Đồ án Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa phân lập trong nước uống được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh

Nội dung text: Đồ án Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa phân lập trong nước uống được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - THỰC PHẨM - MÔI TRƯỜNG  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘ NHIỄM KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP TRONG NƯỚC UỐNG ĐƯỢC KIỂM NGHIỆM TẠI VIỆN PASTEUR THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. BS. CAO HỮU NGHĨA Họ và tên sinh viên: KHANG BẢO KHÁNH Mã số sinh viên: 1211100099 Lớp: 12DSH02 Thành phố Hồ Chí Minh, 2016
2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là bài báo cáo nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả trong đồ án tốt nghiệp này có được để bàn luận là trung thực, không sao chép đồ án, khóa luận tốt nghiệp khác dưới bất kỳ hình thức nào. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình. Sinh viên thực hiện Khang Bảo Khánh
3. LỜI CẢM ƠN Đồ án tốt nghiệp được hoàn thành với sự giúp đỡ tận tình, quý báu từ các Thầy cô, Anh chị tại Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến: TS. BS. Cao Hữu Nghĩa, Trưởng khoa Xét nghiệm Sinh Học lâm Sàng, Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tâm hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp. Quý Thầy, Cô giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập ở trường. ThS. Nguyễn Thị Nguyệt và ThS. Vũ Lê Ngọc Lan, khoa Xét nghiệm Sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này. Các Cô, các Anh Chị Phòng Vi sinh Nước – Thực phẩm và Phòng Vi sinh Bệnh Phẩm, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã luôn nuôi dạy, yêu thương, động viên và chỗ dựa vững chắc cho tôi. Sinh viên thực hiện Khang Bảo Khánh
4. MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC SƠ ĐỒ, QUY TRÌNH viii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 2.1. Mục tiêu tổng quát 2 2.2. Mục tiêu cụ thể 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tình hình nhiễm khuẩn nước uống 3 1.1.1. Trong nước 3 1.1.2. Thế giới 4 1.2. Tình hình kháng kháng sinh của P. aeruginosa 6 1.2.1. Trong nước 6 1.2.2. Trong nước 7 1.3. Khái quát về Pseudomonas aeruginosa 9 1.3.1. Hình thái và cấu trúc 9 1.3.2. Đặc điểm 9 1.3.3. Khả năng đề kháng 10 1.3.4. Kháng nguyên 11 1.3.5. Các yếu tố độc lực 11 1.3.6. Khả năng gây bệnh 13 1.3.7. Phòng bệnh 14 1.3.8. Điều trị 14 i
5. 1.4. Kháng sinh và cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn 15 1.4.1. Giới thiệu về kháng sinh 15 1.4.2. Cơ chế tác động của kháng sinh 16 1.4.3. Cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn 17 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21 2.2. Đối tượng nghiên cứu 21 2.3. Cỡ mẫu 21 2.4. Thiết bị, hóa chất, môi trường 21 2.4.1. Thiết bị và dụng cụ 22 2.4.2. Hóa chất, môi trường thí nghiệm 23 2.5. Phương pháp thực hiện 21 2.5.1. Nguồn mẫu 25 2.5.2. Đánh giá kết quả 25 2.5.3. Xử lý số liệu 26 2.5.4. Phương pháp định lượng P. aeruginosa trong nước uống 26 2.5.5. Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống 36 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống 36 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong từng loại nước uống 36 3.1.2.1. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong 2 nhóm nước uống 36 3.1.2.2. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các loại nước uống 36 3.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống 36 3.2.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống 36 3.2.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong các loại nước uống 38 3.2.3. Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong các loại nước uống 42 ii
6. 3.4. Thảo luận 43 3.4.1. Tình hình nhiễm P. aeruginosa trong nước uống 45 3.4.2. Tình hình kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI 49 4.1. Kết luận 49 4.1. Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 55 iii
7. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI Brain - heart infusion BYT Bộ Y Tế CFU Colony - Forming Unit CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DNA Deoxyribonucleic acid E.coli Escherichia coli kDa Kilodalton QCVN Quy chuẩn Việt Nam S Susceptible I Intermediate R Resistant ISO International Organization for Standardization MH Mueller Hinton NA Nutrient agar NUĐC Nước uống đóng chai NUCT Nước uống công ty NUTH Nước uống trường học NUGĐ Nước uống gia đình RNA Ribonucleic acid PBP Penicillin binding proteins P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa QCVN Quy chuẩn Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam UV Ultra Violet VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm iv
8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Số mẫu nước uống được phân tích 22 Bảng 2.2: Chỉ tiêu kiểm tra vi sinh vật trong nước uống áp dụng theo QCVN 6-1:2010/BYT 25 Bảng 2.3: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ 29 Bảng 3.1: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống 33 Bảng 3.2: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong 2 nhóm nước uống đóng chai và nhóm nước uống xử lý 34 Bảng 3.3: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các loại nước uống 35 Bảng 3.4: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống 36 Bảng 3.5: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống đóng chai 38 Bảng 3.6: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống công ty 39 Bảng 3.7: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống trường học 40 Bảng 3.8: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống gia đình 41 Bảng 3.9: Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong các loại nước uống 42 Bảng 3.10: So sánh tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống 43 Bảng 3.11: So sánh tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa 2 nhóm nước uống 43 Bảng 3.12: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các loại nước uống 44 Bảng 3.13: So sánh tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống 46 v
9. DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống 33 Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong 2 nhóm nước uống 34 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các loại nước uống 35 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống 37 Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống đóng chai 38 Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống công ty 39 Biểu đồ 3.7: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống trường học 40 Biểu đồ 3.8: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống gia đình 41 vi
10. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Pseudomonas aeruginosa 9 Hình 2.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt phễu lọc 23 Hình 2.2: Tủ ấm 23 Hình 2.3: Đèn UV 24 Hình 2.4: Tủ an toàn sinh học cấp 2 24 Hình 2.5: Đĩa môi trường Mueller Hinton và các đĩa kháng sinh 30 vii
11. DANH MỤC SƠ ĐỒ, QUY TRÌNH Sơ đồ 2.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn P. aeruginosa 27 Sơ đồ 2.2: Quy trình thực hiện kháng sinh đồ 31 viii
12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nước là nguồn tài nguyên vô cùng quan trọng đối với con người và các loài sinh vật trên Trái Đất. Trong điều kiện bình thường, mỗi ngày một người lớn trung bình cần khoảng 2 – 2,5 lít nước và nhu cầu này thay đổi tùy theo nhiệt độ môi trường, mức độ hoạt động thể lực, tình trạng bệnh lý của cơ thể Loại nước cơ thể thường dùng nhất là nước lọc, nước nấu chín. Tuy nhiên tại Việt Nam, trong những năm gần đây, do ảnh hưởng của quá trình biến đổi khí hậu và quá trình công nghiệp hóa, dẫn đến nguồn nước sạch ở nhiều khu dân cư, đô thị, khu công nghiệp, làng nghề bị cạn kiệt và ô nhiễm, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh hoạt và sức khỏe của người dân. Chính vì vậy vấn đề nước uống an toàn ngày càng được chú trọng. Nước uống có thể là nguồn lây nhiễm các loại vi khuẩn gây bệnh ảnh hưởng đến sức khỏe của cộng đồng [25]. Pseudomonas aeruginosa là một trong những vi sinh vật hiện diện trong nước và là tác nhân gây nhiễm trùng cơ hội và gây nhiễm khuẩn bệnh viện [26]. Thêm vào đó, trong những điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ cao, thiếu dinh dưỡng, chúng vẫn có thể sinh sôi và phát triển tốt [25]. Tổng kết xét nghiệm 764 mẫu nước uống tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh trong 2 tháng năm 2012. Trong đó, có 74 mẫu nước uống đóng chai và 690 mẫu nước xử lý dùng để uống. Mẫu nước uống đóng chai có 13/74 mẫu không đạt tiêu chuẩn chất lượng, đặc biệt là các mẫu này đều nhiễm P. aeruginosa và 162/690 mẫu nước xử lý dùng để uống cũng nhiễm vi khuẩn này với tỷ lệ là 23,5% [27]. Việc tìm ra kháng sinh đã làm thay đổi mang tính cách mạng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong những thập kỷ vừa qua đã dẫn đến sự xuất hiện rất nhiều chủng vi khuẩn kháng lại kháng sinh và tạo nên mối đe dọa cho nền y học hiện đại. Hiện nay, vi khuẩn P. aeruginosa chiếm một tỷ lệ không nhỏ trên các bệnh nhiễm trùng đường tiểu, máu, phổi, vết thương, và tỷ lệ tử vong khá cao, có thể lên đến 50% so với các loại vi khuẩn khác [18]. Gần đây, nhiều khảo sát cho thấy tính kháng kháng sinh của vi khuẩn này ngày một gia tăng. P. aeruginosa đã đề kháng cao với các kháng sinh thường dùng ở Việt Nam [6]. Ở nước ta, sự kháng kháng sinh của vi khuẩn trong bệnh phẩm được nghiên cứu khá 1
13. Đồ án tốt nghiệp nhiều nhưng trong nước uống thì vấn đề này vẫn còn hạn chế. Do vậy, việc đánh giá tình hình nhiễm và khả năng kháng thuốc của P. aeruginosa là điều cần thiết, nhằm cung cấp thêm thông tin về vi khuẩn gây bệnh trong nước góp phần định hướng việc sử dụng kháng sinh và hạn chế sự lây lan của vi khuẩn gây bệnh qua nguồn nước uống ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa phân lập trong nước uống được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu tổng quát Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong các mẫu nước uống. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các mẫu nước uống. - Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa phân lập được. 2
14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tình hình nhiễm khuẩn nước uống 1.1.1. Trong nước Tổng kết kiểm tra sản xuất nước uống đóng chai, đóng bình, nước đá trên địa bàn TP. Hồ Chí Minh của Sở Y Tế năm 2009. Trong 610 cơ sở được kiểm tra đã có 360 cơ sở không đạt tiêu chuẩn về sản xuất nước uống, 244 mẫu xét nghiệm có hơn 40% nhiễm vi khuẩn và trong đó có 88 mẫu nhiễm P. aeruginosa, 43 mẫu nhiễm Coliforms, 2 mẫu nhiễm E. coli. Phần lớn các cơ sở sản xuất trong điều kiện tạm bợ, mất vệ sinh, thiết bị xuống cấp, việc bảo quản thành phẩm không hợp vệ sinh [32]. Theo Lê Trương Hằng Hà (2010) [7], trong 200 mẫu nước uống thì tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống đóng chai (23,8%), nước uống công ty (16%), nước uống gia đình (40%), nước uống bệnh viện (20%) và nước uống trường học (6,9%). Vương Xuân Vân và cộng sự (2012) [12], trong 400 mẫu nước uống được kiểm nghiệm thì tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nhóm nước uống đóng chai (28,9%), nước uống trường học (25%), nước uống gia đình (34,7%) và nhóm nước uống công ty (31,9%). Năm 2014, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm Quảng Ngãi cho biết: sau khi lấy 30 mẫu nước uống đóng chai ngẫu nhiên ở nhiều địa phương trên địa bàn tỉnh kiểm nghiệm, kết quả cho thấy có đến 60% trong tổng số mẫu này có chứa trực khuẩn mủ xanh. Vào năm 2015, sở Khoa học - Công nghệ tỉnh Nghệ An cho biết đã gửi 37 mẫu nước đóng chai đi xét nghiệm tại Viện Vệ sinh An toàn thực phẩm (Bộ Y tế). Qua xét nghiệm, 21/37 mẫu nước đóng chai không đạt chất lượng. Đáng nói hơn, có nhiều mẫu nước chứa trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa). Đây là loại vi khuẩn gây biến chứng nguy hiểm cho người, kháng thuốc đối với nhiều kháng sinh, có thể gây viêm màng tim, viêm đường hô hấp, viêm phổi [29]. Năm 2015, tại Quảng Trị, nước uống đóng chai bị nhiễm P. aeruginosa có tỷ lệ khá cao so với một số địa phương khác trong cả nước. Kết quả hậu kiểm cho thấy, trong năm 2011 có 13/56 mẫu nước uống đóng chai bị nhiễm P. aeruginosa, chiếm tỷ lệ 23,21%; năm 2012, có đến 26,32% mẫu nước nhiễm P. aeruginosa (15/57), năm 2013 tỷ lệ này chỉ có 13,33% (8/60) và năm 2014 tỷ lệ nước uống đóng chai bị nhiễm 3
15. Đồ án tốt nghiệp P. aeruginosa vẫn còn rất cao 22,22% (14/63). Trong đó thành phố Hồ Chí Minh là 17,6%, tiếp đó là Hà Nam 5,3% và Bình Định 2% mẫu bị nhiễm P. aeruginosa [28]. 1.1.2. Thế giới Benoit Lévesque (1994), so sánh chất lượng vi sinh nước máy và nước từ máy làm lạnh nước uống tại khu dân cư và khu văn phòng, cho kết quả 36% và 28% các mẫu nước từ khu dân cư và khu làm việc đều bị nhiễm ít nhất một Coliform hoặc một chỉ tiêu vi sinh (Coliform fecal và Streptococcus fecalis) hoặc/và một chỉ tiêu vi khuẩn gây bệnh (Staphylococcus aureus, P. aeruginosa, Aeromonas spp). Tỷ lệ nhiễm khuẩn của nước máy thấp hơn rất nhiều so với nước lấy từ máy làm lạnh nước uống. Điều này có thể do các bình làm lạnh nước uống không được vệ sinh sạch sẽ là nơi ẩn trú các vi sinh vật gây bệnh [14]. Rusin PA (1997), giám sát bệnh lây lan qua đường uống và sự bùng phát bệnh liên quan đến nước uống và nước không dùng để uống thì vi sinh vật gây bệnh trong nước uống chủ yếu gồm 3 loại vi khuẩn Gram âm đó là P. aeruginosa, Acinetobacte, Xanthomonas maltophilia với tỷ lệ như sau: P. aeruginosa, < 1%-24%; Acinetobacter, 5%-38%; X. maltophilia, < 1%-2%; Aeromonas, 1%-27. Theo đó, nước uống cũng là nguồn lây nhiễm các loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ cộng đồng [25]. Bharath J. (2003), khảo sát chất lượng nước uống đóng chai nội và ngoại nhập ở Trinidad nhận thấy sự hiện diện của Coliforms tổng số trong các sản phẩm nội địa là 6,9% so với sản phẩm nhập khẩu là 0%. Tương tự như vậy, tổng vi khuẩn hiếu khí trong nước uống đóng chai nội địa cao hơn nhiều so với hàng nhập khẩu (33,6% so với 14,8%). Đối với Pseudomonas sp tỷ lệ nhiễm là 7,6% nhưng tất cả đều âm tính với Coliform fecal và Salmonella spp Như vậy trên cơ sở không có sự hiện diện của Coliform fecal và Salmonella trong nước uống thì 5% nước uống đóng chai (nội và ngoại nhập) bán trên thị trường không đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng [16]. Baumgartner A (2006), đánh giá tình trạng vệ sinh của các loại nước uống: đối với nước uống đóng chai bao gồm nước tinh khiết và nước khoáng từ các máy làm lạnh thì tổng số vi sinh vật hiếu khí ở nước nguồn cao hơn từ các máy làm lạnh. Tuy vậy, P. aeruginosa được tìm thấy trong nước nguồn với tỷ lệ 25% và tần số xuất hiện 4
16. Đồ án tốt nghiệp tương tự như trong các máy làm lạnh, tỷ lệ là 24,1%. Kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh các chủng P. aeruginosa tìm thấy trên cả nước nguồn và nước từ máy làm lạnh là như nhau, chứng tỏ một chủng đơn bắt nguồn từ nước uống đóng chai hơn là xung quanh máy làm lạnh. Cho thấy sự nhiễm này bắt nguồn từ nhà sản xuất [15]. Mohammadi Kouchesfahani M và cộng sự (2015), trong 120 mẫu nước uống thì tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa là 36,7% (44 mẫu) và heterotrophic bacteria là 32,5% (39 mẫu) [23]. 5
17. Đồ án tốt nghiệp 1.2. Tình hình kháng kháng sinh của P. aeruginosa 1.2.1. Trong nước Ở Việt Nam, nghiên cứu ở 36 bệnh viện các tỉnh phía Bắc năm 2006 – 2007 bao gồm 2 bệnh viện Trung ương, 17 bệnh viện tuyến tỉnh, 17 bệnh viện tuyến huyện cho thấy 553/7571 (7,8%) bệnh nhân bị nhiễm trùng mắc phải tại bệnh viện trong đó Pseudomonas aeruginosa (31,5%). Theo kết quả nghiên cứu từ 4 bệnh viện tại Hà Nội: Việt Đức, Xanh Pôn, Bệnh viện 108 và Bệnh viện 103 từ năm 2005 – 2008 cho thấy P. aeruginosa phân lập từ các bệnh phẩm đề kháng rất cao với các loại kháng sinh như Tetracycline (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) và Gentamicin (54%) [30]. Qua luận văn của Nguyễn Hoàng Thu Trang (2007), tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống đóng chai cho thấy: đa số nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm, có một số kháng sinh bị đề kháng với tỷ lệ thấp như Cefulodin, Tobramycin, Amikacin, Aztreonam nhưng riêng Fosfomycin với tỷ lệ đề kháng lên đến 50% [8]. Vi khuẩn phân lập từ nước uống công ty đề kháng với Fosfomycin lên đến 44% còn nước uống gia đình, ngoại trừ Fosfomycin bị đề kháng tới 33% còn các kháng sinh còn lại khác đều nhạy cảm. Nước uống trường học chỉ có 1 mẫu tìm thấy vi khuẩn P. aeruginosa và kết quả kháng sinh đồ cho thấy chủng này nhạy cảm với tất cả các kháng sinh dùng làm thử nghiệm. Nước bệnh viện không tìm thấy P. aeruginosa trong các mẫu khảo sát [8]. Theo Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện ở Việt Nam năm 2008 – 2009, tỷ lệ P. aeruginosa kháng cao nhất với Ceftazidime (80%), Ciprofloxacin (60%) và Imipenem (43%) [1]. Theo Vương Xuân Vân và cộng sự (2012), phân tích 400 mẫu nước các loại thì 30,25% mẫu nhiễm P. aeruginosa. Hầu hết các chủng P. aeruginosa đều nhạy cảm với các loại kháng sinh thử nghiệm. Ngoại trừ Fosfomycin và Aztreonam bị kháng khá nhiều với tỷ lệ lần lượt là 12,5% - 21,4% và 20%, Sulfamides cũng bị kháng nhưng với tỷ lệ không đáng kể 4,2% [12]. Còn theo kết quả nghiên cứu của Hoàng Doãn Cảnh và cộng sự (2014) [4], các chủng P. aeruginosa được phân lập từ 28 mẫu bệnh phẩm đã kháng tất cả với các 6
18. Đồ án tốt nghiệp loại kháng sinh. Mức độ kháng với các kháng sinh: Amikacin 42,9%, Aztreonam 36%, Colistin 10,7%, Cefepime 45,8%, Cefsulodin 62,5%, Cefoperazone 54,2%, Ciprofloxacin 48,2%, Gentamicin 55,6%, Imipenem 46,2%, Piperacillin 60,7%, Sulfamides 64%, Tobramycin và Ticarcillin/a. clavulanic đều là 54,2%. 1.2.2. Thế giới A. Lateef (2005) [22], khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P. aeruginosa được tìm thấy trong các mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông, nước giếng và nước máy). Kết quả: 3,46% P. aeruginosa phân lập từ đất đề kháng với 5 loại kháng sinh. Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng sinh, 30,77% đề kháng 7 loại kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng sinh (Ampicillin, Chloramphenicol, Cloxacillin, Erythromycin, Penicillin, Tetracycline, Streptomycin, Gentamicin). Trong dược phẩm, loại vi khuẩn này cũng có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh từ 2, 4 đến 8 loại kháng sinh khác nhau (Augmentin, Amoxycillin, Tetracycline, Cotrimoxazole, Nalidixic acid, Ofloxacin, Nitrofurantoin). Trong nước uống, 6,7% P. aeruginosa kháng lại 4 loại kháng sinh, 8,5% kháng với 5 loại kháng sinh (Augmentin, Amoxycillin, Tetracycline, Cloxacillin, Cotrimoxazole) [22]. Jonathan K. Lutz, Jiyoung Lee (2011) [20], 23 chủng P. aeruginosa phân lập được từ 108 mẫu nước hồ bơi, thì có tỷ lệ kháng với Aztreonam (22%), Imipenem (26%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (13%) và Ceftriaxone (4%). Theo Ghazi M. Al Maliki (2012) [19], các chủng P. aeruginosa phân lập được từ 40 mẫu nước uống thì có tỷ lệ kháng khá cao với Nalidixic acid (87,98 %) sau đó là Tetracycline (77,9%), Ampicillin (68,82 %), Novobiocin (66,63%), Ceftazidime (63,56%), Erythromycin (61,91%) và Streptomycin (57,41%). Ayodele T. Adesoji và cộng sự (2015) [13], P. aeruginosa phân lập từ trong nước có tỷ lệ kháng khá cao với các kháng sinh như Florfenicol (63,6%), Tetracycline (59,1%), Streptomycin (54,6%), Ceftiofur (59,1%), Amoxicillin/clavulanic acid (81,8%) và Sulfamethoxazole (77,3%) tiếp theo là Chloramphenicol (40,9%), Gentamicin (31,8%), Kanamycin (31,8%), cuối cùng là Nalidixic acid (22,7 %). 7
19. Đồ án tốt nghiệp Còn theo Clemens Kittinger và cộng sự (2016) [17], kiểm tra các mẫu nước sông cho thấy các chủng Pseudomonas spp phân lập được có tỷ lệ kháng kháng sinh lần lượt là Meropenem (30,4%), Piperacilin/tazobactam (10,6%), Ceftazidime (4,2%), Imipenem (2,1%), Cefepime (0,8%), Levofloxacin (1,2%), Ciprofloxacin (3,4%). Ngoài ra, có 9,4% chủng Pseudomonas spp kháng 2 loại kháng sinh, 2,3% chủng kháng 3 loại kháng sinh, 0,6% và 0,2% chủng kháng lần lượt 4 và 5 loại kháng sinh. 8
20. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Khái quát về Pseudomonas aeruginosa 1.3.1. Hình thái và cấu trúc Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Chi: Pseudomonas Loài: aeruginosa Hình 1.1: Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa (hay còn được gọi là trực khuẩn mủ xanh), là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình dạng thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, 2 đầu tròn, kích thước 0,5-1 µm x 1,5-5 µm. Có một lông duy nhất ở 1 cực, là nơi tiếp nhận nhiều loại thực khuẩn thể (phage) ngoài ra còn giúp vi khuẩn gắn vào bề mặt của tế bào vật chủ. Vi khuẩn P. aeruginosa là loài không sinh bào tử [9]. 1.3.2. Đặc điểm ❖ Tính chất nuôi cấy Vi khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, điều kiện hiếu khí tuyệt đối. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 37oC, phát triển được trong khoảng nhiệt độ 5oC - 42oC, pH thích hợp là 7,2 - 7,5 (có thể chịu được pH từ 4,5 - 9) [5]. Trên môi trường đặc thường có 2 loại khuẩn lạc: một loại to, dẹt, nhẵn, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi. Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng có màu xanh ở trên mặt môi trường, môi trường đục [5]. ❖ Phân bố P. aeruginosa phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, trên bề mặt động thực vật, đặc biệt là những nơi môi trường ẩm ướt chúng sinh sôi và phát triển rất mạnh. Trong tự nhiên người ta tìm thấy chúng trên bề mặt nhiều loại rau quả, trên cơ thể và phân một số động vật. Trong cơ thể người, P. aeruginosa hiện diện thường xuyên trong đường tiêu hóa và một số nơi ẩm ướt trong cơ thể như da, niêm mạc, vùng dưới cánh tay, [5]. Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh trưởng trong các môi 9
21. Đồ án tốt nghiệp trường hạn chế sự có mặt của các vi sinh vật khác như chất khử trùng, thuốc mỡ, xà phòng, nước cất, Kể cả trong bệnh viện (người ta còn phát hiện vi khuẩn P. aeruginosa trong các thiết bị, dụng cụ y tế như chụp thở oxy, ống thông tiểu ) [9]. ❖ Sắc tố Tính chất đặc trưng của loại vi khuẩn này là sinh sắc tố và chất thơm. Có 2 loại sắc tố chính: pyocyanin có màu xanh lam tan trong nước và chloroform, làm cho môi trường nuôi cấy và khuẩn lạc có màu xanh; pyoverdin là sắc tố phát huỳnh quang tan trong nước nhưng không tan trong chloroform [5]. Chất thơm do vi khuẩn sinh ra là Kimetylamin [18]. Có khoảng 10% P. aeruginosa không sinh sắc tố. Trong những trường hợp này chẩn đoán vi khuẩn học gặp nhiều khó khăn. Người ta phải dùng các môi trường tăng sinh sắc tố: môi trường King A (tăng sinh pyocyanin) và môi trường King B (tăng sinh pyoverdins). Ngoài ra, còn có các loại sắc tố được tổng hợp bởi P. aeruginosa như pyorubin (màu đỏ đậm), pyomelanin (màu nâu đen) [11]. ❖ Đặc điểm sinh hóa P. aeruginosa có đủ các cytochrom (b, c, a và oxidase) trong hệ thống vận chuyển điện tử. Trong thực hành người ta thường dùng “oxidase test” để tìm sự có mặt của cytochrom oxidase. Các tính chất sinh hóa thường sử dụng trong lâm sàng gồm: Urease (-), - Indol (-), H2S (-); Citrat Simmon, Agrinin dihydrolase và Gelatinase (+); khử NO3 thành N2. Trên môi trường OF (Oxidation-Fermentation) nhiều loại carbohydrate bị thoái hóa theo lối oxy hóa có sinh acid: glucose, mannitol, glycerol, ethalnol, arabinose, fructose và galactose [11] 1.3.3. Khả năng đề kháng Chết nhanh chóng ở 100oC; trong môi trường ẩm, thoáng và không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng tối thiểu; ở nhiệt độ 5oC, chúng sống được hơn 6 tháng [11]. 10
22. Đồ án tốt nghiệp 1.3.4. Kháng nguyên Kháng nguyên liên kết với tế bào: - Kháng nguyên O: là kháng nguyên chịu nhiệt, bản chất hóa học là lipopolysaccharid (LPS), dựa vào kháng nguyên này người ta chia P. aeruginosa thành 12 nhóm. Kháng nguyên O được nghiên cứu nhiều và được sử dụng để kích thích miễn dịch bảo vệ chống lại P. aeruginosa. - Kháng nguyên H: là kháng nguyên không chịu nhiệt, là các protein nằm trong lông của vi khuẩn. Vì khó khăn trong việc điều chế, nên việc định type huyết thanh dựa trên kháng nguyên này chưa được áp dụng rộng rãi. - Protein màng ngoài: các protein ở màng ngoài tế bào có thể kết hợp với LPS tạo thành những thụ thể đặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh. - Polysaccharide ngoại tiết: có 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những chủng P. aeruginosa có khuẩn lạc dạng M và dạng R. Các kháng nguyên ngoại bào: vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hoá trong môi trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ) là những yếu tố độc lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch [5]. 1.3.5. Các yếu tố độc lực P. aeruginosa là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội. Độc tố của P. aeruginosa chỉ có tác động gây chết khi chúng được tạo ra với số lượng lớn. Tuy nhiên, loài vi khuẩn này có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập, lan truyền và gây bệnh [31]: - Nội độc tố (endotoxin): là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm nhiệm. LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết. - Ngoại độc tố (exotoxin A): bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa. Exotoxin A hoạt động tượng tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu. Với khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của P. aeruginosa. Exotoxin A gây rối 11
23. Đồ án tốt nghiệp loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan. 90% số chủng P. aeruginosa sản xuất exotoxin A nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng. - Các enzyme ngoại tiết: vi khuẩn có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại tiết, các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập, gây bệnh tại chỗ: + Protease: gần 90% các chủng P. aeruginosa có khả năng phân giải protein. P. aeruginosa tiết ra 2 loại protease quan trọng là alcaline và elastase. Nhiều chủng tiết ra collagenase. Các protease này thường có tác dụng hiệp đồng. Elastase có thể phá hủy lớp chun keo thành mạch máu gây tổn thương xuất huyết, tạo nên những ổ hoại tử trong thành mạch máu. Enzyme này còn gây ức chế hiện tượng opsonin hoá, làm giảm khả năng thực bào của bạch cầu đa nhân trung tính. Ngoài tác động trực tiếp, các protease còn có khả năng làm thay đổi sức đề kháng của vật chủ thông qua việc bất hoạt bổ thể, phá hủy cấu trúc của các globulin miễn dịch. + Hemolysine có 2 loại: • Glycolipid (hemolysine chịu nhiệt): không có tính enzyme, không có tính kháng nguyên và ít độc. Glycolipid đóng vai trò như một chất tẩy hoà tan các lipid là những chất cần cho hoạt động của phospholipase C. • Phospholipase C (hemolysine không chịu nhiệt): là một enzyme tan máu nằm trong một polypeptid đơn. Phospholipase C thường tác động hiệp đồng với glycolipid và protease alcaline gây xuất huyết, hoại tử tại chỗ tổn thương. + Cytotoxine (leukocidin): là một protein rất độc với bạch cầu đa nhân trung tính và các tế bào lympho. + Exoenzyme S: là một protein, có thể có 2 dạng: dạng không hoạt động và không có tính enzyme và dạng hoạt động, có tính enzyme. + Enterotoxin và yếu tố thấm qua thành mạch: các độc tố này còn ít được biết đến. Một số nghiên cứu đã chứng minh, trong thực nghiệm enterotoxin gây nên tình trạng ứ dịch trong đường ruột; độc tố này có thể là một trong những nguyên nhân gây 12
24. Đồ án tốt nghiệp viêm ruột non. Khi gây nhiễm qua da, yếu tố này có thể thấm vào trong lòng mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất huyết ra ngoài lòng mạch. - Glycocalyx - capsule: ngoài chức năng bảo vệ vi khuẩn chống các yếu tố có hại cho chúng từ vật chủ như thực bào, kháng thể, bổ thể, kháng sinh, giúp cho quá trình nhân lên của vi khuẩn trong các mô còn thực hiện chức năng bám vào tế bào. - Lông: vai trò của lông trong sinh bệnh học nhiễm P. aeruginosa còn chưa rõ ràng. - Pili: giúp cho vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô của vật chủ. 1.3.6. Khả năng gây bệnh P. aeruginosa là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mạn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc sử dụng kháng sinh tùy tiện, việc sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc các vết bỏng, vết thương hở, Chúng có thể gây ra nhiêu bệnh khác nhau: gây viêm màng trong tim, viêm đường hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu, viêm màng não mủ và áp xe não, viêm tủy xương, viêm tai, gây bệnh hóa sừng ở mắt, nhiễm trùng da, mô mềm, [5]. P. aeruginosa xâm nhiễm vào trong mắt thường gây ra những tổn thương giác mạc, sự nhiễm này thường liên quan đến việc sử dụng kính sát tròng. Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu tại Viện Mắt trong vòng khoảng 20 nǎm trở lại đây, P. aeruginosa đã vượt lên với trên 70% các trường hợp xét nghiệm vi khuẩn dương tính trong viêm loét giác mạc do vi khuẩn [5]. Hiện nay, vi khuẩn này là nguyên nhân hàng đầu gây viêm loét giác mạc sau chấn thương nông nghiệp. Các bệnh nhân nằm viện bị mắc các chứng bệnh về tim mạch, tiểu đường hay bị các u ác tính bị sốc do nhiễm trùng máu thường có tỷ lệ tử vong khá cao. Tác nhân thường gặp là P. aeruginosa chiếm từ 5% đến 50% so với các tác nhân vi khuẩn khác [5]. P. aeruginosa dẫn đầu trong các tác nhân nhiễm trùng hô hấp bệnh viện, đặc biệt đối với những bệnh nhân có hỗ trợ các máy thông khí, khả năng bị viêm phổi cao 13
25. Đồ án tốt nghiệp gấp 20 lần và tỷ lệ tử vong cao. Một số nghiên cứu còn cho thấy P. aeruginosa giữ vai trò gây bệnh trong giai đoạn đầu và cuối của bệnh đái tháo đường [6]. Loài này còn là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại kháng sinh. Tính kháng thuốc thường được quy định bởi các plasmid và các yếu tố di truyền này có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng biến nạp và tải nạp tạo ra những dạng đột biến kháng thuốc mới. P. aeruginosa hiện kháng với rất nhiều loại kháng sinh nên việc làm kháng sinh đồ trước khi điều trị là cần thiết [5]. 1.3.7. Phòng bệnh Phòng không đặc hiệu: giữ gìn vệ sinh môi trường trong và ngoài bệnh viện, thực hiện nghiêm túc các quy trình khử trùng, tiệt trùng, thực hiện đúng các thao tác vô trùng để tránh lây chéo trong bệnh viện. Giữ gìn vệ sinh cá nhân (bệnh nhân, người nhà bệnh nhân, nhân viên y tế), tăng cường sức đề kháng chung, tránh lạm dụng thuốc kháng sinh và các thuốc gây suy giảm miễn dịch. Phòng bệnh đặc hiệu: một số nước trên thế giới đã chế vaccine phòng bệnh đặc hiệu để dùng cho bệnh nhân bỏng, chấn thương hở, những bệnh nhân chuẩn bị phẫu thuật [31]. 1.3.8. Điều trị Nhất thiết phải làm kháng sinh đồ để lựa chọn thuốc điều trị. Trong thực tế thường sử dụng kết hợp một penicillin có hoạt tính chống P. aeruginosa (ticarcillin, piperacillin, mezlocillin) với kháng sinh nhóm aminoglycoside (tobramicin, amikacin). Hoặc có thể dùng các kháng sinh như: ceftazidim, imipenem và các quinolon mới (nofloxacin, ciprofloxacin) để điều trị. Có thể kết hợp dùng kháng sinh toàn thân với việc sử dụng tại chỗ các thuốc kháng khuẩn đông nam dược. Sử dụng huyết thanh và globulin miễn dịch kháng P. aeruginosa kết hợp với kháng sinh để điều trị cũng là một xu hướng mới và có nhiều triển vọng [31]. 14
26. Đồ án tốt nghiệp 1.4. Kháng sinh và cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn 1.4.1. Giới thiệu về kháng sinh ❖ Khái niệm Kỷ nguyên hiện đại của hóa trị liệu kháng khuẩn được bắt đầu từ việc tìm ra sulfonamid (Domagk, 1936) “Thời kỳ vàng son” của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng trong lâm sàng (1941). Khi đó, “kháng sinh được xem là những chất do vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn khác” [5]. Về sau, với sự phát triển của khoa học, người ta đã có thể [2]: - Tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (cloramphenicol). - Tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon. - Chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin). ❖ Phân loại Các kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học [2], từ đó chúng có chung một cơ chế tác động và phổ kháng khuẩn tương tự. Mặt khác, trong cùng một họ kháng sinh, tính chất dược động học và sự dung nạp thường khác nhau cũng như đặc điểm về phổ kháng khuẩn cũng không phải giống nhau hoàn toàn, vì vậy cần phân biệt các kháng sinh trong cùng một họ. Dựa trên cấu trúc hóa học, người ta có thể xếp kháng sinh theo các nhóm như: • Nhóm β-lactam: penicillin, ampicillin, cephalosporin, • Nhóm tetracyclines: tetracyclin, oxytetracyclin, • Nhóm phenicol: chloramphenicol, thamphenicol, • Nhóm aminoglycosides: gentamycin, kanamycin, amikacin , • Nhóm macrolides: tylosin, spiramycin, • Nhóm kháng sinh với macrolides: lycomycin, virginiamycin, • Nhóm polypeptid: colistin, bacitracin, polymycin, • Nhóm sulfamides: sulfamethoxazol, sulfadimidin, • Nhóm quinolones: oxfloxacin, ciprofloxacin, • Ngoài ra còn có một số nhóm khác như glycopeptid, nitrofuran, 15
27. Đồ án tốt nghiệp Bên cạnh việc phân loại theo cấu trúc hóa học, ta cũng có thể phân loại kháng sinh theo tác động kháng khuẩn: • Nhóm kháng sinh tác động ức chế: tetracylin, macrolid, phenicol, sulfamid, • Nhóm kháng sinh tác động tiêu diệt: β-lactam, amynosid, quynolones, polypeptid, 1.4.2. Cơ chế tác động của kháng sinh Tác động của kháng sinh lên vi sinh vật gồm 5 cơ chế [3]: ❖ Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: Vách tế bào của vi khuẩn (đặc biệt là các vi khuẩn Gram dương) được cấu tạo bởi các phức hợp peptidoglycan, phức hợp này được trùng hợp bởi các enzyme transpeptidases. Các kháng sinh nhóm β - lactam gắn chọn lọc vào các enzyme transpeptidase này làm cho vách tế bào của vi khuẩn bị tan rã khiến vi khuẩn bị tiêu diệt. ❖ Gây rối loạn chức năng của màng sinh chất: Chức năng đặc biệt quan trọng của màng bào tương là thẩm thấu chọn lọc; khi bị rối loạn các thành phần bên trong tế bào bị thoát ra ngoài và nước từ bên ngoài ào ạt vào trong, dẫn tới chết, ví dụ polymyxin B, colistin. Với cơ chế tác động này, polymyxin có tác dụng diệt khuẩn tuyệt đối, tức là giết cả tế bào đang nhân lên và cả tế bào ở trạng thái nghỉ – không nhân lên. ❖ Ức chế sinh tổng hợp protein: Tham gia sinh tổng hợp protein ngoài ribosome còn có các RNA thông tin và các RNA vận chuyển. Điểm tác động là ribosome 70S (gồm 2 tiểu phần là 30S và 50S). Kết quả là các phân tử protein không được hình thành hoặc được tổng hợp nhưng không có hoạt tính sinh học làm ngừng trệ quá trình sinh trưởng và phát triển. ❖ Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic: - Ngăn cản sự sao chép của DNA mẹ tạo DNA con, ví dụ do kháng sinh gắn vào enzyme gyrase làm DNA không mở được vòng xoắn, như nhóm quinolon. 16
28. Đồ án tốt nghiệp - Ngăn cản sinh tổng hợp RNA, ví dụ do gắn vào enzyme RNA-polymerase như rifampicin. ❖ Ức chế tổng hợp acid folic: Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa cần thiết cho tế bào: quá trình sinh tổng hợp acid folic, co-enzyme cần cho quá trình tổng hợp các purin & pyrimidin (và một số acid amin) bị ngăn cản bởi sulfamid và trimethoprim. 1.4.3. Cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn Hiện tượng kháng kháng sinh xảy ra khi mầm bệnh hay vi khuẩn không bị tiêu diệt triệt để bởi thuốc kháng sinh, chúng vẫn còn tồn tại, sinh sản ra các thế hệ con cháu không có tính cảm ứng với một hay nhiều loại thuốc kháng sinh nào đó [5]. P. aeruginosa rất dễ đề kháng với nhiều loại kháng sinh, vì vậy nó rất nguy hiểm. Loại vi khuẩn này có khả năng kháng thuốc tự nhiên do có hàng rào ngăn cản tính thấm ở màng ngoài lipopolysaccharide. Đồng thời các nghiên cứu còn cho thấy Pseudomonas còn mang các plasmid kháng kháng sinh và các yếu tố di truyền này có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng tải nạp, giao nạp tạo ra những dạng đột biến kháng thuốc mới [5]. Có 2 dạng đề kháng: đề kháng giả và đề kháng thật [3] ❖ Đề kháng giả - Khi hệ thống miễn dịch của cơ thể suy giảm (do dùng corticoid, tia xạ, ) hoặc chức năng của đại thực bào bị hạn chế (ví dụ ở ổ mủ), thì cơ thể không đủ khả năng loại trừ được những vi khuẩn đã bị kháng sinh ức chế ra khỏi cơ thể. - Khi vi khuẩn tự đề kháng: Ở trạng thái nghỉ (không nhân lên, không chuyển hóa do thiếu oxy, pH thay đổi ), vi khuẩn không chịu tác dụng của kháng sinh. - Khi có vật cản, hệ tuần hoàn ứ trệ, kháng sinh không thấm tới ổ viêm thì vi khuẩn cũng đề kháng. ❖ Đề kháng thật Đề kháng tự nhiên: Một số loại vi khuẩn luôn luôn không chịu tác dụng của một số kháng sinh. Ví dụ P. aeruginosa kháng với penicillin G, tụ cầu không chịu tác dụng của colistin. Một số vi sinh vật không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng 17
29. Đồ án tốt nghiệp của các kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách như penicillin, cephalosporin, vancomycin. Đề kháng thu được: Do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gene đề kháng. • Đột biến gene: Biến cố này có thể xảy ra trước hoặc sau khi tiếp xúc với kháng sinh. - Đột biến một bước: Mức độ đề kháng không phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh được tiếp xúc; có thể chỉ sau một lần đột biến, vi khuẩn đã đề kháng rất cao. - Đột biến nhiều bước: Mức độ đề kháng có liên quan đến mức độ kháng sinh. Trong trường hợp này, kháng sinh là nhân tố chọn lọc giữ lại những cá thể đột biến, cho nên ở lần đột biến sau thì nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sẽ cao hơn lần trước. Gene đề kháng sau khi xuất hiện sẽ lan truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn. • Nhận gene đề kháng: Gene đề kháng có thể lan truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua các hình thức vận chuyển chất liệu di truyền như sau: - Tiếp hợp: Hai vi khuẩn tiếp xúc nhau và truyền cho nhau gene đề kháng. - Biến nạp: Khi vi khuẩn đề kháng bị ly giải, giải phóng các đoạn DNA tự do và những đoạn này xâm nhập vào tế bào vi khuẩn khác. - Tải nạp: Phage mang gene đề kháng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. ❖ Cơ chế của sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn • Ức chế bằng enzyme Vi khuẩn sản xuất ra enzyme gây phân hủy hoặc làm bất hoạt kháng sinh. Sự sản xuất enzyme có thể được cảm ứng bới một yếu tố bên ngoài (một kháng sinh khác) hoặc bất biến (không bị ảnh hưởng bởi kích thích bên ngoài). Ví dụ điển hình là sinh enzyme beta-lactamase phá hủy vòng beta-lactam của các nhóm Penicillines hoặc Cephalosporines. Các enzyme beta-lactamase do vi khuẩn sinh ra và lây truyền theo đường nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Trong số các vi khuẩn Gram dương, tụ cầu vàng: Staphylococccus aureus và các cầu khuẩn Gram dương đường ruột là các tác nhân gây bệnh thường hay sinh enzyme beta-lactamase lây truyền qua plasmid nhất. 18
30. Đồ án tốt nghiệp • Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn Vi khuẩn là các vi sinh vật đơn bào: màng tế bào chất phân cách tế bào chất với môi trường bên ngoài. Các vi khuẩn Gram âm còn có thêm một màng bao bên ngoài, gọi là màng ngoài, có tác dụng như một hàng rào che chở cho các thành phần vật chất nằm ở bên trong. Chất dinh dưỡng và kháng sinh phải đi ngang qua màng này để thấm vào bên trong tế bào vi khuẩn, theo cách thức khuyến tán thụ động ngang qua các kênh (lỗ nhỏ). Sự giảm tính thấm của màng ngoài, làm giảm lượng kháng sinh đi vào bên trong đến đích tác dụng, nguyên nhân do biến đổi tính thấm lớp màng bên trong hoặc bên ngoài vi khuẩn. Dạng đề kháng này nói chung xảy ra đối với nhiều kháng sinh của nhiều nhóm khác nhau, do có khi các kháng sinh khác nhau nhưng có thể dùng chung một loại lỗ. Mặt khác, sự đề kháng này là đặc hiệu khi một kháng sinh chỉ dùng riêng một loại lỗ. Ví dụ về sự đề kháng của Pseudomonas aeruginosa với imipenem là sự đề kháng đặc hiệu gây ra do mất đi các lỗ riêng dành cho các Carbapeneme. • Biến đổi vị trí gắn kết Hiện tượng này là do nhiễm sắc thể hoặc plasmid, theo cơ chế làm giảm độ ái lực của kháng sinh tại vị trí tác dụng. Ví dụ: - Biến đổi các protein liên kết với Penicillin (PBP): Giảm ái lực của các PBP với các thuốc nhóm beta-lactamase có thể do đột biến gene ở nhiễm sắc thể, hoặc do mắc phải gene bên ngoài có các PBP mới. Cơ chế này thường gặp với các cầu khuẩn Gram dương, như Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumonia, nhưng rất hiếm gặp ở vi khuẩn Gram âm. - Biến đổi vị trí gắn kết ở ribosome : Biến đổi bên trong tế bào vi khuẩn ở tiểu đơn vị ribosome đích có thể làm giảm hoạt tính của kháng sinh. Sự biến đổi này làm cho kháng sinh không đủ khả năng ức chế tổng hợp protein cũng như sự tăng trưởng của vi khuẩn, do không thể gắn kết vào vị trí tác dụng ở ribosome. - Biến đổi enzyme DNA-gyrase và enzyme topoisomerase: DNA-gyrase là enzyme cần thiết cho hoạt tính của các Quinolone. Sự đột biến nhất thời ở độc nhất một acid amine của DNA-gyrase gây ra đề kháng. 19
31. Đồ án tốt nghiệp - Biến đổi các enzyme đích: Sự biến đổi của enzyme dihydropteroate synthetase kháng lại sự gắn kết với Sulfamide và của enzyme dihydropteroate reductase làm mất nhạy cảm với Trimetoprime đồng thời gây ra kháng kháng sinh. • Bơm đẩy Kháng sinh không thể đạt đến vị trí tác dụng do bơm đẩy chủ động đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn. Các chất vận chuyển đẩy kháng sinh ra là các thành phần bình thường của tế bào vi khuẩn và góp phần lớn cho tính đề kháng nội sinh của vi khuẩn chống lại nhiều kháng sinh. Các bơm này cần năng lượng. Việc tiếp xúc với kháng sinh làm thuận lợi cho việc tăng số lượng bơm do đột biến các chất mang, làm tăng mạnh tính đề kháng của vi khuẩn. Ví dụ, Ciprofloxacine có thể làm thuận lợi việc phát tán đề kháng với Cephalosporine theo cơ chế bơm đẩy. Các vi khuẩn gây bệnh quan trọng trên lâm sàng có mang bơm đẩy gây nên sự kháng kháng sinh, điển hình là vi khuẩn E. coli và Shigella. 20
32. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2016 đến tháng 7/2016 tại phòng Vi sinh Thực phẩm – Nước, khoa Xét nghiệm Sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP. HCM. 2.2. Đối tượng nghiên cứu Các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập trong nước uống do khách hàng mang tới Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh phân tích. Nước uống gồm 2 nhóm chính: - Nhóm 1: nước uống tinh khiết, nước khoáng thiên nhiên, nước uống đóng chai. - Nhóm 2: nước xử lý dùng để uống: nước uống công ty, nước uống trường học, nước uống gia đình. 2.3. Cỡ mẫu ❖ Được tính theo công thức tính cỡ mẫu: N = N: cỡ mẫu cần thiết cho nghiên cứu Z: trị số tra từ bảng phân phối chuẩn, với Z = 1 - α/2 α: mức ý nghĩa thống kê p: tỷ lệ mẫu nước nhiễm P. aeruginosa d: độ chính xác mong muốn 21
33. Đồ án tốt nghiệp ❖ Nghiên cứu được thực hiện trên 200 mẫu nước uống các loại: Bảng 2.1: Số mẫu nước uống được phân tích STT Loại mẫu Tổng số mẫu phân tích 1 Nước uống đóng chai (NUĐC) 50 2 Nước xử lý dùng để uống 150 Nước uống công ty (NUCT) 50 Nước uống trường học (NUTH) 50 Nước uống gia đình (NUGĐ) 50 2.4. Thiết bị, hóa chất, môi trường 2.4.1. Thiết bị và dụng cụ - Tủ sấy để khử trùng khô và nồi hấp ướt - Tủ ấm 37oC - Dụng cụ lọc nước, bộ ba phễu lọc - Đèn UV - Tủ an toàn sinh học cấp 2 - Kẹp giữ màng lọc - Màng lọc vô trùng 0,45 µm - Lame, lamell - Kính hiển vi - Que cấy vòng - Pipet vô trùng 2ml, micro pipet - Máy vortex - Máy đo độ đục McFarland - Đĩa petri - Thước kẻ đo vòng vô khuẩn 22
34. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Hóa chất và môi trường thí nghiệm ❖ Hóa chất - Cồn 70o, 90o - Nước cất, nước muối sinh lý vô trùng - Thuốc thử Nessler ❖ Môi trường nuôi cấy - Thạch Pseudomonas - Thạch dinh dưỡng - Canh thang acetamide - Thạch Mueller-Hinton Hình 2.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt phễu lọc Hình 2.2: Tủ ấm 23
35. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3: Đèn UV Hình 2.4: Tủ an toàn sinh học cấp 2 24
36. Đồ án tốt nghiệp 2.5. Phương pháp thực hiện 2.5.1. Nguồn mẫu ❖ Nguồn mẫu thí nghiệm: Các mẫu nước uống do khách hàng trên địa phận thành phố Hồ Chí Minh và các vùng khác mang đến kiểm nghiệm tại Viện Pasteur TP. HCM - Nước uống đóng chai: nước tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên. - Nước xử lý dùng để uống: nước uống công ty, nước uống trường học, nước uống gia đình. ❖ Các mẫu nước do khách hàng mang đến để kiểm nghiệm sau khi được nhận bởi phòng tiếp nhận, nhanh chóng chuyển lên phòng thí nghiệm và phân tích ngay trong ngày. Nếu để sang ngày hôm sau thì các mẫu nước được lưu trữ trong tủ mát ở 4oC. 2.5.2. Đánh giá kết quả Đánh giá kết quả theo QCVN 6-1:2010/BYT. Trong tiêu chuẩn này quy định mức đánh giá như sau: Bảng 2.2: Chỉ tiêu kiểm tra vi sinh vật trong nước uống áp dụng theo QCVN 6-1:2010/BYT [10] STT Chỉ tiêu kiểm tra Giới hạn cho phép 1 Coliforms tổng số 0 cfu/250 ml 2 Coliform fecal hoặc E. coli 0 cfu/250 ml 3 Streptococcus fecalis 0 cfu/250 ml 4 Pseudomonas aeruginosa 0 cfu/250 ml 5 Bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfide 0 cfu/50 ml Tuy nhiên, đề tài chỉ thực hiện kiểm tra chỉ tiêu vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, yêu cầu không được phép xuất hiện P. aeruginosa trong 250 ml mẫu nước uống kiểm tra. 25
37. Đồ án tốt nghiệp 2.5.3. Xử lý số liệu - Sự nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa được tính theo tỷ lệ (%) bằng phần mềm Excel 2007. - Dùng phép kiểm χ2 test để so sánh sự khác biệt của kết quả phân tích, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 bằng phần mềm xử lý số liệu thống kê SAS 2.5.4. Phương pháp định lượng P. aeruginosa trong nước uống Phân lập và đếm khuẩn lạc P. aeruginosa theo phương pháp nuôi cấy truyền thống ISO 16226:2006 [21] ❖ Nguyên tắc: - Phân lập trên môi trường chọn lọc Pseudomonas agar, ủ 37oC 1oC trong (24 – 48) giờ. - Khẳng định sinh hóa: trên môi trường Pseudomonas agar, những khuẩn lạc tạo sắc tố pyocyanin có màu xanh da trời/ xanh lá cây được khẳng định là P. aeruginosa, những khuẩn lạc phát huỳnh quang dưới tia UV hoặc có màu nâu đỏ cần được khẳng định sinh hóa. - Tính toán số vi khuẩn có trong thể tích thử nghiệm. ❖ Môi trường, hóa chất nuôi cấy: - Môi trường Pseudomonas agar: phân lập P. aeruginosa - Môi trường thạch dinh dưỡng: tăng sinh P. aeruginosa - Môi trường Acetamid: thử khả năng sinh NH3 - Môi trường King’B: kiểm tra khả năng sinh sắc tố Pyoverdin. - Thuốc thử Nessler’s: kiểm tra phản ứng sinh NH3. - Giấy test oxidase: xác định sự hiện diện của enzyme oxidase. ❖ Quy trình thực hiện: 26
38. Đồ án tốt nghiệp Sơ đồ 2.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn P. aeruginosa Lọc lượng mẫu thử qua màng lọc (0,45 m) Rồi đặt màng lọc lên đĩa thạch Thạch PSEU Ủ (37 ± 1oC) / (24 – 48) giờ Khuẩn lạc không tạo màu xanh Khuẩn lạc tạo màu Kiểm tra dưới đèn UV xanh da trời/màu xanh lá cây (pyocyanin) Khuẩn lạc Khuẩn lạc Màu nâu đỏ hoặc không Không t ạo sắc tố pyocyanin phát huỳnh quang Phát huỳnh quang Đếm tất cả Acetamide broth ➢ Thạch dinh dưỡng ➢ Acetamide broth ➢ King’ B Ủ (37 ± 1oC) / 24 giờ Ủ (37 ± 1oC) / 24 giờ Nhỏ 1-2 giọt thuốc thử Nessler’s (Môi trường chuyển màu vàng ➢ Oxidase dương tính đến màu đỏ gạch) ➢ Sinh Ammoniac ➢ Phát huỳnh quang dưới đèn UV Sinh Amoniac Khẳng định Khẳng định Khẳng định P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa 27
39. Đồ án tốt nghiệp ❖ Tính toán kết quả Trong đó: P: số khuẩn lạc có màu xanh da trời / màu xanh lá cây; tất cả được đếm. F: số khuẩn lạc phát huỳnh quang. R: số khuẩn lạc có màu nâu đỏ. nF: số khuẩn lạc phát huỳnh quang được kiểm tra khả năng sinh amoniac. cF: số khuẩn lạc phát huỳnh quang sinh amoniac (dương tính). nR: số khuẩn lạc màu nâu đỏ được kiểm tra các phản ứng: sinh amoniac, thử oxidase, phát huỳnh quang trên môi trường King’B. cR: số khuẩn lạc màu nâu đỏ cho kết quả dương tính trong các phản ứng: sinh amoniac, thử oxidase, phát huỳnh quang trên King’B. V: thể tích của mẫu nước được phân tích. 2.5.5. Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ Thực hiện theo bản hướng dẫn của CLSI (Viện Lâm Sàng Và Tiêu Chuẩn Phòng Thí Nghiệm) [24] ❖ Phương pháp: Phương pháp khuếch tán kháng sinh trên đĩa thạch (phương pháp Kirby – Bauer) ❖ Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueller – Hinton (MH) có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. ❖ Môi trường, hóa chất: - Môi trường: Mueller – Hinton - Hóa chất: Các kháng sinh thử nghiệm 28
40. Đồ án tốt nghiệp Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện kháng sinh đồ trên các chủng vi khuẩn P. aeruginosa phân lập được từ 200 mẫu nước uống với 10 loại kháng sinh theo tiêu chuẩn CLSI – 2015. Bảng 2.3: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ Họ kháng sinh Tên kháng sinh Viết tắt Hàm lượng Nhạy (mm) Trung gian (mm) Kháng (mm) Penicillins Piperacillin PRL 75 μg ≥ 21 15 - 20 ≤ 14 Beta-lactam/ Beta- Ticarcillin / acid lactamase inhibitor TIM 85/10 μg ≥ 24 16 - 23 ≤ 15 clavulanic conbinations Cephems Cefepime FEP 30 μg ≥ 18 15 - 17 ≤ 14 Monobactams Aztreonam ATM 30 μg ≥ 22 16 - 21 ≤ 15 Carbapenems Meropenem MEM 10 μg ≥ 19 16 - 18 ≤ 15 Lipopeptides Colistin CT 10 μg ≥ 11 - ≤ 10 Gentamicin CN 10 μg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 Aminoglycosides Tobramycin TM 10 μg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 Amikacin AK 30 μg ≥ 17 15 - 16 ≤ 14 Fluoroquinolones Ciprofloxacin CIP 5 μg ≥ 21 16 - 20 ≤ 15 29
41. Đồ án tốt nghiệp Bảo quản kháng sinh: - Các đĩa kháng sinh được đóng gói đảm bảo điều kiện được hút ẩm và được giữ ở nhiệt độ 8oC hoặc thấp hơn. - Nên lấy các lọ chứa đĩa kháng sinh còn đóng kín ra khỏi tủ lạnh 1 đến 2 giờ để nhiệt độ trong lọ bằng với nhiệt độ phòng thí nghiệm trước khi mở nắp. - Chỉ sử dụng các đĩa còn hạn dùng, loại bỏ các đĩa kháng sinh quá hạn Hình 2.5: Đĩa môi trường Mueller Hinton và các đĩa kháng sinh 30
42. Đồ án tốt nghiệp ❖ Quy trình thực hiện kháng sinh đồ: Sơ đồ 2.2: Quy trình thực hiện kháng sinh đồ 31
43. Đồ án tốt nghiệp - Đọc kết quả: Dùng thướt kẻ đo đường kính vòng vô khuẩn (mm), ghi nhận kết quả. - Đánh giá kết quả: Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn với 3 mức độ là nhạy cảm (S), trung gian (I), kháng (R) theo tiêu chuẩn CLSI (2015) 32
44. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống Trong thời gian nghiên cứu, phân tích 200 mẫu nước uống ta có kết quả như sau: Bảng 3.1: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống Số mẫu Tỷ lệ Đạt 170 85% Không đạt 30 15% Tổng 200 100% Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống Nhận xét: Theo kết quả bảng 3.1 và biểu đồ 3.1, trong 200 mẫu nước uống được phân tích có 170 mẫu không nhiễm P. aeruginosa chiếm tỷ lệ 85%, trong khi có 30 mẫu nhiễm P. aeruginosa chiếm 15%. 33
45. Đồ án tốt nghiệp 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong từng loại nước uống Các mẫu nước uống phân tích được chia làm 2 nhóm chính: - Nhóm 1: Nước uống đóng chai. - Nhóm 2: Nước xử lý dùng để uống gồm nước uống công ty, nước uống gia đình, nước uống trường học. 3.1.2.1. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong 2 nhóm nước uống Bảng 3.2: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong 2 nhóm nước uống đóng chai và nhóm nước xử lý dùng để uống Tổng số Kết quả Nguồn nước mẫu Đạt Không đạt Nhóm 1: Nước uống đóng chai 50 44 (88%) 6 (12%) Nhóm 2: Nước xử lý dùng để uống 150 126 (84%) 24 (16%) Tồng số 200 170 (85%) 30 (15%) Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong 2 nhóm nước uống Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.2 cho thấy nhóm nước uống đóng chai có tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa là 12% (6/50 mẫu) và thấp hơn nhóm nước xử lý dùng để uống 16% (24/150 mẫu). Giữa 2 nhóm nước uống khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (p > 0,05). 34
46. Đồ án tốt nghiệp 3.1.2.2. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các loại nước uống Phân tích 200 mẫu nước của 2 nhóm nước (nước uống đóng chai và nước xử lý dùng để uống), ta có kết quả như sau: Bảng 3.3: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các loại nước uống Tổng số Kết quả Nguồn nước mẫu Đạt Không đạt 1. Nước uống đóng chai (NUĐC) 50 44 (88%) 6 (12%) 2. Nước xử lý dùng để uống 150 126 (84%) 24 (16%) Nước uống công ty (NUCT) 50 37 (74%) 13 (26%) Nước uống trường học (NUTH) 50 46 (92%) 4 (8%) Nước uống gia đình (NUGĐ) 50 43 (86%) 7 (14%) Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các loại nước uống Nhận xét: Bảng 3.3 và biểu đồ 3.3 cho thấy loại nước có tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa cao nhất là trong nước uống công ty 26% (13/50 mẫu), tiếp theo là nước uống gia đình với 14% (7/50 mẫu), nước uống đóng chai là 12% (6/50 mẫu) và thấp nhất là nước uống trường học với 8% (4/50 mẫu). Giữa các loại nước uống với nhau khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (p > 0,05). 35
47. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống Thực hiện kháng sinh đồ trên 30 chủng P. aeruginosa được phân lập từ 200 mẫu nước uống. Trong đó: - Nước uống đóng chai: có 6 chủng - Nước uống công ty: có 13 chủng - Nước uống trường học: có 4 chủng - Nước uống gia đình: có 7 chủng 3.2.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống Kết quả kháng sinh đồ cho thấy, các chủng P. aeruginosa phân lập được trong nước uống đã xuất hiện hiện tượng kháng kháng sinh: Bảng 3.4: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống Kháng Sinh PRL TIM FEP ATM MEM CT CN TM AK CIP Kết quả (%) Kháng (R) 0 16,66 3,33 3,33 3,33 23,33 0 0 0 0 Trung gian (I) 20 76,67 0 3,33 3,33 0 0 0 0 0 Nhạy (S) 80 6,67 96,67 93,34 93,34 76,67 100 100 100 100 36
48. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống Nhận xét: 30 chủng P. aeruginosa phân lập được trong nước uống đều nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm như: Gentamincin (CN), Tobramycin (TM), Amikacin (AK) và Ciprofloxacin (CIP) và Piperacillin (PRL) có tỷ lệ trung gian là 20%. Tuy nhiên, Colistin (CT) bị kháng với tỷ lệ cao nhất 23,33%, tiếp theo là Ticaracillin/acid clavulanic (TIM) với tỷ lệ 16,66%, các kháng sinh như Cefepime (FEP), Aztreonam (ATM), Meropenem (MEM) đều bị kháng với tỷ lệ 3,33%. 37
49. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong các loại nước uống ❖ Nước uống đóng chai: Kết quả kháng sinh đồ của 6 chủng P. aeruginosa trong nước uống đóng chai Bảng 3.5: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống đóng chai Kháng Sinh PRL TIM FEP ATM MEM CT CN TM AK CIP Kết quả (%) Kháng (R) 0 16,7 0 0 0 16,7 0 0 0 0 Trung gian (I) 16,7 83,3 0 16,7 0 0 0 0 0 0 Nhạy (S) 83,3 0 100 83,3 100 83.3 100 100 100 100 Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống đóng chai Nhận xét: - Kháng sinh Ticarcillin/acid clavulanic, Colistin đều bị kháng 16,7% - Hầu hết các chủng P. aeruginosa phân lập được đều nhạy cảm với các kháng sinh: Cefepime, Meropenem, Gentamicin, Tobramycin, Amikacin và Ciprofloxacin. 38
50. Đồ án tốt nghiệp ❖ Nước uống công ty Kết quả kháng sinh đồ của 13 chủng P. aeruginosa trong nước uống công ty Bảng 3.6: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống công ty Kháng Sinh PRL TIM FEP ATM MEM CT CN TM AK CIP Kết quả (%) Kháng (R) 0 7,7 7,7 7,7 0 23,1 0 0 0 0 Trung gian (I) 23,1 76,9 0 0 7,7 0 0 0 0 0 Nhạy (S) 76,9 15,4 92,3 92,3 92,3 76.9 100 100 100 100 Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống công ty Nhận xét: - Kháng sinh Colistin bị kháng với tỷ lệ khá cao là 23,1% - Ticarcillin/acid clavulanic, Cefepime và Aztreonam đều bị kháng 7,7%. - Hầu hết các chủng thử nghiệm đều nhạy cảm với các kháng sinh: Gentamicin, Tobramycin, Amikacin và Ciprofloxacin. 39
51. Đồ án tốt nghiệp ❖ Nước uống trường học: Kết quả kháng sinh đồ của 4 chủng P. aeruginosa trong nước uống trường học Bảng 3.7: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống trường học Kháng Sinh PRL TIM FEP ATM MEM CT CN TM AK CIP Kết quả (%) Kháng (R) 0 0 0 0 0 50 0 0 0 0 Trung gian (I) 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhạy (S) 100 0 100 100 100 50 100 100 100 100 Biểu đồ 3.7: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống trường học Nhận xét: - Kháng sinh Colistin bị kháng với tỷ lệ cao là 50%. - Cả 4 chủng P. aeruginosa được phân lập trong nhóm nước uống trường học đều nhạy cảm với các kháng sinh: Pipercillin , Cefepime, Aztreonam, Meropenem, Gentamicin, Tobramycin, Amikacin và Ciprofloxacin. 40
52. Đồ án tốt nghiệp ❖ Nước uống gia đình: Kết quả kháng sinh đồ của 7 chủng P. aeruginosa trong nước uống gia đình Bảng 3.8: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong nước uống gia đình Kháng Sinh PRL TIM FEP ATM MEM CT CN TM AK CIP Kết quả (%) Kháng (R) 0 42,9 0 0 14,3 14,3 0 0 0 0 Trung gian (I) 28,6 57,1 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhạy (S) 71,4 0 100 100 85,7 85,7 100 100 100 100 Biểu đồ 3.8: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa phân lập từ trong nước uống gia đình Nhận xét: - Kháng sinh Ticarcillin/acid clavulanic bị kháng với tỷ lệ khá cao 42,9%, Meropenem và Colistin đều bị kháng là 14,3%. - Các chủng P. aeruginosa trong nước uống gia đình đều nhạy cảm với các kháng sinh: Cefepime, Aztreonam, Gentamicin, Tobramycin, Amikacin và Ciprofloxacin. 41
53. Đồ án tốt nghiệp 3.2.3. Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong các loại nước uống Bảng 3.9: Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa trong các loại nước uống Loại nước Loại kháng sinh Số chủng đa kháng kháng sinh NUĐC TIM - CT 1 (1/6 chủng) FEP - CT 1 (1/13 chủng) NUCT TIM - ATM 1 (1/13 chủng) NUGĐ TIM - MEM 1 (1/7 chủng) Nhận xét: Thực hiện kháng sinh đồ với 30 chủng P. aeruginosa phân lập trong nước uống, ta thấy: - Nhóm nước uống đóng chai có 1 chủng đề kháng 2 loại kháng sinh Ticarcillin/acid clavulanic và Colistin. - Nhóm nước uống công ty có 2 chủng đề kháng với 2 loại kháng sinh: Cefepime, Colistin và Ticarcillin/acid clavulanic, Aztreonam. - Nhóm nước gia đình có 1 chủng đề kháng 2 loại kháng sinh: Ticarcillin/acid clavulanic, Meropenem. - Ngoài ra kết quả kháng sinh đồ chưa thấy các vi khuẩn thử nghiệm có hiện tượng đa kháng trên 2 loại kháng sinh. 42
54. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Thảo luận 3.4.1. Tình hình nhiễm P. aeruginosa trong nước uống Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống giữa nghiên cứu này so với nghiên cứu năm 2012 Bảng 3.10: So sánh tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống Năm Đạt Không đạt 2012 69,75% (279/400 mẫu) 30,25% (121/400 mẫu) 2016 85% (170/200 mẫu) 15% (30/200 mẫu) Nhận xét: Trong nghiên cứu này, tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống là 15% và thấp hơn so với nghiên cứu của tác giả Vương Xuân Vân (2012) [12], với tỷ lệ nhiễm là 30,25%. Tỷ lệ nhiễm có giảm và giữa 2 nghiên cứu có khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05). Kết quả này phần nào cũng cho thấy tình hình chất lượng vệ sinh nước uống so với năm 2012 đã có nhiều sự quan tâm cũng như bắt đầu được cải thiện. Bảng 3.11: So sánh tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa 2 nhóm nước uống Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa Năm Nhóm 1 Nhóm 2 (Nước uống đóng chai) (Nước xử lý dùng để uống) 2012 28,9% (13/45 mẫu) 30,4% (108/355 mẫu) 2016 12% (6/50 mẫu) 16% (24/50 mẫu) Nhận xét: Bảng 3.11 cho thấy năm 2016, tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nhóm nước xử lý dùng để uống là 16% và cao hơn nhóm nước uống đóng chai là 12%. Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu năm 2012, tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nhóm nước uống đóng chai (28,9%) và thấp hơn nhóm nước xử lý dùng để uống (30,4%). Mức độ nhiễm P. aeruginosa trong nghiên cứu này giữa nhóm nước uống đóng chai và nước xử lý dùng để uống là như nhau, khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê 43
55. Đồ án tốt nghiệp (p > 0,05). Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong 2 nhóm nước uống giữa nghiên cứu này so với năm 2012 có phần giảm hơn, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Bảng 3.12: Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các loại nước uống Loại nước uống Năm 2012 (N=400) Năm 2016 (N=200) Nước uống đóng chai 28,9% (13/45 mẫu) 12% (6/50 mẫu) (NUĐC) Nước uống công ty 31,9% (67/210 mẫu) 26% (13/50 mẫu) (NUCT) Nước uống trường học 25% (24/96 mẫu) 8% (4/50 mẫu) (NUTH) Nước uống gia đình 34,7% (17/49 mẫu) 14% (7/50 mẫu) (NUGĐ) Nhận xét: Theo kết quả từ bảng 3.12, nghiên cứu năm 2016 có tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa cao nhất trong nước uống công ty (26%), tiếp theo là nước uống gia đình (14%), nước uống đóng chai (12%) và thấp nhất là nước uống trường học (8%). Giữa các loại nước uống được khảo sát khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (p > 0,05). Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu năm 2012, tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa thấp nhất trong nước uống trường học (25%). Tuy nhiên, nghiên cứu này cũng có sự khác biệt so với nghiên cứu năm 2012. Năm 2012, tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa cao nhất trong nước uống gia đình (34,7%) tiếp theo là nước uống công ty (31,9%). Trong nghiên cứu này, tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa cao nhất trong nước uống công ty (26%) sau đó là nước uống gia đình (14%). Có sự khác biệt giữa nghiên cứu này so với năm 2012, có thể là do nguồn lấy nước, thời gian lấy mẫu ở mỗi nghiên cứu là khác nhau. Nhìn chung, tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống công ty, nước uống gia đình vẫn chiếm tỷ lệ cao trong các loại nước uống và thấp nhất vẫn ở trong nước uống trường học. 44
56. Đồ án tốt nghiệp So với năm 2012, tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống công ty và nước uống gia đình đều giảm tuy nhiên vẫn chiếm tỷ lệ khá cao. Điều này cho thấy rằng, vấn đề vệ sinh nước uống ở hai nhóm nước này vẫn chưa được cải thiện nhiều. Trong nước uống công ty, tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa từ 28,9% vào năm 2012 giảm còn 26% ở năm 2016. Nguyên nhân có thể là do các công ty sử dụng các bình lọc nước, bình nước nóng lạnh sử dụng lâu ngày mà không vệ sinh, bảo dưỡng định kỳ, thay mới hoặc có thể là do sử dụng nguồn nước đóng bình, đóng chai không đảm bảo vệ sinh để phục vụ cho người lao động. Về nước uống gia đình, năm 2012 tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa là 34,7% giảm còn 14% ở năm 2016. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nhóm nước uống này vẫn chiếm tỷ lệ khá cao. Nguyên nhân có thể là do nguồn nước uống sử dụng nhiễm khuẩn, dụng cụ chứa nước (chai, bình, lọ ) không hợp vệ sinh hay nguồn nước qua hệ thống lọc không được kiểm tra, vệ sinh định kỳ, thời gian bảo quản nước dài trong điều kiện không đảm bảo vệ sinh, đều là nguyên nhân gây ra nhiễm khuẩn nước uống ở nhóm này. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nhóm nước uống đóng chai và nước uống trường học năm 2016 đều giảm so với năm 2012. Cụ thể, nước uống đóng chai giảm từ 28,9% xuống còn 12%, nước uống trường học giảm từ 25% xuống còn 8%. Nước uống đóng chai có tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa giảm nhưng vẫn còn khá cao. Nguyên nhân có thể là do nguồn nước sản xuất bị ô nhiễm, các cơ sở sản xuất nước uống đóng chai chưa đầu tư đúng mức về thiết bị, cơ sở vật chất đúng theo như quy định để sản xuất nước uống đóng chai. Về nước uống trường học, nghiên cứu năm 2012 và 2016 đều cho thấy tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa thấp nhất trong các nhóm nước. Có thể các trường học đã quan tâm hơn đến vấn đề xử lý nước uống cũng như chọn nguồn cung cấp nước uống an toàn cho học sinh, sinh viên. 3.4.2. Tình hình kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống Với số mẫu nước được kiểm nghiệm (200 mẫu) và số chủng P. aeruginosa phân lập được (30 chủng), các chủng vi khuẩn phân lập được từ nghiên cứu này so với nghiên cứu năm 2012, đều thấy đa số vi khuẩn nhạy cảm với các kháng sinh như: Gentamicin, Tobramycin, Amikacin và Ciprofloxacin. Tuy nhiên, một số kháng sinh lại bị kháng như: 45
57. Đồ án tốt nghiệp - Ticarcillin/acid clavulanic bị kháng tới 16,66% trong khi đó năm 2012 nhạy cảm 100%. - Cefepime bị kháng với tỷ lệ 3,33% trong khi năm 2012 (0%). - Aztreonam bị kháng 3,33%, tuy nhiên lại thấp hơn so với năm 2012 (20%). - Meropenem bị đề kháng 3,33% tăng so với năm 2012, điều đáng lưu ý đây là loại kháng sinh mới thuộc nhóm Carbapenem, là loại kháng sinh thường được dùng để điều trị rất hiệu quả khi nhiễm P. aeruginosa. - Kháng sinh Colistin bị kháng 23,33%, đã tăng lên rất nhiều so với năm 2012 (0%). Tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong các loại nước uống giữa nghiên cứu này so với nghiên cứu năm 2012: Bảng 3.13: So sánh tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa các loại nước uống Kháng NUĐC NUCT NUTH NUGĐ sinh 2012 2016 2012 2016 2012 2016 2012 2016 PRL 0 0 0 0 0 0 0 0 TIM 0 16,7% 0 7,7% 0 0 0 42,9% FEP 0 0 0 7,7% 0 0 0 0 ATM 0 0 0 7,7% 0 0 20% 0 MEM 0 0 0 0 0 0 0 14,3% CT 0 16,7% 0 23,1% 0 50% 0 14,3% CN 0 0 0 0 0 0 0 0 TM 0 0 0 0 0 0 0 0 AK 0 0 0 0 0 0 0 0 CIP 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhận xét: So với nghiên cứu trước đó của tác giả Vương Xuân Vân (2012), thì các chủng P. aeruginosa trong nghiên cứu này có tỷ lệ kháng kháng sinh nhiều hơn. Cụ thể là: 46
58. Đồ án tốt nghiệp - Trong nhóm nước uống đóng chai: so với năm 2012 hầu hết các chủng vi khuẩn đều nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm, năm 2016 kháng với Ticarcillin/acid clavulanic và Colistin 16,7%. - Trong nhóm nước uống công ty: các chủng P. aeruginosa trong năm 2012 đều nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm và năm 2016 kháng với các kháng sinh Ticarcillin/acid clavulanic, Cefepime, Aztreonam đều là 7,7% và Colistin là 23,1%. - Đối với các chủng phân lập trong nước uống trường học: năm 2012 các chủng vi khuẩn đều nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm, năm 2016 có 50% chủng kháng với Colistin. - Đối với các chủng vi khuẩn phân lập trong nước uống gia đình: năm 2012 hầu hết các chủng đều nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm, duy nhất chỉ có 20% chủng kháng với lại Aztreonam, năm 2016 không phát hiện vi khuẩn kháng với Aztreonam nhưng lại có 42,9% chủng kháng với Ticarcillin/acid clavulanic và kháng Meropenem, Colistin đều là 14,3%. Nguyên nhân của việc năm 2012 phát hiện vi khuẩn kháng Aztreonam (20%), còn năm 2016 thì chưa phát hiện có thể do nguồn mẫu ở mỗi nghiên cứu khác nhau. Hơn nữa số chủng phân lập được trong nước uống gia đình năm 2012 (17 chủng) nhiều hơn nghiên cứu này (7 chủng), vì do chủng ít nên cũng chưa phản ánh chính xác được tình trạng kháng kháng sinh nói chung và kháng Aztreonam nói riêng. Qua các kết quả trên, trong khoảng thời gian 2012 đến 2016 một số kháng sinh vẫn chưa bị vi khuẩn kháng, do vậy các kháng sinh như: Gentamicin, Tobramycin, Amikacin và Ciprofloxacin, vẫn là những kháng sinh được bác sĩ ưu tiên khi điều trị nhiễm khuẩn do P. aeruginosa. Các chủng vi khuẩn này được phân lập trong nước vẫn nhạy cảm với một số loại kháng sinh do đây là các chủng hoang dại, chưa mang gene kháng kháng sinh. Tuy nhiên, trong khoảng thời gian 4 năm ta thấy được hiện tượng vi khuẩn P. aeruginosa trong nước uống đã bắt đầu kháng lại với nhiều loại kháng sinh 47
59. Đồ án tốt nghiệp và tỷ lệ kháng kháng sinh cũng tăng lên rất nhiều. Ngoài ra nghiên cứu này còn phát hiện hiện tượng đa kháng với 2 loại kháng sinh. Điều này phù hợp với bản chất tự nhiên của P. aeruginosa, vì thế mà vi khuẩn này còn được gọi là một trong những vi khuẩn kháng thuốc hàng đầu trong bệnh viện. Kết quả này cho thấy mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa trong nghiên cứu này tăng một cách đáng lo ngại so với năm 2012. Vì vậy, nếu không có biện pháp kiểm soát tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn tại Việt Nam, có thể tình hình kháng kháng sinh của chúng sẽ gia tăng, khó kiểm soát, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng và điều trị bệnh sẽ khó hơn nhiều. Kết quả này tuy chưa đánh giá hết được thực trạng nhiễm và khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa trong nước uống hiện nay, nhưng cũng đã góp phần phản ánh tình hình nhiễm và tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn này trong một số nhóm nước uống. 48
60. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận ❖ Nghiên cứu của chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu đề ra: Xác định tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống theo QCVN 6-1:2010/BYT và thực hiện kháng sinh đồ để khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa phân lập được trong nước uống theo tiêu chuẩn CLSI 2015. ❖ Kết quả thu được: - Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong 200 mẫu nước uống là 15%. Trong đó, tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa ở nhóm nước uống đóng chai là 12%, nhóm nước xử lý dùng để uống là 16%. - Trong nhóm nước xử lý dùng để uống: tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa cao nhất là trong nước uống công ty 26%, tiếp theo nước uống gia đình 14% và thấp nhất nước uống trường học 8%. - Tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa phân lập được trong nước uống: + Hầu hết các chủng vi khuẩn đều nhạy cảm với các kháng sinh như: Gentamicin, Tobramycin, Amikacin và Ciprofloxacin. + Colistin bị kháng với tỷ lệ khá cao 23,33%. + Kháng sinh Ticarcillin/acid clavulanic bị kháng 16,66%. + Cefepime, Aztreonam, Meropenem đều bị kháng 3,33%. - Đã xuất hiện các chủng đa kháng 2 loại kháng sinh: Trong nước uống đóng chai (1/6 chủng), nước uống công ty (2/13 chủng) và nước uống gia đình (1/7 chủng). Các vi khuẩn thử nghiệm chưa thấy có hiện tượng đa kháng trên 2 loại kháng sinh. Kết quả này tuy chỉ được thực hiện với số lượng mẫu hạn chế và kết quả chỉ mới đánh giá riêng về chỉ tiêu vi sinh chưa tính đến các chỉ tiêu Lý - Hóa nhưng đã góp phần phản ánh tình hình nhiễm khuẩn trong một số loại nước uống nhất định đến mức báo động. Qua đó mọi người có cái nhìn ý thức hơn trong việc sử dụng các loại nước uống hợp vệ sinh, ngoài ra kết quả còn góp phần giúp cho các cơ sở sản xuất, 49
61. Đồ án tốt nghiệp kinh doanh nước uống đóng chai quan tâm và ý thức hơn trong việc sản xuất nước uổng để đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng. 4.2. Kiến nghị - Mở rộng thu thập thêm các mẫu nước uống bệnh viện để tìm hiểu về tình trạng nhiễm và tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa trong nước uống bệnh viện. - Tăng số lượng chủng P. aeruginosa phân lập trong nước uống nhằm khảo sát tính kháng kháng sinh để có số liệu tin cậy hơn. - Xác định mối tương quan về sự kháng kháng sinh của P. aeruginosa phân lập trong nước uống so với trong bệnh phẩm. - Khảo sát tính kháng kháng sinh với các vi khuẩn còn lại trong nước uống. - Khảo sát thêm các chỉ tiêu Lý – Hóa để có cái nhìn toàn diện hơn về thực trạng sản xuất và xử lý nước uống. 50
62. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: [1]. Bộ Y Tế, 2009. Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện tại Việt Nam năm 2008-2009, Báo cáo của Bộ Y tế-Việt Nam phối hợp với Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng kháng sinh GARP-Việt Nam và Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng ĐH Oxford. Bộ Y tế, 2009. [2]. Bộ Y Tế, 2015. Hướng dẫn sử dụng kháng sinh. Nhà xuất bản Y Học Hà Nội, 2015, trang 17-25. [3]. Bệnh viện Quân Y 108, 2011. Kháng sinh và vi khuẩn. Bài giảng chuyên ngành vi sinh, 2011. [4]. Cảnh, H. D., Lan, V. L. N., Ninh, U. N. Đ., Hữu, L. T., & Nghĩa, C. H, 2014. Tình hình kháng kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa phân lập được trên bệnh phẩm tại Viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh. Tạp chí Khoa học, 2014, (61), 156. [5]. Lê Huy Chính, 2007. Vi sinh vật Y Học. Nhà xuất bản Y Học, 2007, trang 218-221. [6]. Lê Bảo Huy, Lê Đức Thắng, 2005. Khảo sát tác nhân gây viêm phổi bệnh viện và tình hình kháng kháng sinh tại khoa ICU bệnh viện Thống Nhất 2004-2005. Tập thể khoa hồi sức cấp cứu – Khoa vi sinh bệnh viện Thống Nhất. Tài liệu hội thảo khoa học. [7]. Lê Trương Hằng Hà, 2010. Tìm hiểu tình hình nhiễm khuẩn và khảo sát tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa trong nước uống. Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại Học Tôn Đức Thắng TP.HCM, 2010, trang 43. [8]. Nguyễn Hoàng Thu Trang, 2007. Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nước uống. Luận văn cử nhân sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 2007, trang 41-43. 51
63. Đồ án tốt nghiệp [9]. Nguyễn Thị Hải, 2010. Nghiên cứu tính nhạy cảm kháng sinh của trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa). Luận Văn Thạc Sĩ Sinh Học, Trung tâm học liệu-Đại học Thái Nguyên, 2010, trang 4-5. [10]. Quy chuẩn Việt Nam, 2010, QCVN 6-1:2010/BYT. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với nước khoáng thiên nhiên và nước uống đóng chai. [11]. Trần Linh Thước (2006). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm, và mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo Dục. [12]. Vương Xuân Vân, Nguyễn Thị Nguyệt, Nguyễn Văn Trí, Phẩm Minh Thu, Viện Pasteur Tp.HCM, 2013. Tìm hiểu tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nước uống năm 2012. Tạp chí Y học Thực hành (864), số 03/2013, trang 29-32. Tài liệu nước ngoài: [13]. Ayodele T. Adesoji, Adeniyi A. Ogunjobi, Isaac O. Olatoye. Molecular characterization of selected multidrug resistant Pseudomonas from water distribution systems in southwestern Nigeria. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2015; 14: 39. [14]. Benoit Lévesque. Comparision of the Microbological Quality of Water Coolers and That of Municipal Water Systems. Applíed and Environmental Microbiology, Apr 1994, p. 1174- 1178. [15]. Baumgartner A, Grand M. Bacteriological quality of drinking water from dispensers (coolers) and possible control measures. J Food Prot., 2006, Dec; 69(12):3043-6. [16]. Bharath J, Mosodeen M, Motilal S, Sandy S, Sharma S, Tessaro T, Thomas K, Umamaheswaran M, Simeon D, Adesiyun AA. Microbial quality of domestic and imported brands of bottled water in Trinidad. School of Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of the West Indies, St. Augustine, Trinidad and Tobago. Int J Food Microbiol., 2003 Feb 25;81(1):53-62. 52
64. Đồ án tốt nghiệp [17]. Clemens Kittinger, Michaela Lipp, Rita Baumert, Bettina Folli, Günther Koraimann, Daniela Toplitsch, Astrid Liebmann, Andrea J. Grisold, Andreas H. Farnleitner, Alexander Kirschner and Gernot Zarfel. Antibiotic Resistance Patterns of Pseudomonas spp isolated from the River Danube. Front Microbiol 7:586, 2016 [18]. Deanna, L., Kiska, Peter, H., Gilligan. Pseudomonas aeruginosa. In Manual of clinical microbiology. Patrick R. Murray (Ed.), ASM Press, Washington D.C., 2003. [19]. Ghazi M. Al - Maliki, Rajaa Abdul - Kadem Haneff (2012), Studies on Pseudomonas aeruginosa in drinking water from water suppliers consumed in Basra. University of Basrah, Iraq. [20]. Jonathan K. Lutz, Jiyoung Lee (2011). Prevalence and Antimicrobial-Resistance of Pseudomonas aeruginosa in Swimming Pools and Hot Tubs. Int. J. Environ. Res. Public Health 2011, 8, 554-564. [21]. ISO 16266:2006, Water quality - Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa - Method by membrane filtration. [22]. Lateef A, Oloke J. K., Gueguimkana E. B (2005). The prevalence of bacterial resistance in clinical, food, water and some environmental samples in Southwest Nigeria. Environmental Monitoring and Assessment, 100: 59–69. [23]. Mohammadi Kouchesfahani Alimohammadi, Nabizadeh Nodehi, Aslani, Rezaie, Asadian. Pseudomonas aeruginosa and Heterotrophic Bacteria Count in Bottled Waters in Iran. Iran J Public Health. 2015 Nov;44(11):1514-9. [24]. Clinical & Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement, 2015. [25]. Rusin PA, Rose JB, Haas CN, Gerba CP. Risk assessment of opportunistic bacterial pathogens in drinking water. Rev Environ Contam Toxicol 1997;152:57-83. 53
65. Đồ án tốt nghiệp Trang web : [26]. khang-sinh.htm [27]. nhiem-khuan-mu-xanh.html [28]. trang-nguyen-nhan-nhiem-Pseudomonas-Aeruginosa-trong-nuoc-uong-dong- chaiThuc-trang-nguyen-nhan-nhiem-Pseudomonas-Aeruginosa-trong-nuoc-uong- dong-chai-629/ [29]. nhiem-khuan-647278/ [30]. sinh-hien.html [31]. vat/pseudomonas-aeruginosa-whitmore/1176/ [32]. ategoryId=1&ItemID=1398&PublishedDate=2009-05-26T00:00:00Z 54
66. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trường và hóa chất 1. Môi trường Pseudomonas agar - Gelatin pepton 16,0g - Casein hydrolysat 10,0 g - KH2SO4 10,0 g - MgCl2 1,4 g - Glyxerol 10 ml - Agar 11-18 g - Nước 1 000 ml - cetrimid 0,2 g - Axit nalidixic 0,015 g. 2. Môi trường King’s B - Gelatin pepton 20,0 g - Glyxerol 10 ml - K2HPO4 1,5 g - MgSO4.7H2O 1,5 g - Agar 15,0 g - Nước cất 1 000 ml 3. Acetamide broth Dung dịch A - KH2PO4 1,0 g - MgSO4 0,2 g - Acetamid 2,0 g - NaCl 0,2 g - Nước 900 ml - pH 7,0 ± 0,5 ở 25 oC 55
67. Đồ án tốt nghiệp Dung dịch B - Na2MoO4.2H2O 0,5 g - FeSO4.7H2O 0,05 g - Nước 100 ml - Để chuẩn bị môi trường acetamide broth, thêm 1 ml dung dịch B vào 900 ml dung dịch A 4. Que thử Oxydase - N,N,N’,N’ Tetramethyl – p – phenylenediamine dihydrochlride 56
68. Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 2: Một số hình ảnh trong quá trình thử nghiệm Hình 1: Khuẩn lạc P. aeruginosa trên môi trường Pseudomonas agar phát huỳnh quang dưới đèn UV Hình 2: Phản ứng sinh ammoniac dương tính và thử nghiệm oxydase 57
69. Đồ án tốt nghiệp Hình 3: Kết quả định danh P. aeruginosa bằng bộ kit API 10S Hình 4: Kết quả sau khi đặt các đĩa giấy kháng sinh (trước và sau khi ủ) 58
70. Đồ án tốt nghiệp Hình 5: Kết quả kháng sinh đồ của của một số chủng P. aeruginosa 59
71. Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 3: Xử lý số liệu thống kê 1. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa nhóm 1 (nước uống đóng chai) và nhóm 2 (nước xử lý dùng để uống) Table of NHOM by TYLE NHOM TYLE Frequency Expected Cell Chi-Square Percent DAT KHONGDAT Total NHOM1 44 6 50 42.5 7.5 0.0529 0.3 22.00 3.00 25.00 NHOM2 126 24 150 127.5 22.5 0.0176 0.1 63.00 12.00 75.00 Total 170 30 200 85.00 15.00 100.00 Statistics for Table of NHOM by TYLE Statistic DF Value Prob Chi-Square 1 0.4706 0.4927 Likelihood Ratio Chi-Square 1 0.4902 0.4839 Continuity Adj. Chi-Square 1 0.2092 0.6474 Mantel-Haenszel Chi-Square 1 0.4682 0.4938 Phi Coefficient 0.0485 Contingency Coefficient 0.0485 Cramer's V 0.0485 Chi-Square có p = 0.4927 > 0.05 → khác biệt không có ý nghĩa thống kê 60
72. Đồ án tốt nghiệp 2. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa các loại nước uống Table of LOAINUOC by TYLE LOAINUOC TYLE Frequency Expected Cell Chi-Square Percent DAT KHONGDAT Total NUDC 44 6 50 42.5 7.5 0.0529 0.3 22.00 3.00 25.00 NUCT 37 13 50 42.5 7.5 0.7118 4.0333 18.50 6.50 25.00 NUTH 46 4 50 42.5 7.5 0.2882 1.6333 23.00 2.00 25.00 NUGD 43 7 50 42.5 7.5 0.0059 0.0333 21.50 3.50 25.00 Total 170 30 200 85.00 15.00 100.00 Statistics for Table of LOAINUOC by TYLE Statistic DF Value Prob Chi-Square 3 7.0588 0.0700 Likelihood Ratio Chi-Square 3 6.7122 0.0817 Mantel-Haenszel Chi-Square 1 0.2809 0.5961 Phi Coefficient 0.1879 Contingency Coefficient 0.1846 Cramer's V 0.1879 Chi-Square có p = 0.07 > 0.05 → khác biệt không có ý nghĩa thống kê 61
73. Đồ án tốt nghiệp 3. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong nước uống trong năm 2012 – 2016 Table of NAM by TYLE NAM TYLE Frequency Expected Cell Chi-Square Percent DAT KHONGDAT Total NAM2012 279 121 400 299.33 100.67 1.3812 4.1071 46.50 20.17 66.67 NAM2016 170 30 200 149.67 50.333 2.7624 8.2141 28.33 5.00 33.33 Total 449 151 600 74.83 25.17 100.00 Statistics for Table of NAM by TYLE Statistic DF Value Prob Chi-Square 1 16.4648 <.0001 Likelihood Ratio Chi-Square 1 17.5327 <.0001 Continuity Adj. Chi-Square 1 15.6651 <.0001 Mantel-Haenszel Chi-Square 1 16.4374 <.0001 Phi Coefficient -0.1657 Contingency Coefficient 0.1634 Cramer's V -0.1657 Chi-Square có p < 0.0001, < 0.05 → khác biệt rất có ý nghĩa thống kê 62
74. Đồ án tốt nghiệp 4. Tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa nhóm nước uống đóng chai và xử lý trong năm 2012 – 2016 Table of NAM by NHOM NAM NHOM Frequency Expected Cell Chi-Square Percent NHOM1 NHOM2 Total NAM2012 13 108 121 15.225 105.77 0.3252 0.0468 8.61 71.52 80.13 NAM2016 6 24 30 3.7748 26.225 1.3117 0.1888 3.97 15.89 19.87 Total 19 132 151 12.58 87.42 100.00 Statistics for Table of NAM by NHOM Statistic DF Value Prob Chi-Square 1 1.8725 0.1712 Likelihood Ratio Chi-Square 1 1.6937 0.1931 Continuity Adj. Chi-Square 1 1.1255 0.2887 Mantel-Haenszel Chi-Square 1 1.8601 0.1726 Phi Coefficient -0.1114 Contingency Coefficient 0.1107 Cramer's V -0.1114 Chi-Square có p = 0.1712 > 0.05 → khác biệt không có ý nghĩa thống kê 63
75. Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 4: Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ Đường kình vòng vô khuẩn (mm) Nước uống đóng chai Nước uống gia đình Mã chủng 347 N/2 70 N/3 71 N/3 94 N/3 369 N/3 571 N/3 124 N/2 152 N/2 155 N/2 612 N/2 59 N/3 88 N/3 639 N/3 Kháng sinh PRL 26 (S) 21 (S) 20 (I) 25 (S) 25 (S) 28 (S) 24 (S) 25 (S) 24 (S) 20 (I) 24 (S) 20 (I) 25 (S) TIM 22 (I) 22 (I) 21 (I) 23 (I) 20 (I) 15 (R) 21 (I) 15 (R) 14 (R) 20 (I) 20 (I) 0 (R) 20 (I) FEP 28 (S) 29 (S) 25 (S) 31 (S) 28 (S) 24 (S) 26 (S) 24 (S) 30 (S) 26 (S) 28 (S) 23 (S) 25 (S) ATM 27 (S) 23 (S) 21 (I) 25 (S) 23 (S) 23 (S) 24 (S) 24 (S) 28 (S) 23 (S) 24 (S) 17 (S) 24 (S) MEM 25 (S) 28 (S) 26 (S) 32 (S) 28 (S) 24 (S) 22 (S) 26 (S) 27 (S) 22 (S) 23 (S) 12 (R) 28 (S) CT 14 (S) 11 (S) 12 (S) 14 (S) 14 (S) 9 (R) 11 (S) 13 (S) 12 (S) 11 (S) 12 (S) 12 (S) 8 (R) CN 28 (S) 18 (S) 16 (S) 18 (S) 19 (S) 20 (S) 15 (S) 20 (S) 22 (S) 20 (S) 20 (S) 24 (S) 18 (S) TM 24 (S) 20 (S) 20 (S) 20 (S) 20 (S) 23 (S) 22 (S) 22 (S) 20 (S) 23 (S) 22 (S) 26 (S) 20 (S) AK 26 (S) 22 (S) 21 (S) 20 (S) 22 (S) 22 (S) 22 (S) 24 (S) 22 (S) 25 (S) 25 (S) 25 (S) 26 (S) CIP 32 (S) 28 (S) 26 (S) 30 (S) 30 (S) 28 (S) 32 (S) 31 (S) 32 (S) 31 (S) 30 (S) 28 (S) 30 (S) 64
76. Đồ án tốt nghiệp Đường kình vòng vô khuẩn (mm) Nước uống công ty Nước uống trường học Mã chủng 139 141 142 175 282 67 68 77 89 265 70 133 136 84 132 179 174 N/2 N/2 N/2 N/2 N/2 N/3 N/3 N/3 N/3 N/3 N/4 N/4 N/4 N/2 N/2 N/2 N/3 Kháng sinh PRL 26 (S) 23 (S) 22 (S) 26 (S) 28 (S) 24 (S) 24 (S) 25 (S) 20 (I) 26 (S) 20 (I) 23 (S) 20 (I) 28 (S) 28 (S) 25 (S) 24 (S) TIM 22 (I) 19 (I) 24 (S) 22 (I) 25 (S) 20 (I) 20 (I) 22 (I) 22 (I) 21 (I) 8 (R) 18 (I) 22 (I) 20 (I) 21 (I) 20 (I) 21 (I) FEP 31 (S) 23 (S) 26 (S) 30 (S) 30 (S) 30 (S) 20 (S) 29 (S) 29 (S) 27 (S) 22 (S) 25 (S) 7 (R) 25 (S) 32 (S) 26 (S) 24 (S) ATM 26 (S) 24 (S) 24 (S) 25 (S) 25 (S) 24 (S) 25 (S) 23 (S) 25 (S) 22 (S) 12 (R) 24 (S) 24 (S) 22 (S) 30 (S) 23 (S) 24 (S) MEM 30 (S) 23 (S) 31 (S) 28 (S) 30 (S) 28 (S) 23 (S) 30 (S) 30 (S) 22 (S) 16 (I) 26 (S) 22 (S) 27 (S) 28 (S) 23 (S) 23 (S) CT 14 (S) 8 (R) 0 (R) 11 (S) 14 (S) 13 (S) 11 (S) 11 (S) 13 (S) 14 (S) 14 (S) 11 (S) 10 (R) 12 (S) 10 (R) 9 (R) 11 (S) CN 18 (S) 22 (S) 23 (S) 17 (S) 22 (S) 18 (S) 18 (S) 19 (S) 18 (S) 21 (S) 21 (S) 18 (S) 24 (S) 14 (S) 24 (S) 19 (S) 18 (S) TM 22 (S) 20 (S) 16 (S) 20 (S) 24 (S) 20 (S) 21 (S) 21 (S) 21 (S) 22 (S) 22 (S) 21 (S) 25 (S) 18 (S) 23 (S) 23 (S) 20 (S) AK 23 (S) 20 (S) 23 (S) 22 (S) 24 (S) 23 (S) 20 (S) 22 (S) 23 (S) 23 (S) 25 (S) 20 (S) 25 (S) 20 (S) 23 (S) 25 (S) 23 (S) CIP 30 (S) 27 (S) 28 (S) 26 (S) 32 (S) 32 (S) 28 (S) 30 (S) 30 (S) 28 (S) 27 (S) 30 (S) 28 (S) 28 (S) 30 (S) 30 (S) 30 (S) 65
77. Đồ án tốt nghiệp 66
78. Đồ án tốt nghiệp 1 Phụ lục 4