Đồ án Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô dược (Lindera myrrha)

109 trang thiennha21 13/04/2022 8010

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô dược (Lindera myrrha)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_hoat_tinh_khang_oxy_hoa_va_uc_che_qua_trinh_t.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô dược (Lindera myrrha)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HOÁ VÀ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP HẮC TỐ Ở LOÀI Ô DƯỢC (Lindera myrrha) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG ThS. LÊ QUỲNH LOAN Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ THUẬN MSSV: 1311100730 Lớp: 13DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài xin cam đoan đề tài này là công trình nghiên cứu của riêng người thực hiện đề tài dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoàng Dũng và Ths. Lê Quỳnh Loan. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực. Mọi tài liệu tham khảo dùng trong đề tài này đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố. Tất cả nội dung, sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung thực, người thực hiện đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP. Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Võ Thị Thuận i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, Ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ sinh học cùng thầy, cô bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu và kĩ năng để em hoàn thành tốt quá trình học tập, hoàn thành khóa luận này và làm nền tảng chuẩn bị cho công việc sau này. Trong suốt khoảng thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới. Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo cho em được làm đề tài tại đây. TS. Nguyễn Hoàng Dũng đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chi tiết công việc, luôn theo sát chỉ dẫn, động viên em, hỗ trợ kinh phí suốt quá trình làm khóa luận. ThS. Lê Quỳnh Loan đã hướng dẫn tận tình, giúp đỡ và hỗ trợ em trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp. Thầy Ngô Đức Duy đã tạo điều kiện, hỗ trợ em làm đề tài tốt nghiệp. Em xin chân thàh cám ơn cô Nguyễn Hoài Hương, phòng Vi sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài. Cám ơn tập thể lớp 13DSH02 đã cùng em trao đổi, cùng nhau học tập trong suốt bốn năm tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, cám ơn tập thể phòng Vi sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới đã động viên và hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng, con gửi lời cám ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã sinh ra và nuôi dạy con, cám ơn anh chị trong gia đình luôn bên cạnh động viên em trong suốt quá trình học tập và trưởng thành. ii
Đồ án tốt nghiệp Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình nghiên cứu, hoàn thiện đề tài này em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ phía quý Thầy Cô. Tp. Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Võ Thị Thuận iii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ix MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 3. Mục đích nghiên cứu 3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 5. Phương pháp nghiên cứu .4 6. Kết quả đạt được 4 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .5 8. Kết cấu Đồ án tốt nghiệp 5 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1.1. Giới thiệu chung về chi Lindera (Họ Lauraceae) 6 iv
Đồ án tốt nghiệp 1.1.1. Chi Lindera (Họ Lauraceae) 6 1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học 8 1.2. Tổng quan về cây ô dƣợc 9 1.2.1. Phân loại khoa học 9 1.2.2. Đặc điểm thực vật 10 1.2.3. Thành phần hoá học 12 1.2.4. Công dụng theo y học dân gian 12 1.3. Tổng quan về quá trình tổng hợp sắc tố da 12 1.3.1. Ảnh hưởng của tia cực tím (UV) trên người 12 1.3.2. Melanin 14 1.3.3. Vai trò của melanin 15 1.3.4. Phân loại melanin 16 1.3.5. Con đường tổng hợp hoá học melanin 17 1.3.6. Các lại bênh liên quan đến sắc tố 19 1.3.7. Một số hoạt chất ức chế quá trình tổng hợp melanin 22 1.4. Tổng quan về chiết xuất dƣợc liệu 27 1.4.1. Chiết xuất dược liệu 27 1.4.2. Phương pháp chiết xuất 29 1.4.3. Phương pháp Soxhlet 31 1.5. Hoạt tính kháng oxy hoá 31 1.5.1. Khái niệm về gốc tự do 31 1.5.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá 33 1.6. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 37 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 39 2.2. Vật liệu nghiên cứu 39 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 39 2.2.2. Dụng cụ - Thiết bị 39 2.2.3. Hoá chất 39 v
Đồ án tốt nghiệp 2.3. Quy trình thực hiện 40 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 41 2.4.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu 41 2.4.2. Quy trình chiết và thu nhận cao chiết 41 2.4.3. Phương pháp xác định thành phần hoá học 43 2.4.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH assay) 47 2.4.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào (B16F10) 49 2.4.6. Phương pháp xác định độc tính 49 2.4.7. Phương pháp xác định hàm lượng melanin 49 2.4.8. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 50 2.4.9. Xử lý số liệu 51 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1. Kết quả thu nhận cao tổng methanol ô dƣợc 52 3.2. Định tính thành phần cao tổng methanol ô dƣợc 53 3.3. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá của cao tổng methanol ô dƣợc 54 3.4. Khảo sát tác dụng của ô dƣợc lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10 56 3.5. Khảo sát tác dụng của ô dƣợc lên quá trình tổng hợp melanin 57 3.6. Kết quả chiết và thu nhận cao phân đoạn 58 3.7. Kết quả định tính thành phần hoá học cao phân đoạn 59 3.8. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá cao chiết phân đoạn 61 3.9. Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào u sắc tố B16F10 63 3.10. Kết quả xác định thành phần hoá học bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 4.1. Kết luận 67 4.2. Đề nghị 68 vi
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid DHI 5,6-dihydroxyindole DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid DMSO Dimethyl sulfoxide DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl HPLC High Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) IC50 Half maximal Inhibitory Concentration (Nồng độ của một chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme) MTT 3-(4,5- dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide PIH Post-inflammatory hyperpigmentation TRP-1 DHICA oxidation TRP-2 DOPA chrome tautomerase vii
Đồ án tốt nghiệp UV Ultraviolet (Tia cực tím). DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Dung môi khác nhau dung trong chiết xuất các nhóm hoạt chất trong dược liệu. 28 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao tổng methanol ô dược 53 Bảng 3.2. Kết quả xác định thành phần hoá học các mẫu cao phân đoạn ô dược 59 viii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Lindera 8 Hình 1.2. Một số hợp chất Sesquiterpenoids được xác định trong chi Lindera 8 Hình 1.3. Một số hợp chất alkaloids được xác định trong chi Lindera 9 Hình 1.4. Cây ô dược 11 Hình 1.5. Cấu trúc phân tử melanin (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) 14 Hình 1.6. Cấu tạo của da 14 Hình 1.7. Công thức hoá học của các loại melanin. 17 Hình 1.8. Hai nhóm chính của melanin. 17 Hình 1.9. Sơ đồ các con đường tổng hợp melanin 18 Hình 1.10. Các bệnh da tăng sắc tố. 20 Hình 1.11. Các bệnh giảm sắc tố. 21 Hình 1.12. Hydroquinone 23 Hình 1.13. Niacinamide (Vitamin B3) 23 Hình 1.14. Arbutin (4-Hydroxyphenyl-α-D-glucopyranoside) 24 Hình 1.15. Azelaic acid 25 Hình 1.16. Kojic acid 26 Hình 1.17. Vitamin C 26 Hình 1.18. Một số hợp chất ức chế quá trình tổng hợp melanin 27 ix
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.19. Bình ngấm kiệt 30 Hình 1.20. Dụng cụ chiết Soxhlet 31 Hình 1.21. DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 34 Hình 1.22. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do) 35 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình và phương pháp thực hiện 41 Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu 41 Hình 2.3. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do) 47 Hình 2.4. Sơ đồ điều kiện chạy sắc ký HPLC. 51 Hình 3.1. Mẫu ô dược 52 Hình 3.2. Mẫu được chiết ngâm dầm với dung môi Methanol và mẫu cao thu được. 53 Hình 3.3. Đồ thị thể hiện khả năng kháng oxy hóa của 55 Hình 3.4. Tác dụng của cao methanol ô dược lên độc tính tế bào. 56 Hình 3.6. Tác dụng của cao methanol ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. 57 Hình 3.5. Tế bào B16F10 melanoma thu nhận sau khi xử lý với cao methanol ô dược 57 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện hiệu suất thu hồi (%) của các cao phân đoạn ô dược 59 Hình 3.8. Đồ thị thể hiện khả năng chống oxi hóa của các cao dịch chiết. 61 Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 của các phân đoạn cao ô dược 62 Hình 3.10. Tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào u sắc tố B16F10 63 Hình 3.12. Phổ HPLC dịch cao chiết phân đoạn ethyl acetate ô dược 65 Hình 3.11. Phổ HPLC dịch cao chiết methanol ô dược 65 x
Đồ án tốt nghiệp xi
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Melanin là một hợp chất phenolic sinh học cao phân tử có vai trò quan trọng trong việc tạo nên sắc tố da ở người. Các hắc tố (melanin) trong da được sản xuất bởi tế bào hắc tố nằm trong lớp nền của biểu mô. Trong tế bào hắc tố, melanin được tổng hợp trong một bào quan đặc biệt gọi là melanosome. Melanosome chứa nhiều enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp melanin. Tuy nhiên, việc gia tăng lượng melanin tổng hợp ở biểu mô sẽ gây ra hiện tượng đen da hoặc một số bệnh về da như: nám da, tàn nhang và tăng sắc tố sau viêm do melanin được tích luỹ vượt mức ở biểu mô. Những biểu hiện bên ngoài của những bệnh này có thể có tác động mạnh đến tâm lý người bệnh cũng như làm giảm các hoạt động xã hội, hiệu quả trong công việc hay tự kỷ. Do đó, có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành và rất nhiều hoạt chất làm trắng da đang được sàng lọc. Tuy nhiên, tại nhiều quốc gia, các chất làm trắng da như hydroquinone, corticosteroids, các hợp chất chứa thủy ngân vẫn còn được sử dụng bất chấp tác dụng nguy hại của chúng. Một số chất khác như arbutin, kojic acid, vitamin C cũng đươc sử dụng nhưng những chất này có nhược điểm là hiệu quả không cao hoặc không bền. Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Không chỉ các nước phương Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh và làm đẹp. Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học tốt từ các loài thực vật làm mỹ phẩm đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là những hợp chất có thể ức chế quá trình tổng hợp melanin nhưng không gây chết cho tế bào và có nguồn gốc thiên nhiên độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp. 1
Đồ án tốt nghiệp Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng và phong phú. Theo thông kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ lợi ích” của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN) thì nước ta có khoảng gần 13.000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng làm thuốc. Trước kia, các cây thuốc dân gian đóng vai trò quan trọng trong việc chữa bệnh cho con người. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ thực vật đã được nghiên cứu và ứng dụng trực tiếp làm các chất dẫn đường cho một loạt các hợp chất ứng dụng mới trong các ngành công nghiệp như chữa bệnh, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm v.v Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu tính chất và tác dụng của các hợp chất thiên nhiên vẫn đang là nhiệm vụ của rất nhiều nha khoa học. Trong thế giới thực vật muôn màu, đa dạng, cây ô dược (Lindera myrrha Merr) là một loài thuộc chi Lindera, họ Long não (Lauraceae) được sử dụng để trị bệnh một số bệnh trong y học cổ truyền như: đau bụng, nôn mửa, trị tiểu nhiều lần hoặc đái dầm, trị chứng rối loạn tiêu hóa ăn không tiêu, và một số bệnh khác. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này đã chỉ ra sự có mặt của các lớp chất alkaloid, tinh dầu Nhiều hoạt chất trong số đó đã thể hiện nhiều hoạt tính sinh học tốt như: Borneol, Linderane, Linderalactone. Tuy nhiên, khả năng kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của ô dược chưa được nghiên cứu chuyên sâu. Do vậy, đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố từ loài ô dƣợc (Lindera myrrha Merr)” được thực hiện để tiến hành kiểm tra khả năng ức chế quá trình tổng hợp melanin từ ô dược. 2. Tình hình nghiên cứu  Tình hình nghiên cứu trên thế giới Cho đến nay, những nghiên cứu về loài ô dược vẫn chưa được công bố nhiều. Tuy nhiên, những nghiên cứu về những loài thuộc chi Lindera đã được công bố. Năm 1925, lần đầu tiên Kondo và cộng sự đã xác định được hợp chất lindeneol từ loài L. strychnifolia. Sau đó, năm 1964, takeda và cộng sự đã xác định được hơn 100 chất tương tự, những hợp chất này chủ yếu được phân lập từ L. strychnifolia, L. 2
Đồ án tốt nghiệp chunii và L. aggregate. Trong đó có một số hợp chất có tính chống ung thư, chống viêm và kháng vi – rút. Năm 2011, Kim và cộng sự đa tìm ra các hợp chất flavonoids (có dạng một phân tử flavone kết hợp với một hoặc hai nhóm p-methene) có tác dụng gây độc tế bào và ức chế sự phóng thích LDH từ các tế bào thần kinh H9c2. Chiết xuất L. aggregata thường được chỉ định để điều trị các bệnh về hệ tiết niệu như đái tháo đường và đá tiểu và có tác dụng rõ rệt đến viêm dạ dày mãn tính và viêm khớp mãn tính đã được Zang và Wang công bố năm 2000. Năm 2002, Lee và cộng sự đã công bố hợp chất lucitone có độc tính tế bào với các dòng tế bào ung thư B16 – F10, HT1080 và K562 với giá trị ED50 lần lượt là 2,2; 2,5 và 8,3 lg/ml.  Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Trong tài liệu những cây thuốc và vị thuốc ở Việt Nam, theo Đỗ Tất Lợi, loài ô dược ở Việt Nam được sử dụng như một vị thuốc nam có rất nhiều công dụng chữa bệnh như: trị đau bụng, chứng rối loạn tiêu hoá (ăn không tiêu, ợ hơi, ợ chua, buồn nôn ), tiểu nhiều lần hoặc đái dầm. Mặc dù loài ô dược đã được sử dụng trong y học cổ truyền, nhưng hiện nay ở Việt Nam chưa có hoạt tính ức chế hắc tố nào về loài này. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học cũng như các kinh nghiệm sử dụng dược liệu này trong dân gian và đặc thù loài tại Việt Nam để định hướng cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. 3. Mục đích nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ô dược. - Khảo sát khả năng ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của cao chiết ô dược. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 4.1. Giai đoạn 1 - Tiến hành chiết, cô quay chân không và thu cao methanol. - Định tính thành phần hoá học từ cao methanol. - Thử hoạt tính kháng oxy hóa từ cao methanol thu được. 3
Đồ án tốt nghiệp - Khảo sát tác dụng của ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. - Khảo sát tác dụng của ô dược lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10. 4.2. Giai đoạn 2 - Từ cao tổng methanol, tiến hành chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực khác nhau (hexan, chloroform, ethyl acetate), cô quay chân không và thu cao chiết. - Khảo sát tác dụng của các cao phân đoạn lên hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn. - Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao chiết ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. - Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao chiết ô dược lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10 4.3. Giai đoạn 3 Xác định thành phần hoá học cao ô dược bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu  Nghiên cứu lý thuyết - Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, thành phần hóa học và ứng dụng của loài ô dược. - Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách và xác định thành phần hóa học các chất từ thực vật. - Tổng hợp tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học và ứng dụng của loài ô dược.  Nghiên cứu thực nghiệm - Phương pháp lấy và xử lí mẫu. - Phương pháp tách chiết các hợp chất hữu cơ bằng dung môi: phương pháp chiết rắn – lỏng, chiết lỏng – lỏng. 4
Đồ án tốt nghiệp - Phương pháp xác định thành phần hoá: định tính và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Phương pháp sinh học thăm dò hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của cao chiết. - Phương pháp xác định độc tính của cao chiết lên tế bào.  Sử dụng phần mềm Sigma Plot version 10.0 và phần mềm Microsoft Excel 2010 để xử lý số liệu. 6. Các kết quả đạt đƣợc Chiết mẫu ô dược với dung môi, hiệu suất thu hồi 12,46%. Từ cao tổng methanol, chiết phân đoạn với bốn loại dung môi, hiệu suất thu hồi của phân đoạn cao hexan là 3,42%, chloroform 10,57% và ethyl acetate 23,45%, nước 43,02%. Định tính thành phần hoá học, kết quả cho thấy các mẫu cao đều chứa nhiều hợp chất hoá học như: alkaloid, carbohydrate, flavonoid, chất béo, protein. Cao methanol từ cây ô dược cho hiệu quả ức chế quá trình tổng hợp melanin và không gây độc cho tế bào ở nồng độ 200 g/ml. Cao methanol có khả năng bắt gốc tự do cao với IC50 = 58,89 g/ml. Phân đoạn Ethyl acetate có khả năng bắt gốc tự do cao nhất trong các phân đoạn với IC50 = 10,71 g/ml. Cho hiệu quả ức chế tổng hợp melanin và không gây độc với tế bào ở nồng độ 200 g/ml. 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Những kết quả nghiên cứu sẽ góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao ô dược, qua đó góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của cây ô dược trong ngành dược liệu. 8. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp Kết cấu của đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương: - Chương 1: Tổng quan tài liệu - Chương 2: Vật liệu và phương pháo nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Chương 4: Kết luận và đề nghị. 5
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về chi Lindera (Họ Lauraceae) 1.1.1. Chi Lindera (Họ Lauraceae) Chi Lindera thuộc họ Long não (Laraceae) hay còn gọi là Nguyệt quế, gồm khoảng 100 loài, phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, đặc biệt là các nước Đông Nam Á và Brazil. Chúng chủ yếu là các loại thân gỗ hay cây bụi có hương thơm (Võ Văn Chi, 1997). Cây gỗ có cành non màu xanh, vỏ có mùi thơm, thường có chồi ngủ đông. Lá thường mọc cụm đầu cành, có ba gân chính hay hệ gân đơn giản. Hoa mẫu ba, thường có nhị lép và tuyến mật ở gốc chỉ nhị. Quả thường có đài dính liền, phát triển thành dạng đấu dưới quả (Phạm Hoàng Hộ, 1991) (Hình 1.1). Theo thông kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ lợi ích” của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), Lindera không chỉ mang giá trị kinh tế cao mà bên cạnh đó nó còn mang tính dược lý và sinh học như khả năng chống ung thư, cao huyết áp, kháng viêm và được dùng làm thuốc giảm đau. Các nghiên cứu đã tìm ra được khoảng 341 thành phần có trong cây bao gồm sesquiterpenoids, alkaloids, butanolides, lucidones, flavonoids và phenylpropanoids. Butanolides và lucidones quyết định khả năng chống ung thư, trong khi aporphine alkaloids lại quyết định khả năng kháng viêm và giảm đau. Tuy vậy, những hợp chất này cần được đánh giá thêm, thông qua các nghiên cứu chuyên sâu. Cây thuộc họ Lauraceae mang giá trị kinh tế cao vì một số loài của chúng được ứng dụng rộng rãi làm nguồn gia vị, dầu thơm và đặc biệt là dược liệu. Hơn nữa, chúng còn đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái vì là loài cây chiếm ưu thế trong các khu rừng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Gentry, 1988; Van der Werff và Richter, 1996). Lindera, một chi chính trong họ Lauraceae, phân bố rất rộng rãi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới ở Châu Á và Trung Tây Mỹ, bao gồm khoảng 100 loài (Flora Republicae Popularis Sinicae, 1982). 6
Đồ án tốt nghiệp Hầu hết các loài trong chi Lindera chứa một lượng dầu rất lớn, ứng dụng tốt trong việc sản xuất xà phòng, chất bôi trơn và dùng để tách chiết acid lauric. Nhiều loài khác thì được dùng trong việc sản xuất gia vị, nước hoa và vật liệu xây dựng. Đáng nói nhất đó là tính dược liệu của chi. Những chiết xuất từ củ, thân, lá, rễ có công dụng ấm thận, giảm đau, chán nản (17 công thức trong “Dược điển Trung Quốc”); điều trị các bệnh tiết niệu như đái dầm, sỏi thận và dùng để chữa trị viêm khớp, viêm dạ dày mãn tính. Ngoài ra, lá của một số loài thuộc chi Lindera như L. aggregate còn điều trị viêm vú, viêm tế bào da, mụn nhọt (Han và cộng sự, 2008). Lá tươi xào với rượu gạo có thể điều trị bệnh thấp khớp. Chiết xuất của L. aggregate tại Nhật Bản được dùng để điều trị bệnh đột quỵ và bệnh tả (Chou và cộng sự, 2000). Vỏ cây của loài L. obtusiloba dùng làm tan máu bầm, thông cổ. Rễ của L. glauca điều trị mệt mỏi, viêm khớp (Zang và Wang, 2000). Rễ, vỏ cây và cành của L. umbellata chữa loét dạ dày, đau bụng, bệnh tả, tê phù, chống co thắt (Tanaka và cộng sự, 1985). Lindera glauca Lindera aggregate Lindera myrhaa Lindera obtusiloba 7
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Lindera 1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học Trong tổng thể, 341 chất chuyển hóa thứ cấp đã được cô lập và xác định từ chi Lindera cho đến nay. Những thành phần chủ yếu gồm có bảy loại: sesquiterpenoids, alkaloids, butanolides, lucidones, flavonoids, phenylpropanoids và các loại khác. Trong đó, sesquiterpenoids và alkaloids là thành phần chiếm ưu thế (Hình 1.2, hình 1.3). 1.1.2.1. Sesquiterpenoids Năm 1925, Kondo và cộng sự lần đầu tiên đã xác định được hợp chất lindeneol từ loài L. strychnifolia. Năm 1964, Takeda và cộng sự đã xác định được hơn 100 chất tương tự. Nhìn chung, những hợp chất này được phân lập từ L. strychnifolia, L. chunii, và L. aggregata. Một số hợp chất có đặc tính kháng ung thư, kháng viêm và R1: OH R1: OH R2: H R2: H R: H Lindeneol Linderene Lindenenone Lindestrene Linderalactone 1,4-Dimethyl-7- Linderazulene ethylazulene Hình 1.2. Một số hợp chất Sesquiterpenoids được xác định trong chi Lindera kháng vi-rút. 8
Đồ án tốt nghiệp 1.1.2.2. Alkaloids Alkaloids là một trong những chất chuyển hoá thứ cấp phổ biến nhất và là thành phần quan trọng trong chi Lindera. Đa số các hợp chất alkaloids có tác dụng giảm huyết áp, chống viêm và giảm đau đáng kể. Năm 2000, Chang và cộng sự đã xác định được những hợp chất alkaloids từ 10 loài Lindera như: aporphines, benzylinocinolines, isopavines, proaporphine. R1: H R1: H R2, R3: -CH2- R2: OCH2O R4, R5: -CH2- R3: OCH2O R6: H R4: H Hernandonine Lindechunine B R : H 1 R2: H N-p-Coumaroyltyramine Squamolone R: H Hernovine Northalifoline Hình 1.3. Một số hợp chất alkaloids được xác định trong chi Lindera 1.2. Tổng quan về cây ô dƣợc 1.2.1. Phân loại khoa học Giới: Thực vật (Plantae) 9
Đồ án tốt nghiệp Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ: Long Não (Laurales) Họ: Long não (Lauraceae) Chi: Lindera Loài: Lindera Myrrha Merr Cây ô dược có tên khoa học là Lindera myrrha (Lour.) Merr. Ngoài ra còn có các đồng danh khoa học là: Lindera myrrha (Lour.) Merr, Laurus myrrha Lour (Hình 1.4). Tại Việt Nam, cây ô dược còn được gọi là: thiên thai ô dược, bàng tỵ, bàng kỳ, nuy chướng, nuy cước chướng, đài ma, phòng hoa, thai ô dược, thổ mộc hương, tức ngư khương, kê cốt hương, bạch diệp sài, cây dầu đắng, ô dược nam (Lê Đình Sáng, 2010). 1.2.2. Đặc điểm thực vật Ô dược là một cây gỗ nhỏ: Thân cao độ 1,3 - 1,4 m, cành non, gầy, màu đen nhạt, có long vàng hoe, khi già trở nên nhẵn (Đỗ Tất Lợi, 2000). Lá mọc so le, hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 6 cm, rộng 2 cm, đầu lá thót thành đuôi ngắn, gốc hơi tròn, mặt trên nhẵn bóng, mặt dưới có lông, có ba gân, hai gân phụ bắt đầu từ điểm cách cuống lá 2 mm, dài ra chừng 2/3 lá, mặt trên lõm, mặt dưới lồi lên. Cuống dài 7 - 10 mm, lúc đầu có lông, sau nhẵn, mặt trên hõm thành rãnh (Đỗ Tất Lợi, 2000). Cụm hoa tán đơn tính, hợp thành tán nhỏ, mọc ở nách lá, không cuống, đường kính 3 - 4 mm. Bao hoa 6 thùy, ở hoa đực, nhị hữu thụ 9, xếp 3 vòng, vòng trong cùng mỗi nhị có 2 tuyến, nhị lép 3. Bầu gần hình cầu, có lông, vòi cong. Quả mọng hình trứng khi chín có màu đỏ, một hạt (Đỗ Tất Lợi, 2000). Rễ ô dược đa số hình thoi, hơi cong, hai đầu hơi nhọn, phần giữa phình to thành hình chuỗi dài khoảng 10 - 13 cm, đường kính ở chỗ phình to là 1 - 2 cm. Mặt ngoài màu nâu vàng hoặc màu nâu nhạt vàng, có vết của rễ tơ đã rụng, có vằn nứt 10
Đồ án tốt nghiệp ngang và nếp nhăn dọc. Cứng, khó bẻ gãy, mặt cắt ngang màu nâu nhạt, hơi hồng, hơi có bột, ở giữa màu đậm hơn, có vằn tròn, và vằn hoa cúc. Mùi hơi thơm, vị hơi đắng, cay (Đỗ Tất Lợi, 2000). Toàn cây có mùi thơm, vị đắng (Đỗ Tất Lợi, 2000). Mùa hoa nở rộ tháng 4, ở phía Nam mùa hoa sớm hơn. Cây tái sinh bằng hạt (Lê Đình Sáng, 2010). Hình 1.4. Cây ô dược 11
Đồ án tốt nghiệp Ở Việt Nam, cây thường mọc hoang ở nhiều tỉnh toàn miền Bắc. Nhiều nhất tại các tỉnh miền Trung như: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh. Tại Bắc Bộ, có ở Hòa Bình, Hà Tây. Trên thế giới, cây mọc nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc (Đỗ Tất Lợi, 2000). 1.2.3. Thành phần hoá học Trong ô dược, người ta xác định được các chất ankaloids như linderan C8H10O2, linderen C8H14O2, rượu linderola C11H22O và axit linderic C15H18O3 và este của rượu linderola. Ngoài ra, người ta còn xác định được một xeton với công thức C15H18O2 và một chất linderazulen với công thức C14H16 (Đỗ Tất Lợi, 2000). 1.2.4. Công dụng theo y học dân gian Trong y học cổ truyền, rễ cây ô dược được dùng làm dược liệu và được bào chế bằng cách: - Hái thứ rễ bàng chung quanh có từng đốt nối liền nhau, bỏ vỏ, lấy lõi, sao qua họăc mài (Lê Đình Sáng, 2010). - Đào rễ, cắt bỏ rễ con, rửa sạch, phơi khô. Nếu thái miếng thì rễ tươi lấy về, cạo sạch vỏ ngoài (có khi không cạo) ngâm vào nước thỉnh thoảng thay nước rồi thái thành từng miếng mỏng phơi khô (Đỗ Tất Lợi, 2000). Có tác dụng điều trị các triêu chứng như: trị đau bụng do trúng hàn khí trệ, đau bụng kinh, tiểu nhiều lần hoặc đái dầm, chứng rối loạn tiêu hóa: ăn không tiêu đầy bụng, ợ hơi, ợ chua, nôn, buồn nôn (Đỗ Tất Lợi, 2000). Ô dược có tác dụng hai mặt đối với cơ trơn bao tử và ruột, có tác dụng làm tăng nhu động ruột, giúp ruột bài khí, đồng thời làm giảm trương lực của ruột thỏ cô lập. Ô dược có thể làm tăng tiết dịch ruột (Đỗ Tất Lợi, 2000). Bột ô dược khô có tác dụng rút ngắn thời gian tái canxi hóa của huyết tương, rút ngắn thời gian đông máu và có tác dụng cầm máu (Đỗ Tất Lợi, 2000). 1.3. Tổng quan về quá trình tổng hợp sắc tố da 1.3.1. Ảnh hưởng của tia cực tím (UV) trên người Cuộc sống trên trái đất kể từ khi ra đời đã phụ thuộc vào một nguồn năng lượng mặt trời. Trong quang hợp, sinh vật như vi khuẩn, tảo và các thực vật bậc cao 12
Đồ án tốt nghiệp sử dụng chất diệp lục để thu năng lượng từ khu vực cụ thể của quang phổ của mặt trời, cho phép nó được chuyển đổi thành năng lượng hóa học sử dụng trong các hình thức của phân tử đường, với oxy phân tử như một sản phẩm phụ quan trọng. Mặc dù chúng ta được hưởng rất nhiều tác dụng có lợi của năng lượng bức xạ mặt trời, nhưng con người cũng rất nhạy cảm với những tác động có hại của một thành phần của quang phổ: ánh sáng cực tím (Przemyslaw và Maja, 2006). Tia cực tím hay tia tử ngoại, tia UV (Ultraviolet) là sóng điện từ có bước sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy nhưng dài hơn tia X, có bước sóng từ 100 đến 400 nm. Phổ tia cực tím có thể chia ra thành tử ngoại gần (có bước sóng từ 380 đến 200 nm) và tử ngoại xạ hay tử ngoại chân không (có bước sóng từ 200 đến 10 nm) (Andrzej và John, 1988). Khi quan tâm đến ảnh hưởng của tia cực tím lên sức khỏe con người và môi trường, thì phổ của tia cực tím chia ra làm các phần: UVA (380 - 315 nm), hay gọi là sóng dài hay "ánh sáng đen", UVB (315 - 280 nm) gọi là bước sóng trung bình và UVC (ngắn hơn 280 nm) gọi là sóng ngắn hay có tính tiệt trùng. UV chân không với bước sóng 100 - 200 nm và UVC (200 - 290 nm) có tác dụng gây đột biến và gây chết người (Andrzej và John, 1988). UVC: Do là vùng bức xạ có năng lượng cao nhất nên tia UVC có khả năng gây tổn hại nhất cho đôi mắt và làn da. Tuy nhiên hiện nay do nhiều tác động, tầng ozone bảo vệ trái đất đang ngày càng yếu (mỏng đi và có nhiều lỗ thủng) nên có khả năng cho phép các bức xạ năng lượng cao UVC lọt xuống bề mặt trái đất, rất dễ gây nên các vấn đề sức khỏe trầm trọng. UVB: Các bức xạ UVB thì có thể đi xuyên qua tầng ozone (mặc dù cũng đã được lọc một phần). Chúng chỉ chiếm khoảng 3% trong phổ tia UV do mặt trời chiếu và đi xuống tới trái đất, và rất hiệu quả trong việc kích thích gây cháy nắng và sắc tố của da người. UVA: Đây là lượng bức xạ cực tím có nhiều nhất (chiếm tới 97%), do chúng 13
Đồ án tốt nghiệp dễ dàng xuyên qua tầng ozone. Tia UVA có thể xuyên qua giác mạc, đi vào thủy tinh thể hay võng mạc ở bên trong mắt. UVA được chia thành UVA1 (320 - 340 nm) và UVA2 (340 - 400 nm). Khi da tiếp xúc thường xuyên với ánh nắng mặt trời mà không được bảo vệ có thể làm hư hại cho DNA, thậm chí làm đột biến các tế bào da do bị biến đổi về cấu trúc và sinh hóa. Tia UVB gây ban đỏ ngay lập tức, đồng thời kích thích hắc tố melanin và gây ung thư da. Quan trọng hơn, UV gây đột biến dẫn đến ung thư tế bào đáy và tế bào vảy (Wang và Lin, 2006; Andrzej và John, 1988). 1.3.2. Melanin Melanin là một thuật ngữ chung dành cho một nhóm các sắc tố tự nhiên được tìm thấy trong hầu hết các sinh vật. Nó cũng được tìm thấy trong tóc, các tế bào sắc tố nằm bên dưới tròng đen của mắt và trong chất xám ở não người (Solano và cộng sự, 2006) (Hình 1.5). Hình 1.5. Cấu trúc phân tử melanin (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) Melanin là một hợp chất phenolic sinh học cao phân tử có vai trò quan trọng trong việc tạo nên sắc tố da ở người. Các hắc tố (melanin) trong da được sản xuất bởi tế bào hắc tố nằm trong lớp nền của biểu mô (Hình 1.6). Trong tế bào hắc tố, melanin được tổng hợp trong một bào quan đặc biệt gọi là melanosome. Melanosome chứa nhiều enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp melanin (Meredith và Riesz, 2004). 14 Hình 1.6. Cấu tạo của da
Đồ án tốt nghiệp Trong da, sự hình thành hắc tố xảy ra sau khi tiếp xúc với bức xạ tia cực tím, khiến làn da chuyển màu rám nắng mặt trời rõ ràng. Melanin là một chất hấp thụ ánh sáng hiệu quả (hơn 99,9% tia UV hấp thụ) (Meredith và Riesz, 2004). Bởi vì đặc tính này, melanin có tác dụng bảo vệ tế bào da khỏi tác hại bức xạ UV, giảm nguy cơ ung thư da. Tuy nhiên, việc gia tăng lượng melanin tổng hợp ở biểu mô sẽ gây ra hiện tượng đen da. Ngoài ra, một số bệnh về da có thể dẫn đến việc tích lũy vượt mức melanin ở biểu mô. Các bệnh này bao gồm nám da, tàn nhang và tăng sắc tố sau viêm, người không có sắc tố melanin gọi là bạch tạng (hypopgimentation) đây là một loại bệnh rối loạn quá trình tổng hợp sắc tố melanin bẩm sinh (Solano và cộng sự, 2006). Trong một thời gian dài, khoa học đã chứng minh được rằng thiếu hoặc không có melanin là một loại bệnh lý mang tính di truyền không tốt cho sức khỏe con cái đời sau. 1.3.3. Vai trò của melanin Ở người, melanin được tìm thấy trong da, tóc, tế bào biểu mô sắc tố nằm dưới võng mạc, tủy xương và lớp trong của tuyến thượng thận, vân mạch của tai trong, và sắc tố mang tế bào thần kinh của một số hạt nhân não sâu (Chen và cộng sự, 2009). 15
Đồ án tốt nghiệp Melanin là sắc tố tự nhiên của da, quy định màu sắc của da. Melanin nằm phân bố rải rác ở dưới lớp đáy của thượng bì. Sự hình thành melanin cần có sự tác động của men Tyrosinase và về lâu dài có sự tham gia của tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời. Ngoài ra, sự tạo thành melanin còn chịu ảnh hưởng của yếu tố nội tiết và thần kinh. Melanin chính là yếu tố quyết định màu da của mỗi người (Chen và cộng sự, 2009). Melanin cung cấp nhiều lợi ích cho con người. Một trong những lợi ích được công nhận nhiều nhất liên quan đến tia cực tím của mặt trời. Melanin giúp bảo vệ da chống lại các tác hại của tia cực tím, ngăn chặn tia cực tím có hại và không cho chúng thâm nhập vào cơ thể một cách tự nhiên (Chen và cộng sự, 2009). Melanin là một chất hấp thụ ánh sáng hiệu quả (hơn 99,9% tia UV hấp thụ). Melanin cũng rất quan trọng cho độ sắc nét của thị lực, có tác dụng làm giảm thiểu số lượng của chùm ánh sáng vào mắt. Ngoài ra melanin còn là chất chống oxy hóa, chất kháng khuẩn, vi sinh vật và nấm bệnh gây hại cho cơ thể (Wang và Lin, 2006). 1.3.4. Phân loại melanin Ở người, có ba loại cơ bản của melanin: eumelanin, pheomelanin, và neuromelanin. Tuy nhiên, eumelanin và pheomelanin là hai nhóm chính (Ana và cộng sự, 2003) (Hình 1.7, hình 1.8). Eumelanin: là loại melanin phổ biến nhất, trong đó có hai loại eumelanin nâu và eumelanin đen. Eumelanin thường được tìm thấy ở da và mắt và xuất hiện nhiều hơn ở những người có làn da đen (Andrzej và John, 1988). Trong tế bào melanocyte, eumelanin được tổng hợp trong một bào quan đặc biệt gọi là eumelanosome. Eumelanin không tan, có hình dạng elip và có nguồn gốc từ sự oxi hóa hiếu khí của tyrosine với sự có mặt của enzym tyrosinase (Meredith và Riesz, 2004). Pheomelanin cũng được tìm thấy trong tóc và da, xuất hiện nhiều ở những người có làn da trắng hơn. Pheomelanin là một cysteine chứa polymer đỏ của đơn vị benzothiazine chủ yếu chịu trách nhiệm cho tóc màu đỏ, do pheomelanin được tổng hợp trong pheomalanosome. Các pheomelanin tan trong dung dịch kiềm, dạng hình cầu, có màu từ vàng đến nâu đỏ (Ana và cộng sự, 2003). 16
Đồ án tốt nghiệp Neuromelanin được tìm thấy trong não, tuy nhiên chức năng vẫn còn mơ hồ (Brenner và Hearing, 2008). (B) (A) (C) Hình 1.7. Công thức hoá học của các loại melanin. (A) Eumelanin; (B) Pheomelanin; (C) Neuromelanin Hình 1.8. Hai nhóm chính của melanin (Ana và cộng sự, 2003). (A) (B) (A) Eumelanin, (B) Phenomelanin 1.3.5. Con đường tổng hợp hoá học melanin 17
Đồ án tốt nghiệp Quá trình tổng hợp melanin diễn ra trong bào quan có màng bị ràng buộc gọi melanosome, trong đó có chứa các enzyme cụ thể kiểm soát việc sản xuất các sắc tố. Hình 1.9. Sơ đồ các con đường tổng hợp melanin (Andrzej and John, 1988) Bước đầu tiên là hạn chế tỷ lệ hình thành hắc tố melanin được trung gian bởi enzyme tyrosinase xúc tác chuyển hóa tyrosine thành 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) và tiếp theo là quá trình oxy hóa DOPA thành DOPA quinone. Bằng cách tự oxy hóa và tạo vòng tự phát, DOPA sản xuất 5,6-dihydroxyindole (DHI) melanin. Khi có sự hiện diện của enzyme tyrosinase thì enzyme sẽ xúc tác protein 2 (TRP-2) còn được gọi là DOPA chrometautomerase tạo thành 5,6-dihydroxyindole-2- carboxylic acid (DHICA). TRP-1 còn được gọi là DHICA oxidase, có chức năng thúc đẩy quá trình oxy hóa và trùng hợp của DHICA melanins. Hơn nữa, nếu sulphydryl (Glutathione hay cysteine) có sẵn khi DOPA quinone được tạo ra, thì Cysteinyl DOPA có thể được hình thành. Sau đó Phaeomelanin được sản xuất bằng 18
Đồ án tốt nghiệp cách thực hiện quá trình oxy hóa, tạo vòng và trùng hợp (Andrzej và John, 1988) (Hình 1.9). 1.3.6. Các lại bênh liên quan đến sắc tố 1.3.6.1. Bệnh gia tăng sắc tố Mặc dù hắc tố melanin có vai trò giảm sự mẫn cảm của da đối với tia tử ngoại, nhưng melanin chính là nguyên nhân làm tăng sản lượng và tích tụ melanin gây ra bệnh da tăng sắc tố. Sự gia tăng sắc tố của da thường xảy ra và biểu hiện trong một loạt các hình thức khác nhau (Jimbow và cộng sự, 1976). Bởi vì ta có thể nhìn thấy bản chất của bệnh ngoài da, chúng tác động đáng kể đến tâm lý trên bệnh nhân bị ảnh hưởng. Tổn thương hay biến dạng trên khuôn mặt, có thể ảnh hưởng đáng kể đến cảm xúc hạnh phúc của người này và có thể góp phần giảm chức năng ở xã hội, năng suất tại nơi làm việc hay trường học, và lòng tự trọng (Briganti và cộng sự, 2003). Các bệnh có biểu hiện tăng sắc tố ở da bao gồm một số bệnh có căn nguyên di truyền hay bẩm sinh, do rối loạn chuyển hoá, do nội tiết, do hoá chất hoặc thuốc, do dinh dưỡng, yếu tố vật lý và các nguyên nhân khác. Ba trong số các rối loạn tăng sắc tố phổ biến hơn bao gồm bệnh rám má (melasma), sạm da (lentigo), và hội chứng tăng sắc tố sau viêm (post -inflammatory hyperpigmentation) (PIH) (Briganti và cộng sự, 2003) (Hình 1.10). Bệnh rám má (melasma): Bệnh lành tính, tuy không mấy ảnh hưởng đến sức khỏe nhưng bệnh nám da lại được rất nhiều phụ nữ quan tâm bởi nó ảnh hưởng đến sắc đẹp và gây phiền toái mất tự tin cho phụ nữ. Bệnh thường có các biểu hiện lâm sàng ở hai bên má, trán, cằm, mũi xuất hiện những vết màu nâu, hay xanh đen, sắp xếp đối xứng. Kích thước của thương tổn thay đổi khi nhỏ khi to. Bờ rõ nhưng không đều. Màu sắc thương tổn thường xạm như chì, đồng đều, đôi khi có nâu hay đen xạm. Thương tổn không teo da, không bong vảy da và không có ngứa. Bệnh sạm da (lentigo): là tình trạng nhiều dát tăng sắc tố đều, rời rạc, màu sắc thay đổi từ nâu nhạt tới đen. Lentigo kéo dài, nhạt màu đi khi ngưng tiếp xúc ánh sáng mặt trời. Là những thương tổn lành tính gặp ở bất kỳ vùng da hay niêm 19
Đồ án tốt nghiệp mạc nào. Có thể là biểu hiện của một bệnh về gene hay liên quan đến trị liệu tia cực tím. Hội chứng tăng sắc tố sau viêm, vùng da bị tổn thương, lành lại rồi để lại vết thâm. Các nguyên nhân gây ra PIH: bị mụn để lại thâm, nhất là mụn nang, sưng to dưới da, chấn thương cơ học để lại sẹo và thâm, thậm chí các trị liệu thẩm mỹ mài mòn da, lột da hóa học, laser, IPL. Cơ bản khi da bị tổn thương ở đâu, lượng melanin ở đó sẽ nhiều hơn, khi da lành sẽ rất dễ để lại vết thâm. (A) (B) (C) (D) Hình 1.10. Các bệnh da tăng sắc tố (Briganti và công sự, 2003). (A, B) Sạm da, (C) Rám má, (D) Hội chứng tăng sắc tố sau viêm 20
Đồ án tốt nghiệp 1.3.6.2. Bệnh mất sắc tố Da bị sạm màu luôn là vấn đề khiến chúng ta xấu hổ và khó chịu. Thế nhưng, còn có một loại rối loạn sắc tố da nữa cũng ảnh hưởng không nhỏ đến những người mắc (A) (B) (C) (D) Hình 1.11. Các bệnh giảm sắc tố. (A) Bệnh bạch biến, (B) bệnh bạch tạng, (C) Bệnh vẩy nến, (D) bệnh vẩy đốm trắng phải chúng, đó chính là giảm sắc tố da. Giảm sắc tố da, hay còn gọi là mất sắc tố da, là kết quả của việc sụt giảm lượng melanin sản sinh trong cơ thể. Khi mắc chứng rối loạn sắc tố da này, da bạn sẽ bị viêm và phần nào mất đi màu sắc của nó. Giảm sắc tố da có thể có nhiều dạng biểu hiện khác nhau như lang ben, bạch tạng (Briganti và cộng sự, 2003) (Hình 1.11). Bệnh bạch biến: loại mất sắc tố này là một dạng bệnh tự miễn khi các tế bào sản xuất sắc tố bị tổn thương. Bệnh bạch biến gây ra các mảng màu trắng, mềm mịn trên da của bạn và có thể xuất hiện ở bất kì nơi nào trên cơ thể. Bệnh bạch 21
Đồ án tốt nghiệp biến có thể ảnh hưởng tới tất cả mọi người, nhưng những người có làn da tối màu dễ mắc phải bệnh này hơn. Bạch tạng: tình trạng này rất hiếm và thường xảy ra khi bạn mắc phải bệnh rối loạn do mất một loại enzym sản xuất melanin trong cơ thể. Kết quả là người bị bệnh bạch tạng có một loại gen bất thường khiến cho cơ thể không sản sinh ra sắc tố melanin. Người bị bệnh bạch tạng sẽ có tóc trắng, da trắng, hoặc mắt cũng trắng do sự thiếu hụt sắc tố. Người da trắng dễ bị mắc hội chứng này hơn so với các chủng tộc người khác. Các rối loạn sắc tố khác: bao gồm vẩy phấn trắng, lang ben, mất sắc tố sau viêm, viêm da trên cơ địa dị ứng, bệnh vẩy nến. 1.3.7. Một số hoạt chất ức chế quá trình tổng hợp melanin Hiện nay có rất nhiều chất có khả năng ức chế quá trình tổng hợp melanin được sử dụng trong mỹ phẩm cũng như trong việc điều trị các bệnh liên quan đến rối loạn làm tăng lượng sắc tố. 1.3.7.1. Hydroquinone Là một đồng phân của benzene làm trắng da bằng cách triệt tiêu các tế bào melanocytes sản sinh melanin (Hình 1.12). Mặc dù được coi là cách làm trắng da nhanh nhất cho đến thời điểm hiện tại, nó vẫn không thể làm trắng da ngay tức thì được do không có khả năng triệt tiêu các melanin đã vốn có. Các melanin này phải đợi để được đào thải qua quá trình bong da chết thường là vài tuần có khi vài tháng (O’Donoghue, 2006). Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy hydroquinone có tác dụng phụ rất lớn, nếu sử dụng lâu dài còn gây nên hiện tượng bị tối màu mảng da (O’Donoghue, 2006). Một số nghiên cứu còn đưa ra được mối quan hệ của việc sử dụng 22
Đồ án tốt nghiệp hydroquinone với bệnh ung thư leukemia. Hình 1.12. Hydroquinone 1.3.7.2. Niacinamide Niacinamide là một dạng hoạt tính sinh học của niacin (vitamin B3) được tìm thấy rộng rãi trong nhiều loại rau củ và nấm men. Niacinamide đã đề xuất một số các ứng dụng dược liệu trong da bao gồm chống viêm, ngăn ngừa ảnh ức chế miễn dịch và tăng sự tổng hợp lipid nội bào (MacKay và cộng sự, 2012) (Hình 1.13). Hình 1.13. Niacinamide (Vitamin B3) 1.3.7.3. Arbutin Arbutin là một thành phần làm trắng da quen mặt trong các mỹ phẩm. Về mặt hoá học, Arbutin chính là một dạng hydroquinone (một chất làm trắng da) nhưng phân tử của nó có thêm glucose (Hình 1.14). Chính glucose này là yếu tố quyết định cách làm việc khác nhau của Hydroquinone và Arbutin và đã được FDA thông duyệt. Thay vì giết chết các tế bào melanocytes, Arbutin giúp ức chế enzyme sản sinh ra melanin trong tế bào. Chính bởi cách làm việc khác nhau, Arbutin là chất làm trắng da lành tính hơn và không đem lại các tác dụng phụ không mong muốn như Hydroquinone mặc dù có thể kết quả chậm hơn (Solano và cộng sự, 2006; Duskova và cộng sự, 2005). 23
Đồ án tốt nghiệp Arbutin tồn tại ở hai dạng, alpha và beta. Dạng alpha cho mức độ ổn định cao hơn và có tác dụng ức chế mạnh hơn so với dạng beta (Duskova và cộng sự, 2005). Hình 1.14. Arbutin (4-Hydroxyphenyl-α-D-glucopyranoside) Alpha-Arbutin là hợp chất hóa học của 4-Hydroxyphenyl-α-D- glucopyranoside, tan trong nước ở nhiệt độ khoảng 20oC, độ pH từ 3,5 - 6,5, dạng hạt bột mịn màu trắng không mùi. Trong tự nhiên, alpha-arbutin được chiết xuất từ cây Bearberry một loại cây mọc tại hầu hết các vùng phía Bắc phía nam nước Mỹ. Alpha-Arbutin cũng được tìm thấy trong mầm lúa mì, da lê và lá của quả việt quất và nam việt quất. Tuy nhiên, do việc chiết xuất từ tự nhiên khó khăn nên hiện tại aphal-Arbutin chủ yếu được tổng hợp từ phòng thí nghiệm (Briganti và cộng sự, 2003). Alpha-Arbutin hoạt động bằng cách ức chế quá trình oxy hóa enzyme tyrosinase và giảm chuyển đổi DOPA - một loại enzym chịu trách nhiệm sản xuất melanin gây sạm da. Hắc sắc tố sản sinh có thể ảnh hưởng bởi bệnh viêm gan và cũng có thể là do tiếp xúc quá nhiều với tia UV hoặc hình thành từ những vết sẹo mụn trứng cá và các nguyên nhân khác (Solano và cộng sự, 2006; Duskova và cộng sự, 2005). 1.3.7.4. Azelaic acid Azelaic acid là một dicarboxylic acid có nguồn gốc tự nhiên (Hình 1.15), xuất hiện trong các loại ngũ cốc như lúa mạch và lúa mì. Trong ngành da liễu, azelaic acid thường được khuyên dùng cho các trường hợp bị mụn, trứng cá thay thế cho tretinoin. Không những thế, rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Azelaic acid còn có tác 24
Đồ án tốt nghiệp dụng điều trị các vấn đề về sắc tố da như sạm, nám, tàn nhang hay bệnh đỏ da (rosacea). Vào năm 2002, FDA Mỹ đã phê duyệt và thông qua việc sử dụng Azelaic acid để điều trị mụn. Vì là một chất kháng khuẩn tự nhiên nên Azelaic acid có tác dụng tuyệt vời cho những làn da đang phải chiến đấu với mụn nhọt gây nên bởi vi khuẩn. Khi bôi ngoài da, Azelaic acid xâm nhập vào các lỗ chân lông, ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong nang lông, giúp giảm viêm và loại bỏ tế bào chết cứng đầu, giảm sưng tấy và ngăn ngừa sự phát triển của mụn. Năm 2007, các nhà khoa học đã tìm ra tính năng mới của Azelaic acid trong ngành công nghiệp chăm sóc da. Họ tin rằng Azelaic acid có khả năng ức chế sản sinh melanin giúp điều trị các bệnh về sắc tố da như sạm, nám, tàn nhang hay thậm chí sẹo mụn. 1.3.7.5. Kojic Hình 1.15. Azelaic acid acid Trước khi Arbutin xuất hiện thì Kojic acid được coi là thay thế tốt nhất cho Hydroquinone. Được chiết xuất từ một loại nấm lên men, Kojic acid có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase sản sinh melanin (Hình 1.16). Theo một số nghiên cứu Kojic acid có tác dụng tương đương với Hydroquinone. Tuy nhiên do Kojic acid không bền vững khi tiếp xúc với không khí và phản ứng với các chất khác khi tiếp xúc với ánh nắng mặt trời nên vẫn chưa tối ưu được như Arbutin ( 25
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.16. Kojic acid 1.3.7.6. Vitamin C Là một chất có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ cấu trúc tế bào (gồm DNA) tránh các tổn thương. Vitamin C cũng giúp cơ thể đương đầu với ô nhiễm môi trường, tăng cường chức năng miễn dịch, ức chế sự hình thành các hợp chất sinh ung trong cơ thể, ngoài ra vitamin C còn có tác dụng làm chậm quá trình sản sinh melanin. Chính vì thế mà trong hầu hết các sản phẩm dưỡng trắng sang da đều có chứa một dạng nào đó của Vitamin C (Hình 1.17) ( Hình 1.17. Vitamin C 1.3.7.7 . Những thành phần khác Ngoài các thành phần kể trên thì còn một số các thành phần khác có tác dụng làm trắng da có thể tìm thấy trong mỹ phẩm như Licorice Extract, Mulberry Extract (Salona và cộng sự, 2006) (Hình 1.18). Hydroxylsilbenes. Resveratrol R1=R2=R3=OH Oxyresveratrol R1=R2=R3=R5=OH Gnetol R1=R2=R5=R6=OH 26
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.18. Một số hợp chất ức chế quá trình tổng hợp melanin (Salona và cộng sự, 2006). 1.4. Tổng quan về chiết xuất dƣợc liệu 1.4.1. Chiết xuất dược liệu  Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các hợp chất tự nhiên ra khỏi thực vật thô ban đầu. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hoà tan trong dung môi. Dung dịch này gọi là dịch chiết. Quá trình chiết xuất xảy ra như sau: - Dung môi thâm nhập vào bên trong dược liệu. - Dung môi hoà tan các chất bên trong dược liệu. - Khuếch tán các chất có trong dung môi (Khuếch tán phân tử và khuếch tán đối lưu) bao gồm: 27
Đồ án tốt nghiệp + Khuếch tán các chất tan từ trong dược liệu qua màng tế bào qua mặt ngoài dược liệu (khuếch tán qua lỗ xốp và khuếch tán phân tử) + Khuếch tán các chất từ mặt ngoài dược liệu ra lớp dung môi xa hơn (khuếch tán phân tử) + Khếch tán các chất theo chuyển động của dung môi (khuếch tán đối lưu).  Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất: bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu ) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất.  Lựa chọn dung môi chiết phù hợp là một yếu tố quan trọng của qúa trình chiết xuất. Dung môi chiết phụ thuộc vào bản chất của chất cần chiết, các thành phần cần chiết cũng như tạp chất trong dược liệu. Cần lựa chọn dung môi sao cho có khả năng hoà tan tối đa các chất có tác dụng điều trị và tối thiểu các tạp chất trong dược liệu. Một số yêu cầu về dung môi chiết xuất khi lựa chọn: - Dễ thấm vào dược liệu (độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ ) - Hoà tan chọn lọc (hoà tan nhiều hoạt chất, ít tạp chất) - Trơ về mặt hoá học (không làm biến đổi hoạt chất, không gây khó khăn cho quá trình bảo quản, không bị biến đổi ở nhiệt độ cao) - Dễ bay hơi khi cần cô dặc dịch chiết Ví dụ về lựa chọn dung môi trong chiết xuất được thể hiện ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Dung môi khác nhau dung trong chiết xuất các nhóm hoạt chất trong dược liệu (Houghton và Raman, 1998). Độ phân Dung môi Phân nhóm hoá học chiết cực Chloroform Terpenoid, Flavonoid, Alkaloid, Aglycogen Thấp Cyclohexan Sáp, Chất béo Hexan Sáp, Chất béo Dicloromethan Terpenoid, Flavonoid, Alkaloid, Aglycogen Trung bình Diethylether Alkaloid, Aglycogen Ethyl acetate Alkaloid, Aglycogen, Glycoside 28
Đồ án tốt nghiệp Aceton Flavonoid, Alkaloid, Aglycogen Tannin, Polyphenol, Terpenoid, Flavonoid, Ethanol Sterol, Alkaloid, Polyacetylen Saponin, Tanin, Phenon, Flavon, Carbohydrate, Methanol Aminoacid, Anthrocyanidin, Terpenoid, Cao Xanthoxyllin, Totarol, Lactone, Polyphenol Carbohydrate, Aminoacid, Saponin, Tanin, Nước Lectin, Anthrocyani, Terpenoid, Tinh bột, Polypeptid Tuỳ theo từng loại dược liệu và hoạt chất cần thiết mà lựa chọn dung môi thích hợp. Trên thực tế, ethanol ở các nồng độ khác nhau là dung môi được sử dụng nhiều nhất do hoà tan đực nhiều nhóm hoạt chất, không độc, dễ kiếm, rẻ tiền (Houghton và Raman, 1998). 1.4.2. Phương pháp chiết xuất Phương pháp chiết xuất là một yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công của quá trình nghiên cứu dược liệu có nguồn gốc tự nhiên. Một số phương pháp chiết xuất phổ biến như: 1.4.2.1. Phương pháp ngâm Là phương pháp cho dược liệu đã chia nhỏ tới độ mịn thích hợp, tiếp xúc với dung môi trong thời gian nhất định, sau đó gạn, ép, lắng, lọc thu dịch chiết. Tuỳ theo nhiệt độ chiết xuất, chia thành: - Ngâm lạnh: Ngâm ở nhiệt độ phòng, có thể khuấy trộn, thường áp dụng với những dược liệu dễ bị phân huỷ bởi nhiệt. - Hãm: cho dung môi vào dược liệu đã chia nhỏ trong thời gian xác định, thường cho hợp chất dễ tan trong thời gian ngắn ở nhiệt độ cao. - Hầm: Ngâm dược liệu đã chia nhỏ với dung môi trong bình kín, giữ nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi nhưng cao hơn nhiệt độ phòng trong thời 29
Đồ án tốt nghiệp gian nhất định, thỉnh thoảng khuấy trộn, thường áp dụng với những chất ít tan ở nhiệt độ thường, dễ phân huỷ ở nhiệt độ cao. - Sắc: đun sôi đều và nhẹ nhàng dược liệu với dung môi trong một thời gian nhất định. Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện. Nhược điểm: + Năng suất thấp, thao tác thủ công. + Mất nhiều thời gian, có thể từ vài giờ đến vài tuần. + Chiết một lần thì chưa kiệt, nhiều lần tốn dung môi. 1.4.2.2. Phương pháp ngấm kiệt Là phương pháp cho dung môi chảy rất chậm qua khối dược liệu đựng trong một dụng cụ “ngấm kiệt” hình trụ đứng, dưới đáy là van khoá để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra (Hình 1.19). Trong suốt quá trình khuấy trộn, dược lieu luôn được tiếp xúc với dung môi mới, vận tốc dung môi chảy vào bình nguyên lieu bằng vân tốc dung môi chảy ra, tạo ra sự chênh lệch nồng độ hoạt chất cao nên có thể chiết kiệt được hoạt chất. Ưu điểm: Dược liệu được chiết kiệt, dịch đầu đậm đặc. Nhược điểm: Năng suất thấp, lao động thủ công. Hình 1.19. Bình ngấm kiệt 30
Đồ án tốt nghiệp 1.4.3. Phương pháp Soxhlet Dược liệu cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết. Dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu. Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông bình cầu bên dưới, mang theo các chất hoà tan từ dược liệu. Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp dược liệu để hoà tan các chất tan còn lại. Cứ như vậy cho đến khi dược liệu được chiết kiệt (Hình 1.20). Ưu điểm: + Quá trình chiết xuất liên tục. + Tốn ít dung môi hơn các phương pháp trên. + Dịch chiết không cần phải lọc. Nhược điểm: Dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các chất không bề với nhiệt sẽ dễ bị phân huỷ. Không thực hiện được sự khuấy trộn. Hình 1.20. Dụng cụ chiết Soxhlet 1.5. Hoạt tính kháng oxy hoá 1.5.1. Khái niệm về gốc tự do Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống của con người (Gruber và cộng sự, 2008). Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra 31
Đồ án tốt nghiệp những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) (Rhodes, 2000). Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O), đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ •– superoxyde (O2 ) nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ● ● ● ứng cao được tạo ra như hydroxyl (HO ), hydroperoxyl (HOO ), peroxyl (ROO ), ● • alkoxyl (RO ), lipoperoxyde (LOO ), H2O2. Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể (Gruber và cộng sự, 2008). Gốc tự do là những nguyên tử, phân tử hay ion có các điện tử độc thân ở lớp ngoài cùng, do đó chúng kém bền vững, thời gian tồn tại ngắn (1/1000 giây) và hoạt tính cao. Vì vậy mà chúng dễ dàng tham gia phản ứng với các phân tử khác bằng cách lấy đi một điện tử của phân tử đó nhằm bền vững hoá lớp vỏ điện tử của mình nhưng đồng thời sinh ra một gốc tự do mới, gốc tự do mới lại tiếp tục phản ứng với phân tử khác và tạo thành phản ứng dây chuyền (Gruber và cộng sự, 2008). Một số gốc tự do có vai trò quan trọng trong cơ thể, là những chất chuyển hóa trung gian có hoạt tính mạnh, tuy nhiên nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như: ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng. Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, 32
Đồ án tốt nghiệp RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc (Kedare và Singh, 2011). Theo bác sĩ Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng (Harman, 1956). Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT) để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis) (Gruber và cộng sự, 2008). Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu (Cai và cộng sự, 2004). 1.5.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá Hiện nay có rất nhiều phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa: oxigen radical absorbane capacity (ORAC), Total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP), ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl radical scavenging (DPPH), 33
Đồ án tốt nghiệp 1.5.2.1. Phương pháp sử dụng DPPH Blois là người đầu tiên đặt nền móng cho phương pháp DPPH cách đây gần 50 năm (1958), ở thí nghiệm đầu tiên Blois đã thử hoạt tính chống oxy hóa của amino axit cystein bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bước sóng 517nm (Blois, 1958). Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa th ể hiện qua việc giảm màu của DPPH, được xácđịnh bằng cách đo quang ở bước song λ = 517 nm. Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH có những ưu điểm (Brand- William và cộng sự, 2011): - Phương pháp đơn giản, thiết bị yêu cầu không quá phức tạp. - Tiến hành nhanh chóng - Thích hợp nhiều tác nhân chống oxy hóa. Ngoài ra, nó còn được dùng đo tính chống oxy hóa cho các sản phẩm thực phẩm. Tên khoa học của DPPH là (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl; C18H12N5O6, M= 394,33) là một gốc tự do bền (hình 1.121), trong dung dịch ethanol tuyệt đối sẽ có màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác, và độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm. Khi Hình 1.21. DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) DPPH phản ứng với các chất có tính kháng oxy hóa, electron thừa của nguyên tử nitơ trong DPPH sẽ kết hợp với nguyên tử hydro từ chất có tính kháng oxy hóa để tạo thành dạng hydrazine tương ứng là 2,2-Diphenyl-1-picryldrazine không có gốc tự do. Kết quả làm mất màu tím của DPPH ban đầu và dung dịch dần chuyển 34
Đồ án tốt nghiệp sang màu vàng (Kedare và Singh, 2011) (Hình 1.22). 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl 2,2-Diphenyl-1-picryldrazine Hình 1.22. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do). 1.5.2.2. Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II Nguyên tắc: Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II và 2,2’-bipyridyl (thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt II) (Gruber và cộng sự, 2008). *- 1.5.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2 Nguyên tắc: Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ gốc tự do đã sinh ra của chất *- nghiên cứu thông qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2 . Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolim (NBT) cho phức chất có màu tím được đo ở bước sóng λ = 550 nm. Hoạt tính của mẫu thử được thể hiện qua việc giảm sự hình thành phức màu tím (Gruber và cộng sự, 2008). 1.5.2.4. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc peroxyhydro H2O2 - Nguyên tắc: Hai tiểu phân O2* và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại trong cơ thể nhưng nếu hiện điện ở nồng độ cao chúng sẽ tạo ra 1O2, *OH là phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và 35
Đồ án tốt nghiệp từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu của đỏ phenol chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase) (Gruber và cộng sự, 2008). 1.5.2.5. Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hoá ở các loài thực vật hiện nay. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Thực vật là nguồn cung cấp nhiều hợp chất quý giá có giá trị trong dược học và thực phẩm (Suganya và cộng sự, 2007; Chen và cộng sự, 2007; Mustafa và cộng sự, 2010). Đặc biệt, thực vật là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa như các hợp chất polyphenol, flavonoid, caroten, ascorbic acid, .  Trong nước Nhiều loài lá thực vật khác nhau đã được tiến hành chiết và xác định hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH của chúng bao gồm: Lá Ổi (Psidium guyjava), lá Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis), lá Lốt (Piper lolot), lá Nhãn lồng (Passiflora foetida), lá Khoai lang (Lpomoea batatas). Tất cả nguyên liệu này được thu mẫu tại Đồi La Sang, trường Đại học Nha Trang trong tháng 6/2011. Ngò rí (Coriandrum satinum), rau Bồ ngót (Sauropus androgynus), rau Răm (Persicaria odorata), Nha đam (Aloe vera), lá Tía tô (Perilla frutescens), lá Sả (Cymbopogon), lá Mã đề (Plantago), lá Diếp cá (Houttuynia cordata), lá rau má (Centella asiatica), lá trầu không (Piper betle). Ngoài ra, Nấm rơm tươi (Volvariella volvacea) cũng được nghiên cứu (Dương Thị Kim Nguyên và cộng sự, 2012). Khảo sát khả năng kháng oxy hoá của cây ô rô (Acanthus ilicifolius L.) (Đái Thị Xuân Trang và cộng sự, 2014). Tất cả dịch chiết từ 15 loại lá thực vật và một loại nấm rơm trồng ở Việt Nam đều thể hiện hoạt tính chống oxi hóa (dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH). Khả năng chống oxi hóa của dịch chiết khác nhau theo loài.  Ngoài nước 36
Đồ án tốt nghiệp Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện cho thấy trong các phần của thực vật chứa nhiều các chất chống oxi hóa như: Phenolics, flavonoids, tanins, vitamins, quinines, coumarins, lignans, ligin (Cai và cộng sự, 2004; Amarowicz và cộng sự, 2004). Như vậy, thực vật sẽ là một nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận và ứng dụng các chất có hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính sinh học. 1.6. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) (Master, 2007). Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay, đây là phương pháp được ứng dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm nhất là kiểm nghiệm thuốc. Và hiện tại, đây là công cụ đắt lực nhất trong phép phân tích định tính và định lượng các loại dược phẩm đa thành phần (Karger, 1997). Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử) (Karger, 1997). Nguyên tắc chung: Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hoá học lại vừa có cả tính chất lý học. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp chất trong cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách. Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục 37
Đồ án tốt nghiệp qua cột tách với một thành phần pha động nhất định, hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ dầu cột đên cuối cột sắc ký. Mặt khác, cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Khi ở trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không dịch chuyển, mà bị pha tĩnh giữ lại. Như vậy là có một khoảng thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột tách sắc ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như tính chất và cấu trúc của mỗi chất tan khác nhau đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan ít bị lưu giữ, điều đó dẫn đến kết quả là, có quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký (Bùi Thị Ngoan và cộng sự, 2009). Vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả tách sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được lực rửa giải phù hợp nhất. Sau khi chất tan chuyển tới cuối cột tách được chuyển tới detector để phát hiện. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detector khác nhau (Bùi Thị Ngoan và cộng sự, 2009). 38
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 2 năm 2017 đến tháng 6 năm 2017 tại Viện Sinh học nhiệt đới (Địa chỉ: 9/621 xa lộ Hà Nội, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, T.P Hồ Chí Minh). 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu ô dược (đã được phơi khô) được thu mua tại đường Hải Thượng Lãn Ông, quận 5, TP. Hồ Chí Minh. 2.2.2. Dụng cụ - Thiết bị - Tủ cấy vô trùng - Nồi hấp - Tủ sấy tiệt trùng - Bếp điện - Tủ ấm, tủ lạnh - Máy đo pH - Cân phân tích, cân điện tử - Phễu, giấy lọc - Bể ổn định nhiệt - Bình tam giác, ống nghiệm - Pipette loại 100 -1000 l. Đầu tuýp loại 100 -1000 l - Máy cô quay chân không hiệu HEIDOLPH LABOROTA 4001 - Máy đọc đĩa hiệu BENCHMARK PLUS - Máy chạy sắc ký HPLC hiệu WATER 2695 SEPARATIONS MODUTE; WATERS 2414 REFRACTIVE INDEX DETECTOR; WATER 2996 PHOTODIODE ARRAY DETECTOR - Máy đánh sóng siêu âm hiệu S 300H ELMASONIC 2.2.3. Hoá chất - Ethanol absolute (Chemsol -Việt Nam). - DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma – Mỹ). - DPPH (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate). - Vitamin C, Arbutin (Sigma – Mỹ), môi trường DMEM, trypsin/ EDTA. 39
Đồ án tốt nghiệp - Dung môi phân tích: Methanol, Hexan, Chloroform, Ethyl acetate (Chemsol -Việt Nam). - Thuốc thử: Mayer, Wagner, Molish, Fehling A, Fehling B, Benedict, CuSO4 2%, Gelatin 1%, Amonium 10%, HCl đậm đặc, Ethanol 95%, cồn tuyệt đối 2.3. Quy trình thực hiện Xem hình 2.1 Rễ cây ô dược Methanol Nghiền và chiết với dung môi methanol Lọc Dịch methanol Cô quay chân không Cao methanol Xác định thành phần hoá học Thử hoạt tính Ức chế tổng hợp Kháng oxy hóa: melanin DPPH assay Phân đoạn cao (hexane, chloroform, ethyl acetate, nước) Xác định thành phần hoá học Thử hoạt tính Phân đoạn có hoạt tính cao nhất 40
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Sơ đồ quy trình và phương pháp thực hiện 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu Rễ cây mẫu, sau khi thu nhận sẽ được rửa sạch và được phơi khô trong không khí cho đến khi khối lượng không đổi. Các mẫu phơi khô sẽ được nghiền thành bột mịn. Bột mẫu sẽ được đựng trong túi nhựa và được bảo quản ở 40oC (Hình 2.2). Mẫu cây cây Rửa sạch Phơi khô đến khi trọng lượng không đổi Xay mẫu đến kích thước đồng nhất Mẫu Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu 2.4.2. Quy trình chiết và thu nhận cao chiết 2.4.2.1. Chiết cao tổng Kỹ thuật chiết ngâm dầm (chiết rắn – lỏng) Kỹ thuật chiết ngâm dầm dùng để lấy các hợp chất tự nhiên ra khỏi thực vật thô ban đầu. Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chiết bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm 41
Đồ án tốt nghiệp một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bung ra làm dung dịch chiết trào ra ngoài). Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn. Chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi. Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau. Nguyên liệu: Ô dược khô được nghiền đến kích thước đồng nhất. Mục đích: Chiết các hợp chất có trong ô dược nhờ dung môi methanol. Cách thực hiện: Bột ô dược được chiết 3 lần bằng dung môi methanol (1:4 v/v) trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết methanol sau đó được lọc qua giấy lọc, cô cạn bằng máy cô quay chân không ở 40oC để tạo thành cao methanol. 2.4.2.2. Chiết phân đoạn Kỹ thuật chiết lỏng •lỏng Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng áp dụng để phân chia cao chiết thô ban đầu (thường là cao alcol thô) thành các phân đoạn cao có tính phân cực khác nhau. Nguyên tắc: Dung môi có tính phân cực khác nhau sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực tương ứng với nó. Phương pháp này dựa trên sự phân bố của chất tan vào hai pha và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau, thực hiện bằng bình lóng. Cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào nước. Việc chiết được thực hiện lần lượt bằng các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần. Chiết nhiều lần với mỗi loại dung môi, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, đến khi chiết kiệt mới chuyển sang dung môi khác. Thu hồi dung môi được các cao phân đoạn tương ứng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000-2001). Nguyên liệu: cao tổng methanol đã thu nhận được. Mục đích: phân đoạn cao tổng methanol bằng các dung môi hữu cơ để tạo thành các phân đoạn hexane, chloroform, ethyl acetate. Cách thực hiện: 42
Đồ án tốt nghiệp Cao methanol thô sau đó được hòa vào lượng nước cất (1:4 v/v) để hòa tan cao và tiếp tục được phân chia bằng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng. Cho dung dịch cao methanol vào bình lóng, thêm vào khoảng một thể tích hexane với tỉ lệ so với cao chiết là 1:1, lắc nhẹ, chờ hỗn hợp phân lớp hoàn toàn. Lúc này, nhẹ nhàng tháo van chiết lấy pha nước nằm dưới, pha hexane nằm trên được cho vào bình chứa, lặp lại quá trình này 3 lần. Dịch còn lại tiếp tục được chiết với dung môi chloroform theo phương pháp tương tự như trên, pha chloroform nằm dưới được cho vào bình chứa. Cuối cùng, dịch được chiết tương tự với dung môi ethyl acetate, pha ethyl acetate nằm trên và pha nước nằm dưới được cho vào bình chứa. Các dịch chiết (hexane, chloroform, ethyl acetate) sau đó được đem đi cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC, dịch chiết nước được cô quay chân không ở 50oC. Các cao phân đoạn được bảo quản ở nhiệt độ 0oC - 4oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.4.2.3. Hiệu suất chiết  Hiệu suất chiết cao tổng ( ) Trong đó: H: hiệu suất chiết cao tổng a: khối lượng mẫu cao sau khi cô quay (g) b: khối lượng mẫu ban đầu trước khi chiết (g)  Hiệu suất chiết cao phân đoạn ( ) Trong đó: H’: hiệu suất chiết cao phân đoạn a’: khối lượng cao sau cô quay (g) b’: khối lượngcao tổng dùng chiết phân đoạn (g) 2.4.3. Phương pháp xác định thành phần hoá học Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết ô dược bằng các phản ứng hóa học theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã 43
Đồ án tốt nghiệp được chuẩn hoá để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. Định tính alcaloid bằng thuốc thử Dragendorff, nhận biết flavonoid bằng các phản ứng đặc trưng với dung dịch NaOH 10%, nhận biết terpenoid bằng axit sulfuric 10% trong ethanol, nhận biết carotenoid bằng dung dịch H2S04 đậm đặc, nhận biết saponin bằng lắc dung dịch loãng trong nước, nhận biết tinh dầu bằng bốc hơi tới cắn, nhận biết chất béo bằng nhỏ dung dịch lên giấy. Đối với chỉ tiêu Alkaloid: mẫu cao được ngâm trong HCl 10% trong khoảng 30 - 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Đối với chỉ tiêu Glycoside: mẫu cao được tiến hành thuỷ phân với dung dịch HCl đậm đặc trong bể điều nhiệt trong 2 giờ. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được pha trong dung môi dùng để chiết ban đầu cho đến khi tan hết. Sau đó tiến hành lọc bằng giấy lọc để thu dịch trong và tiến hành thử nghiệm. 2.4.3.1. Carbohydrate  Thử nghiệm Molisch - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm vào 5 – 6 giọt thuốc thử Molisch - Nhỏ từ từ 2ml dung dịch H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm Kết quả: Hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách.  Thử nghiệm Fehling - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Cho lần lượt 1ml thuốc thử Fehling A và 1ml thuốc thử Fehling B - Đun cách thuỷ trong 5 phút và đọc kết quả Kết quả: Quan sát kết tủa màu nâu đỏ của Cu2O.  Thử nghiệm Benedict - Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 2 ml thuốc thử Benedict 44
Đồ án tốt nghiệp - Đun cách thuỷ trong 2 phút, đọc kết quả Kết quả: Quan sát màu sắc của dug dịch, mỗi loại carbohydrate sẽ cho một màu đặc trưng. 2.4.3.2. Alkaloid  Thử nghiệm Mayer - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Cho vài giọt thuốc thử Mayer Kết quả: Quan sát kết tủa màu đục tạo thành  Thử nghiệm Wagner - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 2ml thuốc thử Wagner Kết quả: Hình thành kết tủa màu nâu đỏ 2.4.3.3. Glycosides  Thử nghiệm Borntrager (Anthaquinone glycosides) - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 2ml dung dịch H2SO4 loãng và đun sôi - Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc - Thêm 3 ml chloroform và lắc đều sau đó để yên - Tách lấy lớp chloroform - Thêm 2ml ammonia 10% và quan sát màu trong lớp ammonia Kết quả: Xuất hiện màu đỏ. 2.4.3.4. Flavonoid  Thử nghiệm với thuốc thử Alkalie - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh. - Thêm vài giọt HCl loãng, thấy mất màu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid Kết quả: Xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl. 45
Đồ án tốt nghiệp  Thử nghiệm Shinoda - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Cho bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm - Bổ sung 5 ml cồn 95% Kết quả: Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid.  Thử nghiệm Ferric chloride - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 5% Kết quả: Xuất hiện màu xanh hoặc tím 2.4.3.5. Phenolic  Foam test - Hút 5 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Lắc mạnh Kết quả: Hình thành bọt ổn định.  Thử nghiệm Gelatin - Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm một vài giọt gelatin 1% Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng 2.4.3.6. Dầu và chất béo  Spot test - Cho một giọt dịch mẫu thấm vào giấy lọc - Vết dầu xuất hiện trên giấy lọc cho thấy sự có mặt của dầu hoặc chất béo. 2.4.3.7. Protein  Thử nghiệm Biuret - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 1 giọt dung dịch CuSO4 2% - Bổ sung 1 ml ethanol 95% - Sau đó, cho từng miếng KOH đến dư 46
Đồ án tốt nghiệp Kết quả: Xuất hiện phức chất màu xanh tím. 2.4.3.8. Gum và chất nhầy - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 25 ml cồn tuyệt đối, khuấy liên tục Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng đục chứng tỏ có sự hiệm diện của gum và chất nhầy. 2.4.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH assay) 2.4.4.1. Nguyên tắc hoạt động gốc tự do DPPH DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Hoạt tính chống oxy hóa của một chất được xác định bằng phương pháp đo phổ UV, sử dụng thuốc thử là DPPH. Phản ứng được tiến hành dựa theo trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bước sóng 517 nm (Hình 2.3). Hình 2.3. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do). 47
Đồ án tốt nghiệp 2.4.4.2. Biểu diễn kết quả thử nghiệm DPPH Khả năng khử gốc tự do DPPH của một cao chiết (hoặc chất chống oxy hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%) được tính theo công thức: ( ) Kết quả thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa của một chất bằng phương pháp DPPH được báo cáo bằng IC50 (half maximal Inhibitory Concentration). IC50 được định nghĩa là nồng độ của chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme. IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính kháng oxy hoá càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.  Cách tính IC50: Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau và tính I% của từng nồng độ. Với những mẫu có phần trăm bắt gốc tự do biến thiên tuyến tính với nồng độ, vẽ đường phi tuyến biểu diễn mối liên hệ giữa phần trăm bắt gốc tự do và nồng độ mẫu (với y là phần trăm bắt gốc tự do và x là nồng độ mẫu). Tìm phương trình phi tuyến, xác định hệ số a và b của phương trình. Thay y = 50 vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là nồng độ ức chế được 50% gốc tự do (IC50)  Quy trình - Bước 1: hòa tan DPPH vào methanol tuyệt đối để đạt nồng độ 0,6 mg/ml. - Bước 2: hòa tan vitamin C (đối chứng dương) vào nước cất sau đó vortex để đạt nồng độ 2 mg/ml. Pha loãng dung dịch xuống nồng độ 0,2 mg/ml và bao tube lại bằng giấy bạc. - Bước 3: mẫu cao ô dược thô được hòa tan trong ethanol tuyệt đối, vortex để đạt nồng độ 1 mg/ml. Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ. - Bước 4: hút 100 μl methanol tuyệt đối – đối chứng âm. - Bước 5: hút 100 μl vitamin C - đối chứng dương ở nồng độ 0,2 mg/ml. - Bước 6: hút lần lượt 100 μl mẫu ở các nồng độ đã pha. 48
Đồ án tốt nghiệp - Bước 7: thêm 100 μl dung dịch DPPH vào tất cả các giếng, trộn đều hỗn hợp. - Bước 8: bao đĩa bằng giấy bạc và ủ ở 37oC trong 30 phút. - Bước 9: đo OD ở bước sóng 517 nm. Thực hiện mỗi nồng độ 3 lần lặp lại. Khả năng kháng oxy hóa hay bắt các gốc tự do DPPH của mẫu sẽ được tính theo công thức sau: Khả năng kháng oxy hóa của mẫu = (1 - ODmẫu/ODđối chứng) x 100. 2.4.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào (B16F10) Tế bào B16F10 melanoma và Melan-a melanocyte được cung cấp bởi ATCC. Tế bào B16F10 được nuôi trên môi trường DMEM bổ sung 10% (v/v) huyết thanh o bê (FBS) và 1% (v/v) kháng sinh penicillin/streptomycine ở 37 C, 5% CO2, hơi nước bão hòa. Môi trường nuôi tế bào Melan-a melanocyte tương tự như môi trường nuôi tế bào B16F10 melanoma nhưng có bổ sung 200 nM tetradecanoyl phorbol acetate (TPA). Tế bào được cấy chuyền sau mỗi 3 ngày và sử dụng cho đến lần cấy chuyền thứ 30. 2.4.6. Phương pháp xác định độc tính Để xác định độc tính, thử nghiệm dựa trên sự đổi màu của MTT (3-(4,5- dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) được sử dụng. Tế bào được nuôi trên đĩa 96 giếng (96-well plate) ở mật độ tế bào 2.5 x 103. Sau 24 giờ, tế bào được ủ với mẫu cần kiểm tra ở các nồng độ khác nhau và được nuôi cấy tiếp trong 48 giờ. Sau đó 100 µl dung dịch MTT nồng độ 5 mg/ml được bổ sung vào các giếng. Sau 4 giờ ủ ở 37oC, môi trường chứa dung dịch MTT được hút ra và 100 µl DMSO được cho vào để hòa tan các formazan được tạo ra. Sau đó mẫu được đem đi đo quang phổ ở bước sóng 540 nm. 2.4.7. Phương pháp xác định hàm lượng melanin Tế bào được nuôi cấy ở mật độ 6 x 104 tế bào trên đĩa 6 giếng (6 - well plate). Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào được ủ với các mẫu cần kiểm tra trong vòng 48 giờ. Sau 48 giờ nuôi cấy, tế bào được thu nhận và được hòa tan trong 200 µl DMSO chứa 49
Đồ án tốt nghiệp 10% NaOH. Sau đó, mẫu được đem đun ở 80oC trong vòng 1 giờ. Hàm lượng melanin được xác định bằng cách đo quang phổ ở bước sóng 405 nm. Arbutin (200 µl/ml) được xử dụng làm đối chứng dương. Tế bào được nuôi trên môi trường DMEM bổ sung 10% (v/v) huyết thanh bê o (FBS) và 1% (v/v) kháng sinh penicillin/streptomycine ở 37 C, 5% CO2, có hơi nước bão hòa. 2.4.8. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - Mục đích: xác định thành phần hợp chất trong mẫu cao chiết ô dược. - Nguyên lý hoạt động: Bơm cao áp đẩy dung môi pha động đi qua cột chứa chất nhồi là các hạt có đường kính nhỏ, mẫu phân tích đưa vào cột qua bộ phận tiêm mẫu, tại đây các thành phần của hợp chất sẽ được phân tách, đầu dò ghi nhận tín hiệu các chất phân tích khi ra khỏi cột, tín hiệu đi đến hệ thống dữ liệu tạo sắc ký đồ. - Tiến hành sắc lý: Điều kiện phân tích: + Pha tĩnh: Cột sắc ký C18 (5 μm; 150×4,6 mm) + Pha động: Gradient Methanol - H2O từ 30% methanol đến 100% methanol + Tốc độ dòng: 1 ml/phút + Thể tích mẫu tiêm: 20 μl + Nhiệt độ: 25 ± 2oC + Khảo sát chương trình chạy gradient ở thời gian 50 phút theo sơ đồ hình 2.4. + Detector UV 210 nm. 50
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Sơ đồ điều kiện chạy sắc ký HPLC. 2.4.9. Xử lý số liệu Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sử dụng phần mềm Sigma Plot version 10.0 và phần mềm Microsoft Excel 2010 để xử lý số liệu. Giá trị số liệu được biểu thị ở giá trị trung bình SD. 51
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu nhận cao tổng methanol ô dƣợc Mẫu ô dược khô được nghiền đến kích thước đồng nhất (1 - 2 mm3), cho mẫu vào túi vải, buộc kỹ. Trạng thái mẫu: màu vàng nhạt, vị đắng (Hình 3.1). Hình 3.1. Mẫu ô dược. (A) Mẫu sau khi thu; (B) mẫu sau khi nghiền nhỏ Cao methanol tổng được thu nhận bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm được trình bày ở mục 2.3.2.2. Khối lượng bột ô dược đem ngâm là 500 g, sử dụng hết 3,2 lít dung môi methanol để chiết trong 3 lần. Lọc loại bỏ bã thu dịch chiết. Dịch chiết được tiến hành cô quay chân không đuổi dung môi, thu hồi dung môi thu cao tổng. Mẫu cao sau khi cô quay sẽ để khô ở nhiệt độ 40oC đến khối lượng không đổi. Thu được cao methanol tổng có khối lượng là 62,32 g. Hiệu suất điều chế cao methanol tổng được tính theo công thức ở mục 2.3.2.4 là 12,46% (Hình 3.2). 52
Đồ án tốt nghiệp (A) (B) (C) Hình 3.2. Mẫu được chiết ngâm dầm với dung môi Methanol và mẫu cao thu được. (A) Mẫu đang ngâm dầm; (B) Lọc thu dịch chiết; (C) Cao Methanol tổng thu được 3.2. Định tính thành phần cao tổng methanol ô dƣợc Kết quả định tính thành phần hoá học của cao tổng methanol ô dược được trình bày ở bảng 3.1. Dấu (+) cho kết quả dương tính với thuốc thử, có mặt nhóm chất tương ứng cần định tính; dấu (-) cho kết quả âm tính, không có mặt nhóm chất tương ứng cần định tính. Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao tổng methanol ô dược Phản ứng TT Nhóm chất Các phản ứng nhận biết Kết quả dƣơng tính Molisch Phức đỏ - tím + 1 Carbohydrate Fehling Tủa nâu đỏ + Benedict Màu đặc + 53
Đồ án tốt nghiệp trưng Mayer Tủa đục + 2 Alkaloid Wagner Tủa nâu đỏ + 3 Glycoside Bontrager Màu đỏ - Vàng huỳnh Alkaline - quang Màu cam, 4 Flavonoid Shinoda hồng, đỏ đến - tím Màu xanh Ferric chloride + hoặc tím Gelatin Tủa trắng - 5 Phenolic Foam test Bọt - 6 Chất béo Spot test Giọt dầu + Phức màu 7 Protein Biuret + xanh tím Gum, chất Tủa trắng 8 - nhầy hoặc đục Qua phân tích định tính thành phần hóa học cho thấy, cao methanol ô dược chứa các thành phần chính gồm carbohydrate, alkaloid, chất béo, protein và nghi ngờ có flavonoid. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trong cao tổng methanol có chứa các hợp chất có độ phân cực khác nhau (từ không phân cực đến phân cực). 3.3. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá của cao tổng methanol ô dƣợc Hoạt động trung hòa gốc tự do DPPH được đánh giá dựa trên lượng gốc tự do DPPH còn lại sau khi đã kết hợp với chất kháng oxy hóa. Tỷ lệ giảm của mật độ quang đo được ở bước sóng 517 nm khi có và không có chất kháng oxy hóa được xem như hiệu suất kháng oxy hóa của mẫu thí nghiệm. Trong thí nghiệm này, vitamin C được sử dụng như chất kháng oxy hóa đối chứng. Hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng methanol được trình bày ở hình 3.3. 54
Đồ án tốt nghiệp R2 = 0,9955 IC50 = 58,89 (µg/ml) % bắt gốc tự do tự gốc %bắt Nồng độ mẫu (µg/ml) Hình 3.3. Đồ thị thể hiện khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết cao tổng methanol Các nồng độ của cao tổng methanol và phần trăm ức chế được biểu thị dưới dạng đường Hyperbola có dạng: y=a-b/(1+c*x)1/d (Phụ lục B) với hệ số tương quan R2 = 0,9955. Kết quả cho thấy cao tổng methanol ô dược có hoạt tính kháng oxy hoá và khả năng khử gốc tự do tỉ lệ thuận với nồng độ cao, từ 6,996% ở nồng độ 7,8125 g/ml đến 82,579% ở nồng độ 250 g/ml. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do của cao methanol ô dược được xác định thông qua giá trị IC50. Kết quả cho thấy, khả năng kháng oxy hoá của cao methanol ô dược (IC50 = 58,89 g/ml) thấp hơn so với vitamin C (IC50 = 6 g/ml) được dùng để khảo sát trong thí nghiệm (phụ lục B) 9,8 lần. Kết quả này chứng minh cao methanol ô dược có hoạt tính kháng oxy hoá cao hơn một số thảo dược được nghiên cứu trước đây như nhàu (Morinda citrifolia L.) gồm cao ethanol lá, trái xanh, rễ cây nhàu với giá trị IC50 lần lượt là 917,16 g/ml (cao gấp 15,58 lần), 1025,2 g/ml (cao gấp 17,41 lần) và 1531,4 g/ml (cao gấp 26 lần) (Đái Thị Xuân Trang và cộng sự, 2012). Cao methanol hà thủ ô (Streptocaulon Juventas Merr.) có khả năng kháng oxy hoá với IC50 = 2586 g/ml (Nguyen và Eun, 2013) thấp hơn nhiều so với cao methanol ô dược 43,92 lần. Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hoá của cao ethanol chiết xuất từ 55
Đồ án tốt nghiệp thân leo cây Huỳnh Anh (Allamanda Neriifolia) với giá trị IC50 là 100,65 g/ml (Trần Phạm Tuệ Hưng và cộng sự, 2014) (thấp hơn 1,8 lần). Như vậy, hoạt tính kháng oxy hoá của mẫu cao tổng methanol ô dược cao hơn nhiều so với một số mẫu dược liệu đã được nghiên cứu. Kết quả khảo sát cho thấy, cao tổng methanol ô dược có khả năng kháng oxy hoá rất mạnh. 3.4. Khảo sát tác dụng của ô dƣợc lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10 Để khảo sát độc tính của ô dược, tế bào u sắc tố B16F10 được xử lý với cao methanol của loài này các nồng độ khác nhau từ 12,5 µg/ml đến 200 µg/ml trong 48 giờ. Sau đó, độc tính được xác định bằng thử nghiệm MTT. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 100 µg/ml và 200 µg/ml % tế bào sống lần lượt là 96,23% và 95,14%. So với mẫu đối chứng Arbutin có % tế bào sống ở nồng độ 200 µg/ml là 99,4%, mẫu cao methanol ô dược cho kết quả tương đương. Như vậy, cho tới nông độ 200 µg/ml, rễ cây ô dược không gây bất kỳ độc tính nào lên tế bào (Hình 3.4). 120 100 80 60 % tế tế % sốngbào 40 20 0 PBS Arbutin (200 12,5 25,0 50,0 100,0 200,0 mg/ml) Nồng độ mẫu (g/ml) Hình 3.4. Tác dụng của cao methanol ô dược lên độc tính tế bào. 56
Đồ án tốt nghiệp 3.5. Khảo sát tác dụng của ô dƣợc lên quá trình tổng hợp melanin Để kiểm tra tác động của cây ô dược lên quá trình tổng hợp melanin, tế bào u hắc tố B16F10 được xử lý với cao methanol ở các nồng độ khác nhau từ 12,5 µg/ml đến 200 µg/ml trong 48 giờ. Sau đó, lượng hắc tố (melanin) trong tế bào được xác định (Hình 3.5 và hình 3.6). 120 100 80 60 % Melanin % 40 20 0 PBS Arbutin (200 12,5 25,0 50,0 100,0 200,0 ug/ml) Nồng độ mẫu Hình 3.6. Tác dụng của cao methanol ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. Hình 3.5. Tế bào B16F10 melanoma thu nhận sau khi xử lý với cao methanol ô dược. 57
Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát cho thấy, cao methanol của cây ô dược ức chế quá trình tổng hợp melanin tùy thuộc theo nồng độ xử lý. Ở nồng độ 100 µg/ml và 200 µg/ml, cao methanol cây ô dược có thể ức chế 32,79% và 42,58% quá trình tổng hợp hắc tố. Ở mẫu đối chứng, Arbutin ức chế 20% quá trình tổng hợp melanin ở nồng độ 200 µg/ml. Kết quả này cho thấy, cao chiết methanol của cây ô dược có hiệu quả tốt hơn đối chứng Arbutin thường được sử dụng trong mỹ phẩm. Qua các kết quả khảo sát, cao methanol của ô dược ức chế hiệu quả quá trình tổng hợp hắc tố và không gây độc cho tế bào ở nồng độ 200 µg/ml. Ô dược có tác dụng chống oxy cao với hiệu quả loại bỏ gốc tự do của cao tổng methanol là IC50 = 58,89 µg/ml. Hiện nay, có rất nhiều chất có khả năng làm trắng da đang được nghiên cứu cũng như sử dụng. Tuy nhiên, rất nhiều chất có hoạt tính không cao, gây ra tác dụng phụ khi sử dụng trong thời gian dài hoặc không bền. Vì thế, ô dược là loài có thể ứng dụng làm trắng da tiềm năng có nguồn gốc tự nhiên. Do đó, từ cao tổng methanol ô dược, tiến hành phân đoạn cao chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau (hexane, chloroform, ethyl acetae, nước), thử hoạt tính để tìm ra phân đoạn có hoạt tính tốt nhất. 3.6. Kết quả chiết và thu nhận cao phân đoạn Mẫu cao methnol tổng được tiến hành tách chiết phân đoạn bằng phương pháp lỏng - lỏng với 4 loại dung môi (hexane, chloroform, ethyl acetate, nước). Hòa tan 30g cao methanol tổng vào 120 ml nước cất. Chiết lỏng - lỏng dịch cao methanol tổng với dung môi hexan tỉ lệ 1:1 trong 3 lần, mỗi lần chiết dùng khoảng 120 ml dung môi, lắc nhẹ và đều trong 15 phút rồi tách lấy lớp trên. Phần lớp dưới khi trích với hexane tiếp tục được chiết lỏng - lỏng theo thứ tự với chloroform, ethyl acetate. Tiếp tục tiến hành như mục 2.3.2.3. Mẫu sau khi chiết với các dung môi được tiến hành cô quay chân không để đuổi hết dung môi thu cao chiết phân đoạn. Sau khi cô quay, mẫu cao sẽ để khô ở nhiệt độ 4oC đến trọng lượng không đổi. Kết quả hiệu suất thu được của các phân đoạn lần lượt là: 3,46% (hexan), 58
Đồ án tốt nghiệp 10,57%(chloroform), 23,45% (ethyl acetate) và 43,02% (nước), được thể hiện qua hình 3.7. Kết quả cho thấy, cao methanol của ô dược chứa nhiều loại hợp chất khác nhau từ không phân cực đến phân cực. Hiệu suất thu hồi (% theo cao tổng) cao theo (% hồi thu suất Hiệu Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện hiệu suất thu hồi (%) của các cao phân đoạn ô dược 3.7. Kết quả định tính thành phần hoá học cao phân đoạn Kết quả định tính thành phần hoá học của các cao phân đoạn ô dược được trình bày ở bảng 3.2. Dấu (+) cho kết quả dương tính với thuốc thử, có mặt nhóm chất tương ứng cần định tính; dấu (-) cho kết quả âm tính, không có mặt nhóm chất tương ứng cần định tính. Bảng 3.2. Kết quả xác định thành phần hoá học các mẫu cao phân đoạn ô dược Phản ứng Phân đoạn cao TT Nhóm chất nhận biết Chloroform Ethyl acetate Nƣớc Molisch + + + 1 Carbohydrate Fehling + + + Benedict + + + 2 Alkaloid Mayer + + + 59
Đồ án tốt nghiệp Wagner + + + 3 Glycoside Bontrager - - - Alkaline - + - 4 Flavonoid Shinoda - - - Ferric chloride - - + Gelatin - - - 5 Phenolic Foam test - - + 6 Chất béo Spot test + + + 7 Protein Biuret - + - 8 Gum, chất nhầy - - - Dựa vào bảng kết quả phân tích thành phần hoá học của các mẫu cao chiết phân đoạn cho thấy sự khác nhau về thành phần hoá học giữa các mẫu. (Bảng 3.2). Kết quả cho thấy, cả ba mẫu cao chiết phân đoạn (chloroform, ethyl acetate, nước) đều có chứa nhóm chất alkaloid, carbohydrate và chất béo. Đối với nhóm chất flavonoid, cao phân đoạn chloroform cho kết quả âm tính ở cả ba thử nghiệm, chứng tỏ trong mẫu không có nhóm chất này. Hai mẫu cao chiết phân đoạn còn lại cho kết quả một thử nghiệm dương tính trên ba thử nghiệm, nên nghi ngờ mẫu có khả năng chứa nhóm chất flavonoid. Những nhóm chất glycoside, gum và chất nhầy hầu như không có trong cả ba mẫu cao chiết phân đoạn. Nhóm chất protein chỉ xuất hiện ở mẫu cao chiết phân đaon ethyl acetate, không có trong hai mẫu cao chiết còn lại. Như vậy, ngoài cao tổng methanol ô dược chứa nhiều nhóm chất từ phân cực đến không phân cực thì trong các mẫu cao chiết phân đoạn ô dược cũng chứa nhiều nhóm chất và những nhóm chất này có độ phân cực tương ứng với dung môi tách chiết. Do vậy, với cao chiết phân đoạn ethyl acetate có độ phân cực trung bình và 60
Đồ án tốt nghiệp nước có độ phân cực cao sẽ tách chiết được nhiều nhóm chất hơn những dung môi còn lại. 3.8. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá cao chiết phân đoạn Khả năng kháng oxy hóa dựa trên việc bắt gốc tự do DPPH của cao chiết được ly trích từ các phân đoạn cây ô dược được so sánh dựa trên nồng độ ức chế các gốc tự do DPPH ở 50% (IC50). Các nồng độ của cao cao phân đoạn và phần trăm ức chế được biểu thị dưới dạng đường Hyperbola: y=a-b/(1+c*x)1/d (Phụ lục B). Giá trị IC50 và khả năng bắt gốc tự do của các cao phân đoạn được trình bày ở hình 3.8 và hình 3.9. 70 90 80 60 (A) (B) 70 50 60 40 50 30 40 % bắt gốc tự do tự gốc %bắt % bắt gốc tự do tự gốc %bắt 20 2 2 R = 0,9915 30 R = 0,9994 IC50 = 273,13 µg/ml IC50 = 136,63 µg/ml 10 20 0 10 0 200 400 600 0 200 400 600 Nồng độ mẫu (µg/ml) Nồng độ mẫu (µg/ml) 100 90 80 (C) (D) 80 70 tự do tự 60 60 50 40 2 2 gốc %bắt % bắt gốc tự do tự gốc %bắt 40 R = 0,9926 R = 0,9964 IC = 10,71 µg/ml IC50 = 161,62 µg/ml 30 50 20 20 10 0 0 Nồng độ20 mẫu (µg/ml)40 60 0 Nồng độ200 mẫu (µg/ml)400 600 Hình 3.8. Đồ thị thể hiện khả năng chống oxi hóa của các cao dịch chiết. (A) Hexane, (B) Chloroform, (C) Ethyl acetate, (D) Nước. 61
Đồ án tốt nghiệp 300 250 273.13 200 g/ml)  ( 150 50 161.62 136.63 100 Giá trị Giá IC 50 10.71 0 Hexane Chloroform Ethyl acetate Nước Phân đoạn cao ô dược Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 của các phân đoạn cao ô dược Kết quả cho thấy, các cao phân đoạn của ô dược đều có khả năng bắt gốc tự do, nồng độ càng tăng khả năng bắt gốc tự do càng cao. Ở nồng độ 200 µg/ml, phân đoạn cao hexan bắt 42,013% gốc tự do, phân đoạn cao chloroform và nước có % bắt gốc tự do lần lượt là 61,908% và 55,271% trong khi đó phân đoạn cao ethyl acetate cho kết quả khá cao đến 85,828%. Như vậy, phân đoạn cao ethyl acetate có khả năng bắt gốc tự do cao nhất so với các phân đoạn cao còn lại. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do của cao phân đoạn ô dược được xác định qua giá trị IC50 (hình 3.9), IC50 càng thấp hoạt tính kháng oxy hóa các cao phân đoạn ô dược càng cao và ngược lại. Kết quả cho thấy, phân đoạn cao ethyl acetate có khả năng kháng oxy hóa mạnh nhất (IC50 = 10,71 g/ml), thấp nhất là cao hexan (IC50 = 273,13 g/ml). Như vậy, phân đoạn cao ethyl acetate là phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hoá cao nhất so với các phân đoạn cao còn lại, và cao hơn cao tổng methanol (IC50 = 58,89 g/ml). Nghiên cứu cao ethyl acetate lá cỏ mực (Eclipta alba Hassk) có khả 62
Đồ án tốt nghiệp năng kháng oxy hoá (IC50 = 419,38 g/ml) (Đái Thị Xuân Trang và cộng sự, 2016) thì cao ethyl acetate ô dược cho khả năng kháng oxy hoá cao hơn gấp 39,15 lần. Cao ethyl acetate của cây bạch đầu ông (Vernonia cinerea L.) có khả năng kháng oxy hoá với IC50 = 24,10 g/ml (Nguyễn Trọng Tuân và cộng sự, 2017), kết quả này cho thấy khả năng kháng oxy hoá của cao ethyl acetate ô dược mạnh hơn 2,2 lần. Tuy nhiên, so với mẫu đối chứng dương vitamin C (IC50 = 6 g/ml), phân đoạn cao ethyl acetate cho hoạt tính kháng oxy hoá thấp hơn nhưng không đáng kể. 3.9. Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào u sắc tố B16F10 Để khảo sát tác dụng của phân đoạn cao cây ô dược lên độc tính và quá trình tổng hợp melanin, tế bào u hắc tố B16F10 được xử lý với các phân đoạn cao ở nồng độ 200 µg/ml trong 48 giờ. Tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào u sắc tố B16F10 được thể hiện ở hình 3.10. Hình 3.10. Tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào u sắc tố B16F10 63
Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát cho thấy, ở nồng độ 200 µg/ml, phân đoạn cao hexan và ethyl acetate có khả năng ức chế quá trình tổng hợp hắc tố lần lượt là 64,98% và 54%, cao hơn so với phân đoạn cao nước (20%). Phân đoạn cao chloroform có thể ức chế 42,94% qúa trình tổng hợp hắc tố. So với mẫu đối chứng Arbutin ở nồng độ 200 µg/ml ức chế 20% quá trình tổng hợp melanin, phân đoạn cao ethyl acetate cho kết quả cao hơn 2,7 lần. Đối với khả năng gây độc cho tế bào, kết quả cho thấy, ở nồng độ 200 µg/ml, phân đoạn cao ethyl acetate và nước cho tỉ lệ tế bào sống cao hơn hai phân đoạn còn lại, không gây độc cho tế bào. Ở mẫu đối chứng, Arbutin ức chế 20% quá trình tổng hợp melanin ở nồng độ 200 µg/ml và không gây độc cho tế bào (hình 3.10). Như vậy, phân đoạn cao ethyl acetate và phân đoạn cao nước là hai phân đoạn cao cho kết quả tốt trong thử nghiệm này, vừa có khả năng ức chế tổng hợp hắc tố cao ở nồng độ 200 µg/ml, vừa không gây độc cho tế bào. Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát tác dụng của cây ô dược lên quá trình tổng hợp melanin cũng như xem xét độc tính của nó trên tế bào. Kết quả cho thấy cao methanol và cao phân đoạn ethyl acetate của ô dược ức chế hiệu quả quá trình tổng hợp hắc tố và không gây độc cho tế bào ở nồng độ 200 µg/ml. Tia cực tím có thể cảm ứng việc sản sinh các gốc oxy hoạt động, gây ra nhiều tác hại cho các mô tế bào. Các gốc oxy hoạt động cũng kích thích quá trình tổng hợp melanin. Ô dược có tác dụng chống oxy cao với % bắt gốc tự do của cao tổng methanol (IC50 = 58,89 g/ml) và cao phân đoạn ethyl acetate (IC50 = 10,71 g/ml). Kết quả cho thấy, phân đoạn cao ethyl acetate là phân đoạn tốt nhất nên mẫu phân đoạn ethyl acetate của cây ô dược sẽ được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm về sau. 3.10. Kết quả xác định thành phần hoá học bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Với mẫu cao tổng methanol và phân đoạn ethyl acetate, tiến hành sắc lý lỏng hiệu năng cao để xác định thành phần hoá học. Kết quả sắc ký thể hiện ở hình 3.11 và hình 3.12. 64
Đồ án tốt nghiệp Peak1 6 7 Peak 3 Peak 3 Peak Peak Peak Peak Peak Peak Peak 4 8 5 Peak 2 Peak Peak Peak Peak Peak Hình 3.12. Phổ HPLC dịch cao chiết methanol ô dược Peak 4 7 5 Peak Peak 3 Peak Peak Peak Peak 2 Peak Peak 6 Peak Peak 10 9 8 Peak Peak Peak Peak Peak Peak 1 Peak Peak Hình 3.11. Phổ HPLC dịch cao chiết phân đoạn ethyl acetate ô dược Tiến hành sắc ký cao tổng methanol, kết quả hình 3.11 cho thấy, cao tổng có 8 cấu tử chính. Các cấu tử được ly trích ra khỏi hỗn hợp cao trong khoảng thời gian lưu từ 0 – 20 phút đầu. Ngoài ra, có 2 cấu tử được ghi nhận ở 32 – 44 phút. Trong cao tổng methanol chứa nhiều hợp chất từ không phân cực đến phân cực. 65
Đồ án tốt nghiệp Với phân đoạn cao ethyl acetate cho thấy có 10 cấu tử chính và các cấu tử đầu có hàm lượng tương đối lớn. Các cấu tử được ly trích ra khỏi hỗn hợp cao trong khoảng thời gian từ phút 11 đến đến phút 42 (hình 3.12). So với cao tổng methanol ô dược, phân đoạn cao ethyl acetate chứa chủ yếu các hợp chất có độ phân cực trung bình. Như vậy, qua kết quả sắc ký lỏng HPLC cho thấy mẫu thử nghiệm chứa nhiều hợp chất khác nhau từ không phân cực đến phân cực, trong đó những chất có độ phân cực trung bình chiếm đa số. 66
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Hiệu suất chiết cao methanol ở loài ô dược là 12,46%. Từ cao tổng methanol, chiết phân đoạn với bốn loại dung môi, hiệu suất thu hồi của phân đoạn cao hexan là thấp nhất (3,42%), tiếp đến là chloroform (10,57%) và ethyl acetate (23,45%), cao nước là phân đoạn cho hiệu suất thu hồi cao nhất (43,02%). Định tính thành phần hoá học, kết quả cho thấy cao tổng methanol chứa nhiều hợp chất có độ phân cực khác nhau từ không phân cực đến phân cực như: alkaloid, carbohydrate, flavonoid, chất béo, protein. Các mẫu cao chiết phân đoạn đều chứa nhiều hợp chất hoá học như: alkaloid, carbohydrate, flavonoid, chất béo, protein. Trong đó các hợp chất có độ phân cực trung bình chiếm đa số. Cao methanol từ cây ô dược cho hiệu quả ức chế quá trình tổng hợp melanin và không gây độc cho tế bào ở nồng độ 200 g/ml. Ở nồng độ 100 µg/ml và 200 µg/ml, cao methanol cây ô dược có thể ức chế 32,79% và 42,58% quá trình tổng hợp melanin. Cao methanol có khả năng bắt gốc tự do cao với IC50 = 58,89 g/ml. Các phân đoạn cao ô dược (hexane, chloroform, ethyl acetate, nước) đều có khả năng bắt gốc tự do và khả năng bắt gốc tự do tỉ lệ thuận với nồng độ. Trong đó, phân đoạn ethyl acetate có hiệu quả loại bỏ gốc tự do cao nhất trong các phân đoạn còn lại với IC50 = 10,71 g/ml, cho hiệu quả ức chế tổng hợp melanin (42,58 %) và không gây độc với tế bào ở nồng độ 200 g/ml. Sắc ký cao tổng methanol có 8 cấu tử chính có độ phân cực khác nhau từ không phân cực đến phân cực. Phân đoạn cao ethyl acetate có 10 cấu tử chính và các cấu tử đầu có hàm lượng tương đối lớn, phân đoạn cao ethyl acetate chứa chủ yếu các hợp chất có độ phân cực trung bình. Kết quả nghiên cứu tạo cơ sở khoa học cho khoa học dược liệu cơ bản và nhằm góp phần định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo về thành phần và hoạt tính sinh học của loài ô dược. 67