tồn đa dạng di truyền các dòng vật nuôi. 18
  31. Đồ án tốt nghiệp 1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE 1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật Microsatellite Microsatellite (SSR marker) là một dạng của VNTR (variable number of tandem repeats), chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên trên hầu hết genom thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang. 2005). Các đoạn lặp lại ngắn từ 2-6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20 -100 bp, chúng được tìm thấy trong tất cả các cơ thể sống, đặc biệt là những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genom. Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100.000 vị trí khác nhau trong bộ genom động vật điển hình. Ở bất kì một locus nào, thường xuyên có khoảng 5 – 7 allen khác nhau mà mỗi allen có thể nhận biết tùy thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những allen này co thể được phát hiện bởi kỹ thuật PCR, sử dụng primers được thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của microsatellite. Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, allen được ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại. Microsatellite là một DNA marker chuẩn, dễ dàng phát hiện bằng kỹ thuật PCR và chúng có khuynh hướng xác định vị tri bằng nhau từ đầu đến cuối của genom. Hàng ngàn SSR đã được lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau. Ngày nay,thuật ngữ microsatellite được sử dụng phổ biến để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên thay vì sử dụng thuật ngữ STR (short tadem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats). Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-al hay al đồng trội (bao gồm 2 loại: allen đồng hợp và allen dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker. Tần số đột biến từ 104- 5.106, tuân theo định luật Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng. 19
  32. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2 Tính chất Những markers này thường hiện diện với mức độ cao của hiện tượng đa hình, đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10. Trình tự lặp lại thường đơn giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tương ứng với việc lặp lại di-, tri, -tetranucleotide) và có thể được lặp lại từ 10 đến 100 lần. Sự lặp lại của nucleotide CA xảy ra rất thường xuyên trong bộ gen người và các loài khác, và được hiện diện trong khoảng vài ngàn bases pair. Nhờ vậy có sự xuất hiện thường xuyên của nhiều allen tại vị trí microsatellite, kiểu gen trong phả hệ thường cung cấp đầy đủ thông tin về di truyền, trong đó allen đặc thù của tổ tiên có thể được nhận biết dễ dàng. Bằng cách này, microsatellite là marker lý tưởng để xác định nguồn gốc, nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp. Nó còn là marker phân tử dùng để cung cấp đầu mối về những allen có mối quan hệ gần nhau hơn. Microsatellite thường thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của DNA. Tỉ lệ đột biến cao này có thể được giải thích bởi sự bắt cặp sai trong bộ phận trượt (slipped strand mispairing - sự giữ không đúng mục tiêu) trong suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu được sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhưng một vài đột biến có thể không được sửa chữa. Kích thước của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng như là tính thường xuyên của sự dịch mã trong khu vực của DNA lặp lại. Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến, có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình. Tuy nhiên, cơ chế tương tự này thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác của microsatellites có thể được khuếch đại. 1.3.3. Ưu - nhược điểm của microsatellite Ưu điểm: 20
  33. Đồ án tốt nghiệp Cặp mồi microsatellite được ứng dụng nhiều hơn cả vì nó đơn giản hơn, phân bố đều trên bộ gen, đặc hiệu, có độ chính xác cao, có khả năng nhân bản ổn định ứng dụng rộng rãi trong việc lập bản đồ bộ gen của các loài. Giúp phân tích đặc điểm di truyền của các loài, dưới loài và các cá thể trong một loài phục vụ có hiệu quả cho công tác chọn giống trong chăn nuôi và trồng trọt, tìm hiểu về cấu trúc quần thể, phả hệ, khoa học hình sự, các gen liên quan đến năng suất và chất lượng, ngoài ra còn giúp tìm hiểu về nguồn gốc và phân lập các gen gây bệnh, từ đó nghiên cứu ra phương pháp điều trị phù hợp. Chúng là chỉ thị di truyền hoàn hảo, chuyên biệt locus và đồng trội (co - dominant), cho phép xác định thể đồng và dị hợp tử và có khả năng lặp lại. Nhược điểm: Tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền được khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền. Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẫn đến sự cố allen không giá trị (null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Nếu có một sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa allen của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân. Trong tế bào khối u, nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thường xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền từ những mô kí chủ đó. 1.3.4 Các loại Microsatellite Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần), phân loại microsatellite gồm: • Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA • Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT • Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG • Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC 21
  34. Đồ án tốt nghiệp Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa . 1.3.5. Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite 1.3.5.1. Cơ chế hình thành Microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do hai quá trình: quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing- over during meiosis) hoặc quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage). Và quá trình trượt lỗi trong sao mã được coi là nguyên nhân chủ yếu trong việc hình thành các microsatellite, nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp từ đó tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. 1.3.5.2 Vai trò của Microsatellite Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Chức năng rõ rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa. Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. Số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gen và chức năng của gen. Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển có chứa 22
  35. Đồ án tốt nghiệp microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen. Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gen, khi trình tự này được giải phóng thì gen được khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hưởng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Như một trình tự mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi . Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa. Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa. 1.3.6. Các phương pháp phát hiện Microsatellite Có 3 phương pháp để phát hiện microsatellite: phương pháp lai, phương pháp PCR và phương pháp dùng mồi microssatellite 23
  36. Đồ án tốt nghiệp 1.3.6.1. Phương pháp lai Phương pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau. Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế. Trong phương pháp lai có hai cách: phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ và phương pháp nhuộm bạc. Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ Phương pháp hiệu quả và được dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ. Người ta có thể đánh dấu vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling). Nhưng ngày nay phương pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít được sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con người và đòi hỏi việc xử lí chất thải tốn kém. Phương pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ) Phương pháp này rẻ, không hại, nhưng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm. 1.3.6.2. Phương pháp PCR Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử dụng máy giải trình tự tự động. Phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incorporation). Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy tính có thể phát hiện được bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thước chính xác của đoạn DNA quan tâm. Chất huỳnh quang này được gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40ng mồi loại này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR. Phương pháp này có hiệu quả rất cao và đang được sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới. Người ta có thể đánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và 24
  37. Đồ án tốt nghiệp chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thước các đoạn bằng nhau nhưng chúng ta vẫn có thể xác định được nhờ màu huỳnh quang khác nhau. Kết quả được thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích thước của allen, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide 1.3.6.3. Phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế mồi microsatellite đặc trưng cho một locus trong bộ gen. Vì vậy một cặp mồi microsatellite có thể áp dụng cho mọi cá thể trong loài và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước khác nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite. Hình 1.5. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. Ở hình 1.5 , hai mồi của PCR (2 mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo toàn nằm 2 bên trình tự microsatellite. Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm PCR sẽ có chiều dài là 100 bp. Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm PCR là 116 bp). Mồi microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi allen) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking (vùng sườn - vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế mồi) được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng sườn rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. 25
  38. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite. Đề tài sử dụng 15 cặp mồi microsatellite (W2, W3, W4, W9, W10, L1, L3, L4, P1, P2, P4, P5, P7, N1, N2) của các tác giả đã công bố trong bài báo khoa học. Cụ thể, nhóm thực hiện đề tài đã sử dụng các cặp mồi mang kí hiệu W2, W3, W4, W9, W10 trong nghiên cứu “Development of microsatellite markers in black tiger shrimp” (Wuthisuthimethavee và ctv, 2003), được đăng trong tạp chí khoa học ngành thủy sản số 224 vào tháng 5/2003. Trong nghiên cứu của mình, các tác giả đã tổng hợp được 30 cặp mồi microsatellite đặc hiệu cho loài tôm sú Penaeus monodon dựa trên 9 trình tự lặp lại (AG)10, (TG)10, (GAA)10, (GAC)10, (CAT)10, (TAC)10, (GACA)8, (GATA)8, và (TCAG)8 bằng các kĩ thuật sinh học phân tử (sử dụng 4 enzyme cắt giới hạn: EcoRV, DraI, HaeIII, SmaI để cắt DNA, plasmid pBLUESCRIPT SK làm vectơ chuyển gen ). Sau đó các tác giả tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú hoang dã tại Thái Lan và cho kết quả chỉ số thông tin đa hình (PIC) dao động từ 0,4275 – 0,9264. Nhóm thực hiện đề tài nhận thấy sự ổn định và chất lượng cao của các cặp mồi nên đã chọn và sử dụng 5 cặp mồi microsatellite có chỉ số PIC cao nhất cho đề tài này. Các cặp mồi có kí hiệu P1, P2, P4, P5, P7, nhóm thực hiện đồ án tham khảo từ báo cáo khoa học “Isolation and characterization of 23 polymorphic microsatellite markers for diversity and stock analysis in tiger shrimp (Penaeus monodon)” của Pan và ctv (2004). Trong nghiên cứu này, các tác giả đã phân lập và định danh được 26
  39. Đồ án tốt nghiệp 23 cặp mồi microsatellite dùng để đánh giá đa dạng di truyền của loài tôm sú (penaeus monodon). Với việc sử dụng các công cụ gần giống như Wuthisuthimethavee và ctv (2003), (dùng enzyme cắt giới hạn Sau3AI, plasmid pUC18 ), các tác giả đã phân lập được 23 cặp mồi microsatellite đặc hiệu để phân tích đa dạng di truyền trên 30 mẫu tôm sú (penaeus monodon). Kết quả cho thấy, số allen dao động cao từ 15 – 31, số dị hợp tử mong đợi trung bình Ho= 0,936 và kết qua này được bảo vệ trước Hội đồng Học viện động vật học và phát triển khoa học Đài Loan, đã đăng lên tạp chí Molecular Ecology Notes vào tháng 7/2004. Đồng thời, đề tài ”Microsatellite diversity and population genetic differentiation of the tiger shrimp (penaeus monodon) in Indo-Pacific region” (En-Min You và ctv, 2005). Trong bài báo này, các tác giả đã sử dụng 10 cặp mồi microsatellite có số dị hợp tử mong đợi >0,92 của Pan và ctv (2004) để phân tích khác biệt di truyền của 330 cá thể tôm sú thuộc 2 vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Kết quả phân tích thông tin đa dạng di truyền cho thấy: số dị hợp tử quan sát được dao động từ 0,638 – 0,743. Vì thế, nhóm thực hiện đồ án đã chọn ra 5 cặp mồi có kết quả thông tin đa hình tốt nhất của Pan và ctv (2004) làm vật liệu cho đề tài này. Để có thêm nhiều vật liệu phục vụ cho đề tài và tăng độ tin cậy, nhóm đã tham khảo và sử dụng thêm 3 cặp mồi mang kí hiệu L1, L3, L4 trong nghiên cứu“Development of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus monodon and its application in genetic diversity study for two populations” ( Li và ctv, 2007) và 2 cặp mồi kí hiệu N1, N2 trong “Genetic diversity of intensive cultured and wild tiger shrimp Penaeus monodon (Fabricius) in Malaysia using microsatellite markers” của Nahavandi và ctv (2011). Trong nghiên cứu của mình, Li và ctv (2007) đã sử dụng 90 trình tự gen của tôm sú có kích thước 100-350 bp từ ngân hàng gen và thiết kế 13 cặp mồi microsatellite đa thành phần bao gồm 3 và 4 đơn vị lặp lại bằng cách sử dụng PRIMER v.3 tham khảo từ Rozen và Skatetsky (2000) để đánh giá đa dạng di truyền của 2 quần đàn tôm sú ở Australia và Thái Lan. Kết quả cho thấy, số allen của quần đàn tôm sú ở Australia khá cao dao động từ 7- 27, số dị hợp tử quan sát dao động lớn được từ 0,16- 0,91. Đối với quần đàn tôm sú ở Thái 27
  40. Đồ án tốt nghiệp Lan số allen từ 6- 15, số dị hợp tử quan sát dao động lớn từ 0,09- 0,90. Báo cáo này được đăng lên tạp chí Aquaculture vào 1/2007. Nahanvandi và ctv (2011) sử dụng 6 cặp mồi tham khảo trong báo cáo của Pongsomboom và ctv (2000) cũng cho kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần đàn tôm sú hoang dã và nuôi tự nhiên ở Malaysia khả quan. Tuy nhiên trong số 6 cặp mồi đó, nhóm thực hiện đồ án đã chọn 2 cặp mồi N1, N2 có chỉ số thông tin đa hình (PIC) tốt nhất là 0,7600 và 0,7511. Như vậy từ 4 bài báo khoa học tin cậy, nhóm thực hiện đồ án đã chọn ra 15 cặp mồi microsatellite tốt nhất nhằm đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú (penaesus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống. 1.4. ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tại nơi đó chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260nm. Sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine. Dựa vào sự hấp thụ này người ta có thể định lượng được hàm lượng DNA có trong mẫu ly trích. Sự hấp thụ ánh sáng ở đây được tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260nm tương ứng với: 50 g/ml DNA sợi đôi, 40 g/ml DNA sợi đơn. Nồng độ DNA có thể xác định được nhờ sự đo OD (mật độ quang) ở độ dài sóng 260nm. Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức : OD260nm = 50 ng/l (đối với DNA sợi kép). OD260nm = 40 ng/l (đối với DNA sợi đơn). Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác. Do ngoài đỉnh hấp thụ là 280nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các acid nucleotide và vì thế sẽ làm sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleotide trong dịch ly trích. Để ước lượng độ tinh sạch của mẫu ly trích người ta tính tỷ lệ OD260nm/OD280nm. Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 -2 thì mẫu ly trích được xem là sạch.Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều. Tuy nhiên, việc định lượng bằng phương pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lượng 28
  41. Đồ án tốt nghiệp của DNA ly trích. Để biết chính xác chất lượng DNA ly trích, người ta sử dụng phương pháp định tính DNA bằng cách điện di trên gel. 1.5 KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh, công bố tháng 10 năm 1985 tạo bước nhảy vọt trong sinh học phân tử và kỹ thuật gen. Phương pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo một số lượng rất lớn bản sao của gen (hay một đoạn DNA). Nguyên tắc của PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA. Trên cơ sở trình tự của đoạn DNA khuôn, đoạn mồi (primer), các nucleotide tự do (dNTP) và enzyme DNA polymerase có thể tổng hợp được các đoạn DNA, trong một thời gian ngắn số lượng bản sao DNA tạo thành tăng theo cấp số nhân. - Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA là có thể thực hiện được. - Nhược điểm: Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dương tính giả. Trong một số trường hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chưa đủ lượng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính. 1.5.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kì (cycle) kế tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính (denaturation): ở nhiệt độ 94- 950C (cao hơn Tm của DNA khuôn), làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hai mạch DNA tách rời nhau. Giai đoạn này kéo dài từ 1- 2 phút. - Giai đoạn gắn mồi (annealing): ở nhiệt độ khoảng 55- 650C để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lý Chargaff. Giai đoạn này khoảng 30- 60 giây. 29
  42. Đồ án tốt nghiệp - Giai đoạn tổng hợp (Elongation): ở nhiệt độ 70- 720C thích hợp với điều kiện hoạt động của enzyme DNA polymerase. Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lý Chargaff, tạo nên các mạch đơn DNA mới. Thời gian ở giai đoạn này là từ 30 giây đến vài chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA. Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kì liên tục, sản phẩm tạo ra từ chu kì trước làm khuôn tổng hợp ở chu kì tiếp theo, nên số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân. Một phản ứng PCR bao gồm 20- 40 chu kì. Cần lưu ý ở những chu kì sau, lượng DNA khuôn tăng, lượng mồi và dNTP giảm, enzyme DNA polymerase hoạt động yếu dần do đó cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP, enzyme để đảm bảo phản ứng PCR đạt kết quả tốt nhất. 1.5.2 Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR DNA khuôn: đoạn khuôn DNA khuôn tinh sạch là một trong những yếu tố quan trọng, đảm bảo kết quả phản ứng PCR tạo được các sản phẩm PCR chính xác. Kích thước đoạn DNA khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả nhân gen tốt nhất. Nucleotide tự do (dNTP): nucleotide tự do cần thiết cho phản ứng PCR gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Trong mỗi phản ứng PCR cần chú ý đến tỷ lệ G- C trong đoạn khuôn để xác định hàm lượng mỗi loại dNTP phù hợp. Nồng độ dNTP mỗi loại thường sử dụng trong các phản ứng PCR khoảng 50- 200µM. Mồi (primer): mồi là các đoạn oligonucleotide ngắn khoảng 14- 35 nucleotide, có vai trò quan trọng quyết định thành công của phản ứng PCR. Để thực hiện nhân một đoạn DNA bằng phản ứng PCR cần có một cặp mồi thích hợp. Một cặp mồi trong phản ứng PCR bao gồm mồi xuôi F (Foward) và mồi ngược (Revert). Mồi có vai trò tạo các nhóm 3’OH tự do cần thiết cho phản ứng polyme hóa. Enzyme DNA polymerase: là enzyme có yếu tố rất quan trọng, có vai trò quyết định đến hiệu quả của phản ứng PCR. Enzyme Tag DNA polymerase có hoạt tính 30
  43. Đồ án tốt nghiệp cao ở nhiệt độ cao 75- 800C, xúc tác tổng hợp DNA với tốc độ 130- 300 nucleotide/giây. Hoạt tính của enzyme Tag DNA polymerase chịu ảnh hưởng rất 2+ mạnh bởi ion Mg . Ở điều kiện thích hợp với nồng độ MgCl2 bằng 2mM, enzyme Tag DNA polymerase đạt hoạt tính cao nhất. Dung dịch đệm (buffer): dung dịch đệm (buffer) là một trong những thành phần quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của phản ứng PCR. Dung dịch đệm trong phản ứng PCR đảm bảo các điều kiện cần thiết cho hoạt động của enzyme Tag DNA polymerase như MgCl2, KCl, Tris Trong dung dịch đệm, ion Mg2+ là thành phần có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứng PCR do ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn mồi với các mạch khuôn. 2.6 KỸ THUẬT ĐIỆN DI Phương pháp điện di là kỹ thuật thí nghiệm được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm sinh học của các phân tử mang điện tích (DNA, protein và enzyme ). DNA là đại phân tử sinh học mang điện tích âm, do đó trong môi trường có điện trường, các phân tử DNA có kích thước khác nhau di chuyển từ cực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau. Tùy theo mục đích nghiên cứu và loại bản gel sử dụng, người ta chia thành các phương pháp điện di khác nhau, thường được gọi theo tên bản gel sử dụng. Các kỹ thuật điện di chủ yếu gồm: điện di gel agarose, điện di gel polyarcylamide, điện di trên giấy và điện di trên gel tinh bột. Đề tài sử dụng kĩ thuật điện di trên gel agarose vì bộ gen của Tôm sú có kích thuớc lớn, kết quả phân tách khi điện di sẽ tốt hơn. 2.6.1 Điện di trên gel agarose. 2.6.1.1 Khái niệm Gel là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua. Kích thước phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Gel agrose: Lỗ 31
  44. Đồ án tốt nghiệp có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước 300-10.000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau. 2.6.1.2 Các bước thực hiện Bước 1: chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel Dung dịch đệm sử dụng trong điện di agarose là TBE (Tris- Boric acid- EDTA). Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm 0,5X TBE hòa tan với hàm lượng agarose thích hợp, đặt trong lò vi sóng đun đến khi agarose tan hoàn toàn, bổ sung vào một lượng nhất định chất nhuộm ethidium bromide. Đổ vào khuôn có các lược đã cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp mẫu cần thiết. Lưu ý tránh bọt khí khi đổ gel. Khi bản gel đã đông cứng hoàn toàn, cẩn thận rút lược ra khỏi bản gel để tránh làm bể giếng. Đặt bản gel vào bồn điện di và đổ dung dịch đệm ngập bản gel từ 1- 2mm. Bước 2: nạp mẫu Mẫu DNA đã được tách chiết hoặc sản phẩm của phản ứng PCR được trộn đều với chất màu loading buffer tạo thành hỗn hợp có màu xanh giúp dễ quan sát các vạch mẫu di chuyển trong quá trình điện di và giữ DNA không bị trôi ra khỏi giếng. Để kiểm tra kích thước các đoạn DNA, thường chạy đồng thời cùng với thang DNA. Bước 3: chạy điện di Nguồn điện được sử dụng có điện thế 100V, cường độ 100mA. Thời gian chạy điện di khoảng 20- 30 phút đối với mẫu DNA tổng số và khoảng 40 phút đối với sản phẩm PCR. Bước 4: chụp hình bản gel Chụp hình kết quả điện di bằng máy chụp hình ảnh GelDocX. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel agarose: đã được nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát 32
  45. Đồ án tốt nghiệp huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. 2.6.2 Điện di mao quản Capillary Electrophoresis (CE) Điện di mao quản CE là phương pháp phân tách các chất dựa vào sự khác nhau về tốc độ chuyển động của chúng dưới tác dụng của lực điện trường trong một mao quản hẹp. 2.6.2.1. Nguyên tắc Dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất phân tích trong mao quản (ɸ:25-100mm) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 10-30kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CE là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xảy ra nhanh và hiệu quả cao. 2.6.2.2. Cơ chế điện di Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force: EFF) và dòng điện di thẩm thấu (EOF), các phân tử chất tan sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vì điện tích, kích thước và độ linh động của chúng khác nhau. Phương pháp CE sử dụng mạng lưới gel (gel Cartridge). Trong mao quản để tách các chất phân tích. Mạng lưới gel có những lỗ xốp kích thước cỡ phân tử chứa đầy dung dịch đệm, với mạng lưới lỗ xốp như vậy sẽ tạo cho mao quản như một cái “rây” để phân loại các phân tử chất phân tích theo kích thước. Ứng dụng: Phương pháp CE được áp dụng rất hiệu quả trong y học lâm sàng, trong sinh học để tách các protein có khối lượng phân tử lớn, các phân đoạn DNA, các nucleotid, các peptide, các polymer. 33
  46. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34
  47. Đồ án tốt nghiệp 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu sinh học Bảng 2.1 Danh sách 137 mẫu tôm sú. Ấn Độ Dương Gia Hóa Thái Bình Dương Nội Địa (A) (G) (T) (N) 1 A09 35 G02 73 T00 100 N03 2 A13 36 G13 74 T04 101 N11 3 A16 37 G24 75 T06 102 N13 4 A22 38 G28 76 T30 103 N25 5 A23 39 G30 77 T32 104 N29 6 A26 40 G33 78 T33 105 N31 7 A27 41 G34 79 T34 106 N33 8 A30 42 G36 80 T36 107 N47 9 A33 43 G43 81 T37 108 N48 10 A34 44 G47 82 T40 109 N58 11 A36 45 G48 83 T41 110 N60 12 A37 46 G49 84 T43 111 N66 13 A38I 47 G54 85 T44 112 N106 14 A40 48 G55 86 T47 113 N108 15 A41 49 G56 87 T48 114 N110 16 A42 50 G57 88 T49 115 N112 17 A43 51 G60 89 T50 116 N114 18 A44 52 G61 90 T52 117 N118 19 A46 53 G62 91 T55 118 D11 20 A48 54 G64 92 T58 119 D16 21 A50 55 G65 93 T59 120 D19 22 A52 56 G66 94 T62 121 D37 23 A54 57 G67 95 T66 122 D38 35
  48. Đồ án tốt nghiệp 24 A56 58 G68 96 T84 123 D48 25 A58 59 G69 97 T87 124 D49 26 A60 60 G78 98 T90 125 R00 27 A61 61 G81 99 T92 126 R71 28 A62 62 G83 127 R72 29 A65 63 G85 128 R79 30 A66 64 G87 129 R80 31 A68 65 G88 130 R82 32 A70 66 G93 131 R88 33 A74 67 G94 132 R90 34 A75 68 G95 133 R92 69 G97 134 R94 70 G99 135 R95 71 G102 136 R96 72 G108 137 R99 137 mẫu chân bơi tôm sú thu nhận từ 4 quần thể tương ứng với 4 nhóm: Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. Mẫu được cung cấp từ Thái Lan và vận chuyển đến Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II. Mẫu tôm sú được chọn từ những cá thể trưởng thành, khỏe mạnh, đã tham gia sinh sản trong quần thể. Quy trình thu nhận mẫu: từng cá thể tôm sú chọn lấy 1 chân bơi (có cả phần vây và phần thịt), sau đó gắp vào từng eppendorf 1,5ml riêng biệt có chứa cồn 96o và được kí hiệu cụ thể cho từng con, lưu trữ mẫu trong tủ lạnh -25oC. 2.1.2 Hóa chất 2.1.2.1 Mồi (primer) Mười cặp mồi microsatellite sử dụng cho nghiên cứu có chiều dài từ 18- 27bp được sàng lọc từ 15 cặp microsatellite (hãng Sigma) phân tích đặc hiệu cho 137 mẫu tôm sú có kí hiệu như sau: L1, L3, L4, P1, P2, P4, P5, P7, W2, W10. Trong đó: 36
  49. Đồ án tốt nghiệp - 3 cặp mồi được tham khảo từ (Li và ctv, 2007): L1, L3, L4 - 5 cặp mồi được tham khảo từ (Pan và ctv, 2004): P1, P2, P4, P5, P7 - 2 cặp mồi được tham khảo từ (Wuthisuthimethavee, 2003): W10, W2 Bảng 2.2 Thông tin các cặp mồi. Tác giả Kí hiệu mồi Trình tự Li và ctv (2007) L1 F 5’ TGCAGCTTCACACACCCATACACG 3’ R 5’ TATGACAGGCAGTTGCGCCAGGTA 3’ L3 F 5’GAAGGAGAAGGAGGAGGATTACAAGGA 3’ R 5’TCGGGCGGAGAATATGCAAATTAAA 3’ L4 F 5’GTCTGTCCATCCTTCCGTCTGACC 3’ R 5’TGGGAGTAAACAAAGCGTTTGAGATTG 3’ Pan và ctv (2004) P1 F 5’GTGTTATTTTCCACGGGTGC 3’ R 5’GCTGCAGGAAGTGTAGGGAG 3’ P2 F 5’GTTGCGACGGGTTGATTC 3’ R 5’TTTATGGCTATGGCTGACAC 3’ P4 F 5’ TAATGGGCGTAAGTCTTCGG 3’ R 5’TGAAAGGAGTCGGGATATGC 3’ P5 F 5’CTTTTTGAAATCGCCCTGTT 3’ R 5’CATTCATCCCGCTCTTCTGT 3’ P7 F 5’AAAAGCCAGAGGAAACGTG 3’ R 5’ACAGTGCACGTACCCACAAA 3’ Wuthisuthimethavee W10 F 5’TCTATTGTCTGCCAGTTTGTCC 3’ và ctv (2003) R 5’TAGCACGGGATTTATGAAGTGA 3’ W2 F 5’TTATCCGTATAGCCGCGTTATC 3’ R 5’ TTACAGGACCTGCATTTGTGTC 3’ 37
  50. Đồ án tốt nghiệp 2.1.2.2 Thang (ladder) Sử dụng thang M (ladder) DNA để làm chỉ thị xác định kích thước phân tử DNA của các mẫu khảo sát. Kích thước thang M được sử dụng cho thí nghiệm là 100bp DNA ladder - Promega. Hình 2.1. Thang chuẩn DNA 100bp 2.1.2.3.Hóa chất ly trích DNA. -Dung dịch ly trích 1 (Solution 1): 50 mM Tris - HCl pH8; 20 mM EDTA pH8; 2 % SDS. - Dung dịch ly trích 2 (Solution 2): dung dịch NaCl bão hòa 6 M. - Proteinase K (bảo quản -250C). - Ethanol 700 lạnh (bảo quản ở -25oC). - Ethanol tuyệt đối lạnh (bảo quản ở -25oC). - Nước cất hấp khử trùng 2 lần. 2.1.2.4. Hóa chất chạy PCR - 10X PCR buffer (Promega) - 25 mM MgCl2 (Promega) - 10 mM dNTP mix (Promega) 38
  51. Đồ án tốt nghiệp - Taq DNA polymerase 5 U/μl (Promega) - Primer 100 μM (Sigma) - DNA mẫu ( ly trích từ mẫu chân bơi Tôm sú ) 2.1.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose - Agarose (Bio basic) - TBE 0,5 X - 6X DNA Loading Dye (Promega) - 100 bp DNA Ladder (Promega) 2.1.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản - QIAxcel DNA Sreening Kit (Qiagen) - QX DNA Size Marker 50 – 800bp ( 50 ul) (Qiagen) - QX Aligment Marker 15bp/1 kb ( 1,5 ml) (Qiagen) - QX DNA Dilution Buffer ( Quiagen) - QX Separation Buffer (Qiagen) - QX Wash Buffer ( Qiagen) - QX Nitrogen Cylinder (Quigen) 2.1.2.7. Dụng cụ thí nghiệm - Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml, 2ml. - Tủ hút (Astec Microflow). - Micropipet các loại :100 – 1000 μl , 10 – 100 μl , 0,5 – 10 μl (Bio rad). - Đầu tip các loại (Eppendorf) 39
  52. Đồ án tốt nghiệp - Plates 96 well PCR (Eppendorf). - Máy luân nhiệt iCycle (Bio rad). - Máy chụp ảnh điện di GeldocX (Bio rad). - Máy đo OD SmartSpecTM Plus (Bio rad). - Bồn ủ nhiệt ( block heater – Bio rad). - Máy ly tâm (eppendorf). - Bồn điện di agarose ( Bio rad). - Lò viba (Electrolux - Thụy Điển). - Máy điện di mao quản - Tủ mát, tủ âm (Sanyo - Nhật). - QX 0,2ml tube trip (Qiagen) - QX 0,2ml tube trip caps (Qiagen) - QX Color 0,2ml tube Strip (Quiagen) - Các vật dụng trong tách chiết : chày , crack . 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp trích ly DNA tổng số Quy trình tách chiết DNA tổng số dựa trên quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller, 1988). 40
  53. Đồ án tốt nghiệp Mẫu chân bơi Cắt nhỏ mẫu vào eppendoff 1,5ml Thêm 500µl solution 1 Thêm 5µl proteinase K Vortex nhanh 15 giây Ủ 55oC/2h hoặc qua đêm ở 37oC Bỏ trên đá 10 phút Thêm 250µl solution 2 Bỏ trên đá 5 phút Ly tâm 8000v/p 15phút Bỏ cặn Hút 500µl dịch nổi qua eppendoff mới Thêm 1ml ethanol 100% lạnh Ủ 4oC/ 2h hoặc qua đêm 41
  54. Đồ án tốt nghiệp Ly tâm 11000v/p trong 15 phút Bỏ dịch Thu cặn Thêm 500µl ethanol 70% lạnh Ly tâm 11000v/p trong 5 phút Bỏ dịch Thu tủa DNA Thêm 100µl dd TE Làm khô ở 55oC Dung dịch DNA Mẫu chân bơi sau khi được thu về, bảo quản trong dung dịch cồn 96o, được gắp ra và cắt nhỏ cho vào eppendoff 1,5ml. Thêm 500µl dung dịch solution 1 (50mM Tris HCl pH8, 2% SDS) và 5µl dung dịch proteinase K nhằm phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, thủy phân các protein liên kết với DNA. Sau đó đem ủ ở điều kiện thích hợp (55oC/2h). 42
  55. Đồ án tốt nghiệp Thêm 250µl dung dịch solution 2, sốc nhiệt bằng cách bỏ trên đá 5 phút nhằm tủa tất cả các chất không phải DNA. Sau 5 phút, tiến hành ly tâm ở 8000vòng/phút trong 15 phút để thu dịch nổi. Tiến hành tủa DNA bằng cách thêm 1ml cồn tuyệt đối (100%) vào dịch nổi đã hút, sau đó dán nhãn và ủ lạnh -4oC /2h. Dung dịch sau khi ủ lạnh được lấy ra ly tâm ở 11000vòng/phút trong 15 để thu tủa DNA. Tủa này được rửa với 500 μl Ethanol 70%. Tiếp tục ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi và làm khô bằng máy gia nhiệt ở 55oC. Cuối cùng, thêm 50 – 200 μl dung dịch TE vào mỗi eppendorf (trung bình là 100μl). Dán nhãn và bảo quản lạnh -250C. 2.2.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA Trong mẫu DNA thường có lẫn protein và các hợp chất khác. Những tạp chất này làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm. Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch DNA được đánh giá bằng tỷ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm và 280nm. Tiến hành hút 5µl dung dịch DNA sau khi tách chiết pha loãng với 495µl nước cất để đạt được độ pha loãng là 100 lần. Sau khi pha loãng tiến hành cho mẫu vào cuvett và đưa vào máy đo quang phổ, chỉnh bước sóng 260/280nm, đợi máy hiển thị và đọc kết quả. Độ tinh sạch DNA = OD260nm/OD280nm Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2 thì dung dịch DNA được xem là tinh sạch. Tỷ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ DNA có lẫn tạp chất. Đối với acid nucleic tự do, sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng purin và pyrimidine mà nó có thể hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 260nm trong vùng tử ngoại. Dựa vào tính chất này có thể xác định được hàm lượng của DNA sợi đôi theo công thức: Hàm lượng DNA (ng/µl) = 50 × Hệ số pha loãng × OD260nm 43
  56. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3 Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR và khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite. Các thành phần trong phản ứng PCR đóng vai trò quan trọng của thí nghiệm. Vì thế, trong số 15 cặp mồi microsatellite, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng hoạt động của chúng theo gradient nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và hàm lượng DNA khuôn. Đồng thời phân tích và chọn ra nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và hàm lượng DNA khuôn phù hợp nhất để phản ứng PCR đạt điều kiện ổn định hơn. Tiến hành chọn ngẫu nhiên 28 mẫu chân bơi tôm sú thuộc 4 quần đàn Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa, Nội Địa. Sau đó, tiến hành ly trích DNA để kiểm tra hoạt động của 15 cặp mồi microsatellite. Khi có được nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và hàm luọng DNA khuôn tối ưu nhất, tiến hành chạy phản ứng PCR đối với 28 mẫu trên để chọn ra 10 cặp mồi microsatellite cho tỷ lệ khuếch đại sản phẩm và đạt tỷ lệ đa hình cao nhất. Cần lưu ý một số điểm sau: - Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR bao gồm: hàm lượng DNA khuôn, enzyme Taq polymerase, nồng độ mồi, MgCl2, dNTP, nhiệt độ bắt cặp và số chu kì của phản ứng PCR. - Mồi là chỉ tiêu quan trọng để phản ứng đạt được sự khuếch đại đặc trưng và đạt hiệu quả cao. Muốn thu được sản phẩm DNA khuếch đại thì mồi phải bắt cặp được vào trình tự DNA đích. Do đó, nhiệt độ bắt cặp là yếu tố rất quan trọng trong phản ứng PCR. - Nồng độ MgCl2 cũng là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình PCR do ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn. Nếu nồng độ MgCl2 thấp quá thì chúng không được hoạt hoá thành công còn nếu quá cao sẽ làm cho phản ứng PCR mất tính đặc hiệu và tạo ra nhiều sản phẩm phụ. Không có nồng độ chung cho nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR. Do đó nồng độ Mg2+ phải được thử nghiệm cho từng phản ứng. 44
  57. Đồ án tốt nghiệp - Đối với dNTP, thường sử dụng trong khoảng 20 - 200 μM/ mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”. Ngoài ra, theo kết quả tham khảo từ nghiên cứu của các tác giả Muhammad, Barry Jaquish và Khasa, các yếu tố: nồng độ mồi, Taq polymerase khá ổn định và việc tăng các yếu tố trên cũng không làm tăng chất lượng của phản ứng PCR. - Đối với điện di cũng cần khảo sát nồng độ phần trăm (%) agarose, hiệu điện thế và thời gian thích hợp để sản phẩm khuếch đại và thang phân tách rõ ràng. 2.2.3.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite Để cho cặp mồi có thể bắt cặp một cách hoàn toàn đặc hiệu trên sợi DNA khuôn thì phải duy trì giai đoạn bắt cặp của chu kỳ nhiệt ở nhiệt độ tối ưu cho sự bắt cặp của mồi, gọi là nhiệt độ bắt cặp (Ta). Vì vậy việc khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi là cần thiết để phản ứng PCR được tối ưu. Đề tài sử dụng 15 cặp mồi microsatellite đặc hiệu cho loài tôm sú từ ba nhóm tác giả (Li và ctv, 2007; Pan, 2004; Wuthisuthimethavee, 2003) đã khảo sát và công bố nhiệt độ tối ưu cho từng cặp mồi. Tuy nhiên đề tài này được thực hiện ở điều kiện hóa chất, máy luân nhiệt khác với điều kiện mà ba nhóm tác giả thực hiện, vì vậy việc khảo sát lại nhiệt độ bắt cặp cho các cặp mồi từ nhiệt độ tối ưu của ba tác giả đã đưa ra là cần thiết để phù hợp với điều kiện hóa chất, máy luân nhiệt của phòng thí nghiệm mà đề tài thực hiện. 45
  58. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3 Gradient nhiệt độ lai cho 15 cặp mồi microsatellite Nhóm tác giả Kí 1 2 3 4 5 6 7 8 hiệu Dãy nhiệt mồi độ khảo sát 0C Nhiệt độ tối ưu (theo tác giả) 0C Wuthisuthimethavee W2 55 58,5 58,2 57,5 56,4 54,9 53,8 53 52,5 và ctv (2003) W3 W4 W9 W10 Li và ctv (2007) L1 60 64 63,6 62,7 61,2 59,1 57,7 56,7 56 L3 L4 Nahavandi và N1 56 61 60,7 60 58,9 57,4 56,3 55,5 55 ctv (2011) N2 Pan và ctv P1 56 61 60,7 60 58,9 57,4 56,3 55,5 55 (2004) P2 P4 52 55 54,6 53.8 52,5 50,8 49,5 48,6 48 P5 P7 46
  59. Đồ án tốt nghiệp Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt iCycle (Bio – rad) đã được cài đặt sẵn chu trình nhiệt. Sản phẩm sau khi PCR được tiến hành điện di trên gel agarose 1,5%, hiệu điện thế 100V trong thời gian 40 phút với dung dịch TBE 0,5X, thể tích mẫu là 10µl. Dùng thang M (Marker) để so sánh kích thước các vạch của sản phẩm PCR, có độ dài 100bp, với thể tích thang M là 3 µl. 2.2.3.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 Đối với nồng độ MgCl2, tiến hành thay đổi thể tích MgCl2 trong khoảng 1 – 3µl với nồng độ gốc của MgCl2 là 25mM được thể hiện trong bảng Bảng 2.4. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite Phản ứng 1 2 3 4 5 Thể tích MgCl2 (µl) 1 1,5 2 2,5 3 Nồng độ MgCl2 (mM) 1,25 1,875 2,5 3,125 3,75 Nồng độ chuẩn chung cho phản ứng PCR là 1,25mM tương ứng với thể tích MgCl2 là 1 µl. Do đó để dễ theo dõi thí nghiệm, thể tích MgCl2 tương ứng được khảo sát thay cho nồng độ MgCl2. Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt iCycle (Bio – rad) đã được cài đặt sẵn chu trình nhiệt. Các thành phần phản ứng PCR là không đổi, chỉ thay đổi thể tích MgCl2 tương ứng với nồng độ MgCl2 gốc, hiệu chỉnh thể tích H2O sao cho tổng thể tích của phản ứng PCR là 20 μl/1 phản ứng. Sản phẩm sau khi PCR được tiến hành điện di trên gel agarose 1,5%, hiệu điện thế 100V trong thời gian 40 phút với dung dịch TBE 0,5X, thể tích mẫu là 10µl. Dùng thang M (Marker) để so sánh kích thước các vạch của sản phẩm PCR, có độ dài 100bp, với thể tích thang M là 3 µl. 47
  60. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3.3 Khảo sát hàm lượng DNA khuôn Hàm lượng DNA quá cao hay quá thấp cũng ảnh hƣởng đến sản phẩm khuếch đại PCR. Hàm lượng DNA quá cao sẽ làm cho khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn, hàm lượng quá thấp thì sản phẩm sau khi khuếch đại sẽ mờ và không được rõ (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997). Vì vậy tiến hành khảo sát hàm lượng DNA là cần thiết để phản ứng PCR được tối ưu. Đối với hàm lượng DNA ta tiến hành khảo sát ở bốn hàm lượng 25ng, 50ng, 75ng và 100ng trong tổng thể tích phản ứng là 20μl , để tiện cho việc theo dõi và thao tác thí nghiệm thì hàm lượng DNA sẽ được quy đổi về thể tích tương ứng như bảng 2.5 Bảng 2.5. Hàm lượng DNA khuôn khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite Phản ứng 1 2 3 4 Thể tích DNA (µl) 0,5 1 1,5 2 Hàm lượng DNA khuôn trong 20 µl thể tích 25 50 75 100 phản ứng (ng) Nồng độ gốc của DNA là 50ng/ µl tương ứng là trong 1µl dung dịch có hàm lượng DNA là 50ng. Do đó để dễ theo dõi thí nghiệm, thể tích DNA tương ứng được khảo sát thay cho hàm lượng DNA. Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt iCycle (Bio – rad) đã được cài đặt sẵn chu trình nhiệt. Các thành phần phản ứng PCR là không đổi, chỉ thay đổi thể tích DNA tương ứng với nồng độ DNA gốc, hiệu chỉnh thể tích H2O sao cho tổng thể tích của phản ứng PCR là 20 μl/1 phản ứng. Sản phẩm sau khi PCR được tiến hành điện di trên gel agarose 1,5%, hiệu điện thế 100V trong thời gian 40 phút với dung dịch TBE 0,5X, thể tích mẫu là 10µl. Dùng thang M (Marker) để so sánh kích thước các vạch của sản phẩm PCR, có độ dài 100bp, với thể tích thang M là 3 µl. 48
  61. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3.4 Khảo sát tính ổn định của quy trình PCR. Sau khi có được kết quả khảo sát về nhiệt độ lai, nồng độ MgCl2, hàm lượng DNA tối ưu của 15 cặp mồi microsatellite. Tiến hành chạy phản ứng PCR trên 28 mẫu DNA đại diện cho 4 nhóm quần đàn tôm sú (Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa, Nội Địa) nhằm kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR, độ hoạt động của các cặp mồi microsatellite sau khi đã được tối ưu hóa đồng thời sàng lọc chọn ra 10 cặp mồi có tính đa hình và đặc hiệu cao nhất để tiến hành chạy đồng loạt trên 80 mẫu DNA tôm sú nhằm đánh giá được sự đa dạng di truyền của các quần đàn. Phản ứng PCR cho từng cặp mồi được tiến hành trên các dĩa 96 giếng (Plates 96 well PCR) và thực hiện trên thiết bị luân nhiệt PCR iCycle (Bio – rad). Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 20μl, bao gồm các thành phần: buffer, dNTP, primer, Taq polymerase, MgCl2, DNA khuôn và nước cất 2 lần tiệt trùng, nồng độ và thể tích của từng thành phần được thể hiện dưới bảng 2.6. Bảng 2.6. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi microsatellite, DNA khuôn, Taq polymerase cho một phản ứng PCR. Thành phần Thể tích (µl) PCR buffer 10X 2,5 dNTP 10mM 1 MgCl2 25mM Nồng độ đã tối ưu Mồi xuôi (Forward Primer) 10 μM 1 Mồi xuôi (Reverse Primer) 10 μM 1 Taq polymerase 5U/μl 0,25 DNA khuôn 50ng/μl Hàm lượng đã tối ưu Nước cất 2 lần tiệt trùng Định mức đủ 20 49
  62. Đồ án tốt nghiệp Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt PCR icyle (Bio – rad) với chu trình nhiệt: Hình 2.2 Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp các cặp mồi Sản phẩm sau khi khuếch đại, sau đó được tiến hành diện di trên gel agarose 1,5%, hiệu điện thế 100V trong thời gian 40 phút, TBE 0.5X , thể tích mẫu là 10µl. Dùng thang M (Marker) để so sánh kích thước các vạch của sản phẩm PCR, có độ dài 100bp, với thể tích thang M là 3 µl. Thông thường sản phẩm PCR có 2 vạch, 1 vạch chính và 1 vạch phụ nhỏ hơn vạch chính 2 bp. Sự xuất hiện của vạch phụ là do quá trình trượt lỗi của DNA polymerase, vạch phụ có thể gây trở ngại cho việc xác định kích thước chính xác của vạch chính, nhưng vạch phụ cũng có thể được xem như một dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại đúng là microsatellite. Bằng cách này thì chúng ta cũng xác định được kích thước của sản phẩm PCR đồng thời đếm được số lần lặp lại của các nucleotide trên mỗi alen. 2.3. Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các phần mềm Cervus, Fstat, Genepop . Microsatellite allen được xác định bằng cách thống kê kích thước của các sản phẩm khuếch đại. Việc xác định kích thước được dựa vào kết quả điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose và so sánh với thang chuẩn. Các thông số về biến động di truyền bên trong quần thể như tần số allen (A), số allen trung bình của mỗi locus 50
  63. Đồ án tốt nghiệp (A), thông tin đa hình (Polymorphic Information Content – PIC), dị hợp tử quan sát và mong đợi (Ho và He), cân bằng Hardy – Weinberg (HWE) dựa vào Cervus (version 3. 0.3). Mức độ phong phú alen (allelic richness: Ar), giá trị khác biệt di truyền (Fst) được ước lượng bằng phần mềm Fstat (version 2.9.3) bằng cách chuẩn hóa biến dị alen về nhóm mẫu có số lượng thống nhất dựa vào FSTAT for Windows v. 2.9.3, GENEPOP v. 4.0. Xác suất chính xác Fisher về độ lệch so với HWE được tính theo chuỗi Markov (mức dememorization = 1000; số phân tích = 100; số lần lập lại trên mỗi lần phân tích = 5000). Kiểm định ý nghĩa thống kê đốí với các chỉ số trên được xét lại dựa trên hiệu chỉnh Bonferroni. Thêm vào đó sự vượt quá của đồng hợp tử đã xảy ra trong tất cả các quần thể được kiểm định về số allen trơ (null alleles) cũng đã được đánh giá bởi Cervus (version 3. 0.3), và sau đó tần số kiểu gene đã được kiểm tra và hiệu chỉnh lại theo đề nghị từ chương trình này. Đánh giá mức khác biệt bên trong và giữa các quần thể, giá trị thống kê Fst được ước lượng qua phân tích phương sai phân tử (ANOVA), Fst sau đó cũng được kiểm định để so sánh sự khác biệt ý nghĩa so với giá trị 0 bằng bootstrapping trong FSTAT v. 2.9.3 và cũng được xét lại dựa trên hiệu chỉnh Bonferroni . 51
  64. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52
  65. Đồ án tốt nghiệp 3.1 Kết quả trích ly DNA Các mẫu chân bơi tôm sú đại diện cho 4 quần đàn Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa, và Nội Địa được ly trích DNA theo quy trình DNA Salt extraction và cho kết quả như hình 3.1. Agarose 0.8%, 100V, 30 min Hình 3.1. Kết quả trích ly DNA trên mẫu chân bơi tôm sú Kết quả đại diện 28 mẫu DNA của 4 quần đàn Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương , Gia Hóa và Nội Địa cho thấy các băng vạch sáng, rõ nét, không bị nhiễm tạp, không bị đứt gãy, đạt yêu cầu và được sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo. Trong đó các giếng từ 1 đến 7 thuộc nhóm Ấn Độ Dương, giếng 8 đến 14 thuộc nhóm Thái Bình Dương, giếng từ 15 đến 21 thuộc nhóm Gia Hóa, giếng từ 16 đến 28 thuộc nhóm Nội Địa. Sau khi có kết quả điện di thì tiến hành đo OD để kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ của DNA sau khi tách chiết. Kết quả đo OD được thể hiện ở bảng 3.1 53
  66. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1.Kết quả đo OD kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của DNA Nhóm Mẫu OD 260nm/280nm Nồng độ (ng/µl) 1 1,832 145,2 2 1,960 124,3 3 1,821 137,1 Ấn Độ Dương 4 1,947 155,4 5 1,550 187,3 6 1,913 159,7 7 1,985 117,3 8 1,933 127,7 9 1,897 175,2 10 1,736 138,7 Thái Bình Dương 11 1,851 121,3 12 1,920 152,5 13 1,834 161,7 14 1,996 140,9 15 1,831 125,7 16 1,989 145,8 17 1,875 142,8 Gia Hóa 18 2,011 110,4 19 1,899 135,7 20 1,901 153,6 21 1,845 177,5 22 1,778 182,4 23 1,869 139,5 Nội Địa 24 1,882 138,6 25 1,925 129,3 26 1,997 165,5 54
  67. Đồ án tốt nghiệp 27 1,823 175,9 28 1,871 148,2 Từ bảng 3.1 cho thấy hầu hết các mẫu DNA sau khi tách chiết đều cho kết quả tỷ lệ OD260nm/280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2 (khoảng cho phép DNA không bị nhiễm tạp chất), chỉ có vài mẫu như mẫu số 5, 10, 22 là có tỷ số OD260nm/280nm nằm ngoài khoảng cho phép 1,8 – 2, có thể do trong quá trình hút dịch nổi không cẩn thận hút lẫn cặn đáy dẫn tới việc DNA sau khi tách chiết không tinh sạch, ngoài ra cũng có thể do cắt mẫu quá nhiều nhưng sử dụng lượng Proteinase K không đủ để phân hủy hết protein . Ba mẫu 5, 10, 22 được xử lý bằng cách tách chiết lại và tăng lượng Proteinase K để tăng hiệu quả của quá trình tách chiết DNA, sau đó kiểm tra trên gel agarose và đo quang thì kết quả DNA của 3 mẫu đều đạt chất lượng tốt để thực hiện phản ứng PCR. Từ kết quả trên cho thấy quy trình tách chiết DNA Salt extraction là thích hợp để có được chất lượng DNA tốt và nồng độ cao để thực phản ứng PCR. 3.2 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite Dựa vào nhiệt độ bắt cặp của 15 cặp mồi microsatellite mà các tác giả đã tối ưu và công bố, nhóm thực hiện đề tài đã tiến hành khảo sát lại dựa trên nhiệt độ tối ưu của ba tác giả đã công bố và dao động trong khoảng 4oC nhằm tìm ra nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho 15 cặp mồi phù hợp với điều kiện thiết bị, hóa chất ở phòng thí nghiệm. 3.2.1 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite W1 trên bốn mẫu tôm A09, T30, G30, N03 đại diện cho bốn vùng Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. 55
  68. Đồ án tốt nghiệp A09 T30 G30 N03 Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ Từ kết quả hình 3.2 cho thấy các vạch DNA có xu hướng đậm và rõ nét dần từ vị trí giếng số 1 đến giếng số 8, tương ứng với nhiệt độ giảm dần từ 58,50C xuống 52,50C tuy nhiên ở vị trí số 7 (tương ứng với nhiệt độ bắt cặp 530C) của cặp mồi microsatellite W1 thì cả 4 mẫu đại diện đều cho vạch DNA rõ nét hơn so với các vạch DNA khác , các vạch DNA này tương ứng với nhiệt độ bắt cặp đã nêu ở bảng 2.3 mục 2.2.3.1. Từ đó, có thể chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho cặp mồi microsatellite W1 là 53oC. 3.2.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite P1 trên bốn mẫu tôm A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. 56
  69. Đồ án tốt nghiệp A09 T30 G30 N03 Hình 3.3. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ Từ kết quả hình 3.3 cho thấy các vạch DNA được đánh số 5 (tương ứng với nhiệt độ bắt cặp 57,40C) của cặp mồi microsatellite P1 đều cho vạch DNA rõ nét hơn so với các vạch DNA khác, các vạch DNA này tương ứng với nhiệt độ bắt cặp đã nêu ở bảng 2.3 mục 2.2.3.1.Từ đó, có thể chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho cặp mồi Microsatellite P1 là 57,40C. 3.2.3. Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite L1 trên bốn mẫu tôm A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. 57
  70. Đồ án tốt nghiệp A09 T30 G30 N03 Hình 3.4. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ Từ kết quả hình 3.4 cho thấy các vạch DNA được đánh số 4 (tương ứng với nhiệt độ bắt cặp 61,20C) của cặp mồi microsatellite L1 đều cho vạch DNA rõ nét hơn so với các vạch DNA khác , các vạch DNA này tương ứng với nhiệt độ bắt cặp đã nêu ở bảng 2.3 mục 2.2.3.1. Từ đó, có thể chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho cặp mồi microsatellite L1 là 61,20C. Sau khi tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite trên 4 mẫu DNA ngẫu nhiên thuộc 4 quần đàn (độ lặp lại 2 lần). Kết quả cho thấy nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi micrrosatellite W2, W3, W4, W9, W10 là 530C, nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite L1, L3, L4 là 61,20C, nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite P1, P2, N1, N2 là 57,40C, nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite P4, P5, P7 là 49,50C. So với nhiệt độ bắt cặp tối ưu mà các tác giả đã khảo sát và công bố thì nhiệt độ bắt cặp do nhóm thực hiện đề tài tối ưu lại không chênh lệch nhiều. Cụ thể, đối với các cặp mồi W là 550C (Wuthisuthimethavee, 2003), nhiệt độ tối ưu lại là 530C, chêch lệch 20C. Theo Pan và ctv (2004) , các cặp mồi P1, P2 là 560C và P4, P5, P7 là 520C thì nhiệt độ tối ưu lại theo các cặp mồi lần lượt là: 57,40C và 49,50C độ chênh lệch tương ứng 1,40C và 2,50C. Đối với các cặp mồi L1, L3, L4 thì theo Li và ctv (2007) 58
  71. Đồ án tốt nghiệp nhiệt độ tối ưu là 600C, nhiệt độ khảo sát lại là 61,20C, độ chênh lệch là 1,20C. Đối với các cặp mồi N1, N2 thì theo Nahavandi và ctv (2011) nhiệt độ tối ưu là 560C, nhiệt độ khảo sát lại là 57,40C, độ chênh lệch là 1,40C. Qua đó, nhiệt độ mà nhóm thực hiện đề tài khảo sát lại không chênh lệch quá nhiều, điều này chứng tỏ nhiệt độ khảo sát lại là tối ưu cho từng cặp mồi phù hợp với điều kiện thiết bị hóa chất tại nơi thí nghiệm. Kết quả nhiệt độ tối ưu của 15 cặp mồi microsatellite sau khi khảo sát được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Nhiệt độ bắt cặp (Ta) sau khi tối ưu của 15 cặp mồi microsatellite. Số thứ tự Cặp mồi microsatellite Nhiệt độ bắt cặp Ta (0C) 1 L1 61,2 2 L3 3 L4 4 P1 57,4 5 P2 6 N1 7 N2 8 P4 49,5 9 P5 10 P7 11 W2 53 12 W3 13 W4 14 W9 15 W10 3.3 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu Dựa trên các kết quả nhiệt độ bắt cặp tối ưu đã được xác định ở bảng 3.2, tiếp tục tối ưu hóa nồng độ MgCl2 cho 15 cặp mồi microsatellite. Kết quả khảo sát nồng độ 59
  72. Đồ án tốt nghiệp MgCl2 minh họa cho các cặp mồi microsatellite W1, P1, N1 và L1 được thể hiện ở mục 3.3.1, 3.3.2, 3.3.3 và 3.3.4 dưới đây: 3.3.1 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite W1. 1.25 1.875 2.5 3.125 3.75 Hình 3.5. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. Hình 3.5 minh họa cho kết quả tối ưu hóa nồng độ MgCl2 của cặp mồi microsatellite W1. Thể tích và nồng độ MgCl2 khảo sát lần lượt được thể hiện theo bảng 2.4 mục 2.2.3.2. Ta thấy MgCl2 ở các nồng độ: 1,25mM, 1,875mM, 3,125mM, 3,75mM băng vạch DNA mờ, không rõ chứng tỏ rằng nồng độ MgCl2 chưa tối ưu. Điều này cho thấy các nồng độ MgCl2 này không phù hợp cho cặp mồi microsatellite W1. Vạch DNA với thể tích MgCl2 là 2μl tương ứng với nồng độ 2,5mM cho băng vạch DNA rõ và đậm, chứng tỏ ở nồng độ MgCl2 là 2,5mM là nồng độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite W1. 3.3.2 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite P1. 60
  73. Đồ án tốt nghiệp 1.25 1.875 2.5 3.125 3.75 Hình 3.6. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. Hình 3.6 minh họa cho kết quả tối ưu hóa nồng độ MgCl2 của cặp mồi microsatellite P1. Thể tích và nồng độ MgCl2 khảo sát lần lượt được thể hiện theo bảng 2.4 mục 2.2.3.2. Ta thấy MgCl2 ở các nồng độ : 1,25mM, 2,5mM, 3,125mM, 3,75mM băng vạch DNA mờ, không rõ chứng tỏ rằng nồng độ MgCl2 chưa tối ưu. Điều này cho thấy các nồng độ MgCl2 này không phù hợp cho cặp mồi microsatellite P1. Vạch DNA với thể tích MgCl2 là 1,5μl tương ứng với nồng độ 1,875mM cho băng vạch DNA rõ và đậm, chứng tỏ ở nồng độ MgCl2 là 1,875mM là nồng độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite P1. 3.3.3. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite L1. 61
  74. Đồ án tốt nghiệp 1.25 1.875 2.5 3.125 3.75 Hình 3.7. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. Hình 3.7 minh họa cho kết quả tối ưu hóa nồng độ MgCl2 của cặp mồi microsatellite L1. Thể tích và nồng độ MgCl2 khảo sát lần lượt được thể hiện theo bảng 3.4 mục 3.2.3.2.Ta thấy MgCl2 ở các nồng độ : 1,25mM, 1,875mM, 3,125mM, 3,75mM băng vạch DNA mờ, không rõ chứng tỏ rằng nồng độ MgCl2 chưa tối ưu. Điều này cho thấy các nồng độ MgCl2 này không phù hợp cho cặp mồi microsatellite L1. Vạch DNA với thể tích MgCl2 là 2μl tương ứng với nồng độ 2,5mM cho băng vạch DNA rõ và đậm, chứng tỏ ở nồng độ MgCl2 là 2,5mM là nồng độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite L1. 3.3.4. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite N1. 62
  75. Đồ án tốt nghiệp 1.25 1.875 2.5 3.125 3.75 Hình 3.8. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite N1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu. Hình 3.8 minh họa cho kết quả tối ưu hóa nồng độ MgCl2 của cặp mồi microsatellite N1. Thể tích và nồng độ MgCl2 khảo sát lần lượt đƣợc thể hiện theo bảng 2.4 mục 2.2.3.2.Ta thấy MgCl2 ở các nồng độ : 1,25mM, 1,875mM, 2,5mM, 3,125mM, băng vạch DNA mờ, không rõ chứng tỏ rằng nồng độ MgCl2 chưa tối ưu. Điều này cho thấy các nồng độ MgCl2 này không phù hợp cho cặp mồi microsatellite N1. Vạch DNA với thể tích MgCl2 là 3μl tương ứng với nồng độ 3,75mM cho băng vạch DNA rõ và đậm, chứng tỏ ở nồng độ MgCl2 là 3,75mM là nồng độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite N1. Sau khi khảo sát nồng độ MgCl2 của 15 cặp mồi microsatellite ta đưa ra được nồng độ MgCl2 tối ưu cho từng cặp mồi như bảng 3.3. 63
  76. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 15 cặp mồi microsatellite Tên mồi Nồng độ MgCl2 (mM) L1 2,5 L2 L3 P1 1,875 P2 P4 P5 P7 N1 3,75 N2 W2 2,5 W3 W4 W9 W10 3.4. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn. Sau khi có được kết quả tối ưu nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi và nồng độ MgCl2 tối ưu, tiếp tục khảo sát hàm lượng tối ưu của DNA khuôn để cho phản ứng PCR là ổn định nhất, phản ứng PCR ổn định sẽ góp phần cho việc đánh giá kết quả phân tích được tốt hơn. 3.4.1. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite W1 64
  77. Đồ án tốt nghiệp 25 50 75 100 Hình 3.9. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite W1 Nhìn vào hình 3.9, thấy hàm lượng DNA là 25ng, 50ng, 100ng trong thể tích 1 phản ứng là 20μl tương ứng với thể tích DNA là 0,5 μl, 1 μl, 2 μl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi microsatellte W1 mờ , không rõ vạch, chứng tỏ ở các hàm lượng DNA này thì phản ứng khuếch đại PCR của cặp mồi W1 chưa tối ưu. Ở hàm lượng 75ng trong thể tích phản ứng là 20 μl tương ứng với thể tích DNA là 1,5 μl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi W1 rõ nét và đậm, chứng tỏ ở hàm lượng DNA là 75ng trong thể tích phản ứng 20 μl là tối ưu cho cặp mồi microsatellite W1. 3.4.2. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite L1 65
  78. Đồ án tốt nghiệp 25 50 75 100 Hình 3.10. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite L1 Nhìn vào hình 3.10 ta thấy ở hàm lượng DNA là 25ng, 75ng, 100ng trong thể tích một phản ứng là 20μl tương ứng với thể tích DNA là 0,5 μl, 1,5 μl, 2 μl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi microsatellte L1 mờ , không rõ vạch, chứng tỏ ở các hàm lượng DNA này thì phản ứng khuếch đại PCR của cặp mồi L1 chưa tối ưu. Ở hàm lượng 50ng trong thể tích phản ứng là 20 μl tương ứng với thể tích DNA là 1μl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi L1 rõ nét và đậm, chứng tỏ ở hàm lượng DNA là 50ng trong thể tích phản ứng 20 μl là tối ưu cho cặp mồi microsatellite L1. 3.4.3. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite P1 66
  79. Đồ án tốt nghiệp 25 50 75 100 Hình 3.11. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite P1 Nhìn vào hình 3.11 ta thấy ở hàm lượng DNA là 25ng, 75ng, 100ng trong thể tích một phản ứng là 20μl tương ứng với thể tích DNA là 0,5 μl, 1,5 μl, 2 μl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi microsatellte P1 mờ , không rõ vạch, chứng tỏ ở các hàm lượng DNA này thì phản ứng khuếch đại PCR của cặp mồi P1 chưa tối ưu. Ở hàm lượng 50ng trong thể tích phản ứng là 20 μl tương ứng với thể tích DNA là 1μl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi P1 rõ nét và đậm, chứng tỏ ở hàm lượng DNA là 50ng trong thể tích phản ứng 20 μl là tối ưu cho cặp mồi microsatellite P1. 3.4.4. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite N1 67
  80. Đồ án tốt nghiệp 25 50 75 100 Hình 3.12. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite N1 Nhìn vào hình 3.12, thấy hàm lượng DNA là 25ng, 50ng, 100ng trong thể tích 1 phản ứng là 20μl tương ứng với thể tích DNA là 0,5 μl, 1 μl, 2 μl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi Microsatellte N1 mờ , không rõ vạch, chứng tỏ ở các hàm lượng DNA này thì phản ứng khuếch đại PCR của cặp mồi N1 chưa tối ưu. Ở hàm lượng 75ng trong thể tích phản ứng là 20 μl tương ứng với thể tích DNA là 1,5 μl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi N1 rõ nét và đậm, chứng tỏ ở hàm lượng DNA là 75ng trong thể tích phản ứng 20 μl là tối ưu cho cặp mồi Microsatellite N1. Tiến hành khảo sát hàm lượng DNA khuôn tương tự cho các cặp mồi microsatellite còn lại được bảng kết quả hàm lượng DNA khuôn tối ưu của 15 cặp mồi như bảng 3.4. 68