›

Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và khả năng trị tiêu chảy của cao chiết ethanol từ cây Elephantopus sp

pdf 100 trang thiennha21 12/04/2022 5260
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và khả năng trị tiêu chảy của cao chiết ethanol từ cây Elephantopus sp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_danh_gia_hoat_tinh_khang_khuan_va_kha_nang_tri_tieu_ch.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và khả năng trị tiêu chảy của cao chiết ethanol từ cây Elephantopus sp

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG TRỊ TIÊU CHẢY CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY ELEPHANTOPUS SP. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Trƣơng Thị Minh Hiền MSSV: 1151110051 Lớp: 11DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi đƣợc thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Trƣơng Thị Minh Hiền
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trƣớc hết, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, ngƣời đã giúp đỡ, định hƣớng và tận tình hƣớng dẫn em suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Cảm ơn thầy vì đã truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu. Em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM, quý thầy cô hiện đang giảng dạy và làm việc tại Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng đã truyền dạy rất nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và các anh chị đã luôn động viên và giúp đỡ em vƣợt qua khó khăn trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Trƣơng Thị Minh Hiền
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC HÌNH vii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Phạm vi nghiên cứu 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu về cây Elephantopus sp. 3 1.1.1. Nguồn gốc 3 1.1.2. Phân loại khoa học 3 1.1.3. Đặc điểm và sự phân bố 3 1.1.4. Thành phần hóa học thƣờng có trong thực vật 4 1.1.4.1. Alkaloid 4 1.1.4.2. Carbohydrate 6 1.1.4.3. Flavonoid 7 1.1.4.4. Tannin 9 1.1.4.5. Hợp chất phenolic 10 1.1.4.6. Glycoside 11 1.1.4.7. Steroid 14 1.1.5. Công dụng 15 1.2. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật 16 1.2.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn 16 1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn 16 1.2.3. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam i
  5. Đồ án tốt nghiệp 19 1.2.3.1. Tình hình kháng khuẩn trên Thế Giới 19 1.2.3.2. Tình hình kháng khuẩn tại Việt Nam 20 1.3. Giới thiệu về bệnh tiêu chảy 20 1.3.1. Khái niệm 20 1.3.2. Nguyên nhân gây bệnh 21 1.3.2.1. Do virus 21 1.3.2.2. Do vi khuẩn 22 1.3.2.3. Do ký sinh trùng 22 1.3.2.4. Do các nguyên nhân khác 23 1.3.3. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy 23 1.3.3.1. Tiêu chảy do thẩm thấu 23 1.3.3.2. Tiêu chảy do xuất tiết 24 1.3.3.3. Tiêu chảy do tăng nhu động ruột 24 1.3.3.4. Tiêu chảy do tổn thƣơng niêm mạc ruột 24 1.4. Đặc điểm một số vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy điển hình 24 1.4.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 24 1.4.1.1. Đặc điểm 25 1.4.1.2. Độc tính 25 1.4.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 26 1.4.2.1. Đặc điểm 26 1.4.2.2. Độc tính 27 1.4.3.Nhóm vi khuẩn Shigella spp. . 27 1.4.3.1. Đặc điểm 27 1.4.3.2. Độc tính 28 1.4.4. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 28 1.4.4.1. Đặc điểm 28 1.4.4.2. Độc tính 29 1.5. Một số mô hình đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của thực vật trên động vật ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 30 1.5.1. Mô hình đánh giá khả năng trị tiêu chảy 30 1.5.1.1. Mô hình castor oil 30 1.5.1.2. Mô hình magnesium sulfate (MgSO4) 31 1.5.1.3. Mô hình serotonin 31 1.5.2. Mô hình khảo sát enteropooling 32 1.5.2.1. Mô hình prostaglandin E2 32 1.5.2.2. Mô hình irinotecan 33 1.5.2.3. Mô hình sử dụng Heat-labile toxin 33 1.5.2.4. Mô hình castor oil 34 1.5.3. Mô hình khảo sát sự di chuyển ở ruột non 34 1.5.3.1. Mô hình castor oil 35 1.5.3.2. Mô hình prostaglandin E2 35 1.5.3.3. Mô hình irinotecan 35 CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1. Địa điểm và thời gian 36 2.1.1. Địa điểm thu mẫu 36 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 36 2.1.3. Thời gian nghiên cứu 36 2.2. Vật liệu 36 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 36 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu 36 2.2.2.1. Vi sinh vật chỉ thị 36 2.2.2.2. Động vật thí nghiệm 36 2.2.3. Môi trƣờng, hóa chất và thuốc 37 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị 37 2.2.4.1. Dụng cụ 37 2.2.4.2. Thiết bị 37 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 37 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật 37 2.3.2. Phƣơng pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị 38 2.3.3. Phƣơng pháp cấy truyền và giữ giống vi sinh vật 38 2.3.4. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào 39 2.3.5. Phƣơng pháp pha loãng mẫu 39 2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 39 2.3.7. Phƣơng pháp gây tiêu chảy bằng castor oil trên mô hình chuột 40 2.3.8. Phƣơng pháp đánh giá khả năng di chuyển ở ruột 40 2.3.9. Phƣơng pháp khảo sát enteropooling 41 2.3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu 41 2.4. Bố trí thí nghiệm 42 2.4.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu quy trình tách chiết cao ethanol 70% từ Elephantopus sp. 42 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EEE 43 2.4.3. Đánh giá độc tính của EEE trên mô hình chuột 45 2.4.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của EEE trên mô hình chuột . 45 2.4.4.1. Chuẩn bị chuột trƣớc khi thí nghiệm 45 2.4.4.2. Thí nghiệm 3.1: Thử nghiệm khả năng trị tiêu chảy của EEE trên mô hình chuột 45 2.4.4.3. Thí nghiệm 3.2: Thử nghiệm enteropooling 46 2.4.4.4. Thí nghiệm 3.3: Khảo sát sự di chuyển ở ruột non 46 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1. Kết quả hiệu suất thu hồi cao 48 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% đối với nhóm vi khuẩn gây tiêu chảy 48 3.2.1. Kết quả mức độ kháng khuẩn trên nhóm Vibrio spp. của EEE 49 3.2.2. Kết quả kháng khuẩn trên các vi khuẩn khác 50 3.3. Kết quả đánh giá độc tính của cao ethanol 70% trên mô hình chuột 53 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Kết quả đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của cao ethanol 70% trên mô hình chuột 54 3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng trị tiêu chảy của EEE bằng dầu thầu dầu trên mô hình chuột 54 3.4.2. Kết quả về thử nghiệm enteropooling 57 3.4.3. Kết quả về khả năng di chuyển ở ruột non 60 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65 4.1. Kết luận 65 4.2. Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ HIỆU SUẤT THU HỒI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN 1 PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ VỀ KHẢ NĂNG TRỊ TIÊU CHẢY TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT 7 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP: Andenozin Triphotphat cAMP: Cyclic Adenosine Monophosphate Cip 500: Ciprofloxacin 500 µg/ml Cip 8: Ciprofloxacin 8 µg/ml DNA: Deoxyribo Nucleic Acid EEE: Ethanolic extract of Elephantopus sp. EHEC: Enterohaemorrhagic E.coli ETEC: Enterotoxigenic E.coli HUS: Haemolytic Uraemic Syndrom PABA: p Aminobenzoic Acid SD: Standard Deviation STEC: Shiga Toxin-producing E.coli vi
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình thái Elephantopus sp. (Mercadante, 2013) 4 Hình 1.2. Một số loại alkaloid. (A) Samandarin, (B) Samanin 5 Hình 1.3. Cấu trúc chung của flavonoid (A) và các dạng flavonoid, (B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid 8 Hình 1.4. Caffeic acid 11 Hình 1.5. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004) 17 Hình 1.6. Cơ sở đánh giá các loại phân (Thompson, 2006) 21 Hình 1.7. Hình thái của Rotavirus (De Junio Del, 2013) 22 Hình 1.8. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm (Bact, 2005) 25 Hình 1.9. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. (Taragui, 2005) 26 Hình 1.10. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) 28 Hình 1.11. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. (Microscopy, 2004) 29 Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu 39 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 42 Hình 2.3. Quy trình tách chiết cao EEE 43 Hình 2.4. Quy trình đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EEE đối với vi khuẩn chỉ thị 44 Hình 3.1. Dịch của Elephantopus sp. qua các lần ngâm ethanol 70% 48 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của EEE và Ciprofloxacin trên nhóm Vibrio spp.49 Hình 3.3. Đƣờng kính vòng ức chế của EEE đối với V.alginolyticus 50 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của EEE và kháng sinh Ciprofloxacin trên các chủng vi khuẩn khác 50 Hình 3.5. Đƣờng kính vòng kháng của EEE đối với E.coli 51 Hình 3.6. Đƣờng kính vòng kháng khuẩn của EEE đối với S.flexneri 51 Hình 3.7. Kết quả đánh giá độc tính của EEE trên chuột 53 Hình 3.8. Tỷ lệ chuột bị tiêu chảy giữa các nghiệm thức 54 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9. Thời gian bị tiêu chảy và khả năng ức chế tiêu chảy giữa các nghiệm thức 56 Hình 3.10. Khả năng ức chế sự mất nƣớc ở ruột giữa các nghiệm thức 58 Hình 3.11. Tỷ lệ kìm hãm sự di chuyển của than giữa các nghiệm thức 60 viii
  12. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Những nhóm chính của hợp chất thực vật có hoạt tính kháng khuẩn (Cowan, 1999) 17 Bảng 2.1. Thí nghiệm khảo sát khả năng trị tiêu chảy 46 Bảng 2.2. Thí nghiệm khảo sát enteropooling 46 Bảng 2.3. Thí nghiệm khảo sát sự di chuyển ở ruột 47 Bảng 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết và kháng sinh Ciprofloxacin 49 Bảng 3.2. Thời gian và lƣợng phân tiêu chảy ở các nghiệm thức 55 Bảng 3.3. Thể tích dịch ruột và tỷ lệ ức chế sự co bóp ở ruột 57 Bảng 3.4. Chiều dài di chuyển của than và tỷ lệ ức chế sự di chuyển trong ruột 59 ix
  13. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe đang đƣợc quan tâm rộng rãi trên thế giới. Đây là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển. Trong đó trẻ em chiếm đa số, trung bình hằng năm có khoảng 1,6 triệu trẻ em tử vong vì tiêu chảy và 4 tỷ trẻ dƣới 5 tuổi bị tiêu chảy cấp. Bệnh tiêu chảy vẫn là mối đe dọa toàn cầu đối với y tế công cộng, ƣớc tính mỗi năm trên thế giới có khoảng 3 đến 5 triệu ngƣời mắc bệnh, trong đó có 100.000 đến 120.000 ngƣời chết theo Tổ chức Y tế Thế Giới (2013). Tại Việt Nam, tiêu chảy là một trong 10 nguyên nhân hàng đầu gây bệnh nghiêm trọng và dẫn đến tử vong. Theo thống kê của Trung tâm Y tế dự phòng Bình Thuận, chỉ trong hai tháng 4 và 5/2015, toàn tỉnh Bình Thuận đã có 984 trƣờng hợp bị tiêu chảy. Một sai lầm thƣờng gặp trong điều trị tiêu chảy hiện nay là việc sử dụng kháng sinh khá tràn lan và bừa bãi. Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách, không những tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh mà tiêu diệt luôn cả các vi khuẩn có lợi trong ruột, đồng thời làm xuất hiện những chủng vi khuẩn gây bệnh độc hại và kháng với nhiều loại kháng sinh. Một số trƣờng hợp sử dụng kháng sinh lại gây phản tác dụng, giống nhƣ khi nhiễm Escherichia coli sinh độc tố Shiga, việc dùng kháng sinh lúc này sẽ làm tăng sự phóng thích độc tố, dẫn đến hội chứng tan huyết và làm tăng urea huyết. Mặt khác, do việc lạm dụng kháng sinh trong tình trạng hiện nay, khiến cho việc điều trị tiêu chảy bằng kháng sinh không còn hiệu quả nhƣ trƣớc mà còn đem lại nhiều tác dụng phụ. Vì thế, con ngƣời đang dần trở về với thiên nhiên bằng cách sử dụng những bài thuốc cổ xƣa với nhiều loại thảo dƣợc đƣợc biết đến có tác dụng trong việc điều trị tiêu chảy. Tuy nhiên, các cây thuốc đƣợc sử dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian và đƣợc truyền miệng từ đời này sang đời khác. Do đó, liều lƣợng sử dụng, hoạt tính trị liệu và độc tính của 1 số cây thuốc vẫn chƣa đƣợc xác định. Vì thế việc đánh giá hoạt tính sinh học của 1 số cây thuốc dựa trên kinh nghiệm dân gian là điều hết sức cần thiết. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn 1
  14. Đồ án tốt nghiệp nhƣ vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và khả năng trị tiêu chảy của cao chiết ethanol từ cây Elephantopus sp.”. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM và Phòng Thí nghiệm động vật tại Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM, cơ sở Linh Trung, quận Thủ Đức. 2. Mục đích nghiên cứu Đánh giá hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột và hoạt tính trị tiêu chảy trên mô hình động vật từ cao chiết ethanol của cây Elephantopus sp. 3. Nội dung nghiên cứu Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 70% của cây Elephantopus sp. trên các nhóm vi sinh vật chỉ thị Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp Đánh giá độc tính cao chiết ethanol 70% của cây Elephantopus sp. trên mô hình động vật. Đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của cao chiết ethanol 70% từ cây Elephantopus sp. trên mô hình động vật bằng các thử nghiệm đánh giá dấu hiệu lâm sàng, thử nghiệm enteropooling và khảo sát tốc độ di chuyển trong ruột. 4. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và khả năng trị tiêu chảy cây Elephantopus sp. chỉ tiến hành trên dung môi ethanol 70%. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cây Elephantopus sp. chỉ thực hiện với những nhóm vi khuẩn gây bệnh ở đƣờng ruột. Hiệu quả trị tiêu chảy cây Elephantopus sp. chỉ mới đƣợc đánh giá trên mô hình chuột. 2
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây Elephantopus sp. 1.1.1. Nguồn gốc Elephantopus sp. là 1 chi thuộc họ Cúc (Asteraceae) có nguồn gốc ở Trung và Nam Mỹ, từ Argentina đến Mexico bao gồm cả vùng biển Caribbean (Flann, 2009). Một số loài khác có nguồn gốc ở Ấn Độ và Himalayas (Press và ctv, 2009). Hiện nay, Elephantopus sp. đƣợc trồng phổ biến ở nhiều quốc gia và đƣợc biết đến với nhiều tên gọi khác nhau nhƣ chỉ thiên, cúc chỉ thiên hoa trắng, cỏ lƣỡi mèo, cúc chân voi mềm, địa đảm thảo, co tát nai (dân tộc Thái), nhả đản (dân tộc Tày) theo Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam (2008). Elephantopus sp. có khoảng 26 loài, trong đó một số loài đã đƣợc mô tả từ rất sớm điển hình nhƣ Elephantopus scaber đƣợc mô tả lần đầu vào năm 1753 bởi Lour. Elephantopus mollis đƣợc Kunth mô tả vào năm 1820 (Nguyễn Duy Chính, 2009). 1.1.2. Phân loại khoa học Theo Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam (2008) thì Elephantopus sp. đƣợc phân loại khoa học nhƣ sau: Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Asterales Họ : Asteraceae Chi : Elephantopus 1.1.3. Đặc điểm và sự phân bố Elephantopus sp. là loài cây thân thảo, thân cây đƣợc phủ đầy lông với chiều cao trung bình 0,5 – 1 m. Lá mọc dài theo thân và không có cuống, các phiến thon có chiều dài khoảng 10 – 15 cm, gốc ôm lấy thân, các mép khía lƣợn và có lông mềm ngắn ở mặt dƣới, các lá trên bị tiêu giảm dần. Cụm hoa dài theo thân, nhánh mang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung. Các hoa cao 8 mm, mang 4 hay 5 3
  16. Đồ án tốt nghiệp hoa trắng và quả bế cao 3 mm, có rãnh. Mào lông có 5 tơ và cây ra hoa thƣờng vào tháng 6 và 7 (Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, 2008). Elephantopus sp. thƣờng mọc nhiều ở các vùng nhiệt đới nhƣ các nƣớc châu Phi, Đông Nam Á và Thái Bình Dƣơng. Ngoài ra, Elephantopus sp. còn đƣợc tìm thấy ở dọc các bờ biển Philippines và ở các nƣớc Mexico, Đài Loan, Borneo theo Flann (2009). Ở nƣớc ta Elephantopus sp. thƣờng mọc ở rừng thƣa, rừng thông và dọc đƣờng đi ở nhiều nơi, nhất là ở các tỉnh Tây Nguyên (Bùi Xuân Phƣợng, 2014). Tại Việt Nam chúng ta có thể gặp một trong hai loài là Elephantopus scaber hay Elephantopus tomentosus (Phùng Văn Phê, 2014). 1.1.4. Thành phần hóa học thường có trong thực vật 1.1.4.1. Alkaloid a) Khái niệm Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa N, đa số có nhân dị vòng và là dẫn xuất của các acid amin. Alkaloid thƣờng đƣợc tìm thấy ở các chất chuyển hóa phụ trong thực vật. Sau này, ngƣời ta đã tìm thấy alkaloid còn có trong động vật nhƣ samandarin và samanin lấy từ tuyến da con Salamandra maculosa và Salamandra altra. Bufotenin, serotonin, bufotenidin và dehydrobufotenin là những chất độc lấy 4
  17. Đồ án tốt nghiệp từ các loài cóc Bufo. Batrachotoxin có trong tuyến da loài ếch độc Phyllobates aurotaenia. Tuy nhiên, cũng có những chất đƣợc xếp vào alkaloid nhƣng N không ở dị vòng mà ở mạch nhánh nhƣ capsaicin trong ớt (Capsicum annuum L.). Một số alkaloid không có phản ứng kiềm nhƣ colchicin lấy từ hạt tỏi độc (Colchicum autumnale L.), ricinin lấy từ hạt thầu dầu (Ricinus communis L.) và alkaloid có phản ứng acid yếu nhƣ arecaidin và guvacin trong hạt cau (Arca catechu L.) theo Phạm Thanh Kỳ (1998). b) Phân loại Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm: Nhóm pyridin: Piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, cytisin, nicotin, spartein và pelletierin. Nhóm isoquinolin: Các alkaloid thuộc gốc thuốc phiện nhƣ morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin và berberin. Nhóm pyrrolidin: Hygrin, cuscohygrin và nicotin. Nhóm tropan: Atropin, cocain, ecgonin và scopolamin. Nhóm quinolin: Quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnin, brucin, veratrin và cevadin. Nhóm purin: Các xanthin nhƣ caffein, theobromin và theophyllin. Nhóm indol: Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin và serotonin. Các ergolin: Các alkaloid từ ngũ cốc, cỏ nhƣ ergin, ergotamin, 5
  18. Đồ án tốt nghiệp Các β-cacbolin: Harmin, harmalin, yohimbin, reserpin và emetin (Vũ Xuân Tạo, 2013). c) Đặc điểm Những alkaloid mà thành phần cấu tạo không có oxy thƣờng ở thể lỏng nhƣ nicotin (C10H14N2) và coniin (C8H17N). Các alkaloid ở thể rắn thƣờng kết tinh đƣợc và có điểm nóng chảy rõ ràng. Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi đƣợc và bền vững, không bị phân hủy ở nhiệt độ sôi. Đa số các alkaloid không có mùi, thƣờng có vị đắng và một số ít có vị cay nhƣ capsaixin, piperin, Thông thƣờng các alkaloid kiềm không tan trong nƣớc, dễ tan trong các dung môi hữu cơ. Trái lại các muối alkaloid thì dễ tan trong nƣớc và hầu nhƣ không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực. Từ đó, dựa vào độ tan khác nhau của các loại alkaloid mà sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid. Đa số các alkaloid có tính kiềm yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những chất có tính kiềm trung bình và mạnh. Khi định lƣợng alkaloid bằng phƣơng pháp đo acid, ngƣời ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp. Alkaloid có 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có 2 nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Nhóm thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nƣớc, tủa này sinh ra hầu hết là do sự kết hợp của 1 cation lớn là alkaloid với 1 nhóm anion lớn thƣờng là anion phức hợp của thuốc thử và nhóm thứ hai cho kết tủa ở dạng tinh thể. Đối với phản ứng tạo màu, có 1 số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết những chất có trong alkaloid (Phạm Thanh Kỳ, 1998). d) Vai trò Đa số các alkaloid đều có tác dụng diệt khuẩn, 1 số loại có tác động lên hệ thần kinh nhƣ morphin, codein, cocain, Ngoài ra, alkaloid còn làm hạ huyết áp và giúp chống ung thƣ (Vũ Xuân Tạo, 2013). 1.1.4.2. Carbohydrate a) Khái niệm 6
  19. Đồ án tốt nghiệp Carbohydrate là hợp chất hữu cơ đƣợc tạo nên từ các nguyên tố C, H, O và có công thức cấu tạo là Cm(H2O)n, thƣờng thì m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). b) Phân loại Carbohydrate đƣợc chia thành 3 nhóm là monosaccharide, disaccharide và polysaccharide (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). c) Đặc điểm Monosaccharide, disaccharide có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nƣớc, đồng hoá và sử dụng nhanh để tạo glycogen. Các carbohydrate đơn giản này đều có vị ngọt, khi vào cơ thể xuất hiện tƣơng đối nhanh trong máu. Polysaccharide tồn tại dƣới nhiều dạng, mỗi dạng đều có những đặc điểm và tác dụng cũng nhƣ dƣợc tính riêng (Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh, 2011). d) Vai trò Cung cấp năng lƣợng, đóng vai trò là cấu trúc, tạo hình (cellulose, ), giúp bảo vệ (mucopolysaccharide) và chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) theo Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh (2011). 1.1.4.3. Flavonoid a) Khái niệm Flavonoid là 1 nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp trong thực vật, đây còn là sắc tố sinh học giúp tạo màu sắc cho hoa. Flavonoid có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A và B đƣợc nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng, tuy nhiên 1 số có màu xanh, tím, đỏ và 1 số khác lại không màu. Trong thực 7
  20. Đồ án tốt nghiệp vật cũng có 1 số hợp chất không thuộc flavonoid cũng có màu vàng nhƣ carotenoid, anthranoid, xanthon (Quỳnh Ngọc, 2011). b) Phân loại Dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3 C nên các flavonoid đƣợc chia thành 3 nhóm chính: Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2: Euflavonoid. Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3: Isoflavonoid. Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4: Neoflavonoid (Ngô Văn Thu, 2011). c) Đặc điểm Flavonoid tạo đƣợc phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa. Do từng phân nhóm của flavonoid có cấu tạo riêng nên chúng vừa có tính chất chung vừa có những khác biệt về tính chất vật lý và hóa học. Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ƣa béo thì càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Quỳnh Ngọc, 2011). d) Vai trò 8
  21. Đồ án tốt nghiệp Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa bởi các gốc tự do nhƣ OH+, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thƣ, tăng nhanh sự lão hóa, ) làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng. Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại hay các hợp chất hữu cơ chứa các gốc nitrite, carboxyl, carbonyl, giúp bảo vệ sinh vật chống lại quá trình oxy có hại nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thƣơng do bức xạ. Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thƣơng tổn ở gan và bảo vệ chức năng gan. Flavonoid còn có tác dụng chống dị ứng, kháng viêm bằng cách ngăn chặn sự phóng thích hay tổng hợp các hợp chất làm tăng tình trạng viêm và dị ứng nhƣ histamine, serine protease, prostaglandin, leukotrien, (Quỳnh Ngọc, 2011). 1.1.4.4. Tannin a) Khái niệm Tannin là 1 hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid). Tannin có vị chát, tan trong nƣớc, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không tan trong các dung môi hữu cơ, tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt) theo Ngô Văn Thu (2011). b) Phân loại Dựa vào khả năng phân ly mà tannin đƣợc chia thành 2 loại là tannin thủy phân (tanin pyrogalic) và tannin ngƣng tụ (tanin pyrocatechic) theo Ngô Văn Thu (2011). Tannin thủy phân đƣợc thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo thành phần đƣờng (glucose) và phần không đƣờng (các acid) nối với nhau theo dây nối este, tủa xanh đen với muối sắt (III) và dễ tan trong nƣớc nhƣ Ðại hoàng, Ðinh hƣơng, lá cây Bạch đàn. Tannin không thủy phân đƣợc thì dễ tạo thành chất phlobaphen không tan, thƣờng là chất trùng hợp từ catechin, leucoanthoxyanidin hay là những chất 9
  22. Đồ án tốt nghiệp đồng trùng hợp của 2 loại tủa xanh với muối sắt (III) nhƣ Vỏ quế, Canhkina, Ðại hoàng. c) Đặc điểm Tanin pyrogalic khi đun ở 180 - 200oC sẽ thu đƣợc pyrogallol là chủ yếu và thƣờng dễ tan trong nƣớc. Ngoài ra, tanin pyrogalic còn cho kết tủa bông với chì acetate 10% và cho tủa xanh đen với muối sắt (III). Tanin pyrocatechic khi đun sẽ thu pyrocatechin là chủ yếu và khó tan trong nƣớc hơn tannin pyrogallic. Tanin pyrocatechic kết tủa bông với nƣớc brom và cho kết tủa màu xanh đậm với muối sắt (III) theo Ngô Thị Thùy Dƣơng (2012). d) Vai trò Tannin giúp bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng nhƣ thuốc trừ sâu, tác dụng kháng khuẩn, thƣờng dùng làm thuốc súc miệng và có công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy (Ngô Thị Thùy Dƣơng, 2012). 1.1.4.5. Hợp chất phenolic a) Khái niệm Hợp chất phenolic là các hợp chất có 1 hoặc nhiều vòng thơm với 1 hoặc nhiều nhóm hydroxyl, chúng đƣợc phân bố rộng rãi trong thực vật và các sản phẩm trao đổi chất của thực vật. Hơn 8000 cấu trúc phenolic đã đƣợc tìm thấy từ các phân tử đơn giản nhƣ các acid phenolic đến các hợp chất polymer nhƣ tannin. Sự tích lũy các hợp chất phenolic phụ thuộc vào loài, trạng thái sinh lý và vị trí địa lý của các loài cây (Shetty và ctv, 2006). b) Phân loại Các hợp chất phenolic có cấu trúc rất đa dạng và có thể chia thành 10 nhóm chính. Các hợp chất phenolic thực vật bao gồm stilben, lignan, phenolic acid, flavonoid và tannin (Shetty và ctv, 2006). c) Đặc điểm Đa số các hợp chất phenolic đƣợc tổng hợp từ phenylalanine. Ở thực vật nhóm phenolic chủ yếu đƣợc tìm thấy là caffeic acid, đây là 1 trong những hợp chất đơn giản có độc tính sinh học và đƣợc cấu tạo từ dẫn xuất thế vòng phenolic. Một số 10
  23. Đồ án tốt nghiệp phenolic nhƣ furanocoumarin thì không gây độc, nhƣng khi tiếp xúc với nhiệt độ cao, dƣới ánh sáng có bƣớc sóng gần với tia tử ngoại (UV-A) thì nó trở nên rất độc (Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012). Hình 1.4. Caffeic acid d) Vai trò Tạo hƣơng vị và màu sắc cho các loại cây trồng, rau trái. Ngoài ra, chúng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm sợi, bảo vệ thực vật chống lại sự tấn công của các vi sinh vật, côn trùng và động vật ăn cỏ. Đây còn là chất chống oxy hóa tự nhiên, chống ung thƣ, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm. Một hợp chất phenolic khác là chlorogenic acid đƣợc biết nhƣ là chất gây ra viêm da dị ứng ở ngƣời (Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012). 1.1.4.6. Glycoside a) Khái niệm Glycoside là những sản phẩm ngƣng tụ của đƣờng. Cấu tạo gồm 1 phần đƣờng (glycon) kết hợp với 1 phần không phải là đƣờng (aglycon) theo Vũ Kim Dung và ctv (2011). b) Phân loại Dựa vào thành phần glycon, aglycon và kiểu liên kết giữa chúng mà chia thành 3 nhóm (Vũ Kim Dung và ctv, 2011). 11
  24. Đồ án tốt nghiệp c) Đặc điểm Bản chất glycoside gồm cả phần carbohydrate và phi carbohydrate (alcohol). Đây là dạng tinh thể không màu và tác dụng của glycoside phụ thuộc vào phần aglycon còn phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. Glycoside dễ bị hòa tan trong nƣớc, có vị đắng và tạo mùi thơm đặc trƣng (Trần Trƣờng Hận, 2010). d) Vai trò Glycoside giữ vai trò là nguồn dinh dƣỡng cho cơ thể. Ngoài ra chúng còn có vai trò bảo vệ bằng cách tạo ra thể gây độc, do thủy phân tạo ra một số chất kháng khuẩn thƣờng tập trung ở vỏ và hạt (solanin ở khoai tây) theo Trần Trƣờng Hận (2010).  Saponin a) Khái niệm Saponin thuộc nhóm glycoside. Dƣới tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (sapogenin) và phần carbohydrate theo Ngô Văn Thu (2011). b) Phân loại Saponin đƣợc chia thành 2 nhóm là saponin triterpenoid và saponin steroid theo Nguyễn Tấn Thịnh (2013). 12
  25. Đồ án tốt nghiệp c) Đặc điểm Saponin thƣờng ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan đƣợc trong nƣớc, alcohol và rất ít tan trong aceton, ether, hexan. Khi hòa tan saponin vào nƣớc sẽ làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013). d) Vai trò Saponin có nhiều tác dụng dƣợc lý nhƣ chữa ho, long đờm, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng). Một số saponin có tác dụng chống viêm, 1 số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế virus. Ngoài ra, saponin có thể gây kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt (Ngô Văn Thu, 2011).  Cardiac glycoside a) Khái niệm Cardiac glycoside là 1 nhóm của glycoside, bao gồm 2 phần là phần aglycone (không đƣờng) và các glycone hay phần đƣờng (Karkare, 2007). b) Đặc điểm Cardiac glycoside là những chất kết tinh, không màu, có vị đắng. Chúng tan trong các dung môi phân cực và dễ bị thủy phân trong môi trƣờng acid theo Karkare (2007). c) Vai trò 13
  26. Đồ án tốt nghiệp Ở nồng độ thấp, cardiac glycoside có tác dụng điều hòa nhịp tim, nhƣng khi ở nồng độ cao cardiac glycoside lại gây nôn mửa, loạn nhịp tim, tiêu chảy và giảm sức co bóp của tim (Karkare, 2007).  Anthraquinone glycoside a) Khái niệm Anthraquinone glycoside thƣờng tồn tại dƣới dạng glycoside. Ða số các anthraquinone glycoside là các polyoxy anthraquinone và nhân thƣờng gắn các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH Tuỳ theo vị trí các nhóm chức đính vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau (Ngô Văn Thu, 2011). b) Phân loại Dẫn xuất anthraquinone glycoside có thể chia thành ba nhóm là nhóm phẩm nhuộm (các dẫn chất 1,2 dihydroxy anthraquinon), nhóm nhuận tẩy (các dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquinon) và nhóm dimer theo Ngô Văn Thu (2011). c) Đặc điểm Những dẫn xuất anthraquinone glycoside đều có màu từ vàng, vàng cam đến đỏ. Ở thể glycoside thì dễ tan trong nƣớc, còn thể tự do (aglycon) thì tan trong ether, chloroform và một số dung môi hữu cơ khác (Ngô Văn Thu, 2011). d) Vai trò Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn xuất anthraquinon glycoside có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thƣ (Ngô Văn Thu, 2011). 1.1.4.7. Steroid a) Khái niệm Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có bộ khung carbon stenan chứa bốn vòng cycloalkane đƣợc nối với nhau theo những cách đặc trƣng riêng (Đặng Văn Hoài, 2009). b) Phân loại Steroid đƣợc chia thành 4 nhóm chính (Đặng Văn Hoài, 2009). Nhóm steroid động vật: Cholesterol, cholestan-3β-ol, coprostan-β-ol, desosterol, coprosterol, cerebrosterol và lathosterol. 14
  27. Đồ án tốt nghiệp Nhóm steroid của động vật biển không xƣơng sống: Spongesterol, clionasterol, 24-methylencholesterol và fucosterol. Nhóm sterol thực vật: Sistosterol (có các đồng phân α,β,y), stigmasterol, α-spinasterol và brassicasterol. Nhóm sterol nấm men: Ergosterol, zymosterol, acosterol và fecosterol. c) Đặc điểm Các steroid kết tinh dƣới dạng vảy óng ánh nhƣ xà cừ, dạng kết tinh khác nhau tùy theo môi trƣờng kết tinh. Steroid có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, dễ tan trong chloroform, ether, rƣợu nóng và không tan trong nƣớc (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2011). d) Vai trò Tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống và thƣờng đƣợc sử dụng làm các thuốc kích thích (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2011). 1.1.5. Công dụng Toàn bộ cây Elephantopus mollis đƣợc sử dụng nhƣ 1 phƣơng thuốc trị tiêu chảy, rễ cây có tác dụng chữa đau bụng, nhiễm trùng da, bệnh sởi và có tác dụng hạ sốt (Mohan và ctv, 2010). Theo Muthiumani và ctv (2010), E.mollis có tác dụng nhƣ thuốc trợ tim, làm giải nhiệt, lợi tiểu và là thuốc giải độc khi bị rắn cắn. Rễ cây có tác dụng chống nôn, trong khi lá cây đƣợc sử dụng trong điều trị viêm loét và eczema. Rễ và lá đều là chất làm mềm, chống tiêu chảy, khó tiểu ở niệu đạo, trị sƣng hoặc đau ở dạ dày. Chiết xuất ethanol của E.mollis đã đƣợc nghiên cứu thành công về khả năng đẩy nhanh thời gian tái tạo xƣơng bị thƣơng ở chuột (Ngueguim và ctv, 2012). Ngoài ra, E.mollis còn là bài thuốc để chữa đái buốt, đái ra máu, nƣớc tiểu lẫn chất nhầy theo Tuệ Tĩnh (1960). Mặt khác nó còn công dụng chữa mụn nhọt, đinh râu, chữa mũi chảy máu, môi lở sƣng đau, chữa viêm họng và viêm amidan (Đỗ Huy Bích và Bùi Xuân Chƣơng, 1980). Muthiumani và ctv (2010), đã khảo sát khả năng trị tiêu chảy và tác dụng trợ tim của cao chiết Elephantopus scaber trên các hệ dung môi petroleum ether, 15
  28. Đồ án tốt nghiệp benzene, chloroform và ethyl acetate. Kết quả ethyl acetate cho hiệu quả trị tiêu chảy tốt nhất, trong khi đó petroleum ether cho khả năng hoạt động tim tốt nhất khi thí nghiệm trên ếch. Khả năng trị suyễn của E.scaber đã đƣợc thử nghiệm khi sử dụng histamine và acetylcholine gây co thắt phế quản. Sự kích ứng của các tế bào mast và histamine gây co thắt khí quản trên chuột lang theo từng đợt khác nhau khi ở những liều lƣợng khác nhau. Qua đó nhận thấy chiết xuất ethanol của E.scaber có tác dụng làm giảm đáng kể sự co thắt phế quản gây ra bởi histamine, acetylcholine và chống lại sự kích ứng của các tế bào mast (Laranja và ctv, 1991). 1.2. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật 1.2.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thƣờng rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010). 1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn: Gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin. Các chất tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu. Ức chế chức năng của màng tế bào: Gồm colistin, polymycin, gentamicin và amphoterricin. Các chất sẽ làm mất chức năng của màng, làm cho các phân tử có khối lƣợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc các acid amin mới vào chuỗi polypeptide. Nhóm macrolide và lincoxinamide gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide. 16
  29. Đồ án tốt nghiệp Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA. Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho 2 mạch đơn DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotide. Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Hình 1.5. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004) Bảng 1.1. Những nhóm chính của hợp chất thực vật có hoạt tính kháng khuẩn (Cowan, 1999) Nhóm Phân nhóm Ví dụ Cơ chế Catechol Màng sinh chất Phenols đơn Epicatechin Phá vỡ vách tế bào Phenolics Phenolic acid Cinnamic acid ? 17
  30. Đồ án tốt nghiệp Liên kết bám dính, Tạo phức Quinones Hypericin hợp với thành tế bào, Khử hoạt tính enzyme Flavonoids Chrysin Liên kết bám dính - Tạo phức hợp với thành tế bào Flavones Khử hoạt tính enzyme Abyssinone Ức chế phiên mã ngƣợc HIV Flavonols Totarol ? Bám dính protein Bám dính Adhesin Ức chế enzyme Tannins Ellagitannin Màng sinh chất Tạo phức với thành tế bào Phá vỡ vách tế bào Tạo phức với kim loại ion Tƣơng tác với DNA nhân thực Coumarins Warfarin (hoạt tính khháng virus) Terpenoids, - Capsaicin Phá vỡ vách tế bào tinh dầu Berberine Alkaloid - Xen vào thành tế bào hoặc DNA Piperine Lectins và Mannose-specific Khóa sự kết hợp của virus hoặc - polypeptides agglutinin hấp phụ 18
  31. Đồ án tốt nghiệp Falxatin Hình thành cầu Disulfide 8s-heptadeca- Polyacetylens - 2(Z),9(Z)-diene- ? 4,6-diyne-1,8-diol 1.2.3. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam 1.2.3.1. Tình hình kháng khuẩn trên Thế Giới Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh công dụng diệt khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J. Cavallito phân tích đƣợc hợp chất alicin trong tỏi có công dụng nhƣ thuốc kháng sinh. Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh, nƣớc tinh chất từ tỏi có thể chữa đƣợc nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn, nhất là loại Salmonella spp. (Fulder, 2005). Năm 1959, Horak đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ chiết xuất cây Cannabit sativa có nguồn gốc từ Ấn Độ, ông đã tìm thấy cannabiriolic là 1 chất có tác dụng ức chế với vi khuẩn lao ở ngƣời và 1 số vi khuẩn gram dƣơng nhƣ Staphylococcus pyogenes aureus, Streptococcus alpha haemolyticus, Streptococcus beta haemolyticus, Enterococcus, Diplococcus pneumoniae, B.subtilis, B.anthracis, Corynebacterium diphtheriae và Corynebacterium cutis, đặc biệt có thể ức chế vi khuẩn kháng lại penicilin (Kabelik và ctv, 1960). Direkbusarakom và ctv (1997), đã thử nghiệm thành công khả năng kháng khuẩn của các loài cây thảo dƣợc nhƣ: Tinospora cordifolia, T.cripspa, Psidium guajava, Clinacanhus nutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus và P.urinaria đối với Vibrio spp Tuy nhiên, chỉ có 2 cây Momordica charatina và Psidium guajava mới có hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp Chaghaby và ctv (2014), đã chứng minh các dịch chiết khác nhau từ lá cây Annona Squamosa L. đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gram dƣơng 19
  32. Đồ án tốt nghiệp mạnh hơn gram âm. Kết quả của ông đƣợc nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học của Chopra và Greenwood, cho rằng vi khuẩn gram âm ít bị ảnh hƣởng nhiều bởi những chất có chiết xuất từ thực vật hơn so với vi khuẩn gram dƣơng là do chúng có một lớp màng ngoài bao gồm các lipoprotein và lipopolysaccharide. Đó là lớp màng chọn lọc cho phép chúng có khả năng điều hòa lƣu thông các chất ra vào bên trong cơ cấu nội bào. Mỗi một dịch chiết đều thể hiện khả năng kháng ít nhất 6/27 chủng vi khuẩn chỉ thị, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn ở những dịch chiết lên các chủng vi sinh vật là khác nhau. Sự khác nhau đó là do sự khác biệt giữa các hợp chất hóa học có trong mỗi loại dịch chiết. 1.2.3.2. Tình hình kháng khuẩn tại Việt Nam Năm 1956, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc và khẳng định nhiều cây có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn Hƣởng và ctv đã nghiên cứu trên 1000 cây thuốc và chỉ ra việc sử dụng những cây thuốc rất an toàn và có hoạt tính kháng khuẩn cao, từ đó nhóm đã đƣa ra chế phẩm cây Tô Mộc trị tiêu chảy (Trần Nam Hà, 2008). Năm 2009, Võ Thị Mai Hƣơng đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Muồng trâu trên 5 nhóm vi khuẩn Vibrio spp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus và cho kết quả kháng khuẩn cao hơn so với nghiên cứu tƣơng tự vào năm 2002 của Elysha và ctv. Võ Thị Mai Hƣơng và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ các loại dịch chiết ethanol, methanol và các phân đoạn n-Hexan, EtOAC, n-Butanol của methanol từ quả Nhàu và kết quả cho thấy các loại dung môi trên đều cho hoạt tính kháng khuẩn cao với các vi khuẩn khảo sát Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli, Bacillus pumilus. 1.3. Giới thiệu về bệnh tiêu chảy 1.3.1. Khái niệm Theo Tổ chức Y tế Thế Giới (2009), tiêu chảy là 1 dạng bệnh lý xảy ra khi một cơ thể đi ngoài có phân lỏng bất thƣờng (phân lỏng, phân tóe nƣớc, phân có nhầy máu, ) từ 3 lần trở lên trong vòng 24 giờ. 20
  33. Đồ án tốt nghiệp Phân đƣợc chia thành 7 dạng, trong đó dạng 1 – 2 thể hiện sự táo bón, dạng 3 – 4 là dạng bình thƣờng, dạng 5 – 7 đƣợc xem là dấu hiệu của bệnh tiêu chảy và tiêu chảy cấp (Heaton, 1997). Hình 1.6. Cơ sở đánh giá các loại phân (Thompson, 2006) 1.3.2.Nguyên nhân gây bệnh 1.3.2.1. Do virus Rotavirus là nguyên nhân chính gây tiêu chảy nặng nề và đe dọa tính mạng cho trẻ em, Rotavirus gây tiêu chảy ở khoảng 40% trẻ em dƣới 5 tuổi phải nhập viện trên phạm vi toàn cầu theo Tổ chức Y tế Thế Giới (2009). Rotavirus tấn công nhanh vào hệ tiêu hóa, phá hủy tế bào ở thành ruột non gây viêm dạ dày ruột, tiêu chảy, nôn ói dẫn đến mất nƣớc nhanh chóng và có thể tử vong nếu không đƣợc bù nƣớc kịp thời. Ngoài ra, các loại virus khác có thể gây tiêu chảy nhƣ: Adenovirus, Enterovirus, Norovirus, (Lê Anh, 2012). 21
  34. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. Hình thái của Rotavirus (De Junio Del, 2013) 1.3.2.2. Do vi khuẩn Đây là nguyên nhân thƣờng gặp nhất. Nguyên nhân này là do mất cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại trong đƣờng ruột. Các vi khuẩn có hại xâm nhập vào đƣờng ruột, nếu mạnh hơn vi khuẩn có lợi chúng sẽ lấn át các vi khuẩn có lợi và tiết ra độc tố gây tiêu chảy. Vibrio cholerae: Vi khuẩn tả gây tiêu chảy xuất tiết qua trung gian độc tố tả làm xuất tiết ồ ạt nƣớc và điện giải ở ruột non gây tiêu chảy. Tiêu chảy có thể nặng và dẫn tới mất nƣớc điện giải trong vài giờ (Trần Anh Văn, 2011). Shigella: Là tác nhân gây lỵ trong 60% trƣờng hợp lỵ. Khi bị nhiễm Shigella cơ thể sẽ đau bụng quặn thắt, sốt nóng, tiêu chảy thƣờng có máu, có thể bị động kinh và co giật theo Trần Anh Văn (2011). Staphylococcus aureus: Vi khuẩn gây bệnh bằng độc tố với các dấu hiệu nhƣ đau bụng, tiêu chảy và nôn mửa dữ dội (Bùi Quỳnh Nga, 2012). Campylobacter jejuni: Thƣờng có ở thịt gia cầm sống chƣa đƣợc xử lý, vi khuẩn gây tiêu chảy, hội chứng lỵ và sốt kéo dài 2 – 5 ngày. Theo các Báo cáo về Ngƣời Tiêu dùng (2007) dựa vào kết quả phân tích các mẫu thịt gà tƣơi đƣợc bán trên toàn quốc cho thấy, có đến 80% thịt gà đƣợc xét nghiệm có chứa vi khuẩn Campylobacter spp. (Hồng Lĩnh, 2007). 1.3.2.3. Do ký sinh trùng 22
  35. Đồ án tốt nghiệp Entamoeba histolytica (Amip): Xâm nhập vào liên bào đại tràng hoặc hồi tràng khi ở thể hoạt động, tạo các ổ apxe nhỏ, loét và biểu hiện hội chứng lỵ (Trần Anh Văn, 2011). Giardia lamblia: Là ký sinh trùng đơn bào, Giardia lamblia bám dính lên liên bào ruột non làm teo các nhung mao ruột dẫn đến giảm hấp thu và gây tiêu chảy (Trần Anh Văn, 2011). Cryptosporidium: Xâm nhập vào ruột cƣ trú ở biểu mô, nhân lên và tạo ra các nang đào thải qua phân ra ngoài. Cryptosporidium gây đau bụng, buồn nôn và gây tiêu chảy kéo dài ở ngƣời đang bị suy giảm miễn dịch (Nguyễn Bạch Đằng, 2011). 1.3.2.4. Do các nguyên nhân khác Thuốc: Nhiều loại thuốc có thể gây ra tiêu chảy. Phổ biến nhất là thuốc kháng sinh. Thuốc kháng sinh tiêu diệt cả vi khuẩn tốt và xấu, có thể làm rối loạn sự cân bằng tự nhiên của vi khuẩn trong đƣờng ruột dẫn đến tiêu chảy. Ngoài ra, còn có những loại thuốc nhƣ thuốc chống cao huyết áp, thuốc nhuận tràng, thuốc Antacids chứa magnesium cũng dễ gây tiêu chảy (Hà Hiền, 2014). Fructose: Đây là một loại đƣờng tự nhiên đƣợc tìm thấy trong trái cây, mật ong và làm chất tạo ngọt ở một số đồ uống. Fructose có thể gây tiêu chảy ở những ngƣời gặp vấn đề trong việc tiêu hóa chúng (Hà Hiền, 2014). Không dung nạp lactose: Lactose là một loại đƣờng đƣợc tìm thấy trong sữa và các sản phẩm sữa khác. Nhiều ngƣời gặp khó khăn trong tiêu hóa lactose vì không có enzyme để phân giải lactose trong sản phẩm. Vì thế, cơ thể không thể dung nạp lactose và gây ra hiện tƣợng tiêu chảy (Nguyễn Thị Yến, 2011). Ngoài ra còn các nguyên nhân nhƣ: Chất ngọt nhân tạo, các rối loạn tiêu hóa hay phẫu thuật, 1.3.3. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy 1.3.3.1. Tiêu chảy do thẩm thấu Tiêu chảy thẩm thấu xảy ra khi trong ruột xuất hiện nhiều lƣợng chất tan có hoạt tính thẩm thấu nhƣng lại hấp thu kém. Lƣợng chất tan này tạo áp lực thẩm thấu đến màng nhầy trong ruột làm nƣớc bị hút vào lòng ruột, khiến cho Na và Cl cũng 23
  36. Đồ án tốt nghiệp bị kéo theo vào lòng ruột. Nƣớc mất nhiều hơn Na nên có khuynh hƣớng làm tăng Na trong máu và độ thẩm thấu của dịch phân cao hơn độ thẩm thấu của các điện giải trong phân (Đỗ Minh Quang, 2012). 1.3.3.2. Tiêu chảy do xuất tiết Tiêu chảy xảy ra do sự bài tiết nƣớc và điện giải bất thƣờng vào lòng ruột. Sau khi qua dạ dày, vi khuẩn cƣ trú ở phần dƣới hồi tràng và sản sinh ra độc tố ruột, đơn vị B của độc tố gắn vào bộ phận tiếp nhận đặc hiệu của tế bào giải phóng ra đơn vị A của độc tố. Đơn vị này đi vào tế bào ruột hoạt hoá adenylcyclase làm ATP trở thành AMP vòng. Sự tăng AMP vòng trong tế bào làm ức chế hoặc ngăn cản sự hấp thu Na ở ruột, nhƣng không ức chế đối với cơ chế hấp thu Na gắn với glucose và các chất vận chuyển trung gian khác, làm tăng sự bài tiết ở các tế bào hẽm tuyến vào trong lòng ruột do làm tăng tính thấm của màng tế bào phía lòng ruột theo Đỗ Minh Quang (2012). 1.3.3.3. Tiêu chảy do tăng nhu động ruột Để các chất dinh dƣỡng và nƣớc đƣợc hấp thu hiệu quả thì dịch ruột phải đƣợc tiếp xúc với tất cả các biểu mô niêm mạc và giữ lại đủ lâu để có thể hấp thụ. Nhƣng khi có sự rối loạn về nhu động ruột sẽ làm đẩy nhanh thời gian di chuyển ở ruột. Nhu động ruột tăng lên khiến cho thời gian giữ thức ăn trong ruột bị giảm sút, làm giảm thời gian tiếp xúc giữa tế bào niêm mạc và dịch ruột, dẫn đến tiêu chảy (Bowen, 2006). 1.3.3.4. Tiêu chảy do tổn thương niêm mạc ruột Khi các tác nhân gây tiêu chảy xâm nhập vào đƣờng tiêu hoá sẽ sản sinh ra các độc tố ruột (enterotoxin) kích thích tiết các chất điện giải, tấn công trực tiếp và phá huỷ các tế bào biểu mô niêm mạc ruột gây viêm tại ruột và toàn thân. Do tế bào niêm mạc bị tổn thƣơng nên làm giảm sự hấp thu các chất và gia tăng sự bài tiết ion do tăng số lƣợng tế bào hẻm tuyến từ đó dẫn đến tiêu chảy (Low-Beer và Read, 1971). 1.4. Đặc điểm một số vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy điển hình 1.4.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 24
  37. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.1. Đặc điểm Escherichia coli là trực khuẩn gram âm có 2 đầu tròn với kích thƣớc trung bình 0,5 x 2 - 3 µm, đa số vi khuẩn đều có lông, có khả năng di động và không sinh bào tử. E.coli cƣ trú chủ yếu trong ruột ngƣời ở phần cuối của ruột non và ruột già và ở trong ruột động vật máu nóng. Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thƣờng ở đƣờng tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây rất nhiều bệnh đƣờng ruột và ở các cơ quan khác. E.coli dễ dàng phát triển trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng với nhiệt độ thích hợp là 37oC và pH tối ƣu là 7,2 – 7,4. E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 – 30 phút (Lê Thị Mai Khanh, 2004). Hình 1.8. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm (Bact, 2005) Hầu hết các E.coli đều có khả năng lên men nhiều loại đƣờng và có sinh hơi, trừ E.coli trơ (EIEC không lên men hoặc lên men chậm). E.coli có khả năng sinh indole, không sinh H2S, không sử dụng đƣợc nguồn carbon của citrate trong môi trƣờng Simmons. E.coli có decarboxylase, vì vậy chúng có khả năng khử carboxyl của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic. Thử nghiệm β-galactosidase dƣơng tính và thử nghiệm Voges proskauer sau 24 giờ âm tính, 48 giờ sau có thể dƣơng tính theo Lê Thị Mai Khanh (2004). 1.4.1.2. Độc tính Bệnh tiêu chảy do EHEC gây ra có thể diễn biến từ thể nhẹ, phân không có máu hoặc ít máu đến thể nặng phân toàn máu nhƣng không chứa bạch cầu. Triệu 25
  38. Đồ án tốt nghiệp chứng lâm sàng của bệnh bao gồm đau quặn bụng và tiêu chảy cấp, phân có thể có máu, kèm theo có thể có sốt hoặc nôn. Một số chủng E.coli trong nhóm EHEC, trong đó có E.coli O157:H7 là căn nguyên chủ yếu gây ra hội chứng tan máu suy thận cấp trên toàn thế giới. Khoảng 15% trẻ em và tỷ lệ thấp hơn ở ngƣời lớn bị nhiễm E.coli O157:H7, trong đó 50% số bệnh nhân phải chạy thận và 5% tử vong. E.coli O157:H7 có khả năng tiết ra độc tố shiga làm tăng urea huyết, đây là nguyên nhân chính gây tử vong. Nguy hiểm hơn khi nhiễm chủng STEC có thể gây ra hội chứng tan máu suy thận cấp HUS với biểu hiện thiếu máu tan huyết, rối loạn thần kinh, sốt và nổi các ban đỏ do thiếu tiểu cầu, đây là căn nguyên chính gây tử vong ở trẻ nhỏ và ngƣời già (Trần Nhƣ Dƣơng, 2011). 1.4.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 1.4.2.1. Đặc điểm Salmonella spp. là trực khuẩn gram âm, hình que, sống trong đƣờng ruột và có kích thƣớc trung bình từ 2 - 3 x 0,5 - 1 µm. Đa số các loài Salmonella spp. di chuyển bằng tiên mao trừ S.gallimarum, S.pullorum và không tạo bào tử. Salmonella spp. là vi khuẩn kị khí tùy nghi, phát triển đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ 6 - 42oC và pH từ 6 - 9, nhƣng điều kiện thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC ở pH 7,2. Hình 1.9. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. (Taragui, 2005) 26
  39. Đồ án tốt nghiệp Salmonella spp. không lên men lactose nhƣng có khả năng lên men đƣờng glucose và sinh hơi. Vi khuẩn thƣờng không lên men sucrose, salicin, inositol và sử dụng đƣợc nguồn carbon của citrate trong môi trƣờng Simmons. Tuy nhiên, cũng có những trƣờng hợp ngoại lệ nhƣ S.typhi lên men đƣờng glucose, không sinh hơi và không sử dụng citrate trong môi trƣờng Simmons. Hầu hết, các chủng S.paratyphi và S.cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% các loài Salmonella spp. sinh độc tố là bacteriocin chống lại E.coli, Shigella spp. và 1 số loài Salmonella spp. khác (Nguyễn Hữu Liêm, 2013). 1.4.2.2. Độc tính Salmonella spp. là căn nguyên gây ra nhiều loại bệnh do thực phẩm nhiễm độc hay còn gọi là ngộ độc thực phẩm. Các triệu chứng thƣờng gặp nhƣ tiêu chảy, co thắt dạ dày, đau đầu, sốt, nôn mửa và mất nƣớc (mất dịch cơ thể). Triệu chứng có thể tiến triển từ 12 – 72 giờ sau khi nhiễm khuẩn. Các triệu chứng thƣờng kéo dài trong vòng từ 4 – 7 ngày và sau đó tự hồi phục. Tuy nhiên 1 số ít trƣờng hợp có thể diễn biến nặng và gây tử vong (Phạm Thị Cẩm Hà, 2013). Ngoài ra, S.typhi và S.paratyphi còn gây ra bệnh thƣơng hàn. Bệnh xảy ra có các dấu hiệu nhƣ đổ nhiều mồ hôi, sốt liên tục, sốt cao đến 40oC nhƣng nhịp tim chậm. Cơ thể bị phát ban dạng sởi ở vùng quanh thắt lƣng, bị loét họng, loét ruột gây chảy máu ruột. Độc tố vi khuẩn cũng gây nhiễm độc cơ tim, gây viêm cơ tim, trụy tim mạch. Nếu độc tố nhiễm vào não thất gây triệu chứng mạch nhiệt phân ly và gây viêm não. Các trƣờng hợp mắc thƣơng hàn nhẹ có triệu chứng giống nhƣ viêm dạ dày, viêm ruột gây nên tiêu chảy theo Bùi Thị Thu Hƣơng (2014). 1.4.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. 1.4.3.1. Đặc điểm Shigella spp. là trực khuẩn lỵ, đây là vi khuẩn gram âm nhỏ, dài với kích thƣớc 0,5 – 0,6 x 1 - 3 µm, thuộc họ vi khuẩn đƣờng ruột. Shigella spp. là vi khuẩn kị khí tùy nghi, không có roi, không có khả năng di động và không sinh bào tử. Vi khuẩn này có thể tồn tại đƣợc ở nhiệt độ 7 - 46oC, trong đó nhiệt độ tối ƣu cho vi khuẩn tăng trƣởng là 37oC. Chúng có thể sống nhiều ngày với điều kiện lý hóa khắc 27
  40. Đồ án tốt nghiệp nghiệt nhƣ trong tủ lạnh, đông đá, trong môi trƣờng chứa 5% NaCl hay trong môi trƣờng có pH 4,5. Shigella spp. nhạy với nhiệt và bị tiêu diệt khi khử trùng bằng phƣơng pháp khử trùng Pasteur. Shigella spp. lên men glucose, không sinh hơi (trừ S.flexneri type 6) và có khả năng lên men manitol (trừ S.dysenteriae). Hầu hết, các Shigella spp. không lên men lactose, chỉ có S.sonnei lên men lactose nhƣng lên men chậm. Chúng có khả năng sinh indole, không sinh H2S và cho kết quả âm tính với các thử nghiệm Urease, Voges proskauer và Citrate (Nguyễn Thị Khánh Nhƣ, 2009). Hình 1.10. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) 1.4.3.2. Độc tính Trực khuẩn Shigella spp. gây viêm nhiễm cấp tính ở đƣờng tiêu hoá với các biểu hiện bệnh lý thay đổi từ thể tiêu chảy phân nƣớc nhẹ cho đến các thể nặng nề với đau bụng quặn, mót rặn, phân nhầy máu, sốt, buồn nôn, ói, co thắt dạ dày và có dấu hiệu nhiễm trùng nhiễm độc. Sau khi nhiễm vi khuẩn, triệu chứng bệnh khởi phát trong vòng từ 1 - 7 ngày nhƣng cũng có khi lâu hơn. Ngoài ra, Shigella spp. còn gây các bệnh ở ngoài đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm kết mạc, viêm âm đạo, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, theo Nguyễn Đức Hiền (2013). 1.4.4. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 1.4.4.1. Đặc điểm 28
  41. Đồ án tốt nghiệp Vibrio spp. còn gọi là phẩy khuẩn, vi khuẩn có dạng que hơi uốn cong giống hình dấu phẩy với kích thƣớc trung bình 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Phần lớn các loài Vibrio spp. sống hoại sinh chỉ 1 số ít có khả năng lây bệnh cho ngƣời. Đây là vi khuẩn gram âm có tiên mao nằm ở 1 đầu vi khuẩn nên có khả năng di động và không sinh bào tử. Tất cả những loài Vibrio spp. đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, tồn tại ở nhiệt độ 16 - 42oC nhƣng nhiệt độ tối ƣu là 37oC. Vi khuẩn không thể phát triển trong môi trƣờng mà không có muối và không sinh H2S. Một số chủng có khả năng tiết hemolysine làm tan hồng cầu gây ngộ độc. Chúng sống trong bùn lắng ở đầm hồ, vùng nƣớc lợ ven biển hay trong nội tạng của tôm, cua, Đặc trƣng của loài Vibrio spp. là khả năng phát triển trong điều kiện pH rất cao (pH 8,5 - 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở môi trƣờng acid theo Phạm Thị Bích Ngọc (2011). Hình 1.11. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. (Microscopy, 2004) Vibrio spp. có khả năng lên men đƣờng glucose trong cả điều kiện hiếu khí và kị khí, có enzyme nitratase để khử nitrate thành nitrite. Vi khuẩn có kết quả dƣơng tính với thử nghiệm Oxidase và Catalase (Phạm Thị Bích Ngọc, 2011). 1.4.4.2. Độc tính Bệnh tả là 1 bệnh truyền nhiễm cấp tính do Vibrio cholerae gây ra. Biểu hiện lâm sàng của bệnh là nôn nhiều lần, dịch nôn lúc đầu là nƣớc và thức ăn, về sau giống nhƣ dịch phân. Cơ thể bị sốt, sôi bụng hoặc đau bụng nhẹ, chuột rút, đi ngoài 29
  42. Đồ án tốt nghiệp phân lỏng có mùi tanh, dẫn đến cơ thể mất nƣớc, điện giải, suy tim, suy kiệt và dẫn đến tử vong nếu không điều trị kịp thời. Ngoài ra, khi ta ăn phải thức ăn có chứa độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sẽ gây ra các biểu hiện lâm sàng nhƣ tiêu chảy nhiều lần trong ngày, đau bụng, buồn nôn và nôn (Hoàng Ngân, 2013). 1.5. Một số mô hình đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của thực vật trên động vật 1.5.1. Mô hình đánh giá khả năng trị tiêu chảy Mục đích: Đánh giá khả năng chống tiêu chảy của cao chiết so với thuốc đặc trị tiêu chảy đƣợc thử nghiệm trên mô hình chuột, dƣới tác động của tác nhân gây tiêu chảy (Ndukui và ctv, 2013). Vật liệu nghiên cứu: Chuột bạch Thụy Sỹ cả giống đực và cái, có trọng lƣợng 20 - 30 g đạt 6 - 8 tuần tuổi. Chuột đƣợc nuôi ở điều kiện nhiệt độ 22 ± 2oC và chu kỳ sáng tối 12 giờ. Chúng đƣợc cho ăn uống đầy đủ và quan sát trƣớc khi làm thí nghiệm 1 tuần (Awounters và ctv, 1978). Bao gồm các loại mô hình sau: 1.5.1.1. Mô hình castor oil a) Khái niệm: Castor oil còn đƣợc gọi là Oleum palmae christi đƣợc chiết xuất bằng cách ép lạnh từ hạt thầu dầu (Ricinus communis) và có tác dụng chữa bệnh trong nhiều thế kỷ (Gaginella và ctv, 1975). Castor oil là triglyceride chứa hàm lƣợng cao acid béo không bão hòa ricinoleic acid [(9Z, 12R)-12-hydroxyoctadec-9- enoic acid] theo Saalmüller L. (1848). b) Cơ chế tác động: Sau khi uống castor oil, ricinoleic acid sẽ đƣợc phân giải nhờ enzyme lipase, một lƣợng lớn ricinoleic acid đƣợc hấp thụ vào ruột (Meyer H., 1890). Năm 2012, Tunaru S. và ctv đã chứng minh ricinoleic acid là chất đầu tiên đƣợc cơ thể hấp thụ qua niêm mạc ruột giúp hoạt hóa thụ thể prostaglandin E receptor 3 (EP3) ở trên tế bào cơ của ruột và dạ con, gây co thắt cơ trơn của ruột, làm tăng nhu động ruột và giúp nhuận tràng. c) Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi làm thí nghiệm tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói 24 giờ, cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung dịch đối 30
  43. Đồ án tốt nghiệp chứng. Sau 1 giờ cho tất cả chuột uống tiếp 1 ml castor oil và tiến hành quan sát trong 4 giờ (Shoba và Thomas, 2001). 1.5.1.2. Mô hình magnesium sulfate (MgSO4) a) Khái niệm: Magnesium sulfate (MgSO4) còn gọi là muối Epsom, đƣợc sử dụng nhƣ chất làm khô, hút ẩm. Đây là 1 thành phần quan trọng đối với nhiều hệ thống trong cơ thể, đặc biệt là cơ bắp và các dây thần kinh. Magnesium sulfate cũng làm tăng lƣợng nƣớc tiết ra trong ruột nên cũng đƣợc sử dụng làm thuốc nhuận tràng theo Multum (2011). b) Cơ chế tác động: Magnesium sulfate tạo một lực gradient đẩy nƣớc ở phần đầu của đoạn ruột làm gia tăng nhu động ruột, đồng thời kích thích của hormones ở túi mật hoặc thay đổi mức huyết thanh hoặc những hormones khác, làm tăng tiết dịch vào lòng ruột và gây tiêu chảy (Reichelderfer, 1984). c) Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi làm thí nghiệm toàn bộ chuột phải đƣợc nhịn đói 24 giờ, cho từng nhóm chuột uống thuốc trị tiêu chảy, cao thuốc và dung dịch đối chứng. Sau 30 phút, tất cả chuột uống tiếp magnesium sulfate 2 mg/kg và tiến hành quan sát dạng phân trong 4 giờ (Doherty, 1981). 1.5.1.3. Mô hình serotonin a) Khái niệm: Serotonin 5-hydroxy tryptamine (5-HT) là chất dẫn truyền thần kinh, chất này đƣợc bài tiết dƣới tác động của các xung kích thích trong lòng ruột. Serotonin đóng vai trò quan trọng trong điều hòa nhu động ruột. Serotonin đƣợc tiết ra bởi các tế bào enterochromaffin (EC) và các hoạt động trên thụ thể nằm trên cơ trơn, ruột và thần kinh. Có 7 loại thụ thể 5-HT, trong đó thụ thể 5-HT3 và 5-HT4 điều chỉnh sự vận động, cảm giác đau và sự bài tiết của ruột (Moskwa và ctv, 2007). b) Cơ chế tác động: Serotonin sau khi đƣợc kích thích bằng 5-hydroxytryptamine (5-HT) kích hoạt lên thụ thể 5-HT (1P) nằm dƣới lớp niêm mạc ruột bên trong neurones hƣớng tâm chính thì serotonin mới có thể phối hợp co cơ trơn, tạo phản xạ nhu động ruột, kích thích bài tiết nƣớc và điện giải vào lòng ruột và làm thay đổi cảm nhận đau. Nếu serotonin đƣợc tăng tiết sẽ làm tăng nhu động ruột và gây tiêu chảy. Ngƣợc lại, nếu serotonin giảm tiết sẽ làm giảm nhu động ruột và gây chứng 31
  44. Đồ án tốt nghiệp táo bón, đây là những triệu chứng của hội chứng ruột kích thích theo Gershon (2004). c) Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi thí nghiệm tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói qua đêm. Từng nhóm chuột đƣợc uống thuốc trị tiêu chảy, cao thuốc và dung dịch đối chứng. Sau 30 phút cho tất cả chuột uống serotonin 600 µg/kg. Tiến hành quan sát dạng phân sau mỗi 30 phút và quan sát trong 6 giờ (Khan, 2004). 1.5.2. Mô hình khảo sát enteropooling Mục đích: Bằng cách sử dụng các tác nhân gây tiêu chảy để làm giảm hoạt động ở ruột, từ đó xác định hiệu quả tốt nhất khi lƣợng dịch trong ruột tiết ra ít nhất. Vì vậy thử nghiệm “enteropooling” thƣờng sử dụng để đo lƣợng dịch tích tụ trong ruột non của chuột (Bennett, 1983). Vật liệu nghiên cứu: Chuột cống có khối lƣợng 150 - 200 g cả giống đực và cái, đƣợc lấy từ Côte d’Ivoire. Chúng đƣợc cho ăn uống đầy đủ và đƣợc nhịn ăn 18 giờ trƣớc khi tiến hành thí nghiệm (Mitjans, 2008). Bao gồm các loại mô hình sau: 1.5.2.1. Mô hình prostaglandin E2 a) Khái niệm: Prostaglandin E2 là acid béo không bão hòa ở mô, đóng vai trò nhƣ một chất trung gian của quá trình viêm và cảm nhận cơn đau. Prostaglandin E2 đƣợc giải phóng do kích thích cơ học, hóa học, nhiệt, vi khuẩn có tác dụng làm giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch gây viêm và đau (Đại học Y Dƣợc Hà Nội, 1998). b) Cơ chế tác động: Giống với cơ chế gây dịch tả ở độc tố tả, khi độc tố đƣợc phát tán từ các vi khuẩn trong ruột, nó liên kết với các tế bào ruột đƣợc gọi là ruột thông qua sự tƣơng tác của các tiểu đơn vị pentameric B của độc tố với các thụ thể ganglioside GM1 trên các tế bào ruột, kích hoạt endocytosis của các độc tố, tiếp theo các độc tố bệnh tả phải trải qua sự phân cắt để trở thành một enzyme hoạt động. Khi đã ở trong enterocyte, các enzyme A1 mảnh của các độc tố A tiểu đơn vị đi vào bào tƣơng, nơi mà nó kích hoạt các protein G, Gsa thông qua một phản ứng ADP-ribosylation để khóa các protein G, qua đó tiếp tục kích thích adenylate cyclase để sản xuất cAMP (Cyclic adenosine monophosphate). cAMP ở nồng độ cao sẽ làm kích hoạt CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 32
  45. Đồ án tốt nghiệp làm mất lƣợng lớn các ion và nƣớc ở ruột dẫn đến tiêu chảy theo Thiagarajah và Verkman (2005). Trong khi prostagladin E2 có tác dụng làm tăng mức hoạt động của cAMP (Beuble, 2000). c) Tiến hành thí nghiệm: Tất cả chuột đƣợc nhịn đói qua đêm, cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung dịch đối chứng. Sau khi uống xong cho tất cả chuột uống tiếp tục tác nhân gây tiêu chảy 2 mg/kg prostaglandin E2. Sau 30 phút, tiến hành mổ chuột lấy đoạn ruột non đem cân khối lƣợng. Vắt tất cả dịch trong ruột ra ống và cân lại đoạn ruột sau khi đã lấy hết dịch bên trong (Robert và ctv, 1976). 1.5.2.2. Mô hình irinotecan a) Khái niệm: Irinotecan hydrochloride (CPT-11) là 1 dẫn xuất bán tổng hợp của camptothecin có tác dụng ức chế enzyme topoisomerase (Andoh và ctv, 1987). Nó có hiệu quả trong việc điều trị ung thƣ đại tràng và ung thƣ phổi. Nhƣng tác dụng phụ là gây tiêu chảy chậm sau 24 giờ (Abigerges và ctv, 1994). b) Cơ chế tác động: Irinotecan đƣợc chuyển hóa bởi gan và yếu tố ngoại carboxylesterase thành chất hoạt hóa SN-38 (7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin), tiếp tục đƣợc dung hợp bởi UDP-GT 1A1 (Uridine diphosphate glucuronosyl transferase-1A1) ở gan thành SN38G (SN38-glucuronide), SN38G đƣợc bài tiết tới khoang ruột thông qua dịch mật. Tại đây SG38G đƣợc hệ vi sinh đƣờng ruột β- glucuronidase phân hủy thành SG-38 (Yoshio và ctv, 1997). Nồng độ SG-38 cao gây thiệt hại manh tràng dẫn tới tiêu chảy (Kehrer và ctv, 2001). c) Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi làm thí nghiệm tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói qua đêm, cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung dịch đối chứng. Sau đó 30 phút cho tất cả chuột uống irinotecan 30 mg/kg và sau 1 giờ tiến hành mổ lấy đoạn ruột. Cân khối lƣợng ruột, sau đó vắt lấy tất cả các dịch trong ruột ra ống tính lƣợng thể tích và cân lại đoạn ruột (Yoshio và ctv, 1997). 1.5.2.3. Mô hình sử dụng Heat-labile toxin a) Khái niệm: Độc tố ruột kém bền nhiệt (LT) là oligopeptide, đƣợc sinh ra do nhóm ETEC gồm 2 loại là LT-I và LT-II không có phản ứng chéo về mặt miễn 33
  46. Đồ án tốt nghiệp dịch. Heat-labile toxin gây tích tụ muối và nƣớc trong lòng ruột nên thƣờng đƣợc sử dụng làm mô hình tiêu chảy (Spangler, 1992). b) Cơ chế tác động: Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức AMP vòng (cAMP) trong tế bào. cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng không hoạt động thành dạng hoạt động. Dẫn đến sự phosphoryl những kênh chloride hoạt động trên mức bình thƣờng ở màng tế bào biểu mô làm kích thích những tế bào ruột tiết ra Cl-, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl bởi những tế bào nhung mao gây tiêu chảy dữ dội. LT-II có cơ chế tƣơng tự nhƣ LT-I, nhƣng LT-II không liên quan đến bệnh trên ngƣời và động vật (Nataro và Kaper, 1998). c) Tiến hành thí nghiệm: Tất cả chuột đƣợc nhịn đói 16 giờ trƣớc khi làm thí nghiệm, cho từng nhóm chuột uống cao ethanol với những nồng độ khác nhau và dung dịch đối chứng. Sau đó tiêm 0,5 ml của 10 µg Heat-labile toxin cho tất cả chuột và 6 giờ sau tiến hành mổ lấy đoạn ruột. Cân khối lƣợng ruột, sau đó vắt lấy tất cả các dịch trong ruột và cân lại đoạn ruột (Jaw-Chyun Chen và ctv, 2007). 1.5.2.4. Mô hình castor oil Tiến hành thí nghiệm: Tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói 18 giờ trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung dịch đối chứng. Sau 1 giờ cho uống 1 ml castor oil cho tất cả các nhóm. Tiến hành mổ lấy đoạn ruột từ môn vị đến ruột tịt, sau khi đã uống castor oil 1 giờ. Cân khối lƣợng ruột, sau đó vắt lấy tất cả các dịch trong ruột ra ống, cân lại khối lƣợng ruột và tính lƣợng thể tích dịch (Saralaya và ctv, 2010). 1.5.3. Mô hình khảo sát sự di chuyển ở ruột non Mục đích: Đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy dựa vào tốc độ di chuyển lƣợng dịch trong ruột, do sự kích thích nhu động hay phản nhu động làm tăng hoặc giảm khả năng co bóp ở ruột non (Bennett, 1983). 34
  47. Đồ án tốt nghiệp Vật liệu nghiên cứu: Chuột cống cả giống đực và cái, có trọng lƣợng 200 - 250g. Nuôi ở chu kỳ sáng tối 12 giờ, đƣợc ăn uống đầy đủ và nhịn đói 18 giờ trƣớc khi làm thí nghiệm (Saralaya và ctv, 2010). Bao gồm các loại mô hình sau: 1.5.3.1. Mô hình castor oil Tiến hành thí nghiệm: Tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói 18 giờ trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung dịch đối chứng. Sau đó 1 giờ, cho tất cả chuột tiếp tục uống 1 ml castor oil. Chuột đƣợc uống 1 ml than hoạt tính (10% than trong 5% gum acacia) 1 giờ sau khi uống castor oil. Sau 1 giờ tiến hành mổ lấy đoạn ruột từ môn vị đến ruột tịt, đo chiều dài từ môn vị đến vị trí có chứa than và tính đƣợc tỷ lệ phần trăm trên tổng chiều dài ruột (Mascolo và ctv, 1994). 1.5.3.2. Mô hình prostaglandin E2 Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi làm thí nghiệm tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói 24 giờ, cho từng nhóm chuột uống thuốc trị tiêu chảy, cao thuốc và dung dịch đối chứng. Sau đó 10 phút cho tất cả chuột tiếp tục uống prostaglandin E2 2 mg/kg. Chuột đƣợc uống dung dịch đánh dấu. Sau 45 phút chuột đƣợc làm ngạt bằng CO2 và tiến hành mổ chuột lấy hết đoạn ruột, đo chiều dài từ phía đầu đến vị trí đánh dấu và đo chiều dài ruột (Ruwart và ctv, 1984). 1.5.3.3. Mô hình irinotecan Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi làm thí nghiệm tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói qua đêm, cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung dịch đối chứng. Sau đó 30 phút cho tất cả chuột uống irinotecan 60 mg/kg và chuột đƣợc uống tiếp than hoạt tính. Sau 30 phút tiến hành mổ chuột lấy hết đoạn ruột, đo chiều dài từ phía đầu đến vị trí đánh dấu và đo chiều dài ruột (Sarin và Bafna, 2012). 35
  48. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa điểm thu mẫu Vƣờn Quốc Gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng. 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM và Phòng Thí nghiệm động vật, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM, cơ sở Linh Trung, quận Thủ Đức. 2.1.3. Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 01/2015 đến 08/2015. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Toàn bộ cây Elephantopus sp. gồm các phần rễ, thân, lá và hoa. 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.2.1. Vi sinh vật chỉ thị Vi sinh vật chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 15 chủng vi khuẩn đƣờng ruột đƣợc cung cấp bởi Viện Vệ sinh Y tế công cộng, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, bao gồm: Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: E.coli, E.coli 0208, E.coli O157:H7 và ETEC. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp.: S.dublin, S.enteritidis, S.typhi và S.typhimurium. Nhóm vi khuẩn Shigella spp.: S.boydii, S.flexneri và S.sonnei. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp.: V.cholerae, V.harveyi, V.alginolyticus và V.parahaemolyticus. 2.2.2.2. Động vật thí nghiệm Chuột bạch, giống đực, khối lƣợng trung bình 25 – 30 gram/con, đƣợc lấy từ Viện Pasteur TP.HCM. 36
  49. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3. Môi trường, hóa chất và thuốc - Môi trƣờng TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia – Ấn Độ). - Môi trƣờng TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia – Ấn Độ). - DMSO (Dimethyl sulfoxide) (Trung Quốc). - Diethyl ether (Trung Quốc). - Castor oil (France – Pháp). - Than hoạt tính (3% w/v than trong 100 ml carboxymethyl cellulose 0,5%) - Thuốc Loperamide (OLIC – Thái Lan). - Thuốc Ciprofloxacin (Việt Nam). 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị 2.2.4.1. Dụng cụ - Đĩa petri - Các loại đầu típ - Ống nghiệm - Micropipette 100 µl, 1000 µl - Becher - Ống ly tâm eppendrof 2 ml - Ống đong - Dây cấy vòng, que cấy trang - Đèn cồn - Bông thấm nƣớc và bông không thấm - Chai môi trƣờng nƣớc - Đũa thủy tinh - Các loại dụng cụ khác nhƣ: bao chịu nhiệt, - Dụng cụ đục lỗ giấy gói, kẹp gấp, muỗng, dao, thun, - Thƣớc đo ghim - Bàn mổ 2.2.4.2. Thiết bị - Autoclave (Huxky - Đài Loan) - Cân phân tích (Orbital - Đức) - Tủ ấm 37oC (Memmert - Dức) - Bếp cách thủy siêu tốc (Scilogex - Mỹ) - Máy ly tâm (Tuttligen - Đức) - Máy nƣớc cất (Branstead USA) - Máy đo UV – VIS (Hach) 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật 37
  50. Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc: Sử dụng loại dung môi thích hợp để lôi kéo các hợp chất có khả năng kháng khuẩn trong cây thuốc, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau. Cách thực hiện: Mẫu cây sau khi rửa sạch, đƣợc đem đi phơi khô rồi nghiền thành dạng bột. Bột cây đƣợc ngâm trong dung môi ethanol 70% trong 24 giờ, sau đó đem lọc để thu dịch và bã đƣợc ngâm lặp lại từ 5 đến 7 lần cho dến khi dịch chiết hoàn toàn trong suốt, để có thể trích ly hết các hợp chất trong cây. Dịch chiết đƣợc cô cách thủy ở nhiệt độ 70oC cho đến khi trở thành dạng cao. Cao chiết thu đƣợc sẽ bảo quản ở nhiệt độ 4oC (Atta và ctv, 2005). 2.3.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị Nguyên tắc: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp giúp vi sinh vật phát triển và đạt đƣợc số lƣợng cần thiết để phục vụ cho thí nghiệm. Ngoài ra, việc tăng sinh còn giúp hoạt hóa vi khuẩn trở về với trạng thái bình thƣờng sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Cách thực hiện: Vi khuẩn đƣợc bảo quản lạnh ở -80oC trong dung dịch chứa 20% (v/v) glycerol. Tiến hành tăng sinh bằng cách cấy vi khuẩn vào 10 ml môi trƣờng TSB, điều chỉnh cho pH 7 và lắc 220 vòng/phút ở 37oC. Sau 12 - 14 giờ, vi khuẩn đã bắt đầu phát triển nên để vi khuẩn ổn định ở nhiệt độ 25oC. Sau 18 giờ có thể tiến hành đo OD ở 600 nm để xác định lƣợng vi khuẩn (Restaino và ctv, 2013). 2.3.3. Phương pháp cấy truyền và giữ giống vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phƣơng pháp bảo quản đơn giản nhất, các chủng vi sinh vật đƣợc cấy trên môi trƣờng thạch nghiêng và ủ ở điều kiện phù hợp cho chủng vi sinh vật phát triển. Sau đó, các chủng này đƣợc chuyển vào tủ mát có nhiệt độ từ 4oC để bảo quản. Quá trình này đƣợc lặp đi lặp lại sau một thời gian nhất định để tránh hiện tƣợng thoái hóa giống, đảm bảo vi khuẩn không bị già và chết. Thời gian chu kỳ cấy chuyển của từng chủng vi sinh vật là khác nhau, tuy nhiên thời gian tối đa có thể đạt đƣợc của phƣơng pháp này là 3 tháng một lần. Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị cấy chuyền định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng TSA và bảo quản ở nhiệt độ 4oC. 38
  51. Đồ án tốt nghiệp Cách thực hiện: Giống vi khuẩn sau khi đã thuần khiết, đƣợc bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC. Sau 1 - 2 tháng phải cấy truyền bằng cách dùng que cấy đầu tròn lấy ít giống cấy zích zắc sang ống thạch nghiêng mới và đem nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng vi sinh vật phát triển trong vòng 48 - 72 giờ rồi đem bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC (Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007). 2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland). 9 Mật độ = OD600 x 1.02 x 10 (CFU/ml) 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng rất cần thiết trong hầu hết các thí nghiệm. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình phân tích nhờ đó giúp nâng cao đƣợc tính chính xác của các thí nghiệm. Cách thực hiện: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào các ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng để tạo nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp tục hút 1 ml dịch từ ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-1 vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta đƣợc nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng theo nguyên tắc trên cho đến khi đạt đƣợc nồng độ cần thiết (Phạm Minh Nhựt, 2013). Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu 2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 39
  52. Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trƣờng thạch và tác động lên các vi khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác định đƣợc hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm). Cách tiến hành: Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa ở mật độ 106 CFU/ml lên đĩa TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Sử dụng que đục lỗ để đục lỗ, tạo giếng có đƣờng kính 6 mm trên đĩa TSA. Nhỏ 0,1 ml dịch cao chiết lên các giếng và giữ trong tủ lạnh 1 giờ để các chiết xuất của cao có thể khuếch tán vào môi trƣờng thạch. Sau đó, các đĩa đƣợc ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và tiến hành đo đƣờng kính vòng ức chế (Aibinu, 2007). 2.3.7. Phương pháp gây tiêu chảy bằng castor oil trên mô hình chuột Nguyên tắc: Sử dụng tác nhân gây tiêu chảy sau khi uống dung dịch thí nghiệm. Sau đó tính khối lƣợng phân tiêu chảy và đem so sánh với nhóm đối chứng. Từ đó, xác định đƣợc tỷ lệ ức chế tiêu chảy. Cách thực hiện: Chuột bạch có khối lƣợng từ 25 - 30 gram đƣợc sử dụng làm thí nghiệm, sau khi đã nhịn đói 24 giờ. Chúng đƣợc chia thành các nghiệm thức để uống cao chiết ethanol, thuốc trị tiêu chảy Loperamide (3 mg/kg) và uống dung dịch DMSO 1% đƣợc xem là nhóm đối chứng. Sau 1 giờ, tất cả chuột đƣợc uống 0,3 ml castor oil. Tất cả chuột đƣợc nhốt ở những lồng riêng có lót miếng nhựa và quan sát dạng phân trong 4 giờ. Tỷ lệ ức chế tiêu chảy (%) = (To – T1/ To) x 100 To: lƣợng phân tiêu chảy ở nghiệm thức đối chứng (gram). T1: lƣợng phân tiêu chảy ở nghiệm thức thí nghiệm (gram) theo Dosso và ctv (2012). 2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng di chuyển ở ruột Nguyên tắc: Sử dụng tác nhân gây tiêu chảy sau khi uống dung dịch thí nghiệm. Sau đó, xác định khả năng co bóp ở ruột non dựa vào tốc độ di chuyển của lƣợng dịch trong ruột và tính đƣợc phần trăm ức chế sự di chuyển ở ruột. 40
  53. Đồ án tốt nghiệp Cách thực hiện: Chuột có khối lƣợng từ 25 - 30 gram đƣợc sử dụng làm thí nghiệm, sau khi đã nhịn đói 24 giờ. Chúng đƣợc chia thành các nghiệm thức để uống cao chiết ethanol, thuốc trị tiêu chảy Loperamide (3 mg/kg) và uống dung dịch DMSO 1% đƣợc xem là nhóm đối chứng. Sau 1 giờ, tất cả chuột đƣợc uống 0,3 ml castor oil và 30 phút sau đƣợc uống tiếp 0,2 ml than hoạt tính. Sau 30 phút, tất cả chuột đƣợc gây mê bằng diethyl ether và tiến hành mổ lấy đoạn ruột từ môn vị đến manh tràng, đem đo chiều dài và xác định tỷ lệ ức chế sự di chuyển ở ruột. Tỷ lệ ức chế sự di chuyển ở ruột (%) = (To – T1/ To) x 100 To: tổng chiều dài đoạn ruột của các nghiệm thức (cm). T1: chiều dài của than ở các nghiệm thức (cm) theo Dosso và ctv (2012). 2.3.9. Phương pháp khảo sát enteropooling Nguyên tắc: Sử dụng tác nhân gây tiêu chảy để làm tăng hoạt động ở ruột của các nhóm thí nghiệm. Từ đó, hiệu quả trị tiêu chảy đƣợc đánh giá tốt nhất khi sự tiết dịch trong ruột là ít nhất. Cách thực hiện: Chuột có khối lƣợng từ 25 - 30 gram đƣợc sử dụng làm thí nghiệm, sau khi đã nhịn đói 24 giờ. Chúng đƣợc chia thành các nghiệm thức để uống cao chiết ethanol, thuốc trị tiêu chảy Loperamide (3 mg/kg) và uống dung dịch DMSO 1% đƣợc xem là nhóm đối chứng. Sau 1 giờ, tất cả chuột đƣợc uống 0,3 ml castor oil. Sau 30 phút, tất cả chuột đƣợc gây mê bằng diethyl ether và tiến hành mổ lấy đoạn ruột từ môn vị đến ruột tịt. Cân khối lƣợng ruột, sau đó vắt lấy tất cả lƣợng dịch trong ruột ra ống, cân lại khối lƣợng ruột và tính lƣợng thể tích dịch Tỷ lệ ức chế sự co bóp ở ruột (%) = (To – T1/ To) x 100 To: lƣợng dịch ruột ở nghiệm thức đối chứng (gram). T1: lƣợng dịch ruột ở nghiệm thức thí nghiệm (gram) theo Saralaya và ctv (2010). 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm Statgraphics Centurion XV.1 với trắc nghiệm Tukey. Kết quả đƣợc thể hiện ở giá trị 41
  54. Đồ án tốt nghiệp trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Dữ liệu đƣợc phân tích theo oneway ANOVA (P < 0,05) là có ý nghĩa thống kê. 2.4. Bố trí thí nghiệm Để tiến hành thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và khả năng trị tiêu chảy của cao chiết ethanol từ cây Elephantopus sp., tiến trình thí nghiệm đƣợc trình bày nhƣ ở hình 2.2. Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 2.4.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu quy trình tách chiết cao ethanol 70% từ Elephantopus sp. Để tiến hành các thí nghiệm, phải thu đƣợc cao EEE và quy trình tách chiết cao ethanol 70% từ Elephantopus sp. đƣợc thể hiện ở hình 2.3. 42
  55. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3. Quy trình tách chiết cao EEE Cây Elephantopus sp. đƣợc rửa sạch và đem đi phơi khô. Cây sau khi khô đƣợc đem xay thành dạng bột, cân 200 g bột cây bổ sung thêm 2000 ml ethanol 70% và ngâm ở nhiệt độ thƣờng trong 24 giờ. Mẫu sau khi ngâm đƣợc lọc thô, sau đó đƣợc lọc chân không để thu dịch. Bã đƣợc ngâm lại và lọc nhiều lần cho đến khi dịch lọc thu đƣợc trở nên trong suốt. Lấy tất cả dịch lọc thu đƣợc đem đi cô cách thủy ở nhiệt độ 70oC cho đến khi bay hết dung môi, thu đƣợc cao ethanol 70% của cây Elephantopus sp. (EEE). Cao EEE đƣợc bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC để phục vụ cho những thí nghiệm tiếp theo. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EEE Cao EEE đƣợc sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và quy trình tiến hành kháng khuẩn đƣợc trình bày ở hình 2.4. 43
  56. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Quy trình đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EEE đối với vi khuẩn chỉ thị Tiến hành tăng sinh vi khuẩn chỉ thị trong môi trƣờng TSB hay môi trƣờng TSB có bổ sung 1,5% NaCl, ở 37oC trong 24 giờ. Vi khuẩn sau khi tăng sinh đƣợc đem đi đo OD ở bƣớc sóng 600 nm, sau đó pha loãng thành nồng độ 106 CFU/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã pha loãng cho vào đĩa petri có chứa môi trƣờng TSA hay môi trƣờng TSA có bổ sung 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp., cấy trang cho đến khi đĩa khô hoàn toàn. Tiến hành chuẩn bị dịch cao EEE ở nồng độ 100 mg/ml bằng DMSO 1%. Đĩa thạch sau khi khô đƣợc đem đi đục lỗ với đƣờng kính là 6 mm. Hút 100 µl dịch cao EEE cho vào lỗ và để yên trong 2 giờ, sau đó các đĩa đƣợc đem đi ủ ở 37oC trong 24 giờ và đọc kết quả. Đối chứng âm sử dụng DMSO 1%. Đối chứng dƣơng sử dụng Ciprofloxacin ở dãy nồng độ theo cấp số 2 từ nồng độ 1000 µg/ml đến 8 µg/ml. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 44
  57. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3. Đánh giá độc tính của EEE trên mô hình chuột Độc tính cấp đƣợc xác định theo phƣơng pháp liều cố định trong OECD số 425, 12 con chuột đƣợc chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm 6 con. Nhóm 1 cho uống EEE ở nồng độ 5000 mg/kg. Nhóm 2 cho uống dung dịch DMSO 1% để làm đối chứng. Quan sát hành vi, dạng phân, màu lông, khối lƣợng chuột, lƣợng thức ăn, nƣớc uống và số chuột chết ở từng nhóm trong thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ để xác định độ an toàn của cao chiết. Các chỉ tiêu đánh giá độc tính bao gồm: Màu lông: Xem sự thay đổi màu sắc của lông, quan sát kỹ ở vùng cổ. Trạng thái lông: Xem dấu hiệu có sự rụng lông không. Sự linh hoạt: Xem chuột còn tỉnh, nhạy hay lừ đừ, nằm yên một chỗ. Tình trạng tiêu chảy: Quan sát trong trấu có phân lỏng không, quan sát hậu môn có dính phân không. Lƣợng thức ăn: Kiểm soát lƣợng thức ăn hằng ngày. Lƣợng nƣớc uống: Kiểm soát lƣợng nƣớc sử dụng mỗi ngày. Trọng lƣợng: Kiểm tra xem chuột có xuống cân không. Tỷ lệ sống: Xem có con chuột nào bị chết không. 2.4.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của EEE trên mô hình chuột 2.4.4.1. Chuẩn bị chuột trước khi thí nghiệm Chuột bạch, giống đực có khối lƣợng trung bình 25 - 30 gram/con, đƣợc nuôi bằng thức ăn tổng hợp, nƣớc sạch, nuôi trong điều kiện bình thƣờng với nhiệt độ môi trƣờng 22 ± 2oC và đƣợc quan sát trƣớc khi làm thí nghiệm 1 tuần. Trƣớc khi thí nghiệm chuột phải phải đƣợc nhịn đói 24 giờ và chỉ cho uống nƣớc. 2.4.4.2. Thí nghiệm 3.1: Thử nghiệm khả năng trị tiêu chảy của EEE trên mô hình chuột Trƣớc khi thí nghiệm, tất cả chuột đƣợc nhịn đói 24 giờ, 48 con chuột đƣợc chia thành 8 nhóm, mỗi nhóm 6 con đƣợc uống các nghiệm thức theo trình tự sau: 45
  58. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1. Thí nghiệm khảo sát khả năng trị tiêu chảy N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 Nghiệm DMSO 1% Loperamide EEE thức (đối chứng) Nồng độ 3 ml/kg 3 1000 500 250 125 63 32 (mg/kg) Sau 1 giờ, cho tất cả các nhóm uống 0,3 ml castor oil. Xác định thời điểm tiêu chảy và tính lƣợng phân tiêu chảy trong 4 giờ 2.4.4.3. Thí nghiệm 3.2: Thử nghiệm enteropooling Trƣớc khi thí nghiệm, tất cả chuột đƣợc nhịn đói 24 giờ, 48 con chuột đƣợc chia thành 8 nhóm, mỗi nhóm 6 con đƣợc uống các nghiệm thức theo trình tự sau: Bảng 2.2. Thí nghiệm khảo sát enteropooling N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 Nghiệm DMSO 1% Loperamide EEE thức (đối chứng) Nồng độ 3 ml/kg 3 1000 500 250 125 63 32 (mg/kg) Sau 1 giờ, cho tất cả các nhóm uống 0,3 ml castor oil. Gây mê bằng diethyl ether và tiến hành mổ chuột sau 1 giờ, lấy đoạn ruột từ cuối dạ dày đến ruột tịt. Thu dịch trong ruột, xác định thể tích và so sánh với đối chứng. 2.4.4.4. Thí nghiệm 3.3: Khảo sát sự di chuyển ở ruột non Trƣớc khi thí nghiệm, tất cả chuột đƣợc nhịn đói 24 giờ, 48 con chuột đƣợc chia thành 8 nhóm, mỗi nhóm 6 con đƣợc uống các nghiệm thức theo trình tự sau: 46
  59. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Thí nghiệm khảo sát sự di chuyển ở ruột N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 Nghiệm DMSO 1% Loperamide EEE thức (đối chứng) Nồng độ 3 ml/kg 3 1000 500 250 125 63 32 (mg/kg) Sau 60 phút, cho tất cả các nhóm uống 0,3 ml castor oil. Sau 30 phút tiếp theo, cho tất cả các nhóm uống 0,2 ml than hoạt tính. Gây mê bằng diethyl ether và tiến hành mổ chuột sau 30 phút, lấy đoạn ruột từ cuối dạ dày đến ruột tịt. Đo chiều dài ruột và chiều dài than để so sánh với đối chứng. 47
  60. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả hiệu suất thu hồi cao Bột cây Elephantopus sp. sau khi ngâm trong dung môi ethanol 70%, lọc, thu dịch và cô dịch lọc ở 70oC, kết thúc quá trình nàythu đƣợc cao chiết ethanol 70% với hiệu suất là 17,889%. Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Hình 3.1. Dịch của Elephantopus sp. qua các lần ngâm ethanol 70% 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% đối với nhóm vi khuẩn gây tiêu chảy 48
  61. Đồ án tốt nghiệp Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% đối với 15 chủng vi khuẩn chỉ thị và đƣợc trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết và kháng sinh Ciprofloxacin EEE Ciprofloxacin Ciprofloxacin Vi sinh vật 100 mg/ml 8 µg/ml 500 µg/ml E.coli O157:H7 12,2 ± 0,3 0,0 13,2 ± 0,3 E.coli 13,5 ± 0,5 0,0 13,2 ± 0,3 S.flexneri 17,3 ± 0,6 0,0 13,2 ± 0,3 V.alginolyticus 13,2 ± 0,3 16,2 ± 0,3 34,2 ± 0,3 V.cholerae 11,7 ± 0,6 13,3 ± 0,6 22,3 ± 0,3 V.harveyi 15,7 ± 0,6 18,0 ± 0,5 33,0 ± 0,5 V.parahaemolyticus 17,3 ± 0,3 11,3 ± 0,3 28,2 ± 0,3 Dựa vào bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy rằng, EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với 7/15 chủng vi khuẩn chỉ thị khảo sát, bao gồm 4 chủng Vibrio spp., E.coli, E.coli O157:H7 và S.flexneri. 3.2.1. Kết quả mức độ kháng khuẩn trên nhóm Vibrio spp. của EEE Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của EEE và Ciprofloxacin trên nhóm Vibrio spp. Đối với nhóm Vibrio spp., EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với 4/4 chủng khảo sát (Hình 3.2). Điều này chứng tỏ rằng, nhóm Vibrio 49
  62. Đồ án tốt nghiệp spp. khá nhạy cảm đối với EEE ở nồng độ 100 mg/ml. Khi so sánh hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ 8 µg/ml, EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng V.alginolyticus, V.cholerae và V.harveyi thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05), nhƣng V.parahaemolyticus cao hơn Ciprofloxacin ở nồng độ 8 µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Đối với 2 chủng V.alginolyticus và V.cholerae, EEE ở nồng độ 100 mg/ml chỉ có khả năng ức chế vi khuẩn khảo sát. Hình 3.3. Đƣờng kính vòng ức chế của EEE đối với V.alginolyticus 3.2.2. Kết quả kháng khuẩn trên các vi khuẩn khác Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của EEE và kháng sinh Ciprofloxacin trên các chủng vi khuẩn khác 50
  63. Đồ án tốt nghiệp Đối với nhóm E.coli, EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với 2/4 chủng khảo sát đó là E.coli O157:H7 và E.coli. So với hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml, EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với E.coli O157:H7 thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (P 0,05). Hình 3.5. Đƣờng kính vòng kháng của EEE đối với E.coli O157:H7 Đối với nhóm Shigella spp., EEE ở nồng độ 100 mg/ml chỉ cho hoạt tính kháng khuẩn đối với 1/3 chủng khảo sát đó là Shigella flexneri. Khi so sánh hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ 500µg/ml, EEE thể hiện hoạt tính kháng S.flexneri với đƣờng kính vòng kháng khuẩn là 17,3 mm, cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Hình 3.6. Đƣờng kính vòng kháng của EEE đối với S.flexneri 51
  64. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả ở bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy rằng phổ kháng khuẩn của EEE ở nồng độ 100 mg/ml khá hẹp, chỉ đối kháng đƣợc với 7/15 chủng vi khuẩn khảo sát, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn của chúng khá cao với đƣờng kính vòng kháng khuẩn dao động từ 11,7 – 17,3 mm. Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với 2 chủng vi khuẩn là V.parahaemolyticus và S.flexneri đƣợc thể hiện ở đƣờng kính vòng kháng khuẩn là 17,3 mm. Theo nghiên cứu của Aibinu và ctv (2007), khi tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn đối với S.flexneri và E.coli trên một số loại cao chiết từ cây Bryophyllum pinnatum và Kalanchoe crenata kết quả cho thấy rằng, cao methanol của Kalanchoe crenata ở nồng độ 512 mg/ml cho đƣờng kính vòng kháng khuẩn lần lƣợt là 17 mm và 12 mm. Trong khi đó, đƣờng kính vòng kháng khuẩn của EEE ở nồng độ 100 mg/ml đối với S.flexneri là 17,3 mm và E.coli là 13,5 mm khi so sánh ở cùng đƣờng kính lỗ. Nhƣ vậy, EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với S.flexneri và E.coli tốt hơn so với cao methanol của Kalanchoe crenata ở nồng độ 512 mg/ml. Khi so sánh hoạt tính kháng khuẩn đối với V.parahaemolyticus và V.harveyi của EEE ở nồng độ 100 mg/ml với cao ethanol của Salichornia brachiata ở nồng độ 500 mg/ml chúng tôi thấy rằng, EEE ở nồng độ 100 mg/ml cho đƣờng kính vòng kháng khuẩn là 17,3 mm và 15,7 mm so với 14 mm và 12 mm của cao chiết ethanol từ cây Salichornia brachiata. Đối với V.alginolyticus, EEE tuy có đƣờng kính vòng kháng khuẩn không lớn bằng đƣờng kính của cao ethanol từ cây Salichornia brachiata (13,2 mm so với 14 mm), nhƣng EEE khảo sát ở nồng độ 100 mg/ml còn cao ethanol của S. brachiata lại sử dụng ở nồng độ 500 mg/ml nên hoạt tính của EEE đƣợc xem nhƣ mạnh hơn (Babuselvam và ctv, 2012). Từ các kết quả so sánh trên có thể nhận thấy, EEE ở nồng độ 100 mg/ml tuy có phổ kháng hẹp chỉ kháng đƣợc 7/15 chủng vi khuẩn khảo sát, nhƣng mặt khác EEE ở nồng độ 100 mg/ml lại cho hoạt tính kháng khuẩn khá cao. Do đó, chúng tôi sẽ tiếp tục sử dụng EEE để tiến hành các thử nghiệm để đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy trên mô hình chuột. 52
  65. Đồ án tốt nghiệp 3.3. Kết quả đánh giá độc tính của cao ethanol 70% trên mô hình chuột Sau khi đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EEE ở nồng độ 100 mg/ml cho kết quả kháng khuẩn, EEE sẽ đƣợc sử dụng tiếp để đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy trên chuột. Nhƣng trƣớc khi thực hiện các thử nghiệm trên chuột, phải tiến hành kiểm tra độc tính của EEE, để xác định độ an toàn của EEE. Kết quả đánh giá độc tính của EEE đƣợc thể hiện ở hình 3.7. Hình 3.7. Kết quả đánh giá độc tính của EEE trên chuột Dựa vào hình 3.7 chúng tôi nhận thấy rằng, tỷ lệ sống của chuột sau khi uống EEE ở nồng độ 5000 mg/kg sau 120 giờ khảo sát không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (P > 0,05). Về hình dáng bên ngoài, màu sắc lông không bị thay đổi và không có dấu hiệu của sự rụng lông khi so sánh với đối chứng. Về hoạt động của chúng, trong thời gian 12 giờ sau khi uống thuốc một số con tỏ ra hung hăng hơn, tuy nhiên hiện tƣợng này không còn và hoạt động bình thƣờng sau 24, 48, 72, 96 và 120 giờ theo dõi. Về hoạt động ăn uống, bài tiết, chuột vẫn ăn uống, bài tiết và tăng cân bình thƣờng. Không thấy xuất hiện phân lỏng và cũng không có bất kỳ dấu hiệu ngộ độc nào xảy ra trên chuột. Thông qua các chỉ số đánh giá chúng tôi nhận thấy rằng EEE ở nồng độ 5000 mg/kg an toàn trên chuột theo đƣờng uống. Nhƣ vậy, EEE có thể tiến hành các thử nghiệm tiếp theo trên chuột. 53
  66. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Kết quả đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của cao ethanol 70% trên mô hình chuột Để đánh giá đƣợc hiệu quả trị tiêu chảy của EEE, chúng tôi dựa vào các dấu hiệu lâm sàng về thời gian và lƣợng phân tiêu chảy hay dựa vào khả năng co bóp của nhu động ruột, thông qua các thử nghiệm enteropooling và thời gian di chuyển trong ruột. 3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng trị tiêu chảy của EEE bằng dầu thầu dầu trên mô hình chuột Kết quả về tỷ lệ chuột bị tiêu chảy giữa các nghiệm thức đƣợc thể hiện ở hình 3.8. Hình 3.8. Tỷ lệ chuột bị tiêu chảy giữa các nghiệm thức Dựa vào hình 3.8 chúng tôi nhận thấy rằng, ở nghiệm thức đối chứng toàn bộ chuột đều bị tiêu chảy sau 4 giờ khảo sát, điều này chứng tỏ dầu thầu dầu là một tác nhân có khả năng gây tiêu chảy. Ở các nghiệm thức xử lý bằng thuốc đặc trị là Loperamide (3 mg/kg) và EEE ở các nồng độ khác nhau thì có hiệu quả làm giảm tỷ lệ chuột bị tiêu chảy. Nghiệm thức cho uống EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và Loperamide nồng độ 3 mg/kg cho tỷ lệ chuột bị tiêu chảy thấp nhất là 33,33%. EEE ở nồng độ 500 mg/kg và 250 mg/kg có tỷ lệ chuột bị tiêu chảy là 66,67%. EEE ở nồng độ 125 mg/kg, 63 mg/kg và 32 mg/kg cho kết quả phần trăm tiêu chảy khá cao là 83,33%. Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng, EEE có nồng độ càng giảm thì 54
  67. Đồ án tốt nghiệp cho tỷ lệ chuột bị tiêu chảy càng tăng, nhƣng dù cho EEE có ở nồng độ thấp nhƣ 32 mg/kg thì vẫn có tỷ lệ chuột bị tiêu chảy thấp hơn so với đối chứng. Điều đó chứng tỏ rằng, các nồng độ của EEE đều có khả năng kìm hãm sự tiêu chảy, nhƣng chỉ có nồng độ 1000 mg/kg mới cho khả năng kìm hãm sự tiêu chảy tƣơng đƣơng nhƣ Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg. Sau khi xác định tỷ lệ chuột bị tiêu chảy, từ đó xác định thời gian và lƣợng phân tiêu chảy giữa các nghiệm thức. Kết quả đánh giá đƣợc trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Thời gian và lƣợng phân tiêu chảy ở các nghiệm thức Thời gian gây Lƣợng phân Nhóm Nghiệm thức tiêu chảy (phút) tiêu chảy (g) 1 DMSO 1% 3 ml/kg (đối chứng) 92,67 ± 12,79 0,75 ± 0,22c 2 Loperamide 3 mg/kg 176,00 ± 9,90 0,15 ± 0,07a 3 EEE 1000 mg/kg 170,5 ± 9,19 0,25 ± 0,21ab 4 EEE 500 mg/kg 155,75 ± 9,07 0,28 ± 0,17ab 5 EEE 250 mg/kg 149,25 ± 9,98 0,40 ± 0,14abc 6 EEE 125 mg/kg 122,60 ± 9,71 0,46 ± 0,11abc 7 EEE 63 mg/kg 116,00 ± 9,57 0,58 ± 0,27bc 8 EEE 32 mg/kg 92,80 ± 10,47 0,66 ± 0,18c Dựa vào bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy, có sự khác biệt về lƣợng phân tiêu chảy giữa các nghiệm thức và sự khác biệt trên có ý nghĩa về thống kê (P 0,05). Riêng các EEE ở nồng độ từ 32 mg/kg đến 250 mg/kg và đối chứng đều cho lƣợng phân tiêu chảy là nhƣ nhau (P > 0,05). Từ kết quả trên chúng tôi thấy rằng, tuy EEE ở các nồng độ khác nhau, từ 1000 mg/kg đến 125 mg/kg đều cho lƣợng phân tiêu chảy giống nhƣ Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg. 55
  68. Đồ án tốt nghiệp Sau 4 giờ theo dõi, tiến hành xác định đƣợc thời gian, lƣợng phân tiêu chảy và từ đó xác định tỷ lệ ức chế tiêu chảy ở các nghiệm thức. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.9. Hình 3.9. Thời gian bị tiêu chảy và khả năng ức chế tiêu chảy giữa các nghiệm thức Kết quả khảo sát thời gian tiêu chảy và tỷ lệ ức chế khả năng tiêu chảy của các nghiệm thức đƣợc trình bày ở hình 3.9. Dựa vào kết quả này chúng tôi nhận thấy rằng, thời gian bị tiêu chảy ở chuột tỷ lệ thuận với tỷ lệ ức chế tiêu chảy. Khi đánh giá thời gian chuột bị tiêu chảy giữa các nghiệm thức chúng tôi nhận thấy rằng, nồng độ EEE càng cao thì thời gian chuột bị tiêu chảy càng lâu. Thời gian chuột bị tiêu chảy ở các nghiệm thức bổ sung EEE ở các nồng độ từ 63 mg/kg đến 1000 mg/kg lâu hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (P 0,05), điều này chứng tỏ hiệu quả kéo dài thời gian tiêu chảy của cao EEE ở nồng độ 1000 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg tƣơng đƣơng 56
  69. Đồ án tốt nghiệp với thuốc Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg. Song song đó, tỷ lệ ức chế khả năng tiêu chảy đƣợc đánh giá thông qua lƣợng phân lỏng của các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Ở nghiệm thức cho uống EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg thì tỷ lệ ức chế tiêu chảy ở chuột không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với Loperamide (3 mg/kg), điều này có nghĩa rằng EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg có hiệu quả ức chế sự hình thành tiêu chảy tƣơng đƣơng với thuốc đặc trị là Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg trọng lƣợng chuột. Trong khi đó các nghiệm thức còn lại, mặc dù tỷ lệ ức chế tiêu chảy thấp hơn một cách có ý nghĩa so với Loperamide nhƣng lƣợng phân tiêu chảy ở các nghiệm thức này vẫn cao hơn một cách có ý nghĩa so với đối chứng (P < 0,05). Kết quả cho thấy rằng, các nghiệm thức bổ sung EEE ở các nồng độ khác nhau đều có khả năng kìm hãm sự hình thành tiêu chảy ở chuột nhƣng chỉ có nồng độ 500 mg/kg và 1000 mg/kg của EEE mới có hiệu quả kìm hãm tiêu chảy tƣơng đƣơng với thuốc Loperamide (3 mg/kg). 3.4.2. Kết quả về thử nghiệm enteropooling Sau khi đánh giá các dấu hiệu lâm sàng, tiến hành thử nghiệm enteropooling để đánh giá khả năng kìm hãm sự mất nƣớc ở ruột của EEE. Kết quả đánh giá tỷ lệ ức chế sự mất nƣớc ở ruột trên chuột đƣợc trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Thể tích dịch ruột và tỷ lệ ức chế sự co bóp ở ruột Thể tích Ức chế sự Nhóm Nghiệm thức dịch ruột (ml) mất nƣớc (%) 1 DMSO 1% 3 ml/kg 0,329 ± 0,110c - 2 Loperamide 3 mg/kg 0,087 ± 0,048a 74,660 ± 9,942 3 EEE 1000 mg/kg 0,088 ± 0,047a 74,919 ± 8,077 4 EEE 500 mg/kg 0,108 ± 0,030a 66,529 ± 3,425 5 EEE 250 mg/kg 0,154 ± 0,051ab 52,422 ± 9,390 6 EEE 125 mg/kg 0,200 ± 0,072abc 39,094 ± 9,323 7 EEE 63 mg/kg 0,278 ± 0,107bc 16,995 ± 5,040 57
  70. Đồ án tốt nghiệp 8 EEE 32 mg/kg 0,300 ± 0,106c 9,313 ± 4,952 Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy ở nghiệm thức đối chứng, cho dịch ruột ở dạng lỏng và lƣợng dịch thu đƣợc nhiều nhất, điều này chứng tỏ dầu thầu dầu là một tác nhân gây tiêu chảy thông qua làm tăng lƣợng dịch tiết ra trong ruột. Khi chuột ở các nghiệm thức cho uống Loperamide nồng độ 3 mg/kg và EEE nồng độ 1000 mg/kg sẽ cho dịch trong ruột ở dạng rắn. EEE ở nồng độ 500 mg/kg cho dịch ở trạng thái rắn và bán rắn. Đối với nghiệm thức cho uống EEE ở các nồng độ từ 250 mg/kg đến 32 mg/kg và nghiệm thức đối chứng đều cho dịch trong ruột ở dạng lỏng. Dựa vào bảng 3.3 để đánh giá sự sai khác về lƣợng dịch ruột giữa các nghiệm thức, chúng tôi nhận thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa về thống kê (P 0,05). Khi so sánh với khả năng kìm hãm sự mất nƣớc của đối chứng, EEE ở các nồng độ 125 mg/kg, 63 mg/kg và 32 mg/kg cho khả năng kìm hãm sự mất nƣớc không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Nhƣ vậy, khả năng kìm hãm sự mất nƣớc giữa EEE ở nồng độ 125 mg/kg, 63 mg/kg và 32 mg/kg và đối chứng là nhƣ nhau. Hình 3.10. Khả năng ức chế sự mất nƣớc ở ruột giữa các nghiệm thức 58
  71. Đồ án tốt nghiệp Tỷ lệ ức chế khả năng mất nƣớc ở ruột đƣợc đánh giá thông qua lƣợng dịch trong ruột của các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P 0,05), điều này có nghĩa rằng EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg có hiệu quả ức chế sự mất nƣớc ở ruột tƣơng đƣơng với thuốc đặc trị là Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg trọng lƣợng chuột. Trong khi đó, các nghiệm thức bổ sung EEE ở các nồng độ 250 mg/kg, 125 mg/kg, 63 mg/kg và 32 mg/kg, tỷ lệ ức chế khả năng mất nƣớc ở ruột thấp hơn một cách có ý nghĩa so với Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg (P 0,05). Bên cạnh đó, tỷ lệ ức chế sự mất nƣớc của EEE nồng độ 63 mg/kg và 32 mg/kg là nhƣ nhau về ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Mặc dù khả năng kìm hãm sự mất nƣớc ở ruột của các nghiệm thức bổ sung EEE ở nồng độ 250 mg/kg đến 32 mg/kg thấp hơn so với nghiệm thức bổ sung Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg nhƣng lại cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P < 0,05). 3.4.3. Kết quả về khả năng di chuyển ở ruột non Để đánh giá thời gian di chuyển của than ở ruột của EEE ở các nồng độ khác nhau, dựa vào tốc độ di chuyển của than và kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Chiều dài di chuyển của than và tỷ lệ ức chế sự di chuyển trong ruột Tổng Chiều dài Ức chế sự Nhóm Nghiệm thức chiều dài di chuyển di chuyển ruột (cm) của than (cm) ở ruột (%) 1 DMSO 1% 3 ml/kg (đối chứng) 44,00 ± 11,05 39,25 ± 10,33 10,52 ± 6,97c 2 Loperamide 3 mg/kg 39,58 ± 9,99 13,42 ± 3,71 65,52 ± 8,17a 3 EEE 1000 mg/kg 45,25 ± 9,21 16,17 ± 4,78 64,08 ± 8,18a 59
  72. Đồ án tốt nghiệp 4 EEE 500 mg/kg 43,25 ± 4,63 19,50 ± 6,50 55,14 ± 12,53a 5 EEE 250 mg/kg 32,17 ± 4,31 20,42 ± 5,04 37,06 ± 9,83b 6 EEE 125 mg/kg 44,58 ± 3,96 33,00 ± 6,04 25,77 ± 12,99bc 7 EEE 63 mg/kg 43,08 ± 7,16 34,00 ± 6,76 21,22 ± 7,46bc 8 EEE 32 mg/kg 45,00 ± 4,15 37,58 ± 3,97 16,21 ± 7,95c Dựa vào bảng 3.3 chúng tôi nhận thấy rằng, ở nghiệm thức đối chứng chỉ cho uống DMSO 1% mà chiều dài di chuyển của than trong ruột lớn hơn nhiều so với nghiệm thức xử lý bằng thuốc đặc trị là Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg và EEE ở các nồng độ khác nhau. Điều đó chứng tỏ dầu thầu dầu là một tác nhân có khả năng làm tăng nhanh tốc độ di chuyển trong ruột và có thể sử dụng tác nhân này để khảo sát thời gian di chuyển của than ở ruột non. Hình 3.11. Tỷ lệ kìm hãm sự di chuyển của than giữa các nghiệm thức Để khảo sát khả năng ức chế sự di chuyển ở ruột của các nghiệm thức, chúng tôi dựa vào tốc độ di chuyển của than và kết quả đánh giá đƣợc trình bày ở hình 3.11. Tỷ lệ kìm hãm sự di chuyển của than ở ruột đƣợc đánh giá thông qua chiều dài di chuyển của than giữa các nghiệm thức, kết quả này cho thấy rằng tỷ lệ kìm hãm sự di chuyển của than ở ruột non giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). So với nghiệm thức bổ sung Loperamide với nồng độ 3 mg/kg 60
  73. Đồ án tốt nghiệp trọng lƣợng chuột, tỷ lệ ức chế sự di chuyển trong ruột của chuột ở nghiệm thức 1000 mg/kg và 500 mg/kg không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê (P > 0,05), điều này chứng tỏ cao EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg có hiệu quả kìm hãm sự di chuyển của than hoạt tính tƣơng đƣơng với thuốc Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg. Trong khi đó, các nghiệm thức EEE ở các nồng độ còn lại, tỷ lệ ức chế sự di chuyển của ruột thấp hơn một cách có ý nghĩa so với Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg (P < 0,05). Tỷ lệ ức chế sự di chuyển ở ruột của nghiệm thức bổ sung EEE ở các nồng độ từ 250 mg/kg đến 1000 mg/kg cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (P < 0,05). Riêng nghiệm thức bổ sung EEE với các nồng độ 125 mg/kg, 63 mg/kg, 32 mg/kg và nghiệm thức đối chứng cho tốc độ di chuyển của than trong ruột là nhƣ nhau. Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng, chỉ có EEE ở nồng độ 500 mg/kg và 1000 mg/kg có hiệu quả kìm hãm tốc độ di chuyển trong ruột tƣơng đƣơng với thuốc đặc trị tiêu chảy Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg. Tiêu chảy xảy ra bởi nhiều nguyên nhân khác nhau, có thể do sự ảnh hƣởng của các tác nhân hóa học, các vi sinh vật gây bệnh đƣờng ruột, virus, Các tác nhân tấn công vào niêm mạc ruột gây rối loạn nhu động ruột, từ đó đẩy nhanh thời gian di chuyển ở ruột, làm tăng nhanh khả năng mất nƣớc và dẫn đến tiêu chảy. Bên cạnh đó, để đánh giá đƣợc hiệu quả trị tiêu chảy, chúng tôi phải dựa trên những dấu hiệu lâm sàng hay các thử nghiệm về đánh giá sự ức chế khả năng mất nƣớc và thời gian di chuyển của than trong ruột. Qua đó chúng tôi nhận thấy cơ chế hoạt động của các tác nhân gây tiêu chảy và cơ chế đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy có những điểm tƣơng đồng. Chính vì lý do đó, mà các vi sinh vật nói chung hay dầu thầu dầu nói riêng đƣợc sử dụng làm tác nhân gây tiêu chảy để đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy trên chuột. Khi sử dụng dầu thầu dầu làm tác nhân gây tiêu chảy, ricinoleic acid trong dầu thầu dầu sẽ đƣợc phân giải nhờ enzyme lipase. Một lƣợng lớn ricinoleic acid đƣợc hấp thụ vào ruột giúp hoạt hóa thụ thể prostaglandin ở trên tế bào cơ của ruột, gây co thắt cơ trơn của ruột, dẫn đến làm tăng nhu động ruột và gây tiêu chảy. Sau khi 61