›

Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ Podocarpus Sp

pdf 82 trang thiennha21 12/04/2022 3070
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ Podocarpus Sp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_danh_gia_hoat_tinh_khang_khuan_va_buoc_dau_xac_dinh_th.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ Podocarpus Sp

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ CAO CHIẾT TỪ PODOCARPUS SP. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th S. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Hồng Vân MSSV: 1151110422 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những nội dung trong đồ án này do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt. Mọi tham khảo dùng trong đồ án này đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố. Mọi sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, hay gian trá, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Vân
  3. LỜI CẢM ƠN Tôi chân thành cảm ơn Ban Gíam Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm- Môi trường Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói chuyện, thảo luận về lĩnh vực sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, định hướng nghiên cứu. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Cuối cùng em xin cảm ơn thầy cô ở phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm- Môi trường, cùng bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để em hoàn thành đồ án của mình. Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Vân
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN 1 LỜI CẢM ƠN 2 MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH SÁCH CÁC BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 1 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Phạm vi nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu Podocarpus sp. 3 1.1.1. Phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái 3 1.1.3. Đặc điểm sinh học và sinh thái học 3 1.1.4. Công dụng của Podocarpus sp. 4 1.2. Thành phần hóa học của thực vật 5 1.2.1. Carbohydrate 5 1.2.2. Amino acid 5 1.2.3. Alkaloid 6 1.2.4. Glycoside 7 1.2.5. Steroid 8 1.2.6. Tannin 8 1.2.7. Isoprenoid (Terpene) 9 1.3. Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật 10 1.3.1. Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn 10 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn 10 1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 11 1.3.4. Khái niệm nồng độ ức chế tối thiểu MIC 13 1.4. Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 14 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 14 1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 19 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Địa điểm và thời gian 22 2.1.1. Địa diểm 22 2.1.2. Thời gian 22 2.2. Vật liệu 22 2.2.1. Nguồn mẫu 22 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị 22 2.2.3. Hóa chất, môi trường 22 2.2.4. Dụng cụ, thiết bị 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu 24 2.3.2. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi khuẩn 24 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống 25 2.3.4. Phương pháp ngâm mẫu 25 2.3.5. Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) 26 2.3.6. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 26 2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học 27 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu 27 2.4. Bố trí thí nghiệm 28 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 29 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của Podocarpus sp. với các dung môi khác nhau 33 2.4.3. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) 36 2.4.4. Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học Podocarpus sp. 39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 46 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Podocarpus sp. với các dung môi khác nhau 47 3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. 54 3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học Podocarpus sp. 56 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 4.1. Kết luận 58 4.2. Đề nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ETEC: Enterotoxigenic Escherichia coli TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar MIC: Minimal Inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu DMSO: dimethysulfoside iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các dung môi trên 20 chủng vi sinh vật 52 Bảng 3. 2. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. 54 Bảng 3. 3. Thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. 56 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Hình 1. 1.Hình ảnh cây Podocarpus imbricatus 4 Hình 1. 2. Hình ảnh Escherichia coli dưới kính hiển vi 14 Hình 1. 3. Ảnh chụp của Shigella sp. trong một mẫu phân 15 Hình 1. 4. Hình ảnh của Salmonella 16 Hình 1. 5. Hình ảnh Vibrio cholerae 17 Hình 1. 6. Hình chụp Listeria monocytogenes bằng kính hiển vi điện tử 18 Hình 1. 7. Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa 19 Hình 1. 8. Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus 20 Hình 1. 9. Hình ảnh Enterococcus feacalis 21 Hình 2. 1. Quy trình xử lý mẫu 24 Hình 2. 2.Quy trình chung 28 Hình 2. 3. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 29 Hình 2. 4.Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 50o 30 Hình 2. 5 .Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 70o 31 Hình 2. 6. Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 90o 31 Hình 2. 7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn 33 Hình 2. 8 . Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 35 Hình 2. 9. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. 36 Hình 2. 10. Kết quả MIC của ETEC 38 Hình 2. 11 . Kết quả MIC của E.coli O157:H7 38 Hình 2. 12. Quy trình xác định thành phần hóa học 39 Hình 2. 13. Thử nghiệm carbohydrate và saponin 40 Hình 2. 15 Thử nghiệm flavonoid 42 Hình 2. 16 . Thử nghiệm phenolic 43 Hình 2. 17 . Thử nghiệm tannin 44 Hình 2. 18 . Thử nghiệm steroid 45 Hình 3. 1. Hiệu suất tách chiết từ Podocarpus sp. của một số dung môi 46 Hình 3. 2. Hoạt tính kháng khuẩn của Echerichia coli spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500g/ml 47 Hình 3. 3 . Hoạt tính kháng khuẩn của Salmonella spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml 48 Hình 3. 4. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Shigella spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml 49 Hình 3. 5 . Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Vibrio spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 8 g/ml 50 Hình 3. 6. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Listeria spp. và nhóm vi sinh vật gây bệnh khác với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml 51 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Từ ngày xưa, con người đã biết tận dụng các loại cây cỏ trong tự nhiên để phục vụ vào cuộc sống hằng ngày như làm thực phẩm, và đặc biệt là trong chữa bệnh. Tài nguyên cây thuốc là một trong số những tài sản vô giá mà thiên nhiên ban tặng cho con người. Những thầy thuốc giỏi chữa được nhiều căn bệnh hiểm nghèo thường có một kiến thức rất uyên thâm về cây thuốc và các công dụng của chúng, cây thuốc sau khi được đem về sẽ được phơi khô và chủ yếu ngâm với nước sắc làm thuốc uống, thuốc này trị được nhiều bệnh và như một bài thuốc dân gian nó vẫn tồn tại cho tới ngày nay. Xã hội ngày càng phát triển thì tỷ lệ dịch bệnh ngày càng tăng và đa dạng thì việc tạo ra loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên có hiệu quả cao đồng thời không có tác dụng phụ là điều hết sức cần thiết. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về cây thuốc, đi sâu tìm hiểu từng hoạt chất có trong cây cỏ có trong các bài thuốc dân gian. Bên cạnh đó, các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trở nên rất phổ biến và phương pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến rủi ro do hiện tượng kháng thuốc. Do đó, việc tìm ra một nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn giúp ta tạo ra một phương pháp điều trị một cách hiệu quả đối với đối với một số bệnh thông thường. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ Podocarpus sp.” 2. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây Podocarpus sp. với nhiều dung môi khác nhau 1
  11. Đồ án tốt nghiệp Xác định thành phần hóa học của cây Podocarpus sp. với nhiều dung môi khác nhau. 3. Nội dung nghiên cứu Đánh giá ảnh hưởng của một số dung môi đến hiệu suất thu hồi từ Podocarpus sp. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số dung môi từ Podocarpus sp. Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC của Podocarpus sp. Xác định thành phần hóa học của một số dung môi từ Podocarpus sp. 4. Phạm vi nghiên cứu Các khảo sát thực hiện trên dung môi ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90%, nước, methanol 75%. Chỉ khảo sát cây thuốc với mức độ chi Podocarpus sp. Giới hạn khảo sát chỉ trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu Podocarpus sp. 1.1.1. Phân loại Giới : Plantae Ngành : Pinophyta Lớp : Pinopsida Bộ : Pinales Họ : Podocarpaceae Chi : Podocarpus Tên tiếng Việt: Thông lông gà; Thông nàng; Bạch tùng; Mạy hương; Savat; Songo; Nori; Tran; Ngo ri; Sri; Vra panh; Ca do; O ri Có khoảng 105 loài trong chi này. Dạng sống chủ yếu của thực vật trong chi này là cây gỗ thường xanh và cây bụi. Chi này có 2 phân chi là là Podocarpus và Foliolatus. 1.1.2. Đặc điểm hình thái Bạch tùng là loài cây gỗ có kích thước lớn, thân tròn đều, dáng thân thẳng đẹp, cao đến 30 m và đường kính 50 - 60 cm. Vỏ thân xám trắng, vỏ bên trong màu đỏ sáng với nhựa nâu, dát gỗ màu kem. Thân cành lan rộng và các nhánh thấp hơn thường rủ xuống. Nhựa màu đỏ-cam, thơm, trên cây non, lá mọc xếp thành hai dãy như lông chim, dài khoảng trên dưới 1 cm, còn trên cây già, lá hình vẩy nhỏ, đầu nhọn. Tán rậm màu xanh đậm. Hạt hình trứng, dài 0,5-0,6 cm, bóng.( Vũ Văn Dũng). 1.1.3. Đặc điểm sinh học và sinh thái học Chi này có 2 phân chi là Podocarpus và Foliolatus Phân chi Podocarpus thường thấy ở các khu rừng thuộc Tasmania, New Zealand, nam Chile, một vài loài (nhưng hiếm thấy) ở vùng cao nguyên nhiệt đới 3
  13. Đồ án tốt nghiệp châu Phi và châu Mỹ. Phân chi Foliolatus thường thấy phân bố tự nhiên ở châu Á và châu Úc. Ở Việt Nam, cây mọc ở rừng nhiệt đới ẩm thường xanh, giữa các độ cao 300 - 2400 m. Phân bố rải rác ở một số nơi, như đã gặp ở vùng Quảng Ninh (Hoành Bồ), Lào Cai (Sa Pa), Nghệ An (Pù Mát), Quảng Bình, Quảng Trị, Khánh Hoà và Lâm Đồng. Cây còn mọc ở một số nơi vùng Tây Nguyên như Gia Lai, Kon Tum và Đắc Lắc. Phân bố của loài rất thưa thớt, không tìm thấy cây mọc thành quần thụ hoặc thành đám, tái sinh tự nhiên chủ yếu ở chỗ trống, ven đường đi. Gây trồng khó và sinh trưởng chậm. Bạch tùng đã được trồng thử tại Đà Lạt, song sắc lá màu vàng chứng tỏ sinh trưởng kém. Một số cây con cũng đã được trồng thử tại Mang Linh trong những năm vừa qua. Cây mọc chậm, sống lâu, ưa sáng, lúc nhỏ cần che bóng (Vũ Văn Dũng, 1996). Hình 1. 1.Hình ảnh cây Podocarpus imbricatus 1.1.4. Công dụng của Podocarpus sp. Một số loài Podocarpus được sử dụng trong y học cổ truyền cho các bệnh như sốt, ho, viêm khớp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục. Một loại thuốc hóa trị liệu được sử dụng trong điều trị bệnh bạch cầu được làm từ Podocarpus. Một số loài Podocarpus được trồng làm cây vườn, hoặc hàng rào, thường cho tán lá xanh, bao gồm P.macrophyllus, dương xỉ, hoặc P.kusamaki, P. salignus từ Chile, và P. nivalis, cây bụi đỏ cho trái nhỏ hơn. Gỗ bạch tùng đẹp, màu vàng nhạt hay màu nghệ, thớ mịn, có giá trị, dễ gia công chế biến, được khai thác mạnh ở khắp nơi 4
  14. Đồ án tốt nghiệp để dùng làm gỗ xây dựng và trần nhà, sàn nhà. Tỷ trọng đạt 0,56. Không thuộc loại gỗ bền, tốt nhưng đẹp và hiếm nên vẫn được ưa dùng. 1.2. Thành phần hóa học của thực vật 1.2.1. Carbohydrate 1.2.1.1. Khái niệm Carbohydrate là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố: C, H, O. Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n và là nhóm phổ biến nhất trong bốn nhóm phân tử sinh học chính. Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ. 1.2.1.2. Tính chất Carbohydrate có thể chia thành 3 nhóm: - Monosaccharide: glucose, fructose - Disaccharide: saccharose, lactose, maltose - Polysaccharide: tinh bột, cellulose Chúng có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nước, đồng hoá và sử dụng nhanh để tạo glycogen. Các carbohydrate đơn giản đều có vị ngọt, khi vào cơ thể xuất hiện tương đối nhanh trong máu. 1.2.1.3. Vai trò - Cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể thực vật - Vai trò cấu trúc, tạo hình (Cellulose, ) - Bảo vệ (Mucopolysaccharide) - Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể). 1.2.2. Amino acid 1.2.2.1. Khái niệm Amino acid là một phân tử chứa cả nhóm amin và carboxylate. Công thức chung: (H2N)x – R – (COOH)y 1.2.2.2. Tính chất 5
  15. Đồ án tốt nghiệp Các amino acid là những chất rắn ở dạng tinh thể không màu, vị hơi ngọt, dễ tan trong nước (do tồn tại kiểu muối nội phân tử). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 200 – 3000C. 1.2.2.3. Vai trò Amino acid thiên nhiên (hầu hết là α-amino acid) là cơ sở để kiến tạo nên các loại protein của cơ thể sống Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất ở thực vật Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật Tăng khả năng ra hoa và quả (Trumbo P, 2013). 1.2.3. Alkaloid 1.2.3.1. Khái niệm Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số có nhân dị vòng 1.2.3.2. Tính chất Đa số các alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất yếu như caffein, piperin vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromine và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin. Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alcaloid ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH khi định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp. Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng. Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt ) tạo ra muối phức. 1.2.3.3. Vai trò 6
  16. Đồ án tốt nghiệp - Alkaloid co tác dụng diệt khuẩn - Tác động lên hệ thần kinh - Hạ huyết áp - Chống ung thư (Ngô Văn Thu, 2011) 1.2.4. Glycoside 1.2.4.1. Khái niệm Glycoside là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, cấu trúc của các hợp chất này gồm hai thành phần – phần đường và phần không đường. Phần đường của glycoside gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin. Glycoside là những sản phẩm ngưng tụ của đường 1.2.4.2. Tính chất Glycoside là dạng tinh thể không màu. Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men) có chứa trong cây. Phần đường trong glycoside chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, galactose. Trong thành phần của một số glycoside có đường đặc biệt không có trong các glycoside khác (ví dụ trong glycoside tim). Phần aglycon của các glycoside có thể thuộc các nhóm chất hữu cơ khác nhau ví dụ cồn, andehyd, acid, phenol, dẫn chất anthracen đôi khi có các aglycon có chứa nitơ, lưu huỳnh song thường chứa cacbon, hydro, oxy. Do đặc tính dễ bị phân huỷ, khó thu được ở dạng tinh khiết nên việc nghiên cứu cấu trúc thường gặp nhiều khó khăn. Tác dụng phụ thuộc vào phần aglycon, phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. 7
  17. Đồ án tốt nghiệp 1.2.5. Steroid 1.2.5.1. Khái niệm Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của bốn vòng cycloalkane được nối với nhau 1.2.5.2. Tính chất Steroid là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp Khi đun nóng với Se ở 36000C sẽ tạo hợp chất Hidrocacbon Diel. 1.2.5.3. Vai trò Steroid tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Cho đến nay, người ta đã biết đến hàng chục nghìn steroid và trong số đó có hàng trăm chất được sử dụng trong y học. Thường dùng làm các thuốc kích thích (Pedro Aqueveque và ctv, 2005). 1.2.6. Tannin 1.2.6.1. Khái niệm Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và alkaloid) 1.2.6.2. Đặc điểm Tannin có vị chát, làm săn da, tan được trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ. Tannin kết hợp với protein không tan trong nước và dung môi hữu cơ nhưng chiết ra được bằng dung dịch kiềm. Tannin tủa bông trắng với dung dịch gelatin. Tannin tủa với alkaloid, muối kim loại nặng như ch́ì, thuỷ ngân, kẽm, sắt. Với muối sắt những tannin khác nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với đậm độ 8
  18. Đồ án tốt nghiệp khác nhau. (Có thể dựa vào tủa với muối sắt để xác định tannin trên vi phẫu - nhỏ muối sắt III, kalibicromat 10%, tạo thành tủa nâu trên tế bào chứa tannin). 1.2.6.3. Vai trò Tannin bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy (Katie E. Ferrell và ctv, 2006). 1.2.7. Isoprenoid (Terpene) 1.2.7.1. Khái niệm Isoprenoid là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon được tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8. Ngoài các hydrocacbon không no, các dẫn xuất của chúng như ancol, andehyd, ceton, cacboxylic acid cũng được gọi là tecpen. Tuỳ theo số nguyên tử cacbon trong mạch hydrocacbon, người ta phân chúng thành các nhóm: monoterpen, secpuiterpen, diterpen, triterpen, tetraterpen, polyterpen. Trong đó monoterpen là quan trọng nhất trong terpenoid. Nó có cấu trúc mạch hở, mạch vòng. Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông và trong tinh dầu thảo mộc như tinh dầu xả, quế, cam, chanh. 1.2.7.2. Tính chất Terpene hường nhẹ hơn nước, chất lỏng không màu có mùi thơm. Không hòa tan hoặc ít tan trong nước, dễ tan trong ethanol. 1.2.7.3. Vai trò Terpene là thành phần chính của các loại tinh dầu của nhiều loại cây và hoa. Tinh dầu được sử dụng rộng rãi như là chất phụ gia hương vị tự nhiên cho thực phẩm, như nước hoa nước hoa, và trong y học và thuốc thay thế như hương liệu . Biến thể tổng hợp và các dẫn xuất của tecpen thiên nhiên và terpenoid đa dạng của 9
  19. Đồ án tốt nghiệp các hương liệu được sử dụng trong nước hoa và hương vị được sử dụng trong các chất phụ gia thực phẩm. Vitamin A là một terpene. (Đỗ Tất Lợi, 2004) 1.3. Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật 1.3.1. Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn Hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa của chúng, thường có tác dụng đặc hiệu với một nồng độ rất nhỏ. Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid, flavonoid, tannin và một số loại tinh dầu (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2010). 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn: tác động lên quá trình tổng hợp vách tế bào làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu. Ức chế chức năng của màng tế bào (tổn thương màng tế bào): cơ chế làm mất chức năng của màng, các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide. Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bất hoạt RNA, DNA: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin). Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình 10
  20. Đồ án tốt nghiệp nhân đôi của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid. Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic (Amoros và ctv, 1992). 1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 1.3.3.1. Alkaloid a. Solamargine Solamargine, một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum), và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dung chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. b. Berberine Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella, tụ cầu khuẩn, nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn axit. Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét. Cơ chế kháng khuẩn Berberine là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn. Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột. Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột. 1.3.3.2. Terpenoid và tinh dầu Các loại terpenoid tinh dầu cũng có khả năng kháng khuẩn nhờ các khả năng hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn bởi các hợp chất lipophilic. Phá vỡ vách tế bào. Terpenene và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và động vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu 11
  21. Đồ án tốt nghiệp có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn. Các acid betulinic triterpenoid chỉ là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế được HIV. Gần đây các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogenes. 1.3.3.3. Phenol đơn và acid phenolic Phenolic được xem là nguyên nhân dẫn đến sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein. a. Quinone Quinone có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Vì lí do đó khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. b. Tannin Tannin có khả năng liên kết với protein làm mất hoạt tính của các protein chức năng, ức chế enzyme được xem là cơ chế chung của các hợp chất tannin (Hisanori Akiyama và ctv, 2001). c. Flavonoid Flavonoid có khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào và tạo phức với thành tế bào vi khuẩn. Các flavonoid càng ưa béo có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật. Chúng có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucose. Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được, ức chế tổng hợp axit nucleic của vi khuẩn, tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của vi khuẩn (Cushnie T. P và Lamb A. J, 2006). 12
  22. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3.4. Lectin và polypeptide Cơ chế kháng khuẩn là do có sự hình thành của các ion trên màng vi sinh vật, hoặc do sự cạnh tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ quan nhận cảm vật chủ ở vi sinh vật. Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi chất và ảnh hưởng tới các thành phần tế bào chất. 1.3.3.5. Saponin Nhóm saponin, chủ yếu là asiaticosid có tác dụng lên Mycobacterium leprae. Tác dụng được giải thích do asiaticosid làm tan màng sáp của vi khuẩn (Michał Arabski và ctv, 2012). 1.3.4. Khái niệm nồng độ ức chế tối thiểu MIC 1.3.4.1. Khái niệm Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimal Inhibitory concentration) là nồng độ thấp nhất của một kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định. 1.3.4.2. Cách xác định Muốn biết vi khuẩn nhạy với kháng sinh ở nồng độ chính xác là bao nhiêu, ta phải làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp. Kháng sinh có thể được pha loãng với phương pháp: - Agar well diffusion method - Disc diffusion method Ta có thể xác định MIC là nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng của vi khuẩn, quan sát được bằng mắt trần 13
  23. Đồ án tốt nghiệp 1.3.4.3. Ý nghĩa Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng). Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và bằng mắt thường đã có thể xác định được điều này. 1.4. Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 1.4.1.1. Escherichia coli a. Đặc điểm Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính. Hình 1. 2. Hình ảnh Escherichia coli dưới kính hiển vi b. Khả năng gây bệnh của một số Escherichia coli EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): gây xuất huyết ở ruột. EPEC (Enteropathogenic E.coli): gây bệnh đường ruột, chủ yếu gây bệnh ở trẻ em, cơ chế gây bệnh chưa rõ. ETEC (Enterotoxigenic E.coli): sinh độc tố ruột. EIEC (Enteroinvasive E.coli ): gây bệnh do xâm lấn tế bào. 14
  24. Đồ án tốt nghiệp EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli kết tập ở ruột (Cao Minh Nga, 2014). 1.4.1.2. Shigella a. Đặc điểm Shigella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính. Hình 1. 3. Ảnh chụp của Shigella sp. trong một mẫu phân b. Khả năng gây bệnh của một số Shigella Gây bệnh lỵ trực trùng, có 4 nhóm: Nhóm A: S. dysenteriae: tiết độc tố shiga Nhóm B: S. flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga- like- toxin) Nhóm C: S. boydii: không tiết độc tố Nhóm D: S. sonnei: tiết độc tố giống shiga. (Cao Minh Nga, 2014) 1.4.1.3. Salmonella a. Đặc điểm 15
  25. Đồ án tốt nghiệp Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính. Hình 1. 4. Hình ảnh của Salmonella b. Khả năng gây bệnh của một số Salmonella S. typhi: gây sốt thương hàn S. choleraesuis: gây nhiễm trùng máu và áp- xe khu trú ở các cơ quan nội tạng S.enteridis: gây viêm ruột (Cao Minh Nga, 2014) 1.4.1.4. Vibrio a. Đặc điểm Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrite từ nitrate. 16
  26. Đồ án tốt nghiệp Hình 1. 5. Hình ảnh Vibrio cholerae b. Khả năng gây bệnh của một số Vibrio Một số loài vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh. Hầu hết các chủng gây bệnh có liên quan với viêm dạ dày ruột, nhưng cũng có thể lây nhiễm các vết thương hở và gây nhiễm trùng huyết. Tiếu biểu như Vibrio alginolyticu gây nhiễm trùng vết thương, chúng cũng có mặt trong các cơ quan của động vật như cá nóc. V. cholera là tác nhân gây bệnh tả. V. harveyi là một tác nhân gây bệnh của một số loài động vật thủy sinh. Vibrio parahaemolyticus ăn phải vi khuẩn có trong hải sản sống hoặc nấu chưa chín, thường là hàu, là nguyên nhân chủ yếu là viêm dạ dày cấp tính, nhiễm trùng vết thương cũng xảy ra, nhưng ít phổ biến hơn so với bệnh thủy sản gây ra. 1.4.1.5. Listeria a. Đặc điểm Listeria là một vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử. Có thể được tìm thấy trong đất, nước, trong các loại thịt chưa nấu chín, rau sống, trái cây, thực phẩm làm từ sữa, và thực phẩm chế biến. 17
  27. Đồ án tốt nghiệp Hình 1. 6. Hình chụp Listeria monocytogenes bằng kính hiển vi điện tử b. Khả năng gây bệnh Các bệnh của người trong chi Listeria thường do Listeria monocytogenes gây ra. Đây là loại vi khuẩn gây độc, với 20% đến 30% số ca nhiễm lâm sàng gây nên bệnh Listeriosis dẫn đến tử vong. Một số triệu chứng liên quan với bệnh listeriosis bao gồm sốt, đau cơ, tiêu chảy, nôn và buồn nôn. Phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và những người có hệ miễn dịch kém là dễ bị bệnh listeriosis. c. Một số Listeria Listeria innocua L. monocytogenes L. welshimeri (Jemmi và Stephan, 2006) 18
  28. Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 1.4.2.1. Pseudomonas aeruginosa a. Đặc điểm Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học. Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Hình 1. 7. Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa b. Khả năng gây bệnh Pseudomonas là một trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người. Vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ thể, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho nên nó lây nhiễm và phá hủy các mô của 19
  29. Đồ án tốt nghiệp người bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử vong cao; bởi vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt niêm mạc bên trong cơ thể. Bên cậnh đó, vi khuẩn này cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên nhân gây ra viêm chân lông. 1.4.2.2. Staphylococcus aureus a. Đặc điểm Staphylococcus aureus là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi. Hình 1. 8. Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus b. Khả năng gây bệnh Staphylococcus aureus là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu. Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da. (Ogston A, 1984) 1.4.2.3. Enterococcus feacalis a. Đặc điểm 20
  30. Đồ án tốt nghiệp Enterococcus feacalis: Gram dương,lên men glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường. Không tạo độc tố, và không tạo ra một phản ứng catalase với hydrogen peroxide. Nó có thể tạo ra một phản ứng pseudocatalase nếu trên môi trường thạch máu. Hình 1. 9. Hình ảnh Enterococcus feacalis b. Khả năng gây bệnh E. faecalis có thể gây ra viêm nội tâm mạc và nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm màng não và nhiễm trùng khác ở người. 21
  31. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa diểm Thu mẫu: vườn quốc gia Bidoup- Núi Bà, địa bàn huyện Lạc Dương, Đam Rông, tỉnh Lâm Đồng. Thí nghiệm: Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học- Thực phẩm- Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TpHCM. 2.1.2. Thời gian Từ tháng 3/2015 đến 8/2015 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn mẫu Cây thuốc dân gian (tự nhiên) thu ở Lâm Đồng gồm lá, thân, cành của cây Podocarpus sp. 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị - 4 chủng Escherichia coli spp. - 4 chủng Salmonella spp. - 4 chủng Vibrio spp. - 3 chủng Shigella spp. - Pseudomonas aeruginosa - Staphylococcus aureus - Enterococcus feacalis 2.2.3. Hóa chất, môi trường Dung môi DMSO (dimethysulfoside) (Trung Quốc) Methanol (Trung Quốc) Ethanol (Trung Quốc) Cồn (Việt Nam) 22
  32. Đồ án tốt nghiệp Nước cất (Việt Nam) NaCl (Đức) Môi trường TSA, TSB (Trung Quốc) Agar (Việt Nam) 2.2.4. Dụng cụ, thiết bị Tủ cấy vô khuẩn Autoclave Tủ ấm, Tủ lạnh Tủ sấy Máy lắc Máy đo OD Cân điện tử, Cân phân tích Bếp điện Phễu Giấy lọc Bình tam giác Pipette loại 100 – 1000 μl.Đầu típ loại 100- 1000 μl Ống nghiệm Que cấy trang, que cấy vòng Đèn cồn, đĩa petri Parafilm. 23
  33. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu Lá, thân, cành cây Podocarpus sp. Rửa sạch Phơi khô đến trọng lượng không đổi Xay mẫu thành bột mịn Hình 2. 1. Quy trình xử lý mẫu Lá, thân, cành của Podocarpus sp. được thu thập từ vùng Lâm Đồng rửa sạch và phơi khô trong không khí tới khi có trọng lượng không đổi. Các mẫu phơi khô được cắt thành miếng nhỏ và sau đó nghiền thành bột. Bột mẫu được đựng trong túi nhựa và được lưu trữ trong một nơi kín khí chuẩn bị cho công việc tiếp theo (Moses, A.G, 2013). 2.3.2. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi khuẩn Mục đích: tăng sinh khối vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết, giúp hoạt hóa vi khuẩn trở về trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng phải chứa thành phần đa lượng và vi lượng để vi sinh vật phát triển, đảm bảo có đủ điều kiện lý hóa thích hợp để vi sinh vật trao đổi chất với môi trường. 24
  34. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành: - Chuẩn bị chai chứa 10ml môi trường tăng sinh - Lấy sinh khối vi sinh vật cho vào chai môi trường - Lắc 150 vòng/phút, 18- 24h ở nhiệt độ phòng (sinh khối vi sinh vật tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy) 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống Hiện nay có 3 cách giữ giống: - Giữ giống thạch nghiêng: lấy giống VSV cấy vào ống thạch nghiêng, ủ cho VSV phát triển, đem trữ lạnh ở nhiệt độ 40C. Giống này thường được sử dụng cho sản xuất. Thời gian sử dụng từ 7 – 10 ngày. - Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ -40C: vi khuẩn sau khi tăng sinh, hút vào eppendorf và ly tâm 5000 v/p trong thời gian 15 phút. Loại bỏ dịch và giữ cặn. Bổ sung 1 ml glycerol 20% và đồng nhất rồi bảo quản ở nhiệt độ -40C. Giống này được sử dụng để cấy chuyển qua thạch nghiêng. Thời gian sử dụng từ 1 – 3 tháng. - Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ - 180C: cách làm tương tự như trên nhưng bảo quản ở nhiệt độ - 180C. Giống này khi sử dụng để chuyển về -40C trước khi cấy sang thạch nghiêng. Thời gian sử dụng từ 6 tháng – 1 năm. 2.3.4. Phương pháp ngâm mẫu Mục đích: tách chiết hợp chất kháng khuẩn thực vật để nghiên cứu Nguyên tắc: sử dụng dung môi để tách chiết các hợp chất trong thực vật nhờ lực liên kết hóa học Tiến hành: - Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi cho vào erlen, ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 1 - Bã + 100ml dung môi ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 2 - Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần 25
  35. Đồ án tốt nghiệp 2.3.5. Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết dựa trên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Aibinu và ctv, 2007) các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Nếu các hợp chất trong cây có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Phương pháp được thực hiện như sau: Hút dịch vi khuẩn chỉ thị có mật độ 106 cfu/ml để trang trên đĩa TSA. Sau khi trang đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô. Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng kim đã hấp tiệt trùng ghim các khối thạch ra bỏ. Dùng 100 µl dịch vi khuẩn cần khảo sát, nhỏ vào mỗi lỗ trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn chỉ thị, tiến hành dán parafilm để tránh nhiễm. Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và đo đường kính vòng kháng khuẩn. 2.3.6. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng). Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và bằng mắt thường đã có thể xác định được điều này. Phương pháp xác định chỉ số MIC của cao chiết dựa trên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Aibinu và ctv, 2007) tại các nồng độ cao chiết khác nhau, các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường agar cũng khác nhau và cùng tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Nồng độ cao chiết thấp nhất mà tại đó chúng bắt đầu có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch gọi là nồng độ ức chế tối thiểu. 26
  36. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp được thực hiện như sau: Hút dịch vi khuẩn chỉ thị có mật độ 106 cfu/ml để trang trên đĩa TSA. Sau khi trang đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô. Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng kim đã hấp tiệt trùng ghim các khối thạch ra bỏ. Hút 100µl dịch cao chiết với nồng độ khác nhau, nhỏ vào các lỗ trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn chỉ thị, tiến hành dán parafilm để tránh nhiễm. Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và đo đường kính vòng kháng khuẩn. 2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ Podocarpus sp. bằng các phản ứng hóa học với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. Phương pháp xác định thành phần hóa học dựa theo phương pháp của Moses A.G, 2013 và Phani Deepthi Yadav, 2013 bao gồm xác định thành phần hóa học nhóm Carbohydrate bằng các thử nghiệm Molisch, thử nghiệm Flehling, thử nghiệm Barfoed; định tính Alkaloid bằng thử nghiệm Mayer, thử nghiệm Dragendroff, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Wagner; Saponin thử nghiệm Foam; Cardiac glycoside gồm thử nghiệm Legal, thử nghiệm Keller Killiani; Anthraquinone glycoside thử nghiệm Bontrager; Flavonoid gồm thử nghiệm alkaline, thử nghiệm Shinoda, thử nghiệm ferric chloride; Phenolic gồm thử nghiệm lead acetate, thử nghiệm gelatin; Tannin gồm thử nghiệm ferric chloride, thử nghiệm lead acetate; Steroid gồm thử nghiệm Salkowski, thử nghiệm Libermann Burchard; Amino acid thử nghiệm Ninhydrin. 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu Sừ dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 và phần mềm Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu. 27
  37. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm Mẫu Podocapus sp. Xử lý mẫu Cao chiết với các dung môi khác nhau Xác định thành Đánh giá hoạt tính phần hóa học kháng khuẩn Xác định chỉ số MIC Đọc kết quả Hình 2. 2.Quy trình chung 28
  38. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao Mẫu Podocapus sp. Phơi khô, xay mịn Ethanol 50% Ngâm methanol 75% (tỉ Ngâm trong các dung Ethanol 70% lệ 1:15, w/v) môi (tỉ lệ 1:20, w/v) Ethanol 90% Nước Ly tâm 4000 v/p Lọc Cô cách thủy(70 Cô quay 500C 0C) Cao Thu cao methanol Ethanol 50 Ethanol 70 Ethanol 90 Cao nước Hình 2. 3. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao Cây Podocarpus sp. thu thập từ Lâm Đồng được đem chọn lựa, rửa sạch, phơi khô trong không khí đến khi trọng lượng không đổi. Sau đó, mẫu cây được cắt nhỏ, xay nhuyễn thành bột mịn. Bột cây tiếp tục được ngâm với các dung môi ethanol, nước, methanol. Đối với dung môi ethanol (50 %, 70 %, 90 %): 29
  39. Đồ án tốt nghiệp - Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi ethanol (tỉ lệ 1:20,w/v) cho vào erlen, ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 1 - Bã + 100ml dung môi ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 2 - Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần - Cô cách thủy ở 700C, thu cao. Đối với dung môi nước: - Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi nước (tỉ lệ 1:20,w/v) cho vào erlen, ngâm 4h, lọc, thu dịch lần 1 - Bã + 100ml dung môi ngâm 4h, lọc, thu dịch lần 2 - Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần - Cô cách thủy ở 700C, thu cao Hình 2. 4.Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 50o 30
  40. Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 5 .Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 70o Hình 2. 6. Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 90o 31
  41. Đồ án tốt nghiệp Đối với dung môi methanol (tỉ lệ 1:15, w/v) ngâm trong vòng 24 giờ. Sau đó ly tâm 4000 v/p trong 10 phút thu được dịch lần 1, bã còn lại tiếp tục được ngâm với methanol 75% theo tỷ lệ 1:15 trong 24 giờ và ly tâm được dịch lần 2, làm tương tự thu được dịch lần 3. Dịch ở cả 3 lần được thu hồi và đưa đến trường đại học Khoa Học Tự Nhiên cơ sở Linh Trung quận Thủ Đức để tiến hành cô quay chân không ở 500C tới khi thu được thể tích không đổi. Lượng dịch này sau đó được đông khô ở -200C trong 3 ngày thu được cao chiết methanol. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Tiến hành đánh giá hiệu suất tách chiết cao ở mỗi nghiệm thức bằng công thức: H(%) = M1−M x 100 % m M1 (g): khối lượng cốc sau khi cô mẫu M (g): khối lượng cốc ban đầu m (g): khối lượng bột cao ban đầu 32
  42. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của Podocarpus sp. với các dung môi khác nhau Vi sinh vật chỉ thị Tăng sinh trong TSB/ TSB+NaCl 1.5% Lắc 150 vòng/phút,nhiệt độ phòng 18-24h Đo OD 600nm Nước muối Pha loãng vi sinh vật đạt 106 cfu/ml sinh lý Hút 100µl vào đĩa petri chứa TSA/ TSA+NaCl 1.5%, trang đều Đục lỗ trên môi trường TSA Cao+DMSO 1% Nhỏ 100l dịch chiết vào Dịch cao (100 mg/ml) giếng trên môi trường TSA Ủ 370C, 24h Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng đường kính vòng kháng Hình 2. 7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn 33
  43. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.1. Chuẩn bị môi trường Môi trường tăng sinh: - Môi trường TSB: 3g/100ml - Môi trường dùng cho chủng Vibro: 3g TSB+ 1,5% NaCl 2.4.2.2. Tiến hành Chuẩn bị 20 chai có chứa 10ml môi trường tăng sinh. Cấy 20 chủng vi khuẩn vào 20 chai môi trường Lắc 150 vòng/phút, 18- 24h ở nhiệt độ phòng và thu dịch Dịch vi sinh vật sau khi được tăng sinh, tiến hành đo OD ở 600 nm Pha loãng các chủng vi sinh vật theo công thức: C.V=C’.V’ Trong đó: C: mật độ vi sinh vật sau tăng sinh (đo OD) V: thể tích cần cấy giống C’: mật độ vi sinh vật 106 cfu/ml V’: thể tích tăng sinh 10ml Tính V Hút V vào ống nước muối sinh lý 10ml Hút 1ml từ ống trên cho vào ống chứa 9ml nước muối sinh lý Hút 100l cho vào đĩa petri (chứa môi trường TSA), trang đều đĩa cho khô Đục lỗ (d = 8 mm) trên đĩa petri đã cấy trang Hút 100l dịch cao (cao+DMSO 1%) nồng độ 100- 200 mg/ml cho vào từng giếng thạch Ủ 37oC, 24h 34
  44. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.3. Đọc kết quả Đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao (20 chủng vi khuẩn) So sánh vòng kháng khuẩn của mẫu cao và kháng sinh Nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung quanh chứng tỏ cao có kháng khuẩn chủng vi khuẩn đó. Ta sử dụng chủng vi khuẩn này tiếp tục thử nghiệm xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC). Hình 2. 8 . Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn a) cao chiết ethanol 70% với ETEC b) cao chiết ethanol 70% với Listeria monocytogenes c) cao chiết methanol 75% và nước với Vibrio harveyi d) cao chiết ethanol 50% với Vibrio cholera 35
  45. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) Hình 2. 9. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. 2.4.3.1. Chuẩn bị môi trường Môi trường tăng sinh: - Môi trường TSB: 3g/100ml - Môi trường dùng cho chủng Vibro: 3g TSB+ 1,5% NaCl 2.4.3.2. Tiến hành Chuẩn bị chai có chứa 10ml môi trường tăng sinh. Cấy các chủng vi khuẩn vào chai môi trường 36
  46. Đồ án tốt nghiệp Lắc 150 vòng/phút, 18- 24h ở nhiệt độ phòng và thu dịch Dịch vi sinh vật sau khi được tăng sinh, tiến hành đo OD ở 600 nm Pha loãng các chủng vi sinh vật theo công thức: C.V=C’.V’ Trong đó: C: mật độ vi sinh vật sau tăng sinh (đo OD) V: thể tích cần cấy giống C’: mật độ vi sinh vật 106 cfu/ml V’: thể tích tăng sinh 10ml Tính V Hút V vào ống nước muối sinh lý 10ml Hút 1ml từ ống trên cho vào ống chứa 9ml nước muối sinh lý Hút 100l cho vào đĩa petri (chứa môi trường TSA), trang đều đĩa cho khô Dùng ống kim loại đục lỗ (d = 8 mm) trên đĩa petri đã cấy trang Cao chiết ethanol 70 % được cân và pha loãng trong DMSO 1% theo dãy nồng độ 100, 50, 25, 12.5 mg/ml Hút 100l dịch cao (cao+DMSO 1%) cho vào từng giếng thạch. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần trên từng chủng vi sinh vật chỉ thị Ủ 37oC, 24h. 2.4.3.3. Đọc kết quả Đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao Đọc kết quả lần lượt từ đĩa thạch có nồng độ cao chiết thấp đến cao. Nồng độ MIC được xác định ở đĩa thạch có nồng độ cao chiết thấp nhất xuất hiện vòng kháng khuẩn. 37
  47. Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 10. Kết quả MIC của ETEC Hình 2. 11 . Kết quả MIC của E.coli O157:H7 38
  48. Đồ án tốt nghiệp 2.4.4. Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học Podocarpus sp. Mẫu Podocapus sp. Ngâm trong H2SO4 10% Ngâm trong DMSO 1% Lọc Lọc Alkaloid Carbohydrate Saponnin, Flavonoid, Steroid, cardiac phenolic amino acid glycoside, compound, althraquinone tannin Hình 2. 12. Quy trình xác định thành phần hóa học Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao được ngâm trong H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được pha trong DMSO cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó, tiến hành pha loãng và lọc qua giấy lọc để thu dịch trong để tiến hành thử nghiệm. 2.4.4.1. Carbohydrate Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. Thêm vào 5-6 giọt thuốc thử Molisch. Nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm. Kết quả: Hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách 39
  49. Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm Feling: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào 100 mg cao chiết. Đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Kết quả: Quan sát kết tủa màu đỏ của CuO Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả: Hình thành kết tủa màu đỏ gạch Hình 2. 13. Thử nghiệm carbohydrate và saponin 2.4.4.2. Alkaloid Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. Cho vài giọt thuốc thử Meyer. Kết quả: Quan sát kết tủa màu đục tạo thành. Thử nghiệm Dragendroff: Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm. Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendroff. Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng cam. Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm 2 ml thuốc thử Hager. Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm 2 ml thuốc thử Wagner. Kết quả: Hình thành kết tủa màu nâu đỏ. 40
  50. Đồ án tốt nghiệp 2.4.4.3. Saponin Thử nghiệm Foam: Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh. Kết quả: Hình thành bọt ổn định. 2.4.4.4. Anthaquinone glycoside (thử nghiệm Bontrager) Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm 2 ml H2SO4 loãng thêm H2O2 hoặc FeCl3 và đun sôi 30 phút. Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc rồi thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên. Tách lấy lớp benzene và thêm 2 ml ammonia 10% và quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả: Xuất hiện màu đỏ. 2.4.4.5. Flavonoid Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh. Thêm vài giọt HCl loãng mất màu chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. Kết quả: Xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl. Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, sau đó cho dịch mẫu bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm, bổ sung 5 ml cồn 95%. Kết quả: Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. Thử nghiệm Ferric chloride: Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10%. Kết quả: Xuất hiện màu xanh hoặc tím 41
  51. Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 14 Thử nghiệm flavonoid 2.4.4.6. Phenolic Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho 1,5 ml Chì acetate 10%. Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng. Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm một vài gelatin 1% . Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng. 42
  52. Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 15 . Thử nghiệm phenolic 2.4.4.7. Tannin Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho vào 4 giọt ferric chloride 10%. Kết quả: Xuất hiện màu xanh. Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho vào 4 giọt Chì acetate. Kết quả: Xuất hiện kết tủa màu vàng. 43
  53. Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 16 . Thử nghiệm tannin 2.4.4.8. Steroid Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc. Lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp. Đọc kết quả ở mặt phân cách: - Xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới: sterol - Hình thành màu vàng ở lớp dưới: triterpenoid Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm.Kết quả: - Xuất hiện vòng màu xanh dương đậm hoặc xanh lá cây ở mặt phân cách: steroid - Hình thành vòng màu nâu đỏ đậm: triterpenoid 44
  54. Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 17 . Thử nghiệm steroid 2.4.4.9. Amino acid Hút 1 ml dịch chiết, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin rồi đun sôi cách thủy trong 5 phút. Kết quả: Xuất hiện màu tím. 45
  55. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 20 18 b b b 16 14 a a 12 10 8 Hiệu suất (%) Hiệu suất 6 4 2 0 Ethanol 50 Ethanol 70 Ethanol 90 Nước Methanol Hình 3. 1. Hiệu suất tách chiết từ Podocarpus sp. của một số dung môi Dựa vào hình 3.1 chúng tôi nhận thấy rằng hiệu suất tách chiết ở các dung môi khác nhau có sự khác biệt. Hiệu suất tách chiết ethanol 50%, 70%, 90% không có sự khác biệt, nhưng cao hơn hiệu suất tách chiết của nước, methanol 75% một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Kết quả tách chiết cao từ cây Podocarpus sp. cho thấy rằng sử dụng dung môi ethanol 90% cho hiệu suất tách chiết cao nhất trong số 5 dung môi, hiệu suất trung bình là 16,99%, kế đến hiệu suất tách chiết ethanol 50% là 16,33%, hiệu suất tách chiết ethanol 70% là 15,82%, hiệu suất tách chiết nước là 11,99%. Cuối cùng, hiệu suất tách chiết methanol 75% thấp nhất 11,56%. Qua kết quả trên có thể thấy hiệu suất tách chiết của dung môi ethanol là tối ưu. Điều này cho thấy dung môi ethanol hòa tan được nhiều hoạt chất của cây Podocarpus sp. hơn các dung môi khác. 46
  56. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Podocarpus sp. với các dung môi khác nhau Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Podocarpus sp. được trình bày ở hình 3.2. 3.2.1. Nhóm Escherichia coli spp. 35 c 30 25 20 15 b b b b a 10 a a 5 Đường kính vùng ức ức vùngchế (mm) kính Đường 0 Ethanol 50 Ethanol 70 Ethanol 90 Nước Methanol Ciprofloxacin Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli Enterotoxigenic E.coil-ETEC Hình 3. 2. Hoạt tính kháng khuẩn của Echerichia coli spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500g/ml Dựa vào hình 3.2. chúng tôi nhận thấy rằng trong 5 loại cao chiết từ các dung môi khảo sát chỉ có 2 loại cao chiết từ dung môi ethanol 70%, 90% có thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trong nhóm E.coli khảo sát. Đối với cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. phổ kháng khuẩn của chúng khá rộng đối với nhóm E.coli spp., chúng kháng được 3/4 chủng E.coli khảo sát. Đồng thời hoạt tính kháng khuẩn của chúng thể hiện thông qua đường kính vòng kháng khuẩn cũng mạnh nhất trong các loại cao chiết khảo sát (đường kính từ 8,5 mm đến 13,7 mm). Trong khi đó đối với cao chiết ethanol 90% chỉ kháng 1/4 chủng là Echerichia coli với đường kính vùng ức chế 8,67 mm. Qua kết quả khảo sát trên chúng tôi nhận thấy đối với nhóm E.coli spp. cao chiết ethanol 70% kháng tốt nhất so với các cao chiết bằng các loại dung môi khác. 47
  57. Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% thấp hơn một cách có ý nghĩa so với hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin nồng độ 500g/ml (P < 0,05). 3.2.2. Nhóm Salmonella spp. 16 14 c c c 12 c b b b abab a ab 10 a a a a ab 8 6 4 2 Đường kính vùng ức ức vùngchế (mm) kính Đường 0 Ethanol 50% Ethanol 70% Ethanol 90% Nước Methanol Ciprofloxacin 500mg/ml Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii Salmonella typhimurium Hình 3. 3 . Hoạt tính kháng khuẩn của Salmonella spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml Dựa vào hình 3.3. chúng tôi thấy rằng tất cả các dung môi đều có hoạt tính kháng khuẩn với 4 chủng Salmonella spp., tuy nhiên các dung môi kháng với mức độ khác nhau. Kết quả này cho thấy cao chiết ethanol 50 % có phổ kháng khuẩn khá rộng 3/4 chủng gồm S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, đường kính vùng ức chế 9 mm. Cao chiết ethanol 70% kháng 2/4 chủng Salmonella khảo sát với đường kính vùng ức chế 7,5 – 8,5 mm. Đối với cao chiết ethanol 90% cũng có phổ kháng khuẩn rộng 3/4 chủng Salmonella thể hiện qua đường kính vùng ức chế từ 8,33 mm đến 9 mm. Trong khi đó cao chiết nước chỉ ức chế 1 chủng là S.typhii, đường kính vùng ức chế 8,83 mm. Cao chiết methanol 75% ức chế S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, đường kính vùng ức chế mạnh nhất trong các loại cao chiết (10 mm). 48
  58. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi nhận thấy nhóm Samonella spp. dung môi methanol 75 % là ức chế tốt nhất so với các dung môi khác. Mặc dù vậy khi so sánh với kháng sinh Ciprofloxacin ở nồng độ 500 g/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol 75% thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). 3.2.3. Nhóm Shigella spp. 40 35 d 30 25 20 15 c b b ab ab ab b ab 10 a 5 Đường kính vùng ức ức vùngchế (mm) kính Đường 0 Ethanol 50 Ethanol 70 Ethanol 90 Nước Methanol Ciprofloxacin 500mg/ml Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Hình 3. 4. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Shigella spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml Dựa vào hình 3.4. chúng tôi thấy rằng tất cả các dung môi đều có hoạt tính kháng khuẩn với nhóm Shigella spp., đặc biệt Shi.boydii, Shi.flexneri bị ức chế bởi cao chiết dung môi ethanol 50%, 90%, methanol 75%. Đối với cao chiết ethanol 50% phổ kháng khuẩn rộng đối với nhóm Shigella spp., ức chế 2/3 chủng Shigella với đường kính vùng ức chế từ 8,83 mm đến 9,83 mm. Cao chiết ethanol 70% chỉ ức chế Shi.flexneri với đường kính vùng ức chế 10,17 mm. Ngoài ra, cao chiết ethanol 90% ức chế 2/3 chủng Shigella khảo sát và đường kính vùng ức chế 8,5 - 9,67 mm. Cao chiết nước chỉ ức chế một chủng duy nhất là Shi.sonnei với đường kính vùng ức chế 10 mm. Cuối cùng, cao chiết methanol 75% cũng có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế 2/3 chủng thể hiện qua đường kính vùng ức chế 9,83 - 10,83 mm. 49
  59. Đồ án tốt nghiệp Kết quả trên cho thấy rằng đối với nhóm Shigella spp., cao chiết ethanol 50%, 90%, methanol 75% đều ức chế tốt, 2/3 chủng Shigella khảo sát. Tuy nhiên, khi so sánh với kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết đều thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). 3.2.4. Nhóm Vibrio spp. 20 f 18 e 16 d d 14 c 12 bc ab ab ab 10 a a a a 8 6 4 2 Đường kính vùng ức ức vùngchế (mm) kính Đường 0 Ethanol 50 Ethanol 70 Ethanol 90 Nước Methanol Ciprofloxacin 8mg/ml Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Hình 3. 5 . Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Vibrio spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 8 g/ml Dựa vào hình 3.5., chúng tôi nhận thấy rằng cao chiết từ Podocarpus sp. kháng tất cả các chủng Vibrio khảo sát, đặc biệt chủng Vibrio cholerae bị ức chế bởi cao chiết ethanol 50%, 70%, methanol 75% và Vibrio parahaemolyticus bị ức chế bởi cao chiết ethanol 50%, 90%, methanol 75%. Kết quả này cho thấy cao chiết 50% kháng Vibrio cholera với đường kính vùng ức chế 8,33 mm, V. parahaemolyticus với đường kính vùng ức chế 8,33 mm. Đặc biệt, cao chiết ethanol 70% phổ kháng khuẩn khá rộng với nhóm Vibrio, chúng kháng được 3/4 chủng. Đồng thời hoạt tính kháng khuẩn của chúng thể hiện qua đường kính vùng ức chế mạnh nhất trong các dung môi khảo sát (đường kính từ 8,17 mm đến 10,17 mm). Cao chiết ethanol 90% chỉ kháng V. parahaemolyticus với đường kính vùng ức chế 8,17 mm. Cao chiết nước kháng V.harveyi với đường kính 50
  60. Đồ án tốt nghiệp vùng ức chế 14 mm. Đối với cao chiết methanol 75% kháng 2/3 chủng Vibrio khảo sát, với đường kính vùng ức chế 9,33 mm. Kết quả này cho thấy đối với nhóm Vibrio spp. hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% tốt nhất gồm Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae , Vibrio harveyi. Mặc khác, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% thấp hơn một cách có ý nghĩa so với kháng sinh Ciprofloxacin 8 g/ml (p < 0,05). 3.2.5. Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác 14 c c c c c 12 b 10 b ab ab ab a a a a 8 6 4 Đường kính vùng ức ức vùngchế (mm) kính Đường 2 0 Ethanol 50 Ethanol 70 Ethanol 90 Nước Methanol Ciprofloxacin 500mg/ml Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis Listeria innicua Listeria monocytogenes Hình 3. 6. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Listeria spp. và nhóm vi sinh vật gây bệnh khác với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml Dựa vào hình 3.6. nhận thấy tất cả dung môi đều có hoạt tính kháng khuẩn với các vi sinh vật khảo sát, tuy nhiên mức độ kháng khuẩn của từng dung môi thì khác nhau. Đặc biệt Pseudomonass aeruginosa, S.aureus đều bị ức chế bởi cao chiết dung môi ethanol 50%, 90%, methanol 75%. Đối với cao chiết ethanol 50% từ Podocarpus sp. kháng 2/5 chủng vi sinh vật khảo sát với đường kính vùng ức chế 8 - 8,5 mm. Cao chiết ethanol 70% cũng kháng 2/5 chủng vi sinh vật thể hiện qua đường kính vùng ức chế 8,33 - 9,33 mm. 51
  61. Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, cao chiết ethanol 90% cũng kháng 2/5 chủng vi sinh vật khảo sát với đường kính vùng ức chế 8 - 8,67 mm. Trong khi cao chiết nước chỉ kháng 1 chủng là S.aureus với đường kính vùng ức chế 8,17 mm. Cuối cùng, cao chiết methanol 75% kháng đực 2 chủng với đường kính vùng ức chế mạnh nhất trong các loại cao chiết (đường kính 9 - 9,5 mm). Kết quả trên cho thấy đối với các vi sinh vật khảo sát, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. tốt nhất so với các dung môi khác. Nhưng khi so với kháng sinh Ciprofloxacin thì hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết ethanol 70% thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Bảng 3. 1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các dung môi trên 20 chủng vi sinh vật Ethanol Ethanol Ethanol Methanol STT Chủng 50 % 70 % 90 % Nước 75 % Escherichia coli 1 O157:H7 8.83 2 Escherichia coli 0208 3 Escherichia coli 8.50 8.67 Enterotoxigenic E.coil- 4 ETEC 13.17 5 Listeria innicua 6 Listeria monocytogenes 9.33 7 Salmonella dublin 7.50 8 Salmonella enteritidis 9.00 8.33 10.00 9 Salmonella typhii 9.00 8.50 9.00 8.33 10.00 Salmonella 10 typhimurium 9.00 8.67 10.00 11 Shigella boydii 9.83 9.67 10.83 12 Shigella flexneri 8.83 10.17 8.50 9.83 13 Shigella sonnei 10.00 14 Vibrio alginolyticus 8.17 15 Vibrio cholerae 8.33 9.50 9.33 16 Vibrio harveyi 10.17 14.00 Vibrio 17 parahaemolyticus 8.33 8.17 9.33 Pseudomonass 18 aeruginosa 8.50 8.33 8.67 9.50 19 Staphylococcus aureus 8.00 8.00 8.17 9.00 20 Enterococcus feacalis Đường kính giếng d = 8 mm 52
  62. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào bảng 3.1. chúng tôi nhận thấy Podocarpus sp. có phổ hoạt động rộng (4 - 11 chủng), đặc biệt là cao chiết ở dung môi ethanol 70% kháng 11/20 chủng. Tuy nhiên đường kính vòng kháng khuẩn của Podocarpus sp. tương đối hẹp (8 – 14 mm). Podocarpus sp. có khả năng kháng đều trên các vi sinh vật. Cao chiết ethanol 50% phổ kháng khuẩn rộng, kháng được 9/20 chủng vi sinh vật chỉ thị, gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass aeruginosa, Staphylococcus aureus. Tiêu biểu là cao chiết ethanol 70% phổ kháng khuẩn rộng nhất 11/20 chủng vi sinh vật và hoạt tính kháng khuẩn thể hiện qua đường kính vùng ức chế lớn, ức chế Escherichia coli, ETEC, Listeria monocytogenes, Salmonella dublin, S.typhii, Shigella flexneri, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus. Cao chiết ethanol 90% ức chế Escherichia coli, Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio parahaemolyticus, Pseudomonass aeruginosa, Staphylococcus aureus. Trong khi đó, cao chiết nước có phổ kháng khuẩn hẹp nhất 4/20 chủng vi sinh vật khảo sát, ức chế Salmonella typhii, Shigella sonnei, Vibrio harveyi, Staphylococcus aureus. Cuối cùng, cao chiết methanol có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, kháng 9/20 chủng vi sinh vật, gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass aeruginosa, Staphylococcus aureus. Cao chiết từ cây Podocarpus sp. tập trung kháng nhóm Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp. và nhóm vi sinh vật gây bệnh khác. Vì những lý do trên Podocarpus sp. ứng dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột. 53
  63. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ cây Podocarpus sp. bằng các dung môi môi khác nhau thì cao chiết ethanol 70% có hoạt tính sinh học khá cao so với một số loại thực vật khác khi đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đối với cùng một số chủng vi sinh vật chỉ thị. Như vậy, dung môi ethanol 70% được sử dụng để tách chiết cao từ Podocarpus sp. để xác định chỉ số MIC và xác định thành phần hóa học. 3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. Sử dụng kết quả kháng khuẩn ở thử nghiệm trên làm cơ sở cho việc lựa chọn chủng nào tiếp tục khảo sát nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC). Bảng 3. 2. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. Chủng MIC(mg/ml) Escherichia coli O157:H7 50 Escherichia coli 100 Enterotoxigenic E.coil - ETEC 12.5 Listeria monocytogenes 50 Salmonella dublin 100 Salmonella typhii 50 Shigella flexneri 25 Vibrio alginolyticus 50 Vibrio cholerae 50 Vibrio harveyi 12.5 Pseudomonass aeruginosa 50 54
  64. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào bảng 3.2. nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% có giá trị khác nhau. Đầu tiên, nhóm Escherichia coli spp. nhạy hơn các nhóm vi sinh vật khác, nồng độ ức chế tối thiểu 12,5 - 100 mg/ml, trong đó Escherichia coli O157:H7 12,5 mg/ml. Listeria monocytogenes nồng độ ức chế tối thiểu là 50 mg/ml. Nhóm Salmonella spp. nồng độ ức chế tối thiểu 50 -100 mg/ml. Shigella flexneri nồng độ ức chế tối thiểu 25 mg/ml. Nhóm Vibrio spp. nhạy hơn các nhóm vi sinh vật khác, nồng độ ức chế tối thiểu 12,5 - 50 mg/ml, trong đó Vibrio harveyi 12,5 mg/ml. Pseudomonass aeruginosa nồng độ ức chế tối thiểu 50 mg/ml. Từ đó thấy rằng cao chiết ethanol 70% kháng tốt với chủng Escherichia coli O157:H7, Vibrio harveyi. Theo nghiên cứu của cây Rosmarinus officinalis L. đối với chủng Lis.monocytogenes của Rozman (2009) là 2,5 mg/ml, trong khi đó giá trị cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. là 50 mg/ml. Ngoài ra trong nghiên cứu của Salem (2014) về ethanol 70% của cây Sycomorus đối với Shi.flexneri là 30 mg/ml, còn với Podocarpus sp. là 25 mg/ml. Nghiên cứu của Mon (2011) về giá trị MIC của cây A.Japonica với V.cholerae là 5 mg/ml, còn giá trị cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. là 50 mg/ml. Từ kết quả khảo sát trên có thể thấy chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70% trên 11 chủng vi sinh vật cao hơn so với nghiên cứu khác. Nguyên nhân do dung môi tách chiết khác nhau, phương pháp khác nhau và một số yếu tố khách quan khác nên giá trị MIC khác nhau. 55
  65. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học Podocarpus sp. Bảng 3. 3. Thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. Thành phần hóa học Thử nghiệm Ethanol 70% Molisch + Carbohydrate Fehling + Benedict + Mayer - Dragendroff - Alkaloid Hager - Wagner - Saponin Foam test + Anthraquinone Bontrager - Alkaline + Flavonoid Shinoda + Ferric clorid + Lead aceate + Phenolic compound Gelatin + Ferric clorid + Tannin Lead acetate + Salkowski Sterol Steroid Libermann Sterol Amino acid Ninhydrin - (+): dương tính (-): âm tính Dựa vào bảng 3.3. chúng tôi nhận thấy rằng thành phần hóa học Podocarpus sp. bao gồm carbohydrate, saponin, flavonoid, phenolic, tannin, steroid. Các thử nghiệm alkaloid, anthraquinone, amino acid đều cho kết quả âm tính Những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn thực vật gồm alkaloid, saponin, flavonoid, phenolic, tannin. Steroid phá vỡ vách tế bào của vi sinh vật. Hợp chất phenolic, flavonoid, tannin có chức năng phá vỡ tế bào của vi sinh vật, tạo phức hợp với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và có khả năng tương tác với DNA nhân 56
  66. Đồ án tốt nghiệp thực của vi sinh vật. Hợp chất alkaloid có khả năng xen vào thành tế bào hoặc DNA của vi sinh vật và ức chế chúng. Podocarpus sp. gồm các hợp chất kháng khuẩn flavonoid, phenolic, tannin, các hợp chất này giúp ức chế một số vi sinh vật gây bệnh. 57
  67. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Cao chiết ethanol 50% từ cây Podocarpus sp. có hoạt tính kháng khuẩn 9/20 chủng vi sinh vật khảo sát gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass aeruginosa, Staphylococcus aureus. Cao chiết ethanol 70% có hoạt tính kháng khuẩn Escherichia coli, ETEC, Listeria monocytogenes, Salmonella dublin, S.typhii, Shigella flexneri, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus. Cao chiết ethanol 90% ức chế Escherichia coli, Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio parahaemolyticus, Pseudomonass aeruginosa, Staphylococcus aureus. Cao chiết nước có phổ kháng khuẩn hẹp nhất 4/20 chủng vi sinh vật khảo sát, ức chế Salmonella typhii, Shigella sonnei, Vibrio harveyi, Staphylococcus aureus. Cao chiết methanol có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, kháng 9/20 chủng vi sinh vật, gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass aeruginosa, Staphylococcus aureus. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết ethanol 70% từ cây Podocarpus sp. từ 25 mg/ml đến 100 mg/ml. Thành phần hóa học Podocarpus sp. bao gồm carbohydrate, saponin, cardiac glycosides, flavonoid, phenolic, tannin, steroid. 4.2. Đề nghị Tôi đề nghị tiến hành thử nghiệm xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC- minimal bactericidal concentration) của Podocarpus sp. với các dung môi khác nhau. 58
  68. Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thay thế phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) bằng phương pháp MIC trong môi trường lỏng (ống nghiệm) để có thể chia nhỏ nồng độ, thu hẹp, dể xác định chính xác giá trị MIC hơn. Định danh xác định loài Podocarpus Định lượng thành phần hóa học chứa trong cây Podocarpus sp. 59
  69. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Vũ Văn Dũng. 1996. Cây rừng Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam Cao Minh Nga, 2014. Thực tập vi sinh học. Nhà xuất bản giáo dục,67,68 Bài giảng Dược liệu Tập I, 1998, Trường đại học y dược TPHCM Ngô Văn Thu, 2011. Bài giảng dược liệu, tập I. Trường đại học Dược Hà Nội Phạm Thanh Kỳ và cs, 1998. Bài giảng dược liệu, tập II. Trường đại học Dược Hà Nội Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học Viện dược liệu, 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I. Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật Viện Dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam”, tập II, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Trumbo P, Schlicker S, Yates AA, Poos M; Food and Nutrition Board of the Institute of Medicine, The National Academies. Dietary reference intakes for energy, carbohydrate, fiber, fat, fatty acids, cholesterol, protein and amino acids.J Am Diet Assoc Nguyen Tien Hiep, Pan Ke Loc, Nguyen Duc To Luu, PI Thomas, A. Farjon, L. Averyanov & J. Regalado Jr. 2004. Vietnam Conifers: Conservation Status Review 2004. Fauna & Flora International, Vietnam Programme, Hanoi. 60
  70. Đồ án tốt nghiệp Abdillahi, HS, et al. (2011). Anti-inflammatory, antioxidant, anti-tyrosinase and phenolic contents of four Podocarpus species used in traditional medicine in South Africa. Journal of Ethnopharmacology 136(3), 496-503. Jean BRUNETON Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants - Technique & Documentation - Lavoisier, 1995 (Translated by Caroline K. Hatton) Austin, B. & D.A. Austin. 1993. Bacterial fish pathogens, Diseases in farmed and wild fish, 2nd edn. Ellis Horwood Ltd., Chichester Jemmi, T., and Stephan, R.,2006, Listeria monocytogenes: food-borne pathogen and hygiene indicator. Science Magazine Vol (25):571-580 Katie E. Ferrell; Thorington, Richard W. (2006). Squirrels: the animal answer guide. Baltimore: Johns Hopkins University Press. 91. Amoros, M., F. Sauvager, L. Girre, and M. Cormier (1992), In vitro antiviral activity of propolis. Apidologie 23:231–240. Pedro Aqueveque và ctv, (2005). Favolon B, a New Triterpenoid Isolated from the Chilean Mycena sp. Strain 96180, The Journal of Antibiotics 58, 61–64. Hisanori Akiyama và ctv, (2001). Antibacterial action of several tannins against Staphylococcus aureus, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48, 487- 491. Cushnie T. P và Lamb A. J; (2006). Antimicrobial activity of flavonoids, Int J Antimicrob Agents; 26(5):343-56. Michał Arabski và ctv, (2012). Effects of Saponins against Clinical E. coli Strains and Eukaryotic Cell Line, Journal of Biomedicine and Biotechnology Mon M. M.,Maw S. S. and Oo Z. K. (2011), Screening of antioxidant, anti- tumor and antimicrobial herbal drugs/diets from some Myanmar traditional herbs, International Journal of Bioscience, Biochemitry and Bioinformatics. 61
  71. Đồ án tốt nghiệp Rozman T., Jersek B. (2009), Antimicrobial activity ò rosemary extracts (Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agriculturae Slovenica. Salem W. M., Sayed W. F., Haridy M. and Hassan N. H. (2014), Antibacterial activity of Calotropis procera and Ficus sycomorus extracts on some pathogenic microorganisms, African Journal of Biotechnology. Aibinu và ctv (2007). “In vitro antimicrobial activity of crude extracts from plants Bryophyllum pinnatum and Kalanchoe crenata”. Afr. J. Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 4 (3): 338 - 344. Moses A.G., Erastus G., Leonard G. and Henry R., Preliminary Phytochemical screening of eight selected medicinal herbs used for the treatment of diabetes, Malaria and Pneumonia in Kisii Region, Southwest Kenya. Euroean Journal of Applied Sciences Vol(5):01-06, 2013 Rayes A. A.H. (2012), Screening of some natural and cultivated plants in sudia arabia fight infections and inhibit growth of pathogenic bacteria, Faculty of Applied Sciences, Umm A1 – Qura University Makkah Saudi Arabia. Wendakoon C., Calderon P., Gagnon D. (2012), Evaluation of selected medicinal plants extracted in different ethanol concentrations for antibacterial activity against human pathogens, Journal of Medicinally Active Plants. 62
  72. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA PODOCARPUS SP. VỚI CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU A.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 50% Ethanol 50% Chủng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Salmonella enteritidis 8.5 9.5 9 Salmonella typhii(K) 9.5 8.5 9 Salmonella typhimurium 9.5 9 8.5 Shigella boydii 10 9.5 10 Shigella flexneri 9 9.5 8 Vibrio cholerae 8.5 8.5 8 Vibrio parahaemolyticus 8 8 9 Pseudomonass aeruginosa 8.5 8.5 8.5 Staphylococcus aureus 8 8 8 A.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% Chủng Ethanol 70% Lần 1 Lần 2 Lần 3 Escherichia coli O157:H7 8.5 9 9 Escherichia coli 0208 Escherichia coli (K) 8.5 8.5 8.5 Enterotoxigenic E.coil- 11 13.5 15 ETEC Listeria innicua Listeria monocytogenes 10 9.5 8.5 Salmonella dublin 7.5 7.5 7.5 Salmonella enteritidis Salmonella typhii(K) 9 7.5 9 Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri 10.5 10 10 Shigella sonnei Vibrio alginolyticus 9 8 7.5 Vibrio cholerae 9 10 9.5 Vibrio harveyi 10.5 10.5 9.5 Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa 8 8.5 8.5 Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis 1
  73. Đồ án tốt nghiệp A.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 90% từ Podocarpus sp. Ethanol 90% Chủng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Escherichia coli (K) 8.5 9 8.5 Salmonella enteritidis 9 8 8 Salmonella typhii(K) 9 9 9 Salmonella typhimurium 8.5 8.5 9 Shigella boydii 10 10 9 Shigella flexneri 8.5 8 9 Vibrio parahaemolyticus 8.5 8 8 Pseudomonass aeruginosa 9 8.5 8.5 Staphylococcus aureus 8 8 8 A.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước từ Podocarpus sp. Cao nước Chủng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Salmonella typhii(K) 8.5 8.5 8 Shigella sonnei 10 10 10 Vibrio harveyi 13.5 14.5 14 Staphylococcus aureus 8.5 8.5 7.5 A.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol 75% từ Podocarpus sp. STT Chủng Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 Escherichia coli - - - 0157:H7 2 Escherichia coli 0208 - - - 3 Escherichia coli (K) - - - 4 Enterotoxigenic - - - E.coil-ETEC 5 Listeria innicua - - - 6 Listeria - - - monocytogenes 7 Salmonella dublin 8 Salmonella enteritidis 9.5 10.5 10.0 9 Salmonella typhii(K) 10.5 9.5 10.0 10 Salmonella 10.5 10.0 9.5 2
  74. Đồ án tốt nghiệp typhimurium 11 Shigella boydii 11.0 10.5 11.0 12 Shigella flexneri 10.0 10.5 9.0 13 Shigella sonnei - - - 14 Vibrio alginolyticus 15 Vibrio cholerae 9.5 9.5 9.0 16 Vibrio harveyi 17 Vibrio 9.0 9.0 10.0 parahaemolyticus 18 Pseudomonass 9.5 9.5 9.5 aeruginosa 19 Staphylococcus aureus 9.0 9.0 9.0 20 Enterococcus feacalis - - - 3
  75. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÍ SỐ LIỆU BẰNG PHẦN MỀM STATGRAPHIC B.1. Kết quả xử lí số liệu hiệu suất tách chiết cao của các dung môi B.2. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm Escherichia coli spp. B.3. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm Shigella spp. B.4. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm Vibrio spp. 4
  76. Đồ án tốt nghiệp B.5. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm vi sinh vật gây bệnh khác B.6. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Listeria monocytogenes B.7. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Salmonella enteritidis 5
  77. Đồ án tốt nghiệp B.8. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Salmonella typhimurium B.9. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Salmonella typhii (K) 6
  78. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA PODOCARPUS SP. C.1. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. (nồng độ 50,100 mg/ml) 100 mg/ml 50mg/ml STT Chủng Lần Lần Lần Lần Lần Lần 1 2 3 1 2 3 Escherichia coli 1 O157:H7 13 15 15 11 10 10 2 Escherichia coli 0208 3 Escherichia coli 10.5 11 10.5 Enterotoxigenic E.coil- 4 ETEC 13 14 13.5 11 10 11 5 Listeria innicua Listeria 6 monocytogenes 11 10 10 8.5 9 9 7 Salmonella Dublin 9 11 11 8 Salmonella enteritidis 9 Salmonella typhii(K) 11 11.5 11.5 10 10 9 Salmonella 10 typhimurium 11 Shigella boydii 12 Shigella flexneri 11 12 11 10 10 9 13 Shigella sonnei 14 Vibrio alginolyticus 11 11 11 9.5 11.5 10 15 Vibrio cholerae 10.5 10.5 10.5 9 9 16 Vibrio harveyi 11 12 11 9 8.5 8 Vibrio 17 parahaemolyticus Pseudomonass 18 aeruginosa 11 11 11 8 8.5 8.5 19 Staphylococcus aureus 20 Enterococcus feacalis C.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. (nồng độ 12,5, 25 mg/ml) STT Chủng 25 mg/ml 12.5 mg/ml 7
  79. Đồ án tốt nghiệp Lần Lần Lần Lần Lần Lần 1 2 3 1 2 3 Escherichia coli 1 0157:H7 Escherichia coli 2 0208 3 Escherichia coli (K) Enterotoxigenic 4 E.coil-ETEC 11 12 11 9.5 9 9 5 Listeria innicua Listeria 6 monocytogenes 7 Salmonella dublin Salmonella 8 enteritidis 9 Salmonella typhii(K) Salmonella 10 typhimurium 11 Shigella boydii 12 Shigella flexneri 8 9 10 13 Shigella sonnei 14 Vibrio alginolyticus 15 Vibrio cholerae 16 Vibrio harveyi 10 9 8 10 9.5 Vibrio 17 parahaemolyticus Pseudomonass 18 aeruginosa Staphylococcus 19 aureus Enterococcus 20 feacalis 8
  80. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CIPROFLOXACIN D.1. Hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin nồng độ 500 g/ml, nhóm Vibrio spp. nồng độ 8 g/ml Ciprofloxacin 500 g/ml Ciprofloxacin 8 g/ml STT Chủng Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB TB 1 2 3 1 2 3 Escherichia coli 1 O157:H7 13 13 13.5 13.17 Escherichia coli 2 0208 12.5 12 12.5 12.33 Escherichia coli 3 (K) 13 13 13.5 13.17 Enterotoxigenic 4 E.coli-ETEC 30.5 31 31.5 31.00 5 Listeria innocua 11.5 12 12.5 12.00 Listeria 6 monocytogenes 12 12 12.5 12.17 Salmonella 7 dublin 12 11.5 13 12.17 Salmonella 8 enteritidis 13.5 13 12.5 13.00 Salmonella typhi 9 (K) 13 12 12.5 12.50 Salmonella 10 typhimurium 11 11 11 11.00 11 Shigella boydii 0 0 0 0.00 12 Shigella flexneri 13 13 13.5 13.17 13 Shigella sonnei 33.5 33 32.5 33.00 Vibrio 14 alginolyticus 16.5 16 16 16.17 15 Vibrio cholerae 13 13 14 13.33 16 Vibrio harveyi 17.5 18 18.5 18.00 Vibrio 17 parahaemolyticus 11.5 11.5 11 11.33 18 Pseudomonas (K) 12.5 11.5 12.5 12.17 Staphylococcus 19 aureus 12 12 12.5 12.17 Enterococcus 20 feacalis 12 11.5 12.5 12.00 9
  81. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC E: THUỐC THỬ SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM E.1. Phương pháp pha thuốc thử trong phương pháp xác định thành phần hóa học Thành phần hóa học Thuốc thử Tiến hành Carbohydrate Molisch Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành 100 ml Feling Fehling A: hòa tan 34,6 g CuSO4.5H2O vào 500 ml nước cất. Fehling B: Hòa tan 125 g KOH và 173 g Kali Natri tartrate.7H2O vào 500 ml nước cất. Barfoed Thêm 10 ml acid acetic glacial vào 1000 ml nước cất Cân 66,5 g Copper (II) acetate monohydrate Đun và khuấy đến khi tan hoàn toàn. Alkaloid Mayer Hòa tan 1,358 g HgCl2 trong 60ml nước, sau đó đổ vào trong dung dịch này 5 g KI được pha trong 10ml nước. Sau đó định mức lên 100 ml. 10
  82. Đồ án tốt nghiệp Dragendroff Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid acetic 20%. Dung dịch B: dung dịch KI 40% pha trong nước. Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70 ml nước. Hager Hòa tan 1 g acid picric vào 100 ml nước cất Wagner Hòa tan 2 g iodine và 6g KI vào 100 ml nước cất Cardiac glycosides Na nitro prusside 1 g Na nitroferricyanide và bổ sung 10 ml nước cất 11