›

Đồ án Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý

pdf 79 trang thiennha21 12/04/2022 4210
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_he_enzyme_cellulase_thu_nhan_tu_cong_dong_vi.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HỆ ENZYME CELLULASE THU NHẬN TỪ CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ BÒ ĐỂ PHÂN GIẢI RƠM QUA XỬ LÝ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH CN.NGÔ ĐỨC DUY Sinh viên thực hiện: LƯU THÁI HÒA MSSV: 1051110075 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp này là kết quả nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng Quốc Khánh và CN. Ngô Đức Duy, không sao chép của ai. Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của đồ án. Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm và mọi kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra. Sinh viên thực hiện Lưu Thái Hòa
  3. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt bài báo cáo này. Em xin cảm ơn chân thành đến: Thầy TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đồ án tốt nghiệp tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ để em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp. Thầy Ngô Đức Duy phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Ban giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM và toàn thể các Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường là những người đã tận tình dạy dỗ, đã tạo điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập của chúng em trong suốt 4 năm qua. Các anh chị trong phòng Thí Nghiệm Vi Sinh của Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã cung cấp cho em những số liệu mà em cần, khi em làm về qui trình thực nghiệm. Tất cả các bạn trong lớp 10DSH02 thân yêu đã an ủi động viên tôi hoàn thành tốt bài khóa luận này, cũng như những bạn đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ mọi thứ với tôi trong suốt thời sinh viên. Và con xin cám ơn Bố Mẹ, chị hai, em gái, những người thân đã luôn động viên con, giúp con có nghị lực để con có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
  4. MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ v DANH MỤC SƠ ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1 1.Tính cấp thiết của đề tài 1 2.Tình hình nghiên cứu 1 3.Mục đích nghiên cứu 2 4.Nhiệm vụ nghiên cứu 2 5.Phương pháp nghiên cứu 3 6.Các kết quả đạt được của đề tài 3 7.Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Giới thiệu về cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò 4 1.1.1. Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò 4 1.1.2.Vi khuẩn phân giải cellulose ở dạ cỏ bò 8 1.1.3. Điều kiện vật lý trong dạ cỏ bò 9 1.2. Giới thiệu về hệ enzym cellulase 10 1.2.1. Định nghĩa 10 1.2.2. Phân loại 10 1.2.3. Cấu tạo của cellulase 11 1.2.4. Tính chất 11 1.2.5. Các chất ức chế 12 i
  5. 1.2.6. Cellulosome 12 1.3. Phân giải rơm qua xử lý 13 1.3.1. Thành phần của rơm 13 1.3.2. Cấu trúc của rơm trong tự nhiên 14 1.3.3. Các phương pháp tiền xử lý rơm rạ 15 1.3.4. Con đường phân giải rơm 17 1.4. Hiện trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam và các nước trên thế giới 18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Nguyên vật liệu 20 2.2. Thiết bị, hóa chất 21 2.2.1. Thiết bị 21 2.2.2. Hóa chất 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1. Quy trình tăng sinh chọn lọc. 25 2.3.2. Quy trình tăng sinh khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật 26 2.3.3. Quy trình tăng sinh khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật 27 2.4. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 28 2.4.1. Quy trình phát hiện sinh tổng hợp enzyme endoglucanase trên thạch đĩa CMC 28 2.4.2. Định lượng hàm lượng protein tổng trong dịch nuôi cấy theo phương pháp Bradford 28 2.4.3. Định lượng hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper . 30 2.5. Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp của hệ enzyme cellulase 31 2.5.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase 32 ii
  6. 2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 32 2.6. Khảo sát quá trình enzyme cellulase thủy phân cellulose từ rơm rạ 32 2.6.1. Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS 33 2.6.2. Khả năng phân giải rơm rạ 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1. Kết quả tăng sinh trên môi trường PCS 35 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật 38 3.3. Kết quả khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật 39 3.4. Kết quả hàm lượng protein tổngtheo phương pháp Bradford 42 3.5. Kết quả đo hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper 43 3.5.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase 43 3.5.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 44 3.6. Kết quả đo lượng đường khử sau khi phân giải rơm theo phương pháp DNS 46 3.7. Kết quả phân giải rơm rạ 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 4.1.Kết luận 49 4.2.Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC iii
  7. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC carboxymethyl cellulose DNS Acid Dinitro – Salicylic FP phương pháp filter paper mg miligram ml mililiter iv
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Dung dịch đệm citrate 22 Bảng 2.2. Dung dịch đệm phosphate 22 Bảng 2.3. Thông số xây dựng đường chuẩn albumin 29 Bảng 2.4. Thông số xây dựng đường chuẩn glucose 30 Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc trong môi trường PCS và vòng phân giải trên đĩa thạch CMC tại 37℃, pH 7,0. 35 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 37℃, pH 7,0. 38 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 39℃, pH 7,0. 38 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 41℃, pH 7,0 39 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở các pH khác nhau 40 Bảng 3.6. Nồng độ protein tổng của 9 mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò 42 Bảng 3.7. Giá trị OD540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi pH từ 6,0 – 6,9 ở 39℃ 43 Bảng 3.8. Giá trị OD540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi nhiệt độ 37℃, 39℃, 41℃ ở pH tối ưu 44 Bảng 3.9. Kết quả hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp FP 45 Bảng 3.10. Kết quả hàm lượng glucose trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase. 47 Bảng 3.11. Khả năng phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase 48 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Nồng độ protein tổng của 9 mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò 42 Biểu đồ 3.2. Hoạt tính cellulase tổng số của 9 mẫu enzyme cellulase 45 Biểu đồ 3.3. Hàm lượng glucose tạo thành trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase. 47 Biểu đồ 3.4. Khả năng phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase 48 v
  9. DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình thu nhận enzyme cellulase. 20 Sơ đồ 2.2. Tóm tắt toàn bộ thí nghiệm. 24 Sơ đồ 2.3. Quy trình tăng sinh chọn lọc mẫu. 25 Sơ đồ 2.4. Quy trình khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật 26 Sơ đồ 2.5. Quy trình khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật 27 Sơ đồ 2.6. Quy trình phân giải rơm bằng hệ enzyme cellulase 32 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hệ tiêu hóa của trâu bò 4 Hình 1.2.Protazoa cùng với vi khuẩn và bào tử nấm 5 Hình 1.3.Ruminococcus flavefaciens 6 Hình 1.4. Thành phần của lignocellulose 13 Hình 1.5. Cấu trúc hiển vi của lignocellulose 14 Hình 1.6. Cấu trúc của lignocellulose 15 Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase theo Erikson 17 Hình 3.1. Chín mẫu dạ cỏ bò tăng sinh ở 37℃, pH 7,0. 36 Hình 3.2.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cò bò ở 37℃, pH 7,0 sau 07 ngày tăng sinh trong môi trường PCS 37 Hình 3.3.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cò bò ở 37℃, pH 7,0 sau 10 ngày tăng sinh trong môi trường PCS. 37 Hình 3.4.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cò bò ở 37℃, pH 7,0 sau 13 ngày tăng sinh trong môi trường PCS. 37 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar Các phế thải này có thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit.Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu thành công từ việc thu nhận dịch trong dạ cỏ của động vật nhai lại và ứng dụng để tạo chế phẩm cellulase công nghiệp. Ở Việt Nam, hiện nay các nghiên cứu về cộng đồng hệ enzyme cellulase chưa được quan tâm nhiều, đa phần chủ yếu nghiên cứu tính đơn lẻ trong phức hệ enzyme cellulase. Và hướng nghiên cứu cộng đồng hệ enzyme cellulase nhằm đáp ứng một phần trong nghiên cứu phân giải cellulose từ biomasss định hướng cho sự phát triển nguồn nhiên liệu sinh học trong tương lai. Do vậy, đề tài: “ Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý” góp phần vào nghiên cứu và ứng dụng sản xuất công nghiệp cho tương lai. 2.Tình hình nghiên cứu 2.1. Thế giới Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu sử dụng hệ vi sinh vật từ dạ cỏ của loài nhai lại có khả năng sinh enzyme celulase để phân giải rơm rạ, xử lý chất thải công nghiệp biomass. Đó là nghiên cứu của Oyeleke.et.al (2008)[21], Faridha Begum.I.er.al (2013) [22] Nghiên cứu để sản xuất nhiên liệu sạch, thân thiện với môi trường từ biomass và đặc biệt là thay thế được nguồn năng lượng hóa thạch 1
  11. Đồ án tốt nghiệp (dầu mỏ, khí thiên nhiên, than đá ) đang bị cạn kiệt, được các nước trên thế giới rất quan tâm, đặc biệt là những quốc gia có nền kinh tế phát triển mạnh, nghiên cứu của Parameswaraan Binod.et.al (2010)[16]. 2.2. Trong nước Ở Việt Nam, đã có nghiên cứu để xử lý rơm, rạ, trấu thành ethanol - nguồn nhiên liệu sinh học thân thiện môi trường thay thế cho xăng dầu (Nguyễn Hoàng Dũng, trường ĐH Bách Khoa TPHCM, 2012), nghiên cứu sản xuất giấy từ rơm rạ (Nguyễn Phúc Thanh), nghiên cứu “Quy trình lên men acid lactid từ rơm rạ” (Nguyễn Văn Tuyên- Trường Đại Học Đà Nẵng, 2011) [9], “Nghiên cứu việc sử dụng rơm rạ tạo ra các sản phẩm môi trường” như: làm phân hữu cơ, làm giấy, trồng nấm, rau sạch, làm nhiên liệu xây nhà, tạo ra điện, làm thủ công mỹ nghệ, làm chế phẩm sinh học (Nguyễn Thị Ngọc Yến, trường ĐH Công Nghệ TP HCM, 2012)[10], ứng dụng chế phẩm sinh học (nấm Trichoderma) để sản xuất phân rơm rạ hữu cơ và cải thiện độ phì của đất canh tác lúa (Lưu Hồng Mẫn, 2012) 3.Mục đích nghiên cứu Thu nhận và tối ưu hóa điều kiện phát triển của cộng đồng vi khuẩn từ dạ cỏ bò có khả năng sinh hệ enzyme cellulase phân giải cellulose. Thu nhận và tối ưu hóa điều kiện môi trường ảnh hưởng đến hoạt tính hệ enzyme cellulase. Khảo sát khả năng thủy phân cellulose từ biomass của hệ enzyme cellulase. 4.Nhiệm vụ nghiên cứu Chọn lọc cộng đồng vi khuẩn sinh hệ enzyme cellulase từ dạ cỏ bò. Tối ưu hóa điều kiện phát triển của cộng đồng vi khuẩn dạ cỏ bò. Chọn lọc hệ enzyme cellulase tiềm năng. Tối ưu hóa nhiệt độ, pH và thời gian cho hoạt tính hệ enzyme cellulase cao. Khảo sát khả năng phân giải rơm rạ của hệ enzyme cellulase. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp 5.Phương pháp nghiên cứu Tăng sinh, kiểm tra ngày phân giải giấy lọc và kiểm tra khả năng sản sinh endoglucanase phân giải CMC trên đĩa thạch của cộng đồng vi khuẩndạ cỏ bò. Phương pháp đo hàm lượng protein ngoại bào bằng phương pháp Bradford. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme cellulase tổng số bằng phương pháp Filter Paper. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Acid Dinitro - Salicylic (DNS). Phương pháp xác định trọng lượng khô của rơm rạ. Sử dụng các phần mền vi tính Microsoft Office Excel 2007, Statgraphics Centurion XV và Microsoft Office Excel 2007 để thống kê và tính toán. 6.Các kết quả đạt được của đề tài Thu nhận và tối ưu hóa nhiệt độ, pH phát triển của 9 cộng đồng vi sinh dạ cỏ bò có khả năng sinh hệ enzyme cellulase. Thu nhận và tối ưu hóa điều kiện môi trường ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme của 9 hệ enzyme cellulase có khả năng phân giải cellulose. Thu nhận được 3 hệ enzyme cellulase có khả năng phân giải rơm qua xử lý. 7.Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương. Chương 1: Tổng quan. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chương 3: Kết quả và biện luận. Chương 4: Kết luận và đề nghị. 3
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò 1.1.1. Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò Hình 1.1.Hệ tiêu hóa của trâu bò [2]. Dạ cỏ to nhất, chiếm 2/3 dung tích của dạ dày, là túi đặc biệt nhất, tại đây hàng loạt phản ứng sinh hoá học được tiến hành liên tục để phân giải tiêu hoá và hấp thu thức ăn.[2] Trong dạ cỏ có hàng tỷ vi sinh vật sống cộng sinh với nhau. Hệ vi sinh vật này giúp bò tiêu hóa thức ăn, trong khi bò cung cấp cho chúng chỗ ở và chất dinh dưỡng. Nếu không có hệ vi sinh vật này, dạ bò sẽ cần nhiều thời gian tiêu hóa chất xơ, tinh bột và sản xuất axit béo hơn, cung cấp khoảng 60 đến 80% năng lượng. Tóm lại, dạ bò có thể tiêu hóa nhiều loại thức ăn nhờ vào sự đa dạng của hệ vi sinh vật.[14] Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò bao gồm vi khuẩn, protozoa và nấm. Số lượng vi khuẩn khoảng 109- 1010cfu trong 1ml chất chứa, có trên 60 loài vi khuẩn đã được xác định. Số lượng vi khuẩn của từng loài phụ thuộc rất lớn vào khẩu phần ăn của bò.[2] Ngoài ra còn có Mycoplasma, các loại virus và các thể thực khuẩn. Mycoplasma, virus và thể thực khuẩn không đóng vai trò quan trọng trong tiêu hóa 4
  14. Đồ án tốt nghiệp thức ăn. Quần thể vi sinh vật dạ cỏ có sự biến đổi theo thời gian và phụ thuộc vào tính chất của khẩu phần ăn. Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ sống chủ yếu bằng năng lượng sinh ra từ quá trình lên men các chất dinh dưỡng.[8] Hình 1.2.Protazoa cùng với vi khuẩn và bào tử nấm.[33] ❖ Vi khuẩn: được chia thành nhiều nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, hemicellulose, tinh bột, đường, protein Vi khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi còn non, mặc dù chúng được nuôi cách biệt hoặc cùng với mẹ chúng. Thông thường vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong vi sinh vật dạ cỏ và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa xơ. Phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể được tiến hành dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng. Một số nhóm vi khuẩn dạ cỏ chính: Vi khuẩn phân giải cellulose: Đây là nhóm có số lượng lớn nhất trong dạ cỏ của gia súc sử dụng khẩu phần chính cellulose. Những loài vi khuẩn phân giải cellulose quan trọng là: Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminoccocus flavefaciens, Ruminococcus albus, Cillobacterium cellulosolven.[8] Ruminococcus flavefaciens là một loại vi khuẩn gram dương sinh ra phức hệ enzyme bám vào thành tế bào thực vật và xúc tác cho các hoạt động khác nhau.[14] 5
  15. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3.Ruminococcus flavefaciens.[33] Vi khuẩn phân giải hemicellulose: Nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose thì cũng có khả năng phân giải hemicellulose. Tuy nhiên không phải tất cả các loài sử dụng hemicellulose đều có khả năng thủy phân cellulose. Một số sử dụng hemicelluloses là: Butyrivibrio fibrisolvens, Lachnospira multiparus, Bacteroides ruminicola.[8] Vi khuẩn phân giải tinh bột: Trong dinh dưỡng carbonhydrate của các loài nhai lại, tinh bột đứng vị trí thứ hai sau cellulose. Phần lớn tinh bột theo thức ăn vào dạ cỏ được phân giải nhờ hoạt động của vi sinh vật. Tinh bột được phân giải bởi nhiều loại vi khuẩn trong dạ cỏ bò trong đó có cả vi sinh vật phân giải cellulose. Các loại vi khuẩn phân giải tinh bột quan trọng như là: Bacteroides amylophilus, Bacteroides Ruminantium, Steptococcus bovis. Prevotella bryantil là vi khuẩn gram âm có thể sử dụng polysaccharide hòa tan, là xylans.[8] Vi khuẩn phân giải đường: Hầu hết các vi khuẩn sử dụng các loại polysacchride nói trên thì cũng sử dụng đường disacchride và monosaccharide. Các loại vi khuẩn thuộc loài Lachnospira multiparus, Selenomanas ruminantium đều có khả năng sử dụng tốt cacbonhydrat hòa tan.[8] Vi khuẩn sử dụng acid hữu cơ: Loài vi khuẩn đều có khả năng sử dụng axit lactic mặc dù lượng axit này trong dạ cỏ thường không đáng kể trừ trong 6
  16. Đồ án tốt nghiệp những trường hợp đặc biệt. Những loài sử dụng lactic là Veillonella gasogenes, Veillonella alacalescens, Peptostreptococuss elsdenii.[8] Vi khuẩn phân giải protein: Sự phân giải protein và acid amin để sản sinh ra như amoniac trong dạ cỏ bò có ý nghĩa quan trọng đặc biệt về cả phương tiện tiết kiệm nitơ cũng như nguy cơ dư thừa amoiniac. Amoniac cần cho các loài vi khuẩn dạ cỏ để tổng hợp nên sinh khối protein của bản thân chúng, đồng thời một số vi khuẩn đòi hỏi hay được kích thích bởi acid amin, peptid, isoacid có nguồn gốc từ valine, leucine và isoleucine. Trong số những loài sinh aminoac thì Peptostreptococus và Clostridium có khả năng lớn nhất.[8] Vi khuẩn tạo methan: Methanogens là những vi khuẩn sinh methan trong dạ cỏ bò, sử dụng cacbon cho quá trình lên men. Chúng dược chia làm 2 nhóm chính: Methano sphaera stadtmanae và Methano brevibacter ruminatium. Trong đó, Methano bacteriaceae (thuộc Methano sphaera stadtmanae) được tìm thấy nhiều nhất, Methano corpusculaceae và Methano spirillaceae phổ biến thứ hai trong dạ cỏ bò. Nhóm Methano brevibacter ruminatium gồm: Methano microbium, Methano bacterium và Methano sarcina, là những vi khuẩn có khả năng sử dụng khí methan, hình que ngắn, không sinh nội bào tử, nhiệt độ phát triển tối ưu là 40°C và pH 6,1 – 6,9.[14]. Vi khuẩn tổng hợp vitamin: Nhiều loại vi sinh vật trong dạ cỏ bò có khả năng tổng hợp vitamin B và vitamin K.[8] Vi khuẩn lên men pectin: Nhóm vi khuẩn này phát triển ở pH khoảng 6.0 (ngoại trừ Bacterioides là pH 5,1). Có 32 chủng vi khuẩn lên men pectin đã được phân lập từ dạ cỏ bò, nhưng quy lại có 3 chủng chính: Lachnospira Multiparous, Butyrivbrio fibrisolvens và Bacteroides ruminicola. Chúng đều là vi khuẩn kỵ khí, có đường kính từ 1,0 – 1,2 휇m. Chúng thường lên men pectin tạo thành format và khí H2. Các sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men pectin được các vi khuẩn khác sử dụng, như succinate.[14] 7
  17. Đồ án tốt nghiệp ❖ Protozoa: Protozoa hay còn gọi là động vật nguyên sinh, chúng có số lượng ít hơn nhiều so với số lượng vi khuẩn, chúng chỉ có 106 trong 1ml chất chứa, nhưng vì có kích thước lớn hơn nên tổng sinh khối tương tự như vi khuẩn[2]. Protozoa xuất hiện trong dạ cỏ là các loại ciliate thuộc hai họ khác nhau. Họ Isotrichidae, thường gọi là Holotrich, gồm những Protozoa có cơ thể rỗng được phủ bởi các tiêm mao (cilia). Chúng gồm các bộ Isotricha và Dasytricha. Họ kia là Ophryosocolecidae, hay Oligotrich, gồm nhiều loài khác nhau về kích thước, hình thái và diện mạo. Chúng gồm các bộ Entodinium, Diplodinium, Epidinium và Ophryoscolex. Protozoa có tác dụng xé rách màng tế bào thực vật, làm tăng diện tích tiếp xúc, do đó thực vật dễ bị tác động của vi sinh vật.[8] Polyplastron multivesiculatum là protozoan tiêu biểu có khả năng phân hủy thành tế bào thực vật.[14] ❖ Nấm: Nấm ước tính có khoảng 10% tổng sinh khối trong điều kiện khẩu phần có nhiều xơ. Nấm thuộc loại vi sinh vật yếm khí nghiêm ngặt với chu kỳ sống có hai pha là pha bào tử (zoosore) và pha thực vật (sporangium). Những loài nấm được phân lập từ dạ cỏ gồm: Neocallimastix frontalis, Piramonas communis và Sphaeromonas commuis. Sự có mặt của nấm giúp làm tăng tốc độ tiêu hóa xơ. Oyeleke và ctv (2008) [21] đã tiến hành phân lập và tuyển chọn các vi sinh vật phân giải cellulose trong dạ cỏ của ba động vật nhai lại khác nhau bò, cừu, dê. Kết quả đã phân ậl p được các loài nấm: Aspergillus, Mucor and Fusarium có khả năng phân giải cellulose. ❖ Những vi sinh vật khác: Dạ cỏ là một nơi sống tối ưu cho vi sinh vật sống kỵ khí. Điều kiện bên trong dạ cỏ thay đổi liên tục (khoảng 30 - 40°C, pH 5.5 – 7.0). Những vi sinh vật bên trong dạ cỏ vừa cạnh tranh với nhau vừa sống cộng sinh với vi khuẩn.[14] 1.1.2.Vi khuẩn phân giải cellulose ở dạ cỏ bò Có hàng trăm loại vi sinh vật khác nhau trong dạ cỏ bò hỗ trợ lẫn nhau trong quá trình tiêu hóa thức ăn của chúng bao gồm nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh. 8
  18. Đồ án tốt nghiệp Người ta nghiên cứu rằng sau 38 giờ sau khi các bò con được sinh ra thì các vi sinh vật đã phát triển trong dạ cỏ (Mc Allister TA.et.al, 1994) [26]. Bên cạnh đó các nhà khoa học đều đồng ý rằng sự thủy giải cellulose trong dạ cỏ chủ yếu là do các hoạt động của vi khuẩn phân giải cellulose và chiếm đa số với mật độ 1011 cfu/ml. Trong đó các vi khuẩn phân giải cellulose đã được phát hiện chiếm ít nhất là 0,3% tổng số vi khuẩn trong dạ cỏ (Brulc.et.al, 2011) [27]. Vi khuẩn Fibrobacter succnigenes, Ruminococcus albus, Cillobacterium cellulosolvens và Ruminococcus flavefaciens là các loài phân giải cellulose chiếm ưu thế trong vi sinh vật dạ cỏ (Faridha.et.al, 2013) [22]. So sánh với tất cả nghiên cứu hiện nay thì các loại vi khuẩn này có khả năng phân giải cellulose mạnh. Chúng sử dụng cellulose và các sản phẩm thủy phân của chúng như là một nguồn năng lượng cho sự phát triển. Đã có 8 loài được công nhận của giống Ruminococcus, kỵ khí, cầu khuẩn gram dương thích nghi tốt trong môi trường dạ cỏ. Vi khuẩn Ruminococcus flavefaciens đã được Kaars-Sijpesteijn (1951) mô tả như sau: Tế bào hình cầu, gram dương, đường kính 0,8 – 0,9 µm, kỵ khí bắt buộc và tạo ra một sắc tố màu vàng đặc trưng đặc biệt khi phát triển trên cơ chất là cellulose, không có khả năng di động, catalase âm tính. Loài vi khuẩn Cellulomonas flavigena cũng có tế bào hình que, gram dương, thuộc giống Cellulomonas, ngành Actinobacteria, có khả năng sản sinh nhiều loại enzyme cellulase và xylanase trên cơ chất bã mía và nguồn cơ chất cellulose khác [27]. 1.1.3. Điều kiện vật lý trong dạ cỏ bò Dạ cỏ bò có pH khoảng 6.5–7.2. Nhiệt độ của bò khỏe mạnh dao động từ 37,8°C đến 40°C và nhiệt độ của dạ cỏ là khoảng 40°C. Những điều kiện này cho thấy các vi khuẩn trong dạ cỏ là kỵ khí bắt buộc và chúng chỉ phát triển trong điều kiện không khắc nghiệt. [14] Các sản phẩm của mỗi hệ vi sinh vật tạo ra một loại môi trường nhờ đó tất cả chúng cùng tồn tại và góp phần vào tạo nguồn năng lượng cho bò. 9
  19. Đồ án tốt nghiệp Do những ưu điểm nổi bật về tốc độ sinh trưởng, sinh sản và phát triển mà nguồn vi sinh vật được quan tâm nhiều hơn. Mặt khác, do kích thước vi sinh vật nhỏ nên ta có thể cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy vi sinh vật có thể kiểm soát được mà không phụ thuộc vào yếu tố bên ngoài. 1.2. Giới thiệu về hệ enzym cellulase 1.2.1. Định nghĩa Cellulase là tên chung cho các nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân của cellulose và các dẫn xuất celluoligosaccharide.[11] 1.2.2. Phân loại Theo phân loại của hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế (IUBMB- International Union of Biochemistry and Molecular Biology) hệ thống thủy phân cellulose gồm có enzym: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucosidase có ký hiệu EC 3.2.1.21.[6] ❖ Endoglucanase EC 3.2.1.4 Tên thường gọi là cellulase1,4-β –glucanase. Tên hệ thống: 1,2-(1,3:1,4)- β-D-glucan-4- glucanohydrolase. Người ta gọi enzym này bằng những tên khác : endo-1,4- β-D-glucanase; β- 1,4- glucanase; cellulase A Enzym này thường thủy phân các liên kết 1,4-β-D- glucosid trong cellulose và các β-D-glucan của ngũ cốc. ❖ Exoglucanase EC.3.2.1.91 Tên thường gọi là cellulase 1,4-β-cellobiosidase. Tên hệ thống: 1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase. Các tên khác: exo- cellobiohydrolase; exoglucanase; CBH1 Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và cellotetraose từ đầu không khử. 10
  20. Đồ án tốt nghiệp ❖ β-glucosidase EC 3.2.1.21. Tên thường gọi là β-glucosidase. Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase. Các tên khác: cellobiase; β-glucosid glucohydrolase; β-1,6-glucosidase Enzym này thủy phân các gốc β-D-glucosid, một số trường hợp cũng thủy phân β-D-galactosidase, β-D-fucoside, β-D-xyloside, α-L- arabinoside. 1.2.3. Cấu tạo của cellulase Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid –(CO – NH)– và gắn những phần phụ khác. Cấu trúc không gian cellulase bao gồm một tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác nhưng được gắn thêm đuôi vùng glycosil hóa và cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose. Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym.[11] Trọng lượng của enzym cellulase thay đổi từ 30-110 KDal.Cấu trúc không gian khoảng 280 - 600 acid amin nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300-450 acid amin và trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin. Bằng cách bẽ gãy các liên kết β-1,4-glucan, hệ enzym cellulase đã thủy phân cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Trong đó exoglucanase là enzyme chính trong quá trình thủy phân cellulose. 1.2.4. Tính chất ❖ Tính đặc hiệu Enzyme exocellulase thủy phân đặc hiệu liên kết -1,4-glucoside ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin. Enzyme endocellulase thủy phân liên kết -1,4-glucoside ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose. -glucosidase thủy phân đặc hiệu gốc β-D- glucan của rơm rạ.[6] 11
  21. Đồ án tốt nghiệp ❖ Đặc tính hóa lý và hóa sinh Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 0°C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp.[13] Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà có pH trung tính, kiềm hoặc acid.Hoạt tính của một enzyme bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường sống.Enzyme làm thay đổi tốc độ phản ứng. Trong tự nhiên, khi cần thiết, các vi sinh vật sẽ điều chỉnh các điều kiện enzyme để tạo ra một mức phản ứng enzyme tối ưu hoặc chúng có thể tạo ra hệ enzyme để thích nghi với chức năng sống trong điều kiện khắc nghiệt. 1.2.5. Các chất ức chế Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose. Trong đó, ion Hg2+ ức chế cellulase hoàn toàn, các ion khác như Mn2+, Ag+, Zn2+ ức chế nhẹ.[6] 1.2.6. Cellulosome Cellulosome là phức hệ enzyme ngoại bào của vi khuẩn kị khí, giữ vai trò thủy phân cellulose trong biomass với hiệu quả cao. Một số lượng lớn gen của vi khuẩn Clostridium thermocellum mã hóa cho cellulosome. Cellulosome của C.thermocellum chứa hệ enzyme cellulase, ngoài ra còn chứa: xylanase, xyloglucanases, pectinases, glycosidases, protein cấu trúc và ít nhất một thành phần protein không xúc tác, thành phần này đang được nghiên cứu. Những thành phần của cellulosome thường không được phân bố đồng đều trong phức hợp liên enzyme này và không phải gen nào cũng được biểu hiện ra. Hệ enzyme này nằm trên bề mặt tế bào nên giúp giảm thiểu sự khuyếch tán enzyme và sản phẩm từ sự thủy phân, từ đó đảm bảo sản phẩm thuỷ phân được hấp thu hoàn toàn vào sự chuyển hóa của tế bào.[28] 12
  22. Đồ án tốt nghiệp Các bằng chứng cho thấy bộ máy enzyme phân giải cellulose của C.thermocellum có hiệu quả gấp 50 đến 100 lần so với enzyme của nấm, trong mỗi gam protein. Tuy nhiên việc sản sinh cellulosome bởi thermophilic hiện nay là rất thấp. Người ta sẽ cải thiện bằng cách đột biến chọn lọc hoặc dùng kỹ thuật chuyển đổi gen giữa các loài vi khuẩn.[28] Điều đáng chú ý là cellulosome chỉ mới được sản xuất từ loài vi khuần Clostridiaceae và Lachnospiraceae (những vi khuẩn kỵ khí trong dạ cỏ). Phức hợp enzyme của cellulosome đang là mô hình nghiên cứu thú vị cho kỹ thuật sinh học in vitro. 1.3. Phân giải rơm qua xử lý 1.3.1. Thành phần của rơm Lignocellulose là thành phần chính của rơm rạ, bao gồm ba thành phần là cellulose, hemicellulose và lignin. Trong đó, cellulose chiếm 32-47%, hemicellulose chiếm 19-27% và lignin chiếm 5-24%.[16] Trong hemicellulose các pentoses chiếm ưu thế, trong đó xylose là đường quan trọng nhất chiếm 14,8 – 20,2%.[16] Thành phần phần trăm các chất trong rơm rạ được thể hiện trong hình 1.4. Hình 1.4. Thành phần của lignocellulose.[25] 13
  23. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2. Cấu trúc của rơm trong tự nhiên Hình 1.5. Cấu trúc hiển vi của lignocellulose.[24] Thành phần chính của lignocellulose là cellulose, gồm những phân tử glucose nối với nhau bằng liên kết 훽1,4-glucoside. Hemicellulose là thành phần phổ biến thứ hai trong lignocellulose, gồm các đường 5-6 cacbon như arabinose, galactose, glucose, mannose and xylose. Nó tồn tại ở những phần như vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu Lignin bao gồm 3 thành phần chính có vòng phenol là: p- coumaryl alcohol (H), coniferyl alcohol (G) and sinapyl alcohol (S). Lignin được tổng hợp bởi các phản ứng trùng ngưng của các thành phần này.Tỷ lệ các thành phần này là khác nhau trong các cây, mô gỗ và các lớp tế bào khác nhau.Hình thức 14
  24. Đồ án tốt nghiệp cấu trúc của cellulose, hemicellulose and lignin được gọi là microfibrils, chúng ổn định cấu trúc trung gian cho tế bào thực vật [24].Cấu trúc hiển vi của lignocellulose được thể hiện trong hình 1.5. Hình 1.6.Cấu trúc của lignocellulose.[35] Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm. Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng:[36] Vùng kết tinh: các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch khác. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài. Enzyme cellulase chỉ có tác động ở bề mặt hệ sợi của vùng này. Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vander Waals. ở vùng này cellulose có cấu trúc không chặc chẽ và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. 1.3.3. Các phương pháp tiền xử lý rơm rạ Rơm rạ được tạo bởi những sợi polymer cacbonhydrat phức tạp và không đồng nhất.Cellulose và hemicellulose được bao phủ bởi những lớp lignin dày đặc chống lại sự thủy phân của enzyme.Vì vậy, cần phải có một bước tiền xử lý để phá vỡ lignin để lộ cellulose và hemicellulose cho quá trình thủy phân của enzyme được 15
  25. Đồ án tốt nghiệp dễ dàng.Mục đích của tiền xử lý là để giảm cellulose kết tinh, tăng diện tích bề mặt biomass, loại bỏ hemicellulose và phá vỡ lớp lignin.Tiền xử lý làm cho cellulose dễ tiếp cận hơn với enzyme để chuyển đổi polymer carbohydrate thành đường lên men có thể nhanh hơn và với số lượng cao hơn.[16] Tiền xử lý bao gồm các phương pháp hóa học, vật lý, nhiệt và sự kết hợp giữa chúng. Tiền xử lý đã được xem là một trong những bước quan trọng xử lý các bước trong việc chuyển đổi đường cellulose để lên men. a. Tiền xử lí vật lý: Phương pháp này sẽ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và khe rỗng bên trong vật liệu, giảm độ kết tinh và độ polyme hóa của cellulose, thường được sử dụng để làm giảm dư lượng lignocellulosic. Phương pháp này gồm: Hấp, nghiền và xay, chiếu xạ, nhiệt độ và áp suất. b. Tiền xử lý hóa học: Các phương pháp hóa học đầy hứa hẹn bao gồm: Tiền xử lý với kiềm. Tiền xử lý với ammonia. Tiền xử lý với acid. Tiền xử lý với các tác nhân oxy hóa. Tiền xử lý với dung môi hữu cơ. c. Tiền xử lý sinh học: Tiền xử lý sinh học đưa ra một số tiến bộ quan trọng như sử dụng năng lượng và hóa chất ít., nhưng vẫn chưa có ộm t hệ thống có thể điều khiển và thích hợp nhanh chóng,là một phương pháp an toàn và thân thiện với môi trường cho việc loại bỏ lignin từ lignocellulose.Các vi sinh vật đầy hứa hẹn nhất trong tiền xử lý sinh học là nấm trắng thối thuộc về lớp Basidiomycetes được đánh giá trên cơ sở những thay đổi về số lượng và cơ cấu trong thành phần của rơm đã qua xử lý cũng như tính nhạy cảm thủy phân enzym. Hiệu quả thủy phân lignocellulosic biomass tăng lên khi kết hợp nhiều loại enzyme như cellulase, xylanases và pectinases. Nhưng chi phí của phương pháp cũng tăng lên nghiêm trọng mặc dù từ góc độ sinh thái, đây là phương pháp đáng kỳ vọng cao. 16
  26. Đồ án tốt nghiệp d. Tiền xử lý kết hợp Kun.et.al (2009) báo cáo tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm có xúc tác H2O2 với sự hỗ trợ của tiền xử lý vi sóng làm thay đổi tính chất vật lý và vi cấu trúc của rơm, Zhu.et.al (2006) báo cáo một số kết hợp tiền xử lý vi sóng của rơm rạ cùng với axit và kiềm trong đó loại bỏ hemicellulose và lignin.[16] 1.3.4. Con đường phân giải rơm ❖ Cơ chế phản ứng theo công nghệ sinh học hiện đại Endocellulase xúc tác cắt liên kết 1,4 -glucoside trong cellulose, lignin và 훼 - D - glucan ngẫu nhiên. Sản phẩm là cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.[6] Exocellulase : cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose. Cellobiase: tham gia phân giải disaccharide và cellotetrose thành glucose. Cơ chế này được thể hiện qua hình 1.7. Hình 1.7.Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase theo Erikson [1]. 17
  27. Đồ án tốt nghiệp Thủy phân bởi enzyme liên quan đến quá trình bẻ gãy các polyme của cellulose và hemicellulose nhờ vào sử dụng enzyme. Polyme của cellulose thường chỉ chứa glucans, trong khi polyme của hemicellulose chứa nhiều loại đường như mannan, xylan, glucan, galactan và arabinan. Do đó, sản phẩm thủy phân chính của cellulose là glucose, trong khi hemicellulose còn sản sinh ra một số pentoses và hexoses. Tuy nhiên, hàm lượng lignin cao trong rơm gây cản trở sự tiếp xúc của enzyme, gây ra sự ức chế sản phẩm cuối cùng, làm giảm tốc độ và năng suất thủy phân. Ngoài lignin, cellobiose và glucose cũng ức chế mạnh mẽ quá trình thủy phân của cellulases.[16] Thủy phân bởi enzyme thường được tiến hành trong điều kiện nhẹ, tức là áp suất thấp kết hợp với thời gian lưu giữ lâu dài để thủy phân hemicellulose. Aspergillus niger đã được nghiên cứu để sản xuất glucose từ rơm rạ, cho thấy năng suất glucose tăng từ 43% đến 87% và kích thước rơm giảm từ 425 đến 75 µm khi nhiệt độ tối ưu trong khoảng 45 - 50°C và pH tối ưu khoảng 4.5 – 5.0. Nghiên cứu cho thấy nồng độ và tỉ lệ của sản phẩm glucose phụ thuộc vào giai đoạn tiền xử lý rơm, nồng độ cơ chất và tế bào. Hiệu quả thuỷ phân lignocellulosic trong biomass gia tăng khi có sự kết hợp của nhiều loại enzyme như cellulase, xylanases và pectinaza nhiều hơn là chỉ dùng cellulase. [16] 1.4. Hiện trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam và các nước trên thế giới ❖ Tại Việt Nam: Cho đến nay, rơm rạ vẫn là chất đốt chủ yếu dùng để đun nấu ở nhiều vùng nông thôn, là nguyên liệu để sản xuất ra những vật dụng sinh hoạt như: chổi rơm quét nhà, mũ rơm đội đầu, làm giấy và làm nhà. [10] Trong sản xuất nông nghiệp: Rơm là nguồn thức ăn cho gia súc, làm phân bón hữu cơ, trồng và sản xuất nấm rơm, nấm bào ngư, nấm sò và rau sạch, giữ ẩm, giữ ấm cho cây Việc ứng dụng các giải pháp kỹ thuật, nâng cao giá trị dinh dưỡng, sử dụng rơm mang lại hiệu quả trong chăn nuôi gia súc nhai lại. 18
  28. Đồ án tốt nghiệp Trong công nghiệp: Ngày nay, với công nghệ hiện đại, rơm rạ được chế biến làm ván ép để sản xuất đồ nội thất, làm tường ngăn thay thế cho gỗ, làm phụ gia trong sản xuất xi măng Rơm mang lại nhiều ưu điểm thân thiện với môi trường, sản xuất công nghiệp, nông nghiệp tạo công ăn việc làm cho người lao động, nâng cao đời sống tinh thần cho xã hội. Đồng thời, tận dụng nguồn rơm rạ được coi là phế phẩm tạo nên giá trị nghệ thuật, cũng như các vật dụng cần thiết trong đời sống hàng ngày. ❖ Trên thế giới: Rơm lúa được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi trâu bò ở các nước nhiệt đới. Ở Thái Lan, 75% rơm lúa rẫy và 82% rơm lúa nước dùng cho chăn nuôi trâu bò. Ở Bangladesh tỷ lệ này là 47%.[10] Ở Mỹ có 538 dự án xây nhà bằng rơm rạ được đăng ký, trong đó riêng tại khu vực xung quanh thủ đô Washington có một vài dự án đã hoàn thành. Xây nhà, trường học, thậm chí công sở với các bức tường bằng rơm rạ được nhận xét là vừa không bị thấm nước, chống cháy, bảo toàn được năng lượng bên trong và vừa có thể chống giông bão, hữu ích cho môi trường.[10] 19
  29. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu Rơm đã qua tiền xử lý và chưa qua xử lý từ trường Đại Học Bách Khoa TPHCMtheo dự án JICA (Japan International Cooperation Agency). Enzyme thu nhận từ hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò, lấy từ một lò mổ tại huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai. Mẫu dạ cỏ bò được thu thập từ tháng 2/2014. Mẫu thức ăn dạ cỏ 50 ml môi trường PCS có pH phù bò hợp với từng cộng đồng vi sinh vật Đồng nhất mẫu Hấp khử trùng 121°C, 15 phút 1 ml dịch mẫu dạ Môi trường PCS có pH đạt chuẩn cỏ bò Lên men trong 14 ngày Ly tâm 6000 vòng trong 5 phút, nhiệt độ phòng Thu enzyme cellulase thô Bảo quản trong tủ lạnh Sơ đồ 2.1.Quy trình thu nhận enzyme cellulase. 20
  30. Đồ án tốt nghiệp 2.2. Thiết bị, hóa chất 2.2.1. Thiết bị Máy so màu OD 1100RS Spectrophotometer. Một số thiết bị thông dụng khác như: Tủ cấy Laminar; Nồi hấp thanh trùng Hirayama HVE-50; Cân điện tử Excell; Tủ ấm Memmert; máy ly tâm Hettich 2.2.2. Hóa chất A. Hóa chất trong phản ứng xác định hoạt tính enzyme Cellulase ➢ Agar CMC 1% (Carboxymethylcellelose Sodium Salt): CMC 10 g. Agar 20 g Nước cất vừa đủ 1000 ml. Lưu ý: CMC là hợp chất không tan trong nước ở nhiệt độ thường, để CMC tan hoàn toàn cần gia nhiệt kết hợp với khuấy.Khi CMC đã tan hoàn toàn mới trút agar vào, khuấy tan và hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút ➢ Thuốc nhuộm Congo red 0.1%: Congo red 0,5 g. Nước cất vừa đủ 500 ml. ➢ Dung dịch NaOH 1M giải nhuộm congo red: NaCl 29,25g. Nước cất 500ml. ➢ Dung dịch đệm Citrate (1M): Dung dịch acid citric 0.1M (a): 21,01g C6H8O7.H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch trinatri citrate 0.1M (b): 29,41g C6H5O7Na3. 2H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml. 21
  31. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1.Dung dịch đệm citrate. a (ml) b (ml) pH 20.5 29.5 5.0 9.5 40.5 6.0 ➢ Dung dịch đệm phosphate: Dung dịch mononatri orthophosphate (A): 27,8g Na2PO4 hòa tan và định mức đến 1000ml. Dung dịch dinatri hydrophosphate (B): 53,05g Na2HPO4. 7H2O hoặc 71,7g Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000ml. Bảng 2.2.Dung dịch đệm phosphate. A (ml) B (ml) pH A (ml) B (ml) pH 87.7 12.3 6.0 56.5 53.5 6.7 77.5 22.5 6.3 45.0 55.0 6.9 68.5 31.5 6.5 39.0 61.0 7.0 ➢ Thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid): Hòa tan 7,486 g DNS và 6,92 g NaOH trong 1000 ml nước cất. Sau khi hòa tan hoàn toàn, cho thêm 216 g muối sodium potassium tartrate (KNaC4H4O6) và o 5,36 ml phenol ở 50 C, 5,86 g Na2S2O5. Lưu trữ trong chai sẫm màu và bảo quản lạnh. ➢ Dung dịch đường chuẩn 1mg/ml: cân 10mg đường để chuẩn độ bằng cân phân tích, pha trong 10ml nước cất, lắc đều và giữ lạnh. ➢ Thuốc thử Bradford: Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue 0,1g được làm tan trong 50ml Ethanol 99%, pha loãng với nước cất thành 500ml để được dung dịch (1) đựng trong chai màu tối. 100ml H3PO4 85% pha loãng thành 500ml được dung dịch (2). Khi cần sử dụng, hòa 1V(1) với 1V(2) lấy dịch trong. ➢ Dung dịch protein chuẩn 1mg/ml: cân 10mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 10ml nước cất, lắc đều và giữ lạnh. 22
  32. Đồ án tốt nghiệp B. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật • Môi trường PCS medium (Peptone cellulosic solution): Tryptone. 5 g/l. Yeast Extract. 1 g/l. NaCl. 5 g/l. CaCO3. 5 g/l. Rice straw (rơm rạ khô xay) 20 g/l. Cystein- HCl. 0,5 g/l. Giấy lọc (1x4cm) 20miếng Nước cất 1000ml Môi trường được chuẩn độ pH bằng NaOH hoặc HCl để thay đổi pH từ 5,5 – 7,0, hấp khử trùng 121oC, 15 phút. 23
  33. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phương pháp nghiên cứu Mẫu thức ăn từ dạ Thu dịch enzyme cellulase thô cỏ bò Tăng sinh trong PCS có kèm theo Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ miếng giấy lọc để làm chất chỉ thị, lên hoạt tính cellulase bằng pp Filter 37°C, pH 7.0 paper: - Nhiệt độ: 37oC, 39oC, 41oC Thử CMC và kiểm tra sự phân giải - pH 6.0, 6.1, 6.3, 6.5, 6.7, 6.9 gi ấy lọc sau 4, 7, 10, 13 ngày Chọn lọc hệ enzyme cellulase tối ưu Chọn lọc mẫu Phân giải rơm qua xử lý Khảo sát điều kiện phát triển của hệ vi sinh vật: Khảo sát lượng đường khử sinh ra - Nhiệt độ: 37oC, 39oC, 41oC bằng pp DNS: - pH 5.5, 6.0, 6.5 - Nhiệt độ, pH: tùy mẫu - Thời gian: 2, 3, 4, 5 ngày Thử CMC và kiểm tra sự phân giải giấy lọc sau 7, 10, 13 ngày Khảo sát khả năng sử dụng rơm rạ Chọn lọc mẫu Hệ enzyme Ly tâm 6000 vòng, 5 phút cellulase Sơ đồ 2.2.Tóm tắt toàn bộ thí nghiệm. 24
  34. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Quy trình tăng sinh chọn lọc. Mục đích của việc tăng sinh nhằm phát triển mạnh mẽ hệ vsv mong muốn trong môi trường nuôi cấy thích hợp. Việc tăng sinh được tiến hành lặp lại nhiều lần nhằm đảm bảo về sự ổn định.[3] ➢ Quy trình tăng sinh lần 1 được thể hiện theo các bước ở sơ đồ 2.3. Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ thị khả năng phân giải cellulose Hấp khử trùng 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để quan sát khả năng bị nhiễm sau khi khử trùng Đồng nhất mẫu và hút 1 ml dịch và gắp khoảng 0,1 g mẫu rơm dạ cỏ bò phân phối vào các bình chứa môi trường Mẫu được ủ ở nhiệt độ 37°C, pH 7.0, kèm mẫu đối chứng trong 13 ngày Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13mm) và ngày phân giải giấy lọc ngắn (≤7ngày) Sơ đồ 2.3. Quy trình tăng sinh chọn lọc mẫu. 25
  35. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Quy trình tăng sinh khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật ➢ Quy trình tăng sinh lần 2: Khảo sát nhiệt độphát triển của hệ vi sinh vật được thể hiện theo sơ đồ 2.4. Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ thị khả năng phân giải cellulose Hấp khử trùng 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để quan sát khả năng bị nhiễm sau khi khử trùng Lựa chọn các mẫu đã phân hủy hết giấy lọc trong đợt tăng sinh lần 1 Lắc mạnh, trộn đều các mẫu được chọn, hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào bình môi trường PCS Mẫu được ủ ở 2 nhiệt độ 39°C và 41°C, pH 7.0, kèm mẫu đối chứng Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13 mm) và ngày phân giải giấy lọc ngắn (≤7 ngày) Sơ đồ 2.4.Quy trình khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật. 26
  36. Đồ án tốt nghiệp 2.3.3. Quy trình tăng sinh khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật ➢ Quy trình tăng sinh lần 3: Khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật được thể hiện theo sơ đồ 2.5. Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ thị khả năng phân giải cellulose Hấp khử trùng 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để quan sát khả năng bị nhiễm sau khi khử trùng Lựa chọn các mẫu đã phân hủy hết giấy lọc trong đợt tăng sinh lần 2 Lắc mạnh, trộn đều các mẫu được chọn, hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào bình môi trường PCS Tùy từng mẫu được ủ ở các nhiệt độ thích hợp, thay đổi pH 5.5 – 6.0 – 6.5, kèm mẫu đối chứng Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13 mm) và ngày phân giải giấy lọc ngắn (≤7 ngày) Sơ đồ 2.5.Quy trình khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật. 27
  37. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 2.4.1. Quy trình phát hiện sinh tổng hợp enzyme endoglucanase trên thạch đĩa CMC Sau quá trình tăng sinh, kiểm tra sinh tổng hợp enzyme endoglucanase bằng thuốc thử Congo red 0,1% trên thạch đĩa CMC. ➢ Tạo mẫu Các chủng vi khuẩn được tăng sinh trên môi trường PCS ở nhiệt độ khảo sát, sau thời gian cách khoảng 4, 7, 10 và 13ngày. Chuẩn bị môi trường CMC khử trùng và đổ đĩa, tiến hành tạo các giếng trên mặt thạch, bơm 20휇l dịch nuôi cấy vào giếng, đem ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ khảo sát. ➢ Kiểm tra Cho 5 ml dung dịch thuốc thử Congo red 0,1% vào các đĩa thạch đã ủ 24 giờ ở nhiệt độ khảo sát. Sau 30 phút, loại bỏ dung dich thuốc thử và thực hiện bước giải nhuộm với 5ml NaCl 1M. Sau 15 phút, loại bỏ NaCl và đọc kết quả. Mẫu nào có sự phân giải CMC sẽ tạo vùng phân giải nhạt màu hơn so với màu của thuốc thử Congo red. 2.4.2. Định lượng hàm lượng protein tổng trong dịch nuôi cấy theo phương pháp Bradford ➢ Nguyên tắc: Các Protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian. ➢ Ý nghĩa: Phương pháp giúp xác định những hệ vi sinh vật sinh ra hàm lượng enzyme cellulase cao trong quá trình khảo sát các điều kiện lên men tối ưu. ➢ Hóa chất Thuốc thử Coomasie Brilliant Blue. Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml. 28
  38. Đồ án tốt nghiệp Dịch enzyme thô được pha loãng 50 lần. ➢ Lập đồ thị đường chuẩn Để dung dich albumin chuẩn có các nồng độ từ 10-40 µg/ml ta thực hiện như sau: Bảng 2.3: Thông số xây dựng đường chuẩn albumin. Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 Nồng độ albumin (µg/ml) 0 10 20 30 40 Dung dịch albumin chuẩn (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Nước cất vô trùng (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại 1. 2, 3, 4 các ống cách nhau 1 phút.Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành 1 cách tương tự như trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn. Đo ở bước sóng 595 nm. ➢ Tính toán: Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595. Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein ở mẫu phân tích. Tổng hàm lượng protein trong 1ml dịch enzyme thô được tính theo công thức: Protein (휇g/ml) = ∗푛∗ Với: X: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (µg/ml). n: hệ số pha loãng (50 lần). m: khối lượng mẫu (500 휇l=0.5 ml). V: thể tích mẫu hút đi đo OD (1 ml). 29
  39. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3. Định lượng hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper ➢ Nguyên lý phương pháp Filter Paper: FPA là phương pháp phổ biến nhất dùng trong kiểm tra hoạt tính của enzyme cellulase tổng thể được khuyên dùng bởi IUPAC. Phương pháp này dựa trên sự chuyển đổi lượng cơ chất, của tổng cơ chất cố định ban đầu (2mg) đường (dựa trên sự giảm của nồng độ đường được đo bởi phương pháp DNS) tạo ra từ 50 mg giấy lọc (cả hai dạng của cơ chất không kết tinh và kết tinh bị thủy phân) trong một thời gian cố định (60 phút). Hoạt tính của cellulase tổng được thể hiện bằng đơn vị của giấy lọc (FPU) trên thể tích (ml) của dung dịch enzyme ban đầu (chưa pha loãng). Ưu điểm của phương pháp này là cơ chất được sử dụng rộng rãi, bên cạnh đó cơ chất trong phương pháp này dễ bị tác động bởi hoạt tính của cellulase.Tuy nhiên, nhược điểm là cần thời gian cho việc phản ứng và dễ bị ảnh hưởng bởi sai số của thiết bị. ➢ Hóa chất: Thuốc thử DNS. Dung dịch đường glucose chuẩn 1mg/ml. Dịch enzyme: dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường PCS sau 14 ngày. Bảng 2.4.Thông số xây dựng đường chuẩn glucose. Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Dung dịch glucose chuẩn(ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Dung dịch đệm photphate pH 6.3 (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 Thuốc thử DNS (ml) 2 2 2 2 2 ➢ Phương pháp tiến hành: ▪ Chuẩn bị ống trắng và ống đối chứng. ▪ Ống trắng : 1,5ml đệm phosphate. 1 ml đệm + 0,5 ml enzyme. ▪ Ống đối chứng: { 1,5 ml đệm + giấy lọc. 30
  40. Đồ án tốt nghiệp ▪ Ống phản ứng : 1 ml đệm + giấy lọc + 0,5 ml enzyme, sao cho giấy lọc phải được ngập hết trong dung dịch đệm. Votex nhẹ. ▪ Ủ các ống vào 39°C trong 60 phút để thực hiện phản ứng. ▪ Sau ủ, hút dung dịch thí nghiệm vào effendorf 1,5ml và ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút. ▪ Sau khi ly tâm, hút 1ml dung dịch nổi phía trên vào trong một ống nghiệm khác và thêm 2ml thuốc thử DNS và trộn đều. ▪ Đun sôi các ống nghiệm trong 5 phút (có đậy nút). ▪ Chuyển các ống nghiệm vào nước lạnh để làm nguội. ▪ Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 540nm. ➢ Tính toán: Số đo OD của lượng đường khử thực sự được giải phóng là: ∆OD= OD ống nghiệm phản ứng – OD ống nghiệm đệm + giấy lọc – OD ống nghiệm đệm+enzyme Sử dụng phương trình của đường chuẩn để tính hàm lượng đường khử thực sự X(mg/ml) được giải phóng bởi phản ứng thủy phân. Tính hàm lượng đường trong 1ml mẫu ban đầu (mg/ml) = ∗푛∗ 1 Với: X: nồng độ đường suy ra từ đường chuẩn (mg/ml). n: hệ số pha loãng (3lần). V: thể tích mẫu phân tích (0,5ml). V1: thể tích mẫu hút đi đo OD (1ml). ℎà 푙ươ푛𝑔 đườ푛𝑔 푡 표푛𝑔 1 푙 ẫ 푛 đầ Hoạt tính enzyme FPU (U/ml)= 0.18 ( )∗ 푡ℎể 푡í ℎ ẫ (1 푙)∗ 푡ℎờ𝑖 𝑔𝑖 푛 ủ (60 ℎú푡) 휇 표푙 2.5. Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp của hệ enzyme cellulase Các enzyme cellulase thu được từ những nguồn khác nhau sẽ có những điều kiện phản ứng tối ưu khác nhau. Nhiệt độ, pH là 2 yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của cellulase. Do đó, các điều kiện tối ưu cho hoạt tính cellulase cần được xác định. 31
  41. Đồ án tốt nghiệp 2.5.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase Xác định hoạt tính FPase của enzyme cellulase bằng phương pháp DNS tại dung dịch đệm phosphate có pH: 6.0, 6.1, 6.3, 6.5, 6.7 và 6.9. 2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase Xác định hoạt tính FPase của enzyme cellulase bằng phương pháp DNS tại các nhiệt độ phản ứng khác nhau 37°C, 39°C và 41°C. Sử dụng đệm phosphate có pH thích hợp cho từng mẫu đã được khảo sát bên trên. Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính enzyme cellulase. 2.6. Khảo sát quá trình enzyme cellulase thủy phân cellulose từ rơm rạ 500 mg rơm qua xử lý + 10 ml đệm phosphate 1 ml dịch enzyme thô Khuấy trộn Ủ ở nhiệt độ, pH thích hợp Sau 2, 3, 4 và 5 ngày, thu dịch, thử đường khử theo phương pháp DNS Thu nhận rơm còn lại, sấy khô 70°C/ 1ngày, cân Thu nhận kết quả và phân tích,xử lý số liệu Sơ đồ 2.6: Quy trình phân giải rơm bằng hệ enzyme cellulase. Thuyết minh quy trình: Rơm đã qua ửx lý được xay nhuyễn, sấy khô 70°C trong 1ngày, để vào bình hút ẩm cho nguội. Dùng cân đo điện tử cân 500mg rơm cho vào bình chứa, thêm 10ml dịch đệm phosphate (tùy pH phù hợp của từng hệ enzyme), hấp khử trùng ở 32
  42. Đồ án tốt nghiệp 121°C, 15phút. Thêm 1ml dịch enzyme thô vào bình rơm, khuấy trộn, ủ nhiệt độ thích hợp. Sau 2 ngày, thu dịch, quay ly tâm 10.000 vòng trong 5 phút, thu dịch trong. Xác định lượng đường khử tạo ra bằng phương pháp DNS và tương tự ở ngày thứ 3, 4 và 5.Sau 5 ngày, thu nhận rơm còn lại lọc qua giấy lọc (giấy lọc đã sấy khô và cân khối lượng khô), sấy khô giấy lọc và rơm còn lại ở 70°C trong 1 ngày.Thu nhận kết quả, phân tích kết quả hàm lượng đường khử và rơm bị phân giải. 2.6.1. Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS ➢ Nguyên lý phương pháp DNS Phương pháp này dựa trên cơ cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu được tiến hành ở bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khhiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. ➢ Dụng cụ, thiết bị: Máy so màu, bếp điện, pipetman, effenphore 1.5ml, ống nghiệm có nắp, pipetman. ➢ Hóa chất Thuốc thử DNS Dung dịch đường glucose chuẩn 1 mg/ml để dựng đường chuẩn glucose tương tự như phương pháp ở mục 2.4.3. Dịchthu nhận từ bình phân giải rơm được ly tâm 10000vòng trong 5 phút. Hút 1ml dịch trong cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml thuốc thử DNS. Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi đúng 5 phút (có đậy nắp).Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm. ➢ Tính kết quả Sử dụng phương trình của đường chuẩn để tính hàm lượng glucose có trong dịch phân giải rơm. Tính hàm lượng đường trong 1ml mẫu ban đầu (mg/ml)= X*n Với: X: nồng độ đường suy ra từ đường chuẩn (mg/ml). 33
  43. Đồ án tốt nghiệp n: hệ số pha loãng (9,09 lần). 2.6.2. Khả năng phân giải rơm rạ ➢ Mục đích: Xác định lượng rơm được phân giải sau 5 ngày thủy phân bằng enzyme. ➢ Dụng cụ: Bình hút ẩm có silicagel. Tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ 70℃. Cân phân tích độ chính xác đạt ± 0.001 g. ➢ Cách thực hiện: Cân khối lượng rơm ban đầu và giấy lọc đều được sấy khô ở 70℃, 1ngày. Sau 5 ngày, thu nhận lượng rơm còn lại bằng cách lọc qua giấy lọc và sấy khô bằng tủ sấy đã đặt nhiệt độ70℃, bắt đầu tính thời gian khi tủ sấy đạt nhiệt độ này. Sau 1ngày sấy, lấy giấy lọc và rơm ra, làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng (thường khoảng 30 – 40 phút). Cân lại khối lượng rơm còn lại và giấy lọc. Lặp lại thao tác trên đến khi lượng mất đi của 2 lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 50 mg. ➢ Kết quả mrơm tiêu thụ = m rơm ban đầu – (m rơm còn lại + giấy lọc – m giấy lọc) % Rơm tiêu thụ = ơ 푡𝑖ê 푡ℎụ∗100 푛đầ Trong đó: mrơm tiêu thụ: khối lượng rơm khô bị hệ enzyme cellulase thủy phân (mg). mrơm ban đầu: khối lượng rơm khô ban đầu (mg). mrơm còn lại + giấy lọc: khối lượng rơm còn lại và giấy lọc được sấy khô 70℃/1ngày (mg). mgiấy lọc: khối lượng giấy lọc sấy khô và cân trước khi lọc rơm (mg). 34
  44. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả tăng sinh trên môi trường PCS Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc trong môi trường PCS và kết quả kiểm tra vòng phân giải trên đĩa thạch CMC tại 37°C, pH 7.0 được thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc trong môi trường PCS và vòng phân giải trên đĩa thạch CMC tại 37°C, pH 7.0. Ngày phân giải giấy lọc Đường kính vòng phân giải CMC (mm) Mẫu (ngày) 7 ngày 10 ngày 13 ngày M1 13 13 13 13 M2 13 11 13 13 M3 12 13 13 13 M4 6 16 14 15 M5 6 13 13 13 M6 7 14 13 13 M7 17 16 14 15 M8 17 11 - - M9 - 14 12 13 M10 17 11 - - M11 - 11 12 - M12 17 12 - - M13 - 12 13 12 M14 6 12 13 13 M15 7 18 16 18 M16 7 18 17 19 M17 7 19 17 18 M18 - 16 14 16 M19 7 18 16 20 35
  45. Đồ án tốt nghiệp M20 4 20 19 19 M21 4 - - - M22 7 17 16 16 M23 9 16 13 13 M24 7 19 18 18 Ghi chú:“ –“ : không có vòng phân giải CMC, hoặc giấy lọc chưa bị phân giải. Kết quả cho thấy các chủng có khả năng sử dụng giấy lọc và khả năng tạo vòng phân giải CMC là khác nhau. Bên cạnh những kết quả trên và so sánh với các kết quả của những nghiên cứu của Lương Ngọc Tuấn Anh (2012) [1] và kết quả nghiên cứu của Hoàng Nguyên (2011)[5] thì kết quả trên tương tự. Từ đó, ta quyết định chọn lọc những mẫu có khả năng này để thực hiện thí nghiệm tiếp theo: • Ngày phân giải giấy lọc trước 7 ngày và đường kính vòng phân giải CMC khoảng 13mm cùng với sự ổn định qua các ngày thử. • Đó là các ẫm u M4, M5, M15, M16, M17, M19, M20, M22 và M24. Hình 3.1.Chín mẫu dạ cỏ bò tăng sinh ở 37°C, pH 7.0. 36
  46. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cỏ bò ở 37°C, pH 7.0 sau 7 ngày tăng sinh trong môi trường PCS. Hình 3.3.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cỏ bò ở 37°C, pH 7.0 sau 10 ngày tăng sinh trong môi trường PCS. Hình 3.4.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cỏ bò ở 37°C, pH 7.0 sau 13 ngày tăng sinh trong môi trường PCS. 37
  47. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật Kết quả tối ưu nhiệt độđược thể hiện qua các bảng 3.2, 3.3 và 3.4. Bảng 3.2.Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 37°C, pH 7.0. Ngày phân giải giấy Đường kính vòng phân giải CMC (mm) Mẫu lọc (ngày) 7 ngày 10 ngày 13 ngày M4 6 16 14 15 M5 6 13 13 13 M15 7 18 16 18 M16 7 18 17 19 M17 7 19 17 18 M19 7 18 16 20 M20 4 20 19 19 M22 7 17 16 16 M24 7 19 18 18 Bảng 3.3.Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 39°C, pH 7.0. Ngày phân giải giấy Đường kính vòng phân giải CMC (mm) Mẫu lọc (ngày) 7 ngày 10 ngày 13 ngày M4 - 13 12 - M5 - - 12 - M15 7 23 22 21 M16 7 20 13 - M17 - - - 15 M19 7 23 22 22 M20 7 17 17 16 M22 7 18 17 15 M24 7 21 18 20 38
  48. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4.Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 41°C, pH 7.0. Ngày phân giải giấy Đường kính vòng phân giải CMC (mm) Mẫu lọc (ngày) 7 ngày 10 ngày 13 ngày M4 7 17 17 17 M5 - - 14 15 M15 7 19 19 18 M16 10 19 19 20 M17 7 18 18 20 M19 7 20 20 20 M20 7 16 17 18 M22 7 17 17 18 M24 7 19 18 19 Ghi chú:“ –“ : không có vòng phân giải CMC, hoặc giấy lọc chưa bị phân giải. Từ kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc và vòng phân giải CMC trong quá trình khảo sát nhiệt độ 37°C, 39°C và 41°C của các mẫu tăng sinh trên môi trường PCS. Trong đó các ẫm u M4, M5 và M20 thích hợp cho nhiệt độ phát triển ở 37°C, còn mẫu M15 và M19 phát triển tốt ở nhiệt độ 39°C và các mẫu còn lại M16, M17, M22 và M24 thích ứng ở nhiệt độ 41°C. Kết quả trên cũng phù hợp vì cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò luôn luôn thay đổi tùy vào nguồn thức ăn. 3.3. Kết quả khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật Kết quả tối ưu pH của 9 mẫu nuôi cấy trên môi trường PCS lỏng được thể hiện qua bảng 3.5. 39
  49. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5. Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở các pH khác nhau. Ngày phân Đường kính vòng phân giải CMC Nhiệt độ Mẫu pH giải giấy lọc (mm) (°C) (ngày) 7 ngày 10ngày 13ngày 5.5 16 - 13 13 6 16 - 14 16 M4 37 6.5 16 - 14 16 7 6 14 17 16 5.5 7 13 17 18 6 13 15 18 18 M5 37 6.5 7 15 18 19 7 6 13 18 16 5.5 - 13 - 14 6 - 12 - - M15 39 6.5 7 12 16 17 7 7 23 22 21 5.5 13 15 16 18 6 7 16 16 18 M16 41 6.5 7 14 18 18 7 10 19 19 20 5.5 13 12 16 16 6 7 13 16 17 M17 41 6.5 13 14 16 18 7 7 18 18 20 5.5 7 16 19 20 6 7 20 22 23 M19 39 6.5 7 20 23 22 7 7 23 22 22 40
  50. Đồ án tốt nghiệp 5.5 7 15 17 19 6 7 16 19 20 M20 37 6.5 7 13 17 18 7 7 16 17 18 5.5 13 - - - 6 16 13 13 14 M22 41 6.5 7 13 14 14 7 7 17 17 18 5.5 13 - 15 17 6 7 15 18 16 M24 41 6.5 7 18 18 20 7 7 19 18 19 Ghi chú:“ –“ : không có vòng phân giải CMC, hoặc giấy lọc chưa bị phân giải. Sau quá trình kiểm tra sinh tổng hợp cellulase trên thạch đĩa CMC ở các pH khác nhau, ta nhận thấy đường kính vòng CMC ở các độ pH khác nhau là hoàn toàn khác nhau.Đa số đều tập trung ở khoảng pH 6.5 - 7.0, ngoại trừ mẫu M20 ở pH 6.0.Trong đó, ta nhận thấy mẫu M19 cho kết quả phân giải vòng CMC và ngày phân giải giấy lọc ngắn hơn, khoảng pH hoạt động rộng hơnvà vượt trội hơn các mẫu khác. Kết quả tối ưu nhiệt độ và pH này gần giống như môi trường trong dạ cỏ bò, thích hợp cho hệvi sinh vật phát triển. ✓ Mẫu M4 thích hợp phát triển ở pH 7, mẫu M5 thích hợp phát triển ở pH 6.5, mẫu M20 thích hợp phát triển ở pH 6.0 và tại nhiệt độ 37°C. ✓ Mẫu M15 và M19 thích hợp phát triển ở pH 7, tại nhiệt độ 39°C. ✓ Mẫu M16, M24 thích hợp phát triển ở pH 6.5 và mẫu M17 , M22 thích hợp phát triển ở pH 7, tại nhiệt độ 41°C. 41
  51. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Kết quả hàm lượng protein tổngtheo phương pháp Bradford Kết quả nồng độ protein tổng của 9 mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò đo theo phương pháp Bradford được thể hiện trong bảng 3.6 và biều đồ 3.1. Bảng 3.6.Nồng độ protein tổng của 9 mẫuvi sinh vật dạ cỏ bò. Mẫu OD Nồng độ protein (μg/ml) M4 0,052 2769,6 M5 0,082 4073,9 M15 0,067 3421,7 M16 0,041 2291,3 M17 0,040 2247,8 M19 0,084 4160,9 M20 0,032 1900,0 M22 0,044 2421,7 M24 0,024 1552,2 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 Nồng độprotein Nồng 1000 500 0 M4 M5 M15 M16 M17 M19 M20 M22 M24 Mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò Biểu đồ 3.1.Nồng độ protein tổng của 9 mẫuvi sinh vật dạ cỏ bò. Từ đồ thị cho ta thấy nồng độ protein tổng của mẫu M5 (4073,9휇g/ml) và M19 (4160,9휇g/ml)là cao nhất và thấp nhất là mẫu M20 (1900,0휇g/ml) và M24 (1552,2휇g/ml). 42
  52. Đồ án tốt nghiệp 3.5. Kết quả đo hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper Kết quả đo vòng phân giải CMC trên đĩa thạch đã phản ánh phần nào hoạt tính của hệ enzyme cellulase, chủ yếu là định tính, nên ta phải tiến hành kiểm tra hoạt tính cellulase tổng số đồng thời bằng phương pháp FPA. 3.5.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase Kết quả đo mật độ quang học ở bước sóng 540nm của 9 mẫu enzyme cellulase theo phương pháp FPA ở 39°C và thay đổi pH từ 6.0 – 6.9 được thể biện trong bảng 3.7. Bảng 3.7. Giá trị OD 540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi pH từ 6.0 – 6.9 ở 39°C. Mẫu pH6.0 pH6.1 pH6.3 pH6.5 pH6.7 pH6.9 M4 0,064 0,060 0,056 0,072 0,049 0,043 M5 0,077 0,067 0,088 0,067 0,067 0,047 M15 0,157 0,120 0,120 0,113 0,112 0,122 M16 0,070 0,056 0,068 0,076 0,067 0,044 M17 0,059 0,056 0,056 0,066 0,053 0,041 M19 0,144 0,138 0,138 0,145 0,132 0,142 M20 0,120 0,036 0,042 0,050 0,052 0,044 M22 0,067 0,060 0,043 0,054 0,057 0,041 M24 0,100 0,091 0,102 0,124 0,112 0,081 Từ kết quả khảo sát pH tối ưu cho hoạt tính cellulase bằng phương pháp FP khi thay đổi pH từ 6.0 – 6.9 ở nhiệt độ 39°C, trong đó các ẫm u M15, M20 và M22 thích ứng ở pH 6.0, còn mẫu M5 thích ứng ở pH 6.3 và các mẫu còn lại M4, M16, M17, M19 và M24 thích ứng ở pH 6.5. Kết quả trên cũng phù hợp vì cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò chỉ phát triển trong điều kiện không khắc nghiệt. Mức độ pH này được tạo ra do sản phẩm của mỗi hệ vi khuẩn trong dạ cỏ bò, nhờ đó chúng có thể cùng tồn tại. 43
  53. Đồ án tốt nghiệp 3.5.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase Kết quả đo mật độ quang học ở bước sóng 540nm của 9 mẫu enzyme cellulase theo phương pháp FPA khi thay đổi nhiệt độ 37°C, 39°C và 41°C, pH tối ưu và được thể biện trong bảng 3.8. Bảng 3.8.Giá trị OD540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi nhiệt độ 37°C, 39°C và 41°C ở pH tối ưu. Mẫu 37°C 39°C 41°C M4 0,082 0,072 0,087 M5 0,076 0,088 0,093 M15 0,136 0,157 0,175 M16 0,125 0,076 0,060 M17 0,110 0,066 0,114 M19 0,207 0,145 0,199 M20 0,093 0,120 0,095 M22 0,211 0,067 0,116 M24 0,104 0,124 0,100 Từ kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính cellulase bằng phương pháp FP khi thay đổi nhiệt độ 37°C, 39°C và 41°C ở pH tối ưu.Trong đó các ẫm u M16, M19 và M22 thích hợp cho nhiệt độ hoạt động enzyme ở 37°C, còn các mẫu M20, M24 thích hợp cho nhiệt độ hoạt động enzyme ở 39°C và các mẫu còn lại M4, M5, M15 và M17 thích hợp cho nhiệt độ hoạt động enzyme ở 41°C. Từ kết quả tối ưu pH và nhiệt độ cho hoạt tính hệ enzyme cellulase, ta xác định được hoạt tính cellulase tổng số được thể hiện trong bảng 3.9 và biểu đồ 3.2. 44
  54. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.9.Kết quả hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp FPA. Hàm lượng Hoạt tính Nhiệt độ Mẫu pH OD ∆OD glucose cellulase (°C) (mg/ml) (U/ml) M4 6.5 41 0,087 0,039 0,762 0,071 M5 6.3 41 0,093 0,038 0,754 0,069 M15 6.0 41 0,175 0,063 0,957 0,088 M16 6.5 37 0,125 0,073 1,038 0,096 M17 6.5 41 0,114 0,030 0,689 0,064 M19 6.5 37 0,207 0,097 1,232 0,114 M20 6.0 39 0,120 0,046 0,819 0,076 M22 6.0 37 0,211 0,161 1,751 0,162 M24 6.5 39 0,124 0,063 0,957 0,089 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 Hoạt tính U/ml Hoạt 0.04 0.02 0 M4 M5 M15 M16 M17 M19 M20 M22 M24 Mẫu enzyme cellulase Biểu đồ 3.2.Hoạt tính cellulase tổng số của 9 mẫuenzyme cellulase. Từ biểu đồ 3.2 ta nhận thấy, hoạt tính cellulase tổng số của 9 mẫu enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩndạ cỏ bò khác nhau là khác nhau. Kết quả này có vẻ không thống nhất với kết quả nồng độ protein tổng. Nguyên nhân có thể do thành phần của cộng đồng vi khuẩn dạ cỏ bò phải thích nghi với điều kiện thức ăn thay đổi, buộc chúng phải sản sinh hệ enzyme cellulase có hoạt tính mạnh hơn để 45
  55. Đồ án tốt nghiệp cạnh tranh và cùng tồn tại. Điều này cũng cho thấy hoạt tính cellulase tổng số không hoàn toàn tỷ lệ thuận với hàm lượng protein tổng và các hệ enzyme cellulase khác nhau sẽ có tỷ lệ các thành phần enzyme khác nhau. Tham khảo các nghiên cứu của Faridha Begum.et.al (2013) [22] thì kết quả kiểm tra hoạt tính của hệ enzyme cellulase trong 9 mẫu là thấp hơn. Và Nurulnisa Binti Nor Azman(2009) [15] thì kết quả kiểm tra hoạt tính của hệ enzyme cellulase trong 9 mẫu là cao hơn. Trong đó, các mẫu M4, M5, M17 và M20 đạt hoạt tính cellulase tổng số từ 0.064 U/ml đến 0.075 U/ml, còn các mẫu M15, M16, M19, M22 và M24 đạt hoạt tính cellulase tổng số từ 0.088 U/ml đến 0,161 U/ml. Đồng thời, các mẫu M4, M5, M16 và M22 đạt trung bình đường kính vòng phân giải CMC từ 15,67 mm đến 17,33 mm, còn các mẫu M15, M17, M19, M20 và M24 đạt trung bình đường kính vòng phân giải CMC từ 18,33 mm đến 22,33 mm. Từ đây ta chọn lọc 3 hệ enzyme cellulase có khả năng này để thực hiện thí nghiệm tiếp theo: ✓ Mẫu M15 có hoạt tính cellulase tổng số là 0,088 U/ml, ngày phân giải giấy lọc là 7ngày, trung bình đường kính vòng phân giải CMC là 22,00 mm. ✓ Mẫu M19 có hoạt tính cellulase tổng số là 0,114 U/ml, ngày phân giải giấy lọc là 7ngày, trung bình đường kính vòng phân giải CMC là 22,33 mm. ✓ Mẫu M24 có hoạt tính cellulase tổng số là 0,088 U/ml, ngày phân giải giấy lọc là 7ngày, trung bình đường kính vòng phân giải CMC là 18,67 mm. 3.6. Kết quả đo lượng đường khử sau khi phân giải rơm theo phương pháp DNS Tham khảo công trình nghiên cứu của Nguyễn Văn Tuyên (2011) [9] và Jadhav A.R.et.al (2013) [18], thời gian thủy phân có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình thủy phân bằng enzyme, nó quyết định đến hiệu suất thủy phân, tôi chọn các mốc thời gian 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày và 5 ngày để theo dõi quá trình thủy phân. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện tối ưu cho hệ enzyme cellulase hoạt động. Trong khảo sát, lượng enzyme ban đầu là 1ml và rơm là 500 mg. Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, thu dịch lọc, đo mật độ quang OD 540nm theo phương pháp 46
  56. Đồ án tốt nghiệp DNS. Kết quả nồng độ dịch đường khi theo dõi thời gian thủy phân rơm được thể hiện trong bảng 3.10 và biểu đồ 3.3 như sau. Bảng 3.10.Kết quả hàm lượng glucose trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase. Mẫu 0ngày 2ngày 3ngày 4ngày 5ngày M15 1,78 mg/ml 1,90 mg/ml 2,10 mg/ml 2,24 mg/ml 2,15 mg/ml M19 1,66 mg/ml 1,83 mg/ml 2,54 mg/ml 2,74 mg/ml 2,80 mg/ml M24 2,09 mg/ml 2,15 mg/ml 2,19 mg/ml 2,47 mg/ml 2,39 mg/ml 3 2.5 2 1.5 M15 M19 1 M24 0.5 Nồng độglucose Nồng(mg/ml) 0 0ngày 2ngày 3ngày 4ngày 5ngày Thời gian (ngày) Biểu đồ 3.3.Hàm lượng glucose tạo thành trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase. Từ phân tích thống kê ở bảng 3.10 và biểu đồ 3.3 cho ta thấy hàm lượng glucose thay đổi theo thời gian. Trong đó, ẫm u M19 cho thấy có sự tăng lên hàm lượng glucose rõ rệt sau 5 ngày (2,80mg/ml). Còn mẫu M15 và M24 nồng độ glucose tăng dần theo thời gian và đạt cao nhất ở ngày thứ 4 (2,24 mg/ml và 2,47mg/ml) nhưng khi kéo dài thời gian đến 5 ngày thì nồng độ glucose tăng không đáng kể. Điều này chứng tỏ quá trình thủy phân bằng enzyme tăng mạnh cho đến 4ngày, sau đó thì hầu như hoạt động xúc tác của enzyme diễn ra rất chậm. Như vậy với hệ enzyme cellulase M19 thì thời gian thủy phân rơm nên diễn ra ít nhất 5 ngày, 47
  57. Đồ án tốt nghiệp còn hệ enzyme cellulase M15 và M24 nên diễn ra ít nhất 4 ngày mới đạt được hiệu suất thủy phân cao. 3.7. Kết quả phân giải rơm rạ Kết quả khả năng phân giải rơm sau xử lý được trình bày trong bảng 3.11 và biểu đồ 3.4 dưới đây: Bảng 3.11.Khả năng phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase. Mẫu Khối lượng rơm bị thủy phân (mg) % Rơm bị thủy phân M15 84,8 16,96% M19 105,2 21,01% M24 70,2 17,52% 25 % Rơm 20 15 10 5 0 M15 M19 M24 Hệ enzyme cellulase Biểu đồ 3.4.Khả năng phân giải rơmcủa 3 mẫu enzyme cellulase. Từ phân tích thống kê ở bảng 3.11 và biểu đồ 3.4 cho ta thấy cả 3 hệ enzyme cellulase đều có khả năng tiêu thụ rơm cao và vượt trội nhất là mẫu M19 (21,01% sau 5 ngày phân giải rơm). Kết quả trên cũng phù hợp vì tùy từng hệ enzyme cellulase có thành phần các enzyme khác nhau, trong đó enzyme endoglucanase giữ vai trò chủ yếu trong khả năng phân giải lignocellulose trong rơm rạ.Vì thế mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò M19 có khả năng sinh ra enzyme endoglucanase vượt trội sẽ cho khả năng phân giải rơm rạ vượt trội. 48
  58. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1.Kết luận Từ 24 mẫu (M1, M2, M3, và M24) thức ăn trong dạ cỏ bò ban đầu, đồng thời khảo sát khả năng tạo vòng phân giải CMC, phân hủy giấy lọc,chọn lọc được 9 mẫu(M4, M5, M15, M16, M17, M19, M20, M22 và M24) cộng đồng vi sinh có khả năng tạo đường kính vòng phân giải CMC khoảng 13 – 20 mm và ngày phân giải giấy lọc trước 7 ngày.Tiếp tục tối ưu hóa nhiệt độ, pH từ 9 mẫu trên cho thấy đường kính vòng phân giải CMC tăng khoảng 15,67 – 22,33 mm và thời gian phân giải giấy lọc ổn định trong 7 ngày. Tiếp tục kiểm tra hàm lượng protein tổng, khảo sát pH, nhiệt độ lên hoạt tính cellulase và xác định hoạt tính cellulase tổng số, cho hoạt tính cellulase từ 0,064 U/ml – 0,162 U/ml. Các mẫu được so sánhvề khả năng tạo vòng phân giải CMC, ngày phân giải giấy lọc và hoạt tính cellulase, chọn lọc được 3 hệ enzyme cellulase có trung bình đường kính vòng phân giải CMC khoảng từ 18,67 mm – 22,33 mm, ngày phân giải giấy lọc trước 7 ngày và hoạt tính enzyme khoảng 0,088 U/ml. Tiếp tục khảo sát khả năng tạo đường khử và phân giải rơm qua xử lý, 3 hệ enzyme cellulase đạt được kết quả như sau: ✓ Mẫu enzyme M15 thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn M15có nhiệt độ tối ưu là 39°C, pH 7.0, đạt nồng độ protein tổng là 3421,7 휇g/ml sau 14 ngày tăng sinh, hoạt tính cellulase tổng số là 0.088 U/ml tại pH 6.0, 41°C, hàm lượng glucose đạt 2,24 mg/ml sau 4 ngày phân giải rơm và khả năng phân giải rơm đạt 16,96% sau 5ngày. ✓ Mẫu enzyme M19 thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn M19 có nhiệt độ tối ưu là 39°C, pH tối ưu trong khoảng rộng từ 6.0 – 7.0, đạt nồng độ protein tổng là 4160,9휇g/ml sau 14 ngày tăng sinh, hoạt tính cellulase tổng số là 0,114 U/ml tại pH 6.5, 39°C, hàm lượng glucose đạt 2,80 mg/ml sau 5 ngày phân giải rơm và khả năng phân giải rơm đạt 21,01% sau 5ngày. ✓ Mẫu enzyme M24 thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn M24 có nhiệt độ tối ưu là 41°C, pH 6.5, đạt nồng độ protein tổng là 1552,2 휇g/ml sau 14 ngày tăng 49
  59. Đồ án tốt nghiệp sinh, hoạt tính cellulase tổng số là 0,088 U/ml tại pH 6.5, 39°C, hàm lượng glucose đạt 2,47 mg/ml sau 4 ngày phân giải rơm và khả năng phân giải rơm đạt 17,52% sau 5ngày. Còn các mẫu còn lại có đường kính vòng phân giải CMC thấp hơn được thể hiện trong phụ lục 2, 3 và 4, cùng với số ngày phân giải giấy lọc và hoạt tính enzym thấp hơn nên tạm ngưng nghiên cứu. 4.2.Đề nghị Vì thời gian có hạn nên có nhiều phương pháp và quy trình mà đồ án vẫn chưa tiến hành thử nghiệm hết được, chúng tôi có một số đề nghị như sau: ✓ Tối ưu hóa quá trình thu nhận và tinh sạch enzyme cellulase. ✓ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme cellulase và nồng độ cơ chất rơm lên quá trình thủy phân rơm rạ. ✓ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzyme cellulase từ cộng đồng vi khuẩn dạ cỏ bò. 50
  60. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Lương Ngọc Tuấn Anh (2012), Đồ Án Tốt Nghiệp: Phân Lập và Định Danh Vi Khuẩn Kị Khí, Chịu Nhiệt, Sinh Cellulase từ mẫu Compost, trường ĐH Công Nghệ TPHCM. [2] Đỗ Hữu Công (2013), Hệ Tiêu Hóa Loài Nhai Lại, Vet Shop. [3] Nguyễn Hoài Hương (2009), bài giảng Thực Hành Hóa Sinh, trường ĐH Công Nghệ TPHCM. [4] Nguyễn Trần Nhật Minh (2011), Đồ Án Tốt Nghiệp: Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei, trường ĐH Công Nghệ TP HCM. [5] Hoàng Nguyên (2011), Luận Văn Thạc Sĩ:Phân Lập, Định Danh Và Xác Định Đặc Điểm Sinh Hóa Của Các Chủng Vi Khuẩn Kị Khí Ưa Nhiệt Sinh Cellulase, trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên [6] Huỳnh Thị Hồng Sương(2009), Đồ Án Tốt Nghiệp: Nghiên Cứu Quá Trình Tách Chiết Và Tinh Sạch Sơ BộEnzym Cellulase Từ Trichoderma Viride, trường ĐH Công Nghệ TP HCM. [7] Nguyễn Văn Tặng (2012), Tổng Quan Về Sản Xuất Ethanol Sinh Học Từ Rơm Rạ. [8] Nguyễn Xuân Trạch, Mai Thị Thơm và Lê Văn Ban (2012), Giáo trình Chăn nuôi trâu bò. NXB Nông nghiệp. [9] Nguyễn Văn Tuyên (2011), Luận Văn Thạc Sĩ: Nghiên Cứu Quá Trình Lên Men Acid Lactic Từ Rơm Rạ, Đại Học Đà Nẵng. [10] Nguyễn Thị Ngọc Yến (2012), Đồ Án Tốt Nghiệp: Nghiên Cứu Việc Sử Dụng Rơm Rạ Tạo Ra Các Sản Phẩm Môi Trường, trường ĐH Công Nghệ TPHCM. TIẾNG ANH [11] Krystal Worthington (1993), Cellulase, Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. 51
  61. Đồ án tốt nghiệp [12] Emert, G., Gum, E., Lang, J., Liu, T., and Brown, Cellulases, Food Related Enzymes, Washington. DC USA, 1974. [13] Sam Adam-Day(2012), Factors affecting Enzyme Activity, A Level Notes website. [14] Rachel Larsen.et.al (2011),Bovine Rumen, MicrobeWiki. [15] Nurulnisa Binti Nor Azman (2009), “Isolation and characterization of potential cellulolytic bacteria from masterfeed using 16s rna analysis and biochemical method”, pages 49-51. [16] Parameswaran Binod.et.al(2010),Bioethanol production from rice straw: An overview. Bioresource Technology, 101: 4767–4774. [17] Whitaker, D.: Cellulases, The Enzymes Vol. 5,P. Boyer, Academic Press, NY, 273, 1971. [18] Jadhav A. R., Chitanand M. P., Shete H. G. (2013), Study on the Use of Agricultural Wastes for Cellulase Production by Using AspergillusNiger, IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences (IOSR-JPBS), pg 17-20. [19] S.Siva Sakthi, P.Saranraj and M.Rajasekar (2011), Optimization for cellulase production by Aspergillusniger using paddy straw as substrate, International journal of Advanced Scientific and Technical Research. [20] M. Charitha Devi and M. Sunil Kumar (2012), Production, Optimization and Partial purification of Cellulase by Aspergillusnigerfermented with paper and timber sawmill industrial wastes, Journal of Microbiology and Biotechnology Research, pg 120-128. [21] Oyeleke, S. B.* and Okusanmi, T. A (2008), Isolation and characterization of cellulose hydrolysingmicroorganism from the rumen of ruminants, African Journal of Biotechnology Vol. 7 (10), pp. 1503-1504, Academic Journals. [22] Faridha Begum. I., Meignanalaksmi. S., Pandima Devi. M. (2013), Isolation and characterization of cellulase producing paracoccus pantotrophus fmr19 (jx012237) from goat rumen fluid and its effects on pH, temperature and carbon 52
  62. Đồ án tốt nghiệp sources, International Journal of Advanced Biotechnology and Research Vol 4, pp 384-390, BioIT Journals. [23] S. Hatami, H.A. Alikhani, H. Besharati, N. Salehrastin, M. Afrousheh and 1Z. Yazdani Jahromi (2008), Investigation on aerobic cellulolytic bacteria in some of North forest and farming Soils,American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 3 (5): pg 713-716, © IDOSI Publications. [24] Edward M. Rubin (2008), Structure of lignocellulose, Genomics of cellulosic biofuels, Nature 454, pg 841–845. [25] Catherine Dawson (2011),Thermochemical integration key to improving the efficiency of bio-ethanol production,Sandia National Labouratories. [26] McAllister. TA.,Bae HD., and Cheng KJ. (1994).Microbial attachment and feed digestion in the rumen. Journal of AnimalScience 72:3004-3018. [27] Brulc JM., Yeoman CJ., and Wilson MK. (2011). Cellulosomics, a GeneCentric Approach to Investigating the Intraspecific Diversity and Adaptation of Ruminococcusflavefaciens within the Rumen. Plos One Journal 6. [28] Vladimir V. Zverlov and Wolfgang H. Schwarz (2013), The Clostridium thermocellum Cellulosome - the Paradigm of a Multienzyme Complex, Technische Universitaet Muenchen, Germany. INTERNET [29] [30] vat/3822-tieu-hoa-o-dong-vat-nhai-lai.html#ixzz2tl8DE4rW [31] [32] [33] [34] 128.pdf [35] nhiem-moi-truong/dcdccd40 [36] 53
  63. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC ✓ Phụ lục 1: Một số hình ảnh mẫu dạ cỏ bò được lấy làm thí nghiệm. ✓ Phụ lục 2: Một số hình ảnh kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc và đường kính vòng phân giải CMC ở bước tăng sinh, chọn lọc tại 37°C , pH7.0. ✓ Phụ lục 3: Một số hình ảnh kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc và đường kính vòng phân giải CMC ở bước tối ưu nhiệt độ phát triển. ✓ Phụ lục 4: Một số hình ảnh kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc và đường kính vòng phân giải CMC ở bước tối ưu pH phát triển. ✓ Phụ lục 5: Tối ưu điều kiện môi trường cho hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp FPA. ✓ Phụ lục 6: Đo lượng đường khử sau khi phân giải rơm theo phương pháp DNS. ✓ Phụ lục 7: Khả năng sử dụng rơm rạ. ✓ Phụ lục 8: Dựng đường chuẩn Bradford và Glucose. 1
  64. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 1: Một số hình ảnh mẫu dạ cỏ bò được lấy làm thí nghiệm. 2
  65. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 2: Một số hình ảnh kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc và đường kính vòng phân giải CMC ở bước tăng sinh, chọn lọc tại 37°C, pH 7.0. ❖ Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc ở bình tăng sinh trên môi trường PCS. ➢ Sau 7 ngày. ❖ Kết quả kiểm tra đường kính vòng phân giải CMC trên đĩa thạch CMC. 3
  66. Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 7 ngày. ➢ Sau 10 ngày. 4
  67. Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 13 ngày. ❖ 9 mẫu dạ cỏ bò ở 37°C, pH 7.0 được chọn đầu tiên: 4, 5, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24. 5
  68. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 3: Một số hình ảnh kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc và đường kính vòng phân giải CMC ở bước tối ưu nhiệt độ phát triển. ❖ Tại 37℃, pH 7.0. (tham khảo phụ lục 2) ❖ Tại 39℃, pH 7.0. ➢ Sau 7 ngày. Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc từ bình tăng sinh PCS. Kết quả kiểm tra đường kính vòng phân giải CMC. ➢ Sau 10 ngày. 6
  69. Đồ án tốt nghiệp Sau 13 ngày. ❖ Tại 41°C, pH 7.0 ➢ Sau 7 ngày. Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc từ bình tăng sinh PCS. Kết quả kiểm tra đường kính vòng phân giải CMC. 7
  70. Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 10 ngày. ➢ Sau 13 ngày. 8
  71. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 4: Một số hình ảnh kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc và đường kính vòng phân giải CMC ở bước tối ưu pH phát triển. ➢ Sau 7 ngày. Mẫu 7 ngày phân giải giấy lọc Đường kính vòng phân giải CMC M4 M5 M15 M16 9
  72. Đồ án tốt nghiệp M17 M19 M20 M22 M24 10
  73. Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 10 ngày. Mẫu 10 ngày phân giải giấy lọc Đường kính vòng phân giải CMC M4 M5 M15 M16 11
  74. Đồ án tốt nghiệp M17 M19 M20 M22 M24 12
  75. Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 13 ngày. 13
  76. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 5: Tối ưu điều kiện môi trường cho hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp FPA. Nồng độ OD sau OD enzyme OD giấy lọc Mẫu ∆OD Gluocose phản ứng và đệm và đệm (mg/ml) M4 0,087 0,038 0,010 0,039 0,762 M5 0,093 0,045 0,010 0,038 0,754 M15 0,175 0,102 0,010 0,063 0,957 M16 0,125 0,042 0,010 0,073 1,038 M17 0,114 0,074 0,010 0,030 0,689 M19 0,207 0,100 0,010 0,097 1,232 M20 0,120 0,064 0,010 0,046 0,819 M22 0,211 0,040 0,010 0,161 1,751 M24 0,124 0,051 0,010 0,063 0,957 ∆OD = ODsau phản ứng – ODenzyme+đệm – OD giấy lọc+đệm Từ phương trình đường chuẩn glucose ta suy ta hàm lượng đường X ( ) (mg/ml). Hàm lượng đường trong 1 ml mẫu= ∆ +0.055 ∗푛∗ 0.74∗ Trong đó: n: là độ pha loãng enzyme (3 lần). V: thể tích mẫu đo OD (1 ml). m: khối lượng mẫu (0,5 ml). 14
  77. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 6: Đo lượng đường khử sau khi phân giải rơm theo phương pháp DNS. Từ phương trình đường chuẩn glucose ta suy ta hàm lượng đường X (mg/ml). Hàm lượng đường trong 1 ml mẫu= ( +0.055)∗푛∗ 0.74∗ Trong đó: n: là độ pha loãng enzyme (9,09lần). V: thể tích mẫu đo OD (1ml). m: khối lượng mẫu (1ml). • Giá trị OD 540nm sau 2, 3, 4 và 5 ngày enzyme phân giải rơm qua xử lý. Mẫu 0 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày M15 0,090 0,100 0,116 0,127 0,120 M19 0,080 0,094 0,152 0,168 0,173 M24 0,115 0,120 0,124 0,146 0,140 PHỤ LỤC 7: Khả năng sử dụng rơm rạ ơ ị ủ â % Rơm thủy phân= 푡ℎ ℎ 푛 ∗ 100 ơ 푛 đầ Giấy lọc Rơm còn lại + Rơm còn Rơm ban Rơm bị thủy Mẫu khô (g) giấy lọc (g) lại (g) đầu (g) phân (g) ( 1 ) ( 2 ) (3)=(2)-(1) ( 4 ) (5)=(4)-(3) M15 0,7823 1,1975 0,4512 0,5000 0,0848 M19 0,7590 1,1546 0,3956 0,5008 0,1052 M24 0,7830 1,1134 0,3304 0,4006 0,0702 15
  78. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 8: Dựng đường chuẩn Bradford và Glucose. ➢ Đường chuẩn glucose. Nồng độ glucose OD (mg/ml) 0.1 0,020 0.2 0,090 0.3 0,170 0.4 0,240 Đường chuẩn glucose 0.3 0.25 y = 0.74x - 0.055 R² = 0.9993 0.2 0.15 OD 0.1 0.05 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ glucose 16
  79. Đồ án tốt nghiệp ➢ Đường chuẩn albumin. Nồng độ protein OD (휇g/ml) 10 0,010 20 0,032 30 0,059 40 0,079 50 0,099 Đường Chuẩn Bradford 0.12 0.1 y = 0.0023x - 0.0117 R² = 0.9968 0.08 0.06 OD 0.04 0.02 0 0 10 20 30 40 50 60 Nồng Độ Protein 17